ZET Labaratuvar ortamlarnda yaplan almalarda elde edilen sonularn mmkn olduunca hassas olmas gerektiinden dolay deneylerde

kullanlan zeltiler ierisindeki net madde miktarnn bilinmesi deneyin doru sonu vermesi asndan nem arz etmektedir.Spektrofotometereler madde analizlerinde olduka hassas sonular veren lm aletleridirler.Yaplan deneyin amac spektrofotometreler kullanlarak lm yapabilmek ve bu aletler hakknda bilgi sahibi olmaktr.Bu deneyde adndan da anlalaca zere k yardmyla madde miktarn len bu spektrofotometereler kullanlarak Bradford Assay yntemi ile farkl miktarlarda sr serum albumin(Bovine Serum Albumin(BSA)) zetileri ierisinde bulunan protein miktar llm ve elde edilen deerler grafie dklmtr. TANITIM Bu blmde spektrofotometreler Bradford zeltileri hakkna ayrntl bilgi verilip.Yaplacak deneyde izlenecek yol hakknda ksaca bahsedilecektir. Spektrofotometreler atomun elektromagnetik dalgalar olan fotonlar absorblamas esasna dayanarak zelti ierisindeki znen miktarn len cihazlardr[1].Bu cihazlar temel olarak lm yaplacak olan zeltiden geirilmi olan fotonun enerjisini lerek madde miktarn lme ilemini gerekletirirler[2].ekil1 de temel mekanizmalar gsterilen spektrofotometreler grld gibi kvet ierisindeki rnek zelti ierisine dalga boyu spektrometre yardmyla ayarlandktan sonra gnderilen nn bu zeltiden getikten sonra dalga boylarnn fotometre yardmyla llmesiyle rnek zeltideki partikllerin absorbladklar total enerjiyi hesaplayan dolaysylada zeltideki madde miktarn hesaplayan aletlerdir. Yaplan deneyde ekil2de gsterilen Shimadzu Corparation UV/V 1601 marka ekil 1:Spektrofotometre Mekanizmas spektrofotometre kullanlmtr.Bu cihazlarn iki adet kvet haznesi vardr.Birincisi, bu deneydede hazrlayacamz blank zeltisi iindir.Blank zeltisi cihazn sfr noktasn belirlemesi iin gereklidir.kinci hazneye ise lm yaplacak olan zelti konulur. zelti ierisindeki protein miktarlarnn belirlenmesinde WarburgChristian, Biuret,Bradford Assay ve Lowry yntemi olmak zere drt farkl yntem vardr[3].Bugn ki deneyde kullanlan yntem olduka duyarl olan Bradford Assay yntemidir.Bu yntem ekil 2:Shimadzu Corp. UV/V 1601 comassie blue boya maddesinin proteinlerin asidik ve bazik ksmlarna birlemesi esasna dayanr[4].Proteine balanan bu boya maddesi normal artlarda 465 nm dalga boyunda maksimum absorbans verirken proteinle birletikten sonra 595 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir.Bu nedenle spektrometre 595nm dalga boyuna ayarlanr[5]. 1

Yaplan deneyde zelti halinde sr serum albuminin(BSA) proteininin miktar analizi yaplmas amacyla yukarda da aklanan Bradford Assay yntemi kullanlmtr.BSA solsyonu zerine bradford zeltisi ilave edilip seyreltildikten sonra yukardaki ekildeki spektrofotometre kullanlarak protein miktarlar llmtr. MATERYAL VE METODLAR Materyaller 5 adet spektro kveti 5 adet parafin(kvet iindeki zeltiyi kartrmak iin) 1 adet falcon 2 adet Hamilton marka micro pipet(biri 100 dieri 1000mikrolitrelik olmak zere) 1 adet spektrofotometre cihaz (shimadzu corp. UV/V 1601) Bradford zeltisi BSA (Bovine serum albumin) stok solsyonu(400mg/2ml) Distile su Metodlar Bu blmde deney srasnda katedilen aamalardan srasyla bahsedilecektir. ncelikle deneye balamadan nce verilen be adet spektro kveti musluk suyu ile ykandktan sonra kurulanmak zere kurutma kad zerine brakld.Daha sonra ortamdaki ktan etkilenmemesi iin alminyum folyo ile sarl falcon ierisinde Bradford zeltisi ve ikiayr falcon ierisinde distile su ve sr serum albumin(BSA) alnd.Kuruyan spektro kvetleri birden bee kadar numaralandrld.Asistanlarn nceden belirledii zere 2,3ve4 numaral kvetler ierisine srasyla 1gr 2gr 4gr ve 8gr BSA eklemek zere 400mg/2ml BSA stok solsyonundan kaar ml alnmas ekil-3: Dinlenmeye braklan kvetler gerektii hesapland.Buna gre BSA stok solsyondan 100lk micropipet yardmyla srasyla 5,10,20 ve 40mikrolitre alnarak kvetlere konuldu.1 numaral spektro kveti ise blank zelti oluturmak zere yalnzca 100microlitrelik distile su ile doldruldu. Blank zelti hazrlamaktaki ama spektrofotometre cihaznn kalibrasyon ayarn yamak yani cihazn sfr noktasn belirlemesini salamaktr. Daha sonra ilerinde BSA bulunan 2,3,4ve5 numaral kvetlerin her birine 0,9ml Bradford zeltisi ilave edilmitir.Son durumdaki bu zeltiler 1000lik micro pipet yardm ile 100microlitreye tamamlandktan sonra parafinler yardmyla azlar kapatlp k geen taraflar izilmemesine dikkat edilerek kartrldktan sonra ekil3 de grld gibi ekil-4:Spektroda lm 2

oda artlarnda 5-10 dk beklemeye braklmtr.Son olarak kvetler spektrometre cihazna gtrlerek 1 numaral kvet blank zelti olarak spektrofotometre cihaznn ierisine yerletirildikten sonra srayla dier kvetlerde cihaz ierisine konularak lm deerleri not edilmitir. SONULAR Deney Sonucu Elde Edilen Veriler

Tablo1: Deney sonucu elde edilen veriler Deney sonucunda ierisinde 1mg protein bulunan 2. kvettin absorbans 0.2393 2mg protein bulunan 3.kvetin absorbans 0.4000 4mg protein bulunan 4. kvetin absorbans 0.686 8mg protein bulunan 5. kvetin absorbans 1.1877 olarak okunmutur. Yukardaki tabloda deney sonucu spektrofotometrede okunan her bir kvet iin birim litreye den 10000 mga karlk gelen absorbanslar gsterilmitir. Grafikteki deerler Excele girilerek grafiin fonksiyonu y=0.134301x + 0.124622 olarak bulunmutur.Bu fonksiyon iin r2 deeri hesaplatldnda 0.997799 olduu grlmtr. Deneyde yaplan hatalar Yaplan bu deneye balamadan nce deney fynde verilen deerlerde zeltiler hazrlanm fakat llen absorbans deerleri birbirine ok yakn okmtr.Bu nedenle deney metodlar ksmnda verilen deerlerle tekrar edilmitir. Tablo1 deki grafiktende grlebilecei gibi verilen protein miktarlarna karlk gelen absorbans deerleri beklenildii gibi protein miktarlaryla orantl olarak artmamtr.rnein, 1. erisinde 1mg protein bulunan zeltinin absorbans 0,2393 iken 2mg protein bulunan zeltinin absorbansnn 0.2393x2=0.4786 olmas beklenirken 0.4000

olarak llmtr.Buradaki bal hata pay 0.4786-0.4000/0.4786=%16 olarak bulunur. 2. erisinde 4mg protein bulunan kvetteki zeltinin absorbans deeri ise yine 2. kvetteki deer esas alndnda 0,2393x4=0.9572 olmas beklenirken 0.686 llmtr.Buradaki bal hata pay 0.9572-0.686/0.9572=%28 olarak bulunur 3. Son olarak ierisinde 8mg protein bulunan kvetteki zeltinin absorbans deeri yine 2.kvetteki deer esas alndnda 0.2393x8=1.9144 olmas beklenirken 1.1877 llmtr.Buradaki bal hata pay 1.91441.1877/1.9144=%3 olarak bulunur. TARTIMA Deney sonucu elde edilen verilerin analizi Deney sonucu elde edilen verilere gre, ierisinde 1mg sr serum albumin proteini bulunan 2 kvetin spektrofotometrede llen absorbans deeri 0.2393, ierisinde 2mg protein bulunan 3.kvetin llen absorbans deeri 0.4000, ierisinde 4mg protein bulunan 4.kvetin llen absorbans deeri 0.686 ve son olarak ierisinde 8mg protein bulunan 5.kvetin absorbans deeri 1.1877 olarak llm idi. Bu sonulara bakarak zeltideki protein miktarnn artan deerleri iin spektrofotometre cihaznda llen absorbans deerlerinin artt rahata grlebilmektedir.Buradan zeltideki protein miktarnn artmasyla spektrofotometre cihaznn rnek zeltiye gnderdii fotonlarn absorblanma miktarnn artt anlalmaktadr.Bu sonu beklenen sonula uyum gstermektedir. Deneyde yaplan hatalarn analizi Bu deneyden hemen nce yaplan hatal deneyde hazrlanmas istenen zeltiler ierisindeki protein miktarlar 2,4,6,8,10 mg gibi ardk saylard.Spektrofotometrede llen absorbans deerleri ok kk saylar olduundan buradaki protein miktarndaki art absorbans deerlerinde nemsenmeyecek derecelerde olacandan sanki art yokmu gibi deerler okunmutur.Bu nedenle deney protein miktarlar arasndaki oran arttrlarak tekrarlanmtr. Bu deneyde yaplan hatalar hesaplanrken 2.kvetteki zelti iin yaplan lmlerin doru olduu varsaylarak hesaplamalar yaplmtr.Burada eer dier herhangi bir kvet esas alnsayd hata paylar ok daha farkl kacakt.Ancak sonu olarak llen deerler ne olursa olsun protein miktar iki katna karldnda absorblanan enerjinin de iki katna kmas beklenirdi.Yaplan deneyin sonularnda aka grlmektedir ki absorblanan enerjide art gzlenmi fakat bu art beklenen oranda olmamtr.Bu durum iin olas sebepler olarak, bradford solsyonunun a maruz kalp bozulma gerekletirmesi,deneyin ok kk miktarlar iin gerekletirilmi olmasndan dolay protein stok zeltisinin mikro pipet yardmyla kvetlere alnrken pipetin tam doldurulamamas ya da tam boaltlamamas sylenebilir. REFERANSLAR [1] http://www.taek.gov.tr/tr/sss/132-olcme-ve-analiz/517-spektrofotometrenedir-.html [2] http://www.genbilim.com/content/view/2147/34/ [3][4][5] http://www.mu.edu.tr/departments/biyoloji/MUbiyoweb/molbio/molbiolabsonhafta.pp t 4