GLUKOZ OKSDAZ BAZLI ENZM ELEKTROTLARDA ELEKTRKSEL LETKENLN GELTRLMES

IMPROVEMENT OF ELECTRICAL CONDUCTIVITY OF GOD BASED ENZYME ELECTRODES

GONCA BLGE

Hacettepe niversitesi Lisansst Eitim retim ve Snav Ynetmeliinin Biyomhendislik Anabilim Dal in ngrd YKSEK LSANS TEZ olarak hazrlanmtr.

2010

KABUL VE ONAY Fen Bilimleri Enstits Mdrl'ne, Bu alma, jrimiz tarafndan BYOMHENDSLK ANABLM DALI 'nda YKSEK LSANS TEZ olarak kabul edilmitir. Bakan :.. Prof. Dr. Tlin Kutsal

ye

(Danman) : .. Prof. Dr. Selma Mutlu

ye

:.. Prof. Dr. Meneme Gmdereliolu

ye

:.. Prof. Dr. smail Hakk Boyac

ye

:. Prof. Dr. Nuran ziek Pekmez

ONAY Bu tez ...../06/2010 tarihinde Enstit Ynetim Kurulunca kabul edilmitir.

Prof.Dr. Adil Denizli Fen Bilimleri Enstits Mdr

GLUKOZ

OKSDAZ

BAZLI

ENZM

ELEKTROTLARDA

ELEKTRKSEL

LETKENLN GELTRLMES Gonca Bilge Z Sunulan alma ile nemi giderek artan, birok aratrmaya konu olan biyosensrler ve biyoyakt pili uygulamalarnda kullanlmak zere elektriksel iletimi gelitirilmi glukoz oksidaz (GOD) bazl enzim elektrodu oluturulmas

hedeflenmitir. Bu amala, enzimin redoks aktif merkezi ve elektrot arasndaki elektriksel iletimin arttrlmas esas alnarak, farkl immobilizasyon yntemleriyle elektriksel iletkenlii gelitirilmi glukoz oksidaz bazl enzim elektrodu tasarm nerilmitir. Tez kapsamnda amalanan GOD enzim elektrodu tasarm almalar kovalent balama, elektrokimyasal immobilizasyon ve apo-enzimin yeniden yaplandrlmas yntemleri ile gerekletirilmi, hazrlanan enzim elektrotlarn performanslar karlatrlmtr. Elektrot ve enzimin redoks aktif merkezi arasndaki elektron transferini arttrmak amacyla, kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemlerinde medyatr molekllerinden, apo-enzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde ise direk elektron transferinden yararlanlmtr. Enzim elektrodu tasarm almalarndan, kovalent ve elektrokimyasal

immobilizasyon yntemlerinde iletken polimer olarak polipirol (PPy), medyatr olarak dimetilaminometil ferrosen (DMAMFc), apo-enzimin yeniden

yaplandrlmas ynteminde ise iletken polimer olarak polianilin (PAn) ile modifikasyon yaplmtr. mmobilizasyon ilemlerinin verimini arttrmak amacyla her immobilizasyon yntemine zg immobilizasyon parametreleri incelenmitir. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde stabilizasyon problemi ile karlald iin immobilizasyon parametreleri zerinde allamamtr. pH ve scaklk gibi evresel koullarn hazrlanan enzim tabanl elektrotlarn performansna etkisi bir elektrokimyasal potansiyostat-galvanostat sisteminde kronoamperometri (CA) yntemiyle incelenmitir. Enzim elektrotlarn kalibrasyon
i

erileri kartlarak kinetik parametreler (Imax, Km) hesaplanmtr. Buna gre elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle hazrlanan enzim elektrodunun Km deeri 7 mM, Imax deeri 833 A, kovalent balama yntemiyle hazrlanan enzim elektrodunun Km deeri 19.87 mM, Imax deeri 1250 A, apo-enzimin yeniden yaplandrlmasyla hazrlanan enzim elektrodunun Km deeri 27.4 mM, Imax deeri 2000 A olarak bulunmutur. Kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemleri ile hazrlanan enzim elektrotlar biyoyakt hcresinde test edilmitir. Biyoyakt hcresinin performans, akm-voltaj karakteristiini veren deerlendirmeler ile sunulmutur. Bu sonulara gre kovalent balama ile oluturulan biyoanodun bal olduu biyoyakt hcresinde ak devre potansiyeli (OCP) 333 mV, ksa devre akm younluu 18.17 A/cm2 (0.85 diren altnda), maksimum g younluu 0.9 W/cm2; elektrokimyasal immobilizasyon ile oluturulan biyoanodun bal olduu biyoyakt hcresinde ise ak devre potansiyeli (OCP) 456 mV, ksa devre akm younluu 13.30 A/cm2 (0.85 diren altnda), maksimum g younluu 0.88 W/cm2 olarak bulunmutur. Son olarak farkl immobilizasyon yntemleri ile hazrlanan enzim elektrotlarnn yzeyleri AKM ve FTIR teknikleri ile topografik ve kimyasal olarak karakterize edilmitir. Bu alma ile dnyada son dnemde hzl bir gelime srecine giren enzim tabanl yakt pili teknolojisinde ve hemen her alanda kullanlma imkan bulan biyosensrlerin geliiminde farkl enzim immobilizasyon yaklamlar ile elektrot performansnn deerlendirmesi sunulmutur. Anahtar Kelimeler: Glukoz Oksidaz, Apo-enzim, Direk Elektron Aktarm, Elektrot, letken polimer Danman: Prof. Dr. Selma MUTLU, Hacettepe niversitesi, Biyomhendislik Anabilim Dal

ii

IMPROVEMENT OF ELECTRICAL CONDUCTIVITY OF GOD BASED ENZYME ELECTRODES Gonca Bilge ABSTRACT This study aims to develop electrical conductivity of glucose oxidase based (GOD) enzyme electrode for biosensors and biofuel cells applications which has become more important. For this purpose, the design of glucose oxidase based enzyme electrode which is based on development of electrical conductivity between the redox active center of enzyme and the electrode prepared by different enzyme immobilization techniques has been proposed. In the scope of thesis, the design studies of GOD enzyme electrode including covalent bounding, electrochemical immobilization and reconstitution of apoenzyme techniques have been presented. The enzyme electrodes prepared by different immobilization techniques were compared with each other. To increase the electron transfer between the redox center of enzyme and electrode, in the covalent bounding and electrochemical immobilization techniques the mediator molecules, in the reconstitution of apo-enzyme technique direct electron transfer were used. Polipyrrole (PPy) as conductive polymer and dimethyl aminomethyl ferrocene (DMAMFc) as mediator were used in the covalent bounding and electrochemical immobilization techniques. Polyaniline as conductive polymer was used in the reconstitution of apo-enzyme technique. For increasing the efficiency of immobilization, some parameters of immobilization were studied. Immobilization parameters of reconstitution of apo-enzyme technique couldnt be studied due to stabilization problem of this technique. The effects of environmental factors such as pH and temperature on enzyme based electrodes were investigated by chronoamperometry (CA) technique in electrochemical potantiostat-galvanostat system. Calibration curves of enzyme
iii

electrodes were plotted and the kinetic parameters (Km, Imax) were calculated. For the enzyme electrode prepared by electrochemical immobilization, Km is 7 mM and Imax is 833 A. For the prepared enzyme electrode by covalent bounding, Km is 19.87 mM, Imax is 1250 A. For the third one, theenzyme electrode prepared by the reconstitution of apo-enzyme, Km is 27.4 mM, Imax is 2000 A. Prepared enzyme electrodes by covalent bounding and electrochemical immobilization techniques were tested on a biofuel cell. The performance of the biofuel cell was discussed from its current-potential characteristics. According to this result, biofuel cell consist of prepared bioanode by covalent bounding open circuit potential (OCP) is 333 mV, short circuit current density was 18.17 A/cm2 (under 0.85 resistance) and maximum power density was 0.9 W/cm2. Biofuel cell consist of prepared bioanode by electrochemical immobilization open circuit potential (OCP) is 456 mV, short circuit current density was 13.30 A/cm2 (under 0.85 resistance) and maximum power density was 0.88 W/cm2. Finally, the surfaces of prepared enzyme electrodes by different immobilization techniques were characterized as topografhical and chemical by AFM and FTIR. With this study the performances of enzyme electrodes which prepared by different immobilization techniques on biofuel cells and biosensors were presented. Keywords: Glucose Oxidase, Apo-enzyme, Direct Electron Transfer, Electrode, Conductive Polymer Supervisor: Prof. Dr. Selma MUTLU, Hacettepe University, Chemical Engineering Department

iv

TEEKKR Yksek Lisans tez almam boyunca ok byk desteini grdm, gr ve bilgi birikiminden yararlandm deerli tez danmanm ve deerli hocam Sayn Prof. Dr. Selma Mutlu ya, Bilgi ve desteini esirgemeyen Sayn Prof. Dr. Mehmet Mutlu ve Plazma Destekli Biyoteknoloji ve Biyomhendislik Aratrma Grubuna, almalarm boyunca bana yardmc olan Yk. Mh. Ebru Akdoana, Tecrbelerinden yararlandm her konuda bana destek olan Yk. Mh. Ceyda Pabuu ve Hrkan atalkayaya, her zaman yzm gldren ayn laboratuvar paylamaktan ve dostluklarndan keyif aldm Yeliz akr ve Yk. Mh. Nesrinire, Her konuda beni dinleyen, yol gsteren sevgili Lale ztrke, Tez almam sresince ilgi, sabr ve desteklerini esirgemeyip benim iin fedakarlklarda bulunan, canm annem, canm babam, biricik ablam ve nee kaynam hereyden ok sevdiim minik yeenim Efeye; SONSUZ TEEKKRLERM SUNARIM. Gonca Bilge

NDEKLER DZN Sayfa z...i ABSTRACT .......................................................................................................... iii TEEKKR .......................................................................................................... v NDEKLER DZN............................................................................................vi EKLLER DZN .................................................................................................ix ZELGELER DZN .......................................................................................... xiii SMGELER ve KISALTMALAR DZN ............................................................... xiv 1. 2. GR ve ALIMANIN AMACI .................................................................... 1 GENEL BLGLER ......................................................................................... 3 2.1. Enzim................................................................................................... 3 Enzimlerin Yaps.......................................................................... 4

2.1.1.

2.1.1.1. Aktif Merkez ........................................................................... 5 2.1.2. 2.2. Enzimlerin Snflandrlmas .......................................................... 7

Enzim mmobilizasyonu ....................................................................... 8 Enzim mmobilizasyonu Yntemleri .............................................. 8

2.2.1.

2.2.1.1. Tayc Bir Yzeye Balama................................................. 8 2.2.1.2. apraz Balama .................................................................. 11 2.2.1.3. Tutuklama ............................................................................ 12 2.2.2. 2.3. Apo-enzimin Yeniden Yaplandrlmas....................................... 13

Enzim Kinetii .................................................................................... 15 Enzim Aktivitesi .......................................................................... 15 Michelis ve Menten Kinetii ........................................................ 16

2.3.1. 2.3.2. 2.4.

Glukoz Oksidaz ................................................................................. 18 Glukoz Oksidazn Genel zellikleri ............................................ 19 Glukoz Oksidazn Reaksiyon Mekanizmas................................ 19

2.4.1. 2.4.2. 2.5.

Enzim Elektrodu ................................................................................ 20 Amperometrik Enzim Elektrodu Jenerasyonlar .......................... 21 Enzim Elektrodu Karakteristikleri ................................................ 23

2.5.1. 2.5.2.

2.5.2.1. Kararllk .............................................................................. 24

vi

2.5.2.2. Seicilik................................................................................ 24 2.5.2.3. Cevap Sresi ....................................................................... 25 2.5.3. Amperometrik Glukoz Elektrodu ................................................. 25

2.5.3.1. Amperometrik Glukoz Elektrodunun Kullanm Alanlar ........ 26 2.6. letken Polimerler ............................................................................... 29 letken Polimerlerin Sentezi ........................................................ 30 letken Polimerlerin Elektrokimyasal Polimerleme Mekanizmas 33 2.6.3. 2.7. letken Polimerlerin letkenlii ve Dopingi ................................... 34

2.6.1. 2.6.2.

Analiz Teknikleri ................................................................................ 35 Elektrokimyasal lmler ........................................................... 35

2.7.1.

2.7.1.1. Voltametrik Yntemler ......................................................... 35 2.7.2. Yzey Karakterizasyonu ............................................................. 36

2.7.2.1. Atomik Kuvvet Mikroskopisi (AKM) ...................................... 37 2.7.2.2. Fourier Transform nfrared Spektroskopisi .......................... 37 3. DENEYSEL ALIMALAR ......................................................................... 39 3.1. 3.2. Kimyasal Madde ve Malzemeler ........................................................ 40 Enzim Elektrodu Hazrlanmas .......................................................... 41 Enzimin Kovalent Balanmas .................................................... 42

3.2.1.

3.2.1.1. mmobilizasyon Parametreleri ............................................. 43 3.2.1.2. Enzim Elektrodunun Dnml Voltametri ncelemesi ...... 44 3.2.2. Elektrokimyasal mmobilizasyon ................................................. 45

3.2.2.1. mmobilizasyon Parametreleri ............................................. 46 3.2.2.2. Enzim Elektrodunun Dnml Voltametri ncelemesi ...... 47 3.2.3. 3.3. Enzimin yeniden yaplandrlmas ............................................... 47

Elektrot Performans almalar ........................................................ 52 Ortam pHsnn Etkisi .................................................................. 53 Scakln Etkisi .......................................................................... 54 Enzim Elektrodunun Kalibrasyonu .............................................. 54

3.3.1. 3.3.2. 3.3.3. 3.4.

Enzim Elektrodunun Biyoyakt Pilinde Test Edilmesi ......................... 54 Biyokatot Hazrlanmas............................................................... 54 Enzim Elektrot Performanslarnn Biyoyakt Pilinde

3.4.1. 3.4.2.

Deerlendirilmesi ...................................................................................... 55 3.5. Elektrot Yzeylerinin Karakterizasyonu ............................................. 55

vii

3.5.1. 3.5.2. 4.

FTIR (Fourier Transform Kzltesi Spektroskopisi) Analizi ........ 55 AKM (Atomik Kuvvet Mikroskobu) Analizleri ............................... 56

DENEYSEL SONULAR VE TARTIILMASI ............................................. 57 4.1. Enzim Elektrodu Hazrlanmas .......................................................... 58 Enzimin Kovalent Balamas ...................................................... 60

4.1.1.

4.1.1.1. mmobilizasyon Parametreleri ............................................. 62 4.1.1.2. Enzim Elektrodunun Dnml Voltametri ncelemesi ...... 65 4.1.2. Elektrokimyasal mmobilizasyon ................................................. 65

4.1.2.1. mmobilizasyon Parametreleri ............................................. 65 4.1.2.2. Enzim Elektrodunun Dnml Voltametri ncelemesi ...... 72 4.1.3. 4.2. Enzimin yeniden yaplandrlmas ............................................... 73

Elektrot Performans almalar ........................................................ 79 Ortam pHsnn Etkisi .................................................................. 79 Scakln Etkisi .......................................................................... 81 Enzim Elektrodunun Kalibrasyonu .............................................. 82

4.2.1. 4.2.2. 4.2.3.

4.2.3.1. Enzim Elektrodunun Kinetik Parametreleri Km ve Imaxn Hesaplanmas ..................................................................................... 85 4.3. Enzim Elektrodunun Biyoyakt Pilinde Test Edilmesi ......................... 88 Enzim Elektrot Performanslarnn Biyoyakt Pilinde

4.3.1.

Deerlendirilmesi ...................................................................................... 88 4.4. Elektrot Yzey Karakterizasyonu ....................................................... 91 FTIR (Fourier Transform Kzltesi Spektroskopisi) Analizi ........ 91 AKM (Atomik Kuvvet Mikroskobu) Analizleri ............................... 93

4.4.1. 4.4.2. 5.

GENEL SONULAR.................................................................................... 97

KAYNAKLAR DZN......................................................................................... 101 ZGEM ...................................................................................................... 105

viii

EKLLER DZN Sayfa ekil 2.1. Katalizr mekanizmas. Ea, katalizlenmemi reaksiyonun aktivasyon enerjisi; Ea, katalizlenmi reaksiyonun aktivasyon enerjisi; G, reaksiyonun serbest enerjisindeki deiim (Illanes, 2008). ................. 3 ekil 2.2. Baz koenzimlerin yaps (Illanes, 2008). .............................................. 6 ekil 2.3. Tayc yzeye bal enzimin ematik gsterimi. ................................. 9 ekil 2.4. apraz bal enzimin ematik gsterimi. ............................................. 12 ekil 2.5. Tutuklanm enzimlerin ematik gsterimi. ......................................... 12 ekil 2.6. Yeniden yaplandrlan enzim moleklnn ematik gsterimi (Zayats et al., 2008)............................................................................................ 15 ekil 2.7. Michelis Menten grafii. ...................................................................... 17 ekil 2.8. Lineweaver-Burk Erisi ....................................................................... 18 ekil 2.9. GOD reaksiyonunun ematik gsterimi (Witt et al., 2000). ................. 19 ekil 2.10. Bir enzim elektrodunun temel elemanlar. ......................................... 21 ekil 2.11. Amperometrik enzim elektrodu jenerasyonlar a) birinci jenerasyon amperometrik elektrotlar b) ikinci jenerasyon amperometrik elektrotlar c) nc jenerasyon amperometrik elektrotlar. ................................ 22 ekil 2.12. Enzim tabanl biyoyakt pili (Kim et al., 2006). .................................. 29 ekil 2.13. Baz iletken polimerlerin yaps (Ahuja et al., 2007). ......................... 30 ekil 2.14. Elektrokimyasal sentez ile heterohalkal polimerizasyon mekanizmas. X=NH, S ya da O. .............................................................................. 32 ekil 2.17. Kronoamperometride alma elektroduna uygulanan potansiyelin zamanla deiimi. .............................................................................. 36 ekil 2.18. Atomik kuvvet mikroskobunun ematik gsterimi. ............................ 37 ekil 3.1. Elektrokimyasal Potansiyostat-Galvanostat Cihaz. (Iviumstat,

Hollanda). .......................................................................................... 42 ekil 3.3. FADn molekler yaps. ..................................................................... 48

ix

ekil 3.4. Karbon elektrot yzeyinde elektrokimyasal oksidasyon ile fonksiyonel grup oluumu (Wei et al., 2008). ........................................................ 49 ekil 3.5. FAD ve fonksiyonel karboksilik asit gruplar arasnda kovalent balanma. .......................................................................................... 50 ekil 3.6. Polianili/poli(akrilik asit) kompozit film modifikasyonu (Raitman et al., 2002). ................................................................................................ 50 ekil 3.7. FAD ve fonksiyonel karboksilik asit gruplar arasnda kovalent balanma. .......................................................................................... 51 ekil 3.8. GOD enziminde FAD ve apo-enzimin ayrlmas. ................................ 51 ekil 3.9. Apo-enzimin FAD immobilize edilmi elektrot zerine yeniden yaplandrlmas. ................................................................................ 52 ekil 3.10. Elektrokimyasal alma istasyonuna bal l elektrot sistemi. ..... 53 ekil 3.11. Biyoyakt hcresi kurulumu. .............................................................. 55 ekil 4.1. Pirol elektropolimerizasyonu. .............................................................. 61 ekil 4.2. PPy iletken filminin ykseltgenmesi. ................................................... 61 ekil 4.3. PPy kapl ve kapsz karbon elektrotlarn dnml voltamogram (0.1 M, pH 7 PBS). .................................................................................... 62 ekil 4.4. Enzim konsantrasyonunun akm younluuna etkisi (50mM glukoz zeltisi, 0.1 M, pH 7.0 PBS). ............................................................ 63 ekil 4.5. Medyatr konsantrasyonunun akm younluuna etkisi (50mM glukoz zeltisi, 0.1 M, pH 7.0 PBS). ............................................................ 64 ekil 4.6. Enzim elektrodunun dnml voltamogram (0.1 M, pH 7.0 PBS). . 65 ekil 4.7. Farkl yklerde hazrlanan elektrotlarda glukoz konsantrasyonunun akm younluuna etkisi (0.1 M, pH 7.0 PBS). .................................. 66 ekil 4.8. Yk miktarnn akm younluuna etkisi (50 mM glukoz, 0.1 M, pH 7.0 PBS). ................................................................................................. 67 ekil 4.9. Enzim konsantrasyonunun elektropolimerizasyona etkisi. ................. 68 ekil 4.10. Enzim konsantrasyonunun akm younluuna etkisi (50 mM glukoz, 0.1 M, pH 7.0 PBS). ........................................................................... 69
x

ekil 4.11. Ferrosen-GOD reaksiyonu. ............................................................... 70 ekil 4.12. Medyatr konsantrasyonunun elektropolimerizasyona etkisi. ........... 71 ekil 4.13. Medyatr konsantrasyonunun akm younluuna etkisi. .................. 71 ekil 4.14. Enzim elektrodunun dnml voltamogram (0.1 M, pH 7.0 PBS). 73 ekil 4.15. Kapsz karbon elektrodun dnml voltamogram (0.1 M, pH 7.0 PBS). ................................................................................................. 74 ekil 4.16. H2SO4te elektrokimyasal aktivasyon. ............................................... 75 ekil 4.17. FAD bal karbon elektrodun dnml voltamogram (pH7, 0.1M PBS). ................................................................................................. 75 ekil 4.18. An-akrilik asit kopolimeri oluumu. .................................................... 76 ekil 4.19. FAD bal elektrodun dnml voltamogram (pH7, 0.1M PBS). .. 76 ekil 4.20. Elektrokimyasal olarak aktive edilmi karbon elektrot/FAD/apo-glukoz oksidaz enzim elektrodunun dnml voltamogram (pH7, 0.1M PBS). ................................................................................................. 77 ekil 4.21. An-akrilik asit kompozit filmi modifiye edilmi karbon

elektrot/FAD/apo-glukoz oksidaz enzim elektrodunun dnml voltamogram (pH7, 0.1M PBS). ........................................................ 78 ekil 4.22. Kovalent balama yntemiyle oluturulmu GOD elektroduna pHnn etkisi. ................................................................................................. 80 ekil 4.23. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu GOD elektroduna pHnn etkisi. .................................................................. 80 ekil 4.24. Kovalent bal GOD elektroduna scakln etkisi. ............................ 81 ekil 4.25. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu GOD elektroduna scakln etkisi............................................................... 82 ekil 4.26. Kovalent balama yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun kalibrasyon erisi (pH 7.5, 35C). ...................................................... 83 ekil 4.27. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun kalibrasyon erisi (pH 7.5, 35C). ................................ 83

xi

ekil

4.28.

Apo-enzimin

yeniden

yaplandrlmasyla

hazrlanan

enzim

elektrodunun kalibrasyon erisi (pH 7, 25C). ................................... 84 ekil 4.29. Kovalent balama yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun Lineweaver-Burk erisi. ..................................................................... 86 ekil 4.30. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun Lineweaver-Burk erisi................................................. 86 ekil 4.31. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun Lineweaver-Burk erisi................................................. 87 ekil 4.32. Kovalent balama yntemiyle oluturulmu anot ile kurulan biyoyakt hcresinin g younluu grafii. ...................................................... 90 ekil 4.33. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu anot ile kurulan biyoyakt hcresinin g younluu grafii. .......................... 90 ekil 4.34. Enzim elektrotlarna ait FTIR spektrumlar; a) Kovalent balama yntemiyle oluturulmu enzim elektrodu, b) Elektrokimyasal

immobilizasyon yntemiyle oluturulmu enzim elektrodu, c) Apoenzimin yeniden yaplandrlmasyla oluturulan enzim elektrodu. .... 93 ekil 4.35. Kovalent balama ynteminde elektrot hazrlama aamasndaki AKM grntleri a)PPy ile kaplanm karbon elektrot, b)PPy zerine kovalent balama yntemiyle DMAMFc ve GOD immobilize edilmi karbon elektrot. .................................................................................. 94 a)b) .................................................................................................... 95 ekil 4.36. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu enzim elektrodunun AKM grnts, a) yaln karbon elektrot, b)

elektrokimyasal immobilizasyon sonras karbon elektrot. .................. 95 ekil 4.37. Apo-enzimin yeniden yaplandrlarak oluturulan enzim elektroduna ait AKM grntleri a)An-akrilik asit modifiye edilmi karbon elektrot, b)An-akrilik asit/FAD modifiye edilmi karbon elektrot, c)An-akrilik asit/FAD/Apo-enzim modifiye edilmi enzim elektrodu. ..................... 96

xii

ZELGELER DZN Sayfa izelge 2.1. Kimyasal ve elektrokimyasal polimerizasyonun avantaj ve dezavantajlarnn karlatrmas ....................................................... 31 izelge 4.1. Farkl immobilizasyon yntemlerine gre hazrlanm enzim elektrotlarnn Km ve Imax deerleri. .................................................... 87

xiii

SMGELER ve KISALTMALAR DZN

ABTS AKM CV DMAMFc E0 FTIR GA GOD I Km mC OCP P PAn PBS PPy Py R V W

: 2,2-azinobis-(3-etilbenzotiozdin-6-sulfonik asit) : Atomik Kuvvet Mikroskobu : Dnml Voltametri : Dimetilaminometil Ferrosen : Standart Potansiyel : Fourier Transform Kzltesi Spektroskopisi : Glutaraldehit : Glukoz Oksidaz : Akm (A) : Michelis Menten Sabiti : Mili Coloumb : Ak Devre Potansiyeli : G (W) : Polianilin : Potasyum Fosfat Tamponu : Polipirol : Pirol : Diren () : Potansiyel (V) : Watt : Ohm

xiv

1.

GR ve ALIMANIN AMACI

Gnmzde tan ve proses kontrol amal kullanlan biyosensrler ve enerji retimi amacyla tasarlanan biyoyakt pili uygulamalar gibi geni spektrumda kullanlan enzim elektrotlarnn tasarm ve performans almalar youn bir aratrma konusudur. Enzim elektrotlar, biyokatalizr olarak enzim ile evirici olarak elektrodu birletiren, elektrokimyasal sistemlerin ana bileenidir. Bu konuda yaplan aratrmalarda ilk olarak, diyabet hastalarna ynelik kandaki glukoz takibi amacyla glukoz oksidaz (GOD) enzimi ile platin elekrodunu birletiren bir tasarm gerekletirilmi ve enzim elektrodu olarak isimlendirilmitir (Illanes, 2008). Bu amala, fizyolojik ortamlar ve fermantasyon proseslerinde bulunan glukozun tayini iin gelitirilen enzim elektrot tasarmlarnda, ucuz ve kolay temin edilebilir olmas nedeniyle de birok almada model enzim olarak GOD, elektrot tasarmlarnda kullanlmaktadr. ok sayda diyabet hastasnn varl, kan ekerini lebilen ucuz ve basit glukoz tayini yapabilen glukoz elektrotlar ihtiyacn dourmutur. Ayrca, glukoz elektrotlar, fermantasyon endstrisi gibi glukoz miktarnn kontrol edilmesi gereken alanlarda ve biyoyakt pillerinde anot bileeni olarak glukozun ykseltgenmesinde grev almaktadr. Biyosensr olarak kullanlan enzim elektrotlarda ksa srede, yksek seicilikte ve hassasiyette analiz yapabilme zellii, biyoyakt pilinde ise anot

olarak kullanmnda yksek akm younluuna sahip olmas istenen zelliklerdir. Enzim elektrotlarnn performans, enzim ve elektrot arasnda gerekleen elektron transferine baldr. GOD enzimi, bir kofaktr (flavinadenin dinkleotid, FAD) ve onu evreleyen bir glikoprotein klftan olumutur. Enzimin aktif merkezi olan kofaktr zerinde gerekleen indirgenme ykseltgenme tepkimeleri sonucu, kofaktr ile elektrot yzeyi arasnda oluan elektron transferi yetersizdir. Bunun nedeni, GOD enziminin kofaktr olan FADn glikoprotein klf tarafndan izole edilmi olmasdr. Bu sterik engel, elektron medyatrlerinin kullanm ve direkt elektron transferini salayacak konfigrasyonun elde edilmesi amacyla farkl immobilizasyon yntemlerinin uygulanmas ile almaya allmaktadr. Bu tez kapsamnda, GOD enzimi ile elektrot yzeyi arasnda elektriksel iletimin arttrlmas hedef alnmtr. Bu amala, elektrot tasarmnda farkl GOD immobilizasyon yntemleri uygulanm ve hazrlanan elektrotlarda enzimin aktif
1

merkezi ve elektrot arasndaki elektriksel iletimi incelenmitir. GOD elektrot tasarmnda enzimin glikoprotein klfnn iine difzlenerek elektron aktarm mesafesini ksaltmak, dolaysyla elektriksel iletimin artmasn salamak amacyla medyatr olarak dimetilaminometil ferrosen (DMAMFc) kullanlmtr. Medyatr varlnda GOD immobilizasyonu iin kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemleri uygulanmtr. Ayrca, direkt elektron transferi

salamak amacyla, elektrot zerinde GOD enziminin yeniden yaplandrlmas yntemi ile GOD elektrodu hazrlanmtr. Bu alma, apo-enzim ve kofaktrn ayrlmas, kofaktr ile elektrot yzeyinin modifiye edilmesi ve son aama olarak apo-enzim ile kofaktrn elektrot zerinde yeniden yaplandrlmas basamaklar ile gerekletirilmitir. Kovalent balama ynteminde enzim ve medyatr konsantrasyonu, elektrokimyasal immobilizasyon ynteminde polimerizasyon yk, enzim ve medyatr konsantrasyonu parametreleri incelenmitir. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde ise GOD kofaktrnn (FAD) karbon elektrot yzeyine balanabilecei farkl yntemler denenmi ve enzim elektrodu

hazrlanmas iin optimum koullar saptanmtr. Hazrlanan enzim elektrotlarn performans deerlendirmeleri kapsamnda ortam scakl ve pHsnn etkisi incelenmi ve saptanan koullarda alan elektrotlarn kalibrasyon erileri elde edilmitir. Elektrotlarn kalibrasyon grafikleri kullanlarak enzimin kinetik parametreleri (Km, Imax) saptanmtr. Sonular, hazrlanan elektrotlar iin karlatrmal olarak verilirken, literatre dayanarak yaplan deerlendirmeler sunulmutur. Sunulan tez kapsamnda hazrlanan GOD elektrotlarn performanslar, kullanm alanlarndan biri olan biyoyakt pilinde anot bileeni olarak test edilmi ve elektrot performanslar, ak devre potansiyeli, ksa devre akm younluu ve farkl direnlerde verdikleri g kt deerleri kapsamnda deerlendirilmitir. Son blmde ise kovalent balama, elektrokimyasal immobilizasyon ve apo-enzimin yeniden yaplandrlmas yntemleriyle oluturulmu enzim elektrot yzeyleri FTIR ve AKM teknikleri ile kimyasal ve topografik olarak karakterize edilmitir. Bu almada, elektron medyatrlerinin kullanm ve uygulanan farkl enzim immobilizasyon yntemleri ile elektriksel iletimde artn gzlendii GOD enzim elektrodu tasarm gerekletirilmitir.
2

2. 2.1.

GENEL BLGLER Enzim

Birok kimyasal reaksiyon kendiliinden gerekleir. Dier baz reaksiyonlarn belirli bir hzda gerekleebilmeleri iin ise katalizlenmeye ihtiyalar vardr. Katalizrler, substratn kimyasal olarak baka bir maddeye dnmn salamak iin gerekli enerji bariyerini indirgeyen molekllerdir. Termodinamik olarak bu enerji bariyeri serbest enerjideki deiim olarak da ifade edilebilir. Katalizrler, aktiflemi gei kompleksini oluturarak rn oluumunu salamak iin gerekli enerji bariyerini azaltrlar (ekil 2.1). Katalizrler reaksiyon srasnda

harcanmazlar ya da deiime uramazlar. dnmnde snrsz olarak kullanlrlar,

Prensipte substratn rne ancak pratikte bu katalizrn

stabilitesiyle snrldr. Katalizrlerin stabilitesi, reaksiyon koullarna gre aktif yaplarn muhafaza edebilme kapasiteleridir (Illanes, 2008).

ekil 2.1. Katalizr mekanizmas. Ea, katalizlenmemi reaksiyonun aktivasyon enerjisi; Ea, katalizlenmi reaksiyonun aktivasyon enerjisi; G, reaksiyonun serbest enerjisindeki deiim (Illanes, 2008). Canl organizmada meydana gelen birok biyokimyasal reaksiyon ise protein yapl spesifik biyokatalizrler olan enzimler tarafndan katalizlenir. Metabolizmada elektron aktarm, hidroliz, yapm, ykm gibi olaylardan sorumludurlar. Kimyasal katalizrlere gre spesifiklik ve katalitik g bakmndan stn molekllerdir. Sadece in vivo olarak deil belirli koullar salandnda in vitro olarak da etkin olduklar iin birok alanda kullanlmaktadrlar (Kuzu, 2008).
3

Enzimlerin 19. yzyldan sonra ortaya kt bilinmektedir. 1883 ylnda ekeri alt birimlerine paralayan aktif madde izole edilmi ve bu maddeye diastaz, daha sonra mide suyundan ekstrakte edilmi maddeye ise pepsin ad verilmitir. Bunlara ve dier aktif maddelere genel olarak fermentler denilmitir. 1878de Khne tarafndan Yunanca maya anlamna gelen enzume kelimesinden treyen enzim teriminin kullanlmas nerilmitir. Bcheners canl hcrenin olmad ortamlarda bile maya hcresi ekstraktnn ilave edildii heryerde eker fermantasyonunun gerekletiini gstermitir. 1926 ylnda Sumner, faslyeden reaz enzimini izole etmi ve kristalletirebilmitir. Bu almasyla 1947 ylnda Nobel dln almaya hak kazanmtr (Narl, 2006). 2.1.1. Enzimlerin Yaps

Enzimlerin karakteristik zellikleri molekler yaplarndaki farkllklardan gelir. Enzimler yzlerce amino asidin meydana getirdii proteinlerdir. Bu amino asitler birbirlerine bir amino asidin karboksil grubundaki karbon atomu ile bir sonraki amino asidin -amino grubundaki N atomunun peptid ba oluturmas ile kovalent olarak balanmlardr. Radikal grubunun zelliine gre amino asitler hidrofilik ya da hidrofobik zellik gsterebilirler. Bu amino asitlerin protein molekl zerindeki dalmlar ise molekln davrann belirler. Proteinlerin birincil yapsn amino asit dizilimi belirler. Birincil yapy belirleyen amino asitlerin dizilimi ise yapdaki deoksiribonkleotid dizilimi ile belirlenir. DNA zinciri ilk olarak mRNA moleklne kopyalanr ve bu bilgiye gre ribozomda

amino asit dizisi oluturulur. Son olarak sentezlenen polipeptid zinciri doal yap olarak bilinen boyutlu yapya evrilir. Proteinin boyutlu yaps genetik olarak belirlenir fakat evresel faktrlerden de etkilenir. nk protein molekl ortamdaki molekllerle de etkileim iindedir. Proteinin ikincil boyutlu yaps

ise birincil yapdaki amino asitlerin birbirleri ile etkileimleri sonucu oluur. Bu etkileimler genelde amid gruplar arasnda hidrojen balar oluumudur. Tersiyer boyutlu yap ise birincil yapda yer alan amino asitlerin etkileimleri ile sk ve sarmal bir konfigrasyon oluturmalar sonucu oluur. Bu yapda ounlukla yzeyde hidrofilik amino asitler yer alr iken i ksmda hidrofobik amino asitler yer almaktadr. Proteinin biyolojik fonksiyonu iin tersiyer yap temeldir. Baz enzimler kuaterner boyutlu yapya sahiptir. zellikle dzenleyici proteinler bu grup

iindedir. Kuaterner yap farkl polipeptid zincirlerinin etkileimi sonucunda oluur (Bugg, 2004). boyutlu yapnn olumas iin temel etkileimler aadaki gibidir; Hidrojen balar: Protonlanm bir elektronegatif atom ile bir dier elektronegatif atomun etkileimi sonucu oluur. Hidrojen ba kovalent bada depolanan enerjinin onda birine sahiptir. Bu da globler proteinlerin heliks yapsnn oluumunda belirleyicidir. Ayrca bu zellik tersiyer yap oluumu iin de nemlidir. Apolar etkileimler: Hidrofobik amino asit ularnn su gibi polar zcler karsnda ortak itme kuvvetlerinin sonucu oluurlar. Kuvvetli kimyasal bir ba deildir ancak proteinin boyutlu yapsnn stabilizasyonuna katks vardr. Dislfit kprleri: Sistein molekllerinin oksidasyonu sonucu oluurlar. zellikle dk molekl arlkl proteinlerin boyutlu yapsnn stabilizasyonunu salarlar. Ykl amino asit birimleri arasndaki iyonik balar: Amino asitleriin bulunduu ortamdaki iyonlarla etkileimi sonucu oluur. Proteinlerin boyutlu yapsnn oluumuna katk salarlar. Dier zayf etkileimler: Van der Waals gibi proteinin boyutlu yapsnda ok nemli rol olmayan kuvvetlerdir. 2.1.1.1. Aktif Merkez Enzimatik reaksiyonlarn gerekleebilmesi iin substratn enzime balanmas gerekir. Enzimler tek substrata spesifik olabilecei gibi birden fazla substratla da balanarak bir veya daha fazla reaksiyon rn oluturabilirler. Enzimatik reaksiyonlarda substrat bir metabolitken dier reaktant su molekl gibi baka bir metabolit ya da metal iyonu olabilir ancak her durumda dier reaktant bir koenzimdir. Substartlara ek olarak enzimler inhibitr, aktivitr, allosterik aktivitr ya da inhibitr gibi spesifik molekllerle de balanabilirler. Metal iyonlar gibi inorganik ya da organik bileenler olabilen koenzimler, enzimlerin reaksiyonlar katalizlemesini saladklar iin reaksiyonlarda olduka nemli rol oynarlar. ekil 2.2de temel koenzimlerin yaps listelenmitir.

ekil 2.2. Baz koenzimlerin yaps (Illanes, 2008). Enzim substrat kompleksindeki stabilizasyonu salayan kovalent olmayan etkileimler protein yapsnn stabilizasyonu salayan etkileimlerle ayndr. Enzimlerin zerinde spesifik substratlarn balanabilmesi iin aktif merkez de denilen bir blm yer alr. Enzim ve substrat arasnda boyut olarak byk farkllk

vardr. Bunun sebebi substratn, koenzimin, metal iyonlarnn ve protonlarn balanmasndan sorumlu olan aktif blgenin ok kk olmasdr. Akitf merkez enzim yzeyi zerinde girinti ya da cep eklinde bulunur. Substrat tamamlaycs yapsndadr. Substrat ile enzimin protein ksm arasnda oluan hidrojen balar ve substratn apolar ksm ile proteinin apolar ksm arasnda ykl molekllerden dolay meydana gelen etkileimler enzim substrat kompleksinin oluumunda rol oynarlar. Enzimler tarafndan katalizlenen tm reaksiyonlar,

reaktantlarn enzim yzeyi zerindeki aktif merkeze adsorbland yerde gerekleir. Bundan dolay aktif blge, enzim kinetii ve enzimolojideki kinetik ve mekanik kavramlar asndan ok nemlidir. Bu kavram, molekllerin

arpmasna dayal kimyasal reaksiyonlar ile adsorpsiyona dayal enzimatik reaksiyonlar arasndaki temel fark oluturur (Bugg, 2004). 2.1.2. Enzimlerin Snflandrlmas

Enzimler, Uluslar aras Biyokimya ve Molekler Biyoloji Biriminin (IUBMB) simlendirme Komitesinin verdii kararla katalizledikleri reaksiyon trne gre 6 kategoride snflandrlmaktadr. IUBMBnin Enzim Komitesi (EC) tarafndan her enzime 4 haneli bir numara verilmitir. lk numara snf, ikinci numara alt snf, nc numara alt grubu, drdnc numara ise alt grup ile ilikisini ifade etmektedir (Illanes, 2008). Uluslararas snflandrmaya gre enzimler alt snfa ayrlmtr: 1. Oksidoredktazlar: elektronlarn hidrojen ya da oksijen atomlarnn transferini kapsayan indirgenme ykseltgenme reaksiyonlarn katalizlerler. 2. Transferazlar: Bir donrden uygun bir akseptre fonksiyonel grup transferini katalizlerler. 3. 4. Hidrolazlar: Kimyasal balarn su varlnda hirolizini katalizlerler. Liyazlar: Kimyasal balarn hidrolitik ve oksidatif olmayan ayrlma

reaksiyonlarn katalizler. 5. 6. zomerazlar: Bir substratn bir izomere dnm reaksiyonlarn katalizler Ligazlar: ki molekln kovalent balanma reaksiyonlarn katalizler.
7

2.2.

Enzim mmobilizasyonu

Biyosensrler ve enzimatik yakt pilleri alanndaki gelimeler arttka enzim aktivitesi kayb, enzim mr ve stabilitesiyle ilgili problemler de artmaktadr. Bunlara ek olarak enzimatik cevap sresinin ksal ve tek kullanmlk cihazlara olan ihtiyacn artmas da sz konusudur. Bu problemlerin stesinden gelebilmek iin farkl immobilizasyon yntemleri gelitirilmitir. letken bir yzey zerine enzim immobilizasyonu yaplrken uygulanan yntem oluturulan elektrokimyasal cihazn performansyla birinci dereceden ilikilidir (Ahuja et al., 2007). Bu sebeple enzim moleklnn etkin bir ekilde yzeyde tutunabilmesi iin uygulanan immobilizasyon ynteminin; Enzimin evirici yzey zerine etkili ve stabil bir ekilde tutunmasn salamas, Enzimin biyolojik zelliklerini etkilememesi, Biyouyumlu ve kimyasal olarak inert olmas gerekmektedir.

Enzim, bir yzey zerine immobilize edilirken, seilen yntem ok nemlidir. Uygulanan yntem enzimin aktif merkezindeki kimyasal yapy ya da reaktif gruplar deitirerek enzim aktivitesinde bir kayba sebep olmamaldr. Bir baka deyile enzim immobilizasyonu enzime olabildiince az hasar vererek yaplmaldr. Enzimin aktif merkezi hakkndaki bilgilerin fazla olmasyla bu hasar minimuma indirilebilir. 2.2.1. Enzim mmobilizasyonu Yntemleri

2.2.1.1. Tayc Bir Yzeye Balama Tayc bir yzey zerine balama bilinen en eski enzim immobilizasyon yntemidir. Bu yntemde balanan enzim miktar ve immobilize enzim aktivitesi tayc yzeyin zelliklerine baldr. ekil 2.3 tayc yzey zerine bal enzim molekln ematize etmektedir.

ekil 2.3. Tayc yzeye bal enzimin ematik gsterimi. Tayc yzey seilirken enzimin baz zellikleri dikkate alnmaldr. Bunlar aadaki gibi sralanabilir. Partikl bykl Yzey alan Hidrofilik ve hidrofobik gruplarn molar oran Kimyasal bileim

Genel olarak hidrofilik gruplarn oran ve enzim miktarndaki art, immobilize enzimin daha yksek aktiviteye sahip olmasyla sonulanmaktadr. Enzim immobilizasyonu iin yaygn olarak kullanlan tayc yzeyler arasnda selloz, dekstran, agaroz ve poliakrilamid jel bulunmaktadr (Goel, 1994). Balanma ekline gre, tayc yzey zerine balama yntemleri eitlilik gstermektedir. Fiziksel Adsorbsiyon Bu method, enzim proteininin suda znmeyen bir tayc zerine fiziksel adsorbsiyonunu temel almaktadr. Enzim moleklnde ve aktif blgede hemen hemen hibir hasara ve konformasyonal deiime yol amayan bir immobilizasyon yntemidir. Eer uygun bir tayc yzey bulunursa hem ucuz hem de kolay olabilmektedir. Ancak enzim ve tayc arasnda oluan kuvvetlerin zayflndan dolay kullanm srasnda, adsorbe olmu enzim tayc yzey zerinden
9

ayrlabilmektedir. Enzimlerin fiziksel adsorbsiyonu iin uygulanan baz yntemler aadaki gibidir. Statik ilem Elektro-boalm Reaktrde bekletme alkalama ya da kartrma banyosunda bekletme

Genel bir immobilizasyon methodu olan adsorbsiyonun ana avantaj balama iin kimyasal madde kullanlmamas ve aktivasyon iin minimum basamaa ihtiya duyulmasdr. Adsorbsiyon kimyasal balama yntemlerine gre enzim proteinine daha az zarar vermektedir. nk adsorbsiyonda balanma, hidrojen balar, oklu tuz kprleri ve Van der Waals kuvvetleriyle olmaktadr. Oluan zayf balardan dolay ortam pHsnn, scakln, iyonik kuvvetlerin deiimiyle ve substrat varlyla enzim proteininin tayc yzey zerinden desorbsiyonu gzlenmektedir. Bir dier dezavantaj ise ok spesifik bir yntem olmamasndan dolay dier proteinlerin ve maddelerin immobilize edilecek enzim gibi

kullanlmasdr. Bu durum immobilize enzimin zelliklerini deitirmekte ve reaksiyon hzn drmektedir (Goel, 1994). yonik Balama yonik balama yntemi enzim proteininin suda znmeyen iyon deiimini salayan maddeler ieren bir tayc yzey zerine iyonik olarak balanmasna dayanmaktadr. yon deiim merkezleri ieren polisakkaritler ve sentetik polimerler bu amala yaygn olarak kullanlmaktadrlar. Enzimin tayc yzey zerine balanmas

kovalent balamada olduu gibi ortam koullarna ok bal olmadndan kolaylkla gerekletirilebilmektedir. Ayrca bu yntem konformasyonda ve enzimin aktif blgesninde ok az deiime sebep olmaktadr. Bu sebeple yksek aktivite grlmektedir. Enzimin tayc yzey zerinden ayrlmas gibi durumlar yksek iyonik kuvvete sahip substrat zeltilerinde ve pH deiimlerinde olmaktadr. Bunun sebebi
10

tayc yzey ile enzim arasnda oluan balayc kuvvetlerin kovalent balamada olduu kadar kuvvetli olmamasdr. yonik balanma ve fiziksel adsorbsiyon arasndaki ana fark iyonik balamada tayc yzey ile oluturulan balarn daha kuvvetli olmasdr (Goel, 1994). Kovalent Balama Kovalent balama enzim ve tayc matriks arasnda kovalent balarn olutuu en sk kullanlan immobilizasyon yntemidir. Proteinin immobilize edilecei

reaksiyon tipi seilirken 1) balanma reaksiyonunun gerekletii koullarda enzim aktivitesinin kaybolmamasna, 2) kullanlan kimyasallardan dolay enzimin aktif blgesinin etkilenmemesine dikkat edilmelidir. Kovalent balama yntemi enzim ve suda znmeyen bir tayc yzeyin kovalent gruplardr. Oluan balara gre bu yntem, diazo, peptid ve alkilasyon yntemleri gibi alt gruplara ayrlabilir. Kovalent balama fiziksel adsorbsiyon ve iyonik balama gibi yntemlere gre daha komplekstir ve immobilizasyon iin gerekli artlar daha fazladr. Bu sebeple kovalent balama enzimin konformasyonunu deitirebilecei gibi enzimin aktif blgesini de etkileyerek aktivite kaybna sebep olabilir. Ancak enzim ve tayc yzey arasndaki balanma kuvvetleri ok gl olduundan yksek iyonik gteki bir zeltide bile enzimin tayc yzey zerinden desorbsiyonu gibi bir durum kovalent balamada sz konusu olamaz. 2.2.1.2. apraz Balama Bu yntemde enzim immobilizasyonu, enzim proteinlerinin dier protein balanmas temeline dayanmaktadr. Bu balama ynteminde

oluabilecek baz fonksiyonel gruplar karboksil, amino, hidroksil ve slfidril

molekllerine ya da fonksiyonel gruplara molekller aras apraz balanmasyla gerekleir. Enzim molekllerinin birbirlerine apraz balanmas hem pahal hem yetersiz bir yntemdir nk protein moleklleri ana destek maddesi yerine geeceklerdir. Bu da dk enzim aktivitesine sebep olacaktr. Genel olarak apraz balama dier yntemlerle ska kullanlmaktadr. zellikle adsorbe olmu enzimlerin stabilizasyonunu salamak iin ve poliakrilamid jellerden enzimin ayrlmasn engellemek iin kullanlr.
11

ekil 2.4te apraz bal enzim molekl ematik olarak gsterilmitir.

ekil 2.4. apraz bal enzimin ematik gsterimi. apraz balamada en sk kullanlan balayc ajan gluteraldehittir. Balanma reaksiyonlar ar koullarda gerekleir. Bu koullar enzimin aktif blgesinde konformasyon deiikliklerine yol aabilecei gibi enzim aktivitesine de sebep olabilmektedir. 2.2.1.3. Tutuklama Enzim tutuklama yntemi, enzim moleklnn polimer ya da membran matrisinin rg yapsnn ierisine lokalizasyonunu temel almaktadr. Bu tutuklama ilemi enzim substratnn difzyonuna izin verecek ekilde yaplr. Difizyonu salayan bu yap kafes (lattice) ve mikro kapsl olmak zere ikiye ayrlr. ekil 2.5te tutuklanm enzim moleklleri ematik olarak gsterilmitir.

ekil 2.5. Tutuklanm enzimlerin ematik gsterimi. Bu yntem, enzimin bir jel ya da membran matrisine balanmamasndan dolay kovalent balama ve apraz balamaya gre farkllk gstermektedir. Bu da geni kullanm alan salamaktadr. Ancak kimyasal polimerizasyon reaksiyonlarnda uygulanan koullar enzim aktivitesini drebilmektedir. Bundan dolay enzim immobilizasyonu iin uygun koullarn salanmas ok nemlidir.

12

Kafes tipi tutuklama apraz olarak balanm, suda znr polimer moleklleri arasndaki boluklara enzimin hapsedildii yntemdir. Poliakrilamid, polivnilalkol gibi baz sentetik polimerler ve niasta gibi doal polimerler bu yntem ile enzim

immobilizasyonunda kullanlmaktadrlar. Mikrokapsl tipi tutuklama Enzim moleklnn yar geirgen polimer membranlar ile kaplanmas yntemidir. Enzim mikro kapsllerinin hazrlanmas ok iyi kontrol edilebilen koullar gerektirmektedir. 2.2.2. Apo-enzimin Yeniden Yaplandrlmas

Amperometrik biyosensrler ve biyoyakt pili bileenleri gelitirmek iin redoks enzimlerinin elektrotla arasndaki elektriksel iletimin gelitirilmesi temeldir (Katz et al., 1999). Protein molekllerinin redoks merkezleri yaklak 70A-150A derinde protein matrisi iine gml bulunmaktadr. Redoks merkezlerinin elektrot yzeyinden protein matris sebebiyle uzaysal, sterik ayrm sonucunda, protein matrisi elektron transferinde bariyer rol oynamaktadr (Willner et al., 2006). Son yllarda yaplan almalar redoks proteini ve elektrot arasnda elektriksel iletiminin gelitirilmesi ve protein matrisinin sebep olduu sterik engeli amak zerinedir. Bu sorunun almas iin elektron transfer mesafesini ksaltan ve proteinin redoks merkezi ve elektrot arasnda elektron aktarmn salayan medyatr moleklleri yaygn olarak kullanlmaktadr. Bu difze olabilen elektron medyatrleri protein matrisi iine girip karak elektron tanmn salamaktadrlar. Ferrosen, potasyum ferrosiyanid, ruthenyum ve osminyum kompleksleri ska kullanlan elektron medyatrleri arasndadr (Bott, 2004). Benzer olarak elektron medyatrlerinin proteinlere kovalent olarak balanmas da elektron transfer mesafesini ksaltmakta ve enzimin redoks aktif polimerik hidrojeller iine katklanmas da redoks enzimi ve elektrot arasndaki elektriksel iletimin gelitirilmesini salamaktadr. Bu yntemler baarl bir ekilde

uygulanmakta ve pratikte de bu yntemleri baz alarak tasarlanm biyosensrler pazarda yerini almaktadr. Ancak baz deikenlerin daha temel bir aratrmaya ihtiyac vardr. Redoks enzimi ve elektrot arasndaki elektriksel iletimin salanmas
13

iin uygulanan stratejiler baarl olmasna ramen redoks enzimi ve onun doal elektron akseptr arasndaki elektriksel iletim hala etkin deildir. Bu yetersiz elektriksel iletimin sebebinin, enzimin uygun olmayan sterik pozisyonlarda, polimerler iine katklanrken ya da immobilizasyon srasnda elektrot yzeyine dzensiz konumlanmasndan kaynakland grlmtr (Zayats et al., 2008). Enzimin redoks merkezi ve elektrot yzeyi arasndaki elektriksel iletimin arttrlmasna ynelik en yeni yaklam enzimin yeniden yaplandrlmasdr. Enzimin yeniden yaplandrlmas yar sentetik kofaktrlerle yeni zelliklerde yar sentetik enzim molekl oluturmak iin uygulanr. Kofaktrle modifiye edilmi elektrot materyali zerine apo-enzimin yeniden yaplandrlmas iin birok yaklam bulunmaktadr. Apoflavoenzimin bir elektron medyatr ve FAD ile modifiye edilmi elektrot zerine yaplandrlmas elektriksel iletkenlii arttrlm enzim elektrodunu oluturmaktadr. Bu ekilde tasarlanm bir enzim elektrodunda tm enzim moleklleri elektrot yzeyine doru konfigrasyonda balandndan ve elektron medyatr kofaktr ve elektrot arasnda olduundan elektron transferi ok etkili bir ekilde gereklemektedir (Katz et al., 1999). Bu tr yntemlerde GOD apo-enziminin eldesi iin birok yntem bulunmaktadr. Bunlardan birisi tampon zelti ierisinde enzim zeltisinin pH 1.4e kadar amonyum slfat ile asitlendirilmesi ardndan santrifjlenmesi ile elde edilir. Elde edilen apo-enzimin kofaktr modifiye edilmi elektrot yzeyine immobilizasyonu ise 4-12 saat inkbasyon ile salanr (Savitri and Mitra, 1998). ekil 2.6da elekriksel iletimi, apo-enzimin redoks medyatr ve koenzim ile modifiye edilmi elektrot yzeyi zerine yeniden yaplandrlarak arttrlm bir enzim elektrodu grlmektedir.

14

ekil 2.6. Yeniden yaplandrlan enzim moleklnn ematik gsterimi (Zayats et al., 2008). 2.3. 2.3.1. Enzim Kinetii Enzim Aktivitesi

Birok enzimatik reaksiyonunun balang aamasnda enzimin meydana getirdii deiim sadece substrat konsantrasyonuyla orantldr. Kullanlan yntem enzim zeltisi konsantrasyonundan bamsz sonular vermelidir. Enzim aktivitesi

enzimin optimum pH, scaklk, subtrat konsantrasyonunda ve aktivitr maddelerin varlnda belirlenir. Enzimin kullanld uygulama alanlarnda en nemli bilgi onun spesifik aktivitesidir. Spesifik aktivite belirli koullar altnda enzimin reaksiyonu

katalizleyebilme zelliidir. Bu da birim zamanda enzimin miktar bana retilen rn ya da reaksiyona giren substrat miktarnn bir lsdr (Mutlu et al., 1997). Enzim aktivitesi birim olarak ifade edilir. Belirli koullar altnda belirli bir miktarda substratn deiime ya da ykma urad miktar birim aktivite olarak adlandrlr. Birim says, toplam enzim-polimer konjugatnn miligramnda, dakikada rne

dnen substratn mikromol cinsinden miktar olarak tanmlanr. Enzim aktivitesini aklamann bir baka yolu da spesifik aktiviteyle olmaktadr. Spesifik aktivite, belirli koullar altnda proteinin miligramnda dakikada rne dnen substratn mikromol cinsinden miktardr (Blkbayram, 2005).

15

2.3.2.

Michelis ve Menten Kinetii

Enzimin katalitik etkinlii genellikle kimyasal reaksiyon hzna yapt etkinin llmesiyle belirlenir. Enzim katalizli realsiyonlar ilk olarak 19. yzyln sonlarnda allmtr. 1913 ylnda Michelis ve Menten substrat konsantrasyonu deiirken, enzim konsantrasyonu, pH, scaklk gibi parametreleri sabit tutarak skrozun balang hzn lmlerdir. Bunun

invertaz katalizli hidroliz reaksiyonunun

sonucunda bir enzim-substrat kompleksi olutuu bulunmu ve substrat konsantrasyonu arttka reaksiyon hznn da hiperbolik olarak maksimuma ulat grlmtr. Michelis ve Menten tek substrat, tek ara rn ve serbest enzim-enzim substrat kompleksi arasnda denge ieren enzim katalizli reaksiyonlar iin bir hz eitlii tretmilerdir. Aadaki reaksiyon mekanizmas nerilmitir.
k +1 k +2 E+S ES E + P k 1

E, serbest enzim; S, substrat, ES enzim-substrat kompleksi ve P reaksiyon rndr. ESnin rne ykm hznn, ESnin enzim substrat iine dalmasndan ok daha yava olduu varsaylmaktadr. Michelis ve Menten, eitliklerini bu varsaym baz alarak oluturmulardr bundan dolay;

k + 2 << k 1
Ancak michelis ve mentenin formlasyonu enzim katalizinin ilk basaman ilgilendirdiinden hz sabitleri asndan gereksiz ve yersiz varsaymlardr. Bu konuda Briggs ve Haldane balang reaksiyon hz asndan daha geerli bir nermede bulunmulardr. Buna gre neredyse reaksiyon baladktan hemen sonra ara rn(enzim-substrat kompleksi) konsantrasyonunun sabit kald durgun hale ulalr.

d[ES] / dt = k+1 [E][S] - k-1 [ES] - k+2 [ES] = 0

Toplam enzim konsantrasyonu, [E]0 ; [E] ve [ES]nin toplam olarak yazlabilir. d[ES]/dt=k+1[E]0[S] - (k+1[S] + k-1 + k+2) [ES] = 0

(2.1)

(2.2)

16

E. 2.2, k+1e blnerek [ES] iin zlr,

[ES] =

[E]0 [S] (k 1 + k + 2 ) / k +1 + [S]

(2.3)

Aadaki eitlik elde edilir. V = k + 2 [ES] = Vmax [S] K m + [S] k + 2 [E]0 [S] (k 1 + k + 2 ) / k +1 + [S] (2.4)

V=

(2.5)

Km Michelis sabiti olarak bilinir, enzim substrat kompleksinin dalm iin bir denge sabiti ve tersinir olarak etkili olan enzimin substrata affinitesiyle ilgilidir. Vmax reaksiyonun maksimum hzdr. Tm enzim, enzim-substrat kompleksi formunda olduunda elde edilir. Grlmektedir ki bu teori ve eitlik tm enzim kinetik lmleri iin standart olan deneylerin kesinliinden dolay invertazla ilgili sonular olduka kesin olarak hesaplayabilmektedir. Bugn Michelis ve Menten modern enzimolojinin kurucular olarak bilinmektedir. bilinmektedir. Michelis Menten eitliine uyan sabit enzim konsantrasyonunda substrat konsantrasyonunun fonksiyonu olan balang reaksiyon hz ekil 2.7de verilmitir. Genellikle E. 2.5 Michelis Menten eitilii olarak

ekil 2.7. Michelis Menten grafii.

17

ekil 2.7de de grld gibi ok dk substrat konsantrasyonlarnda hz, [S] ile orantldr. Bundan dolay anlalmaktadr ki Sde reaksiyon birinci derecedendir. ok yksek substrat konsantrasyonlarnda ise hz Vmaxa yaklar ve reaksiyon Sde sfrnc derecedendir. Bu durumda enzimin substratla doygunlua ulat sylenebilir. Farkl substrat konsantrasyonlarnda bir dizi balang hzlar llecekse Michelis ve Menten eitliinin grafiksel gsterimi uygundur. Bu ekilde Km ve Vmax kinetik parametreleri belirlenebilir. Ancak Sye kar V grafii izildiinde dikdrtgensel bir hiperbol elde edilir ki bu hiperboln izim zorluundan ve asimptotlarn tahmin zorluklarndan dolay istenmez. Bu nedenle kinetik parametrelein belirlenmesi iin enzim katalizli reansiyonlarda lineer bir iliki daha yararl olacaktr. Lineweaver ve Burk, Michelis ve Mentenin eitliini dz bir doru zerinde iaretlemeye imkan tanyan bir formda tekrar yazmlardr.
K 1 1 1 = m + V Vmax [S] Vmax

(2.6)

1/Sye kar 1/V grafii izildiinde dz bir doru elde edilmektedir. Bu dorunun eimi Km/Vmax, y eksenindeki kesim noktas ise 1/Vmax vermektedir (ekil 2.8).

ekil 2.8. Lineweaver-Burk Erisi

2.4. Glukoz Oksidaz

Glukoz Oksidaz enzimi (GOD) (EC. 1.1.3.4, -D-glukoz:oksijen oksidoredktaz) D-glukopiranoza (6 karbonlu glukozun hemiaketal formu) balanr ve eker moleklnn molekler oksijen ile ykseltgenip glukono--lakton (glukono-1,518

lakton) ve hidrojen peroksidin (H2O2) olutuu reaksiyonun katalizlenmesini salar (zylmaz, 2005). Reaksiyon ekil 2.9de gsterilmitir.

ekil 2.9. GOD reaksiyonunun ematik gsterimi (Witt et al., 2000).

2.4.1. Glukoz Oksidazn Genel zellikleri

Glukoz oksidaz enzimi kanda, rede, gdalarda ve dier biyolojik sistemlerde glukozun analitik olarak llmesinde yaygn olarak kullanlmaktadr. Glukoz Oksidaz enzimi ilk defa 1928 ylnda Muller tarafndan Aspergillus niger ve
Penicillium glaucumda kefedilmitir. Dana sonra Aspergillus oryzae, Penicillium anagaskiense ve Penicillium notatum gibi dier kflerde de rastlanmtr. Yksek

organizmal bitkilerde ve hayvanlarda rastlanmamtr. Glukoz oksidaz enzimleri farkl kaynaklardan elde edilmi olsalar bile benzerlik gsterirler. Molekl arlklar yaklak 160,000-180,000 arasndadr. Bir mol enzim 2 mol FAD ierir ve izoelektrik noktalar yaklak pH 4.2dir. almalarda en yaygn kullanlan Glukoz Oksidaz A. Nigerden elde edilen molekl arl 186,000 olan dimerdir (Richardson and Findlay, 1985).
A. Niger GODsinin her alt birimi bir mol FAD bulundurmaktadr. GOD moleklnn

%74 protein, %16s ntral eker ve %2si amino ekerinden olumaktadr. Ag+, Hg+, Cu+2 GOD enziminin balca inhibitrleridir (zylmaz, 2005).
2.4.2. Glukoz Oksidazn Reaksiyon Mekanizmas

Glukoz oksidaz, -D-glukozu elektron alcs olarak molekler oksijeni kullanarak D-glukono--laktona ve H2O2ye oksidasyonunu katalizleyen bir flavo proteindir. Bu
19

reaksiyon, indirgeyici ve ykseltgeyici basamak olmak zere 2ye ayrlr. ndirgeyici yar reaksiyonda GOD katalizler. Bunun yar -D glukozun D-glukono--laktona oksidasyonunu GODn ise FAD halkas FADH2ye oksijenle indirgenir. yeniden

sonucunda reaksiyonda

Ykseltgeyici

indirgenmi

GOD

ykseltgenerek H2O2 aa kar (Bankar et al., 2009).

2.5. Enzim Elektrodu

Enzim elektrodu, zerine ince bir tabaka halinde enzim modifiye edilmi elektrokimyasal bir sensrdr (Updike and Hicks, 1967). Genellikle enzim tabakas ve zelti arasna, enzim tabakas ve elektrot arasna ya da ikisi arasna da yar geirgen bir membran modifye edilmiitir. rnek, herhangi bir n ileme tabi tutulmadan, oluturulan probla direk olarak lm yaplr. Prob analit zeltisiyle temas ettiinde substrat enzim tabakasnn iine doru difzlenir. Birok enzimatik reaksiyon sonucunda elektrotla llebilen retilen ya da tketilen trler olur. Enzimatik reaksiyonun sonucu olarak substrat ve rn konsantrasyonu deiir ve belirli bir sre sonunda rn retimi ve substrat tketimi hznn eit olduu kararl konuma ulalr. Elektroaktif trlerin konsantrasyonlar potansiyometrik ya da amperometrik olarak kontrol edilir ve elektrokimyasal sinyal substrat konsantrasyonunun llmesi iin ilikilendirilebilir (Illanes, 2008). Enzim elektrotlarnn en temel iki unsuru enzim ve elektrot materyalidir. Enzim elektrodunda elektrot materyali seilirken elektriksel iletkenlik ve sertlie nem verilmelidir. Bu sebeple enzim elektrotlarda kullanlan elektrotlar genelde yaprak ya da ubuk eklinde; platin, altn karbon gibi kat destek materyallerinden oluturulmaktadr. Kullanlacak enzimin seimi ise gerekleecek tepkime ve analite gre yaplr. Oksidoredktaz enzimleri amperometrik enzim elektrodu tasarmlarnda yaygn olarak kullanlan enzimlerdir. Glukoz oksidaz, reaz, alkol dehidrogenaz,

peroksidaz, katalaz, billirubin oksidaz ve laktat oksidaz bu enzimlerden bazlardr. Enzim modifiye edilmi elektrot sistemleri ok bileenli sistemlerde hzl analize imkan tandklarndan ve yksek hassasiyette lm yapmalarndan dolay evre, tp, analitik kimya gibi alanlarda uygulama alan bulmaktadr.

20

Enzim bazl bir amperometrik elektrot, kimyasal seici tabaka olarak bir enzimden, evirici olarak bir elektrottan, elektrodun bal olduu bir amplifikatrden ve sonularn okunaca bir ekrandan oluur (Sarma et al., 2009) (ekil 2.10).

ekil 2.10. Bir enzim elektrodunun temel elemanlar.

2.5.1. Amperometrik Enzim Elektrodu Jenerasyonlar

Amperometrik biyosensrlerin tasarm iin redoks enzimi ve elektrotlar arasndaki elektronik balant; enzim substratnn ya da rnn elektroaktivitesini (birinci jenarasyon); rekods medyatrlerinin serbest halde ya da immobilize olarak

biyomoleklle kullanmn (ikinci jenarasyon), ya da enzimin rekods aktif blgesi ile elektrot yzeyi arasnda direk elektron transferini (nc jenerasyon) baz alr. ekil 2.11 amperometrik elektrotlarn geliimdeki farkl yaklamlar ematik olarak gstermektedir (Freire et al., 2003).

21

ekil 2.11. Amperometrik enzim elektrodu jenerasyonlar a) birinci jenerasyon amperometrik elektrotlar b) ikinci jenerasyon amperometrik elektrotlar c) nc jenerasyon amperometrik elektrotlar. Birinci jenerasyon elektrotlarda ok yksek potasiyel uygulanmas en byk eksikliktir. Bu sorun kk redoks aktif molekller olan, enzimin redoks aktif merkezi ile elektrot yzeyi arasnda elektron transferini salayan medyatrlerin (ferrosen trevleri, ferrosiyanid, iletken organik tuzlar ve kuinonlar) kullanlmasyla almaktadr. Birok redoks enzimi bazl elektrotlar iin medyatrlerin kullanm uygulanan potansiyeli drr. Buna ek olarak medyatrler kullanldklar elektrotlarda lineer cevap araln arttrmaktadr. Ayrca glukoz elektrotlarnda tahmin edilen elektrot mrn uzatrlar nk enzim iin zararl olan hidrojen peroksit medyatr kulanld durumda retilmemektedir. Ne yazk ki, medyatrler sadece redoks enzimleri ile balanarak enzim ve elektrot arasnda elektron transferini salamaz ayn zamanda eitli reaksiyonlara da sebep olurlar (Jusoh and Aziz, 2006).
22

Redoks medyatrlerinin elektrot ve enzim moleklleri arasnda kullanm iin birok yaklam bulunmaktadr. Ancak uygulanan birok immobilizasyon ynteminin kinetik adan dezavantajlar bulunmaktadr. Kinetik kstlamalarn ou enzim ve medyatrn elektrot yzeyine asimetrik yklenmesi ve immobilize konumda medyatrn hareketliliinin kstlanmasndan kaynaklamaktadr. Tasarlanan

elektrot kullanlmadan nce enzim medyatr oran sabittir ancak elektrokimyasal ilem boyunca bu oran immobilize formdaki medyatrn anyonik ve katyonik formlarnn stabilitesine bal olarak deimektedir. Bu deiim sebebi elektron medyatrlerinin znrldr (Pandey et al., 1997). Uygulanan immobilizasyon yaklamlarnn tmnn hedefi redoks medyatrlerinin znrlnden dolay elektrot yzeyinden desorbe olmasn nlemektir. Bu amala redoks medyatrlerinin elektrot yzeyine absorbe ve immobilize edilmesi de medyatrlerin znrlk sorununu tamamen zememektedir. Son yllarda yaplan almalar redoks medyatrlerinin iletken polimerler ve iyon-deiimli membranlarla birlikte kullanlmasnn bu sorunu byk oranda zdn gstermektedir (Vaillancourt et al., 1998). nc jenerasyon biyosensrlerde elektron transferi substratn rne katalitik dnmyle ilgilidir. Redoks enzimi elektrot ve substrat molekl arasnda medyatr olmadan elektron transferini arttrarak bir elektrokatalizr grevi grr. Bu tr biyosensrler genellikle daha iyi seicilik gsterirler, nk baka reaksiyonlara sebep olmadan enzimin redoks potansiyeline yakn potansiyelde alabilirler. Biyomolekl ve elektrot yzeyi arasndaki balantnn gl olmas bu tr biyosensrlerin hassasln arttrmaktadr. Son zamanlarda yaplan almalar yksek performansl amperometrik biyosensrler iin redoks enzimi ve elektrot arasnda elektron transferinin gelitirilmesi zerine zerine younlamtr. Bu sistemlerin baka bir gelecei ise direk elektron transferine dayal enzim bazl amperometrik cihazlara dayanmaktadr (Freire et al., 2003).
2.5.2. Enzim Elektrodu Karakteristikleri

Bir

enzim

elektrodunun

kullanlabilirliine

karakteristik

zelliklerinin

belirlenmesinden sonra karar verilebilir.

23

2.5.2.1. Kararllk

Kararllk bir enzim elektrodunun pratik kullanm asndan uygunluunu belirledii gibi elektrodun raf mrn de belirler. Uzun mrl bir elektrot ile ok sayda analiz yaplabilecei iin maliyet asndan avantajldr. Elektrot mr alma ve depolama koullar asndan incelenmektedir. Depolama ve kullanm srecindeki elektrot mr farkllk gstermektedir. Enzimin immobilizasyon yntemi, saflk derecesi ve kayna gibi faktrler enzim elektrodunun kararlln etkileyen nemli parametrelerdir. rnein fiziksel yntemlerle immobilize edilen bir enzim elektrodunun mr kimyasal olarak immobilize edilmi bir enzim elektroduna gre daha ksadr (Suelter and Kricka, 1992).
2.5.2.2. Seicilik

Kullanlan elektrodun yksek seicilie sahip olmas bir enzim elektrodundan beklenen en temel zelliktir. Enzimler genel olarak antikor ve nkleik asitlerden sonra seicilik sralamasnda yer almalarna kar mutlak zgl enzimler sz konusu olduunda bu durum geersizdir. Seicilik zerine etki eden balca

parametreler ph, sensrle giriimler ve biyokatalizrle giriimlerdir. Girimi engellemenin en iyi yolu sadece analiz edilcek maddeye spesifik bir biyokatalizr kullanmaktr. Amperometrik enzim elektrotlar potansiyometrik elektrotlara gre daha seicidirler ancak yine de alma potansiyelinde giriimde bulunan elektroaktif maddeler bulunabilir. Seicilii etkileyen bir dier faktr ise kendi ierisinde yarmal substratlar ve enzimi aktive ya da inhibe eden maddeler olarak ayrlan biyokatalizrle giriimdir. Eer kullanlan enzim alkol oksidaz gibi grup zgllne sahip bir enzim deil de yalnzca bir substratla tepkime verme zelliine sahip bir enzim ise yarmal bir baka substrat giriimi sz konusu olamaz. Ortamdaki inhibitr ve aktivitrler de enzim aktivitesini etkilemektedir. Ag+, Hg2+, Cu2+ gibi metal iyonlar, tiyol bileikleri ve organofosfatlar da birok enzimin aktif blgesinde yer alan serbest tiyol gruplarn inhibe eden nemli inhibitrlerdendir.

24

Seicilii etkileyen bir dier deiken ise ortam pHsdr. Enzimin optimum alt Ph, immobilizasyon sonucu ve ykl substat varl gibi durumlarda kaymalar gsterebilir. Bu nedenle elektrodun alaca optimum pH teorik zorlamalara gre deil deneysel almalara gre belirlenmelidir. lm aralnn da seicilik zerine nemli etkisi bilinmektedir. Hedef substratn dnda girimde bulunabilecek maddelerin elenmesi iin dk deerlere inebilen bir lm aralna sahip elektrotta rnekteki hedef madde seyreltilerek giriimde bulunabilecek maddelerin konsantrasyonlar lm snrlar dna karlabilir (Suelter and Kricka, 1992).
2.5.2.3. Cevap Sresi

Cevap sresi, elektrodun analizlenecek madde ortamna demesinden lme sisteminden sonucun okunmasna kadar geen sre anlamna gelmektedir. Cevap sresinin ksa olmas bir enzim elektrodundan beklenen temel zelliklerden biridir. zellikle rutin analizlerde ksa cevap sresi pratiklik asndan byk nem tar. Genellikle bir biyosensrn cevap sresi birka saniye ile birka dakika arasnda deiir. Bir enzim elektrodunun cevap sresini etkileyen faktrler; Substratn zar yzeyine difzyon hz Substratn biyokatalizrn aktif blgesi ile verdii tepkimenin hz Oluan rnn elektrot yzeyine difzyon hz

Bu faktr de etkileyen unsurlar substrat konsantrasyonu, enzim deriimi, scaklk, pH, kartrma hz, biyoaktif tabaka zerinde zar kullanlp

kullanlmaddr. Bu etkenlerden optimum pH ve scaklk, kartrma cevap sresini ksaltrken, substrat deriimdenki art, biyoaktif tabaka zerinde zar bulunmas cevap sresinin uzamasna yol aar (Suelter and Kricka, 1992).

2.5.3.

Amperometrik Glukoz Elektrodu

Amperometrik glukoz elektrodunda glukoz oksidaz enzimi analiti olan glikozu hidrojen peroksite dntrr. Oluan hidrojen peroksit ise elektrokimyasal bir
25

evirici tarafndan elektrokimyasal olarak llr. Tercihen elektrokimyasal evirici ve enzim birbirine olabildiince yakn olmaldr. Bu sebepten dolay enzim alma elektroduna immobilize edilir (Rhemrev-Boom et al., 2001).
2.5.3.1. Amperometrik Glukoz Elektrodunun Kullanm Alanlar Tan

Diyabet hastalarnn kan ekeri lmleri iin daha ucuz ve basit glukoz tayini yapan cihaz ihtiyalarnn domas zerine glukoz elektrotlar zerine yaplan aratrmalar artmtr. Diyabet vcudun kan ekerini sabit tutmas iin inslini retememesi ya da etkin kullanamamasndan dolay ortaya kar. ki eit diyabet vardr. Tip 1 ya da insline bal diyabet (IDDM) olarak bilinen diyabet hastalnda vcut inslin retemez. Tip 2 ya da insline bal olmayan diyabette (NIDDM) ise vcut inslini yeterince kullanamaz. Amerikan diyabet derneine gre amerikada 15.7 milyon (toplam nfusun %5.9u) diyabet hastas bulunmakta ve her gn yaklak 2200 insana diyabet tehisi konmaktadr. Diyabet Ameriakada yedinci lm sebebidir. Krlk ve bbrek

hasarlarna yol at gibi kalp ve sinir sistemi zerinde de komplikasyonlara sebep olduu bilinmektedir. Aratrmalar gstermektedir ki IDDM hastalar youn bir bakmla kandaki glukoz seviyesi normale yakn tutulduunda diyabet hastalnn sebep olduu komplikasyonlar azaltlabilmektedir. Ayn sonutan NIDDM hastalar iin de sz edilebilir. Bu sebeple e zamanl olarak kandaki glukoz seviyesini len cihazlarn varl temeldir. Elektrokimyasal enzim sensrleri yksek hassasiyetleri, yksek seicilikleri, dk maliyet ve kullanm kolaylklarndan dolay ilgi oda olmulardr. Bu tr enzim elektrotlar son zamanlarda ticari glukoz analizi yapan sistemlerde ya da evde kullanlabilen finger stick tipi glukoz lerlerde evirici olarak kullanlmakta ve klinik olarak kesin sonular vermektedirler. Bu glukoz lerler kk bir ine yardmyla deriyi delerek kan rnei alrlar. Srekli kan rnei alnmas gereken diyabet hastalarnda bu durum deri tahriine ve daha fazla acya sebep olacandan srekli glukoz len sistemler kullanlmaktadr. Bu sistemlerin ise sadece implantasyon ve kalibrasyon periyotlar acya sebep olurlar. Test sresi boyunca kandaki glukoz konsantrasyonu bilgilerini hafzaya alrlar (Chen, 2001).

26

Proses Kontrol

Fermantasyon ileminde glukoz konsantrasyonunun ayarlanmas noktadr. nk fazla miktardaki glukoz laktat oluumuna

nemli bir

sebep olur bu da

verimlilii olduu gibi biyoktleyi de azaltr. Glukoz izleme sistemleri devre d ya da balantl izleme olarak ikiye ayrlrlar. Enzimatik glukoz elektrotlar her iki yntemde de yksek hassasiyet ve seicilikte sonu vererek kullanlmaktadrlar. Bu elektrotlarn kullanm kimyasal ya da enstrmental analiz yntemleriyle karlatrldnda olduka basit ve dk maliyetlidir. Geleneksel devre d

glukoz izleme ynteminde rnek alma ve laboratuvar analizi ilemleri manuel olarak gerekletirilir. rnek alma ve analiz aamas arasnda geen zaman fermantasyon ileminin kontrol asndan sonular daha az anlaml klar. Balantl glukoz izleme yntemi ise glukoz konsantrasyonu hakknda e zamanl bilgi vererek optimum reaksiyon koullar iin e zamanl mdaheleye olanak salar. Glukoz sensrleri bu sistemlerde direk olarak fermantasyon ortamna bir d zellikle

yerletirilebilcei gibi sistemin dnda proses aknn zerinde olan enstrmana da yerletirilebilirler. Kullanlan glukoz elektrotlarn

fermantasyon ortamnda kullanlanlarn sterilizasyonu etkilememesi ve kompleks fermatasyon ortamnda yalnzca glukoza seici olarak hassas lm yapabilmesi gerekmektedir (Chen, 2001).
Biyoyakt Pilleri

Enzim

katalizli

elektrot

reaksiyonlarnda indirgeyici

kimyasal enzim

bilgi

elektrik

sinyaline bir

dntrlr.

Harici

olarak

elektroduna

balanan

ykseltgeyiciye bal olarak iki elektrokatalizr arasnda oluan potansiyel fark ile redoks reaksiyonu kendiliinden gereklemeye balar. Elektronlar srekli olarak ykseltgeyici elektrottan (anot) indirgeyici elektroda (katot) doru akmaya balarlar. Eer bu dngde yk varsa kimyasal enerjiden elektrik enerjisi retilmi olur (Katz et al., 1999). Yakt pilleri ile bataryalar arasndaki fark bataryada indirgeyici ve ykseltgeyici hcre ierisinde bulunuur. Yakt pilleri ise elektrotlara ktle aktarmnn geerkelemesi ile desteklenirler. Baterilerde volumetrik enerji younluu ve gravimetrik enerji younluu bateri kapasitesnin belirlenmesi asndan kritik parametreler iken d bir kaynakla beslenen yakt pillerinde sadece g younluu
27

kritiktir. deal bir yakt pili yakt saland srece snrsz g retebilmelidir. Anot ya da katottan biri ya da ikisi birden biyokatalizli elektrot olduunda yakt pili biyoyakt pili adn alr. H2-O2 sistemleri gibi bilinen yakt pilleri anot ve katodun yksek metal alamlarndan iyi performans alabilmek iin yksek scaklklarda ve korozif pHlarda alrlar. Bunlar implante edilebilir medikal cihazlar iin uygun g kaynaklar deillerdir. Biyoyakt pilleri, mikroorganizmalar gibi biyokatalizrler ya da oksidoredktaz enzimlerini kullanrlar ve dk scaklk (<40C), ntral phda alrlar. Bu sebeple anot yakt olarak glukoz seilir nk glukoz kaynaklarn bulmak kolaydr ve fizyolojik svlarda ok miktarda bulunur. Katot yakt olarak ise hcre voltajn belirlemede nemli olan yksek reaksiyon potansiyeline sahip oksijen seilir (Kim et al., 2006). Mikrobiyel biyoyakt pilleri (MFCs) de organik substratlar mikroorganizmalarn metabolizmas ile elektrik enerjisine dntren biyoelektrokimyasal eviricilerdir. Son yllarda yaplan almalar Mikrobiyel biyoyakt pilleri (MFCs) sayesinde atklarn paralanmasndan enerji elde edilebildiini gstermektedir (Prasad et al., 2007). Yakt pilinin k akm younluu birim alandaki reaksiyon hzna ve reaktantlarn aksna gre belirlenir. Enzim elektrotlar glukozun ykseltgendii anot olarak seilmektedirler nk glukozun direk ykseltgenmesi olduka yava olmakta ve metal katalizrler hzl deforme olmaktadrlar. Bu zellikleri onlar fizyolojik koullarda almaya uyumsuz yapmaktadr. 3 tip enzimatik glukoz elektrodu

iinde anot olarak kullanmaya sadece medyatrl enzim elektrotlar uygundur. nk oksijen tipi elektrotlar normal koullarda indirgenir, H2O2 tipi elektrotlar ise hcre k potansiyelini kstlayarak yksek potansiyellerde alrlar. Glukoz-O2 enzimatik biyoyakt pilleri zerine aratrmalar 1960larda balamtr. Yakt pili, katod iin uygun bir etkili biyokatalizr bulunamamas zerine inorganik katalizrl bilinen bir oksijen katoduna glukoz biyoanodu balanarak

oluturulmutur. Son yllardaki almalar gstermektedir ki, biyokatalizr ya da medyatrn tamam ya da bir blm yar hcre bileeninde znmekte ve biyokatalizr ve elektrot arasndaki elektron aktarmn hzlandrmaktadr. Bundan dolay biyokatalizr ve medyatrn geisini nlemek iin ayrc membranlarn
28

kullanm mecburi olmutur. mmobilize enzim elektrotlar ise zelti iinde serbest halde bileenlerin bulunmasna izin vermedii iin ayrc membran kullanma zorunlulunun nne gemektedir (Chen, 2001). ekil 2.12de enzim tabanl bir biyoyakt pilinin ematik gsterimi verilmitir.

ekil 2.12. Enzim tabanl biyoyakt pili (Kim et al., 2006).

2.6. letken Polimerler

letken polimerler poliaromatik, polikonjuge ve poliheterosiklik molekllerden oluan elektriksel iletkenlie sahip molekllerdir. Doping yapldklarnda elektriksel iletkenlikleri metallerin gsterdii iletkenlie yaklar. Polimere doping yaplmas dopant trlerinin tayc madde ierisinde bir yer igal ettiini ve dopant trleri iermeyen haline gre daha iletken olduu ilevini ifade etmektedir. Polipirol gibi konjuge polimerlerde doping ilemi polimerin ksmen ykseltgenmesiyle ya da nadiren indirgenmesiyle oluan bir yk deiimidir (elikkan, 2001). Bir iletken polimer olan polipiroln gemii 1960lara dayanmaktadr ancak o zamanlarda polimerler hakknda bilinenler olduka az olduundan bu bulu unutulmutur. 1977 ylnda Alan Mac Diarmid, Hideki Shirakawa ve Alan Heeger poliasetilene iodinle doping yapldnda iletkenliin 10 kat arttn gzlemlemi ve ilk iletken polimer bu ekilde kefedilmitir. Poliasetilen halkal yapda bir polyene olmamasna kar hala bu alanda en sk kullanlan polimerdir. Ancak poliasetilenin de retimindeki zorluklar ve havadaki kararszl gibi snrlayc faktrleri vardr. Poliasetilenden farkl olarak halkal yapdaki polifenilenler aromatik yapsnn sonucunda termal olarak stabil bilinirler. Aromatik yapdaki iletken polimerlerin gelitirilmesi sonucunda farkl alanlardaki kullanmlar iin iletken polimerler daha da nem kazanmlardr. Polipirol, polianilin, poli(3,4-etilendioksitiyofen) gibi
29

polihetero-halkal yaplar

da iletkenliklerinden, stabilitelerinden ve sentezinin

kolaylklarndan dolay yeni bir snf olarak ortaya kmlardr (Guimard et al., 2007). Elektrokimyasal devreler, piezoelektrik reticileri, elektronik alet yapm, kimyasal sensr, elektrokatalizr fotovaltik devreler, doldurlabilir piller iletken polimerlerin balca kullanm alanlardr. ekil 2.13te baz iletken polimerlerin yaps verilmitir.

ekil 2.13. Baz iletken polimerlerin yaps (Ahuja et al., 2007).

2.6.1. letken Polimerlerin Sentezi

letken

polimerler hem

kimyasal

olarak hem

de

elektrokimyasal

olarak

sentezlenebilirler. ki yntemin de kendine gre olan avantaj ve dezavantajlar vardr (izelge 2.1).

30

izelge 2.1. Kimyasal ve elektrokimyasal dezavantajlarnn karlatrmas Polimerizasyon Tr Avantajlar -Byk lekli retim imkan -Yn yapdaki iletken polimerin kovalent modifikasyona uratlabilmesi

polimerizasyonun

avantaj

ve

Dezavantajlar

-nce film retilememesi -Sentezinin zor olmas

Kimyasal Polimerizasyon

-letken polimer zincirinin kovalent olarak modifiye edilebilmesi iin ok seenek olmas -nce film retilebilmesi -Sentez kolayl Elektrokimyasal Polimerizasyon -letken polimer iine molekllerin tutuklanabilmesi -E zamanl olarak doping yaplabilmesi -Elektrot yzeyinden oluan filmin temizlenmesinin zorluu -Yn yapdaki iletken polimerin kovalent modifikasyona uratlabilmesinin zorluu

Kimyasal sentez younlatrarak polimerizasyon ve katkl polimerizasyon gibi farkl metodlar iermektedir. Younlatrarak polimerizasyon su ya da hidroklorik asit moleklleri gibi kk molekllerin kaybyla gerekleir. Radikal, katyon ve anyon polimerizasyonlar da katkl polimerizasyona rneklerdir ki bunlar sentez srasnda polimer zincirinin reaktif ucundaki ara rnn radikal katyon ya da anyon olmasna gre ayrlrlar. Kimyasal sentez sadece eitli iletken polimerler sentezlemek iin farkl yollar salamaz ayn zamanda bu materyallerin bymesini de salar ki bu elektrokimyasal yntemle yaplamaz. letken polimer sentezinde kullanlan bir dier alternatif yntem ise uygulamas olduka kolay olan elektrokimyasal yntemdir. Elektrokimyasal yntemle iletken polimer hazrlama

31

yntemi, platin elektrot zerinde kelti eklinde pirol siyahnn grld 1968lere dayanmaktadr. Bu kaplama platin elektrodun piroln sulu zeltisi ve slfrik asit ierisinde oksidasyon potansiyeline maruz braklmas sonucunda olumutur. Bugn elektrokimyasal polimerizasyon ilemi monomer zeltisi, uygun bi zc ve elektrolit ierisinde l elektrot konfigrasyonlaryla (alma elektrodu, referans elektrodu, kart elektrot) yaplmaktadr. Akm zeltiden geirilmeye balandnda pozitif ykl alma elektrodu ya da anotta elektro birikim gereklemeye balar. alma elektrodu zerindeki monomerler radikal katyonlar oluturmak zere okside olmaya balarlar. Oluan radikal katyonlar da dier monomer ya da radikal katyonlaryla tepkimeye girerek elektrot yzeyi zerinde znmeyen bir polimer zinciri meydana getirirler (ekil 2.14). Elektrokimyasal polimerizasyon monomer zeltisinin, elektrot yzeyinde direk bir polimer filmi oluturmak zere oluturmasdr (Durst et al., 1997). indirgenip/ykseltgenerek aktif bir form

ekil 2.14. Elektrokimyasal sentez ile heterohalkal polimerizasyon mekanizmas. X=NH, S ya da O. Bu reaksiyon alma elektrodu zerinde monomerin katyonik trler vermek iin ykseltgenmesiyle balamaktadr. Oluan katyonik trler de ntral monomer ya da radikal katyon oligomerik trleri ile reaksiyona girerek polimer oluturabilir. Bu yntemde birikim zaman, scaklk, zc sistemi (su ierii), yk, elektrolit ve

32

elektrot sistemi gibi birok parametre dikkate alnmaldr. Bahsedilen her bir parametrenin oluan filmin morfolojisine (kalnlk ve topografi), mekanik

zelliklerine ve iletkenliie dorudan etkisi vardr. letken polimer sentezinde kullanlan iki yntem arasndaki en nemli fark, elektrokimyasal yntemle 20 nm gibi ok ince film kaplamas yaplabilirken kimyasal yntemde kaln film yaplabilmesidir. Ancak elektrokimyasal yntemde, uygun potansiyel varlnda monomer reaktif radikal iyon ara rnleri oluturmak iin okside olabilmekte bu da elektrokimyasal yntemi kstlamaktadr (Guimard et al., 2007).
2.6.2. letken Polimerlerin Elektrokimyasal Polimerleme Mekanizmas

Polimerlerin sentezinde olduu gibi iletken polimerlerin sentezi de balama, byme ve sonlanma basamaklarn ierir. Monomerin elektrokimyasal olarak ykseltgendii ve radikal katyonunun olutuu basamak balama reaksiyonudur. Monomer katyonlarnn birleerek zincir oluturmas ve zincir zerindeki reaktif merkezlerin birleerek zincirin bytlmesi ise byme basamadr. Monomer radikallerinin ve zincir zerindeki aktif merkezlerin birlemesi ise sonlanma basamadr (ekil 2.15) (Yakar, 2006).

ekil 2.15. Pirol iin ykseltgenme mekanizmas.

33

Pirol

monomerinden

elektropolimerizasyon

yntemiyle

polipirol

oluum

reaksiyonunda piroln anodik oksidasyon polimerizasyonu ekilden de grld gibi 3 basamakta gerekleir. lk olarak dimer oluturmak iin kendliinden gelien radikal oluma reaksiyonu gerekleir. Daha sonra elektropolimerizasyon boyunca harcanan akm zamanla doru orantldr ve bu da reaksiyonun elektrot yzeyinde gerekletiini dorular. Son olarak ise elektrot yzeyinde dimer, trimer ve polimer, monomerden dk potansiyelde ykseltgenir. Bu ekilde polimerizasyon sresince ykseltgenmi durumda bulunurlar. Polimer zerindeki pozitif ykler zeltideki anyonlarla karlanr (Yakar, 2006).
2.6.3. letken Polimerlerin letkenlii ve Dopingi

letken polimerlerde elektron transferinin redoks polimerlerinde olduu gibi redoks merkezlerinden elektron zplamas mekanizmasyla deil delokalize band yapsyla yzey boyunca olduu dnlmektedir. Ayrca polimer zincirleri ile zelti ierisindeki molekllkerin (kart iyonlar, zc moleklleri) iyonik etkileimleri sonucunun da polimerin elektriksel iletkenlik zelliklerini arttrd gzlenmektedir. Konjuge sistemlerdeki yk tama mekanizmas maddeden maddeye deimekte ve sebebi bilinmemektedir. Maddeye zg yk tama mekanizmasn aydnlatmak iin birka model rnek alnr ve yk tayclarn mekanizmasyla ilgili iliki kurulmaya allr. Yk tayclar genelde solitonlar, polaronlar ve bipolaronlar olmak zere 3 tanedir. Polipirolde yk tanmasndan sorumlu temel ykl trlerin bipolaron olduuna baz ESR sonular sonucunda ulalmtr. Yaplan deneysel sonular yk tama hznn polimerin morfolojisiyle dorudan ilikili olduunu gstermektedir. Morfolojiye etki eden parametreler ise destek elektrolit ve film hazrlama artlardr (elikkan, 2001). letken polimerlerin dopingi kimyasal ya da elektrokimyasal olabilmektedir. Kimyasal dopingte iletken polimer iyodin gibi ykseltgeyici bir gaza tabi tutularak ykseltgenme gerekletirilir. Bir baka kimyasal doping ilemi ise polianilinin protonlanmasdr. Bu ilem anilinin yar iletken formundan (emaraldin baz) metalik forma (emaraldin tuzu) eviren redoks reaksiyonuna sebep olur. Bir dier alternatif doping yntemi ise elektrokimyasal dopingtir. Bu yntemde uygulanan potansiyel

34

ayarlanarak doping ilemi kontrol edilebilir bir hal almaktadr. Dlaysyla doping miktar kontrol edilebilmektedir (Lange et al., 2008).
2.7. Analiz Teknikleri

GOD elektrotlar hazrlandktan sonra ve hazrlanmadan nce fonksiyonel gruplarn oluturulmas srasnda yzey zelliklerinin ve elektrokimyasal

davranlarnn elektrokimyasal yntemlerle incelenmesi gerekmektedir. Bu alma kapsamnda bu amala Atomik Kuvvet Mikroskobu (AKM), Fourier Transform nfared Spektroskopisi (FTIR) kullanlmtr.
2.7.1. Elektrokimyasal lmler

Elektrot yzeylerinde gerekletirilen iletken polimer ve medyatr modifikasyonu, enzim moleklnn tutuklanmas ilemlerinden sonra elektrokimyasal yntemlerle yzeylerin performans deerlendirilebilir.
2.7.1.1. Voltametrik Yntemler

Voltametri ynteminde alma elektrodu ve referans elektrot arasna deeri zamanla deien gerilim uygulanr. Buna kar kart elektrot ve alma elektrodu arasndaki akm deeri llr.
Dnml Voltametri (CV)

Bu yntemde kartrlmayan zeltideki elektrodun akm ikizkenar gen eklindeki bir potansiyel ile uyarlr (ekil 2.16).

ekil 2.16. Dnml voltametride alma elektroduna uygulanan potansiyelin zamanla deiimi (Kale, 2004).

35

Dnml voltametri ynteminde elektroda belli bir potansiyel aralnda dorusal olarak bir tarama yaplr. Daha sonra taramann yn ters evrilir ve potansiyel balang deerine getirlir. Bu evirim birka kez yaplr. Dnml voltamogramlarn incelenmesiyle sistemin ka basamakta indirgenip ykseltgendii, elektrokimyasal olarak tersinir olup olmad, indirgenme ve ykseltgenme rnlerinin kararl olup olmad ve elektrot tepkimesinin bir zelti tepkimesi ile yryp yrmeyecei anlalabilmektedir (Yakar, 2006).
Kronoamperometri (CA)

Bu yntemde alma elektrodunun potansiyeli aniden deitirilir ve durgun ortamda-akm zaman arasndaki balant gzlenir. lk olarak alma elektroduna herhangi bir indirgenmenin olmad E1 potansiyeli uygulanr. Daha sonra ani olarak potansiyel E1den E2ye karlr (Kale, 2004) (ekil 2.17).

ekil 2.17. Kronoamperometride alma elektroduna uygulanan potansiyelin zamanla deiimi.

Kronopotansiyometri

Galvonostatik metot olarak da bilinen bu yntem sabit akmda, potansiyeli zamann fonksiyonu olarak len bir yntemdir. Potansiyelin zamanla deiiminin dorusallndan yaplan kaplamann yapsal dzenlilii hakknda bilgi edinilir (Byknohutu, 2009).
2.7.2. Yzey Karakterizasyonu

letken polimer ve medyatr modifikasyonu, enzimin yzeyde tutuklanmas gibi ilemlerden sonra elektrot yzeyinin kimyasal ve fiziksel olarak karakterizasyonu gerekmektedir.

36

2.7.2.1. Atomik Kuvvet Mikroskopisi (AKM)

Atomik Kuvvet Mikroskopisi (AKM), Taramal Prob Mikroskopisi grubundaki en ok kullanlan yzey analiz yntemlerinden biridir. Sistem bir inenin piezo elektrik kontrol elemanlar ile rnee ok yakn ve boyutta tarama yaparak grnt elde etmesine dayanr. Nanometre seviyesinde lm yapan bu sistem, ine yzeyindeki itme ve ekme kuvvetleri ile ekilin bozularak topografinin elde edilmesi prensibine dayanr (ir, 2009).

ekil 2.18. Atomik kuvvet mikroskobunun ematik gsterimi.

2.7.2.2. Fourier Transform nfrared Spektroskopisi

Infrared Absorbsiyon Spektroskopisi, dk enerjili IR blgedeki nlarn kullanld absorbsiyon spektroskopisidir. eitli balarn titreim frekanslarn ler ve molekldeki fonksiyonel gruplar hakknda bilgi verir. Belirli molekller IR nn absorplayarak molekl ii titreim enerji dzeyleri arasnda geiler olur. Molkllerdeki titreim frekanslarna uyan infrared fotonlarnn dalga saylar 4000 650 cm-1 arasnda, yani yaklak 15 m ile 2.5 m dalga boyu aralnda deimektedir. Monokromotrler yardmyla dalga boylarn seerek lmn

yapld spektrofotometrelerde herhangi bir anda sadece seilen dalga boyundaki spektroskopik bilgi toplanr. Ancak baz spektrofotometrelerde zel yntemler kullanlarak tm frekanslardaki bilgileri ayn anda elde etmek mmkndr. Bu tr spektrofotometrelerde monokromotr bulunmaz ve spektrumlar frekans leinde deil zaman leinde elde edilir. Gnterferogram denilen spektrumlar absorpsiyon spektrumunun Fourier

dnmdr. Elde edilen veri bilgisayar aracl ile matematiksel bir metot uygulanarak frekans leindeki bilgilere dntrlr. Ters Fourier dnm ad
37

verilen bu yntemle veri zaman alanndan frekans alanna aktarlr ve deiik frekanslarda oluan absorpsiyonlar grafie dklr. Bu ekilde gerekletirilen IR uygulamas Fourier Transform Infrared Spektoskopisi (FTIR) adn alr

(Byknohutu, 2009).

38

3.

DENEYSEL ALIMALAR

Sunulan tez kapsamnda biyosensr ve biyoyakt pilinin ana bileeni olarak kullanlan enzim elektrodun performansna etki eden enzim immobilizasyon yntemleri incelenmitir. Bu amala, farkl immobilizasyon yntemlerine gre GOD elektrot tasarm gerekletirilmi ve hazrlanan elektrotlarn performans

elektrokimyasal lmlerle deerlendirilmitir. Yaplan almalar aadaki basamaklarda yrtlmtr. Enzim elektrodu hazrlanmas: Karbon elektrotlar zerine enzim

immobilizasyonu farkl yntem ile gerekletirilmitir. Bu yntemler, Kovalent balama Elektropolimerizasyon ile hapsetme Yeniden yaplandrma olarak uygulanmtr. mmobilizasyon yntemine bal olarak belirlenen enzim miktar, medyatr miktar ve elektropolimerizasyonda yk uygulamas gibi immobilizasyon koullarnn etkileri incelenmitir. Elektrot performans almalar: Hazrlanan elektrotlar ile akm-voltaj lmleri yaplarak elde edilen voltamogramlar elektrot performans olarak deerlendirilmitir. Elektrokimyasal lmlere etki eden alma koullar olarak; Ortam pHs Scaklk parametreleri incelenmitir. Elde edilen elektrotlarn saptanan pH ve scaklkta substrat (glukoz) konsantrasyonuna kar enzimatik reaksiyon verimi test edilmitir. Bu kapsamda, Elektrot kalibrasyonu KM ve Imax kinetik parametrelerinin saptanmas

39

amacyla elektrotlarn glukoz ortamnda zamana kar akm deerlerinin lm yaplmtr. Elektrotlarn biyoyakt pili olarak test edilmesi: Saptanan immobilizasyon koullarnda hazrlanan enzim elektrodu, biyayakt pilinde kullanlarak pil performans verileri elde edilmitir. Elektrot yzey karakterizasyonu: Hazrlanan elektrot yzeylerinin topografik ve kimyasal yaps, AKM, FTIR teknikleri ile karakterize edilmitir.
3.1. Kimyasal Madde ve Malzemeler

Glukoz Oksidaz (GOD) elektrot malzemesi olarak ticari amala retilen %99.99 saflkta 3.06 mm apndaki (Alfa Aesar, USA) grafit elektrotlar kullanlmtr. Karbon elektrotlarn yzeyine enzim immobilizasyonunu salamak iin yaygn olarak iletken polimer filmlerinde kullanlan pirol (Py) ve anilin (An) monomerleri uygulanmtr. Py ISOLab (Almanya), An Merck (Almanya), An ile birlikte polimerizasyonda kullanlan akrilik asit ise ISOLab (Almanya) firmasndan temin edilmitir. Polimerizasyon sonrasnda apraz balayc ajan olarak kullanlan gluteraldehit (GA), enzim elektrodu tasarmnda kullanlan Glukoz Oksidaz (GOD) (Aspergillus
niger kkenli, 200U/mg)

ve substrat olarak kullanlan -D(+) glukoz ISOLab

(Almanya) firmasndan temin edilmitir. Glukoz oksidaz elektrodunda enzimin redoks aktif mekezi ve elektrot yzeyi arasnda elektron aktarmn arttrmak zere kullanlan medyatr dimetilaminometil ferrosen (DMAMFc) ve GOD kofaktr olarak kullanlan flavin adenin dinkleotid (FAD) ISOLab (Almanya) firmasndan temin edilmitir. Hazrlanan enzim elektrotlarn enzimatik biyoyakt pilinde test edilebilmeleri iin biyokatot tasarmnda kullanlan Lakkaz (Trametes versicolor kkenli, 22.4 U/mg), Fluka (Almanya) firmasndan, biyokatot tasarmnda elektron medyatr olarak kullanlan 2,2-azinobis-(3-etilbenzotiozdin-6-sulfonik asit) (ABTS) ise ISOLab (Almanya) firmasndan temin edilmitir.

40

Deneysel almalarda kullanlan dier kimyasal maddeler, elektrokimyasal deneylerde tampon zelti olarak kullanlan (PBS) potasyum hidrojen fosfat tuzlar, sodyum asetat tamponu, destek elektrolit olarak kullanlan potasyum klorr (KCl) ISOLab (Almanya) firmasndan temin edilmitir. Karbon elektrot yzeyinin iletken polimer ile modifikasyonu iin elektrokimyasal polimerizasyon teknii kullanlmtr. Elektropolimerizasyon ve elektrot performans almalar iin uygulanan voltamogramlarn (C-V erileri) eldesi, Elektrokimyasal Potansiyostat-Galvonostat (Iviumstat, Hollanda) cihaz ile gerekletirilmitir. Elektrokimyasal deneyler, Iviumstat lm cihazna entegre edilen bir hcre ve l elektrot sistemini kapsayan bir hcre standnda (C3 cell stand, BASi; USA) yrtlmtr. Kurulan elektrokimyasal hcrede alma elektrodu olarak enzim elektrodu olarak hazrladmz karbon elektrot, referans elektrodu olarak gm/gm klorr (Ag/AgCl) ve kart elektrot olarak da platin (Pt) elektrot kullanlmtr. Hazrlanan elektrotlarn yzey karakterizasyonu iin Atomik Kuvvet Mikroskobu (AKM, Ambios Universal SPM, USA) cihaz ile yzey grntlemesi yaplmtr. Fourier Transform Kzltesi Spektroskopi (FTIR, Vertex, 80, Bruker, Almanya) cihaz ile de modifiye edilmi karbon elektot yzeylerindeki deien kimyasal ba yaplar tespit edilmitir.
3.2. Enzim Elektrodu Hazrlanmas

Bu almada, biyosensr olarak kullanlan enzim elektrotlar ile enzimatik biyoyakt pili tasarmlarnda ana bileen olarak bilinen immobilize enzim ieren elektrot tasarm gerekletirilmitir. Bu amala, enzim elektrot performansn etkileyen nemli parametre olarak enzim immobilizasyon almalar yaplmtr. Enzim elektrodu tasarmnda, elektrot malzemesinin elektriksel olarak iletken ve sert yapda olmas, enzim immobilizasyonu iin iletken polimer ve medyatr ile modifiye edilebilir olmas istenen zelliklerdir. Literatr aratrmasna dayanarak bu zellikleri salayan karbon ubuklar, elektrot malzemesi olarak seilmi ve enzim immobilizasyonu iin karbon elektrotlar kullanlmtr. Tm almalarda 0,074 cm2 yzey alana sahip karbon ubuklar kullanlmtr. Elektrot yzey alannn elektrot performansna etkisini Karbonun elektrot olarak kullanmnn

41

avantaj ve dezavantjlar Deneysel Sonular ve Tartlmas blmnde verilmitir. Glukoz oksidaz elektrodu gelitirilmesi amacyla, karbon elektrot zerine uygulanan farkl enzim immobilizasyon prosedrleri ve etkiyen alma

parametreleri aada detaylar ile sunulmutur.

3.2.1. Enzimin Kovalent Balanmas

Bu yntemde elektron aktarm medyatr olarak kullanlan DMAMFc ve GOD enzimi, elektrokimyasal olarak karbon elektrodu zerinde oluurulmu PPy iletken filmi zerine apraz balayc ajan olan GA ile kovalent olarak balanmtr. Yntem elektrokimyasal polimerizasyon ve enzim immobilizasyonu olarak iki aamada gerekletirilmitir.
1. Aama: Elektrokimyasal polimerizasyon

Enzim immobilizasyonu iin fonksiyonel grup yaratmak amacyla elektrot yzeylerinin uygulanmtr. modifiye edilmesinde elektrokimyasal polimerizasyon yntemi

Karbon elektrot yzeyinde Elektrokimyasal Potansiyostat - Galvanostat Cihaznda (Iviumstat, Hollanda) mixed mode denilen bir yntemin uygulanmasyla kronoamperometri ve kronopotansiyometri yntemlerinin bir arada kullanlarak PPy filmi kaplanmtr. Sistemimizde var olan bu kombine yntem (mixed mode) ile pirol kaplama zeltisi iinde kaplanacak karbon elektroda 0,7 V sabit potansiyelde 300 mC/cm2 yk geecek ekilde uygulanmtr (ekil 3.1).

ekil 3.1. Elektrokimyasal Potansiyostat-Galvanostat Cihaz. (Iviumstat, Hollanda).

42

Pirol monomerinin polimerlemesi pHya bal olmad iin herhangi bir katklama ilemine gerek duyulmadan tek basamakta gerekletirilmitir. Elektrokimyasal polimerleme zeltisinde 0.1 M, pH7 PBS iinde 0.4 M Py monomeri ve 0.1 M KCl destek elektroliti kullanlmtr. Pirol elektropolimerizasyonu literatrden alnan verilere gre yaplmtr (Guerrieri et al., 1998). zerinde pirol filmi oluturulmu modifiye karbon elektrotlar, kronoamperometrik yntemle 0.7 V sabit potansiyel altnda 0.1 M, pH7 PBS iinde sabit akm grlene kadar ykseltgenmilerdir. Daha sonra ykseltgenmi modifiye karbon elektrotlar saf su ile ykanarak oda scaklnda kurumaya braklmtr. Yzeyde oluturulan PPy kaplamasn gzlemleyebilmek amacyla dnml voltametri yntemiyle, PPy kaplanm ve kaplanmam yaln karbon elektrotlarn 0.1M, pH 7 PBS ierisinde (-1V)-(1V) potansiyel aralnda verdikleri amperometrik cevaplar karlatrlmtr.
2. Aama: Enzim mmobilizasyonu

Biyosensrlerde substrat, biyoyakt pillerinde yakt olarak kullanlan glukozun katalizi iin GOD, PPy modifiye edilmi karbon elektrotlara immobilize edilmitir. Elektrokimyasal polimerizasyon ile modifiye edilmi karbon elektrot yzeylerine kovalent balama yntemiyle GOD ve elektron aktarm medyatr olan DMAMFc tutuklanarak enzim elektrotlar oluturulmutur.
3.2.1.1. mmobilizasyon Parametreleri

Kovalent balama ynteminde enzim ve medyatr konsantrasyonunun elektrot performansna etkisi incelenmitir. Enzim Konsantrasyonu PPy filmi ile kaplanm karbon elektrotlar zerine DMAMFc konsantrasyonu sabit tutularak 3-18 mgmL-1 konsantrasyonlarnda GOD immobilize edilmitir. 5 l % 2.5 (v/v) gluteraldehit (GA), 15 l GOD zeltisi (0.1M pH7 fosfat tamponunda 3mgmL1

-18 mg.mL-1) ve 8l DMAMFc zeltisi (etanol iinde 5mM) ieren immobilizasyon

zeltisi, PPy kaplanm karbon elektrot zerinde oda scaklnda kurumaya

43

braklmtr. Hazrlanan enzim elektrotlar kullanlmadnda 4Cde 0.1M pH7 fosfat tamponunda bekletilmitir. Farkl GOD konsantrasyonlarnda hazrlanan enzim elektrotlar

kronoamperometrik yntemle 600 saniye sre ile 50 mM glukoz zeltisi iinde (0,1M, pH7 PBS) test edilerek akm-zaman grafikleri elde edilmitir. Bu veriler nda enzim konsantrasyonunun akm younluuna etkisi grafiksel olarak sunulmutur. Medyatr Konsantrasyonu Medyatr konsantrasyonunun immobilizasyona etkisinin incelenmesi amacyla PPy kapl elektrotlara GOD konsantrasyonu sabit tutularak farkl medyatr konsantrasyonlarnda enzim immobilizasyonu yaplmtr. 5 l % 2.5 (v/v) gluteraldehit (GA), 15 l GOD zeltisi (0.1M pH7 fosfat tamponunda 9 mg.mL-1) ve 8l DMAMFc zeltisi (etanol iinde, 5 - 80 mM) ieren immobilizasyon zeltisi PPy kapl karbon elektrot zerinde oda scaklnda kurumaya braklmtr. Hazrlanan enzim elektrotlar kullanlmadnda 4Cde 0.1 M, pH 7 fosfat tamponunda bekletilmilerdir. Farkl DMAMFc konsantrasyonlarnda hazrlanan enzim elektrotlar

kronoemperometrik yntemle 600 saniye sre ile 50mM gkukoz zeltisi iinde (0.1 M, pH 7 PBS) test edilerek akm-zaman grafikleri elde edilmitir. Bu veriler nda medyatr konsantrasyonunun akm younluuna etkisi grafiksel olarak sunulmutur.
3.2.1.2. Enzim Elektrodunun Dnml Voltametri ncelemesi

Enzim konsantrasyonu ve medyatr konsantrasyonu gibi parametrelerin elektrot performans zerindeki etkisi, kronoamperometrik yntemlerle incelenmitir. PPy kaplanm elektrotlara 60 mM DMAMFc ve 9 mgmL-1 GOD konsantrasyonlarnda enzim immobilizasyonu yaplarak hazrlanan elektrodun tampon ve 50 mM glukoz zeltisinde (pH 7.5 potasyum fosfat tamponu) 0-0.7 V potansiyel aralnda dnml voltamogram incelenmitir.

44

3.2.2.

Elektrokimyasal mmobilizasyon

Elektrokimyasal immobilizasyon ynteminde enzim ve monomer ieren tampon zeltiden elektrot yzeyine doru bir katyonik film oluumu gerekleirken ntral pHda tamamen negatif ykl olan GODn kart iyon olarak polimer filmi iine tutuklanmasndan yararlanlr (Bartlett et al., 1992). Elektrokimyasal immobilizasyon, potansiyostat galvonostat cihaznda mixed mode olarak tanmlanan kronoamperometri ve kronopotansiyometri yntemlerinin bir arada kullanld alma koullarnda gerekletirilmitir. lk olarak enzim ile medyatrn yzeyde adsorplanmas iin karbon elektrotlar GOD ve DMAMFc ieren 0.1 M PBS ile hazrlanm 3 mL zelti ierisinde 4oCde 12 saat inkbe edilmilerdir. Daha sonra inkbe edilen elektrotlar, GOD (210mgmL-1), DMAMFc (3-15mM), 0.1M Py ve 0.1M KCl ieren 0.1M PBS ile hazrlanm polimerizasyon zeltisinde 0.9 V sabit potansiyelinde yk kontroll olarak kaplanmlardr. ekil 3.2de elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle enzim elektrodu

hazrlanmas ematik olarak gsterilmitir.

ekil 3.2. Potansiyostatik pirol elektropolimerizasyonu ile enzim elektrodu hazrlama. Pirol elektropolimerizasyonu ile yzeyde oluturulan filmin zellikleri eitli parametreler deitirilerek kontrol edilebilmektedir. Bu nedenle almada elektrotta glukozun GODa, reaksiyon sonucu oluan elektroaktif materyalin de

45

elektrot yzeyine tanm srasndaki direnlerin minimuma indirilmesi iin optimizasyon almalar yaplmtr.
3.2.2.1. mmobilizasyon Parametreleri

mmobilizasyon parametreleri almalarnda elektrotta performansa etkisi olduu dnlen elektropolimerizasyon yk, polimerizasyon zeltisindeki enzim ve medyatr konsantrasyonlar incelenmitir. Elektropolimerizasyonda Geen Yk Miktar Elektropolimerizasyon srasnda geen yk miktarnn enzim immobilizasyonuna etkisinin incelenmesi iin zeltideki enzim ve medyatr konsantrasyonlar sabit tutularak farkl polimerizasyon ykleriyle kaplama gerekletirilmitir. lk olarak enzim ile medyatrn yzeyde adsorplanmas iin karbon elektrotlar, 4mg.mL-1GOD ve 5mM DMAMFc ieren 0.1 M PBS ile hazrlanm 3 mL zelti ierisinde 4oCde 12 saat inkbe edilmilerdir. Daha sonra inkbe edilen elektrotlar, 4mgmL-1GOD, 5 mM DMAMFc, 0.1 M Py ve 0.1 M KCl ieren 0.1 M PBS ile hazrlanm polimerizasyon zeltisinde 0.9 V sabit potansiyelde 100 2000 mC arasnda deien farkl polimerizasyon yklerleriyle kaplanmlardr. Elektrotlarn 0.1 M, pH 7 potasyum fosfat tamponuyla hazlanm 5 mM, 10 mM, 30 mM ve 50 mMlk glukoz zeltilerindeki davran medyatrn alma potansiyeli olan 0.40 Vta kronoamperometrik yntemle 600 sn sre ile takip edilerek akm younluu ile glukoz konsantrasyonu arasndaki iliki incelenmitir. Enzim Konsantrasyonu Enzim konsantrasyonunun immobilizasyona etkisinin incelenmesi amacyla medyatr konsantrasyonu ve elektropolimerizasyonda geen yk miktar sabit tutularak farkl enzim konsantrasyonlarnda elektrotlar kaplanmtr. lk olarak enzim ile medyatrn yzeyde adsorplanmas iin karbon elektrotlar 210 mgmL-1 arasnda deien GOD ve 5mM DMAMFc konsantrasyonlarnda 0.1 M PBS ile hazrlanm 3 mL zelti ierisinde 4oCde 12 saat inkbe edilmitir. Daha sonra inkbe edilen elektrotlar, 2-10 mgmL-1 GOD konsantrasyonlarnda, 5mM DMAMFc, 0.1M Py ve 0.1M KCl ieren 0.1M PBS ile hazrlanm polimerizasyon zeltisinde 0.9 V sabit potansiyelinde 400 mC yk miktarnda kaplanmtr.
46

Farkl enzim konsantrasyonu kullanlarak hazrlanan elektrotlarn 0.1 M pH 7.0 potasyum fosfat tamponuyla hazrlanm 50 mM glukoza kar amperometrik cevaplar kronoamperometri yntemiyle elde edilen akm-zaman grafiklerinden yararlanlarak incelenmiir. Medyatr Konsantrasyonu Medyatr konsantrasyonunun immobilizasyona etkisinin incelenmesi amacyla zeltideki enzim konsantrasyonu ve elektropolimerizasyonda geen yk miktar sabit tutularak farkl medyatr konsantrasyonlarndaki zeltilerde elektrotlar kaplanmtr. Enzim ile medyatrn yzeyde adsorplanmas iin karbon elektrotlar 4 mgmL1

GOD ve 3-15mM DMAMFc ieren 0.1 M PBS ile hazrlanm 3 mL zelti

ierisinde 4oCde 12 saat inkbe edilmitir. Daha sonra inkbe edilen elektrotlar, 4mgmL-1 GOD, 3-15mM DMAMFc, 0.1M Py ve 0.1M KCl ieren 0.1M PBS ile hazrlanm polimerizasyon zeltisinde 0.9 V sabit potansiyelinde 400 mCluk ykle kaplanmlardr. Farkl medyatr konsantrasyonu kullanlarak hazrlanan elektrotlarn 0.1 M pH 7.0 potasyum fosfat tamponuyla hazrlanm 50 mM glukoza kar davranlar kronoamperometri yntemiyle 600 saniye sre ile test edilmi ve medyatr konsantrasyonunun akm youluuna etkisi incelenmitir.
3.2.2.2. Enzim Elektrodunun Dnml Voltametri ncelemesi

Polimerizasyon yk, enzim konsantrasyonu ve medyatr konsantrasyonu gibi parametrelerin elektrot performans zerindeki etkisinin kronoamperometrik yntemlerle incelemesi yaplmtr. 5 mM DMAMFc ve 4 mgmL-1 GOD varlnda 400 mCluk yk ile elektropolimerizasyonla enzim tutuklamas gerekletirilerek bu elektrodun 50 mM glukoz ve tampon ortamnda (pH 7.0 potasyum fosfat tamponu) 0-0.7V potansiyel aralnda dnml voltamogram incelenmitir.
3.2.3. Enzimin yeniden yaplandrlmas

Enzim elektrotlarnda elektriksel iletimin gelitirilmesi iin son yllarda yaplan almalarn ou enzimin redoks aktif merkezi ile elektrot yzeyi arasnda direk

47

bir elektron transferi salamay temel alan apo-enzimin yeniden yaplandrlmas almalar zerinedir. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas almalar, FAD immobilizasyonu, apo-

glukoz oksidazn hazrlanmas ve apo-gukoz oksidazn FAD modifiye edilmi elektrot zerine yeniden yaplandrlmas olmak zere 3 aamada

gerekletirilmitir.
1. Aama: FAD immobilizasyonu

FADn

direk

elektron

transferini

temel alan

elektrokimyasal

sistemlerde

kullanmnda FAD ile kullanlan elektrot arasndaki etkileimlerin iyi bilinmesi gerekmektedir. FAD ekil 3.3te grld gibi aromatik gruplar ve ift balardan olumaktadr. Bu yapsndan dolay karbon ve metal yaplara tutunduu bilinmektedir (Wei and Omanovic, 2008).

ekil 3.3. FADn molekler yaps. FADn elektrokimyasal sistemlerde kullanm iin immobilizasyonun salanaca fonksiyonel gruplarn oluturulmas esastr. mmobilizasyon iin adsorbsiyon ve kovalent balama yntemleri sklkla kullanlmaktadr. FAD karbon elektrot yzeyine immobilize edilmeden nce yaln karbon elektrodun FAD ieren tampon zelti iindeki davran 0.1 M, pH 7 PBS iinde (-1V)-(0V) potansiyel aralnda dnml voltametri yntemiyle incelenmi bylece FADn indirgenip ykseltgendii potansiyel aral gzlemlenmitir. alma kapsamnda karbon elektrotlar zerinde FADn immobilize olabilecei fonksiyonel gruplar oluturmak amacyla yzey modifikasyolar yaplmtr. Bu
48

amala yzeyde FADn amin gruplarnn balanabilecei COOH gruplar oluturmak iin 2 yntem denenmitir. ilk olarak karbon elektrotlar slfrik asit (H2SO4) iinde elektrokimyasal olarak aktifletirilerek karboksil gruplar (COOH) oluturulmutur (Wei et al., 2008). kinci yntemde ise elektrot yzeyinde anilinakrilik asit kompozit redoks polimeri oluturularak COOH gruplar

oluturulmutur (Raitman et al., 2002). a) Elektrokimyasal immobilizasyonu: Karbon elektrotlar 0.5 M H2SO4 iinde (-1.4V) (1.9V) potansiyel aralnda 0.1 Vs-1 tarama hznda 100 dng yaptrlarak elektrokimyasal olarak aktifletirilmitir. Yaplan elektrokimyasal aktifletirme ile karbon elektrot yzeyinde karboksil gruplar oluturulmutur. oluumu gsterilmektedir. ekil 3.4te karbon elektrot zerinde COOH grubu olarak aktifletirilen karbon elektrot yzeyine FAD

ekil 3.4. Karbon elektrot yzeyinde elektrokimyasal oksidasyon ile fonksiyonel grup oluumu (Wei et al., 2008). Elektrokimyasal aktivasyon ile yzeyde oluturulan COOH gruplar zerine FAD immobilizasyonu; 50M FAD ieren 0.05 M pH 7 fosfat tamponu iinde elektrotlarn 25Cde 12 saat inkbe edilmesiyle salanmtr. FAD

immobilizasyonunun ematik gsterimi ekil 3.5te verilmitir.

49

ekil 3.5. FAD ve fonksiyonel karboksilik asit gruplar arasnda kovalent balanma. b) Anilin-akrilik asit kompozit redoks polimeri zerine FAD immobilizasyonu: Karbon elektrot yzeyinde anilin-akrilik asit kompoziti oluturulmutur. Kompozit film oluumu 0.1 M H2SO4 ve 0.5 M Na2SO4 ieren pH 1.8 zelti iinde 0.2 M anilin ve 15 mgmL-1 akrilik asitin (-0.1V)-(+1.1V) potansiyel aralnda 0.1 Vs-1 tarama hznda 5 dngde elektropolimerizasyonu ile oluturulmutur. ekil 3.6da An-akrilik asit kompozit film oluumu ematize edilmitir.

ekil 3.6. Polianili/poli(akrilik asit) kompozit film modifikasyonu (Raitman et al., 2002). Anilin/akrilik asit kompozit filmi zerine FAD immobilizasyonu; 1,5x10-4 M FAD ve 1x10-3 M EDC ieren 0.01 M pH 7 HEPES tampon zeltisi iinde elektrotlarn 25Cde 2 saat inkbe edilmesiyle salanmtr. FAD immobilizasyonunun ematik gsterimi ekil 3.7de verilmitir.

50

ekil 3.7. FAD ve fonksiyonel karboksilik asit gruplar arasnda kovalent balanma.
2. Aama: Glukoz oksidaz apo-enziminin hazrlanmas

FAD glukoz oksidazn apo-enzimine kuvvetli balarla balanmtr ve diyaliz yntemleriyle ayrlamazlar. Glukoz oksidaz protein yapda olan apo-enziminden ayrmak iin (NH4)2SO4 ile asidifikasyon ilemi yaplmtr. Doygun (NH4)2SO4 zeltisi 25Cde 2.5N H2SO4 ile pH 1.4e kadar asitlendirilmitir. GOD enzimi 0.1M, sodyum asetat tamponunda 250Lde 5mg olacak ekilde hazrlanmtr. Hazrlanan enzim zeltisi -5Cde pH 1.4 (NH4)2SO4 zeltisine ilave edilmi ardndan 5000 rpmde, -5Cde, 15 dakika santrifjlenmitir. Santrfj ileminden sonra spernatant ayrlarak spektrofotometrede okunmu ve ayrlan FAD miktar belirlenmitir. kelti ise alnarak 2.5 M sodyum asetat tamponu ile 0Cde ntralletirlimitir. Ardndan renksiz protein keltisi ntral (NH4)2SO4 (%90 doygunlukta) ile tekrar ktrlm ve 0.1 M pH 5.6 sodyum asetat tamponu ile zlmtr (Savitri and Mitra, 1998). Elde edilen apo-enzim 0-4Cde pH 5.6da sakland srece FADa balanma kapasitesi 3-4 hafta devam etmektedir ekil 3.8de apo-enzim ve FADn ayrl ematize edilmitir.

ekil 3.8. GOD enziminde FAD ve apo-enzimin ayrlmas.

51

3. Aama:

Apo-enzimin

mmobilize

FAD

zerine

Yeniden

Yaplandrlmas

FAD immobilize edilmi karbon elektrotlar apo-enzim ieren pH 5.6, 0.1M sodyum asetat tamponunda 0-4Cde 12 saat inkbe edilmilerdir. ekil 3.9de apo-enzimin yeniden yaplandrlmas gsterilmektedir.

ekil 3.9. Apo-enzimin FAD immobilize edilmi elektrot zerine yeniden yaplandrlmas. Apo-enzimin FAD bal elektrotlar zerine yeniden yaplandrld elektrot zerinde dnml voltametri incelemesi yaplmtr. Bu amala elektrodun 50 mM glukoz ve tampon ortamnda (pH 7.0 potasyum fosfat tamponu) 0-0.7 V potansiyel aralnda dnml voltamogram incelenmitir.
3.3. Elektrot Performans almalar

Yaln karbon elektrotlar zerine farkl immobilizasyon yntemleri kullanlarak enzimlerin tutukland enzim elektrotlaryla performansa etki eden evresel koullarn deerlendirildii elektrokimyasal lmler yaplmtr. Enzim elektrodunun tasarm srasnda kullanlan ve sonrasnda da performansnn incelendii sistem elektrokimyasal alma istasyonu elektroliz hcresi ve elektrotlar muhafaza eden hcre standndan olumaktadr. Deneyler l elektrot sistemi ile yrtlmtr. Karbon elektrotlarn modifiye edilmesiyle oluturulan enzim elektrodu sisteme alma elektrodu olarak balanm; referans elektrodu olarak gm/gm klorr (Ag/AgCl) elektrot ve kart elektrot olarak da platin (Pt) elektrot kullanlmr. ekil 3.10da elektrokimyasal alma istasyonuna bal elekroliz hcresi (l elektrot sistemi) grlmektedir.

52

ekil 3.10. Elektrokimyasal alma istasyonuna bal l elektrot sistemi. Farkl immobilizasyon yntemleriyle oluturulan enzim elektrotlarnn

performanslarnn deerlendirildii elektrokimyasal lmler potansiyostat galvonostat cihaznda uygulanan kronoamperometri deneylerini iermektedir. Kronoamperometri ynteminde (CA, chronoamperometry) alma elektrodu ile referans elektrodu arasna sabit potansiyel uygulanr ve zamana kar hcredeki alma elektrodu ile kart elektrot arasndaki akm llr. Elektrot performans almalar kapsamnda ortam pHsnn, scakln ve substrat konsantrasyonunun elde edilen enzim elektrotlarnn performansna etkisi incelenmitir. Elektrokimyasal immobilizasyon ve kovalent balama yntemleri ile oluturulan enzim elektrotlar performans hazrlanan almalar enzim yaplmtr. ise Enzimin kinetik yeniden verilerin

yaplandrlmasyla

elektrodunda

gzlenebilmesi asndan literatrden alnan pH ve scaklk deerlerinde substrat konsantrasyonunun akm younluuna etkisi incelenmitir.
3.3.1. Ortam pHsnn Etkisi

Farkl immobilizasyon yntemlerine gre hazrlanan enzim elektrotlarnn pH 5-pH 8.5 aralndaki performanslar incelenmitir. Bu amala kronoamperometri yntemi ile 0.4 V sabit potansiyelde 600 saniye sre ile enzim elektrotlarnn farkl pHlardaki 0,1 M fosfat tamponu ile oluturulmu 50 mM glukoz ieren zeltilerindeki akm-zaman grafikleri elde edilmitir. Bu grafiklere gre de pHnn akm younluuna etkisi incelenmitir.

53

3.3.2.

Scakln Etkisi

Farkl immobilizasyon yntemlerine gre hazrlanan enzim elektrotlarnn farkl 10C-60C scaklk aralndaki performanslar incelenmitir. Bu amala

kronoamperometri yntemi ile 0.4 V sabit potansiyelde 600 saniye sre ile enzim elektrotlarnn 0.1 M, pH 7 fosfat tamponu ile hazrlanm 50 mM glukoz zeltisi iindeki akm-zaman grafikleri elde edilmitir. Bu grafiklere gre de scakln akm younluuna etkisi incelenmitir.
3.3.3. Enzim Elektrodunun Kalibrasyonu

Hazrlanan enzim elektrotlarnda substrat konsantrasyonunun akm younluuna etkisi incelenmitir. Bu amala kronoamperometri yntemi ile 0.4 V sabit potansiyelde 600 saniyelik sre ile enzim elektrotlarnn 2.5 mM-100 mM glukoz konsantrasyonlarndaki zeltilerinde akm-zaman grafikleri elde edilmi

kalibrasyon grafikleri karlmtr. Elde edilen bu verilerle de kinetik parametreler (Km, Imax) incelenmitir. almalar kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemleri iin optimum bulunan pH ve scaklk deerlerinde, apoenzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde ise literatrden alnan pH 7, 25C ortam koullarnda gerekletirilmitir.
3.4. Enzim Elektrodunun Biyoyakt Pilinde Test Edilmesi

Elektrokimyasal immobilizasyon ve kovalent balama yntemleri ile oluturulan enzim elektrotlar anot bileeni olarak kullanlarak enzimatik biyoyakt pilinde test edilmitir. Enzimin yeniden yaplandrlmasyla hazrlanan enzim elektrodunda ise stabilizasyon problemi olduundan bu aamada kullanlamamtr. Oluturulacak biyoyakt pilinin katot bileeninin hazrlanmas aada sunulmutur.
3.4.1. Biyokatot Hazrlanmas

Biyokatot hazrlanmas aamasnda elektrokimyasal immobilizasyon, potansiyostat galvonostat cihaznda mixed mode denilen bir yntemin uygulanmasyla kronoamperometri gerekletirilmitir. lk olarak enzim ile medyatrn yzeyde adsorplanmas iin karbon elektrotlar Lakkaz ve ABTS ieren 0.1 M potasyum fosfat tamponu ile hazrlanm 3 mL zelti ierisinde 4oCde 12 saat inkbe edilmitir. Daha sonra inkbe edilen
54

ve

kronopotansiyometri

yntemleri

birlikte

kullanlarak

elektrotlar 0.275 mg/ml Lakkaz, 6,6.10-3 M ABTS, 0.02 M Py ieren 0.1 M pH 7 PBS iinde 0.9 V sabit potansiyelinde yk kontroll olarak kaplanmtr.
3.4.2. Enzim Elektrot Performanslarnn Biyoyakt Pilinde Deerlendirilmesi

Biyoanot olarak kullanlan kovalent balama ve elekrokimyasal immobilizasyon yntemleriyle hazrlanan enzim elektrotlar ve biyokatot olarak tasarlanan PPyABTS-Lakkaz kapl karbon elektrot bir hcre ierisine yerletirilerek lmlerin yapld harici bir multimetreye balanmtr (ekil 3.11).

ekil 3.11. Biyoyakt hcresi kurulumu. Kurulan biyoyakt hcresinde ak devre potansiyelleri, ksa devre akm younluu ve farkl diren deerlerinde verdikleri g kt deerleri dijital multimetreyle harici diren kullanlarak kurulan devrede llmtr. Bu deerler ile farkl

immobilizasyon yntemleriyle oluturulmu enzim elektrotlarnn performans deerlendirmeleri yaplmtr.

3.5. Elektrot Yzeylerinin Karakterizasyonu

Hazrlanan enzim elektrotlarnn fiziksel ve kimyasal yaplarnn incelenmesi amacyla FTIR (Fourier Transform Kzltesi Spektroskopisi) ve AKM (Atomik Kuvvet Mikroskobu) analizleri yaplmtr.
3.5.1. FTIR (Fourier Transform Kzltesi Spektroskopisi) Analizi

Farkl

immobilizasyon

yntemlerine

gre

hazrlanan

enzim

elektrotlarnn

modifikasyon basamaklarnda kimyasal yaplarnn tayini iin Fourier Transform Kzltesi Spektroskopisi (FTIR, Vertex, 80, Bruker, Almanya) kullanlmtr. Modifiye edilmi karbon elektrot yzeyleri zerinden 650-4000 cm-1 dalga boyu aralnda analiz yaplmtr.

55

3.5.2.

AKM (Atomik Kuvvet Mikroskobu) Analizleri

Farkl immobilizasyon yntemleri baz alnarak hazrlanan enzim elektrotlarnn modifikasyon basamaklarnda fiziksel yaplarnn tayini iin AKM Atomik Kuvvet Mikroskobu (Ambios, USA) cihaz ile grntleme yaplmtr.

56

4.

DENEYSEL SONULAR VE TARTIILMASI

Sunulan alma, biyosensr ve biyoyakt pili uygulamalarnda enzimatik dnme dayal olarak tasarlanan elektrotlarn aktif biyomolekl olarak kullanlan enzim ile birletirilmesi iin uygulanan yntemleri kapsamaktadr. Bu kapsamda yaplan almann amac, enzimin elektrot ile birletirilmesinde uygulanan farkl immobilizasyon yntemlerinin elektrot ile enzimin redoks merkezi arasndaki elektriksel iletime etkisinin aratrlmas ve gelitirilmesidir. Sunulan alma, GOD elektrodu tasarm, hazrlanan GOD elektrotlarn performans deerlendirmeleri, elde edilen sonulara gre saptanan koullarda hazrlanan elektrodun biyoyakt pilinde test edilebilmesi ve elektrot yzey karakterizasyon basamaklarnda gerekletirilmitir. zlenen alma basamaklar aada verilmi ve alnan sonular ve deerlendirilmesi ilgili blmlerde aklamalarla sunulmutur.
GOD elektrodu hazrlanmas.

Karbon

ubuklar

zerine

enzim

immobilizasyonu iin farkl yntemler uygulanmtr. Herbir yntem incelenen alma koullarnn etkisi aada verilmitir. Enzimin kovalent balanmas. GOD (enzim) konsantrasyonunun etkisi DMAMFc (medyatr) konsantrasyonunun etkisi Hazrlanan elektrodun dnml voltametri incelemesi Enzimin elektropolimerizasyon ile iletken polimere hapsedilmesi. Elektropolimerizasyonda geen yk miktarnn etkisi Enzim konsantrasyonunun etkisi Medyatr konsantrasyonunun etkisi Hazrlanan elektrodun dnml voltametri incelemesi Enzimin apo-enzim ve ko-enzim bileenleri ile yeniden yaplandrlmas.
GOD elektrodun performans. ncelenen immobilizasyon koullarnn

etkilerine dayanarak saptanan optimum koullarda hazrlanan elektrotlarn

57

performans test edilmitir. Bu amala, aada verilen parametreler incelenmitir. Ortam pHsnn etkisi Scakln etkisi Enzim elektrodunun kalibrasyonu Kinetik parametreler, KM ve Imax deerlerinin saptanmas
GOD elektrodun biyoyakt pilinde test edilmesi. Uygulanan immobilizasyon

yntemlerinin saptanan optimum koullarnda elde edilen elektrotlar, uygulama olarak hazrlanan biyayakt hcresinde test edilmitir. Biyoyakt hcresi performansn veren almalar aada verilen kapsamda

gerekletirilmitir. Ak devre potansiyelleri Ksa devre akm younluu G younluu

GOD elektrot yzey karakterizasyonu. Farkl immobilizasyon yntemleri ile

hazrlanan elektrot yzeylerindeki modifikasyonlar sonucu oluan fiziksel ve kimyasal deiimler, AKM ve FTIR analizleri ile saptanmtr.
4.1. Enzim Elektrodu Hazrlanmas

Elektriksel iletiminin gelitirilmesi amacyla uygulanan farkl enzim immobilzasyon yntemleri ile elde edilen elektrotlara uygulama koullarnn etkisi incelenmi ve sonular tartma ve karlatrmalarla bu blmde sunulmutur. Enzim

elektrotlarnda enzim immobilizasyonu iin elektrot malzemesi olarak platin, altn, karbon vb. eitli malzemeler kullanlmaktadr. Uygulamaya ynelik ve bir elektrottan istenen zelliklere gre elektrot malzemesi seilmektedir. Bu almada, Yksek saflkta elde edilmesi yi elektrik iletkenlii
58

Dk maliyeti Yksek sl iletkenlii Dk younluu Geni potansiyel aral eitli fiziksel yapda elde edilebilirlik

gibi zelliklerinden dolay karbon, elektrot materyali olarak seilmitir. Enzim elektrodu oluturmak zere yaplan deneylerde %99.99 saflkta 3.06 mm apndaki grafit elektrotlar kullanlmtr. Kullanlan elektrotlarn hcre ierisinde aktif olan yzey alan 0.074 cm2dir. Enzim elektrodu tasarm iin seilen karbon elektrot zerine kovalent balama, elektrokimyasal immobilizasyon ve apo-enzimin yeniden yaplandrlmas

yntemleri ile GOD enzimi immobilize edilmitir. Sunulan tez kapsamnda enzim immobilizasyonu yntemlerinde iletken polimer olarak polipirol (PPy) ve polianilin (PAn) monomeri, elektron medyatr olarak dimetilaminometilferrosen (DMAMFc) kullanlmtr. Polipirol yaygn olarak kullanlan yksek elektriksel iletkenlik ve termal stabiliteye sahip, biyouyumlu yar iletken polimerlerden birisidir (Nastase et al., 2005). Bu sebeple kovalent balama ynteminde ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemlerinde Py monomeri kullanlmtr. An ise kararl yaps, uygun fiyat ve kolay sentezlenebilir olmasndan dolay tercih edilen bir dier iletken polimerdir. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas almalarnda karboksil grubu yaratmak amacyla An monomeri ile akrilik asit birlikte kullanlarak allmtr. An dk pHlarda daha aktiftir. Bu zellik enzim gibi ntral pHlarda aktif olan biyomolekllerin varlnda Anin kullanmn kstlamaktadr. Ancak An, akrilik asit ile kompozit film oluturulduunda pHdan bamsz olmaktadr. Bu sebeple almalarda An-akrilik asit kompozit filmi zerinde allmtr. Elektron transferini arttrmak amacyla kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemlerinde medyatr olarak kararl, tersine evrilebilir redoks zellikleri olan, enzim aktif merkezinin redoks potansiyelinden yksek redoks
59

potansiyele sahip ve termodinamik adan kendiliinden ilerleyen bir reaksiyona olanak salayan dimetilaminometil ferrosen (DMAMFc) bileii kullanlmtr. Enzim elektrodu hazrlamada GODn karbon elektrot yzeyine immobilizsyonu iin uygulanan farkl yntemlere ait bulgular aada sunulmutur.
4.1.1. Enzimin Kovalent Balamas

Enzimin kovalent balanmasyla oluturulan enzim elektrodu; Karbon elektrot yzeyine elektropolimerizasyonla PPy kaplanmas PPy kapl karbon elektrotlara GA apraz balayc ajan ile GOD ve DMAMFcnin kovalent olarak balanmas olmak zere 2 aamada gerekletirilmitir. Deneysel almalar ksmnda detayl olarak anlatlan pirol monomerinin elektropolimerizasyonu, kronopotansiyometri ve kronoamperometri yntemlerinin bir arada kullanmyla gerekletirilmitir. Sistemimizde var olan bu kombine yntem (mixed mode) ile pirol kaplama zeltisi iinde kaplanacak karbon elektroda 0.7 V sabit potansiyelde 300 mC/cm2 polimerizasyon yknde kaplama yaplmtr. Pirol elektropolimerizasyonuyla kaplanan elektrotlar, 0.1 M, pH 7 PBS iinde sabit akm grlene kadar ykseltgenmitir. Elektropolimerizasyonda anodik oksidasyon polimerizasyonu olarak bilinen piroln polimerleme reaksiyonu aamada gerekleir. ncelikle gerekleen tepkime, dimer oluturmak iin baka bir radikal katyonla etkileen veya monomere elektrofilik olarak saldran radikal oluumudur. Oluan radikal katyonu baka bir radikal katyonu ile dimerleir. Bu esnada 2 H+ aa kar. Sonrasnda, dimerik yap monomere gre biraz daha dk bir potansiyelde ykseltgeneceinden dimerik yap ayn yolla byr ve polimer meydana gelir. Elektrokimyasal sentez srasnda oluan polipirol, elektrot yzeyinde znmeyen bir kelti verir. ekil 4.1de pirol elektropolimerizasyonu gsterilmektedir.

60

ekil 4.1. Pirol elektropolimerizasyonu. ekil 4.1 sabit potansiyel (0.7 V) altnda 300 mC/cm2lik ykle gerkeleen polimerizasyon srasnda, zamana kar elektrot zerinden geen akm deiimini gstermektedir. Elektropolimerizasyon ileminden sonra PPy kaplanan elektrot 0.1 M, pH 7 PBS iinde sabit akm grlene kadar 0.7 Vde kronoamperometri yntemiyle ykseltgenmitir (ekil 4.2). Oluturulan filmin elektron iletme kapasitesi iletken filmin ykseltgenmi olmasyla ilgilidir.

ekil 4.2. PPy iletken filminin ykseltgenmesi. Yzeyde oluturulan filmin varln test etmek amacyla dnml voltametri ynteminde, PPy kaplanm ve kaplanmam yaln karbon elektrotlarn tampon zelti ierisinde uygulanan gerilime verdii cevaplar karlatrlmtr (ekil 4.3).

61

ekil 4.3. PPy kapl ve kapsz karbon elektrotlarn dnml voltamogram (0.1 M, pH 7 PBS). ekil 4.3 incelendiinde PPy kaplanm yzeydeki potansiyel taramas srasnda geen akmn daha yksek olduu grlmektedir. Bu da PPy kaplamann karbon elektrodun elektroaktivitesini arttrdn gstermektedir. Elektrot yzeyinde

oluturulan PPy, enzim ile elektrot arasndaki elektron transferini arttrmasnn yansra enzim immobilizasyonu iin fonksiyonel yapda yzey salamaktadr.
4.1.1.1. mmobilizasyon Parametreleri

Kovalent

balama

ynteminde

enzim

ve

medyatr

konsantrasyonunun

immobilizasyona etkisinin incelendii deneylere ait sonuar bu blmde verilmitir. Enzim Konsantrasyonu almann bu ksmnda PPy ile kaplanm karbon yzeylere GOD

immobilizasyonu, sabit medyatr konsantrasyonunda, enzim konsantrasyonu 3-18 mgmL-1 aralnda deitirilerek gerekletirilmitir. mmobilizasyon yntemi Deneysel almalar blmnde detayl olarak anlatlmtr. Farkl enzim konsantrasyonlarnda hazrlanan elektrotlarn verdikleri amperometrik cevaplar 50 mM glukoz zeltisi iinde kronoamperometri yntemiyle llm ve GOD konsantrasyonunun akm younluuna etkisi incelenmitir (ekil 4.4).

62

ekil 4.4. Enzim konsantrasyonunun akm younluuna etkisi (50mM glukoz zeltisi, 0.1 M, pH 7.0 PBS). ekil 4.4 incelendiinde 0.40 Vta en yksek cevabn enzim konsantrasyonunun 9 mgmL-1 olduu durumda elde edildii grlmtr. Kullanlan 9 mgmL-1lik stok enzim zeltisinin 15 L ilavesi ile 28 Llik immobilizasyon ortamndaki GOD konsantrasyonu 4.8 mgmL-1 olmaktadr. 9 mgmL-1dan dk ve yksek enzim konsantrasyonlar kullanldnda akm younluunda d meydana ortamdaki enzim gelmitir. glukozu Bunun nedeni dk kadar enzim GOD

konsantrasyonlarnda bulunmamasdr.

ykseltgeyecek akm

Yksek

konsantrasyonlarnda

younluunun

azalmas ise enzim molekllerinin st ste yn oluturacak ekilde elektrot zerinde birikmesidir. Bunun sonucunda GODn aktif merkezi dier enzim moleklleri tarafndan engellenmi durumda olmakta ve bu sterik engel sonucunda dk akm younluklar elde edilmektedir. Medyatr Konsantrasyonu Bir enzim elektrodunda ortamdaki glukozu ykseltgeyecek kadar GOD bulunsa bile medyatr miktarnn az olduu durumda elektron trasnferini salayacak ajanlar yetersiz kalacandan elde edilen akm younluklar medyatr konsantrasyonuna bal kalacaktr. Bu sebeple GOD enzim elektrodu tasarm yaplrken nce enzim daha sonra medyatr konsantrasyonunun optimizasyonu yaplmtr.

63

Stok medyatr zeltisi konsantrasyonunun 6-80 mM arasnda deitirilerek, stok enzim zeltisinin konsantrasyonunun 9 mgmL-1de sabit tutularak yaplan immobilizasyon, Deneysel almalar blmnde detayl olarak anlatlmtr. Elde edilen elektrotlarn performans 50 mM glukoz zeltisi ierisinde kronoamperometrik yntemle 600 saniye sre ile test edilmitir. Medyatr konsantrasyonunun akm younluuna etkisi ekil 4.5te verilmitir.

ekil 4.5. Medyatr konsantrasyonunun akm younluuna etkisi (50mM glukoz zeltisi, 0.1 M, pH 7.0 PBS). 50 mM glukoz zeltisinde elektrot performanslar incelendiinde (ekil 4.5) 60 mM DMAMFcnin immobilizasyonda yer almas durumunda optimum akm younluu gzlenmektedir. 6-60 mM arasnda DMAMFc konsantrasyonu arttka akm younluunun da artt, 60 mM zerindeki DMAMFc konsantrasyonlarnda ise akmn sabit kald grlmtr. Bunun sebebi ortamdaki enzim miktarn karlayacak medyatr konsantrasyonuna ulalana kadar akmn artmas daha sonra ise aa kan elektronlarn kayna olan enzim miktar sabit olduundan akmn medyatrden bamsz olmaya balamasdr. nk gzlenen akmn asl sebebi elektrotta meydana gelen enzimatik tepkimedir. Medyatr moleklleri ise aa kan elektronlarn enzim moleklleri ve elektrot arasnda tanmn salar. Dolaysyla arac olan bu molekllerin konsantrasyonu enzim molekllerinin aa kard elektronlar karlayacak konsantrasyona ulatnda sabitlenmitir.

64

Etanol iinde 60 mMlk (optimum konsantrasyon) stok DMAMFc zeltisinden 8 L ilavesi ile DMAMFcin 28 Llik immobilizasyon ortamndaki konsantrasyonu 17 mM olmaktadr.
4.1.1.2. Enzim Elektrodunun Dnml Voltametri ncelemesi

Yukarda

yaplan

almalarda

enzim

ve

medyatr

konsantrasyonunun

immobilizasyona etkisi incelenmitir. Bu almalar sonucunda 60 mM DMAMFc ve 9 mgmL-1 glukoz oksidaz deerleri, kovalent balama yntemiyle enzim tutuklama iin optimum deerler olarak saptanmtr. Hazrlanan bu elektrodun tampon ve 50 mM glukoz zeltisinde elde edilen dnml voltametri incelemesi ekil 4.6da verilmitir.

ekil 4.6. Enzim elektrodunun dnml voltamogram (0.1 M, pH 7.0 PBS).

4.1.2. Elektrokimyasal mmobilizasyon

Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle enzim elektrodu hazrlanmasnda immobilizasyona etki edecek potensiyostatik elektropolimerizasyon srasnda geen yk miktar, enzim konsantrasyonu, medyatr konsantrasyonu gibi immobilizasyon parametrelerine ait sonular ve yorumlar bu blmde verilmitir.
4.1.2.1. mmobilizasyon Parametreleri

Elektropolimerizasyonda Geen Yk Miktar Polimerizasyon srasnda elektrottan geen yk miktar deitirilerek film kalnl kontrol edilebilmektedir. Deitirilen film kalnl ile birlikte yklenen enzim miktar

65

da deimektedir. Film kalnlnn enzim immobilizasyonuna iki etkisinin olduu sylenebilir. Bunlar kalnln fazla olmas durumunda oksitlenerek glukonolaktona dnecek olan glukozun film ierisinde tutuklu bunlunan enzime ulamas srasnda difzyon bariyeri olumas ve kalnlnn ince olmas durumunda ise yksek g younluu iin gerekli olan tutuklanm enzim miktarnn az olmasdr. Bu etkiler gz nne alnarak, almann bu ksmnda film kalnlnn enzim yklemesine, dolaysyla elektrot yzeyindeki enzimin glukozun ykseltgenme reaksiyonunu katalizlemesindeki rol incelenmitir. Bunun iin elektropolimerizasyon zeltisindeki GOD (4 mgmL-1) ve DMAMFc (5 mM) konsantrasyonlar sabit tutularak uygulanan 0.9 V elektropolimerizasyon

potansiyeline kar elektrottan geen yk miktarlar deitirilmitir. 100 mC ile 2000 mC arasnda deien farkl polimerizasyon ykleriyle enzim ve medyatr tutuklamas gerekletirilmitir. Elektrotlarn 0.1 M pH 7.0 potasyum fosfat tamponuyla hazlanm 5, 10, 30 ve 50 mMlk glukoz zeltilerindeki davran medyatrn alma potansiyeli olan 0.40 Vta kronoamperometrik yntemle 600 saniye sre ile takip edilerek akmn davran ile glukoz konsantrasyonu arasndaki iliki incelenmitir (ekil 4.7).

ekil 4.7. Farkl yklerde hazrlanan elektrotlarda glukoz konsantrasyonunun akm younluuna etkisi (0.1 M, pH 7.0 PBS). Pirol elektropolimerizasyonu ile enzim tutuklamas srasnda polimerizasyon yknn elektrot performans zerindeki etkisinin incelenmesi iin

kronoamperometrik almalarda en yksek akm deerlerinin gzlendii 50 mM

66

glukoz konsantrasyonunda elektropolimerizasyon ykne kar elde edilen akm deerleri grafiksel olarak tartlmtr (ekil 4.8).

ekil 4.8. Yk miktarnn akm younluuna etkisi (50 mM glukoz, 0.1 M, pH 7.0 PBS). Grafiksel veriler sonucunda maksimum akm deerlerinin gzlendii 400 mC elektropolimerizasyon iin optimum yk deeri olarak bulunmutur. ekil 4.8 incelendiinde 400 mCdan dk deerlerde gzlenen akm dnn gerekletirilen elektropolimerizasyonda yeterli miktarda enzim tutuklanamad sonucuna varlmaktadr. 800 mCdan yksek deerlerde gerekletirilen

elektropolimerizasyonda ise film kalnlndaki art nedeniyle meydana gelen bir difzyon engelinden szedilebilmektedir. Bunun yannda polimerizasyon

ykndeki artla birlikte polimerizasyon sresi uzamakta ve 0.90 V gibi bir potansiyele maruz kalan enzimin yapsnda aktivitesinde dler meydana getirebilecektir. Ayrca pirol elektropolimerizasyonu srasndaki katyon oluumu nedeniyle ortaya kan protonlar nedeniyle ortamn pHndaki d yine aktivite kayplarna sebep olabilmektedir. Yk art nedeniyle ortaya kan proton konsantrasyonu da tartlabilecek bir kouldur. Enzim Konsantrasyonu Enzim elektrotlarnn kullanld biyoyakt hcresi almalarnda birim yzeyden elde edilen g younluunu arttrmak amacyla litaratrde eitli almalar bulunmaktadr. Bunlarn arasnda enzimin aktif merkeziyle elektrot arasnda dorudan iletiimin saland tek katmandan oluan tasarmlar veya bu
67

almada olduu gibi iletken polimerden oluan bir matrisin ierisinde gerekletirilen enzim tutuklamalar rnek olarak verilebilir. Tek katman enzim immobilizasyonunda enzim ile dorudan elektrot arasnda oluturulan bir balant var olduundan g younluklar ok katmanl yaplarda olduu gibi yksek miktarda enzim immobilizasyonuna bamllk fazla deildir. Ancak ok katmanl bir enzim tutuklamas gerekletirildiinde -glukoz oksidaz gibi elektron transferinin aktif merkez ve elektrot arasnda elektron transfer ajan olan medyatrlerle gerekletirildii durumlardaenzimler ynlendirilmemi olduklarndan ve

medyatr ile olan elektron alverileri direk elekron transferine gre yava olduu durumlarda yklenen enzim miktar nemli olmaktadr. almann bu ksmnda elektropolimerizasyon srasnda ortamdaki enzim konsantrasyonu 2-10 mgmL-1 arasnda deitirilerek enzim konsantrasyonunun etkisi incelenmitir. Bir nceki aamada optimum polimerizasyon yk olarak tespit edilen 400 mCluk yk ve 5 mM DMAMFc konsantrasyonu sabit tutularak farkl enzim konsantrasyonuyla hazrlanan 0.1 M Py, 0.1 M KCl ieren polimerizasyon zeltilerinde elektrot modifikasyonlar gerekletirilmitir (ekil 4.9).

ekil 4.9. Enzim konsantrasyonunun elektropolimerizasyona etkisi. ekil 4.9 incelendiinde farkl enzim konsantrasyonlar varlnda polimerizasyon srasnda elde edilen akm-zaman grafikleri incelenerek enzim konsantrasyonunun artmas ile birlikte polimerizasyon hznn dt grlmektedir. Bunun sebepleri olarak ok sayda enzim moleklnn yn oluturmas sonucu polimerlemede bir diren olarak rol oynamas, dolaysyla bu diren tabakasnn polimerizasyonda
68

en nemli faktr olduu bilinen katyon radikallerinin oluumunu engellemesi olarak aklanabilir. Farkl enzim konsantrasyonu kullanlarak hazrlanan elektrotlarn 0.1 M pH 7.0 potasyum fosfat tamponunda hazrlanan 50 mM glukoz konsantrasyonu ieren zeltideki performanslar grafiksel olarak incelenmitir (ekil 4.10).

ekil 4.10. Enzim konsantrasyonunun akm younluuna etkisi (50 mM glukoz, 0.1 M, pH 7.0 PBS). ekil 4.10a gre 0.40 Vta en yksek cevabn enzim konsantrasyonunun 4 mgmL1

olduu durumda elde edildii grlmtr. 4 mgmL-1dan dk enzim

konsantrasyonlar kullanldnda akmda ciddi bir d meydana gelmitir. Bunun nedeni enzim miktarnn azlnn glukozun ykseltgenme reaksiyonunda yetersiz kalmas olarak dnlebilir. 4 mgmL-1dan fazla enzim kullanld durumda ise benzer ekilde akmda yine belirgin bir d tespit edilmitir. Bunun sebepleri yukarda da belirtildii gibi enzim varlnn polimerizasyon hzn drmesidir. Ayn zeltide polimerizasyon yknde pay olan polimerizasyon srasndaki DMAMFc ykseltgenmesi de dnlrse bununla balantl olarak enzim konsantrasyonunun 400 mCa kar gelen film kalnl zerinde negatif bir etkiye sahip olduu sylenebilmektedir. Katyon oluumu ve dolaysyla

polimerizasyon inhibe olurken 0.40 Vta ykseltgenebilen DMAMFcnin elektroda difzlenip Faradaic akma giriim yaparak aslnda polimerizasyon yavalad anda bile devam ediyormu gibi grnmesine sebep olmaktadr. Sonu olarak 400 mCluk ykn geiine neden olan Faradaic admda piroln ykseltgenmesi

69

sonucu aa kan elektronlarla DMAMFcnin ykseltgenmesi sonucu ortaya kan elektronlarn rol elektrodun zelliklerini belirleyen etmendir. Litaratrde de pirol elektropolimerizasyonu srasnda enzim konsantrasyonunun polimerizasyon ve film zellikleri zerindeki benzer etkisi rapor edilmitir. Buna ek olarak enzim kosantrasyonundaki artla beraber filmdeki difzyonda da ciddi bir d olduu grlmtr. Dk film geirgenliinde iletken polimer bariyer rol oynad iin substratn filmden difzlenerek enzim moleklne ulamas zorlamaktadr. Yksek enzim konsantrasyonunun negatif etkisi ekil 4.10da da grlmektedir. Medyatr Konsantrasyonu Enzimin aktif merkezi olan FAD glukoz oksidaz tarafndan glukozun oksitlenmesi sonucu 2 ealarak FADH2ye dnmektedir. Daha sonra FADH2 bir nceki reaksiyonda ald 2 e-nu elektron transfer ajan olan DMAMFCye transfer ederek elektron iletimini salamaktadr (ekil 4.11). Bu nedenle enzimle elektrot arasnda elektron tama iini gerekletiren DMAMFcnin konsantrasyonunun birim elektrot bana elde edilen g younluu zerinde etkisi olduu dnlmektedir. Medyatr olarak kullanlan DMAMFcnin konsantrasyonunun dk olmas durumunda enzim yksek miktarda glukoz oksitleyebilecek kapasitede olsa bile elektron tama ajannn yetersiz miktarda olmas elektroda elektron aktarmnda olaynda medyatr konsantrasyonuna bal kalacaktr. Bu nedenle elektrodun performans zerindeki etkisi incelenen son parametre polimerizasyon srasnda ortamda bulunan medyatr konsantrasyonudur.

ekil 4.11. Ferrosen-GOD reaksiyonu. 0.1M potasyum fosfat tamponu (pH 7.0) ile hazrlanm 4 mgmL-1 glukoz oksidaz ieren polimerizasyon zeltisinin ierdii DMAMFc konsantrasyonu 3, 5, 7, 10 ve
70

15 mM olarak deitirilerek alma elektrodundan geen 400 mCluk ykle polimerizasyon gerekletirilmitir (ekil 4.12).

ekil 4.12. Medyatr konsantrasyonunun elektropolimerizasyona etkisi. ekil 4.12daki polimerizasyona ait akm-zaman grafikleri incelendiinde medyatr konsantrasyonundaki artla birlikte 400 mCluk yk geii daha ksa bir srede gerekleerek polimerizasyon tamamlanmaktadr. Burada medyatr

konsantrasyonundaki artla birlikte polimerizasyon hznda pozitif ynde bir etkiden bahsedilebilir. ekil 4.12a gre elde edilen elektrotlarn performans 50 mM glukoz zeltisi ierisinde kronoamperometrik yntemle 600 saniye sre ile test edilmi ve medyatr konsantrasyonunun akm younluuna etkisi incelenmitir (ekil 4.13).

ekil 4.13. Medyatr konsantrasyonunun akm younluuna etkisi.

71

ekil 4.12 ile ekil 4.13 birlikte yorumlanacak olursa buradan elde edilecek sonu ortamda 0.40 voltta ykseltgenen bir elektroaktif madde (DMAMFc) varken gerekletirilen elektopolimerizasyonda DMAMFcnin 0.90 V uygulanan

elektropolimerizasyon potansiyeli altnda Faradaic akma giriimde bulunarak 400 mCluk ykn hzl gemesidir. ekil 4.11deki 50 mM glukoz zeltisinde elektrot performanslar incelendiinde 5mM DMAMFcnin elektropolimerizasyonda yer almas durumunda optimum akm younluu gzlenmitir. DMAMFc

konsantrasyonunun artmasyla birlikte akmda d grlmtr. Buna iki ynden baklabilir. lk olarak artan medyatr konsantrasyonu ile birlikte ksalan polimerizasyon sresi nedeniyle PPy ile enzim tutuklanmas negatif olarak etkilendiinden gerekli miktarda enzim yklemesi salanamamtr. kincil olarak litaratrde eitli medyatr trlerinin enzim ile etkileerek (enzim fonksiyonel gruplar ile medyatr arasnda ba oluumu vs.) enzim aktivitesinde d yarattna dair bilgilere yer verilmektedir. DMAMFc iin byle bir almaya rastlanlmamtr, ancak artan medyatr konsantrasyonuyla birlikte gzlenen akm younluundaki azalmada pay olabilecei gz ard edilmemelidir.
4.1.2.2. Enzim Elektrodunun Dnml Voltametri ncelemesi

Yukardaki almalarda polimerizasyon yk, enzim konsantrasyonu ve medyatr konsantrasyonu gibi parametrelerin elektrot performans zerindeki etkisi kronoamperometrik yntemlerle incelenmitir. 5 mM DMAMFc ve 4 mgmL-1 glukoz oksidaz varlnda 400 mCluk yk ile elektropolimerizasyonla enzim tutuklamas gerekletirildiinde optimum deerlerin elde edilecei grlmtr. Bu

parametreler kullanlarak yaplan elektrodun 50 mM glukoz ortamnda (pH 7.0 potasyum fosfat tamponu) elde edilen dnml voltametri incelemesi ekil 4.14de verilmitir.

72

ekil 4.14. Enzim elektrodunun dnml voltamogram (0.1 M, pH 7.0 PBS).

4.1.3. Enzimin yeniden yaplandrlmas

Enzimin yeniden yaplandrlmas yntemiyle GOD enziminin kofaktr FAD ile elektrot arasnda dorudan bir iletiim kurularak direk elektron transferi amalanmaktadr. Doal GOD enziminde FAD glikoprotein yap tarafndan izole edilmi durumdadr. Bu yntem ile glikoprotein yapnn sebep olduu sterik engel almaktadr. Bu amala yaplacak almalar 3 aamada toplanmtr; Karbon elektrot yzeyine fonksiyonel gruplar yardmyla FAD

immobilizasyonu, GOD apo-enziminin FADdan ayrlmas, FAD immobilize edilmi karbon elektrot zerine apo-enzimin yeniden yaplandrlmas.
1. Aama: FAD mmobilizasyonu

Enzimin yeniden yaplandrld enzim elektrodunda GODn kofaktr olan FADn karbon elektrot yzeyine immobilizasyonu esastr. FAD karbon elektrot yzeyine immobilize edilmeden nce yaln karbon elektrodun FAD ieren tampon zelti iindeki davran dnml voltametri yntemiyle incelenmi bylece FADn indirgenip ykseltgendii potansiyel aral gzlenmitir (ekil 4.15).

73

ekil 4.15. Kapsz karbon elektrodun dnml voltamogram (0.1 M, pH 7.0 PBS). ekil 4.15 incelendiinde FADn kapsz karbon elektrot yzeyinde -0.5 Vde indirgendii, -0.4Vde ykseltgendii grlmektedir. FAD, bir riboflavinin, adenozin difosfat (ADP) moleklnn fosfat grubuna balanmasyla olumaktadr. Yapsndaki amin grubundan yararlanlarak karbon elektrot yzeyinde oluturulan COOH gruplar ile kovalent ba yapmas salanmaktadr. Karbon elektrot zerinde COOH grup oluturmak iin uygulanan Deneysel almalar blmnde detayl olarak verilen elektrokimyasal olarak aktifletirilen karbon elektrot yzeyine FAD immobilizasyonu ve anilin-akrilik asit kompozit redoks polimeri zerine FAD immobilizasyonu yntemlerinin sonular aada sunulmutur. a) Elektrokimyasal immobilizasyonu ekil 4.16 yzeyde COOH grubu oluturmak iin karbon elektrot yzeyinde yaplan elektrokimyasal aktivasyon ilemini gstermektedir. olarak aktifletirilen karbon elektrot yzeyine FAD

74

ekil 4.16. H2SO4te elektrokimyasal aktivasyon. Slfrik asit (H2SO4) iinde elektrokimyasal olarak aktive edilen karbon elektrotlarn yzeyinde COOH gruplar olumutur. FADn oluan bu fonksiyonel gruplar zerinden elektrot yzeyine immobilize edilmesi Deneysel almalar blmnde detayl olarak verilmitir. FAD immobilize edilmi elektrodun tampon zelti iindeki davran incelenerek yzeydeki FAD varl incelenmitir (ekil 4.17).

ekil 4.17. FAD bal karbon elektrodun dnml voltamogram (pH7, 0.1M PBS). ekil 4.17 incelendiinde H2SO4 aktivasyonuyla oluturulan fonksiyonel gruplara FADn immobilize olduunu grlmektedir. Bu ynteme ait voltamogram incelendiinde FADa ait indirgenme ykseltgenme pikleri bunu dorulamaktadr.
75

b) Anilin-akrilik asit kompozit redoks polimeri zerine FAD immobilizasyonu: ekil 4.18 karbon elektrot yzeyinde COOH grubu oluturmak iin An-akrilik asit kompozit filmi oluumunu gstermektedir.

ekil 4.18. An-akrilik asit kopolimeri oluumu. An-akrilik asit kompozit filmi oluturulmu karbon elektrotlarn yzeyinde COOH gruplar olumutur. FADn oluan bu fonksiyonel gruplar zerinden elektrot yzeyine immobilize edilmesi Deneysel almalar blmnde detayl olarak verilmitir. FAD immobilize edilmi elektrodun tampon zelti iindeki davran ekil 4.19de sunulmutur.

ekil 4.19. FAD bal elektrodun dnml voltamogram (pH7, 0.1M PBS).
76

ekil 4.19 incelendiinde An-akrilik asit kompozit filmiyle oluturulan fonksiyonel gruplara FADn immobilize olduu grlmektedir. Bu ynteme ait voltamogram incelendiinde FADa ait indirgenme ykseltgenme pikleri bunu dorulamaktadr.
2. Aama: Glukoz oksidaz apo-enziminin hazrlanmas

Deneysel almalar blmnde detayl olarak anlatlan GODn apo-enziminin ayrlmas ilemi sonucunda elde edilen FAD, 350nm dalga boyunda

spektrofotometrik olarak llmtr. Elde edilen veriler sonucunda %0,93 orannda FAD ieren GOD enziminden %0.43lk bir ayrma ilemi

gerekletirilmitir. Ayrma prosedr sadece spektrofotometrik lmn yapld aamada kalmayp sonraki basamaklarda da devam etmitir.
3. Aama: Apo-enzimin mmobilize FAD zerine Yeniden

Yaplandrlmas

Ayrlan

apo-enzimin

FAD

immobilize

edilmi

elektrot

yzeyine

yeniden

yaplandrlmas Deneysel almalar blmnde anlatlmtr. Elde edilen enzim elektrotlarn performanslarn tanmlamak zere tampon ve 50 mM glukoz zeltisinde (Ph 7, 0.1 M PBS) dnml voltamogramlar alnarak incelenmitir (ekil 4.20, ekil 4.21).

ekil 4.20. Elektrokimyasal olarak aktive edilmi karbon elektrot/FAD/apo-glukoz oksidaz enzim elektrodunun dnml voltamogram (pH7, 0.1M PBS).

77

ekil 4.21. An-akrilik asit kompozit filmi modifiye edilmi karbon elektrot/FAD/apoglukoz oksidaz enzim elektrodunun dnml voltamogram (pH7, 0.1M PBS). ekil 4.20 incelendiinde elektrokimyasal olarak aktive edilmi karbon

elektrot/FAD/apo-glukoz oksidaz enzim elektrodunun tampon ve 50mM glukoz zeltisinde ayn akm younluunu verdii grlmektedir. Buna gre yeniden yaplandrlan enzim elektrodunun almadn syleyebiliriz. Bunun sebebi apoenzimin FAD zerine yeniden yaplanrken uygun konfigrasyonda bulunamamas ve haloenzim yapsnn salanamamasdr. Doal bir GOD moleklnde FAD glikoprotein klf ierisine gml olarak bulunmaktadr. Bu konfigrasyonun yeniden yaplandrma yntemiyle salanabilmesi iin FAD ile elektrot yzeyi arasndaki mesafenin apo-enzimin tutunabilmesine uygun olmas gerekmektedir. An-akrilik asit kompozit filmi modifiye edilmi karbon elektrot/FAD/apo-glukoz oksidaz enzim elektrodunda ise tampon ve 50 Mm glukoz zeltisindeki akm younluklar arasnda byk bir fark grlmektedir (ekil 4.21). Bu da apo-enzimin uygun bir konfigrasyonda FAD zerine tutunabildiini ve haloenzimin katalitik aktivitesini gsterebildini ortaya koymaktadr. An-akrilik asit kompozit filmi ile FAD molekl arasndaki uzakln apo-enzimin yaplanmas iin uygun olduu grlmtr. Ancak bu yntemle elde edilen elektrodun stabilitesi iyi deildir. Birka kullanmdan sonra ayn glukoz konsantrasyonunda elde edilen akm younluklar dmektedir. Bunun sebebinin apo-enzim ve FAD arasndaki zayf balardan dolay apo-enzimin zeltiye gemesinden kaynakl olduu

dnlmektedir. Doal GOD enziminde FAD ile apo-enzim birbirine kovalent olmayan fakat dier iyonik ve elektriksel kuvvetlerle balanmtr. Apo-enzimin
78

yeniden yaplandrlmas ynteminde apo-enzimin yaklak %70inin FAD zerine tutunabilmektedir (Savitri and Mitra, 1998). Bu balanmann ise stabilitesini arttrmak amacyla farkl yaklamlar bulunmaktadr. Apoglukoz oksidaz ve FADn aktif kompleksini oluturabilmek amacyla apoglukoz oksidaz, antibadi gibi immnolojik olarak aktif olan balayc ajanlarala etkiletirilmektedir. Bu sayede apoglukoz oksidazn FAD ile balanmas iin affinitesi arttrlm olmaktadr. Ayrca bu amala aminlenmi FAD kullanm da olduka yaygndr (Katz et al., 1999). Her GOD molekl, iki molekl FADa baldr. Eer enzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde apo-enzimin balanaca yzeyde FAD

konsantrasyonunu fazla ise apo-enzim sadece bir molekl FAD ile balanabilir. Bu durumda da dk enzim aktivitesi grlebilmektedir.
4.2. Elektrot Performans almalar

Kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunda ortam pHsnn, scakln etkisine baklm ve kalibrasyonlar yaplmtr. Kalibrasyon grafikleri elde edilen enzim elektrotlarnn kinetik parametreleri (Km, Imax) deerlendirilmitir. Enzimin yeniden yaplandrlmasyla hazrlanan enzim elektrodunda ise stabilizasyon salanamadndan pH ve scaklk etkisine baklamamtr. Kinetik verilerin incelenebilmesi amacyla literatrden alnan pH 7, 25C koullarnda kalibrasyon erisi kartlmtr.

Stabilizasyon problemi olduu iin tm glukoz konsantrasyonlarnda ayn elektrot kullanlamamtr.

4.2.1. Ortam pHsnn Etkisi

Kovalent

balama

ve

elektrokimyasal

immobilizasyon

yntemlerine

gre

hazrlanan enzim elektrodu ile yaplan deneyler sonunda 0,4 Vde elde edilen amperometrik cevap akmlar pH ya kar grafie geirilerek ekil 4.22 ve ekil 4.23de verilmitir.

79

ekil 4.22. Kovalent balama yntemiyle oluturulmu GOD elektroduna pHnn etkisi.

ekil 4.23. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu GOD elektroduna pHnn etkisi. ekil 4.22 ve ekil 4.23 incelendiinde dk pH deerlerinde llen amperometrik cevap akm dk iken, yksek pH deerlerinde amperometrik cevap akmnn artt grlmektedir. Cevap akmndaki bu art optimum pH deerine yaklatka beklenen bir durumdur. Grafikler incelendiinde maksimum cevap akm pH 7.5te gzlenmitir. pH 7.5ten sonraki pH deerlerinde cevap akm tekrar azalmaya balamtr. Enzim ve substrat molekllerinde asidik ve bazik gruplarn iyonlama durumu, Enzim-Substrat (E-S) aktiflemi kompleksinin oluum hzn belirlemektedir. E-S kompleks oluumunun maksimum olduu kouldaki iyonlama durumunun saland pH deeri (7.5) alma pH deeri
80

olarak seilmitir. Bu koul dndaki iyonlama seviyelerinde (E-S) kompleksinin oluumu zorlaacak ve tepkime hz deceinden akmlardaki azalma beklenen bir durumdur. Literatre gre elektron alcs olarak molekler oksijen kullanld durumlarda GODn optimum pHs 5.5 civarndadr. Ancak ferrosen trevleri gibi fizyolojik olmayan elektron alclar (medyatrler) kullanld durumda ise bu deer pH 7.5e kadar kabilmektedir. Cass ve arkadalarnn yapt almada ferrosen trevlerinin reaksiyon hz sabiti iin ise bu deerin pH 6-9 arasnda olduu rapor edilmitir(Cass et al., 1984). ki yntem iin de optimum olarak bulunan pH 7.5 deeri literatr verileri ile uyumaktadr.
4.2.2. Scakln Etkisi

Kovalent hazrlanan

balama enzim

ve

elektrokimyasal ile

immobilizasyon deneyler

yntemlerine elde

gre edilen

elektrotlar

yaplan

sonunda

amperometrik cevap akmlar (0,4 V ve pH 7,5) scakla kar grafie geirilerek ekil 4.24 ve ekil 4.25te verilmitir.

ekil 4.24. Kovalent bal GOD elektroduna scakln etkisi.

81

ekil 4.25. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu GOD elektroduna scakln etkisi. ekil 4.24 ve ekil 4.25 incelendiinde dk scaklk deerlerinde enzimin dk aktivite gsterdii ve amperometrik cevap akmlarnn scaklk arttka artt grlmektedir. Maksimum cevap akmnn 35C da olduu gzlenmitir. 35 Cdan sonra enzimin aktivitesinin dt grlmektedir. Aktivitedeki bu dlerin enzimin protein yapsnn ve yksek scaklklarda denatre olmas ve bundan aktif merkezin ve enzim aktif merkezindeki koenzimin etkilenmesinden ileri geldii sylenebilir. Literatrde de deiik destek materyallere immobilize edilmi GOD iin 35C, 40 C gibi scaklklar bulunmutur. GOD bal enzim elektrodunda termal kstlama iki sebeple ortaya kmaktadr. Bunlardan birisi GOD enzimin 55C zerinde termal olarak inaktive olmas ikincisi ise gm gm klorr referans elektrodunun -10C ,+60C arasnda gvenilir olarak almasdr. Ayrca kullanlan medyatrn difzyon katsays da scaklkla deimektedir. Bu almada dikkate alnmam olsa da bu durum, allan scaklk aral seiminde nemli bir parametredir.
4.2.3. Enzim Elektrodunun Kalibrasyonu

Kovalent balama, elektrokimyasal immobilizasyon ve apo-enzimin yeniden yaplandrlmas yntemleri ile hazrlanan enzim elektrotlarnda substrat

konsantrasyonunun akm younluuna etkisi incelenerek kalibrasyon erileri karlmtr. Bu amala hazrlanan enzim elektrotlarnn amperometrik cevaplar

82

kronoamperometri ynteminde 0.4 Vde 600 saniye sre ile llerek grafie geirilmitir (ekil 4.26, 4.27, 4.28).

ekil 4.26. Kovalent balama yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun kalibrasyon erisi (pH 7.5, 35C). ekil 4.26. incelendiinde akm younluunun 2.5-60 mM glukoz deriimi

aralnda dorusal olarak artt, 60 mMdan sonra ise dorusallktan sapt grlmtr. 80 mM glukoz konsantrasyonundan sonra akm younluu glukoz konsantrasyonundan bamsz hale gelmitir.

ekil 4.27. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun kalibrasyon erisi (pH 7.5, 35C).

83

ekil 4.27 incelendiinde ise akm younluunun 2.5-10 mM glukoz deriimi aralnda dorusal olarak artt, 10 mM glukoz deriiminden sonra ise sapt grlmtr.

ekil 4.28. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmasyla elektrodunun kalibrasyon erisi (pH 7, 25C).

hazrlanan

enzim

ekil 4.28 incelendiinde akm younluunun 10-70 mM glukoz deriimi aralnda dorusal olarak artt, 70 mM glukoz konsantrasyonundan sonra sapt grlmtr.

Elde edilen kalibrasyon erileri (ekil 4.26, ekil 4.27, ekil 4.28 ) Michelis Menten eitliini ifade etmektedir. Michelis Menten eitlii amperometrik elektrot sistemlerinde E. 4.1deki gibi ifade edilmektedir. Imax [S] K m + [S]

I=

(4.1)

ynteme gre hazrlanan enzim elektrotlar karlatrlacak olursa apo-enzimin yeniden yaplandrlmasyla hazrlanan enzim elektrodunun daha yksek akm younluuna ulat grlmektedir. Bunun sebebi FADn dorudan elektroda bal olmasdr. Bu yntemle iin enzim molekllerinin transferi elektrot etkin zerindeki bir ekilde

konformasyonu

ayarland

elektron

gereklemektedir. Dier yntemlerde elektron transferini arttrmak amacyla

84

elektron medyatrleri kullanlmasna kar direk elektron transferinin daha etkili olduu ortaya kmaktadr. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemine gre hazrlanan enzim elektrodunda dk akm younluu elde edilmesinin sebebi GODn bu yntemde polimer iine tutuklanmasdr. Polimer iinde tutuklu bulunan enzim substratyla dorudan tepkimeye girememekte, difzyon kstlamas ortaya kmaktadr. Ayrca elektrot tasarmnda kullanlan enzim miktarnn dier yntemlere gre daha az olmas da dk akm younluuna sebep olmaktadr. mmobilizasyon ortamnda daha az enzim bulunan elektrokimyasal immobilizasyonla hazrlanm enzim elektrodu daha abuk doygunlua ulat iin dorusallktan sapma daha dk glukoz konsantrasyonunda olmutur. Kovalent balama yntemiyle oluturulan enzim elektrodunda ise elektrokimyasal yntemle hazrlanm elektrottan yksek akm younluuna ulalmtr. Bunun sebebi ise uygulanan yntemde immobilizasyon ortamndaki enzim miktarnn fazla olmasdr. mmobilizasyon parametreleri belirlenirken kovalent balama ynteminde son immobilizasyon immobilizasyon zeltisindeki ynteminde ise GOD GOD iin iin 4.8 4 mgmL-1, mgmL-1

elektrokimyasal

konsantrasyonlar optimum olarak bulunmutur. Bu sonular da kovalent balama ynteminde yzeye daha fazla enzim tutuklanabileceini gstermektedir. Kovalent balama yntemi iin 2.5-60 mM, elektrokimyasal immobilizasyon yntemi iin 2.5-10 mM, apo-enzimin yeniden yaplandrlmas yntemi iin ise 1070 mM glukoz konsantrasyonu aralnn dorusal blge olduu bulunmutur (ekil 4.26, ekil 4.27, ekil 4.28).
4.2.3.1. Enzim Elektrodunun Kinetik Parametreleri Km ve Imaxn Hesaplanmas

Enzim

katalizli

reaksiyonlardan

elde

edilen

akm

younluu,

substrat

konsantrasyonu art ile belli bir noktaya kadar artar. Kinetik ifadede akm younluunun substrat konsantrasyonundan bamszlaarak sabit kald nokta Imax deerini ifade etmektedir. Enzim ve substrat arasndaki affiniteyi ifade eden Km deeri ise saysal olarak, reaksiyon hznn Imaxa eit olduu noktadaki substrat konsantrasyonudur.

85

Kinetik parametrelerimizi oluturan Imax ve Km deerlerinin belirlenmesinde Michaelis-Menten kullanlmtr. Kovalent balama, elektrokimyasal immobilizasyon ve apo-enzimin yeniden yaplandrlmasyla hazrlanm enzim elektrotlarna ait Lineweaver-Burk erileri, aada sunulmutur (ekil 29, ekil 30, ekil 31). eitliinin dorusal biimi olan Lineweaver-Burk erisi

ekil 4.29. Kovalent balama yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun Lineweaver-Burk erisi.

ekil 4.30. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun Lineweaver-Burk erisi.

86

ekil 4.31. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas yntemiyle hazrlanm enzim elektrodunun Lineweaver-Burk erisi. Kovalent balama yntemiyle oluturulan enzim elektrodunun dorusallnn en iyi olduu [R2=0,9956] grlmektedir. Bu sonu kovalent balama ile oluturulmu enzim elektrodunun glukozun kantitatif tayini iin gvenle kullanlabileceini ifade etmektedir. ekil 4.30 ve ekil 4.31de verilen Lineweaver-Burk erilerinin dorusallnn ise daha dk olduu grlmektedir (R = 0.9862, R = 0.9528). Hazrlanan enzim elektrotlarnn kinetik parametreleri olan Km ve Imax deerleri Michelis Menten eitliinin dorusallatrlm hali olan; 1 Km 1 1 = + I Imax [S] Imax eitlii yardmyla hesaplanm ve izelge 4.1de verilmitir. izelge 4.1. Farkl immobilizasyon yntemlerine gre hazrlanm enzim elektrotlarnn Km ve Imax deerleri. mmobilizasyon Yntemleri Kovalent Balama Elektrokimyasal immobilizasyon Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas Km (mM) 19.87 7 27.4 Imax (A/cm2) 1250 833 2000
(4.2)

87

Km

deerinin

kk

olmas

enzimin

aktivitesinin

immobilizasyonla

ok

deimediini gstermektedir. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemine gre hazrlanm enzim elektrodunda dk Km deeri (7 mM), elektrodun aktivitesini gstermektedir. almalarnda Bu yntemle elde edilen enzim elektrodunun syleyebiliriz. sensr Dk kullanmnn ok uygun olduunu

hassasiyetteki bir enzim elekrodunda Imax deerine ulaabilmek iin daha fazla substrat konsantrasyonuna ihtiya duyulurken yksek hassasiyetteki bir enzim elektrodunda daha dk substrat konsantrasyonu yeterli olmaktadr. Kovalent balama ve apo-enzimin yeniden yaplandrlmasyla hazrlanan enzim elektrotlarnda ise elektrokimyasal immobilizasyon yntemine gre daha yksek Km deeri ve daha yksek Imax elde edilmitir. Bu yntemlere gre hazrlanan enzim elektrotlarnn ise daha yksek akm deerlerine kmas biyoyakt pillerinde anot bileeni olarak kullanma uygun olduunu gstermektedir. Yksek akm younluu elde edilen bir enzim elektrodu biyoyakt pili uygulamalarnda kullanld zaman daha yksek g younluu elde edilecektir. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmasyla direk elektron aktarm salandndan en yksek Imax deeri bu yntemde gzlenmitir.
4.3. Enzim Elektrodunun Biyoyakt Pilinde Test Edilmesi

Elektrokimyasal immobilizasyon ve kovalent balama yntemleri ile oluturulan enzim elektrotlar anot bileeni olarak kullanlarak enzimatik biyoyakt pilinde test edilmilerdir. Enzimin yeniden yaplandrlmasyla hazrlanan enzim elektrodunda ise stabilizasyon problemi olduundan bu aamada kullanlamamtr.
4.3.1. Enzim Elektrot Performanslarnn Biyoyakt Pilinde Deerlendirilmesi

Farkl

immobilizasyon

yntemlerine

gre

hazrlanan

enzim

elektrotlarnn

(biyoanot) biyoyakt pilindeki performanslar ak devre potansiyeli, ksa devre akm younluu ve farkl diren deerlerinde verdikleri g kt deerleri kapsamnda deerlendirilmitir. Bir elektrik devresinden hi akm gemezken llen potansiyele ak devre potansiyeli (OCP) denir. OCP, yakt pillerini karakterize eden nemli bir parametredir.

88

Biyokatot olarak kullanlan lakkaz elektroduna kar kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu biyoanotlar ile kurulan biyolojik yakt hcrelerinin ak devre potansiyelleri (OCP) srasyla 333 mV ve 456 mV olarak dijital multimetreden okunmutur. Literatrde yaplan benzer

almalara bakldnda 0.1 Vdan 1.0 V deerine kadar geni bir aralkta ak devre potansiyelleri ile karlalmaktadr. Yaplan almada bu araln iinde kalan bir ak devre potansiyeli elde edilmitir. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu enzim elektrodunda yksek OCP deerinin bulunmasnn sebebi elektrot yapsnda indirgenmi DMAMFc miktarnn fazla olmasdr. Yksek OCP, reaksiyon hzn arttrd ve yakt hcresine kendi kendini arj edebilme zellii kazandrmasndan dolay biyoyakt pillerinde istenen bir zelliktir. Biyoyakt hcresi iin bir dier nemli parametre olan ksa devre akm younluu, kovalent balama yntemiyle tasarlanan elektrotla kurulan hcrede 18.17 A/cm2 (0.85 diren altnda), elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle tasarlanan elektrotla kurulan hcrede 13.30 A/cm2 (0.85 diren altnda) olarak

bulunmutur. Daha yksek akm younluu gsteren kovalent balama yntemiyle oluturulmu elektrotta (Imax=1250 A) ksa devre akm younluunun fazla kmas beklenen bir sonutur. G Younluu bir pilin salayabilecei gc tanmlamas asndan nemli bir parametredir. Yakt pili elektrotlarnn birim yzey alanndan salad g miktar g younluu olarak tanmlanmaktadr. Bir yakt pilinden elde edilen elektriksel g voltaj ve akmn arpmna eittir. (P= Vhcre x I) Voltaj da akm ve diren arpm olarak tanmlandndan (Vhcre=I x R), bir pilin performansn deerlendirmek zere hesaplanan g younluu deerleri diren ve akmn karesinin arpmnn (P=I2xR) elektrot yzey alanna blnmesiyle bulunmaktadr. Biyoanot olarak tasarlanan kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemleri kullanlarak hazrlanan GOD elektrodu ve biyokatot olarak tasarlanan Lakkaz elektrodu ile kurulan biyoyakt hcresinin baland dijital multimetre ile devreye seri balanan farkl diren deerlerinde verdikleri akm deerleri alnmtr. 1 - 10 M aralndaki direnler devreye seri olarak balanarak oluturulan pil devresinden geen akm deerleri multimetreden okunmu ve elde edilen bu
89

verilerden hcre potansiyelleri ve g younluklar yukarda anlatld ekilde hesaplanmtr. Hesaplanan g younluu deerleri, her iki enzim

immobilizasyonuna gre hazrlanan elektrodun kullanld hcre iin deien hcre potansiyeline kar grafie geirilmitir (ekil 4.32, ekil 4.33).

ekil 4.32. Kovalent balama yntemiyle oluturulmu anot ile kurulan biyoyakt hcresinin g younluu grafii.

ekil 4.33. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu anot ile kurulan biyoyakt hcresinin g younluu grafii.

ekil 4.32 incelendiinde pil g younluunun hcre potansiyeli ile ilk bata artt 180 mVtan sonra ise g younluunun azald grlmektedir. Pil g

90

younluunun azalmaya balad potansiyelde maksimum g younluu 0,909 W/cm2 olarak bulunmutur. ekil 4.33 incelendiinde pil g younluunun hcre potansiyeli ile ilk bata artt yaklak 190 mVtan sonra ise g younluunun azald grlmektedir. Pil g younluunun azalmaya balad potansiyelde maksimum g younluu 0.88 W/cm2 olarak bulunmutur. Biyoanodun hazrland immobilizasyon yntemlerine gre maksimum g younluklar deerlendirildiinde daha yksek Imax deerine sahip kovalent balama yntemiyle hazrlanan enzim elektrodunun elekrokimyasal immobilizasyonla hazrlanan enzim elektroduna gre daha iyi sonu vermitir. Biyoyakt pilini karakterize eden OCP, ksa devre akm younluu ve g younluu parametreleri birlikte ele alnacak olursa kovalent balama yntemiyle oluturulan enzim elektrodunun biyoyakt pilinde anot bileeni olarak kullanlmaya daha uygun olduu grlmektedir. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas

yntemiyle hazrlanan enzim elektrodunda

(Imax=2000 A) stabilizasyonun

salanmas durumunda daha yksek g younluuna sahip biyoyakt pili tasarmlar yaplacaktr.
4.4. Elektrot Yzey Karakterizasyonu

Karbon elektrot yzeylerinin kovalent balama, elektrokimyasal immobilizasyon ve apo-enzimin yeniden yaplandrlmas yntemleriyle hazrlanan enzim

elektrotlarnn fiziksel ve kimyasal yaplarnn incelenmesi amacyla ekilen FTIR spektrumlar ve yaplarn morfolojisini veren AKM (Atomik Kuvvet Mikroskobu) grntleri aada sunulmutur.
4.4.1. FTIR (Fourier Transform Kzltesi Spektroskopisi) Analizi

Farkl

immobilizasyon

yntemleriyle

oluturulmu

enzim

elektrotlarnn

yzeylerindeki kaplamalarnn kimyasal olarak incelenebilmesi iin FTIR analizi yaplmtr (ekil 4.34). Farkl immobilizasyon yntemlerine gre oluturulmu enzim elektrotlarna ait FTIR spektrumlar, son olarak elde edilen enzim elektrotlar zerinden verilmi kaplama ilemindeki aamalara ait FTIR spektrumlar kaplamann ok ince olmas sebebiyle verilmemitir.

91

a)

b)

92

c) ekil 4.34. Enzim elektrotlarna ait FTIR spektrumlar; a) Kovalent balama yntemiyle oluturulmu enzim elektrodu, b) Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu enzim elektrodu, c) Apo-enzimin yeniden yaplandrlmasyla oluturulan enzim elektrodu.

Alnan sonular genel olarak deerlendirilecek olursa 3800-3500 cm-1 dalga boylarnda ekil 4.34 a),b)de PPyden kaynakland dnlen pikler gzlenmitir. 3000 cm-1de gzlenen oklu pik, aromatik bir halkadaki C-H balarn; 1800-1390 cm-1 dalga boyu aralnda gzlenen halka gerilim band ekil 4.34 a),b)de PPy, ve DMAMFc, ekil 4.34 c)de An bileiklerinde bulunan aromatik yaplarn varln dorulamaktadr (ekil 4.34 a),b)).1600-1400 cm-1de gzlenen oklu pikler ise aromatik yapdaki C=C balarn gstermektedir. 1000750 cm-1 deki pikler, bal karbonlara bal hidrojenler(=C-H) nedeniyle gzlenmitir.
4.4.2. AKM (Atomik Kuvvet Mikroskobu) Analizleri

Farkl immobilizasyon yntemleri sonucunda elde edilen enzim elektrotlarnn yzey topografyasnn incelenmesi amacyla AKM (Atomik Kuvvet Mikroskobu) grntleri incelenmitir.

93

Kovalent balama Kovalent balama yntemi ile oluturulan enzim elektrotlarnn hazrlanmas aamasnda GOD immobilize edilen karbon elektrotlarn AKM grntleri ekil 4.35te verilmitir.

a)

b)

ekil 4.35. Kovalent balama ynteminde elektrot hazrlama aamasndaki AKM grntleri a)PPy ile kaplanm karbon elektrot, b)PPy zerine kovalent balama yntemiyle DMAMFc ve GOD immobilize edilmi karbon elektrot. Elde edilen grntler zerinden przllk deerlerine bakabilmek amacyla rms deerleri llmtr. PPy ile kaplanm karbon elektroda ait rms deeri 68,4 nm, PPy zerine kovalent balama yntemiyle DMAMFc ve GOD immobilize edilmi karbon elektrodun rms deeri ise 168 nm bulunmutur. Bu deerlere gre PPy kapl elektrodun przllnn GOD immobilize edilmi elektroda gre daha az olduu grlmektedir. ekil 4.34 incelendiinde grlen przl yzey, enzimin yzeye hapsolmasn salamakta ve uzun sre yzeyde enzimi muhafaza edebilmektedir (Shirale et al., 2006).

Elektrokimyasal immobilizasyon Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle hazrlanm GOD elektrodunun ve immobilizasyon ncesi yaln karbon elektrodun AKM grnts ekil 4.36da verilmitir.

94

a)

b)

ekil 4.36. Elektrokimyasal immobilizasyon yntemiyle oluturulmu enzim elektrodunun AKM grnts, a) yaln karbon elektrot, b) elektrokimyasal immobilizasyon sonras karbon elektrot.

Yaln karbon elektroda ait rms deeri 19.6 nm, elektrokimyasal immobilizasyon yntemine gre hazrlanm enzim elektroduna ait rms deeri ise 117 nm olarak bulunmutur. Enzimin yeniden yaplandrlmas GOD apo-enziminin ayrlarak FAD balanm karbon elektrot yzeyine yeniden yaplandrlmasyla oluturulan enzim elektrodunun yapm aamalarna ait AKM grntleri ekil 4.37da verilmitir.

a)

b)

95

c) ekil 4.37. Apo-enzimin yeniden yaplandrlarak oluturulan enzim elektroduna ait AKM grntleri a)An-akrilik asit modifiye edilmi karbon elektrot, b)An-akrilik asit/FAD modifiye edilmi karbon elektrot, c)An-akrilik asit/FAD/Apo-enzim modifiye edilmi enzim elektrodu.

Apo-enzimin yeniden yaplandrmas ynteminde An-akrilik asit kaplanm elektroda ait rms deeri 44.5 nm, An-akrilik asit/FAD modifiye edilmi karbon

elektroda ait rms deeri 126 nm, An-akrilik asit/FAD/Apo-enzim modifiye edilmi enzim elektroduna ait rms deeri ise 75.7 nmdir. ekil 37 b) incelendiinde apoenzimin yzeye tutunabilmesine uygun porzite grlmektedir.

96

5.

GENEL SONULAR

Tez kapsamnda, biyosensr ve biyoyakt pili uygulamalarna ynelik farkl immobilizasyon yntemleri ile GOD elektrodu tasarm almalar, performans deerlendirmeleri, enzim elektrodunun biyoyakt pilinde test edilmesi ile elektrot yzeylerinin karakterizasyonu sunulmutur. alma kapsamnda elde edilen nemli sonular aada zetlenmitir. Dk maliyet ve kolay ilenebilirlik, iyi elektriksel ve sl iletkenlik, gibi avantajlarndan dolay karbon elektrotlar, enzim elektrodunda kullanlan temel yapy oluturmutur. Enzim elektrodu tasarmnda kullanlan glukoz oksidaz (GOD) karbon elektrot yzeylerine 3 farkl immobilizasyon yntemi kullanlarak tutuklanmtr. Enzim immobilizasyonu amacyla kovalent balama, elekrokimyasal immobilizasyon ve yeni bir yntem olan apo-enzimin yeniden yaplandrlmas yntemleri uygulanmtr. Enzim tutuklama prosesinde elektrot yzeyi ile enzimin redoks aktif merkezi arasnda elektriksel iletimin arttrlmas iin kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemlerinde PPy iletken polimeri ve DMAMFc medyatr; apo-enzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde ise An-akrilik asit kompozit filminden yararlanlmtr. Anilin monomerinin polimerlemesiyle elde edilen polianilinin (PAn), asidik pHlarda aktif olduu iin GOD gibi ntral pHlarda daha aktif olan enzimlerin varlnda kullanm problem yaratmaktadr. Bu durumun almas iin anilin monomeri akrilik asit ile birlikte kullanlarak kompozit film oluumu salanm ve anilinin pH kstlamas ortadan kaldrlmtr. Annin iletken yapsndan faydalanmak ve An-akrilik asit kompozit filminde oluan COOH gruplarndan enzim immobilizasyonunda yararlanmak amacyla apo-enzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde An iletken polimeri seilmitir.

97

Pirol monomerinin polimerlemesiyle elde edilen polipirol (PPy) ise iletken olmas, biyouyumlu olmas, ntral pHda aktif olabilmesi elektrotlarn zerinde elektro-aktif anyon gibi giriim yaratacak bileiklerin birikimini nlemesi, sulu zeltilerde znebilir olmas ve baz durumlarda redoks medyatr gibi davranarak enzimden elektroda elektron aktarmn gerekletirebilmesi

avantajlarn sunmutur. Elektrot ile enzimatik tepkimenin gerekletii enzim aktif merkezi arasndaki elektriksel iletimi arttrmak amacyla medyatr denilen araclardan yararlanlm bu sayede elektrottaki alma potansiyeli medyatrn redoks potansiyeline yakn bir deerde olduundan substrat-spesifik bir elektrot tasarmna olanak salayacak ferrosen trevi olan dimetilaminometil ferrosen (DMAMFc) bileii kullanlmtr. Yzeyde iletken redoks tabakas oluumu elektrokimyasal polimerizasyon ilemleri ile uygulanmtr. Elektrokimyasal polimerizasyon ile karbon elektrot yzeylerinde iletken polimer tabakalar oluturulmu, elektrokimyasal davranlar modifiye edilmi ve edilmemi karbon elektrotlara ait dnml voltamogramlar karlatrlarak incelenmitir. Enzim incelenmitir. Kovalent balama yntemi iin enzim konsantrasyonu, medyatr elektrodu tasarmna immobilizasyon parametrelerinin etkisi

konsantrasyonu; elektrokimyasal immobilizasyon iin polimerizasyon srasnda geen yk miktar, enzim konsantrasyonu, medyatr konsantrasyonu

parametreleri incelenmitir. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde ise apo-enzimin yzeye tutunup elektrokimyasal olarak cevap verebilecek elektrot tasarm prosedr belirlenmi ancak stabilizasyon salanamad iin

optimizasyon almalar yaplamamtr. Apo-enziminin elektrot yzeyinde FAD zerine yeniden yaplandrlmas amacyla iki farkl yntem kullanlarak FAD yzeye immobilize edilmitir. Karbon elektrotlarn elektrokimyasal aktivasyonu ve An-akrilik asit kompozit filmi
98

kaplanmasyla FAD immobilizasyonu iin uygun yzey hazrlanan iki yntemde de FAD immobilizasyonu salanabilmitir. Ancak sadece An-akrilik asit kompozit filmi kaplanm elektrot zerinde apo-enzimin yeniden yaplandrlmas salanabilmitir. Apo-enzimin FAD zerine yeniden yaplanabilmesi iin elektrot ve FAD arasndaki mesafenin nemli olduu grlmtr. GOD apo-enziminin yeniden yaplandrlmasyla elde edilen enzim elektrodunda stabilizasyon sorununun FAD-apo-enzim arasndaki affinitenin arttrlarak zlmesi gerekmektedir. Hazrlanan enzim elektrotlar iin performans faktrleri incelenmitir (pH, scaklk, substrat konsantrasyonu). Enzim elektrotlarnn performanslarnn deerlendirildii elektrokimyasal lmler sonucu kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyonla

hazrlanan enzim elektrotlarnda optimum scaklk 35C, optimum pH 7.5 olarak bulunmutur. 3 farkl immobilizasyon yntemi iin kalibrasyon erileri kartlarak kinetik parametreler (Km, Imax) hesaplanmtr. Kovalent balama ynteminde Km 19.87 mM, Imax 1250 A,

elektrokimyasal immobilizasyon ynteminde Km 7 mM, Imax 833 A, apo-enzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde ise Km 27.4 mM, Imax 2000 A olarak bulunmutur. farkl immobilizasyon yntemi karlatrldnda en yksek akm younluunun apo-enzimin yeniden yaplandrlmas ynteminde elde edildii grlmtr. Kovalent balama ve elektrokimyasal immobilizasyon yntemlerine gre elde edilen edilen enzim elektrotlar biyoanot olarak kullanlarak biyoyakt hcresinde test edilmitir. Biyoyakt pili katodu, iletken polimer olarak yine polipirol (PPy), medyatr olarak ise 2,2-azinobis-(3-etilbenzotiozdin-6-sulfonik asit) (ABTS) ve biyolojik

99

katalizleme ile indirgeme ilemi yapan lakkaz enziminin kullanld grafit elektrottan yaplmtr. ki farkl enzim immobilizasyonu yntemine gre hazrlanan biyoanot ve biyokatot bir hcre ierisine yerletirilmi ve lmlerin yapld harici bir multimetreye balanarak biyoyakt pili devresi tamamlanmtr. Kovalent balama ile oluturulan biyoanodun bal olduu biyoyakt hcresinde ak devre potansiyeli (OCP) 333 mV, ksa devre akm younluu 18,17 A/cm2 (0.85 diren altnda), maksimum g younluu 0,9 W/cm2 olarak bulunmutur. Elektrokimyasal immobilizasyon ile oluturulan biyoanodun bal olduu biyoyakt hcresinde ise ak devre potansiyeli (OCP) 456 mV, ksa devre akm younluu 13,30 A/cm2 (0.85 diren altnda maksimum g younluu 0,88 W/cm2 olarak bulunmutur. Tasarlanan enzim elektrotlarnn yzeyinin kimyasal yaps FTIR tekniiyle ve topografyas da AKM grntleme teknii ile karakterize edilmitir. Tez kapsamnda sunulan kullanm alma alan ile biyoyakt GOD pilleri ve biyosensr farkl

uygulamalarnda

bulan

enzim

elektrodunun

immobilizasyon yntemleri ile tasarm gerekletirilmitir. Apo-enzimin yeniden yaplandrlmas optimizasyon ynteminde almalarna elektrodun geilmesi stabilizasyonunun almann salanmas ve

gelecekteki

hedefini

oluturmaktadr. Bu sayede direk elektron transferi salanacandan ok daha yksek akm younluklarna ulalacaktr.

100

KAYNAKLAR DZN

Ahuja, T., Mir, I. A., Kumar, D., Rajesh, 2007, Biomolecular immobilization on conducting polymers for biosensing applications, Biomaterials. 28, pp. 791-805. Bankar, S. B., Bule, M. V., Singhal, R. S., Ananthanarayan, L., 2009, Glucose oxidase - An overview, Biotechnology Advances. 27, pp. 489-501. Bartlett, P. N., Tebbutt, P., Tyrrell, C. H., 1992, Electrochemical Immobilization of Enzymes. 3. Immobilization of Glucose Oxidase in Thin Films of Electrochemically Polymerized Phenols, Anal. Chem. 64, pp. 138-142. Bott, A. W., 2004, Applications of Wired Enzyme Electrodes, Current Separations 21(1), pp. 3-6. Blkbayram, A. E., 2005, Immobilization of Invertase, Polyphenol Oxidase and Glucose Oxidase in Conducting Copolymers of Thiophene-Capped Polytetrahydrofuran and Pyrrole, Doctor of Philosophy, The Graduate School of Natural and Applied Sciences of Middle of East Technical University, Ankara, 123s. Bugg, T.D.H., 2004, Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry, Blackwell Publishing, ISBN 1-4051-1452-5, pp. 8-24. Byknohutu, C., 2009, Glukoz Oksidaz Tabanl Biyoyakt Pili Gelitirilmesi, Yksek Lisans Tezi, Hacettepe niversitesi Fen bilimleri Enstits. Ankara, 121s. Cass, A. E. G., Davis, G., Francis, G. D., Hill, H. A. 0., Aston, W. J., Higgins, I. J., Plotkin, E. V., Scott, L. D. L., Turner, A. P. F., 1984, Ferrocene-Mediated Enzyme Electrode for Amperometric Determination of Glucose, Analytical Chemistry. 56(4), pp. 667-671. Chen, T., 2001, The Development and Application of Glucose Electrodes Based on Wired Glucose Oxidase, Doctor of Philiosophy, the Faculty of the Graduate School of The University of Texas. Austin, 147p. elikkan, H., 2001, Polipirol le Modifiye Edilmi Karbon Elektrot Kullanlarak ASV Yntemiyle Pb ve Cu Tayini, Yksek Lisans Tezi, Gazi niversitesi Fen Bilimleri Enstits. Ankara, 88s. Durst, R. A., Baumner, A. J., Murray, R. W. , Buck, R. P. , Andrieux, C. P., 1997, Chemically Modified Electrodes: Recomendded Terminology and Definitions, Pure &App/. Chem. 69(6), pp. 1317-1323. Freire, R. S., Pessoa, C. A., Mello, L. D. and Kubota, L. T., 2003, Direct Electron Transfer: An Approach for Electrochemical Biosensors with Higher Selectivity and Sensitivity, J. Braz. Chem. Soc. 14(2), pp. 230-243. Goel, M.K., 1994, Immobilized Enzymes, Renssealer Polytechnic Institute. http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/goel2nd.htm.
101

Guerrieri, A., De Benedetto, G. E., Palmisanot, F., Zambonint, P. G., 1998, Electrosynthesized non-conducting polymers as permselective membranes in amperometric enzyme electrodes: a glucose biosensor based on a co-crosslinked glucose oxidase/overoxidized polypyrrole bilayer, Biosensors & Bioelectronic. 13, pp. 103-112. Guimard, N. K., Gomez, N., Schmidt, C. E., 2007, Conducting polymers in biomedical engineering, Prog. Polym. Sci. 32, pp. 876-921. Illanes, A., 2008, Enzyme Biocatalysis Principles and Applications, Springer Science + Business Media B.V., ISBN 978-1-4020-8360-0, 398p. Jusoh, N., Aziz, A. A., 2006, Immobilization of Glucose Oxidase and Ferrocene Redox Polymer in Cross-Linked Poly (Vinyl Alcohol) with Bovine Serum Albumin as Protein Stabilizer, Regional Postgraduate Conference On Engineering and Science (RPCES), 26 -27 July 2006, Johor Bahru, Johor, 5p. Kale, C., 2004, The Investigation of Some Electrochemical Properties Of The On Type Schiff Bases In Nonaqueus Solvents, Master Thesis, Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry. Ankara. Katz, E., Filanovsky, B., Willner, I., 1999, A biofuel cell based on two immiscible solvents and glucose oxidase and microperoxidase-11 monolayerfunctionalized electrodes, New J. Chem. pp. 481-487. Katz, E., Riklin, A., Heleg-Shabtai, V., Willner, I., Bckmann, A. F., 1999, Glucose oxidase electrodes via reconstitution of the apo-enzyme: tailoring of novel glucose biosensors, Analytica Chimica Acta. 385, pp. 45-58. Kim, J., Jia, H., Wang, P., 2006, Challenges in biocatalysis for enzyme-based biofuel cells, Biotechnology Advances. 24, pp. 296-308. Kuzu, S.B., 2008, Kitinaz reten Bacillus zolasyonu, Enzimin Ksmi Saflatrlmas Ve Karakterizasyonu, Yksek Lisans Tezi, ukurova niversitesi Fen Bilimleri Enstits. Adana, 93s.

Lange, U., Roznyatovskaya, N. V., Vladimir, M. M., 2008, Conducting Poliymers in Chemical Sensors and Arrays, Electrochemica Acta. 614, pp. 1-26. Mutlu, S., Alp, B., zmelles, R. S., Mutlu, M., 1997, Amperometric Determination of Enzymatic Activity by Multienzyme Biosensors, Journal of food Engineering. 33, pp. 81-86. Narl, I., 2006, Activity Analysis Of Immobilized Tyrosinase Enzyme In The Presence Of Different Inhibitors, The Degree of Master of Science, The Graduate School of Natural and Applied Sciences Of Middle East Technical University. Ankara, 117s.

102

Nastase, F., Mihaiescu, D., Nastase, C., Mirea, C., Burzo, I., Stamatin, I., 2005, Plasma polymerized ferocennepyrrole copolymer lms, Composites: Part A. 36, pp. 503507. zylmaz, G., 2005, Glukoz Oksidaz ve Katalazn Ayr Ayr ve Birlikte mmobilizasyonu ve Karakterizasyonu, Doktora Tezi, ukurova niversitesi Fen Bilimleri Enstits. Adana, 175s. Pandey, P. C., Upadhyay, S., Upadhyay, B., 1997, Peroxide Biosensors and Mediated Electrochemical Regeneration of Redox Enzymes, Analytical Biochemistry. 252, pp. 136142. Prasad, D., Arun, S., Murugesan, M., Padmanaban, S., Satyanarayanan, R.S., Berchmans, S., Yegnaraman, V., 2007, Direct electron transfer with yeast cells and construction of a mediatorless microbial fuel cell, Biosensors and Bioelectronics. 22, pp. 2604-2610. Raitman, O. A., Katz, E., Bckmann, A. F., Willner, I., 2002, Integration of Polyaniline/Poly(acrylic acid) Films and Redox Enzymes on Electrode Supports: An in Situ Electrochemical/ Surface Plasmon Resonance Study of the Bioelectrocatalyzed Oxidation of Glucose or Lactate in the Integrated Bioelectrocatalytic Systems, J. AM. CHEM. SOC. 124(22), pp. 6487-96. Rhemrev-Boom, M.M., Korf, J., Venema, K., Urban, G., Vadgama, P., 2001, A versatile biosensor device for continuous biomedical monitoring, Biosensors & Bioelectronics. 16, pp. 839-847. Richardson, T., Finley, J. W.,1985, Chemical Changes in Food during Processing, Springer, ISBN 0-87055-504-9, 520p. Sarma, A. K. a, Vatsyayan, P., Goswami, P., Minteer, S. D., 2009, Recent advances in material science for developing enzyme electrodes, Biosensors and Bioelectronics. 24, pp. 2313-2322. Savitri, D., Mitra, C. K., 1998, Electrochemistry of reconstituted glucose oxidase on carbon paste electrodes, Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47, pp. 6773. Shirale, D.J., Gade, V.K., Gaikwad, P.D., Savale, P.A., Kharat, H.J., Kakde, K.P., Pathan, A.J. and Shirsat, M.D., 2006, Studies of immobilized glucose oxidase on galvanostatically synthesized poly(N-methylpyrrole) film with PVS-NaNO3 composite dopant, Int. J. Electrochem. Sci. 1, pp. 62-70.

Suelter, C. H. (Editor), Kricka, L. J. (Editor), 1992, Methods of Biochemical Analysis, Volume 36, Bioanalytical Applications of Enzymes, John Wiley & Sons, Inc., ISBN: 978-0-471-55880-4, 268p. ir, N., 2009, Plazma Polimerik Membran Polimerizasyonu Teknii Yzeylerde letkenlik le ve Desenlenmi Biyomolekl
103

Tutuklama zelliklerinin Belirlenmesi, Hacettepe Lisans Tezi, Fen Bilimleri Enstits. Ankara, 121s.

niversitesi,

Yksek

Updike, S. J., Hicks, G. P., 1967, The Enzyme Electrode, Nature. 214, pp. 986988. Vaillancourt, M., Chen, J. W., Fortier, G., Belanger, D., 1998, Electrochemical and Enzymatic Studies of Electron Transfer Mediation by Ferrocene Derivatives with Naon-Glucose Oxidase Electrodes, Electroanalysis. 1, pp. 23-31. Wei, H. Z., T. van de Ven, G. M., Omanovic, S., Zeng, Y. W., 2008, Adsorption Behavior of Dinucleotides on Bare and Ru-Modied Glassy Carbon Electrode Surfaces, Langmuir. 24, pp. 12375-12384. Wei, H. And Omanovic, S., 2008, Interaction of Flavin Adenine Dinucleotide (FAD) with a Glassy Carbon Electrode Surface, Chemistry&Biodiversity. 5, pp. 1622-1639. Willner, B., Katz, E., Willner, I., 2006, Electrical contacting of redox proteins by nanotechnological means, Current Opinion in Biotechnology. 17, pp. 589596. Witt, S., Wohlfahrt, G., Schomburg, D., Hecht, H., Kalisz, H., 2000, Conserved arginine -516 of Penicillium amagasakiense glucose oxidase is essential for the efcient binding of - D -glucose. J Biochem. 9, pp. 347-553. Yakar, E., 2006, Elektropolimerizasyon Yntemiyle Polipirol ve Polianilin le Kaplannm Aliminyumun Asidik Korozyonunun nlenmesinde Farkl Anyonlarn Etkileri, Yksek Lisans Tezi, Kocaeli niversitesi Fen Bilimleri Enstits. Kocaeli, 125s. Zayats, M., Willner, B., Willner, I., 2008, Design of Amperometric Biosensors and Biofuel Cells by the Reconstitution of Electrically Contacted Enzyme Electrodes, Electroanalysis. 20 (6), pp. 583601.

104

ZGEM

Ad Soyad Doum Yeri Doum Yl Medeni Hali

: : : :

Gonca Bilge ANKARA 1985 Bekr

Eitim ve Akademik Durumu: Lise (1999-2003):

Hac mer Tarman Anadolu Lisesi, Ankara, Trkiye Hacettepe niversitesi, Ankara, Trkiye Mhendislik Fakltesi, Gda Mhendislii Blm

Lisans (2003-2008):

Yabanc Dil Tecrbesi Ekim 2008 -

ngilizce, Almanca

Ar-Ge Uzman, Hacettepe niversitesi, Deltamed Yaam

Bilimleri ve Plazma Teknolojileri Ar-Ge San. A.., Ankara.

105