Protein Saflatrlmas le lgili Baz metotlar Nezir Yaar TOKER*, Some methods about protein purification Summary: n this

century ;in the field of chemistry ,drugs, foods, and biology and their subdivisions one of the most usefull method is purification .In this study it was explained about protein purification and its problems.Our target is more and cheapear products to gain at the final work.For this work we have to pay attention to the activity of the protein. zet: Yzylmzda ;kimya ,ila,gda ve biyoloji ve onlarn alt birimlerinde en ok kullanlan metotlardan biridir.Bu almada protein saflatrlmas ve onun problemlerinden bahsedilmektedir.Hedefimiz sonuta ucuz ve ok rn elde etmektir.Bu ama iinde ok dikkat edilmelidir. Giri Gnmzde ila ve gda sanayiinde ve bunlara bal dier kollarda protein saflatrlmas son yllardaki en popler alma metotlarndan biridir. Protein saflatrlmas beraberinde birok spesifik problem getirir (Otoliz, denatrasyon, aktivite kayb gibi).Zaman ve giderler ideal bir saflatrma emas oluturmaya tam anlam ile yetmemektedir. almadaki ana hedeflerden ilki, saflatrlacak molekle en uygun metotlar seerek ideal bir prosedr gelitirmektir(1,2,6,8,16,20,24). Saflatrmada ,balangtaki materyalden mmkn olduunca ok rn elde etmeye allr. Bu konuda dikkate alnmas gereken iki zellik vardr: 1-Safln derecesi ,2-rnn miktar ve aktivitesi. Aktif olmayan rn kullanm amac bulamayacaktr.Hedefler tespit edildikten sonra almaya balanr(2,6,8,10,16,20,22,24,34). almada seilecek metotlar proteinin fiziksel,kimyasal ve biyolojik zelliklerine baldr. Protein saflatrlmasnda almaya balayabilmek iin ncelikle u aletlere ihtiya vardr : Hassas terazi, metre,manyetik kartrc,souk oda, kromatografi cihazlar,derin dondurucular (-4,-800 C aras),250-900 m aras okuma yapabilen spektrofotometre, ELISA mini okuyucu,elektroforez kabini,HPLC ekipman, liyofilizatr, UV monitr, mikserler,homojenizatr,masa tipi santrifj, ultrasantrifj, fraksiyonlama aleti(kolon kromatografi iin),kimyasal malzemeler ve tampon zeltiler(2,6,7,8,9,22,24,30,31). Proteinin fiziksel, kimyasal ve biyolojik zellikleri belirlenir. Bu bilgilere nceden sahip olmak almada seilecek metotlar asndan ok byk kolaylk salar(2,6,8,10,16,20,22,24). * ..Veteriner Fakltesi Biyokimya Anabilim Dal Saflatrlmada kullanlan ana materyal ile elde edildii hcre,doku ve organn bitkisel veya hayvansal olmas ,saflatrma sonunda elde edilen rnn miktar zerine ve uygulanacak metotlarn isabetliliine, dolays ile harcanacak zaman ve

giderler iin ok nemlidir. Bunlar ierisinde enzimleri; zellikle organizmada belirli dokularca retilen ve az olan enzimleri saflatrmak epeyce gtr. Yntemler A. Materyalin hazrlanmas B. Materyalin stabilizasyonu C. Materyalin konsantriyasyonu D. Materyalin izolasyonu ve saflatrlmas,elde edilen rnde molekller arlk tayini ve karakter tespiti. A. Materyalin hazrlanmas Materyalin hazrlanmasnda materyalin elde edildii orijine gre metot seilir. Burada uygulanacak fiziksel ,kimyasal ve biyolojik ilemler proteinin orijinine baldr. Svlatrma: Proteinin saflatrlmas iin gerekli birinci kouldur. zolasyon koullarna gre sadece svlatrlm materyal kullanlr(1,2,5,6,8,15,17,20,22,24,28,31,34). Svlatrmada kullanlan zeltiler hcreleri paralayp,aarak ierlerindeki proteinlerin dar kmasn salarlar. Saflatrlacak protein subseller organeller de olabilirler .rnein protein mitakondride lokalize olmusa ncelikle mitakondrinin izole edilmesi gerekir. Daha sonra protein zndrlerek bu organelden ayrlr(1,2,6,8,22,28,30,34). Yaplan almada materyale ve uygulanan metotlara gre znm madde miktar mg ve kg dzeylerinde olabilecei gibi,sanayideki gibi tonlarca da olabilir(1,3,7,22,30,31,32,34). Ozmotik lizis: Hcreleri paralayp amak iin kullanlan metotlardan biridir. Bu metot hcreyi hipotonik bir ortama alp ieriin ortama gemesinden sonra ierii pipetlemek suretiyle olur.Hcre duvarnda yksek oranda karbonhidrat ieren bakteriler,bitkiler ve mantarlar iin uygun bir yntem deildir(1,3,4,5,7,10,11,12,22,23,25,27,28,29). Ezme: Ezme ilemi saflatrmada en ilk ve en ok uygulanan metottur. Basit anlamda havan,manuel veya elektrikli homejenizatrlerle yaplr(2,4,8,10,11,22,24,25,28,31). Bu ilem genellikle mitakondri,lizozom gibi hcre ii organelleri aa karmak iin kullanlr. Ezme ileminden sonra sv kolayca znr hale gelir(1,2,6,8,20,22,26,28,29,31). Kuru materyalle alrken (maya,bitki gibi) paralayc ierisine buz ilave ederek srtnmeden doan snma ve yanmaya kar nlem alnm olur. Ezme ileminde en ok homojenizatrler ile mutfak tipi paralayclar kullanlrlar. Pres veya ultrasonik dalgalar da ezme ileminde kullanlabilirler(4,10,16). Bu ilemlere balamak iin materyalin svlatrlmas gerekir. Svlatrlm materyal ile yaplacak fiziksel ve kimyasal ilemler daha kolay olur. Materyali

svlatrmak iin tampon zeltilere ihtiya vardr En ok kullanlan tampon zeltiler unlardr(2,4,7,9,10,22,25,31,32): Tablo 1. Materyali Svlatrmak in En ok Kullanlan Tampon zeltiler pH deeri --- asit ve bazlar 1.0-2.2 2.2-3.6 2.6-7.6 3.0-6.2 3.7-5.6 5.8-8.0 5.8-9.5 6.3-9.5 6.8-8.6 7.0-9.0 8.0-10.0 8.1-9.0 8.6-10.6 9.0-10.7 9.3-10.7 11.0-11.9 HCL/KCL Glisin/HCL Na2HPO4/sitrik asit Sitrik asit/NaOH Asetik asit /NaOH veya Sodyum asetat NaH2PO3/Na2HPO4 Bis.Tris/HCL Bis.Tris propan/HCL Trietonalamin hidroklorid/NaOH Tris/HCL Dietonalamin Sodyumborat/HCL Glisin/NaOH Sodyumkarbonat/sodyum bikarbonat Sodyumborat/NaOH Na2HPO4/NaOH

*Cooper,Terrance.G. (6) Bu tr tamponlar ok abuk bozulurlar. Koruyucu olarak EDTA veya 2merkaptoetanol ilave ederek dayankllk sresi arttrlr. Tampon zeltilerde pH sya gre deiim gsterirler. Hazrlanrken kullanldklar ortam ve s gz nne alnr. Tampon zeltiler normal konsantrasyonlarnn 10-100 kat oranlarda hazrlanr ve stoklanrlar. Gerekli durumda bu stoklardan kullanlr(1,2,3,4,6,7,9,10 ). B. Stabilizasyon: Protein saflatrmada en hassas konu , proteinin aktivitesinin korunmasdr. Aktivite kayb nlenemez ise elde edilecek rn miktar da o kadar azalr. nemli olan nokta , en son basamakta daha fazla aktif protein elde etmektir. Her basamakta stabilizasyon kurallar tekrar yerine getirilmelidir. zellikle enzim proteinleri ile alrken buna daha ok dikkat etmek gerekir(7,20,22,28,31,32). Stabilizasyonu salayan fiziksel ve kimyasal faktrler aadaki gibi sralanabilirler : a. pH b. Oksidasyon derecesi c. Ar metal konsantrasyonu d. Polarite e. Proteaz ve nkleazlarn konsantrasyonu f. Is g. Saflatrmada balangtan sona kadar geen sre h. Elde edilecek rnn ortamdaki konsantrasyonu

C.Konsantriye edilmesi Saflatrlacak proteinin fiziksel ve kimyasal zelliklerini bilmek, metotlarda kullanlacak maddelerin seimi iin kolaylk olur. Kolon kromotografilerinde , kolonun apn dar tutmak fraksiyonlama ilemini daha da kolaylatrr. Bunun iin materyalin konsantriye edilmesi gerekir. Konsantrasyonu arttrmak iin fiziksel ve kimyasal metotlar uygulanr. Balang materyalinin hacmi ne kadar az ve konsantrasyonu ne kadar fazla olursa alma da o kadar kolay yrtlr. Materyalin konsantriye edilmesi iin u metotlar uygulanabilir. a.Ayrc protein keltme b.Ultrafiltrasyon c.Dializ d.Polietilenglikol ile hacmin daraltlmas Tablo 2.Ayrc protein keltilmesi ile ilgili rnek tablo Spesifikaktivite aktivite/protein (mU/mg) Saflatrma faktr rn eldesi *Treskatis.Sven.,(31) Bu tablodan da anlald gibi protein miktar azalm,hacim kltlm fakat toplam aktivite artrlmtr. Bu ilem yaplrken , iin farkl konsantrasyonlardaki tuz zeltileri ilave edilerek pH deitirilmi ortamdaki dier proteinlerin kelmesi salanmtr. Ayrc protein keltme iin rnek bir tablodur(9,10,11,16,32). Polietilenglikollerde , ar su ekme zelliklerinden dolay , hacmi ok olan materyallerin youn PEG zeltisi ierisinde dialize ederek buna benzer bir ilem yaparz. Dializ ve ultrafiltrasyon metotlatr da prensipte hacmi daraltmaya dayanrlar(2,3,7,23,25,32). Konsantriye edilen materyal artk izolasyon ve saflatrma ilemine alnabilir. D. zolasyon ve saflatrma: zolasyon ve saflatrma ileminde protein miktar lmeye yarayan ok iyi bir metoda ihtiya vardr. Protein testi iin eldeki imkanlar dahilinde, Biret,Lowry veya UV 280 nm dalga boyunda bir spektrofotometre ile dorudan llebilir. Ucuzluu ve hzl olmas ok byk avantaj salamaktadr(2,6,7,14,16,22,23,32). Proteinin anyonik veya katyonik zelliklerine bal olarak kromatografi ilemine balanr (2,8). Kromatografide, proteinin fiziksel zelliklerine bal olarak ortamdaki dier proteinlerden ve yabanc maddelerden ayrt edilmesi amalanr(25).Molekler arlna bal olarak protein kolonlardan filtre edilir. Burada kullanlan matriksleri seerken , proteinin molekler arl ayrt edici bir kolaylk salar. Saflatrmada Civciv serumu 10.1 mU/mg 1 % 100 Tuz/pH keltilmesi 350 mU/mg 35 % 60

kullanlan iyon deiim ve affinite kromatografileri proteinlerin molekler arlklarna gre seilmelidir. Her bir basamakda, elde edilen rnn hacmi daralr ve almamz kolaylar(2,8,11,12,17,20,22,25,32). Burada dikkat edilmesi gereken husus aktivite kaybdr. Saflatrlan protein azalaca iin ortamda birbirlerine balanarak kolayca kebilirler. Bunu engellemek iin ortama farkl molekler arlkta olan ve aktiviteyi bozmayacak ekilde youn protein ilavesi yaplabilir. Her basamakta sodyum dodesilslfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS PAGE) uygulamas yaplarak proteinin molekler arl ve miktar tespit edilir. Jel elektroforezi 1,2,3 boyutlu olarak uygulanabilir. Bylece ortamdaki dier proteinlerin varl tespit edilir(1,2,6,8,9,13,18,20,22,23,25,28). Saflatrma ilemlerinde , proteinin molekler arlna bal olmak kouluyla farkl younluk ortam meydana getirerek gradient santrifj teknii uygulamas ile hem ayrc santrifj yaplr ve hem de molekler arlk tayini yaplr. Rotofor ile fiziksel zelliine bal olarak protein fraksiyonlamas yaplr. Proteinin izoelektrik noktas da ayrt edici metotlardan biridir. Bu ilemler uygulanrken en ok yaplan ilemlerden biri dikkat edildii gibi santrifjdr. Santrifj teknii ile protein fraksiyonlanmas,gradient santrifj,keltme gibi metotlar uygulanr. Gradient santrifj iin en ok deiik konsantrasyonlardaki sakkaroz zeltileri kullanlmaktadr(9,11,14,15,20,24,26,32). Molekler arlk tayini iin elekroforez ve gradient santrifj ile beraber yksek basnl likit kromatografisi (HPLC) uygulamas da yaplabilir. Bu metot molekler arlk tayininde en ok kullanlan metottur ve alete yksek verimli anyonik (MonoQ gibi) kolonlar taklarak yaplr. Standart ve kolonlarnn pahall kullanlacak malzemeler iin zorluk oluturabilir. Amacmz en ucuz yolla ve en ok rn elde etmektir(1,2,10,12,18,20,22,27,28,34 Elde edilen protein amaca ynelik olarak ardklk(sekvenzasyon) testine tabi tutulur. Bu testte ama, proteindeki amino astlerin ardkln tespit etmektir. Bylece saflatrlan protein dier almalar iin karakterize edilmi olarak elde edilir (2,5,10,11,12,18,19,20,21,27,30). Bu ilemler yaplrken uygulanan metotlar yle ematize edebiliriz. a. Anyon,katyon deiim kromatografisi b. Absorbsiyon kromatografisi c. Affinite kromatografisi d. Sakkaroz gradient santrifj teknii e. Rotofor ile fraksiyonlama f. Elektroforez(SDS- PAGE) g. Elektrofokussing h. Molekler eleme teknikleri l. Ayrc znrlk m.Yksek basn likit kromatografisi(HPLC) n. Protein ardkll(Sekvenzasyon)

Tablo 3:Karboksilesterazn(pI 5.8) saflatrlmas.(Rat akcierinden)

Fraksiyon

Hacim(ml)

1.protein ekstrakt 2.%35-70 youn (NH4)2SO4 fraksiyonlam as 3.Jel Filtrasyon(Ul t-rajel AcA34) 4.Kromatofo -kussing I 5.Kromatofo -kussing II 6.Anyon deiim(Mon oQ HR5/5) ve Katyon deiim (Mono S HR 5/5) kromatografi si

350 30

Protein (mg) Spesifik Saflatrma aktivite katsays (mol/h/mg) 8000 17 1 960 60 4

Elde edilen rn yzdesi(%) 100 42

7.3

201

168

10

25

6.0 1.2 2.0

38 11 1.7

297 920 3750

18 54 221

8 7 5

*Gaustad,Rolf.,(11) Saflatrmann kriteri , oluturulan yntem sonucu elde edilen rndr. En son rn ne kadar saf ve ok ise yntemi o kadar baarl kabul edebiliriz. Kullanlan malzeme ve giderler sonucu ekonomik olup olmadn kontrol ederiz .En ekonomik ve en hzl olan yntemler seilerek protein saflatrma prosedr sabitletirilir ve ilerkii almalarla daha da iyiletirilir.

Kaynaklar 1.Arpagaus,M.,Fedon,Y.,Cousin,X.,Chatonnet,A.,Berge,J.B.,Fournier,D., and Toutant,J.B.(1994):CDNA Sequence,gene structure,and in vitro expression of ace-1,the gene encoding acetylcholinesterase of class A in the Nematode caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem.,269:13,9957-9965. 2.Beynon,R.J. and Bond,J.S.(1989):Proteolitic enzymes.pp.15-25,Oxford University Press,Oxford. 3.Blackman,S.C.,Dawson,G.,Antonakis,K.,and Le Breton,G.C.(1998):The identification and characterization of oligodendrocyte thromboxane A2 receptors. Jpn. J. Biol. Chem., 273:1,475-483. 4.Boopathy,R., and Balasubramanian,A.S.(1985):Chemical modification of the bifunctional human serum pseudocholinesterase.Eur.J.Biochem.,151:351-360. 5.Chhajlani,V.,Derr,D.,Earles,B.,Schmell,E., and August,T.(1989):Purification and partial amino acid sequence analysis of human erythrocyte acetylcholinesterase. FEBS,247:2,279-282. 6.Cooper,Terrance.G.(1977):The tools of Biochemistry.pp136-404,John Willey and Sons, Inc. New York 7.De La Hoz,D.,Doctor,B.P.,Ralston,J.S.,Rush,R.S., and Wolfe,A.D.(1986):A simplified procedure for the purification of large quantities of fetal bovine serum acetylcholinesterase. Life Sci., 39:195-199. 8.Eisenthal,R.,and M.J.Danson., (1993):Enzyme assays.pp.1-335,Oxford University Press,Oxford 9.Elena,M., and Inestrosa,N.C.(1988):Characterization of a tetrameric G4 form of acetylcholinesterase from bovine brain:a comparison with the dimeric G2 form of the electric organ.Mol. Cell. Biochem., 81:53-64 10.Ferrand,R.,Sine,J.P., and Colas,B.(1993):Butyrylcholinesterase from intestinal epithelial cells of quail,chick and duck:a comperative study during development.Comp.Biochem.Physiol.,105B:3/4,567-572. 11.Gaustad,R.,Sletten,K.,Lovhaug,D., and Fonnum,F.(1991):Purification characterization of carboxylesterases from rat lung.Biochem.J.,274:693-697. and

12.Godavarti,R.,and Sasisekharan,R.(1998):Heparinase I from Flavobacterium heparinum. Jpn.J.Biol.Chem.,273:1,248-255. 13.Harris,H.,Hopkinson,D.A., and electrophoresis of pseudocholinesterase serum.Nature,196:1296-1298. Robson,E.B.(1962):Two-dimensional component in normal human

14.Hilliard,J.J.,Maurizi,M.R.,and Simon,L.D.(1998):Isolation and characterization of the Phage T4 PinA Protein, an inhibitor of the ATP-dependent Lon Protease of Escherechia coli. Jpn.J.Biol.Chem.,273:1,518-523. 15.Hirayama,B.,Smith,C.,and Wright,E.(1989):Rotofor fractionation of intestinal brush Border membrane proteins.Bio-Rad Labor.Bul.,1517:1-3 16.Hori,S.,Ohtani,S.,Hori,C., and Nokihara,K.(1998):Purification and characterization of myonase from X-chromosome linked muscular dystrophic mouse skeletal muscle.J.Biochem.,123:650-658. 17.Kohn,J., and Wilchek,M.(1981):Procedures for the analysis of cyanogen bromideactivated sepharose or sephadex by quantitative determination of cyanate esters and imidocarbonates. Anal. Biochem., 115:375-382. 18.LeBoeuf,R.D.,Ban,E.M.H.,Green,M.M.,Stone,A.S.,Propst,S.M.,Blalock,E.J.,and David,J.(1998):Molecular cloning ,sequence analysis,expression,and tissue distrubution of suppression,a novel suppressor of cell cycle entry.Jpn.J.Biol.Chem.,273:1,361-368. 19.Maulet,Y.,Camp,S.,Gibney,G.,Rachinsky,T.L.,Ekstrm,T.J., and Taylor,P.(1990): Single gene encodes glycophospholipid-anchored and asymetric acetylcholinesterase forms:Alternative coding exons contain inverted repeat sequences.Neuron,4:289-301. 20.Meyer,V.(1986):Laborbcher chemie,praxis der HochleistungsFlssigchromatographie. pp1-262 Otto Salle Verlag,Frankfurt am Main 21.Nogueira,C.P.,Bartels,C.F.,McGuire,M.C.,Adkins,S.,Lubrano,T.,Rubinstein,H. M.,Lighstone,H.,Van Der Spek,F.L.,Lockridge,O., and La Du,B.,(1992):Identification of two different point mutations associated with the fluoride-resistant phenotype for human butyrylcholinesterase. Am.J.Hum.Genet.,51:821-828. 22.Ohnishi,M.,Hayashi,T.,and Terawaki,Y.,(1998):Purification and characterization of procytotoxin of Pseudomonas aeruginosa.Jpn.J.Biol.Chem.,273:1,453-458. 23.Oommen,A.,and Balasubramanian,A.S.(1979):The association of the serotoninsensitive aryl acylamidase with acetylcholinesterase in monkey brain.Eur.J.Biochem.,94:135-143.

24.Pharmacia.,(1993):Gel Filtration principles and methods.pp1-99,Pharmacia LKB Biotechnology,Upsala,Sweden 25.Porcelli,M.,Cacciapuoti,G.,Fusco,S.,Iacomino,G.,Gambacorta,A.,De Rosa ,Mario and Zappia,V.(1993):S-adenosylhomocysteine hydrolase from the thermophilic archaeon sulfobulos solfataricus:purification,physico-chemical and immunological properties. Biochem. Biop.Acta ,1164:179-188. 26.Rotundo,R.L.(1984):Purification and properties of the membrane-bound form of acetylcholinesterase from chicken brain. J. Biol. Chem., 259:21,13186-13194. 27.Schalk,I.,Ehret-Sabatier,L.,Bouet,F.,Goeldner,M., and Hrth,C.(1994):Trp 279 is involved in the binding of quaternary ammonium the peripheral site of Torpedo marmorata acetylcholinesterase.Eur.J.Biochem.,219:155-159. 28.Schnackenberg,J.,Schulz,R., and Senger,H.(1993):Characterization and purification of a hydrogenase from the eukaryotic green alga Scenedesmus obliquus.FEBS ,327:1,21-24 29.Thirstrup,K.,Carriere,F.,Hjorth,S.,Rasmussen,P.B.,Widike,H.,Nielsen,P.F., and Thim,L.(1993):One-step purification and characterization of human pancreatic lipase expressed in insect cells.FEBS,327:1,79-84. 30.Tojo,H.,Ying,Z., and Okamoto,M.(1993):Purification and characterization of guinea pig gastric phospholipase A2 of the pancreatic type.Eur.J.Biochem.,215:81-90. 31.Treskatis,S.,Ebert,C., and Layer,P.G.(1992):Butyrylcholinesterase from chicken brain Is smaller than that from serum: Its purification ,glycosylation,and membrane association.J.Neurochem.,58:6,2236-2247 32.Tripathi,R.K., and OBrein,R.D.(1977):Purification of acetylcholinesterase from house fly brain by affinity chromatography.Biochem. Biop. Acta,480:382-389. 33.Walker,John.M.(1984):Methods in molecular biology ,Volume 1,Proteins:pp1349,Human Press,Clifton,New Jersey 34.Winkler,R.,and Maier,K.(1994):berprfung einer HPLC-methode zur bestimmung von malondialdehyd (MDA) in harn,plasma und eventuelle strungen durch glukose und streptozotocin .Klin.Lab.,40:351-355.