T.

C HACETTEPE NVERSTES SALIK BLMLER ENSTTS

KRONK MYELOD LSEM ( KML) VAKALARINDA MNMAL REZDEL HASTALIIN ZLENMES

Serpil KAHRAMAN ABABA

Tbbi Biyoloji Program YKSEK LSANS TEZ

ANKARA 2008

T.C HACETTEPE NVERSTES SALIK BLMLER ENSTTS

KRONK MYELOD LSEM ( KML ) VAKALARINDA MNMAL REZDEL HASTALIIN ZLENMES

Serpil KAHRAMAN ABABA

Tbbi Biyoloji Program YKSEK LSANS TEZ

TEZ DANIMANI Prof Dr. Serap EMRE

ANKARA 2008

TEEKKR

Bu tez almasnn gereklemesinde Tez danmanm olarak bana verdii destek ve bilimsel katklarndan dolay sevgili hocam Sayn Prof Dr Serap Emre ye, meslek yaamm boyunca manevi desteini hibir zaman esirgemeyen deerli hocam Prof Dr M. Tezer Kutluk a, bilgisini daima benimle paylaan deerli hocam Do Dr Evren zdemir e, Tbbi Biyoloji Anabilim Dal nda grev yapan tm hocalarma, tm asistan arkadalarma, eitim-retim hayatm boyunca sevgi ve sabrla beni her zaman destekleyen ve her zaman benimle birlikte olacaklarn bildiim aileme, sevgili eim Nejdet e, her zaman bana yaama sevinci veren canm olum Ege Arda ma sonsuz teekkrlerimi sunuyorum.

ZET

Kahraman Ababa, S. Kronik Miyeloid Lsemi hastalarnda minimal rezidel hastaln izlenmesi. Hacettepe niversitesi Salk Bilimleri Enstits Tbbi Biyoloji Yksek Lisans Tezi, Ankara 2008. Kronik Myeloid Lsemi (KML); hematopoetik bir kk hcrenin neoplastik transformasyonundan kaynaklanan klonal bir hastalktr. 9. ve 22. kromozomun karlkl translokasyonu ile oluan Ph kromozomunun varl KML iin tan koydurucu bir zelliktir. Hastaya uygulanan tedaviden kaan ve relapsa neden olan hcrelerin varl minimal rezidel hastalk (MRD) kavramn gndeme getirmitir. KML hastalar MRD asndan belirli periyotlarda izlenirler. MRD n tesbiti, hastaln prognozunun izlenmesi ve relapsa girdiinde tedbirlerin alnmas iin olduka nemlidir. MRDn takibinde en hassas ve gvenilir metot olarak RT-PZT kullanlmaktadr. KML hastalarnda imatinib mesilat tedavisi etkin bir tedavi yntemi olmasna karn, hastalar zamanla diren gelitirebilmektedir. Bu almada KML hastalarnda minimal residual hastalk ve oklu ila direnci deerlendirilmesinde RT-PZT yntemi ile BCR-ABL ve MDR1 gen ifade seviyelerine ve MDR1 C3435T polimorfizminin incelenmesi amalanmtr. alma sonucunda 17 hastann BCR-ABL ve MDR1 ekspresyonlar arasnda istatiksel olarak anlaml sonular bulunamamasna ramen ila direnci gelitii dnlen hastada MDR 1 in ve BCR-ABL yksek ifadeleri tespit edilmitir. Hastalarn polimorfizm incelemesinde % 25 CC, %47 CT; %28 TT bulunmu, kontrol grubunda ise % 25 CC, % 61 CT, %14 TT bulunmutur. Hasta grubunun iki kat daha fazla TT genotipini tad gsterilmitir.

Anahtar Kelimeler: Kronik myeloid lsemi, minimal rezidea hastalk, oklu ila direnci, MDR1 C3435T polimorfizmi

ABSTRACT

Agbaba Kahraman, S. Following up minimal residual disease in Chronic Myeloid Leukemia Patients. Hacettepe University Institute of Health Sciences, MS.Thesis in Medical Biology, Ankara, 2008. Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal disorder which is based on neoplastic transformation of a haematopoietic stem cell. Presence of Ph chromosome which is the result of a translocation between chr 9 and 22 is from the diagnostic for CML. The presence of cells that cause relapse and escape treatment bring the concept of minimal residual disease (MRD). CML patients are followed up for MRD at spesific periods. Detection of MDR is very important to follow the disease prognosis and to be cautious of relapse. RT-PCR is the most sensitive and reliable method to detect MRD. Although imatinib mesilat is the most effective treatment, patients may become resistant on the course of treatment. The aim of this study is to evaluate minimal residual disease and multiple drug resistance by RT-PZT and analyse the expression levels of BCR-ABL, MDR1 gene and detecte the MDR1 C3435T polymorphism in CML patients. As a result of this study show that although there was no significant statistical corelation between the expression of BCR-ABL and MDR1 genes in 17 patients, higher gene expresion was found in three patients who were candidates to develop drug resistance. In the polymorphism study, the genotype frequency of patients were calculated as follows; 25% of the patients CC, 47% of them CT and 28% of them TT. In control group it was found as 25% CC, 61% CT and 14% TT. According to these results, it was determined that the TT genoype is encountered two folds in the patient population.

Key Words: Chronic myeloid leukemia, minimal residual disease ,multidrug resistance , MDR1 C3435T polymorphism.

NDEKLER
Sayfa ONAY SAYFASI..iii TEEKKR...iv ZET..v ABSTRACT...vi NDEKLER..vii SMGELER ve KISALTMALAR DZNix EKLLER DZN...xii TABLOLAR DZNxiii 1.GR ve AMA.....1 2.GENEL BLGLER..3 2.1. KML..3 2.2. Ph Kromozomu.6 2.3. ABL Gen ve Proteinin Yaps..7 2.4. BCR Gen ve Proteinin Yaps...9 2.5. BCR-ABL Fzyon Geni..11 2.6. Bcr-Abl Fzyon Proteinin Yaps ve Hastalk Fenotipi..14 2.7. BCR-ABL Patogenezi ile lgili Mekanizmalar17 2.7.A. Hcresel Adezyonun Bozulmas.....17 2.7.B. Apoptozisin nhibisyonu..17 2.7.C. Mitojenik Sinyal Yolaklarnn Aktivasyonu18 2.8. KMLde Uygulanan Tedavi Yntemleri..20 2.8.A. Konvansiyonel Kemoterapi.....20 2.8.A.1. Hidroksire...20 2.8.A.2. Busulfan20 2.8.B. Kratif Tedavi..20 2.8.B.1. FN-...........20 2.8.B.2. manitib Mesilat21 2.8.B.3. Allojenik Hematopoetik Kk Hcre Nakli...22 2.9. oklu la Direnci...25 3. MATERYAL ve YNTEMLER...28

3.1. Bireyler..28 3.2. almada Kullanlan Malzemeler....29 3.2.A. Kandan RNA zolasyon Protokol30 3.2.B. cDNA Protokol.31 3.2.C. M(9;22) P210BCR-ABL alma Protokol...32 3.2.D. m(9;22) P190BCR-ABL alma Protokol.34 3.2.E. -2Mikroglobulin alma Protokol....34 3.2.F. MDR1 alma Protokol.....35 3.3. MDR1 Polimorfizmi..38 3.3.A. Kandan DNA zolasyonu...38 3.3.B. Hibridizasyon.40 4. BULGULAR....42 5. TARTIMA..52 6. SONU ve NERLER...57 KAYNAKLAR.58

SMGELER VE KISALTMALAR
ABL ALL AML Atm ATP BCR C CaLB CBL C-terminal dATP dCTP ddH2O dGTP dk dNTP G Grb- 2 GTP IFN- Ile JAK kb Abelson Akut Lenfoid Lsemi Akut Myeloid Lsemi Ataxia telangiectasia mutated Adenozin Trifosfat Breakpoint Cluster Region Sitozin baz Calcium-dependent lipid binding Casitas-B-lineage lymphoma protein Karboksi Ucu Deoksiriboadenozintrifosfat Deoksiribositidintrifosfat Deiyonize Su Deoksiriboguanozintrifosfat Dakika Deoksi Ribonkleotit Trifosfat Guanin Baz Growth factor receptor bound - protein 2 Guanidin trifosfat nterferon alfa zolsin Janus Kinase Kilobaz

kDa KLL KML LAP M M-BCR m-BCR MDR mg MgCl2 ml mM NES ng NES NLS N-terminal PZT Ph PI3K PKC rpm sn SOS

Kilodalton Kronik Lenfoid Lsemi Kronik Myeloid Lsemi Lkosit Alkalen Fosfataz Molarite Major breakpoint cluster region Minr breakpoint cluster region Multidrug resistance Miligram Magnezyum klorr Mililitre Milimolar Nuclear Export Signals Nanogram Nuclear Export Signals Nuclear Localization Signals Amino terminal Polimeraz Zincir Tepkimesi Philadelphia Kromozomu Fosfoinozitid 3-Kinaz Protein kinaz C Dakikadaki Dn Says Saniye Son of sevenless

STAT T Taq g l -BCR

Signal Transducers and Activators of Transcription Timin baz Thermus aquaticus Mikrogram Mikrolitre Mikro breakpoint cluster region

EKLLER
Sayfa 2.1. Kronik Myeloid Lseminin geliimi.......5 2.2.1. Ph kromozomunun (22q-) ve 9q+n gsterimi..7 2.3.1. Abl proteininin yaps...9 2.4.1. Bcr proteinin yaps.10 2.5.1. BCR ve ABL genlerinin balca krlma blgeleri..13 2.6.1. BCR-ABL geninin balca formlar.15 2.7.1. Bcr-abl ile ilgili olu mekanizmalar ..18 2.7.2. BCR-ABL vastasyla etkilenen sinyal yolaklar.19 2.8.2. manitib mesilatn etki mekanizmas........................................................22 alma sonras amplifikasyon erilerinin gsterildii pencere...36 Standart eri..37 3.3.1. PGX-HIV Strip...41 %P210 BCR-ABL/ -2M deerleri..46 6 numaral hastann gen ekspresyon deerlerinin grafii....47 10 numaral hastann gen ekspresyon deerlerinin grafii......48 9 numaral hastann gen ekspresyon deerlerinin grafii.49

TABLOLAR
Sayfa 1. Hastalarn klinik zellikleri...42 2. P210 BCR-ABL eksresyon dzeyinin logaritma 10 tabannda gsterimi43 3. BCR-ABL ve MDR1in gen eksprsyonlarnn logaritmik deerleri (log 10)..45 4. MDR-1 C3435T polimorfizminin dalm...50 5. MDR-1 C3435T polimorfizminin allel dalm.50 6. Hasta va Kontrol grubunun MDR1 C3435T polimorfizminin dalm ....51

ALIMA PROTOKOLLER
Sayfa 3.2.A. Kandan RNA zolasyon Protokol.30

3.2.B. cDNA Protokol......31 3.2.C. M(9;22) P210BCR-ABL alma Protokol....32 3.2.D. m(9;22) P190BCR-ABL alma Protokol...34 3.2.E. -2 Mikroglobulin alma Protokol.34 3.2.F. MDR1 alma Protokol......35

1 1.GR VE AMA Kanser, hcrelerin kontrolsz olarak bymesi ve oalmas sonucu oluan genetik bir hastalktr. Hematopoetik sistemdeki anormal hcre oalmas ile karakterize olan lsemilerde oluan kromozomal deiikliklerin analizi, lsemi tipinin doru belirlenmesi, remisyon ve relaps durumlarnda hastaln prognozunun anlalmas ve minimal rezidel hastalklarn takibinde yardmc olmaktadr. Lsemi alt grublarndan biri olan Kronik Myeloid Lsemi (KML), zgl kromozom anomalisi ile tanmlanan ilk kanser tipidir.KML vakalarnn %90 ndan fazlasnda Philadelphia (Ph) kromozomu grlmektedir. Hastaln ortaya kmas ve ilerlemesi ile ilgili yakn ilgisinin olduu dnlmektedir. Ph kromozomu 9q34 deki ABL protoonkogeninin 22q11 deki bcr geni karlkl translokasyonu ile oluan BCR-ABL fzyon geni ortaya kar. Hastaya uygulanan tedaviden kaan ve relapsa neden olan hcrelerin varl minimal rezidel hastalktr. KML hastalarnda, rezidel hastalk analizlerinin temel amac tedaviye cevap veren hastalarn deerlendirilmesi ve erken relapsn tayin edilebilmesidir. Tedavi alan KML hastalarnda hastalk tekrarlayabilmekte ve ilaca kar diren geliebilmektedir. Gzlenen bu oklu ila direncinden (MDR) Multidrug resistance sorumlu birok mekanizma tanmlanmtr. Bunlardan biri p-glikoprotein (MDR1) dir. BCR-ABL ve MDR1 genlerinin transkripsiyon dzeylerinin hzl ve ok daha hassas olarak tesbit edilebilmesi, hastaln kinetiinin izlenmesi iin en uygun yntem Kantitatif Revers transkriptaz-polimeraz zincir tepkimesidir (RT-PZT). Bu tez almasnda hastanemize KML tans veya phesiyle gelen vakalarn periferik kan rneklerinden total RNA izolasyonu yaplp, mRNA sndan revers transkriptaz enzimi ile cDNAlar elde edilerek PZT teknii ile amplifikasyonu sonucu BCR-ABL fzyon geni ve MDR1 geninin ifadelerindeki art ve azalmalar

2 kantitatif lmlerle belirlenerek minimal rezidel hastalk ve oklu ila direnci asndan deerlendirilmesi amalanmtr.

3 2. GENEL BLGLER 2.1. KML KML, hematopoetik bir kk hcrenin neoplastik transformasyonundan kaynaklanan klonal bir myeloproliferatif hastalktr. lk kez 1845 te aratrclar Craigie, Bennett, ve Virchow tarafndan tanmlanmtr. 1960 ta Nowell ve Hungerford ilik hcrelerinde G grubu kromozomda uzun kolun byk parasnn koparak kaybolduunu tanmlam ve ksalm bu kromozoma bulunduu ehrin ad olan Philadelphia (Ph) Kromozomu adn vermilerdir. Rowley, 22. Kromozomun kopan bu parasnn kaybolmadn 9. kromozomun uzun koluna transloke olduunu gstermitir (1). Klinik geliimi ve spesifik kromozom anomalisi nedeni ile KML en iyi tanmlanm ve en ok allm myeloproliferatif bir hastalktr. Bat lkelerinde 1-2 /100.000 insidans bulunduu ve tm lsemilerin %20-30unu oluturduu bildirilmektedir. Erkeklerle kadnlar arasnda grlme olasl 1.3- 1 dir (2). Erkeklerde daha sk grlmektedir. KML her ya grubunu etkilemekle birlikte grlme ya 40 larn ortalar olup 40-60 ya arasnda art gstermektedir. Amerika Birleik devletlerinde her yl 3500-5000 yeni vaka grlmektedir (3). KML hastalarnn %90 ndan fazlasnda Ph kromozomu grlmektedir. ocuklarda ise nadir grlr ve ocukluk a lsemilerin %2-3 n oluturmaktadr. Bat lkelerinde ocuklarda insidans 1 000 000 da 1 dir.(4) Klinik bulgular; yorgunluk, kilo kayb, itahszlk, dalak ve karacier bymesidir. Hastalarn yaklak %40 tany semptomsuz alrlar. Periferik kanda; beyaz kan hcrelerinin says 25.000 mm3/ml, %30-50 orannda artm trombosit says, bazofil saysnn artmas (bazofili), azalm lkosit alkalen fosfataz (LAP) aktivitesi, periferik yaymada granlosit farkllamasnn tm basamaklar gzlenir.

Kemik iliinde; hipersellerite ile azalm ya ierii, myeloid/ eritrosit hcrelerinin orannn artmas, megakaryositlerin saysnn artmas izlenmektedir.

4 Balatc olayn genellikle tek pluripotent hematopoetik kk hcrenin t(9;22) kromozomal translokasyonu ile olutuu dnlmektedir. Oluan BCR-ABL fzyon geni byme avantaj salar ve klonal art gerekleir. Bylelikle genomik kararszla neden olur (5) . Oluan Bcr-Abl artm ve srekli tirozin kinaz aktivitesine sahiptir. Bu aktivite myeloid hcrelerine proliferasyonunu salar.(6) KML; farkl klinik evre ile karakterizedir. lk faz olan kronik fazda, periferik kanda lkositoz ve sklkla trombositoz, bazofili gzlenir. Hastalarn yaklak % 85 i bu fazda tan alrlar. Hematopoetik kk hcrelerinin (HKH) BCR-ABL fzyon gen ekspresyonuyla hastalk balar (ekil 2.1.1.). HKH ler myeloid nclleri (M) ve lenfoid nclleri (L) eklinde farkllar. M ler granlosit/makrofaj nclleri (GM; granlosit nclleri (G), makrofajlar (M) ve megakaryosit/eritrosit nclleri (ME) eritrositler, megakaryositler ve onlarn rn trombositler eklinde farkllar. Lenfosit nclleri T hcreleri, B hcreleri eklinde farkllar. Bu dnemde farkllama yeteneini kaybetmemi pluripotent kk hcrelerinden gelen Ph (+) lsemik klonunun ok fazla oalmas sz konusudur. Bu hcrelerin farkllamas sonuna kadar devam etmekte ve yksek miktarda granlosit dolamda yer almaktadr. Ksaca KMLnin kronik faz granlositik hcre serisinin ktlece art ile karakterizedir. Kronik fazn ortalama uzunluu 3-4 yldr. kinci faz olan akselere faz her hastada gzlenmeyebilir. Akselere fazda ntrofil farkllamas bozulmaya balar ve lkosit saysn myelospresif ilalarla kontrol altnda tutmak zorlar. Edinilmi genetik mutasyonlarla hastalk blast veya blastik faza geer. Blastik fazda hastaln prognozu ktdr ve ortalama yaam sresi 3-6 aydr (7). Blast faz yaklak hastalarn 2/3 inde myeloid ya da 1/3 nde lenfoid blast hcrelerinin birikmesiyle karakterizedir (8). Kemik ilii veya periferik kana geen blast hcrelerinin says %30 veya daha zerindedir. KML nin blast faz akut lsemiye benzer ve myeloid, lenfoid blastlar farkllamay baaramazlar. Vakalarn 1/3 nde blastlar lenfoid morfolojisine sahiptir. CD10 common acute lymphoblastic leukemia antigen ve terminal deoksinkleotidil transferaz gibi lenfoid belirleyicilerini eksprese ederler (9). Blast fazda en yaygn grlen kromozomal deiiklikler, ikinci bir Ph kromozomu, kromozom 8 in trizomisi (+8),

5 kromozom 17 in uzun kolunun izokromozomu i(17q) dur. Daha az yaygn olarak kromozom19 ve kromozom21 in trizomileri (+19, +21) grlmektedir. Transformasyon esnasndaki blastlarn fenotipi KMLdeki hangi HKHlerinin baskn olduunu gstermektedir. Hastadan hastaya farkllk gstermekle birlikte, olgularn %65 inde myeloid blastlar, %30 unda lenfoid blastlar, %5 inde ise megakaryositik veya farkllamam blastlar bulunmaktadr. Vakalarn byk bir ksmnda KML in sonu genellikle birka aylk yaamlar olan Akut Lsemidir.
HKH

KML-BF
(Myeloid)

M ME

L
Ek Mutasyonlar

KML-BF
(Lenfoid)

GM Ek Mutasyonlar

Mega Karyosit

KML-KF
Makrofaj Eritrosit Trombosit T Hcresi B Hcresi

Granlosit

ekil 2.1.1. Kronik Myeloid Lseminin geliimi.

6 2.2. Ph KROMOZOMU Kanser ile ilikisisi bulunan ilk kromozom anomalisi Ph kromozomudur. Sitogenetikte uygulanan tekniklerin gelimesi ile kromozomlarda daha detayl bant boyama teknikleri sonucu bu iki kromozomdaki krk noktalar tespit edilerek 9 numaral kromozomun uzun kolu ile 22 numaral kromozomun uzun kolu arasndaki karlkl translokasyon olduu anlald. Bunun sonucunda kk bir 22 numaral kromozom ile daha uzun 9 numaral kromozom ortaya kmaktadr. Ph kromozomu 5 bcr ile 3 abl dizilerinin birlemesiyle oluan BCR-ABL (22q-) onkogenini tar. Kromozom 9 zerindeki dier translokasyon paterni olan ABL-BCR (9q+) KML hastalarnn yaklak %60 nda eksprese edilir ama bunun hibir biyolojik fonksiyonu yoktur ve henz fenotipi bilinmemektedir (ekil 2.2.1.). KML ye neden olan faktrler hala bilinmemekle birlikte epidemiyolojik almalar iyonize edici radyasyon (IR) un etken olduunu gstermilerdir. nk IR ift zincirli DNA krklarna yol aabildii en iyi bilinen ajanlardan biridir. Kromozom 9 ve 22 nin hcre ekirdeindeki topografik yerleimleride resiprokal translokasyonlarn kolaylatrmaktadr. nsan hematopoetik hcrelerinde ABL ve BCR genlerinin konfokal mikroskopi ve floresan in situ hibridizasyon (FSH) teknikleri ile gsterilmesi sonucu hcre siklusunun S fazndan G2 fazna geite yanyana geldiklerini gstermitir. ABL ve BCR genlerinin birlemelerinin en kritik annn hcre dngsnn bu periyodu olduunu dndrmektedir. 2002 ylnda Saglio ve arkadalar tarafndan kromozom 22 zerindeki BCR genine ve kromozom 9 zerinde ABL genine ok yakn yerleimli duplike olmu byk genomik segmentler gsterilmitir. Bu segmentlerin fonksiyonel bir BCR-ABL fzyon geni oluturmak zere her iki kromozom arasndaki homolog rekombinasyonu kolaylatrd dnlmektedir. KML vakalarnn %90 ndan fazlasnda, erikin ALL vakalarnn 1/3 nde ve ocuk ALL ile AML vakalarnn t(9;22)(q34.1;q11.7) grlmektedir (10). %6 snda

BCR

BCR-ABL

ABL

ABL--BCR

ekil 2.2.1. Ph kromozomunun(22q-) ve 9q+n gsterimi.

2.3. ABL GEN VE PROTENNN YAPISI ABL geni, Abelson Murine Leukemia Virus (A-MuLV) onkogeni v-abl nin insan homologudur. 230 kb uzunluunda bir gen olup 11 ekzon ierir. 9q34 de lokalize olan ABL geni 145 kD luk bir reseptr olmayan tirozin kinaz kodlar (11).Abl proteinini kodlayan ABL geninin iki alternatif 1. ekzonu, 1a ve 1b, alternatif kesilmeye urayarak 5 ve 6,5 kb lk mRNA transkriptlerini oluturur. Bu kesilme varyantlarnn translasyonu, yalnzca N-terminal sekanslar birbirinden farkl olan iki ABL izoformunun olumasn salar. Abl proteini, tirozin kinaz ailesine aittir. ekirdekte ve sitoplazmada bulunabilir. Proteinin yerleimi NLS ve NES ler ile kontrol edilmektedir. Abl tip1b proteininin zerinde bir miristolasyon blgesi vardr ve bu nedenle bu protein plazma membranna balanabilir. Abl nin N-terminaline doru yerleen blgesi, bir protip non-reseptr tirozin kinaz olan Src iindeki blgeler ile yksek derecede homoloji gsterir. Bu blgeler ABL in tirozin kinaz fonksiyonunu dzenler. SH1 blgesi ABL nin kinaz blgesidir. SH2 ve SH3 blgeleri ise katalitik deildir ve tirozin kinaz aktivitesini dzenleyen dier proteinler iin balanma blgesi olutururlar. SH3 blgesi, SH1 blgesinin kinaz aktivitesinin dzenlenmesi iin arttr. ABL nin orta blgesi, Crk ve Crkl gibi proteinlerin SH3 blgelerine balanmay salayan prolinden zengin diziler ierir. ( 12, 2 )

8 ABL nin C-terminal blgesinde aktin filamentlerine balanmay salayan blgeler, DNA ya balanmay salayan blgeler, 3 adet Nkleer Lokalizasyon Sinyali (NLS) blgesi, 1 adet Nkleer Export Sinyali (NES) blgesi bulunur (ekil 2.3.1.). Abl normalde ekirdekte bulunur. NLS lerin kayb ABL nin sitoplazmaya translokasyonu ile sonulanr. ABL nin tirozin kinaz aktivitesi fizyolojik koullar altnda sk bir ekilde kontrol edilmektedir. SH3 blgesi bu inhibisyon ileminde kritik rol oynar. nk bu SH3 blgesinin delesyonu ve yer deiimi ile protein kinaz ilevi aktive olmaktadr. ABL nin ok sayda fonksiyonu vardr. Balca; Nkleer ABL: Genotoksik strese kar p53 ya da bunun ilevsel homologu olan p73 u kontrol ederek apoptozisi indkler. Hcre siklusunun G1 faznda tutulmasn salayarak bymenin negatif dzenleyicisi olarak rol alr. Sitoplazmik ABL: ntegrinlerden sinyal iletiminde rol alr. Transgenik farelerle yaplan almalarda, homozigot ABL gen delesyonu tayan farelerin normal geliimini tamamlayamad ve geliim gerilii, lenfoid organ hiperplazisi ve adrenal yetersizlikten dolay prenatal dnemde ld gsterilmitir. (12, 13).

ekil 2.3.1. Abl proteininin yaps. Tip Ia formu Tip Ib formundan biraz daha ksadr.Y393
kinaz domaininde otofosforilasyon blgesidir. F401 ok iyi korunmutur. Proteinin orta blgesinde 3 adet prolince zengin blge, 3 adet nklear lokalizasyon sinyal blgesi, DNA, Gaktin, F-aktin balanma blgesi, nklear eksport sinyal blgesi ierir. Fosforilasyon blgeleri Atm, cdc2, PKC ile gsterilmitir. (Deininger ve ark. 2000)

2.4. BCR GEN VE PROTENN YAPISI BCR geni 23 ekzon ierir. 1270 amimoasitten olumutur. Gen rn 160 kD luk birka ilevsel blgesi olan bir sitoplazmik proteindir (ekil 2.4.1.). N-terminalinden itibaren ilk 426 aminoasitlik blge zellikle nemlidir. nk BCR geninin 1. ekzonu tarafndan kodlanr ve tm Bcr-Abl fzyon proteini izoformlarnda yer alan tek polipeptit dizisidir. Bu ksm proteinin serin/threonin kinaz blgesini ve iki adet serin/threonince zengin blgeyi ierir. Serin/threonin kinaz blgesi otofosforilasyondan ve bilinen tek substrat olan Bap-1(BCRassociated protein 1 ) in fosforilasyonundan sorumludur. Bu blgede bulunan 177. pozisyondaki tirozinin fosforilasyonu nemlidir. nk BCR Ras N- Terminal blgesinde coiled coil blgesi in vivo ortamda dimerizasyona olanak salar. Transformasyon iin gereklidir. Sarmal-bobin eklindedir. RHO-GEF Blgesi; Bcr proteinin merkezinde bulunur. Cdc24, Dbl, Vav ve Cdc25 gibi birka guanin nkleotid deiim faktr (GEF) ile homoloji gsterir.

10 GEFler G-proteinlerinde GDP-GTP deiimini salayarak aktivasyonu

gerekletirirler. C-Terminali; Rac iin GTPaz aktive edici protein(GAP) fonksiyonu gren bir blge ierir. Bu GAP blgesi Rac ile etkileerek GTP hidrolizini hzlandrr. Bylece BCR n G-proteinleri aracl sinyal iletiminde ikili etkisinin olduu anlalmaktadr; merkezi blge uyarc rol oynarken C-terminal blgesi tirozin kinaz aktivitesinin inhibisyonuna yol aar. BCR -/- farelerle yaplan almalarda, BCR fonksiyonlarnn normal hcre fizyolojisi iin ok gerekli olmad sonucunu vermitir bu farelerde saptanabilen tek defekt, artm ntrofilik oksidatif yanma olarak bulunmutur (12).

ekil 2.4.1. Bcr proteinin yaps. N-terminalinde dimerizasyon domaini (DD), siklik
adenozinmonofosfat kinaz (cAMP) homolojisi gsteren domain bulunur. Grb-2in balanmas iin Y177 ok nemli otofosforilasyon blgesi, proteinin merkezinde Rho- guanidin nkleotid deitirme faktr (Rho-GEF), C terminalinde kalsiyum baml lipid bal (CaLB) ve Rac-GTPaz (Rac-GAP) blgesi bulunur.BCR-ABL fzyon proteinlerinin krlma pozisyonlar okla gsterilmitir. (Deininger et al.2000)

11 2.5. BCR-ABL FZYON GEN BCR ve ABL genlerinin zel blgelerinden krlmas (ekil 2.5.1.) ve birlemesi sonucu ortaya kan BCR-ABL fzyon geni, hematolojik malignitelerle birlikte sz edilmektedir. ABLdeki krlma noktalar; Krlma ABL geninin zerinde 300 kb dan uzun olan 5 segmentinin herhangi bir yerinde meydana gelebilir. Krlma noktalar; sklkla ekzon 1b ve ekzon 1a arasndaki intronik dizide, ekzon 1a nn 3 ucunda yer alan dizide, ya da ekzon 1b nin 5 ucunda yeralan intronik dizide yer alabilirler. Bu nedenle BCR-ABL fzyon genleri 1b ve 1a ekzonlarn veya tek bana ekzon 1a y ya da her iki alternatif ekzonuda bulundurmayabilir. Fzyon geninin yaps ne olursa olsun BCR-ABL mRNA s 1. ekzonu iermez ve BCR ekzonlarn ieren transkript direkt ABL ekzon a2 ye balanr. BCRdeki krlma noktalar: BCR geninde, balca tanmlanm blgede krlma noktalar yer alr. KML hastalarnn %95 inde ve ALL hastalarnn yaklak 1/3 nde BCR geni Major breakpoint cluster region (M-bcr) ad verilen 5.8 kb lk blgenin iinde ksalmaya urar. Bu blge orjinal ad b1-b5 olan ve gnmzde ise e12-e16 olarak adlandrlan be ekzondan oluur. Krlmalarn byk ounluu ya ekzon 13 n (b2) ya da ekzon14 n (b3) 3 blgelerindeki intronlarda oluur. Oluan hibrid transkriptler ya e13a2 (b2a2) ya da e14a2 (b3a2) birlemesine sahiptirler. Her iki durumda da mRNA 210 kD luk p210 Bcr-Abl fzyon proteinini kodlayan 8.5 kb lk bir diziden oluur. KML hastalarnn %99 unda b2a2 ve b3a2 olarak iki tip bcr-abl bilekesi gzlenmektedir (14). Ph pozitif ALL hastalarnn 2/3 nde ve nadir KML ve AML vakalarnda bcr deki krlma M-bcr n 5 blgelerinde yeralan minr breakpoint cluster region (m-bcr) olarak adlandrlan blgede oluur. Bu blge BCR geninin alternatif 2.ekzonlar olan e2 ve e2 arasnda yeralan 54.4 kb lk bir introndur. m-bcr da krlma noktalarna sahip BCR-ABL fzyon genleri BCR deki alternatif 1. ekzonlar (e1 ve e1) ile birlikte alternatif 2. ekzon olan (e2) yi ierirler.

12 BCR geni zerinde tanmlanm nc krlma demeti blgesi Micro Breakpoint Cluster Region(-bcr) olarak adlandrlmtr. Bu durumda krklar, BCR geninin 3 ucuna yakn olan e19(c3) ve e20(c4) ekzonlar arasnda gerekleir. Hibrid geninin transkripsiyonu, 230 kD luk bir protein olan p230 bcr-abl kodlayan e19a2 fzyon transkriptinin oluumunu salar. Ayrca e13a2, e14a2, e1a2, e19a2 den farkl birleim ekline sahip baz atipik BCR-ABL transkriptleri rapor edilmitir. e6a2 ve e2a2 birleimine sahip fzyon transkriptler rapor edilmitir. e2a2 birleiminin grld KML vakasnn, ek bir Ph kromozomu ve monozomi 7 ile beraber daha agresif bir klinik seyir gsteren hastala sahip olduu belirtilmitir. e8a2, e15a2, e1a3, e13a3, e14a3 transkriptlerine sahip hastalarda tespit edilmitir. (15, 2, 1, 16, 12, 11, 17, 18, 19 ).

13

BCR Geni

ABL Geni
Kromozom

9
KML-KF
Makrofaj Eritrosit

Kromozom Karyosit

Mega

22

T Hcresi Trombosi t

B Hcresi

Krlma Blgesi

Granlosit

ekil 2.5.1. BCR ve ABL genlerinin balca krlma blgeleri. (F. Pane, Intrieri M, Quintarelli C
2002

14 2.6. BCR-ABL FZYON PROTENN YAPISI VE HASTALIK FENOTP Bcr-Abl proteinleri, ABL ekzon 1 in BCR nin farkl ksmlaryla yer

deitirdii fzyon geninden kodlanr. Fzyon geninde yeralan ABL ierii deimediinden hastalk fenotipindeki deikenlik BCR geni tarafndan kodlanan protein dizilerinden kaynaklanmaktadr (ekil 2.6.1.). P210 BCR-ABL ekspresyonu: Klasik tipte KML nin ilgili olduu onkoproteindir. Hastaln kronik fazndaki belirgin zellii granlositik ve megakaryositik serilerdeki ar arttr. Mekanizmas iyi bilinmese de p210 Bcr-Abl nin granlositik farkllama ve maturasyonla ilgili hcre sinyal yolaklarn bozduu dnlmektedir. Genede bu bozulma ok ar deildir. Hcrelerin bir ksm olgun ntrofiller, eozinofiller ve bazofiller oluturmak zere geliimlerinin son basamaklarna ulaabilirler. P210 Bcr-Abl onkoproteininin e13a2 (b2a2) ve e14a2 (b3a2) bilekelerini tayan iki farkl formu bulunur. Ekzon e14, 75 nkleotid ierir, sonu olarak e14a2 birlemesine sahip fzyon geninin kodlad onkoproteinde fazladan 25 aminoasit bulunur. M-bcr krlma noktas pozisyonunun hastalk fenotipine etkisinin aratrld ilk almalar sonucunda e13a2 birlemesine sahip onkoproteinlerin yer ald KML tipinde akut fazn daha ge dnemlerde balad ne srld. Fakat daha byk rneklemelerle yaplan almalar sonucunda, bu dnn yanl olduu ve p210 Bcr-Abl yi kodlayan transkript tipinin herhangi bir prognostik deer tamad gsterilmitir. P190 BCR-ABL ekspresyonu : Sklkla ALL de grlrken belirgin bir monositozun olduu baz KML hastalarnda da grlebilir. P190 Bcr-Abl mRNA s e1a2 birleimini ierir ve proteinin toplam onkojenik potansiyeli yanlzca BCR ekzon e1 den gelen dizilerle snrldr. Bu tip proteinin eksprese olduu dominant hastalk tipinin ALL olmas, myeloid ncllerinden ok lenfoid ncllerindeki belirli metabolik yolaklarn seici olarak bozulmas demektir.

15 P230 BCR-ABL ekspresyonu : Bcr-Abl fzyon proteinlerden en by olan bu protein, e19a2 birlekesine sahip mRNA transkriptlerince kodlanr. e19a2 transkriptine sahip hastalarda nadir grlen myeloproliferatif bir hastalk olan Ntrofilik- KML ye ait zellikler gzlenmi. Ntrofilik-KML yi klasik KML den ayran zellikler; daha hafif ve yava klinik seyir, daha az splenomegali, hastaln blastik transformasyona dnm gecikmi, hatta hi gzlenmeyebilir. Dolamdaki baskn lsemik myeloid hcre tipi olgun granlositlerdir. Ayrca -bcr blgesi krnn, M-bcr den farkl olduundan, iyi huylu fenotipten sorumlu olduu dnlmektedir. P230 Bcr-Abl; Bcr nin peptid dizisinin %90 ndan fazlasn ierir. Sadece C-terminalindeki GAP homoloji blgesinin 2/3 n bulundurmaz. Kalan 1/3 lk ksm fonksiyonel olarak aktiftir ve GAP aktivitesi iin gereklidir. Bu onkoproteinini eksprese eden KML ncllerinin, hem normal hem de transloke BCR alleleri fizyolojik olarak normal GAP aktivitesi gsteren bir protein eksprese edebildiklerinden, granlositik diferansiyonun normal basamaklarndan geebildii ne srlmtr. Bu hipotez, p230 Bcr-Abl deki ek BCR dizilerinin dier iki fzyon proteinine gre daha hafif seyirli bir myeloproliferatif hastalkla sonulanan bir fonksiyona yol at gr ile uyumludur.

ekil 2.6.1. BCR-ABL geninin balca formlar.

16 Yksek hassasiyetteki Kantitatif Revers Transkriptaz- Polimeraz Zincir Tepkimesi (RT-PZT) metodu kullanldnda, hcrelerinde M-bcr krlma noktas bulunan ve eksprese edilen fzyon proteini p210 Bcr-Abl olan hastalarda e1a2 bilekesine sahip transkriptlerde saptanabilir. Erken dnemlerde, p210 bcr-abl kodlayan mRNA ya ek olarak BCR-ABL nin p190 formunu kodlayan BCR-ABL mRNA snn bulunmas, bu durumun bir ekilde hastalkta akut faza ya da blast krizine olan ilerlemeyle ilikili olduu dnlmtr. Sonraki almalarda ise, bu p190 tipi BCR-ABL mRNA molekllerinin, tek ve klasik M-bcr krlma noktas bulunan KML hastalarnn %90 ndan fazlasnda, hastaln fazndan bamsz olarak saptanabildiini ortaya karmtr. Daha baskn olan p210Bcr-Abl mesajna karn dk dzeylerdeki ekspresyonlar, e1a2 transkriptlerinin byk olaslkla e13a2 ya da e14a2 transkriptlerinden birinin alternatif kesilmesiyle olutuunu dndrmektedir.

17 2.7. BCR-ABL PATOGENEZ LE LGL MEKANZMALAR BCR-ABL aracl malign transformasyonda majr mekanizma etkilidir (ekil 2.7.1.). 2.7.A. HCRESEL ADEZYONUN BOZULMASI Adezyon moleklleri, hcrelerin zgl olarak dokulara ynlenmelerinde, birbirlerini tanmalarnda, embriyogenez, hcre bymesi, hcre farkllamas ve inflamasyon gibi olgularn dzenlenmesinde grev alrlar. Normal hematopoezde ncl hcreler kemik ilii stroma hcrelerine ve ilgili ekstraseller matrikse tutunur. Matriks, fibronektin gibi stromal hcrelerce sentezlenen ve ncl hcrelerin yzeylerinde eksprese olan reseptrler iin adezif ligand fonksiyonu gren proteinlerden oluur. Adezyon, ncl hcrelerin sitokin salglayan hcrelerin yaknnda bulunabilmesi iin arttr. Bylece hematopoetik ncller, sitokinler ile iletilen lokal sinyalleri almak zere birarada tutulurlar. ncl hcrelerin gelecekleri de bu sinyaller ile belirlenir. Aldklar ya da alamadklar sitokin mesajlarna gre hayatta kalr ya da apoptoza urarlar. KML Ph pozitif ncl hcrelerinin kemik ilii stroma hcrelerine ve ekstraseller matrikse adezyonlar azalr. Bylece bu ncl hcreler, normal adezif progenitrlere salanan sinyallerden yoksun kalrlar. Stromaya adezyon hcre proliferasyonunu negatif olarak dzenler ve KML hcreleri deien adezyon zellikleri ile bu dzenden ka gsterirler. 2.7.B. APOPTOZSN NHBSYONU Apoptozis, hcrenin yaam emberi boyunca yapm-ykm dengesinin srdrlmesini salar. Genetik olarak planlanm hcre lm olarak tanmlanm apoptozis, belirli bir hcre klonunun genilemesini snrlar. Fare ve insan hcre hatlarna eksojen olarak BCR-ABL transfeksiyonu, byme faktr geri ekilmesiyle indklenen apoptozisi inhibe etmitir. Ayrca genotoksik ajanlara kar apoptoza kar da artm diren gzlenmitir. BCR-ABL n hcre hatlarnda apoptozu nasl inhibe ettii iyi anlalamamtr. Bcl-2 protein ailesinin yeleri BCR-ABL aracl anti-apoptoza

18 yardmc olabilirler. BCR- ABL, Ras ve PI-3K araclyla Bcl-2 ailesi yelerini upregle edebilmektedir. Bcl-2, Raf-1in mitokondriye hedeflenmesinde ve bylece pro-apoptopik protein Bad n inaktivasyonunda rol oynar.

BCR-ABL

Adezyonun Deimesi

Mitojenik Aktivasyon

Apoptozisin nhibisyonu

Malign Fenotip

ekil 2.7.1. Bcr-abl ile ilgili olu mekanizmalar (Deninger 2000).

2.7.C. MTOJENK SNYAL YOLAKLARININ AKTVASYONU BCR-ABL mitojenik potansiyele sahip birok sinyal yolan aktive etmektedir (ekil 2.7.2.). Ras ve MAP kinaz yolaklar Ras ve Raf protoonkogendir. BCR-ABL, proteinlere direkt balanabilir. Tirozin177 rezidsnn otofosforilosyonu, adaptr proteini Grb-2 iin balanma blgesi oluturur. Grb-2 ise SOS proteinine balanr. SOS proteinin inaktif GDP bal Ras aktif GTP bal Ras haline getirir. stirahat halindeki hcrelerde Ras proteinleri inaktif (Ras-GDP) halde bulunurlar. Aktive olan Ras proteini Raf-1 e yksek afinite ile balanr. Aktifleen Raf-1 MAP kinaz sinyal kaskadn aktifletirir. Ras sinyal yolan aktive eden

19 Jak-Stat yola: Normal hcrelerde, Janus kinazlarn aktivasyonu (JAK) ile STAT Signal transducer and activator of transcription lar aktif hale gelir. Ancak BCR-ABL pozitif hcrelerde JAK lara ihtiya duymadan direkt olarak fosforile ederek transformasyona yol aar. Gnmzde yedi STAT proteini tanmlanmtr. STAT3 ve STAT5 aktivitelerinin kontrolsz ileyii malign transformasyonda rol oynamaktadr. Devaml aktif olan STAT proteini antiapoptotik yollar uyararak malign srete etkili olabilmektedir (20, 12). PI-3 Kinaz yola: Fosfoinozitid-3 kinaz (PI-3K) ailesi, byme ve yaama sinyallerinin iletiminden sorumlu proteinlerdir (21). BCR-ABL pozitif hcre hatlarnn ve primer hcrelerin proliferasyonu PI-3 kinaz aktivitesine baldr. BCR-ABL, PI-3 kinaz Crk, Crkl, p120 araclyla aktive eder. Aktive PI-3 kinaz, bir serin/treonin kinaz olan efektr Akt yi aktive eder. Akt aktivasyonu pro-mitojeniktir. Hcre siklusunun inhibitr olan P27 yi downregle eder. Myc yola: Myc onkoproteinin overekspresyonu birok insan malignitesinde gsterilmitir. Myc in aktivasyonu ile BCR-ABL in hcresel transformasyona yol at san fibroblastlarnda gsterilmitir (22).

ekil 2.7.2. BCR-ABL vastasyla etkilenen sinyal yolaklar.

20 2.8. KML DE UYGULANAN TEDAV YNTEMLER Allojenik kk hcre transplantasyonu KML iin bilinen tek tedavi edici yntemdir. Ancak ou hasta ilerlemi ya ( ki bu durum onlarn tedavinin ciddi yan etkilerini tolere edememelerine sebep olur.) veya uygun kk hcre vericisinin olmamasndan dolay bu tedaviden faydalanamaz. KML nin oluumu iin BCRABL fzyon geninin gerekli olmasnn ve ABL nin tirozin kinaz aktivitesinin BCRABL nin transformasyonu iin gerekli olduunun kefedilmesi ABL kinaz tedavi iin dikkat ekici bir hedef haline getirmitir. KML tedavisininde ncelikle lkosit says azaltlmal ve kratif tedaviye geilmelidir. Gnmzde bilinen en iyi tedavi ekli gen hastalarda %100 HLA-uygun verici varlnda Allojenik hematopoetik kk hcre naklidir. 2.8.A. Konvansiyonel Kemoterapi 2.8.A.1. Hidroksire: Ribonkleotid redktaz inhibitrdr. Lkosit saysn hzlca drr, ciddi bir yan etkisi yoktur, iyi tolero edilir. la kesilince etkisi hemen sonlanr. Ph kromozomunu negatifletirmez. 2.8.A.2. Busulfan: Gnmzde pek kullanlmamaktadr. Ciddi yan etkileri vardr. Hidroksi reye gre etkisi ge balar ve ge sonlanr. 2.8.B. Kratif Tedavi Gnmzde 3 tedavi seenei vardr. nterferon-alfa (FN-), Tirozin kinaz inhibitr (imanitib mesilat), Allojeneik hematopoetik kk hcre naklidir. 2.8.B.1. FN-: Allojeneik kk hcre nakli olma ans olmayan Ph pozitif KML hastalar iin iyi bir tedavi seenei olmutur (imanitib mesilat kullanma girmeden nce). IFN- nn KML deki etki mekanizmas tam bilinmemektedir. Antiproliferatif, antianjiogenik, immun modulatr ve stromal hcreler ile adhezyon moleklleri arasndaki ilikiyi dzenler. IFN- birlikte uygulanan tedavi eklidir (23, 51). tek bana veya dier ajanlarla

21 2.8.B.2. manitib Mesilat: 2-fenil-aminopirimidin trevidir. BCR-ABL nin tirozin kinaz aktivitesini inhibe eder. manitib mesilat, enzimatik blgesinde ATP ile yara girerek, ABLin kinaz aktivitesini bloke eder. manitib mesilat BCR-ABL i eksprese eden hcreler iin seici toksitite gsterir. FN- ya gre yan etkileri daha az ve sitogenetik yant oran daha yksektir. manitib mesilat kullanm ile karlalan en nemli sorun hastalarda belli bir sre sonra tedaviye direncin gelimesidir. Dirence yol aan mekanizmalar, BCR-ABL amplifikasyonu, BCRABLin kinaz blgesinde meydana gelen nokta mutasyonlar, yeni sitogenetik anormallikler, P-gpnin ar ekspresyonudur. manitib direnci ile ilgili eitli mutasyonlar rapor edilmitir bunlardan bazlarna T315I threoninin izolsine dnmesini salayan, M351T de metioninin threonine, E255K da glutamik asitinin lizine dnmesini salayan mutasyonlar rnek olarak verebiliriz (5). Direncin stesinden gelmek iin ya ila dozaj artrlmal ya da etkili ila kombinasyonlar kullanmak gerekir. almamzdaki hasta grubunda bir hastaya FN- balanm daha sonra imanitibe balanmtr. manitib KML hastalarnda yaygn kullanldndan etki mekanizmas u ekildedir. manitib mesilatn etki mekanizmas; manitib, BCR-ABL in ATP tarafndan doldurulan balanma cebine balanarak normalde ATP tarafndan karlanan fosfat gruplarnn eksikliine ve bylece substrat fosforilasyonun engellenmesine yol aar. Fosforillenmemi tirozine sahip substratlar , efektr molekllere balanmak iin gerekli ekli alamazlar. manitib, Bcr-Abl proteininin inaktif konformasyonda kalmasn indkler, ATPden fosfat transferini engeller ve aa ynde sinyal iletim yolaklarn bloke ederek byme duraklamasna ya da apoptozise neden olur (24, 25, 26). ekil (2.8.2.).

22

ekil 2.8.2. manitib mesilatn etki mekanizmas

2.8.B.3. Allojenik Hematopoetik Kk Hcre Nakli: HLA-uygun verici gen hastalar iin en uygun tedavi eklidir. zellikle erken kronik faz ve dk risk grubundaki hastalarda uzun dnem hastalksz ve uzun sakalm gzlenmektedir. Nakil sonra erken relaps tayin etme MRD testleri olduka nem kazanmaktadr. Hastalarda nakil sonra 6 aylk dnemde RT-PZT ile BCR-ABL transkriptleri saptanrsa relaps riski yksek gruptadrlar. Molekler relaps gelitiren hastalarda birka sonra sitogenetik relaps ve hematolojik relaps gzlenir (27). Tedaviye yant klinik, hematolojik ve sitogenetik dzeyde deerlendirilir. Klinik tam yant KML nin neden olduu semptomlarn kaybolmas, hematolojik tam yant periferik kan deerlerinin normale dnmesi, sitogenetik yant ise; Ph kromozom orannn tespit edilmesi ile deerlendirilir. Tam cevap (CCR) %100 Ph-negatif metafaz, Major cevap(MCR) 65-99 % Ph-negatif metafaz, 10-64 %Ph-negatif metafaz minor cevap(mCR), %90 dan fazla Ph-pozitif metafaz cevapsz (NCR) eklinde deerlendirilir. Molekler yant ise, RT-PZT yntemi ile BCR-ABL transkriplerinin saptanamamasdr ( 28, 29 ,30 ).

23 Tanda vcuttaki lsemi hcrelerinin says yaklak1012 dir. Tam remisyonu (CCR) salam hastalar hala 109 lsemi hcresini vcutlarnda barndrrlar. Eer kemoterapi yada Allojenik kk hcre nakli ile yok edilemezse bu hcreler relapstan sorumludur (5, 31). Lsemi tedavisinde son yllardaki gelimelere ramen, relapsn varl hala ciddi bir problem olarak devam etmektedir. Hastaya uygulanan tedaviden kaan ve relapsa neden olan hcrelerin varl minimal rezidel hastalk (MRD) tanmlamasn gndeme getirmi ve tedavi sonras relapsa yol aan en nemli nedenin MRD olduunu dndrmtr. Remisyonda grlen hcrelerde MRD n belirlenmesi klinik relapsn tesbitinde nemli rol stlenmektedir. Kemik ilii transplantasyonu sonras hastann izlenmesi, relapsn erken safhada yakalanmas asndan ok nemli olmaktadr. Yine kemoterapi alan hastalarn remisyonunun gerek olup olmadnn tesbiti bu tekniklerin gvenirliliine baldr. MRD nin tesbiti, hastaln prognozunun izlenmesi ve relapsa girdiinde tedbirlerin alnmas iin olduka nemlidir (32). MRD n tespiti iin kullanlan metotlar ve hassasiyetleri aadaki gibidir: Metot Konvansiyonal Sitogenetik FISH Southern Blot Western Blot Kantitatif RT-PCR Ph kromozomu BCR ve ABLin yanyana konulmas M-bcr BCR-ABL proteini BCR-ABL mRNA K / PK K / PK K / PK K / PK 0,2- 5 1- 10 0,2- 1 0,001- 0,0001 K 1- 10 hedef materyal hassasiyet%

K: Kemik ilii PK: Periferik kan

Minimal rezidel hastaln deerlendirilmesi iin kullanlan tekniklerden biri olan konvansiyonal sitogenetiktir. 100 normal hcrede bir lsemi hcresi tespit edilebilir. Tedavi sresince meydana gelebilecek genomik deiiklikleri belirlemek ve sitogenetik remisyonu tanmlamak iin seilebilir ancak hassasiyeti dktr. Southern Blot ve Western Blot hassasiyetleri dk ve olduka zahmetli metotlardr.

24 Daha hassas bir izleme iin FSH ya da kantitatif RT-PZT teknikleri nerilmektedir (32, 33, 36, 43). Kantitatif RT-PZT Teknii; Materyalin , ilk miktarn kantite eden spesifik, duyarl, tekrarlanabilir ve reaksiyon srasndaki amplikon retimini, floresan yaplan bir metottur. Hassasiyeti yaylmn indikatr olarak kullanarak lm

olduka yksek bir metottur, 106 normal hcredeki bir malign hcreyi tespit edebilmektedir. Amplikonun tespitinde iki materyal kullanlr. Floresan problar ve DNA ya balanan ajanlardr. almamzda floresan prob olarak Taqman prob kullanlmtr. Taqman prob mettotunda rneklerdeki cDNA hedef sekans miktarnn lmn yaparken Taq Polimerazn 5 ekzonkleaz aktivitesi kullanlr. Prob 5 ucuna bal haberci bir boya, [genellikle de FAM (6-karboksifloresein)], 3 ucuna basklayc boya [TAMRA (karboksitetrametilrodamin) en tipik olarak bilinen basklayc boyadr] ierir. Taq Polimeraz Taqman probun bal olduu hedef blgeyi oaltmaya baladnda, 5 nkleaz aktivitesi probu kesmeye balar. Basklayc boya haberci boyann florasan emisyonunu prob bozulmadnda nleyebilir. Reaksiyon srasnda probun blnmesi haberci ve basklayc boyay birbirinden ayrr. Bylece haberci boyann her dngde serbest kalmas ile doru orantl olarak artan floresan ma vermesine yol aar. PZT rnlerinin oalmas haberci boyann florasenda artmas ile saptanr ve CCD kamera gibi dijital grnt sistemleri kullanlarak grnt oluturulur (34). Eik deeri veya Ct deeri, PZT rnlerinin oalmasnda nemli artn olduu zamanki siklustur. Ct, log-lineer fazda PZT rnnn eksponansiyal bymesi ile sinyal artmasnn balama belirtisidir ve bu faz reaksiyon hakknda en kullanl bilgiyi salar. Kantitasyon iin en nemli parametre Ct deeridir. Ct deeri ile kopya says birbiriyle ters orantldr. Yksek kopya says olan rnein Ct deeri dktr (35,14). Yaplan allojenik kk hcre naklinden sonra kandaki BCR-ABL transkript saysnn llmesi relaps riskini belirlemede nemlidir. KML li hastalarda imanitib mesilat standart tedavi olmutur. manitib, BCR-ABL geninin tirozin kinaz aktivitesinin gl ve seii inhibitrdr. Yaplan almalarda imanitib kullanan hastalarda gl cevap ve sabit remisyonda kalma rapor edilmitir, yalnz kronik fazda baz hastalarda major sitogenetik cevab baaramama ya da kaybetme, ve

25 akselere/ blastik faza ilerleme ya da relaps gzlemlenmitir. Bu da imanitibe direnci aratrclar iin ilgi ekici hale getirmitir. manitibe direncin eitli mekanizmalarla iliii olabilir bu durum hala bir fenomendir: BCR-ABL geninin overekspresyonu ve amplifikasyonu, ATP-balanma blgesindeki nokta mutasyonlar ile yeniden kinaz aktivasyonu kazanmas ya da MDR1 geninin overekspresyonunu ila direnliliinde dnlebilecek seeneklerdir. 2.9. OKLU LA DRENC Kanserin tedavisinde kemoterapinin ok nemli bir yeri vardr. Ancak normal doku ve hcrelere olan yan etkileri yansra kemoterapinin tedavi etkinliini snrlayc en nemli faktrlerden biride kemoteraptiklere direnli kanser hcre varyantlardr. Bu varyant hcreler spesifik tek bir ilaca diren gsterebilecekleri gibi deiik kimyasal yaplardaki ve deiik etki mekanizmalarna sahip birbirinden farkl birok ilaca diren gsterebilmektedir. Kanser tedavisinde kemoterapi baarszlnn nde gelen nedenlerinden biri oklu ila direncidir. nvitro ve in-vivo almalarla oklu ila direncinden sorumlu farkl birok mekanizma ortaya kmaktadr. Apoptotik mekanizmalardaki bozukluk, ilacn hcre ii konsantrasyonunun azalmas, ilacn aktivasyonunun bozulmas, ilacn katabolizmasnn hzlanmas, hcre iinde hedef enzim konsantrasyonunun azalmas ya da yapsal deiiklie uramas, DNA tamir mekanizmalarnn hzlanmas bugn oklu ila direncinde en sklkla rol oynad dnlen mekanizmalar oluturmaktadr (37). MDR ilk kez memeli hcresinde 1970 ylnda kefedilmitir. oklu ila direncinde en bilinen mekanizma, insan MDR1 geni tarafndan kodlanan 170 kDa arlnda bir transmembran proteini olan p-glikoproteininin (P-gp) ar ekspresyonudur. P-gp ilk kez 1976 ylnda Ling ve Juliano tarafndan rapor edilmitir. P-gp, ATP- baml bir pompa olark i grr ve hcre ii ila konsantrasyonunu sitotoksik seviyenin altnda tutar.(38) P-gp; ATP-binding casette (ABC) ailesinin bir yesidir. ABCB1 geni tarafndan kodlanr buna yaygn olarak MDR1 geni de denilmektedir. 7 no lu kromozomun

26 uzun kolunun 21-31 bandnda yeralr (7q21-31) ve 28 ekzona sahiptir. MDR gen ailesinin insanda 2 yesi bulunmaktadr, MDR1 ve MDR3 eklindedir, farelerde ise mdr1a, mdr1b, mdr2 olmak zere 3 gen bulunmaktadr. rodentlerdeki mdr1a/mdr1b ayn fonksiyona sahiptir, nsandaki MDR1 ile ilacn dar transportunu

salar. P-gp molecular vacuum cleaner olarak i grr, bu modele gre P-gp substratn hcrenin iinden membrana doru basit difzyonla hareket ettirir (39). P-glikoproteinin yaps, 6 transmembran blm ve nkleotid balama sekans ieren homolog iki yardan oluur, 1280 aminoasite sahiptir. Molekln N-termainalinin yarsnn ekstraselller blgesinde tek glikolizasyon blgesi vardr. P-glikoprotein, adenozin-3-fosfat a ( ATP ) baml bir protein olup, ilalarn hcreden dar atm pompas olarak almakta ve hcre ii ila dzeyini dk seviyede tutarak, klasik MDR olarak adlandrlan, antrasiklinler, epipodofilotoksinler, aktinomisin D, vinka alkaloidleri ve baz alkilleyici ajanlara kar dirence neden olmaktadr. P-gp; yalnzca tmr dokusu ile snrl deildir normal dokularda da eksprese olur. Karacierde, kolonda, adrenalin bezinde, jejenum ve pankreasta, bbrekte, hematopoetik kk hcrelerde, periferik kanda mononkleer hcrelerde, olgun makrofajlarda, T ve B lenfositlerde P-gp ekspresyonu vardr. MDR1 mRNA s birka lenfosit soylarnda da yksek seviyede CD56+ hcrelerinde, dk seviyede ise CD8+, CD4+, CD15+, CD19+, CD14+ hcrelerinde bulunmutur(40). P-gp olduka geni substrat spesifikliine sahiptir. Bu substratlar genellikle hidrofobik ve amfipatiktir. Bu substratlarn iinde baz antikanser ilalar (imanitib mesilat gibi), HIV proteaz inhibitrleri, immnospresanlar, antibiyotikler, antihistaminiklerdir. P-gp in genetik bazl veya sonradan edinilmi deiimlerle aktivitesinin deimesi toksinlere maruz kalmay artrabilir bu mekanizma vastasylada tmr oluma riskinin artmasna katkda bulunabilecei dnlmektedir. P-gp nin hangi kanserlerde ila direncinden sorumlu olduunun ortaya konmas iin yaplm almalarn ou hematopoetik kanserler zerinedir. Lsemi, lenfoma ve multiple myelomada bata dk ekspresyon gstermekle birlikte zellikle kemoterapi sonras ekspresyonunun artt gsterilmitir. P-gp ile AML hastalarnda ok sayda alma yaplm olup AML hastalarnn 1/3 nde tan annda, %50sinde

27 ise ilk nkste yksek seviyelerde P-gp ekspresyonunun olduu gsterilmitir. AML hastalarnda P-gp ekspresyon seviyesinin nks ihtimali ile korele olduu bildirilmitir. KML hastalarnn blast krizi dneminde P-gp nin ar ekspresyonu gzlenmitir. lalara yant ve ilalara bal yan etkiler ila metabolize eden enzimlerdeki genetik deiiklere bal olarak ayn toplumdaki bireyler arasnda farkllklar gsterir. Bu fark ila direnci oluturan MDR genlerinin artm ekspresyonuna bal olabilir. MDR1 geninin 26. ekzonunda tek nkleotid polimorfizmi C3435T (Ile1145 Ile) P-glikoprotein ekspresyonunu azaltmaktadr. Ayrca MDR1 gen polimorfizmi toplumlararas farkllklar gstermektedir. Son yllarda MDR1 geninde 40 dan fazla SNP gsterilmitir (41).

28 3. MATERYAL ve YNTEMLER 3.1. Bireyler Bu tez almas kapsamnda Kronik Miyeloid Lsemi tans konulan 32 hastann 17 sinde BCR-ABL ve MDR1 gen ifadelerine 0-48. ay aralnda baklm, MDR1 C3435T polimorfizm deerlendirilmesi 32 KML hastasnda ve 36 salkl bireyde allmtr. 17 KML hastasnn klinik deerlendirmeleri Hacettepe niversitesi Tp

Fakltesi Temel Onkoloji Anabilim Dalnda yaplmtr. Tm almalar kiilerden Bilgilendirilmi Onam Formu ve H.. Tbbi,

Cerrahi ve la Aratrmalar Etik Kurulu nun Onay alnarak (20 07 2006 tarihli FON 06/30-6 karar no) gerekletirilmitir.

29 3.2. almada Kullanlan Malzemeler RNA izolasyonu iin nvitek marka RNA izolasyon kiti kullanld. Ykama solusyonu 1; Kaotropik tuz, izoamilalkol, etanol, DEPC li ddH2O Ykama solusyonu 2; Etanol, izoamilalkol, DEPC li ddH2O Elsyon solusyonu (EL); DEPC le muamele edilmi dH2O ierir. Lizis Tampon; 2-merkaptoetanol, EDTA, DEPCli ddH2O, kaotropik tuz ierir.

cDNA sentezi 10X Reverz Transkripsiyon tamponu MgCl2 25mM dNTP miks 10mM(her birinden (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 2,5 mM) 10X Random Hekzamer 50mM, 50 nmol RNAaz inhibitr(2000U) 20 nite/ml Multiscrib Reverz transkriptaz, (5000U)50nite/ml dH2O

M(9;22), m(9;22), MDR1 tesbiti; MgCl2 50mM 10 X PCR Tampon 10 X Pasif referans boya solusyonu AmpliTaq Gold DNA Polimeraz (1250U) 5 nite/ ml Her bir test iin 5 X miks (her bir almaya spesifik primerleri ve probu ieren karm)

30 MDR1 Polimorfizmi ; PGX-HIV Strip kiti kullanld. Kitin iindeki solusyonlar; Hibridizasyon buffer, Ykama solusyonu A, Ykama solusyonu B, Denatrasyon solusyonu, Renk Artrc, Konjugat solusyonu (Streptavidin-alkalin fosfataz ierir.), Amplifikasyon miski(iinde allacak blgeye zg biyotinlenmi primerleri ierir.), Taq dilusyon buffer, Taq Polimeraz dr. Kandan DNA izolasyonu iin nvitek marka izolasyon kiti kullanld. Kitin iindeki solusyonlar; Balama solusyonu, Ykama solusyonu 1, Ykama solusyonu 2, Proteinaz K, Lizis Buffer A, Elsyon Buffer D eklindedir. Kantitasyondaki ana hedef, gen anlatmnn llmesi olduundan kantitatif PZT yntemi, mRNA zerinden gerekletirilir. RNA her trl dokudan elde edilmekle birlikte hematolojide kullanm en kolay materyal kandr. Hastalardan alnan periferik kan rneklerinden RNA izolasyonu aadaki protokolle gre yaplmtr. 3.2.A. KANDAN RNA ZOLASYON PROTOKOL Eritrositlerin paralanmas 15 ml lik tp ierisine 10 ml souk EL konulur sonra 1- 1,5 ml kan eklenir. Buz iinde 15 dk. inkbe edilir. Lkositlerin Toplanmas 4000 rpm de 5 dk +4 oC santrifj edilir, spernatan atlr. 5 ml souk EL pellet zerine eklenir. Vortekslenir ve 4000 rpm de 5 dk. +4 derecede santrifj edilir. Tm spernatan uzaklatrlr. 900 ml lizis Solusyon DCT hcre peleti zerine eklenir, vortekslenir.. 10dk.

Lkositlerin paralanmas. Oda ssnda inkbe edilir. Genomik DNAnn uzaklatrlmas rnek 12,000 rpm de 18 0C derecede 30 sn santrifj edilir. Spernatan yeni bir tpe aktarlr. Total RNAnn spin filtreye balanmas 800 ml %70 lik etanol spernatan zerine eklenir.

31 Yeni bir tpe spin filtre yerletirilir. Karmdan 850 ml spin filtreye aktarlr. 10,000 rpm de 1dk. Santrifj edilir. 500 ml Ykama solusyonu 1 spin filtre iine aktarlr ve 10,000 rpm de 30 sn

Spin filtrenin 1. ykanmas (18 0C) santrifj edilir. Filtre tpe yerletirilir. Spin filtrenin 2. ykanmas (18 0C) 750 ml Ykama solusyonu 2 spin filtre iine aktarlr ve 10,000 rpm de 30 sn santrifj edilir. Filtre tpe yerletirilir Spin filtrenin kurutulmas Etanol artklarn uzaklatrmak iin filtreyi tek bana 12,000rpm de 3 dk. Santrifj edilir. Total RNAnn elde edilmesi Spin filtre tp iine yerletirilir ve 30-60ml (arasnda) Elution Buffer R spin filtreye eklenir. Oda ssnda 2 dk. inkbe edilir ve 8,000 rpmde , 18 0Cde, 1 dk santrifj edilir Filtre atlr ve RNA buz zerinde saklanr. (Bu yntemle 1-5 g RNA elde edilir.) Total RNA elde edildikten sonra RNAdan DNAya evirim iin cDNA protokol uyguland. 3.2.B. cDNA PROTOKOL Reaktifler 10X Revers Transkripsiyon buffer MgCl2 25X dNTP 10X Random Hekzamer RNAaz inhibitor Multiscribe Reverz transkriptaz, 50 U/ml dH2O Toplam hacim Miktar (1 rnek iin) 5.0 11.0 2.5 2.5 3.0 1.25 14.75 40.0 ml ml ml ml ml ml ml ml

32 Toplam hacim 40 ml olacak ekilde hazrlanp zerine 10 ml elde edilen total RNA ilave edilmitir. Aadaki siklus ve derecelerde ABI 9700 Thermal Cycler cihaznda cDNA elde etme ilemi gerekletirilmitir. alma gerekleene kadar rnekler + 4o C de saklanmtr. Scaklk 1. 2. 3. 25 C 48 0C 4
0 0

Sre 10 dakika 60 dakika Sonsuz

3.2.C. M(9;22) P210BCR-ABL ALIMA PROTOKOL Reaksiyon Karm Reaktif Steril distile su 10 x PCR Buffer 10 X Pasif referans boya solusyonu MgCl2 5 x karm AmpliTaq Gold DNA polimeraz cDNA Toplam Hacim Miktar 8,7 l 2,5 l 2,5 l 4 l 5 l 0,3 l 2 l 25 l Final Konsantrasyonu -----1X 1X 8 mM 1X 1.5 nite (reaksiyon bana) 2 l

33 cDNA miktarlar spektrofotometrede llerek 50 ng a dilue edilmitir. Kantitatif alma, P210BCR-ABL M(9;22), P190BCR-ABL m(9;22), MDR1 genlerine zg 8 standartla ve negatif kontrolle birlikte yaplmtr. Standartlar, kopye says belli olan pozitif kontrollerdir. Negatif kontrolde amplifikasyon erisi grlmemelidir. Sadece -2M de 8 yerine 3 standart kullanlmtr. P210BCR-ABL ve P190BCR-ABL iin pozitif kontrol deerleri 100.000, 10.000, 2500, 500, 100, 50, 25, 5 molekldr. MDR1 in pozitif kontrolleri 1.000.000, 250.000, 25.000, 5.000, 1.000, 250, 100,25 molekl, -2M in pozitif kontrolleri 100.000, 1.000.000, 10.000.000 molekl eklindedir. Negatif kontrol 23l + 2 l dH2O olacak ekilde hazrlanmtr. Her gen ekspreyonunun lm iin gene zg protokolle hazrlanan karmdan 23 l alma plateindeki allacak tm kuyucuklara ilave edilip zerine 2 l hastalarn cDNA lar eklenir (23l karm + 2l hasta rnei) . Pozitif kontrollere 25 l karmdan ilave edilir. M(9;22), m(9;22), MDR1, Mikroglobulin iin aadaki PZT program seilmitir. normalizasyon iin referans gen olarak -2 mikroglobulin kullanlmtr. - 2 almamzda

Scaklk 50 C 95 0C 95 0C 60 0C 4 0C
0

Sre 2 dakika 10 dakika 15 saniye 1 dakika Sonsuz 40 dng

34 3.2.D. m(9;22) P190BCR-ABL ALIMA PROTOKOL Reaksiyon Karm Reaktif Steril distile su 10 x PCR Buffer 10X Pasif referans boya solusyonu MgCl2 5 x Miks (dNTP, primerler, prob) AmpliTaq Gold DNA polimeraz cDNA Toplam Hacim Miktar 9,8 l 2,5 l 2,5 l 3 l 5 l 0,2 l 2 l 25 l Final Konsantrasyonu -----1X 1X 6 mM 200 nM, 80 nM 1 nite (reaksiyon bana) 2 l

3.2.E. -2Mikroglobulin ALIMA PROTOKOL Reaksiyon Karm Reaktif Steril distile su 2X Master Miks Forward Primer Reverse Primer Prob cDNA Toplam hacim Miktar 12,5 l 5,75 l 0,75 l 0,75 l 0,25 l 5,0 l 25,0 l

35 3.2.F. MDR1 ALIMA PROTOKOL Reaksiyon Karm Reaktif Steril distile su 10 x PCR Buffer 10 X Pasif referans boya solusyonu MgCl2 5 x Miks cDNA Toplam Hacim (dNTP, primerler, prob) AmpliTaq Gold DNA polimeraz Miktar 9,8 l 2,5 l 2,5 l 3 l 5 l 0,2 l 2 l 25 l Final Konsantrasyonu -----1X 1X 6 mM 1X 1 nite (reaksiyon bana) 2 l

36

ekil 9. alma sonras amplifikasyon erilerinin gsterildii pencere.

Her reaksiyon iin ve her amplifikasyon siklusunda elde edilen floresan miktarn gsterir. Eik deeri (Ct) X dzleminde, yatay olarak gsterilmitir. Siyah amplifikasyon erileri orta ve dk dzeydeki gen ifadelerini gstermektedir. (Hastalara ait deerlerdir). Negatif kontrolde amplifikasyon erisi grlmemelidir. Mavi noktalar negatif kontrol gstermektedir. ekil 9da oklarla gsterilmeyen eriler ise pozitif kontroller aittir. Pozitif kontrollerin molekl (kopye) says ve artn olduu Ct deerine gre standart eri izilerek kantitatif hesaplama yaplmaktadr. Standart eri ekil 10 da gsterilmitir.

37

ekil 10. Standart eri

Kantitasyon hesaplamalarnda en az standart kullanlarak korelasyon erisi izilmelidir. Standart erinin slope deeri -2 ile -4,7 aralnda korelasyon katsaysnn (r) deerinin de 0,95 ile 0,999 aralnda olmas gereklidir.

38 3.3. MDR1 POLMORFZM MDR1 Polimorfizmi almada PGX-HIV marka stript testi kullanlmtr. DNA izolasyonu iin nvitekin izolasyon kiti, Hibridizasyon Cihaz olarak Oto-Lipa cihaz kullanlmtr. 3.3.A. Kandan DNA zolasyonu 1. 200 l kan rnei, 200 l lizis buffer A ve 20 l Proteinaz K tpe konulur. 10 dakika 56Cde inkbasyona braklr. 2. 400 l Binding Buffer tpe eklenir, Svnn tamam filtreli tpe aktarlr , 3 dk oda ssnda inkbe edilir ve 12 000 rpm de 2 dk santrifj edilir. 3. Toplama tp deitirilir, filtre zerine 500 l Ykama solusyonu 1 eklenir ve 12 000 rpm de 1 dk santrifj edilir. 4. Toplama tp deitirilir, filtre zerine 800 l Ykama solusyonu 2 eklenir ve 12 000 rpm de 1 dk santrafj edilir. Filtre bo toplama tpne aktarlr en yksek hzda 4 dk santrifj edilerek alkolden arndrlr. 5. Filtre ependorf tpe aktarlr ve alkoln tamamen uzaklamas iin 3 dk kapak ak biimde oda scaklnda inkbe edilir. Filtre membrann tam ortasna stlm 56 oC deki 200 l Elsyon Buffer-D eklenir, 5 dk oda scaklnda inkbe edilir. 10 000 rpmde 1dk santrafj edilir ve filtre atlarak, rnek alnr ve analiz edilene kadar -20 C de saklanr. zolasyon ileminden sonra uygun polimeraz zincir reaksiyonu uyguland. Enzim Hazrlama: Taq DNA polimeraz (5U/l) : 0,4 l Taq DNA Buffer : 4,6 l +-----------5,0 l PZT koullar belirlendikten sonra

39 Reaktif Hazrlama Amplifikasyon Miks Hazrlanan Enzim (1U) rnek Toplam PZT reaksiyon Hacmi 15 l 5 l 5 l 25 l

PZT Protokol 94 C ----------------- 02:00 dakika 94 C ----------------- 00:15 saniye 58 C ----------------- 00:30 saniye 72 C ----------------- 00:30 saniye 72 C ----------------- 03:00 dakika 4 C ----------------- Sonsuz 35 Dng

PZT ilemi ABI 9700 cihaznda yaplm olup MDR1 rn 81 baz iftidir. PZT ile oaltlan uygun hedef blgesi rnleri hibridizasyon iin Oto-Lipa cihazna yklendi.

40 3.3.B. Hibridizasyon 1. 10 l denatrasyon solsyonu rneklerin allaca kuyucuklarnn kelerine pipetlenir. 10 l PZR ile oaltlm rnekler denatrasyon solsyonuna pipetlenerek kartrlr ve oda scaklnda 5 dakika inkbe edilir. 2. rneklerin zerine nceden stlm 1 ml hibridizasyon solsyonu konulur ve homojen renk elde edilene kadar yavaa alkalanr. 3. Stripler dikkatlice plate kuyularna yerletirilir. 4. Stripler 45 Cde 30 dakika alkalanarak inkbe edilir. 5. Hibridizasyon solsyonu pipet kullanlarak tamamen kuyucuklardan boaltlr. 6. Her bir kuyucua 1 ml Ykama solusyonu I eklenir edilir. 7. Kuyucuklardan Ykama solusyonu I boaltlr ve yeniden 1 ml WASH A solsyonu ile 15 dakika 45 Cde alkalanarak inkbe edilir. Sonra Ykama solusyonu I tamamen boaltlr. 8. Her bir kuyucua 1 ml konjugat scaklnda alkalanarak inkbe edilir. 9. Her bir kuyucua 1 ml Ykama solusyonu II solusyonu alkalanarak inkbe edilir. 10. Kuyucuklardan Ykama solusyonu II boaltlr ve yeniden 1 ml Ykama solusyonu II solsyonu ile 5 dakika oda scaklnda alkalanarak inkbe edilir 11. Her bir strip zerine 1 ml inkbe edilir. 12. Bant oluma ilemi striplerin iki kez distile su ile ykanmas ile sonlandrlr. 13. Son olarak, stripler kuyucuklardan alnarak kurutma kadnn arasna konularak kurutulur ve deerlendirme aamasna geilir. Konjugat solsyonu eklenir ve karanlkta test koullarna bal olarak bantlarn olumasna gre en az 15 dakika alkalanarak eklenir 1 dakika alkalanarak boaltlr ve 1 ml Ykama solusyonu II 5 dakika oda scaklnda solusyonu eklenir ve 15 dakika oda 1 dakika alkalanarak boaltlr ve 1 ml WASH A solsyonu ile 15 dakika 45 Cde alkalanarak inkbe

41 Kandan genomik DNA elde edilir ve biyotin iaretli primerlerin kullanld multipleks PZT ile mutasyonlu ve normal gen blgeleri oaltlr. PZT rnleri nitrosellaz membran zerindeki allel-spesifik fragmentlere hibridize edildikten sonra grnr hale getirilerek deerlendirme yapld (ekil 3.3.). Yaplan bu deerlendirme, yalnz normal MDR1 de bant varsa CC genotipi, hem normal MDR1 de hem de mutant MDR1 de bant varsa CT genotipi, sadece mutant MDR1 de bant varsa TT genotipi ifade etmektedir. (almada sadece MDR1 polimorfizmi deerlendirilmitir.) Krmz Marker Kontrol

1 2 3 4 5

MDR1 CYP2D6 CYP2D6 CYP2D6 CCR5

3435 C>T 1795 del T 1934 G>A 2637 del A 32bp del

6 7 8 9 10

Normal MDR1 Normal CYP2D6 Normal CYP2D6 Normal CYP2D6 Normal CCR5

3435 C>T 1795 del T 1934 G>A 2637 del A 32bp del

Yeil Marker

ekil 3.3.1. PGX-HIV Strip

42 4.BULGULAR Bu tez almasnda toplam 32 KML hastasnn 17 sinde 48 ay boyunca dzenli olarak BCR-ABL ve MDR1 gen ifadeleri lmleri yapld. 17 hastann 8i erkek 9 u kadn ve tandaki ortalama ya 47 dir. Tan anndaki sokal skor deerlendirilmesine gre 12 hasta dk riskli, 3 hasta orta derecede riskli, 2 hasta yksek riskli grupta bulunmutur. Tan annda yalnzca bir hasta akselere fazda, dier 16 hasta kronik fazdadr. Hastalarn klinik zellikleri Tablo1de zetlenmitir.
Tablo 1. Hastalarn klinik zellikleri

zellikler Ya Aralk Ortalama Cinsiyet Kadn Erkek Beyaz kre Says( X 109/L ) Aralk Ortalama Trombosit Says( X 109/L) Aralk Ortalama Blast Says % Eozinofil Bazofil Splenomegali (hasta says) Sokal Skor Dk Orta Yksek nceki Tedaviler Hidroksire IFN

Hastalar n = 17 25 - 69 44 9 8 25 - 444 124 187 - 1442 484 2 1 3 10 12 3 2 16 3

43 Periyodik olarak P210

BCR-ABL

mRNA fzyon transkriptleri llen 17

BCR-ABL

hastann log10 tabannda gen ifadeleri Tablo 2 de gsterilmektedir.Tablo 2nin deerlendirilmesinde 10 hastada tan annda P210 ifadesi bir hastada log 4, 2 hastada ifadeleri saptand. Gen log 3- 3,5 aralnda, 6 hastada log 2,91,9

aralnda, bir hastada log 0,3 olarak saptanmtr. Bu tabloya gre hastalarn dier aylardaki P210 BCR-ABL ifadeleri Friedman testine gre mukayese edildiinde, BCR-ABL ekspresyonunun 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24. ay BCR-ABL lmlerinin ikili karlatrmalar yapldnda sadece 0.ay lmleri dier aylara gre yksek kmtr (p<0.001). Dier aylardaki lmler arasnda bir farkllk bulunamamtr. (p>0,05). Yaplan Kaplan-Meiyer testine gre hastalarn 5 yllk sakalmlar %59 bulunmu, BCR-ABL seviyelerinindeki deiiklikler Spearmans rho testine gre yatan, cinsiyetten, WBC, LDH, Pltten bamsz bulunmu, istatiksel bir anlam bulunmamtr.
Tablo 2. P210 BCR-ABL eksresyon dzeyinin logaritma 10 tabannda gsterimi (log P210 BCR-ABL ekspresyonu (log 10) 0.AY
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 10).

3.AY 6.AY 2 1 0 1,6 0 0 0 0 0 0 0,3 0 1,3 0 0 1,8 2,6

9.AY 0 0 0 0 0 1,5 0 0 0,7 0,5

12.AY 18.AY 24.AY 30.AY 36.AY 48.AY 0 0 0 0 0 -0,1 0 0 1,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,7 0,5 0 1,1 0 0 1,3 1,1 0 0 0 1,7 1 0,6 0 0 0 0 0 0 0 2,5 0 0,7 1,2 0 0 0 0 0

3,1 3,3 4 1,9 2,5 0,3

2,5 2,5 2,4 2,9

0,9 1,9

2,5 2

1,6

0 0

0,9 0 3,2 1,4

1,6

2,1

2,5

0: Hastada P210 BCR-ABL fzyon transkripti saptanamadn ifade etmektedir.

44 17 hasta ve kontrol bireyleri de P190 tm sonular negatif bulunmutur. la direnliliinin deerlendirmesinde almamzda MDR1 gen ekspresyonu analiz edildi. Sonular, P210
BCR-ABL BCR-ABL

asndan deerlendirilmi ve

ve MDR1 ekspresyonlar eklinde Tablo 3de

gsterilmitir. MDR1 in Friedman testine gre 0, 3, 6, 9, 12,18,24. ay lmleri birbirinden farkl bulunmamtr. Hastalarn tedavi sresince MDR1 lmleri birbiriyle kyaslandnda anlaml sonu bulunamad(p> 0.051). MDR1 in zaman iinde deiimi anlaml deildir. P210 BCR-ABL ve MDR1 in zaman iinde birlikte deiimlerine Spearmans rho korelasyon katsay ile bakldnda istatiksel olarak anlaml sonu bulunamamtr.

45

Tablo 3. P210

BCR-ABL

ve MDR1in gen ekspresyonlarnn logaritmik deerleri (log 10)

0.AY P210 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2,4 2,9 2,4 -0,6 2,5 2 2,5 1,9 2,5 1,3 4 1,9 2,5 0,3 2,9 -1,1 -0,6 0 0 0 0 0,3 0,9 1,9 3,1 3,3 MDR1 -1,1 0

3.AY P210 2 1 0 MDR1 1,2 1,4 1,9

6.AY P210 1,6 0 0 0

9.AY MDR1 2,2 1,3 0,18 1,3 1,4 2,7 -0,3 0,04 2,6 0

12.AY P210 0 0 0 0 0 -0,1 0 0 1,1 0

18.AY MDR1

24.AY P210 MDR1

30.AY P210

36.AY MDR1

48.AY P210 MDR1

MDR1 P210 0,8 0 1,3 0 0,2 3 1,5 1,4 2,5 -0,6 0 0 0 0 0 1,5 0 0 0,7 0,5

MDR1 P210 0,04 0,51 1,3 3,3 0,8 1,3 -0,3 3,1 1,3 0,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0,7 0,5

MDR1 P210

-0,1 1,5 0,9 0,6 0,8 -0,2 1,2 0 2,5 -1,3

0 0

1,63 0 0 1 0 -0,1 0 -0,1

1,9 0 1,7 0

0 1,3 0 0 1,8

0 1,1 0 0 1,3 1,1 0 0

1 1,2 0,5 0,6 0,9 2,3 1,8

0 0,7

0,9 0,04 1,2 3,1

1,7

2,6

1,7 1 0,6 2,9 2,2 -0,2

0 0 0 0

1,2 0

2,5

-0,5 3,4 0,2

0 0,85 0

2,6 -0,2

1,6

1,1

0 0

1,3 0

0,9

0,9

1,6

1,4

1,7

2,3

0 3,2 1,4

2,62 0 1,5 2 1 2,1 0 2,5

P210; P210 BCR-ABL deerini gstermektedir.

46 P210
BCR-ABL

/ -2M sonularnn deerlendirilmesi Ct testi ile yaplmtr.

BCR-ABL

Hastalarn tan anndan itibaren aldklar tedaviye cevap olarak gsterdikleri eri ekil 1 de gsterilmitir. P210 gen ifadesindeki en fazla azalma 3-6. ay aralnda saptanmtr. Tedaviye maksimum cevap bu aylar arasnda alnmtr.

%Bcr-Abl /Beta 2-Mikroglobulin

0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0.AY 3.AY 6.AY 9.AY 12.AY 18.AY Tedavi Sreci
P210 BCR-ABL , BCR-ABL eklinde ksaltlmtr. ekil 1. % P210
BCR-ABL

/ -2M deerleri

Yaptmz almada hastalarmzn %91 inde tedaviden 3 ay sonra BCRABL ekspresyon seviyesinde azalma, %9 unda ise artma gzlenmitir. Tedavinin 6.aynda ise hastalarn % 73 nde BCR-ABL ekspresyonunda azalma, %27 inde ise artma gzlenmitir. Tedavinin 9. aynda ise hastalarn % 87,5 inde BCR-ABL ekspresyonunda azalma, %12,5 unda ise artma gzlenmi. Tedavinin 12. aynda ise hastalarn %78 inde BCR-ABL ekspresyonunda gzlenmitir. Tedavinin 18. aynda ise azalma, %22 sinde ise artma %60unde BCR-ABL hastalarn

ekspresyonunda azalma, %40unda ise artma gzlenmitir. BCR-ABL ifadesindeki artn ilaca kar diren oluturduu dnlmektedir.la direnci oluan hastalarda BCR-ABL ekspresyonunun art ile birlikte MDR1 geninin ekspresyonunda da art gzlenmitir.

47 la direnci gelitirdii dnlen ve Tablo 3 n verilerine gre yaplan ekil 2 deki hastann gen ifadelerinin deerlendirilmesi gsterilmitir. ekil 2e gre hastann ald tedaviye cevap 3. ayda olumu ve BCR-ABL fzyon transkripti saptanmamtr. BCR-ABL ekspresyonu bulunmutur. la direnci gelitirdii dnlmesinin en nemli nedeni BCR-ABL saptanamayp, negatif sonu bulunduktan sonra sonraki aylarda tekrar BCR-ABL ekspresyonunda artn olmas, hastalarn remisyona girememesidir. ile MDR1 ekspresyonunda korele art

Log10 Gen fade Deerleri

3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

36 .A Y Y Y Y 0. AY 6. AY 3. AY 9. AY .A .A .A 12 18 24 30 .A Y

P210 BCR-ABL MDR1

Tedavi Sreci

ekil 2. 6 numaral hastann gen ekspresyon deerlerinin grafii

ekil 2in bulgular 6 numaral hastada 0.ay BCR-ABL fzyon transkripti 291 kopye olarak bulunmu ve imanitibe 400mg/gn olarak balamtr. 3.ay BCRABL fzyon transkripti saptanmamtr. 6. ay BCR-ABL fzyon transkripti 18 kopye 9. ay BCR-ABL fzyon transkripti 30 kopye tespit edilmi ve imanitib gnlk 400mg dan 600 mg a karlm, 12. ay BCR-ABL fzyon transkripti 1 kopye gelmi, 18. ay BCR-ABL fzyon transkripti saptanamam sonu negatif, 24.ay BCR-ABL fzyon transkripti 12 kopye bulunmutur. 30. ayda BCR-ABL fzyon transkripti 5 kopye 36.ayda BCR-ABL fzyon transkripti 13 kopye bulunmutur. Hasta imanitibi gnlk 600 mg kullanmaya devam etmektedir.

48 ekil 3de ila diren gelitiren 2. hastaya ait ekspresyon deerleri vardr. Bulgular aada zetlenmitir.

Log10 Gen fade Deerleri

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

3. AY Y 18 .A Y 24 .A Y 30 .A Y 36 .A Y 48 .A Y 0. AY 6. AY 9. AY 12 .A

P210 BCR-ABL MDR1

Tedavi Sreci

ekil 3. 10 numaral hastann gen ekspresyon deerlerinin grafii

ekil 3un bulgular; 10 numaral hasta d merkezde tan alm,

imanitib

400 mg/gn balanmtr. 3 ay sonra pansitopeni nedeniyle imanitib kesilmi ama BCR-ABL fzyon transkripti 72 kopye olarak saptandndan imanitibe tekrar balanmtr(400 mg). 6.ay BCR-ABL fzyon transkripti 410 kopye, 9. ay BCR-ABL fzyon transkripti 3 kopye, 12. ay BCR-ABL fzyon transkripti negatif bulunmutur. 18. ay BCR-ABL fzyon transkripti 8 kopye bulunmu imanitib 600 mg/gn a artrlmtr ancak 12 kopye knca tekrar ilaca 400mg/gn hematolojik toksisite nedeniyle ila kesilmitir. Hasta 1 ay ila kullanmamtr. 24.ayda BCR-ABL fzyon transkripti olarak baland. 30.ay BCR-ABL fzyon transkripti 55 kopye tespit edilmi ve ila 600mga karlmtr. 36.ayda BCR-ABL fzyon transkripti saptanmamtr. 48. ay BCR-ABL fzyon transkripti 202 kopye bulunmutur. manitib 600mg/gn alyor kopye says artmaya devam ederse baka ila denemesi planlanmtr. la direnci oluturduu dnlen hastann gen ifade deerleri ekil 3 de gsterilmitir.

49 BCR-ABL ile MDR1 gen ifadelerinde art ve azalmalarnda uyumluluk vardr. Ayn deerlendirme ekil 4 deki hasta iinde yaplmtr.
3 Log10 Gen fade Deerleri 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0.AY 3.AY 6.AY 9.AY 12.AY 18.AY 24..AY Tedavi Sreci P210 BCR-ABL MDR1

ekil 4. 9 numaral hastann gen ekspresyon deerlerinin grafii

ekil 4n bulgular; 9 numaral hasta KML tansyla HTF ye gelmi 303 kopye BCR-ABL fzyon transkripti tespit edilmi, imanitib 400 mg/gn balanmtr. manitibden 3 ay sonra BCR-ABL fzyon transkripti 8 kopye bulunmu fakat ntropeni nedeniyle imanitib kesilmi, bir ay sonra tekrar 300 mg/gn balanm, 6.ay BCR-ABL fzyon transkripti 63 kopye , 9. ay BCR-ABL fzyon transkripti 5 kopye, 12. ay BCR-ABL fzyon transkripti 14 kopye imanitib 400mga karld. 3 ay sonra lkopeni nedeniyle doz 300 mga indirildi. 18.ay BCR-ABL fzyon transkripti saptanamamtr. 24. ay BCR-ABL fzyon transkripti 18 kopye tespit edilince imanitib 600 mga karld. 2 X 400mg/ gn kullanyor. Bulant nedeniyle hasta 600mg tek dozda alamyor.

50 32 KML hastasnn MDR-1 C3435 T polimorfizmi asndan deerlendirilmesi Tablo 5 de gsterilmitir. 9 KML hastasnda bu polimorfizmi homozigot olarak tad, 15 inin heterozigot olarak tad ve 8 hastann ise tamad saptanmtr. 37 Salkl bireyin 9 unun CC, 22 sinin (CT) heterozigot, 5 inin (TT) homozigot olduu bulunmutur (Tablo 4). Hasta ile kontrol grubu karlatrldnda hasta bireylerde 2 kat daha fazla TT genotipi gzlenmitir. MDR1 polimorfizminin allel dalmna baktmzda sonularn birbirinden farkl olmadn grld (Tablo 5). Allel dalmlar ise Tablo 5de gsterilmitir. Hasta ve kontrol grubunun MDR1 C3435T polimorfizminin genotip dalm Tablo 6 da gsterilmitir.

Tablo 4 MDR-1 C3435T polimorfizminin genotip dalm

CC (n) %n n Hasta Kontrol 32 36 (8) 25,0 (9) 25,00

CT (n)

%n

TT (n) %n

(15) 46,88 (22) 61,11

(9) 28,12 (5) 13,89

Tablo 5 MDR-1 C3435T polimorfizminin allel dalm

n Hasta Kontrol p 64 72

%T % 51,57 % 44,45 0,4

%C %48,43 %55,55 0,6

51

Tablo 6. Hasta ve Kontrol grubuna ait MDR1 C3435T polimorfizminin genotip dalm HASTA D.U A.D N.I M.S C.Y F. M.I A.C .S A. S.T H.B T.G Y.G S.E K.S H.A S.K F. K.D S.N . F.M.L .Y S.B S.A A.K .A A.D S.B .K R.B KONTROL S.S T.P O. E.K A.D N.G S.B G.B B.B .U P.H G.E T.I M. H.A L.T M.D M.K L.A A.T Y. Y.B N. B.A P.Y H.U N. H.K S.E S. D.Y F. M.A H.K . E.O

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

TT CT CT TT CC CT CT TT CT TT TT TT CT CT CC CT CT CT CC CC TT TT CT CC CC CC CT CC CT TT CT CT

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

CT CC TT CT CT CC CT CT CT CT CT CT CT TT TT CT TT CT CT CT CT CC CC TT CT CT CC CC CT CT CC CC CT CT CC CT

52 5. TARTIMA Rezidel hastal tespit etmek iin kullanlan metotlarn amac; kemik ilii transplantasyonu sonras hastann izlenmesi, relapsn erken safhada yakalanmas, kemoterapi alan hastalarn remisyonunun gerek olup olmadnn tesbiti, tedavi protokolunun yararllnn deerlendirilmesidir. MDR nin tesbiti, hastaln prognozunun izlenmesi ve relapsa girdiinde tedbirlerin alnmas iin olduka nemlidir. Kantitatif RT-PZT yntemi BCR-ABL ve MDR1 mRNA sn lmek iin kullanlan hassas tekniklerden tekniklerden biridir. KML hastalarnn tedavisinde BCR-ABL fzyon geninin selektif inhibitr olan imanitib mesilat kullanlr. zellikle kronik faz bata olmak zere, KML nin tm safhalarnda bulunan hastalarda etkili bir ajandr. Yaptmz almada hastalarn %100u hematolojik cevab baarm, tedavinin 3.aynda hastalarn %54 CCR (%100 Ph (-) metafaz hcresi) , % 31i ise molekler cevab (Molekler cevap: Kantitatif RT-PZT yntemi ile BCR-ABL ekspresyonunun saptanamamasdr.) baarmtr. Tedavinin 6.aynda %55 i molekler cevab salam, %8 i molekler cevab kaybetmitir. Tedavinin 9.aynda ise, hastalarn % 81i CCR, %75i molekler cevab baarmtr. 12. ayda % 90 oranndaki hastada CCR , % 69u ise molekler cevab salamtr. 3.ayda BCR-ABL ekspresyonun ortalama deeri %0,14, 6.ayda %0,006, 9.ayda % 0,013, 12.ayda % 0,028, 18. ayda %0,0128 olarak bulunmutur. Gamberrti ve ark. 2005 ylnda yapt almada tedavi sresince elde edilen BCRABL ortalama deerleri ile uyumluluk gstermi ve BCR-ABL ifadesindeki azalma en fazla 3-6. ay arasnda dmtr. manitib hedefe ynelik spesifik tedavi edici ajan olduu iin hastalarda yksek oranda tedavi baars salanmtr. Fakat imanitib tedavisine kar hastalarda gsterilmitir. Hochhaus A. ve ark. 2000 ylnda yapm olduu almada manitibe direnli olan 72 KML hastasnn 7sinde 10 kat fazla artm BCR-ABL seviyesi tespit zamanla diren geliebilecei birok almada CCR, % 40

53 edilmitir. 19 hastada ek kromozom anomalileri ve 29 hastada ise ABL tirozin kinaz balanma blgesinde eitli nokta mutasyonlar tespit edilmitir. alma sonucunda direnliliin BCR-ABL e bal olarak gelimi olabilecei belirtilmektedir (43). Yaptmz almada diren gelien 3 hasta remisyonda uzun sre kalamam ve BCR-ABL ifadesinde tekrar art gzlenmitir. 2005 ylnda yaplan almada hastalarda imanitibe diren, tedaviye daha uzun sreli ila

baladktan 9-12 ay sonra olumu ancak 12 aylk veya hastalarda da ilaca diren gelitii gsterilmitir.

tedavisiyle major sitogenetik veya komple sitogenetik cevab salam baz Yaptmz almada ise hastalarda tedaviye baladktan 18-24 ay sonra diren olumutur. Galimberti ve ark. 2005 ylnda (42) yapm olduu almada 33 KML hastasnn 4 haftalk imanitib tedavisi ile tm hematolojik cevab salamtr. Hastalarn yaklak %96 s tedaviye baladktan sonraki 3 ayda BCR-ABL ekspresyonundaki azalma 1,5 log dan fazla , BCR-ABL ekspresyonundaki ortalama deer % 0,02 bulunmu ve manitib tedavisinden 6 ay sonra hastalarn %72 sinde BCR-ABL ekspresyonundaki azalma 2 log dan fazla olmutur. 6. aydaki BCR-ABL ekspresyonundaki ortalama deer %0,002 olarak bulunmutur. Hastalarn % 14 unde ise BCR-ABL transkriptlerinde ortalama 0,5 log luk art olmu, 12 aydan sonra ise hastalarn % 23 unde PCR negatif, ancak%36 nda BCRABL ekspresyonunda 2 logdan fazla art gzlemlenmitir. BCR-ABL ekspresyonundaki ortalama deer % 0,003 dr. Tedavi sresince en yksek d 3-6. aylar aras olmutur. 18 aydan sonra ise hastalarn %38 inde PCR negatif bulunmutur. Kantitatif data gstermitir ki BCR-ABL ifadesindeki en byk azalma tedaviden sonraki 3-6 ay aras olmutur. Bu azalma sitogenetik cevapla korele olmutur. CCR daki hastalarda ekspresyondaki azalma 3 log ya da daha fazla olmutur. Major ya da CCR baaramamam hastalar da MDR1 seviyesindeki art 10 kattan fazla olmutur.. BCR-ABL ve MDR1 ekspresyonunudaki art birlikte gzlemlenmitir. Tan annda tm rneklerin MDR1 pozitif sebebi hematopoetik kk hcrelerde bu genin fizyolojik ekspresyonu olduunun dnlmesidir.

54 manitib tedavisinden 3 ay sonra hastalarn %36 snda MDR1 ekspresyonunun azald gzlenmitir. Hastalarn %89 unda BCR-ABL ifadesinde azalma gzlenmitir.Yaplan bu almalarda ilaca diren; BCR-ABLin amplifikasyonu ve ifadesindeki artma, BCR-ABL in kinaz blgesinin mutasyonlar, en ok grlen mutasyon imanitib ile hidrojen ba oluturan T315I blge mutasyonlar, MDR1 geninin ar ifadesi ile ila konsantrasyonunun dnlmektedir. Yaptmz almada hastalarn hepsinde tan annda dk seviyede de olsa MDR1 gen ifadesi var ( nk hematopoetik kk hcrelerde fizyolojik ekspresyon grlyor). laca kar diren gelitii dnlen hastalarmzda BCR-ABL gen ifadesinin saptanamad dnemden sonraki dnemlerde BCR-ABL ve MDR1 genlerinin ifadelerindeki art uyumluluk gstermitir. Hematolojik malignansiler almada C3435CT ile MDR1 polimorfizmi arasnda ilikiyi azalmas sonucu olutuu

aklayabilecek yaynlar bulunmaktadr. Jamroziak K ve ark.yapm olduu polimorfizmi ile ocukluk a ALL arasnda pozitif korelasyon bulunmu ve TT genotipi tayanlar, dier genotipleri tayanlara oranla ALL gelitirme de daha yksek riskli bulunmular ve CC genotipini tayanlarn anlaml derecede kt prognoza sahip olduunu bildirmilerdir (p=0.008) (44) . 405 AML li erikin hastada yapt almada CC genotipi ile kt prognoz arasnda uyumluluk gsterilmitir. CT genotipine sahip bireylerin ortalamann zerine sakalm salad gsterilmitir. varyasyonlarnn gsterilmitir ( 45). Hattori H ve ark. larnn 2007 ylnda yapt almada ocukluk a protein ekspresyonuna ve Bylece MDR1 geninin allelik fonksiyonuna etki edebilecei

ALLde MDR1 ekspresyonu ile MDR1 C3435T polimorfizmine bakmlar ve gen ekspresyonu ile polimorfizm arasnda istatistiksel olarak anlaml bir sonu bulunamamtr (46). 60 ya ve zeri 150 AML hastasnda yapt almada genotipler arasnda MDR1 mRNA ifadesi dzeyinde bir farkllk bulunamam tm hastalarda yksek seviyede

55 MDR1 mRNA ifadesi bulunmutur.AML ile yksek MDR1 mRNA ifadesi arasnda pozitif korelasyon tespit edilmitir ( 50) . 198 KML li hasta ile yapt almada MDR1 ekspresyonu ile ya, lkosit says, trombosit says arasnda balant bulmular, 50 yann zerindekilerde, trombosit says 700.000 zerinde ve lkosit says 50.000 in zerinde olan hastalarda MDR1 ekspresyonunu daha yksek bulunmulardr (47). Yaplan almalarda blastik fazdaki KML hastalarnda P-gp eksprsyonunun yksek , kronik fazdaki hastalarda ya ok az ya da hi P-gp ekspresyonunu tespit edememilerdir. Hibir almada KML hastalarnda MDR ekspresyonu ile prognostik deer arasnda bir korelasyon rapor edilememitir (48). almamzda hastalarda % 28,12 TT, kontrol grubunda ise %13,89 orannda TT bulunmu, TT genotipinin grlme skl kontrol grubuna gre fazla olmasna ramen MDR1 ekspresyonu ile TT genotipinin Mann- Whitney testine gre ikili karlatrmas yapldnda anlaml bir sonu bulunamamtr.

MDR1 C3435T polimorfizmi kolon kanseri,

renal karsinom, lseratif kolit ile

ilikili bulunmutur. Siegmund ve ark. larnn (2002) yapt almada 212 hasta birey ve 567 salkl bireyle almlar ve T alleli ve TT genotipi ile renal epitel tmr riski arasnda pozitif korelasyon bulmulardr (49). MDR1 3435 TT yada CT genotipini tayanlarla CC genotipiyle mukayese edildiinde ocukluk a ALLde nks riski anlaml derecede dk bulunmutur. 113 ocukluk a ALLde 175 salkl bireyde allm ve %30unda TT, salkl bireylerde ise %19 TT Sonuta 1.8 kat daha fazla ALL gelitirme riski bulunmutur (44). Yaptmz almada da hastalarn % 28,12 TT, kontrol grubunda ise %13,89 orannda TT bulunmutur. TT genotipini tayanlar hasta grubunda iki kat daha fazladr. TT genotipinin KML gelitirmede etkili olabilecei dnlebilir fakat bunu destekleyici bilgiye referanslarda rastlanmamtr. Kontrol grubu ile kyaslandnda hastalarn

genotipi tad gsterilmitir.

56 KML hastalarnda T allel frekans yksek bulunmu olmasna ramen fark anlaml deildir (p= 0,414) (Tablo 5 ) 17 KML hastasnn BCR-ABL gen ifadesindeki en yksek azalmalar 3-6. aylar arasnda olmutur. 3 hastada BCR-ABL ekspresyonu ile MDR1 ekspresyonundaki art korele olmutur. Kontrol grubu ile hasta grubu MDR1 C3435T polimorfizmi asndan deerlendirildiinde hasta grubunda TT polimorfizmi 2 kat daha fazla bulunmutur.

57 6. SONU VE NERLER KML hastalarnda MRD n izlenmesinde en hassas ve gvenilir metot RT-PZT mettotur. Hastalarn imanitib tedavisine cevap olarak gsterdikleri BCR- ABL ekspresyonun ortalama deerleri 3.ayda BCR-ABL ekspresyonun ortalama deeri %0,14, 6.ayda %0,006, 9.ayda % 0,013, 12.ayda % 0,028, 18. ayda %0,0128 olarak bulunmutur. Hastalar en gl cevab 3-6. aylar arasnda vermitir. Kantitatif RT-PZT metodu ile 17 hastann MDR1 ve BCR-ABL lmlerini birlikte yaplmtr ve ilaca diren oluan hastalarda MDR1 ve BCR-ABL gen ifadelerinin birbirleriyle korele olarak art saptanmtr. balantl olabilecei dnlmektedir. la direnci gelitii dnlen hastada BCR-ABL ekspresyonu saptanamam iken MDR1 ekspresyonunda art grlm ve hastann BCR-ABL negatif lmnden bir sonraki dnemdeki lmde BCR-ABL ekspresyonunda artma tespit edilmitir. la direnci gelitii dnlen fazla sayda rnekle allabilirse belki de MDR1in ila direncinde n bildirge olabilecei kansna varlabilir. MDR1C3435T polimorfizmi ile MDR1 gen ekspresyon dzeyi arasnda korelasyon saptanamad. Hasta bireylerin kontrol grubu ile mukayesinde iki kat daha fazla TT genotipini tad bulundu. KML gelitirmede TT genotipi yksek riskli grup olabilir fikrini dourdu fakat literatrde KML ile TT genotipi arasnda balant salayc bilgi olmadndan ok merkezli, fazla sayda KML hastas ile deerlendirme yaplmas nerildi. MDR1in imanitib direnci ile Kantitatif

58

KAYNAKLAR
1. 2. Ltzow, M.R., 2006., Imatinib Resistance Obstacles and Opportunities. Arch Pathol Lab Med. 130, 669-679. Faderl S., Talpaz M., Estrov Z., OBren S., Kurzrock R., Kantarjian H.M., 1999., Chronic Myeloid Leukemia: Biology and Therapy . Ann.Intern Med., 131, 207-219 Deninger M.W.N., Druker J.B., 2003., Specific targeted therapy of chronic myelogenous leukemia with imanitib., Pharmacol Rev., 55, 401-423 Millot F., Traore P., Guilhot J., Guilhot J., Nelken B., Leblanc T., Leverger G., Plantaz D., Bertrand Y., Bordigoni P., Guilhot F., 2005., Clinical and biological features at diagnosis in 40 children with chronic myeloid leukemia. Pediatrics., 116 :140-143 Goldman J., 2004., Monitoring minimal residual disease in BCR-ABL positive chronic myeloid leukemia in the imanitib era. Curr Opin Hematol., 12, 33-39 O'Dwyer M.E., Mauro M.J., Druker B.J., 2002., Recent Advancements in the Treatment of Chronic Myelogenous Leukemia. Annu.Rev.Med., 53, 369-381 Ohno R., 2006., Treatment of chronic myeloid leukemia with imanitib mesylate., Int J Clin Oncology., 11, 176-183 Ren R., 205., Mechanism of Bcr-Abl in the pathogenesis of chronic myelogenous leukemia Nature reviews/ cancer 5, 172-183 Griffin J.D., Todd R.F., Ritz J., Nadeler L.M., Canellos G.P., Rosenthal D., 1983., Differnatitation patterns in the blastic phase of chronic myeloid leukemia., Blood ., 61, 85-91 Goldman J.M., Melo J.V., 2003., Chronic myeloid leukemia-Advances in biology and new approaches to treatment., 349, 1451-1464 Pane F., Intrieri M., Quintarelli C. et al. 2002., BCR/ABL genes and leukemic phenotype: from molecular mechanism to clinical correlation. Oncogene 21,8652-8667 Deininger M.W.N., Goldman J.M., Melo J.V., 2000. The molecular biology of chronic myeloid leukemia., Blood, 3343-3356 Saglio G., Cilloni D., 2004., Abl: The prototype of oncogenic fusion proteins Cell Mol.Life Sci 61, 2897-2911

3. 4.

5.

6. 7. 8. 9.

10.

11.

12. 13.

59 14. Amabile M., Giannini B., Testoni N., Montefusco Vttoro., ve dierleri., 2001, Real-time quantification of different types of bcr-abl transcript in chronic myeloid leukemia., Haematologica , 86, 252-259 Walz C., Sattler M., 2005., Novel targeted therapies to overcome imatinib mesylate resistance in chronic myeloid leukemia (CML)., Clinical Rev. n Onc / Hemat 25-31 Sawyers, C.L., 1999., Chronic myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 340,1330-1340 Appleby N., Burke E., Curran T.A., Neary E., 2005, Chronic Myeloid Leukemia Molecular abnormalities and treatment options., TSMJ, 6, 45-51 Teferi A., Dewald G.W., Litzow M.L., Cortes J., Mauro M.J., Talpaz M., Kantarjan H.M., 2005., Chronic myeloid leukemia: Current application of cytogenetics and molecular testing for diagnosis and trestment., Genetics in clinical practice., 80(3), 390-402 Chasseriau J., Rivet J., Bilan F., Chomel J.C., Guilhot F., Kitzis A., 2004., Characterization of the different BCR-ABL transcripts with a single multiplex RT-PCR., Journal molecular diagnostics., 6(4), 343-347 Doan A.L., G D., 2004., Sinyal iletimi Hacettepe Tp Dergisi., 35, 34-42 mekanizmalar ve kanser.,

15.

16. 17.

18.

19.

20. 21.

Chang F, Lee JT, Navolanic PM, et al., 2003., Involvement of PI3K/Akt pathway in cell cycle progression, apoptosis, and neoplastic transformation: A target for cancer chemotherapy., Leukemia 17, 590-603 Melo J.V., Deininger M.W.N., 2004., Biology of chronic myelogenous leukemia -signaling pathways of initiation and transformation., Haematology/Oncology Clinics of North America., 18, 545-568 Salesse S., Verfaillie C.M., 2002., BCR/ABL : from molecular mechanism of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia., Oncogene., 21, 8547-8559 Branford, S., Rudk, Z., Walsh, S., Parknson, I., Grgg, A., Szer, J., Taylor, K., Herrmann R., Seymour, J.F., Arthur, C., Joske, D., Lynch, K., Hughes, T., 2003. Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (P-loop) are associated with apoor prognosis. Blood. 102(1), 276-283

22.

23.

24.

60 25. Corbn A.S., La Rosee P., Stoffregen, E.P., Druker, B.J., Deininger, M.W., 2003., Several Bcr-Abl kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib. Blood 101, 46114614 Savage D.G., Antman K.H., 2002., Imanitib mesylate- anew oral targeted therapy., Drug therapy 346, 683-693 Bagg A., 2002., Chronic myeloid leukemia A minimalistic view of posttherapeutic monitoring., Journal of molecular diagnostic., 4, 1-11 Martinelli G., Iacobucc I., Soverini S., Cilloni D., Saglio G., Pane F., Baccarani M., 2006., Monitoring minimal residual disease and controlling drug resistance in chronic myeloid leukemia patients in treatment with imanitib as a quide to clinical management., Hematological oncology., 24, 196-204 Lange T., Bumm T., Otto S., Kovacs I., Khler T., Deininger M.W.N., 2004., Quantative reverse transcriptase polymerase chain reaction should not replace conventional cytogenetics for monitoring with chronic myeloid leukemia during early phase of imanitib therapy., Hematologica., 89, 49-57 Kaeda J., Chase A., Goldman J.M., 2002., Cytogenetic and molecular monitoring of residual disease in chronic myeloid leukemia., Acta Haematology., 107, 64-75 Lwenberg B., 2003., Minimal residual disease in chronic myeloid leukemia., New England Journal of Medicine 349, 1400-1401 Chung N.G., Buxhofer. V., Radich J.P., 2006., The detection and significance of minimal residual disease in acute and chronic leukemia. Journal Compilation 68 , 371-385. Hochhaus A., 2002., Minimal residual disease in chronic myeloid leukemia patients. Best Practice&Research Clinical Haematology 15, 159-178 Van der Velden V.H.J., Hochhaus A., Cazzaniga G., Szczepanski T., Gabert J., Van Dongen J.J.M., 2003., Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects., Leukemia., 17, 1013-1034 Preudhomme C., Revillion F., Merlat A., Hornez L., Roumier C., DuflosGrardel N., Jouet J.P., Cosson A., Peyrat J.P., Fenaux P., 1999., Detection of BCR_ABL transcripts in Chronic myeloid leukemia (CML) using a realtime quantitative RT-PCR assay., Leukemia, 13, 957-964

26.

27.

28.

29.

30.

31. 32.

33. 34.

35.

61 36. Faderl S., Hochhaus A., Hughes T., 2006., Monitoring of minimal residual in chronic myeloid leukemia. Haematology /Oncology Clinics of North America., 18, 657-670 Norgaard JM, Hokland P., 2000., Biology of Multiple Drug Resistance in Acute Leukemia. International Journal of Hematology ., 72, 290-297 Alexandrova R., 1998., Multidug resistance and P-glycoprotein., Expermental pathology and parastology., 1, 62-66. Jamroziak K., Robak T., 2004., Pharmacogenomics of MDR1/ABCB1 gene: the Influence on risk and clinical outcome of haematological malignancies., Hematology., 9(2), 91-105 Fromm M.F., 2002., The influence of MDR1polymorphisms on Pglycoprotein expression and function in humans., Advanced Drug Delivery reviews., 54, 1295-1310 Bebek N., ine N., ner G.., Ekazan E., zbek U., 2005., Genotye and allele frequencies of MDR-1 C3435>T polymorhism in Turkish population, Journal of Neurological sciences, 22,3, 37, 261-265 Galimbertti S., Cervetti G., Gueriini F., 2005., Quantitative molecular monitoring of bcr-abl and mdr1 trancripts in patients with chronic myeloid leukemia during imanitib treatment., Cancer Genetics and Cytogenetics., 162, 57-62 Hochhaus A. Weisser A. , Rosee L.P. , Emig M. , Mller M.C. , Saubelle S. ,Reiter A. Kuhn C., Berger U., Hehlmann R. ,CrossN.C.P., 2000., Detection and quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia. Leukemia. 14, 998-1005 Jamroziak K., Mlynarski W., Balcerczak E., Mistygacz M., Trelinska J., Bodalski J., Robak T., 2004., Functional polymorhismof MDR1 gene: an impact on genetic susceptibility and clinical outcome of childhood acute lymphoblastic leukemia European Journal of Haemotology., 72, 314-321 Illmer T., Schuler U.S., Thiede C., Kim R.s., Ferund D., Schaich M., 2002., MDR gene polymorhism affect therapy outcome in acute myeloid leukemia patients.Cancer Res. 62, 4955-4962 Hattori H., Sumionoe A., Wada M., Koga Y., Koga Y.,Kohno K., Okamura J., Hara T., Matsuzaki A.,2007., Regulatory polymorphisms of multidrug resistance 1 (MDR1) gene are associated with the development of childhood acute lymphoblastic leukemia., Leukemia Research., 1-8

37. 38. 39. 40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

62 47. Giles F.J., Cortes J., Thomas A.D., Talpaz M., Albitar M., 1999., Multidrug resistance protein expression in chronic myeloid leukemia., American cancer society., 13, 805-812 Duhem C., Dicato M., 1996., What does multidug resistance expression mean in clinic., The oncologist. 1,151-158 Segmund W., 2002., The effects of human MDR1 genotype on thexpression of duodonal p-glycoprotein and disposition of the probe drug talional Clin. Pharmacol Ther 72, 572-583 Holt B., Heuvel-Eibrink M., Schaik R., Ilse P., Wiemer E.A.C., Vossebeld P., Lwenberg B., 2006, ABCB1 gene polymophism are not associated with treatment outcome in eldery acute myeloid leukemia patients., Clinical Pharmacology Therapeutcs., 80, 5, 427-438 Cardana-Quntas A., Cortes J.E., 2006., Chronic myeloid leulemia:diagnosis and treatment., Symposum on oncology practice hematological malignancies., 81(7), 973-988

48. 49.

50.

51.