UNIVERSIDAD DEL QUINDO FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS Y TECNOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA MICROBIOLOGA IV SEMESTRE

OBSERVACIN DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS MEDIANTE TINCIN GRAM

Arias, Diana Carolina. Cdigo: 1094927766; Crdoba, Luz Dari. Cdigo:

RESUMEN Una manera de diferenciar las bacterias Gram + de las Gram - es mediante el mtodo de la tincin GRAM, el cual se basa en la fijacin de los colorante en la de la pared celular. Se aplico la tcnica GRAM con los colorantes cristal violeta y safranina, a muestras del medio de cultivo sembrado 5 das antes. Palabras clave: Gram positiva, Gram negativa, tincin GRAM

INTRODUCCIN El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y la forma ms simple de incrementar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre dos tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, capsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. (Stanier et al., 2005). La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos de estos utilizados con frecuencia, son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos (Ingraham et al., 1999). Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. (Planas, 2000). En esta prctica se us la tincin GRAM, esta es uno de los mtodos ms importantes en el

laboratorio bacteriolgico ya que permite diferenciar las bacterias en Gram Positivas y Gram Negativas. Este mtodo fue descubierto por Christian Gram (Dans), en 1884, quien observ que en cortes histolgicos que contenan bacterias coloreadas con violeta de genciana y tratadas con solucin acuosa de yodo, este colorante podra ser removido del corte histolgico con el empleo de alcohol, pero no de las bacterias. Posteriormente descubri que no todas las bacterias retenan al violeta de genciana sino que algunas eran decoloradas por accin del alcohol. A las primeras las llamo Gram positivas y las segundas Gram negativas. Estas que quedan incoloras son teidas luego mediante el empleo de un colorante de contraste como la safranina, para hacer posible su observacin. (Madigan et al., 2004). La reaccin de la tincin de Gram se basa en la cantidad de peptidoglicano que se encuentra en las paredes celulares de las bacterias. Las Gram + tiene muchas capas de peptidoglicano, las cuales a su vez, sostienen molculas de acido teicoico. Este reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tincin. Un complejo de las molculas cristal violeta-yodo-cido teicoico es muy difcil de remover. Como la pared celular de las Gram positivas retiene estos compuestos, es ms difcil decolorar una clula Gram + que una Gram - (Schlegel et al., 2000) Una mezcla de

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alcohol remueve el cristal violeta de la clula Gram -, pero no de la Gram +. Esta mezcla de alcohol tambin disuelve mucho de la capa exterior de lipopolosacrido de la pared celular de la Gram negativa, lo cual acelera la remocin del colorante primario cristal violeta de estas clulas. (Stanier et al., 2005) Cuando otro colorante, usualmente safranina, se aade, las clulas Gram positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tincin, las clulas Gram + sern del color del cristal violeta, o colorante primario, y las clulas Gram sern del color de la safranina que es el colorante de contraste (Brewster et al., 2004).

poco del inoculo y se coloc en el portaobjetos, haciendo un frotis con l, luego ste se fij a la llama con ligeros pases con el mechero y se dej secar; a continuacin se le adicion el colorante cristal violeta, se dej actuar durante un minuto y se lav con agua destilada, luego se le agreg lugol, igualmente se dej por un minuto, volvi y se lav con alcohol al 96%, se le adicion safranina, esta se dej durante un minuto y se lav nuevamente con agua destilada; una vez hecho esto, se dej secar nuevamente; se realiz el montaje en el microscopio y se inici la observacin en diferentes objetivos, tambin se prepar el objetivo de inmersin adicionndole un poco de aceite de cedro al cubreobjetos. Se realizaron microscpicos. observaciones de hongos

OBJETIVOS RESULTADOS Y DISCUSIN Diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas en un cultivo, mediante la tincin Gram. Observar niveles de organizacin multicelular. Aplicar el mtodo de tincin Gram. Identificar clulas procariotas y eucariotas mediante tincin. Conocer las diferencias entre bacterias Gram positivas y Gram negativas. Al observar en el microscopio el inoculo teido, de las muestras bacterianas del cultivo sembrado cinco das antes, se encontr lo siguiente:

A - 40X

B - 100X

METODOLOGA
C - 100X D - 100X

Se prepararon dos medios de cultivo: un agar nutritivo y un Mac Conkey, los cuales fueron abiertos en un lugar donde se encontraran bacterias; se llev los medios a una incubadora y se dejaron all durante cinco das. Se encendi un mechero para as usar la tcnica asptica, se utiliz un asa de siembra, la cual se calent al rojo en el mechero, se tom una gota de agua con el asa y se deposito en un portaobjetos. Se volvi a esterilizar el asa, se abri la caja de petri que contena el inoculo que se teira, se introdujo el asa evitando que sta eliminara por excesivo calor a los microorganismos; se tom un

Figura 1. Bacterias Gram+ (violeta) y Gram(rosadas). A- cocos (gram+); B- estafilococos (gram+) y bacilos (gram-); C- estafilococos (gram-) y D- estreptococos (gram+) y estreptobacilos (gram+).

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En las observaciones de todas las muestras, fue de notar, que se encontraron en ms proporcin las bacterias Gram+ que las Gram-. Esto es respaldado por lo dicho en Schlegel (2000), la tcnica de coloracin de Gram es de gran utilidad en Bacteriologa, ya que permite diferenciar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas. Casi la mitad de las bacterias, son Gram positivas y el resto Gram negativo. La diferencia que se observ en la coloracin de las bacterias es responsabilidad de la pared celular de estas, como lo dice Loewy (2002) la propiedad de teirse o no de violeta oscuro segn la tincin introducida por Gram (1884) es una caracterstica taxonmica importante, en la que participa fundamentalmente la pared celular y con la que se correlacionan tambin otras propiedades de las bacterias. Entre la pared celular de las Gram negativas y de las Gram positivas hay ciertas diferencias estructurales lo que produce la tincin de distinto color en cada una de ellas, estas diferencias estn corroboradas con lo mencionado en Ingraham (1999) donde dice: La pared celular de las Gram+ se distingue de las Gram-, en que las primeras poseen una pared celular gruesa, que consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de acido tcnico; generalmente, 80% 90% de la pared de la clula Gram+ es peptidoglicano. La pared de la clula Gram-, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Solo 10% 20% de la pared de la clula Gram- es peptidoglicano. Mediante la tincin Gram tambin se pudo observar las agrupaciones de algunas de las bacterias encontradas, como se puede ver en la figura 1 (B-C-D), algunas bacterias aparecen en forma de cocos (estreptococos y estafilococos) y bacilos. Tambin se encontraron y se observaron hongos filamentosos en el agar nutritivo, figura 2.

100X

Figura 2. Hongos filamentosos.

CONCLUSIONES Se diferenci clulas Gram positivas de Gram negativas mediante la tcnica de tincin GRAM. Se reconoci la forma y agrupaciones de algunas bacterias. Se comprendi que la tincin GRAM se basa en la cantidad de peptidoglicano presente en la pared celular de las bacterias. Se conocieron algunas propiedades de la pared celular de las bacterias.

BIBLIOGRAFA Brewster, R. Q.; Vanderwerf, C. A.; McEwen, W. E. 2004. Curso Prctico de Qumica Orgnica. Vedado. La Habana: Pueblo y Educacin. 311p. Ingraham, J. L. & Ingraham, C. A. 1999. Introduccin a la Microbiologia. Volumen II. Espaa: Revert, S. A. 803p. Loewy, A. G. y Siekevitz, P. 2002. Estructura y Funcin Celular. (I. Rodrguez, Trad.). Mxico: Continental S.A. 572p. Madigan, M. T; Martinko, J. M y Parker, J. 2004. Brock, Biologa de los Microorganismos. (10 ed.). Madrid: Pearson Educacin. 1096p. Planas, J. 2000 Prcticas de Biologa. Barcelona: Mega. 284p.

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Schlegel, H. G. y Zaborosch, C. 2000. Microbiologa General. (J. Lalucat, Trad.) Barcelona: Omega. 654p. Stanier, R. Y; Ingraham, J. L; Wheelis, M. L. and Painter, P. R. 2005. Microbiologa. Segunda edicin. Barcelona, Espaa: Revert, S.A. 753p.