TEMA 49: TCNICAS ANALTICAS RELACIONADAS CON LAS PROTENAS 1. Introduccin Las protenas son polmeros de aminocidos.

En las protenas podemos encontrar hasta veinte tipos diferentes de aminocidos. Las protenas se diferencian entre s segn el tipo, nmero y secuencia de aminocidos que forman el esqueleto del polipptido. Como resultado, tienen diferentes estructuras moleculares y propiedades fsico-qumicas. Las protenas son componentes importantes de alimentos para una serie de razones diferentes. Son una fuente importante de energa, as como de aminocidos esenciales (lisina, triptfano, metionina, leucina, isoleucina y valina). Muchas protenas son enzimas que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones bioqumicas. A continuacin veremos las principales tcnicas analticas empleadas en el estudio de la concentracin total, el tipo, la estructura molecular y propiedades funcionales de las protenas. 2. Determinacin de la concentracin de protena total 2.1. El mtodo Kjeldahl Por lo general se considera que es el mtodo estndar para determinar la concentracin de protena. Debido a que el mtodo de Kjeldahl no mide el contenido de protenas directamente un factor de conversin (F) es necesaria para convertir la concentracin de nitrgeno medidos a una concentracin de protenas. Un factor de conversin de 6,25 (equivalente a 0,16 g de nitrgeno por gramo de protena) se utiliza para muchas aplicaciones, sin embargo, esto slo es un valor medio, y cada protena tiene un factor de conversin diferentes, dependiendo de su composicin de aminocidos. El mtodo de Kjeldahl convenientemente se puede dividir en tres etapas: la digestin, la neutralizacin y titulacin. 6.2.1.1. Principios La digestin La muestra de alimento a analizar se pesa en un matraz de digestin y digerido por calentamiento en presencia de cido sulfrico (un agente oxidante que digiere los alimentos), sulfato de sodio anhidro (para acelerar la reaccin al aumentar la temperatura de ebullicin) y un catalizador, como el cobre, selenio, titanio, o el mercurio (para acelerar la reaccin). La digestin convierte cualquier nitrgeno en los alimentos (excepto los que se encuentra en forma de nitratos o nitritos) en amoniaco, y otras materias orgnicas de C0 2 y H 2 0. El gas de amonaco no es liberado en una solucin cida debido a que el amoniaco es en forma de ion amonio (NH 4 +) que se une a los iones de sulfato (SO 4 2 -) y por lo tanto permanece en solucin: N (alimentos) (NH 4) 2 SO 4 (1) Neutralizacin

Despus de la digestin se ha completado el matraz de digestin est conectado a un matraz receptor por un tubo. La solucin en el matraz de digestin se hace entonces alcalinos mediante la adicin de hidrxido de sodio, que convierte el sulfato de amonio en gas amonaco: (NH 4) 2 SO 4 + 2 NaOH 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 (2) El gas amoniaco que se forma se libera de la solucin y se mueve fuera del matraz de digestin y en el matraz de recepcin - que contiene un exceso de cido brico. El bajo pH de la solucin en el matraz receptor convierte el gas amonaco en el ion amonio, y al mismo tiempo convierte el cido brico para el ion borato: NH 3 + H 3 BO 3 (cido brico) NH 4 + + H 2 BO 3 - (ion borato) (3) Valoracin El contenido en nitrgeno entonces se calcula mediante una valoracin de amonio borato forma con el cido sulfrico o clorhdrico estndar, utilizando un indicador adecuado para determinar el punto final de la reaccin. H 2 BO 3 - + H + H 3 BO 3 (4) La concentracin de iones hidrgeno (en moles) requerido para alcanzar el punto final es equivalente a la concentracin de nitrgeno que estaba en el alimento original (ecuacin 3). La siguiente ecuacin se puede utilizar para determinar la concentracin de nitrgeno de una muestra que pesa gramos m con una x M solucin de cido HCl para la valoracin: (5) Donde s V y V b son los volmenes de valoracin de la muestra y en blanco y 14 gramos es el peso molecular de nitrgeno N. Una muestra en blanco por lo general corri en el mismo tiempo que el material que est siendo analizada para tener en cuenta el nitrgeno residual que puede estar en los reactivos utilizados para llevar a cabo el anlisis. Una vez que el contenido de nitrgeno se ha determinado que se convierte en un contenido de protenas utilizando el factor de conversin: Protena = F% N. 6.2.1.4. Ventajas y desventajas Ventajas. El mtodo de Kjeldahl es ampliamente utilizado a nivel internacional y sigue siendo el mtodo estndar para la comparacin con otros mtodos. Su universalidad, alta precisin y buena reproducibilidad han convertido en el principal mtodo para la estimacin de la protena en los alimentos. Desventajas. No da una medida de la protena verdadera, ya que todo el nitrgeno en los alimentos no es en forma de protenas. protenas diferentes necesitan diferentes factores de correccin debido a que tienen diferentes secuencias de aminocidos. El uso de cido sulfrico concentrado a las altas temperaturas supone un riesgo considerable, al igual que el uso de algunos de los posibles catalizadores La tcnica es mucho tiempo para llevar. 6.2.2. Mayor Dumas mtodo Recientemente, una tcnica instrumental automatizado se ha desarrollado que es capaz de medir rpidamente la concentracin de protenas de muestras de alimentos. Esta tcnica se basa en un mtodo descrito por primera vez por un cientfico llamado Dumas ms de un siglo y medio hace. Se est empezando a competir con el mtodo de

Kjeldahl como el mtodo estndar de anlisis de las protenas de algunos alimentos debido a su rapidness. 6.2.2.1. Principios generales Una muestra de masa conocida se quema a una temperatura alta (900 C) en la cmara de la presencia de oxgeno. Esto conduce a la liberacin de CO 2, H 2 O y N 2. El CO 2 y H 2 O se eliminan al pasar los gases en columnas especiales que absorberlos. El contenido de nitrgeno se mide haciendo pasar los gases restantes a travs de una columna que tiene un detector de conductividad trmica en el extremo. La columna de ayuda a separar el nitrgeno de cualquier residuo de CO 2 y H 2 O que han permanecido en la corriente de gas. El instrumento se calibra mediante el anlisis de un material que es puro y tiene una concentracin de nitrgeno conocidos, tales como EDTA (= 9,59% N). As, la seal del detector de conductividad trmica se puede convertir en un contenido de nitrgeno. Al igual que con el mtodo de Kjeldahl es necesario para convertir la concentracin de nitrgeno en una muestra de ese contenido, utilizando los factores de conversin adecuados que dependen de la secuencia de aminocidos de la protena precisa. 6.2.2.2. Ventajas y desventajas Ventajas: Es mucho ms rpido que el mtodo de Kjeldahl (menos de 4 minutos por cada medicin, en comparacin con 1.2 horas para Kjeldahl). No necesita productos qumicos txicos o catalizadores. Muchas muestras se pueden medir de forma automtica. Es fcil de usar. Desventajas: Alto costo inicial. No da una medida de la protena verdadera, ya que todo el nitrgeno en los alimentos no es en forma de protenas. protenas diferentes necesitan diferentes factores de correccin debido a que tienen diferentes secuencias de aminocidos. El tamao de la muestra hace que sea difcil obtener una muestra representativa. 6.2.3. Los mtodos que utilizan espectroscopa UV-visible Un nmero de mtodos se han ideado para medir la concentracin de protena, que se basan en la espectroscopia UV-visible. Estos mtodos de utilizar la capacidad natural para absorber las protenas (o dispersin) la luz en la regin UV-visible del espectro electromagntico, o qumica o modificar fsicamente de las protenas para hacerlas absorber (o dispersin) la luz en esta regin. El principio bsico detrs de cada una de estas pruebas es similar. En primer lugar una curva de calibracin de absorbancia (o turbidez) en comparacin con la concentracin de protenas se prepara a partir de una serie de soluciones de protenas de concentracin conocida. La absorbancia (o turbidez) de la solucin que se analiza se mide en la misma longitud de onda, y su concentracin de protena determina a partir de la curva de calibracin. La principal diferencia entre las pruebas son los grupos qumicos que son responsables de la absorcin o dispersin de la radiacin, por ejemplo, los enlaces peptdicos, aromticos grupos secundarios, grupos de base y agregados de protenas. Algunos de los comnmente utilizados UV-visible la mayora de los mtodos para la determinacin del contenido en protenas de los alimentos se destacan a continuacin: 6.2.3.1. Principios Medicin directa a 280 nm

Triptfano y tirosina absorben la luz ultravioleta fuertemente a 280 nm. El contenido de tirosina y triptfano de muchas protenas se mantiene bastante constante, por lo que la absorbancia de las soluciones de la protena en 280 nm puede ser utilizado para determinar su concentracin. Las ventajas de este mtodo son que el procedimiento es sencillo de realizar, que no es destructiva, y no reactivos especiales se requieren. La principal desventaja es que los cidos nucleicos tambin absorben fuertemente a 280 nm, por lo que podra interferir con la medicin de la protena si estn presentes en concentraciones suficientes. A pesar de ello, se han desarrollado mtodos para superar este problema, por ejemplo, midiendo la absorbancia a dos longitudes de onda diferentes. Mtodo de Biuret A-violceo color violeta se produce cuando los iones de cobre (Cu 2 +) interactan con los enlaces peptdicos en condiciones alcalinas. El reactivo de biuret, que contiene todos los productos qumicos necesarios para llevar a cabo el anlisis, se pueden adquirir comercialmente. Se mezcla con una solucin de protenas y luego se deja reposar durante 15-30 minutos antes de que se lee la absorbancia a 540 nm. La principal ventaja de esta tcnica es que no hay interferencia con materiales que absorben a menores longitudes de onda, y la tcnica es menos sensible al tipo de protena, ya que utiliza la absorcin de participacin de los enlaces peptdicos que son comunes a todas las protenas, en lugar de los grupos secundarios especficos. Sin embargo, tiene una sensibilidad relativamente baja en comparacin con otros mtodos visible-UV. Mtodo de Lowry El mtodo de Lowry combina el reactivo de biuret con otro reactivo (el Ciocalteau fenol reactivo Folin-), que reacciona con los residuos de tirosina y triptfano en las protenas. Esto le da un color azulado que puede ser ledo en alguna parte entre 500 750 nm en funcin de la sensibilidad necesaria. Hay un pequeo pico alrededor de 500 nm que se pueden utilizar para determinar las altas concentraciones de protenas y un gran pico alrededor de 750 nm que se pueden utilizar para determinar las protenas bajas concentraciones. Este mtodo es ms sensible a bajas concentraciones de protenas que el mtodo de biuret. Mtodos de tincin Un exceso conocido de una carga negativa (aninicos) colorante se agrega a una solucin de protena cuyo pH se ajusta de modo que las protenas tienen carga positiva (es decir, <el punto isoelctrico). Las protenas forman un complejo insoluble con el colorante, debido a la atraccin electrosttica entre las molculas, pero el colorante no unido permanece soluble. El colorante se une a los grupos catinico aninico del cido residuos de aminocidos bsicos (histidina, lisina y arganine) y para liberar a grupos amino terminales. La cantidad de colorante no consolidados que queda en solucin despus de la protena-colorante complejo insoluble se ha eliminado (por ejemplo, por centrifugacin) se determina midiendo su absorbancia. La cantidad de protena presente en la solucin original es proporcional a la cantidad de colorante que una a l: tinte obligado = tinte inicial - tinte libre. Turbimetric mtodo Las molculas de protenas que normalmente son solubles en la solucin se puede hacer para precipitar mediante la adicin de ciertos productos qumicos, por ejemplo, el cido tricloroactico. precipitacin de protenas hace que la solucin sea turbia. As, la concentracin de protenas se puede determinar midiendo el grado de turbidez. 4

6.2.3.2. Ventajas y desventajas Ventajas: UV-visible tcnicas son bastante rpidos y simples de realizar, y son sensibles a concentraciones bajas de protenas. Desventajas: Para la mayora de las tcnicas visible-UV, es necesario utilizar la dilucin y las soluciones transparentes, que no contienen sustancias contaminantes que absorben o dispersan la luz en la misma onda que la protena que se analiza. La necesidad de soluciones transparentes significa que la mayora de los alimentos deben someterse a cantidades significativas de preparacin de la muestra antes de que puedan ser analizadas, por ejemplo, la homogeneizacin, extraccin por solvente, centrifugacin, filtracin, que puede ser lento y laborioso. Adems, a veces es difcil de extraer cuantitativamente las protenas de determinados tipos de alimentos, especialmente despus de haber sido procesada de manera que las protenas se agregan o enlaces covalentes con otras sustancias. Adems, la absorcin depende del tipo de protenas analizadas (diferentes protenas tienen diferentes secuencias de aminocidos). 6.2.4. Otras Tcnicas Instrumentales Hay una gran variedad de diferentes mtodos instrumentales disponibles para la determinacin del contenido de protena total de productos alimenticios. stos se pueden dividir en tres categoras diferentes de acuerdo a sus principios fisicoqumicos: (i) la medicin de propiedades fsicas a granel, (ii) medicin de la absorcin de la radiacin, y (iii) la medicin de la dispersin de la radiacin. Cada uno de los mtodos clsicos tiene sus propias ventajas y desventajas, y la variedad de alimentos a los que se puede aplicar. 6.2.4.1. Principios La medicin de propiedades fsicas a granel

Densidad: La densidad de una protena es mayor que la de la mayora de los componentes de otros alimentos, y as se produce un aumento en la densidad de un alimento que aumenta su contenido de protenas. As, el contenido de protenas de los alimentos puede ser determinada mediante la medicin de su densidad. ndice de refraccin: El ndice de refraccin de una solucin acuosa aumenta la concentracin de protenas aumenta y por lo tanto las mediciones de RI puede ser usado para determinar el contenido de protena. UV-visible: La concentracin de protenas se puede determinar midiendo la absorbancia de la radiacin ultravioleta-visible (vase ms arriba). Infrarrojos: tcnicas de infrarrojo se puede utilizar para determinar la concentracin de protenas en muestras de alimentos. Las protenas absorben IR natural debido a las vibraciones caractersticas (estiramiento y flexin) de determinados grupos qumicos a lo largo de la columna vertebral del polipptido. Las mediciones de la absorcin de la radiacin en ciertas longitudes de onda por lo tanto puede ser utilizado para cuantificar la concentracin de protena en la muestra. IR es particularmente til para en-lnea de anlisis rpido del contenido de protenas. Tambin requiere la preparacin de muestras poco y no es destructiva. Sus principales desventajas son su alto costo inicial y la necesidad de calibracin amplia.

La medicin de la adsorcin de las Radiaciones

Resonancia Magntica Nuclear: espectroscopa de RMN se pueden utilizar para determinar la concentracin total de protenas de los alimentos. El contenido de protena se determina midiendo el rea bajo un pico en un turno de espectros de RMN qumicas que corresponde a la fraccin proteica. De dispersin de luz: La concentracin de agregados de protenas en solucin acuosa se puede determinar utilizando tcnicas de dispersin de la luz debido a la turbidez de una solucin es directamente proporcional a la concentracin de los agregados presentes. la dispersin por ultrasonidos: La concentracin de agregados de protenas tambin se puede determinar utilizando tcnicas de dispersin por ultrasonidos, porque la velocidad ultrasnica y la absorcin de la ecografa se relacionan con la concentracin de agregados proteicos presentes.

Medida de la dispersin de la radiacin

6.2.4.2. Ventajas y desventajas Algunos de estos mtodos instrumentales tienen grandes ventajas sobre las otras tcnicas mencionadas anteriormente, ya que no son destructivas, requieren poca o ninguna preparacin de la muestra, y las mediciones son rpidas y precisas. Una desventaja importante de las tcnicas que se basan en mediciones de propiedades fsicas de la mayor parte de los alimentos es que una curva de calibracin debe estar preparado entre la propiedad fsica de inters y el contenido de protena total, y esto puede depender del tipo de protena y la comida la matriz que se encuentra dentro. Adems, las tcnicas basadas en las mediciones de las propiedades fsico-qumicas a granel slo se puede utilizar para analizar los alimentos con composiciones simples relativamente. En una comida que contiene muchos componentes diferentes, cuya concentracin puede variar, es difcil separar la contribucin que hace la protena a la medicin global de la de los otros componentes. 6.2.5. Comparacin de los mtodos de Como cientficos alimentos que a menudo se puede estar en una posicin donde tenemos que elegir una determinada tcnica para medir la concentracin de la protena de un alimento. Cmo decidir qu tcnica es la ms apropiada para nuestra aplicacin en particular? Lo primero que debe determinar es cul es la informacin va a ser utilizado para. Si el anlisis se llevar a cabo con fines oficiales, por ejemplo, legales o de los requisitos de etiquetado, es importante utilizar un mtodo reconocido oficialmente. El mtodo de Kjeldahl, y cada vez ms el mtodo de Dumas, han sido autorizados oficialmente para una amplia gama de aplicaciones en alimentos. En contraste, slo un pequeo nmero de aplicaciones de la espectroscopia de UV-visible han sido reconocidas oficialmente. A efectos de control de calidad, a menudo es ms til contar con medidas rpidas y sencillas de contenido de protenas y por lo tanto las tcnicas de IR son los ms adecuados. Para los estudios fundamentales en el laboratorio, donde las protenas puras se han analizado, las tcnicas de espectroscopa visible-UV se prefieren a menudo porque dan mediciones rpidas y fiables, y son sensibles a concentraciones bajas de protena. Otros factores que pueden tener que tener en cuenta son la cantidad de preparacin de la muestra requerida, su sensibilidad y su velocidad. El Kjeldahl, Dumas y los mtodos de IR requieren de preparacin de muestras muy poco. Despus de una muestra

representativa de los alimentos ha sido seleccionado por lo general se puede probar directamente. Por otra parte, la UV-visible-varios mtodos requieren una preparacin extensa muestra antes del anlisis. La protena debe ser extrada de los alimentos en una solucin diluida transparente, que generalmente implica mucho tiempo de homogeneizacin, extraccin, filtracin de disolventes y los procedimientos de centrifugacin. Adems, puede ser difcil de aislar por completo algunas protenas de los alimentos, ya que estn fuertemente ligados a otros componentes. Las diversas tcnicas tambin tienen sensibilidades diferentes, es decir, la menor concentracin de protenas que pueden detectar. Los mtodos UV-visible son los ms sensibles, siendo capaz de detectar concentraciones de protena tan bajas como 0,001% en peso. La sensibilidad de los Dumas, Kjeldahl y mtodos de IR es de alrededor de 0,1% en peso. El tiempo requerido por el anlisis, y el nmero de muestras que se pueden ejecutar al mismo tiempo, son tambin factores importantes a considerar al decidir qu tcnica de anlisis a utilizar. tcnicas de infrarrojos son capaces de un anlisis rpido (menos de 1 minuto) de la concentracin de la protena una vez que han sido calibrados. El instrumental moderno mtodo de Dumas es totalmente automtico y se puede medir la concentracin de protenas de una muestra en menos de 5 minutos, en comparacin con el mtodo de Kjeldahl que toma entre 30 minutos y 2 horas para llevar a cabo. El UVvisible-varios mtodos oscilan entre un par de minutos a una hora (dependiendo del tipo de colorante que se utiliza y cunto tiempo se tarda en reaccionar), aunque tiene la ventaja de que muchas muestras se pueden ejecutar simultneamente. Sin embargo, suele ser necesario para llevar a cabo la preparacin de muestras amplias antes del anlisis con el fin de obtener una solucin transparente. Otros factores que pueden ser importantes al seleccionar una tcnica apropiada son: el equipo disponible, facilidad de uso, la precisin deseada, y si la tcnica no es destructiva. 6.3. Separacin y Caracterizacin de la protena En la conferencia anterior, las tcnicas utilizadas para determinar la concentracin total de protena en un alimento se discutieron. Los analistas de alimentos se han interesado tambin en el tipo de protenas presentes en un alimento, ya que cada protena tiene nica y fisicoqumicas propiedades nutricionales. tipo de protena es determinada generalmente por la separacin y aislamiento de las protenas individuales de una mezcla compleja de protenas, de modo que puedan ser posteriormente identificado y caracterizado. Las protenas son separadas en la base de las diferencias en sus propiedades fisicoqumicas, como el tamao, la carga, las caractersticas de la adsorcin, la solubilidad y estabilidad trmica. La eleccin de una tcnica de separacin adecuada depende de una serie de factores, incluyendo las razones para llevar a cabo el anlisis, la cantidad de muestra disponible, la pureza deseada, el equipo disponible, el tipo de protenas presentes y el costo. Mtodos de gran escala estn disponibles para los aislamientos de crudo de grandes cantidades de protenas, mientras que los mtodos de pequea escala estn disponibles para las protenas que son caras o slo estn disponibles en pequeas cantidades. Uno de los factores que deben ser considerados durante el proceso de separacin es la posibilidad de que el nativo de la estructura tridimensional de las molculas de protena puede ser alterado. Un conocimiento previo de los efectos de las condiciones ambientales en la estructura de la protena y las interacciones es extremadamente til cuando la seleccin de la separacin tcnica ms apropiada. En primer lugar, porque ayuda a determinar las condiciones ms adecuadas a emplear para aislar una protena particular de una mezcla de protenas (por ejemplo, pH, fuerza inica, temperatura, etc disolvente.), Y en

segundo lugar, porque puede ser importante para elegir las condiciones que se no afectan negativamente a la estructura molecular de las protenas. 6.3.1. Mtodos basados en diferentes caractersticas de solubilidad Las protenas se pueden separar por explotar las diferencias entre su solubilidad en soluciones acuosas. La solubilidad de una molcula de protena est determinada por su secuencia de aminocidos, ya que esto determina su tamao, forma, hidrofobicidad y la carga elctrica. Las protenas pueden ser selectivamente precipitado o solubilizado mediante la alteracin del pH, fuerza inica, constante dielctrica o la temperatura de una solucin. Estas tcnicas de separacin son los ms sencillos de utilizar, cuando grandes cantidades de muestra estn involucrados, porque son relativamente rpido, barato y no son particularmente influenciada por otros componentes de los alimentos. A menudo se utilizan como el primer paso en cualquier proceso de separacin debido a que la mayora de los materiales contaminantes se puede quitar fcilmente. Ensanchamiento Las protenas se precipitan a partir de soluciones acuosas, cuando la concentracin de sal supera un nivel crtico, lo que se conoce como la salazn de espera, ya que toda el agua es "obligado" a las sales, y por tanto no disponibles para hidratar las protenas. Sulfato de amonio [(NH 4) 2 SO 4] se usa comnmente, ya que tiene un agua de alta solubilidad, aunque otras sales neutras tambin puede ser utilizado, por ejemplo, NaCl o KCl. En general, un procedimiento de dos pasos se utiliza para maximizar la eficiencia de separacin. En el primer paso, la sal se aade a una concentracin por debajo de las necesarias para precipitar la protena de inters. La solucin se centrifuga para eliminar las protenas que son menos solubles que la protena de inters. La concentracin de sal es luego aument a un punto justo por encima de la necesaria para causar la precipitacin de la protena. Esto precipita la protena de inters (que pueden ser separados por centrifugacin), pero deja ms protenas solubles en la solucin. El principal problema de este mtodo es que las grandes concentraciones de sal contamine la solucin, que debe ser removido antes de la protena puede ser resolubilzed, por ejemplo, mediante dilisis o ultrafiltracin. La precipitacin isoelctrica El punto isoelctrico (pI) de una protena es el pH donde la carga neta de la protena es cero. Las protenas tienden a agregarse y precipitar a su pI porque no hay repulsin electrosttica mantenerlos separados. Las protenas tienen diferentes puntos isoelctricos por sus secuencias de aminocidos diferentes (en relacin por ejemplo, nmeros de grupos aninicos y catinicos), y por lo tanto pueden ser separados por el ajuste del pH de una solucin. Cuando se ajusta el pH a la pi de una protena particular, se precipita dejando a las otras protenas en solucin. Solvente Fraccionamiento La solubilidad de una protena depende de la constante dielctrica de la solucin que lo rodea, porque esto altera la magnitud de las interacciones electrostticas entre los grupos de cargos. Como la constante dielctrica de una solucin reduce la magnitud de las interacciones electrostticas entre los acusados aumentos de las especies. Esto tiende a reducir la solubilidad de las protenas en solucin, ya que son menos ionizado, y por lo tanto la repulsin electrosttica entre ellos no es suficiente para evitar la agregacin. La constante dielctrica de las soluciones acuosas se puede reducir mediante la adicin de disolventes orgnicos solubles en agua, como el etanol o acetona. La cantidad de disolventes orgnicos necesarios para causar la precipitacin 8

depende de la protena y por lo tanto las protenas se pueden separar en esta base. La cantidad ptima de disolventes orgnicos necesarios para precipitar una protena vara de 5 a 60%. fraccionamiento solvente se realiza generalmente a 0 C o menos para evitar la desnaturalizacin de protenas causada por el aumento de la temperatura que se producen cuando los solventes orgnicos se mezclan con agua. La desnaturalizacin de las protenas contaminantes Muchas protenas se desnaturalizan y precipitado de la solucin cuando se calienta por encima de cierta temperatura o mediante el ajuste de una solucin a pH muy cido o bsico. Las protenas que son estables a altas temperaturas o en los extremos de pH son ms fciles de separar por esta tcnica debido a contaminacin de las protenas puede ser precipitada, mientras que la protena de inters se mantiene en solucin. 6.3.2. Caractersticas de separacin por adsorcin de diferentes cromatografa de adsorcin consiste en la separacin selectiva de los compuestos por adsorcin-desorcin en una matriz slida que se encuentra dentro de una columna a travs del cual pasa la mezcla. La separacin se basa en las afinidades diferentes de diferentes protenas de la matriz slida. Afinidad y cromatografa de intercambio inico son los dos principales tipos de cromatografa de adsorcin de uso general para la separacin de las protenas. La separacin puede llevarse a cabo utilizando una columna abierta o de alta presin de cromatografa de lquidos. Cromatografa de intercambio inico cromatografa de intercambio inico se basa en la adsorcin reversible-desorcin de iones en la solucin de un cargo o matriz polimrica slida red. Esta tcnica es la tcnica de cromatografa de uso comn para la mayora de separacin de protenas. Una carga positiva de la matriz se llama un intercambiador de aniones, ya que se une iones cargados negativamente (aniones). Una carga negativa de la matriz se llama un ion de gato intercambiador porque se une iones cargados positivamente (cationes). Las condiciones (pH y fuerza inica) se ajustan a favor de la mxima unin de la protena de inters para la columna de intercambio inico. La contaminacin de protenas se unen con menos fuerza y por lo tanto pasan ms rpidamente a travs de la columna. La protena de inters se eluye con otra solucin tampn que favorece la desorcin de la columna (, diferentes por ejemplo, pH o fuerza inica). Cromatografa de afinidad cromatografa de afinidad utiliza una fase estacionaria que consta de un ligando unido covalentemente a un soporte slido. El ligando es una molcula que tiene un nico y reversibles afinidad altamente especficos para una protena en particular. La muestra a analizar se pasa a travs de la columna y la protena de inters se une al ligando, mientras que las protenas contaminantes pasan directamente a travs. La protena de inters como a continuacin se eluy con una solucin tampn que favorece la desorcin de la columna. Esta tcnica es el medio ms eficaz de separar una protena individuales de una mezcla de protenas, pero es el ms caro, debido a la necesidad de tener columnas con ligandos especficos vinculados a ellos. Tanto de intercambio inico y cromatografa de afinidad se usan comnmente para separar las protenas y aminocidos en el laboratorio. Se utilizan con menos frecuencia para las separaciones comerciales porque no son adecuados para la rpida separacin de grandes volmenes y son relativamente caros. 6.3.3. Separacin Debido a las diferencias de tamao 9

Las protenas tambin pueden ser separados de acuerdo a su tamao. Normalmente, los pesos moleculares de las protenas varan de cerca de 10.000 a 1.000.000 daltons. En la prctica, la separacin depende de la radio de Stokes de una protena, en lugar de hacerlo directamente en su peso molecular. El radio de Stokes es el radio promedio de una protena que tiene en la solucin, y depende de su estructura de tres dimensiones moleculares. Para las protenas con el mismo peso molecular aumenta el radio de Stokes en el siguiente orden: compacto <protena globular al azar de la bobina <bastncomo la protena flexible. Dilisis La dilisis se utiliza para separar las molculas en solucin mediante el uso de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas ms pequeas de un determinado tamao a travs, pero impedir el paso de molculas ms grandes. Una solucin de la protena se coloca en el tubo de dilisis que se sella y se coloca en un gran volumen de agua o buffer que se agita lentamente. de peso molecular bajo flujo de solutos a travs de la bolsa, pero el gran peso de las molculas de protena molecular permanecen en la bolsa. La dilisis es un mtodo relativamente lento, teniendo un mximo de 12 horas para ser completado. Por tanto, es ms frecuente en el laboratorio. La dilisis se utiliza a menudo para eliminar la sal de las soluciones de la protena despus de haber sido separados por la salazn de salida, y cambiar amortiguadores. Ultrafiltracin Una solucin de la protena se coloca en una celda que contiene una membrana semipermeable, y la presin se aplica. Molculas ms pequeas pasan a travs de la membrana, mientras que las molculas ms grandes permanecen en la solucin. El principio de separacin de esta tcnica es por tanto similar a la dilisis, pero la presin se aplica la separacin, porque es mucho ms rpido. membranas semipermeables con puntos de corte entre 500 y 300 mil estn disponibles. La parte de la solucin que se mantiene por la clula (molculas grandes) se llama el retenido, mientras que la parte que pasa a travs de la membrana (molculas pequeas) forma parte del ultrafiltrado. Ultrafiltracin se puede utilizar para concentrar una solucin de protena, eliminar las sales , tampones de cambio o fraccionar las protenas sobre la base de su tamao. unidades de ultrafiltracin se utilizan en el laboratorio y en escala comercial. Tamao de la cromatografa de exclusin Esta tcnica, conocida a veces como la filtracin del gel, tambin separa las protenas segn su tamao. Una solucin de la protena se vierte en una columna que est lleno de granos porosos hechos de un material polimrico vinculados de cruz (por ejemplo, dextrano o agarosa). las molculas ms grandes que los poros de los granos estn excluidos, y se mueven rpidamente a travs de la columna, mientras que el movimiento de las molculas que entran en los poros se retrasa. As, las molculas se eluyen de la columna en orden decreciente de tamao. Bolas de la media de tamao de poro diferentes para separar las protenas de diferentes pesos moleculares. Los fabricantes de estas cuentas proporcionan informacin sobre el rango de peso molecular que son los ms adecuados para la separacin. Los pesos moleculares de protenas desconocidas se puede determinar mediante la comparacin de sus volmenes de elucin Vo, con los que utilizan las protenas determinada de peso molecular conocido: una parcela de volumen de elucin frente a log (peso molecular) debe dar una lnea recta. Un problema con este mtodo es que el peso molecular no est directamente relacionado con el radio de Stokes para diferentes protenas en forma.

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6.3.4. Separacin por electroforesis Electroforesis se basa en las diferencias en la migracin de las molculas cargadas en una solucin cuando un campo elctrico se aplica a travs de ella. Puede ser utilizado para separar las protenas en funcin de su tamao, forma o carga. Para no desnaturalizar la electroforesis En la electroforesis no desnaturalizante, una solucin tamponada de protenas nativas se vierte sobre un gel poroso (por lo general, el almidn de poliacrilamida o agarosa) y se aplica un voltaje a travs del gel. Las protenas se mueven a travs del gel en una direccin que depende del signo de su carga, ya un ritmo que depende de la magnitud de la carga, y la friccin de su movimiento: Las protenas pueden ser cargados positiva o negativamente en la solucin en funcin de sus puntos isoelectic (pI) y el pH de la solucin. Una protena tiene carga negativa, si el pH est por encima de la PI, y con carga positiva si el pH est por debajo del pI. La magnitud de la carga y la tensin aplicada se determinar en qu medida las protenas migran en un tiempo determinado. Cuanto mayor sea el voltaje o la mayor carga sobre la protena ms se mover. La friccin de una molcula es una medida de su resistencia al movimiento a travs del gel y est determinado en gran medida por la relacin entre el tamao efectivo de la molcula, y el tamao de los poros en el gel. Cuanto menor sea el tamao de la molcula, o cuanto mayor sea el tamao de los poros en el gel, menor ser la resistencia y por lo tanto ms rpido se mueve una molcula a travs del gel. Geles con la porosidad diferentes se pueden comprar de proveedores de productos qumicos, o compuesto en el laboratorio. Poros ms pequeos tamaos se obtienen mediante una mayor concentracin de reactivo del cross-linking para formar el gel. Los geles pueden estar contenidos entre dos placas paralelas, o en tubos cilndricos. En la electroforesis no desnaturalizante de las protenas nativas estn separados sobre la base de una combinacin de su carga, tamao y forma. La desnaturalizacin de la electroforesis En desnaturalizar las protenas electroforesis se separan principalmente en su peso molecular. Las protenas se desnaturalizan antes del anlisis mediante la mezcla con mercaptoetanol, que rompe los enlaces disulfuro y dodecilsulfato sdico (SDS), que es un surfactante aninico que hydrophobically se une a molculas de protenas y hace que se desarrollan debido a la repulsin entre la carga negativa de surfactante cabeza de los grupos. Cada molcula de protena se une aproximadamente la misma cantidad de las existencias por unidad de longitud. Por lo tanto, la carga por unidad de longitud y la conformacin molecular es aproximadamente similar para todas las protenas. Como las protenas viajar a travs de una red de gel son principalmente separados sobre la base de su peso molecular debido a que su movimiento depende del tamao de la molcula de protena en relacin con el tamao de los poros en el gel: protenas ms pequeas movindose ms rpidamente a travs de la matriz que las grandes molculas. Este tipo de electroforesis que comnmente se llama de sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida-sulfato, o SDS-PAGE. Para determinar hasta qu punto las protenas se han movido un medio de seguimiento se agrega a la solucin de la protena, por ejemplo, azul de bromofenol. Este colorante es una carga pequea molcula que migra por delante de las protenas. Despus de la electroforesis de las protenas se completa se hacen visibles al tratar el gel con un tinte de protenas tales como azul brillante de Coomassie o tincin de plata. La movilidad relativa de cada banda de protenas se calcula: 11

Electroforesis se utiliza a menudo para determinar la composicin proteica de los alimentos. La protena se extrae de los alimentos en solucin, que se separa mediante electroforesis. SDS-PAGE se utiliza para determinar el peso molecular de una protena mediante la medicin de R m, y luego se compara con una curva de calibracin producidos con protenas de peso molecular conocido: una parcela de registro (peso molecular) en contra de la movilidad relativa es generalmente lineal. electroforesis desnaturalizante es ms til para la determinacin de pesos moleculares de electroforesis no desnaturalizante, porque la friccin con el movimiento no depende de la forma o la carga original de las molculas de protena. Isoelectroenfoque electroforesis Esta tcnica es una modificacin de la electroforesis, en los que las protenas son separadas por la carga en una matriz de gel que tiene un gradiente de pH a travs de ella. Las protenas migran hacia el lugar donde el pH es igual a su punto isoelctrico y luego dejan de moverse porque ya no son cargos. Este mtodo tiene una de las resoluciones ms altas de todas las tcnicas que se utilizan para separar las protenas. Los geles estn disponibles que cubren un rango de pH estrecho (2-3 unidades) o un amplio rango de pH (3-10 unidades) y un tanto, debe seleccionar un gel que es ms adecuado para las protenas estn separados. Electroforesis de dos dimensiones Isoelectroenfoque y SDS-PAGE se pueden utilizar juntos para mejorar la resolucin de mezclas complejas de protenas. Las protenas se separan en una direccin sobre la base de carga usando la concentracin isoelctrica y, a continuacin en una direccin perpendicular sobre la base de tamao mediante SDS-PAGE. 6.3.5. Amino cido Anlisis anlisis de cido amino se utiliza para determinar la composicin de aminocidos de las protenas. Una muestra de la protena hidrolizada por primera vez (por ejemplo, utilizando un cido fuerte) para liberar los aminocidos, que luego son separados mediante cromatografa, por ejemplo, de intercambio inico, cromatografa de afinidad o de absorcin.

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