Hematologia

HEMATOLOGA
Fisiopatologa y Diagnstico
Editores Ivn Palomo G., Jaime Pereira G., Julia Palma B.
UNIVERSIDAD
EDITORIAL
DE TALCA
MCMXCI
UNIVERSIDAD DE
TALCA
EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA COLECCIN E-BOOK Serie de libros electrnicos
HEMATOLOGA Fisiopatologa y Diagnstico

Editores Ivn Palomo G., Jaime Pereira G., Julia Palma B. EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA Vicerrectora Acadmica COLECCIN E-BOOK Serie de libros electrnicos
Registro de propiedad intelectual N 146.421 ISBN: 978-956-7059-85-0 EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA Talca- Chile, julio de 2009 Edicin soporte papel ao 2005
Diseo Editorial: Marcela Albornoz Dachelet Correccin de textos: Mara Cecilia Tapia Castro
UNIVERSIDAD
EDITORIAL
DE TALCA
MCMXCI
HEMATOLOGA
Editores
Ivn Palomo G., Jaime Pereira G., Julia Palma B.
UNIVERSIDAD DE TALCA
HEMATOLOGA: Fisiopatologa y Diagnstico
Editores
Prof. TM. Dr. Ivn Palomo Gonzlez Unidad de Hematologa e Inmunologa Departamento de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Prof. Dr. Jaime Pereira Garcs Departamento de Hematologa y Oncologa Facultad de Medicina Pontificia Universidad Catlica de Chile Prof. Dra. Julia Palma Behnke Departamento de Pediatra Facultad de Medicina Universidad de Chile
Unidad de Trasplante de Mdula sea Hospital Luis Calvo Mackenna
Editorial Universidad de Talca Registro de propiedad intelectual N 146.421 ISBN: 956 - 7059 - 63 - 2
EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA Talca - CHILE, 2005
Ilustraciones Brbara Fuentes Y. Estudiante de Tecnologa Mdica, Universidad de Talca Diseo grfico: Marcela Albornoz Dachelet Impresin: Impresora Gutenberg Talca Revisin de textos: Mara Cecilia Tapia Castro
TM. Lic. Marianela Agurto O.
AUTORES DE CAPTULOS
Escuela de Tecnologa Mdica Facultad de Medicina Universidad de Concepcin TM. Lic. Marcelo Alarcn L. Depto. de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Dr. Jorge Aldunate O. Servicio Laboratorio Clnico Hospital Clnico Universidad de Chile Dr. Jorge Alfaro L. Depto. de Hematologa Facultad de Medicina Universidad de Chile BQ. Dr. Eduardo Aranda L. Laboratorio de Hemostasia y Trombosis P. Universidad Catlica de Chile TM. Mg. Leonor Armanet B. Escuela de Tecnologa Mdica Facultad de Medicina Universidad de Chile TM. Dr. Miguel Arredondo O. Laboratorio de Micronutrientes Instituto de Tecnologa de los Alimentos Universidad de Chile TM. Lic. Carmen Gloria Artigas A. Mg (c) Depto. de Medicina Interna Facultad de Medicina Universidad de La Frontera Dr. Pablo Bertin C-M. Depto. de Hematologa y Oncologa Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile Dr. Juan Francisco Cabello A. Unidad de Enfermedades metablicas Instituto de Nutricin y Tecnologa de los Alimentos Universidad de Chile Dra. Myriam Campbell B. Unidad Oncologa Hospital Roberto del Ro Dpto. de Pediatra Facultad de Medicina Universidad de Chile BQ. Dr. Flavio Carrin A. Unidad de Inmunologa Facultad de Medicina Universidad de los Andes TM. Mg. Juan Luis Castillo N. Laboratorio de Citometra de Flujo Hospital del Trabajador Concepcin Dr. Guillermo Conte L. Depto. de Hematologa Facultad de Medicina Universidad de Chile Dr. Claudio Cruzat C. Servicio de Anatoma Patolgica Hospital Regional de Talca Universidad Catlica del Maule Dra. Patricia Dal Borgo A. Laboratorio de Hematologa Hospital Calvo Mackenna Dr. Mario Donoso S. Programa Nacional de Hemostasia y Trombosis Ministerio de Salud Banco de Sangre Hospital del Salvador BQ. Dr. Alejandro Erices O. Laboratorio de Biologa Celular y Farmacologa Depto. de Ciencias Biolgicas Facultad de Ciencias de la Salud Universidad Andrs Bello Dra. Patricia Fardella B. Depto. de Hematologa Facultad de Medicina Universidad de Chile BQ. Dr. Ricardo Forastiero V.
Depto. de Hematologa Facultad de Medicina Universidad Favaloro Buenos Aires, Argentina Dr. scar Gonzlez R. Unidad de Trasplantes de Progenitores Hematopoyticos Hospital Civil de Guadalajara Universidad de Guadalajara Mxico TM. Patricia Hidalgo P. Laboratorio de Hemostasia y Trombosis Hospital Clnico P. Universidad Catlica de Chile Dr. Ricardo Hojas B. Unidad Docente asociada de la Asistencia Pblica Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile Dra. Alejandra King D. Unidad de Trasplante de Mdula sea Hospital Luis Calvo Mackenna Dr. Milton Larrondo L. Banco de Sangre Facultad de Medicina Universidad de Chile TM. Mara Eugenia Legues S. Laboratorio de Hematologa Hospital Clnico P. Universidad Catlica de Chile TM. Mg. Elba Leiva M. Depto. de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Dr. Pablo Lira V. Depto. de Hematologa y Oncologa Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile Dr. Alejandro Majlis L.
Unidad de Hemato-Oncologa Clnica Alemana, Santiago TM. Mg. Mnica Maldonado R. Depto. de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Dr. Diego Mezzano A. Depto. de Hematologa y Oncologa Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile BQ. Dr. Jos Minguell U. Programa terapias celulares, INTA, Universidad de Chile y Laboratorio de Trasplante de Mdula sea, Clnica Las Condes Dr. Claudio Mosso Ch. Unidad de Trasplante de Mdula sea Hospital Luis Calvo Mackenna TM. Lic. Victor Muoz F. Mg (c) Escuela de Tecnologa Mdica Universidad de Chile TM. Blanca Muoz V. Laboratorio de Hemostasia y Trombosis Hospital Clnico P. Universidad Catlica de Chile Dr. Mauricio Ocqueteau T. Depto. de Hematologa y Oncologa Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile Dr. Manuel Olivares G. Laboratorio de Micronutrientes Instituto de Tecnologa de los Alimentos Universidad de Chile TM. Mg. Santiago Orizola G. Depto. de Tecnologa Mdica Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Antofagasta Dra. Julia Palma B.
Depto. de Pediatra Facultad de Medicina Universidad de Chile Unidad de Trasplante de Mdula sea Hospital Luis Calvo Mackenna TM. Dr. Ivn Palomo G. Depto. de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca BQ. Dra. Olga Panes B. Laboratorio de Hemostasia y Trombosis Hospital Clnico P. Universidad Catlica de Chile Dra. Claudia Paris D. Unidad de Trasplante de Mdula sea Hospital Luis Calvo Mackenna Dr. Jaime Pereira G. Depto. de Hematologa y Oncologa Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile BQ. Dra. Silvia Pierangeli Department of Microbiology Biochemistry and Immunology, Morehouse School of Medicine Estados Unidos TM. Fernando Pizarro A. Laboratorio de Micronutrientes Instituto de Tecnologa de los Alimentos Universidad de Chile Dr. Gonzalo Pombo V. Depto. de Hematologa Facultad de Medicina Universidad Favaloro Argentina Dra. Erna Raimann B. Unidad de Enfermedades metablicas Instituto de Nutricin y Tecnologa de los Alimentos Universidad de Chile TM. Mg. Eduardo Retamales C.
Laboratorio Nacional y de Referencia en Hematologa Instituto de Salud Pblica Biol. Lic. Concepcin Risueo A. Laboratorio de Hematologa Hospital Clnico P. Universidad Catlica de Chile Dr. Jaime Rodrguez C. Depto. de Ciencias Bsicas Biomdicas Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Talca Dr. Carlos Rodrguez-Galindo Department of Hematology Oncology St. Jude Childrens Research Hospital Estados Unidos Dr. Pablo Rubinstein National Cord Blood Program New York Blood Center Estados Unidos Dr. Guillermo Ruiz-Argelles Centro de Hematologa y Medicina Interna de Puebla Laboratorios Clnicos de Puebla Secretario General Divisin Interamericana, ISH Mxico Dr. Guillermo J. Ruiz-Delgado Hospital Mdica Sur Ciudad de Mxico, Mxico Dr. Guillermo Ruiz-Reyes Laboratorios Clnicos de Puebla Puebla, Mxico BQ. Dra. Claudia Sez S. Laboratorio de Hemostasia y Trombosis Hospital Clnico P. Universidad Catlica de Chile Dra. Carmen Salgado M.
Unidad de Onco-Hematologa Hospital Infantil Dr. Exequiel Gonzlez Corts Depto. de Pediatra Facultad de Medicina Universidad de Chile Unidad Hemato-Oncologa Clnica Alemana, Santiago Dra. BQ. Mara Teresa Santos D. Unidad de Aterosclerosis, Trombosis y Biologa Vascular Cantro de Investigacin Hospital Universitario La Fe Valencia, Espaa Dra. Rosario Silva C. Laboratorio de Hematologa Hospital Luis Calvo Mackenna Dr. Juan Tordecilla C. Depto. de Hematologa Hospital Roberto del Ro Dra. QF. Juana Valls G. Unidad de Aterosclerosis, Trombosis y Biologa Vascular Cantro de Investigacin Hospital Universitario La Fe Valencia, Espaa TM. Mg. Cs. Marcela Vsquez R.
Depto. de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca MV. Dr. Ulises Vergara C. Laboratorio de Inmunologa Depto. de Medicina Preventiva Animal Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile Dra. Mara Jess Vial C. Servicio Laboratorio Clnico Hospital Clnico Universidad de Chile Dr. Vicente Vicente G. Unidad de Hematologa y Oncologa Mdica Hospital Universitario Morales Meseguer Murcia, Espaa
PATROCINIO
Sociedad Chilena de Hematologa Universidad de Talca Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Catlica de Chile Facultad de Medicina, Universidad de Chile Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera Universidad de Antofagasta Direccin de Investigacin, Universidad Andrs Bello Instituto de Salud Pblica de Chile
AUSPICIO
Bayer Healthcare Diagnstico S.A. Clnica Santa Mara S.A. Clinitest Ltda. Direccin de Investigacin, Universidad Andrs Bello Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Talca Farmalatina Ltda. Grifols Chile S.A. Ivens S.A. Laboratorio Clnico Loncomilla Ltda. Laboratorio Clnico Talca Ltda. Laboratorio Recalcine S.A. Sociedad Clnica del Maule S.A.
A nuestras queridas familias y a nuestros estimados alumnos
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CONTENIDOS
PREFACIO PRLOGO SECCIN I. HEMATOPOYESIS Captulo 1 HEMATOPOYESIS Claudia Sez S. e Ivn Palomo G.
Pgina 39 41 43 45
1. Introduccin 2. Mdula sea 2.1. Histologa 3. Clulas troncales hematopoyticas 3.1. Definicin de clula troncal hematopoytica 3.2. Estudio de la clula troncal hematopoytica 3.3. Identificacin y aislamiento de las clulas troncales hematopoyticas 3.4. Heterogeneidad de las clulas troncales hematopoyticas 3.5. Divisin de las clulas troncales hematopoyticas 3.6. Ontogenia de la clula troncal hematopoytica 3.7. Influencia de factores de crecimiento involucrados en la decisin de linaje 3.8. Genes involucrados en la decisin de linaje 4. El microambiente de la mdula sea 5. Granulomonopoyesis 5.1. Estadios madurativos 5.2. Factores de maduracin 6. Eritropoyesis 6.1. Estadios madurativos 6.2. Eritropoyetina 6.3. Gen de EPO 7. Megacariopoyesis 7.1. Estadios madurativos 7.2. Regulacin 8. Linfopoyesis 8.1. Clulas B 8.2. Clulas T 9. Estudio de la hematopoyesis
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Captulo 2 CLULAS TRONCALES DE MDULA SEA Jos Minguell U. y Alejandro Erices O. 1. Introduccin
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2. Propiedades de las clulas troncales adultas 3. Clula troncal hematopoytica 4. Clulas troncales mesenquimticas 5. Clulas troncales de la mdula sea y su potencial uso clnico
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SECCIN II. GLBULOS ROJOS Captulo 3 GLBULOS ROJOS Y HEMOGLOBINA Ivn Palomo G., Santiago Orizola G., Jaime Rodrguez C. y Ricardo Hojas B. 1. Introduccin 2. Estructura de los glbulos rojos 2.1. Membrana eritrocitaria 2.1.1.Protenas integrales 2.1.2.Protenas perifricas 2.1.3.Molculas de adhesin 3. Metabolismo de los hemates 3.1. Gluclisis anaerobia 3.2. Metabolismo xido-reductor (va de las pentosas o hexosamonofosfato) 3.3. Metabolismo nucleotdico 3.4. Sistema de diaforasas 4. Hemoglobina 4.1. Estructura de la Hb 4.1.1. Estructura primaria a cuaternaria 4.1.2. Hemo 4.1.3. Tipos de hemoglobinas 4.1.4. Ontogenia de la hemoglobina humana 4.2. Funcin de la hemoglobina 4.2.1. Transporte de oxgeno 4.2.2. Descarga de oxgeno a los tejidos 4.2.3. Mecanismo de carga de oxgeno 4.2.4. Interaccin hemo-hemo 4.2.5. Sistema tampn 4.2.6. Transporte de CO2 4.2.7. Interaccin con aniones inorgnicos 4.2.8. Interaccin con fosfatos orgnicos 5. Destruccin de los hemates
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Captulo 4 ANEMIA Y SNDROME ANMICO Ivn Palomo G. y Pablo Lira V. 1. Introduccin 2. Definicin de Anemia
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3. Estudio de laboratorio 3.1. Recuento de GR, Hto y Hb 3.2. ndices eritrocitarios 3.3. Recuento de reticulocitos e ndice reticulocitario 4. Mecanismos de adaptacin y sintomatologa 4.1. Mecanismos de adaptacin 4.2. Sntomas y signos 5. Clasificaciones de las anemias 5.1. Clasificacin morfolgica 5.2. Clasificacin fisiopatolgica 5.2.1.Anemias arregenerativas 5.2.2.Anemias regenerativas
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Captulo 5 APLASIA MEDULAR Claudio Mosso Ch., Claudia Paris D. y Rosario Silva C. 1. Introduccin 2. Aplasia medular adquirida 2.1. Epidemiologa 2.2. Cuadro clnico 2.3. Estudios de laboratorio 2.3.1.Sangre perifrica 2.3.2.Otros estudios de laboratorio 2.3.3.Mdula sea 2.4. Etiologa 2.5. Fisiopatologa 2.6. Tratamiento y evolucin de la aplasia medular 2.6.1.Tratamiento de soporte 2.6.2.Tratamiento y respuesta 2.7. Tratamiento de soporte 2.8. Tratamiento y respuesta 2.8.1.Trasplante de mdula sea 2.8.2.Tratamiento inmunosupresor 3. Aplasias medulares hereditarias y/o congnitas 3.1. Anemia de Fanconi 3.2. Disqueratosis congnita 3.3. Sndrome de Shwachman-Diamond 3.4. Hipoplasia cartlago-pelo 3.5. Sndrome de Pearson 3.6. Disgenesia reticular 3.7. Trombocitopenia amegacarioctica 3.8. Anemia Blackfan-Diamond 3.9. Neutropenia congnita severa (sndrome Kostmann) 3.10. Trombocitopenia con ausencia de radio
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Captulo 6 133 ALTERACIONES DEL METABOLISMO DEL HIERRO Y DE LA SNTESIS DEL GRUPO HEM Ivn Palomo G., Manuel Olivares G., Miguel Arredondo O. y Fernando Pizarro A. 1. Introduccin 2. Metabolismo del hierro 2.1. Homeostasis del hierro 2.2. Absorcin intestinal de hierro 2.3. Regulacin intracelular de los niveles de hierro 2.3.1.Transportador de metales divalentes 1 (DMT1) 2.3.2 Receptor para transferrina 2.3.3.Protena HFE 2.3.4.Transportador Ireg1 2.3.5.Hefestina 2.3.6.Hepcidina 2.4. Modelo de homeostasis del hierro 2.5. Biosntesis del Hem 3. Deficiencia de hierro 3.1. Cambios con el desarrollo y requerimientos de hierro 3.2. Etiopatogenia de la deficiencia de hierro 3.3. Cuadro clnico y consecuencias 3.4. Diagnstico de laboratorio de la deficiencia de hierro 3.5. Prevencin y tratamiento de la deficiencia de hierro 4. Sobrecarga de hierro 4.1. Hemocromatosis 4.1.1.Hemocromatosis hereditaria tipo 1 (clsica) 4.1.2.Hemocromatosis hereditaria tipo 2 (juvenil) 4.1.3.Hemocromatosis hereditaria tipo 3 (mediterrnea) 4.1.4.Hemocromatosis hereditaria tipo 4 4.2. Aceruloplasminemia 4.3. Atransferrinemia 4.4. Hemocromatosis neonatal 4.5. Sobrecarga de hierro africana (Siderosis Bantu) 4.6. Manifestaciones clnicas de la Hemocromatosis Hereditaria (HH) 4.7. Diagnstico de la Hemocromatosis Hereditaria 4.8. Tratamiento de la Hemocromatosis Hereditaria 5. Anemia de enfermedades crnicas y de la inflamacin aguda 6. Anemia sideroblstica 6.1. Anemia sideroblstica hereditaria (ASH) 6.2. Anemia Sideroblstica Adquirida (ASA) 7. Porfirias Captulo 7 ANEMIAS MEGALOBLSTICAS Gonzalo Pombo V. e Ivn Palomo G. 1. Introduccin 2. Eritropoyesis megaloblstica 134 135
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3. Laboratorio 4. Metabolismo de la cobalamina 4.1. Estructura 4.2. Fuentes, requerimientos diarios y depsitos corporales 4.3. Absorcin, transporte y almacenamiento 4.4. Funciones 5. Dficit de vitamina B12 5.1. Etiologas 5.2. Anemia perniciosa 6. Metabolismo del cido flico 6.1. Estructura 6.2. Fuentes, requerimientos diarios y depsitos corporales 6.3. Absorcin, transporte y almacenamiento 6.4. Funciones 7. Dficit de cido flico 7.1. Etiologa 7.2. Manifestaciones clnicas 7.3. Diagnstico 8. Diagnsticos diferenciales
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Captulo 8 175 ANEMIAS HEMOLTICAS Ivn Palomo G., Marcela Vsquez R., Leonor Armanet B., Guillermo Ruiz R., Victor Muoz F., Patricia Dal Borgo A. y Ricardo Hojas B. Introduccin Sndrome hemoltico 1. Clasificacin de las anemias hemolticas 2. Mecanismos de destruccin de los hemates 2.1. Hemlisis extravascular 2.2. Hemlisis intravascular 3. Aspectos clnicos 3.1. Sndrome hemoltico agudo 3.2. Sndrome hemoltico crnico 4. Laboratorio Anemias hemolticas intracorpusculares 1. Membranopatas 1.1. Membranopatas hereditarias 1.1.1. Esferocitosis hereditaria 1.1.2. Eliptocitosis hereditaria 1.1.3. Piropoiquilocitosis hereditaria 1.1.4. Estomacitosis hereditaria 1.1.5. Xerocitosis hereditaria 1.2. Membranopata adquirida 1.2.1. Hemoglobinuria paroxstica nocturna 176 176 176 177
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2. Enzimopatas 2.1. Dficit de enzimas de la gluclisis anaerobia 2.1.1. Dficit de Piruvatoquinasa 2.1.2. Dficit de la Glucosafosfato isomerasa (GPI) 2.1.3. Dficit de la Triosafosfato isomerasa (TPI) 2.1.4. Dficit de Hexoquinasa (HK) 2.1.5. Dficit de Fosfofructoquinasa (PFK) 2.1.6. Dficit de Fosfogliceratoquinasa (PGK) 2.2. Enzimopatas del metabolismo xidorreductor 2.2.1. Dficit de Glucosa 6 fosfato deshidrogensa 2.2.2. Dficit de Glutatin sintetasa (GS) 2.2.3. Dficit de Gamma-glutamilcisten sintetasa (GGS) 2.2.4. Dficit Glutatin reductasa (GR) 2.2.5. Dficit de Glutatin peroxidasa (GP) 2.3. Enzimopatas del metabolismo nucleotdico 3. Hemoglobinopatas 3.1. Talasemias 3.3.1. Talasemia 3.3.2. Talasemia 3.3.3. Talasemia 3.3.4. Talasemia 3.3.5. Sndromes hemoglobina Lepore 3.2. Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal 3.3. Hemoglobinopatas estructurales 3.3.1. Nomenclatura 3.3.2. Base gentica de las hemoglobinopatas estructurales 3.3.3. Clasificacin 3.3.4. Variantes de hemoglobina ms comunes Anemias hemolticas extracorpusculares 1. Anemias hemolticas inmunes 1.1. Antignicos eritrocitarios 1.2. Anemias hemolticas aloinmunes 1.2.1. Enfermedad hemoltica del recin nacido 1.2.2. Reaccin hemoltica transfusional 1.3. Anemias hemolticas autoinmunes 1.3.1. AHAI por anticuerpos calientes 1.3.2. AHAI por anticuerpos fros a) Enfermedad de las aglutininas fras b) Hemoglobinuria paroxstica a frigore 1.3.3. AHAI por mezcla de autoanticuerpos fros y calientes, o tipo mixto 1.3.4. AHAI inducida por frmacos 2. Anemias hemolticas no inmunes 2.1. Agentes infecciosos 2.1.1. Parasitosis 2.1.2. Infeccin bacteriana 2.2. Venenos 2.2.1. Veneno de araas
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2.2.2. Veneno de serpientes 2.2.3. Veneno de abejas 2.3. Frmacos oxidantes 2.4. Agentes fsicos 2.4.1. Quemaduras 2.4.2. Radiaciones ionizantes 2.5. Productos qumicos 2.5.1. Arsnico 2.5.2. Cobre 2.5.3. Anhdrido trimetlico
Captulo 9 ANEMIAS POR HEMORRAGIA AGUDA Milton Larrondo L. 1. Introduccin 2. Epidemiologa 3. Fisiopatologa 3.1. Transporte de oxgeno 3.2. Concentracin de hemoglobina y saturacin 3.3. Gasto cardiaco (GC) 3.4. Respuesta fisiolgica a la hemorragia 4. Tratamiento 4.1. Conducta clnica inicial 4.2. Hemorragia aguda y transfusin 4.3. Alternativas a transfusin alognica
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SECCIN III. GLBULOS BLANCOS Captulo 10 LEUCOCITOS Y SISTEMA INMUNE Ivn Palomo G., Jaime Pereira G. y Ulises Vergara C. 1. Introduccin 2. Leucocitos 2.1. Generalidades sobre hematopoyesis 2.2. Linfocitos 2.2.1. Caractersticas generales 2.2.2. Diferenciacin de linfocitos 2.2.3. Reconocimiento antignico 2.2.4. Activacin de los linfocitos 2.3. Sistema fagoctico mononuclear 2.3.1. Monocitos 2.3.2. Macrfagos 2.3.3. Clulas dendrticas
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2.4. Granulocitos 2.4.1. Neutrfilos 2.4.2. Eosinfilos 2.4.3. Basfilos 3. rganos linfoides 3.1 rganos linfoides primarios 3.1.1. Mdula sea 3.1.2. Timo 3.2. rganos linfoides secundarios 3.2.1. Ganglios linfticos 3.2.2. Bazo 3.2.3. Tejido linfoide asociado a mucosa 3.2.4. Amgdalas 4. Trnsito linfocitario
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Captulo 11 ALTERACIONES NO MALIGNAS DE LOS LEUCOCITOS Ivn Palomo G., Flavio Carrin A. y Alejandra King D. 1. Introduccin 2. Alteraciones cuantitativas de los leucocitos 2.1. Neutrfilos 2.1.1. Neutrofilias 2.1.2. Neutropenias 2.2. Eosinfilos 2.2.1. Eosinofilias 2.3. Basfilos 2.3.1. Basofilia 2.4. Monocitos 2.4.1. Monocitosis 2.5. Linfocitos 2.5.1. Linfocitosis 2.5.2. Linfopenia 3. Alteraciones funcionales de los leucocitos 3.1. Alteraciones funcionales de los granulocitos 3.1.1.Defectos de la adhesin 3.1.2.Defectos de la quimiotaxis 3.1.3.Defectos del metabolismo oxidativo 3.1.4.Defecto de los grnulos de los lisosomas 3.2. Alteraciones funcionales de los linfocitos 3.2.1.Defectos en la expresin de molculas MHC 3.2.2.Defectos de activacin y funcin de clulas T 3.2.3.Sndrome hiper IgM ligado al sexo 3.2.4.Inmunodeficiencia comn variable 3.2.5.Deficiencia selectiva de IgA 3.2.6.Deficiencia selectiva de subclases de IgG
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3.3. Alteraciones funcionales secundarias de los leucocitos y en situaciones especiales 3.3.1. Sistema inmune fetal y neonatal 3.3.2. Envejecimiento y sistema inmune 3.3.3. Inmunidad y nutricin 3.3.4. Inmunodeficiencia secundaria a enfermedades crnicas 3.3.5. Inmunodeficiencia secundarias a enfermedades infiltrativas y tumorales 3.3.6. Inmunodeficiencia secundaria a terapia inmunosupresora
Captulo 12 LEUCEMIAS AGUDAS Miriam Campbell B. y Jorge Alfaro L. Introduccin Leucemia linfoblstica aguda 1. Introduccin 2. Patognesis 3. Cuadro clnico 3.1. Aspectos generales 3.2. rganos comprometidos 4. Laboratorio 5. Diagnstico diferencial 6. Clasificacin 7. Factores pronsticos 8. Tratamiento de LLA 8.1. Quimioterapia 8.2. Tratamiento de soporte 8.3. Resultados de tratamiento de LLA 8.4. Complicaciones del tratamiento de la LLA Leucemias mieloides agudas 1. Introduccin 2. Epidemiologa 3. Etiologa 4. Presentacin clnica 5. Clasificacin de las LMA 5.1. Clasificacin segn criterios FAB 5.1.1. Leucemia mieloide aguda con mnima diferenciacin (M0) 5.1.2. Leucemia mieloide aguda sin maduracin (M1) 5.1.3. Leucemia mieloide aguda sin maduracin (M2) 5.1.4. Leucemia promieloctica aguda (M3) 5.1.5. Leucemia mielomonoctica aguda (M4) 5.1.6. Leucemia monoblstica aguda (M5) 5.1.7. Eritroleucemia (M6) 5.1.8. Leucemia megacarioblstica aguda (M7)
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5.2. Clasificacin segn criterios OMS 5.2.1. LMA con alteraciones citogenticas recurrentes 5.2.2. LMA con displasia multilineal 5.2.3. LMA y sndromes mielodisplsicos relacionados a tratamiento 5.2.4. LMA no categorizada 6. Fisiopatologa 6.1. Citogentica de las LMA 6.2. Marcadores moleculares en las LMA 7. Tratamiento 7.1.Quimioterapia 7.1.1. Quimioterapia de induccin 7.1.2. Consolidacin/intensificacin 7.1.3. Mantencin 7.2. Trasplante de progenitores hematopoyticos (TPH) Captulo 13 SNDROMES MIELOPROLIFERATIVOS CRNICOS Guillermo J. Ruiz-Argelles, Guillermo J. Ruiz-Delgado y Guillermo Ruiz-Reyes 1. Introduccin 2. Leucemia granuloctica crnica 2.1. Anatoma patolgica 2.2. Etiopatogenia 2.3. Fisiopatologa y cuadro clnico 2.4. Diagnstico 2.5. Curso, tratamiento y pronstico 2.6. Pronstico 3. Policitemia vera 3.1. Patogenia 3.2. Epidemiologa 3.3. Datos clnicos 3.4. Estudios de laboratorio 3.5. Diagnstico 3.6. Tratamiento 4. Trombocitosis primaria 4.1. Patogenia 4.2. Datos clnicos 4.3. Estudios de laboratorio 4.4. Tratamiento 5. Mielofibrosis con metaplasia mieloide agnognica 5.1. Patognesis 5.2. Epidemiologa 5.3. Datos clnicos 5.4. Estudios de laboratorio 5.5. Tratamiento
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Captulo 14 333 SNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRNICOS Pablo Bertin C-M., Mauricio Ocqueteau T., Alejandro Majlis L. y Carmen Salgado M. Introducccin Leucemia linftica crnica 1. Introduccin 2. Fisiopatologa 3. Clnica 4. Laboratorio 5. Tratamiento 5.1. Tratamiento segn estados de la clasificacin de Rai y Binet 5.2. Estrategias teraputicas 5.3. Criterios de respuesta a tratamiento Linfomas Linfoma de Hodgkin 1. Introduccin 2. Patologa 3. Etapificacin 4. Tratamiento 4.1. Tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, etapa precoz 4.2. Tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, etapa avanzada 5. Valoracin de las masas residuales en la enfermedad de Hodgkin Linfomas no Hodgkin del adulto 1. Introduccin 2. Patogenia 3. Patologa 4. Historia Natural 4.1. Linfomas de bajo grado 4.2. Linfomas de grado intermedio 4.3. Linfomas de alto grado 5. Diagnstico 5.1. Anatoma patolgica 5.2. Citogentica, biologa molecular y citometra de flujo 6. Diagnstico de extensin 7. Tratamiento 7.1. Manejo de los linfomas de bajo grado (LBG) 7.2. Manejo de los linfomas de grado intermedio 7.3. Manejo de los linfomas de alto grado Linfoma no Hodgkin Peditrico 1. Introduccin 2. Epidemiologa 3. Etiologa 4. Clasificacin 334 334 334 334 335 336 337
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5. Clnica 6. Diagnstico y etapificacin 7. Factores pronsticos 8. Tratamiento 8.1. Terapia de apoyo 8.2. Tratamiento especfico Gammapatas monoclonales 1. Introduccin 2. Estudio inmunolgico de las gammapatas monoclonales 2.1. Pesquisa de una protena monoclonal 2.2. Identificacin de una protena monoclonal 2.3. Cuantificacin de inmunoglobulinas 2.4. Viscosidad srica 2.5. Beta-2 microglobulina 2.6. Protena C reactiva 2.7. Interleuquina-6 2.8. Estudios inmunolgicos en orina 3. Gammapata monoclonal de significado incierto 3.1. Aspectos generales 3.2. Evolucin de las MGUS en el tiempo 4. Mielona mltiple 4.1. Conceptos preliminares a) Incidencia b) Patogenia c) Manifestaciones clnicas d) Pronstico 5. Variedades infrecuentes de mielona mltiple y otras gammapatas 5.1. Mieloma indolente 5.2. Leucemia de clulas plasmticas 5.3. Mieloma osteoesclertico 5.4. Plasmocitoma extramedular 5.5. Plasmocitoma seo solitario 5.6. Macroglobulinemia de Waldenstrom (MW) 5.7. Enfermedad de cadenas livianas 5.8. Amiloidosis primaria 5.9. Enfermedad por cadenas pesadas 6. Diagnstico diferencial entre MGUS y MM 7. Tratamiento 7.1. Terapia de apoyo 7.2. Tratamiento citotxico Captulo 15 SNDROMES MIELODISPLSTICOS Juan Tordecilla C. e Ivn Palomo G. 1. Introduccin 2. Clasificacin de los SMD
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3. Patognesis de los sndromes mielodisplsticos 4. Diagnstico 4.1. Alteraciones morfolgicas 4.1.1. Alteraciones citolgicas generales 4.1.2. Alteraciones morfolgicas en los diferentes tipos de SMD 4.2. Alteraciones citogenticas 4.3. Alteracin molecular 4.4. Alteraciones inmunolgicas 4.5. Alteraciones enzimticas 4.6. Cultivos de mdula sea 5. Sndromes mielodisplsticos en pediatra 6. Evaluacin diagnstica de mielodisplasia 7. Tratamiento de los SMD 7.1. Estrategias generales de tratamiento 7.2. Tratamiento de los SMD en pediatra Captulo 16 GENERALIDADES SOBRE TRASPLANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYTICOS Julia Palma B. y scar Gonzlez R. 1. Introduccin 2. Fundamento y objetivos del TPH 3. Tipos de TPH 3.1. TPH alognico 3.2. TPH autlogo 4. Fuente de precursores hematopoyticos 4.1. Progenitores obtenidos de la mdula sea 4.2. Progenitores obtenidos de la sangre perifrica 4.3. Progenitores obtenidos de la sangre de cordn 5. Etapas del TPH 5.1. Planificacin 5.2. Preparacin 5.3. Acondicionamiento 5.4. Trasplante 5.5. Implante 5.6. Recuperacin a corto plazo 5.7. Recuperacin a largo plazo 6. Indicaciones del TPH Captulo 17 TRASPLANTE DE CLULAS TRONCALES DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL DE DONANTES NO RELACIONADOS: TECNOLOGA Y RESULTADOS CLNICOS Pablo Rubinstein 1. Introduccin 2. Ventajas hipotticas del trasplante de sangre de cordn de donantes no relacionados con el receptor
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3. Mtodos 3.1. Recoleccin de sangre de cordn 3.2. Consentimiento informado de la madre 3.3. Identificacin de unidades y especmenes 3.4. Reduccin de volumen 3.5. Exmenes 3.6. Congelamiento y descongelamiento de la sangre de cordn 4. Estudios clnicos 4.1. Datos sobre los pacientes y seleccin de trasplantes 4.2. Anlisis estadsticos 4.3. Prendimiento de los trasplantes de sangre de cordn 4.4. Histocompatibilidad 4.5. Enfermedad Trasplante contra Husped 4.6. Eventos Relacionados al Trasplante 4.7. Recidiva leucmica 4.8. Sobrevida sin eventos negativos 4.9. Avances recientes para mejorar el pronstico, especialmente en adultos 5. Conclusiones Captulo 18 ENFERMEDADES LISOSOMALES E HISTIOCITOSIS Erna Raimann B., J. Francisco Cabello A., Claudio Cruzat C., Carlos Rodrguez-Galindo e Ivn Palomo G. ENFERMEDADES LISOSOMALES 1. Introduccin 2. Enfermedades lisosomales 2.1. Esfingolipidosis 2.1.1.Antecedentes generales 2.1.2. Enfermedad de Gaucher 2.1.3. Enfermedad de Niemann Pick 2.2. Otras Enfermedades lisosomales HISTIOCITOSIS 1. Introduccin 2. Etiologa y epidemiologa de la histiocitosis 3. Ontogenia y fisiopatologa de las clulas histiocticas y dendrticas 4. Morfologa, localizacin e inmunofenotipo de clulas dendrticas e histiocticas 5. Clasificacin de la histiocitosis 6. Afecciones relacionadas con las clulas dendrticas 6.1. Histiocitosis de clulas de Langerhans 6.2. Proceso de clulas dendrticas secundario 6.3. Xantogranuloma juvenil y afecciones asociadas 6.4. Histiocitomas solitarios de clulas dendrticas con fenotipos variables, dendrocitomas.
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7. Afecciones relacionadas con los macrfagos 7.1. Sndromes hemofagocticos 7.2. Retculohistiocitoma y retculohistiocitosis multicntrica 7.3. Enfermedad de Rosai-Dorfman SECCIN IV. HEMOSTASIA Y TROMBOSIS Captulo 19 HEMOSTASIA PRIMARIA Mara Teresa Santos D., Eduardo Aranda L., Juana Valls G. e Ivn Palomo G. 1. Introduccin 2. Aspectos generales de la Trombopoyesis 3. Estructura de las plaquetas 3.1. Membrana de las plaquetas 3.1.1. Glicoprotenas 3.1.2. Receptores no glicoproticos 3.2. Grnulos plaquetarios 3.2.1. Grnulos alfa 3.2.2. Grnulos densos 3.3. Citoesqueleto plaquetario 3.4. Sistema de membrana interno 3.4.1. Sistema canicular abierto 3.4.2. Sistema tubular denso 4. Envejecimiento y remocin plaquetaria 4.1. Fenmenos asociados con el envejecimiento de las plaquetas en la circulacin 4.1.1. Densidad 4.1.2. Contenido granular 4.1.3. Membrana plaquetaria 4.2. Remocin fisiolgica de plaquetas 4.2.1. Mecanismo inmune de remocin plaquetaria 4.2.2. Mecanismos no inmunes de remocin plaquetaria 5. Formacin del trombo plaquetario 5.1. Adhesin y extensin de las plaquetas 5.2. Agregacin plaquetaria 5.3. Secrecin y reclutamiento 5.4. Consolidacin del trombo 6. Secuencia bioqumica de activacin plaquetaria 6.1. Receptores plaquetarios que participan en la transduccin de seales 6.2. Protenas G 6.3. Fosfolipasa C 6.4. Calcio 6.5. Fosfolipasa A2 6.6. Fosforilacin de protenas en las plaquetas 6.6.1. Protena kinasa C 6.6.2. MAP kinasas 6.6.3. Tirosina kinasas 6.6.4. Fosforilacin en tirosina y funcin plaquetaria
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6.6.5. Sealizacin a travs de GPIIbIIIa 6.7. Cinasas lipdicas 6.8. Fosforilacin de protenas e inhibicin plaquetaria 6.9. Reorganizacin del citoesqueleto. Captulo 20 SISTEMA DE LA COAGULACIN Y SISTEMA FIBRINOLTICO Ivn Palomo G., Patricia Fardella B. y Jaime Pereira G. 1. Introduccin 2. Sistema de la coagulacin 2.1. Nomenclatura 2.2. Secuencia clsica de las reacciones 2.2.1. Va intrnseca 2.2.2. Va extrnseca 2.3. Estructura, sntesis y funcin de los factores de la coagulacin 2.3.1. Estructura genrica de las enzimas de la coagulacin 2.3.2. Estructura y activacin de los factores del sistema de contacto 2.3.3. Factores vitamina K dependientes 2.3.4. Factor tisular 2.3.5. Cofactores V y VIII 2.3.6. Complejos macromoleculares 2.3.7. Fibringeno, trombina, factor XIII y formacin de fibrina 2.4. Vida media de los factores 2.5. Sistema de la coagulacin in vivo 2.6. Regulacin del sistema de la coagulacin 2.6.1. Sistema antitrombina III 2.6.2. Sistema de la protena C 2.6.3. Inhibidor de la va extrnseca 2.6.4. Inhibidor de proteasas dependiente de protena Z 2.6.5. Anexinas 3. Sistema fibrinoltico 3.1. Componentes del sistema fibrinoltico 3.1.1. Plasmingeno 3.1.2. Activadores del plasmingeno 3.1.3. Plasmina 3.2. Regulacin del sistema fibrinoltico 3.2.1. PAI-1 y PAI-2 3.2.2. Alfa 2 antiplasmina 3.2.3. Inhibidor fibrinoltico dependiente de trombina Captulo 21 TROMBOCITOPENIAS Y TROMBOCITOPATAS Jaime Pereira G., Diego Mezzano A. y Vicente Vicente G. 1. Introduccin 2. Trombocitopenias 2.1. Trombocitopenias hereditarias 493
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2.1.1. Generalidades 2.1.2. Trombocitopenias amegacariocticas 2.1.3. Trombocitopenia y radio ausente 2.1.4. Sndrome de Wiskott-Aldrich y Trombocitopenia ligada a X 2.1.5. Sndrome velocardiofacial 2.1.6. Enfermedades relacionadas a MYH9 2.2. Trombocitopenias adquiridas 2.2.1. Trombocitopenias por disminucin de la produccin a) Hipoplasia megacarioctica inducida por drogas b) Hipoplasia megacarioctica asociada a infeccin viral 2.2.2. Trombocitopenias por aumento de la destruccin a) Trombocitopenias inmunes a1) Trombocitopenias autoinmunes primarias Prpura trombocitopnico inmunolgico agudo Prpura trombocitopnico inmunolgico crnico a2) Trombocitopenias autoinmunes secundarias Trombocitopenias asociadas al uso de drogas Trombocitopenia inducida por heparina a3) Trombocitopenias aloinmunes Prpura aloinmune neonatal Prpura postransfusional b) Trombocitopenias no inmunes b1) Prpura trombtico trombocitopnico/sndrome hemoltico urmico b2) Trombocitopenia del embarazo b3) Preeclampsia/eclampsia b4) Trombocitopenia asociada a infeccin b5) Trombocitopenia asociada a exposicin a superficies no biolgicas 2.2.3 Trombocitopenia por secuestro esplnico 2.2.4 Trombocitopenia dilucional 3. Trombocitopatas 531 3.1. Trombocitopatas hereditarias 3.1.1. Defectos hereditarios de la adhesin plaquetaria a) Patologa del complejo glicoproteico Ib-IX-V: Sndrome de BernardSoulier y seudo-von Willebrand. a1) Sndrome de Bernard-Soulier (SBS) a2) Sndrome de seudo-von Willebrand b) Patologa de los receptores plaquetarios del colgeno: complejo glicoproteico Ia-IIa, GPVI, GPIV. b1) Patologa del complejo GPIa-IIA b2) Patologa de la GPVI b3) Patologa de la GPIV 3.1.2. Defectos hereditarios de la agregacin plaquetaria: Tromboastenia de Glanzmann 3.1.3. Defectos congnitos de la secrecin plaquetaria: Anormalidades granulares a) Sndrome de las plaquetas grises b) Deficiencia en el almacenamiento de grnulos c) Deficiencia combinada de grnulos y
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d) Alteracin plaquetaria tipo Quebec 3.1.4. Defectos hereditarios en los mecanismos implicados en la transmisin de seales de activacin plaquetaria. a) Defectos en los receptores para agonistas b) Defectos en otros elementos intraplaquetarios implicados en la activacin: protenas G, enzimas efectoras, segundos mensajeros, fosforilacin de protenas. c) Defectos en el metabolismo del cido araquidnico y/o en la produccin de tromboxano A2 3.1.5. Alteraciones congnitas de la actividad procoagulante de las plaquetas 3.1.6. Otras trombocitopatas 3.2. Trombocitopatas adquiridas 3.2.1. Asociadas a enfermedades sistmicas a1) Trombocitopata urmica a2) Anomala funcional de las plaquetas en insuficiencia heptica a3) Alteraciones plaquetarias inducidas por la ciruga con circulacin extracorprea a4) Disfuncin plaquetaria en leucemias, mielodisplasias y disproteinemias 3.2.2. Disfunciones plaquetarias inducidas por drogas y alimentos b1) Aspirina y antiinflamatorios no esteroideos (AINE) b2) Antibiticos -lactmicos b3) Heparina y fibrinolticos b4) Drogas que aumentan la concentracin de cAMP y Cgmp en plaquetas b5) Expansores de volumen b6) Otras sustancias y frmacos
Captulo 22 HEMOFILIAS, ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND Y OTRAS ALTERACIONES HEREDITARIAS DE LA COAGULACIN
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Mario Donoso S., Ivn Palomo G., Carmen Gloria Artigas A. y Jaime Pereira G.
1. Introduccin 2. Hemofilia 2.1. Hemofilia clsica o tipo A 2.2. Hemofilia tipo B 2.3. Diagnstico 2.4. Cuadro clnico y conducta 2.4.1. Conceptos generales 2.4.2. Sangrado en sitios especiales 2.4.3. Rehabilitacin 2.4.4. Procedimientos diagnsticos y teraputicos 2.4.5. Inhibidores 2.5. Terapia de reemplazo 2.5.1. Tipos de terapia de reemplazo 2.5.2. Clculo de dosis del factor a administrar 2.5.3. Forma de administrar el factor deficitario 564 564
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2.6. Terapia gnica 2.7. Terapia asociada 3. Enfermedad de von Willebrand 3.1. Factor von Willebrand 3.1.1. Estructura 3.1.2. Biosntesis y secrecin 3.1.3. Funcin 3.1.4. Regulacin de los niveles sanguneos 3.2. Clasificacin y patologa molecular de la enfermedad de von Willebrand 3.2.1. EvW tipo 1 3.2.2. EvW tipo 2 3.2.3. EvW tipo 3 3.3. Clnica 3.4. Diagnstico 3.4.1. Pruebas de screening 3.4.2. Pruebas especficas 3.4.3. Pruebas para diagnstico de subtipos 3.5. Tratamiento 4. Otras alteraciones hereditarias de la coagulacin 4.1. Alteraciones de fibringeno 4.1.1. Afibrinogenemia 4.1.2. Disfibrinogenemia 4.2. Dficit de factor XIII 4.3. Dficit de protrombina 4.4. Dficit de factor V 4.5. Dficit de factor VII 4.6. Dficit de factor X 4.7. Dficit de factor XI 4.8. Dficit de factor XII 4.9. Dficit de precalicrena 4.10. Dficit de kiningeno de alto peso molecular (HMWK) 4.11. Deficiencia de 2 antiplasmina
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Captulo 23 ALTERACIONES HEMORRAGPARAS ADQUIRIDAS DE LA COAGULACIN Patricia Fardella B. e Ivn Palomo G. 1. Introduccin 2. Coagulacin intravascular diseminada 2.1. Tipos de CID 2.2. Etiologas 2.3. Elementos que gatillan la CID 2.4. Eventos fisiopatolgicos 2.5. Caractersticas clnicas 2.6. Laboratorio 2.7. Criterios diagnsticos 2.8. Tratamiento
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3. Deficiencia de vitamina K 3.1. Causas de deficiencia de vitamina K 3.2. Diagnstico 3.3 Tratamiento 4. Alteraciones hemostticas en enfermedades hepticas 4.1. Enfermedades hepticas y fisiopatologa de la hemostasia 4.1.1. Hepatitis aguda 4.1.2. Enfermedad heptica crnica 4.1.3. Colestasia 4.1.4. Enfermedad heptica neoplsica 4.1.5. Cirugas 4.1.6. Trasplante heptico 4.2. Laboratorio 4.3. Tratamiento 5. Inhibidores adquiridos de la coagulacin 5.1. Inhibidores de factor VIII 5.1.1. Clasificacin 5.1.2. Caractersticas 5.1.3. Deteccin 5.1.4. Tratamiento 5.2. Inhibidores de factor IX 5.3. Inhibidores de factor XI 5.4. Inhibidores de factor V
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Captulo 24 TROMBOFILIAS Jaime Pereira G., Guillermo Conte L. e Ivn Palomo G. 1. Introduccin 2. Trombofilias hereditarias 2.1. Deficiencia de antitrombina III 2.2. Deficiencia de protena C 2.3. Deficiencia de protena S 2.4. Factor V Leiden y resistencia a la protena C activada 2.5. Mutacin G20210A del gen de la protrombina 2.6. Disfibrinogenemias hereditarias 2.7. Deficiencia hereditaria de factor XII 3. Trombofilias adquiridas 3.1. Sndrome antifosfolpidos (SAF) 3.1.1. Anticuerpos antifosfolpidos 3.1.2. Antgenos 3.1.3. Patognesis 3.1.4. Clnica 3.1.5. Diagnstico 3.1.6. Tratamiento
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3.2. Cncer 3.2.1. Molculas procoagulantes 3.2.2. Sistema fibrinoltico 3.2.3. Citoquinas 3.2.4. Interacciones celulares 3.3. Sndromes mieloproliferativos 3.4. Hemoglobinuria paroxstica nocturna 3.5. Sndrome nefrtico 4. Trombofilias por mecanismo mixto 4.1. Hiperhomocisteinemia 4.1.1. Patogenia 4.1.2. Diagnstico 4.2. Aumento de los niveles de factores de la coagulacin 5. Estrategia diagnstica
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Captulo 25 TRATAMIENTO ANTITROMBTICO Jorge Aldunate O. y Mara Jess Vial C. 1. Introduccin 2. Frmacos antiplaquetarios 2.1. Mecanismo de accin de los antiplaquetarios 2.2. Uso de pruebas de laboratorio para el control del tratamiento con antiplaquetarios 2.3. Bases farmacolgicas de los frmacos antiplaquetarios 2.3.1. cido acetilsaliclico 2.3.2. Clopidogrel 2.3.3. Dipiridamol 2.3.4. Eptifibatide 2.3.5. Ticlopidina 2.3.6. Tirofiban 3. Anticoagulantes 3.1. Anticoagulantes parenterales: heparinas 3.1.1. Historia de las heparinas 3.1.2. Composicin qumica de la heparina 3.1.3. Mecanismo de accin de la heparina: Efecto sobre la AT-III 3.1.4. Uso de pruebas de laboratorio para el control del tratamiento con heparina 3.1.5. Farmacocintica de las heparinas 3.1.6. Efectos secundarios y reacciones adversas del uso de heparinas 3.1.7. Contraindicaciones 3.1.8. Indicaciones teraputicas 3.2. Anticoagulantes orales 3.2.1. Generalidades 3.2.2. Mecanismos de accin de los anticoagulantes orales 3.2.3. Frmacos anticoagulantes orales disponibles en Chile 3.2.4. Interacciones de los anticoagulantes orales
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3.2.5. Mecanismos de interaccin farmacolgica 3.2.6. Efectos secundarios de los anticoagulantes orales 3.2.7. Monitorizacin del tratamiento anticoagulante oral 3.2.8. Indicaciones clnicas de la terapia anticoagulante oral 3.2.9. Contraindicaciones de terapia anticoagulante oral 3.2.10. Resistencia a los anticoagulantes orales 4. Frmacos fibrinolticos 4.1. Proceso fibrinoltico 4.2. Uso mdico del proceso fibrinoltico 4.3. Frmacos anticoagulantes fibrinolticos disponibles en Chile. 5. El futuro en el tratamiento antitrombtico
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SECCIN V. LABORATORIO Captulo 26 SANGRE PERIFRICA Y MDULA SEA: MUESTRAS Y VALORES DE REFERENCIA Ivn Palomo G., Marcelo Alarcn L., Claudio Cruzat C. y Eduardo Retamales C. 1. Introduccin 2. Anticoagulantes 2.1. cido etilendiaminotetractico 2.2. Citrato de sodio 2.3. Heparina 3. Recoleccin de sangre perifrica 3.1. Sistemas de recoleccin de muestras 3.2. Tipos de puncin 3.2.1. Puncin venosa 3.2.2. Puncin capilar 3.3. Almacenaje y transporte 3.4. Frotis sanguneo 4. Obtencin de mdula sea 4.1. Aspirado de mdula sea 4.2. Biopsia de mdula sea 5. Tincin de May-Grnwald Giemsa 6. Unidades hematolgicas internacionales 7. Valores de referencia normal
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Captulo 27 663 HEMOGRAMA, MIELOGRAMA Y BIOPSIA DE MDULA SEA Ivn Palomo G., Claudio Cruzat C., Marcelo Alarcn L., Marianela Agurto O. y Eduardo Retamales C. 1. Introduccin 2. Hemograma 2.1. Glbulos rojos 2.1.1. Anlisis cuantitativo 664 664
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a) Hematocrito b) Hemoglobina c) Recuento de glbulos rojos d) Constantes hematolgicas e) Recuentos de reticulocitos f) ndice ictrico g) Velocidad de eritrosedimentacin 2.1.2.Anlisis citolgico a) Alteraciones del tamao b) Alteraciones del color c) Alteraciones en la forma d) Inclusiones intraeritrocitarias 2.2. Glbulos blancos 2.2.1. Anlisis cuantitativos a) Recuento de leucocitos b) Frmula leucocitaria 2.2.2. Anlisis cualitativo a) Neutrfilos b) Linfocitos 2.3. Plaquetas 2.3.1. Anlisis cuantitativo a) Recuento de plaquetas 2.3.2. Anlisis citolgico 2.4. Contadores celulares 2.4.1. Principio de los contadores celulares 2.4.2. Tipos de contadores 2.4.3. Muestra de sangre 2.4.4. Aseguramiento de la calidad 2.4.5. Procedimientos e instrucciones 2.4.6. Fuentes de error 2.4.7. Limitaciones del sistema 2.4.8. Confiabilidad de los resultados 2.4.9. Correlacin con frotis sanguneo 2.5. Recomendaciones para la interpretacin del hemograma 3. Estudio de mdula sea 3.1. Mielograma 3.2. Biopsia de mdula sea 3.2.1. Aspectos generales 3.2.2. Mdula sea normal a) Distribucin de la mdula hematopoytica y celularidad b) Clulas hematopoyticas normales c) Composicin celular de la mdula sea y relacin mieloide/eritroide 3.2.3. Alteraciones estructurales y anormalidades morfolgicas en la biopsia de mdula sea a) Alteraciones generales b) Biopsia de mdula sea en enfermedades hematolgicas especficas
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Captulo 28 ESTUDIO DE LABORATORIO DE ANEMIAS NUTRICIONALES. Ivn Palomo G., Fernando Pizarro A., Manuel Olivares G., Miguel Arredondo O., Marcelo Alarcn L. y Gonzalo Pombo V. 1. Introduccin 2. Mtodos de laboratorio para estudio de las anemias hipocromas 2.1. Etapas de la deficiencia de hierro 2.2. Diagnstico de laboratorio de la deficiencia de hierro 2.3. Diagnstico diferencial 3. Estudio de laboratorio de las anemias megaloblsticas 3.1. Estudio de anemia megaloblstica 3.1.1.Hemograma 3.1.2.Mielograma 3.1.3.Bioqumica srica 3.1.4.Vitamina B12 y cido flico 3.1.5.Prueba teraputica 3.2. Pruebas para diagnstico de anemia perniciosa 3.2.1.Endoscopa con biopsia duodenal 3.2.2.Anticuerpos anti-factor intrnseco 3.2.3.Pruebas de Shilling 3.3. Otras pruebas
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Captulo 29 701 ESTUDIO DE LABORATORIO DE ANEMIAS HEMOLTICAS. Ivn Palomo G., Marcela Vsquez R., Marcelo Alarcn A., Mnica Maldonado R. y Leonor Armanet B. 1. Introduccin 2. Anemias hemolticas intracorpusculares 2.1. Membranopatas 2.1.1. Esferocitosis Hereditaria 2.1.2. Hemoglobinuria paroxstica nocturna 2.2. Enzimopatas 2.2.1. Dficit de Glucosa fosfato deshidrogenasa (G6PD) 2.2.2. Dficit de Piruvato kinasa (PK) 2.3. Globinopatas 3. Anemias hemolticas extracorpusculares 3.1. Anemias hemolticas inmunes 3.1.1. Anemias hemolticas aloinmunes 3.1.2. Anemias hemolticas autoinmunes 3.2. Anemias hemolticas no inmunes Captulo 30 ESTUDIO DE LABORATORIO DE ENFERMEDADES ONCOHEMATOLGICAS Mara Eugenia Legues S., Concepcin Risueo A., Juan Luis Castillo N., Elba Leiva M. e Ivn Palomo G. 1. Introduccin 702 702
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2. Citoqumica 718 2.1. Antecedentes generales 2.2. Seleccin de mtodos citoqumicos 2.2.1. Peroxidasas 2.2.2. Estearasas 2.2.3. Fosfatasas cidas 2.2.4. Fosfatasas alcalinas de los neutrfilos 2.2.5. Tincin de Perls para hierro 2.3. Aspectos especiales 3. Estudio citogentico 720 3.1. Citogentica clsica 3.1.1. Antecedentes generales 3.1.2. Anlisis citogentico a) Fotografa y cariotipo b) Leucemia aguda c) Sndromes mielodisplsicos d) Anemia aplstica e) Leucemia mieloide crnica y otros sndromes mieloproliferativos f) Sndromes linfoproliferativos 3.1.3. Aspectos prcticos 3.2. Hibridacin in situ con fluorescencia 3.2.1. Antecedentes generales 3.2.2. Aspectos metodolgicos 3.2.3. FISH interfsico 3.2.4. FISH en el seguimiento de una enfermedad 3.2.5. Avances relacionados con FISH 4. Biologa molecular 726 4.1. PCR y modificaciones 4.1.1. PCR 4.1.2. RT-PCR 4.1.3. Q-PCR 4.2. Aplicaciones de las PCR en oncohematologa 4.2.1. Leucemias Agudas 4.2.2. Leucemia mieloide crnica 4.2.3. Linfomas no Hodgkin 4.3. Consideraciones 5. Citometra de flujo 732 5.1. Generalidades 5.2. Aplicaciones en el estudio de Leucemias, linfomas y gammapatas monoclonales 5.2.1. Indicaciones mdicas 5.2.2. Toma de muestras para estudios inmunofenotpicos 5.2.3. Almacenamiento y transporte de muestras para estudios inmunofenotpicos 5.2.4. Preparacin de la muestra para un estudio inmunofenotpico 5.2.5. Anlisis segn cuadro clnico 5.2.6. Informe de resultados 6. Inmunoqumica aplicada a Gammapatas monoclonales 737 6.1. Pesquisa y estudio de la protena monoclonal
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6.2. Viscocidad srica 6.3. Beta 2 microglobulinemia 6.4. Inhibidor 1 del activador de Plasmingeno (PAI-1), Fibringeno, Protena C reactiva (PCR) e Interleuquina 6 (IL-6). 6.5. Nuevos marcadores
Captulo 31 ESTUDIO DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES HEMORRAGPARAS. Ivn Palomo G., Blanca Muoz V., Eduardo Retamales C., Olga Panes B., Carmen Gloria Artigas A. y Patricia Hidalgo P. 1. Introduccin 2. Estudio de alteraciones de la coagulacin 2.1. Pruebas de coagulacin 2.1.1.Pruebas de screening 2.1.2.Dosificacin de factores 2.2. Coagulmetros 2.2.1. Tecnologas de coagulmetros 2.3. Control de calidad interno en coagulacin 2.3.1. Fase pre-analtica 2.3.2. Fase analtica 2.3.3. Fase post-analtica 2.4. Control de calidad externo 3. Estudio de la enfermedad de von Willebrand 3.1. Factor von Willebrand (FVW) 3.2. Clasificacin de la Enfermedad de von Willebrand 3.2.1. EvW tipo 1 3.2.2. EvW tipo 2 3.2.3. EvW tipo 3 3.3. Laboratorio 3.3.1. Exmenes bsicos de hemostasia 3.3.2. Exmenes para identificar el tipo EvW 3.3.3. Exmenes para identificar el subtipo de EvW 3.3.4. Exmenes adicionales 4. Estudio de laboratorio de las trombocitopenias inmunes 4.1. Mtodos generales 4.2. Mtodos de pesquisa de Anticuerpos antiplaquetarios 4.2.1.Mtodos de fase I 4.2.2.Mtodos de fase II 4.2.3.Mtodos de fase III 4.2.4.Mtodos para estudiar las trombocitopenias inducidas por drogas 4.3. Biologa Molecular aplicada a las trombocitopenias inmunes 5. Estudio de la funcin plaquetaria 5.1. Principales disfunciones plaquetarias 5.1.1. Desrdenes adquiridos 5.1.2. Desrdenes hereditarios
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5.2. Estudios de laboratorio 5.2.1.Pruebas de screening 5.2.2.Estudios para determinar la causa de la alteracin 5.2.3.Estudio de agregacin plaquetaria 5.2.4.Estudio de secrecin plaquetaria 5.2.5.Estudio de glicoprotenas plaquetarias especficas
Captulo 32 ESTUDIO DE LABORATORIO DE LAS TROMBOFILIAS Ivn Palomo G., Ricardo Forastiero V., Silvia Pierangeli y Jaime Pereira G. 1. Introduccin 2. Trombofilias hereditarias 2.1. Principios de la metodologa aplicada al estudio de trombofilias 2.1.1. Ensayos funcionales 2.1.2. Ensayos inmunolgicos 2.1.3. Ensayos genticos por PCR 2.2. Trombofilias hereditarias 2.2.1. Antitrombina III 2.2.2. Protena C 2.2.3. Protena S 2.2.4. Resistencia a la PC activada 2.2.5. Factor V Leiden 2.2.6. Polimorfismo G20210A del gen de la protrombina 2.2.7. Homocistena plasmtica 3. Anticuerpos antifosfolpidos 3.1. Anticuerpos anticardiolipina 3.2. Anticoagulante lpico 3.3. Otras pruebas de laboratorio
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NDICE ALFABTICO DE MATERIAS
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PREFACIO
Al igual que otras ciencias biomdicas, en la ltima dcada la hematologa ha presentado importantes avances, tanto en el campo de la fisiopatologa y diagnstico, como tambin en las estrategias de tratamiento. Con el propsito de poner esta informacin al alcance de los alumnos de pregrado, postgrado y profesionales, el primer semestre de 2003 iniciamos la edicin del libro docente Hematologa: Fisiopatologa y Diagnstico. En esta iniciativa participan, como autores de captulos, 65 profesionales que trabajan, ya sea como mdicos hematlogos o en importantes laboratorios de hematologa; muchos de ellos son profesores de ctedras de hematologa. Si bien la mayora de los autores son chilenos, doce acadmicos son de Estados Unidos, Espaa, Mxico y Argentina. El libro, constituido por 32 captulos, 782 pginas, 127 figuras y 181 tablas, est estructurado en cinco secciones: Hematopoyesis, Glbulos rojos, Glbulos blancos, Hemostasia y Trombosis, y Laboratorio. La seccin I trata, en dos captulos, la Hematopoyesis; la seccin II se refiere a los eritrocitos, tanto sus aspectos estructurales y funcionales, como a los diferentes tipos de anemia; la seccin III trata los aspectos normales y patolgicos (no malignos y malignos) de los leucocitos; la seccin IV se refiere a los aspectos normales de la hemostasia primaria y secundaria y a las patologas (sndromes hemorragparos y trombosis) tanto hereditarias como adquiridas; finalmente, en la seccin V se presentan los principios y aplicaciones ms relevantes de los mtodos de laboratorios utilizados en el diagnstico de las diferentes patologas hematolgicas. Para dar al libro una estructura simple y hacerlo ms comprensible al alumno de pregrado, algunos temas estn agrupados en un solo captulo, a modo de ejemplo en el captulo 12, Leucemias agudas incluye a la Leucemia linftica aguda y las Leucemias mieloides agudas. Adicionalmente el lector podr encontrar 36 casos clnicos de diferentes enfermedades hematolgicas, preparados por autores de este libro en: ftp://colbun.utalca.cl/ CasosClinicosHematologia/CCHematologia.pdf. Por tratarse de un texto docente, con el propsito de facilitar la lectura, en los captulos se han numerado los subttulos, y en cada uno de ellos se ha incluido, al comienzo, un ndice de captulo y un Resumen; y al final las Lecturas Sugeridas. Con el mismo objetivo, se incluye un ndice alfabtico general de materias. Si bien el texto est escrito en castellano, se usarn algunos trminos y siglas en ingls por lo difundido de su uso, como por ejemplo DNA, RNA y LT helper. Damos las gracias al Prof. Dr. Camilo Larran A., por haber escrito el Prlogo y al Prof. Dr. Arnaldo Toradori C., por presentar el libro en la ceremonia de lanzamiento del mismo.
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Agradecemos a las personas que colaboraron en la edicin del libro: a la correctora de textos, Profesora Mara Cecilia Tapia Castro, por su excelente trabajo profesional; a la alumna de Tecnologa Mdica de la Universidad de Talca, Srta. Brbara Fuentes Y., quien realiz las figuras del libro; a la Diseadora Grfica y Directora de la Editorial, Sra. Marcela Albornoz D., y a la secretaria Hayde Alvarez A., nuestro reconocimiento por su destacada colaboracin en el trabajo de preedicin. Agradecemos tambin a las instituciones que respaldaron nuestro trabajo con su patrocinio: la Sociedad Chilena de Hematologa. Tambin agradecemos a la Universidad de Talca, Pontificia Universidad Catlica de Chile, Universidad de Chile, Universidad de La Frontera, Universidad de Antofagasta, Universidad Andrs Bello, e Instituto de Salud Pblica de Chile. Damos las gracias a la Universidad de Talca, en la persona de su Rector, Prof. Dr. lvaro Rojas Marn, y a la Editorial de esta institucin en la persona del Vicerrector de Extensin y Comunicaciones, Prof. Dr. Pedro Zamorano Prez, por el apoyo otorgado durante el desarrollo de esta obra. Finalmente, expresamos nuestro deseo que este libro sea de utilidad e inters para alumnos y profesionales que deseen conocer algo ms sobre la fisiopatologa y diagnstico de las enfermedades hematolgicas.
Ivn Palomo G. Jaime Pereira G. Julia Palma B.
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PRLOGO
Los problemas hematolgicos que afectan al pas han sido estudiados por diversos grupos de hematlogos, a lo largo de los ltimos 60 aos del siglo XX, en investigaciones fundamentalmente clnicas, que han sido publicadas principalmente en la Revista Mdica de Chile y en la Revista Chilena de Pediatra. En dichas publicaciones se ha aplicado el mtodo cientfico, que es el que permite entender las modificaciones que la enfermedad produce en el organismo afectado por ella; esto ha permitido realizar avances formidables, que un observdor situado a comienzos del siglo no hubiera podido imaginar. Conocer, a travs de la investigacin, los mecanismos que llevan a la enfermedad, parece ser el mejor camino que conduce a realizar un diagnstico y teraputica correctos. Esto es lo que ha llevado a Ivn Palomo, de la Unidad de Hematologa e Inmunologa, Departamento de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa, Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Talca; a Jaime Pereira, del Departamento de Hematologa y Oncologa, Facultad de Medicina de la Pontificia Univesidad Catlica de Chile y a Julia Palma, del Departamento de Pediatra, Facultad de Medicina de la Universidad de Chile y mdica especializada en trasplantes de mdula sea, del Hospital Luis Calvo Mackenna, a editar este hermoso libro, que trata de la fisiopatologa y diagstico en hematologa. A lo largo de la obra se suceden en forma ordenada, sistemtica y profunda las descripciones de las modificaciones fisiopatolgicas de la hematopoyesis, de los eritrocitos, de los leucocitos, de la hemostasis y, finalmente, de los mtodos de estudio ms tiles en la evaluacin y diagnstico de las diferentes enfermedades hematolgicas, completando en total 32 captulos. La primera de las 5 secciones del libro est dedicada a la hematopoyesis y en ella se destaca el rol de la clula troncal hematopoytica ubicada, en el adulto, en la mdula sea y la responsable de la diferenciacin de las diversas estirpes de clulas sanguneas maduras. Se analiza tambin la posibilidad de utilizarla en terapias de reemplazo celular en tejidos que han perdido su funcionalidad o son asiento de neoplasias malignas. La descripcin abarca no slo el uso de la clula troncal hematopoytica, sino tambin el de la clula troncal mesenquimtica. En la segunda seccin, dedicada al eritrocito, se revisa su estructura, fisiologa y metabolismo normales, las caractersticas de la hemoglobina y sus variantes; se describe la anemia y sus consecuencias, tambin los procesos fisiopatolgicos que explican la gran variedad de anemias, su sintomatologa y la manera de diagnosticarlas.
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La fisiopatologa de los leucocitos ocupa la tercera seccin de la obra, que se inicia con una descripcin de stos y del sistema inmune en la que se revisan los diversos tipos de leucocitos, la funcin diferente de los linfocitos, de los granulocitos, del sistema fagoctico mononuclear (monocitos, macrfagos y clulas dendrticas) y el rol de los rganos linfticos primarios y secundarios. Se enumeran, a continuacin, las alteraciones fisiopatolgicas de las afecciones benignas y luego de las malignas, seguidas de una informacin sobre el trasplante de progenitores hematopoyticos y su utilizacin en los procesos hematolgicos tumorales (leucemias y linfomas) y su indicacin en defectos hematolgicos congnitos y adquiridos como la anemia aplstica. La seccin se cierra con una referencia respecto del empleo de las clulas troncales del cordn umbilical y una nota sobre las enfermedades lisosomales e histiocitosis. La cuarta seccin, dedicada a la hemostasis se abre con una exposicin de lo que es la hemostasis primaria y se sigue con el anlisis de la coagulacin sangunea y luego de la fibrinolisis, tal como funcionan en condiciones normales, adentrndose posteriormente en la fisiopatologa de las trombocitopenias, de las trombocitopatas, de la hemofilia, de la enfermedad de von Willebrand y de las enfermedades adquiridas de la coagulacin sangunea. Completan la seccin un anlisis de la trombosis y sus variantes: trombofilias hereditarias y adquiridas y del uso en ellas de la terapia anticoagulante. Crucial en el diagnstico de las enfermedades hematolgicas es el empleo de los mtodos tecnolgicos de laboratorio. La quinta seccin trae una detallada mencin de stos, en la que se exponen las caractersticas citolgicas de la sangre y de la mdula sea y el aporte diagnstico de las diversas tcnicas hematolgicas en la patologa eritrocitaria y leucocitaria, en las enfermedades hemorrgicas y en la trombosis. Lo anterior hace que este libro sea de la mayor utilidad en el mejor conocimiento de la fisiopatologa de los rganos hematopoyticos; entrega un enorme caudal de informacin respecto de lo mucho que ahora se sabe en hematologa. Est escrito por especialistas en los temas abordados y, hecho interesante, la mayora de ellos se ha formado y trabaja en nuestro medio, lo que habla del alto grado de desarrollo que alcanza la hematologa en el pas. Digna tambin de encomio es la contribucin que entregan los especialistas latinoamericanos, a quienes se ha pedido colaboracin. La obra es un texto de consulta indispensable en esta materia para estudiantes, mdicos, tecnlogos mdicos y tambin para hematlogos. Es, ciertamente, el producto de un esfuerzo loable de sus editores y de la Universidad de Talca, que merece ser destacado en lo mucho que vale. Prof. Dr. Camilo Larran Aguirre
Profesor titular Facultad de Medicina Universidad de Chile
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HEMATOLOGA
Ivn Palomo G., Jaime Pereira G., Julia Palma B. Editorial Universidad de Talca, 2005
SECCIN I
HEMATOPOYESIS
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HEMATOLOGA
Captulo
HEMATOPOYESIS
Claudia Sez S. e Ivn Palomo G.
1. Introduccin 2. Mdula sea 2.1. Histologa 3. Clulas troncales hematopoyticas 3.1. Definicin de clula troncal hematopoytica 3.2. Estudio de la clula troncal hematopoytica 3.3. Identificacin y aislamiento de las clulas troncales hematopoyticas 3.4. Heterogeneidad de las clulas troncales hematopoyticas 3.5. Divisin de las clulas troncales hematopoyticas 3.6. Ontogenia de la clula troncal hematopoytica 3.7. Influencia de factores de crecimiento involucrados en la decisin de linaje 3.8. Genes involucrados en la decisin de linaje 4. El microambiente de la mdula sea 5. Granulomonopoyesis 5.1. Estadios madurativos 5.2. Factores de maduracin 6. Eritropoyesis 6.1. Estadios madurativos 6.2. Eritropoyetina 6.3. Gen de EPO 7. Megacariopoyesis 7.1. Estadios madurativos 7.2. Regulacin 8. Linfopoyesis 8.1. Clulas B 8.2. Clulas T 9. Estudio de la hematopoyesis
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RESUMEN
Las clulas sanguneas (glbulos rojos, glbulos blancos y plaquetas) se forman en la mdula sea a partir de clulas pluripotentes, a travs de un proceso finamente regulado. Una caracterstica distintiva del sistema hematopoytico es que las clulas maduras poseen una vida media corta, de modo que la hematopoyesis es, necesariamente, un proceso continuo durante la vida. En mamferos, el sistema hematopoytico comprende una jerarqua de clulas en donde la clula troncal hematopoytica o stem cell, es la base. En un individuo adulto, la clula troncal hematopoytica (CTH) reside en la mdula sea y es responsable del desarrollo de todos los linajes de clulas sanguneas maduras, reflejando su pluripotencialidad, su capacidad de diferenciacin, de proliferacin y de auto-renovacin. Estudios destinados a entender cmo la clula troncal pluripotencial es capaz de auto-renovarse, de desarrollar la capacidad de restriccin de linaje y de adquirir las caractersticas de una clula terminalmente diferenciada, han permitido identificar un gran nmero de factores y genes los que interactan en forma controlada y coordinada con la finalidad de mantener el desarrollo normal de la hematopoyesis. El microambiente en el cual las CTH y clulas progenitoras residen, otorga un entorno adecuado para el desarrollo de la hematopoyesis, proveyendo los factores y molculas necesarias para la diferenciacin, maduracin y eventual emigracin de las clulas a la circulacin. Adems de entender la regulacin del sistema hematopoytico, el conocimiento de la biologa de las CTH es de crucial importancia mdica, debido a su enorme potencial en reemplazos o reparacin de tejidos y eventualmente como vehculo en terapias gnicas. En este captulo se revisan los aspectos ms importantes de la CTH, eritropoyesis, granulopoyesis, linfopoyesis y megacariopoyesis.
1. INTRODUCCIN Las clulas sanguneas (glbulos rojos, glbulos blancos y plaquetas) se originan en la mdula sea mediante un complejo proceso de diferenciacin y maduracin celular. En este proceso denominado hematopoyesis participan varios factores de maduracin. Tambin es fundamental la participacin de las molculas de adhesin celular, presentes en las clulas hematopoyticas, en las clulas del estroma y en la matriz extracelular. Este captulo describir los aspectos fisiolgicos fundamentales de la hematopoyesis y de cada una de las lneas celulares en particular. 2. MDULA SEA La hematopoyesis ocurre en la mdula sea a partir de la segunda mitad del embarazo y en el resto de la vida. La mdula sea se encuentra en la cavidad medular de los huesos largos (principalmente en las epfisis) y en los espacios existentes entre las trabculas de los huesos esponjosos.
2.1. Histologa La mdula sea est for mada por dos importantes compartimientos: vascular y hematopoytico (figura 1-1).
Figura 1-1. Estructura general de la mdula sea. Se destaca el compartimiento vascular (arterias, venas y sinusoides) y el compartimiento hematopoytico.
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Los vasos sanguneos del compartimiento vascular forman un esqueleto estructural en la mdula sea. La sangre que ingresa a la mdula sea lo hace por las arterias nutricias que perforan la difisis a travs de los agujeros nutricios. Estas arterias entran en la cavidad medular y dan origen a la arteria longitudinal central, desde la cual se generan pequeos vasos que irrigan tanto la mdula como el hueso cortical. Las ramas dirigidas a la mdula descargan su sangre a capilares, los cuales vacan en una extensa red de sinusoides. Los sinusoides (45 a 80 mm de dimetro) estn compuestos por clulas endoteliales, una lmina basal y una capa externa de clulas reticular es; estas ltimas cubren aproximadamente el 50% de la superficie endotelial. Estos sinusoides drenan en una vena longitudinal central, que a su vez descarga su contenido en venas que salen del hueso por el conducto nutricio. El pasaje transendotelial de clulas maduras, desde el comportamiento hematopoytico a la sangre ocurre directamente a travs de poros
de migracin transitorios (<4 m de dimetro) que se forman en las clulas endoteliales de los sinusoides. El compartimiento hematopoytico est for mado por los islotes de clulas hematopoyticas de las diferentes lneas celulares (serie eritroblstica, serie granuloctica, serie monoctica serie linfoide y serie megacarioctica), en sus distintos estadios madurativos. En clulas se ubican entre los sinusoides, y entre stos y la cortical del hueso. Adems de las clulas hematopoyticas en la mdula sea tambin existen otras clulas que forman parte del denominado estroma medular. Entre ellas destacan: macrfagos, clulas reticulares y algunas clulas adiposas (figura 1-2). Estas clulas participan activamente en la regulacin de la hematopoyesis secretando citoquinas y factores de maduracin. Adicionalmente los macrfagos fagocitan ncleos expulsados por los eritroblastos ortocromticos al madurar a reticulocitos, clulas alteradas y clulas muertas.
Figura 1-2. Estructura histolgica de la mdula sea. La mdula sea est formada por vasos sanguneos, sinusoides, clulas del estroma y clulas hematopoyticas. Los distintos tipos de clulas se desarrollan en islotes hematopoyticos ubicados a diferente distancia de la pared de los sinusoides, segn el linaje celular.
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Figura 1-3. Esquema de la Hematopoyesis. La clula madre pluripotencial autoperpetuable, da origen a una clula pluripotencial, tambin denominada CFU-ML (Unidad formadora de colonias mieloides y linfoides), de la que se originan: a) el progenitor mieloide (CFU-GEMM), a partir del cual por procesos de maduracin y diferenciacin se originan los granulocitos (neutrfilos, eosinfilos y basfilos), monocitos, eritrocitos y plaquetas; y b) el progenitor linfoide (CFU-L), que despus de un proceso de maduracin y diferenciacin, da origen a los linfocitos T y linfocitos B. Se muestra los puntos de accin de las citoquinas (IL-1, IL-3, IL-6 e IL-7) y factores estimuladores de colonias (CSF) especficos, que participan como factores reguladores de la granulopoyesis y linfopoyesis. EPO, eritropoyetina; TPO, trombopoyetina.
Compartimiento de clulas madres. Las clulas madres o troncales (stem cells) representan menos del 1% de las clulas de la mdula sea. No son identificables morfolgicamente, por lo que deben ser identificadas por el inmunofenotipo (CD34+, CD38-) y adicionalmente (CD90+, CD117+ y HLA-DR-), o ser estudiadas en cultivos in vitro. Las CTH (stem cells) tambin denominadas CFU-ML (Unidad for madora de colonias mieloides y linfoides) dan origen a dos lneas celulares principales, mieloide y linfoide (figura 1-3). En la lnea mieloide, a partir de la CFUGEMM (granuloctica, eritroide, monoctica y megacarioctica) se producen dos diferentes CFU encomendadas, CFU-GM (granulocito, monocito) y CFU-MegE (megacariocito, eritroide); posteriormente se generan las CFUG, CFU-M, CFU-E, CFU-Meg.
Entre los mecanismos de control que regulan las clulas troncales, destacan: clulas del estr oma medular, matriz extracelular (fibronectina, vitronectina, laminina, colgeno), molculas de adhesin (integrinas, superfamilia de las inmunoglobulinas, selectinas), y citoquinas y factores de crecimiento. Actualmente existen varias fuentes de stem cells: mdula sea, sangre perifrica, sangre de cordn umbilical, hgado fetal y sistemas in vitro, siendo la sangre perifrica y de cordn umbilical las ms utilizadas actualmente en el tratamiento con clulas progenitoras. Compartimiento mittico. A partir de las CFU de las lneas celulares especficas antes mencionadas, se generan las primeras clulas reconocibles morfolgicamente de cada lnea celular: mieloblasto en el caso de los
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granulocitos, que posteriormente madurar a promielocito y luego a mielocito etapa en la cual se diferencian las tres lneas especficas de los granulocitos (neutrfilos, eosinfilos y basfilos). Comportamiento de maduracin almacenamiento. Las etapas posteriores de maduracin de los granulocitos corresponden a juveniles, baciliformes y segmentados. Por su parte, la serie monoctica madura en las etapas de monoblasto y monocito. De la CFU-Meg, la lnea megacarioctica se reconoce las etapas de megacarioblasto, megacariocito y plaquetas. En la serie eritr oblstica se reconocen las etapas, proeritroblasto, eritroblasto basfilo, eritroblasto policomatfilo, eritroblasto ortocromtico, reticulocito y glbulo rojo. En la lnea linfoide, a partir de la CFU-L, despus de un proceso de diferenciacin y maduracin se originan los linfocitos B y linfocitos T; estos ltimos requieren una etapa posterior de maduracin en el Timo. 3. CLULAS TRONCALES HEMATOPOYTICAS 3.1. Definicin de clula troncal hematopoytica Dcadas de estudios funcionales realizados en ratones y ltimamente en humanos, han contribuido a la definicin conceptual de la clula troncal hematopoytica (CTH) como una poblacin celular que reside en la mdula sea de un individuo adulto y que es responsable del origen de todo el espectro de clulas sanguneas maduras. Tres propiedades caractersticas de la CTH son, su multi-potencialidad, su capacidad de autorenovacin y de proliferacin. Por lo tanto, una clula troncal hematopoytica puede ser definida como clulas clonognicas que poseen la propiedad de renovarse a s mismas, de proliferar y de diferenciarse hacia todos los tipos de clulas sanguneas. 3.2. Estudio de la clula troncal hematopoytica Con el propsito de comprender la biologa de las CTH, se han desarrollado diversos ensayos tanto in vivo como in vitro. La mayora de estos sistemas permiten estudiar la potencialidad de
las CTH para diferenciarse a clulas sanguneas maduras o a sus precursores. En general, los ensayos in vitro miden la actividad de clulas ms maduras, y los in vivo, generalmente detectan la actividad de clulas ms primitivas, siendo necesario el trasplante o injerto de las clulas a un ambiente adecuado para producir la progenie. Ensayos in vitro Los sistemas de cultivo in vitro se pueden agrupar en dos categoras generales: los independientes de estroma y los dependientes de estroma: a) Cultivo in vitro independiente de estroma. Entre los cultivos de este tipo est el ensayo de unidades de formacin de colonias en cultivo (CFU-C) el cual detecta el crecimiento de clulas hacia una poblacin ms madura, comprometida al linaje eritroide o mieloide. Las colonias emergen luego de 5 a 14 das de cultivo en un medio semi-slido, en presencia de uno o ms factores de crecimiento. Una clula primitiva que posea potencialidad de multilinaje y un alto grado proliferativo en cultivo, es denominada una clula formadora de colonias de alto potencial pr oliferativo (high proliferative potencial colony-forming cell: HPP-CFC). En este caso, es posible observar colonias que se caracterizan por alcanzar un tamao mayor a 0,5 mm de dimetro y por contener varias clulas de la lnea mieloide. Cultivo in vitro dependiente de estroma. Un ensayo que se correlaciona mejor con la actividad de las CTH, es el cultivo dependiente de estroma por largos perodos de tiempo o long-term culture initiating cell (LTC-IC). Las clulas primitivas, cultivadas sobre una capa de clulas estr omales generan pr ogenie aproximadamente a las 12 semanas de cultivo, teniendo la precaucin de remover clulas semanalmente para evitar su sobrecrecimiento. Esta alta capacidad de crecimiento es indicativa de la habilidad de auto-renovacin continua que poseen las clulas primitivas. Ensayos in vivo Uno de los ensayos in vivo ampliamente utilizado, es el de formacin de unidades de colonias en bazo o colony-forming unit-spleen assay (CFU-S), desarrollado en 1961 por Till y McCulloch, el cual se basa en el trasplante de clulas de mdula sea o de bazo en ratones irradiados letalmente. Luego de 8 12 das,
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los bazos de estos ratones se analizan para la deteccin de colonias, llamadas CFU-S8 y CFUS12, respectivamente. Estas colonias representan dos poblaciones diferentes de clulas, las que generaron las CFU-S8 son predominantemente uni-potenciales y estn compuestas primordialmente de clulas del linaje eritroide y las CFU-S12 estn compuestas por varios tipos de clulas mieloides, incluyendo eritrocitos, megacariocitos, macrfagos y granulocitos. Un ensayo ms riguroso para evaluar actividad de CTH es el ensayo de repoblacin por largos perodos de tiempo o long term repopulation assay (LTRA), ya que requiere que las clulas a analizar posean los criterios que definen una CTH. Las clulas donantes son multipotenciales si generan clulas del linaje linfoide (B y T) adems del mieloide; poseen capacidad de auto-renovacin si son capaces de mantener su actividad por periodos de tiempo prolongados y adems, poseen la habilidad de proliferar. En este ensayo, las clulas troncales se trasplantan en ratones que han sido irradiados letalmente para depletar las clulas hematopoyticas endgenas y se evalan a las 8 a 10 semanas post-trasplante. Luego de este periodo se espera que haya ocurrido un reestablecimiento de la hematopoyesis con clulas provenientes de las CTH trasplantadas. La incorporacin de marcadores celulares en las CTH donantes comprueba que las clulas hematopoyticas generadas en el ratn receptor son efectivamente progenie de las clulas trasplantadas. El ensayo de re-trasplante de las CTH en un segundo animal puede ilustrar y cuantificar el proceso de auto-renovacin, propiedad de CTH verdaderas. 3.3. Identificacin y aislamiento de las clulas troncales hematopoyticas Una de las primeras aproximaciones utilizadas para aislar CTH de mdula sea se bas en tcnicas de separacin por densidad y tamao. Ensayos de velocidad de sedimentacin y centrifugacin por gradientes de equilibrio demostraron que las clulas de CFU-S proliferantes poseen un tamao que vara entre 7,3 a 9,2 m de dimetro, en tanto que las clulas no proliferantes son de 7,0 m de dimetro. Enriquecer la obtencin de CTH es requisito para su estudio e identificacin. Una de las estrategias empleadas utiliza drogas que intervienen en el ciclo celular (vinblastina, 5-Fluorouracil, etc.) que
depletan las clulas proliferantes de la mdula sea y enriquecen la poblacin de clulas no proliferantes. A pesar de que esta estrategia enriquece la poblacin de CTH y la actividad de CFU-S, la calidad de las clulas se ve afectada. Un avance importante para la separacin de CTH se logr mediante la utilizacin de la citometra de flujo o fluorescence-activated cell sorter (FACS). Este mtodo utiliza un flujo citomtrico que separa clulas en base a sus caractersticas fsicas tales como tamao o granularidad y adems, por la presencia de marcadores de superficie celular. Anticuerpos especficos, mar cados con molculas fluorescentes, diseados a reconocer protenas de la superficie celular generan un patrn de fluorescencia por la incidencia de un rayo lser, permitiendo su identificacin y subsiguiente separacin. Para la utilizacin de esta tcnica fue necesario la identificacin de protenas que fueran expresadas especficamente en la superficie de la CTH. Uno de los primer os antgenos descubierto fue Thy-1 que se expresa en la superficie de las CFU-S de mdula sea de rata, hgado fetal y, en bajos niveles, en la mdula sea de ratn. En 1982, Muller-Sieburg y colaboradores desarrollaron una estrategia para la separacin de CTH de ratn por FACS basados en un protocolo de seleccin negativa, en el cual utilizaron una mezcla de antgenos expresados en clulas B y T maduras, macrfagos y granulocitos. Combinando esta estrategia y la seleccin de clulas negativas para el antgeno de linaje (Lin neg) y con baja expresin de Thy-1 (Thy-1low), se obtuvieron CFU-S enriquecidas 200 veces. En la actualidad, en ratn se aslan CTH en base a fenotipos Sca-1pos, c-kitpos, Thy-1.1low, linneg, obtenindose un enriquecimiento de 2000 veces para actividad de CTH. Clulas troncales hematopoyticas humanas se aslan comnmente en base a los marcadores de superficie CD34, CD38-, HLA-DR- y bajos niveles de Thy-1 y la ausencia del marcador de linaje Lin. Estas clulas poseen la capacidad de multilinaje en ensayos in vivo e in vitro (LTC-IC) y son capaces de mantener su propiedad de auto-renovacin en ensayos de repoblacin celular en un segundo husped. Funcionalmente, CD34 es importante en la adhesin de las clulas hematopoyticas al estroma de la mdula sea y en la interaccin entre progenitores. El antgeno c-kit es un
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miembro de la familia de los receptores de tirosinas kinasas y el antgeno Sca-1(stem cell activator) y aunque su funcin no est totalmente esclarecida, aparentemente tendra una funcin en activacin celular. Aunque estos marcadores son tiles para la identificacin y purificacin de CTH humanas y murinas, no se ha encontrado una molcula cuya expresin sea definitoria de clula troncal, como lo es por ejemplo, la expresin de globina en clulas rojas. Es as como la expresin de CD34, adems de encontrarse en clulas troncales, se encuentra en endotelio vascular y en algunos fibroblastos y c-kit se expresa en algunas clulas hematopoyticas maduras, tales como mastocitos, megacariocitos, linfocitos pre-B, melanocitos, algunas clulas germinales, cerebro, estmago y testculo. 3.4. Heterogeneidad de las clulas troncales hematopoyticas Las tcnicas de aislamiento de CTH actuales no han permitido an la obtencin de clulas de suficiente pureza de modo que cada una de ellas sea capaz de repoblar el sistema hematopoytico de un ratn. Debido a esto, se ha incorporado el concepto de un compartimiento de clulas troncales que contiene CTH y adems, una poblacin de clulas multipotentes que pueden carecer de la propiedad de auto-renovacin en forma permanente o continua. Utilizando un colorante fluorescente mitocondrial, rodamina-123 (Rho-123), se han identificado CTH con diferentes grados de fluorescencia que corresponden a clulas con distintas actividades de auto-renovacin en ensayos in vivo e in vitro, pero capaces de mantener un cierto grado de multilinaje. De estos estudios se deduce que las CTH que mantienen una extensa capacidad de regeneracin constituyen, probablemente, menos de un 0,01% de las clulas de la mdula sea, con una frecuencia de aproximadamente 1 CTH por 10.000 clulas de la mdula. La habilidad de estas clulas de regenerarse en forma prolongada estara dado por la gran capacidad proliferante de ellas. Esta capacidad per mitira que la CTH cumpla con la extraordinaria funcin de producir clulas sanguneas durante toda la vida de un individuo. En trasplantes de mdula sea, para propsitos teraputicos, es preciso determinar lo que constituye una CTH verdadera, sin embargo, es
quizs ms til funcionalmente considerar la clula troncal como aquella que es capaz de renovarse a s misma y de diferenciarse en clulas hematopoyticas maduras independiente de su grado de pureza. Este concepto de compartimiento de clulas troncales involucra una jerarqua de CTH con capacidad de auto-renovacin y de multilinaje. 3.5. Divisin de las clulas troncales hematopoyticas La generacin continua de clulas sanguneas maduras desde el pool de clulas troncales multipotentes, sin alteracin del tamao de ste, puede lograrse por divisin celular simtrica, asimtrica o ambas en cualquier nivel de la jerarqua hematopoytica. Una de las preguntas es cmo logra la CTH dividirse produciendo dos clulas hijas con diferentes destinos, y si es as, cmo regula esta asimetra. La asimetra puede resultar por procesos extrnsecos o intrnsecos (figura 1-4). En el modelo extrnseco, las clulas hijas son originalmente idnticas, pero adoptan difer entes destinos debido a factores ambientales como por ejemplo, citoquinas (figura 1-4A). En el modelo intrnseco, la clula hija difiere al momento de la divisin debido a una particin desigual de los determinantes del destino celular, tales como factores de transcripcin, receptores celulares o RNA (figura 1-4B). En mamferos, hay pocos ejemplos de
Figura 1-4. Modelos de divisin simtrica versus asimtrica en clulas troncales hematopoyticas. Divisin celular simtrica (A), la cual puede dar como resultado dos clulas troncales hijas (gris) o dos progenitores de linaje restringido (blanco). En este modelo, la clula progenitora debe poseer la capacidad de auto-renovacin para permitir la expansin de un linaje determinado (B) Modelo en que todas las divisiones son asimtricas; este modelo no permite un aumento del tamao del pool de clulas troncales.
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divisin celular asimtrica, siendo la corteza cerebral de la marta un ejemplo. En estos, las clulas progenitoras del tubo neural, pueden dividirse ya sea verticalmente y producir dos clulas hijas idnticas, u horizontalmente para producir una clula hija que permanece en la zona ventricular y una neurona migratoria. En la clula progenitora, el receptor Notch-1 se localiza en la superficie basal de tal modo que en la divisin vertical se segrega solamente a la que se diferenciar a neurona migratoria. En clulas hematopoyticas humanas, mediante la utilizacin de un colorante fluorescente de membrana (PKH26) se ha podido evidenciar divisin celular asimtrica en una CTH proveniente de hgado fetal. Aproximadamente el 30% de las CTH-CD34+ generan una clula hija que permanece sin dividirse (fuertemente fluorescente con PKH26), en tanto que la otra clula hija se divide en forma exponencial per diendo intensidad de fluorescencia. Experimentos de re-cultivo de las clulas fuertemente fluorescentes, demostraron capacidad de auto-renovacin en un porcentaje similar al del cultivo primario con lo que se puede concluir que las clulas CD34+ obtenidas se comportaran como CTH o clulas progenitoras tempranas con capacidad de autorenovacin por divisin celular asimtrica. La bsqueda de mecanismos moleculares que expliquen la divisin celular asimtrica ha llevado a la identificacin de los genes notch como cruciales en la regulacin de la autorenovacin celular versus diferenciacin celular. El producto proteico del gen notch funciona como receptor de superficie celular y adems como factor de regulacin de la transcripcin, con la funcin de transmitir seales del medio ambiente hacia el ncleo de la clula. La activacin de notch inhibe la diferenciacin celular y variaciones en los niveles de expresin del mismo dan como resultado una heterogeneidad de respuesta a la diferenciacin celular. En mamferos, se han identificado cuatro genes homlogos a notch (notch 1-4) y en vertebrados su expresin se ha observado en tejido neuro-epitelial, epidermis, epitelio intestinal y dentario, endotelio, precursores hematopoyticos y estroma. La participacin de notch en hematopoyesis ha sido ampliamente investigada desde su deteccin en clulas CD34+ de mdula sea y en clulas hematopoyticas precursoras. De
hecho, algunas leucemias linfoblsticas T involucran una mutacin en el gen notch-1 resultando en una activacin constitutiva de la protena lo que contribuira a la enfermedad. Estudios recientes han demostrado que las seales a travs de notch pueden inhibir apoptosis, lo que sugiere la posibilidad de que una alteracin de la actividad proteica de notch pueda contribuir a la leucemia por inhibicin de muerte celular, adems o en vez del aumento de proliferacin celular. Las seales de notch pueden ser reguladas a diferentes niveles y un sinnmero de evidencias experimentales involucran a los productos proteicos de los diferentes genes notch en diversas respuestas, no solamente en la capacidad de auto-renovacin celular sino adems en la decisin de linajes de difer enciacin hematopoytica, lo cual dependera de la seal extracelular o ligandos tales como citoquinas o factores de crecimiento. 3.6. Ontogenia de la clula troncal hematopoytica Desde el desarrollo de un animal, el cual comienza con la fertilizacin del ovocito, las clulas se comprometen, progresivamente, a un tipo celular especfico. Las clulas generadas a partir de las primeras divisiones celulares postfertilizacin tienen la capacidad de formar un animal completo, por lo que se les denomina totipotentes. En mamferos, esta capacidad se pierde durante el pre-implante, en la formacin de la blstula en la que se distinguen una capa externa, una capa interna y una masa celular interna de la cual se pueden obtener clulas troncales embrinicas pluripotentes (ES). Durante la gastrulacin se establecen las tres capas germinales, el ecto-, endo- y mesodermo con el consecuente grado de compromiso celular, lo que dar como resultado clulas maduras con funciones especficas con una vida media limitada y baja capacidad de proliferacin, necesitando ser renovadas constantemente. Sin embargo, no todas las clulas maduran a etapas terminales y es posible encontrar clulas en tejidos diferenciados con capacidad proliferativa y de auto-renovacin, las que se denominan clulas multipotentes (figura 1-5). Clulas hematopoyticas (CH) y clulas endoteliales vasculares (CE) son los tejidos que maduran ms tempranamente durante embriognesis y es ampliamente aceptado que ambos tipos celulares comparten precursores
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Figura 1-5. Ontogenia de la clula troncal. Clulas pluripotentes provenientes del endodermo, mesodermo o ectodermo, formados durante la embriognesis, evolucionan a tejidos especficos, clulas terminalmente diferenciadas y clulas troncales multipotentes.
comunes. Durante la embriognesis temprana, estos linajes se forman desde el mesodermo prximo-lateral y evidencias histolgicas sugieren que tanto las CH como las CE se diferencian desde un precursor bi-potente llamado hemangioblasto. Inmediatamente luego de la generacin del mesodermo, las clulas de la regin interna se diferencian a CH y las de la regin externa a CE vasculares. Estudios inmuno-histolgicos han demostrado la expresin de mar cadores de clulas endoteliales tales como CD31 y cadherina (Cadherina-EV) en las clulas de la capa externa y la ausencia de stos en las clulas de la regin interna. Ambos tipos celulares expresan CD34 observndose la aparicin de marcadores especficos para CE y para CH a medida que el proceso de diferenciacin ocurre. Estudios recientes en varias especies de vertebrados sugieren que el sitio primario de hematopoyesis es el mesodermo del saco embrionario. Aunque las clulas troncales hematopoyticas definitivas y primitivas se generan durante embriognesis, an es controversial si la produccin de CTH definitivas ocurre en el mesoderma del saco embrionario o ms tarde durante la embriognesis. Las seales moleculares necesarias para la generacin del sistema hematopoytico en el embrin y en adulto involucran a genes tales como bmp-4 que acta tempranamente
afectando la formacin del mesodermo, al gen para el receptor de tirosina kinasa, flk-1, al gen para el factor de crecimiento transformante, tgf1 y al gen para el factor de crecimiento Stem Cell Leukemia, scl. Un gran nmero de genes parecen participar en la regulacin del desarr ollo de la hematopoyesis a diferentes niveles, ya sea a nivel embriognico o en la hematopoyesis definitiva. Sin embargo, las evidencias sugieren que la hematopoyesis primitiva embrionaria no requiere de CTH definitivas, en tanto que para la hematopoyesis adulta su existencia es crucial. El funcionamiento de la jerarqua hematopoytica adulta requiere de seales adicionales de regulacin que confieran otras propiedades, tales como un alto grado de proliferacin celular, capacidad de autorenovacin y seales relacionadas con la integracin de las clulas a otros tejidos. 3.7. Influencia de factores de crecimiento involucrados en la decisin de linaje La sobrevida y proliferacin de la CTH y de pr ogenitores ms difer enciados est ampliamente influenciada por la accin de diferentes tipos de mediadores, tales como citoquinas, factores de crecimiento, pptidos, molculas de adhesin y la expresin de sus respectivos receptores. Estos cumplen un rol importante en la especificacin de linaje y en la
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deter minacin del destino de las clulas precursoras. En general, tres modelos podran explicar la accin de factores extrnsecos sobre el destino de clulas precursoras (figura 1-6). Es posible que clulas funcionalmente equivalentes, las cuales poseen al menos dos potenciales de linaje, reciban diferentes seales externas y respondan de acuerdo al linaje especificado por la seal (figura 1-6A). Otro modelo propone que la adquisicin de linaje ocurre independiente de las seales extrnsecas
per o que los factores de crecimiento y citoquinas son esenciales para la supervivencia, pr oliferacin o apoptosis de la clula comprometida (figura 1-6B). Un tercer modelo combina los dos anteriores dando como resultado diversas posibilidades. Por ejemplo, la CTH pluripotente genera clulas multipotentes, las cuales son influenciadas por factores externos para comprometer linaje o para pr oliferar y madurar en clulas ya comprometidas (figura 1-6C).
Figura 1-6. Modelos de la accin de factores externos sobre la eleccin de linaje celular. El modelo (A) representa la eleccin de linaje de acuerdo a la especificacin de la seal recibida. En el modelo (B), las seales no determinan el compromiso de linaje pero afectan el destino de la clula comprometida. En el modelo (C) las seales externas afectan a clulas multipotentes determinando su linaje y adems, actan sobre clulas ya comprometidas afectando su maduracin.
Una de las evidencias ms impactantes de la influencia de factores extrnsecos sobre la eleccin de linaje, proviene de experimentos en clulas bi-potenciales obtenidas de colonias de macrfago-granulocitos o granulocytemacrophage colony forming cells (GM-CFC). Al cultivar las GM-CFC en presencia del factor de crecimiento de clula troncal (stem cell factor: SCF), las clulas se diferencian en granulocitos. Sin embargo, al ser cultivadas en presencia de factor estimulador de colonias macrofgico (M-CSF) o de interleuquina-4 (IL4), las clulas se diferencian a macrfagos. Numerosos diseos experimentales destinados a elucidar el rol de factores de crecimiento y citoquinas en el compromiso de linaje pueden
ser encontrados en la literatura, destacndose entre ellos los estudios con animales transgnicos. Un ejemplo, son los experimentos en donde se han alterado los genes que codifican para eritropoyetina (EPO) o su receptor (EPO-R) mediante recombinacin homloga. Al utilizar esta estrategia se obtuvieron ratones con anemia severa carentes de clulas rojas maduras, indicando que las seales dependientes de EPO son requeridas para la difer enciacin y maduracin de clulas eritroides. Sin embargo, en estos ratones no se observa una disminucin significativa de clulas eritroides progenitoras, lo que sugiere que el compromiso eritroide no se ve afectado por la ausencia de EPO y que la accin de este factor sera sobre clulas ya comprometidas.
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Experimentos similares con otras citoquinas relacionadas a linajes y sus receptores, arrojan resultados equivalentes, apoyando el postulado que el compromiso de linaje puede ocurrir en ausencia de las seales particulares. Sin embargo, al igual que en todos los experimentos que utilizan animales transgnicos, no es posible descartar la existencia y la influencia de seales adicionales compensatorias a las especficas, o algn grado de participacin de seales especficas en la decisin de linaje, considerando que las estrategias experimentales no necesariamente reflejan la situacin in vivo en su totalidad. Ejemplos de factores y citoquinas necesarias para la maduracin de ciertos linajes celulares son: Interleuquina-7, crucial en la diferenciacin linfoide, ya sea clulas B o T. Trombopoyetina (TPO), secretada en el hgado, determina el linaje megacarioctico y eritroide. Eritropoyetina (EPO), producida en los riones, aumenta la pr oduccin de eritrocitos. Interleuquina-11 y TPO estimulan la pr oduccin de megacariocitos y su fragmentacin en plaquetas. Factor estimulante de colonias granuloctica-monoctica (GM-CSF), deter minante del linaje granulocitomonocito. Con la participacin del factor estimulador de colonias granulocticas (GCSF), las clulas se diferencian en neutrfilos, en tanto que en presencia de interleuquina-5 se diferencian en eosinfilos. Interleuquina-3 participa en la diferenciacin de la mayora de las clulas blancas, pero tiene un rol prominente en la formacin de basfilos. Factor de estimulacin macrofgico (MCSF), participa en la diferenciacin a monocito a partir de clulas progenitoras granulocticas/macrofgicas. 3.8. Genes involucrados en la decisin de linaje Estudios en humanos destinados a la determinacin de la funcin especfica de factores de crecimiento en la hematopoyesis humana, han empleado tcnicas de manipulacin gnica, ya sea sobre-expresando o disminuyendo la expresin de genes. Un gran nmero de genes se han descrito como reguladores de la decisin y maduracin de un
linaje celular especfico, por lo que a continuacin se describirn aquellos que han arrojado resultados de mayor consistencia. Familia de genes hox Las protenas HOX pertenecen a una gran familia de factores de transcripcin que comparten una secuencia de unin a DNA altamente conservada (homeodomain). Fueron descubiertos en Drosophila y resultaron ser cruciales en la regulacin del desarrollo embrionario nor mal, encontrndose posteriormente que sus anlogos en humanos participan en el desarr ollo de una hematopoyesis normal. En mamferos, se han descubierto 39 genes que se agrupan en cuatro grupos, A, B, C y D, conteniendo cada uno de ellos entre 8-11 genes. Aunque la funcin de las protenas HOX en hematopoyesis es en extremo compleja, las evidencias experimentales indican que los genes hoxb4 estn asociados con la diferenciacin mieloide y los del grupo hoxc con el linaje linfoide. Evidencias in vitro e in vivo indican que HOXB3, HOXB4 y HOXB5 actan sobre progenitores tempranos, probablemente antes de que ocurra la diferenciacin de linaje mieloide y eritroide, y que probablemente HOXB4 es adems importante en la auto-renovacin celular. Por otro lado, HOXB6 y HOXB7 parecen tener una funcin ms tar da en la jerarqua hematopoytica, afectando la diferenciacin granulocito vs monocito. El grupo de genes hoxc participa en eventos relacionados con la diferenciacin linfoide temprana y tarda. Hoxc4, por ejemplo, est presente tanto en progenitores como en linfocitos T y B terminalmente diferenciados, en tanto que hoxc6 est expresado en clulas maduras del linaje T per o no en sus progenitoras. Familia de genes gata Es una familia de factores de transcripcin con dominio de unin al DNA. De ellos, tres miembr os de la familia gata han sido identificados como reguladores de la expresin gnica en clulas hematopoyeticas. GATA-1 est altamente expresado en clulas eritropoyticas, mastocitos y megacariocitos y su expresin es crucial para eritropoyesis primitiva y definitiva. La prdida de gata-1 causa anemia embrionaria
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fatal, debido al bloqueo de la maduracin eritroide. GATA-2 tambin se expresa en clulas eritr oides tempranas, mastocitos y megacariocitos, pero adems, se han observado niveles particularmente elevados en clulas pluripotentes (CTH) y su expresin disminuye a medida que las clulas maduran. La alteracin de los genes gata-2 causa letalidad en tero debido a un defecto en la hematopoyesis temprana, implicndolo en la mantencin de la funcin de la CTH. La expresin de gata-3 es importante en la hematopoyesis de hgado fetal y se requiere para el desarrollo de linfocitos T. Familia de genes pax La familia de genes pax codifica para un grupo de factores de crecimiento que han sido conservados a travs de millones de aos de evolucin y tienen un rol en desarr ollo temprano. Las protenas PAX participan en la regulacin de la organognesis y son un factor clave en la mantencin de la pluripotencialidad de las clulas troncales durante el desarrollo. Mutaciones en los genes pax causan defectos importantes en organismos tan diversos como moscas, ratones y humanos. Uno de estos genes, pax-5, ha sido ampliamente estudiado en hematopoyesis, encontrndose que su expresin es crucial para la determinacin del linaje linfoide B. La inactivacin del gen pax-5 convierte a los linfocitos B comprometidos en progenitores hematopoyticos tempranos multipotenciales, sugiriendo que su expresin es necesaria en forma continua para mantener el linaje linfoide B. A nivel molecular, pax-5 cumple un rol ambivalente, activando la expresin de genes especficos del linaje linfoide B y reprimiendo la transcripcin de genes de un linaje inapropiado. Protenas morfognicas seas Las protenas morfognicas seas o Bone morphogenetic proteins (BMPs) son miembros de la familia de factor de crecimiento transformante- (TGF-). Estas citoquinas regulan la proliferacin celular, diferenciacin, morfognesis y apoptosis celular. Durante embriognesis, estas protenas participan en el desarrollo de tejidos y rganos, en tanto que en tejidos maduros, mantienen la homeostasis tisular. En relacin a hematopoyesis, se ha observado que BMP-4 induce la formacin de tejido embrionario hematopoytico, en tanto que la
presencia de BMP-2 induce un microambiente hematopoytico que contribuye el crecimiento clonognico de progenitores mieloides y linfoides. Adems de los mencionados, otros miembros de la familia TGF- tambin participan con funciones especficas en las diferentes etapas de la hematopoyesis. El continuo inters por entender la regulacin de la hematopoyesis normal, ha llevado a los investigadores a estudiar y descubrir mltiples genes que actan regulando los procesos celulares en los diversos niveles de la jerarqua hematopoytica. Un foco esencial de las investigaciones ha sido la identificacin de genes relacionados con la capacidad de autorenovacin de la CTH. Aunque los estudios realizados no han arrojado an resultados concluyentes, se han postulado algunos genes como esenciales para la funcin de autorenovacin, habilidad particular de las clulas troncales. Un ejemplo es el gen foxd3 necesario para la pluripotencialidad celular. Una mutacin en el gen foxd3 produce embriones de corta supervivencia, en los cuales, se forma parte del saco embrionario pero la masa interna que contiene las clulas que formarn el cuerpo del embrin no se expande lo suficiente como para generar el embrin. Interesantemente, la adicin del gen normal de foxd3 restaura el desarrollo embrionario normal. El gen foxd3, en conjunto con otros identificados anteriormente, oct4, fgf4 y sox2 parecen controlar la pluripotencialidad de las clulas troncales en estadios tempranos de la embriognesis. La participacin de estos genes sobre la capacidad de auto-renovacin de CTH adultas, est an siendo investigada. 4. EL MICROAMBIENTE DE LA MDULA SEA El microambiente de la mdula sea est formado por un endotelio particular y un tejido conectivo estromal, combinado con citoquinas que regulan la compartimentalizacin, proliferacin y diferenciacin de las CTH. Una forma en que el estroma medular contribuye a la hematopoyesis es debido a su alto contenido de matriz extracelular rica en glicosamino-glicanos que une y distribuye factores de crecimientos, tales como el factor estimulante de colonias granulocticamieloctica y diversas citoquinas. En humanos, clulas de la mdula encontradas en relacin al ambiente hematopoytico que no tienen origen hematopoytico son: a) Clulas vasculares de la mdula sea, que incluye clulas endoteliales, abluminales de
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la musculatura lisa, pericitos y clulas parasinusoidales. La hematopoyesis ocurre en los espacios inter-sinusoidales y las clulas sanguneas entran en la circulacin sistmica pasando a travs de las clulas endoteliales y la delgada capa de la membrana basal presente en el lado abluminal. Esto implica una interaccin cercana entre clulas sanguneas y clulas endoteliales, en donde el endotelio participara en la retencin de clulas inmaduras o defectuosas y en la secrecin de factores que afecten el comportamiento de las clulas hematopoyticas. Estas clulas endoteliales, presentes en los espacios inter-sinusoidales, llamadas tambin r eticulocitos poseen extensiones citoplasmticas en ntimo contacto con clulas hematopoyticas y con procesos o extensiones de clulas reticulares presentes en los espacios inter-sinusoidales adyacentes. Las clulas reticulares estn en contacto adems con las clulas de la membrana basal y se ha propuesto que el grado de migracin celular a los sinusoides estara en relacin con esta interaccin. El endotelio, en conjunto con la cubierta reticular, es lo que se conoce como la barrera hemato-medular la que se ha implicado en el flujo de mediadores solubles producidos en otras zonas de la cavidad medular, adems de la regulacin de la migracin celular. b) Clulas del endsteo que incluye fibroblastos. Algunos reportes indican que los primeros intentos de cultivo in vitro de clulas estromales, llamados unidad formadoras de colonias de fibroblastos (fibroblast colony forming units: CFU-F) detectaban clulas del endsteo. Sin embargo, no es claro que este ensayo detecte siempre la misma poblacin o
que la clula for madora de colonia sea fibroblasto. Interesantemente, el cultivo de estas clulas en condiciones adecuadas puede generar clulas seas. c) Adipositos o mdula amarilla no hematopoytica. No est totalmente dilucidado si las clulas adiposas son una poblacin distinta o son derivadas de fibroblastos y clulas reticulares que han acumulado lpidos. Su funcin en la mdula sea es an especulativa. Trentin y colaboradores, fueron uno de los primeros en discutir microambientes y proponer que las clulas estromales estn organizadas en compartimentos. La organizacin de las clulas estromales en estos compartimentos estaran determinando vas de induccin especficas a travs de la cual una clula pluripotente hematopoytica se diferencia. Aunque estos sitios de restriccin de linaje no han sido evidenciado en mdula sea de mamferos, se ha observado un cierto grado de localizacin o gradiente de clulas inmaduras del linaje B en la regin del sub-endsteo. Estudios en ratn, primates y humanos han detectado la produccin de varios tipos de citoquinas en clulas estromales, las cuales pueden ser permanecer unidas a protenas de la matriz extracelular o en componentes de la membrana de clulas estromales de la mdula sea, tales como heparan sulfato, otorgando en el microambiente concentraciones suficientes como para influir en la maduracin y proliferacin de clulas hematopoyticas. Un resumen de la produccin y efecto de citoquinas se expone en la tabla 1-1.
Tabla 1-1: Citoquinas expresadas en cultivo de clulas estromales Citoquina GM-SCF G-CSF M-CSF IL-6 IL-11 IL-7 IL-8 IL-1 SCF TPO SDF-1 MIP-1 TGF- TNF- Expresin constitutiva +/+/+ + + + + ? + + + + + Expresin inducible + + + + ? + + ? + + + +
SDF-1: stromal cell-derived factor. MIP-1: macrophage inflammatory protein. LIF: Leukemia inhibitory factor. FL: flt3 ligand.
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Estudios recientes realizados en preparaciones de mdula sea de ratn, rata y humano, han detectado la presencia de clulas mesenquimticas tr oncales (MSC) o precursores tempranos: clula progenitora adulta multipotente (MAPC) con capacidad pluripotente de diferenciacin. Estas clulas, generalmente positivas para el marcador endotealial/hematopoytico, CD34+ y negativas para el marcador hematopoytico CD45-, al ser cultivadas en forma apropiada son capaces de diferenciarse en clulas neuronales, y tienen la potencialidad de contribuir a la formacin de mltiples tejidos al ser inyectadas en blastocitos para ser utilizados en la generacin de ratones quimricos. Las evidencias actuales resumen la participacin del microambiente medular en hematopoyesis, otorgando a las clulas del sinusoide endotelial un rol en la transmigracin de clulas hematopoyticas maduras hacia la circulacin, en tanto que clulas parasinusoidales con extensiones citoplasmticas regularan la conducta celular, proveyendo citoquinas como mediadores y sitios de anclaje. Estudios recientes indican que clulas de la mdula sea adulta poseen la capacidad de diferenciarse en clulas maduras especficas de diferentes tejidos no-hematopoyticos, incluyendo, hepatocitos, clulas de rin, de pulmn, piel, del tracto gastrontestinal y en miocitos cardiacos y de tejido esqueltico. El conocimiento de las seales que regulan esta plasticidad celular, podra permitir el manejo controlado de la diferenciacin de clulas de la mdula sea hacia clulas terminalmente diferenciadas tejido-especficas lo que otorgara
una herramienta valiosa con un enor me potencial teraputico. 5. GRANULOMONOPOYESIS La granulomonopoyesis es el proceso por el cual se forman, diferencian y maduran los granulocitos (eosinfilos, basfilos y neutrfilos) y las clulas del sistema fagoctico mononuclear (monocitos y macrfagos). Tanto los granulocitos como los monocitos y macrfagos, derivan de clulas llamadas GMCFU. Los granulocitos siguen un patrn similar en su desarrollo en la mdula sea y en su liberacin a la circulacin. 5.1. Estadios madurativos Durante el pr oceso de maduracin y diferenciacin de los granulocitos se observan las siguientes caractersticas citolgicas: (i) reduccin del tamao celular, (ii) adquisicin de granulacin especfica y (iii) segmentacin nuclear. En la mdula sea el compartimiento mittico est for mado por clulas que tienen la capacidad de divisin, compuesto por mieloblastos, promielocitos y mielocitos. El compartimiento de maduracin comprende metamielocitos, baciliformes y segmentados, siendo sta la clula ms madura correspondiente a eosinfilos, neutrfilos o basfilos (figura 1-7).
Figura 1-7. Estadios madurativos de la granulomonopoyesis.
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Los monocitos y macrfagos derivan de la maduracin de las CFU a monoblastos, promonocitos y monocitos, los cuales son liberados a circulacin donde permanecen alrededor de 12 horas, para luego migrar a los tejidos, donde reciben el nombre de macrfagos. 5.2. Factores de maduracin Las CFU tienen la capacidad de formar y desarrollar colonias in vitro en medios de cultivos semislidos, para lo cual requieren la presencia de molculas regulatorias especficas, entre las que destacan citoquinas que actan sobre distintas clulas, dependiendo de la presencia de receptores en la superficie celular. Las principales acciones de estas citoquinas son: (a) mejorar la sobrevida y proliferacin celular, (b) inducir la diferenciacin celular y (c) activar las clulas maduras. El proceso de proliferacin sera estimulado por la participacin de estos factores en el paso de G0 a G l en el ciclo celular. En cultivos celulares, en los cuales se suprime la adicin exgena de estos factores y se bloquea la sntesis endgena de stos, se acelera el proceso de apoptosis, y sera de esta manera como influyen en la sobrevida celular. Entre los CSF involucrados granulomonopoyesis se encuentran: en la
monocitos maduros. Mejora la actividad antitumoral de los monocitos. Existe una forma soluble y una forma biolgicamente activa unida a la membrana. IL-3. Es producida por linfocitos T activados, pero tambin por mastocitos. Estimula el crecimiento y diferenciacin de mltiples linajes, incluyendo granulocitos, macrfagos, megacariocitos, eritrocitos y mastocitos. Pr omueve el crecimiento de clulas relativamente primitivas. Tambin potencia la actividad funcional de eosinfilos, basfilos y monocitos. Stem cell factor. Es una citoquina altamente pleiotrpica con mltiples actividades sobre clulas mieloides y linfoides; tambin sobre clulas no hematopoyticas. Se expresa en una variedad de rganos (hgado, pulmn, rin) y especialmente en cerebelo. Sobre las clulas hematopoyticas, preferencialmente promueve el crecimiento de progenitores celulares relativamente primitivos. Este factor es producido en una forma unida a la membrana y en una forma soluble. Como factor soluble, tiene actividad limitada sobre la formacin de colonias mieloides. FIt-3 ligand. La identificacin de este factor, deriva del reconocimiento de su receptor FIt-3 en humanos. El FIt-3 se expresa en monocitos, pero no en granulocitos. Como factor aislado tiene un modesto efecto proliferativo. El papel FIt-3 es ser un factor sinrgico para las clulas hematopoyticas progenitoras primitivas. Los factores de cr ecimiento, en for ma individual, actan sobre mltiples linajes hematopoyticos y cada linaje puede ser regulado por varios factores. Otra propiedad de muchos factores de crecimiento, es su interaccin sinrgica. Por ejemplo, la mxima produccin de eosinfilos in vitro, requiere la presencia combinada de IL-3 y GM-CSF e IL-5. 6. ERITROPOYESIS La eritropoyesis es el proceso de maduracin de la serie eritropoytica desde proeritroblasto hasta glbulo rojo. 6.1. Estadios madurativos
Factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF). Es secretado por linfocitos T, macrfagos, clulas endoteliales, fibroblastos y una variedad de clulas neoplsicas. Es un factor estimulador de colonias multilinaje, que pr omueve el cr ecimiento de clulas progenitoras pertenecientes a los linajes de neutrfilos, basfilos, eosinfilos y monocitos. Factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). Es secretado por clulas endoteliales, fibroblastos, macrfagos, y clulas neoplsicas. Es un estimulador primario de la proliferacin y diferenciacin de las CFU comprometidas en el linaje de neutrfilos. Adems es un potente activador de neutrfilos madur os, favoreciendo la fagocitosis y quimiotaxis. Factor estimulador de colonias de monocitosmacrfagos (M-CSF). Es un factor de linaje especfico para clulas progenitoras y clulas maduras pertenecientes al linaje monocitosmacrfagos. Tiene efectos sobre la funcin de
Los estadios madurativos con capacidad de mitosis son: proeritroblasto, eritroblasto basfilo y eritroblasto policromtico (doble mitosis). Le siguen los estadios de eritroblasto
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ortocromtico, reticulocito y glbulo rojo. A partir de 1 proeritroblasto se obtienen 16 eritr ocitos (figura 1-8). El proceso de maduracin y diferenciacin eritroblstico se
caracteriza por: (i) hemoglobinizacin progresiva y (ii) reduccin del tamao nuclear, hasta picnosis y expulsin.
Figura 1-8. Estadios madurativos de la eritropoyesis
6.2. Eritropoyetina La eritropoyetina (EPO) es una hor mona glicoproteica de aproximadamente 34 kDa identificada como el regulador humoral de la eritropoyesis. La disminucin del oxgeno en los tejidos (hipoxia) modula los niveles de EPO por un incremento en la expresin del respectivo gen. Normalmente la eritropoyesis ocurre a nivel basal, para reemplazar glbulos rojos envejecidos. Se ve estimulada por disminucin de la tensin de oxgeno en el ambiente, por aumento de la afinidad del oxgeno por la hemoglobina y otros estmulos que disminuyen la liberacin de oxgeno a los tejidos. La EPO es un factor de crecimiento obligatorio desde la etapa de CFU-E hasta el estado eritroblasto basfilo. La produccin de esta hormona aparece primariamente regulada por la demanda de oxigenacin de los tejidos. En adulto la EPO se produce en gran parte por las clulas peritubulares localizadas en la corteza renal, aunque un informe tambin implica las clulas tubulares renales. La hipoxia renal conduce a la liberacin de prostanglandinas, produciendo un incremento en los niveles de AMPc renal que conduce a una reduccin en los niveles de calcio intracelular, lo que intensifica.
En estados de hipoxia severa la produccin de EPO aumenta sobre 1000 veces. La secrecin de hormona circulante en sangre y unida a receptores expresados especficamente en clulas progenitoras eritroides fomentan la viabilidad, proliferacin y diferenciacin terminal de precursores eritroides, resultando un aumento de la masa de los eritrocitos. Seales especficas limitan la expresin del gen EPO a ciertos tejidos; en el feto la EPO es producida principalmente en el hgado y en el rin en una pequea proporcin; en el adulto existe mayor produccin de EPO en el rin y una mnima cantidad en el hgado. Receptor EPO (EPO-R). Se ha demostrado su presencia solamente en clulas eritroides, incluidas CFU-E, BFU-E y levemente en glbulos rojos. Aparecen en una densidad de 200 a 1000 copias por clula, principalmente durante el estadio CFU-E. El receptor EPO-R es una protena de transmembrana de 55 Da ( 301 aminocidos). Es codificado por un gen localizado en el cromosoma 19. 6.3. Gen de EPO El gen que codifica para EPO posee 5 exones y se ubica en el cromosoma 7. Adems de especificidad tisular y seales, la expresin del gen EPO es modulada por agentes fisiolgicos
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y farmacolgicos. La regulacin del gen EPO por hipoxia y otros estmulos ocurre a nivel del mRNA. Tres segmentos no traducidos del gen EPO son altamente conservados en el DNA humano y murino: Promotor. ste contribuye a la inducibilidad del gen EPO por hipoxia. El promotor acta sinrgicamente con la secuencia del enhancer 3 otorgando una induccin de 40 veces en respuesta a hipoxia. Este promotor se encuentra 117 pb ro arriba del sitio de inicio de la transcripcin. Enhancer 3. Es un sitio para DNAsa hipersensitiva, hgado especfica. Se ubica en el extremo 3 del gen. La caracterizacin detallada del enhancer 3 de EPO permiti definir tres sitios que son crticos para la regulacin de la hipoxia: (a) Secuencia
CACGTGGT, ubicada al lado 5' del enhancer; a sta se une factor de transcripcin, Factor1 inducible por a hipoxia (HIF-1), (b) sitio de 7 pb en el enhancer 3 que tiene secuencia CACA el gen humano, y (c) sitio DR-2. La secuencia del tercer sitio en el enhancer EPO es una repeticin de dos sitios y medio del receptor de hormona eritroide separado por 2 pb. Mutaciones en el enhacer inhiben la induccin hipxica de gen EPO. HIF-1. El sitio HIF-1 en el enhancer 3 es el primer elemento en el gen EPO que responde a hipoxia mediante la transcripcin. La hipoxia estimula la unin del factor de transcripcin HIF1 al DNA. HIF-1 es un heterodmero compuesto de una subunidad y una . Bajo condiciones de normoxia la subunidad es rpidamente degradada por la proteosoma ubiquinona. El HIF-1 interacciona con coactivadores transcripcionales como p30 o CBP. (figura 1-9).
Figura 1-9. Regulacin del gen de la eritropoyetina. La figura muestra la estructura del gen EPO el cual posee el enhancer constituido por secuencias que unen protenas tales como HIF-1 y HNF4, las que forman un complejo con una protena de mayor tamao, p30. Posee adems el promotor que es activado por el enhancer cuando existe hipoxia.
La activacin de HIF-1 es modulada por un complejo mecanismo que involucra fosforilacin y localizacin nuclear. Luego de la unin del HIF-1 a secuencias Cis - activas anlogas, se requier e la interaccin con un factor transcripcional adyacente y protenas coactivadoras para la induccin hipxica de la transcripcin. 7. MEGACARIOPOYESIS Las plaquetas circulantes se originan a partir de
los megacariocitos de la mdula sea. Una for ma para estudiar la maduracin megacarioctica es bajo el criterio de la microscopia de luz, segn: razn ncleo/ citoplasma, forma nuclear, basofilia y grnulos citoplasmticos. 7.1. Estadios madurativos El proceso de maduracin megacarioctica, citolgicamente se caracteriza por: (i) poliploida con gigantismo nuclear y (ii) acidificacin del citoplasma.
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Precursores megacariocticos. Se encuentran en 1-4/1000 clulas nucleadas en la mdula sea. Estas no pueden ser distinguidas morfolgicamente de otras clulas diploides. BFU: MK. Requiere 21 das para dar origen a varias colonias con alta celularidad. Es estimulada por IL-1, IL-3 y trombopoyetina (TPO) para originar CFU-MK. CFU-MK. Es un estadio ms maduro; requiere de 10 a 12 das para formar colonias con baja celularidad (LD-CFU-MK)
(figura 1-10). LD-CFU-MK. Da origen a algunas colonias con baja celularidad y alto contenido de DNA, es decir, ha disminuido la multiplicacin celular junto al aumento del proceso de endomitosis.
Las clulas de los estadios BFU-MK y CFU-MK son CD34+, no as las clulas del estadio LDCFU-MK
Figura 1-10. Estadios madurativos de la megacariopoyesis y regulacin. Durante el proceso de trombopoyesis, participan varias citoquinas, como por ejemplo IL-1, IL-3, adems los factores de crecimiento de colonias granulocticas y monocticas (GM-CSF y G-CSF) sobre las clulas progenitoras. A nivel de los estadios reconocibles morfolgicamente actan otras citoquinas como IL-6, IL-11 y TPO, esta ltima responsable de la estimulacin de los megacariocitos maduros para liberar plaquetas a la circulacin.
Megacariocitos. Se distinguen varias etapas de maduracin de los megacariocitos: Megacarioblasto o megacariocito 1. Es la clula de transicin entre los precursores y las clulas reconocibles morfolgicamente. Representa el 5 a 20% de la poblacin megacarioctica en la mdula sea. Es una clula pequea de 18 m de dimetro, mononuclear, expr esa marcador es especficos, pero an no es reconocible morfolgicamente; posee acetilcolinesterasa. En su citoplasma hiperbasfilo se encuentran protenas como FvW, PF4 y GPIIb. Una forma de reconocer esta clula es a travs de la peroxidasa ubicada en el retculo endosplasmtico (RE).
Promegacariocito o megacariocito II. Esta clula es de mayor tamao (20 m de dimetro). Se observa el sistema de demarcacin de membrana (SDM) poco desarr ollado, presenta abundantes ribosomas y el ncleo comienza a lobularse. El ncleo en algunos casos se observa en for ma de herradura, el citoplasma es basfilo y abundante. Representa el 25% de la poblacin megacarioctica en la mdula sea. Megacariocito granular o megacariocito III. Presenta mayor tamao que el estadio anterior (35 m de dimetro). Representa el 56% de la poblacin megacarioctica de la mdula sea. Megacariocito maduro o megacariocito
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IV. Es la clula ms grande de la mdula sea (50-80 m de dimetro), presenta ncleo multilobulado y poliploide, citoplasma acidfilo, con pocas mitocondrias, SDM desarrollado y presencia de grnulos citoplasmticos. La maduracin completa de los megacariocitos demora 10 das en humanos. Los megacariocitos maduros representan el 0.020.05% del total de clulas de la mdula sea. El nmero normal de megacariocitos maduros es de 6.1x 106/ Kg. En el feto, se han encontrado megacarocitos en hgado, bazo y mdula sea. En adulto los megacariocitos se pueden detectar en todos los rganos mayores pero preferentemente en la mdula sea. Durante la maduracin el desarrollo de la ploida est dada por divisiones nucleares sucesivas sin divisin celular (endomitosis); el ncleo se divide a razn de mltiplos de 2 (2N, 4N, 6N, etc.). En el humano, el modelo clsico de ploidia es 16N, con tres ciclos endomitticos. Desde el segundo estado madurativo, con un contenido de 8N, los megacariocitos son capaces de dar origen a plaquetas; dependiendo de la ploida dan origen a plaquetas con distinta forma y densidad. Un megacariocito es capaz de producir entre 1000 y 5000 plaquetas (produccin proporcional a la ploida); el ncleo y citoplasma restante son fagocitados por macrfagos cercanos. La liberacin de plaquetas a la circulacin est explicada por dos modelos: (a) el modelo de proplaquetas en el cual SDM organizara el citoplasma de tal manera que formara un seudopodio, que a travs de los sinusoides se extiende a la circulacin y por efecto de la misma se fragmentara y liberara plaquetas a la sangre y (b) en el segundo modelo, el SDM no organiza el citoplasma pero es igualmente importante, ya que se fragmenta la membrana redundante y se liberan plaquetas. 7.2. Regulacin La regulacin del proceso megacarioctico se realiza por un mecanismo humoral en el que se responde al nmero de plaquetas en circulacin. En este proceso participan varias citoquinas, siendo la ms importante la TPO (o c-MPL ligand), una glicoprotena de 15-48 kDa. Se ha
encontrado mRNA para TPO en el hgado y riones, siendo el primero el lugar de mayor produccin. La TPO es sintetizada en forma constitutiva y liberada a la circulacin segn la unin a su receptor (c-MPL). La TPO presenta un 75% de homologa en la secuencia aminoacdica, con la eritropoyetina, lo que ha permitido postular que se originaron en un gen comn, encontrado en el cromosoma 3. La TPO se une a su receptor c-MPL ubicado en los megacariocitos, estimulando as la maduracin megacarioctica con el consiguiente aumento de ploida y maduracin citoplasmtica. El c-MPL estimula segundos mensajeros que activan la tirosina kinasa JACK2 y la fosforilacin de protenas que activan la trascripcin STAT. Las JACKs tirosinas quinasas de la familia de las JANUS kinasa no tienen actividad tirosina kinasa intrnseca por lo que deben unirse a otras protenas kinasas (PTK). Se ha demostrado que la activacin de JACK lleva a la fosforilacin de protenas estimuladoras y activadoras de la transcripcin (factores de transcripcin), las llamadas STAT; stas una vez fosforiladas pueden translocarse al ncleo de la clula y activar la transcripcin. 8. LINFOPOYESIS 8.1. Clulas B Las clulas B y clulas T presentan un proceso de diferenciacin y maduracin diferente, en el caso de los LB stos maduran en la mdula sea y en el caso de los LT el proceso ocurre en el Timo, ambos llamados rganos linfoides primarios. El proceso de maduracin de los linfocitos B involucra dos etapas, una antgenoindependiente, que ocurre en la mdula sea y otra antgeno-dependiente que ocurre, fundamentalmente, en los rganos linfoides secundarios (ganglios linfticos, bazo y otros tejidos linfoides), lugar en el cual los linfocitos B especficos para un determinado antgeno, toman contacto con ste. En este captulo no referiremos a la primera etapa. Se ha identificado una clula progenitora (linfoide) capaz de diferenciarse especficamente hacia el linaje de las clulas linfoides (clulas B, T y NK). Esta clula progenitora linfoide correspondera al estado ms temprano de diferenciacin linfocitaria, que se caracteriza por una alta actividad mittica. Se requiere en esta
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etapa de alta proliferacin. Posteriormente, y debido a la activacin de un programa gentico especfico las clulas progenitoras linfoides son conducidas hacia la diferenciacin del linaje B. La clasificacin de los siguientes estados de diferenciacin de las clulas B est definido, principalmente, por el rearreglo de los genes de cadena liviana y pesada de las inmunoglobulinas y por la ausencia o presencia de marcadores de superficie celular. Estadio pro-B. No producen inmunoglobulinas y se distinguen por la expresin de los marcadores CD19, CD43 y B220. Estadio pre-B. Ocurre la recombinacin de los genes V-D-J de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas y la sntesis y expresin citoplasmtica de la cadena pesada . Estas clulas no expresan inmunoglobulinas en su membrana, ya que an no sintetizan la cadena liviana (L), y por lo tanto son incapaces de reconocer o responder a antgeno. Posteriormente, algunas de las cadenas H se asocian a una cadena L de reemplazo, molcula estructuralmente similar a la cadena L normal pero que no posee la regin variable de sta. La combinacin de la cadena H con la cadena L de reemplazo constituyen el receptor de clulas pre-B (pre-BCR), el que regulara la sntesis ulterior de las cadenas L y la consiguiente maduracin de los linfocitos B. Linfocitos B inmaduros. Ocurre la recombinacin de los genes VJ de las cadenas livianas y por tanto la sntesis de las cadenas livianas ( las cuales se asocian con la cadena pesada para generar una molcula de IgM en el citoplasma. Estos linfocitos B no pueden generar nuevas regiones variables (de cadenas L o H) en la mdula sea y se les considera funcionalmente inmaduros. De hecho, su encuentro con antgenos propios puede llevarlos a un estado anrgico (inactivacin funcional) o de muerte celular ms que a una activacin. Sin embargo, esta es una importante etapa de seleccin negativa de linfocitos B autorreactivos que eventualmente podran ocasionar enfermedades autoinmunes. Linfocitos B maduros. Los linfocitos B son capaces de co-expresar molculas de IgM y de IgD en la membrana celular, las cuales pueden actuar como receptores especficos para antgeno. En esta etapa los linfocitos adquieren competencia funcional (figura 1-11). Adems de la regulacin gnica mediada por diversos factores de transcripcin y de IL-7, se conoce
que protenas tirosina quinasa de la familia Src y ciertos procesos adhesivos entre los linfocitos B en desarrollo y los elementos del estroma de la mdula sea actan como factores inductores de la diferenciacin de clulas B.
Figura 1-11. Etapas en la maduracin de los linfocitos B.
Los linfocitos B virgen que expresan en su membrana receptores especficos para un determinado antgeno, salen de la mdula sea y entran en la circulacin perifrica. A partir del estado de clulas B inmaduras los linfocitos experimentaran una disminucin en su respuesta a la quimioquina CXCL12 lo que les permitira escapar a la accin reclutadora de este factor y abandonar la mdula sea. En la periferia, los linfocitos B vrgenes migran a los rganos linfoides secundarios donde completarn su proceso de diferenciacin. 8.2. Clulas T Los linfocitos T se originan en la mdula sea a partir de un precursor capaz de migrar al timo, el principal rgano donde se lleva a cabo la diferenciacin de los linfocitos T. Este proceso de maduracin de los linfocitos T en el timo (denominados timocitos en oposicin a los linfocitos T maduros que se encuentran en circulacin), y la generacin del repertorio de receptores de LT puede dividirse en tres etapas: (a) la migracin de los progenitores de la mdula sea al timo, (b) la diferenciacin de estas clulas progenitoras y (c) un proceso de seleccin. Migracin de los precursores de linfocitos T Se postula, que los precursores de clulas T originados en la mdula sea expresaran en su
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superficie receptores de adhesin que se ligaran selectivamente al endotelio tmico permitiendo su entrada al interior del rgano. Uno de estos receptores podra ser la molcula CD34 la interactuara con la molcula L-Selectina presente en el estroma del Timo. Una vez en el timo los precursores de los linfocitos T mantienen una alta capacidad proliferativa. Diferenciacin. Los precursores T ingresan al Timo ubicndose en la zona cortical de ste. A medida que los timocitos migran hacia zonas ms internas de la corteza stos van avanzando en su proceso de diferenciacin. En estados finales de maduracin los linfocitos T pasan desde la corteza hacia la mdula y finalmente salen del timo a la periferia a travs de las vas linfticas o venas. El ambiente tmico representado por las interacciones fsicas que se establecen entre los timocitos y los diferentes tipos celulares que all se encuentran (clulas epiteliales, dendrticas y macrfagos) y los factores solubles que son liberados al medio externo son claves en los procesos de maduracin y seleccin. El patrn diferencial de expresin de ciertas quimioquinas y de sus receptores, en particular CXCL12, CCL17, CCL19, CCL21, CCL22 y CCL25, estara relacionado con la migracin de los timocitos a travs de los diferentes subcompartimentos tmicos. Entre las diferentes citoquinas que las clulas estromales tmicas secretan, se ha identificado a IL-7 como un modulador directo de la sobrevida, diferenciacin, transcripcin y rearreglo gnico del receptor de clulas (TCR). Adems, la diferenciacin de linfocitos T est sometida a un estricto control de expresin gnica mediada por factores transcripcionales tales como GATA-3, E12, E47, HEB, NF-kB, Ikaros y Notch. En base a la expresin de CD4 y/o CD8, la poblacin de linfocitos T en un individuo adulto puede ser dividida en cuatro grupos: los linfocitos T dobles negativos (CD4- CD8-), los dobles positivos (CD4+ CD8+) que representan poblaciones ms o menos inmaduras de linfocitos T y los simples positivos (CD4+ CD8, LT helper y CD4- CD8+, LT citotxicos) que corresponden a las poblaciones ms maduras de linfocitos T. Seleccin tmica. En el timo ocurren dos importantes eventos de seleccin que son centrales en la generacin del repertorio de linfocitos T maduros circulantes. Uno de estos pr ocesos per mite la generacin de autotolerancia eliminando o silenciando aquellos linfocitos T que poseen una alta afinidad por antgenos propios (Seleccin negativa). El
otr o pr oceso de seleccin deriva en la generacin de linfocitos T maduros con un TCR capaz de reconocer el MHC (Complejo Principal de Histocompatibilidad) propio asegurando que la respuesta inmune sea restringida por MHC (Seleccin positiva). Estos eventos de seleccin, que llevan a la produccin de linfocitos T efectivos ocurren en el timo luego de la expresin del TCR, CD4 y CD8 y antes que estas clulas salgan a la periferia. 9. ESTUDIO DE LA HEMATOPOYESIS Varios procedimientos pueden ser utilizadas para evaluar la hematopoyesis: Hemograma. El estudio cuali y cualitativo de las clulas de la sangre perifrica (hemograma) es un primer e importante procedimiento para estudiar el estado de la hematopoyesis (ver captulo 27). Mielograma. El mielograma es el estudio citolgico series: eritroblstica, granuloctica, agranuloctica y megacarioctica) de un aspirado de mdula sea (ver captulo 27). Biopsia de mdula sea. A diferencia del mielograma, en este caso se trata de un estudio histolgico y por tanto puede evaluar tambin la arquitectura medular, pero no puede estudiar los aspectos citolgicos. Ferrocintica. Bsicamente se trata de administracin de Fe59-transferrina y medida de desaparicin del plasma, aparicin de eritrocitos marcadas. Cultivo in vitro de clulas troncales. El estudio de las CTH ha sido descrito en el punto 3.2 y adems tambin se hace mencin en el captulo 2. LECTURAS SUGERIDAS Bokoch, G., Chemoattractant signaling and leucocyte activation, Blood 86(5):1649-1660, 1995. Bono, M.R. Citoquinas en Fundamentos de inmunologa bsica y clnica, Palomo, I., Ferreira, A., Rosemblatt, M., Seplveda, C. y Vergara, U. (Eds). Editorial Universidad de Talca. Captulo 10, 1998. Broudy, V. Stem Cell Factor and Hematopoiesis, Blood 90 (4): 1345-1364, 1997. Bruno, L., Hoffmann, R., McBlane,F., Brown, J., Gupta, R., Joshi, C., Pearson, S., Seidl, T.,
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HEMATOLOGA
Captulo
CLULAS TRONCALES EN LA MDULA SEA

Jos J. Minguell U. y Alejandro A. Erices O.
1. 2. 3. 4. 5.
Introduccin Propiedades de las clulas troncales adultas Clula troncal hematopoytica Clulas troncales mesenquimticas Clulas troncales de la mdula sea y su potencial uso clnico
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RESUMEN
El mejor conocimiento de los mecanismos celulares y moleculares que controlan la autorrenovacin y diferenciacin de las clulas troncales, tanto de origen embrionario como de tejidos adultos, ha permitido profundizar sobre la biologa de este tipo celular tan especial. Pero asociado a esto, se ha visualizado la opcin de su utilizacin en terapias celulares dirigidas a la regeneracin de tejidos u rganos daados o al reemplazo anticipado de tejidos en vas de envejecimiento o con prdida de funcionalidad. Las clulas troncales que existen en la mdula sea, tanto la hematopoytica como la mesenquimtica, son hoy en da objeto de un sinnmero de estudios, tanto a nivel experimental como clnico. Lo anterior debido a su capacidad de multidiferenciacin a varios linajes celulares y adems por expresar una aparente plasticidad, que les permitira la generacin de linajes celulares no convencionales.
1. INTRODUCCIN No slo los tejidos embrionarios, cualquiera sea su estado de desarrollo, sino que tambin los tejidos de un organismo adulto (postnacimiento) presentan clulas troncales. En una condicin de funcionamiento fisiolgico (normal, estado estable) de un organismo adulto, las clulas troncales cumplen la importante funcin de reemplazar la dotacin de clulas diferenciadas que en cada tejido, se pierden por uso o por envejecimiento celular. La capacidad de una clula troncal adulta de diferenciarse a uno o a varios linajes celulares, es el mecanismo por el cual la clula troncal alimenta de clulas especializadas y maduras a los tejidos, rganos y sistemas de un organismo adulto. La mdula sea es el sitio de residencia de al menos dos tipos de clulas troncales multipotentes. La clula troncal hematopoytica origina todas las clulas de la sangre (mieloides/linfoides, eritrocitos y plaquetas). A su vez, la clula troncal mesenquimtica ubicada en el estroma de la mdula sea,
origina tanto linajes considerados mesenquimticos (seo, cartlago, msculo, adiposo y de soporte hematopoytico), como no-mesenquimticos, segn evidencias en modelos experimentales (neural, heptico). La abundante literatura acerca de las propiedades biolgicas de estas clulas troncales de la mdula sea, como la relacionada con las clulas troncales embrionarias, ha sugerido su uso en terapias celulares dirigidas al tratamiento de un vasto repertorio de enfermedades. Es indudable que el intenso trabajo cientfico en curso, en diferentes laboratorios tanto acadmicos como de empresas de biotecnologa, permitir dentro del corto plazo decidir, ajeno a la fuente de obtencin de las clulas troncales (embrionarias o adultas), cul es el tipo ms adecuado para desarrollar una terapia dirigida contra una particular enfermedad. El uso teraputico de la clula troncal hematopoytica no es nuevo, dado que desde la dcada de los 50 viene siendo utilizada exitosamente en la clnica hematooncolgica. A su vez, estudios preclnicos efectuados en los ltimos 3-4 aos han sealado promisorios resultados con la utilizacin de clulas troncales mesenquimticas en varias
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enfermedades. Si embargo, la necesidad de profundizar sobre una serie de aspectos de la biologa de estas clulas troncales, permitir su utilizacin clnica bajo condiciones de mxima seguridad y eficiencia. 2. PROPIEDADES DE LAS CLULAS TRONCALES ADULTAS No slo los tejidos embrionarios, cualquiera sea su estado de desarrollo, sino tambin los tejidos de un organismo adulto contienen clulas troncales (CT). Bajo condiciones de estado estable, las clulas troncales cumplen en un organismo adulto la importante funcin de reemplazar la dotacin de clulas diferenciadas que en cada tejido se pierde por uso o por envejecimiento. Igualmente, en condiciones de dao la regeneracin de un tejido depende de la dotacin de clulas troncales que existen en dicho tejido. De las propiedades de una clula troncal adulta, las ms relevantes son: a) Su capacidad de autogenerarse (selfrenewal) est fuertemente asociada a su condicin de salir del ciclo celular (proliferativo) y permanecer en un estado no proliferativo (G0). Bajo circunstancias de alto requerimiento de clulas maduras (envejecimiento o dao), se generan seales mitognicas y de diferenciacin con lo cual la CT abandona su estado quiescente y reinicia su ciclo celular. Es probable que una de las clulas hijas que han completado el ciclo, regrese a una condicin G0 de modo de mantener y asegurar una dotacin fija de CT durante la vida de la especie, incluso en
condiciones de alta demanda. b) Su capacidad de comprometerse, diferenciarse y madurar hacia uno o varios linajes, para as producir clulas maduras especializadas que alimentan a los tejidos, rganos y sistemas de un organismo adulto. Una propiedad adicional de las clulas troncales adultas, recientemente descrita, se desprende del anlisis referente al dogma, que seala que una clula troncal solo produce las clulas diferenciadas y maduras propias del tejido de residencia. Esto implica, por ejemplo, que la clula troncal hematopoytica que indiscutiblemente reside en la mdula sea solo producir los distintos tipos de linajes celulares que se encuentran en la sangre. Numerosas evidencias generadas en los ltimos 3 aos, han desafiado este dogma al mostrar que el potencial de diferenciacin de una clula troncal es ms vasto y permite la formacin de linajes celulares diferentes a los del tejido de residencia. Este concepto llamado plasticidad de las clulas troncales adultas, sugiere que estas pueden cambiar su destino y comprometerse en la produccin de clulas de otro (s) tejido (s). Aunque la mayora de los estudios sobre plasticidad se han realizado con clulas troncales murinas, es evidente que la extensin de estos estudios a las clulas troncales humanas contribuirn a hacer ms atractivo an, el potencial uso teraputico de estas clulas. Sin embargo, numerosas evidencias han demostrado que la plasticidad de clulas troncales adultas no posee relevancia funcional. Evidencias de plasticidad de las clulas troncales adultas se resumen en la tabla 2-1.
Tabla 2-1. Clulas troncales adultas: algunas evidencias de plasticidad* Clula troncal Hematopoytica Neuronal Muscular Mesenquimtica Tejido convencional Tejido no convencional Referencias
que forma
Clulas de la sangre Nervioso Muscular
que puede formar

Nervioso, epitelial, heptico, Petersen, 1999; Krausse, 2001 msculo esqueltico y cardiaco Sangre, msculo Nervioso, sangre Bjornson, 1999; Galli, 2000 Gussoni, 1999; Jackson, 1999 Koppen,1999; Ito, 2001
seo, cartlago, adiposo, msculo, nervioso, pulmn, estroma hematopoytico,renal
*: revisiones generales sobre el tema: Wulf, 2001; Herzog, 2003; Prockop, 2003.
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3. CLULA TRONCAL HEMATOPOYTICA El inicio de todos los estudios sobre la clula troncal hematopoytica (HSC), lo constituy la demostracin que en la mdula sea de animales adultos existe una clula precursora con capacidad de autorrenovarse y un potencial de diferenciacin hacia todos los linajes celulares de la sangre. Esta clula troncal que existe en pequeas cantidades, se divide, se compromete hacia un linaje particular de diferenciacin y finalmente genera las clulas maduras de la sangre. Esta ordenada secuencia permite mantener la homeostasis y suplir en forma eficiente y rpida la demanda que se produce en situaciones de dao o estrs fisiolgico, como prdida de sangre, infecciones, etc. Las clulas troncales hematopoyticas que presentan las propiedades de autorrenovacin y diferenciacin, no forman una poblacin homognea sino un conjunto de subpoblaciones (stem cell pool). As, se han descrito las siguientes subpoblaciones: (a) la llamada LT-HSC (long-term reconstituting HSC) est formada por clulas que tienen el mayor potencial de autorrenovacin, diferenciacin y de reconstitucin por largos perodos de una hematopoyesis suprimidida, (b) la llamada STHSC (shortterm reconstituting), que es una poblacin intermedia y que slo difiere de la anterior en que las clulas que la forman reconstituyen la hematopoyesis solo por perodos cortos, y (c) un grupo de clulas con baja capacidad de autorrenovacin y con un potencial de diferenciacin restringido a un solo linaje (linfoide, mieloide, eritroide, etc.) A pesar que el mejor ensayo para evaluar la calidad y caractersticas de una HSC es su capacidad de reiniciar la hematopoyesis en un husped mieloablatido (trasplante de mdula sea), existen otras opciones para separar y luego evaluar las propiedades de una HSC. Esquemas de aislamiento utilizando esferas magnticas asociadas con anticuerpos monoclonales y posterior inmunotipificacin para determinar la expresin o no de ciertos clusters de diferenciacin (CDs), permitieron seleccionar clulas que entre otros, no expresan antgenos de linajes maduros (Lin-), pero que s expresan el antgeno mieloide CD45 y el troncal hematopoytico CD34. Estas clulas Lin/CD45+/CD34+/CD38- representan una selecta poblacin de HSC. Con el uso de otras metodologas se ha obtenido una poblacin celular altamente enriquecida en HSC primitivas, equivalentes a LT-HSC. Estas clulas, son
llamadas side population (SP) por su habilidad nica de excluir colorantes especficos y por demostrar en citometra de flujo (FACS) un espectro de emisin nico. Adems de estar presentes en la mdula sea, clulas tipo SP se han encontrado en otros tejidos (msculo, cerebro), lo que ha permitido especular acerca si estas clulas troncales son tejido-especficas o son clulas troncales propias de la mdula sea y que se han anidado (lodgement) en otr os tejidos. Utilizando modelos de hematopoyesis animal se ha establecido que una sola HSC, purificada por los mtodos antes indicados, puede ser capaz de reiniciar una hematopoyesis suprimida en un receptor irradiado letalmente y mantenerla durante la vida del animal. Al momento de la divisin de una HSC, se plantea para las clulas hijas resultantes la toma de decisin entre generar progenitores que mantengan el depsito (pool) de HSC (autorrenovacin) o de generar clulas comprometidas ocurre una divisin simtrica y de este modo se generan dos clulas hijas idnticas que mantengan el depsito de HSC y luego en algn momento de demanda de clulas ocurren divisiones asimtricas que originan clulas capaces de iniciar procesos de compromiso y maduracin. El tema de si las divisiones de una HSC son simtricas, asimtricas o con alternancia simetra/asimetra est abierto y existe evidencia experimental de apoyo a las diferentes opciones. Un rol central en la determinacin de destino (autorrenovacin vs diferenciacin) de una HSC, lo juega el microambiente (nicho) donde esta clula se aloja. Este microambiente es una citoarquitectura dinmica formada por diversas citoquinas, factores de crecimiento, molculas de matriz extracelular altamente organizadas y varios tipos de clulas estromales de la mdula sea Estos nichos ofrecen a la HSC los factores de sobrevida y de autorrenovacin, ya sea por contactos clula-clula, clula-matriz extracelular o indirectos que implican la produccin y secrecin de factores diversos. En la decisin de una HSC hacia autorrenovacin o diferenciacin, la participacin del microambiente como tal y en particular de citoquinas, no ocurre a nivel de la decisin de cul camino seguir sino a nivel de favorecer la sobrevida y la proliferacin de las clulas que se originan. Por otro lado, existen evidencias in vitro que SLF, Flt3L, IL-3, IL-6 o trombopoyetina pueden ser las seales exgenas que gatillen en una HSC el inicio de un ciclo de
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autorrenovacin durante dos o tres mitosis a fin de mantener un nmero ptimo de HSC. Por otro lado, los mecanismos asociados con muerte celular programada (apoptosis), tambin tienen un papel central en regular el destino y muy especialmente el nmero de HSC en la mdula sea. A nivel molecular, un aumento en autorrenovacin de HSC est asociado con una sobreexpresin de HoxB4 y con induccin de mecanismos de sealizacin, va Wnt, Notch o Sonic hedgehog. Las interacciones entre la HSC y el microambiente estromal de la mdula sea son muy dinmicas y necesariamente implican eventos adhesivos y des-adhesivos. La HSC mientras est adherida, particularmente a molculas que forman la matriz extracelular, expresa sus potencial de autorrenovacin y/o de diferenciacin y se mueve o migra por la fina citoarquitectura del estroma. Una clula diferenciada y madura pierde inters por permanecer adherida y por el contrario gana inters en migrar y acercarse al torrente sanguneo. Por lo tanto, asociado al proceso de diferenciacin ocurren procesos de migracin y modulacin de la expresin de receptores o ligandos adhesivos o bien de seales de desadhesin, que finalmente permitirn el egreso de un clula madura desde el espacio estromal hacia el lumen capilar y alcanzar as la circulacin. Sin embargo, la HSC como tal puede migrar desde la mdula sea e ingresar a la circulacin sin que medien decisiones de diferenciacin. As ocurr e durante el desarrollo de la hematopoyesis (migracin secuencial desde el saco vitelino a la mdula sea del recin nacido) y tambin ocurre en condiciones en las cuales se altera el estado estable hematopoytico por drogas mielosupresivas o por infusin de altas dosis de citoquinas o factores de crecimiento. En estos casos los niveles de HSC en sangre aumentan en tiempos relativamente cortos (36 das) desde valores mnimos (preestimulacin) hasta niveles muy elevados. Este fenmeno se utiliza a diario en las clnicas de trasplante para obtener HSC desde la sangre perifrica (peripheral blood stem cells) y ser usadas en trasplantes de clulas troncales hematopoyticas (trasplantes de mdula sea). La capacidad de las HSC de migrar por el estr oma, de hacer movimientos transendoteliales y de circular en condiciones fisiolgicas parece ser un evento fisiolgico bastante frecuente, sin embargo, minimizado por el corto tiempo de permanencia de las HSC
en la sangre. Esta ltima caracterstica de las HCS, explica la alta eficiencia del trasplante de clulas troncales hematopoyticas y tambin el eventual alojamiento y residencia de una HSC en un microambiente diferente al de la mdula sea, desde donde esta clula troncal itinerante pueden contribuir a la formacin de clulas y tejidos no hematopoyticos (plasticidad?). 4. CLULAS TRONCALES MESENQUIMTICAS La mdula sea contiene una segunda poblacin de clulas troncales denominadas clulas tr oncales mesenquimticas (MSC, mesenchymal stem cells). La MSC, reconocida originalmente como fibroblasto de estroma, fue identificada como una clula con capacidad de diferenciarse a clulas del tejido seo. Estudios posteriores demostraron que estas clulas son multipotentes dado que pueden diferenciarse a clulas correspondientes a tejidos mesenquimticos tales como hueso, cartlago, tendn, msculo, tejido adiposo y estroma hematopoytico. De este modo se ha demostrado que, en el organismo adulto, las MSC participan en la homeostasis celular de tejidos mesenquimticos y adems en los procesos de regeneracin/reparacin frente a situaciones de dao. Las MSC no solo se encuentran en el estroma de la mdula sea, sino que tambin en sangre perifrica, hgado fetal y sangre de cordn umbilical. En cultivo, las MSC crecen como clulas adherentes, tienen una mor fologa fibroblastoide y requieren de suero fetal para crecer. La capacidad de estas clulas de crecer in vitro y de poder ser subcultivadas (expansin) es muy alta y depende de factores tales como la edad o condicin de la mdula sea del donante de la cual fueron. Las MSC, despus de moderados ( 5-7) ciclos de subcultivo mantienen su cariotipo, actividad telomerasa y potencial de diferenciacin, sin embargo despus de ser exhaustivamente subcultivadas muestran evidentes signos de senescencia, apoptosis y una prdida en la capacidad de diferenciacin. Las MSC no tienen un perfil antignico exclusivo y su caracterizacin se realiza sobre la base de la expresin de un conjunto de mar cador es los cuales son compartidos con otros tipos celulares (linajes mesenquimticos maduros, clulas endoteliales, clulas epiteliales). Dentro de los marcadores ms representativos y utilizados se destaca la expresin de los antgenos mesenquimticos
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SH2, SH3, SH4, -actina de msculo esqueltico (ASMA) y STRO-1, como tambin la ausencia de marcadores hematopoyticos CD34, CD14 y CD45. Al examinar la progresin de las MSC por el ciclo celular, se ha encontrado que sobre el 90% de estas clulas se encuentran en fase G0/G1 y solo un (10%) en fases S+G2/M. Dentro de la poblacin en G0/G1, se ha determinado que entre un 10-20% de las clulas se encuentran en el estado de quiescencia o G0. Estas clulas corresponden a progenitores mesenquimticos tempramos y no-comprometidos en diferenciacin a los diversos linajes mesenquimticos (real clula troncal mesenquimtica ?). Por otro lado, la mayora de las MSC que estn en ciclo celular corresponden a progenitores mesenquimticos tardos y que han adquirido un compromiso de diferenciacin en alguno de los linajes (figura 2-1).
implica la expresin y/o activacin de factores de transcripcin determinados, tales como Cbfa1 o PPAR para los linajes osteognico y adipognico, respectivamente. A su vez un progenitor comprometido, progresa por esa va de diferenciacin hasta generar el fenotipo maduro debido a que se expresan y/o activan genes y protenas asociadas a la funcin del tejido maduro que la clula diferenciada formar. As, para el linaje osteognico se producirn osteocalcina y osteopontina y para el adiposo se sintetizar la enzima lipoprotein lipasa. A pesar que se conocen muchos inductores para el compromiso y diferenciacin in vitro de las MSC, los factores que operan in vivo no han sido identificados an. Por otro lado, numerosos estudios tanto in vivo como in vitro han demostrado que stas clulas adems de diferenciarse a los tejidos mesenquimticos ya sealados, tambin pueden diferenciarse a clulas de linajes no mesenquimticos (tabla 21). As, estas clulas troncales adultas tambin presentan plasticidad y pareciera por lo tanto que su potencial de diferenciacin es ms amplio que lo inicialmente supuesto. El alto poder expansivo ex vivo de las MSC, junto a su capacidad de ser les confiere un enorme atractivo para ser usadas en terapias biolgicas. Como componente celular del estroma de la mdula sea, la MSC forma parte del proceso hematopoytico. Desde esta perspectiva la MSC contribuye a la conformacin del microambiente hematopoytico, a travs de la produccin tanto de citoquinas y factores de crecimiento (seales solubles) como de molculas de adhesin y matriz extracelular (tabla 2-2). Por lo tanto, se ha planteado que la MSC puede ser un blanco celular atractivo para regular, en forma indirecta la hematopoyesis, como por ejemplo en acelerar y hacer mas eficiente la reconstitucin hematopoytica posttrasplante de HSCH. Otra propiedad muy interesante de las MSC es su capacidad de establecer interacciones con progenitores especficos de clulas efectoras del sistema inmune y modular as su funcin. En el contexto de estas interacciones, la MSC expresa antgenos del complejo principal de histocompatibilidad (HLA: Human leucocyte antigen) de clase I, pero no de clase II, los que s pueden ser expresados frente a estmulos como IFN-. A pesar de la expresin de los antgenos de HLA, las MSC escapan al reconocimiento y no activan linfocitos T alorreactivos en cultivo. Por otro lado las MSC tienen pr opiedades inmunosupresoras mediadas por citoquinas, son capaces de inhibir
Figura 2-1. Jerarqua proliferativa y de diferenciacin de la clula troncal mesenquimtica. En este esquema de diferenciacin los progenitores mesenquimticos se encuentran subdivididos en tres subpoblaciones: clulas troncales mesenquimticas correspondientes a MSC no compr ometidas, pr ogenitores mesenquimticos comprometidos con un linaje mesenquimtico y clulas maduras. Los progenitores comprometidos han sido denominados como unidades formadoras de colonias (CFU) y su potencial de diferenciacin por S, estroma hematopoytico; O, osteoblastos; C, condrocitos; T, tenocitos; A, adipocitos; skM, clulas de msculo esqueltico; smM, clulas de msculo liso; cM, clulas de msculo cardiaco; As, astrocitos; Ol, oligodendrocitos y N, neuronas. El esquema ha sido estructurado en base a estudios con cultivos expandidos de clulas progenitoras mesenquimticas de la mdula sea adulta (Adaptado de Minguell 2001).
La proliferacin o mantencin de las MSC, segn sea su grado de compromiso, es regulada por varios factores de crecimiento como PDGF, TGF1, EGF y FGFs. El compromiso de una MSC a seguir un camino particular de diferenciacin
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la proliferacin de linfocitos T activados y de reducir la incidencia de enfermedad injerto contra husped. Estas observaciones apoyan el
uso de MSC alogeneicas, con fines inmunomodulador es en pacientes no compatibles.
Tabla 2-2. Clulas troncales; mesenquimticas: expresin de citoquinas y sus receptores y de componentes de matriz extracelular Tipo de protena Componente especfico
Citoquinas y factores IL-1a, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-27, LIF, SCF, Flt-3 ligando, GM-CSF, de crecimiento G-CSF, M-CSF. Receptores Molculas de adhesin Matriz extracelular IL-1R, IL-3R, IL-4R, IL-6R, IL-7R, IL-10R, IL-13R, IL-17R, LIFR, SCFR, G-CSFR, IFNR, TNFIR, TNFIIR, TGFIR, TGFIIR, bFGFR, PDGFR, EGFR. v3, v5, 1, 2, 3, 5, v, 1, 3, 4, ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, ALCAM-1, LFA3, L-selectina, endoglina, CD44. Colgenos I, II, IV, V, VI, fibronectina, laminina, proteoglicanos, hialuronato.
*: revisiones generales sobre el tema: Prockop, 1997, Minguell, 2001
5. CLULAS TRONCALES DE LA MDULA SEA Y SU POTENCIAL USO CLNICO La abundante literatura acerca de las propiedades biolgicas de las clulas troncales, ajeno a su origen embrionario o adulto, demuestra que algunas de estas propiedades han sido utilizadas para el desarrollo de estrategias de terapias celulares, muchas de las cuales ya estn en avanzadas etapas de estudios clnicos. As, el uso de CT adultas se visualiza en el desarrollo de terapias celulares dirigidas
al tratamiento de procesos regenerativos, de un vasto repertorio de enfermedades y muy probablemente en ofrecer al paciente una mejor calidad de vida con una ms prologada expectativa de subsistencia libre de enfermedad. En la tabla 2-3, se indican algunas de las opciones teraputicas asignadas a las clulas troncales adultas. Es interesante destacar que en la mayora de las terapias indicadas, la clula troncal asociada es una clula residente de la mdula sea.
Tabla 2-3. Posibles usos teraputicos de clulas troncales adultas Clula troncal o progenitores relacionados Neuronal Musculares cardiacas Productoras de insulina Mesenquimticas Hematopoyticas Hepticas Epiteliales (piel) Retina Dentales Sangre cordn umbilical Enfermedad blanco Parkinson, Alzheimer, dao mdula espinal, esclerosis mltiple, apopleja Infarto miocardio, fallas cardiacas congestivas Diabetes Osteoartritis, distrofia muscular, osteoporosis Cncer, inmunodeficiencias, leucemias, enfermedades hematolgicas hereditarias Hepatitis, cirrosis Quemaduras severas, cicatrizaciones, folculo piloso Degeneracin mcula Estructuras dentales Terapias in tero Referencias Schwarz, 1999; Magavi, 2000; Kondo T, 2000 Beltrami, 2001; Rosenthat, 2001, Siminiak, 2003 Serup, 2001 Young, 1998; Cancedda, 2003 Ikehara, 2001 Shafritz,2000; Starin, 2000; Muraca, 2003 Toma, 2001; Oshima, 2001 Tropepe, 2002 Gronthos, 2000 Ende, 2001
*: revisiones generales sobre el tema: Johansson, 2003; Burt, 2003; Marty, 2003; Byrne, 2003; Hirani, 2002.
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Si bien es cierto que an falta mucha informacin sobre la biologa de las CT, no cabe duda que el intenso trabajo cientfico en curso permitir dentro del corto plazo identificar aquellos aspectos celulares o moleculares que an son contradictorios o desconocidos. Por otro lado, dada la notable velocidad con que la informacin generada en los laboratorios cientficos se ha trasladado a la clnica mdica, en muchos se ha decidido meter en una caja negra aquellos datos bsicos no definitivamente establecidos y avanzar con la implementacin de una terapia en particular, en beneficio de los pacientes que puedan recibirla. Entre aquellos aspectos, an no totalmente establecidos, se mencionan los siguientes: (a) determinar para cada caso la va ms adecuada para hacer ingresar la CT al paciente (implante vs trasplante), (b) determinar el perfil de histocompatibilidad y las respuestas inmunognicos que genera una CT alogeneica, (c) las CT estn normalmente presentes en bajas cantidades en los diferentes tejidos u rganos, por lo tanto ser necesario perfeccionar los sistemas de expansin ex vivo manteniendo sus propiedades de no comprometidas y no diferenciadas, (d) definir opciones para su uso en enfer medades agudas, donde probablemente no se dispondr de tiempo suficiente para efectuar las manipulaciones tendientes a su obtencin y expansin, (e) definir estrategias para el uso de CT en enfermedades genticas, (f) determinar la calidad biolgica de CT de pacientes adultos en cuanto a acumulacin de dao o de evidencias de senescencia (largo de telmeros) y finalmente, (g) ser la utilizacin de CT en terapias celulares un privilegio nico de pacientes de pases desarrollados o ser factible implementar o transferir tecnologas para que pacientes de pases en desarrollo tambin se beneficien?. LECTURAS SUGERIDAS Ailhaud, G. Extracellular factors, signalling pathways and dif ferentiation of adipose precursor cells. Curr Opin Cell Biol., 2:10431049,1990. Angelopoulou, M., Novelli, E., Grove, J.E., Rinder, H.M., Civin, C., Cheng, L., Krause, D.S. Cotransplantation of human mesenchymal stem cells enhances human myelopoiesis and megakaryocytopoiesis in NOD/SCID mice. Exp Hematol., 31:413-420, 2003.
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Agradecimientos
Varnum-Finney, B., Xu, L., Brashem-Stein, C., Nourigat, C., Flowers, D., Bakkour, S., Pear, W.S., Bernstein ID. Pluripotent, cytokine-dependent, hematopoietic stem cells are immortalized by constitutive Notch1 signaling. Nat Med ., 6:1278-1281, 2000. Wagers, A.J., Sherwood, R.I., Christensen, J.L., Weissman, I.L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science., 297: 2256-2259, 2002.
Este trabajo se realiz con financiamiento de los proyectos Fondecyt # 1010566 y # 1030304.
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HEMATOLOGA
SECCIN II
GLBULOS ROJOS
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HEMATOLOGA
Captulo
GLBULOS ROJOS Y HEMOGLOBINA

Ivn Palomo G., Santiago Orizola G., Jaime Rodrguez C. y Ricardo Hojas B.
1. Introduccin 2. Estructura de los glbulos rojos 2.1. Membrana eritrocitaria 2.1.1. Protenas integrales 2.1.2. Protenas perifricas 2.1.3. Molculas de adhesin 3. Metabolismo de los hemates 3.1. Gluclisis anaerobia 3.2. Metabolismo xido-reductor (va de las pentosas o hexosamonofosfato) 3.3. Metabolismo nucleotdico 3.4. Sistema de diaforasas 4. Hemoglobina 4.1. Estructura de la Hb 4.1.1. Estructura primaria a cuaternaria 4.1.2. Hemo 4.1.3. Tipos de hemoglobinas 4.1.4. Ontogenia de la hemoglobina humana 4.2. Funcin de la hemoglobina 4.2.1. Transporte de oxgeno 4.2.2. Descarga de oxgeno a los tejidos 4.2.3. Mecanismo de carga de oxgeno 4.2.4. Interaccin hemo-hemo 4.2.5. Sistema tampn 4.2.6. Transporte de CO2 4.2.7. Interaccin con aniones inorgnicos 4.2.8. Interaccin con fosfatos orgnicos 5. Destruccin de los hemates
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RESUMEN
Los glbulos rojos son clulas anucleadas que se forman en la mdula sea a partir de stem cells. Una vez en la circulacin tienen como principal funcin transportar oxgeno a los tejidos, tarea que desarrollan por aproximadamente 120 das, hasta que el sistema fagoctico mononuclear los retira de la circulacin. En este captulo se revisa la estructura de los eritrocitos (especialmente de su membrana), sus principales vas metablicas, y la estructura y funcin de la hemoglobina (Hb). El conocimiento sobre la estructura de la membrana, enzimas y Hb de los hemates es necesario, entre otros aspectos, para entender las anemias hemolticas intracorpusculares (ver captulo 8).
1. INTRODUCCIN Los glbulos rojos tienen como funcin principal y utilizando su protena ms abundante, la Hb, transportar el oxgeno desde los pulmones a los tejidos. Dicho de otra manera la misin de los hemates es proteger y transportar la Hb para que sta pueda realizar su funcin respiratoria. Para ello, tanto el ncleo como las estructuras citoplasmticas han sido reemplazadas por una solucin concentrada de Hb, en la que tambin se encuentran enzimas, encargadas de mantener un reducido metabolismo celular. Este captulo describe los aspectos ms importantes de la estructura de los eritrocitos (protenas de membrana y Hb), su metabolismo y destruccin. Conocer lo anterior es muy importante para comprender la fisiopatologa de algunas anemias, intra y extracorpusculares. 2. ESTRUCTURA DE LOS GLBULOS ROJOS La misin de los glbulos rojos (GR) es proteger y transportar la Hb para que sta pueda realizar su funcin respiratoria. Para ello, tanto el ncleo como las estructuras citoplasmticas han sido reemplazados por una solucin altamente concentrada de Hb, en la que tambin se encuentran diversas enzimas, imprescindibles para mantener un reducido metabolismo celular. Al no tener ncleo, esta clula no puede replicarse ni sintetizar protenas. Algunas funciones de los hemates son: Transportan Hb (la cual lleva el oxgeno
desde los pulmones a los tejidos). Transportan el CO2 desde los tejidos a los pulmones. Esto, en parte, lo consigue porque contiene gran cantidad de anhidrasa carbnica, la que cataliza la reaccin entre el dixido de carbono y el agua, formando in bicarbonato (HCO3-). Son un excelente amortiguador cido-base.
Los sistemas metablicos de los hemates se hacen progresivamente menos activos con el tiempo, y las clulas se hacen ms frgiles, probablemente porque sus procesos vitales se desgastan. Los glbulos rojos por dentro de la membrana celular presentan el citoesqueleto, llamado esqueleto de membrana eritrocitaria; es una red de pr otenas que tapiza la membrana plasmtica. En el interior de la clula se encuentra la Hb como solucin concentrada. La estructura de los hemates les permite adquirir forma de disco bicncavo; esto les confiere ms superficie que volumen y les facilita la deformabilidad y transporte de oxgeno. Los eritrocitos de frente tienen un dimetro de 7 - 8 micras y de perfil 2,5 micras y 1,2 micras de espesor. Esta conformacin les permite pasar por los capilares (2-3 micras) y llegar al bazo, el cual acta como filtro, ya que, a medida que los GR envejecen, pierden la capacidad de deformarse debido a que van adquiriendo rigidez en la membrana, producto de la
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disminucin en el aporte de ATP y otros eventos en su superficie, lo que impide un paso normal por los capilares del bazo. Este proceso lleva a la destruccin de aquellos GR que quedan retenidos en este rgano por un proceso denominado hemocateresis. 2.1. Membrana eritrocitaria La membrana es responsable de la caracterstica forma discoide de los GR y contribuye a mantener su deformabilidad y elasticidad; su permeabilidad le permite regular tambin el volumen. Al igual que otras membranas celulares posee un modelo de mosaico fluido y est constituida por lpidos, protenas e hidratos de carbono (figura 3-1).
Los lpidos se disponen en doble capa, en la que se hallan total o parcialmente sumergidas diversas pr otenas, llamadas pr otenas integrales, y su superficie interna est recubierta por una estructura fibrilar de protenas (citoesqueleto). La interaccin entre protenas integrales y protenas del esqueleto y lpidos condiciona la forma eritrocitaria, caracterizada por un exceso de superficie con relacin al volumen, la relacin sup/vol es decisiva para garantizar la deformabilidad eritrocitaria. Los lpidos, que constituyen un 40% del peso seco de la membrana son, principalmente, fosfolpidos y colesterol y en menor proporcin, cidos grasos libr es y glucolpidos. Al disponerse en doble capa permiten que los grupos polares queden al exterior y los apolares se unan entre s. Esta estructura es fluida por el carcter insaturable de los cidos grasos que forman parte de los fosfolpidos. Las protenas constituyen aproximadamente el 50% del peso seco de la membrana y pueden hallarse total o parcialmente sumergidas en la doble capa lipdica. Su estudio se puede realizar a travs de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), que las separa por peso molecular (tabla 3-1). Las protenas integrales forman estructuras de la membrana y las protenas perifricas forman el citoesqueleto. Los carbohidratos representan alrededor del 10% de las macromolculas de la membrana del GR.
Figura 3-1. Estructura de la membrana de los glbulos rojos. La membrana del eritr ocito se compone principalmente de lpidos y protenas que la atraviesan y que adems se encuentran formando una malla interna que tiene caractersticas de citoesqueleto. La distribucin y las interacciones verticales y horizontales de estas protenas permiten la estabilidad y deformabilidad del eritrocito y el movimiento de las mismas en la membrana.
Tabla 3-1. Distribucin de las protenas de membrana eritrocitaria en PAGE Nmero de banda Protena electrofortica 1 2 2.1 3 4.1 4.2 4.5 4.9 5 6 7 Regin PAS 1* Regin PAS 2* Regin PAS 3* Espectrina (cadena a) Espectrina (cadena b) Ankirina Banda 3 Banda 4.1 Protena kinasa Transportador glucosa Dematina Actina G-3PD Tropomiosina Glicoforinas A, B, C y D Monmero Glicoforina A Monmero Glicoforina B Peso molecular (kDa) 240 220 215 90-105 80 72 45 75 48 43 35 29 39 39 Numero de sitios por clula 200.000 200.000 100.000 1.200.000 200.000 100.000 500.000 1.000.000 Relacin con la membrana Perifrica Perifrica Perifrica Integral Perifrica Perifrica Integral Perifrica Perifrica Perifrica Perifrica Integral Integral Integral
* Corresponde a la deteccin de protenas altamente glicosiladas teidas con PAS.
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2.1.1. Protenas integrales Las molculas integrales for man parte estructural de la doble capa lipdica, hallndose total o parcialmente incluidas en el espesor de la bicapa, de forma que muchas pueden desplazarse a lo largo y a lo ancho de ella, confirindole gran fluidez. A continuacin se indican estas protenas con las caractersticas ms relevantes: Banda 3 o Canal aninico. Es la protena integral ms abundante. Posee elevado PM (95 kDa) y est codificada por un gen situado en el cromosoma 17. Su fragmento oligosacrido es responsable de la antigenicidad de los grupos sanguneos Ii y ABH. Sus funciones son: (a) contribuir al intercambio de iones Cl- y HCO3- entre el interior y el exterior de los GR, y (b) contribuir a fijar el citoesqueleto a la bicapa lipdica. Glicoforinas. Las glicoforinas son ricas en cido silico. Las de mayor importancia son cuatro (A, B, C y D) y constituyen el 2% de las protenas de membrana. Los fragmentos glucdicos de estas protenas afloran a la superficie externa de diversos grupos sanguneos. La glicoforina C adems, desempea un papel importante en la unin del citoesqueleto a la bicapa lipdica. Bomba Na, K ATPasa. La bomba Na, K que es dependiente de ATP, regula el intercambio de Na+ y K+. GLUT 1. Es una protena estructurada como un homotetrmero, que realiza el transporte de glucosa a travs de la membrana eritrocitaria. Este sistema de transporte es del tipo difusin facilitada y presenta una Km de 1-2 mM (Km es la concentracin de glucosa con la que se alcanza la mitad del transporte mximo). El transportador GLUT 1 tambin ha sido identificado en placenta, barrera hematoenceflica, cerebro, riones, colon, etc. Este transportador no depende de la accin de la insulina. Otras protenas transportadoras. Se ha reportado la existencia de varias otras protenas transportadoras en la membrana de los glbulos rojos humanos. Entre ellas se puede mencionar al cotransportador de glicina y sodio, que permite la incorporacin del aminocido a las clulas. El transportador de colina, que incorpora a esta molcula nitrogenada fundamental para la sntesis del fosfolpido de membrana fosfatidilcolina. El transportador de uridina, otra de las protenas transportadoras reportadas para la membrana de los eritrocitos, permite el
movimiento de la base nitrogenada a favor de su potencial qumico de difusin. Tambin se ha observado la presencia de un intercambiador sodio-proton y transportadores de tirosina, fenilalanina, triptofano, valina, leucina, lisina, arginina, adenosina, AMPc, glicerol, piruvato, lactato, cido rico, creatina, etc. 2.1.2. Protenas perifricas Las pr otenas perifricas confor man el citoesqueleto; son muy diversas. Mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida se identifican y cuantifican fcilmente. Estas protenas perifricas son: Espectrina (Bandas 1 y 2). Es la protena ms abundante del citoesqueleto. Resulta de la unin de 2 dmeros cada uno formado por una cadena alfa y una cadena beta. La alfa es codificada en el cromosoma 1 y la beta en el cromosoma 14. La espectrina establece interacciones funcionales con otras protenas del esqueleto, en especial con la actina, la protena 4,1 y la Ankirina. Protena 4,1. Contribuye a la estabilidad de la unin entre la espectrina y la actina y al anclaje del esqueleto a la bicapa lipdica. Protena 2,1 o Ankirina. Constituye un importante punto de anclaje del esqueleto a la bicapa lipdica, especialmente a la banda 3. Actina. Se une a la espectrina. Protena 4,9. Necesaria para la configuracin molecular de la actina. Aducina, Tropomiosina y Palidina. Los dmeros de espectrina se unen cabeza a cabeza for mando tetrmeros y estableciendo interacciones funcionales con otras protenas del esqueleto, en especial con la actina, la protena 4,1 y la ankirina, de forma que 6 unidades de espectrina se unen a un oligmero de actina, formando una red de estructura hexagonal altamente organizada. Cada unin espectrinaactina se estabiliza por la formacin de un complejo ternario (junctional complex) con la protena 4,1 que adems fija la red a la membrana por su interaccin con la glucoforina C. Este complejo es estabilizado por la tropomiosina, la cual se asienta en el canal de los filamentos de actina, la protena 4.9 se une a la actina envolvindola, en tanto la aducina permite la unin de dos heterodmeros de espectrina, la ankirina une la red al lado interno de la doble
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capa de lpidos a travs de su unin con la banda 3, esta unin es estabilizada con la adicin de la banda 4.2. La relacin funcional de las protenas del citoesqueleto entre s y con la doble capa lipdica, se ha establecido a partir del modelo que considera dos tipos de interacciones: a) Interacciones horizontales. Mantienen la estabilidad global del esqueleto: Dmeros de espectrina (sp-sp) Espectrina (beta) y actina, estabilizada por la protena 4,1 (sp-actina-4,1) b) Interacciones verticales: Unen el citoesqueleto a la bicapa lipdica (membrana): Espectrina (beta) y Banda 3 estabilizada por ankirina (sp-ank-3) Protena 4,1, glicoforina, banda 3 (4,1-glucoforina-3). 2.1.3. Molculas de adhesin
Los eritrocitos expresan una gran cantidad de molculas de adhesin (tabla 3-2), entre las protenas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF) y que median la adhesin de los glbulos rojos, varias de ellas son bien conocidas, CD47 que es un receptor para trombospondina y se puede encontrar tambin en otras clulas, CD239 que corresponde al antgeno Lutheran funciona como receptor para laminina tanto en clulas Drepanocticas como en diversos epitelios neoplsicos, CD242 que corresponde al antgeno LW y es capaz de unir varias formas de integrinas comnmente expresadas por leucocitos y otros tejidos, CD147 molcula necesaria para que el glbulo rojo pueda atravesar el Bazo y regresar a la circulacin, CD44 coopera con VLA-4 como receptor para fibronectina y CD99 que media las interacciones GR-linfocitos, aunque este rol fisiolgico todava no es bien conocido.
Tabla 3-2. Molculas de adhesin expresadas por los eritrocitos circulantes
Molculas de adhesin y nombre alterno CD36 ( solo reticulocitos ), GP IV plaquetaria VLA-4 ( solo reticulocitos ), Integrina 4 1 CD44, Indian ( Ina / Inb ) CD47, Protena asociada a Integrina ( IAP ) CD58, LFA-3 CD99, producto del gen MIC2 CD108, JMH, Semaforina K1 ( SEMA7A ) CD147, Neurotelina, Oka CD242, ICAM-4, LW CD239, Lutheran, B-CAM/LU
Ligando/ Funcin adhesiva Trombospondina (plaquetas) Trombospondina, VCAM-1, posiblemente fibronectina Hyalurona, posiblemente fibronectina Trombospondina CD2 Formacin de rosetas de clulas T Posible rol en la adhesin de linfocitos activados Colgeno tipo IV, fibronectina, laminina en otros tejidos. Integrinas de leucocitos (4 1 , 43 , v1 ) Laminina, posiblemente alguna integrinas
3. METABOLISMO DE LOS HEMATES Los hemates maduros no tienen ncleo, mitocondrias ni retculo endoplsmico; sin embargo, s poseen enzimas citoplasmticas que son capaces de metabolizar la glucosa y formar pequeas cantidades de adenosn trifosfato (ATP) y la forma reducida de la nicotn-
amida-dinucletido fosfato, NADPH. La glucosa es prcticamente el nico combustible utilizado por los hemates. Penetra en ellos rpidamente por difusin facilitada, para convertirse en glucosa-6-fosfato (G6P). sta puede seguir dos vas (figura 3-2).
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Ciclo de la hexosa-monofosfato
Figura 3-2. Va metablica de la gliclisis en el eritrocito. Se encuentra la va anaerbica o de Embden-Meyerhof, la va aerbica o va de las pentosas, el shunt de Rapaport (indispensable en la for macin de 2,3-DPG) y la va de las diaforasas o metahemoglobinreductasa.
El 80-90% se convierte en lactato mediante la va glucoltica. A partir de una reaccin colateral (shunt de Rapaport ) se obtiene el mediador de la afinidad de la Hb por el O2, el 2,3difosfoglicerato (2,3-DPG). El 10% de la glucosa es sometida a oxidacin por medio de un cortocircuito de la hexosamonofosfato. Esta va mantiene el glutatin en forma reducida para proteger a la Hb y la membrana del eritrocito de la oxidacin por radicales libres (perxidos y superxidos) y por oxidantes exgenos (frmacos y toxinas). El NADPH sirve a los hemates de muchas e importantes formas: Mantiene la flexibilidad de la membrana celular. Mantiene el transporte de iones a travs de la membrana. Permite regenerar el ATP que proporciona la energa necesaria para que la membrana del hemate mantenga til la bomba de sodio-potasio, evitando as que el sodio y el agua penetren en su interior, lo que provocara su destruccin. Es decir, contribuye a mantener la forma del hemate. Mantiene el hierro de la Hb en forma ferrosa
(Fe+2), en lugar de frrica (Fe+3) que provoca la formacin de metahemoglobina que no transporta oxgeno. Evita la oxidacin de las protenas de los hemates.
La maduracin eritroblstica conlleva la desaparicin de prcticamente todas las vas presentes en cualquier otra clula. El eritrocito maduro es incapaz de sintetizar lpidos o protenas y obtener energa a travs del ciclo de Krebs y la fosforilacin oxidativa. Su nica fuente energtica es la gluclisis anaerobia, cuyo rendimiento neto es de 2 ATP por cada molcula de glucosa oxidada. Esta fuente energtica es suficiente para que desarrolle funciones que permiten su supervivencia en circulacin. El eritrocito presenta 4 vas metablicas: gluclisis anaer obia (va de Embden-Meyerhof), metabolismo xido-reductor (va de pentosas fosfato y sntesis de glutatin), metabolismo nucleotdico, y sistema diaforsico. 3.1. Gluclisis anaerobia La glucosa que difunde hacia el interior de los eritrocitos es oxidada a piruvato mediante un proceso de gliclisis sin consumo de O 2
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(anaerobio), en un proceso que consta de 2 etapas (figura 3-2): (a) Transformacin de glucosa en Gliceraldehido-3-P (GA3P) y Dihidroxiacetona-P (DHAP) con consumo de 2 ATP, y (b) Oxidacin de ambos compuestos a piruvato y lactato con formacin de 2 ATP por cada molcula de GA3P (total 4 ATP/glucosa); el piruvato se transforma en lactato por la accin de la LDH (lactato deshidrogenasa) eritrocitaria. La gluclisis anaerobia posee 3 enzimas que al catalizar reacciones irreversibles constituyen etapas limitantes: Hexoquinasa (HK) que transforma glucosa en Glucosa-6-P (G6P), fosfofructoquinasa (PFK) que transfor ma Fructosa-6-P (F6P) en Fructosa-1,6-diP (F1, 6DP), y piruvatoquinasa (PK) que transforma el Fosfoenolpiruvato (PEP) en piruvato. Debido a que la va de Embden-Meyerhof es la nica fuente de energa del eritrocito, el dficit de una de estas enzimas es suficiente para bloquear su funcionamiento y ser causa de anemia hemoltica produciendo un aumento en los niveles de LDH plasmtico. Una derivacin importante de la gluclisis anaerobia es el ciclo de Rapaport-Luebering, que transforma 1,3 difosfoglicerato (1,3 DPG) en 2,3 DPG. El 2,3 DPG mediante fosforilacin se transforma en 3-Pglicerato y con ello cierra el ciclo. Ambas reacciones son catalizadas por una misma enzima, con doble funcin: mutasa y fosfatasa. Aunque la importancia de este ciclo deriva de la funcin reguladora del 2,3 DPG sobre la funcin hemoglobnica, es probable que este metabolito constituya un reservorio energtico frente a situaciones, como una disminucin de pH intraeritrocitario que disminuye la actividad glucoltica. El 2,3 DPG es un anin altamente cargado que se une a las cadenas de la Hb, favoreciendo la liberacin del O 2 . El aumento de la concentracin de 2,3 DPG en los glbulos rojos, desplaza la curva de disociacin de la oxihemoglobina hacia la derecha. Entre los factores que se sabe que elevan la concentracin de 2,3 DPG en los eritrocitos humanos se cuentan la disminucin del pH citoslico, las hormonas tiroideas, la hormona del crecimiento y los andrgenos. Otra reaccin importante de la gluclisis anaer obia es catalizada por la enzima gliceraldehido-3-P-DH, ya que mantiene el NADH en estado reducido, imprescindible para mantener al Fe de la Hb en estado reducido, a
travs de la reaccin catalizada por NADH diaforasa o citocromo B5-reductasa. 3.2. Metabolismo xido-reductor (va de las pentosas o hexosamonofosfato) Una va alternativa a la gluclisis anaerobia es el ciclo de la hexosa monofosfato (va de las pentosas), que en condiciones normales deriva entre 5-10% del catabolismo de la glucosa. Esta va funciona sin el consumo de oxgeno, de forma que su actividad puede aumentar 20-30 veces si se produce un brusco aumento de la oxidacin intracelular. El principal factor limitante es el cociente NADP+/NADPH y la enzima Glucosa-6P-DH, que precisa del cofactor NADP+, pero que a la vez es intensamente inhibida por NADPH (reducido). En el desarrollo de su funcin, el eritrocito suele hallarse sometido a agresiones oxidantes y el NADPH es por s mismo insuficiente para amortiguarlas. La clula dispone de un compuesto, el Glutatin, que en estado reducido (GSH) realiza esta funcin. El glutatin es un tripptido sintetizado por 2 enzimas que precisan consumo de ATP. Bajo forma reducida y mediante una reaccin catalizada por la glutatin peroxidasa, elimina el exceso de perxido. El nivel de GSH generalmente elevado, se mantiene gracias a NADPH (de la va de las pentosas) y a la actividad de la glutatin reductasa. El poder reductor del eritrocito reside en su capacidad de regenerar NADPH, necesario a su vez, para mantener el nivel de GSH. El dficit congnito de glucosa-6-P-DH implica una gran disminucin del poder reductor eritrocitario. Dado que el glutatin no difunde a travs de membranas eritrocitarias, su concentracin se mantiene gracias a un sistema en el que intervienen 2 enzimas: deltaglutamilcisteinasintetasa y glutatin sintetasa. 3.3. Metabolismo nucleotdico Junto a las enzimas glucolticas, el eritrocito dispone de otras enzimas que tambin contribuyen al mantenimiento del ATP, y que actan sobre la llamada mezcla de nucletidos adenlicos (ATP y en mucho menor proporcin ADP y AMP). Entre ellos se destacan la adenilatoquinasa (AK), la ATPasa, la
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adenosindiaminasa (ADA) y la pirimidina-5nucleotidasa. AK y ATPasa contribuyen a reciclar el ADP a partir de ATP generado en la gluclisis. La ADA transforma adenosina en inosina y contribuye a su eliminacin o reciclaje. AK y ADA utilizan el mismo sustrato (adenosina), lo que explica que tanto el dficit de AK como un exceso de ADA tengan una expresividad clnica similar, derivada del insuficiente reciclaje de AMP y la disminucin de la concentracin de ATP. La pirimidina 5 nucleotidasa interviene en la degradacin del RNA, y su dficit produce acumulacin intraeritrocitaria de nucletidos, que interfiere, tanto en la degradacin normal del RNA como en la actividad de las enzimas clave de la gluclisis, disminuyendo la produccin de ATP. 3.4. Sistema de diaforasas El mantenimiento de la funcin respiratoria de la Hb, requiere que el Fe hemnico se halle en estado reducido. A ello contribuye la enzima diaforasa o metaHbreductasa (citocromo B5 reductasa). El GR normal posee 2 sistemas diaforsicos, el principal y el secundario. En el principal interviene la citocromo B5 reductasa, que utiliza el NADH y el secundario permanece inactivo. La citocromo-B5-reductasa est presente en gran nmero de clulas del organismo y cataliza la transferencia de electrones desde el NADH al citocromo B5, que los cede directamente al Fe hemnico, manteniendo su estado reducido. La diaforasa que usa NADPH como sustrato, carece de aceptor fisiolgico de electrones, por lo que permanece inactiva en condiciones normales. Ciertos colorantes como el azul de metileno son aceptores no fisiolgicos de electrones, de tal forma que en caso de dficit del sistema diaforsico principal, pueden emplearse como tratamiento para disminuir el exceso de metaHb y eliminar la cianosis. 4. HEMOGLOBINA 4.1. Estructura de la Hb La molcula de Hb es el resultado final de un largo proceso evolutivo, con perfecta adaptacin a la funcin que desarrollan las clulas animales, esto es: transportar O2 desde los pulmones a los tejidos del cuerpo y facilitar el regreso de CO2 desde los tejidos a los pulmones. Las caractersticas funcionales de la Hb como un transportador de gases fueron determinadas
ms de medio siglo antes de que se formulara su estructura proteica, la cual ha tenido que esperar el desarrollo de tcnicas de laboratorio ms complejas como son la cristalografa por rayos X y el advenimiento de la biologa molecular moderna. El conocimiento de su estructura y funcin es fundamental para entender y comprender el comportamiento de las hemoglobinas anor males y valorar la importancia que su dficit o ausencia origina. La Hb fundamentalmente, aunque no en forma exclusiva, es una protena transportadora de O2. Se localiza en el interior de los glbulos rojos. En la mayor parte de los invertebrados, el pigmento que transporta O2 circula libremente en el plasma ms que dentro de clulas, lo cual es bastante ineficiente. La Hb como una protena libre en el plasma ejerce una presin osmtica de alrededor de cinco veces ms que la producida por las protenas plasmticas solas. Al estar este pigmento en corpsculos (eritrocitos), la viscosidad de la sangre puede ser mantenida a un bajo nivel no provocando deshidratacin de los tejidos. En cada hemate hay alrededor de 280 millones de molculas de Hb, cada una con un peso molecular de 64.458 daltons, tiene forma elipsoide y unas dimensiones de 64 x 55 x 60 , (2 subunidades de 15.750 daltons y 2 subunidades de 16.500 daltons). La Hb es una protena conjugada cuya parte no aminoacdica o grupo protsico se conoce con el nombre de hemo, el cual est formado por la unin de una protoporfirina IX y un tomo de hierro en estado ferroso (Fe+2). La porcin proteica se denomina globina, es una protena globular formada por un tetrmero integrado por cuatro subunidades iguales dos a dos, siendo cada subunidad una cadena polipeptdica. Aunque lo ms probable es que originalmente haya sido una protena monomrica similar a la mioglobina. Las cadenas de Hb humana se han denominado de acuerdo a las letras del alfabeto griego: alfa (), beta (), gamma (), delta (), psilon () y zeta (). De las combinaciones dos a dos de las diferentes cadenas de globina se van a formar las diferentes hemoglobinas en los perodos embrionario, fetal, neonatal y adulto. En condiciones normales se forman seis variantes de Hb: Tres son hemoglobinas embrionarias transitorias, con gran afinidad por el O2: Gower 1 (2 2), Gower 2 (2 2), y Portland (2 2). La Hb fetal (F0: 2 G2) y (F1: 2 AI2) presentes
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al nacimiento en una proporcin de 7:1 respectivamente, es la Hb ms importante del feto y neonato (65%-95%), producindose solamente como trazas en la vida adulta en condiciones nor males (<1%). En ciertas situaciones que pueden ser adquiridas o hereditarias se encuentra aumento de la Hb fetal y fundamentalmente en base a F1 (2 AI2). Las hemoglobinas encontradas despus del nacimiento son: A0: 2 2 y A2: 2 2. La Hb A0 representa aproximadamente el 97% de la Hb del adulto. La Hb A2 es una pequea fraccin que existe en los individuos normales en una cantidad de aproximadamente 2,5%. Existen tres condiciones imprescindibles que deben ser satisfechas para que la globina funcione en forma adecuada: Libre acceso del agua a la superficie de la globina para mantenerla en solucin, para ello el exterior molecular debe ser rico en cadenas laterales hidroflicas polares. El interior de la molcula debe seguir siendo hidrofbico, resultado de su alto contenido en aminocidos repelentes al agua. La molcula de globina debe mantenerse lo suficientemente rgida, lo que se logra con una proporcin extraordinariamente alta de aminocidos en disposicin helicoidal. 4.1.1. Estructura primaria a cuaternaria a) Estructura primaria Con este trmino se designa al esqueleto de la cadena polipeptdica de globina y establece especficamente la secuencia de sus aminocidos. Las protenas estn compuestas por unidades
estructurales denominadas aminocidos unidos por un fuerte enlace covalente denominado enlace peptdico, el cual se establece entre los grupos carboxilos y amino de los aminocidos. De los 20 aminocidos que forman las protenas, la Hb incorpora a la estructura de su molcula 17 de ellos. Cada aminocido posee 2 grupos, un grupo amino cargado positivamente y un grupo carboxilo que lo est negativamente, neutralizndose estas cargas al establecerse el enlace peptdico, permaneciendo slo cargados sus residuos N-terminal y C-terminal. Quedan cargadas tambin las cadenas laterales (grupos R), pudindose dividir los aminocidos segn la naturaleza de sus grupos laterales en hidroflicos o polares que se disponen en la superficie de la molcula o formando la cavidad central de la misma, e hidrofbicos situados en el interior molecular y tapizando el bolsillo del hemo. Los residuos aminoacdicos ms numerosos son los hidrfobos (alanina, valina, leucina), siendo tambin muy abundante la histidina, cuyo grupo imidazol es responsable en forma importante de las propiedades funcionales de la molcula: el poder tampn y el efecto Bohr. Muchas posiciones en las diferentes cadenas de globina estn ocupadas por el mismo aminocido, este fenmeno se conoce como homologa secuencial, siendo muy importante para el funcionamiento de la molcula. La secuencia aminocidica de las cadenas globnicas, se conocen en muchas especies. Existen nueve posiciones en la secuencia que contienen el mismo aminocido, en prcticamente todas las especies estudiadas hasta ahora (tabla 3-3).
Tabla 3-3. Residuos aminoacdicos permanentes en la Hb Posicin F8 E7 CD1 F4 B6 C2 HC2 C4 H10 Aminocido Histidina Histidina Fenilalanina Leucina Glicina Prolina Tirosina Treonina Lisina Funcin Histidina proximal ligada al hemo Histidina distal prxima al hemo Contacto con el hemo Contacto con el hemo Permite mxima aproximacin de hlices B y E Trmino de la hlice Enlaces cruzados de las hlices H y F Desconocida Desconocida
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Cadena La cadena de -globina humana consiste de 141 aminocidos en secuencia lineal. El grupo hemo est unido covalentemente por un enlace entre el hierro del hemo y el grupo imidazol de un residuo de histidina en la posicin 87 (contando desde la regin N-terminal del polipptido). Esta es la denominada histidina proximal. Cadena La cadena es ligeramente ms larga que la cadena (146 residuos). El hemo se une a la histidina 92 de la cadena globina. A diferencia de muchas otras protenas no hay puentes disulfuro sea dentro o entre las subunidades de Hb. El residuo de cistena en posicin 93 de la cadena es altamente reactivo y fcilmente se oxida para formar disulfuros mixtos y otros tiosteres. Este fenmeno puede estar involucrado en el catabolismo de la Hb. Cadenas , , y Existe una considerable homologa estructural entre las cadenas , , y las cadenas . En realidad estas cadenas son sintetizadas a partir de un grupo de genes localizados en el cromosoma 11. De igual manera la cadena es homloga con la cadena , siendo ambos productos de un grupo de genes localizados en el cromosoma 16. b) Estructura secundaria La estructura secundaria est determinada por la relacin espacial entre residuos que estn cercanos uno de otro en la secuencia lineal. Las subunidades de Hb son muy buenos ejemplos de un patrn de hlice y dextrogira, consistiendo de 3,6 aminocidos por vuelta. Esta hlice se establece por enlaces de hidrgeno entre el grupo carboxilo de cada residuo y el grupo amino de cuatro residuos antes (enlaces intracatenarios). En su estado nativo, aproximadamente el 75% de la molcula de Hb es una hlice . Este relativamente alto contenido helicoidal en comparacin con otras protenas globulares simplifica la solucin de su estructura tridimensional. En ciertas localizaciones especficas de las subunidades de Hb, la hlice es interrumpida por segmentos que pierden la configuracin helicoidal, adoptando as una disposicin lineal por donde la cadena suele angularse.
Los segmentos helicoidales se denominan con letras que van desde la A a la H, comenzando por el extremo N-terminal de la molcula, los no helicoidales reciben su denominacin a partir de las hlices entre los que estn situados, es decir: NA, AB, CD, EF y as hasta GH. Los dos pequeos segmentos lineales situados en los extremos se denominan NA y HC. La subunidad ha demostrado tener 8 segmentos helicoidales, desde la A hasta la H. Los segmentos helicoidales de la cadena son comparables a los de la cadena , con excepcin de los residuos que constituyen la hlice D de la cadena que estn ausentes en la cadena . Dado que el nmero de aminocidos en las distintas cadenas es diferente, 141 en la y 146 en la , y con el fin de lograr una mxima homologa entre subunidades, cada aminocido se numera de acuerdo con su posicin en la cadena lineal y con el lugar que ocupa en cada segmento, de este modo la histidina F8 en la 87 y 92. La homologa entre subunidades de Hb de diferentes especies se mantiene, de tal forma que residuos que son importantes para la funcin de la molcula se conservan a travs de la evolucin de las especies. As por ejemplo todas las hemoglobinas cuya estructura es conocida tienen un residuo de histidina en la posicin F8, excepto dos metahemoglobinas: la M-Iwate y la M-Hyde Park. c) Estructura terciaria La estructura terciaria se refiere a como est plegada tridimensionalmente cada cadena polipeptdica, y est deter minada por la situacin en el espacio de los residuos aminoacdicos que forman parte de la estructura lineal, lo que facilita la comprensin de las propiedades funcionales de la protena. Hoy en da existen evidencias claras de que la secuencia primaria de los aminocidos es la que determina fundamentalmente los plegamientos de la protena en el espacio tridimensional, y que solamente esta secuencia primaria es la que est determinada genticamente, definindose posteriormente las estructuras secundaria y terciaria por uniones entre los radicales de los aminocidos que forman la misma (figura 3-3).
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La combinacin de las cadenas y y para formar el tetrmero de forma elipsoide 22 y 22 es esencial para que la Hb realice las funciones que le son propias: curva sigmoidea de disociacin de la oxihemoglobina, interaccin hemo-hemo y efecto Bohr. Las diferencias fsicas y qumicas que se producen entre la forma oxi y desoxi se manifiestan por cambios en la estructura cuaternaria de la molcula. En un tetrmero de Hb del adulto (Hb A0) se aprecia que cada cadena contacta con las dos cadenas a lo largo de dos diferentes superficies (figura 3-4) de aqu que si las subunidades son designadas 1, 2, 1 y 2, pueden definirse dos interfases entre distintas subunidades: 11 y 12 que son estructuralmente idnticas a las 22 y 21, respectivamente. La inter fase 1 1 y 2 2 per manecen relativamente fijas durante la oxigenacin. La unin entre estos dmeros es muy estrecha debido a los 40 contactos entre residuos que en esta interfase se producen, incluyendo 9 puentes de hidrgeno, por lo que no hay difer encias entre la for ma oxi y desoxihemoglobina, per mitindose movimientos de tan slo 1 . El contacto en la interfase 1 2 y 2 1, al contrario del previamente sealado, permite un desplazamiento y rotacin considerable durante la oxigenacin y desoxigenacin del tetrmero de hasta 7 . Debido a que el contacto del tipo 12 y 21 est cerca del hemo, cualquier movimiento de la histidina proximal en la oxigenacin y desoxigenacin podra esperarse que tenga un efecto en esta inter fase y viceversa. En realidad la disposicin de los dos dmeros a lo largo de este contacto 12 es una caracterstica fundamental de la interaccin hemo-hemo. Solamente 19 residuos estn comprometidos en el contacto 12, 10 en la cadena y 9 en la cadena . Las fuerzas involucradas son principalmente no polares del tipo Van der Waals. Debido a la importancia del movimiento a travs de este contacto, muchos de los aminocidos comprometidos se mantendrn invariables en la evolucin y al comparar las hemoglobinas de las distintas especies vertebradas. El contacto entre cadenas similares (12 y 12) son mnimos. Una cavidad interna tapizada por aminocidos polares y llena con agua separa en forma parcial las cadenas similares una de otra.
Figura 3-3. Estructura terciaria de la Hemoglobina. La figura muestra una cadena de globina con su respectivo hemo.
Los plegamientos hacen que dentro de la forma esferoide que adopta la molcula se cree una cavidad donde se alojar el hemo, denominada bolsillo, limitada por las hlices B, G, H en el fondo, por la E y F en sus paredes y con una apertura prxima a la superficie tapada en parte por la hlice C y D. Esta cavidad est esencialmente tapizada por residuos cuyas cadenas laterales, fuertemente hidrfobas, evitan la presencia de agua y por tanto la oxidacin del tomo de hierro, permitiendo el transporte reversible del O2. Existen adems numerosos puentes de hidrgeno y fuerzas de Van der Waals que mantienen la cohesin externa de la estructura terciaria. d) Estructura cuaternaria La estructura cuaternaria est referida a la forma como se articulan las cuatro subunidades de globina, la cual se realiza por uniones dbiles como son los enlaces inicos y fuerzas no covalentes tipo Van der Waals y no por fuertes enlaces covalentes (figura 3-4).
Figura 3-4. Diagrama del tetrmero de Hb ilustrando los diferentes puntos de contacto .
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Contacto 12 La unin entre las dos cadenas , aunque escasa, es de importancia fisiolgica. Ocurre slo en la molcula de desoxihemoglobina y juega un importante papel en la interaccin hemo-hemo, efecto Bohr y transporte de CO2. Contacto 12 Las cadenas estn ms ampliamente separadas que las cadenas . El hueco dejado en la conformacin desoxigenada es capaz de acomodar una molcula de 2-3 difosfoglicerato (2-3 DPG). En la conformacin oxigenada, cuando las cadenas se mueven en conjunto, este hueco se hace ms estrecho expulsando a la molcula de 2-3 DPG. 4.1.2. Hemo a) Estructura del hemo El hemo es el grupo protsico de la Hb. Est constituido por una ferroprotoporfirina IX, esto es un esqueleto formado por la protoporfirina IX con el hierro en estado ferroso (Fe +2 ). Es un compuesto tetrapirrlico con un tomo de hierro hexacovalente en el centro unido a los nitrgenos de los pirroles (figura 3-5).
oxidacin del triptofano. b) Biosntesis del Hemo La mayor parte de los organismos pueden sintetizar el hemo y las apohemoprotenas. Aproximadamente el 85% del hemo se sintetiza en la mdula eritropoytica, y el resto fundamentalmente en el hgado. En el hgado la mayora del hemo sintetizado se incorpora al citocr omo P 450 micr osomal, que realiza importante biotransformacin de una gran variedad de qumicos, carcingenos, esteroides, vitaminas, cidos grasos y prostaglandinas. La va de biosntesis del hemo involucra 8 enzimas, 4 de ellas se encuentran en el citoplasma y las otras 4 en las mitocondrias (figura 3-6). El proceso de sntesis se inicia en la mitocondria con la condensacin de glicina con succinil CoA para formar el cido -5 aminolevulnico (ALA), reaccin catalizada por la enzima aminolevulnico sintetasa (ALAS). Los siguientes 4 pasos de la va tienen lugar en el citoplasma, la ALA deshidratasa (ALAD) convierte a 2 molculas de ALA en por fobilingeno (PBG). Los dos pasos enzimticos siguientes convierten a cuatro molculas de PBG en una estructura cclica llamada tetrapirroli uroporfiringeno III el cual es descarboxilado for mando el coproporfiringeno III. El tercer paso final incluye la insercin de una molcula de Fe+2 en la protoporfirina IX por la ferroquelatasa etapa que ocurre en la mitocondria.
Figura 3-5. Estructura del hemo. El hemo est formado por una estructura de protoporfirina IX ms el hierro.
El hemo es fundamental para la funcin de todas las clulas aerbicas. Adems de ser el grupo protsico de la Hb lo es de los citocromos mitocondriales que realizan el transporte de electrones, de los citocromos microsomales comprometidos en una variedad de reacciones que metabolizan drogas, de la catalasa que descompone el perxido de hidrgeno, de la peroxidasa que activa al perxido, y finalmente de la triptofano pirrolasa que cataliza la
Figura 3-6. Biosntesis del Hemo. Parte del proceso ocurre en el interior de la mitocondria y otra en el citosol. (ver texto).
A continuacin se mencionan las enzimas que participan en la biosntesis del hemo: cido aminolevulnico sintetasa (ALAS). Es un homodmero que reside en la matriz de la membrana mitocondrial interna con absoluta
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especificidad por la glicina, aun as esta enzima se une a este aminocido con baja afinidad. El segundo sustrato, succinil CoA, es un intermediario del ciclo de Krebs y es el que provee la energa para la compleja va de la biosntesis de porfirina. La enzima requiere de piridoxal fosfato (vitamina B6) como cofactor. Las evidencias indican que el hemo regula a la ALAS por disminucin de la vida media del mRNA y por bloqueo en la translocacin del precursor proteico de ALAS dentro de la mitocondria. El hemo regulara la sntesis eritrocitaria del hemo en un feedback negativo, sin embargo existe controversia acerca del mecanismo. cido aminolevunlico deshidratasa (ALAD). Est compuesta por 8 subunidades de 36 kDa y contiene 4 sitios catalticos. La enzima requiere zinc (un tomo por subunidad) y grupos sulfidrilos intactos para la actividad. Es la enzima ms abundante en la sntesis del hemo y por lo tanto incapaz de jugar un rol regulador. Porfobilingeno desaminasa (PBG-D). Cataliza el paso de desaminacin y condensacin de las 4 molculas de PBG formando el intermediario tetrapirrlico pre-uroporfiringeno. La enzima tiene 35-40 kDa. En humanos el gen de PBG-D tiene dos isoformas, uno exclusivo de clulas eritroides. Uropor firingeno isomerasa (URO-S) y uroporfiringeno descarboxilasa (URO-D). La URO-S cataliza la nica reaccin en que el anillo del Pseudoporfiringeno es invertido y la cadena es ciclada proporcionando el ismero tipo III. La URO-D cataliza la descarboxilacin secuencial de 4 molculas de acetato de las cadenas laterales del uroporfiringeno III formando el coproporfiringeno III, esta enzima no requiere cofactor pero s necesita grupos tioles para la actividad enzimtica. Coproporfiringeno oxidasa (CPO). Esta enzima cataliza la descarboxilacin oxidativa de dos grupos propinicos en la posicin 2 y 4 del coproporfiringeno III y dos grupos vinlicos. La CPO es localizada en el espacio intermembranoso mitocondrial probablemente en asociacin con la cara externa de la membrana interna pero existe poca informacin sobre el mecanismo por el cual el coproporfiringeno III atraviesa la membrana externa. Protoporfiringeno oxidasa (PPO). Es una protena integral de la membrana mitocondrial inter na con el sitio activo en el espacio
intermembranoso. La PPO cataliza el ltimo paso en la va del hemo removiendo 6 tomos de hidrgeno del anillo porfiringeno. Ferroquelatasa. Esta enzima tambin llamada hemsintetasa tiene 2 sustratos protoporfirina IX y hierro frrico y dos productos el hemo y 2H+. La protena madura est sujeta a la membrana mitocondrial interna con el sitio activo localizado en la matriz. La enzima activa es probablemente un monmero aunque se ha sugerido que funciona como un homodmero 80 kDa. c) Iteracciones del hemo con la globina Estudios de Rayos X de alta resolucin han suministrado informacin precisa acerca de los detalles de la interaccin entre el hemo y la globina. El hemo se encuentra insertado en una hendidura entre la hlices E y F. El hierro est ligado covalentemente al nitrgeno imidazlico de la histidina proximal F8 y con la E7, tambin llamada histidina distal. Estos residuos de histidina son una caracterstica invariable de todas las globinas de los vertebrados normales. Hemoglobinopatas estructurales encontradas hasta la fecha por mutacin de la histidina pr oximal incluyen: Hb Mozhaisk (92, HisArg), Hb M-Hyde Park (92 HisTyr), Hb New Castle (92 HisPro), Hb Saint Etienne (92 HisGln), Hb J-Altgeld Gardens (92 HisAsp). Las hemoglobinopatas estructurales encontradas por mutacin de la histidina distal incluyen: Hb Zurich (63 HisArg), Hb MSaskatoon (63 HisTyr), Hb Bictre (63 HisPro). El residuo de valina E11 parece guardar el acceso del O2 al bolsillo del hemo. Este tambin corresponde a un residuo que es considerado invariable y que apar ece sustituido en algunas hemoglobinopatas inestables y metahemoglobinas, como son: Hb MMilwaukee-I (67 ValGlu), Hb Bristol (67 ValAsp), Hb Alesha (67 ValMet), Hb Sydney (67 ValAla), Hb Manakau (67 ValGly). Adems de las uniones descritas el hemo est ligado a la globina por dos puentes de hidrgeno que unen los grupos propinicos de las cadenas laterales de la porfirina a los segmentos FG y GD y a la hlice H, pero la unin ms fuerte est asegurada por un gran nmero (aproximadamente 80) de enlaces hidrofbicos. Con la unin a la globina, el hemo logra hacerse soluble asegurndose adems un ambiente hidrofbico, el cual es necesario para captar de forma reversible el O2.
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Como se desprende del anlisis estructural sealado, la incorporacin del O2 a la molcula de Hb desencadena una profunda alteracin en la conformacin de la molcula, lo que implica una cooperatividad entre las subunidades. Es decir la transicin de la estructura cuaternaria desoxigenada a la oxigenada afecta al medio ambiente de los hemo no ligados, de tal forma que la afinidad por el O2 se incremente. 4.1.3. Tipos de hemoglobinas a) Hemoglobinas normales del adulto y neonato Hemoglobina A (22) Tanto las hemoglobinas A como la A2 son las hemoglobinas ms intensamente estudiadas. La Hb A constituye aproximadamente el 97% de toda la Hb del adulto, mientras que en el recin nacido su cuanta es del 20-40% . Su estructura ha sido descrita en los puntos 4-1 y 4-2. Hemoglobina A2: (22) En el neonato representa menos del 0,5% del total de Hb, mientras que en el adulto representa el 0,3% a 2,6%, dichos valores dependen en parte del mtodo empleado para su cuantificacin . Su estructura es muy homognea debido a que las cadenas y de la Hb tan slo difieren en 10 de los 146 aminocidos que componen la secuencia primaria de la cadena . En vista de su baja cantidad en los glbulos rojos, la Hb A2 es poco probable que tenga algn papel fisiolgico en el transporte de O2. Sus propiedades de unin al O2 simulan aquellas de la Hb A. Las dos hemoglobinas tienen similar afinidad por el O 2, cooperatividad entre subunidades, efecto Bohr y respuesta al 2-3 DPG. La Hb A 2 es ms resistente a la desnaturalizacin trmica que la Hb A. Esto puede explicarse por un contacto adicional en la interfase 11, lo cual confiere aumento de la estabilidad al dmero . La aparente falta de un papel fisiolgico para la Hb A2 es compatible con mayores diferencias en la estructura primaria entre las cadenas de primates comparado con las cadenas . As ciertas mutaciones que en for ma significativa alteran la funcin o estabilidad de la Hb podra ser tolerado en la Hb A2 pero no en el componente responsable del transporte de la mayor parte del O2.
Puede encontrarse aumentada en for ma congnita en las -talasemias, en pacientes con S/ -talasemia, as como S/S y A/S y en forma adquirida en la anemia megaloblstica, hipertiroidismo y malaria. Por otra parte se encuentra disminuida en estados de carencia de hierro, anemias sideroblsticas, -talasemias, -talasemias, -talasemias y persistencia hereditaria de Hb fetal (PHHF). Lo nico que explica estas alteraciones es que las cadenas se combinan ms fcilmente con las cadenas que con las , por lo que tendrn ms posibilidad de formarse unin / en las -talasemias y homocigotos S/S y menos en las -talasemias. b) Hemoglobinas fetales El descubrimiento por Krber, en 1866, de que los hemolizados de glbulos rojos de recin nacidos eran resistentes a la desnaturalizacin por lcali, sugera que estas clulas contenan una Hb estructuralmente distinta. Esta conclusin fue reforzada por la demostracin que la Hb de un neonato tiene aumento de la absorbancia en el espectro ultravioleta, un hallazgo que hoy en da se sabe que se debe a un residuo adicional de triptofano en la cadena . El desarrollo de tcnicas cromatogrficas y electroforticas permiti el aislamiento y caracterizacin de la Hb F humana. Anlisis ms precisos de la Hb fetal purificada sugirieron que era un tetrmero con dos subunidades idnticas en comn con la Hb A (cadenas ). Sin embargo las otras dos subunidades tienen una estructura comn diferente de las subunidades de la Hb A. La estructura primaria de la cadena humana fue determinada por Walter Schroeder y colaboradores. La secuencia aminoacdica de la cadena de la Hb humana es muy similar a la de la cadena . Las secuencias de las dos protenas difieren en 39 de 146 residuos. De stos, 22 residuos estn en la superficie externa de la molcula, y es por lo tanto muy improbable que tengan otro efecto significativo sobre las propiedades de la Hb F fuera de la diferente carga elctrica. Las sustituciones internas son conservadoras involucrando a aminocidos de polaridad similar. Cuatro sustituciones ocurren en la interfase 11, las que probablemente explican el aumento de la estabilidad de la Hb F y la disminucin de la disociacin en monmeros. En contraste ninguna sustitucin ocurre en la interfase 12 que es tan importante para el
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efecto de cooperatividad entre subunidades. La Hb F tiene dos tipos de heterogeneidad estructural: gentica y post-traduccin. La heterogeneidad qumica de la Hb F humana fue descubierta en 1968 cuando se observ que la Hb F contena una mezcla de dos tipos de cadenas que diferan solamente en la presencia de un residuo de glicina (cadena G) o un residuo de alanina (AI) en la posicin 136. Las cadenas G (75%) y AI (25%) son los productos de genes no allicos, los cuales estn relacionados a los genes y . La disposicin del cluster del gen de las cadenas no es: 5 - - G - A - - - 3, en el cual representa el gen que produce la cadena embrionaria . As los nios recin nacidos producen una mezcla de dos tipos de Hb F. El componente mayor tambin denominado F0 son tetrmeros del tipo 2G2, que comprende la mayora de la Hb total. Una porcin de Hb F menos abundante (F1) y con un punto isoelctrico menor (carga ms negativa) difiere de la Hb F principal en que el tetrmero est compuesto por 2A I2. Un segundo y ms importante tipo de heterogeneidad estructural de la Hb fetal se origina de la presencia de diferentes genes que codifican para la cadena . La proporcin de G/A (de 3/1) es constante a travs del desarrollo fetal. En contraste a esto, la pequea cantidad de Hb F en los glbulos rojos del individuo adulto contienen alrededor de 40% de G y 60% de AI. La transicin del cociente fetal de G/A al del adulto ocurre en los primer os diez meses de vida. Mas recientemente se ha documentado otra importante heterogeneidad de cadena ; en la Hb F de alrededor de 30% de los recin nacidos blancos y 20% de los negros, una minora de cadenas AI (aproximadamente 18%) tienen treonina en vez de isoleucina en la posicin 75. En un nmero pequeo de homocigotos, esta subunidad compone alrededor del 30% del total de la Hb fetal del recin nacido. Esta sustitucin reside exclusivamente en la cadena A, de tal forma que esta subunidad ha sido designada como AT, y es en trminos estrictos una variante estructural de A. Desde el punto de vista funcional la Hb F tiene una mayor afinidad por el O2 que la Hb A. Esto es fundamentalmente consecuencia de la incapacidad de la Hb F para unirse al 2-3 DPG con la misma intensidad que la Hb A, lo que le confiere una ventaja funcional en la captacin de O2 a presiones bajas (pO2 de 45 mm Hg) como sucede en el intercambio placentario.
Los niveles de Hb F en el adulto se sitan por debajo del 2%. Sin embargo el desarrollo de mtodos ms sensibles y especficos como la cromatografa lquida de alta presin (HPLC), han demostrado que dichos niveles son ligeramente superior es en adultos aparentemente normales. Estos niveles se ven incr ementados en algunos trastor nos hereditarios tales como: -Talasemias, PHHF y en las hemoglobinopatas S, E y C homocigotas y en trastornos adquiridos como en la anemia megaloblstica, aplasia medular, algunas leucemias y tumores y durante el embarazo fisiolgico. Los niveles de Hb F pueden tambin verse afectados por diferencias en la atraccin para el ensamblaje de unas cadenas con otras, sugirindose que las subunidades se combinan con menor facilidad con las que con las , observndose Hb F ms baja en recin nacidos con -talasemia que en aquellos recin nacidos normales o con deficiencia de hierro. Hemoglobina de Bart (4 ) Se encuentra en cantidades menores del 2% en los neonatos normales. Es un tetrmero (4) funcionalmente anmalo, mostrando una afinidad por el O2 aumentado, ausencia de interaccin hemo-hemo y efecto Bohr. Se encuentra ligeramente aumentado en los recin nacidos con -talasemia y excepcionalmente en el adulto. c) Hemoglobinas embrionarias En 1961, Huehns y colaboradores descubrieron dos hemoglobinas en la sangre de embriones humanos y diferentes a la Hb A y a la Hb F. Estos componentes migraban ms lentamente que la Hb A2 al ser estudiados con electroforesis a pH alcalino (8.6). Se las design como Hb Gower 1 y Gower 2. Posteriormente Capp y colaboradores describen una tercera Hb embrionaria, la cual tiene un movimiento electrofortico similar a la Hb A a pH de 8.6, pero se separa de sta a pH cido y que denominaron Hemoglobina Portland I. Mientras los componentes menores de sta, Portland II y III fueron descubiertas ms tardamente. La estructura de las hemoglobinas embrionarias es la siguiente: Gower 1. Es un tetrmer o compuesto completamente de subunidades embrionarias, 22. Corresponde al componente mayor de las hemoglobinas embrionarias.
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Gower 2. Es un tetrmero compuesto de dos cadenas y dos cadenas (22). Las cadenas son codificadas por un gen localizado en el complejo gnico de -globina en el cromosoma 11. El gen est localizado en el lado 5 del gen G20 . Corresponde al componente menor de las hemoglobinas embrionarias. Hemoglobina Portland I. Es un tetrmero compuesto de dos cadenas y dos cadenas . La cadena muestra una fuerte homologa estructural con la cadena . El gen que la codifica se encuentra situado en el lado 5 de los genes de la cadena en el cromosoma 16. Respecto a la Hb A, la Hb Portland I tiene una mayor afinidad por el O 2 que la Hb A, menor cooperatividad entre subunidades y un efecto Bohr de aproximadamente la mitad. Estas tres hemoglobinas embrionarias recin sealadas: 22, 22 y 22 funcionan tambin como transportadores fisiolgicos de O2. Los glbulos rojos de los embriones en los cuales estas tres hemoglobinas predominan tienen una afinidad por el O2 similar a la de los eritrocitos de la sangre de cordn, y una curva de disociacin de O2 sigmoidea indicativa de que tambin existe el fenmeno de cooperatividad entre las subunidades. El efecto Bohr en los glbulos rojos embrionarios es similar al de los fetales. Las hemoglobinas embrionarias pueden ser fcilmente detectadas por isoelectroenfoque y por tcnicas cromatogrficas, aunque la separacin de la Hb Portland I y Hb A es difcil. 4.1.4. Ontogenia de la hemoglobina humana En la figura 3-7 se esquematiza el control gentico de la sntesis de las hemoglobinas humanas. Las hemoglobinas que predominan durante el perodo embrionario son las Gower 1, Gower 2 y Portland. Se ha visto en los embriones ms jvenes (examinados a los 37 das de gestacin) que la proporcin de hemoglobinas Gower 1 y 2 son del 42% y 24%, respectivamente del total, y el resto Hb F. En etapas posteriores la proporcin de Hb Gower desciende hasta casi ser indetectable en la 10-12 semana de gestacin. El perodo en el cual aparece y desaparece la Hb Portland ha sido ms difcil de determinar, ya que su migracin en gel de almidn es muy similar a la Hb A, siendo observada en
electroforesis de agar citrato. En los fetos normales a la 10 semana de gestacin se observa un 20% de Hb Portland del total de la Hb.
Figura 3-7. Control gentico de la sntesis de Hb humana. En blanco se sealan los genes activos; en punteado los genes poco activos; en sombreado, los genes que todava no son activos, y en rayado los genes que han pasado de activos a no funcionales.
La Hb F aparece precozmente durante la gestacin , siendo el 30% del total a los 37 das de gestacin y del 90% hacia la 8-10 semanas, permaneciendo as hasta poco antes del parto. Ambas cadenas tanto como se sintetizan desde el principio del embarazo y su relacin es de aproximadamente 3/1, permaneciendo de esta manera de forma constante. A los seis meses de vida extrauterina la cantidad de Hb F es menor del 1% aunque en nios normales pueda encontrarse con frecuencia niveles del 2-5%, para posteriormente situarse al ao en valores menores del 1%, que mantendr durante toda la vida. La Hb A en cuanta del 5-10% se detecta en fetos normales desde la 6 semana de gestacin en delante, aunque electroforticamente no sea demostrable hasta la 12 semana de vida. Pequeas cantidades de cadena pueden comprobarse por el estudio de sntesis de globinas antes de la 6 semana de gestacin; posteriormente se observa un ligero incremento en la sntesis de la cadena (hacia la 12-20 semana), proporcin que permanece constante hasta iniciarse la sntesis de Hb A. La Hb A2 aparece en ltimo lugar, se comienza a producir en el tercer trimestre de la gestacin, detectndose solamente trazas de Hb A2 en la sangre del cordn umbilical en el momento del nacimiento. Su sntesis se va incrementando a lo largo de los 6-12 primeros meses de vida hasta alcanzar los niveles definitivos. Por todo lo anteriormente sealado se entiende que el dficit o anomala de las cadenas se
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manifiesta mejor en el perodo neonatal. Despus del parto la sntesis de cadenas va aumentando y, puesto que la afinidad de las cadenas es mayor por las cadenas que por las , es por lo que las cantidades de Hb Bart (4) se cuantifican mejor en el neonato que en el adulto. Adems, como la cadena forma parte tambin de las hemoglobinas Gower 2, F, A y A2, la sntesis defectuosa de la cadena se va a manifestar en todas las etapas del desarrollo. En cuanto a las variantes estructurales de cadena que pueden aparecer, van a tener el mismo porcentaje de Hb anmala en el perodo neonatal que en el adulto, mientras que las de cadena se van a manifestar ms claramente durante el periodo de adulto, y por ltimo las variantes de Hb F (cadena ) se detectan mejor en el periodo neonatal, desapareciendo en la vida adulta. 4.2. Funcin de la hemoglobina La Hb tiene como funciones el transporte del O2 desde los pulmones a los tejidos, el traslado del CO 2 desde los tejidos a los alvolos pulmonares y acta adems como sistema tampn. 4.2.1. Transporte de oxgeno A nivel del mar el aire que respiramos contiene 20,95% de O2. La tensin de O2 ambiental (PO2) es aproximadamente 0,21 x 760 160 mm Hg. A medida que el aire pasa por la va area superior llega a saturarse completamente con agua. Dentro de las vas areas y pulmones el aire inspirado se mezcla tanto con el gas del espacio muerto y el gas alveolar que permanentemente est siendo alterado por captacin de O2 y liberacin de CO2 desde la sangre que pasa a travs de los capilares pulmonares. As la pO2 en el aire alveolar cae hasta alrededor de 95 mm Hg. La cantidad de O2 transportado a travs de la membrana alveolar por unidad de tiempo es un producto de la capacidad de difusin de la membrana por unidad de tiempo y la diferencia de pO2 entre el gas alveolar y la sangre del capilar pulmonar. Esta membrana es de alrededor de 0,2 m de grosor y consiste de surfactante, epitelio alveolar, membrana basal, tejido intersticial y endotelio capilar. El O2 es transportado pasivamente a travs de la membrana del capilar alveolar. En el tejido pulmonar normal la resistencia al movimiento
del gas a travs de esta membrana es prcticamente despreciable, un factor que contribuye levemente a crear un gradiente de O 2 alvolo-capilar es el tejido pulmonar, incluyendo macrfagos metablicamente activos que captan O2 directamente del gas alveolar. La expulsin de CO2 en la circulacin pulmonar resulta en un aumento en el pH intracelular. Debido al efecto Bohr, la afinidad por O 2 de la Hb aumenta, facilitando el transporte de O2 al glbulo rojo. La sangre de los capilares pulmonares se mezcla con sangre de las venas bronquiales, pleurales y de Tebesio. En condiciones normales este shunt produce una cada de la pO2 en las venas pulmonares a 90 mm Hg. Esta presin parcial de O2 se mantiene hasta que la sangre alcanza las arteriolas. La difusin de O2 dentro y fuera del eritrocito es incrementada por la alta concentracin intracelular de Hb. La membrana del glbulo rojo no posee una barrera adicional, pero la capa de agua que circunda a la clula retrasa la tasa de captacin y liberacin del O2. As, las tasas de oxigenacin y desoxigenacin de las suspensiones de glbulos rojos son diez veces menores que una solucin equimolar de Hb. Sin embargo los tiempos de trnsito en los capilar es pulmonares y perifricos son aproximadamente de cinco veces el tiempo medio que se requiere para r ealizar la oxigenacin y desoxigenacin. En un individuo normal y en reposo el glbulo rojo tarda alrededor de 0,75 seg. en transitar a travs del lecho capilar pulmonar. Se ha estimado que el equilibrio con el gas alveolar se completa en 0,35 seg. 4.2.2. Descarga de oxgeno a los tejidos El transporte de O2 a los tejidos est gobernado por tres variables independientes que pueden expresarse cuantitativamente en la ecuacin de Fick: VO2= 0.139 x Q x Hb x (SAO2-SVO2) VO2 es la cantidad de O2 liberado (L/min), 1,39 es la cantidad (en mL) de O2 unido por 1 g de Hb totalmente saturada, Q es el flujo sanguneo (L/min), y SAO2 y SVO2 son saturaciones de O2 arterial y venosa mixta (%). En esta frmula la pequea cantidad de O2 disuelta en sangre no es considerada.
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La concentracin de Hb de la sangre es la resultante del balance entre eritropoyesis y destruccin de glbulos rojos. El flujo sanguneo a un tejido determinado est controlado por un complejo interjuego de factores locales, neurales y hormonales. El tercer factor en la ecuacin de Fick (SAO2S VO 2) es una expresin cuantitativa de la descarga fraccional de O2 de la Hb durante el flujo de sangre desde la arteria a la vena. Este parmetro es dependiente de la curva de disociacin del O2 de la Hb de la sangre. En condiciones fisiolgicas la sangre est casi totalmente saturada de O2 durante la circulacin por los pulmones. Durante el flujo a travs de los capilares sistmicos la Hb permite una importante descarga de O2 a pesar de una pequea cada en la pO2. Esto permite que el O2 sea liberado en el plasma a concentraciones lo suficientemente altas como para mantener un gradiente adecuado al interior de las clulas. Adems de los tres determinantes importantes expresados en la ecuacin de Fick, otras variables a nivel tisular influyen en la descarga de O 2 . En los capilares la tensin de O 2 plasmtica es de alrededor de 1 mm Hg menor que dentro del eritrocito. El gradiente de pO2 entre el plasma y el interior de las clulas tisulares depende de diversos factores independientes, incluyendo el patrn y densidad de los capilares como tambin su flujo relativo. Ms an, este gradiente est afectado por diferencias en la difusin de O2 entre los tejidos y la afinidad por O2 de las enzimas que utilizan O2. En la mayor parte de los tejidos, el transporte de O2 en la clula est limitado por la capacidad de difusin. La transferencia de O2 a travs del protoplasma tisular es ms rpida que a travs de un gr osor equivalente de H 2 O. La musculatura cardiaca y esqueltica tiene altas concentraciones de mioglobina dentro del citoplasma. Debido a su alta afinidad por O2 esta protena almacena O2. La mioglobina tambin facilita el transporte de O2 dentro de la clula. La pO2 dentro de las clulas musculares del miocardio ha sido estimada en 5 mm Hg. Se requiere una pO2 de alrededor de 0,5 mm Hg para el proceso de respiracin mitocondrial. Si la tensin de O2 cae bajo de 0,1 mm Hg, la respiracin tisular cesa y sobreviene la muerte celular.
4.2.3. Mecanismo de carga de oxgeno Perutz y colaboradores propusieron la base molecular de los cambios que se producen en la Hb con la llegada del O2 . (figura 3-8).
Figura 3-8. Esquema muestra que en la oxigenacin el tomo de hierro se desplaza hacia el plano del Hemo.
La oxihemoglobina presenta el tomo de hierro en el plano del anillo del hemo, impulsando hacia arriba la histidina F8. El residuo aminoacdico HC3 rota libremente, insertndose la molcula de O2 entre el hierro y los residuos E7 y E11. El residuo HC2 (tirosina) se encuentra libre y puede mantenerse suelto entre las hlices F y H. La hlice E se desplaza hacia adentro si el O2 es expulsado, y el tomo de hierro sale del plano del hemo al aumentar su tamao en un 13% con la ganancia de un electrn, desplazndose 0,6 hacia F8. La hlice F se aleja de la H dejando una cavidad que ser ocupada por el residuo HC2. En la desoxihemoglobina la hlice F se ha desplazado en forma importante, permitiendo que el residuo HC2 se aloje firmemente entre ella y la hlice H. El residuo HC3 se sita en una posicin tal, que forma enlaces inicos que estabilizan la conformacin desoxi. El cambio de la for ma T (tensa) de la desoxihemoglobina a la R (relajada) de la oxihemoglobina comprende una serie bien definida de modificaciones estructurales que incluyen la ruptura de las uniones que estabilizan la forma T, y la rotacin relativa de la cadena sobre la , con abundancia de movimientos intramoleculares a nivel de la interfase 12. La porcin C-terminal de las cadenas y contribuye fundamentalmente a la estabilidad de la forma T, pues la penltima tirosina de ambas cadenas ( 140 y 145) est anclada en una hendidura entre las hlices F y H.
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En la cadena la arginina C-terminal participa en dos uniones salinas, en una el grupo guanido est unido a un aspartato (residuo 126) de la misma cadena , y en otra el grupo carboxilo puede unirse al grupo amino N-terminal de la otra cadena . El extremo C-terminal de la cadena juega un papel igualmente importante, as la histidina Cterminal ( 146) constituye dos uniones salinas: su grupo carboxilo se liga al grupo -amino de la lisina 40, y su grupo imidazol forma una unin intra-subunidad con el carboxilo del aspartato 94, as por ejemplo en la Hb Barcelona [94 (FG1) AspHis] al romper esta unin salina, la estructura desoxi es menos estable, produciendo una afinidad aumentada y un efecto Bohr reducido. La estructura cuaternaria de la desoxihemoglobina es mucho ms estable que la forma oxi, debido a uniones inicas inter o intra-subunidad cuya alta energa es liberada cuando el tomo de hierro realiza su desplazamiento de 0,6 hacia el plano del hemo al entrar el O2 en la cavidad. Dado que el hemo de la cadena es ms accesible para el O2 que los de las , las son oxigenadas primero, inicindose en ellas los cambios conformacionales que conducen a la oxigenacin de la molcula completa, rompiendo las cadenas posteriormente sus uniones con el 2-3 DPG, y aproximndose stas tras la expulsin del fosfato orgnico. 4.2.4. Interaccin hemo-hemo La entrada de O2 en el interior del tetrmero de Hb permite una captacin ms fcil de las siguientes molculas de este gas, es decir la incorporacin de O2 a una cadena aumenta la afinidad que por este gas tienen el resto de las cadenas que todava no han reaccionado con l, esta es la base del denominado efecto hemohemo o de cooperatividad. Este mecanismo tan eficiente de transporte de O2 no podra ser posible si no fuera por la forma sigmoide de la curva de disociacin entre el O2 y la Hb, pr oducto del fenmeno de cooperatividad recin sealado. Si cada uno de los cuatro grupos hemo de la molcula de Hb se unieran a O2 independientemente de los otros, la curva de disociacin del O2 sera de forma hiperblica como la de la mioglobina. Como se muestra en la figura 3-9, tal curva hiperblica que presenta la mioglobina no es buena para el transporte de O2, ya que al no existir cooperacin hemo-hemo se aprecia una
gran afinidad por el O2, lo que le incapacita para transportarlo, favoreciendo lo que realmente es su funcin, que en el caso de la mioglobina es el almacenamiento de O2 en los tejidos. Para que la Hb cumpla con su papel fisiolgico debe ligar O2 con una afinidad apropiada. Si la ligazn O2-Hb fuera demasiado dbil la sangre no podra oxigenarse en la circulacin pulmonar, si fuera muy fuerte slo una escasa cantidad de O2 sera descargada a los tejidos.
Figura 3-9. Curva de disociacin de oxgeno de Hb y mioglobina a 37C y pH 7,4.
La afinidad del O2 por la Hb es convenientemente expresada en trminos de P50, y corresponde a aquella tensin de O2 en la cual la Hb est saturada al 50%. A mayor afinidad de la Hb por O2 menor ser la P50 y viceversa. De este modo la P50 est inversamente relacionada a la afinidad por O2. La P50 normal para la sangre humana en condiciones fisiolgicas a pH de 7,4 y temperatura de 37C es de 26 + 1 mm Hg. Existe un gran nmero de factores genticos y medioambientales que afectan la afinidad por O2 de la sangre humana (figura 3-10). Los tres determinantes primarios de la afinidad de la sangre completa son: temperatura, pH y 2,3 DPG intraeritrocitario.
Figura 3-10. Curva de disociacin de la Hb A. Se indican los desplazamientos hacia la izquierda o hacia la derecha en relacin con los cambios de pH, la concentracin de 2,3 DPG y la temperatura.
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a) Temperatura La relacin entre temperatura y afinidad por O2 es un fenmeno apropiado desde el punto de vista fisiolgico. De este modo, en condiciones de hipoter mia r elativa, las demandas metablicas son comparativamente ms bajas. Debido a la desviacin a la izquierda en la curva de disociacin del O2, menos cantidad de O2 es liberado a los tejidos. A la inversa, si la temperatura aumenta sobre lo normal, la desviacin de la curva a la derecha resulta en una diminucin de la afinidad por O2 y as mayor descarga de O2. En individuos homeotermos, como es el caso del hombre, solamente se permiten leves variaciones en la temperatura corporal, y para que este fenmeno (P 50 /T) sea fisiolgicamente importante debe ser pronunciado. El efecto del pH y del 2,3 DPG intraeritrocitario ser descrito ms adelante, por ahora baste decir que el aumento del pH y la disminucin del 2,3 DPG desvan la curva de saturacin hacia la izquierda, es decir aumentan la afinidad de la Hb por O 2. Un efecto contrario, es decir desviacin hacia la derecha y disminucin de la afinidad por el O2 se produce si disminuye el pH y aumenta el 2,3 DPG intraeritrocitario. b) Efecto Bohr Bohr, Hasselbach y Krogh, descubrieron que la afinidad de la Hb por el O 2 disminuye al aumentar las cantidades de CO 2. Estudios posteriores demostraron que este efecto era debido primariamente a una reduccin en el pH. Los investigadores rpidamente dilucidaron el significado de estas observaciones. Concluyeron que un organismo liga y descarga O2 y CO2 recprocamente: el O 2 es captado por los pulmones a medida que el CO2 es expelido. En los tejidos ocurre el proceso inverso. Debido al efecto Bohr, el intercambio de CO2 facilita el intercambio de O2 y viceversa. Sobre un rango de pH fisiolgico, la P 50 vara inversamente con el pH. Esto corresponde al denominado efecto Bohr alcalino. A medida que el CO2 es expelido durante la circulacin a travs de los pulmones hay un correspondiente aumento en el pH y una disociacin a la izquierda en la curva de disociacin del O2. De este modo el relativo aumento en la afinidad por O2 favorece la unin del O2 a la Hb. A la
inversa, a medida que la sangre circula a travs de los capilares el CO2 entra al plasma y glbulos rojos. Debido a la abundancia de anhidrasa carbnica en los glbulos rojos, rpidamente se forma cido carbnico: CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 . La ionizacin de este cido dbil (H2CO3H++HCO3-) provoca una disminucin en el pH intracelular. Debido al efecto Bohr la afinidad de la Hb por el O2 disminuye, resultando en una mejora en la descarga de O2 a los tejidos. As, el efecto Bohr per mite un ciclo fisiolgicamente apropiado para el trasporte de O2 y CO2 en el organismo. El hecho de que los protones se unan ms fcilmente a la estructura desoxi (T) que a la oxi (R), es debido a que hay grupos especficos sobre la molcula en este estado cuando las uniones salinas se han formado, que tienen una mayor afinidad por ellas. Se han identificado tres lugares que contribuyen al efecto Bohr alcalino: el imidazol de la histidina 146 (HC3), el grupo amino N-terminal de la cadena , y el imidazol de la histidina 122 (H5). 4.2.5. Sistema tampn Dependiente del efecto Bohr, la unin de protones a la Hb representa el sistema tampn ms importante para mantener neutro el pH intracelular. Es decir, la mayor parte del CO2 producido en los tejidos pasa a los hemates donde se hidratan rpidamente gracias a la accin de la anhidrasa carbnica eritrocitaria, se genera H2CO3 que se disocia a H+ y HCO3-, siendo la Hb capaz de captar este hidrogenin y equilibrando de este modo el pH intracelular. As mismo, el bicarbonato formado en los eritrocitos pasa a constituir en el plasma el sistema amortiguador ms eficaz de que dispone la sangre. 4.2.6. Transporte de CO2 El CO2 es transportado principalmente como ion bicarbonato. En condiciones fisiolgicas slo un 10% del CO2 producido por la respiracin tisular es transportado como complejo carbamino con la Hb. El CO2 puede combinarse de forma no enzimtica con el grupo amino N-terminal de la molcula. Lo mismo que con la unin a los protones, la carbamino Hb a un determinado pH tiene una
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afinidad por el O2 ms baja que lo que pueda tener la Hb en ausencia de CO2. Las cadenas y difieren en su interaccin con el CO2. En ausencia de fosfatos orgnicos (2-3 DPG) la cadena de la desoxihemoglobina se une al CO 2 con una afinidad aproximadamente tres veces mayor que la cadena . 4.2.7. Interaccin con aniones inorgnicos La afinidad de la Hb por el O 2 disminuye pr ogr esivamente en la presencia de concentraciones ascendentes de fosfato inorgnico o ion cloruro. Estos aniones inorgnicos se unen ms fuertemente a la desoxihemoglobina que a la oxihemoglobina. Los sitios de enlace a la desoxihemoglobina han sido identificados mediante anlisis de rayos-X. En ausencia de fosfatos orgnicos hay dos sitios en la molcula de desoxihemoglobina que tienen relativamente alta afinidad por el cloruro: los grupos amino de las cadenas , y el grupo amino del aminocido lisina de la cadena 82 (EF6). Ya que este ltimo sitio sealado es un importante lugar de unin del 2-3 DPG, es muy pr obable que no ligue cantidades significativas de cloruro en condiciones fisiolgicas. En contraste a esto, la interaccin del cloruro en la regin N-terminal de la cadena es un importante determinante de la funcin de la Hb. El enlace del cloruro en este sitio estabiliza la hidrogenacin de este grupo amino elevando su pKa. Despus de la oxigenacin tanto el cloruro como el protn son liberados. As parte de la dependencia del pH del fenmeno de oxigenacin (efecto Bohr) est relacionado al enlace del cloruro. De hecho, el efecto Bohr alcalino disminuye a alrededor de la mitad, si la concentracin del ion cloruro est reducida desde el nivel fisiolgico (0,1 M) hasta cero. 4.2.8. Interaccin con fosfatos orgnicos El glbulo rojo humano y el de otros mamferos tiene concentraciones muy altas del intermediario de la va glicoltica, 2-3 DPG. Aunque es el fosfato orgnico ms abundante al interior del glbulo rojo, est presente slo en cantidades trazas en otros tejidos. Su concentracin dentro del eritrocito es de 5mM por litro de eritrocitos concentrados. Todos los otros fosfatos orgnicos se encuentran en
concentraciones mucho menores. En el ao 1967 dos grupos de investigadores en forma independiente demostraron que el 2-3 DPG es un potente modificador de la funcin de la Hb. A la Hb que se le ha extrado todos los fosfatos orgnicos intraeritrocitarios tiene una afinidad por O2 inesperadamente alta, aunque la interaccin hemo-hemo y el efecto Bohr permanezcan intactos. En sentido inverso, la adicin de bajas concentraciones de 2-3 DPG resulta en una disminucin progresiva en la afinidad por O2. La potencia relativa de otros fosfatos orgnicos en disminuir la afinidad de la Hb por O2 es proporcional a su fuerza aninica. El 2-3 DPG se une a la desoxihemoglobina en una relacin molar de 1:1, y mucho menos fuertemente a la oxihemoglobina y otras formas ligadas como la carboxi o cianmetahemoglobina. El ATP se une a la Hb competitivamente con el 2-3 DPG, y al igual que ste es en una relacin molar de 1:1. Adems de los protones, CO2 y cloruro, el 2-3 DPG se une a la Hb de una forma recproca al O2 Hb DPG + 4O2 Hb (O2)4 + DPG Los lugares precisos de la desoxihemoglobina sobre los cuales se une el 2-3 DPG son el grupo amino N-terminal de la cadena , los imidazoles de la histidina 143 y el grupo amino de la lisina 82 (EF6), esto explica que la Hb A1C y la F1, hemoglobinas que tienen bloqueado el Nter minal de la cadena no , tengan marcadamente alterada su reactividad con el 2-3 DPG. Adems se ha demostrado que el CO2 compite con el 2-3 DPG en su unin a la Hb. La alta afinidad de la Hb por el O2 de la sangre fetal puede explicarse por la elevada reactividad de la Hb F humana con el 2-3 DPG y podra justificarse por las diferencias en la estructura primaria entre las cadenas y en la posicin 143 (H21): histidina en la cadena y serina no cargada en la cadena . En resumen, como se ha dicho, el 2-3 DPG se une firmemente a lugares especficos sobre la desoxihemoglobina, sin embargo los cambios conformacionales inducidos por la oxigenacin debilitan esta unin expulsando de una forma definitiva al 2-3 DPG cuando se alcanza la forma R, al incorporarse el tercer O2 al tetrmero.
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5. DESTRUCCIN DE LOS HEMATES La vida media de los hemates cuando pasan de la mdula sea al sistema circulatorio es de aproximadamente 120 das. Una vez que la membrana de los hemates se hace frgil, la clula puede romperse al pasar a travs de algn vaso sanguneo estrecho de la circulacin. Sin embargo, la mayora de los hemates se fragmentan en el bazo, donde se estrujan al pasar a travs de la pulpa roja y no reciben la cantidad de glucosa adecuada lo que termina alterando su metabolismo, los eritrocitos envejecidos por lo regular tienen un aumento en la permeabilidad de cationes y las clulas disminuyen rpidamente la concentracin de ATP al intentar mantener un equilibrio osmtico mediante el bombeo de estos cationes en exceso fuera de la clula, por tanto, el medio esplnico est bien preparado para eliminar estos eritrocitos. Los espacios entre las trabculas estructurales de la pulpa roja, por los cuales deben pasar la mayor parte de las clulas, son slo de 2-3 m de ancho, comparados con los 8 m de dimetro de los hemates. Cuando se extirpa el bazo, aumenta considerablemente el nmero de hemates anormales y de clulas viejas circulantes. Normalmente la destruccin de los GR se lleva a cabo pr eferentemente en el espacio extravascular (90%). Los macrfagos del recubrimiento inter no de los vasos, especialmente del bazo y del hgado, fagocitan (ingieren y destruyen) los hemates envejecidos, anormales o fragmentados. La Hb liberada por la destruccin celular es fagocitada y digerida por el sistema fagoctico mononuclear (SFM), liberando: Hierro. El hierro vuelve a la mdula sea para ser utilizado en la formacin de nueva Hb o va al hgado y otros tejidos donde se almacena en for ma de ferritina o hemosiderina, pero la mayor parte se une a su protena de transporte, transferrina. Aminocidos. Los aminocidos, liberados de las globina de la Hb son utilizados en la sntesis de nuevas protenas (pool de aminocidos). Bilirrubina. El grupo Hemo se rompe libera el hierro y en el anillo de protoporfirina IX liberado el puente -metano del anillo de porfirina se une, producindose un mol de monxido de carbono y biliverdina. El monxido se libera al torrente sanguneo y
se transporta como carboxihemoglobina a los pulmones, y se exhala. La biliverdina es rpidamente reducida dentro de la clula a bilirrubina, una vez liberada del macrfago se une a la albmina plasmtica y llevada al hgado, en ste se conjuga volvindose polar e insoluble de tal forma que se excreta a la bilis para ser convertida a urobilingeno en el tracto intestinal y ser eliminado a travs de las heces y la orina. LECTURAS SUGERIDAS Benesch, R., Benesch, R.E., and Enoki, Y. The interaction of hemoglobin and its subunits with 23 DPG. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1968; 61: 1102. Benesch, R., Benesch, R.E., and Yu, C.I. The oxygenation of hemoglobin in the presence of DPG. Effect of temperature, pH, and ionic strength and hemoglobin concentration. Biochemestry 1969; 8: 2567. Biss, E., and Wieland, H. HPLC of human hemoglobins, a new approach to the study. J. Chromatogr 1988; 434: 95. Bisse, E., Wieland, H. HPLC separation of Human Haemoglobins. J Chromatogr 1988; 434: 95. Bunn, H. F. and Forget, B. G. Hemoglobin structure in Hemoglobin: Molecular, genetic and clinical aspects. W. B. Saunders; Phyladelphia; 1986: 13 Bunn, H.F., and Briehl, R.W. The interaction of 2-3 DPG with various human hemoglobins. J. Clin. Invest 1970; 49: 1088. Capp, G.L., Rigas, D.A., and Jones, R.T. Hemoglobin Portland 1: a new human hemoglobin unique in structure. Science 1967; 157:65. Dikerson, R.E., Geis, I. Hemoglobin: Structure, Function, Evolution and Pathology. The Benjamin/Cummings Companny Inc. Menlo Park 1983:263. Foradori, A. Hemoglobina: Metabolismo y Funcin en Fisiologa de la sangre, Mezzano D., Pereira J. Eds. Editorial P. Universidad Catlica de Chile, 1993. Garraty, G., Telen, M.J., Petz, L.D. Red Cell Antigens as Functional Molecules and Obstacles to Transfusion. Hematology, 445-462, 2002
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HEMATOLOGA
Captulo
ANEMIA Y SNDROME ANMICO

Ivn Palomo G. y Pablo Lira V.
1. 2. 3.
Introduccin Definicin de anemia Estudio de laboratorio 3.1. Recuento de GR, Hto y Hb 3.2. ndices eritrocitarios 3.3. Recuento de reticulocitos e ndice reticulocitario Mecanismos de adaptacin y sintomatologa 4.1. Mecanismos de adaptacin 4.2. Sntomas y signos Clasificaciones de las anemias 5.1. Clasificacin morfolgica 5.2. Clasificacin fisiopatolgica 5.2.1. Anemias arregenerativas 5.2.2. Anemias regenerativas
4.
5.
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RESUMEN
Las anemias se encuentran entre las patologas hematolgicas ms frecuentes. Este captulo introductorio sobre anemias, incluye aspectos como: definicin de anemia, estudio de laboratorio, mecanismos de adaptacin y sintomatologa, y clasificaciones de las anemias. Respecto a este ltimo tema, se describe las clasificaciones morfolgica y fisiopatolgica.
1.
INTRODUCCIN
2. DEFINICIN DE ANEMIA La definicin ms aceptada de anemia es la propuesta por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), la que se basa en la concentracin de hemoglobina (Hb). Se entiende que una persona pr esenta anemia cuando la concentracin de Hb est por debajo de los valores normales. El valor normal de Hb vara segn la edad, el sexo, y algunas situaciones especiales como la altura de residencia. As, los nios de 6 meses a 6 aos con concentracin de Hb menor de 11 g/dL, y de 6 a 12 aos con Hb inferior a 12 g/dL, presentan anemia. Para los adultos el criterio es diferente segn se trate de hombres o mujeres; el lmite inferior normal es de 13 y 12 g/dL de Hb, respectivamente. En mujeres embarazadas (a nivel del mar) los valores normales de Hb no deben ser inferiores a 11 g/dL. Adems del criterio bsico de la OMS, la definicin de anemia puede asimismo incluir los valores de hematocrito (Hto) y el recuento de glbulos rojos (GR). As, se considera que un hombre presenta anemia cuando tiene un recuento de GR menor de 4.5 x 106/L, menos de 13 g/dL de Hb y menos de 42% de Hto. Dichos valores en la mujer son de 4 x 106/L, 12 g/dL y 37%, respectivamente. En la tabla 41 se muestran valores normales para Hb en adultos y nios.
Se denomina sndrome anmico al conjunto de sntomas y signos que aparecen con la anemia. La anemia es un sntoma y no una enfermedad definida, por ello al pesquisar una anemia, ya sea por un examen de laboratorio o por la clnica, se debe avanzar en el diagnstico y determinar la causa, ya que el tratamiento es diferente en cada caso. Los signos y sntomas que acompaan a la anemia son consecuencia de los mecanismos de adaptacin del organismo frente al fenmeno de hipoxia, lo que resulta de la falla en la capacidad de aporte de oxgeno a los tejidos. Dichos cambios son ms evidentes en los sistemas respiratorio y cardiovascular, y cuyo desarrollo est en relacin directa con la severidad y tiempo de evolucin del proceso patolgico. La anemia es la causa ms frecuente de consulta hematolgica, afecta a un 30% de la poblacin mundial de todas las edades y clases sociales, y es cuatro veces ms frecuente en la mujer que en el hombre. Las mujeres presentan un peak en la edad frtil. Ms de la mitad de las anemias son debidas a deficiencia de hierro y alrededor de un tercio a dficit de folato o vitamina B12. En este captulo se revisarn bsicamente tres aspectos: definicin de anemia, estudio de laboratorio, mecanismos de adaptacin y sintomatologa, y clasificaciones de las anemias.
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Tabla 4-1. Valores normales de hemoglobina Hemoglobina (g/dL) Adultos Nios Mujeres Varones 0-2 semanas 2-6 meses 6 meses-6 aos 6-12 aos El diagnstico de anemia requiere establecer una buena historia clnica y el hallazgo de parmetros especficos de laboratorio. El establecimiento de la causa subyacente en cada caso de anemia es esencial para el tratamiento adecuado. La determinacin de Hb es una medida de concentracin, por lo que se debe tener en cuenta el estado general del individuo y los anlisis deben ser considerados en el contexto clnico del paciente ya que, a veces, los valores tomados aisladamente, aunque normales, pueden indicar anemia, por ejemplo un paciente de sexo masculino que acostumbra tener un Hto de 49 a 50%, que baja bruscamente a 42%, puede padecer anemia aunque esta cifra sea normal. De la misma forma, los individuos que viven en zonas de grandes alturas y los fumadores crnicos son nor malmente policitmicos, de esta manera en ellos un Hto o Hb normal puede significar anemia. Debe considerarse que el Hto y la Hb relacionan los GR con el plasma de modo que si aumenta el volumen plasmtico (hemodilucin) puede encontrarse un Hto y Hb bajos simulando una falsa anemia como sucede en la hipopr oteinemia, insuficiencia cardaca, hiperesplenismo, etc. Lo opuesto puede suceder en casos de deshidratacin en que la disminucin del volumen plasmtico aumenta artificialmente el nmero de GR, de modo que los pacientes que realmente son anmicos en condiciones de deshidratacin podran tener valores medidos de GR, Hto y Hb normales. 3. ESTUDIO DE LABORATORIO 3.1. Recuento de GR, Hto y Hb Actualmente los sistemas analticos (ver captulo 27) bien estandarizados y sometidos a un 12-16 13-17 13.5-18.5 9.5-13.5 11-14 12-15.5
riguroso control de calidad, ofrecen valores hematolgicos de exactitud y reproducibilidad dentro de los lmites clnicamente tiles, tanto para el diagnstico de las anemias como para el seguimiento de su evolucin y el control del tratamiento. El hemograma proporciona informacin inicial muy importante para el diagnstico de anemia. Al nacer el recuento de GR es ms elevado; luego, a partir de los dos meses siguientes, ocurre una disminucin gradual de los mismos. Posteriormente sigue un incremento, tambin gradual, hasta alcanzar los valores del adulto. En la pubertad se presenta una diferencia segn sexo, con recuentos menores en las mujeres en relacin con los hombres. Su valor normal es en mujeres: 3,9-5,4 x106 /l, hombres: 4,06,0 x106 /l. El hematocrito es el porcentaje que, del volumen total de la sangre, corresponde a los GR. Es una medicin compuesta por el tamao y nmero de GR. Como se indic en el punto 2, los valores normales varan segn el sexo y la edad. La hemoglobina es el principal componente de los eritrocitos y su funcin es transportar el oxgeno y dixido de carbono. Su valor es ms importante que el de los GR ya que la capacidad de la sangre para combinarse con el oxgeno es directamente proporcional a la concentracin de Hb. Al igual que el recuento de GR y el Hto, los valores normales dependen de la edad y sexo (ver punto 2). 3.2. ndices eritrocitarios Los ndices eritrocitarios son muy importantes para clasificar las anemias desde el punto de
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vista morfolgico y, por lo tanto, para iniciar su estudio diagnstico. El volumen corpuscular medio (VCM) es una expresin, en trminos absolutos, del volumen o tamao promedio de los eritrocitos. Se determina en forma directa con contadores celulares automatizados; cada GR pasa a travs de un orificio por donde fluye una corriente elctrica; la clula produce un pulso de voltaje cuya magnitud es proporcional al volumen celular (ver captulo 27). Sin embargo, tambin puede calcularse a partir del Hto y el recuento de GR. El valor normal es de 80-100 fL. Su determinacin permite clasificar las anemias en normocticas, microcticas y macrocticas. La concentracin de Hb corpuscular media (CHCM), define la concentracin de Hb promedio por mL de eritrocitos (ver captulo 27). En adultos los valores normales son de 32 a 36%. Sobre la base de valores de CHCM, las anemias pueden ser clasificadas como normocromas, o hipocromas (CHCM: < 32%). La Hb corpuscular media (HCM), corresponde al valor promedio de la Hb contenida en cada hemate. Los valores normales van de 28 a 32 pg. La HCM siempre debe relacionarse con la CHCM y la VCM. Valores menores de 27 pg se observan en las anemias hipocromas. 3.3. Recuento de reticulocitos e ndice reticulocitario El recuento reticulocitario valora la produccin de GR, permitiendo clasificar las anemias en regenerativas o arregenerativas. Se determina por recuento directo en el frotis mediante una tincin con azul de cresil brillante o de forma automtica con los contadores electrnicos y se expresa en porcentaje o como nmero absoluto sobre el nmero de eritrocitos, siendo nor mal 0.5-2% y 25 - 85 x 10 3 /L, respectivamente. Si el nmero absoluto es mayor de 100 x 103/L, indica una eritropoyesis aumentada (mdula sea) en respuesta a la anemia; se observa en las anemias regenerativas (ej. anemias hemolticas). El recuento porcentual de reticulocitos podra dar un valor falsamente elevado en anemias con disminucin importante del nmero de eritrocitos. Para evitar esta distorsin se debe usar el recuento absoluto de reticulocitos o el ndice de produccin reticulocitaria (IPR) segn la frmula: IPR = IR/ 2, donde IR (ndice reticulocitario) se determina con la frmula: IR = porcentaje reticulocitos x Hto paciente x 100/Hto normal (Hombres: 45,
Mujeres: 40). Los IPR menores de 2, son propios de las anemias arregenerativas y los mayores de 2-3 de las anemias regenerativas. 4. MECANISMOS DE ADAPTACIN Y SINTOMATOLOGA 4.1. Mecanismos de adaptacin La principal funcin de los eritrocitos es transportar el oxgeno a los tejidos. El adulto normal requiere 250 mL de oxgeno por minuto. La capacidad de transporte de oxgeno por la sangre normal es de 1.34 mL por gramo de hemoglobina o 20 mL de O2 por 100 mL de sangre. La consecuencia de la anemia es la hipoxia tisular; si esta alteracin se desarrolla en forma paulatina permite el desarrollo de mecanismos de adaptacin que tratan de mantener la oxigenacin de los tejidos: a) Aumento del 2,3 difosfoglicerato (2,3-DPG) eritrocitario. El aumento del 2,3 DPG se asocia a disminucin de la afinidad de la Hb por el oxgeno, por lo que aumenta su liberacin a los tejidos. En algunas anemias, como en el dficit de piruvato kinasa que desde el principio presentan aumento de 2,3-DPG, los sntomas son menores para el mismo descenso de la Hb. En algunas hemoglobinopatas que presentan Hb con disminucin de la afinidad por el oxgeno, ocurre lo mismo; en estos casos se explica porque la liberacin de oxgeno es mayor y, por lo tanto, el sndrome anmico es ms leve. La hipoxia celular estimula el metabolismo anaerbico y la acumulacin de cido lctico, con lo cual la curva de disociacin de la hemoglobina se desplaza a la derecha (efecto Bohr). b) Aumento de la produccin de GR. La disminucin de la oxigenacin renal conlleva un aumento de la produccin de eritropoyetina para aumentar la produccin de GR. Este mecanismo es lento y es efectivo si la eritropoyesis es normal. La maduracin normal de eritrocitos en la mdula sea demora 7 das, pero el estmulo producido por la eritropoyetina reduce dicho perodo a 3-4 das. c) Redistribucin sangunea. Algunos rganos como el cerebro y el corazn necesitan para su funcionamiento una concentracin de oxgeno mantenida, por lo que en la anemia se redistribuye el flujo sanguneo de otros sectores como piel y rin hacia rganos vitales como los antes mencionados. El organismo produce
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una redistribucin del flujo sanguneo con vasoconstriccin cutnea y la consiguiente palidez, tambin debida a la disminucin de la Hb. La vasoconstriccin esplnica causa anorexia y nuseas y la vasoconstriccin renal produce un aumento de la secrecin de aldosterona con retencin de lquidos y hemodilucin. d) Estimulacin cardaca. Es el mecanismo compensador ms importante, aumenta la fuerza de contraccin ventricular y la frecuencia de la misma. Adems pr oduce una vasodilatacin arteriolar a nivel visceral con vasoconstriccin cutnea y muscular esqueltica. Todo ello produce una hiperkinesia circulatoria que se manifiesta clnicamente (palpitaciones, taquicardia con pulso saltn, soplos cardacos funcionales, aumento de la presin arterial diferencial, cefaleas pulstiles) y que sumada a la disnea, mareos y palidez mucocutnea, permiten el diagnstico de sndrome anmico. 4.2. Sntomas y signos En la aparicin de los sntomas influyen varios factores, entre ellos es importante el tiempo en que se desarrolla la anemia. Una anemia que se instala en forma lenta puede que no presente sntomas o stos sean muy leves; en cambio frecuentemente los provoca aquella de
instalacin brusca. Otros factores que influyen en la aparicin de sntomas son la edad y el estado previo de salud. En la (tabla 4-2) se mencionan las manifestaciones clnicas ms importantes del sndrome anmico. Los signos que suelen apreciarse en la exploracin fsica de los pacientes con anemia son: Palidez: secundaria a la disminucin de aporte de sangre a la piel para aumentarla en otros rganos ms vitales. Taquicardia: mecanismo compensador del corazn; a veces tambin soplo cardiaco funcional. Taquipnea: aumento de la frecuencia respiratoria. Hipotensin: manifestacin de la prdida de volumen sanguneo en casos de anemia aguda. Signologa especfica: en los casos de anemia hemoltica es habitual encontrar ictericia (conjuntiva y piel) y esplenomegalia. En los pacientes con dficit de vitamina B12 pueden existir alteraciones en el sistema nervioso.
Tabla 4-2. Manifestaciones clnicas del sndrome anmico Manifestaciones generales Astenia Manifestaciones cardiovasculares Palpitaciones Disnea de esfuerzo Hipotensin Manifestaciones neurolgicas Cefalea Mareo, vrtigo Somnolencia, confusin, irritabilidad Ruidos en los odos (tinitus) Manifestaciones en la piel Palidez Fragilidad de las uas En casos de anemia severa o de rpida instalacin. Piel fra y hmeda Disminucin del volumen de orina Dolor precordial (angor) Otros sntomas y signos dependern del tipo de anemia y su causa o etiologa.
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5. CLASIFICACIONES DE LAS ANEMIAS Las anemias se originan generalmente por uno de los siguientes mecanismos bsicos: eritropoyesis deficiente, hemlisis excesiva o hemorragia (aguda o crnica). En hombres la principal fuente de sangrado es el sistema digestivo, en tanto que en la mujer corresponde a las prdidas de sangre con la menstruacin. En las anemias secundarias a eritropoyesis deficiente, es til observar las alteraciones morfolgicas de los GR, as la presencia de eritrocitos microcticos pueden sugerir deficiencia de hierro, talasemias, defectos en la sntesis de hemoglobina o anemia asociada a enfermedades crnicas; por el contrario, los GR macrocticos se relacionan a defectos en la sntesis de DNA, como resultado de la deficiencia de vitamina B12, cido flico o de la quimioterapia con metotrexato o hidr oxyurea. Por su parte, las anemias normocticas-normocrmicas aparecen como consecuencia de un mecanismo hipoproliferativo de la mdula sea o hemlisis perifrica. En cuanto a este ltimo es necesario descartar los mecanismos fisiopatolgicos bsicos ms comnmente asociados como son el secuestro esplnico y la hemlisis mediada por anticuerpos, y menos frecuentes las causadas por alteraciones propias de los hemates, como son las membranopatas, enzimopatas y hemoglobinopatas. Desde el punto de vista clnico, se utilizan dos clasificaciones: morfolgica y fisiopatolgica. 5.1. Clasificacin morfolgica La clasificacin morfolgica de las anemias (tabla 4-3) tiene una importante utilidad clnica. Se basa en los cambios que presentan los GR en
el tamao (VCM) y en el contenido de Hb (CHCM, HCM). Estos cambios son detectados por los contadores celulares y observados con microscopa ptica en los frotis sanguneos (ver captulo 27). Considerando que el valor normal del VCM es entre 80 y 100 fL y la CHCM entre 32 y 36%, las anemias se pueden clasificar en tres tipos: Microcticas (VCM < 80 fL). Se asocia a trastornos en la sntesis de la Hb, como por ejemplo anemia ferropriva y talasemias. En general se acompaan de disminucin de la CHCM que define la hipocroma. Macrocticas (VCM > 100 fL). Se presentan en anemias con trastornos de la maduracin eritroide, como por ejemplo las anemias megaloblsticas. Normocticas-normocrmicas. En este grupo de anemias, que presentan VCM y CHCM normal, se incluyen las anemias de las enfermedades crnicas, las anemias hemolticas, y las anemias de causa medular (Ejs. leucemias, mieloma mltiple, aplasia medular).
La clasificacin morfolgica de las anemias sumada a estudios complementarios, permite en la mayora de los casos, for mular el diagnstico del tipo de anemia (ver los captulos especficos de cada tipo de anemia y los captulos 27, 28 y 29). 5.2. Clasificacin fisiopatolgica La clasificacin fisiopatolgica de las anemias se basa en la respuesta de la mdula sea para compensar la anemia, as se les clasifica en dos grupos: anemias arregenerativas y anemias regenerativas. A continuacin se describen algunas caractersticas de cada grupo y se indican algunos ejemplos.
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Tabla 4-3. Clasificacin morfolgica de las anemias Anemias macrocticas Hematolgicas Anemia megaloblstica Anemias hemolticas Sndromes mielodisplsicos No hematolgicas Alcoholismo Hepatopata crnica Anemias microcticas Anemia ferropriva Talasemias Anemia normocticas Anemia aplstica Infiltracin medular (Mieloptisis) Anemias secundarias a enfermedad crnica
5.2.1. Anemias arregenerativas En estas anemias la mdula sea es incapaz de producir GR en forma adecuada para compensar la anemia, ya sea por un defecto de la misma (Ejs. anemia aplstica, leucemias) o por falta de nutrientes (hierro, vitamina B12, etc.). En este tipo de anemias la cifra de reticulocitos es normal o disminuida y el IPR es menor a 2, indicando que el origen de la anemia es a nivel central (mdula sea). A continuacin se mencionan las causas ms importantes de anemias arregenerativas: Disminucin de las clulas progenitoras de GR o de todas las lneas medulares (adems granulocitos y plaquetas): Anemia aplstica por txicos industriales (benceno), drogas (cloranfenicol, dipirona, antiinflamatorios no esteroidales), citostticos (antineoplsicos) radiaciones ionizantes y de causa desconocida (anemia aplstica idioptica).
Infiltracin de la mdula sea por clulas extraas que reemplazan las clulas pr ogenitoras: blastos leucmicos, metstasis de carcinomas, tejido conectivo fibroso (mielofibrosis), etc. En conjunto se les denomina anemias mieloptsicas. Las clulas eritropoyticas son normales pero no reciben los factores nutritivos necesarios para producir eritrocitos. Son las denominadas anemias carenciales. El dficit puede ser de: (a) hierro, por falta de aporte (carencia de hierro) o con aporte normal pero incapacidad de utilizar el hierro (anemia secundaria a enfer medades crnicas), (b) vitamina B12 y/o cido flico (anemias megaloblsticas) y (c) hormonas (hipotiroidismo, hipopituitarismo, hiposuprarrenalismo, hipogonadismo masculino, disminucin de eritropoyetina en la insuficiencia renal).
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Tabla 4-4. Clasificacin fisiopatolgica de las anemias

Estado de la eritropoyesis Anemias arregenerativas Por depresin Infecciones extramedulares Mesenquimopatas Dficit de Hierro Sntesis alterada de DNA Subagudas o crnicas Lupus, esclerodermia Carencial, prdida exagerada, defecto en absorcin, transporte o utilizacin Anemia perniciosa, Ca gstrico, difilobotiasis, diverticulitis intestinal, embarazo, etilismo crnico, cirrosis heptica, tratamientos citostticos (citosina arabinosa), otras drogas). Nefropatas crnicas difusas, ciertos hipernefromas Mixedema Nefrosis, malabsorcin, atransferrinemia congnita Uremia, cncer metastsico Benzol, cloranfenicol, fenilbutazona, citostticos, etc. Hepatitis, micosis diseminada ciertas virosis Leucemias, linfomas, metstasis neoplsticas difusas mieloesclerosis, osteosclerosis, tesaurismosis, sarcoidosis Causa de la anemia Situaciones clnicas
Dficit de eritropoyetina Dficit de tiroxina Dficit de transferrina Por agresin Intoxicaciones endgenas Intoxicaciones exgenas Infecciones intramedulares Procesos autoinmunes Por sustitucin Proliferaciones celulares
Anemias regenerativas Anemias Hemolticas A. hemolticas intracorpusculares
Membranopatas Hemoglobinopatas Enzimopatas
Esfero, elipto, acanto y pirocitosis hereditarias, hemoglobinuria paroxstica nocturna HbS, Hb inestables, HbS, HbC y otras; talasemias Dficit de G6PDH, PK y otras enzimas Linfomas, leucemias, lupus, cepas, virosis, idiopatas Sensibilizacin anti-Rh y otras, accidentes transfusionales Vlvulas cardacas mal implantadas, marcha exagerada Vasculitis, poliarteritis nodosa, coagul. Intravascular diseminada Cefalohematoma del recin nacido, traumatismos violentos. Congelamiento, quemaduras extensas, irradiacin Fenilhidrazina, anilinas, otros oxidantes Clostridium, estrepto y estafilococo, otros microorganismos Crisis malricas, bartonelosis
A. hemolticas extracorpusculares
Autoanticuerpos Aloanticuerpos Traumatismos constantes Microcirculacin alterada Grandes hematomas
Fsicas Qumicas Toxi-infecciosas Parasitarias Anemias por hemorragia aguda
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5.2.2. Anemias regenerativas Las anemias regenerativas son aquellas en que existe prdida de GR por hemorragia o por hemlisis (intravascular o extravascular). Son anemias de causa perifrica; la mdula sea intenta compensar la anemia aumentando la produccin de hemates, por lo cual el recuento de reticulocitos aumenta (IPR: > 3). Anemias hemolticas Las anemias hemolticas pueden deberse a causas propias de los GR (Anemias hemolticas intracorpusculares) o ajenas a ellos (Anemias hemolticas extracorpusculares) (ver captulo 8). Las anemias hemolticas intracorpusculares, pueden deberse a alteraciones en la membrana (Ej. Esfer ocitosis her editaria), defectos enzimticos (Ej. Dficit de glucosa 6 fosfato deshidr ogenasa) y alteraciones en la hemoglobina (Ej. Talasemias). Las anemias hemolticas extracorpusculares, pueden tener como causa mecanismos inmunes (alo o autoanticuerpos), agentes txicos e infecciosos (plomo, venenos de serpientes, toxinas bacterianas, parsitos), factores mecnicos (anemia hemoltica microangioptica y anemia hemoltica por prtesis cardacas), y secuestro de hemates en el bazo (hiperesplenismo). b) Anemias post-hemorrgicas La gravedad y sntomas de la anemia estn dados por el volumen de sangre perdido y el perodo de evolucin del proceso de base, que puede o no dar tiempo a que el organismo utilice mecanismos compensatorios. Las hemorragias pueden ser agudas o crnicas (ver captulo 9). En las anemias por hemorragia aguda, la prdida de sangre puede ser evidente (hematemesis, melena, ginecorragia, hemoptisis, epistaxis, hematuria) o no serlo (hemoperitoneo, hematoma retroperitoneal, hemotrax, fractura de cadera o pelvis). El aumento de la eritropoyesis puede tardar en manifestarse, de manera que es posible no encontrar reticulocitosis en las primeras horas de la hemorragia. Por otra parte, la Hb liberada de los GR extravasados en los lugares de acumulacin de la sangre en las hemorragias ocultas, sufre la transformacin que lleva a la produccin de bilirrubina no conjugada que al pasar a la sangre produce hiperbilirrubinemia. sta, combinada con la anemia y la reticulocitosis puede simular una anemia hemoltica.
En las anemias por hemorragia crnica, la prdida de GR implica una disminucin del hierro (presente en la hemoglobina) lo que produce un agotamiento de sus reservas. Esto explica que se comporte como una anemia arregenerativa (sin reticulocitosis), microctica e hipocrmica. El tratamiento adecuado de las anemias requier en establecer previamente los mecanismos subyacentes. Los nios, las mujeres y los ancianos son los grupos de poblacin en mayor riesgo para desarrollar este tipo de alteraciones, razn por la cual el mdico ha de prestar particular atencin a su evaluacin. Basndose en una adecuada anamnesis, examen fsico minucioso, y en el estudio riguroso del hemograma con recuento de reticulocitos, as como la realizacin de algunos exmenes complementarios, se puede formular el diagnstico correcto de la mayora de las anemias. LECTURAS SUGERIDAS Blackall, D.P., Marques, M., Hemolytic uremic syndrome revisited: Shiga toxin, factor H, and fibrin generation. Am J Clin Pathol . 121 Suppl:S81-8. 2004. Dhaliwal, G.; Cornett, P.A; Tierney, L.M. Jr. Hemolytic anemia. Am Fam Physician ; 69(11):2599-606, 2004. Gasche, C.; Lomer, M.C.; Cavill, I.; Weiss, G. Iron, anaemia, and inflammatory bowel diseases. Gut; 53(8):1190-7, 2004. Gilsanz, F. Anemia: manifestaciones clnicas y clasificacin, Medicine ; 7(28):1169-1171, 1996. Hill, J.; Walsh, R.M.; McHam, S.; Brody F.; Kalaycio, M. Laparoscopic splenectomy for autoimmune hemolytic anemia in patients with chronic lymphocytic leukemia: a case series and review of the literature. Am J Hematol.;75(3):134-8, 2004. Maciejewski, J.P., Selleri, C. Evolution of clonal cytogenetic abnormalities in aplastic anemia. Leuk Lymphoma; 45(3):433-40, 2004. Ricard, A. Protocolo de actitud diagnstica en las anemias, Medicine ; 7(28):1220-1222, 1996.
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Richar d Lee, G., Wintrobes Clinical Hematology, Captulos 29 y 30, Dcima edicin, Editorial Williams & Wilkins, Baltimore, 1998. Shah, S., Vega, R. Hereditary spherocytosis. Pediatr Rev.; 25(5):168-72, 2004. Testa, U. Apoptotic mechanisms in the control of erythropoiesis. Leukemia;18(7):1176-99, 2004. Wilson, A.; Yu H.T.; Goodnough, L.T.; Nissenson, AR. Prevalence and outcomes of anemia in rheumatoid arthritis: a systematic review of the literature. Am J Med.;116 Suppl 7A:50S-57S, 2004. Wingard R. Increased risk of anemia in dialysis patients with comorbid diseases. Nephrol Nurs J;31(2):211-4, 2004.
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HEMATOLOGA
Captulo
APLASIA MEDULAR
Claudio Mosso Ch., Claudia Paris D. y Rosario Silva C.
1. Introduccin 2. Aplasia medular adquirida 2.1. Epidemiologa 2.2. Cuadro clnico 2.3. Estudios de laboratorio 2.3.1. Sangre perifrica 2.3.2. Otros estudios de laboratorio 2.3.3. Mdula sea 2.4. Etiologa 2.5. Fisiopatologa 2.6. Tratamiento y evolucin de la aplasia medular 2.6.1. Tratamiento de soporte 2.6.2. Tratamiento y respuesta 3. Aplasias medulares hereditarias y/o congnitas 3.1. Anemia de Fanconi 3.2. Disqueratosis congnita 3.3. Sndrome de Shwachman-Diamond 3.4. Hipoplasia cartlago-pelo 3.5. Sndrome de Pearson 3.6. Disgenesia reticular 3.7. Trombocitopenia amegacarioctica 3.8. Anemia Blackfan-Diamond 3.9. Neutropenia congnita severa (sndrome Kostmann) 3.10. Trombocitopenia con ausencia de radio
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RESUMEN
La aplasia medular es una patologa poco frecuente, pero condiciona una alta morbimortalidad asociada. Durante las ltimas dcadas, en la medida que ha aumentado el conocimiento sobre la fisiologa normal de la mdula sea y de los fenmenos inmunolgicos involucrados en su fisiopatologa se ha logrado desarrollar herramientas teraputicas que han cambiado el pronstico. En el presente captulo se revisan las diferentes formas de aplasia medular, tanto congnitas como adquiridas, las diferentes hiptesis actuales acerca de su fisiopatologa y se muestran las diferentes formas de tratamiento y sus resultados.
1. INTRODUCCIN La falla medular est caracterizada, desde el punto de vista clnico y de laboratorio, por una disminucin variable en los recuentos perifricos de los elementos sanguneos (glbulos rojos, leucocitos y plaquetas); estas citopenias tienen su origen en una marcada reduccin en la produccin efectiva de ellos por la mdula sea. Esta alteracin puede ser de una serie especfica (monocitopenia) o de todas ellas (pancitopenia). La disminucin de la entrega de clulas maduras desde la mdula sea a la circulacin puede estar dada por alteraciones en el nmero de progenitores hematopoyticos, como en el caso de la aplasia medular adquirida o en la anemia de Blackfan Diamond, donde se observa una mdula con celularidad disminuida en forma global o para una lnea especfica, respectivamente, o por alteraciones en la maduracin de estos precursores. En este ltimo caso se encuentra una mdula con celularidad aumentada, pero con detencin maduracional, llamada hematopoyesis ineficaz. En este captulo, se revisan los diferentes tipos de aplasia medular (AM): adquiridas y congnitas, desde el punto de vista clnico, laboratorio y tratamiento.
El primer caso de AM adquirida fue descrito en el ao 1888 por Paul Ehrlich en una autopsia de una paciente embarazada quien presentaba anemia severa, hemorragias cutneas y fiebre. En la autopsia se encontr que la mdula sea se encontraba reemplazada por grasa. Posterior mente, durante el siglo XX se describieron muchos y diferentes cuadros asociados a diferentes grados de aplasia o hipoplasia medular, de diferentes etiologas y cursos clnicos. Se ha avanzado en forma importante en la comprensin de su fisiopatologa y su tratamiento, logrando en la actualidad, pese a la severidad de la mayora de las formas de aplasia, alcanzar tasas de curacin importantes y definitivas. La AM se caracteriza por la presencia de una pancitopenia de mayor o menor severidad asociada a una marcada disminucin en el nmero de progenitores en la mdula sea. Sus causas pueden ser adquiridas, o hereditarias (no necesariamente expresadas al nacimiento) o congnitas (expresadas desde el nacimiento). Las causas de la aplasia medular son mltiples y su curso clnico tambin es variable. En la tabla 5-1 se describe una clasificacin de la AM considerando el momento de aparicin de la misma.
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Tabla 5-1. Clasificacin de la aplasia medular Hereditarias Anemia de Fanconi Disqueratosis congnita Sndrome Schwachman-Diamond Disgenesia reticular Trombocitopenia amegacarioctica Anemia aplstica familiar Sndromes mielodisplsicos Sndromes no hematolgicos (S. Down, S. Shekel, S. Dubowitz) Adquiridas Secundarias Radiacin Drogas Virus Enfermedades inmunolgicas Fascitis eosinoflica Hipogammaglobulinemia Timoma Embarazo Hemoglobinuria paroxstica nocturna Preleucmica Idioptica
Desde un punto de vista de la severidad se clasifica en aplasia medular severa cuando se cumplen en sangre perifrica al menos dos de los siguientes requisitos: neutrfilos menor a 500/L, recuento de plaquetas menor a 20.000/ L e ndice reticulocitario menor a 1%.
Adems, la biopsia de mdula sea debe tener menos de un 25% de la celularidad normal. Si no se cumplen estos criterios el cuadro se clasifica como aplasia medular leve o moderada, lo que determinar la conducta teraputica y pronstico (tabla 5-2).
Tabla 5-2. Definicin de severidad en aplasia medular Aplasia medular severa (Camita et al, 1976) Mdula sea celularidad menor al 25% 25 50% con menos de 30% cel. hematopoyticas Sangre perifrica (dos de los 3 criterios) Neutrfilos menores de 500 Plaquetas menores 20.000 Reticulocitos menores a 1% Aplasia medular muy severa (Bacigalupo et al, 1988) Hipoplasia o aplasia leve Neutrfilos menores de 200 Paciente con pancitopenia que no cumple requisitos anteriores
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2. APLASIA MEDULAR ADQUIRIDA Esta es la forma ms frecuente de aplasia, y en esta denominacin se incluyen los pacientes con pancitopenia asociada a hipoplasia o aplasia medular, en los que no existe evidencia de enfermedad hereditaria y se descartan otras causas secundarias de pancitopenia. 2.1. Epidemiologa La incidencia anual de aplasia medular presenta una distribucin geogrfica caracterstica, con un patrn opuesto a la distribucin de leucemia, ya que tiene una mayor incidencia en los pases del tercer mundo y menor en Europa y Estados Unidos. Grandes estudios prospectivos muestran que en los pases desarrollados, la AM tiene una incidencia de 2 casos por milln de habitantes, sin embargo esta alcanza hasta 6 casos por milln en algunas regiones rurales de Tailandia; en Latinoamrica existen escasos estudios epidemiolgicos, en Ciudad de Mxico se ha reportado una incidencia de 3,9 casos por milln de habitantes con una significativa mayor incidencia en la poblacin peditrica (4,2 casos/ 106/ao). En Chile no se cuenta con estudios de incidencia real, ya que desde el ao 1998 que se encuentra en funcionamiento el Registro Nacional de AM cuyos resultados se encuentran pendientes debido al corto tiempo de observacin. Con respecto a la distribucin por sexos es de 1:1 y la distribucin de la mortalidad, muestra que sta es uniforme hasta los 55 aos, incrementndose sustancialmente desde esa edad. Los factores de riesgo para el desarrollo de la enfermedad parecen ser algo diferentes entre los pases desarrollados y en vas de desarrollo, as por ejemplo, si bien la forma predominante en todo el mundo es la aplasia medular adquirida idioptica, porque no se logra establecer un agente causal, en Europa se reporta como uno de los factores de riesgo principales los frmacos, en Asia la mayor incidencia est relacionada a estatus socioeconmico bajo, exposicin a solventes y cultivo de arroz. 2.2. Cuadro clnico Los pacientes con AM se presentan frecuentemente con sntomas de anemia, asociados a hemorragias de piel y mucosas y en los adultos con alteraciones visuales secundarias a hemorragias intrarretinales. La neutropenia se manifiesta con la presencia de
lceras bucales, infecciones bacterianas y fiebre. Los sntomas de anemia se caracterizan por palidez, decaimiento y taquicardia, en general bien tolerada, ya que su velocidad de instalacin es lenta, a no ser que se agregue una hemorragia importante asociada a la trombocitopenia. La aparicin de esta sintomatologa depende de la velocidad de instalacin de la enfermedad y tambin de la vida media de los elementos sanguneos, esto explica que, en general, los pacientes presenten manifestaciones hemorrgicas e infecciosas antes o de mayor cuanta que las manifestaciones anmicas (Vida media de plaquetas 8-10 das, neutrfilos 7-9 horas y eritrocitos 120 das). 2.3. Estudios de laboratorio 2.3.1. Sangre perifrica En la AM, los recuentos celulares estn uniformemente disminuidos, comprometindose, en general, de manera ms severa la serie blanca y las plaquetas (50% de los pacientes presentan menos de 20.000/L al diagnstico). El frotis muestra habitualmente anemia normoctica o macroctica y normocrmica. El RDW (plano de distribucin del glbulo rojo), que es un ndice de anisocitosis, se encuentra normal y el recuento reticulocitario est disminuido. El tamao de las plaquetas es nor mal, sin presencia de macroplaquetas u otros rasgos displsicos. El nmero de granulocitos est disminuido, pero su funcin fagoctica y bactericida es normal. 2.3.2. Otros estudios de laboratorio El estudio de la hemoglobina (Hb) puede exhibir un incremento de la hemoglobina fetal que muestra el estrs medular compensatorio. Existe un incremento en la expresin del antgeno I en los eritrocitos, lo que aumenta su riesgo de lisis por anticuerpos fros. Los niveles de folato y vitamina B12 son normales y la eritropoyetina se encuentra elevada en un mayor rango que el esperable para el grado de anemia. El hierro srico se encuentra normal o aumentado y la capacidad de fijacin de la transferrina (TIBC) se halla saturada, y la ferritina srica se encuentra elevada. Las pruebas de funcin heptica se encuentran alteradas en los pacientes en que la aplasia se asocia a hepatitis. Los niveles de inmunoglobulinas estn ocasionalmente disminuidos.
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Los estudios cromosmicos son habitualmente normales, sin embargo en el ltimo tiempo se han descrito alteraciones genticas inespecficas, que no se han asociado a pronstico ni a respuesta a tratamiento. 2.3.3. Mdula sea El diagnstico de AM debe ser hecho a travs de mielograma y biopsia de mdula sea, ya que la celularidad debe ser evaluada desde un punto de vista cuantitativo y cualitativo (figura 5-1). Fundamental es la biopsia medular, la que muestra, habitualmente, hipocelularidad con espculas vacas y reemplazo por grasa. La celularidad observada es en base, predominantemente de linfocitos y clulas plasmticas (ver captulo 27).
2.4. Etiologa En la gran mayora de los casos de AM adquirida es difcil establecer un factor causal y por esta razn son catalogadas de idiopticas, existen otros casos en que se puede identificar claramente una causa, y en otros en que podra existir un factor del husped asociado a una mayor incidencia de la enfermedad, tal es el caso de la alta asociacin del antgeno de histocompatibilidad HLA-DR2, que se describe con una frecuencia de dos veces sobre la poblacin normal en pacientes portadores de la enfermedad; su relacin etiopatognica an no est definida. Muchos de los pacientes recin diagnosticados han estado expuestos en forma previa a la aparicin de los sntomas a frmacos o sustancias potencialmente mielotxicas las que tambin se encuentran al interrogar a poblacin sana, sin la enfermedad, por esta razn es difcil encontrar una clara relacin causa efecto entre un medicamento y un paciente determinado. Adems es necesario considerar que la evolucin clnica, manejo y respuesta al tratamiento estn relacionados ms a la severidad de la enfermedad que al agente causal, de esta forma la aplasia secundaria a frmacos o txicos tiene un pronstico similar a las formas idiopticas. La otra relacin causal es con enfermedades infecciosas virales; est clara y bien definida la aplasia posthepatitis y su relacin causal. En la tabla 5-3 se detallan los medicamentos y agentes infecciosos asociados a la Aplasia medular.
Figura 5-1. Mielograma de paciente con Aplasia medular. Se observa celularidad disminuida en los grumos de mdula sea.
Tabla 5-3. Clasificacin de frmacos y agentes infecciosos asociados a aplasia medular Frmacos Drogas que habitualmente producen aplasia Agentes quimioterpicos Benceno Reacciones idiosincrticas Cloranfenicol Antiinflamatorios no esteroidales Sulfas Antiepilpticos y sicotrpicos Drogas antitiroideas Sales de oro, alopurinol, penicilamina. Virus Virus Ebstein Barr Virus Hepatitis A, No A, No B, No C, No G VIH
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2.5. Fisiopatologa Desde el punto de vista terico, la aplasia medular se debe a una alteracin numrica o funcional de las clulas troncales hematopoyticas, a alteraciones en el estroma de la mdula sea o a una combinacin de ambas. Las clulas troncales hematopoyticas (Stem cells, SC) se caracterizan por su alta capacidad proliferativa, el potencial para diferenciarse a las diferentes lneas celulares, su propiedad de renovarse a s mismas (capacidad de generar otras SC por mitosis sin diferenciacin) y desde el punto de vista inmunolgico marcan para un tipo de antgeno especfico, CD34+ (ver captulos 1 y 2). Estas clulas se definen adems por su capacidad de repoblar el compartimiento hematopoytico de animales letalmente irradiados. Al estudiar esta poblacin celular en los pacientes con AM, a travs de citometra de flujo, se ha descrito una marcada disminucin en el nmero de ellas. Funcionalmente, las clulas hematopoyticas diferenciadas, que normalmente son capaces de formar colonias eritroides, mieloides y megacariocticas estn tambin muy reducidas y los anlisis in vitro de clulas hematopoyticas muy primitivas muestran una marcada disminucin. Los pacientes con aplasia medular presentan pancitopenia cuando los progenitores hematopoyticos han cado a menos del 1% de los valores normales. Esto indica que las clulas hematopoyticas presentan una gran capacidad de compensacin. En condiciones normales, la proliferacin y diferenciacin de las clulas hematopoyticas depende de factores de crecimiento especficos y de la indemnidad del estroma medular (ver captulos 1 y 2) y este podra ser un factor que produce la aplasia medular, sin embargo, se ha demostrado una funcin celular normal en las clulas estromales, y niveles circulantes y produccin in vitro de citoquinas en rangos normales o incluso elevados. Esta evidencia es comprobada desde el punto de vista clnico, si consideramos que al someter a los pacientes a trasplante de progenitores hematopoyticos (TPH) (ver punto 2.6.2.a y captulo 16), las clulas estromales continan siendo de origen del husped y permiten el sostn y posterior repoblamiento de la mdula con SC provenientes de un donante sano. Adems, la estimulacin con factores de crecimiento es
habitualmente ineficaz para mantener una adecuada hematopoyesis. As se puede entender que la aplasia medular se produce fundamentalmente por un dao directo sobre la clulas troncales; ste puede producirse en forma directa o a travs de un mecanismo inmunolgicamente mediado: Dao directo La forma ms comn de aplasia transitoria o definitiva es iatrognica al uso de drogas citotxicas o radioterapia como tratamiento antineoplsico, en estos casos los agentes actan directamente o a travs de inter mediarios daando el DNA celular impidiendo la pr oliferacin y/o desencadenando mecanismos apoptticos (muerte celular programada); los derivados del benceno utilizan el mismo mecanismo. Este mecanismo de dao tambin puede explicar la presencia de reacciones idiosincrticas de algunos medicamentos, ya que el polimorfismo gentico en alguna de las enzimas responsables de su degradacin produce metabolitos inter mediarios que actan como txicos medulares (figura 5-2).
Figura 5-2. Dao a precursores hematopoyticos por toxicidad directa.
Dao inmunolgicamente mediado. El descubrimiento clnico de la mejora de la pancitopenia en pacientes sometidos TPH que presentaron recuperacin autloga, sugiri que la inmunosupr esin a que haban sido sometidos, como parte de su tratamiento de acondicionamiento, permita la recuperacin de la funcin normal de sus propios progenitores hematopoyticos, estos hallazgos promovieron el desarrollo del tratamiento inmunosupresor en aplasia medular, adems de desarrollar una hiptesis de que el dao de la SC es mediado por activacin de una respuesta inmunolgicamente mediada. La activacin de
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linfocitos T (LT) es la responsable del dao a nivel medular, los LT activados producen interfern (IFN), factor de necrosis tumoral (TNF) e interleuquina 2 (IL-2), todas estas citoquinas son capaces de inhibir la proliferacin de clulas hematopoyticas y SC quiescentes. IFN y TNF suprimen la hematopoyesis daando el ciclo mittico celular, adems ambos inducen la expresin del receptor FAS (CD95) en la membrana de la clula CD34+, la activacin de este receptor y su ligando (FA5-L) activa las vas apoptticas (figura 5-3).
preceden la activacin de LT citotxicos, es posible que exista la participacin de LT CD4+ en la mantencin de la respuesta, pero an no es claro cul es el antgeno inicial que gatilla la activacin de esta respuesta. Uno de los eventos iniciales mejor documentados es la asociacin entre virus de la hepatitis y aplasia medular. La aplasia medular es una complicacin infrecuente de la hepatitis, se observa con mayor frecuencia en pacientes con hepatitis por virus no A, no B, no C y no G; en estos casos la infeccin viral gatilla la produccin de protenas virales y de protenas normales aberrantes, las que son presentadas por una clula presentadora de antgenos a LT, quienes se activan y proliferan produciendo la eliminacin de las clulas infectadas, en algunas ocasiones esta activacin persiste produciendo dao autoinmune. En el caso de la aplasia asociada a frmacos, se ha postulado un mecanismo similar. 2.6. Tratamiento y evolucin de la aplasia medular
Figura 5-3. Mecanismos inmunes comprometidos en aplasia medular. Linfocitos T citotxicos (LTc) activados cumplen un importante rol en la destruccin de las clulas hematopoyticas, ellos producen citoquinas como interfern (IFN) y factor de necrosis tumoral TNF los que por accin directa o por activacin de receptor FAS desencadena el dao celular. IFN a travs del factor regulador de interfern 1 (IRF1) produce la inhibicin de la transcripcin y detencin ciclo celular adems de aumentar la produccin de xido ntrico (NO) por activacin de xido ntrico sintetasa inducible, este aumento de xido ntrico produce dao txico en otras clulas. La activacin del receptor FAS a travs de FAS ligando desencadena la apoptosis. NOs, NO sintetasa
La evolucin del paciente con AM depender de la severidad, de la causa de la AM y de la terapia ofrecida. Wolf en 1957 describe una sobrevida de slo un 3%. En otras series previas a 1965 se describe sobrevida entre 10 y 35%, incluso hay una serie de Shahidi y Diamond que encontr 2 pacientes que respondieron, pero que posteriormente recurrieron. Aunque todas estas series no fueron estrictas con los criterios de gravedad. Se han hecho esfuerzos por encontrar un criterio que al diagnstico haga prever la evolucin de la enfermedad y de acuerdo a eso ofrecer la terapia ms adecuada (ver tabla 5-4).
Sin embargo, an no est completamente definido, cules son los eventos iniciales que
Tabla 5-4. Resultados del tratamiento de aplasia medular con trasplante de mdula sea de acuerdo a edad del paciente Ao de reporte IBMTR 1997 Ao de trasplante 1996 - 80 1981 - 87 1988 92 1991 - 97 n pacientes 186 648 471 874 696 129 Edad (aos) mediana (rango) 19 (2-56) 20 (1-57) 20 (1-51) 1- 20 21-40 > 40 Sobrevida % 48 61 66 75 3 68 4 35 18
IBMTR
2000
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La terapia del paciente se inicia una vez sospechado el diagnstico, con todas las medidas de soporte y una vez completado el estudio el tratamiento definitivo. 2.6.1. Tratamiento de soporte a) Nutricin Es necesario dar un aporte nutricional adecuado, ya que fcilmente se incrementan los requerimientos basales (infecciones especialmente), y de no ser cubiertos rpidamente llevarn al paciente a una desnutricin. De ser necesario se debe precozmente iniciar nutricin parenteral. b) Soporte transfusional El apoyo transfusional de plaquetas y de glbulos rojos ha significado un importante avance en la sobrevida de los pacientes, ya que ha cambiado la causa de muerte de hemorragia a infeccin. A continuacin se detallan los requerimientos transfusionales de los pacientes portadores de AM. Debe destacarse que considerando la alta frecuencia con que estos pacientes requier en transfusiones y considerando el tratamiento definitivo de ellos, es que todos los esfuerzos del equipo tratante, deben estar enfocados a disminuir el riesgo de secuelas debido a accidentes hemorrgicos y evitar la alosensibilizacin y disminuir el riesgo de enfermedades transmisibles a travs de las transfusiones; por esto, todos los productos deben ser idealmente filtrados e irradiados. Hemorragia. Se debe transfundir plaquetas si el paciente presenta recuento de 10.000/L o menor, o si presenta algn sangramiento o un cuadro febril no controlado. Es de eleccin el uso de plaquetas provenientes de afresis de donante nico, ya que disminuye el riesgo de aloinmunizacin y de refractariedad a la transfusin de plaquetas. Otras medidas para evitar el sangramiento incluye una buena higiene dental, cepillos suaves, evitar traumas (suspender deportes violentos o de riesgo). Toda puncin para extraccin de sangre debe ser seguida de compresin fir me por 15 minutos. El sangramiento local puede ser manejado con tratamiento tpico y agentes antifibrinolticos como el cido tranexmico, pero en caso de sangramientos mayores no es suficiente. Tambin se debe evitar el uso de frmacos que interfieren con la funcin plaquetaria, como el
cido acetil saliclico o los antiinflamatorios no esteroidales. Anemia. La reposicin de glbulos rojos lavados o filtrados para remover los leucocitos y evitar la sensibilizacin, debe ser efectuada en tanto sea necesario. Inicialmente el paciente puede requerir valores de hemoglobina mayor, alrededor de 9 g/dL, pero posteriormente, como anemia crnica compensada, puede manejarse con valores bajos, incluso de 6 g/dL. La transfusin a largo plazo puede llevar a niveles crticos de sobrecarga de hierro, pudiendo producir dao en el corazn, hgado y sistema endocrino. La desferoxamina debe ser indicada en los pacientes crnicamente transfundidos, antes de que se produzca dao, lo que ocurre habitualmente con alrededor de 50 unidades transfundidas. c) Infecciones. El sistema inmune especfico se mantiene intacto, lo que contrasta con los pacientes con la aplasia secundaria a quimioterapia. El riesgo de infeccin bacteriana en los pacientes con aplasia medular va incrementando en la medida que aumenta la neutropenia. Por otro lado la neutropenia evita el desarrollo de respuesta inflamatoria, lo que hace difcil detectar un foco infeccioso. Las bacterias pueden ser tanto grmenes gram negativos como positivos. El uso de antibiticos profilcticos no tiene indicacin. En el contexto de neutropenia y fiebre, se deben realizar los cultivos que correspondan y luego usar un esquema antibitico de amplio espectro, de acuerdo a la flora y sensibilidad bacteriana que predomine en el lugar donde se encuentra el paciente, de la presencia de un foco clnico evidente y del estado general del paciente al momento de presentarse la infeccin. El tratamiento debe completarse por 14 das aunque el cultivo sea negativo. Las infecciones por hongos se presentan frecuentemente en los pacientes que han recibido repetidos e intensos esquemas teraputicos con esquemas inmunosupresores (ver punto 2.6.2) o con neutropenia prolongada; la candidiasis y la aspergilosis son en muchos casos la causa de muerte, por lo que si el paciente persiste febril en el tiempo y no responde al esquema antibitico debe ser reevaluada esta posibilidad y agregarse terapia antifngica junto a la readecuacin del esquema. La transfusin de granulocitos no est indicada. Muy importante es la prevencin de las infecciones, con una cuidadosa higiene bucal, comidas todas cocidas o procesadas y al
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momento de contacto con el paciente un prolijo lavado de manos. 2.6.2. Tratamiento y respuesta El tratamiento tiene por objetivo restituir la produccin de las series hematopoyticas. Para llegar a esto actualmente existen dos lneas teraputicas principales, que son el trasplante de mdula sea y la inmunosupresin usando linfoglobulina antitimoctica, ciclosporina y metilprednisolona a) Trasplante de progenitores hematopoyticos. Para el TPH, las clulas son obtenidas de donantes familiar, con estudio de HLA-A, HLAB y HLA-DR compatibles. Antes del trasplante al paciente se le hace el acondicionamiento, habitualmente con ciclofosfamida y Timoglobulina, inmunosupresin necesaria para eliminar el factor de autoinmunidad como
elemento etiopatognico, prevenir el rechazo del trasplante y de la enfermedad de injerto contra husped (GVHD) (ver captulo 16). La recuperacin de la mdula hematopoytica despus del trasplante es rpido, completo y estable. Los rangos de sobrevida pueden ser tan altos como 90%, pero los registros varan entre 75 a 80%, (tabla 5-5). Sin embargo, la sobrevida es edad dependiente (75% en los menores de 20 aos, 68% entre los 20 y 40 aos, y 35 % en los pacientes mayores de 40 aos) en un anlisis publicado por Horowitz MM., del International Bone Marrow Transplant Registry. Adems de las complicaciones cercanas al momento del trasplante, existen las complicaciones a largo plazo, incluyendo enfermedad pulmonar restrictiva u obstructiva (25%), osteoporosis (18%) y tumor slido (12%). Todas las complicaciones son ms frecuentes en los pacientes que presentan GVHD.
Tabla 5-5. Comparacin entre diferentes esquemas de tratamiento de aplasia medular Objetivo del Estudio Comparar ATG vs CsA ATG vs CsA ATG+Csa vs Csa ATG+CsA vs CsA+G-CSF Sinergismo con ATG ATGvs ATG+oximetolona ATG vs ATG+CsA Rol de factores de crecimiento ATG vs ATG+GM-GSF ATG+CsA vs ATG+CsA+G-CSF
(* Estadsticamente significativo)
Severidad de la AM severa no severa severa severa severa severa severa
% de respuesta (tiempo evaluacin) 6/12 (3 ms) 74/46*(6 m) 55/23* (4 m) 40/56* (4 m) 31/58* (3 m) 64/18 (3 m) 45/83* (4 m)
Sobrevida (1 ao) 0.64/0.70 0.93/0.91 0.82/0.71 0.71/0.73 (2 a) 0.55/0.80 (2 a) no informada 0.82/0.81 (2 a)
Referencia (ao) 1992 1999 1999 1983 1991 1991 1999
b) Tratamiento inmunosupresor. La globulina antilinfoctica (ALG) o antitimoctica (ATG) se us para el acondicionamiento de los TPH en las AM, pero, G. Math observ en 2 pacientes que fueron acondicionados, pero no trasplantados que su mdula sea present recuperacin. Posteriormente otros trabajos confirmaron la actividad teraputica, Speck mostr una respuesta de 62% en los pacientes tratados con ATG y posteriormente en 1983 se public la superioridad de sta sobre el tratamiento de soporte o de los andrgenos. La respuesta vara entre un 40 y 70%, independiente de la etiologa. El mecanismo de accin de este suero sera estimular la produccin y liberacin de
factores de crecimiento por los linfocitos perifricos, per o stos siempre estn aumentados en los pacientes con AM. La actividad antilinfoctica directa sera el principal mecanismo de accin. La ATG rpidamente desciende el recuento de los linfocitos, al 10% de lo que haba al inicio de la infusin. Otras drogas han sido probadas, comparando su efecto aislado, como la asociacin a la ATG. c) Corticoides. Como agente nico en dosis bajas es inefectivo. La metilprednisolona en dosis muy altas produce remisin, pero con alta toxicidad a corto y largo plazo. Actualmente se usa slo en periodos cortos, en dosis moderada,
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para disminuir el efecto adverso de la ATG, como la anafilaxia y la enfermedad del suero. d) Ciclofosfamida. Se hizo estudios a dosis baja en 1980, sin respuesta en la mayora, pero a partir del ao 2000 nuevamente se retomaron los estudios, ahora a dosis alta, resultando efectiva, pero con importantes complicaciones, por lo que se suspendi el estudio y se recomend dejarlo para aquellos pacientes que no respondan a otros esquemas teraputicos. e) Anticuerpos monoclonales. Se han estudiado anticuerpos monoclonales dirigidos contra los antgenos de los linfocitos T. A excepcin de reportes anecdticos, nada ha
probado como tratamiento. f) Ciclosporina A. La ciclosporina A (CsA) es una potente droga inmunosupresora, inhibe la transcripcin de genes para IL2, INF, y otras citoquinas, bloqueando las etapas centrales de la respuesta inmune. Inducira o mantendra una remisin por interferencia de la produccin de citoquinas inhibidoras o por inhibicin de la apoptosis de las clulas hematopoyticas. Es la nica droga que ha demostrado tener eficacia en la AM comparable a la ATG, pero los estudios han demostrado que su efecto es mayor al asociarla a la ATG. Investigaciones clnicas de las ltimas dcadas han permitido establecer la mejor terapia para los pacientes con AM (tabla 5-6).
Tabla 5-6. Sndromes de Aplasia Medular Hereditaria por orden de frecuencia Sndrome Anemia de Fanconi Anemia Blackfan-Diamond Disqueratosis congnita Tipo de herencia Autosmica recesiva Autosmica dominante Recesiva y espordica Recesiva ligada Cr X Autosmica recesiva Autosmica dominante Autosmica recesiva Autosmica recesiva Autosmica recesiva Autosmica recesiva Mitocondrial completa. El G-CSF se usa en dosis de 10 g/kg da subcutnea en 2 dosis, desde el da 6 hasta tener un recuento de neutrfilos mayor de 1000/L en 3 das consecutivos. Independiente del esquema teraputico usado, la respuesta es lenta con una recuperacin de valores dentro de los 3 meses siguientes, slo entonces se hablar de falta de respuesta, debiendo efectuarse un segundo ciclo teraputico con ATG (en este caso se prefiere usar ATG de origen de conejo). Como complicaciones tardas se deben mencionar la recada, que es esperable en un tercio de los pacientes, que afortunadamente responde a un nuevo esquema teraputico y la
Sindrome Shwachman-Diamond Trombocitopenia con ausencia de radio Neutropenia congnita severa Trombocitopenia amegacarioctica Sindrome de Pearson Actualmente el tratamiento inmunosupresor recomendado es el uso de ATG asociado a CsA, metilprednisolona y Factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). La Sociedad de Hematooncologa peditrica chilena en el ao 1998 propuso un protocolo basado en el protocolo espaol del tratamiento de la AM, con ATG de origen de caballo (15 mg por kg / da por 5 das), asociado a CsA en dosis de 10 mg/ kg y luego regular segn niveles plasmticos (siempre asociado a modificacin por signos de toxicidad), y metilprednisolona 5 mg kg/da durante la administracin de la ATG para luego pasar a prednisona oral por 23 das, como prevencin de la enfermedad del suero. La CsA se mantiene por doce meses, suspendiendo despus de tener una respuesta
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dependencia a la CsA, descrita en un 25% de los pacientes que han respondido en primera o segunda cura, pero en la mitad de ellos se puede suspender a largo plazo (5 a 8 aos). Las enfer medades hematolgicas clonales se presentan en un 25%, como Hemoglobinuria paroxstica nocturna, Sndrome mielodisplstico (SMD), Leucemia mieloide aguda y Tumor slido, que se presentarn a largo plazo. Finalmente si se comparan lo resultados de TPH versus inmunosupresin la sobrevida a 5 aos en algunos trabajos son equivalentes, pero la posibilidad de recada, la respuesta hematolgica a veces es incompleta, los efectos adversos de los frmacos, especialmente renales, dependencia a CsA de algunos pacientes, que es droga de alto costo y el 25% de enfermedad clonal o maligna versus los pacientes que reciben tratamiento inmunosupresor hace que el TPH sea en los menores de 20 aos el tratamiento de eleccin. Entre los 20 y 40 aos de edad la diferencia de beneficio versus riesgo y complicaciones del trasplante no lo hace tan claro, pero si la AM es muy severa se recomienda el TPH, y cuando es moderada la aplasia hacer la inmunosupresin. En pacientes mayores a 40 aos, hasta 50 aos, en caso de AM muy severa se podra recomendar hacer TPH, pero en los otros casos sobre 40 aos hacer inmunosupresin. En todos los casos los TPH deben ser con donante familiar HLA compatible, porque el no
relacionado se recomienda slo una vez que haya fracasado la inmunosupresin, por el mayor riesgo de complicaciones del trasplante. En resumen, si el paciente es menor a 50 aos y tiene donante familiar compatible se debe hacer TPH. Si es mayor a 50 aos y/o no tiene donante familiar hacer inmunosupresin con ATG + CsA, asociado a metilprednisolona y G-CSF si el paciente tiene una neutropenia muy severa o infeccin. La ciclofosfamida, otra terapia inmunolgica como micofenolato o rapamicina o TPH de donante no relacionado debe ser considerada como ltima medida en un paciente que no respondi y como experimental mientras no haya estudios en grupo de pacientes con un claro resultado comparable tanto en la respuesta, como en las complicaciones. 3. APLASIAS MEDULARES HEREDITARIAS Y/ O CONGNITAS Aproximadamente un 25% de las aplasias en la infancia son de causa hereditaria o congnitas o forman parte del sndrome, Anemia Aplstica Constitucional, definido por OGorman Hughes como una falla medular asociada a anomalas familiares congnitas o trombocitopenia al nacer. La aplasia congnita puede estar asociado a malformaciones o al desarrollo de algunas neoplasias. Es importante reconocer los sndromes predisponentes, diagnosticarlos y tratarlos oportunamente. La tabla 5-7 muestra los sndromes ms frecuentes y su herencia.
Tabla 5-7. Genes asociados a aplasia medular congnita Enfermedad Anemia de Fanconi Gen FANCA FANCB* FANCC FANCD1* FANCD2 FANCE FANCF FANCG RPS19 N/I N/I DKC1 DKC2 N/I ELA2 c-Mpl N/I DNA mitocondrial Delecin de 2 a 8 kb locus 16q24.3 N/I 9q22.3 N/I 3p25.3 6p21.3 11p15 9p13 19p13.3 8p23.2-p22 N/I Xq28 3q21-28 7q1.1 19p13.3 1p35 N/I % 70 raro 10 raro raro 10 raro 10 25 35 40 Lig cr X Dominante 100 90 100 N/I 100
Anemia de Blackfan-Diamond Disqueratosis congnita Sndrome de Shwachman-Diamond Neutropenia congnita severa Trombocitopenia Amegacarioctica Trombocitopenia con ausencia de radio Sndrome de Pearson
N/I: no identificado,* an no ha sido clonado
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3.1. Anemia de Fanconi Fanconi en el ao 1927 describi a 3 hermanos con pancitopenia asociado a diversas malformaciones (talla baja, manchas caf con leche, malformaciones en los pulgares, renales e hipogonadismo), posterior mente se describieron otros casos similares y as el sndrome adopt su nombre. Los pacientes pueden ser diagnosticados desde el nacimiento hasta la 5 dcada de la vida, con una mediana de edad de presentacin de 8 aos; todas las razas y grupos tnicos estn incluidos. La relacin entre hombres y mujeres es 1,2:1. Las manifestaciones de este sndrome al nacer han sido reportadas en el 70% de los pacientes, y en orden de frecuencia decreciente son: hiperpigmentacin cutnea o manchas caf con leche, talla baja, hipoplasia o ausencia de pulgar con o sin ausencia de radio, criptorquidea e hipogonadismo en los hombres, microcefalia, microftalmia y estrabismo, malformaciones renales (rin en herradura), bajo peso de nacimiento, retraso del desarrollo psicomotor,
sordera y otras. Existe un 30% de pacientes con Anemia de Fanconi (AF) que no tienen ninguna manifestacin somtica y debutan como AM. La AF es una enfermedad autosmica recesiva compleja, fenotpicamente heterognea, ms frecuente en grupos proclives a endogamia como judos ashkenazi y africanos (1/90). En 1982 se cre un Registro Internacional de AF en la Universidad Rockefeller y se ha estimado que su frecuencia en EEUU y Europa es de 1 recin nacido entre 300 nacimientos. Considerando que existe una serie de patologas con expresin fenotpica similar a AF, es necesario realizar estudios de laboratorio que entreguen un diagnstico de certeza. El estudio que permite un diagnstico certero, es la bsqueda de quiebres cr omosmicos espontneos o inducidos. Las clulas de los pacientes con AF muestran tendencia a presentar quiebres cromosmicos espontneos o provocados por agentes inductores de entrecruzamiento del DNA como son: diepoxibutano (DEB) y mitomicina C (MMC) (figura 5-4).
Figura 5-4. Cariograma caracterstico de paciente con anemia de Fanconi. Se observan quiebres cromosmicos (fecha delgada) e imgenes tri y cuadrirradiales (flecha gruesa).
Las lesiones cromosmicas pueden ser: rupturas, reordenamientos, intercambios y endorreduplicaciones. La fragilidad cromosmica puede efectuarse en linfocitos de sangre perifrica, fibroblastos y en clulas fetales de las vellosidades corinicas, es una prueba sensible, especfica y reproducible que tiene valor diagnstico incluso en los pacientes en que no se ha desarrollado ninguna citopenia. Aproximadamente entre un 10-15% puede ser
normal en las AF con mosaicismo somtico en que las clulas hematopoyticas sufren una correccin gnica. En la actualidad se han reconocido 8 genes de AF y de ellos 7 han sido clonados (tabla 5-7), se denominan FANCA, FANCB, FANCC, FANCD, FANCE, FANCF, FANCG. El gen FANCA, el ms frecuente, es altamente polimorfo. Estudios recientes han establecido cierta correlacin entre el tipo de mutacin y el comportamiento
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de la enfermedad. Por este motivo los pacientes FANCA en los que hay ausencia de expresin de una protena y los pacientes FANCG constituyen un grupo de alto riesgo con peor evolucin hematolgica y mayor nmero de malformaciones. La terapia gnica an est en estudio, pero podra ser el futuro del tratamiento de esta enfermedad. Evidencias clnicas sugieren que el producto de los genes A, C, E, F y G forman un complejo nuclear que participa junto a una protena D2 en la reparacin del DNA que es defectuoso produciendo as 2 protenas BRCA1 y BRCA2, ellas tambin pueden ser encontradas en otras patologas que se caracterizan por quiebres cromosmicos como: ataxia telangiectasia, sndrome Bloom, Xeroderma Pigmentoso, entre otras (figura 5-5).
tienen un donante familiar idntico pueden ser tratados con andrgenos orales, generalmente se usa oximetolona a dosis de 2-5 mg/Kg/da, ms del 50% responden a esta terapia, su problema son los efectos adversos como: virilizacin, disfuncin heptica y tumores hepticos (3% de las AF). Los tumores hepticos son adenomas y hepatomas, por esto, deben tener un seguimiento y control estricto con estudio de funcin heptica y ecotomografas peridicas. Si el paciente desarrolla efectos secundarios severos al uso de andrgenos debe ofrecerse un donante alternativo. Alrededor del 6% de los pacientes con AF desarrollan SMD (ver captulo 15) caracterizado por: citopenias, dismielopoyesis, diseritropoyesis y megacariocitos anormales, asociado a veces a clones con citogentica anormal. Esto ltimo puede presentarse en pacientes con AF sin manifestaciones de mielodisplasia y no siempre se transforman en leucemia. El 10% de los portadores desarrollan una leucemia que generalmente es mieloide aguda y de ellas solo un 10% han debutado como SMD y un 25% no tiene antecedentes de aplasia previa ni de AF. Su tratamiento es complicado ya que los esquemas de quimioterapia convencional provocan una alta toxicidad al daar el DNA y no poder repararlo en forma adecuada en la clula normal, pueden ser tratados con TPH, pero a pesar de esto la mayora fallece el primer ao del debut de la enfermedad. De los pacientes que no manifiestan una AM, SMD o leucemia, existe el riesgo de desarrollar un tumor slido, lo que ocurre en un 5% de los casos. Estos tumores comprometen habitualmente cara y cuello, esfago, vulva, cervix uterino, piel (no melanoma), SNC y otros sitios con menos frecuencia. Estos tumores los presentan alrededor de la tercera dcada de la vida, un 25% no tienen el diagnstico de AF. En general los pacientes que presentan un tumor slido viven alrededor de 30 aos, debido a la toxicidad de la quimioterapia y radioterapia; solo ayuda la ciruga cuando es posible efectuarla a tiempo. Los pacientes que desarrollan AM o leucemia y que son curados por un TPH, tienen aumentado el riesgo de un cncer secundario. En algunas series clnicas ha llegado a ser de un 24% a los 8 aos del TPH; los rganos ms comprometidos han sido la lengua o piso de la boca.
Figura 5-5. Interaccin de protena BRCA en la Anemia de Fanconi.
La complicacin ms frecuente que compromete la vida es la falla medular que se pr esenta en el 90% de los pacientes, generalmente aparece en la primera dcada de la vida, manifestada por trombocitopenia, neutropenia, anemia macroctica y una mdula sea hipocelular. En la fase previa, aparece macrocitosis y aumento de la hemoglobina fetal. El manejo de la anemia aplstica est indicada cuando la Hb cae bajo 8 g/dL o se hace sintomtico, plaquetas menor a 30.000/L, y/ o neutrfilos menor a 500/L. El tratamiento de eleccin es el TPH, sin embargo no previene el desarr ollo de tumor es slidos. El acondicionamiento debe ser ajustado por la gran toxicidad al usar dosis habituales debido a su fragilidad cromosmica disminuyendo las dosis de ciclofosfamida y radioterapia, incluso algunos grupos han reemplazado la radioterapia por dosis ms altas de ciclofosfamida o busulfan con buenos resultados. La sobrevida con trasplante de mdula sea es mayor a un 70% con donante familiar idntico y menos de un 40% con donante alternativo. Los pacientes que no
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Las recomendaciones para el control de un paciente con AF son control con hemograma cada 3 meses, mielograma, biopsia de mdula sea y citogentica anual, para pesquisar precozmente SMD, leucemias y aplasia. Las malformaciones deben ser corregidas lo antes posible con apoyo transfusional si fuera necesario. Los pacientes en tratamiento con andrgenos orales deben tambin controlarse cada 2 a 3 meses con pruebas hepticas y ecotomografa anual. Tambin deben controlarse en forma dirigida en busca de tumores de cabeza y cuello anualmente todos los pacientes con ms de 10 aos o todo paciente trasplantado despus del primer ao de este tratamiento; debe incluirse un examen minucioso de boca y faringe. Endoscopa esofgica en el adulto joven. Examen ginecolgico despus de la menarquia o 16 aos. Debe evitarse el uso de tabaco, alcohol y exposicin al sol. 3.2. Disqueratosis congnita El diagnstico de la disqueratosis congnita se basa en una triada: (a) hiperpigmentacin reticulada en cara, cuello, hombros, (b) uas distrficas, que aparecen en la primera dcada de la vida, y (c) leucoplaquias en mucosa oral que se presentan en la segunda dcada, y adems en el 50% de los pacientes aparece AM y un 10% desarrollan una neoplasia entre la tercera y cuarta dcada de la vida. La disqueratosis congnita se hereda de 3 formas: recesiva ligada al cromosoma X, autosmica recesiva y dominante, se han descrito en la literatura ms de 200 casos clnicos y aproximadamente 50 de ellos son de 7 familias. La triada clsica aparece entre los 5 y 10 aos de vida, un 20% de los pacientes desarrollan complicaciones pulmonares con disminucin de la capacidad de difusin y defectos restrictivos. Tienen alteraciones oculares que incluyen epfora por bloqueo del conducto lacrimal, blefaritis, prdidas de pestaas, lceras, ectropion y conjuntivitis. Son frecuentes las caries y prdidas dentales. El cabello se cae en forma prematura y se torna grisseo. Adems tienen retar do de crecimiento, talla baja, alteraciones en el aprendizaje y retardo mental, microcefalia, hiper hidr osis, y alteraciones seas (osteoporosis, necrosis avascular y escoleosis). La aplasia suele aparecer con una mediana de edad de 11 aos, en ms del 30% de los pacientes con herencia ligada al cromosoma X
(llegando a un 94% a los 40 aos), en ms de la mitad de los autosmicos recesivos y rara vez en los autosmicos dominantes. Los hallazgos de laboratorio son similares a la AF, pero la fragilidad cromosmica es normal, los progenitores hematopoyticos se encuentran disminuidos o ausentes y los factores estimulantes de colonias no son efectivos. Las diferentes mutaciones pueden verse en la tabla 5-7. En la disqueratosis congnita en su forma ligada al cromosoma X, se han identificado mltiples mutaciones del gen DKC1, el cual codifica una protena nucleolar llamada disqueratina, cuyo rol an no est definido, pero se cree que est relacionado con el ensamblaje del RNA ribosomal. Esta protena se une a la telomerasa y determina la longitud del telmero, el que se encuentra acortado en esta enfermedad. La AM en la disqueratosis se debe a insuficiencia de la telomerasa. Esta enfermedad generalmente es mortal por el desarrollo de aplasia, cncer o las complicaciones de su tratamiento. El 70% de las muertes se deben a la aplasia, 10% a las complicaciones pulmonares, 8% a neoplasias (SMD, leucemia mieloide aguda y carcinomas). No existe ningn tratamiento para esta enfermedad, el TPH, solo mejora a un 30% de los pacientes, independiente del tipo de donante. Puede usarse esteroides anablicos y factores estimulantes de colonias con efectos transitorios. 3.3. Sndrome de Shwachman-Diamond Enfermedad hereditaria, autosmica recesiva que cursa con diarrea crnica, neutropenia y condrodisplasia, se han reportado ms de 300 casos a travs del mundo. Aunque el sndrome de mala absorcin est presente precozmente, ms del 40% desarrollan una aplasia medular. El diagnstico se basa en niveles bajos de tripsingeno, grasa pancretica y disostosis metafisiaria. El gen defectuoso se localiza en el centrmero del cromosoma 7. El recuento de neutrfilos es inferior a 1500/L, y la evolucin de la neutropenia puede ser crnica, intermitente o cclica, tambin se puede desarrollar trombocitopenia y anemia. El mielograma es hipocelular con escasa formacin de unidades for madoras de colonias. La evalucin citogentica no muestra quiebres cromosmicos. Entre 5-10% de los pacientes de sexo masculino
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pueden pr esentar leucemia, la mayora mieloide. Tambin pueden presentar SMD en el 10%, alteraciones citogenticas con anomalas clonales que involucran al cromosoma 7. El pronstico vital es mejor que los pacientes con AF. El tratamiento se hace con reemplazo de enzimas pancreticas orales. La neutropenia puede mejorar con factor estimulante de colonia de granulocitos. Cuando desarrollan una aplasia severa est indicado el TPH y su xito es de un 50% con donante no relacionado. 3.4. Hipoplasia cartlago-pelo Es una enfermedad autosmica recesiva que se caracteriza por condrodisplasia con disostosis metafisial, extremidades cortas asociadas a manifestaciones hematolgicas como neutropenia, anemia macroctica y linfopenia. Tiene 7 veces ms riesgo de desarrollar cncer. La localizacin de la enfermedad a nivel gentico se encuentra en una mutacin localizada en el cromosoma 9 (9p21-p13). 3.5. Sndrome de Pearson Consiste en una disfuncin exocrina del pncreas, acidosis metablica, neutropenia y anemia refractaria sideroblstica con vacuolizacin en precursores hematopoyticos medulares. Su defecto molecular se encuentra en el DNA mitocondrial. 3.6. Disgenesia reticular Es un desorden muy raro, autosmico recesivo que se caracteriza por ausencia congnita de monocitos y neutrfilos, linfopenia y ausencia de inmunidad celular y humoral. El TPH puede ser efectivo para su mejora. 3.7. Trombocitopenia amegacarioctica Esta enfer medad se caracteriza por trombocitopenia de aparicin precoz, en periodo de lactante con ausencia de malfor maciones o asociacin con otros sndromes. Puede tener anemia macroctica y cerca de la mitad progresan a AM. En el mielograma se puede observar una celularidad nor mal con disminucin o ausencia de megacariocitos, el nivel de trombopoyetina est elevado. El test de fragilidad cromosmica es nor mal. Esta enfer medad se debe a una mutacin en el gen del receptor de la trombopoyetina, (c-mpl) el cual se localiza en brazo corto del cromosoma 1 (1p35). Su
herencia es autosmica recesiva. La aplasia medular aparece alrededor de los 3 aos de vida y se corrige con TPH; ocasionalmente pueden presentar leucemia. El diagnstico prenatal se hace con la deteccin en sangre fetal de trombocitopenia y el anlisis del DNA. 3.8. Anemia Blackfan-Diamond Es una enfermedad hereditaria caracterizada por el desarrollo muy precoz de anemia macroctica, nomocrmica, hiporregenerativa con hipoplasia medular selectiva de precursores eritroides, asociada en un 50% a anomalas fenotpicas. Esta enfermedad fue descrita en 1930 por Josephs, Diamond y Blackfan como una aplasia congnita pura de glbulos rojos. Ya se han descrito ms de 1000 casos en la literatura. El diagnstico frecuentemente se efecta durante los 2 primeros aos de vida, un 10% al nacer, 50% a los 3 meses y el 90% antes de los 18 meses, pero puede ser tan tardo como alrededor de los 60 aos. Un 25% presenta herencia autosmica recesiva o dominante, aunque la mayora son casos espordicos. Estos casos espordicos se han descrito como autosmicos dominante con diferente penetrancia. Las anomalas fsicas encontradas en estos pacientes son: fascie tpica, paladar ojival, labio leporino, micr ognatia, hipertelorismo, estrabismo, ptosis palpebral, epicantus, glaucoma, cataratas, cuello corto, fenotipo turner. En los pulgares puede encontrarse ausencia de ellos, bfidez y triples falanges; menos frecuente es encontrar malformaciones cardiacas, genitourinarias y esquelticas. La anemia puede llegar a valores de Hb< 1,5 g/dL, esta anemia es macroctica con aumento de Hb fetal y antgeno i fetal. El mielograma presenta celularidad conservada con ausencia o marcada reduccin de progenitores de la serie roja. Los niveles de eritropoyetina, hierro srico, ferritina, cido flico, y vitamina B12 estn en valores elevados. Adems de altos niveles de adenosin deaminasa (ADA) en los glbulos rojos. La fragilidad cromosmica es normal. La mdula sea muestra un nmero de progenitores hematopoyticos reducido aunque las unidades formadoras de colonias pueden estar aumentadas con altos niveles de eritropoyetina; estas clulas muestran apoptosis acelerada. No se han encontrado mutaciones en c-kit, SCF, ni en genes del receptor de eritropoyetina.
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Pacientes con traslocacin X, 19 o sndromes de microdeleciones que compromete la zona 19q13,2 que expresa el gen RPS19 y codifica una protena ribosomal subunidad 19 (tabla 57), han sido identificadas en un 25% de los pacientes con Anemia de Blackfan-Diamond El gen RPS19 tiene diferente penetrancia. El rol en la eritropoyesis no ha sido aclarado an. Un segundo gen encontrado en esta enfermedad es 8p23.2-p22 en el 35% de los pacientes, cuyo rol tampoco est completamente definido. El tratamiento de primera lnea es el uso de corticoides; se utiliza prednisona en dosis de 2 mg/kg/da hasta que la Hb sea mayor a 8 g/dL seguido de una disminucin gradual de ella, hasta su uso en das alternos, para disminuir los riesgos de su utilizacin en forma crnica. Ms de un 50% responde a los corticoides, sin embargo, un 25% pueden recaer y requerir dosis crecientes aumentando el riesgo de tener efectos adversos. El 25% restante no responde a ellos, en estos pacientes esteroides resistentes se requiere de transfusiones de eritrocitos leucorreducidas peridicas cada 3 a 6 semanas y as mantener Hb> 6 g/dL. El riesgo de la transfusin crnica es la sobrecarga de hierro y es necesario usar terapia quelante del mismo como desferroxamina con protocolos similares a la talasemia. El TPH es una alternativa a los pacientes corticoide resistentes; el xito del trasplante es de un 75-88% de un donante familiar idntico y 14-40% con donantes alternativos. La sobrevida promedio llega a los 42 aos y se han reportado en la ltima dcada hasta los 65 aos. Se han reportado transformaciones malignas como: Leucemia mieloide aguda (LMA), SMD y tumores slidos. Puede efectuarse diagnstico prenatal por la determinacin con ecodopler de anemia in tero, y obtener muestra por cordocentesis para buscar la mutacin RPS19. El diagnstico diferencial ms importante es con la Eritroblastopenia transitoria de la infancia, una enfermedad que aparece despus de los 2 aos de vida, no se asocia a malformaciones y hasta un 20% puede tener asociacin con neutropenia. El ADA de los eritrocitos es normal, de volumen corpuscular (VCM), Hb fetal, antgeno i son normales; el nivel de Hb vuelve a su valor normal entre 1 a 2 meses de su aparicin, no se ha encontrado una causa precisa y requiere de transfusin generalmente en una ocasin.
3.9. Neutropenia Congnita Severa (Sndrome Kostmann) Es una enfermedad autosmica dominante, caracterizada por la presencia de infecciones pigenas recurrentes desde los primeros meses de su vida asociada a recuentos de neutrfilos inferiores a 200/L. La primera descripcin de este sndrome fue efectuada en el ao 1956 por Kostmann. La alteracin gentica que conduce a la enfermedad se encuentra localizada en el gen 2 de la elastasa (ELA2) el que sufre una mutacin heterocigota. En los precursores mieloides se ha descrito adems heterocigocidad para la activacin de la mutacin ras y mutacin del receptor del GCSF, lo cual se relaciona con el desarrollo de neoplasias hematopoyticas. Se caracteriza por una neutropenia marcada, aunque los eosinfilos y monocitos pueden estar aumentados. En la mdula sea se observa una celularidad conservada con ausencia o disminucin de progenitores mieloides o una detencin de la maduracin en los mielocitos o pr omielocitos. En estudios in vitro , la mielopoyesis se corrige al agregar G-CSF, lo que ha permitido el uso teraputico de este factor. Antes del uso de G-CSF los pacientes fallecan antes de los 3 aos de vida debido a infecciones pigenas; desde 1989 ha sido posible su uso en forma rutinaria la dosis recomendada es entre 5-10 mg/kg/da con un xito del tratamiento de un 90%. Al aumentar la sobrevida en este grupo de pacientes, se ha encontrado un riesgo mayor de desarrollar neoplasias hematolgicas como leucemias mieloides (13%) y SMD (7%), el desarrollo de estas enfer medades se asocia con ms frecuencia a la presencia de monosoma 7, la que puede estar desde el diagnstico, o aparecer en el curso de la enfermedad. El TPH est indicado en los pacientes que no responden al G-CSF o presentan alteraciones citogenticas. El diagnstico prenatal se basa en buscar la mutacin ELA2. 3.10. Trombocitopenia con ausencia de radio (TAR) Se han descrito ms de 400 casos, generalmente se diagnostican al nacer debido a la trombocitopenia en ausencia o aplasia del radio con pulgares presentes y normales a diferencia de la AF. Otros hallazgos clnicos son: anomalas en los dedos, ausencia o anomala del cbito, hmer o anor mal, extr emidades cortas, cardiopata congnita y alteraciones gonadales.
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Un 20% presenta alergia a la protena de la leche de vaca. El recuento de plaquetas es <50.000/L al diagnstico, anemia por los sangramientos y ms de un tercio tienen leucocitosis (> 40000/ L) debido a una reaccin leucemoide transitoria. Al examen fsico se encuentra esplenomegalia por eritropoyesis extramedular. La mdula sea tiene celularidad conservada per o, con ausencia o anor malidad de megacariocitos. Presentan fragilidad cromosmica y cultivos hematopoyticos normales para la serie eritroide y mieloide con ausencia de colonias de megacariocitos. Los niveles de trombopoyetina estn elevados con una trombocitopenia amegacarioctica. Su herencia es autosmica recesiva, y no se han descrito alteraciones genticas. El pronstico es mejor que otros sndromes de falla medular congnita; muchos pacientes mejoran despus del primer ao de vida, aunque requier en durante este perodo mltiples transfusiones para mantener el recuento de plaquetas sobre 10000/L. Actualmente su sobrevida es del 75% a los 4 aos. El trasplante es un tratamiento excepcional en esta patologa. Muy rara vez desarrollan alguna neoplasia aunque han sido descritas . El diagnstico prenatal se hace con la bsqueda de las malformaciones del radio asociado a trombocitopenia fetal. LECTURAS SUGERIDAS Abkowitz,J. Aplastic anemia:Wich treatment?. Ann of Intern Med.;137: 524-526, 2001. Alter, B. Bone marrow failure syndromes in children. The Pediatrics Clinics of North America 49: 973-988, 2002. Camita, B.M., Thomas, E.D., et al. Severe aplastic anemia: a prospective study of the effect of early marrow transplantation on acute mortality. Blood; 48:63, 1976.
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HEMATOLOGA
Captulo
ALTERACIONES DEL METABOLISMO DEL HIERRO Y DE LA SNTESIS DEL GRUPO HEM

Ivn Palomo G., Manuel Olivares G., Miguel Arredondo O. y Fernando Pizarro A.
1. Introduccin 2. Metabolismo del hierro 2.1. Homeostasis del hierro 2.2. Absorcin intestinal de hierro 2.3. Regulacin intracelular de los niveles de hierro 2.3.1. Transportador de metales divalentes 1 (DMT1) 2.3.2. Receptor para transferrina 2.3.3. Protena HFE 2.3.4. Transportador Ireg1 2.3.5. Hefestina 2.3.6. Hepcidina 2.4. Modelo de homeostasis del hierro 2.5. Biosntesis del Hem 3. Deficiencia de hierro 3.1. Cambios con el desarrollo y requerimientos de hierro 3.2. Etiopatogenia de la deficiencia de hierro 3.3. Cuadro clnico y consecuencias 3.4. Diagnstico de laboratorio de la deficiencia de hierro 3.5. Prevencin y tratamiento de la deficiencia de hierro 4. Sobrecarga de hierro 4.1. Hemocromatosis 4.1.1. Hemocromatosis hereditaria tipo 1 (clsica) 4.1.2. Hemocromatosis hereditaria tipo 2 (juvenil) 4.1.3. Hemocromatosis hereditaria tipo 3 (mediterrnea) 4.1.4. Hemocromatosis hereditaria tipo 4 4.2. Aceruloplasminemia 4.3. Atransferrinemia 4.4. Hemocromatosis neonatal 4.5. Sobrecarga de hierro africana (Siderosis Bantu) 4.6. Manifestaciones clnicas de la Hemocromatosis Hereditaria (HH) 4.7. Diagnstico de la Hemocromatosis Hereditaria 4.8. Tratamiento de la Hemocromatosis Hereditaria 5. Anemia de enfermedades crnicas y de la inflamacin aguda 6. Anemia sideroblstica 6.1. Anemia sideroblstica hereditaria (ASH) 6.2. Anemia Sideroblstica Adquirida (ASA) 7. Porfirias
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RESUMEN
El hierro (Fe) es un elemento esencial para el ser humano pero en exceso puede ser txico. La homeostasis de Fe es regulada por su absorcin a travs del enterocito. El Fe se absorbe por dos vas, una para el Fe hemnico (Fe-hem) y la otra para el Fe no-hemnico (Fe no-hem). El Fe-hem parece slo ser afectado por protenas animales que facilitan su absorcin y por calcio que puede inhibir su absorcin. En cambio, el Fe no-hem es influenciado por una gran cantidad de factores que disminuyen su absorcin (calcio, fosfato, casena, polifenoles, fitalo) o la favorecen (cido ascrbico y compuestos derivados de la digestin de las carnes). La deficiencia de hierro es la carencia nutricional ms prevalente y la principal causa de anemia. Adems de las manifestaciones propias de la anemia, se han descrito otras manifestaciones tales como: alteraciones de la capacidad de trabajo fsico, actividad motora espontnea, conductuales, del desarrollo mental y motor, inmunidad celular, capacidad bactericida de los neutrfilos, velocidad de crecimiento, mayor riesgo de parto prematuro, bajo peso de nacimiento y de morbilidad perinatal, menor transferencia de hierro al feto, velocidad de conduccin ms lenta de los sistemas sensoriales auditivo y visual. La prevencin de la deficiencia de Fe incluye cambios en los hbitos alimentarios, fortificacin de los alimentos y la suplementacin con hierro. La sobrecarga de Fe puede deberse a un aumento de la absorcin intestinal, como ocurre en la hemocromatosis hereditaria, alteraciones de la movilizacin del hierro tisular y por transfusiones a repeticin en pacientes especialmente en aquellos con anemia aplstica o anemias hemolticas crnicas. La hemocromatosis hereditaria se caracteriza por un depsito anormal y lesivo de hierro en las clulas parenquimatosas de diferentes rganos. Esta patologa afecta a los homocigotos manifestndose entre la cuarta y quinta dcada de vida en hombres y algo ms tarde en mujeres. La anemia secundaria a enfermedades crnicas es una de las anemias ms frecuentes. En su fisiopatologa se reconoce retencin de Fe en el estroma de la mdula sea. Las anemias sideroblsticas son un grupo de desrdenes que se caracterizan por una alteracin en la sntesis del grupo Hem y sideroblastos en anillo en la mdula sea. Las porfirias son un grupo heterogneo de enfermedades adquiridas o hereditarias caracterizadas todas ellas por una anomala en la biosntesis del hem.
1. INTRODUCCIN El hierro es el tercer metal ms abundante en la corteza terrestre y se encuentra en 2 estados redox: Fe+2 y Fe+3. Este mineral es indispensable para la vida; sirve como cofactor de muchas enzimas, hemoprotenas y protenas no hem que cumplen funciones biolgicas cruciales como sntesis de DNA, sntesis de RNA, transporte de oxgeno (hemoglobina), metabolismo del oxgeno (oxidasas, peroxidasas, catalasas e hidroxilasas), transporte de electrones (citocromos) y en el ciclo de Krebs. Sin embargo, las mismas propiedades que lo hacen til le proporcionan caractersticas txicas cuando se encuentra en exceso. El hierro libre puede generar radicales libres que daan componentes biolgicos esenciales (lpidos, protenas y DNA). Para regular una posible alteracin en los niveles de hierro, el organismo debe ser capaz de estimar cundo existe un
dficit o un aumento de hierro, el que ser controlado principalmente a travs de la absorcin de hierro, ms que a travs de su excrecin. Una respuesta inapropiada o una carencia de respuesta conducirn a una anemia o a una sobrecarga de hierro. En medios biolgicos el Fe se distribuye principalmente asociado a protenas (60-70% en hemoglobina, 10% en mioglobina, citocromos y otras enzimas que contienen Fe y 20-30% en protenas de almacenamiento como ferritina y hemosiderina en el sistema retculoendotelial y clulas parenquimatosas hepticas. Los requerimientos en el ser humano son a nivel de elemento traza, diario se absorben desde la dieta 1-2 mg y se excreta la misma cantidad de este in. As en el hombre y en la mujer adultos el contenido de Fe es 55 y 45 mg de Fe por kg de peso, respectivamente.
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2. METABOLISMO DEL HIERRO 2.1. Homeostasis del hierro La mayor parte de las necesidades de hierro del organismo son suplidas por la reutilizacin del hierro proveniente de la destruccin de los glbulos rojos senescentes. El hierro producto del catabolismo de la hemoglobina, en el sistema reticuloendotelial, se une en el plasma a una protena transportadora denominada transferrina (Tf), la que lo entrega va receptor para transferrina (TfR Tranferrin receptor) a los precursores eritroides de la mdula sea, siendo reutilizado en la produccin de hemoglobina. En el adulto el 95% del hierro empleado en la sntesis de hemoglobina proviene de este reciclaje, mientras que en un lactante de 1 ao este valor es de slo un 70%, siendo por tanto este ltimo ms dependiente del aporte externo de este mineral. Las prdidas de hierro son bastante restringidas y fijas. Estas ocurren principalmente a nivel del intestino por sangramiento fisiolgico y descamacin celular. Menos importantes son las debidas a la descamacin de piel y fanerios, sudoracin o eliminacin urinaria. En el nio las prdidas se han estimado en 0.04 mg/Kg de los 0 a 2 aos y de 0.03 mg/Kg de los 2 a 8 aos de edad. Las prdidas en el adulto son de alrededor de 0,9 mg diarios (0,5 mg/m2). En la mujer en edad frtil, la menstruacin eleva las prdidas totales a 1,5 mg diarios. Existen importantes variaciones individuales en la prdida de hierro por la menstruacin, sin embargo en una misma mujer esta variacin entre diferentes perodos es pequea. Por otra parte, los mtodos anticonceptivos pueden alterar significativamente la prdida menstrual. La prdida de hierro es menor a lo normal en mujeres que utilizan tabletas anticonceptivas y mayor que lo nor mal cuando utilizan dispositivos intrauterinos. 2.2. Absorcin intestinal de Fe El metabolismo del hierro est regulado fundamentalmente por su absorcin, proceso que ocurre preferentemente en las primeras porciones del intestino delgado. Los estudios radioisotpicos de absorcin han demostrado que el hierro de los alimentos vegetales es pobremente absorbido, no ocurriendo as con los alimentos de origen animal. Esto se debe a que en la dieta existen dos formas de hierro, las que tienen un comportamiento diferente: a) hierro inorgnico o no-hem, que es el presente
en las sales de hierro y los alimentos vegetales, y b) hierro hem proveniente de la carne (mioglobina) y sangre (hemoglobina). El hierro no-hem se encuentra en los alimentos en forma de complejos frricos. Estos complejos se degradan durante la digestin, integrndose el hierro liberado a un pool comn de hierro ionizado, quedando por tanto sometido a la interaccin con factores intraluminales, provenientes de la dieta o propios del intestino, que van a inhibir o facilitar su absorcin. En la dieta habitual hay un predominio de los ligandos inhibidores, los que actan formando complejos de hierro insolubles. Entre los inhibidores, provenientes de la dieta, uno de los ms potentes son los polifenoles especialmente el tanino, los que estn presentes en el t, caf y algunos alimentos vegetales (legumbres, espinacas, cereales, etc.). La ingestin de t es capaz de reducir marcadamente la absorcin del hierro de la dieta, el caf presenta un efecto similar pero menos pronunciado. Tienen tambin un efecto depresor de la absorcin los fitatos, calcio, carbonatos, oxalatos, fosfatos, el salvado y la yema de huevo. De los facilitadores de la absorcin, el cido ascrbico es el que tiene el efecto ms notable. Su accin pareciera deberse a que forma complejos solubles con el hierro y a que es capaz de reducir el hierro frrico a ferroso, forma que es ms absorbible. Esta vitamina en relaciones molares con hierro superiores a 1:1 es capaz de duplicar la absorcin del hierro inorgnico de la dieta. Presentan tambin un efecto favorecedor la car ne de vacuno, el pescado, algunos aminocidos como la cistena, algunos cidos orgnicos (lctico, ctrico, mlico, tartrico) y azcares. La secrecin cida gstrica tiene un efecto beneficioso al mantener el hierro en su forma reducida (ferrosa), por el contrario un aumento del pH intestinal, como sucede por la accin del bicarbonato presente en la secrecin pancretica, inhibe la absorcin del hierro al favorecer la formacin de quelatos insolubles. La absorcin de hierro est marcadamente influenciada por factores extraluminales, como son el estado de los depsitos de hierro, la velocidad de la eritropoyesis y la hipoxia. A menores depsitos de hierro o mayor velocidad de eritropoyesis existe un aumento de la absorcin. Adems, existe una relacin inversa entre la cantidad de hierro ingerida y el porcentaje absorbido. El hierro hemnico es captado por un proceso an no esclarecido e ingresa como tal al
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enterocito, postulndose que esta captacin es mediada por un proceso de endocitosis en la que participa un receptor. Una vez en la vescula endoctica, el grupo porfirnico es degradado por la enzima hem-oxigenasa, y el hierro as liberado queda disponible para ser transportado al interior celular o entregado a la circulacin, donde es transportado unido a la transferrina, acoplndose de este modo al circuito interno del hierro. Por esta caracterstica de absorcin, el Fe hemnico no es influenciado por las sustancias favorecedoras o inhibitorias de la absorcin del hierro, excepto por el calcio, presentando una absorcin de un 20 a 25%. Otra peculiaridad es que su absorcin es menos influenciada por el estado de los depsitos de hierro. En los organismos superiores la homeostasis del hierro est centrada a nivel de las clulas epiteliales del duodeno, las cuales son responsables de los cambios sensibles de la demanda de hierro corporal. En las criptas duodenales existen clulas precursoras pluripotentes, algunas de las cuales migran hacia las vellosidades y se diferencian en enterocitos, clulas epiteliales altamente polarizadas. Estas clulas estn especializadas en la absorcin y transporte de nutrientes, entre ellos el hierro, mientras que las clulas precursoras solo tienen una funcin de sensor de las necesidades de hierro del organismo. El flujo transepitelial del Fe se divide en 3 fases principales: a) incorporacin del Fe desde el lumen del intestino al interior de la clula, b) trnsito intracelular y c) fase de transferencia al plasma. A nivel intracelular, el Fe se encontrara unido principalmente a tres protenas: mobilferrina, ferritina, y transferrina plasmtica incorporada desde el plasma va receptores para transferrina. La etapa de transferencia de Fe desde la clula al medio basal es la menos caracterizada. Los enterocitos responden a una baja en los depsitos corporales de Fe incrementando su absorcin desde la dieta. Estas clulas regulan el balance de Fe de manera tal que altos niveles corporales bloquean y bajos niveles incrementan la absorcin intestinal de este in. Por lo tanto, se considera a la absorcin intestinal como el paso clave en la regulacin de los niveles corporales de Fe. Los enterocitos representan un primer sistema de regulacin del contenido de Fe relacionado a la edad de la clula. En la cripta intestinal, las clulas ms jvenes se ubican en el fondo de la cripta y presentan
menor contenido de Fe y ferritina (Fn; protena de almacenaje), las clulas ms envejecidas se localizan hacia la punta de la cripta desde donde se descaman. De esta forma, al perder las clulas con mayor contenido de Fe, los enterocitos regulan el contenido de Fe almacenado en el epitelio intestinal (figura 6-1). Para la mayora de las clulas humanas, se ha descrito que el mecanismo de incorporacin de Fe, es realizado a travs de la endocitosis de transferrina va receptores para transferrina. Las clulas del epitelio intestinal expresan TfR en su membrana basal y la captacin de Fe es complementada con la captacin realizada por el Transportador de metales divalentes (DMT1, Divalent Metal Transport 1) en la membrana apical de las clulas del epitelio intestinal.
Figura 6-1. Modelo diferencial entre una clula precursora y enterocito maduro. Las clulas precursoras y los enterocitos maduros se ubican en el fondo y punta de la cripta intestinal, respectivamente. De esta forma, estas clulas detectan concentraciones diferentes de Fe y por lo tanto la expresin de las protenas involucradas en el metabolismo intracelular de Fe es distinta.
2.3. Regulacin intracelular de los niveles de Fe La expresin de las protenas que participan en el metabolismo de Fe es regulada traduccionalmente por el sistema regulador de hierro IRP/IRE. Este sistema de regulacin est conformado por: a) los elementos reguladores de hierro: IRE (Iron Responsive Elements) que se encuentran en los extremos 5 3 no codificantes de los mRNA que traducen las protenas involucradas en el metabolismo de Fe, tales como Ferritina, DMT1, RTf e Ireg1 (transportador de salida en las clulas de epitelio intestinal). As, elementos IRE se encuentran en el extremo 5 de los mRNA de la ferritina y de
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Ireg1 y en el extremo 3 de los mRNA del RTf y del transportador DMT1; y b) por las protenas reguladas por hierro: IRP 1 y 2 (Iron Regulatory Proteins). IRP1 es una protena de 98 kDa, cuya actividad de unin a los elementos IREs es regulada inversamente por la concentracin intracelular de Fe, es decir, a menor concentracin intracelular de Fe, mayor actividad de unin a IREs. IRP2 (105 kDa), presenta una actividad de unin constitutiva, es decir, siempre est presente y no depende de la concentracin intracelular de Fe. Sin embargo, esta protena es degradada por ubiquitinacin cuando la concentracin de Fe aumenta (figura 6-2).
se unen a los elementos IREs, e impiden la traduccin de la ferritina e Ireg1, lo que se traduce en una disminucin del almacenamiento y adems, se produce la estabilizacin de los mensajeros del receptor de transferrina y DMT1, lo que aumenta la captacin de Fe. Cuando el Fe intracelular aumenta, el ncleo de las protenas IRPs cambia de estado conformacional a 4Fe-4S (estado cerrado) perdiendo su capacidad de unirse a los mRNA y se convierte en la enzima aconitasa citoslica. Esto finalmente produce la traduccin de los mensajeros de Fn e Ireg1 y desestabilizacin de los mensajeros del TfR y DMT1, lo que se traduce finalmente en un aumento del almacenamiento y una disminucin de la captacin de Fe. 2.3.1. Transportador de metales divalentes 1 El DMT1 tiene un amplio rango de sustratos, entre los que se encuentran Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co2+, Cd2+, Ni2+, y Pb2+. Dos mRNA para DMT1 se generan por empalme alternativo, uno con un motivo IRE en la regin 3 no traducida y otro sin motivo IRE. Esto resulta en la activacin de la sntesis de DMT1-IRE y del transporte apical de hierro a bajos niveles celulares de hierro y en una actividad basal de transporte independiente de la concentracin celular de hierro dado por DMT1 sin IRE. DMT1 realiza transporte activo acoplado a protn y depende del potencial de membrana de la clula. La secuencia del gen DMT1 predice una protena con doce segmentos de transmembrana, de 561 aminocidos con sus extremos amino y carboxilo terminal ubicados hacia el citoplasma y es expresado ubicuamente. La expresin de DMT1 es estimulada por una dieta deficiente en hierro y representara un mediador clave de la absorcin de hierro intestinal. DMT1 adems de localizarse en la membrana apical de las clulas de epitelio intestinal, tambin se encuentra localizado en endosomas tardos y lisosomas, donde DMT1 podra transferir el Fe libre del endosoma al citoplasma durante el ciclo intracelular de la transferrina. 2.3.2. Receptor para Transferrina El TfR es una macromolcula central para la regulacin de la homeostasis del hierro. Es una glicoprotena de transmembrana tipo 2; homodimrica, cada monmero se conforma por 780 aminocidos, se expresa en los enterocitos de las criptas duodenales, los cuales regulan la absorcin del hierro de la dieta; casi todas las clulas animales expresan el TfR, a
Figura 6-2. Regulacin del metabolismo intracelular de Fe: Sistema IRP/IRE. Las protenas IRP se unen a los elementos IRE, localizados en los extremos 5 3 no traducidos de los RNAm que codifican para protenas involucradas en el metabolismo de Fe y de esta forma regulan su expresin, ya sea inhibiendo la traduccin o estabilizando al RNAm.
Los elementos IRE y las protenas IRP actan en conjunto para detectar y responder a los cambios de hierro en el medio intracelular (pool de hierro reactivo). Las protenas IRP contienen un ncleo cubano que les permite detectar el contenido intracelular de Fe. Cuando el contenido del pool de Fe reactivo es bajo, el ncleo se encuentra en un estado conformacional 3Fe-4S, es decir abierto. En estas condiciones se puede unir a los elementos IRE de los mRNA y as regular su expresin. Cuando la protena IRP se une al extremo 5 no codificante del mRNA, inhibe la traduccin pues bloquea la entrada de la subunidad mayor del complejo traduccional. Cuando se une al extremo 3no codificante, estabiliza al mRNA ya que impide la accin de las ARNasas. Por lo tanto cuando el contenido de Fe en el pool de Fe reactivo es bajo, las IRPs
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excepcin de algunas clulas como los eritrocitos maduros. La estructura del RTf presenta una r egin extracelular con 3 dominios; un dominio de unin a proteasas, un dominio apical y un dominio helical; una regin transmembrana y una regin citoplasmtica (extremo amino terminal). La membrana basolateral participa en dos procesos relacionados con el metabolismo de hierro: a) en la transferencia del hierro desde el enterocito al plasma a travs del transportador Ireg1 y la oxidasa hefestina. (figura 6-1). El hierro que no es exportado al plasma es almacenado en la pr otena de almacenamiento Fn y posteriormente se pierde por exfoliacin de las clulas intestinales. Las protenas relacionadas al metabolismo del hierro en esta membrana, tanto en el precursor como en el enterocito maduro, son sensibles a los depsitos de hierro del cuerpo y b) en la captacin de Fe sistmico (transferrina-Fe) por el TfR. Cuando el hierro corporal se encuentra normal o aumentado, el TfR une transferrina-Fe (Tf-Fe) formando el complejo ternario TfR-Tf-Fe, en la superficie de la membrana basolateral y lo internaliza a travs de un proceso endoctico. El complejo TfR-TfFe una vez en la vescula endoctica y por efecto del pH (aproximadamente 5,5-6,0) se libera el Fe al lumen de la vescula. El complejo TfR-Tf es estable a este pH. El complejo TFR-Tf recicla a la membrana y puede realizar un nuevo ciclo. El Fe de la vescula endoctica es transportado al citasol de la clula intestinal por el transportador DMT1 y pasa a formar parte del pool de Fe comn de la clula. Este proceso aumenta el contenido intracelular de Fe de la clula y por lo tanto, cambia la actividad de las protenas reguladoras de Fe. En la clula eritroide, el Fe liberado probablemente forma parte del pool de hierro que va al interior de la mitocondria para la sntesis del heme o para la insercin del heme en protenas, enzimas dependientes del heme o para ser almacenado en la ferritina. Cuando el hierro alcanza la membrana mitocondrial interna es atrapada por ligandos y es transferido a travs de la membrana interna por la ferroquelatasa. Slo la forma reducida del hierro (Fe+2) puede ser procesada por la ferroquelatasa. El hierro modula la expresin del TfR de una manera feedback negativo en clulas no eritrocticas, sin embargo en clulas que sintetizan hemoglobina los niveles de mRNA son solamente afectadas por una alta concentracin de hierro. El hem baja los niveles de mRNA del receptor para transferrina. Luego que el hem es formado, este
es transportado rpidamente fuera de la mitocondria para combinarse con las cadenas de la globina en el citosol. Cuando la sntesis del hem es inhibida en las clulas eritroides, muy poco o ningn hierro es acumulado en el citosol como ferritina, en contraste con clulas no eritrocitarias en que el exceso de hierro es necesariamente metabolizado formando ferritina. Un defecto en la sntesis del hem explica la formacin de sideroblastos en anillo en pacientes con anemia sideroblstica. Algunos factores que seran los causantes de la acumulacin de Fe no hem en las mitocondrias de los eritroblastos son: a) El hierro no puede ser usado por falta de protoporfirina IX, y b) El hierro puede abandonar la mitocondria slo cuando es incorporado a la protoporfirina IX y forma el hem. La diferenciacin eritrocitaria es activada por la eritropoyetina (EPO) que lleva a una induccin de la transcripcin de todas las enzimas de la va del hem que ocurren coordinadamente con la induccin de los receptores de la transferrina. Adems la disponibilidad de transferrina est sujeta a los niveles de hierro en la sntesis eritrocitaria. 2.3.3. Protena HFE La protena HFE es el producto de expresin del gen de la hemocromatosis hereditaria (HH). La protena HFE es una glicoprotena de transmembrana tipo 1 de 343 aminocidos, que es codificada por el gen HFE. Esta protena es homloga a la molcula MHC clase I; pero existen diferencias, ya que la molcula MHC clase I participa en el sistema inmune presentando el pptido antignico a las clulas T, en cambio, la HFE no une pptidos ni realiza funciones inmunes. Estructuralmente la HFE presenta tres dominios extracelulares (1, 2 y 3), una regin transmembrana y una pequea regin citoplasmtica. Los superdominios 1 y 2 se forman por 8 cadenas beta plegadas y dos alfa hlices, los cuales se ubican en la superficie del dominio 3, el cual se une a travs de un puente de disulfuro a la 2-Microglobulina (2m) en la superficie celular. La protena HFE interacta con el complejo TfRTf-Fe al pH de la superficie de la clula (pH 7,4). Por lo tanto, se forma un complejo ternario (FeTf, TfR, HFE), el cual es endocitado y al pH endosomal el hierr o se libera desde la transferrina; esta ltima se transforma en apotransferrina unida al TfR, la cual se recicla en
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la superficie celular donde el pH bsico de la sangre gatilla su disociacin. La molcula de HFE se disocia del TfR en el interior del endosoma, se piensa que la HFE induce cambios estructurales que facilitan la liberacin del hierro del complejo Fe-Tf a pH cido. Adems del complejo ternario se puede formar otro complejo; en el cual a cada cadena del homodmero del TfR, se une una molcula de HFE para formar un complejo simtrico doble, donde hay amplios contactos entre las dos cadenas polipeptdicas del dmero TfR, pero no hay contacto entre las dos molculas de HFE. Los contactos intermoleculares primarios son entre los dominios 1-2 de la HFE y las hlices 1 y 3 del dominio helical del TfR formando un centro estable. Los dominios 3 y 2m de la HFE no hacen contacto con el TfR, son ms mviles. La Tf se une a la regin correspondiente al dominio helical del TfR; la molcula de HFE se une tambin a la misma zona, es decir, ambas molculas compiten por el mismo sitio en el TfR. La evidencia estructural y bioqumica de que la HFE y el complejo Fe-Tf se unen al mismo sitio en el TfR sugiere que este receptor con dos molculas de Fe-Tf no podra unir HFE. Asimismo, el complejo HFE-TfR con una estequiometra 2:2 no podra unir Fe-Tf; con esto se da a conocer que la HFE puede competir eficazmente con el Fe-Tf a pesar de la gran concentracin fisiolgica de ste. En solucin lo que ms predomina es el complejo ternario, con estequiometra 1:2:1 (Fe-Tf, TfR, HFE). Algunas funciones de la protena HFE en condiciones normales son: a) participar en la captacin del hierro celular, b) en la liberacin del hierro intracelular ya sea disminuyendo la afinidad del TfR y c) anulando la endocitosis del receptor del TfR. La hemocromatosis hereditaria (HH) es un desorden caracterizado por un incremento en la captacin de hierro diettico y un incremento de la tasa de transferencia de hierro hacia la sangre, lo que conduce a una sobrecarga de hierro. Esto se debe a una disminucin en la expresin de la protena HFE funcional. Dos mutaciones principales dan cuenta del 90% de la hemocromatosis hereditaria. La primera es la mutacin de la cistena 280 por una tirosina en el dominio 3. Esta mutacin impide que la chaperona 2-microglobulina se una a la pr otena HFE y por lo tanto sta no es transportada hasta la membrana basolateral de
la clula del epitelio intestinal, donde realiza su actividad. La segunda mutacin corresponde a un cambio de la histidina 63 por un cido asprtico, en el dominio 1. Esta mutacin disminuye la afinidad de la protena HFE por el receptor para transferrina. Se han postulado tres posibles mecanismos de accin de la protena HFE: 1) gracias a que la protena HFE presenta afinidad por el R Tf, competera con la Tf, disminuyendo as la absorcin de hierro sistmico; 2) A nivel del endosoma bloqueara al transportador DMT1, inhibiendo as la liberacin de Fe desde la vescula endoctica al citoplasma y 3) por un proceso de transitosis, la protena HFE llega a la membrana apical y ah inhibe al transportador DMT1. Esto implicara que HFE actuara como una protena sensible a los niveles de depsitos de hierro del organismo (figura 6-1). Adems se seala que las concentraciones relativas de HFE y TfR seran importantes para la carga de hierro, y por lo tanto su relacin es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis del hierro. Tambin se ha demostrado que la protena HFE incrementa la actividad de unin IREs-IRPs, lo que ejerce un control universal sobre la regulacin de hierro celular. 2.3.4. Transportador Ireg1 Otro elemento que participa en la homeostasis de Fe es el transportador Ireg1, tambin denominado ferr oportina o protena transportadora de metales (MTP1). La localizacin de Ireg1 en clulas y tejidos es consecuente con su funcin de exportacin de hierro desde las clulas. En el duodeno est presente en los enterocitos maduros y ausente en las criptas (figura 6-1). En el hgado se encuentra preferentemente en las clulas de Kpffer, y esto podra explicar porque en individuos con HH las clulas de Kpf fer contienen bajos niveles de hierr o en comparacin con el resto de las clulas del hgado. El mRNA de Ireg1 posee en su regin 5 un sitio de unin para IRPs. Por esto se sugiere que este mRNA sera inhibido en condiciones de hierro intracelular disminuido. En individuos hipotransferrmicos el transportador Ireg1 se encuentra elevado a nivel duodenal, debido a que estos individuos, como presentan una anemia severa, necesitan un aumento rpido en la carga de hierro, que se obtiene mediante la estimulacin del transportador por reguladores eritropoyticos y posiblemente va hipoxia.
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2.3.5. Hefestina La protena hefestina (protena homloga a la ferroxidasa multicobre ceruloplasmina) se localiza en la membrana basolateral del enterocito, asociada al transportador Ireg1 (figura 6-1) participando en la oxidacin de Fe+2 a Fe+3. En esta condicin, es decir, Fe+3 la transferrina plasmtica une al Fe y lo transporta por la circulacin, hacia los distintos tejidos. La anemia ligada al sexo (SLA) es un desorden que se caracteriza por una sobrecarga de hierro en el enterocito y una cantidad disminuida en el plasma, producida por una inhibicin en la exportacin del hierro a travs de la membrana basolateral. En la SLA, la hefestina se encuentra mutada (donde ocurre una delecin del aminocido 194 de la protena) y se inhibe la oxidacin del hierro, disminuyendo el Fe disponible para ser transportado por la transferrina. 2.3.6. Hepcidina Es un pptido catinico circulante rico en cistenas, sintetizado en el hgado y excretado por la orina, con actividad anti-microbiana. Existen dos formas predominantes de hepcidina (Hepc), Hepc20 y Hepc25, ambas presentan 8 cistenas conectadas por enlaces disulfuros intramoleculares. El pptido es sintetizado como un pro-pptido de 84 aminocidos, pero solamente las formas de 20 y 25 aminocidos son purificadas a partir de orina. Evidencias en modelos animales sugieren que la hepcidina es un regulador negativo de la absorcin del Fe dietario y de la liberacin del Fe de reciclaje desde los macrfagos. El RNAm de la hepcidina es inducido por los depsitos de Fe y por la inflamacin. Se ha sugerido que la hepcidina sera uno de los mediadores que participan en el desarrollo de la anemia de la inflamacin. El mecanismo por el cual la hepcidina ejerce su efecto sobre la absorcin intestinal an no est claramente establecido. Hepcidina podra regular la absorcin de Fe a travs de la modulacin de la expresin de alguna de las molculas involucradas en la absorcin intestinal de Fe. Dos posibles blancos por su funcin crtica en la captacin de Fe son los transportadores DMT1 e Ireg1. 2.4. Modelo de homeostasis del hierro La regulacin de la homeostasis del hierro comienza en las criptas, que presentan el complejo HFE-TfR, pero no DMT1. Debido a esto no son sensibles a los niveles de hierro en el lumen intestinal. Esta regulacin es mediada por reguladores de depsito de hierro
corporal y por el regulador eritropoytico, quienes comunicaran a travs del plasma el estado de replecin/deplecin de hierro y eritropoyesis que presenta el organismo, ayudado por la capacidad del duodeno de aislar las seales que pudiesen confundir, tales como el pool de hierro lbil del lumen intestinal o en trnsito en el estrato epitelial. Adems estos reguladores tienen la capacidad de estimular, mediante seales externas, a los enterocitos diferenciados. El nivel del pool de hierro reactivo cumple un rol regulador clave en la actividad de unin de las protenas IRP a los elementos IREs de los mRNA, en la modulacin del trfico posttraduccional dependiente de hierro, y en eventos de degradacin. As la expresin de protenas que participan en el metabolismo de Fe depender en parte del pool de hierro lbil que exista en la clula precursora. Este modelo de homeostasis de hierro puede explicarse mejor utilizando como ejemplo lo que sucede en individuos con HH, en donde se observa un alto nivel de pool de hierro lbil producida por un aumento en la captacin por DMT1 y un aumento en la exportacin por Ireg1 y una disminucin de niveles de ferritina. Si la exportacin por Ireg1 sobrepasa al de captacin por DMT1, los niveles de ferritina y pool de hierro lbil se encontrarn disminuidos, estimulando la actividad de unin de los complejos IRP-IREs, lo que conduce a un mayor aumento en la protena DMT1 (figura 6-2). La disminucin del pool de hierro lbil puede redistribuir a DMT1 a la membrana apical desde vesculas endocticas. Un mejor entendimiento de la homeostasis de hierro en el intestino ocurrir con la identificacin de los reguladores eritroides y depsitos de hierro del cuerpo y los mecanismos por los cuales ellos regulan los transportadores de hierro, y posiblemente otras protenas relacionadas con hierro tales como HFE y hefestina. 2.5. Biosntesis del Hem La va de biosntesis del hem es probablemente idntica en las clulas de todos los mamferos, esta va involucra 8 enzimas, 4 de ellas se encuentran en el citoplasma y las otras 4 en las mitocondrias (ver captulo 3). Brevemente, el primer paso ocurre en la mitocondria e involucra la condensacin de glicina con succinil CoA formando el cido -5 aminolevulnico (ALA) esta reaccin es catalizada por la enzima
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aminolevulnico sintetasa (ALAS). Los siguientes 4 pasos de la va tienen lugar en el citoplasma, la ALA deshidratasa (ALAD) convierte a 2 molculas de ALA en porfobilingeno (PBG). Los dos pasos enzimticos siguientes convierten a cuatro molculas de PBG en una estructura cclica llamada tetrapirroli uroporfiringeno III el cual es descarboxilado for mando el coproporfiringeno III. El tercer paso final incluye la insercin de una molcula de Fe+2 en la protoporfirina IX por la ferroquelatasa etapa que ocurre en la mitocondria. 3. DEFICIENCIA DE HIERRO 3.1. Cambios con el desarrollo y requerimientos de hierro El feto adquiere el hierro en forma activa a travs de la placenta. La mayor transferencia de hierro al feto ocurre a las 30 semanas del embarazo, en la cual hay un mximo de traspaso del hierro materno hacia el feto. La transferrina transporta hierro (Tf-Fe) de la circulacin materna a TfR localizados en la superficie apical placentaria, la Tf-Fe es endocitada, el hierro se libera y la apotransferrina vuelve a la circulacin materna. El hierro libre luego se une a la ferritina en clulas de la placenta donde es transferida a la apotransferrina que ingresa del lado fetal de la placenta y sale como holotransferrina a la circulacin fetal. El contenido de hierro del feto es directamente proporcional a su masa corporal, estimndose en 75 mg/kg. El recin nacido de bajo peso de nacimiento, tiene por tanto un menor contenido total de este nutriente. Al nacer la concentracin de hemoglobina es mucho ms alta que en otros perodos de la infancia, siendo estimada a nivel del cordn en alrededor de 170 g/L (17.0 g/dL), siendo esta cifra menor en el prematuro y en la ligadura precoz del cordn. Este gran aumento de la masa de hemoglobina constituye una verdadera reserva de hierro. En el perodo postnatal ocurre un gradual descenso de la concentracin de hemoglobina por la frenacin de la eritropoyesis, debida al aumento de la saturacin de O2 que ocurre una vez iniciada la respiracin y a la sobrevida disminuida de los eritrocitos fetales. Este descenso llega a su mximo a las 6 a 8 semanas de vida, siendo ms pronunciado en el pretrmino, luego de lo cual se reinicia la eritropoyesis. El hierro proveniente del catabolismo de la hemoglobina queda depositado como reserva en el sistema reticuloendotelial y clulas parenquimatosas hepticas, siendo reutilizado una vez reiniciada la eritropoyesis. Los depsitos as formados permiten que el recin nacido de trmino sea
independiente del aporte de hierro exgeno durante los 4 a 6 primeros meses de vida. El recin nacido de bajo peso de nacimiento por tener una reserva de hierro menor y una mayor velocidad de crecimiento, puede ya tener depletados sus depsitos a los 2 a 3 meses de vida. En el embarazo ocurren cambios en la volemia determinados por variaciones en la masa eritrocitaria y en el volumen plasmtico. Ambos componentes son controlados separadamente. La masa eritrocitaria es gobernada por las necesidades de transporte de O2, mientras las variaciones del volumen plasmtico dependen de la necesidad de llenar el lecho vascular y as mantener la presin sangunea. Variaciones en las relaciones entre el volumen plasmtico y la masa eritrocitaria van a dar lugar a modificaciones en el hematocrito, hemoglobina y ferritina srica. En el embarazo se produce un aumento gradual del volumen plasmtico (40-60%), siendo este incremento al final de la gestacin de alrededor de 2.600 ml. Este aumento es ms pronunciado en las multparas, an mayor en los embarazos mltiples, as como tambin se relaciona con el tamao fetal. Los mecanismos involucrados en este aumento no se conocen del todo, postulndose como responsable a algunos de los cambios hormonales y a la existencia de shunts arteriovenosos en el lecho placentario. Es sabido que en las primeras semanas de gestacin existe una reduccin de la resistencia vascular perifrica debida a una relajacin de las fibras musculares lisas probablemente efecto de las prostaglandinas, progesterona y a una reducida sensibilidad a agentes vasoconstrictores como la angiotensina II. Respecto a la masa eritrocitaria, sta experimenta una reduccin en el primer trimestre para luego aumentar progresivamente en el curso de la gestacin (2030%), siendo este aumento al trmino de la gestacin de alrededor de 250 ml. Este incremento es una respuesta a las mayores necesidades de oxgeno de la embarazada. Por otra parte, el descenso inicial ha sido explicado por una secrecin inadecuada de eritropoyetina que ha sido explicada por el incremento del flujo renal en el primer trimestre lo que dara una falsa seal a los sensores de oxgeno renal, a un cambio en el umbral (hecho no demostrado) y al aumento de los niveles de 2,3 difosfoglicerato, responsable que modifica la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno. Todos estos cambios en el volumen plasmtico y en la masa eritrocitaria determinan la existencia de una anemia fisiolgica del embarazo por
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hemodilucin. Los valores nor males de hemoglobina son de 11.0 g/dl para el primer trimestre, 10.5 g/dl para el segundo y 11.0 g/dl para el tercero. La necesidad total de hierro de una embarazada es de 1040 mg. De esto, 350 mg es entregado al feto y placenta, y 250 mg se pierden con el sangramiento del parto. Se necesitan 450 mg para cubrir la demanda impuesta por la expansin de la masa eritrocitaria materna y por ltimo continan las prdidas basales normales, excepto la prdida menstrual, lo que suma aproximadamente 240 mg. Sin embargo, la prdida neta de hierro es de 840 mg (1040 mg 250 mg perdidos en el parto + 450 mg recuperados en el postparto al contraerse la masa eritrocitaria). Esta prdida neta es mayor en partos por cesrea, ya que la cantidad de sangre perdida es casi el doble que en un parto normal debido a la hipoxia y un posible aumento del riesgo de infeccin por alteraciones en la respuesta inmune. 3.2. Etiopatogenia de la deficiencia de hierro La deficiencia de hierro es la enfermedad nutricional ms prevalente en el mundo, estimndose que afecta a alrededor de 100 millones de personas en Latinoamrica. Los grupos ms vulnerables son los lactantes, nios y mujeres en edad frtil. En la infancia la causa ms frecuente de la carencia de hierro es nutricional, originada por la dificultad de cubrir los mayores requerimientos de este mineral por la dieta habitual, predominantemente lctea. El lactante debido a sus elevados requerimientos es particularmente susceptible a la carencia de hierro. Esta predisposicin es an mayor cuando el contenido de hierro al nacer est disminuido como en el prematuro o en embarazos mltiples. Esta susceptibilidad se incrementa en el nio con lactancia artificial, a menos que reciba frmulas lcteas fortificadas, ya que el hierro de la leche de vaca es pobremente absorbido. Por el contrario el lactante de trmino alimentado con leche materna exclusiva, pese al bajo contenido de hierro de sta, se encuentra protegido hasta los 6 meses de vida debido a la excelente biodisponibilidad del hierro de esta leche (50%). En el nio mayor debido a su menor ritmo de crecimiento y a una dieta ms variada, la etiologa nutricional es menos prevalente, siendo habitualmente la deficiencia una situacin que se arrastra desde el perodo de lactante. En esta etapa de la vida adquieren importancia otras causas,
especialmente las prdidas sanguneas aumentadas y el sndrome de malabsorcin. De los sangramientos el ms frecuente es el digestivo. En los pases tropicales una causa comn de prdida crnica de sangre son infestaciones por parsitos intestinales hematfagos, como la ancilostomiasis y la trichocefalosis masiva. En la mujer en edad reproductiva no embarazada la principal causa de deficiencia de hierro es un sangramiento menstrual aumentado asociado a una dieta que tiene cantidades insuficientes de hierro y/o presenta una baja biodisponibilidad de este nutriente (predominante en inhibidores de la absorcin de hierro y con un bajo contenido de hierro hemnico). En la embarazada la cantidad promedio de hierro absorbido requerido diariamente es de 0,8 mg en el primer trimestre (menor que mujer no gestante), concentrndose la mayor parte de los requerimientos en los dos ltimos trimestres, 4,4 mg en el segundo trimestre y 6,3 mg en el tercer trimestre en mujeres que comienzan su embarazo con depsitos ausentes o mnimos. Por otra parte, la absorcin de hierro dietario es baja en el primer trimestre, para luego aumentar progresivamente a medida que declina la nutricin de hierro, llegando a triplicarse alrededor de la semana 36 de gestacin. No obstante este aumento, es imposible cubrir los elevados requerimientos slo con el aporte de hierro de la dieta. Se estima, que a pesar del aumento de la absorcin de hierro, se requieren entre 300 a 500 mg de depsitos de hierro para cubrir el dficit neto de hierro impuesto por el embarazo. Esta cuanta de depsitos de hierro es difcil de encontrar an en sociedades con altos ingresos econmicos. En el hombre adulto y mujeres postmenopasicas la deficiencia de hierro es habitualmente la consecuencia de un sangramiento crnico habitualmente del tracto gastrointestinal. Cuando el aporte de hierro es incapaz de suplir los requerimientos, se producen etapas progresivas de severidad de la deficiencia de hierro. Inicialmente ocurre un agotamiento de los depsitos de hierro (deficiencia latente), que se evidencia por un descenso de la ferritina srica bajo el lmite normal. Si el balance negativo contina se pasa a la etapa siguiente en la que se encuentra comprometido el aporte tisular de hierro (eritropoyesis deficiente en hierro)y que se caracteriza inicialmente por un aumento de los receptores de transferrina sricos y posteriormente por una disminucin de la saturacin de la transferrina y un aumento de la protoporfirina libre eritrocitaria. En caso de
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persistir el dficit se llega a la ltima etapa en la cual existe una anemia, acompaada de microcitosis e hipocroma 3.3. Cuadro clnico y consecuencias Las manifestaciones son las propias de una anemia, asociada a manifestaciones no hematolgicas consecuencia de la mala funcin de enzimas hierro dependientes. En la carencia de hierro se han descrito alteraciones de la capacidad de trabajo fsico y de la actividad motora voluntaria, alteraciones de la inmunidad celular y capacidad bactericida de los neutrfilos, una posible mayor susceptibilidad a las infecciones, alteracin de la termognesis, disminucin de la velocidad de crecimiento, alteraciones funcionales e histolgicas del tubo digestivo, falla en la movilizacin de la vitamina A heptica, alteraciones conductuales y del desarrollo mental y motor, alteraciones neurosensoriales como velocidad de conduccin ms lenta de los sistemas sensoriales auditivo y visual, alteraciones del tono neurovegetativo y ciclo sueo-vigilia. Existen evidencias que estas alteraciones neuro-conductuales no seran del todo recuperables con la terapia con hierro. En embarazadas la anemia severa se asocia a un aumento de la mortalidad materna y fetal. Por otra parte, estudios en los que se ha evaluado el efecto de la anemia ferropriva sobre el embarazo han demostrado que la anemia ferropriva que ocurre tempranamente en el embarazo se asocia a un riesgo 2,7 veces mayor de parto prematuro y 3,1 veces de bajo peso de nacimiento. El riesgo de parto prematuro 5 veces mayor cuando se le aade una metrorragia previa o concurrente. La suplementacin con hierro de embarazadas en
poblaciones con una alta prevalencia de anemia ferropriva mejora su nutricin de hierro, aumenta la duracin de la gestacin y el peso de nacimiento. Hasta hace no mucho tiempo se pensaba que la nutricin de hierro de la madre no tena ningn impacto sobre la nutricin de hierro del recin nacido y lactante, salvo en casos de una deficiencia materna de hierro severa. Esta falta de relacin obedeca ms bien a problemas metodolgicos. Estudios realizados en pases en los que la deficiencia de hierro en la embarazada es alta, han mostrado una asociacin entre la nutricin de hierro materna y los niveles de ferritina srica en el cordn. 3.4. Diagnstico de laboratorio de la deficiencia de hierro Para el diagnstico de la deficiencia de hierro se cuenta con una batera de exmenes. Se dispone de un grupo de anlisis sencillos de realizar y de bajo costo los que se utilizan en la pesquisa de esta patologa (exmenes de tamizaje o screening) y otros ms complejos o ms caros que se emplean para su confirmacin. Entre los primeros se encuentran la medicin de la hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio y prueba teraputica. Los exmenes confirmatorios incluyen las mediciones de la saturacin de la transferrina, protoporfirina libre eritrocitaria, receptor de transferrina srico y ferritina srica. Estos parmetros presentan cambios de los valores normales relacionados con la edad, sexo y algunas condiciones fisiolgicas. Los puntos de corte de hemoglobina utilizados para definir anemia se muestran en la tabla 6-1.
Tabla 6-1. Puntos de corte de hemoglobina y hematocrito recomendados por la Organizacin Mundial de la Salud para el diagnstico de anemia en una poblacin a nivel del mar. Grupo Hemoglobina (g/dL) Hematocrito (%)
Nios 6 a 59 meses 5 a 11 aos 12 a 14 aos Mujeres no embarazadas (>15 aos) Embarazadas * Hombres (>15 aos)
11,0 11,5 12,0 12,0 11,0 13,0
33 34 36 36 33 39
* Puntos de corte utilizados por el Center for Disease Control, USA. Hemoglobina: 1er y 3er trimestre = 11,0 g/dL, 2 trimestre 10,5 g/dL. Hematocrito: 1er y 3er trimestre = 33%, 2 trimestre 32%.
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La medicin de la concentracin de hemoglobina es un examen que se puede realizar en una muestra sangunea capilar o venosa. Este parmetro mide la ltima etapa de la carencia de hierro y su especificidad va a depender de la prevalencia de la carencia de este mineral en la poblacin o grupo a estudiar. La superposicin que existe entre los valores normales y anormales de hemoglobina es un hecho a considerar en la interpretacin de este examen. El hematocrito, si bien es ms simple de realizar, es algo menos sensible que la hemoglobina en la deteccin de anemia. El volumen corpuscular medio para que tenga valor debe ser medido con un contador electrnico de eritrocitos. Se puede realizar en una muestra sangunea capilar o venosa. Cabe sealar que en el recin nacido y embarazada existe una macrocitosis fisiolgica. La microcitosis no es exclusiva de la deficiencia de hierro, tambin se puede apreciar en otras condiciones en las que existe un defecto de la hemoglobinizacin de los precursores eritroides (talasemia, infeccin o inflamacin crnica, intoxicacin plmbica, anemias sideroblsticas, etc.). Al inicio de la reduccin de la concentracin de hemoglobina en la deficiencia de hierro pude que no se aprecie la microcitosis. En los contadores electrnicos de eritrocitos ms avanzados se puede cuantificar el ancho de la distribucin del volumen de los eritrocitos (RDW en la sigla en ingls), el que se encuentra aumentado en algunas variedades de anemias entre las cuales se encuentra la anemia ferropriva. La prueba teraputica certifica la existencia de la anemia ferropriva. Esta es una prueba fcil de realizar a escala individual, pero difcil en el mbito poblacional. Consiste en administrar hierro medicinal en una dosis teraputica (3-5 mg/kg de hierro elemental en nios y 80 mg diarios en adultos, fraccionado en dos dosis) durante un mes. Se considera que la prueba es positiva cuando el aumento de la concentracin de hemoglobina es igual o superior a 1 g/dL. Una prueba positiva indica que el sujeto es verdaderamente anmico ferroprivo, incluso a pesar que pueda tener una hemoglobina dentro de los lmites normales. Una prueba negativa, siempre que el sujeto haya recibido el hierro en dosis y tiempo adecuados, indica la inexistencia de una anemia ferropriva, no excluyendo una deficiencia de hierro en una etapa previa a la anemia. Otras posibilidades son que el sujeto sea normal a pesar de tener una hemoglobina levemente disminuida (ver ms adelante falsa anemia) o corresponder a
una anemia de otro origen. La protoporfirina libre eritrocitaria aumenta cuando existe una disminucin del hierro disponible en el eritroblasto para combinarse con la protoporfirina y formar hem, es por ello que se eleva en la eritropoyesis deficiente en hierro. Al contar con hematofluormetros esta medicin es sencilla de realizar bastando para su determinacin una gota de sangre por lo que se puede realizar en una muestra capilar. Valores aumentados se encuentran tambin en la intoxicacin plmbica y en la anemia de la inflamacin/infeccin aguda y crnica. Las mediciones del hierro srico, capacidad total de combinacin de hierro (TIBC) y saturacin de la transferrina se utilizan frecuentemente como exmenes de confir macin de la deficiencia de hierro. El TIBC constituye una medida de la cantidad de transferrina circulante, protena que nor malmente se encuentra saturada en un tercio de su capacidad. Estos parmetros requieren de una macro muestra sangunea obtenida en ayunas y en material libre de minerales. Por otra parte, el hierro srico y saturacin de la transferrina presentan una gran variabilidad, existiendo importantes fluctuaciones diarias (ciclo circadiano) e interdas. En la eritropoyesis deficiente en hierro ocurre una disminucin del hierro srico y un aumento de la transferrina, lo que determina que en esta condicin exista una reduccin de la saturacin de la transferrina. En la infeccin/ inflamacin aguda o crnica se encuentran disminuidos el hierro srico, TIBC y saturacin de la transferrina. Por otra parte una reduccin del TIBC se encuentra en la enfermedad de kwashiorkor, en el sndrome nefrsico y la enteropata perdedora de protenas. Desde hace no mucho tiempo se encuentra disponible la cuantificacin del nivel srico del TfR, parmetro que ya se altera en la deficiencia tisular de hierro incipiente. Estudios en adultos han demostrado que este parmetro tiene una alta sensibilidad y especificidad en la deteccin de la deficiencia de hierro. Un estudio reciente en lactantes ha demostrado que su sensibilidad no es tan alta como en el adulto si bien posee una gran especificidad. Existen varios kits para su medicin los que tienen valores que no son comparables hasta que no se disponga de un estndar internacional de referencia. Este parmetro se eleva en la deficiencia de hierro y en la hiperplasia eritr oide que es un acompaante de algunas anemias como las hemoltica, etc. La gran limitacin de esta
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medicin es su elevado costo y su gran ventaja es que no se altera en los procesos infecciosos/ inflamatorios agudos o crnicos. En condiciones normales circula una pequea cantidad de ferritina en el plasma que se cuantifica por medio de una tcnica de ELISA. Su concentracin es directamente proporcional al contenido de hierro de los depsitos y slo se encuentra reducida en la deficiencia de hierro. Sin embargo, la ferritina srica es un reactante de fase aguda por ello aumenta en la inflamacin/infeccin aguda o crnica. Tambin se encuentra aumentada en la necrosis heptica. Se estima que existe una deplecin de los depsitos de hierro cuando la ferritina desciende bajo 10 g/L en el nio y de 12 g/L en el adulto. En sujetos con infeccin/inflamacin una ferritina mayor de 50 g/L descarta la existencia de una deplecin de los depsitos de hierro. Al utilizar estos indicadores de laboratorio se debe considerar las variaciones con el desarrollo que experimentan la hemoglobina, hematocrito y volumen corpuscular medio, saturacin de la transferrina, protoporfirina libre eritrocitaria, ferritina srica y receptor de transferrina. Por otra parte, la hemoglobina presenta variaciones con el gnero, embarazo y en la altitud. En sujetos que viven en la altura los valores de referencia se deben incrementar a partir de los 1000 metros. Tambin se debe realizar una correccin en los individuos fumadores. Las pruebas de laboratorio confirmatorias se emplean para la deteccin de la deficiencia de hierro antes de la aparicin de la anemia, para la confirmacin de la etiologa ferropriva especialmente en estudios poblacionales, y en el mbito individual cuando no se obtuvo una respuesta teraputica satisfactoria o si existen dudas de la etiologa ferropriva de la anemia. Como la sensibilidad y especificidad de los indicadores de laboratorio de la nutricin de hierro difieren considerablemente, el dficit de hierro puede detectarse ms precisamente en estudios poblacionales usando una batera de exmenes. Como criterio para el diagnstico de anemia ferropriva se exige una reduccin de la hemoglobina (o hematocrito) junto con una prueba teraputica positiva, o una reduccin de la hemoglobina ms uno de los otros exmenes de laboratorio alterados. Para el diagnstico de deficiencia de hierro sin anemia se exige hemoglobina (o hematocrito) normal, ms al menos dos de los otros exmenes de laboratorio alterados. Deplecin de los depsitos de hierro
se diagnostica cuando existe slo una ferritina srica bajo el lmite normal. 3.5. Prevencin y tratamiento de la deficiencia de hierro La deficiencia de hierro puede prevenirse mediante modificaciones de la dieta, fortificacin de los alimentos, suplementacin y en los pases tropicales adems mediante el control de parsitos intestinales hematfagos. Ninguna de estas medidas es excluyente. Idealmente la deficiencia de hierro debiera prevenirse mediante el consumo de una dieta con un adecuado contenido de hierro de buena biodisponibilidad. Esta condicin la cumplen aquellos alimentos de origen animal que contienen preferentemente hierro hem (carnes, sangre). Tambin es aconsejable estimular una lactancia natural de a lo menos 6 meses, dada la excelente absorcin del hierro de la leche humana (en lactante de trmino protege de la deficiencia de hierro hasta los 6 meses, despus da proteccin parcial); promover la ingesta de alimentos favorecedoras de la absorcin del hierro no-hem, como son las carnes (vacuno, ave, pescado) y aquellos ricos en cido ascrbico (jugos, frutas), siendo esta ltima alternativa una posibilidad barata de mejorar la absorcin de hierr o. Es fundamental tambin desincentivar el consumo de preparados ricos en inhibidores: t, caf, infusiones de hierbas, yema de huevo etc. Los cambios en la dieta dependen principalmente del factor educacin y secundariamente del precio y disponibilidad de los alimentos. Las principales prdidas susceptibles de controlar son la infestacin intestinal por parsitos hematfagos, el consumo de leche de vaca fresca, especialmente en el primer semestre de vida y las diarreas a repeticin. En el contr ol de las enteroparasitosis son fundamentales el tratamiento medicinal de stas y las medidas de saneamiento ambiental. El agregado de hierro a los alimentos tiene como objeto reponer las prdidas de este mineral ocurridas durante el procesamiento (restauracin) o aumentar el contenido de hierro del alimento (fortificacin). La fortificacin de los alimentos con hierro es la forma ms prctica de prevenir la carencia de hierro. Tiene la ventaja de ser de un costo relativamente bajo y de no requerir de la cooperacin activa de los individuos. Para su implementacin se debe seleccionar un vehculo y compuesto de hierro
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adecuados. Los programas de fortificacin de alimentos pueden ser focalizados a un grupo o ser de tipo universal (dirigidos a la poblacin en general). La administracin de hierro medicinal puede ser de carcter preventivo (suplementacin pr ofilctica) o con fines curativos (suplementacin teraputica). La primera modalidad est indicada cuando la poblacin en riesgo de desarrollar deficiencia de hierro no tiene acceso a alimentos fortificados con este nutriente, o existen requerimientos de hierro muy altos los que deben ser cubiertos en un perodo corto de tiempo, como ocurre durante el embarazo. Las dosis de hierro profilctico son menores a las utilizadas cuando la suplementacin tiene un carcter curativo, lo que tiene implicancias en la incidencia de efectos colaterales asociados a la administracin de hierro oral. Estos aumentan en proporcin geomtrica a la dosis utilizada, lo que ha llevado a una progresiva disminucin en las dosis de hierro medicinal utilizadas tanto en la prevencin o el tratamiento de la deficiencia de hierro. Las manifestaciones adversas ocurren en un 6 a 31% de los casos, siendo los sntomas ms comunes nusea, pirosis, dolor abdominal, diarrea o constipacin. El mecanismo responsable de estos efectos adversos es un fenmeno de produccin de radicales libres, desencadenado por el hierro inico, lo que produce un dao en la mucosa gastr ointestinal. La efectividad de la suplementacin preventiva se ve limitada por numerosos factores, siendo el principal la falla en la adherencia a dosis diarias administradas por un perodo relativamente prolongado, lo que ha sido atribuido a los efectos colaterales del hierro, factores sicolgicos, falsas creencias (ejemplo temor en la embarazada de macr osomia fetal con una consiguiente dificultad en el parto) y a la falta de motivacin de una persona que o bien no se siente enferma o ignora las consecuencias de experimentar una deficiencia de hierro y tiene que tomar un medicamento durante un lapso relativamente extenso. Existen varias medidas que se pueden realizar para aumentar la adherencia a la suplementacin. Una muy importante es la motivacin de los sujetos y la educacin sobre la importancia de la prevencin y tratamiento de la deficiencia de hierro, sus consecuencias sobre la salud, as como de los posibles efectos adversos y su manejo. Tambin es importante considerar que el producto a administrar debe presentar la mejor calidad de envase, as como
unas caractersticas fsicas y organolpticas adecuadas. Finalmente es necesario implementar estrategias para reducir la incidencia de los efectos colaterales de la administracin de hierro. Ultimamente se han desarr ollado compuestos de hierr o que presentan una baja incidencia de efectos indeseables gastrointestinales Estos preparados medicinales se caracterizan por proveer una liberacin gradual de hierro inico al intestino. Por otra parte, existen estudios que han demostrado que la administracin intermitente de hierro (una o dos veces a la semana) se asocia a una menor frecuencia de efectos colaterales. En un metanlisis de los estudios de suplementacin intermitentes, los niveles de hemoglobina alcanzados con la terapia una a dos veces a la semana son menores que en la administracin diaria, requiriendo en la primera de un periodo ms largo de suplementacin para alcanzar los valores obtenidos con la administracin diaria. Este hecho hace que la suplementacin intermitente no sea aconsejada para la suplementacin de embarazadas y para el tratamiento de la anemia ferropriva. En la terapia de la anemia ferropriva se utilizan compuestos de hierro de buena biodisponibilidad en una cantidad diaria de 35 mg/kg de hierro elemental en el nio y 80 a 120 mg en el adulto fraccionada en 2 dosis, administradas preferentemente alejadas de las comidas, de modo de evitar las interacciones con los ligandos inhidores presentes en la dieta. La hemoglobina se recupera habitualmente al mes del tratamiento, requirindose un tratamiento adicional por 2 a 3 meses para repletar los depsitos de hierro. 4. SOBRECARGA DE HIERRO La sobrecarga de hierro puede deberse: a) por un aumento de la absorcin intestinal, como ocurre en la hemocromatosis hereditaria, alteraciones de la movilizacin del hierro tisular y b) por transfusiones a repeticin en pacientes especialmente en aquellos con anemia aplstica o anemias hemolticas crnicas. 4.1. Hemocromatosis La Hemocromatosis es una alteracin fisiopatolgica en la que se produce un depsito anormal y lesivo de hierro en las clulas parenquimatosas de diferentes rganos. Se conocen dos tipos de hemocromatosis: primaria o hereditaria (HH) y hemocromatosis secundaria (HS).
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La HH, es un desorden gentico del metabolismo del hierro, existen tres variantes: clsica, juvenil y mediterrnea. Su mecanismo de transmisin es autosmico recesivo que da lugar a un aumento de la absorcin de hierro por la mucosa gastrointestinal y origina un depsito progresivo de este metal desde el nacimiento en las clulas parenquimatosas de diferentes rganos (corazn, hgado, rganos endocrinos, piel y articulaciones) que con el tiempo daa los tejidos y da lugar a enfermedades como cardiomiopata, cirrosis, diabetes mellitus, hipogonadismo, hiperpigmentacin cutnea y artropata, si no se diagnostica y trata precozmente. La HS se produce como consecuencia de alteraciones patolgicas diversas: hepatopata alcohlica crnica, aumento de la ingesta oral de fierro, porfiria cutnea tarda, atransferrinemia congnita, hemocromatosis perinatal idioptica y sobrecarga de hierro parenteral. 4.1.1. Hemocromatosis hereditaria tipo 1 (clsica) Se caracteriza por ser un desorden gentico del metabolismo del hierro, exclusivo de la raza blanca, afecta a uno de cada 300 individuos, con una incidencia de portadores de uno de cada diez individuos, es 5 veces ms frecuente en hombres que en mujeres, tiene carcter recesivo y ligado al HLA; en este sentido es caracterstico encontrar asociacin con HLA-A3 y dentro de l, los haplotipos A3,B7 y A3,B14. En el ao 1996, Feder clon el gen asociado a este tipo de hemocromatosis, denominado HFE, el cual se localiza en el brazo corto del cromosoma 6 (6p21.3) prximo al gen HLA-A, y en l se han detectado dos mutaciones: una a nivel de exon 4 que produce una sustitucin de guanina por adenina en la posicin 845 del gen, que provoca un cambio aminoacdico de cistena por tirosina en la posicin 282 (C282Y) del dominio 3 de la cadena polipeptdica de la protena HFE, esta mutacin se encuentra en el 85% de los individuos con diagnstico clnico de la enfermedad. La segunda mutacin en importancia es a nivel de exon 2 que produce una sustitucin de citosina por guanina en la posicin 183 del gen, que provoca un cambio aminoacdico de histidina por cido asprtico en la posicin 63 (H63D) de la protena; se encuentra solo en un 2.1% de los individuos con hemocromatosis. Cualquiera de estas mutaciones en el gen HFE codificara una protena HFE anormal la cual no podra participar
en el mecanismo de la homeostasis del hierro. Se han descrito otras mutaciones menos frecuentes del gen HFE, que habitualmente se asocian a formas leves de la enfermedad. Las mutaciones mencionadas que afectan a la protena HFE, provocan cambios a nivel estructural ya que se rompe el puente de disulfuro que une el dominio 3 de la HFE con la 2m en la superficie celular, por lo tanto, la HFE no se puede unir al TfR; y ste queda en cierta medida libre, lo que favorece el paso rpido de hierro desde el enterocito al capilar sanguneo. Esto permite comprender la pobreza de hierro en el enterocito de los enfer mos con hemocromatosis. Esta pobreza de Fe intracelular condiciona que las IRP y los IRE-NAR sensibles al hierro, no favorezcan la formacin de apoferritina pero s la de produccin de DMT1 y TfR. En pacientes con HH, se encuentra aumentada la protena DMT1; esto se debe a que el mRNA de esta protena tambin posee en su regin 3' no traducida elementos IRE, donde se une con gran afinidad la IRP-1, y de esta manera estabiliza el mRNA de la protena y aumenta su expresin en la cara apical del enterocito, todo esto sucede cuando hay baja concentracin de hierro intracelular. 4.1.2. Hemocromatosis hereditaria tipo 2 (juvenil) Es un desorden autosmico recesivo en el que existe una mutacin que se ha localizado en el brazo largo del cromosoma 1; las manifestaciones clnicas se presentan antes de los 30 aos; en estos pacientes es caracterstico encontrar hipogonadismo hipogonadotrfico, diabetes y cardiomiopata, pero a diferencia de la hemocromatosis tipo 1 un dao heptico severo es menos frecuente. Recientemente se han descrito dos familias con hemocromatosis tipo 2 asociadas a mutaciones de hepcidina. 4.1.3. Hemocromatosis hereditaria tipo 3 (mediterrnea) Un nuevo tipo de hemocromatosis (tipo 3 o HFE 3) fue recientemente caracterizado en pacientes italianos; es un desorden relacionado con el cromosoma 7 (7q22), exn 6. Estos pacientes son homocigotos por una mutacin (Y250X) del TfR 2, el cual es un miembro de la familia de receptores de transferrina, que muestra una moderada homologa con el TfR, a nivel de su dominio extracelular. Este receptor tambin capta el hierro celular, pero este mecanismo no
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es regulado por el hierro, por lo que se sugiere que el TfR 2 tiene una distinta funcin en el metabolismo del hierro. La falta de interaccin entre TfR 2 y HFE sugiere que TfR 2 tiene un rol independiente en la regulacin del hierro, comparado con la va HFE/TfR. Existen 2 formas de TfR 2 (a y b), la forma a se expresa mayormente en el hgado, es una protena de transmembrana, la forma b se expresa en bajos niveles, por no tener dominio extracelular y de transmembrana se piensa que es protena intracelular. Los pacientes con HFE 3 tienen el receptor de transferrina tipo 2 (a y b) inactivado por la mutacin antes descrita. Mediante tcnicas de biologa molecular (PCR, Reaccin de Polimerasa en cadena), se determinaron dos nuevas mutaciones que inactivan el TfR tipo 2. Una de estas mutaciones es la E60X, en la cual existe una insercin de un residuo de citosina en el exn 2 (84-88 insC). Esta mutacin resulta por una prematura detencin del codn en el aminocido 60 en la protena. La otra mutacin se identific en el exn 4, en el cual ocurra una transversin de timina por adenina (T A) en la posicin 515 del DNA del TfR 2. Este cambio de nucletidos da como resultado un cambio aminoacdico de metionina por lisina en la posicin 172 (M172K) de la protena. En relacin a la mutacin E60X afecta la transcripcin del aTfR2 pero no afecta la transcripcin del bTfR 2 a diferencia de la mutacin Y250X. La mutacin M172K produce un aTfR 2 modificado y afecta la iniciacin del codn de la variante b. Se especula que la ausencia del bTfR 2 podra estar asociado con el fenotipo severo en Y250X y en M172K homocigotos, por lo tanto, individuos con la mutacin E60X homocigotos tendran una funcin parcial de la protena (TfR 2). Se considera que el bTfR 2 tendra una significancia fisiolgica. Los pacientes con HFE 3 presentan todas las manifestaciones clsicas de la hemocromatosis.
exportadora de hierro, cuya consecuencia es una acumulacin de hierro en los macrfagos y una menor disponibilidad de hierro para la transferrina plasmtica y tejido eritropoytico, que llevara a un aumento de la absorcin intestinal de hierro con la consiguiente sobrecarga de hierro. 4.2. Aceruloplasminemia Es un desorden autosmico recesivo extremadamente raro, que ha sido descrito preferentemente en japoneses. En esta afeccin existen mutaciones del gen de la ceruloplasmina el que est localizado en el cromosoma 3q2124. Esta protena por su actividad ferroxidasa cataliza la oxidacin del hierro ferroso a frrico, cambio indispensable para la unin del hierro a la transferrina. En hepatocitos y clulas del sistema reticuloendotelial cooperara con la ferroportina 1. La ausencia de la ceruloplasmina resulta en una acumulacin de hierro en el hgado, pncreas, ganglios basales y ncleo dentado, que lleva a una diabetes mellitus, degeneracin retinal, ataxia y demencia. Adems se encuentra una anemia leve a moderada (consecuencia de la incapacidad de reciclar el hierro desde el sistema retculoendotelial) que se acompaa de niveles disminuidos de hierro y una ferritina srica aumentada. 4.3. Atransferrinemia Es una rara afeccin, probablemente autosmica recesiva, en la que existe una alteracin de la movilizacin del hierro que lleva a una menor disponibilidad de este mineral para la eritropoyesis y acumulacin de hierro en los tejidos. Esta enfermedad se caracterizada por una deficiencia de transferrina que se acompaa de una anemia microctica hipocroma severa, refractaria a la terapia con hierro, y alteraciones en diferentes parnquimas (hgado, corazn, pncreas) producto del dao originado por el aumento del contenido de hierro. 4.4. Hemocromatosis neonatal
4.1.4. Hemocromatosis Hereditaria Tipo 4 Recientemente se ha caracterizado una nueva entidad gentica autosmica dominante, en que fenotpicamente se semeja a la hemocromatosis clsica, pero que a diferencia de la anterior presenta una anemia en edades tempranas. En esta patologa se han descrito mutaciones en el gen de la ferroportina 1, que determinara una pr dida de la funcin de esta protena Este es un sndrome de causa no conocida en que coexiste una enfermedad heptica (cirrosis o hepatitis fulminante) antenatal con un exceso de hierro tisular. La sobrecarga masiva de hierro en el hgado lleva a una falla heptica en el periodo perinatal. Existe tambin una acumulacin de hierro en el miocardio y clulas pancreticas acinares. Algunos casos parecen corresponder a una alteracin en el manejo del
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hierr o tisular, mientras otros par ecen corresponder a una falla heptica de aparicin en el perodo fetal con una sobrecarga de hierro secundaria. En algunos casos hay sugerencias de una herencia autosmica recesiva. Hasta el momento no ha sido posible demostrar ningn gen alterado. 4.5. Sobrecarga de hierro africana (Siderosis Bantu) Esta es una patologa que se observa en poblaciones africanas que beben en forma excesiva una cerveza producida en vasijas de hierro no galvanizado. A pesar de que en estos casos existe una ingesta de hierro excesiva, no todos los bebedores de esta cerveza desarrollan la enfermedad. Anlisis de segregacin han dado bases para plantear una susceptibilidad gentica, en la que individuos con una alteracin en un gen distinto del de la hemocromatosis desarrollara la enfer medad cuando son expuestos a un consumo elevado de hierro. El patrn de la sobrecarga de hierro es distinto al observado en la hemocromatosis hereditaria, existiendo una sobrecarga marcada de hierro en las clulas de Kpfer y en hepatocitos, que ms se asemeja a la siderosis transfusional. La manifestacin ms prominente es la cirrosis heptica, la que en ocasiones se complica de un hepatocarcinoma. La diabetes y cardiomiopata son menos frecuentes. Si bien la ferritina srica se encuentra elevada, la saturacin de la transferrina no siempre se correlaciona con el grado de sobrecarga de hierro. Estos pacientes son ms susceptibles a infecciones, teniendo una mayor incidencia de tuberculosis. Se piensa que en esta patologa existira una alteracin en el reciclamiento de hierro. 4.6. Manifestaciones clnicas de la Hemocromatosis Hereditaria Los sntomas de la (HH) son consecuencia de la sobrecarga de hierro en diferentes tejidos. Esta enfermedad se manifiesta entre la cuarta y quinta dcada de vida en hombres y algo ms tarde en mujeres, debido a las prdidas de hierro por la menstruacin y por los embarazos. La expresin clnica de la enfermedad slo se observa en homocigotos. Los heterocigotos presentan menos alteraciones de los parmetros del hierro y solo desarrollan una sobrecarga significativa cuando coexisten con otras enfermedades que afecten al metabolismo del
hierro: heterocigotos -talasemia, esferocitosis hereditaria, porfiria cutnea tarda. Los rganos y sistemas ms afectados por esta enfermedad son el hgado, la piel, el corazn y el sistema endocrino. El hgado es uno de los rganos ms afectados. En el 90% de los casos existe una hepatomegalia que muchas veces se acompaa de dolor en el hipocondrio derecho. En la histologa se puede apreciar necrosis y cirrosis. El 70% de los pacientes presenta cirrosis, la que es un factor muy importante de pronstico desfavorable. Por otra parte, la cirrosis heptica puede llevar al desarr ollo de un hepatoma (carcinoma hepatocelular primario). La produccin de radicales libres, gatillada por la sobrecarga de hierro, produce una peroxidacin lipdica que genera el dao heptico. La alteracin cardaca ms frecuente es una car diomiopata que en su evolucin se acompaa de una insuficiencia cardaca congestiva resistente a los fr macos convencionales y que responde al disminuir la sobrecarga de hierro. Tambin se pueden observar arritmias tanto auriculares como ventriculares. Un 90% de los pacientes presenta una hiperpigmentacin de la piel (color pardo grisceo), especialmente de las zonas expuestas al sol, debido a un incremento de la sntesis de melanina y a la acumulacin de hemosiderina en los macrfagos y fibroblastos drmicos. En la hemocr omatosis hereditaria son prevalentes las alteraciones endocrinolgicas. La acumulacin de hierro en las clulas gonadotrficas origina una disfuncin hipotlamica con falla hipofisiaria e hipogonadismo (atrofia testicular e impotencia en hombres y amenorrea en mujeres). La diabetes mellitus es frecuente (71%) y se debe a la sobrecarga de hierro del pncreas que lleva a una fibrosis de este rgano y a una destruccin las clulas -pancreticas, adems se puede presentar un aumento de la resistencia insulnica secundaria a la cirrosis heptica. Las manifestaciones osteoarticulares son frecuentes en estos pacientes. Un 20 a 25% tiene sntomas articulares, especialmente de manos, rodillas y columna. Tambin se produce un
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depsito anormal de pirofosfato clcico que lesiona el cartlago articular pudiendo llevar incluso a una poliartritis que se le ha denominado pseudogota. Desgraciadamente, los sntomas articulares no mejoran tras la eliminacin del exceso de hierro. Osteoporosis se observa en el 45% de los casos y es ms frecuente si hay hipogonadismo. La sobrecarga de hierro favorece el crecimiento bacteriano y por otro lado disminuye la funcin de los leucocitos polimorfonucleares, por esto los pacientes son ms propensos a desarrollar infecciones bacterianas, sobre todo con las especies Yersenia y Vibrio. Las infecciones por Yersinia enterocolitica pueden ser muy graves y originar sepsis y abscesos hepticos. 4.7. Diagnstico de la hemocromatosis hereditaria La determinacin bioqumica ms sensible para el diagnstico de la HH la saturacin de la transferrina; as que es sugerente de la enfermedad el hallazgo de dos mediciones superiores al 60% en hombres y al 55% en mujeres. Si el paciente tiene la saturacin de la transferrina normal, no es necesario ningn seguimiento. Otra prueba til es la cuantificacin de la ferritina srica. Es sospechoso el encontrar una ferritina srica >400 g/L en hombres y >200 g/L en mujeres, siempre que no existan otras causas posibles del aumento de la ferritina tales como la necrosis hepatocelular en la hepatitis C, enfer medades inflamatorias, hipertiroidismo y neoplasias. Dado que la ferritina srica es una protena de fase aguda, la medicin conjunta de la protena C reactiva y VHS, ayuda a descartar otras causas de elevacin de la ferritina. Una ferritina srica por encima de 1000 g/L es el indicador bioqumico ms potente de fibrosis heptica. La presencia de una saturacin de transferrina y ferritina elevadas tiene una sensibilidad diagnstica del 93%. En los heterocigotos se pueden encontrar pequeas diferencias con los sujetos normales en los indicadores de laboratorio de metabolismo de hierro. Si las pruebas de tamizaje (saturacin de la transferrina y/o ferritina srica) son sugerentes
de hemocromatosis hereditaria es necesario realizar una biopsia heptica cuantificacin de los depsitos de hierro, procedimiento que tiene importancia para el diagnstico y pronstico de esta patologa puesto indica la existencia o no de cirrosis, la intensidad de la fibrosis, etc. El contenido heptico de hierro puede ser evaluada por mtodos histoqumicos (azul de Prusia de Perls) y tcnicas cuantitativas. En la coloracin de Perls, se nota la presencia de grnulos de coloracin azulada (hemosiderina) en los hepatocitos, predominando frecuentemente en el rea pericanalicular. Basndose en esta coloracin se clasifica el contenido de hierro en 4 grados: IV (100% de los hepatocitos afectados), III (75%), II (50%) y I (25%). En la hemocromatosis el contenido de hierro heptico se encuentra entre los grados III y IV, afectando especialmente a los hepatocitos periportales. Por otra parte el contenido de este metal puede ser cuantificado por espectrometra de absorcin atmica, siendo sugerente de la enfer medad una concentracin de hierro heptico por encima de 80 umol por gramo de tejido seco. Tambin es posible calcular el ndice de hierro heptico (micromoles de hierro por gramo de tejido seco/edad en aos del paciente). Este ndice sirve para diferenciar si el exceso de hierro heptico se debe a una hemocromatosis hereditaria o a una hepatopata alcohlica; si es 2 es concluyente de una hemocromatosis hereditaria. Un ndice heptico de hierro 2 puede considerarse diagnstico, aunque no es igual en varones que en mujeres debido a las prdidas de hierro por la menstruacin y embarazos. La Tomografia Axial computarizada permite detectar aumentos de la densidad heptica compatibles con la sobrecarga de hierro, pero slo cuando es 5 veces superior al lmite mximo normal. Los exmenes genticos sirven para confirmar el diagnstico en pacientes con aumento de los depsitos de hierro y para el tamizaje de sus familiares. La tcnica utilizada es la de PCR, la que sirve para detectar las mutaciones C282Y y H63D entre otras y determina si el individuo es de genotipo homocigoto, heterocigoto o doble heterocigoto. La exactitud de este anlisis es de ms del 99% (tabla 6-2).
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Tabla 6-2. Significado del test gentico para el diagnstico de la hemocromatosis hereditaria Genotipo C282Y +/+ C282Y +/C282Y -/C282Y / H63D H63D / H63D Significado Riesgo elevado de desarrollar la enfermedad (50-95%) No la desarrollan, transmiten el gen Libres del gen Riesgo de desarrollar la HH (0.5-2.0%) Riesgo < 1.0%
4.8. Tratamiento de la Hemocromatosis Hereditaria La flebotoma es el tratamiento de eleccin, es simple, bien tolerada y eficaz. Consiste en extraer 500 mL de sangre semanal, lo que elimina de 200-250 mg de hierro. Se debe monitorear los niveles de ferritina y saturacin de transferrina, hasta alcanzar una concentracin de ferritina <50 g/L y una saturacin de transferrina <50%. La frecuencia de las flebotomas depende de variables como la superficie del individuo, tolerancia y estilo de vida. En los casos de miocardiopata, este tratamiento mejora la funcin ventricular izquierda as como la sobrevida. Durante la terapia de flebotoma se recomienda recibir vitamina E y cido flico. Los quelantes de hierro no son tan efectivos como las flebotomas ya que slo logran eliminar 10-20 mg de Fe por da, pero ellos pueden ser empleados en pacientes con anemia grave, enfermedades heptica y cardaca severas. Tambin se les puede utilizar en combinacin con las flebotomas con la finalidad de lograr una rpida movilizacin del hierro. El agente quelante de hierr o utilizado es la desferrioxamina que forma un complejo con el Fe +3 denominado ferrioxamina, que es excretado a travs de la orina. La desferrioxamina mejora la funcin ventricular y suprime las arritmias de la reperfusin post isqumica del miocardio. El consumo de una dieta pobre en hierro contribuye a reducir la acumulacin de hierro. En ese sentido se deben consumir alimentos con un bajo contenido de hierro, ricos en inhibidores de la absor cin de hierro y pobr es en promotores de la absorcin. Tambin se recomienda no consumir alcohol ya que ste aumenta la absorcin intestinal de hierro.
Los resultados del trasplante heptico no son tan favorables como en otras enfermedades crnicas del hgado, ya que los pacientes suelen presentar un compromiso orgnico mltiple. La terapia de esta enfermedad, mediante sangras y la administracin de quelantes, mejora en for ma significativa algunas manifestaciones como el dolor abdominal, la pigmentacin cutnea, las manifestaciones cardacas (insuficiencia cardaca y arritmias) y la alteracin del metabolismo de la glucosa. Tambin produce una disminucin de tamao del bazo y del hgado, y normaliza las pruebas de funcin heptica. Sin embargo la artritis, el hipogonadismo y la cirrosis no experimentan una mejora. La mortalidad a los cinco aos es del 11% para los que reciben una terapia intensiva de eliminacin del hierro y del 69% para los no tratados. Las principales causas de muerte en los pacientes no tratados son la insuficiencia cardaca (30%), la insuficiencia hepatocelular (25%) y el carcinoma hepatocelular (30%). 5. ANEMIA DE ENFERMEDADES CRNICAS Y DE LA INFLAMACIN AGUDA La anemia de enfermedades crnicas (AEC) es la ms frecuente en los pacientes hospitalizados y la segunda en ocurrencia en la poblacin general. Se define como aquella anemia asociada a enfer medades infecciosas e inflamatorias crnicas, neoplsicas o a grandes traumatismos. En general su severidad es proporcional a la enfermedad de base. La AEC es primariamente una anemia debida a una falla en la produccin eritrocitaria, que se acompaa de una alteracin del metabolismo del hierro en que destaca la coexistencia de una hipoferremia con depsitos de hierro normal o
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aumentado. La anemia es nor moctica y normocrmica, sin embargo se ha observado que un 30-50% de los pacientes presentan hipocroma y microcitosis. En la patogenia de la AEC participan algunas citoquinas y la eritropoyetina. Las primeras investigaciones de niveles de eritropoyetina en AEC fueron efectuadas en pacientes con artritis reumatoide. Aunque estos pacientes tienen un nivel de EPO aumentado como respuesta a su anemia, los niveles de EPO producidos son menores que aquellos detectados en otros pacientes con igual grado de anemia, pero no relacionada con enfermedad crnica. Hallazgos similares se han observado en pacientes con cncer y con SIDA. Si bien la menor produccin relativa de EPO pudiera contribuir a la reduccin de la eritropoyesis en la AEC, sta no debe ser considerada como la causa principal, ya que los niveles de EPO se encuentran aumentados comparados con individuos normales sin anemia. Por lo anterior una falla de la mdula sea para responder al aumento de la EPO tiene un rol fundamental en la gnesis de la AEC. En esta falla medular tienen una participacin crucial diversas citoquinas que van a inhibir la proliferacin de las clulas progenitoras eritroides y alterar el metabolismo del hierro. La interleuquina-1 (IL-1) es capaz de inhibir la formacin de unidades formadoras de colonias BFU-E y CFU-E (progenitores eritr oides tempranos). Se ha visto que el efecto sobre CFU-E es indirecto estando mediado por el interfern- (IFN- producido por linfocitos T como consecuencia de la accin de IL-1. El factor de necrosis tumoral- (TNF-) tambin es capaz de inhibir a las BFU-E y en forma indirecta a las CFU-E. En este ltimo caso el efecto est mediado por el IFN-, producido por las clulas del estroma medular bajo estmulo del TNF. En la AEC existen profundas alteraciones del metabolismo del hierro. Existe un bloqueo en la entr ega de hierro por el sistema retculoendotelial y una menor absorcin intestinal de este mineral lo que producira una deficiencia de hierro funcional que limita la eritropoyesis. Estas alteraciones estn mediadas por algunas citoquinas Las citoquinas y protenas relacionadas con el metabolismo del hierro como HFE, hepcidina, etc. La vida media del glbulo rojo en la AEC est leve a moderadamente disminuida. En estudios
relacionados en pacientes con enfermedades crnicas se estableci que la vida media de sus glbulos rojos era de 80-90 das. Se cree que este fenmeno est relacionado con factores extracorpusculares, ya que al ser transfundidos a un paciente normal, la sobrevida de los glbulos rojos es normal. Los pacientes con infecciones/inflamaciones agudas, incluso leves, pueden presentar una anemia transitoria con alteraciones de laboratorio semejantes a las que se observan en la AEC. La clnica de la anemia secundaria a enfermedades crnicas o enfermedades agudas est comandada por el cuadro base. La anemia es tpicamente leve a moderada. Habitualmente es asintomtica y de evolucin estable en el tiempo en el caso de la AEC. En las infecciones/ inflamaciones agudas es de curso autolimitado. Los exmenes de laboratorio, adems de la anemia muestran un VCM normal o disminuido, hipoferremia, transferrina disminuida, saturacin de la transferrina disminuida o nor mal, protoporfirina libre eritrocitaria aumentada y receptor de transferrina srico normal y ferritina srica aumentada. Este cuadro de laboratorio es muy parecido a la anemia ferropriva con la diferencia de que en la anemia ferropriva los niveles sricos de receptor de transferrina estn aumentados y la ferritina srica est disminuida. Por otra parte, en la EAC o infeccin aguda existe un aumento de la protena de fase aguda y VHS lo que no ocurre en la anemia ferropriva. 6. ANEMIAS SIDEROBLSTICAS Las anemias sideroblsticas son un grupo heterogneo de desrdenes que se caracterizan por presentar una alteracin en la sntesis del grupo Hem y sideroblastos en anillo en la medula sea. El grupo Hem es importante para muchas enzimas mitocondriales, y tambin es un componente integral de la hemoglobina, donde cumple funciones tanto estructurales como funcionales. Tambin modula la transcripcin de mRNA de la globina. El hierro es un importante elemento que integra al grupo Hem tanto estructuralmente como funcional (ver punto 2.5) y adems participa como cofactor de diversas enzimas. En las anemias sideroblsticas se produce una acumulacin de hierro amorfo en las mitocondrias de los eritroblastos de la mdula sea, en forma de fosfato frrico e hidrxido de hierro, llamndose a estas clulas sideroblastos en anillo.
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Las anemias sideroblsticas se caracterizan por presentar en la mdula sea, una eritropoyesis inefectiva y una hiperplasia eritroide acompaada con un recuento nor mal o levemente aumentado de reticulocitos. En sangre perifrica, los glbulos rojos son mayoritariamente microcticos hipocromos, pero pueden presentarse como normocticos normocromos; el hecho de que puedan tener un grado de hipocromia proporciona una evidencia de una sntesis alterada de hemoglobina. Otra caracterstica importante es la sobrecarga
de hierro; sin embargo la causa de sta es todava confusa. Se ha establecido que la eritropoyesis inefectiva est asociada con un aumento de la absorcin intestinal de hierro, y as contribuye a la sobrecarga. Hay varios mecanismos que producen una sntesis defectuosa del Hem y se reflejan en diversas formas de anemias sideroblsticas (tabla 6-3). Estas se clasifican en dos grupos: Anemias sideroblsticas hereditarias y anemias sideroblsticas adquiridas, siendo estas ltimas ms comunes.
Tabla 6-3. Clasificacin de Anemias Sideroblsticas Anemia sideroblstica hereditaria Ligada al cromosoma X Forma autosmica dominante Forma autosmica recesiva Forma congnita Aislada, herencia indeterminada Asociada a citopatas mitocondriales (sndrome de Pearson) Anemia sideroblstica adquirida Idioptica Asociada con mielodisplasia, desrdenes mieloproliferativos Reversible, asociada con: Alcoholismo Ciertas drogas ( isoniazida, cloramfenicol) Deficiencia de cobre (nutricional, toxicidad por Zinc) Hipotermia
Desde el punto de vista clnico los pacientes se caracterizan por presentar sndrome anmico y adems visceromegalia y arritmia cardiaca y en cuanto a parmetros de laboratorio, generalmente presentan: Hemoglobina disminuida (menor a 10 g/dL), CHCM disminuida (hipocr omia), Hierr o srico aumentado, TIBC nor mal o disminuida, Saturacin de transferrina aumentada, Hemosiderina medular aumentada y Presencia de sideroblastos en anillo. 6.1. Anemia sideroblstica hereditaria Este tipo de anemia es infrecuente. Se caracteriza por un defecto en el gen de la enzima ALAS. Hay dos genes que codifican a ALAS, por lo tanto tiene dos isoenzimas. Un gen codifica para ALAS1 en el cromosoma 3 (forma autosmica) y est ubicada principalmente en el hgado. El otro gen codifica para ALAS2
ubicado en el cromosoma X (regin Xp11.21). Por lo tanto, hay cuatro tipos de Anemia sideroblstica hereditaria (ASH): las ligadas al cromosoma X, herencia autosmica, casos aislados congnitos y citopatas mitocondriales: ASH por herencia ligada al cromosoma X. Las ASH ligada al cr omosoma X ocurre principalmente en hombres (XY). Bsicamente se produce una mutacin de la isoenzima ALAS2 que est ntimamente relacionada con clulas eritroides inmaduras ya que su expresin est modulada por la eritropoyesis. A consecuencia de esto, la enzima tiene baja afinidad por el fosfato de piridoxal, hay una inestabilidad estructural, y el sitio cataltico es anormal. Cualquiera de estas anormalidades disminuye la actividad de ALAS y obviamente la produccin de Hem. Como consecuencia de esto, la sntesis de hemoglobina tambin est disminuida.
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ASH por herencia autosmica. Se refiere a la transmisin de la ASH por formas autosmicas recesivas o dominantes. ASH, forma congnita. Representan casos en que los padres aunque sean normales, sus hijos nacen con ASH. ASH por mutaciones mitocondriales. Son desrdenes producidos por deleciones del genoma mitocondrial. Cuadro clnico Este tipo de anemia aparece generalmente en la niez. Puede cursar con visceromegalia, sobrecarga de hierro. Como consecuencia de esta sobrecarga se presenta diabetes y arritmias cardacas. La anemia puede ser altamente variable; casos graves pueden presentarse como anemia microctica- hipocroma, con siderocitos en sangre perifrica. En mdula sea hay hiperplasia eritroide, acompaada de eritropoyesis inefectiva, producto de un desequilibrio entre la sntesis de Hem y formacin de hemoglobina, y sideroblastos en anillo. Tratamiento de ASH Casi la mayora de los pacientes con ASH responden a la administracin de piridoxina, expresndose en el aumento del recuento de reticulocitos, pero los signos de anemia no desaparecen. Los pacientes que no responden a la piridoxina son transfundidos peridicamente con concentrado de glbulos rojos. En pacientes con anemia moderada, la sobrecarga de hierro es tratada con flebotomas. Para pacientes con anemia severa se utiliza el quelante de hierro desferroxamina. 6.2. Anemia Sideroblstica Adquirida La anemia sideroblstica adquirida (ASA) es ms comn que la ASH. Se manifiesta en adultos. Este tipo de anemia se refiere a un defecto de la enzima ALAS, secundaria a cualquier dao. Existen las ASA idiopticas y las ASA reversibles. Anemia Sideroblstica Adquirida Idioptica (ASAI) Est relacionada con los sndr omes mieloproliferativos (SMP) y mielodisplsticos (SMD). Ocurre en personas de mediana edad. Hay tres formas de ASAI: Anomala del cromosoma 5 q- confinada a la serie eritr oide, llamada anemia sideroblstica pura. Anormalidad de las tres lneas celulares. Las
mutaciones cromosmicas pueden ser mltiples: deleciones, trisonoma o inversin. Mutaciones puntuales del DNA mitocondrial de precursores eritr oides tempranos (sndrome de Pearson).
Es una anemia crnica, estable, con una falla medular progresiva o una evolucin leucmica. Esta falla medular se refleja en sangre perifrica con citopenias en las tres lneas celulares. Cuadro clnico. Esplenomegalia leve y sobrecarga de hierro. En el hemograma se aprecia una anemia normoctica (algunas veces puede cursar con macrocitosis), con hipocroma leve, pr esencia de punteado basfilo, leucopenia y trombocitopenia moderada. En el mielograma se observa hiperplasia eritroide, aumento considerable de sideroblastos en anillo. La saturacin de transferrina y ferritina srica estn aumentadas. Tratamiento. La mayora de los pacientes son refractarios al tratamiento con piridoxina. En reemplazo se utilizan transfusiones peridicas y otros tratamientos de sostn. Anemia Sideroblstica Adquirida Reversible (ASAR) Es una anemia inducida por drogas y toxinas. Estas sustancias inhiben algn paso de la biosntesis del Hem. Frecuentemente, la anemia sideroblstica es corregida con la eliminacin del agente causal. ASAR inducida por drogas ASAR inducida por etanol. El etanol es la causa ms comn de ASAR inducida por toxinas. Se produce por el abuso de alcohol. El mecanismo que produce anemia es la inhibicin de la sntesis del grupo Hem, en varios de los pasos. En sangre perifrica, la hemoglobina es normal y el volumen corpuscular medio (VCM) es normal o levemente aumentado, hay presencia de siderocitos. En mdula sea, se presentan eritroblastos con vacuolas como resultado de una injuria o estrs de las clulas y tambin sideroblastos en anillo. Al dejar de consumir alcohol, desaparecen los sideroblastos en anillo dentro de pocos das a dos semanas. ASAR inducida por agentes antituberculosos. Algunas drogas que se
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usan para el tratamiento de la Tuberculosis como isoniazida, pirazinamida y cicloserina entre otras, son causales de anemia sideroblstica. Estas drogas pueden inter ferir en el metabolismo de la vitamina B 6, disminuyendo el piridoxal fosfato (PLP) por lo que la actividad de ALAS estar disminuida as como tambin la produccin del hem. La isoniazida puede inhibir la enzima piridoxal fosfoquinasa (formacin de PLP). La anemia se acompaa de niveles sricos disminuidos de PLP y actividad enzimtica dependiente de PLP disminuida. En sangre perifrica la anemia es microctica- hipocroma. Esta anemia puede revertirse administrando grandes dosis de piridoxal durante el tratamiento de la tuberculosis. ASAR inducida por cloramfenicol. Su mecanismo de accin es inhibir la sntesis proteica bacteriana fijndose en la unidad 50 S del ribosoma procarionte y a su vez, puede inhibir la sntesis proteica en las mitocondrias de los humanos. Es por esta inhibicin que el cloramfenicol induce anemia sideroblstica. La sntesis alterada de hem es identificada por una disminucin de las actividades de ferroquelatasa y ALA sintetasa. Se ha verificado que esta droga tambin reduce la expresin del receptor de transferrina y ferritina. En sangre perifrica, se observa reticulocitopenia, anemia microctica hipocroma. El hierro srico est aumentado. Con la descontinuacin del uso del cloramfenicol desaparecen los sideroblastos en anillos. ASAR inducida por factores nutricionales ASAR por deficiencia de cobre. La deficiencia de cobre es consecuencia de una ingesta inadecuada en sujetos con requerimientos aumentados. Tambin puede ser la consecuencia de una disminucin de la absorcin por patologas digestivas o por la accin de una ingesta excesiva de zinc. El zinc induce la expresin de metalotionena en el intestino la que atrapa al cobre perdindose este mineral al descamarse el enterocito, proceso que
ocurre normalmente entre 3 a 5 da. En la deficiencia de cobre existen niveles disminuidos de ceruloplasmina, enzima que por su actividad ferr oxidasa La ceruloplasmina, enzima dependiente de cobre, facilita la transformacin del hierro ferroso a frrico hecho indispensable para que el hierro se una a la transferrina y sea entregado a los eritroblastos para la produccin de hem. Al no existir una cantidad suficiente de ceruloplasmina se producir una sntesis alterada de Hem. La deficiencia de cobre produce anemia, granulocitopenia, sideroblastos en anillo y eritroblastos con vacuolas. La administracin de cobre (sulfato de cobre) revierte completamente estas anomalas. ASAR inducida por deficiencia de vitamina B6. Es secundaria a mala nutricin, slo ocasionalmente causa anemia sideroblstica.
ASAR inducida por txicos La ASAR inducida por zinc cae dentro de esta clasificacin. El mecanismo de accin se explic en el punto 2.2.2. ASAR inducida por intoxicacin por plomo. Las personas se pueden intoxicar con plomo por aspiracin de gasolina, inhalacin de humos, o absorcin por la piel. Los heterocigotos de deficiencia hereditaria de ALA deshidratasa son ms susceptibles a la exposicin con plomo. En la intoxicacin plmbica se produce una anemia ya que el plomo tiene efectos inhibitorios sobre la sntesis del hem. Todos los pasos de la sntesis del hem son afectados, pero especialmente ALA deshidratasa y ferroquelatasa, entre otras. El plomo tambin limita la entrega intracelular de hierro al sitio de accin de la ferroquelatasa y sustituye el metal hierro por zinc en el sitio de la protoporfirina. El plomo tambin incrementa la destruccin de los glbulos rojos, y disminuye la sntesis de hemoglobina. Cuando la exposicin es muy prolongada puede causar hipoplasia eritroide. Las manifestaciones clnicas tpicas de una toxicidad avanzada son: neuropata autonmica, disfuncin renal. Los cambios hematolgicos son ms bien variables: la anemia tiende a ser levemente microctica hipocroma, la resistencia
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osmtica est disminuida por la injuria a la membrana. El tratamiento consiste en remover las concentraciones de plomo mediante la administracin de un quelante (EDTA) por infusin intravenosa. Un nuevo agente quelante ms efectivo es el cido 2,3 dimercaptosuccinico (DMSA). 7. PORFIRIAS La palabra por firia pr oviene del griego porphyra, que significa morado o prpura. Las por firias se consideran como un grupo heterogneo de enfermedades adquiridas o hereditarias con carcter autosmico dominante o recesivo, caracterizadas todas ellas por una anomala en la biosntesis del hem. Cada tipo de porfiria tiene un patrn caracterstico de sobreproduccin y acumulacin de precursores hem, dependiendo de la disfuncin enzimtica (enzima es una sustancia proteica capaz de activar una reaccin qumica del organismo). El dficit especfico de una enzima en cada tipo de porfiria resulta de un bloqueo parcial en la
biosntesis del hem. Las porfirias se pueden clasificar de acuerdo a tres caractersticas: a) el sitio principal de produccin anormal de porfirinas, en hepticas o eritropoyticas (eritropoyesis es el mecanismo por el que se for ma la sangr e), b) la presentacin: aguda (que tiene un curso breve y relativamente grave) o crnica (que tiene un curso prolongado por mucho tiempo) y c) el patrn de dficit enzimtico en la produccin del hem. El grupo hem es sintetizado en grandes cantidades en la mdula sea e hgado. El grupo hem libre es el que se incorpora a la hemoglobina y a los citocromos, especialmente el p450. El nivel en donde se encuentre la deficiencia enzimtica determinar el tipo de porfiria que se produzca. Se han descrito alrededor de 7 tipos distintos de porfirias (tabla 6-4).
Tabla 6-4. Anormalidades genticas y metablicas de las Porfirias Tipo de Porfiria ALA deshidratasa Intermitente aguda Herencia autosmica Recesiva Dominante Enzima defectuosa ALA deshidratasa PBG deaminasa UFG III sintetasa Porfirina/ precursor excretado Ruta de excrecin Principal tejido de origen Hgado Hgado Mdula sea Hgado Hgado Hgado Mdula sea
ALA, Orina coproporfirina PBG,ALA Uroporfirina I Orina Orina
Eritropoytica Recesiva congnita Cutnea tarda Dominante Coproporfiria Variegata Protoporfiria Dominante Dominante
UFG Uroporfirina I+III Orina descarboxilasa CFG oxidasa PFG oxidasa Coproporfirina Heces PBG, ALA Orina Protoporfirina PBG,ALA Heces Orina Heces
Indeterminada Ferroquelatasa Protoporfirina
ALA cido aminolevulnico; PBG, porfobilingeno; UFG, Uroporfiringeno.; PFG, Protoporfiringeno; CFG, Coproporfiringeno.
Las manifestaciones clnicas son producidas casi en su totalidad por los efectos causados en la piel y en el sistema nervioso, con lo cual se
pueden clasificar en 2 grupos: (a) las que presentan fotosensibilidad cutnea, debido a la propiedad de fluorescencia de las porfirinas,
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cuando son expuestas a la luz ultravioleta de longitud de onda larga. Dentro de stas se encuentran: Porfiria Cutnea Tarda, Coproporfiria Hereditaria, Porfiria Variegata, Protoporfiria Eritropoytica y Eritropoytica Congnita; y (b) las que se pr esentan con alteraciones neurolgicas asocindose a un aumento de la produccin y excrecin de los precursores de las porfirinas, como el cido aminolevulnico y el porfobilingeno, definiendo una Porfiria Aguda o Inducible. Entre stas se encuentran: Por firia Inter mitente Aguda, Porfiria por deficiencia de ALA deshidratasa, Coproporfiria Hereditaria y Porfiria Variegata. La excrecin de la porfirina est determinada por la capacidad de solubilizacin en el agua, que est dada por la cantidad de grupos carboxilos que posee. Porfiria cutnea tarda La porfiria cutnea tarda (PCT) es la ms frecuente de todas las por firias, es una enfermedad del adulto que no se presenta antes de los 45 aos y afecta mayoritariamente a los varones. Tiene una prevalencia de 1 entre 15.000 personas. Sin embargo, la frecuencia en las mujeres ha aumentado por el consumo cr eciente de anticonceptivos orales y estrgenos. Tambin se asocian a infecciones crnicas por virus de la Hepatitis C. Se debe a una deficiencia de la enzima uropor firingeno descarboxilasa, lo que produce porfirinas en exceso en el hgado, las que pasan al plasma y a la piel produciendo una fotosensibilidad que ocasionan lesiones cutneas. Se manifiesta de 2 formas: (a) La enzima est considerablemente disminuida pero slo en el hgado, a este grupo se le denomina PCT I y corresponde es su mayora a casos de deficiencia adquirida (espordica) y (b) Los pacientes que tienen PCT II poseen una deficiencia hereditaria de la enzima que afecta a todos los tejidos. Este tipo corresponde al 20% de los pacientes. La mutacin en el gen HFE es uno de los factores que contribuye a la patognesis de la PCT. Se observ que individuos homocigotos para la mutacin cys282tyr podran desarrollar porfiria cutnea tarda espordica, siendo el aumento del hierro heptico el factor desencadenante. Este aumento producido en la HH, inhibe a la uroporfiringeno descarboxilasa. Entre otros factores desencadenantes se
encuentran el hierro (que podra participar en reacciones que generan radicales libres), el alcohol (como factor hepatotxico), el virus de la hepatitis C, y los estrgenos (se desconoce el mecanismo de estos dos ltimos), y ocasionalmente los hidrocarbonos clorinados (ej, hexaclorobenzeno). El hbito de fumar est posiblemente asociado. Estos factores, especialmente en combinacin con el hierro, pueden producir especies reactivas de oxgeno en el hgado que inactivan la uroporfiringeno descarboxilasa u oxidar sus sustratos. Tambin se puede presentar PCT en pacientes que presentan falla renal y que se hemodializan, ya que el proceso no elimina de manera efectiva las porfirinas debido a que se encuentran ligadas a protenas. Dada la gran elevacin de porfirinas, las lesiones cutneas suelen ser mucho ms graves. Cuadro clnico: aparecen ampollas en las reas expuestas a la luz solar, como cara, brazos y el dorso de las manos. La piel, especialmente la de las manos, es tambin frgil y vulnerable al menor traumatismo. Se aprecian costras y cicatrices. La cicatrizacin es lenta y va seguida a menudo de hiperpigmentacin e hipopigmentacin, hipertricosis (especialmente facial) y aspecto pseudoesclerodermia. Puede presentarse lesin heptica por la presencia de porfirinas, a una infeccin crnica por el virus de la hepatitis C o al exceso de alcohol. La histopatologa heptica muestra comnmente siderosis, hgado graso, necrosis y cambios inflamatorios crnicos. Con el tiempo aparecen cirrosis y carcinoma hepatocelular. El diagnstico se realiza mediante los sntomas y signos que presentan los pacientes. La biopsia cutnea apoya el diagnstico de la PCT, pero no es especfica. Todas las Porfirias que causan lesiones cutneas presentan por firinas plasmticas elevadas. En la PCT se encuentran tambin en la orina, siendo en su mayor parte Uroporfirinas I y III, porfirinas heptacarboxlicas, con aumentos menores de la coproporfirina y de las porfirinas con 5 y 6 carboxilos. En pacientes con dao renal, el diagnstico se establece principalmente midiendo las porfirinas plasmticas y fecales. La PCT tipo II se detecta adems midiendo la uropor firingeno descarboxilasa eritrocitaria antes de realizar flebotomas ya que el aumento de la eritropoyesis posterior a este procedimiento puede elevar el nivel de la enzima en el eritrocito.
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La PCT es la ms fcil de tratar. Debe evitarse el alcohol, los estrgenos, el hierro, contacto con herbicidas y exposicin al sol (utilizar cremas con filtros solares). Flebotomas de 400 500 mL cada 2 a 4 semanas. Si no es posible realizar la flebotoma, una opcin es la administracin de cloroquina o la hidroxicloroquina oral (125 mg 2 veces por semana) con control heptico o de 50 a 100 mg/ 24 horas. Estos frmacos eliminan el exceso de porfirinas del hgado. Las dosis ms altas eliminan las porfirinas con demasiada rapidez, causando un empeoramiento transitorio de la porfiria y dao heptico. Los 2 tipos de PCT responden a la sangra y a la cloroquina a bajas dosis, pero no otros tipos de Por firia. Por lo tanto, es importante un diagnstico exacto antes de iniciar el tratamiento. La flebotoma suele estar contraindicada en pacientes con dao renal a causa de la anemia (debida generalmente a deficiencia de eritr opoyetina), la clor oquina y la hidroxicloroquina no son eficaces. El tratamiento de reposicin con eritropoyetina puede estimular la eritropoyesis, movilizar el exceso de hierro, apoyar la flebotoma y provocar la remisin de la PCT en estos pacientes. LECTURAS SUGERIDAS Allen, L.H. Anemia and iron deficiency: effects on pregnancy outcome. Am. J. Clin. Nutr. 71: 1280S-1284S, 2000. Andrews, N.C. Iron homeostasis insights from genetics and animal models. Nature Rev/ Gentics 1: 208-217, 2000. Andrews, N.C. Medial progress: disorders of iron metabolism. N. Engl. J. Med. 341: 19861995, 1999. Andrews, N.C., Levy, J.E. Iron is Hot: Update the pathophisiology of hemochromatosis. Blood 92:18451850, 1998. Arredondo, M., Muoz, P., Mura, C., Nez, M.T. DMT1, a physiologically relevant apical Cu +1 transporter of intestinal cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284: C1525-C1530, 2003. Aviado, M., Gattermann, N., Bottomley, S. X chromosome inactivation ratios in female carriers of X-linked sideroblastic anemia. Blood 97: 4000-4002, 2001.
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HEMATOLOGA
Captulo
ANEMIAS MEGALOBLSTICAS
Gonzalo Pombo V. e Ivn Palomo G.
1. Introduccin 2. Eritropoyesis megaloblstica 3. Laboratorio 4. Metabolismo de la cobalamina 4.1. Estructura 4.2. Fuentes, requerimientos diarios y depsitos corporales 4.3. Absorcin, transporte y almacenamiento 4.4. Funciones 5. Dficit de vitamina B12 5.1. Etiologas 5.2. Anemia perniciosa 6. Metabolismo del cido flico 6.1. Estructura 6.2. Fuentes, requerimientos diarios y depsitos corporales 6.3. Absorcin, transporte y almacenamiento 6.4. Funciones 7. Dficit de cido flico 7.1. Etiologa 7.2. Manifestaciones clnicas 7.3. Diagnstico 8. Diagnsticos diferenciales
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RESUMEN
Las anemias macrocticas, con morfologa megaloblstica -presencia de macrovalocitos y pleocariosis-, obedecen a deficiencias de vitamina B12 y/o folatos. Los trastornos en la absorcin suelen ser la principal causa relacionada al dficit de B12, mientras que el aspecto carencial se halla ms vinculado al cido flico. Desde el punto de vista morfolgico y clnico, ambas entidades son indistinguibles, pero la presencia de neuropata es ms caracterstica de la deficiencia de cobalamina. El dficit de esta ltima obliga siempre a establecer su etiologa: gastrgena o entergena. La anemia perniciosa es un ejemplo de patologa autoinmune, y debe considerarse la posibilidad de enfermedades asociadas. Las determinaciones humorales -vitamina B12 y folato srico, as como del folato intraeritrocitario-, representan parmetros que, la mayora de las veces, permiten establecer el diagnstico. Tener presente que un valor normal de folato intraeritrocitario excluye prcticamente, una deficiencia de estos dos co-factores de maduracin nuclear.
1.
INTRODUCCIN
encarar el estudio de una macrocitosis. El mecanismo biomolecular de las anemias megaloblsticas reside en el enlentecimiento de la sntesis de ADN, lo cual las diferencia de las otras causas de macrocitosis, en las cuales el VCM suele ser inferior a los 110 fL. Alteraciones en el metabolismo de la vitamina B12 (vit B12): cobalamina, y/o del cido flico (AF) representan las causas ms frecuentes de megaloblastosis, las cuales casi siempre se acompaan de anemia, siendo objeto de descripcin en el presente captulo. 2. ERITROPOYESIS MEGALOBLSTICA La vit B 12 y el AF representan factores de maduracin nuclear, su dficit ocasiona desequilibrio en el crecimiento y divisin celular, expresin del retraso en la sntesis del ADN. Ms apropiado es hablar de hemopoyesis megaloblstica, pues afecta a las tres series, cuyas caractersticas pueden evidenciarse tanto en sangre perifrica como en mdula sea.
Desde un punto de vista general, las anemias macrocticas se dividen en megaloblsticas y no megaloblsticas. Es de hacer notar que, con frecuencia, se observa en la prctica diaria, macrocitosis sin anemia. Se considera macrocitosis cuando el volumen corpuscular medio (VCM) de los glbulos rojos, supera los 100 fl promedio. La hemoglobina suele elevarse en forma proporcional con aumento de la hemoglobina corpuscular media (HCM), siendo la concentracin de HCM (CHCM) normal. En el extendido de sangre perifrica, los hemates pierden su palidez central, impresionando hipercrmicos, trmino infrecuentemente empleado, pues implica elevacin de la hemoglobina, lo cual no es cierto. Es as que a las anemias macrocticas se las designa como normocrmicas. Situaciones tales como hiperglicemia severa, hiponatremia, cuadros hiperleucocitarios, y la presencia de crioaglutininas, pueden cursar con falsos aumentos del VCM (pseudomacrocitosis), debiendo ser un diagnstico de exclusin al
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El anlisis del frotis (extendido de sangre periferica), revela: macrocitos, grado variable de ovalocitos, en r ealidad se trata de macroovalocitos, tamao equivalente a dos eritrocitos, originados de mitosis incompletas, observndoselos bien hipercromticos. Estos, junto a la pr esencia de neutrfilos polisegmentados, con ms de 4 lobulaciones nuclear es, denominados pleocariocitos, constituyen las caractersticas de mayor relevancia en el diagnstico de megaloblastosis. La presencia de anisocitosis, y sobre todo de poiquilocitosis es bastante constante, pudiendo observarse tambin: punteado basfilo, anillos de Cabot, as como de cuerpos de Howell Jolly, expresin de diseritropoyesis. Es comn la presencia de eritroblastos circulantes. Respecto de la lobulacin de los neutrfilos, en condiciones normales, elementos de 4 lbulos se observan en hasta un 17%, y de 5 lbulos hasta un 2%. Cuando estos porcentajes se elevan o bien se evidencia al menos un neutrfilo de 6 o ms lbulos, se habla de pleocariosis. La mdula sea suele ser hipercelular, con las siguientes caractersticas: La serie eritroide es hiperplsica, con signos de eritropoyesis inefectiva, reflejo de la destruccin intramedular de los hemates. Los eritroblastos son de gran tamao, con ncleo inmaduro, en ocasiones con forma de hoja de trbol y cariorrexis, siendo su cromatina laxa (particulada o perlada). El citoplasma suele ser abundante y con gran basofilia citoplasmtica, expresin de la extensa hemoglobinizacin. Estas caractersticas reflejan la disociacin o asincr onismo madurativo ncleocitoplasmtico, descripta por Ehrlich, a los cuales denomin megaloblastos. En la serie mieloide se evidencia la presencia de metamielocitos juveniles gigantes, muy caractersticos de la megaloblastosis. Los megacariocitos suelen presentar un tamao mayor, con aumento del nmero de sus ncleos (hiperploides). La presencia de macrfagos con gruesos grnulos en su interior son expresin del aumento de los depsitos de hierro.
3. LABORATORIO La macrocitosis megaloblstica, en general suele acompaarse de anemia, y a mayor severidad de la misma, es frecuente observar grados variables de leucopenia y/o trombitopenia (pancitopenia). El VCM (Volumen Corpuscular Medio) es > 110 fL, la CHCM (Concentracin de Hemoglobina Corpuscular Media) es normal, el RDW (red cell distribution width, ndice de anisocitosis), suele estar elevado. El recuento de reticulocitos es normal o bajo, excepto en respuesta teraputica y/o hemlisis. Hiperbilirrubinemia indirecta y aumento de LDH, como expresin de hemlisis intramedular son frecuentes. En ocasiones, puede hallarse disminucin de la haptoglobina, con el mismo significado. Elevacin de la LDH, a valores por encima de 3000 UI/L, es muy sugerente de megaloblastosis. Cuando esta ocurre a expensas de la isoenzima 1, permite el diagnstico diferencial con hemlisis. 4. METABOLISMO DE LA COBALAMINA Aspectos bioqumicos y fisiopatolgicos relacionados a esta vitamina, fueron objeto de dos premios Nobel. En 1928, William Castle, sugiri la presencia de un factor extrnseco sintetizado por el hgado, y que ste requera de un factor intrnseco para su absorcin. El autor y otros cientficos, caracterizaron este factor extrnseco, como vitamina B12, siendo receptores del primero de los Nobel en 1934. El segundo correspondi a Dorothy Hodgkin en 1964, por la descripcin de la estructura tridimensional de la vitamina B12 (cristalografa por rayos X). 4.1. Estructura La cobalamina (Cb) o vitamina B12 est formada por dos componentes bsicos (constantes): un ncleo corrina y un nucletido benzimidazlico; su componente radical (variable), es el que determina sus formas activas. Un tomo de cobalto ocupa el centro del ncleo corrnico, a travs del cual se une al nucletido y por el otro al radical (figura 7-1).
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Las principales formas activas de la vit B12 en el organismo humano son: metilcobalamina (plasma) y 5 desoxiadenosilcobalamina (hgado). La cianocobalamina, muy estable, es utilizada como preparado comercial para las pruebas de absor cin. La for ma teraputica, est representada por la hidroxicobalamina. 4.2. Fuentes, requerimientos diarios, depsitos corporales Las principales fuentes de vit B12 son las bacterias saprofitas intestinales (fuente menor), y los alimentos de origen animal (fuente mayor): carne, hgado, riones, corazn. Adems, los huevos, el queso, la leche y los pescados, poseen dicha vitamina (tabla 7-1).
Figura 7-1. Estructura de la vitamina B12
Tabla 7-1. Aspectos metablicos del cido flico y la vitamina B12 Vitamina B12 Fuentes Carnes rojas (hgado, corazn, rin, cerdo) pescado, huevo, leche bacterias intestinales 2 5 g 2 5 mg 3 5 aos Ileon distal Defecto absorcin Acido flico Espinaca, lechuga, coles. bananas, meln, limn hgado, riones 50 100 g 10 12 mg 3 4 meses Intestino delgado proximal Ingesta deficiente
Requerimientos diarios Depsitos corporales Agotamiento depsitos Absorcin Patologa
Los requerimientos diarios oscilan entre 2 5 g, siendo el contenido total de cobalamina del organismo entre 2 5 mg, cuyo principal reservorio es el hgado. Si se interrumpe la absorcin de la vit B12, las reservas se agotan en el lapso de 3 4 aos, pero requiere de 10 20 aos si cesa la ingesta de la misma. Esta diferencia se debe a la recirculacin heptica de dicha vitamina. Una dieta clsica normocalrica contiene entre 10 30 g de vit B12, de los cuales se absorben 3 5 g/diarios.
4.3. Absorcin, transporte y almacenamiento La absorcin, transporte y almacenamiento de la vit B12 es un proceso complejo en el que intervienen una serie de protenas, siendo de suma importancia pues la mayora de los dficit de vit B12 se deben a problemas en la absorcin. Las glndulas salivales y la mucosa gstrica secr etan una cobalofilina (pr otena R o haptocorrinas o protena de acople), encargadas de fijar a la cobalamina o sus anlogos (figura 7-2).
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Figura 7-2. Metabolismo de la vitamina B12
A nivel duodenal, la accin de proteasas pancreticas, ocasionan la disociacin del complejo cobalofilina-cobalamina, para que sta pueda unirse al factor intrnseco (FI). Este es una glicoprotena sintetizada por las clulas parietales u oxnicas del fundus y cardias gstrico. El FI solo se une a la cobalamina y no a sus otras formas activas. Su secrecin es estimulada por el cido clorhdrico, histamina, gastrina, as como por el neumogstrico. De esta forma, el complejo cobalamina-FI, se une a receptores especficos en la membrana de la
clula intestinal (leon distal), en presencia de calcio y a pH alcalino. Recientemente se han descrito dos protenas epiteliales: cubilina y amnionless (AMN), de 460 y de 45-50 KDa, respectivamente. El complejo funcional cubilinaAMN une y endocita al complejo cobalaminaFI, a nivel intestinal. Una vez internalizado, y en el citoplasma, se libera la cobalamina la cual se acopla a su transportador: transcobalamina (TC). Estas, son de tres tipos: I, II y III, perteneciendo a la familia de las cobalofilinas, son 1, y 2 globulinas respectivamente, siendo sintetizadas por distintos tipos celulares (tabla 7-2). La mayora de la Cb, entregada a los tejidos, es la transportada por la TC II, la principalmente asignada al tejido hematopoytico. Mientras que el 70 90 % de la Cb se fija a la TC I y III, su aclaracin plasmtico suele ser muy lento, y el dficit de stas no acarrea patologa alguna. Es de hacer notar, que el tejido nervioso recibe adems, Cb transportada por estas dos ltimas cobalofilinas. La Cb es almacenada en el hgado (1 10 mg) y en los tejidos. Parte puede ser secretada por va biliar al intestino (ciclo enteroheptico), fundamentalmente la transportada por TC III.
Tabla 7-2. Cobalofilinas Cobalofilinas I Sntesis Precursores mieloides Cobalofilinas II Macrfagos, fibroblastos, clulas endoteliales, hepatocitos. Disminuye en dficit de vitamina B12 Cobalofilinas III Serie mieloide madura 2 Aumenta en Policitemia vera
Globulinas Patologa
1 Aumenta en Leucemia mieloide crnica
4.4. Funciones La Cb es clave en dos procesos metablicos, a saber: a) Conversin de homocistena a metionina (metilcobalamina acta como cofactor, de la enzima metionina sintetasa, en el proceso de desmetilacin). b) En el pasaje de metilmalonil CoA a succinilCoA. El cofactor es la 5 desoxiadenosil B12, que acta en la reaccin de isomerizacin. El dficit
de cobalamina, ocasiona una acumulacin intracelular de metimalonil-CoA, con eliminacin urinaria de cido metilmalnico (aciduria metilmalnica). 5. DFICIT DE VITAMINA B12 5.1. Etiologa La deficiencia de vit B12 en los adultos, en su mayora se debe a un defecto en la absorcin, motivo por el cual siempre es importante investigar la causa de la misma (tabla 7-3).
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Tabla 7-3. Etiologa del dficit de vitamina B12 Ingesta inadecuada (rara) Alteraciones gstricas Anemia perniciosa Ausencia hereditaria de FI normal Produccin gentica de un FI alterado molecularmente Gastritis atrfica asociada a autoinmunidad Anemia perniciosa juvenil, Gastritis atrfica degenerativa hereditaria, Atrofia gstrica adquirida (alcoholismo, gastritis crnica), Endocrinopatas (hipo o hipertiroidismo) Gastrectoma Lesiones que destruyan la mucosa gstrica Casticos, Linitis plstica Alteraciones en el complejo vit B12-FI Anticuerpos: Bloqueadores, Fijadores Enfermedades intestino delgado Enteropata inducida por gluten, Espru tropical Enteritis regional (Crohn), Linfoma de intestino delgado Tuberculosis intestinal, Esclerodermia, Reseccin ileal Drogas que alteran absorcin de vit B12 PAS, Colchicina, Etanol, Cimetidina, Ranitidina, Neomicina, Biguanidas Malabsorcin especfica de vit B12 Ingesta de quelantes de calcio por largos perodos Inadecuada obtencin de pH alcalino en leon Zollinger-Ellison, Enfermedad pancretica Alteracin de receptores en leon Congnitos: Sme Immerslund Grsbeck Adquiridos Competicin con vit B12 Parsitos: Diphylobotrium latum Bacterias: sndrome asa ciega Insuficiencia pancretica Utilizacin inadecuada Enzimopatas congnitas o adquiridas Metilmalonil CoA mutasa, Metilentetrahidrofolato reductasa, Desoxiadenosil transferasa Anomalas en la unin de protenas a vit B12, ocasionando inaccesibilidad a los tejidos Aumento de TC I y III: sndromes mieloproliferativos crnicos Aumento de TC II Dficit congnito o adquirido de protena de transporte: Disminucin de TC II Aumento de requerimientos Infancia (etapa crecimiento), Embarazo, Hipertiroidismo Aumento en excrecin Unin lbil vit B12 - TC II, Hepatopata (inadecuada capacidad de depsito)
FI: Factor intrnseco; TC: transcobalamina
Comentaremos algunos aspectos particulares de situaciones especficas. En la patologa pancretica crnica, la malabsorcin de Cb se debe a la imposibilidad de degradar a las protenas R de la saliva, el jugo pancretico y la bilis, consecuencia de la falta de proteasas liberadas por dicho rgano. En el sndrome de Zollinger Ellison, el pH que llega al leon suele ser cido, impidiendo la absorcin de la vitamina.
El sndrome de Imerslund, es de carcter hereditario recesivo, con aparicin de una anemia megaloblstica antes de los 2 aos de vida, asociado a proteinuria persistente, esta ltima suele no responder al tratamiento con vit B12, presumindose un defecto tubular renal Su patogenia reside en una mutacin del receptor ileal (cubilin) del complejo FI-Cb lo que impide la unin de este ltimo al receptor y como consecuencia se presenta una mala absorcin de la vit B12.
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Las anomalas en las protenas de transporte (deficiencia de TC II), se expresan como una anemia megaloblstica, la cual suele manifestarse a edad temprana de la vida. 5.2. Anemia perniciosa 5. 2. 1. Fisiopatologa La anemia perniciosa (AP), fue descripta por Thomas Addison en 1849, siendo Austin Flint, quien en 1860, la relacion con patologa gstrica. Fue George Minot en 1926, quien report que la ingestin de grandes cantidades de hgado crudo poda curar la anemia perniciosa, enfermedad de elevada mortalidad hasta ese entonces. Dicha entidad comprende la asociacin de anemia por dficit de vit B12 y gastritis atrfica crnica (tabla 7-4). Existen dos mecanismos
fisiopatolgicos para explicarla: a) La destruccin y/o prdida progresiva de la masa de clulas parietales, localizadas fundamentalmente en el fundus y cuerpo gstrico, con el consecuente dficit en la produccin de FI. b) La presencia de autoanticuerpos bloqueadores en el jugo gstrico, los cuales se unen al sitio de interaccin de la vit B 12, impidiendo as la formacin del complejo vit B 12 FI. La gastritis atrfica crnica se reconoce macroscpicamente por la prdida de los pliegues gstricos y el adelgazamiento de la mucosa. Las gastritis crnicas pueden ser de dos tipos: tipo A (autoinmune) y tipo B (no autoinmune) (tabla 7-4).
Tabla 7-4. Gastritis crnicas Tipo A Autoinmune Cuerpo y fundus gstrico Anticuerpos anti-clulas parietales y anti-FI Disminucin de Pepsingeno I srico Aclorhidria Hipergastrinemia y carcinoides gstrico Dficit de vit B12 Desde el punto de vista anatomopatolgico, la biopsia gstrica revela un infiltrado mononuclear (plasmocitos, clulas T y probablemente B) en la submucosa extendido a la lmina propia, de distribucin interglandular. En su evolucin, la reduccin de las glndulas gstricas, con la prdida de las clulas parietales, hace que stas sean reemplazadas por clulas de contenido mucoso, llevando a la metaplasia intestinal. La progresin de una gastritis crnica tipo A a una atrofia gstrica, y la aparicin de las manifestaciones clnicas de anemia, es probable que transcurran entre 20 30 aos, hasta su expresin. Las clulas plasmticas contiene autoanticuerpos contra antgenos de las clulas parietales y del FI. El nico target molecular demostrado de los anticuerpos anti-clulas parietales (AACP), es Tipo B No autoinmune Antro No Hipogastrinemia
la ATPasa H +/K + en las clulas parietales gstricas. Esta es responsable de la secrecin de in H+ por dichas clulas, y su recambio por K+. Es improbable que estos auto-anticuerpos sean patognicos in vivo, debido a que dicha ATPasa no es accesible a los anticuerpos circulantes. La presencia de AACP en el suero es predictor de gastritis autoinmune. La patogenia de la gastritis atrfica es mediada por linfocitos T CD4. La activacin de LTh1, resulta de la interaccin de los mismos con su receptor antignico de la clula T (TCR), y el complejo subunidad de la ATAasa H+/K+ con molculas clase II del Complejo Principal de Histocompatibilidad, sobre la clula presentadora de antgeno. Se desconoce el mecanismo ntimo a travs del cual se produce la activacin de la clula presentadora de antgeno, as como la va patognica mediante la cual la clula T produce la gastritis.
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5.2.2. Manifestaciones clnicas Conocida como la gran simuladora, pues puede manifestarse de mltiples maneras, con signo-sintomatologa variable. Enfermedad de comienzo lento e insidioso, a la edad promedio de 60 aos, con leve predileccin por el sexo femenino. Siendo ms comn en personas de ojos azules, canicie precoz, y grupo sanguneo A. Existe tambin una predisposicin gentica, y alrededor del 20% de los pacientes con anemia perniciosa pueden experimentar dicha enfermedad en sus familiares. La forma de presentacin ms frecuente, es por manifestaciones clnicas de anemia, la cual puede ser tambin un hallazgo en un screening de laboratorio de rutina. Es comn observar palidez e ictericia, con una piel de tinte pajizo, similar al observado en el hipotiroidismo y en la insuficiencia renal crnica. La presencia de una glositis atrfica de Hunter (lengua lisa, dolorosa y brillante) suele ser un signo caracterstico, aunque no especfico de dicho trastorno carencial. En ocasiones, puede haber un sndrome diarreico y malabsorcin. Esplenomegalia se puede constatar en un 10 15 %. El dficit de vit B12 puede causar neuropata perifrica y lesin de cordones posteriores y laterales de la mdula espinal (degeneracin combinada subaguda), as como afeccin cerebral. La lesin progresa de la desmielinizacin a la degeneracin axonal y an la muerte neuronal, las cuales pueden ser irreversibles a pesar del aporte de la vit B12. Dicha neuropata perifrica puede presentarse en ausencia de anemia megaloblstica manifiesta. Las parestesias distales y simtricas, en manos y pies, as como la hipoestesia, son expresin de la misma. La hipo o apalestesia (sensibilidad profunda vibratoria) y la prdida de la sensibilidad propioceptiva (sensacin de postura y posicin), reflejan el dao del cordn medular posterior, al igual que la ataxia sensorial con presencia del signo de Romberg. La paresia de los miembros, la espasticidad y el signo de Babinsky expresan el dao del cordn medular lateral.
Entre las manifestaciones cerebrales pueden citarse al cambio de carcter, prdida de la memoria, confusin y hasta una franca psicosis, conocida como locura megaloblstica. Tener presente que dficit cognitivos, fatiga, depresin, los cuales son mal interpretados como relacionados a la edad, pueden ser expresin de dficit de vit B12, an sin anemia. Manifestaciones cardiovasculares: a pesar de presentarse con hemoglobina extremadamente baja puede manifestar una buena tolerancia a la misma, sin embargo, la fiebre, expresin de la hemlisis intramedular o bien de proceso infeccioso o tiroideopata asociada, puede desencadenar un cuadro de insuficiencia cardaca. Por otra parte, eventos trombticos arteriales y an venosos, han sido atribuidos al aumento de los niveles de homocisteina, consecuencia del dficit de flico y/o vit B12. 5.2.3. Complicaciones gstricas La aclorhidria, el sobrecimiento bacteriano y el desarr ollo de una metaplasia intestinal constituyen todos factores de riesgo para aparicin de un adenocarcinoma (AC). Los pacientes con AP, tienen tres veces ms riesgo de AC, as como trece veces ms de tumor carcinoide. La prevalencia de AC en esta patologa es de 1-3%, mientras que 2% de los pacientes con AC, tienen una AP. Se recomienda el seguimiento peridico con sangre oculta en materia fecal y/o videoendoscopa gstrica en estos enfermos. 5.2.4. Asociaciones clnicas Es conocida la asociacin de AP con endocrinopatas inmunes y enfermedades autoinmunes antirreceptor. As se la ha encontrado r elacionada a: tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, vitiligo, hipoparatidoidismo, enfermedad de Addison, insuficiencia ovrica primaria, diabetes insulinodependiente, cirrosis biliar primaria, colitis ulcerosa, miastenia gravis, sndrome de Eaton Lambert, lupus eritematoso sistmico, entre otros. Una asociacin a inmunodeficiencia comn variable, con descenso de inmunoglobulinas o dficit selectivo de Ig A, ha sido reportado en pacientes jvenes con gastritis tipo B.
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5.2.5. Diagnstico a) Hemograma. Revela anemia macroctica, en general con un VCM mayor a 110 fl, y con frecuencia mayor a 120, con reticulocitos normales o disminuidos. Puede observarse presencia de leucopenia y/o trombocitopenia, o bien una pancitopenia perifrica. Es caracterstica la hipersegmentacin de los neutrfilos. La elevacin de la LDH y la hiperbilirrubinemia indirecta son expresin de la hemlisis intramedular. b) Dosajes sricos: en la prctica se realizan los dosajes de vit B12 srica, la cual suele estar disminuida, al igual que el folato intraeritrocitario, siendo la concentracin srica de ste normal. Deben tenerse presente ciertas consideraciones, a saber: (i) los valores de vit B12 srica reflejan, los niveles de est, unida a sus dos proteinas transportadoras: haptocorrina y transcobalamina. Esta ltima (TC) representa una fraccin cercana al 30 % de la vit B12 circulante, siendo a la vez la nica que libera dicha vitamina a la clula; (ii) las modificaciones en el status de la B 12, revelan una mayor sensibilidad para la holotranscobalamina (hTC) respecto de la holohaptocorrina (hHC); (iii) Aproximadamente un 15 % de disminucin de los niveles sricos de B12 se deben a un descenso de la hHC, sin reflejar un estado de deficiencia de B12; (iv) Estas diferencias en la sensibilidad y especificidad se deben tener en cuenta en la interpretacin de los resultados. Es posible que los valores de hTC reflejen mejor y detecten en forma ms precoz el dficit de vit B12. c) Niveles de cido metilmalnico (AMM) en orina. La aciduria metilmalnica es una expresin del aumento srico del cido metilmalnico que se observa en los pacientes con dficit de vitamina B12. Permite hacer diagnstico diferencial con el dficit de folatos, ya que en este ltimo los niveles de cido metilmalnico son normales. d) Prueba de supresin de desoxiuridina (dU). Consiste en la incorporacin in vitro de la desoxitimidina tritiada a las clulas de la mdula sea y linfocitos, la cual suele ser anormal, corrigiendo con el agregado de vit B12 y/o AF al medio de cultivo. Es una prueba muy sensible, detectando carencia an en ausencia de anemia. No siendo de uso rutinario pues requiere equipamiento y material especializado, por lo cual ha quedado relegado a la investigacin. e) Test de Schilling. Prueba utilizada para valorar
la absorcin de la vit B12. Permite adems, diferenciar una anemia megaloblstica de origen gastrgeno de entergeno. Consiste en cuantificar la excrecin urinaria de la Cb marcada con Co58, suministrada por va oral, habiendo previamente saturado completamente la TC II, mediante la administracin intramuscular de 1000 mg de Cb no mar cada. La orina recolectada durante 24 horas, elimina entre 0 2% de la dosis administrada (valor normal: > 5%). El siguiente paso consiste en administrar Co 58 + FI. Si se obtiene correccin, mayor eliminacin de Co por orina, se debe a que existe un dficit de FI, por lo tanto presume una etiologa gstrica (gastrgeno). En el caso contrario, es decir cuando no corrige, el pr oblema residira a nivel intestinal (entergeno). f) Medicin de la acidez gstrica (pH). Realizada en ayunas, revela un pH alcalino debido a la aclorhidria, la cual es resistente a la histamina o pentagastrina. Un 25% de los pacientes con espru o intolerancia al gluten, tambin pueden presentarla. g) Autoanticuerpos anti clulas parietales. Se detectan en casi el 90% de los pacientes con AP, y en hasta el 30% de los familiares de primer grado sin anemia, al igual que en aquellos con endocrinopatas autoimmunes. En sujetos normales, se observa un incremento en relacin a la edad (2.5 9.6%). Se emplea la tcnica de inmunofluorescencia indirecta, utilizando estmagos de ratn, para evitar falsos positivos. h) Autoanticuerpos anti-FI (complejo cobalamina-FI). Su presencia es casi diagnstica de AP y gastritis tipo A. Pueden ser de dos tipos: tipo I o bloqueadores: impiden unin vit B12 al FI. Se hallan presentes en el 70% de los sueros de los enfermos con AP. Los tipo II o fijadores los cuales interaccionan con el complejo vit B12FI impidiendo su absorcin. Se encuentran en el 3040% de los pacientes con AP, y raramente se los halla en ausencia de anticuerpos tipo I. Ambos anticuerpos se pueden detectar con mayor frecuencia en el jugo gstrico que en el suero. La hipergastrinemia resulta en la extensin de la gastritis al antro, y por la estimulacin, por la aclorhidria, de las clulas G, productoras de gastrina. La destruccin de las clulas principales, es la responsable de los niveles descendidos de pepsingeno I.
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Biopsia gstrica: realizar mltiples tomas, con los hallazgos anatomopatolgicos caractersticos. 6. METABOLISMO DEL CIDO FLICO
cuales aumentan su demanda. Los depsitos corporales oscilan entre 10 12 mg, los cuales se agotan al cabo de 3 4 meses del cese de la ingesta. 6.3. Absorcin, transporte y almacenamiento
6.1. Estructura De la unin del cido pteroico y una o ms molculas de L-glutmico surge el cido flico o pteroilglutmico (figura 7-3). En los alimentos se encuentra bajo la forma de poliglutamatos, los cuales deben ser reducidos a tetrahidroflico (THF), forma activa, para ser absorbidos. El AF en los alimentos se encuentra bajo la forma de poliglutamatos, los cuales son degradados a monoglutamatos, por las conjugasas intestinales (carboxipeptidasas). Estos, a nivel del ribete en cepillo de las clulas del yeyuno proximal, se unen a un receptor especfico, siendo incorporadas al espacio intracelular (figura 7-4). All son transfor madas a dihidrofolato (DHF), luego a travs de una DHFreductasa, a tetrahidrofolato (THF), y este a 5 metil THF (5-MTHF), siendo esta ltima la forma en que circula por el plasma, unida a una protena transportadora ( globulina) y a la albmina.
Figura 7-3. Estructura del cido flico
Las formas teraputicas existentes son como cido flico o bien como cido folnico. 6.2. Fuentes, requerimientos diarios y depsitos corporales Las principales fuentes estn representadas por los vegetales: espinacas, lechugas, coles. Las carnes, poco cocidas, tambin contienen dicho co-factor. Las bananas, el meln, el limn, garbanzos, lentejas, porotos, manes, germen de trigo y levadura son otras sustancias en las cuales est presente (tabla 7-1). Se trata de un compuesto lbil, as las elevadas temperaturas, destruye el AF de los alimentos, motivo por el cual se aconseja evitar hervirlos, y reducir el tiempo de coccin. El cido flico producto de sntesis intestinal, no suele ser aprovechado por el organismo, ya que se elimina por materia fecal. Los requerimientos diarios son de 50100 g, siendo el embarazo y la lactancia etapas en las
Figura 7-4. Metabolismo del cido flico
La determinacin del 5-MTHF es expresin del folato srico (folatemia), mientras que la valoracin del folato intraeritrocitario, es un fiel reflejo de los depsitos corporales de AF. El 5-MTHF se incorpora a los distintos tejidos, fundamentalmente hgado y mdula sea, donde es depositado como poliglutamatos, para luego ser transformado en otros compuestos entre ellos el 5-formil THF (cido folnico) y el 5-10 metilenTHF (metilenTHF). El eritrocito maduro es impermeable al AF, siendo este incorporado al citoplasma de los eritroblastos. Este proceso, al igual que su retencin celular, es dependiente de la vit B12, explicando por qu los pacientes con dficit de esta vitamina presentan disminucin del FiGR. El organismo utiliza el 5-MTHF de los depsitos corporales, siendo su reconversin a THF,
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tambin dependiente de la vit B12. Cuando existe deficiencia de Cb, este proceso no es posible, quedando atrapado el 5-MTHF (trampa de metilo). Por ltimo tambin existe una circulacin enteroheptica de AF, a travs de la cual los folatos de los hepatocitos son eliminados por la bilis al intestino para ser posteriormente reabsobidos. 6.4. Funciones Interviene en la sntesis del ADN a travs de sus for mas metiladas, principalmente el metilenTHF, co-enzima de la timidilato sintetasa (TMS), la cual transforma la desoxiuridina monofosfato (dUMP) en desoxitimidina momofosfato (dTMP). La vit B12 tambin es necesaria para la sntesis del ADN, pues es requerida en la reconversin de 5- MTHF a THF, como ya se coment antes. 7. DFICIT DE CIDO FLICO 7.1. Etiologa A diferencia de la vit B12, la deficiencia de folatos tiene como causas principales la inadecuada ingestin, el alcoholismo y la accin de mltiples agentes farmacolgicos sobre el metabolismo del AF (tabla 7-5). El embarazo y posiblemente la tercera edad, son etapas en las cuales se incrementan sus requerimientos. La hemlisis suele acompaarse de carencia del mismo debido al aumento de la demanda por la actividad eritropoytica exaltada, y ante el dficit de folatos puede observarse un freno en la respuesta reticulocitaria. La anemia megaloblstica del alcoholismo suele deberse al dficit de AF, de carcter multifactorial: aporte inadecuado en la dieta, bloqueo absortivo del mismo, disminucin del almacenamiento, prdidas urinarias excesivas, aumento del secuestro heptico, por interferencia en ciclo enteroheptico. En la infancia, anemia macroctica con
megaloblastosis, relacionada al metabolismo de los folatos, pueden deberse a causas congnitas. Una de ellas es el sndrome de Lesch-Nyhan, por deficiencia en la hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa, y se caracteriza por hiperuricemia, automutilacin, transtornos mentales y neurolgicos. La otra es la aciduria ortica congnita, muy rara, y se presenta con retardo en el crecimiento fsico y mental, anemia megaloblstica y trastorno inmune. No tiene respuesta al AF y la vit B12, pero si a la uridina, excepto el matiz inmunolgico. 7.2. Manifestaciones clnicas El cuadro clnico puede ser indistinguible del dficit de vit B12, respecto de las caractersticas y magnitud de la anemia. Las manifestaciones neurolgicas tambin pueden estar presentes, aunque su mecanismo fisiopatolgico se desconoce. Suelen responder al aporte de AF o cido folnico, pero no al de vit B12. 7.3. Diagnstico Los aspectos morfolgicos en sangre perifrica as como en la mdula sea, no difieren de las comentados para el dficit de vit B12. Desde el cese de la ingesta de AF a la aparicin de la anemia, se suceden una secuencia de eventos: en su inicio desciende el folato srico, comenzando a incrementar el tamao de los eritr oblastos, a continuacin emerge la hipersegmentacin de los neutrfilos, con aparicin de los metamielocitos gigantes, con su ncleo en herradura. A posteriori , se incr ementa la excrecin urinaria de formiminoglutamato (FIGLU). A partir del cuarto mes, desciende el folato intraeratrocitario. Le sigue en la secuencia la aparicin de los macroovalocitos, as como los francos cambios megaloblsticos en la mdula sea. Por ltimo, hacia el quinto y sexto mes, se pone de manifiesto la anemia. Los parmetros humorales -folato srico e intraeritrocitario- son de utilidad desde el punto de vista diagnstico (tabla 7-6).
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Tabla 7-5. Etiologa del dficit de cido flico Ingesta inadecuada (frecuente) Dietas sin vegetales y/o carnes muy cocidas, Etilismo crnico. Inadecuada absorcin Enfermedad celaca, Espru tropical, Esclerodermia Sndrome asa ciega, Otras patologas asociadas a malabsorcin Frmacos Difenilhidantoina, primidona, barbitricos. Cicloserina. Metformina. Colestiramina. Sulfazalasina. Etanol. Aporte excesivo de glicina o metionina. Otras (?): nitrofurantoina, glutetimida, anticonceptivos orales. Inadecuada utilizacin (bloqueo metablico) Inhibicin de la dihidroflico reductasa Metotrexato, Pirimetamina, Trimetoprima, Triamtirene, Pentamidina. Difenilhidantoina (bloqueo de la captacin y utilizacin celular) Deficiencias enzimticas Congenitas Formiminotransferasa, Dihidrofolato reductasa, MTHF transmetilasa Adquiridas: Hepatopatas, Formiminotransferasa Deficiencia de vit B12 Alcohol Dficit de cido ascrbico Excesiva incorporacin diettica de glicina y/o metionina Aumento de los requerimientos Parasitismo Por el feto (sobre todo multparas y embarazos mltiples), lactancia Por tejido neoplsico (Snd. linfoproliferativos) Infancia (etapa crecimiento), Incremento de la hematopoyesis (hemlisis, hemorragia), Cuadros hipermetablicos (hipertiroidismo, sndrome febril), Sndrome de Lesch-Nyhan Frmacos (L-dopa ?) Excrecin aumentada Dilisis, Dermatitis exfoliativa crnica, Dficit de vit B12, Hepatopata Incremento de la destruccin Drogas metabolismo de las purinas 6-Mercaptopurina. Tioguanina. Azatioprina. Allopurinol. Sndrome de Lesch-Nyhan (defecto enzimtico con interferencia en sntesis de nucletidos purnicos) Interferencia en sntesis de pirimidinas Antagonistas de pirimidinas: 5-Fluorouracilo. 6-Azauridina. Defectos enzimticos: Aciduria ortica congenita Inhibicin de ribonucletido reductasa Citosina arabinsido, Hidroxiurea, Procarbazina, Dficit de hierro. Inhibicin de la sntesis proteica: L-asparaginasa Mecanismos desconocidos Frmacos - txicos: Sulfasalazina, Benceno, Arsnico. Anemia megaloblstica sensible a la piridoxina (10 % de anemias sideroblsticas) Anemias megaloblsticas sensibles a la tiamina Anemias megaloblastoides Sndrome de Di Guglielmo (eritroleucemia), Mielodisplasias, Snd. mieloproliferativos crnicos
MTHF: Metilen tetrahidrofolato
Tabla 7-6. Parmetros humorales del metabolismo del cido flico Deficiencia posible Folato srico (ng/mL) Folato intraeritrocitario (ng/mL) 3-4 100 - 200 Deficiencia <3 < 100
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8. DIAGNSTICO DIFERENCIAL Debe realizarse con aquellas causas de macrocitosis, las cuales pueden cursar sin anemia, con grados variables de megaloblastosis ,y que suelen no responder al aporte de vit B12 y o AF. Son objeto de diagnstico diferencial, las siguientes entidades: anemias diseritropoyticas congnitas, los sndromes mielodisplsicos, la hipoplasia medular, las leucemias agudas, cuadr os hemolticos, hepatopatas, hipotiroidismo, drogas, entre otros. Los mismos sern analizados en los captulos respectivos. LECTURAS SUGERIDAS Bolander-Gouaille, C. The changing conception of vitamin B12 deficiency and diagnosis. Clinical Laboratory International 2003, 38-39. Carmel, R., Rasmussen, K., Jacobsen, D.W. et al. Comparison of the deoxyuridine suppression test with serum levels of methylmalonic acid and homocysteine in mild cobalamin deficiency. Br J Haematol 93 (29):311-8, 1996. Dickinson, C.J. Does folic acid harm people with vitamin B12 deficiency ?. QJM, 88 (5):357-64, 1995. Finch, C.A., Winkelstein, A., Harker, L.A. Manual de hematologa. Edit. El manual moderno. Mxico. 2da edicin, 1998, pp. 84-93. Fyfe, J.C., Madsen, M., Hojrup, P., Christensen, E.I., Tanner, S.M., de la Chapelle, A., He, Q., Moestrup, S.K. The functional cobalamin (vitamin B12)-intrinsic factor receptor is a novel complex of cubilin and amnionless. Blood; 103(5):1573-9, 2004.
Herbert, V., Vischer, T.J. The megaloblastic anemias: physiopathology and diagnosis. En: Plenary Lectures and Educational Program. XX Congress of the International Society of Hematology. Buenos Aires, 1984. Hof fbrand, V., Pr ovan, D. Macrocytic anaemias. BMJ, 314:431-34, 1997. Kozyrati, R., Kristiansen, M. The Human Intrinsic Factor-Vitamin B12 Receptor, Cubilin: Molecular characterization and chromosomal mapping of the gene to 10p within the autosomal recessive Megaloblastic Anemia (MGA1) region. Blood, 91(10):3593-3600, 1998. Martnez, P. Anemias por alteracin de la sntesis de ADN. Journal of Medicine, 18:26462654, 2001. Oosterhuis, W.P., Niessen, R.W., Bossuyt, P.M. et al. Diagnostic value of the mean corpuscular volume in the detection of vitamin B12 deficiency. Scan J Clin Lab Invest, 60 (1):9-18, 2000. Saavedra, S., Regadera, A.I., Jarque, I., Sanz, M.A. Anemia per niciosa. JANO EMC , 58(1338) pp.58-64, 2000. Toh Ban-Hock, M.B., van Dhiel, I.A., Gleeson, P.A. Per nicious Anemia. NEJM , 337 (20):1441-8, 1997. Wahlstedt-Froberg, V., Pettersson, T. Proteinuria in Cubilin-deficient whin selective vitamin B12 malabsorption. Pediatr Nephrol, 18(5):417421, 2003.
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HEMATOLOGA
Captulo
ANEMIAS HEMOLTICAS
Ivn Palomo G., Marcela Vsquez R., Leonor Armanet B., Guillermo Ruiz R., Victor Muoz F., Patricia Dal Borgo A. y Ricardo Hojas B.
Introduccin Sndrome hemoltico 1. Clasificacin de las anemias hemolticas 2. Mecanismos de destruccin de los hemates 2.1. Hemlisis extravascular 2.2. Hemlisis intravascular 3. Aspectos clnicos 3.1. Sndrome hemoltico agudo 3.2. Sndrome hemoltico crnico 4. Laboratorio Anemias hemolticas intracorpusculares 1. Membranopatas 1.1. Membranopatas hereditarias 1.1.1. Esferocitosis hereditaria 1.1.2. Eliptocitosis hereditaria 1.1.3. Piropoiquilocitosis hereditaria 1.1.4. Estomacitosis hereditaria 1.1.5. Xerocitosis hereditaria 1.2. Membranopata adquirida 1.2.1. Hemoglobinuria paroxstica nocturna 2. Enzimopatas 2.1. Dficit de enzimas de la gluclisis anaerobia 2.1.1. Dficit de Piruvatoquinasa 2.1.2. Dficit de la Glucosafosfato isomerasa (GPI) 2.1.3. Dficit de la Triosafosfato isomerasa (TPI) 2.1.4. Dficit de Hexoquinasa (HK) 2.1.5. Dficit de Fosfofructoquinasa (PFK) 2.1.6. Dficit de Fosfogliceratoquinasa (PGK) 2.2. Enzimopatas del metabolismo xidorreductor 2.2.1. Dficit de Glucosa 6 fosfato deshidrogensa 2.2.2. Dficit de Glutatin sintetasa (GS) 2.2.3. Dficit de Gamma-glutamilcisten sintetasa (GGS) 2.2.4. Dficit Glutatin reductasa (GR) 2.2.5. Dficit de Glutatin peroxidasa (GP) 2.3. Enzimopatas del metabolismo nucleotdico 3. Hemoglobinopatas 3.1. Talasemias 3.3.1. Talasemia 3.3.2. Talasemia 3.3.3. Talasemia 3.3.4. Talasemia 3.3.5. Sndromes hemoglobina Lepore 3.2. Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal 3.3. Hemoglobinopatas estructurales 3.3.1. Nomenclatura 3.3.2. Base gentica de las hemoglobinopatas estructurales 3.3.3. Clasificacin 3.3.4. Variantes de hemoglobina ms comunes Anemias hemolticas extracorpusculares 1. Anemias hemolticas inmunes 1.1. Antignicos eritrocitarios 1.2. Anemias hemolticas aloinmunes 1.2.1. Enfermedad hemoltica del recin nacido 1.2.2. Reaccin hemoltica transfusional 1.3. Anemias hemolticas autoinmunes 1.3.1. AHAI por anticuerpos calientes 1.3.2. AHAI por anticuerpos fros a) Enfermedad de las aglutininas fras b) Hemoglobinuria paroxstica a frigore 1.3.3. AHAI por mezcla de autoanticuerpos fros y calientes, o tipo mixto 1.3.4. AHAI inducida por frmacos 2. Anemias hemolticas no imnunes 2.1. Agentes infecciosos 2.1.1. Parasitosis 2.1.2. Infeccin bacteriana 2.2. Venenos 2.2.1. Veneno de araas 2.2.2. Veneno de serpientes 2.2.3. Veneno de abejas 2.3. Frmacos oxidantes 2.4. Agentes fsicos 2.4.1. Quemaduras 2.4.2. Radiaciones ionizantes 2.5. Productos qumicos 2.5.1. Arsnico 2.5.2. Cobre 2.5.3. Anhdrido trimetlico
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RESUMEN
Las anemias hemolticas se caracterizan por ser anemias regenerativas. Fisiopatolgicamente se clasifican en intra y extracorpusculares. En las primeras, la alteracin puede estar en la membrana, las enzimas o en las globinas. Las segundas, pueden estar mediadas por anticuerpos u otros mecanismos no inmunes. En este captulo se describen los hallazgos asociados de un sndrome hemoltico y las caractersticas fisiopatolgicas y de laboratorio de las principales anemias hemolticas.
INTRODUCCIN En condiciones fisiolgicas la masa de glbulos rojos circulante permanece constante gracias a mecanismos de control, los cuales estn finamente regulados para satisfacer los requerimientos corporales de oxgeno. La destruccin de los eritrocitos senescentes se pr oduce a nivel del Sistema Fagoctico Mononuclear (SFM) del bazo. Por su parte, la mdula sea est constantemente liberando eritrocitos para permitir el equilibrio. Las anemias hemolticas constituyen un grupo heterogneo de enfermedades hematolgicas cuyo denominador comn es la destruccin excesiva de los eritrocitos. La destruccin acelerada acorta la vida media de los glbulos rojos y obliga a la mdula sea a aumentar su produccin en un esfuerzo por mantener el nivel normal de hemoglobina circulante. Cuando esta produccin aumentada equilibra la destruccin acelerada, desaparece la anemia pero contina la hemlisis, establecindose una anemia hemoltica compensada. En otros casos, el aumento de la eritropoyesis no alcanza a compensar totalmente la destruccin excesiva y se desarrolla el cuadro clnico y de laboratorio comn a todos los estados hemolticos. Existen dos grupos de anemias hemolticas: (a) Las caracterizadas por la destruccin acelerada de los eritr ocitos debido a un defecto, generalmente congnito de las mismas clulas (anemias hemolticas intracorpusculares) y (b) las anemias hemolticas en que el eritrocito es normal pero lo destruyen prematuramente factores exter nos (anemias hemolticas extracorpusculares).
SNDROME HEMOLTICO El proceso de eritropoyesis demora 6 a 8 das. En ese lapso la clula eritroide se multiplica 5 a 6 veces dando origen, finalmente, a glbulos rojos capaces de servir a sus diferentes funciones por aproximadamente 120 das (ver captulo 3). Sin embargo varias causas, pueden provocar una destruccin prematura de los glbulos rojos (GR) y/o etapas ms inmaduras (reticulocitos, entroblastos); ante esta situacin la mdula sea (MO) responde aumentando el pr oceso eritropoytico. Todo esto conforma parte del sndrome hemoltico (SH). Cuando la destruccin de elementos eritroides afecta primordialmente a eritroblastos o reticulocitos, conlleva a una anemia casi segura, en cambio cuando son afectados los GR no siempre es as. Aunque la anemia es generalmente notoria en los procesos hemolticos agudos, no ocurre igual caso en los crnicos, ya que la anemia se manifiesta cuando se establece una descompensacin entre destruccin y regeneracin de eritrocitos. 1. CLASIFICACIN DE LAS ANEMIAS HEMOLTICAS Las anemias hemolticas se pueden clasificar en dos grupos: anemias hemolticas intracorpusculares, en las que la causa de la hemlisis radica en los eritrocitos, y generalmente son hereditarias y anemias hemolticas extracorpusculares en las que la causa del proceso hemoltico es ajena a los glbulos rojos y por tanto son adquiridas. En la tabla 8-1 se nombran las principales anemias hemolticas segn una clasificacin fisiopatolgica.
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Tabla 8-1. Clasificacin de las anemias hemolticas Causas intracorpusculares Defectos de membrana Hereditarias Esferocitosis hereditaria Eliptocitosis hereditaria Ovalocitosis hereditaria Piropoiquilocitosis Acantocitosis Adquiridas Hemoglobinuria paroxstica nocturna Defectos enzimticos Deficiencia de G6PD Dficit de piruvato kinasa Dficit de glutatin reductasa Defectos hemoglobnicos Talasemias Persistencia hereditaria de HbF Hemoglobinopatas estructurales Causas extracorpusculares Inmunes Anemias hemolticas aloinmunes Anemias hemolticas autoinmunes No inmunes Agentes infecciosos Venenos Frmacos oxidantes Agentes qumicos Agentes fsicos Mecnicas Hemoglobinuria de la marcha Coagulacin intravascular diseminada Fsicas Quemaduras extensas Radiaciones Congelacin de extremidades Infecciones Infecciones bacterianas Infecciones parasitarias 2. MECANISMOS DE DESTRUCCIN DE LOS HEMATES Normalmente la destruccin de los eritrocitos est relacionada con la edad celular. El envejecimiento eritrocitario se caracteriza por un deterioro de sistemas enzimticos, en especial los de la va glicoltica, y consecuencia se presenta disminucin de ATP y de los sistemas reductores por lo que el eritrocito pierde la capacidad para mantener su forma y la integridad de membrana. La destruccin normal de los GR ocurre en el sistema fagoctico mononuclear (SFM). La destruccin que acontece en los SH puede ocurrir en el SFM (hemlisis extravascular) y a nivel intravascular. A continuacin se describen ambos mecanismos. 2.1. Hemlisis extravascular La mayor parte (cerca del 90%) de la destruccin de los eritrocitos es extravascular, es decir, ocurre en macrfagos del bazo. Los eritrocitos envejecidos tienen membranas ms rgidas, se mueven lentamente y con dificultad a travs de pequeas aperturas de los cordones alineados de macrfagos del bazo; adems estos eritr ocitos tienen un aumento en la per meabilidad de cationes y las clulas
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disminuyen rpidamente el valor de ATP al intentar mantener el equilibrio osmtico a travs del bombeo de cationes en exceso. En el macrfago la molcula de hemoglobina es fragmentada en hierro, hem, y globina. Los elementos esenciales, hierro y globina, se conservan y reutilizan para la sntesis de nueva hemoglobina u otras protenas. El hierro hem puede ser almacenado como ferritina y hemosiderina en el macrfago, pero la mayor parte es liberado a la transferrina. Si se libera hacia la transferrina, el hierro es derivado a la mdula sea para reutilizarlo en la eritropoyesis. La fraccin globina de la molcula de hemoglobina es fragmentada y reciclada dentro del fondo comn de aminocidos. Posteriormente, el hem es catabolizado y excretado en las heces. El puente alfa metano del anillo de porfirina se une, producindose un mol de CO y de biliverdina. El CO es liberado a la sangre, y es transportado por los eritrocitos como carboxihemoglobina, hasta los pulmones donde se exhala. La biliverdina es luego reducida en el macrfago a bilirrubina, la cual es liberada desde el macrfago y se une a la albmina plasmtica para ser transportada al hgado, donde se conjuga a bilirrubinglucurnido (glucurnido de bilirrubina) por la enzima UDP-glucuronil transferasa que se encuentra en el retculo endoplsmico de los hepatocitos. La bilirrubina conjugada es polar e insoluble en lpidos, se excreta en la bilis y al llegar al tracto intestinal es convertido en urobilingeno por la flora bacteriana. La mayor parte del urobilingeno se excreta en heces, donde es oxidado a urobilina o estercobilina. Una pequea parte del urobilingeno se reabsorbe desde el intestino, ingresa a la circulacin portal y es excretado hacia el intestino por el hgado. Parte del urobilingeno reabsorbido se filtra por el rin y aparece en la orina (figura 8-1).
El bazo, respecto del hgado, es ms eficiente en la eliminacin de eritrocitos levemente lesionados debido a su patrn circulatorio en los cordones esplnicos. El flujo de sangre del hgado excede el del bazo; elimina eritrocitos marcadamente alterados. 2.2. Hemlisis intravascular Normalmente solo una pequea cantidad de hemoglobina (Hb) es liberada a la circulacin producto de la destruccin intravascular de eritrocitos. Dicha Hb se descompone en dmeros los que unen rpidamente a la haptoglobina (Hp) en una relacin 1:1. El complejo haptoglobina-hemoglobina de mayor tamao evita el filtrado de dmeros de la hemoglobina por el rin y es depurado rpidamente. En SH agudos la concentracin de la haptoglobina libre disminuye, debido a que el hgado no la puede sintetizar a niveles compensatorios. Por otro parte, la haptoglobina, una protena de fase aguda, suele encontrarse aumentada en procesos inflamatorios, infecciosos y neoplsicos. Cuando la haptoglobina se agota, como ocurre en hemlisis intensas, los dmeros libres logran filtrarse por el rin y son reabsorbidos por clulas del tbulo proximal. Cuando los dmeros que filtran en el rin exceden la capacidad de absorcin de las clulas tubulares, stos aparecern en la orina como hemoglobina libre, y segn el grado de hemlisis, la hemoglobina puede ser rosada, roja o de color negro parduzco. Los dmeros reabsorbidos en clulas del tbulo proximal son catabolizados a bilirrubina y hierro que luego ingresan al plasma. Sin embargo, algunos restos de hierro permanecen en las clulas tubulares y se unen en complejo a la ferritina y hemosiderina. Por ltimo, las clulas tubulares cargadas con hierro se descaman y se excretan en la orina. Las inclusiones de hierro suelen observarse con la tincin Azul de Prusia. Por tanto, la presencia de hierro en la orina (hemosideruria) es signo de reciente hemlisis intravascular aumentada. En casos de hemlisis intravascular crnica, los grnulos de hemosiderina pueden aparecer en la orina en ausencia de hemoglobinuria.
Figura 8-1. Esquema representativo de la hemlisis extravascular.
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En ausencia de haptoglobina, la hemoglobina no excretada por el rin, es depurada directamente por el consumo heptico o puede ser oxidada a metahemoglobina. El hem se disocia de la metahemoglobina y se une a la hemopexina, la cual es sintetizada en el hgado y se combina con el hem en una relacin 1:1. Este complejo se depura lentamente del plasma de (7-8 horas). Cuando la hemopexina se termina, el hem disociado oxidado se combina con la albmina plasmtica en una relacin 1:1, y se for ma entonces la metalbmina. La metalbmina se depura a nivel heptico muy lentamente y suele ser solo una for ma combinante transitoria del hem, hasta que estn disponibles ms hemopexina o haptoglobina. El hem quizs se transfiera de metalbumina a hemopexina por depuracin heptica y se encuentra por tanto, disponible. Cuando estn presentes en grandes cantidades los complejos de metalbmina y hemopexina-hem proporciona un tono caf al plasma (figura 82).
Figura 8-2. Esquema representativo de la hemlisis intravascular.
La hemlisis intravascular puede ser causada por: (a) activacin del complemento sobre la membrana eritrocitaria, (b) traumatismo fsico o mecnico el GR, y (c) presencia de sustancias txicas solubles en el medio ambiente eritrocitario. En la tabla 8-2 se reunen las alteraciones, pesquisables en el laboratorio, ms caractersticas de las SH extravasculares e intravasculares.
Tabla 8-2. Caractersticas de laboratorio de los sndromes hemolticos extravasculares e intravasculares Hemlisis extravascular Aumento de bilirrubina indirecta srica Aumento urobilingeno fecal y urinario Aumento Co2 expirado Hemlisis intravascular Hemoglobinemia Hemoglobinuria Hemosiderinuria Metahemoglobinemia Disminucin de haptoglobina Disminucin de hemopexina
3. ASPECTOS CLNICOS Las manifestaciones clnicas en la anemia hemoltica dependen de la intensidad de la anemia y de su forma de presentacin (aguda o crnica). Dado que ambos factores dependen en gran medida de la causa que origina la hemlisis, la expresividad clnica de la anemia hemoltica puede variar desde la ausencia de sintomatologa hasta una anemia con requerimiento transfusional.
3.1. Sndrome hemoltico agudo El SH agudo se presenta bruscamente en un sujeto previamente sano. Presenta manifestaciones clnicas tales como fiebre, ictericia o palidez intensa, fatiga muscular, palpitaciones y, eventualmente, emisin de orinas oscuras. El color oscuro de la orina obedece a la eliminacin del exceso de hemoglobina plasmtica libre (hemoglobinuria) producto de la hemlisis intravascular.
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Si la anemia es muy intensa se puede presentar pr dida del conocimiento, signos de insuficiencia renal y shock hipovolmico. Si se trata de un nio o paciente joven, el antecedente de ingesta medicamentosa es altamente indicativo de dficit de la G6PD o hemoglobinopata inestable, mientras que en un sujeto adulto, lo ms probable es que se trate de un trastorno adquirido. 3.2. Sndrome hemoltico crnico Debido a que el SH crnico es de instauracin lenta y progresiva y si la hemlisis no es intensa, suele dar tiempo a que se desarrollen los mecanismos de compensacin. Por ello la expresividad clnica es generalmente menos evidente que en SH agudo y puede variar desde la ausencia de sintomatologa a una anemia moderada o intensa. El examen fsico demuestra la existencia de palidez y/o ictericia con esplenomegalia palpable. La intensidad de la ictericia y su distribucin (piel y/o mucosas) varan ampliamente de un paciente a otro de forma que, en algn caso, queda limitada a la conjuntiva ocular. La ictericia hemoltica obedece al aumento de la bilirrubina no conjugada o libre (tambin llamada indirecta) por lo que nunca se acompaa de coluria (ictericia acolrica) y prurito, excepto cuando coexiste con una enfermedad hepatobiliar. Dado el carcter evolutivo de la anemia hemoltica crnica, su expresividad clnica es ms una consecuencia de ciertas complicaciones que del propio sndrome anmico. Estas complicaciones son ms importantes cuanto mayor es la intensidad de la anemia. Las complicaciones debidas a la hipoxia crnica son especialmente evidentes en casos de anemias muy intensas y consisten en retraso del desarrollo seo y crecimiento corporal, retraso del desarrollo gonadal (caracteres secundarios y menarquia) y eventualmente lceras. Este tipo de complicaciones suelen ir asociadas a los efectos secundarios que produce la excesiva eritropoyesis como deformaciones del esqueleto debidas a la expansin del tejido mieloide a expensas de la eritropoyesis, estas deformaciones son especialmente evidentes en el crneo y cara (fascies mongoloides, implantacin anmala de los dientes) que pueden evidenciarse radiolgicamente. La excesiva eritropoyesis puede, por un lado, facilitar la aparicin de hemocromatosis en
individuos genticamente predispuestos debido al exceso de la absorcin intestinal de hierro y, por otro, agotar las reservas de folato del organismo por hiper consumo (crisis megaloblstica). Tambin se pueden presentar manifestaciones debidas al hipercatabolismo hemoglobnico, como es la colelitiasis, la cual es un fenmeno relativamente frecuente y que no exige una intensidad del cuadro anmico; a veces el dolor abdominal que produce constituye la primera y nica manifestacin de la enfermedad. 4. LABORATORIO Los hallazgos de laboratorio en pacientes con anemia hemoltica reflejan el aumento de la destruccin de GR y de la eritropoyesis. El hemograma es de gran utilidad en el diagnstico inicial de las anemias hemolticas. El volumen corpuscular medio (VCM) suele ser normal, aun cuando es posible observar leve aumento (98-105 fL) debido a la presencia de reticulocitos. La concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM) en general tambin es normal, de tal forma que, en general, las anemias hemolticas son anemias normocticasnormocromas. A continuacin se describen los principales hallazgos de laboratorio que reflejan aumento de la eritropoyesis: Reticulocitosis. El aumento del ndice de produccin reticulocitaria (>3) es una caracterstica fundamental en la etapa inicial del diagnstico de los SH. En el frotis sanguneo teido con May GrumwaldGiemsa este aumento de reticulosis se expresa en policromatoflia. Leucocitosis. Eritroblastos en sangre perifrica. Hiperplasia eritroblstica en la mdula sea. Se caracteriza por aumento del nmero de precursores eritroides. Los hallazgos de laboratorio que reflejan aumento de la destruccin de los GR, son los siguientes: Anemia. Presencia de esferocitos, esquistocitos u otro tipo de poiquilocitosis. Prueba de la globulina antihumana positiva. Disminucin de la haptoglobina. Es un signo muy sensible de destruccin eritrocitaria perifrica, especialmente intravascular (ver
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punto 2.2.2.), pero no es especfica, ya que puede observarse tambin en anemia megaloblstica. Rango normal: 0.5-1.5 g/ L. Disminucin de hemopexina. Sigue un curso similar al de la Hp, pero tiene menos valor clnico, ya que es ms variable y su existencia es slo apreciable cuando la hemlisis intravascular es muy intensa. Hb glicosilada disminuida. La deter minacin de la Hb glucosilada (HbA1c) puede ser de utilidad en el estudio de la hemlisis. Frecuentemente disminuye (2-5%) en relacin con los valores normales. Ester cobilingeno y urobilingeno aumentados. Normalmente un adulto elimina 50-300 mg/24 horas de estercobilingeno por las heces; en anemias hemolticas generalmente supera los 400 mg/da. El aumento de eliminacin fecal de estercoblingeno se acompaa de cierto grado de urobilinuria, lo que confiere una coloracin oscura a la orina que puede sobreaadirse a la hemoglobinuria. Hiperbilirrubinemia no conjugada. Hemoglobinemia y metahemoglobinemia. Slo en casos de hemlisis intravascular. Hemosiderinuria y hemoglobinuria. Slo en pacientes con hemlisis intravascular. Aumento de LDH (Lctico Deshidrogenasa) srica. La LDH es liberada de los eritrocitos destruidos; su especificidad es baja ya que aumenta en otras situaciones como anemia megaloblstica, infarto al miocardio y miopatas. En los procesos hemlicos se observa un predominio de la isoenzima LDH-2 y en la anemia megaloblstica predomina la LDH-1. Aumento del CO2 espirado. ANEMIAS HEMOLTICAS INTRACORPUSCULARES
conducir a destruccin prematura de los eritrocitos se pueden agrupar en tres categoras: (a) Anemias hemolticas por defectos en la membrana del eritrocito (Membranopatas), (b) anemias hemolticas por defectos genticos de hemoglobina (Hemoglobinopatas), y (c) anemias hemolticas por defectos enzimticos del eritrocito (Enzimopatas). 1. MEMBRANOPATAS 1.1. Membranopatas hereditarias
La membrana de los GR es la responsable de las propiedades mecnicas y de la mayora de las funciones fisiolgicas de la clula. Est formada por una bicapa lipdica plana, donde predominan los fosfolpidos y el colesterol y en menor medida los glicolpidos y aminofosfolpidos, distribuidos asimtricamente. De igual forma, se encuentran distribuidas parcial o totalmente en ella, las protenas integrales de membrana, unidas por enlaces apolares. Su libre desplazamiento a travs de la bicapa lipdica contribuye a mantener la fluidez de la membrana. Las protenas perifricas interactan entre s para formar una malla o enrejado que recubre la cara interior de la doble capa de fosfolpidos y son las responsables de la estabilidad y las propiedades viscoelsticas de la membrana. Entre estas protenas destacan la espectrina (Sp), la ankirina (banda 2.1, 2.2, 2.3 y 2.6), la banda 4.1, la banda 4.2, la banda 4.9, la aducina, la tropomiosina y la banda 7. Otras protenas perifricas se disponen hacia la cara exterior de la bicapa lipdica y ellas son fundamentalmente antgenos de grupos sanguneos (ver captulo 3). La banda 3 representa el 25% del total de las protenas integrales. Est constituida por 2 dominios estructurales: el dominio citoplasmtico, encargado de la unin con las protenas del esqueleto, y la regin de transmembrana que mantiene el contacto con el medio extra e intracelular, proporcionando los canales responsables del transporte de iones bicarbonato (HCO3-) y cloruros (Cl-). Adems, posee un sitio de glicosilacin capaz de unir antgenos para el grupo sanguneo I/i e interviene activamente en la eliminacin de eritrocitos envejecidos. Las glicoforinas son un grupo de protenas integrales caracterizadas por su elevado contenido en cido silico. Las glicoforinas A, B, C y D son las ms importantes y constituyen
La integridad del eritrocito depende de la interaccin de tres unidades celulares, que lo capacitan para realizar su funcin primaria de transporte de oxgeno y CO2. Estas tres unidades celulares son la Hb, la membrana eritrocitaria, y los elementos solubles intracelulares (enzimas, coenzimas, y substratos del metabolismo de la glucosa). La alteracin de una de estas unidades celulares da lugar a alteraciones en las otras dos, dando como resultado un acortamiento de la vida media eritrocitaria (hemlisis) Los defectos intracorpusculares que pueden
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los sustratos antignicos de los diferentes grupos sanguneos. La glicoforina C contribuye a la estabilidad de la membrana gracias a su interaccin con protenas perifricas, adems de participar en el inter cambio inico transmembranoso. La Sp es la protena ms abundante y adems la principal responsable del mantenimiento del enrejado proteico. Est compuesta por 2 subunidades y enrolladas de for ma antiparalela, las que se unen por sus extremos para formar tetrmeros. Estas 2 subunidades estn constituidas por secuencias repetitivas de 106 aminocidos, las que se enlazan para formar una triple hlice. La ankirina (Ank) est compuesta por 3 subunidades estructurales correspondientes a 3 dominios funcionalmente diferentes: regulador, de unin a la membrana y de unin a la Sp. Su contribucin a la integridad de la membrana es decisiva, ya que constituye un importante punto de anclaje a la bicapa lipdica a travs de la banda 3.1. La actina es una protena organizada en forma de protofilamentos helicoidales estabilizados por la interaccin con la Sp, la protena 4.1 y la tropomiosina. La protena 4.1, forma parte del citoesqueleto y su funcin fundamental es estabilizar la unin espectrina-actina, y contribuir a fijar el esqueleto a la bicapa lipdica. El mantenimiento de la forma y estabilidad de la membrana es tambin responsabilidad de otras protenas. Entre ellas est la protena 4.2, que acta como modulador para estabilizar la interaccin ankirina-banda 3. La banda 4.9, la aducina y la tr opomiosina, pr otegen la estabilidad de la actina. Los estudios moleculares han permitido conocer la localizacin cromosmica de estas protenas, as como la secuencia nucleotdica de cada uno de los genes. Las alteraciones en las interacciones entre las protenas del citoesqueleto y lpidos de la membrana se dividen en 2 categoras, verticales y horizontales: Interacciones verticales. Estas interacciones son perpendiculares al plano de la membrana de los eritrocitos y comprenden las que ocurren entre el citoesqueleto y las protenas integrales,
y los lpidos de la membrana. Los defectos en estas interacciones conducen al desacoplamiento entre la doble capa lipdica y el citoesqueleto, lo que da lugar a la prdida de porciones de la membrana. Todo esto trae como consecuencia la formacin de esferocitos y la hemlisis. Los defectos verticales pueden producirse por una deficiencia primaria de espectrina o tambin por alteraciones de la protena 4.2, Ank (banda 2,1), banda 3 o por la existencia de una espectrina anormal la cual se enlaza pobremente con la protena 4,1. Interacciones horizontales. Son paralelas al plano e importantes en la formacin del citoesqueleto que soporta la tensin de la membrana dndole su estabilidad mecnica. Los defectos en la interacciones horizontales pueden ser causados por defectos o deficiencia de actina, protena 4,1, y aducina; esto lleva a una rotura del citoesqueleto con la consecuente desestabilizacin de la membrana que da lugar a la fragmentacin celular con formacin de poiquilocitos. Defectos en algunas de estas protenas pueden dar lugar a trastornos clnicos en los cuales est involucrada la estabilidad de los GR. Se incluyen distintos tipos de membranopatas: esferocitosis, eliptocitosis y piropoiquilocitosis, estomacitosis, xerocitosis hereditarias. En la hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN), la membrana del eritrocito es demasiado sensible al complemento, pero este defecto es una anormalidad adquirida, no hereditaria. 1.1.1. Esferocitosis hereditaria La Esferocitosis hereditaria (EH) es una anemia hemoltica intracorpuscular en la que los GR son destruidos extravascularmente, de preferencia en el bazo. Se caracteriza por la presencia de esferocitos debido a un defecto molecular que afecta a una de las protenas del citoesqueleto de la membrana eritrocitaria. Suele presentar una herencia autosmica dominante, aunque en algunas ocasiones puede ser autosmico recesivo; se han descrito casos con mutaciones de novo. Presenta una incidencia de 1:1000 a 1:4500 individuos, siendo ms frecuente en la raza blanca. A veces, el sndrome hemoltico se manifiesta en la primera infancia, pero hay casos en que el diagnstico se realiza en edad adulta. Fisiopatologa La sobrevida de los GR en la circulacin depende de su capacidad de mantener una superficie lisa,
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forma bicncava y relacin volumen/superficie tal que permita la deformacin extrema a la que se ve expuesto en la circulacin. En el bazo es donde esta pr opiedad cobra su mayor expresin, all la ms leve disminucin de la plasticidad de la membrana les impide sortear los estrechos sinusoides, situacin en la que los macrfagos esplnicos los fagocitan. La EH se caracteriza por presentar diversidad clnica, la que se explica por: (a) el tipo de mutacin, puesto que existen alelos sin sentido (generan un codn de trmino), alelos con sentido equivocado (codones equivocados), alelos con alteracin del marco de lectura (generados por insercin o delecin de bases), que conducen a diferentes fenotipos aunque se trate del mismo locus; (b) el efecto de dosis de mutacin, ya que el cuadro clnico de un heterocigoto simple es menos severo que el de un homocigoto, de un heterocigoto compuesto que presenta dos mutaciones diferentes ubicadas en locus diferentes y de un doble heterocigoto con dos mutaciones diferentes en el mismo locus; (c) la localizacin de la mutacin en la protena, podran compr ometer o no su estructura, conformacional y eventualmente su funcin, y (d) el fondo gentico de cada individuo (participacin de otros genes). La alteracin molecular de la EH afecta a las protenas del citoesqueleto; alrededor del 30% presenta alteraciones de la Sp, 30-45% de los pacientes presenta defectos tanto en la Sp como en la Ank, protena esta ltima, que forma un puente entre la protena banda 3 y la Sp. Aproximadamente un 20% de los pacientes presenta una mutacin en el gen que codifica para la banda 3. Porcentajes menores afectan a la banda 3 y la protena 4.2 (2-4%) y solo a protena 4.2 (0,8%). El dficit de beta Sp suele ser leve y de herencia dominante, mientras que el dficit de alfa Sp es grave y de herencia recesiva. Cuando estas pr otenas estn alteradas, la bicapa lipdica no est suficientemente estable y parte de ella desaparece por vesiculacin, dando lugar a una clula ms redonda (esferocito) y menos deformable. Debido a su forma y su rigidez, los esferocitos no pueden atravesar los intersticios esplnicos, especialmente los que limitan con los senos venosos del bazo, y quedan expuestos a un ambiente donde no pueden mantener su elevado metabolismo basal, lo que provoca nuevas prdidas de la membrana celular. Un defecto aparentemente secundario de la
membrana de los GR, pero de importancia patognica, es su excesiva permeabilidad al Na+. La membrana del eritrocito normal es libremente permeable al agua y los aniones (Cl, HCO3-, etc.). Los cationes (Na+, K+, Ca++) la atraviesan muy lentamente. Para regular su volumen y mantener el equilibrio inico, la membrana utiliza un sistema de transporte activo, es decir, dependiente de energa. El Na+ entra pasivamente a los GR por una gradiente electroqumica y sale de ellos por accin de la enzima Na-K-ATPasa, la cual est asociada a la membrana. Debido a que los GR de pacientes con EH presentan permeabilidad aumentada al Na+, la Na-K-ATPasa debe eliminar el exceso de Na+ lo que implica un mayor gasto de energa. Clnica y laboratorio Los pacientes portadores de EH presentan anemia, esplenomegalia e ictericia (por hiperbilirrubinemia indirecta). Es frecuente la litiasis por clculos biliares. En los huesos largos se observa hiperplasia eritroide compensadora de la mdula sea acompaada de expansin de la mdula hacia el centro de la difisis y, en ocasiones, de eritropoyesis extramedular. Como la capacidad de la mdula sea para aumentar la eritropoyesis es de seis a ocho veces lo nor mal y esto supera habitualmente la intensidad de la hemlisis, la anemia suele ser leve o moderada y puede incluso no observarse. La compensacin puede quedar interrumpida por episodios de hipoplasia eritroide desencadenados por las infecciones principalmente virales (parvovirus). La intensidad de la hemlisis puede aumentar transitoriamente en infecciones que inducen mayor esplenonomegalia. La alteracin eritrocitaria caracterstica es la presencia de esferocitos. El volumen corpuscular medio (VCM) suele ser normal o algo bajo, y la concentracin de Hb corpuscular media (CHCM) puede aumentar hasta 30%. En la prctica clnica el examen de laboratorio ms utilizado es la fragilidad osmtica, aun cuando existen otros procedimientos, algunos de ellos solo son usados en investigacin. Prueba de fragilidad osmtica. Mide la resistencia de los eritrocitos a la hemlisis frente a condiciones de tensin osmtica. Esta resistencia depende de la relacin superficie/ volumen de los GR y de la funcin de la membrana. Los eritrocitos se incuban en
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soluciones de concentraciones decrecientes de cloruro de sodio desde isotonicidad hasta marcada hipotonicidad. Los eritrocitos captan agua en un esfuerzo por lograr el equilibrio osmtico, de esta forma la clula se hincha hasta adquirir forma esfrica. La captacin adicional de agua crea una membrana porosa que finalmente estalla, liberando la Hb (hemlisis). Un pequeo porcentaje de GR normales se
hemolisan a 0,5% de NaCl y el 100% de los mismos lo hace a 0,3%. Debido a la menor relacin superficie/volumen, los esferocitos no pueden incorporar tanta agua como los eritrocitos normales por lo que se hemolisan a concentraciones ms cercanas a la isotonicidad (figura 8-3). La prueba es ms sensible si la sangre se incuba toda la noche a 37C antes de realizar el ensayo.
Figura 8-3. Representacin grfica de la fragilidad osmtica de eritrocitos normales y pacientes con esferocitosis hereditaria. La regin achurada corresponde al rango de hemsilis de individuos normales (N) y la zona blanca representa la hemlisis en los pacientes con Esferocitosis Hereditaria (EH).
Prueba de la autohemlisis. La prueba de autohemlisis mide el porcentaje de hemlisis espontnea que ocurre despus de incubar los eritrocitos durante 48 horas a 37C, en condiciones estriles. El porcentaje de hemlisis es del 10-50% y <4% en pacientes portadores de EH y normales, respectivamente. La adicin de glucosa a la muestra disminuye la autohemlisis. Prueba de criohemlisis. Est basada en observaciones que demuestran que los eritrocitos de las personas con EH suspendidos en soluciones hipertnicas, son ms susceptibles a los cambios de temperatura que los eritrocitos de los sujetos nor males. Con este procedimiento es posible identificar todos los casos de EH, incluyendo a los portadores asintomticos de la enfermedad. La capacidad de la prueba para identificar los casos menos graves, posiblemente repr esenta la dependencia de la criohemlisis a factores que estn ms relacionados con los defectos
moleculares primarios de la membrana y menos a la relacin del rea de superficie y el volumen de los eritrocitos. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). En el estudio de la EH la PAGE per mite determinar la presencia o ausencia de protenas de membrana de GR, situacin que podra certificarse con immunobloting o inmunoprecipitacin. Biologa molecular. Tcnicas como PCR alelo especfico, Southern blot, secuenciacin de DNA y otras, permiten estudiar mutaciones puntuales o deleciones, segn corresponda. En el diagnstico diferencial, dado que la anemia hemoltica inmune generalmente presenta algn grado de esferocitosis, se debe incluir la prueba de antiglobulina humana (prueba de Coombs) directa e indirecta.
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Tratamiento Las variedades leves de EH no requieren tratamiento. La esplenectoma es el tratamiento estndar en los pacientes con hemlisis sintomtica; con esto se corrige la anemia y la hemlisis, per o el defecto bsico en la membrana per manece por lo que se encontrarn esferocitos en la sangre perifrica. Existen pacientes que no responden a la esplenectoma, esto puede deberse a la presencia de bazo accesorio, desarrollo de esplenosis u otra causa de anemia hemoltica concomitante. Los pacientes deben recibir profilcticamente 1 mg/da de cido flico para evitar carencia de esta vitamina, situacin que se debe evitar en las anemias hemolticas crnicas. 1.1.2. Eliptocitosis hereditaria La Eliptocitosis hereditaria es un trastorno que se her eda como un rasgo autosmico dominante y que afecta a 1 de 4000 5000 habitantes. Fisiopatologa Se han descrito muchas mutaciones en los genes de - y -Sp, protena 4.1, banda 3, glicoforina C y otras protenas. Estas incluyen mutaciones puntuales, deleciones e inserciones. Las ms comunes son en Sp, principalmente en el sector de asociacin de las cadenas y . Cada uno de estos defectos puede conducir a cambios esquelticos que pueden hacer que la clula cambie a la forma elptica y/o se fragmente bajo las exigencias de la circulacin, dependiendo de la magnitud del defecto. Clnica y laboratorio La mayora de las personas que sufren de esta patologa no muestran signos de hemlisis. Los homocigotos para la alteracin presentan hemlisis ms intensa. La mayora de los pacientes slo presenta una hemlisis leve (Hb > de 12 mg/dL), menos del 4% de reticulocitos, niveles bajos de haptoglobina y supervivencia de los hemates justo por debajo de los lmites normales. En el 10 a 15% de pacientes la hemlisis es considerablemente mayor, la supervivencia media de los GR es tan breve como 5 das y los
reticulocitos se elevan hasta el 20%. Los niveles de Hb rara vez descienden por debajo de 9 a 10 mg/dL. Los GR se destruyen preferentemente en el bazo, lo que se expresa clnicamente en esplenomegalia. La presencia de eliptocitos es el hallazgo ms caracterstico y consistente del laboratorio con o sin anemia. Tratamiento La esplenectoma corrige la hemlisis, pero al igual que en la EH solo evita la hemlisis y protege al paciente de las complicaciones de la hemlisis crnica. 1.1.3. Piropoiquilocitosis hereditaria La Pir opoiquilocitosis hereditaria (PPH) corresponde a un trastorno recesivo autosmico poco frecuente; ocurre de preferencia en individuos de raza negra. La enfermedad se presenta en la lactancia o en la primera infancia como una anemia hemoltica grave con microcitosis y poiquilocitosis marcada. Los GR se destruyen a 44 45C, mientras que los hemates normales resisten hasta 49C. La alteracin se debe a un dficit de Sp y a un defecto en el autoensamblaje de la misma. Existe una cierta asociacin entre PPH y Eliptocitosis hereditaria. La esplenectoma, no suprime la hemlisis, aunque s la disminuye en forma importante. 1.1.4. Estomacitosis hereditaria La Estomatocitosis hereditaria es una anemia hemoltica autosmica dominante muy poco frecuente. Se caracteriza porque la membrana eritrocitaria tiene una permeabilidad anormal para sodio y potasio; hay aumento en la concentracin intracelular de cationes, el agua entra a los GR lo que le da la forma de estomatocitos; stos se caracterizan por presentar un rea central plida, estomtica como rendija. La CHCM puede estar disminuida y la VCM puede presentarse aumentada. Los GR presentan menos deformabilidad que los eritrocitos normales y, por ello los secuestra el bazo, donde el suministro de glucosa se agota con facilidad. La anemia es, por lo general, leve a moderada.
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La bilirrubina aumenta y la reticulocitosis es moderada. El frotis sanguneo de estos pacientes presenta el 10 a 50% de estomatocitos. La esplenectoma es de respuesta variable; en algunos casos la hemlisis desaparece, en cambio en otros slo se observa una mejora parcial en la supervivencia de los GR. 1.1.5. Xerocitosis hereditaria En la Xerocitosis hereditaria se observa un trastorno de permeabilidad, con una prdida neta de potasio intracelular que excede a la entrada pasiva de sodio y su ganancia neta. En consecuencia, la clula se deshidrata, y la CHCM aumenta. Los GR tienen aspecto de glbulos blancos. Se desconoce su fisiopatologa. 1.2. Membranopata adquirida 1.2.1. Hemoglobinuria paroxstica nocturna La Hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN) es un trastorno adquirido y poco comn de la membrana de los eritrocitos, que se caracteriza por su sensibilidad anormal al complemento. El estado se exacerba durante el sueo, aunque muchos pacientes presentan hemlisis crnica que no se relacionan con el sueo ni con hemoglobinuria evidente. Fisiopatologa Los GR de pacientes portadores de las HPN al ser transfundida a individuos nor males presentan sobrevida acortada. Por otra parte, los GR normales tienen supervivencia normal en los pacientes con HPN. Un clon anormal de clulas precursoras produce eritrocitos, plaquetas y neutrfilos que son muy sensibles a la lisis por el sistema del complemento. Se sabe que el defecto radica en una mutacin en el gen PIG-A del cromosoma X; ste codifica una protena que participa al inicio de la sntesis del glicosil fosfatidil inositol (GPI), molcula gracias a la cual diversas protenas se unen a la membrana celular. El GPI, un glicolpido de anclaje, consiste en una molcula de fosfatidil inositol a la cual se une un glicano (N-glucosamina), tres manosas y etanolamina. Al carboxilo final de la etanolamina se unen las protenas (figura 8-4).
Figura 8-4. Estructura del Glicosil Fosfatidil Inositol (GPI).
a) Sntesis del GPI. El GPI es sintetizado en el retculo endotelial. Brevemente, la molcula UDP-N-acetilglucosamina aporta Nacetilglucosamina (NAG), que es transferida al fosfatidil inositol en la superficie externa del retculo endoplsmico. Luego la NAG es deacetilada y se agrega un cido graso al inositol. Posteriormente esta molcula es translocada a la cister na del retculo endoplsmico. La GDP-manosa, acta como un dador de manosa; la primera manosa es agregada al dolicol fosfato formando dolicol fosforil manosa (DPM), por la accin de la enzima DPM sintetasa. El DPM tambin es translocado y puede entregar manosas a la molcula anterior. El paso final es el anclaje de la fosfoetanolamina (PEA) a la tercera manosa. Las molculas PEA se pueden unir a las otras dos manosas, pero ellas no participan en la unin a la protena. La protena es sintetizada al interior de la cisterna del retculo endoplsmico y una transaminasa la une a una etanolamina terminal. Una vez que la protena est anclada al GPI es transferida al aparato de Golgi y luego es transportada a la membrana. b) Defecto molecular en la HPN En la HPN la molcula GPI no es sintetizada, o lo es en muy pequeas cantidades. El defecto ocurre en la adicin de la NAG a la molcula de fosfatidil inositol. El gen defectuoso en la HPN se denomina Pig A, se localiza en el brazo corto (p) del cromosoma X (Xp 22,1) y posee 6 exones. El primer exn es muy corto y no es traducido, el segundo codifica la mitad de la protena madura y los exones 3-6 codifican el resto de la protena
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madura. El gen codifica para una protena de 24 kDa y 84 aminocidos. El tipo de mutaciones incluyen: deleciones (75%) y mutaciones puntuales (25%). Se han descrito varios tipos de mutaciones en el gen que codifica para la protena Pig A. Los eventos mutagnicos aparentemente tienen lugar en la stem cell. Los primeros precursores identificables son CD34+, CD38- y en ellos se ha observado carencia de precursores de GPI. Debido a lo anterior es que ciertas protenas no se expresen en la membrana celular de los pacientes con HPN: acetilcolinesterasa, CD55 (DAF), CD59 (MIRL), FcRIIIb (CD16b), C8, CD58, CD14, CD73, CD87, CDw52, CD66c, P50-80, CD24, CD48, CD67 y receptor de folato. El dficit de algunas de estas protenas desencadenan los episodios de hemlisis intravascular que caracterizan esta enfermedad. El CD55 (DAF: Factor acelerador del decaimiento de convertasas), interviene en el control de la activacin del sistema del complemento. Las deficiencias ms graves se relacionan con la incapacidad de inactivar al Complejo de ataque a membrana (CAM) sobre los eritrocitos. La unin de C8 a la membrana y el paso siguiente,
la polimerizacin de C9, son eventos que normalmente se encuentran restringidos por el factor de restriccin homlogo (HRF) y por CD59 (MIRL: Inhibidor de la lisis reactiva de membrana) que se une a C8 e impide la formacin del CAM. El HRF interfiere con la unin de C9 a C8. CD59 es una protena de transmembrana que slo presenta un punto de unin extramembranal entre C9 y el complejo C5b-C8, pero bloquea el segundo punto de unin entre C9 y la porcin transmembranal de C5b-C8; de este modo inhibe la reaccin cataltica de C5bC8 sobre C9, impidiendo la formacin del polmero de C9 y su insercin en la membrana. En la HPN, la deficiencia de las protenas CD55, CD59 y/o HRF, inhibidores naturales de la activacin del sistema del complemento sobre la membrana celular, deter mina una susceptibilidad anormalmente aumentada de los eritrocitos a la lisis por el complemento. Pruebas in vitro que cuantifican la sensibilidad de los eritrocitos a la lisis mediada por el complemento permiten identificar tres fenotipos (tabla 8-3).
Tabla 8-3. Fenotipos de Hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN) Designacin fenotpica HPN I HPN II Sensibilidad al complemento Normal Moderada sensibilidad (3 a 4 veces ms sensible de lo normal) Marcada (15 a 20 veces ms sensible de lo normal) Expresin de GPI Normal Positivo Tipo de mutacin Ninguna Parcial
HPN III
Negativo
Completa
En el 78% de los pacientes existe una mezcla de clulas HPN I y HPN III, alrededor del 9% de los casos presentan clulas HPN I y HPN II, 9% presentan los tres fenotipos y 3% de los pacientes presentan clulas HPN II y III, y en casos raros slo hay presencia de una poblacin celular HPN II. Clnica y laboratorio Hemoglobinuria. Un 25% de los pacientes presentan hemoglobinuria debido a la hemlisis
durante el sueo. La orina en los pacientes con HPN durante la maana es oscura y durante el da es clara. La causa de la exacerbacin nocturna es poco conocida, pero se postula que sera una pequea disminucin del pH plasmtico, secundaria a la retencin de CO2 producto de la hipoventilacin noctur na (acidocis respiratoria). Hipoplasia medular. La falla gentica en las clulas troncales, puede explicar que algunos pacientes portadores de HPN desarrollen
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anemia aplsica. Trombosis. Pacientes con HPN poseen predisposicin a trombosis, especialmente venosa. La trombosis explican alrededor del 50% de las muertes en estos pacientes. Trombosis fatal ocurre usualmente en el sistema portal y el cerebro; son comunes en extremidades y otros sitios. Adicionalmente, la Coagulacin Intravascular Diseminada (CID) puede ser gatillada por la activacin del complemento en plaquetas que presenta la alteracin propia de la HPN; las plaquetas se activan y se producen agregados plaquetarios. Alteracioneses renales. En pacientes con HPN puede ocurrir insuficiencia renal, tanto aguda como crnica. El dao renal se expresa en disminucin del clearence de creatinina. Adems en estos pacientes se puede observar hematuria, proteinuria, hipertensin y/o una incapacidad de concentrar la orina. Las alteraciones renales podran explicarse por repetidos episodios de trombosis que afectan a pequeas vnulas y a la hemoglobinuria que caracteriza a la enfermedad. Infecciones. El mayor ndice de infecciones se explica por la leucopenia o defecto en la funcin de los leucocitos. Leves infecciones podran exacerbar el proceso hemoltico conducir a crisis de aplasia. Laboratorio. El diagnstico de la HPN tradicionalmente se basaba en pruebas de laboratorio que investigaban la sensibilidad exagerada de los eritrocitos a la accin del complemento hemoltico; entre estas pruebas se encuentran las de hemlisis cida o prueba de Ham, las de hemlisis por inulina y sacarosa, as como la investigacin de hemosiderinuria (ver captulo 29). Gracias al advenimiento de la citometra de flujo, ahora es posible investigar la expresin de algunas protenas ancladas a las clulas a travs de GPI. Las dos protenas ms frecuentemente investigadas en HPN por el trastorno en GPI son las molculas CD55 y CD59 y su sub-expresin puede demostrarse en fracciones muy pequeas de clulas deficientes, como suele ocurrir despus de una crisis hemoltica (figura 8-5). En estas condiciones, en que las clulas deficientes son escasas, las pruebas tradicionales proporcionan resultados falsos negativos. La experiencia obtenida investigando estas molculas ancladas por GPI ha demostrado ser ms sensible que las pruebas tradicionales para investigar a la HPN.
Figura 8-5. Expresin del antgeno CD55 en los leucocitos de un paciente con hemoglobinuria paroxstica noctura (HPN). El panel de la izquierda corresponde a un individuo normal: el eje horizontal corresponde a la complejidad interna de las clulas (side scatter) y el vertical a la intensidad de expresin del antgeno CD55. Se discriminan claramente las poblaciones de linfocitos (L), monocitos (M), granulocitos (G) y plaquetas (P). En el panel de la derecha, que corresponde a un paciente con HPN, se observan proporciones pequeas de monocitos y granulocitos en los que la expresin del antgeno CD55 est francamente disminuida (flechas). Histogramas proporcionados gentilmente por el Dr. Alejandro Ruiz-Argelles, Director Mdico de Laboratorios Clnicos de Puebla y del Depto. de Inmunologia del mismo.
Tratamiento Como tratamiento sintomtico de la anemia al paciente se le indica tratamiento con sales de hierro debido a la prdida de este elemento (hemoglobinuria) y si se requiere se le indican transfusiones. En los pacientes que presentan trombosis venosa se utilizan anticoagulantes orales. En caso de infecciones se indican antibiticos. El trasplante de mdula sea es el nico tratamiento curativo. 2. ENZIMOPATAS Las anemias hereditarias resultantes de alteraciones del metabolismo de los glbulos rojos se diferencian de las anemias hemolticas por alteraciones de la membrana por la ausencia de esferocitos, una fragilidad osmtica normal y ser de herencia recesiva. La estructura y sntesis de hemoglobina es normal y por no tener ninguna anormalidad morfolgica se las conoce como anemias hemolticas congnitas no esferocticas (AHCNE). El diagnstico se hace descartando las otras causas de anemias hemolticas, como hemoglobinopatas o esferocitosis, para luego continuar con las pruebas para desrdenes enzimticos. El diagnstico definitivo se hace con la cuantificacin de la enzima o la identificacin de la mutacin especfica al hacer el anlisis del DNA. Considerando las vas metablicas de los GR las eritroenzimopatas se clasifican en tres grupos:
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(a) de la gluclisis anaerobia o va de EmbdenMeyerhof, (b) del metabolismo xidorreductor y (c) del metabolismo nucleotdico, siendo las alteraciones enzimticas ms frecuentes: Piruvato quinosa (PK), glucosa 6-Fosfato deshidr ogenasa (G6PD) y Pirinridina-5 nucleotidasa (P 5N), respectivamente. 2.1. Dficit de enzimas de la gluclisis anaerobia 2.1.1. Dficit de piruvatoquinasa Las enzimopatas del metabolismo glucoltico alteran la capacidad energtica del eritrocito, dificultando la formacin o utilizacin del ATP. Cuando disminuye la capacidad energtica del eritrocito ste envejece prematuramente y es eliminado de la circulacin sangunea por el sistema fagoctico mononuclear (SFM). En general, la hemlisis acompaa a aquellas enzimopatas que ocupan una posicin relevante o clave en la va metablica, por ejemplo, la Hexoquinasa (HK), Fosfofructoquinasa (PFK) y Piruvatoquinasa (PK) o las que intervienen en determinadas etapas esenciales como Glucosafosfato isomerasa (GPI), Triosafosfato isomerasa (TPI), y Fosfogliceratoquinasa (PGK), principalmente. A excepcin del dficit hereditario de PFK y TPI que se acompaan de importantes trastornos musculares y neurolgicos, respectivamente, las restantes enzimopatas de la gluclisis anaerobia slo presentan una anemia hemoltica crnica
de intensidad variable. La enzimopata ms frecuente de esta va es el dficit de PK. La PK es la enzima que cataliza una de las etapas ms importantes de la gluclisis transformando el fosofenolpiruvato (PEP) a piruvato, proceso en que se produce una molcula de ATP. La PK es un tetrmero (230 kDa) y es codificada por dos genes distintos, PK-LR y PK-M. El gen PK-LR codifica dos enzimas: PK-R (eritrocitos) y PK-L (hgado). La sntesis de las enzimas eritrocitarias (PK-R) y heptica (PK-L) est regulada por un mecanismo de escisin y empalme (splicing) alternativo a partir del gen PK-LR localizado en el cromosoma 1 y por el cual, el mRNA de la enzima PK-R difiere del de la enzima PK-L en la lectura de los exones 1 y 2, respectivamente. El dficit congnito de PK se transmite con carcter autosmico recesivo y se han descrito alrededor de 400 casos a nivel mundial, la mayora del norte de Europa. La clonacin del gen PK ha permitido a travs del ADNc, la secuenciacin de este gen y el hallazgo de unas 130 mutaciones distintas debido a sustituciones, deleciones o adiciones. Aproximadamente el 70% de estas mutaciones afectan estructural y funcionalmente a importantes dominios de la PK. Las 6 mutaciones que se indican en la tabla 8-4 se encuentran cerca del sitio de unin con el sustrato (1 y 3) o afectan su configuracin.
Tabla 8-4. Mutaciones de la Piruvatoquinasa Nucletido genmico 1 2 3 4 5 6 2757 3660 3719 3894 6360 6377 Exn 4 6 6 7 10 10 Sustitucin base G C G G G C T T A A T T Sustitucin aminocido Gly 159 Val Ala 295 Val Glu 315 Lys Gly 341 Asp Arg 504 Leu Arg 510 Ter
A medida a que un glbulo rojo deficiente de P-K envejece hay una progresiva reduccin de la gliclisis que va en paralelo a la gradual degradacin de la enzima lo que lleva a una deplecin de ATP y a hemlisis. Se observa un acmulo de productos glicolticos intermedios proximales al dficit enzimtico en la mayora de los casos como es el 2,3 difosfoglicerato o
el 3 fosfoglicerato lo que ayuda a confirmar el diagnstico. La herencia es de transmisin autosmica recesiva y la enfermedad la presentan los homocigotos y los heterocigotos compuestos. Los heterocigotos simples no tienen el cuadro clnico a pesar de tener el 50% de reduccin de
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actividad enzimtica. Laboratorio Hematologa. Hemoglobina entre 6 a 12 g/dl, reticulocitosis, moderada macrocitosis (VCM: 98-105 fl), disminucin de la vida media eritr ocitaria, equinocitosis ausencia de esferocitos circulantes y fragilidad osmtica normal. Bioqumica. Moderada bilirrubinemia conjugada aumento de 2,3 DPG y PEP, y disminucin de haptoglobinemia, ATP, lactato y piruvato. Para el diagnstico definitivo existen tcnicas como: ensayo enzimtico cuantitativo que es la medida de la actividad enzimtica en el hemolizado en UI por gramo de hemoglobina (rango normal: 11.1-18.9 UI/gHb), prueba de fluorescencia y autohemlisis. Finalmente la determinacin de las distintas mutaciones de PK-R se realiza a travs de tcnicas moleculares. Clnica Los pacientes con dficit de PK tienen anemia, ictericia y esplenomegalia frecuentemente. La anemia puede ser severa y desde el nacimiento, necesitando transfusiones mensuales; un hecho llamativo es que los reticulocitos no siempre estn elevados. Los recin nacidos tienen casi siempre hiperbilirrubinemia de predominio indirecto y pueden requerir exsanguneo transfusin al nacer. Esta hiperbilirrubinemia persiste durante los prximos aos lo que produce los consiguientes clculos biliares. Tratamiento Las crisis hemolticas son poco frecuentes y no se asocian al uso de drogas, ms bien aparecen con cuadros febriles importantes. Los pacientes con anemia severa dependientes de transfusiones se deben esplenectomizar y despus de ella ocurre un fenmeno denominado reticulocitosis paradojal con reticulocitos de 50-70 y hasta 90% a pesar de que la hemlisis disminuye y la necesidad de transfusiones tambin. 2.1.2. Dficit de la Glucosafosfato isomerasa (GPI) La enzima GPI es la segunda enzimopata ms frecuente de esta va. Se hereda con carcter
autosmico dominante. La clonacin del gen GPI situado en el cromosoma 19 ha permitido identificar mutaciones que en prcticamente todos los casos obedecen a sustituciones de una nica base nitrogenada y sntesis de una enzima inestable. 2.1.3. Dficit de la Triosafosfato isomerasa (TPI) El dficit TPI se hereda con carcter autosmico recesivo. Es codificada por un nico gen situado en el cromosoma 12 cuya clonacin ha per mitido identificar cinco mutaciones diferentes, todas ellas por sustitucin de una nica base nitrogenada. La mutacin prevalente en todas las poblaciones analizadas es la sustitucin G-C del codn 104 (GAC-GAC) con cambio del glutamato por aspartato y empleada en el diagnstico prenatal de la enfermedad. Esta mutacin se acompaa de una marcada inestabilidad de la enzima deficiente. 2.1.4. Dficit de Hexoquinasa (HK) Existen tres genes que codifican para la enzima HK: HK1, HK2 y HK3. La enzima eritrocitaria es codificada por el gen HK1, es la de menor actividad en comparacin con otras enzimas de la gluclisis, es muy influenciable por la reticulocitosis. Se transmite por carcter autosmico recesivo. 2.1.5. Dficit de Fosfofructoquinasa (PFK) La enzima PFK es codificada por tres genes diferentes (PFK M, PFK L y PFK P) con cinco isoenzimas (M4, M3L1, M2L2, ML3 y L4) los glbulos rojos. 2.1.6. Dficit de Fosfogliceratoquinasa (PGK) La enzima PGK es codificada por dos genes, uno situado en el cromosoma 19 (PGK testicular) y otro ligado al cromosoma X (Xq13) de distribucin ms generalizada y que codifica la enzima presente en las clulas sanguneas. Afecta esencialmente a varones homocigotos siendo las mujeres heterocigotos, generalmente asintomticas. 2.2. Enzimopatas del metabolismo xidorreductor Pertenecen a diferentes vas metablicas relacionadas todas ellas con el mantenimiento del glutatin reducido (GSH): (a) va de l a s p e n t o s a s - f o s f a t o : Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), (b) va de la sntesis del
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glutatin: Glutatin sintetasa (GS) y Gammaglutamilcistena sintetasa (GCS) y (c) sistema xidorr eductor del glutatin: Glutatin peroxidasa (GP) y Glutatin reductasa (GR). El mecanismo fisiopatolgico de la hemlisis en este tipo de enzimopatas es la prdida del poder reductor eritrocitario frente a la accin de distintas sustancias oxidantes, que se generan en el interior del eritrocito o proceden del exterior (perxido de hidrgeno, radical superxido). En ausencia de un adecuado sistema xidorreductor, tales sustancias condicionarn la desnaturalizacin de la hemoglobina y otras protenas eritrocitarias produciendo una hemlisis inmediata. La enzimopata ms frecuente y destacada del metabolismo xidorreductor es el dficit G6PD. 2.2.1. Dficit de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa La deficiencia de la glucosa 6 fosfatodehidrogenasa (G 6 PD) es el dficit enzimtico del glbulo rojo ms frecuente en el ser humano. Se cree que hay 200 millones de personas afectadas, y la razn de esto, es que el dficit de ella confiere resistencia a la malaria. Justamente es al estudiar la anemia hemoltica provocada por la primaquina, droga antimalrica, que este dficit es descubierto. La G6PD es una enzima muy antigua en la evolucin, ya que se encuentra en todos los organismos desde levaduras y protozoos a plantas y animales. En los mamferos es citoplasmtica y se encuentran en todas las clulas del cuerpo. El rol de la G6PD en el glbulo rojo es un rol metablico por su potencial reductivo y as, la deficiencia de esta enzima provoca un dao oxidativo en l y su posterior destruccin. La vida media de esta enzima es de 60 das y refleja paso a paso la edad del glbulo rojo ya que ste es incapaz de formar nuevas molculas proteicas y as, el reticulocito, que es el glbulo rojo ms joven, tiene 5 veces ms actividad enzimtica que los senescentes. Formas clnicas El dficit de esta enzima se manifiesta en el individuo en 3 formas clnicas: (a) anemia
hemoltica aguda (AHA), (b) anemia hemoltica crnica no esferoctica (AHCNE), y (c) anemia hemoltica neonatal. Actualmente se cree que esta ltima presentacin se debe ms a inmadurez heptica por dficit de la enzima en la clula heptica que a una hemlisis propiamente tal, ya que los recin nacidos no presentan anemia cuando hacen la ictericia. En las AHA los individuos no tienen anemia ni hemlisis normalmente, sta se hace evidente slo bajo estrs, como es la administracin de frmacos, las infecciones o la ingestin de habas (favismo) y la presentan personas con las mutaciones ms frecuentes, como la Africana (A-) y la Mediterrnea. Los siguientes frmacos que no deben ser indicados a los pacientes deficientes G6PD: Antimalricos (Primaquina, Pamaquina), Sulfonamidas (Sulfanilamida, Sulfapiridina, Sulfadimidina, Sulfa+Trimetropin, Sulfametoxazole), Nitr ofurantoina (Nitrofurantoina, Furazolidona, Nitrofurazona), Otr os (cido Nalidxico, Cloranfenicol, Pr obenecid, Azul de Metileno, Azul de Toloudina, Naftaleno, Trinitrotoluene, Fenilhidrazina, Fenazopiridina) y Antihelmnticos (B-Naftol, Niridazole) Las AHCNE las producen variantes raras donde la mutacin se ubica en la regin de unin con NADPH y no depende tanto de la actividad de la enzima que a veces es bastante alta (35%). En general la hemlisis es de poca cuanta, aunque se han descrito anemias tan intensas como la talasemia mayor. El glbulo rojo, en estos casos, no es capaz de resistir ni siquiera el estrs de la circulacin y est en permanente destruccin. Gentica El gen de G6PD se clon en 1984. Est ubicado en la regin telomrica del brazo largo del cromosoma X. Este gen tiene 20kb de longitud y 13 exones. La secuencia codificadora comienza en el exn 2 ya que el exn 1 no codifica. La enzima normal se denomina G6PD B y es un oligmero con una sola cadena polipeptdica de 515 aminocidos. La deficiencia de G 6 PD puede deberse a deleciones o a mutaciones puntuales afectando la transcripcin, procesamiento o la estructura
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primaria misma. Aunque la actividad enzimtica sea muy baja (1%) nunca est totalmente ausente. Las sustituciones de aminocidos alteran la funcin de la enzima ya sea por disminucin de la estabilidad de ella afectando la funcin cataltica de la G6PD. El estudio electrofortico y las propiedades cinticas de la enzima residual ha mostrado que no todos los grupos tnicos tienen la misma mutacin y as se han descrito ms de 400 mutaciones.
Con la posibilidad actual del uso de la reaccin de polimerasa en cadena para el estudio de exones individuales o grupos de exones, el anlisis de las mutaciones de la G6PD se ha simplificado y actualmente hay descritas alrededor de 100 variantes. Clasificacin La organizacin mundial de la salud (OMS) ha categorizado las deficiencias de G6PD segn la actividad enzimtica en 5 clases (tabla 8-5).
Tabla 8-5. Clasificacin clnicomolecular de las variantes de G6PD segn la OMS Clase I II Actividad en eritrocitos (%) 0 0-5 Expresividad clnica Anemia hemoltica crnica Infeccin de repeticin Asintomticas o Anemia aguda medicamentosa Favismo Ejemplos Variantes raras G6PD Barcelona Variantes mediterrneas G6PD mediterrnea Variantes asiticas G6PD Cantn III 5-15 Asintomticas o Anemia aguda medicamentosa Favismo Asintomticas Asintomticas Variantes africanas G6PD Btica (A-) Enzimas normales G6PD B+ y G6PD A+ Variantes hiperactivas G6PD Hecktoen
IV V
100 130
De las 100 mutaciones diferentes de G6PD descritas hasta la fecha, se las ha identificado en todos los exones salvo en el exn 1 que no tiene secuencia codificadora y en la gran mayora de los casos slo hay una sustitucin aminoacdica. El 25% de las mutaciones estn en el exn 10 que se extiende desde el nucletido 1052 al 1287, y de ellas, todas menos 2 que se encuentran en el extremo 5 del exn, son de clase I. Se ha pensado en la
secuencia aminoacdica que codifica este exn se encuentra el sitio de unin del NADP porque algunas de estas variantes se activan con altas concentraciones de NADPH. Otra posibilidad sera que esta zona fuera una de contacto de subunidades y las mutaciones en esta zona alteraran la estabilidad de la enzima. En la tabla 8-6 se indican las mutaciones de las variantes ms frecuentes de G6PD.
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Tabla 8-6. Mutaciones de las variantes ms frecuentes de G6PD Variantes Mediterrnea G6PD Mediterrnea G6PD Seattle Africanas G6PD A+ G6PD ABase nitrogenada mutada C563T G844C A376G A376G y G202A G680T T968C A95G G1376T Cambio de aminocido Ser188Phe Asp282His Asn126Asp Asn126Asp y Val68Met Arg227Leu Leu323Pro His32Arg Arg459Leu Clasificacin segn OMS II II IV
III III III III II
Asiticas G6PD Cantn Laboratorio
desencadenar el cuadro hemoltico. 2.2.2. Dficit de Glutatin sintetasa (GS) El dficit de GS es la segunda enzimopata en frecuencia del metabolismo xidorreductor. Junto a la GGS intervienen en la sntesis del glutatin con consumo de una molcula de ATP. Esta enzima tiene una vida media de 4 das y existe bajo dos for mas moleculares, una exclusivamente eritrocitaria (produce slo anemias) y otra sistmica (produce oxoprolinuria, retraso mental o neuropata grave). 2.2.3. Dficit de Gamma-glutamilcisten sintetasa (GGS) El dficit de GGS es un desorden autosmico recesivo. La anemia hemoltica slo se observa en estados homocigotos, donde los niveles de GSH eritrocitario son aproximadamente un 5% de lo normal, con una marcada disminucin en la actividad de la GGS. 2.2.4. Dficit de Glutatin reductasa (GR)
Para diagnosticar que existe un dficit de PK existen distintas pruebas de laboratorio, tanto rutinarias como especficas. Hematolgicas. Hemoglobina entre 3 a 4 g/dl, excentrocitos (presentan un desplazamiento de la hemoglobina hacia uno de los extremos), cuerpos de Heinz (hemoglobina desnaturalizada que precipita en el interior del eritrocito). Bioqumicas. Se observa un aumento de hemoglobina, bilirrubina plasmtica y uroblingeno urinario y fecal, una disminucin de haptoglobinemia, hemoglobinuria y hemosidenuria. El diagnstico definitivo se realiza en tcnicas como: ensayo enzimtico cuantitativo que es la medida de la actividad enzimtica en el hemolizado en UI por gramo de hemoglobina (rango normal: 4.6 - 13.5 UI/gHb) prueba de fluor escencia, prueba de reduccin de metahemoglobina, prueba de ascorbato-cianide y electroforesis. Tratamiento El dficit de la G6PD carece de tratamiento etiolgico y siempre debe ser paliativo, a base de transfusiones sanguneas cuando se requiera; adems una vez establecido el diagnstico debe procurarse evitar el contacto del paciente con todas aquellas sustancias capaces de
La enzima GR cataliza la reduccin del glutatin oxidado en presencia de NADPH. Los estudios sobre su secuencia aminoacdica demuestran que contiene FAD, por lo que la actividad normal de la enzima depende de que la dieta contenga riboflavin, es por esto que la deficiencia parcial de glutatin reductasa se debe a una dieta
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deficiente en este compuesto, es as que los niveles de glutatin reductasa aumentan luego de administrar concentraciones fisiolgicamente adecuadas de riboflavin. Estudios actuales no han podido demostrar feacientemente si la deficiencia de esta enzima es la real causante de las hemlisis que cursan estos pacientes. 2.2.5. Dficit de Glutatin peroxidasa (GP) La enzima GP cataliza la oxidacin de glutatin reducido por perxidos, incluyendo perxido de hidrgeno e hidroxiperxidos orgnicos. Esta deficiencia es rara en casos de hemlisis, tanto en nios como en adultos, tanto as que en la actualidad no se sabe si la deficiencia de esta enzima es la real causante de la hemlisis.
2.3. Enzimopatas nucleotdico
del
metabolismo
Debido a que el eritrocito no cuenta con mecanismos para la sntesis de novo de nucletidos adenlicos (AMP, ADP y ATP), todas aquellas enzimas que de alguna manera eviten su degradacin o intervengan en su metabolismo adquieren gran importancia funcional. Estas enzimas son las siguientes: Pirimidina 5nucleotidasa (P5N), Adenilatoquinasa (AK) y Adenosina desaminasa (ADA). La enzimopata ms frecuente y destacada del metabolismo nucleotdico es la P5N, seguida de las restantes enzimopatas de inters clnico tabla 8-7.
Tabla 8-7. Eritroenzimopatas del metabolismo nucleotdico Subunidades activas P5N AK ADA * Localizacin preferente del gen Exclusivo AK-1 Comn a otras clulas Localizacin cromosmica ? 9 20 Intensidad del sndrome hemoltico ++ + +
P5N, Pirimidina 5 nucleotidasa; AK, Adenilatoquinasa; ADA, Adenosina desaminasa.
3. HEMOGLOBINOPATAS Las hemoglobinopatas son trastornos de la hemoglobina, originados sea por la sntesis de una cadena de globina estructuralmente anormal (hemoglobinopatas estructurales) o por la ausencia o bien disminucin en la sntesis de una cadena normal (sndromes talasmicos). Este conjunto de patologas, estn presentes en millones de personas y constituyen a nivel mundial el trastorno gentico ms frecuente. Sus consecuencias varan desde ser indetectables hasta provocar la muerte del individuo afectado, causando un grave problema de salud pblica en muchos pases en desarr ollo y en otras comunidades desarrolladas con gran nmero de inmigrantes procedentes de reas de alta incidencia. A pesar de los grandes avances en el conocimiento de la estructura, funcin y gentica de la hemoglobina, an no se cuenta con un tratamiento curativo para estas enfermedades, y las medidas teraputicas a la que son sometidos especialmente los
talasmicos son molestas para el enfermo, adems de muy caras desde el punto de vista social y econmico. Por ello el diagnstico precoz y la prevencin continan siendo el pilar fundamental. En la mayora de los sndromes talasmicos, debido a la utilizacin de contadores automticos que deter minan el VCM, la deteccin de portadores suele ser fcil, puesto que su fenotipo se manifiesta como una microcitosis. Por el contrario, en la mayora de las hemoglobinopatas estructurales, al carecer de manifestaciones en su estado de portador heterocigoto, slo tcnicas un poco ms laboriosas pueden detectarlas, siendo las ms utilizadas en los programas de bsqueda a gran escala la electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino, el isoelectroenfoque de hemoglobinas y hoy en da la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). La mayor parte de los programas de bsqueda de hemoglobinas estructurales se han dirigido hacia el diagnstico de las formas que ms problemas causan por su gravedad o por su
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frecuencia, como son la Hb S, Hb C, Hb E, etc, o por sus combinaciones, y por tanto los pases ms desarrollados tecnolgicamente, en los cuales adems esta patologa es frecuente debido a los fenmenos migratorios, son los situados a la cabeza de este tipo de estudios. Por otra parte, est perfectamente establecida la relacin de algunos tipos de hemoglobinas anormales con determinados grupos raciales, lo que le confiere a la investigacin de los tipos de hemoglobinas una vertiente etnolgica, aportando datos acerca de la influencia de determinadas migraciones en la composicin tnica del rea geogrfica que se estudia. En la prctica clnica el tr mino hemoglobinopata se emplea para denominar a las alteraciones de la estructura y la sntesis de la protena, sin embargo, los trastornos heredados de la hemoglobina agrupan tanto a la patologa del hemo como a la de la globina. Las hemoglobinopatas pueden clasificarse de forma general en varios grupos: Talasemias. Se caracterizan por la sntesis disminuida o bien ausente de una o ms cadenas de globina, las cuales son de estructura normal. Hemoglobinopatas estructurales. stas se deben a cambios en la estructura de las cadenas de globina. Son silentes en la gran mayora de los casos, pero en otros originan un funcionamiento y/o estabilidad anormal produciendo un transporte de O2 defectuoso o bien anemia hemoltica. Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (PHHF). Se caracteriza por una alteracin en el perodo neonatal del cambio en la produccin de HbF a la del adulto, debido a causas genticas. No tiene mayor importancia clnica y su inters es fundamentalmente derivado del estudio de la regulacin gnica.
3.1. Talasemias En estas patologas encontramos ausencia o produccin disminuida de una o ms cadenas de globina, debido a alteraciones genticas. Se clasifican segn la cadena afectada en , , , y , y segn su forma de manifestarse en portador silente, rasgo talasmico, enfermedad de la hemoglobina H e hidropesa fetal, dependiendo de la gravedad de cada una de ellas. Las y talasemias son adems subdivididas en formas 0 y 0, en los cuales no se produce la cadena afectada y en formas + y + cuando la cadena se sintetiza pero en cantidad reducida. La r epercusin fisiopatolgica y las consecuencias clnicas derivadas de estos trastornos vienen dadas, en primer lugar porque al sintetizarse menos cantidad de una cadena de globina se forma menos hemoglobina normal, dando por resultado la aparicin de una anemia microctica e hipocrmica. Otro mecanismo que tambin juega un papel importante en la anemia que caracteriza a la talasemia, consiste en que la cadena producida en cantidad normal al no poderse aparear con la cadena deficitaria, se agrupa en hemotetrmeros ms o menos estables, o bien precipitan en el interior del glbulo rojo produciendo alteraciones en su maduracin y supervivencia. En la talasemia, el exceso de cadena es incapaz de formar un homotetrmero estable, por lo que precipita rpidamente en los precursores eritrocitarios, siendo destruidos en el interior de la mdula sea, proceso que se conoce como eritropoyesis inefectiva, o bien lo hace en el eritr ocito, dando lugar a su destruccin en el sistema retculo endotelial (hemlisis extravascular). En la talasemia, el exceso de cadenas y sin aparear se agrupa en homotetrmeros hemoglobnicos conocidos respectivamente como Hemoglobina Bart (4) y Hemoglobina H (4). Ambos son bastante inestables y slo llegan a ser insolubles cuando el eritrocito envejece, precipitando en ese momento, por lo que se produce la destruccin de los eritrocitos viejos. Esto hace que en este tipo de talasemias la anemia hemoltica sea leve o moderada y que el grado de eritropoyesis ineficaz sea mucho menor que en la talasemia.
A continuacin se describirn los conceptos y clasificacin de todos estos trastornos, puesto que en poblaciones donde las talasemias son comunes, a menudo existen dobles heterocigotos para ambos trastornos, adems de que la fisiopatologa de algunas variantes estructurales estn muy relacionadas a los sndromes talasmicos.
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Por otro lado, tanto la Hb Bart como la Hb H poseen gran afinidad por el O2 al no presentar el efecto hemo-hemo, lo que las inhabilita para transportar este gas, ya que no puede cederlo a los tejidos. 3.3.1. Talasemia Hay dos formas clnicas importantes de las talasemias , el hidrops fetal por Hb Bart y la enfermedad de la Hb H, las cuales resultan de la interaccin de dos determinantes genticos talasmicos (0 y +). a) Talasemia 0. Resulta de la prdida o delecin de ambos genes de globina del cromosoma 16 cuyo haplotipo es (/ ), o bien por delecin del elemento regulatorio HS-40. b) Talasemia +. Resulta por delecin de uno de los genes de cada par, o en otros casos denominados no delecin en los que el gen est intacto, pero tiene mutaciones que le hacen inactivo parcial o totalmente. Se clasifican en: Tipo delecin. Su haplotipo es ( - ) y ( - / - ) Tipo no delecin. En una minora de los casos los genes no estn delecionados, sino que se producen por mutaciones puntuales, pequeas deleciones o sustituciones de una o ms bases en los genes estructurales que regulan su expresin, por lo que afectan a los procesos de transcripcin, procesamiento del RNA y traduccin. Se caracterizan por una reduccin en la sntesis de la cadena de globina ms intensa que en aquellos casos con haplotipo - / . Estas formas conservan ambos genes de globina , por lo cual no son detectables por las tcnicas habituales de Southern-Blott. Hoy en da se sabe que a nivel molecular son for mas muy heterogneas. Su haplotipo es (T). Hemoglobina Constant Spring. Se considera otro grupo de no delecin. Se origina por la mutacin de una nica base en el codn de terminacin de la cadena 2, continuando la lectura del DNA cuando debera finalizar, y por tanto sintetizndose una cadena con 31 aminocidos ms en el extremo C-terminal, pero en cantidad reducida dado que el RNA alargado es inestable. El haplotipo es (CS / ).
determinantes genticos citados anteriormente se puede esperar los siguientes cuatro fenotipos: Estado de portador silente o rasgo talasmico 2. Son los heterocigotos para el determinante +, es la forma ms leve de enfermedad y su genotipo puede ser (- /), (T/), (CS/). Hematolgicamente son normales. Algunos de ellos tienen un 1%-2% de Hb Bart al nacer. Rasgo talasmico 1 . Ocurr e como consecuencia de la interaccin de dos heterocigotos para la + talasemia, (-/-), (-/T), y diversas formas (T/T). El espectro tanto clnico como hematolgico que presentan estos enfermos es muy variable, desde un fenotipo de mnima microcitosis e hipocroma hasta presentar un sndrome parecido a la Hb H. El rasgo de talasemia puede ser puesto de manifiesto desde el nacimiento con la medicin de los niveles de Hb Bart que relacionan los diferentes genotipos con los niveles de Hb Bart. El rasgo talasmico tambin se puede poner de manifiesto por la determinacin de los valores de hemoglobina, VCM y HCM, y por existir en ellos una disminucin del ratio de sntesis de las cadenas de globina (/), que aunque no siempre indica claramente el genotipo, s diferencia abiertamente entre los individuos con rasgo talasmico de los individuos normales y de los (-/). Enfermedad de la Hemoglobina H. Se produce por una falta de funcin de 3 genes como resultado de la herencia de un determinante de 2 talasemia de uno de los progenitores y una 1 talasemia del otro, y en algunos casos la enfermedad de la Hb H es el resultado de la asociacin de una talasemia delecin y una no delecin. Siendo el genotipo ms frecuente el de ( - /T). En estos pacientes se produce una anemia microctica de intensidad variable, comportndose como una talasemia intermedia. Su clnica puede ser muy variada desde una forma moderadamente severa hasta un cuadro de anemia hemoltica intensa con hepatoesplenomegalia, alteraciones seas, colelitiasis y lceras de extremidades. La confirmacin analtica se fundamenta en el hallazgo de una banda de hemoglobina rpida e inestable en la electroforesis a pH alcalino, as como la demostracin de cuerpos de inclusin de Hb H ( 4 )
Considerando que la sntesis de cadena est regida por cuatro loci, de la interaccin de los
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intraeritrocitaria con azul cresil brillante. Hidrops fetal por Hemoglobina Bart. Se produce por una delecin completa de los genes de globina, cuyo fenotipo es (- - / - -). Es incompatible con la vida y constituye una causa de aborto hacia la semana 30 de gestacin, o bien muerte poco despus del nacimiento por un cuadro de hidrops f e t a l c o n mar cado edema, ascitis, hepatoesplenomegalia y un cuadro de hematopoyesis extramedular que se confirma en la necropsia. Sus niveles de hemoglobina al nacimiento oscilan entre los 6-8 g/dL, la serie roja presenta hipocroma y poiquilocitosis marcada observndose reticulocitos y numerosos eritroblastos. La cuantificacin de la Hb Bart supera el 80%, siendo el resto Hb Portland (20%), no existiendo Hb F ni Hb A, por lo que su diagnstico es fcil por electroforesis en sangre de cordn.
mayora de los individuos con rasgo talasmico son portadores de un gen normal (A) y el otro gen talasmico (T) donde se localiza la mutacin. Se caracteriza por no tener, en general, una clnica llamativa, y ser en gran parte de los casos un hallazgo casual. El diagnstico se basa en la microcitosis con un VCM de entre 60 fL y 75 fL, morfologa microctica de los hemates y una concentracin de Hb A2 entre 3,5-6%. Se han descrito tambin casos de talasemia heterocigota con valores normales de Hb A2, de 2 tipos: Tipo I o silente. Fue descrito por vez primera por Schwartz, y se caracteriza por una mor fologa nor mal de los hemates o solamente leves alteraciones, e ndices eritrocitarios normales. La sntesis de cadenas se encuentra alterada con un razn / de 1,6. Su interaccin con una talasemia con nivel de Hb A2 elevada resulta en un cuadro de talasemia intermedia. Tipo II. Presenta una morfologa anormal de los glbulos rojos y un mayor desequilibrio en la sntesis de cadenas (/ = 2,5).
- Microcitosis Es una forma infrecuente de aparicin de la enfermedad de la Hb H. Acompaa a ciertas alteraciones hematolgicas como los sndromes mielodisplsicos que progresan hacia las formas leucmicas. Es ms frecuente en el sexo masculino, y se presenta incluso antes de que aparezcan las alteraciones hematolgicas de la enfermedad de base. En ellas aparece un dficit muy importante en la sntesis de cadena de globina, con cifras de Hb H que se sitan en torno al 18%, pudiendo llegar incluso hasta el 57%. Los estudios moleculares de estos pacientes muestran que no existen reordenamientos en el cluster de globina y no aparece un efecto compensatorio de los genes . Los niveles de 2 mRNA y 1 mRNA estn reducidos en concordancia con los niveles extraordinariamente bajos de globina, por lo cual se piensa que el dficit se debe a un problema de la transcripcin de genes . 3.3.2. Talasemia Aunque la talasemia tiene un fenotipo considerado dependiente de algunos factores tales como la naturaleza de la mutacin que la desarrolla, desde un punto de vista clnico se pueden diferenciar tres estados. El rasgo talasmico o talasemia menor, la enfermedad grave o talasemia mayor y talasemia intermedia. a) Rasgo talasmico o talasemia menor. Se corresponde con la forma heterocigota. La
b) Talasemia mayor. Corresponde a la forma ms grave de la enfermedad. Los individuos que la padecen son portadores de dos genes talasmicos (TT); son homocigotos. A largo plazo la evolucin es mortal, fundamentalmente por la presencia de siderosis heptica y miocr dica asociada a esplenomegalia, deformaciones seas y anemia hemoltica. La anemia se produce como consecuencia de hemlisis, eritropoyesis ineficaz y pobre hemoglobinizacin de los eritrocitos. Estos pacientes son dependientes de transfusiones. En el laboratorio se encuentra aumento de la Hb F con valores de entre 10% y 95% o ms. La Hb A2 es normal o ligeramente elevada. El estudio de los padres corrobora el diagnstico. c) Talasemia intermedia. Se denomina as a los casos sintomticos que espontneamente mantienen niveles de hemoglobina entre 7 y 11 g/dL, y que slo muy ocasionalmente reciben transfusiones. Generalmente es el resultado de defectos genticos combinados: Homocigotos para genes + talasmicos de mayor gravedad. Combinacin del gen 0 talasmico grave con una + talasemia particularmente benigna.
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Presencia de factores genticos que aumentan la produccin de cadenas de globina (persistencia hereditaria de Hb F, talasemia o mutaciones de talasemia asociadas con un incremento de cadenas , las cuales se combinan con el exceso de cadenas para formar hemoglobina F. Herencia de una talasemia heterocigota asociada a una triplicacin de genes (/ o /) y la presencia de variantes de hemoglobina inestables en estado heterocigoto ( talasemia dominante). Tambin se ha demostrado que en muchas ocasiones la expresin ms leve es debida a la asociacin de talasemia, producindose un equilibrio en la sntesis de cadenas de globina.
3.3.5. Sndromes hemoglobina Lepore Se producen a partir de un gen nuevo, fusionado durante el entrecruzamiento en la meiosis de los genes y y transmitido posteriormente de forma mendeliana simple (figura 8-6).
Base molecular de las talasemias: La mayor parte de los defectos moleculares causantes de talasemia son la mutacin de un nico nucletido (mutacin puntual) que afecta a uno de los diferentes procesos moleculares involucrados en la expresin del gen de globina, esto es: transcripcin, procesamiento del pre-mRNA y traduccin. Al contrario que en las talasemias, solamente una minora de las talasemias estn producidas por deleciones en el gen. Los diferentes mecanismos responsables de la talasemia representan modelos de inactivacin de los genes en mamferos, y gracias al anlisis de los defectos en las talasemias se ha logrado entender algunos aspectos generales de la expresin de los genes. 3.3.3. Talasemia Se debe a un defecto en la sntesis de cadenas . Se caracteriza, en su forma heterocigota, por un cuadro talasmico menor con Hb A2 normal y niveles relativamente altos de Hb F, as como ausencia de Hb A y A2 en el estado homocigoto con clnica de talasemia intermedia. Se clasifican de acuerdo con la estructura de la hemoglobina fetal en G ()0 y GA ()0. 3.3.4. Talasemia Se han observado solamente en portadores heterocigotos. Se caracterizan por hemlisis neonatal y cambios hematolgicos de talasemia , con un nivel normal de Hb A2 en el adulto.
Figura 8-6. Formacin del cromosoma Lepore
Existe una sntesis ineficaz de una cadena no hbrida, estructuralmente anormal, formada por una porcin N-terminal idntica a la cadena y por una C-terminal idntica a la . El punto de fusin es variable, habindose detectado tres tipos: Boston, Baltimore y Hollandia, todas ellas con propiedades similares. La sntesis de la cadena de la Hb Lepore sigue un patrn prcticamente idntico al de la cadena de la Hb A2, por ello no se detecta en la electroforesis alcalina de la sangre de cordn en el perodo neonatal. Sin embargo, en el individuo adulto la Hb Lepore es fcilmente detectada por dicho tipo de electroforesis, teniendo aproximadamente la misma movilidad que la Hb S, en cambio, en una electroforesis a pH cido es imposible separarla de la Hb A. Los hallazgos en sangre perifrica son muy similares a los que se encuentran en individuos heterocigotos para talasemia con Hb A2 alta, con presencia de microcitosis, hipocroma y codocitos. Las manifestaciones clnicas en el estado homocigoto varan entre una forma de talasemia intermedia y mayor, no se sintetiza Hb A ni A2, apareciendo solamente Hb F y Lepore en una cuanta media del 15% del total, no muy distinto a lo que se encuentra en el estado heterocigoto. Este estado por su manifestacin clnica puede considerarse una talasemia +.
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La forma heterocigota no se manifiesta desde el punto de vista clnico produciendo solamente microcitosis con Hb A2 normal y una discreta elevacin de Hb F. 3.2. Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal En la persistencia hereditaria de Hb F (PH HF) existe una produccin de Hb F en el adulto que excede el nivel normal en ausencia de cualquier cambio hematolgico mayor. Existen diferencias fenotpicas, tanto en la cantidad de hemoglobina F producida como en la relacin de las cadenas G / A que contienen. El anlisis molecular de las condiciones con PHHF ha demostrado que en algunos casos el cluster de globina est intacto (PHHF-no delecin), mientras que en otros existen deleciones que afectan el extremo 3 del cluster con remocin completa de los genes y (PHHF delecin). Tipo delecin. Son la mayora de los casos y se debe a la prdida de cantidad variable de material gentico que incluye generalmente los genes y . G A PHHF es muy similar a la G A talasemia, excepto que en heterocigotos tienen mayor nivel de Hb F y en homocigotos tienen un cuadro hematolgico y sntesis de globina similar a la talasemia heterocigota, con 10% de Hb F y tambin distribucin heterognea. La condicin con delecin puede ser ampliamente dividida en G A ()0-PHHF, Hb Kenya-PHHF, G A ()0-talasemia, G (A )0talasemia y ( G A )0-talasemia. Cada grupo, con la excepcin de Hb Kenya-PHHF, puede ser subdividido posteriormente a nivel molecular, pero dentro de cada grupo el cuadro clnico y hematolgico es relativamente uniforme. Tipo no delecin. Se han descrito muchas variantes en las que la mutacin de una nica base dentro o fuera del grupo de genes origina el trastorno. En estos casos la produccin de cadena deriva casi completamente de uno de los dos genes . El gen sobre el cromosoma afecto est expresado en forma correcta. Segn la distribucin de la Hb F en los hemates, determinado por la tcnica de elucin cida de Kleihauer, se pueden distinguir dos formas de
PHHF: PHHF homognea o pancelular con aumento uniforme de Hb F en todos los hemates. PHHF heterocelular, en la cual slo una subpoblacin de glbulos rojos contiene Hb F. A este grupo pertenecen los tipo delecin y estn estrechamente relacionados con las talasemias. Interaccin de talasemias con variantes estructurales Cuando un paciente adquiere un gen talasmico de una determinada cadena de globina en un cromosoma y un gen para una variante estructural del mismo tipo de cadena de globina en el otro cromosoma, el porcentaje observado de la hemoglobina estructuralmente anormal aumenta por sobre el nivel encontrado en un heterocigoto simple para aquella variante estructural, y la severidad clnica de la condicin llega a ser como si fuera una homocigocidad para la hemoglobina anormal. Por otro lado, cuando un paciente hereda la combinacin de talasemia de un tipo de cadena de globina (p. ej ) y un gen para una variante estructural del otro tipo de cadena () no se observa aumento en la cantidad de hemoglobina anormal, y las manifestaciones clnicas son similares a las del estado heterocigoto para dicha variante estructural. Talasemia en asociacion con variantes estructurales de cadena Hemoglobina S / talasemia. Esta combinacin afecta especialmente a personas con ancestros mediterrneos y africanos. El cuadro clnico simula al de anemia de clulas falciformes, pero la enfermedad, en general, sigue un curso ms moderado. Ocasionalmente la enfermedad puede ser extraordinariamente moderada y el diagnstico puede ser descubierto como un hallazgo incidental. Estas diferencias en las manifestaciones clnicas se deben a la interaccin del gen S con las diferentes formas de talasemia (0 o forma grave y + o forma leve), que como se sabe reduce la produccin de A. La esplenomegalia es una caracterstica comn y es de ayuda en diferenciar la hemogobina S / talasemia de la anemia de clulas falciformes en adultos y nios mayores. Los hallazgos de laboratorio incluyen un grado variable de anemia acompaado por clulas en diana (codocitos), hipocroma y microcitosis de
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los glbulos rojos y ocasionalmente formas falcifor mes en el frotis sanguneo de los pacientes ms severamente afectados. Los estudios de cuantificacin de hemoglobinas, sea con electroforesis o HPLC revela 60-90% de Hb S, 0-30% de Hb A, aumento de los niveles de Hb A2 y 1-15% de Hb F. Hemoglobina S / Hemoglobina Lepore. Los casos descritos muestran un amplio espectro de severidad clnica desde una forma discreta a una grave con hepatoesplenomegalia y anemia hemoltica. El patrn de hemoglobinas muestra una ausencia de Hb A y la presencia de Hb A2 (0.9%-2.6%), S (60%-90%), Lepore (10%) y F (9%-25%). Hemoglobina S / Talasemia . Esta combinacin gentica no se asocia con un cuadr o clnico especialmente severo, probablemente porque el nivel de Hb F es elevado, protegiendo de la falciformacin, por lo que no suelen tener crisis vaso-oclusivas. El patrn de hemoglobinas demuestra ausencia de Hb A, Hb F (15-25%), Hb S (60-70%) y Hb A2 en niveles normales. Hemoglobina C / talasemia: Esta condicin ocurre fundamentalmente en gente de raza negra y se asocia con anemia moderada. El frotis sanguneo se caracteriza por hipocroma y abundantes codocitos. La electroforesis de hemoglobina y HPLC demuestra 65-80% de Hb C, siendo el resto Hb A (en el caso de asociacin de Hb C y + talasemia) con bajo nivel de Hb F (2-5%). La Hb C / 0 talasemia es menos comn y se asocia con anemia ms severa y esplenomegalia. La Hb A est totalmente ausente en ambas condiciones, siendo difcil de diferenciar de los homocigotos C / C. Hemoglobina C / Hemoglobina Lepore. Produce un trastorno muy discreto similar a la Hb C / + talasemia. Hemoglobina C / talasemia. Ocasiona un cuadro ms leve que la Hb C / C y que la C / 0 talasemia, y parecido ms bien la Hb C / + talasemia. Los niveles relativamente altos de Hb F en los eritrocitos reducen la severidad del proceso hemoltico secundario a la presencia de Hb C. Hemoglobina E / talasemia. Esta asociacin es bastante comn en Tailandia y todo el sudeste asitico, por razones no muy bien comprendidas es tan severa como la talasemia homocigota.
La Hb E por s misma se asocia con un fenotipo de talasemia debido a una disminucin en la sntesis de cadenas E a causa de una disminucin en la formacin de E mRNA funcional, secundario a procesamiento anormal del precursor E del mRNA de globina. Sin embargo, el dficit total en la sntesis de globina en la Hb E homocigota es equivalente a aquella de la talasemia heterocigota, siendo la Hb E homocigota un desorden benigno. Por ello es difcil entender por qu los dobles heterocigotos para Hb E y talasemia pr esentan una enfermedad tan severa. Se ha sugerido que ya que la Hb E es inestable desde el punto de vista oxidativo, el mayor exceso de cadenas generado por el estado de doble heterocigoto (comparado con Hb E homocigota) podra producir un estrs oxidativo suficiente como para causar desnaturalizacin acelerada y precipitacin de la Hb E y, por lo tanto, mayor hemlisis. La electroforesis de hemoglobina demuestra Hb E, un alto porcentaje de Hb F (cercano al 50%), sin Hb A, ya que la gran mayora de los casos se asocian con 0 talasemia. La asociacin de talasemia con otras variantes menos frecuentes tambin han sido descritas, encontrndose la asociacin con Hb D, Hb JBaltimore, Hb Hofu, y Hb G. Talasemia con variantes estructurales de cadena Los casos descritos de esta asociacin pr opor cionan infor macin acerca de la regulacin post-transcripcional de la sntesis de hemoglobina. Cuando un portador de una variante estructural de cadena tiene tambin un gen de talasemia, el nivel de la variante de cadena es por lo general ms bajo que en el estado heterocigoto simple. Esto se explicara porque al producirse un desequilibrio en la sntesis de cadenas de globina con exceso de cadenas , y aunque la cadena normal y anormal se sintetizan a la misma velocidad, la degradacin proteoltica de la cadena mutante es mucho ms rpida que la normal. Adems es posible que con un nmero limitado de cadenas no , las cadenas nor males sean ligadas con preferencia, llegando a no combinarse las mutantes con el nmero limitado de cadenas o si el desequilibrio es severo.
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Talasemia con variantes estructurales de cadena En tr minos generales, en presencia de talasemia , al haber un nmero limitado de cadenas disponibles, la cantidad de una variante cargada positivamente est disminuida en proporcin al nmero de genes delecionados, al contrario de lo que sucede con las variantes cargadas negativamente, que est presente en los heter ocigotos en cantidades mayores. Hemoglobina S / talasemia. Esta combinacin de hemoglobinopatas es de inters debido a los efectos que la talasemia asociada tiene sobre la cantidad de Hb S que se acumula en los heterocigotos SA y en las caractersticas clnicas de la enfermedad por Hb SS. Inicialmente fue reconocido por distintos investigadores que individuos que heredaban un fenotipo de talasemia y un estado heterocigoto para Hb S tienen niveles de Hb S que son menores que el simple heterocigoto SA: 25-35% versus 40-45%. Posteriormente se demostr que el bajo nivel de Hb S es debido a un recambio post-traduccin de las cadenas S, que no pueden competir tan eficientemente como las cadenas A por el pool limitado de cadenas disponibles. La utilizacin de estudios de mapeo gentico para la identificacin de la talasemia ha confirmado la correlacin entre el porcentaje de Hb S y el nmero de genes en los heterocigotos para Hb S: individuos con 4 genes generalmente tienen Hb S mayor de 36%; aquellos con 3 genes tienen Hb S del 30-36% y aquellos con 2 genes tienen Hb S < 30%. En pacientes homocigotos para Hb S (SS) o bien dobles heterocigotos (SC) y talasemia concomitante, el grado de anemia, hemlisis y otras anormalidades del glbulo rojo son menores que si no tuvieran talasemia asociada. Sin embargo, no existe igual certeza con respecto al grado de atenuacin de la enfermedad vasooclusiva vista en la Hb S, cuando existe asociacin con talasemia.
asociadas con talasemia son de escasa frecuencia, exceptuando como ya se seal la Hb E en el Sudeste Asitico Talasemia asociada a variantes de cadena Debido a que las variantes de cadena son raras, su asociacin con la talasemia es tambin poco frecuente. Se han descrito interacciones con Hb I, Hb Q, Hb G Philadelphia, Hb J Mexico, Hb J Tangariki, Hb J Cape Town y Hb Hasharon. El porcentaje de la mayor parte de las variantes en heterocigotos es aproximadamente un 25% o menos del total de hemoglobina. Al asociarse con talasemia este porcentaje aumenta en proporcin directa al nmero de genes que falten. El cuadro clnico de estos dobles heterocigotos es el que corresponde a su talasemia.
3.3. Hemoglobinopatas estructurales Con este nombre se denomina a aquellas hemoglobinas patolgicas cuya alteracin fundamental reside en anomalas de la estructura molecular, siendo el proceso biosinttico normal en la gran mayora de los casos. 3.3.1. Nomenclatura Existen tres sistemas distintos de nomenclatura para las variantes de hemoglobina: (a) nombre comn, asignado por el investigador que primero descubre la nueva hemoglobina, (b) designacin segn el sitio y naturaleza del aminocido sustituido en la cadena de globina y (c) designacin de acuerdo con la posicin sustituida en la hlice. Primero se utilizaron las letras del alfabeto de una forma ordenada, reservndose la letra A para nominar a la mayor fraccin de hemoglobina del adulto; la F para la fraccin mayor de la fetal y la S para la causante de sicklemia, acordndose que la letra B no sera adjudicada a ninguna. Este sistema funcion bien hasta 1956, pero debido a que el nmero de letras es limitado y que muchas variantes con idntica movilidad electrofortica posean propiedades y estructura diferentes, se acord dar un nombre especfico
Hemoglobina C / Talasemia . Los enfermos tienen un fenotipo talasmico y unos niveles de Hb C ms bajos (alrededor de 30%), que los que normalmente se encuentran en los que slo llevan Hb C ( 42%).
Las restantes hemoglobinopatas estructurales
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a cada hemoglobina, la mayora de las veces de origen geogrfico. La nomenclatura ms lgica es la que se busca en la posicin del aminocido sustituido. De este modo la Hb S se designa como 22 6Glu Val, o bien 22 6Val . As se indica la naturaleza de la sustitucin en el sexto residuo aminoacdico desde el extremo N al C-terminal. En el momento actual se recomienda que los sobrescritos sean evitados, que no se ponga la cadena de globina no afectada, y que se indique rutinariamente la posicin helicoidal. As la Hb S se designa: 6(A3)Glu Val. La designacin de la posicin helicoidal tiene la ventaja de aportar en forma automtica informacin de la regin funcional y de la homologa posible con variantes que afecten a regiones similares en otras cadenas de globina. As las Hb Chesapeake y Wood tienen ambas la sustitucin FG 4 Leu, la primera en la cadena y la segunda en la , puesto que es una posicin importante para el control de la afinidad por el O2, no sorprende que ambas variantes tengan una expresin clnica muy parecida. 3.3.2. Base gentica de las hemoglobinopatas estructurales Las variantes de hemoglobinas son heredadas como rasgos codominantes, de acuerdo a la gentica mendeliana clsica. Un individuo hereda un gen de cadena de cada padre. Si ambos padres son heterocigotos para la Hb S, variante de cadena , existe un 50% de posibilidades que el nio sea heterocigoto tambin como sus padres (AS), 25% que sea normal (AA) y 25% de posibilidades que sea homocigoto para dicha condicin (SS). Si uno de los padres es heterocigoto para la Hb S (AS) y el otro heterocigoto para la Hb C (AC), existe un 25% de posibilidades que el nio sea doble heterocigoto (SC). La presencia del gen para la Hb S produce enfermedad clnica slo si es heredado en el estado homocigoto (SS), o doble estado heterocigoto (SC, SD Los Angeles, SO Arab o S / talasemia). En contraste, las variantes inestables y aquellas con marcadas anormalidades de la afinidad por O2 causan morbilidad en los heterocigotos. En muchos casos, la funcin de la hemoglobina est tan deteriorada que el estado homocigoto sera incompatible con la vida. Como es de suponer, los estados homocigotos han sido encontrados entre variantes con alta
frecuencia gnica, tales como S, C y E y entre algunas con moderadas frecuencias gnicas como D Los Angeles, O Arab y Korle-Bu. La existencia de otras variantes menos frecuentes presentadas en forma homocigota, son el pr oducto de matrimonios con alta consanguinidad. Debido a que un individuo hereda slo 2 genes de cadena , una variante de cadena funcionalmente anormal constituye la mitad de la hemoglobina total en el eritrocito y por lo tanto es posible que contribuya en forma significativa a la funcin del glbulo rojo. En contraste, las variantes de cadena generalmente constituyen slo el 25% de la hemoglobina total y es mucho menos probable que causen deterioro significativo de la funcin del glbulo rojo. Esta consideracin explica el porqu 50% de las variantes de cadena se asocian con manifestaciones clnicas, comparados con slo 20% de las variantes de cadena . Slo en forma ocasional, las variantes de hemoglobinas se originan como mutaciones espontneas. Las mutaciones espontneas se presumen que se originan a nivel de la clula germinal en una etapa tarda de su desarrollo. Variantes estructurales de hemoglobina tambin se han encontrado en los otros dos genes de globina, esto es y . La menor cantidad de variantes de cadena detectadas se debe fundamentalmente a que la Hb F rara vez es detectable despus de los 6 meses de vida. As tambin las variantes de cadena pueden escapar a la deteccin debido a que estn presentes en pequeas cantidades (1-2%). En trminos generales ningn significado funcional ha sido adscrito a las variantes de cadena , con la excepcin de la Hb F-Cincinnati (41GPhe Ser) que cursa con cianosis, Hb F-Onoda (146G His Tyr) que posee aumento de la afinidad por O2, Hb F-Poole (130G Trp Gly) que es una variante inestable y que cursa con anemia hemoltica al igual que la Hb F-Xinjiang (25 AT Gly Arg) 1 , 1 y Hb FM-Fort Ripley (92G His Tyr) y Hb F-M Osaka (63G His Tyr) que cursan con metahemoglobina y cianosis neonatal. 3.3.3. Clasificacin Las hemoglobinas patolgicas puede pueden clasificarse desde distintos puntos de vista, sea por su trastorno gentico, sus manifestaciones clnicas, su patologa molecular, su comportamiento electrofortico, sus propiedades funcionales y qumicas o su origen geogrfico.
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a) clasificacin segn el trastorno gentico Sustitucin de una nica base. De la larga lista publicada de hemoglobinopatas, la gran mayora, ms del 95% corresponden a reemplazos de un nico aminocido en la cadena polipeptdica de globina. La alteracin estructural puede ser explicada por la sustitucin de una sola base en el codn correspondiente para el DNA de globina. Unas pocas variantes poseen reemplazos aminoacdicos en dos sitios diferentes de la misma subunidad. Estas variantes se pueden originar por una mutacin nueva sobre un gen con una variante preexistente, o bien por entrecruzamiento entre dos genes variantes. As por ejemplo, la Hb C Harlem podra haberse originado por un entrecruzamiento entre genes que codifican para S y Korle Bu. Solamente 4/5 de las posibles mutaciones (1690 de 2583 posibles mutaciones) pueden producir un cambio de aminocido, debido a la capacidad de los distintos tripletes de nucletidos de codificar el mismo aminocido. Adems de aquellas que pr ovocan un cambio de aminocido, solamente 1/3 (575) ocasionaran variacin en la carga elctrica de la molcula y por tanto las variantes seran identificadas en la electroforesis, en el resto de ellas la sustitucin sera neutra desde el punto de vista elctrico, pudiendo en algunas ocasiones ser detectada mediante HPLC. Mutacin con desplazamiento del marco de lectura (Frame shift mutation). El desplazamiento en la lectura del cdigo gentico puede ser producido por una delecin o bien adicin de una base nitrogenada, que crea a nivel de la misma un desplazamiento en la disposicin de los tripletes y con ello la aparicin de nuevos codones de lectura completamente diferentes. Un ejemplo de desplazamiento de lectura es la Hb Wayne, producida por delecin de una base nitrogenada a nivel del triplete AAA (lisina) en la posicin 139 de la cadena . Otro ejemplo por adicin es el de la Hb Cranston al aadirse dos nuevas bases nitrogenadas (AG) al codn AAG en la posicin 144 de la cadena .
Deleciones e inserciones sin desplazamientos en la lectura. Estas mutaciones se producen por la prdida o adicin de codones completos, por lo cual no se producen desplazamientos en la lectura y el resto de los aminocidos no difieren de los normales. Habitualmente se comportan como hemoglobinas inestables, y la subunidad puede ser ms corta como en el caso de la Hb Gun Hill (por delecin de los residuos 91 a 95 en la cadena ), o ms larga (por adicin de 3 aminocidos en la cadena ) como en la Hb Grady. Fusin de genes. Los ejemplos ms caractersticos son las Hb Lepore (con fusin ) y la Hb Kenya (fusin ). Sustitucin de una base en el codn de terminacin de la cadena. Un ejemplo clsico es la Hb Costant-Spring, donde al haber una mutacin en el codn terminal (UAA, AUG o UGA), contina la lectura donde debera terminar. Se obtiene de este modo una protena con 31 aminocidos ms que la cadena normal. Mutaciones que provocan la finalizacin precoz de la cadena: Esta situacin se ha descrito en una variante donde faltan los dos residuos finales de la cadena , siendo el resto de la cadena absolutamente normal. Es el caso de la Hb Mc Kees Rocks, producida por una mutacin de A o G por U en la tercera base del codn UAU que codifica para tirosina en la posicin 145, producindose un codn de terminacin (UAA o UAG). Estas mutaciones slo son viables si se producen despus de los residuos de unin con el hemo. La Hb Mc Kees Rocks posee un importante aumento de la afinidad por el O2 cursando con una eritrocitosis an en el estado heterocigoto, alcanzando niveles de hematocrito de 50-64%. b) Clasificacin clnica La larga lista de variantes de hemoglobina humana, de las que a la fecha han sido descubiertas ms de 800, resultan fciles de comprender si stas son clasificadas de acuerdo a sus manifestaciones clnicas (tabla 8-8).
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Tabla 8-8. Clasificacin clnica de las hemoglobinopatas estructurales Asintomticas (Son la mayora) Portadores de Hb S (en condiciones muy especiales pueden dar sntomas) Hb C Hb D Hb E Anemia hemoltica Sndrome de falciformacin (Enfermedad de clulas falciformes ) SS SC SD Los Angeles SO Arab S talasemia Hemoglobinas inestables Poliglobulia Hemoglobinas con alta afinidad por el O2 Eritrocitosis familiar. Cianosis familiar Hemoglobinas con baja afinidad por el O2 Hb Kansas Hb Beth Israel Hb St. Mand Hemoglobinas M Metahemoglobinas M- Boston M- Saskatoon M- Milwaukee-1 M- Iwate M- Hyde Park M- FM Osaka Variantes estructurales que se expresan con fenotipo talasmico Fenotipo de Talasemia Hemoglobinas Lepore Procesamiento anormal de mRNA: Hb E, Hb Knossos Inestabilidad extrema: Hb Indianpolis. Fenotipo de Talasemia Mutantes de terminacin de cadena Hb Constant Spring Hb Icaria Hb Seal Rock Hb Koya Dora Inestabilidad extrema Hb Quong Sze
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La mayor parte de las variantes conocidas no se asocian con manifestaciones clnicas aparentes. Muchas de ellas fueron descubiertas en forma accidental o en el curso del estudio de grandes poblaciones. En poblaciones donde no estn presentes las variantes estructurales ms frecuentes, como S, C o E, un individuo de cada 800 posee una variante estructural que puede ser detectada mediante electroforesis. Sin embargo, del total de mutaciones posibles, solamente un tercio produce cambios en la carga elctrica que permitan su separacin con la electroforesis, el resto de ellas presentan propiedades electr oforticas nor males con medios convencionales. G. Martn describe una incidencia de hemoglobinopatas estructurales de 1,47 / 1000, en un estudio realizado en 4.750 recin nacidos en la regin de la Alta Extremadura. La presencia de ciertas variantes da tambin luces en cuanto a la gentica poblacional y al estudio de migraciones. Cuando las hemoglobinopatas estructurales presentan sntomas, stos pueden ser de cianosis, eritrocitosis y hemlisis, recalcando no obstante que la mayora de las variantes carecen de manifestacin clnica. c) Clasificacin segn la patologa molecular Las manifestaciones clnicas de las hemoglobinopatas estructurales pueden llegar a entenderse mejor, si se correlaciona con el lugar que ocupa el aminocido sustituido. Segn sea el lugar que ocupe y el tipo de aminocido cambiado en la molcula, ser la alteracin que cause en la estructura y funcin de la molcula. En la mayora de los casos este cambio no se manifiesta al no afectar a la carga, la estabilidad o la funcin, sin embargo, si se produce en una parte crtica de la misma que altere sus propiedades fsicas, podran originar un trastorno clnico de severidad variable. Al respecto, se consideran 3 grandes grupos: Sustitucin de un aminocido externo (Polar) en la superficie de la molcula. Solamente en algunos casos da lugar a anemia hemoltica y cuando est en su forma homocigota. Los ms frecuentes son las Hb S, C, D y E. Sustitucin de un aminocido interno (No
polar). En trminos generales la sustitucin de un aminocido interno resulta siempre en una anomala severa, tanto en la estructura como en su funcin. Dentro de este grupo se generan los grandes subgrupos: Hemoglobinas inestables, Metahemoglobinas y Hemoglobinas con afinidad alterada por el O2. La sustitucin puede ser de un aminocido hidrofbico por otro de igual caracterstica, siendo menos grave que si el reemplazo es de un hidrofbico por un hidroflico, cuyo cuadro hemoltico es ms intenso. Cambios en las zonas de contacto entre subunidades (11) y (22). Estos cambios pueden debilitar la molcula de hemoglobina, hacindola inestable y en otros casos puede alterar la colaboracin hemo-hemo y aumentar o disminuir la afinidad de la molcula por el O2.
3.3.4. Variantes de hemoglobina ms comunes a) Hemoglobina S (6 [A3] Glu Val) La prevalencia ms alta de Hb S est en el Africa tropical y entre los habitantes de raza negra o mestizos de aquellos pases que participaron en la trata de esclavos. Ocurre con baja frecuencia en la cuenca del mediterrneo, Arabia Saudita y regiones del subcontinente Indio. Los resultados de estudios de polimorfismos del DNA sugieren que se origina de tres mutaciones indepedientes en el Africa tropical. La mutacin ms frecuente se encuentra en Benn (cercano a Nigeria), Africa Central Occidental. Un segundo haplotipo es prominente en Senegal y la costa africana occidental y el tercer haplotipo en la Repblica Centroafricana. Estos mismos haplotipos se asocian con el gen S en negros norteamericanos y jamaicanos. Slo los haplotipos de Benn y Senegal son prevalentes entre norteafricanos, griegos e italianos, sugiriendo que la mutacin S se disemin a esos pases desde el Africa Occidental . En algunas partes de Africa hasta el 45% de la poblacin posee el rasgo falciforme. En los Estados Unidos de Amrica, Amrica Latina y el Caribe, aproximadamente 8% de los negros poseen el rasgo. Toda la abundante informacin existente seala que la distorsin de las clulas que contienen Hb S, sea la forma de hoz y la alteracin de membrana por deshidratacin, es el resultado de la polimerizacin de la hemoglobina,
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provocando una disminucin en la solubilidad y un aumento de la viscosidad en el estado oxigenado. El equilibrio de Hb S entre sus fases lquida y slida est determinada por cuatro variables: tensin de oxgeno, concentracin de Hb S, temperatura y presencia de otras hemoglobinas adems de la Hb S. El ms importante determinante fisiolgico de la gelificacin de la Hb S es el O 2 . La polimerizacin ocurre solamente con la desoxigenacin. Con la desoxigenacin la afinidad de la Hb S por el O2 cae, estabilizando as el estado desoxi. Tanto el aumento del 2-3 DPG como una disminucin del pH disminuyen la afinidad de la hemoglobina por O2, facilitando tambin la polimerizacin de la Hb S. Existe una correlacin positiva entre la concentracin de Hb S y la gelificacin. Bajo condiciones de laboratorio controladas, la gelificacin ocurre a medida que la concentracin de desoxi-hemoglobina S se eleva sobre 20,8 g/dL. Debido a que la temperatura requerida para que ocurra este fenmeno es bastante menor que el rango fisiolgico, el significado de esto slo se limita al estudio de laboratorio. La influencia de otras hemoglobinas en la polimerizacin de la Hb S es variable. Tanto la Hb A como la F tienen un efecto inhibitorio en la gelificacin . Las molculas de desoxihemoglobina S se copolimerizan ms efectivamente con otras molculas de Hb S, y en orden descendente con Hb C, D, O Arab, A, J y F. Estas observaciones in vitro predicen la severidad clnica de desrdenes que comprometen a estas variantes. El portador heterocigoto no padece manifestaciones clnicas excepto en situaciones especiales. En la electroforesis de hemoglobina y en isoelectroenfoque aparecen dos bandas, la Hb A y la Hb S (40% aproximadamente). En el estudio mediante HPLC de hemoglobinas en fase reversa se observa un doble pico en la cadena , eluyendo S entre 1 y 2 minutos luego de A. En el estado homocigoto (SS) no aparece Hb A y el cuadro clnico, aunque se reconoce que hay una gran diferencia en su severidad, suele ser grave, lo que se denomina enfermedad de clulas falciformes y se caracteriza por: (a) anemia hemoltica crnica, (b) manifestaciones
sistmicas que incluyen retraso del crecimiento y desarrollo con mayor susceptibilidad para las infecciones, (c) crisis dolorosas vaso-oclusivas y (d) dao orgnico consecuencia de las crisis oclusivas y de la anemia crnica. b) Hemoglobina c (6 [A3] Glu Lys) El reemplazo de lisina por cido glutmico en la sexta posicin de la cadena da lugar a una variante con carga positiva que le confiere una lenta movilidad electrofortica, tanto a pH cido como alcalino. Aunque la Hb C no se puede separar de la Hb A2 por tcnicas electroforticas, su separacin es posible con la utilizacin de cromatografa en columna. La variante fue reconocida por vez primera en Detroit, en un emigrante de la costa occidental africana. Aunque hay menos evidencia que en el caso de la Hb S, la distribucin de la Hb C en Africa sugiere que tambin se ha desarrollado como un medio de proteccin contra la malaria. El estado heterocigoto se ha detectado en 2-3% de los negros americanos y el homocigoto afecta aproximadamente a 1/5000 de ellos. As como la Hb S, la Hb C ha sido detectada tambin en individuos que no tienen ancestros africanos. Rasgo de Hemoglobina C (Hb C). El estado heterocigoto para Hb C es clnicamente silente. Aunque la concentracin de hemoglobina est dentro del amplio rango de lo normal, el valor promedio para este grupo de sujetos es claramente bajo. La masa de glbulos rojos y la sobrevida de los mismos tambin puede estar disminuida. Enfermedad por Hemoglobina C (Hb CC). La enfermedad por Hb C es un trastorno de moderada severidad. El crecimiento y desarrollo son apropiados y el embarazo y la ciruga son bien tolerados. El bazo est crecido en el 90% de los individuos afectados, habindose reportado tambin la ruptura espontnea del rgano. La funcin del bazo es nor mal. Como en otr os desrdenes hemolticos existe colelitiasis con mayor frecuencia. La anemia es de moderada severidad, con hematocrito de alrededor de 33%. La morfologa eritrocitaria es marcadamente anormal con prominencia de dianocitos (90% o ms), esferocitos ocasionales y clulas distorsionadas.
El acortamiento en la sobrevida del glbulo rojo pr obablemente est relacionada a la disminucin en la solubilidad de la desoxihemoglobina C, una consecuencia de
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interacciones electrostticas entre grupos amino -6 cargados positivamente y grupos cargados negativamente en molculas adyacentes. Los agregados intracelulares de hemoglobina limitan la deformabilidad celular aumentando la viscosidad inter na, predisponiendo a fragmentacin, formacin de esferocitos y secuestro esplnico. El diagnstico descansa en el anlisis electrofortico de la hemoglobina. La mayor fraccin es Hb C, la Hb A est ausente y la Hb F levemente aumentada. El estudio mediante HPLC, tanto de fase reversa (donde C eluye por delante de A) como de intercambio catinico, donde la Hb C eluye al final del cromatograma, son de bastante ayuda. Enfermedad por Hemoglobina SC. El desorden conocido por este nombre resulta de la herencia de un gen S de un padre y un gen C del otro. Los eritrocitos contienen aproximadamente igual cantidad de las 2 hemoglobinas. La Hb A est ausente y la Hb F es normal o levemente aumentada. Ocurre con una frecuencia aproximada de 1 en 833 entre el grupo de negros americanos y 1 en 1400 en Jamaica. En Ghana la enfermedad por Hb SC es tan prevalente como la anemia de clulas falciformes, y en algunas regiones afecta hasta el 25% de la poblacin. Las manifestaciones clnicas de la enfermedad por Hb SC son similares, pero menos severas que las de la anemia de clulas falciformes (SS). Los sntomas durante el primer ao de vida son raros y 1/4 de los individuos afectados per manecen asintomticos durante la primera dcada de la vida. El sntoma ms comn es el dolor abdominal episdico y el dolor esqueltico, cualitativamente similares a aquellos eventos vaso-oclusivos de la anemia de clulas falciformes. El bazo est crecido en alrededor de 2/3 de los nios, y aunque la perfusin de rganos est intacta su funcin est comprometida, siendo de menor cuanta, ms gradual y a edades ms tardas que en la anemia de clulas falciformes. Debido a la frecuencia con la cual ocurren, tres complicaciones de la enfermedad por Hb SC poseen especial importancia: (a) Retinopata proliferativa: es ms comn y ms severa que en la anemia de clulas falciformes, pudiendo afectar hasta 1/3 de la poblacin; (b) necrosis asptica de la
cabeza femoral: tambin se presenta con ms frecuencia que en la Hb SS, y (c) sndrome torcico agudo: por embolia grasa luego del infarto de mdula sea ocurre ms comnmente durante los meses finales del embarazo. La exagerada vulnerabilidad de individuos con Hb SC a estas complicaciones se piensa que es debido a la mayor viscosidad relativa de la sangre. La anemia es moderada o inexistente, slo 10% de los individuos con enfermedad por Hb SC tienen una concentracin de hemoglobina menor de 10 g/dL. El VCM puede estar disminuido y la CHCM puede estar aumentada por deshidratacin celular. El frotis de sangre perifrica contiene a lo menos 50% de dianocitos. c) Hemoglobina d (D-Los Angeles; D-Punjab): 121 [GH 4]Glu Gln La Hb D tiene una movilidad electrofortica idntica a la Hb S a pH alcalino. Se distingue de la Hb S por su solubilidad normal, una movilidad electrofortica en gel de agar a pH cido claramente diferente. No produce falciformacin. Las pr opiedades electr oforticas y de solubilidad de la Hb G son tan similares a la D, que las dos generalmente no se diferencian por estas tcnicas. Existen al menos 11 variantes de cadena y seis variantes de cadena que tienen las caractersticas electroforticas y de solubilidad de las hemoglobinas D y G. La Hb D-Punjab, tambin denominada Hb DLos Angeles, es lejos la ms comn de las variantes de Hb D, presentndose en una frecuencia de 1-3% de la poblacin de la regin occidental de la India y en pequeo nmero en comunidades europeas que tienen lazos coloniales con aquel pas. En Norteamrica la variante ms prevalente es la Hb G-Philadelphia, una anormalidad de cadena encontrada especialmente en negros. Rasgo de Hemoglobina D (AD). El estado heterocigoto no se asocia con manifestaciones clnicas ni hematolgicas. Personas con Hb AD son identificadas a travs de programas de screening para Hb S, y salvo que se realicen otras tcnicas de laboratorio para el diagnstico diferencial se confunde fcilmente con Hb S. Enfermedad por Hemoglobina D (DD). Se caracteriza por moderada anemia hemoltica y esplenomegalia. La electroforesis de
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hemoglobina muestra 95% de Hb D y cantidades normales de Hbs F y A2. Enfermedad por Hemoglobina SD. De las 16 variantes sealadas que cumplen con los criterios de Hbs D y G, a la fecha 9 de ellas se ha reconocido que se asocian con Hb S. Con slo una excepcin (Hb D-Punjab), los estados de doble heterocigoto para Hb S, D o G son clnicamente silentes. La Hb DPunjab interacta con la Hb S produciendo anemia hemoltica de mediana intensidad y sntomas moderados que simulan la anemia de clulas falciformes. Gran parte de estos individuos son de origen africano.
acortamiento de la sobrevida del glbulo rojo puede resultar en parte por inestabilidad de la Hb E, una propiedad atribuida a la tendencia de los dmeros E a disociarse en monmeros, exponiendo as los grupos SH reactivos. e) Hemoglobina OARAB: (121 Glu Lys) Se denomina as, debido a que el primer caso se identific en un nio rabe y en asociacin con Hb S. Tambin ha sido encontrada en negros americanos, Jamaica, Sudn, Arabia Saudita, Yugoslavia, Bulgaria, Egipto y Grecia. Esta variante probablemente es originaria de Africa y emigr hacia el Medio Oriente. Tiene una movilidad electrofortica similar a la Hb C a pH alcalino, pero se desplaza con la Hb S en agar citrato a pH cido. El estado heterocigoto y el doble heterocigoto para Hb O Arab y C son clnica y hematolgicamente normales. Hemoglobina O Arab homocigota. Se caracteriza por moderada anemia hemoltica asociada a esplenomegalia. El frotis de sangre perifrica adems de mostrar las caractersticas morfolgicas de eritropoyesis acelerada contiene abundantes target cells. Enfermedad por Hemoglobina S- OArab. Este doble estado heterocigoto es clnica y hematolgicamente indistinguible de la anemia de clulas falciformes. Asplenia funcional ocurre a una edad precoz y es seguido por infartos esplnicos progresivos.
d) Hemoglobina E: (26 [B8] Glu Lys) Es la segunda variante estructural ms prevalente en el mundo. De los 30 millones de personas que se estima que poseen este trastorno, ms del 80% viven en el sudeste asitico. La diseminacin de la variante a Norteamrica se debi a la inmigracin Indochina a los Estados Unidos hacia el final de la dcada de los 70. La incidencia de Hb E entre los nios refugiados alcanza hasta el 19%. La movilidad electrofortica de la Hb E es similar, aunque ligeramente ms rpida que la Hb C a pH alcalino. Puede diferenciarse de la Hb C mediante electroforesis a pH cido, desplazndose junto con la Hb A , y es inestable frente a oxidantes. Los sndromes por Hb E se asocian con marcada microcitosis e hipocroma, simulando un sndrome talasmico. El estado de doble heterocigoto para Hb E y talasemia se caracteriza clnicamente por talasemia mayor. Rasgo de Hemoglobina E (AE). Aun cuando es clnicamente silente se asocia con microcitosis (VCM 65 fL), leve eritrocitosis y presencia de clulas en diana. La cuantificacin de hemoglobina mediante electroforesis o HPLC de intercambio inico revela 20% de Hb E. La proporcin relativa de Hb E est reducida posterior mente por la coexistencia con talasemia y deficiencia de hierro. Enfermedad por Hemoglobina E (EE). Se caracteriza por microcitosis prominente (VCM 55-65 fL) y alteraciones morfolgicas significativas (dianocitos, leptocitosis) pero sin anemia o anemia escasa. No se encuentran alteraciones fsicas, salvo leve esplenomegalia. La Hb E compromete el 92% a 98% del total de hemoglobina. La Hb F est normal o ligeramente aumentada. El
f) Hemoglobinas inestables Su caracterstica principal es la precipitacin de la variante inestable, lo que produce una anemia hemoltica crnica secundaria al dao de la membrana con la formacin de cuerpos de Heinz. Algunas son tan inestables que precipitan completamente en los hemates casi despus de sintetizarse, ejemplos de stas son: Hb Bristol, Hb Castilla y Hb Hammersmith. Otras son menos inestables, incluso slo in vitro, como la Hb Hofu, por lo cual el trmino de Hemoglobina inestable se reserva para aquellas variantes cuya inestabilidad es lo suficiente como para causar clnica de hemlisis. A pesar del gran nmero de variantes inestables descritas, la enfermedad por hemoglobinopata inestable es rara. Lejos la ms comn de las
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variantes inestables es la Hb Kln, que tiene una amplia distribucin a travs del mundo. La Hb Hammersmith ha sido reportada en pacientes de China y Japn como tambin del Reino Unido. Gran parte de las variantes inestables han sido demostradas slo en individuos aislados. La enfermedad por hemoglobina inestable se expresa totalmente en su estado heterocigoto, por lo tanto el patrn de herencia es autosmico dominante. En una variedad de casos diagnosticados los padres de los casos ndices eran normales, indicando que haba ocurrido una mutacin espontnea, y en stos se observa que evolucionan con un cuadro hemoltico severo. Defecto molecular Las hemoglobinas inestables son un grupo muy heterogneo dependiendo del grado de afectacin de la molcula, de la posicin que ocupe la mutacin y del tipo de aminocido cambiado. Se pueden agrupar de la siguiente forma: Aquellas que debilitan las uniones del hemo con la globina. Como se ha sealado previamente la unin del hemo a la globina contribuye a estabilizar la estructura terciaria de la molcula. El hemo se inserta en una hendidura hidrofbica en la superficie de la subunidad contactando con algunos aminocidos no polares en las regiones CD, E, F y FG, aminocidos que son invariables a lo largo de la evolucin de los mamferos. El debilitamiento de estas uniones puede generarse por: Sustitucin de un aminocido en la cavidad del hemo. Supone la prdida de un puente entre ambos como ocurre en la Hb Sydney (67 [E11] Val Ala), porque al ser la alanina menor que la valina, aumenta la distancia con el hemo debilitando su unin. Sustitucin de aminocidos no polares por polares en el interior de la subunidad. Las subunidades de globina estn dobladas de tal for ma que todos los aminocidos cargados, tales como lisina, arginina , cido glutmico y cido asprtico se ubican en la superficie de la molcula, permitiendo a sus grupos ionizados ponerse en contacto con el agua. En contraste, los residuos orientados
hacia el interior tienen grupos no polares, estabilizando el interior de la molcula por interacciones hidrofbicas. El cambio de uno de estos aminocidos permite la entrada de agua y la formacin de metahemoglobina. Un ejemplo es la Hb Estambul (92 [F8] His Gln). La ausencia de este aminocido que est directamente unido al hemo provoca la ruptura del puente y la prdida del grupo. Aproximadamente un tercio de las variantes inestables incluyen la sustitucin de un aminocido cargado. Deleciones de aminocidos: lo que puede condicionar dependiendo de su situacin, la unin con el hemo, as por ejemplo la Hb Gun Hill 91-95 [F7-FG2] incluye la prdida de la histidina en posicin 92 y por tanto la prdida del hemo. Aquellas que distorsionan la estructura del tetrmero. Cada una de las cadenas de globina establecen puentes de unin con las cadenas homlogas y no homlogas como ya se seal previamente. El cambio de un aminocido por otro en estas zonas puede sugerir la distorsin del tetrmero formando dmeros o monmeros con inestabilidad variable. Las mutaciones que afectan la interfase 11 (Hb Khartoum, Philly y Tacoma) por lo general son ms inestables que aquellas que afectan los sitios de contacto 12. Las cadenas de globina aisladas y los dmeros son vulnerables a la oxidacin con formacin de hemicromos. La formacin de hemicr omos es seguido por la precipitacin de hemoglobina y cadenas aisladas. Aquellas que alteran la estructura helicoidal de las globinas. La secuencia primaria de una pr otena es la que determinar, fundamentalmente, cmo se ordenar su estructura secundaria. Algunos residuos tienen mayor facilidad que otros para formar una hlice . As, la prolina que al carecer de un grupo amino libre, ya que lo tiene unido a su cadena lateral formando un anillo, le impide formar un puente H2 con otro aminocido, por lo que su presencia interrumpe la estructura helicoidal (que slo se conserva si la prolina ocupa una posicin extrema en la hlice esto es entre los 3 primeros aminocidos). En consecuencia el cambio de un aminocido de la hlice por una prolina distorsionar la estructura helicoidal cuya gravedad depender del punto donde ha tenido lugar la sustitucin
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en el segmento helicoidal. Mecanismo de hemlisis El acortamiento de la vida media del eritrocito est mediado fundamentalmente por 2 procesos: formacin de cuerpos de Heinz y dao oxidativo a la estructura lipoproteica de la membrana. La secuencia de eventos involucrados es la conversin oxidativa de la hemoglobina a hemicromos y la precipitacin de estos ltimos para formar cuerpos de Heinz. Estos se unen a las membranas celulares por enlaces hidrofbicos, limitando la deformabilidad celular y aumentando la per meabilidad de la membrana. Los cuerpos de Heinz son removidos selectivamente por el bazo, fenmeno que contribuye directamente al proceso hemoltico, dejando adems glbulos rojos con viabilidad reducida. El papel del dao oxidativo a las membranas no relacionado con la formacin de cuerpos de Heinz est peor caracterizado. Biosntesis La proporcin relativa de hemoglobina inestable en los heter ocigotos es, en general, considerablemente menor que la de las variantes estables. Las variantes inestables de cadena constituyen menos del 30% del total de hemoglobina y las variantes inestables de cadena menos del 20%. Los bajos niveles de hemoglobinas inestables son debidos con mayor probabilidad a prdida de la cadena mutante de globina en la etapa post-traduccin. La explicacin ms probable es que el bajo nivel de hemoglobina inestable resulta de proteolisis de las cadenas anormales de globina antes de su incorporacin en los tetrmeros de hemoglobina. Herencia Es similar al de las dems hemoglobinas estructurales. Hasta la fecha no se han reportado estados homocigotos, pero s con relativa frecuencia casos debidos a una mutacin espontnea. Como prcticamente todos dan sntomas, su diagnstico es relativamente fcil. Clnica A la fecha se han descrito 139 variantes inestables, siendo 33 de ellas (24%)
asintomticas y sin anor malidades hematolgicas. Once variantes causan enfermedad hemoltica severa y se expresan clnicamente en el primer ao de vida. Gran parte de ellas son variantes de cadena y se van expresando progresivamente a medida que la sntesis de Hb F disminuye. Gran parte de estas variantes que producen enfermedad severa parecen haberse originado como mutaciones de novo. En estas variantes la concentracin de hemoglobina es menos de 7 g/dL, el recuento reticulocitario mayor del 30% y la esplenectoma no produce alivio de la sintomatologa. Quince variantes producen una enfermedad hemoltica de moderada severidad y que se beneficia sustancialmente con la esplenectoma. La deteccin del desorden habitualmente se retrasa hasta la infancia tarda o adolescencia. Al examen fsico generalmente se encuentra ictericia inter mitente, esplenomegalia y sntomas de colelitiasis. La gran mayora de las variantes inestables producen enfermedad hemoltica leve, con anemia ausente o de grado moderado, reticulocitos entre 4 y 10%, esplenomegalia generalmente ausente. En general, el diagnstico se establece durante una crisis hemoltica. Varias hemoglobinas inestables no se asocian con anormalidades hematolgicas. Gran parte de ellas se detectaron en programas de screening. No tienen significado clnico. Las crisis hemolticas ocurren caractersticamente durante el curso de enfermedades febriles. Es muy probable que la fiebre de por s sea el factor precipitante ms comn. La termolabilidad de muchas de las hemoglobinas inestables predisponen a la formacin de cuerpos de Heinz, aun con discreta elevacin de la temperatura. En algunas hemoglobinas inestables se ha demostrado la relacin de ciertas drogas oxidantes con el desarrollo de crisis hemolticas. Para muchas de las variantes inestables los sntomas clnicos de anemia no se correlacionan con la concentracin de hemoglobina, fundamentalmente debido a diferencias en la afinidad de las distintas variantes por el O2. Algunas de ellas tienen baja afinidad, permitiendo una oxigenacin tisular ms eficiente. Otras variantes inestables se caracterizan por aumento de la afinidad por O2
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y son muy susceptibles a la hipoxia tisular si se agregan enfermedades que deterioran an ms la entrega de O2. Algunas variantes inestables pr edisponen a la for macin de metahemoglobina, produciendo cianosis, entre stas se pueden sealar: Hb Freiburg, Hb St Louis y Hb Chile. Diagnstico Se realiza al estudiar una anemia hemoltica no esferoctica congnita. Su diagnstico se basa en el test de desnaturalizacin por calor y el test de isopropranol. El test de desnaturalizacin o de estabilidad con el calor resulta positivo en prcticamente todas las variantes excepto la Hb Bryn Mawer, tambin conocida como Hb Buenos Aires y Hb Indianapolis, donde la cantidad de hemoglobina anormal es menor al 2% del total de hemoglobina. Por su simplicidad y sensibilidad, el test del isopr opranol es el pr ocedimiento de screening preferido, sin embargo los resultados falsos positivos son comunes especialmente si el espcimen ha sido almacenado o posee Hb F mayor del 4%. La adicin de cianuro de potasio reduce el nmero de resultados falsos positivos y los efectos del almacenamiento se minimizan si los especmenes se guardan como sangre total ms que como hemolizados y a 4C de temperatura. La electroforesis puede ser de ayuda en caracterizar una hemoglobina inestable an cuando muchas variantes tienen un patrn electrofortico normal. La HPLC es de indudable valor diagnstico. Sin embargo, la identificacin precisa de una hemoglobina anormal requiere anlisis del DNA. La mayora de los pacientes no requieren tratamiento. Aquellos con hemlisis severa se benefician con el aporte de cido flico y el tratamiento oportuno de las infecciones. Debe evitarse el uso de drogas oxidantes y prevenir la hipertermia. Algunos casos se benefician con esplenectoma, lo cual requiere la identificacin precisa de la variante. g) Variantes de hemoglobina con propiedades de transporte de oxgeno alterado Las propiedades de transporte de O2 de la hemoglobina puede alterarse principalmente por dos vas: (a) sustitucin de un aminocido
prximo al anillo del hemo produciendo una metahemoglobina (Hemoglobinas M), y (b) cambio de aminocidos en otros lugares que provoquen aumento o disminucin de la afinidad por el O 2 con el resultado de policitemia o cianosis, respectivamente. Variantes con alta afinidad por el O2 La mayora de las variantes con alta afinidad tienen sustituciones en una de las tres regiones que son fundamentales para la funcin de la hemoglobina: la interfase 1-2, el C-terminal de la cadena , el lugar de unin para el 2-3 DPG. Muestran un desplazamiento primario de la curva de saturacin de la hemoglobina hacia la izquierda, provocando hipoxia tisular cuyo mecanismo de adaptacin se manifiesta como una poliglobulia. Esta poliglobulia es familiar, heredada con carcter autosmico dominante, exceptuando algn caso de mutacin espontnea. Gran parte de los casos son asintomticos. Su diagnstico se realiza al estudiar un paciente que se presenta con eritrocitosis. El recuento de leucocitos y plaquetas habitualmente es normal, y el frotis de sangre perifrica es normal. Durante la evaluacin inicial debe descartarse otras posibilidades diagnsticas de poliglobulia, como la proliferacin eritroide autnoma (Policitemia Rubra Vera) y aquellas que producen proliferacin eritroide secundaria, sea por aumento inapropiado en la secrecin de eritropoyetina (neoplasias, lesiones renales) o por aumento apr opiado (hipoxemia). En una primera etapa se realiza una electroforesis de hemoglobina. Si sta revela una banda anormal el diagnstico est virtualmente establecido. Sin embargo si no se demuestra anor malidades sea en electroforesis o isoelectroenfoque, por ningn motivo se puede descartar el diagnstico. Slo alrededor de la mitad de las variantes de hemoglobina de alta afinidad pueden ser separados de la Hb A por electroforesis en gel de acetato de celulosa a pH de 8,6. Algunas variantes pueden detectarse si se utilizan otros tipos de electroforesis como agar citrato a pH de 6,0 o bien HPLC, que es al momento actual un mtodo altamente sensible para la deteccin de variantes estructurales de hemoglobina.
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Sin embargo la nica forma de establecer definitivamente el diagnstico de una variante con alta afinidad por el O 2 es realizando la medicin de la capacidad de enlace de la hemoglobina con el O 2 , logrando demostrar una desviacin hacia la izquierda de la curva de disociacin de la hemoglobina con el 2-3 DPG normal (ya que el descenso de este fosfato provoca igual fenmeno). Cuando hay sospecha se realiza como mtodo de despistaje una curva espectrofotomtrica de unin del O2 con el hemolizado despr ovisto de fosfatos orgnicos, revelando en el espectro visible la pr esencia de metahemoglobina o carboxihemoglobina y en su ausencia una alteracin significativa en la unin con el O2, ello es diagnstico de la presencia de una variante de hemoglobina funcionalmente anormal. Variantes con baja afinidad por el O2 Bajo este punto se incluyen a aquellas variantes estables de hemoglobina que muestran como sntoma fundamental la cianosis, saturacin arterial de O2 muy baja con PO 2 nor mal y afinidad por el O 2 disminuida. Estas caractersticas presentan entre otras las siguientes hemoglobinas: Hb Kansas (102 [G4] Asn Tre), Hb Beth Israel (102 Asn Ser) y Hb St. Mand (102 Asn Tyr). La mayora de los miembros afectados tiene un nivel de hemoglobina levemente disminuido, probablemente debido a la liberacin de O2 aumentada en los tejidos (desviacin hacia la derecha de la curva de disociacin del O 2 ), con lo cual la oxigenacin tisular es muy eficaz, tolerando mucho mejor la anemia, y reducindose el estmulo para producir eritropoyetina. Las tres variantes de hemoglobina citadas previamente tienen el cambio en el mismo aminocido el 102 asparragina situado en la interfase 12, que normalmente cuando la hemoglobina es oxigenada forma un puente de hidrgeno con el cido asprtico 94, unin que en estas variantes no puede formarse, disocindose ms fcilmente en dmeros , que la oxihemoglobina A. Adems de stas, se han encontrado diversas variantes inestables con baja afinidad por el O2, pero no como sntoma fundamental.
Hemoglobinas M Son un grupo de variantes que ocasionan una for ma de Metahemoglobinemia congnita transmitida de forma autosmica dominante.
La anomala molecular bsica es la sustitucin de una histidina distal o proximal por una tirosina, cuya cadena lateral al ser ms larga alcanza al Fe+2 formando una unin covalente, estabilizndose en su forma oxidada Fe+3. Hasta el momento se han descrito siete tipos en diversas partes del mundo. Seis de ellas muestran el cambio de histidina E7 o F8 por tirosina sea en la cadena , o : Hemoglobina M-Boston: 58 (E7) His Tyr, Hemoglobina MIwate: 87 (F8) His Tyr, Hemoglobina MSaskatoon: 63 (E7) His Tyr, Hemoglobina MHyde Park: 92 (F8) His Tyr, Hemoglobina MMilwaukee: 67 (E11) Val Glu, Hemoglobina FM-Osaka: G63 (E7) His Tyr, y Hemoglobina FM-Fort Ripley: G92 (F8) His Tyr. En la Hb M-Milwaukee, debido a la configuracin helicoidal , el cido glutmico est situado internamente y su cadena lateral al ser suficientemente larga alcanza el grupo hemo, oxidando el tomo de hierro. El equilibrio de O2 de las hemoglobinas M depende de la cadena afectada, ms que de la histidina proximal o distal sustituida. As las de cadena M-Boston y M-Iwate, en las cuales slo la cadena reacciona con el O2 tienen una baja afinidad por el O 2, mientras que las variantes de cadena , en las que slo transportan O2 las cadenas , tienen una P50 prcticamente normal. Los pacientes suelen ser completamente asintomticos, excepto por su cianosis y algunos por poliglobulia. El trastorno puede manifestarse desde el nacimiento si la alteracin est en la cadena , o a partir de los seis meses si est en la cadena . La sangre tiene un color chocolate marrn y en algunos casos discreta hemlisis, si bien la mayora de sus parmetros hematolgicos de rutina son normales. El diagnstico de presuncin de la hemoglobina M se hace por el espectro de absorcin del hemolizado y por la demostracin de su presencia en la electroforesis de hemoglobinas realizadas en condiciones apropiadas,
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especialmente con el hemolizado oxidado con ferricianuro. El diagnstico diferencial debe hacerse con el dficit congnito de Citocromo b5 Reductasa y con la ingesta crnica de oxidantes. Una vez que se ha establecido el diagnstico de presuncin la anomala debe ser identificada estructuralmente por los mtodos habituales.
se producen por una disminucin en la vida media de los glbulos rojos como consecuencia del aumento de la destruccin celular a nivel perifrico. La destruccin inmune de los eritrocitos se inicia con la unin de anticuerpos de clase IgG o IgM a protenas o carbohidratos ubicados en la membrana celular. La destruccin de los eritrocitos puede suceder a nivel intravascular o extravascular, dependiendo si ella ocurre en el torrente circulatorio o fuera de l, respectivamete. El sistema inmune puede atacar a los eritrocitos como consecuencia de un proceso autoinmune o aloinmune, lo que permite clasificar a las AHI en tres grandes categoras: Anemias hemolticas autoinmunes, Anemias hemolticas aloinmunes y Anemias Inducidas por frmacos (ver tabla 89). Los desrdenes inmunohemolticos han sido tambin clasificados de acuerdo a la naturaleza especfica del anticuerpo involucrado.
ANEMIAS HEMOLTICAS EXTRACORPUSCULARES Las anemias hemolticas extracorpusculares pueden ser causadas por mecanismos inmunes o no inmunes. 1. ANEMIAS HEMOLTICAS INMUNES Las anemias hemolticas inmunes (AHI), son un grupo de anemias hemolticas adquiridas, que
Tabla 8-9. Clasificacin de las Anemias hemolticas inmunes Anemias hemolticas aloinmunes Enfermedad hemoltica del recin nacido Reaccin hemoltica transfusional Anemias hemolticas autoinmunes Por anticuerpos calientes Primaria Secundaria Sndromes linfoproliferativos Mesenquimopatas Infecciones virales Enfermedades inmunolgicas Por anticuerpos fros Enfermedad de aglutininas fras Hemoglobinuria paroxstica a frigore Inducidas por frmacos
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La hemlisis puede ocurrir en el interior de los vasos sanguneos (intravascular) o en el sistema fagoctico mononuclear (SFM). Hemlisis extravascular. Los eritrocitos en cir culacin pueden ser recubiertos (sensibilizados) con anticuerpos de clase IgG, IgM y/o IgA. Los eritrocitos sensibilizados pueden ser retirados de circulacin por el SFM del bazo y 100 veces menos eficientemente por las clulas de Kupffer del hgado. En este proceso parecen estar involucrados dos mecanismos: (a) la presencia de macrfagos en el bazo que tiene receptores para la regin Fc de las IgG (FcR), especficamente IgG1 e IgG3, y receptores para el fragmento C3b del complemento, que pueden mediar la fagocitosis directa; y (b) una fagocitosis parcial de la clula, en la cual una porcin de la membrana es removida por el fagocito, provocando una disminucin en la relacin superficievolumen en el eritrocito. Este proceso parece ser el responsable de la formacin de esferocitos, un mar cador mor folgico de las AHI, caracterizados por la pr dida de la deformabilidad propia de los glbulos rojos normales, induciendo su secuestro a nivel esplnico. En la destruccin extravascular de las clulas rojas, prcticamente no se produce liberacin de hemoglobina al plasma, pero producto de la eritrofagocitosis se induce hipertrofia del SFM de hgado y bazo, lo que se traduce en hepatoesplenomegalia. La presencia de fragmentos del complemento en la membrana eritrocitaria (C4b, C2b y C3b), pr oducto de la activacin parcial del complemento acta sinrgicamente con la IgG para generar seales fagocticas potentes que aumentan la tasa de destruccin inmune, constituyendo eficientes amplificadores de esta respuesta inmune. Hemlisis intravascular. La destruccin de los eritrocitos sensibilizados con IgM es mediada por el complemento, involucrando ms componentes de este sistema que los asociados con la hemlisis extravascular que slo llega a la for macin de C3b. La destruccin intravascular mediada por el complemento
ocurre por hemlisis directa producto de la activacin total del complemento que permite la formacin de C5b6789, tambin conocidos como Complejo de ataque de a membranas, que una vez formado es capaz de inducir la formacin de poros en la membrana celular y as su lisis. Este tipo de hemlisis se manifiesta por liberacin de hemoglobina, estromas eritrocitarios y enzimas intracelulares al plasma, provocando hemoglobinemia. Cuando la hemoglobina escapa al plasma se une a la haptoglobina para formar un complejo que previene la excrecin a nivel renal, por lo que la haptoglobina disminuye, el complejo es rpidamente limpiado por el SFM. Cuando la haptoglobina es saturada la hemoglobina remanente es excretada a nivel renal provocando hemoglobinuria, dando una coloracin rosada de la orina. 1.1. Antgenos eritrocitarios Se han descrito ms de 250 antgenos eritrocitarios que se agrupan en 29 sistemas sanguneos, 5 colecciones y 2 series. Los antgenos eritrocitarios residen en molculas de diversa naturaleza qumica y funcin. Algunos de ellos adems de expresarse en glbulos rojos lo hacen en tejidos no eritroides; en la mayora de los casos su rol biolgico es desconocido. La bioqumica y la gentica molecular han permitido establecer la estructura gentica de la mayora de estos antgenos. Desde 1995, la International Society of Blood Transfusion (ISBT) se ha preocupado de establecer y actualizar la nomenclatura y clasificacin de los sistemas sanguneos humanos, basndose en aspectos genticos. Los antgenos for man parte de un sistemas sanguneo cuando su biosntesis est gobernada por slo un gen o un complejo gnico estrechamente ligados en genes homlogos, sin recombinacin gentica (tabla 8-9). Las colecciones de grupos sanguneos estn formadas por antgenos que estn relacionados gentica, serolgica o bioqumicamente, pero no cumplen todos los criterios para conformar un sistema sanguneo.
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Tabla 8-9. Nomenclatura y gentica de los grupos sanguneos N ISBT 001 002 003 004 005 006 007 008 009 010 011 012 013 014 015 016 017 018 019 020 021 022 023 024 025 026 027 028 029 Nombre ABO MNS P Rh Lutheran Kell Lewis Duffy Kidd Diego Yt o Cartwright Xg Scianna Dombrock Colton LandsteinerWiener Chido/Roger Hh Kx Gerbich Cromer Knops Indian Ok Raph John Milton Hagen I Globosido Gil Smbolo ISBT ABO MNS P1 RH LU KEL LE FY JK DI YT XG SC DO CO LW CH/RG H XK GE CROMER KN IN OK MER2 JMH I GLOB GIL N Ags del Sistema 4 43 1 55 21 27 6 6 3 21 2 1 4 5 3 3 9 1 1 7 10 5 2 1 1 1 1 1 1 Producto gnico Glicosiltransferasa Glicoforina A,B Glicosiltransferasa Polipptido D y CcEe Glicoprotena Lutheran Glicoprotena Kell Glicosiltransferasa Glicoprotena Fy Glicoprotena Jk (transporte de urea) Protena Transporte (banda 3) Acetilcolinesterasa Glicoprotena Xga Glicoprotena Sc Glicoprotena Do Aquaporina-1 (CHIP) Glicoprotena LW C4 (complemento) Glicosiltransferasa Glicoprotena Kx Glicoforina C/D CD55(DAF) CD35(CR1) CD 44 CD 147 N-Acetil glucosaminil transferasa Globsido sintetasa Aquaporin- 3 Localizacin cromosmica 9q34.1-q34.2 4q28-q31 22q11-qter 1p36.2-p34 19q13.2 7q33 19p13.3 1q22-q23 18q11.1-q12.2 17q21-q22 7q22 Xp22.32-Yp11.3 1p36.2-p22.1 112p13.2-p12.1 7p14 19p13.3 6p21.3 19q13 Xp21.1 2q14-q21 1q32 1q32 11p13 19p13.3 11p15.5 15q23-q24 6p24 3q13 9p13
Ag1, antgenos
Sistema ABO. El sistema ABO sigue siendo el ms importante en la prctica transfusional. Su especificidad antignica reside en estructuras oligosacridas, sintetizadas por la accin de varias enzimas del tipo glicosil-transferasas que actan secuencialmente sobre el tetrasacrido precursor o paraglobsido. La sntesis de estos antgenos requiere de la accin de enzimas codificadas por genes ubicados en los cromosomas 9 (ABO) y 19 (H). En 1990 se dilucidaron las bases genticas de los tres principales alelos del locus ABO. Los antgenos del sistema han sido identificados sobre glbulos rojos, en secreciones y sobre la membrana de clulas epiteliales y endoteliales. Adems, estructuras antignicas similares han
sido detectadas en diversos organismos tales como microorganismos y plantas. Sistema RH. El sistema Rh es el ms polimrfico e inmunognico de los sistemas sanguneos humanos y el segundo en importancia clnica. Est compuesto por ms de 50 antgenos, los cuales son codificados por dos genes estrechamente unidos, ubicados en el cromosoma 1; uno de ellos codifica la protena RhD que expresa el antgeno D y sus variantes y el otro gen codifica la protena RhCE que expresa los antgenos C, c, E, e y sus variantes. Las protenas RhD y RhCE tienen pesos moleculares que fluctan de 30 a 34 kDa y constan de 417 aminocidos (figura 8-7). Se ha descrito la glicoprotena Rh 50, llamada
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glicoprotena asociada al Rh (RhAG, CD241), codificada por un gen ubicado en el cromosoma 6 y que sera esencial para el ensamblaje de las protenas Rh en la membrana eritrocitaria, as como para la inmunogenicidad de sta. Existe adems un grupo de protenas accesorias del Rh confor madas por un grupo de otras glicoprotenas (glicoprotena LW, glicoforina B, banda 3, protenas asociada a integrinas y glicoprotena Duffy), por esta razn al sistema Rh se le considera como un complejo de protenas Rh.
hemoltica del recin nacido que puede llegar a ser muy severa y mortal. Los dems sistemas sanguneos cobran importancia clnica en la medida en que los anticuerpos desarrollados causen reacciones hemolticas transfusionales o enfermedad hemoltica del recin nacido. Los anticuerpos que ms frecuentemente causan estos cuadros clnicos corresponden a los sistemas Kell, Duffy, Kidd y MNSs. Sistema P (003), Sistema globsido (028) y coleccin 209. El sistema P, el sistema globsido y la coleccin o antgenos asociados 209 tienen en conjunto 4 antgenos altamente relacionados que dan origen a 5 fenotipos. Todos ellos existen como glicoesfingolpidos en la membrana de los glbulos rojos y se sintetizan a partir de un precursor denominado lactosilceramido, el cual por la accin de diversas reacciones catalizadas por glicosiltransferasas originan al paraglobosido tipo 2, sobre el cual la enzima 4-galactosiltransferasa sintetiza P1, nico antgeno perteneciente al sistema P. Por otro lado, el lactosilceramido es sustrato para otra enzima 4--galactosiltransferasa encargada de sintetizar el antgeno Pk, que actualmente forma parte de la coleccin 209. La conversin del antgeno Pk a P se produce por la accin de la enzima N-acetil galactosaminil transferasa (globsido sintetaza) la cual adiciona, por enlace (1-3), un residuo de N-acetil galactosamina sobre Pk. El antgeno P es el nico antgeno que forma parte del sistema globsido. Sistema I (027) y Coleccin 207002. El antgeno I est compuesto por unidades repetidas de un disacrido compuesto por galactosa y N-acetilglucosamina, unidas a ceramidos o glicoprotenas de membrana. Adems de glbulos rojos, se detecta en granulocitos, linfocitos, macrfagos y plaquetas. El antgeno I, que previamente perteneca a la coleccin 207, constituye un sistema. Ha sido clonado el gen que codifica para una N-acetil glucosaminil transferasa, enzima responsable de la conversin de las cadenas lineales con actividad i, en cadenas ramificadas con actividad I, proceso que ocurre en los primeros 18 meses de vida. El antgeno i, precursor de I, permanece con la nomenclatura 207002.
Figura 8-7.Topologa de las protenas RhD, RhCE y glicoprotena Rh50 (RhAG). Las protenas del sistema Rh presentan doce regiones transmembrana. Los crculos indican los 35 aminocidos diferentes entre la protena D y la CE. En la protena CE se indican los aminocidos en posicin 103 y 226 donde radica el polimorfismo C/c y E/ e, respectivamente.
Las protenas RhD y RhCE tienen 92% de homologa entre s y 38,5% y 39.2% con la RhAG respectivamente, adems muestran una gran similitud en la topologa, ya que todas presentan 12 r egiones transmembrana, sugiriendo que ellas pertenecen a una misma familia de protenas (familia de protenas Rh). El antgeno D es el ms importante del sistema. En la poblacin blanca aproximadamente el 15% de los individuos son Rh negativo, por carecer de la protena D en sus glbulos rojos. En Chile, la poblacin mixta chilena presenta alrededor de un 6% de individuos Rh negativo, situacin que es variable dependiendo del origen tnico de la poblacin que se estudie, es as como en poblacin mapuche se describe casi un 100% de Rh positivo. En general el 80% de las personas Rh negativo se aloinmunizan en respuesta al contacto con eritrocitos Rh positivo. Estos aloanticuerpos son usualmente del tipo IgG y pueden causar reacciones hemolticas postransfusionales de intensidad y severidad variable, y enfermedad
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1.2.
Anemias hemolticas aloinmunes
Las anemias hemolticas aloinmunes, se producen cuando un individuo se expone a antgenos extraos presentes en otro individuo de la misma especie, generando anticuerpos contra ellos. Los aloanticuerpos no reaccionan con las clulas propias, sino que con eritrocitos que presentan antgenos desconocidos. Los cuadros clnicos asociados a este tipo de anemia son la Enfermedad Hemoltica del Recin Nacido (EHRN) y las Reaccin Hemoltica Transfusional (RHT). 1.2.1. Enfermedad hemoltica del recin nacido La EHRN es una anemia causada por destruccin de los glbulos rojos del feto o del neonato por anticuerpos maternos de clase IgG, capaces de atravesar la placenta, dirigidos especficamente contra antgenos presentes en los eritrocitos del hijo, que han sido heredados del padre. Solamente los anticuerpos clase IgG son transportados activamente a travs de la placenta y por lo tanto capacitados para cruzarla y sensibilizar los glbulos rojos fetales que posteriormente son retirados por el SFM del feto, especialmente en el bazo. Los aloanticuerpos maternos pueden aparecer por embarazos ya que, an en embarazos normales es relativamente comn el paso transplacentario de pequeas cantidades de sangre fetal a la madre. Los glbulos rojos incompatibles pueden estimular el sistema inmune mater no, pr oduciendo su aloinmunizacin. Otra forma de sensibilizacin de la madre es a travs de transfusiones con eritr ocitos que presentan antgenos desconocidos, los que pueden estimular una respuesta inmune generando as aloanticuerpos. La EHRN asociada a anticuerpos dirigidos contra antgenos de sistema Rh corresponde a los casos ms severos. La incompatibilidad ABO es la causa ms comn de EHRN y constituye el 95% de los casos, per o el desarrollo de la enfermedad usualmente es de curso leve, sin importancia clnica. Anticuerpos dirigidos contra antgenos de los sistemas Kell, Duffy y Kidd, entre otros, tambin pueden causar esta enfer medad, con un grado variable de compromiso del hijo. El feto afectado desarrolla anemia, producto del retiro de circulacin por el SFM del bazo, de los glbulos rojos sensibilizados con anticuerpos
maternos. La tasa de destruccin de eritrocitos depende del ttulo de anticuerpos, la especificidad de ste y la cantidad de determinantes antignicos por clula roja. El cuadro anmico provoca en el hijo una estimulacin a nivel de mdula sea para acelerar la tasa de produccin de eritrocitos, que induce la liberacin de clulas inmaduras (eritroblastos) a circulacin perifrica. Cuando la mdula no es capaz de suplir la demanda de glbulos rojos, la eritropoyesis ocurre a nivel heptico y esplnico provocando hepatoesplenomegalia que induce hipertensin portal y dao hepatocelular. La anemia severa junto con la hipoproteinemia causada por una disminucin de produccin heptica de protenas plasmticas, induce una falla cardaca con edema generalizado, efusin y ascitis, condicin conocida como hidrops fetalis. En casos severos el hidrops puede presentarse entre las 18 a 20 semanas de gestacin. El proceso de destruccin eritrocitario persiste despus del nacimiento ya que los anticuerpos maternos permanecen en la circulacin del neonato por, aproximadamente, 25 das despus del nacimiento (vida media de las IgG). La hemlisis libera hemoglobina que se metaboliza a bilirrubina. La forma no conjugada de esta molcula es transportada a travs de la placenta para ser conjugada en el hgado materno para luego ser excretada por la madre, as los niveles de bilirrubina en la circulacin fetal y en el lquido amnitico, aunque estn aumentados no causan complicaciones al feto. Por el contrario, despus del nacimiento la bilirrubina no conjugada se acumula en la circulacin fetal ya que la inmadurez heptica hace que el proceso de conjugacin sea poco eficiente, especialmente en recin nacidos prematuro, incluso con hemlisis moderada la bilirrubina no conjugada puede alcanzar niveles txicos (> 18 mg/dL) para el recin nacido, ya que atraviesa la barrera hematoenceflica y se infiltra en el tejido cerebral produciendo una encefalopata bilirrubnica irreversible, cuadro conocido como kernicterus. Diagnstico y evaluacin prenatal Deteccin y titulacin de anticuerpos maternos. La deteccin de aloanticuerpos en el suero materno se realiza mediante la prueba de antiglobulina humana indirecta (PAI). Si se detecta en el suero de una embarazada la presencia de un aloanticuerpo de importancia clnica (activo a 37C y detectado en fase antiglobulina humana), se debe identificar para
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conocer su especificidad y luego titular de modo de tener un valor basal de la cantidad relativa de anticuerpo presente en el suero mater no, la titulacin debera hacerse mensualmente, usando como referencia el estudio paralelo del suero mater no correspondiente al mes anterior. Espectrofotometra de lquido amnitico. Debe evaluarse cuidadosamente la necesidad de hacer espectrofotometra de lquido amnitico mediante amniocentesis, que es un mtodo invasivo no exento de riesgos. Este procedimiento se basa en que la concentracin de bilirrubina en el lquido amnitico se correlaciona con el grado de anemia fetal. Este anlisis consiste en medir la densidad ptica del lquido amnitico entre 350 y 700 nm, a los 450 nm se produce un peak de absorcin dado por la bilirrubina presente, la diferencia que se produce con respecto a la linearidad de absorbancias se anota como DO 450 nm, este valor se lleva al grfico de Liley considerando la edad gestacional. La densidad ptica del lquido amnitico es ms alta en el segundo trimestre y disminuye, gradualmente, hasta el nacimiento. En el grfico se distinguen 3 zonas, que orientan el manejo obsttrico de las embarazadas; valores en zona III indican hemlisis severa con riesgo de vida por lo que se requiere de una intervencin urgente; en la zona II es sugerente de una enfermedad moderada que podra requerir intervencin; la zona I indica enfermedad ausente o leve que no requiere intervencin, sino control seriado. Ultrasonido. El desarrollo de la tecnologa que utiliza ultrasonido, ha sido una herramienta de mucha utilidad en el seguimiento prenatal de la EHRN, ya que permite medir el tamao de distintos rganos como la placenta y el hgado, as como determinar la presencia o ausencia de edema, ascitis y otras efusiones fetales. Cordocentesis. El desarrollo del ultrasonido permiti adems, efectuar procedimientos para la obtencin de sangre de cordn, en la que se pueden medir los parmetros bioqumicos y hematolgicos estndares, siendo sta la forma ms segura de determinar el estado de avance de la EHRN en ausencia de hidrops. Este procedimiento se puede realizar entre las 20 y 21 semanas de gestacin, pero en situaciones extremas se puede hacer, incluso, con 18 semanas.
Determinacin del fenotipo Rh del feto. El clonamiento del cDNA de los genes D y CE, han proporcionado un medio para determinar la presencia o ausencia del gen D en el feto a partir del DNA fetal obtenido desde las vellosidades corinicas o por amiocentesis. Diagnstico y evaluacin postnatal Anlisis de sangre de cordn. Al momento del parto es posible obtener sangre de cordn para los anlisis bioqumicos, hematolgicos e inmunohematolgicos pertinentes. Desde el punto de vista hematolgico se podr detectar y evaluar la concentracin de hemoglobina, reticulocitosis, presencia de eritroblastos; mor fologa de las clulas r ojas (que se observarn con macrocitosis y policromatofilia como consecuencia del aumento de la eritr opoyesis) Desde el punto de vista inmunohematolgico se podra observar una prueba de antiglobulina humana directa (PAD) positiva si se trata de EHRN no ABO en la cual la PAD puede ser negativa o dbilmente reactiva; tambin puede haber dificultad en la clasificacin Rh o de otros sistemas sanguneos que se revelan por medio de la prueba antiglobulina humana (ver captulo 29). Desde el punto de vista bioqumico se encontr hiperbilirrubinemia en un grado variable dependiendo de la severidad de la hemlisis, la que podra tender a un incremento significativo en las 48 a 72 horas siguientes al nacimiento. Tratamiento prenatal Reduccin de la tasa de anticuerpos maternos. Si el feto est en un nivel de riesgo moderado o la edad gestacional no permite otro tipo de procedimento, se puede recurrir a la plasmafresis, procedimento que debera reducir la tasa de anticuerpos hasta en un 75%. El plasma removido se reemplaza con albmina e inmunoglobulinas intravenosa (IVIG), como una forma de reducir el nivel de rebote que habitualmente hace aumentar dramticamente el nivel de anticuerpos mater nos post plasmafresis Transfusin intrauterina. Si la severidad de la enfermedad indica alto riesgo y no es posible interrumpir el embarazo por la edad gestacional, se puede realizar una transfusin intrauterina. La transfusin intraperitoneal (TIP) que consiste en la inyeccin de glbulos rojos compatibles,
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en la cavidad peritoneal del feto, los eritrocitos son absorbidos por va laguna linftica subdiafragmtica, de ah pasan al ducto linftico derecho y desde ah a la circulacin venosa; el proceso de absorcin es dependiente de los movimientos diafragmticos fetales. La otra modalidad que se puede aplicar es la transfusin intravenosa (TIV) a travs del cordn umbilical, la ventaja de este mtodo respecto al anterior es que el incremento del nivel de hemoglobina es inmediato e independiente de los movimientos diafragmticos. La venopuncin orientada con ultrasonido disminuye los riesgos. Este procedimento tiene una tasa de sobrevida superior a la TIP. Los glbulos rojos a emplear en una transfusin intrauterina deben ser frescos, de grupo O que carezcan del antgeno que es reconocido por el anticuerpo materno, con una prueba cruzada negativa utilizando el suero materno, adems se debe asegurar que sean irradiados, y en lo posible con serologa negativa para citomegalovirus. Tratamiento postnatal En el perodo postnatal se utiliza la fototerapia si la hiperbilirrubinemia es leve. Este procedimiento consiste en exponer el neonato a una fuente de luz fluorescente (luz azul) que es capaz de reducir el nivel de bilirrubina, ya que es oxidada a biliverdina, metabolito no txico e hidrosoluble que es excretado por la bilis y la orina. Si el RN sufre hidrops o los niveles de hemoglobina son inferiores a 12 g/dL, o la bilirrubina es superior a 5,5 mg/dL, se est en presencia de una ENRH severa, debiendo realizarse un recambio sanguneo, con el objetivo de remover la bilirrubina libre y los glbulos rojos sensibilizados, por otros no sensibilizados que tengan las mismas caractersticas que los empleados en una transfusin intrauterina. Con esto se corrige la anemia y se previene la hiperbilirrubinemia al remover los erotrocitos sensibilizados y la bilirrubina circulante. Los parmetros de hemoglobina y bilirrubina son ms estrictos si se trata de un neonato prematuro. Prevencin Para la prevencin de la EHRN inducida por antiD, existen protocolos de profilaxis bien establecidos que consisten en la inmunizacin pasiva de madres Rh negativas no sensibilizadas
al antgeno D, con anticuerpos anti-D comerciales (Rho IgG), cuyo objetivo es prevenir que clulas Rh positivas del feto o recin nacido estimulen una respuesta inmune materna, evitando as la formacin de anticuerpos que pudieran ocasionar problemas en embarazos futuros. Existe una proteccin natural a la inmunizacin cuando la madre es ABO incompatible con el feto, debido a que los hemates fetales (ABO incompatibles), son rpidamente hemolizados en la circulacin materna por accin de los anticuerpos naturales, antes que el antgeno D estimule al sistema inmune materno, de esta forma disminuye la incidencia de inmunizacin frente al antgeno D del sistema Rh. 1.2.2. Reaccin hemoltica transfusional La composicin antignica de los glbulos rojos transfundidos siempre difiere con la del receptor, pero slo una minora de pacientes politransfundidos desarrollan aloanticuerpos, debido a que la aloinmunizacin depende tanto de la respuesta inmune del receptor como de la inmunogenicidad de los diferentes antgenos eritr ocitarios. En general el riesgo de aloinmunizacin es de 1,0 a 1,4% por unidad transfundida. Una reaccin hemoltica transfusional ocurre cuando se transfunden glbulos rojos portadores de antgenos frente a los cuales el receptor ha formado anticuerpos, con la consecuente destruccin de ellos. Son menos frecuentes las reacciones hemolticas causadas por destruccin de los eritrocitos del receptor despus de la transfusin de plasma incompatible. Dependiendo del antgeno y del anticuerpo involucrado, la hemolisis puede ocurrir inmediatamente a nivel intravascular, o ms lentamente a nivel del SFM (extravascular). Esto tambin permite clasificar las reacciones de acuerdo al tiempo de aparicin de los sntomas como, reacciones hemolticas inmediatas o reacciones hemolticas tardas. a) Reaccin hemoltica transfusional inmediata Este tipo de reacciones ocurre cuando los anticuerpos estn presentes en el plasma del paciente a ttulos altos. La causa ms tpica de este tipo de reaccin es la incompatibilidad ABO, dado que los anticuerpos anti-A y anti-B son de clase IgM, capaces de fijar y activar completamente el sistema del complemento. La incompatibilidad ABO ocurre,
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principalmente, por errores administrativos; ocasiona el 86% de las muertes por reacciones hemolticas transfusionales. Anticuerpos dirigidos contra otros antgenos, tales como, Kell, Jka y Fya, tambin pueden causar este tipo de reacciones. Los mecanismos fisiopatolgicos asociados con estas reacciones corresponden a los descritos para la hemlisis intravascular. Se inicia con la formacin de un complejo inmune donde el anticuerpo involucrado es de clase IgM, capaz de activar el sistema del complemento, la cascada de la coagulacin y el sistema de las cininas. La activacin del complemento induce la formacin del MAC que provoca hemlisis intravascular en forma inmediata, con liberacin de hemoglobina, estroma y enzimas eritrocitarias al plasma, la hemoglobina satura a la haptoglobina por lo que comienza a ser eliminada por la orina generando hemoglobinuria. Producto de la activacin del complemento tambin se liberan los fragmentos C3a y C5a que actan como potentes anafilotoxinas, responsables de los sntomas de fiebre, escalofros, hipotensin y shock. El estroma eritrocitario contiene sustancias tromboplsticas que activan la cascada de la coagulacin induciendo Coagulacin intravascular diseminada (CID) (ver captulo 22). El complejo antgeno-anticuerpo formado, tambin activa el sistema de las cininas, liberando bradicinina, la que provoca hipotensin y liberacin de catecolaminas que causan vasoconstriccin en rganos tales como el rin. El cuadro puede generar una falla renal producto de la isquemia renal causada por la combinacin de la hipotensin, la vasoconstriccin y la CID. La hemoglobina libre circulante parece no participar en la insuficiencia renal. Otro de los sntomas caractersticos de esta reaccin son, dolor lumbar, enrojecimento y dolor en el recorrido de la vena puncionada, disnea y taquicardia. En pacientes anestesiados los signos principales son la hipotensin, la hemoglobinuria y el sangramiento en napa de las heridas quirrgicas producto de la CID. La severidad de la reaccin se correlaciona con el volumen de glbulos rojos incompatibles transfundidos. Frente a este tipo de reaccin, la transfusin debe ser inmediatamente suspendida, manteniendo permeable la va para proceder a tomar una muestra de sangre posreaccin, y usarla en caso necesario. La muestra debe ser enviada al laboratorio del Banco de Sangre junto con la unidad que gatill la reaccin para su
anlisis. La muestra de sangre postransfusional debe ser centrifugada inmediatamente y observada en busca de hemoglobinemia, que se detecta por el tinte rosado del plasma, es muy conveniente compararla con la muestra pretransfusional. Hay que cuidar la hidratacin del paciente para prevenir la falla renal, la administacin de drogas vasoactivas mejoran la hipotensin y la perfusin a este nivel. Se requier e monitorear los mecanismos hemostticos para evaluar la necesidad de transfundir plaquetas, crioprecipitado y/o plasma fresco congelado. La mayora de estas reacciones son evitables ya que la causa principal se debe a error humano, entre ellos se destaca: mal etiquetaje de la muestra del paciente, extraccin de sangre a un paciente equivocado, errores de transcripcin, errores en la identificacin de la unidad de glbulos rojos. El seguimiento riguroso de los procedimentos descritos en los manuales es la forma ms segura para evitar estos errores, as como la aplicacin de un completo programa de gestin de calidad. b) Reaccin transfusional hemoltica tarda Las reacciones transfusionales hemolticas tardas, por lo general son ms leves que las inmediatas ya que la hemlisis es de predominio extravascular. Se producen cuando el ttulo de los aloanticuerpos de isotipo IgG presentes en el suero es bajo, no siendo detectados en las pruebas pretransfusionales. Los sntomas se inician entre 2 a 14 das de realizada la transfusin de sangre incompatible. La respuesta anamnstica hace aumentar rpidamente los ttulos del anticuerpo, as los glbulos rojos transfundidos sufren hemlisis extravascular porque se sensibilizan con anticuerpos IgG o fracciones del complemento, siendo secuestrados por clulas del SFM heptico o esplnico. La especificidad de los anticuerpos involucrados en este tipo de reaccin estn dirigidos contra antgenos de los sistemas Kell, Rh (D, E y c), Duffy y Kidd. Se presentan con una incidencia de 1 en 3.200 transfusiones. Fiebre y anemia son los principales sntomas aunque a veces se produce ictericia leve, eventualmente se presenta hemoglobinemia y hemoglobinuria mientras que el dao renal es muy excepcional. Por lo general el paciente que sufre este tipo de reacciones no requiere de una terapia especial.
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Para el diagnstico es necesario una muestra de sangre postransfusional para medir el nivel de hemoglobina, bilirrubina y realizar una PAD, que al ser positiva se debe proseguir el estudio con una elucin para estudiar su especificidad; si la tasa de hemlisis es alta la PAD podra ser negativa y en este caso se debera detectar el anticuerpo en el suero del paciente (ver captulo 29). Debido a que este tipo de reacciones ocurre por una respuesta inmune secundaria, resulta de gran importancia en su prevencin, considerar el historial transfusional, de trasplantes y de embarazos del paciente. 1.3. Anemias hemolticas autoinmunes Las Anemias hemolticas autoimunes (AHAI) se producen por alteraciones en los mecanismos reguladores normales de la respuesta inmune, con la consecuente formacin de anticuerpos patolgicos que reaccionan con antgenos eritr ocitarios pr opios, induciendo su destruccin. En situaciones normales, los linfocitos T supresores inducen tolerancia a los antgenos propios al inhibir la actividad de las clulas B, por lo que la prdida o alteracin de esta funcin puede resultar en la pr oduccin de autoanticuerpos. Las causas de la disfuncin de este sistema regulador no estn del todo dilucidadas, pero existen evidencias que agentes microbianos y drogas lo alteran, as como asociacin con desrdenes relacionados con fallas en la inmunorregulacin, como son Lupus eritr omatoso asistmico (LES) y desrdenes linfoproliferativos. La presencia de autoanticuerpos es importante por dos razones: (a) ellos pueden causar destruccin in vivo de glbulos rojos, generando el cuadro anmico y (b) cuando los eritrocitos estn cubiertos por autoanticuerpos y stos tambin estn libre en el suero y son reactivos con clulas de donantes al azar, puede ser mas dificil la determinacin de grupo sanguneo ABO, la deteccin e identificacin de aloanticuerpos y las pruebas de compatibilidad pretransfusionales. Los autoanticuerpos pueden ser inocuos o nocivos dependiendo de la temperatura mxima a la que son activos. Uno de los criterios ms usados en la clasificacin de las AHAI, se basa en la temperatura de reaccin del anticuerpo in vitro.
En las AHAI por anticuerpos calientes el anticuerpo involucrado reacciona con mayor fuerza a 37C que a temperaturas ms bajas, mientras que en AHAI por anticuerpos fros, el autoanticuerpo reacciona con mayor fuerza entre 0 y 5C. Adicionalmente se incluyen en este grupo las AHAI inducidas por frmacos. Los eritrocitos recubiertos con autoanticuerpos son en primer lugar secuestrados en el bazo, ya que son detectados por receptores especficos presentes en los macrfagos, esta interaccin puede inducir fagocitosis total o parcial de los eritrocitos. Cuando se produce la remocin de parte de la membrana celular y el eritrocito se libera nuevamente a circulacin, situacin que es muy frecuente, la clula queda con una menor proporcin membrana contenido, lo que trae como consecuencia la aparicin de esferocitos, caracterizados por su rigidez, baja sobrevida y aumento de fragilidad frente a cambios osmticos. La incidencia anual de las AHAI es 1 en 80.000 personas, siendo el tipo caliente hasta un 70%, la Enfermedad de aglutininas fras entre un 1632%, la Hemoglobinuria paroxistica a fro el 2%, y la Anemia hemoltica inducida por frmacos entre el 12-18% de los casos. El tipo mixto, AHAI por anticuerpos fros y calientes corresponde al 7% de los casos. 1.3.1. AHAI por anticuerpos calientes La AHAI por anticuerpos calientes se produce cuando el sistema inmune del paciente produce anticuerpos anti-eritrocitarios que reaccionan ms eficientemente en el laboratorio a temperaturas de 37C. Generalmente los anticuerpos involucrados son de tipo IgG, predominantemente de las subclases IgG1 e IgG3, pueden adems estar acompaados de IgA e IgM, rara vez estos ltimos se presentan solos, pudiendo ser fijadores parciales o no fijadores de complemento, por lo que inducen hemlisis extravascular, como consecuencia de lo cual se observa hiperbilirrubinemia. Los autoanticuerpos patgenos se unen a la superficie de los glbulos rojos y activan complemento, proceso que generalmente no se completa generan la lisis intravascular de las clulas. Frecuentemente, el factor del complemento presente en los hemates es C3b o C3d, este ltimo generado por el inactivador de C3b. La lisis extravascular ocurre por la intervencin de macrfagos con receptores de IgG o C3b presentes en los eritrocitos.
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El 70-75% de todas las anemias hemolticas autoinmunes son provocadas por anticuerpos calientes, de ellas aproximadamente entre un 30 a 50% son de origen idioptico (primario), es decir sin una enfermedad de base asociada. Este tipo de anemia puede presentarse a cualquier edad, aunque se observa frecuentemente en pacientes sobre los 40 aos, y afectan con mayor frecuencia a mujeres. El porcentaje restante son secundarias a otras enfer medades, tales como sndromes linfoproliferativos, especialmente Linfoma de clulas B y Leucemia linfoctica crnica, LES, otras enfermedades autoinmunes, tumores malignos e infecciones. El curso de la enfermedad puede ser moderado, con un desarrollo gradual de los sntomas, o agudo con sntomas fulminantes. Los hallazgos clnicos incluyen, debilitamiento progresivo, episodios febriles, hemoglobinuria, ictericia moderada, hepatoesplenomegalia y linfoadenopatas. Hallazgos de laboratorio Hematolgicos. El nivel de hemoglobina se encuentra disminuido en un grado variable de acuerdo a la intensidad de la anemia. El recuento de reticulocitos es usualmente elevado, pero dado que estas clulas ya presentan determinantes antgenicos desarrollados, es posible tener cuadros de reticulocitopenia, situacin que se asocia con una alta mortalidad. El frotis sanguneo muestra los hallazgos clsicos de anemia hemoltica: policromatofilia, macrocitosis, y esferocitosis. Bioqumicos. La bilirrubina no conjugada est moderadamente elevada, al igual que los urobilingenos urinarios. En casos severos se puede observar hemoglobinemia, disminucin de la haptoglobina, aumento de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) y hemoglobinuria. Inmunohematolgicos. Casi el 95% de los casos presenta la PAD positiva, confirmando la presencia de glbulos rojos sensibilizados con IgG con o sin fracciones del complemento, y un eluado reactivo con anticuerpos de clase IgG (ver captulo 29). Generalmente el autoanticuerpo caliente no interfiere con la determinacin del grupo ABO y Rh, pero puede interferir en los estudios de reactividad del suero. Aproximadamente en el 80% de los casos, el autoanticuerpo no solamente se encuentra unido a los eritrocitos,
sino que tambin aparece libre en el suero, reaccionando con clulas de donantes o en una PAI positiva, cuando hay una hemlisis activa. La especificidad de los autoanticuerpos calientes es variable y la mayora de ellos reconocen antgenos de alta incidencia. Unos pocos reaccionan especficamente con antgenos del sistema Rh como e, otros reaccionan ms fuerte con clulas e positivas que e negativas (especificidad relativa), pero lo ms frecuente es encontrar que reaccionan bien con todos los eritrocitos, salvo con clulas Rh nulo, por lo que presentan especificidad amplia para antgenos del sistema Rh. Ocasionalmente se han descrito autoanticuerpos asociados a otros sistemas sanguneos como el sistema Kell. Casos que cursan con PAD negativa pueden ser estudiados con tcnicas de mayor sensibilidad como los geles y otras, o se explican por la presencia de anticuerpos de isotipo IgA. La severidad de la enfermedad autoinmune se ha relacionado con ciertas propiedades de los autoanticuerpos, como ttulo en el suero, avidez por los eritrocitos y capacidad de fijar el complemento, as como nmero y distribucin de los antgenos en los glbulos rojos. Tratamiento En pacientes con una enfermedad asociada a la AHAI, el tratamiento de sta puede revertir el proceso hemoltico, aunque en adultos es infr ecuente la remisin completa de la enfermedad. Adems se requiere el uso de corticoesteroides, que actan inhibiendo la sntesis de anticuerpos y la fagocitosis de hemates sensibilizados. Los tratamientos adicionales utilizados en estos casos incluyen esplenectoma, terapia inmunosupresora, plasmafresis, vinca alcaloides, danasol y IVIG. La transfusin sangunea como tratamiento, slo debe ser considerada dependiendo del grado de hemlisis y de la habilidad del paciente para tolerar la anemia, ya que como se mencion anterior mente, existen dificultades para encontrar unidades de glbulos rojos compatibles. En el caso que la transfusin sea esencial para preservar la vida del paciente debido al compromiso cardiaco o de otro tipo derivado de la intensa anemia, es imprescindible transfundir para mejorar el transporte de oxgeno, hasta que la hemlisis aguda disminuya, o que las otras medidas teraputicas logren beneficios ms duraderos. La transfusin
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no debe postergarse solo por incompatibilidad serolgica, se recomienda transfundir slo el volumen necesario, fresco, con la menor cantidad de plasma posible, y con un monitoreo constante del paciente durante y despus de la transfusin. La seleccin del donante de sangre apropiado es crtico en estos casos. Debe ser isogrupo, compatible a los aloanticuerpos que presente el paciente, compatible a los autoanticuerpos especficos. Si bien es cierto que la transfusin de unidades antgeno negativa cuando el autoanticuerpo presenta especificidad relativa es discutible, sera recomendable hacerlo para disminuir al mximo cualquier posible destruccin de las clulas transfundidas. En caso de autoanticuerpos inespecficos, lo ms importante es descartar la presencia de aloanticuerpos coexistentes por medio de mtodos como dilucin, autoabsor cin, absor cin diferencial, seguidas de la identificacin de aloanticuerpos en los sueros libres de autoanticuerpos, con el fin de seleccionar los eritrocitos ms inocuos para transfundir al paciente. En un 32-40% de los casos de AHAI se han detectado aloanticuerpos, y que aparecen despus de transfusiones recientes. Es claro que estos aloanticuerpos no detectados pueden ser los causantes de un aumento de hemlisis posterior a la transfusin, y que puede errneamente atribuirse a un aumento en la severidad de la AHAI. En caso de urgencia transfusional, siempre existe posibilidad de realizar, al menos, algunas pruebas, pero es importante realizar con tiempo los estudios de laboratorio anteriormente sealados que son largos y engorrosos, para disponer de unidades lo ms seguras posible en el momento de la transfusin. 1.3.2. AHAI por anticuerpos fros En el plasma de un alto porcentaje de individuos sanos es posible detectar autoanticuerpos fros benignos, que reaccionan con mayor intensidad cerca de los 4 C y son activos slo hasta temperaturas de 10 a 15C, se encuentran en ttulos inferiores a 64, por lo que no generan problemas serolgicos ni clnicos. Sin embargo, estos autoanticuerpos se transfor man en patolgicos cuando aumenta su ttulo, o aumentan el rango trmico de reactividad in vitro hasta 30C o ms. Entre las AHAI por anticuerpos fros se reconocen dos cuadros clnicos, Enfermedad de las aglutinas
fras y Hemglobinuria paroxstica a frigore. a) Enfermedad de las aglutininas fras La enfermedad por aglutininas fras (EAF) representa aproximadamente el 15% de todas las AHAI. Puede ser idioptica, afectando principalmente a adultos mayores con predominio en mujeres, o aparecer como una enfermedad crnica secundaria a neoplasias de clulas B como linfoma, macroglobulinemia de Waldenstrom, a leucemia linfoctica crnica, o como una condicin transitoria secundaria a cuadr os infecciosos por Mycoplasma pneumoniae o Mononucleosis infecciosa. La especificidad de estos autoanticuerpos fros es anti-I en un 90%, anti-i en un 8% de los casos, y excepcionalmente se han descrito otros antgenos involucrados. El isotipo encontrado es IgM. Cuando el paciente se expone al fro ocurre la reaccin antgeno anticuerpo principalmente en zonas del cuerpo expuestas (punta de los dedos de manos y pies, lbulo de las orejas y punta de la nariz), donde la temperatura corporal puede fluctuar entre 28 y 31C. La hemaglutinacin obstruye la circulacin capilar, causando entumecimiento, dolor y coloracin azul de la piel; esta alteracin circulatoria se conoce como acrocianosis o fenmeno de Raynaud, que en situaciones severas puede ocasionar gangrena de la zona afectada. El complejo antgeno anticuerpo formado fija y activa el sistema del complemento por la va clsica, pudiendo producir una hemlisis directa de tipo intravascular. Sin embargo, cuando los glbulos rojos vuelven a la circulacin donde la temperatura corporal es mayor, los anticuerpos tienden a eluirse pero las fracciones del complemento permanecen opsonizando las clulas, induciendo su remocin por el SFM. Un tercer mecanismo de hemlisis menos importante, se genera por el trauma sufrido por las clulas cuando se aglutinan y ocluyen pequeos vasos sanguneos perifricos. La forma crnica se caracteriza por una anemia leve a moderada que depende bsicamente de la habilidad del autoanticuerpo de activar el complemento. La forma secundaria a cuadros infecciosos, habitualmente se desencadena luego de 2 3 semanas de iniciada la enfermedad y los signos ms comunes son palidez e ictericia, mientras que la acrocianosis y la hemoglobinuria son infrecuentes.
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Hallazgos de laboratorio Hematolgicos. Los valores de hemoglobina disminuyen moderadamente especialmente en periodos de invierno y climas fros. El recuento de glbulos rojos est artificialmente disminuido y la VCM est falsamente elevada produciendo un valor increblemente alto de la CHCM, adems como en todo cuadro hemoltico se observa reticulocitosis. Los glbulos blancos y las plaquetas se mantienen normales en nmero y funcin. Dadas las caractersticas del anticuerpo involucrado es posible evidenciar aglutinacin de los glbulos rojos a temperatura ambiente, dificultando la preparacin de los frotis y el trabajo de la muestra en contadores automticos. Bioqumicos. Los niveles de bilirrubina pueden estar levemente aumentados (no mayor a 3 mg/ dL) al igual que la LDH. Inmunohematolgicos. La PAD es positiva con suero antiglobulina humano poliespecfico o anti-complemento C3d, como consecuencia de las fracciones del complemento que permanecen sensibilizando las clulas. Una vez detectada la presencia de crioaglutininas, debe estudiarse su ttulo que habitualmente supera la dilucin 1/1000 cuando se incuba a 4C, y la amplitud trmica del autoanticuerpo que puede fluctuar entre 0-32C. Generalmente, el rango trmico del autoanticuerpo predice en forma ms certera que el ttulo la patogenicidad del autoanticuerpo involucrado (ver captulo 29). En estos casos puede haber dificultad en la clasificacin ABO y Rh, por la aglutinacin espontnea de los GR del paciente a temperatura ambiente, mediada por anticuerpos IgM. Esta interferencia suele desaparecer si se trabaja estrictamente a 37C. La identificacin de la especificidad del autoanticuerpo es solo una infor macin adicional ya que no afecta el manejo clnico o transfusional del paciente. Por otra parte, es muy importante detectar la coexistencia de autoanticuerpos fros y aloanticuerpos de importancia clnica, ya que estos ltimos deben ser tomados en cuenta en la bsqueda de sangre compatible para una eventual transfusin, realizando una prueba cruzada a 37C. Tratamiento Es importante investigar la presencia de linfoma antes de iniciar tratamiento de la EAF crnica,
ya que algunos agentes quimioterpicos pueden ser beneficiosos en pacientes con EAF secundarias. En la enfermedad idioptica no hay tratamiento especfico, salvo que el paciente se mantenga en ambiente temperado. Dado que casi la totalidad de la IgM se encuentra en circulacin, en caso de ser necesario puede realizarse plasmafresis para retirar estas aglutininas fras. La transfusin sangunea, la terapia con esteroides y la esplenectoma, slo han mostrado efectividad en casos extremos y aislados. Cuando el cuadro hemoltico es secundario a otra enfermedad, generalmente el cuadro es autolimitado y cede con el tratamiento de la patologa de base. b) Hemoglobinuria paroxstica a frigore La hemoglobineuria paroxstica a frgore (EPF) es una enfermedad similar a la EAF, pero tiene una incidencia que no supera el 2%. En esta enfermedad los glbulos rojos son hemolizados en el compartimiento intravascular por accin del autoanticuerpo llamado de DonathLandsteiner. Este autoanticuerpo es una hemolisina bifsica de clase IgG, que se une a los eritrocitos del paciente despus de la exposicin al fro, activa la fijacin del complemento, y cuando las clulas sensibilizadas llegan a zonas con mayor temperatura se gatilla la hemlisis intravascular, por medio de la generacin del complejo de ataque a membrana, producindose como su nombr e lo indica una hemoglobinuria paroxstica o intermitente importante. La especificidad principal de esta hemolisina bifsica es para el antgeno P del sistema globsido (028), pero tambin se han descrito especificidades anti-i y anti-Pr. La HPF es una anemia hemoltica aguda que aparece casi exclusivamente en nios y adultos jvenes, generalmente es un problema transitorio. Puede tener una etiologa idioptica y ms frecuentemente ser secundaria a una variada gama de infecciones virales citomegalovirus mononucleosis infecciosa, influenza, adenovirus, sarampin, entre otros), por Micoplasma pneumonie en nios y sfilis no tratada en adultos. El paciente, luego de la exposicin al fro, presenta sntomas como fiebre, dolor en abdomen, espalda y extremidades, escalofros, nuseas, vmitos, y hemoglobinuria significativa.
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Hallazgos de laboratorio Inmunohematolgicos. Los ms caractersticos son los hallazgos asociados con una hemlisis intravascular aguda. La morfologa eritrocitaria es usualmente normal. La prueba de DonathLandsteiner es positiva y permite pesquisar la hemolisina bifsica. La PAD es positiva si se realiza precozmente y usando suer o antiglobulina especfico para complemento. Si se realiza una incubacin previa de la muestra a 4C y lavados con solucin salina fra podra obtenerse una reaccin positiva con suero antiIgG. La PAI tambin puede ser positiva si se realiza a 4C, usando para los lavados solucin salina fra al igual que en el caso anterior (ver captulo 29).
Tratamiento En los cuadros secundarios a infecciones es necesario tratar la enfermedad de base, mientras que en los cuadros idiopticos, lo ms adecuado es la prevencin al evitar la exposicin al fro. Dado que las crisis son autolimitadas habitualmente no requieren tratamiento, pero en situaciones extremas se ha recurrido al uso de plasmafresis, esteroides y transfusin sangunea. En este ltimo caso, idealmente se requerira contar con glbulos rojos de fenotipo p (1 en 200.000 unidades), es muy difcil disponer de ese fenotipo, por lo que hay que transfundir al paciente en un ambiente temperado y con monitoreo constante. La tabla 8-10 muestra una comparacin de los hallazgos serolgicos que se presentan en los diferentes tipos de AHAI descritas.
Tabla 8-10. Hallazgos serolgicos en Anemias hemolticas autoinmunes AHAI por Ac calientes Anticuerpo PAI IgG Reactiva (80%) AHAI por Ac fros IgM No reactiva Mtodo precalentado (67%) (24%) (7%) (1%) No reactivo Hemoglobinuria paroxstica a frigore IgG bifsica No reactiva
PAD
IgG IgG+C3d C3d Negativo Panaglutininas
C3d C3d
Eluado
No reactivo
AHAI, Anemia hemoltica autoinmune; Ac, anticuerpos
1.3.3. AHAI por mezcla de autoanticuerpos fros y calientes, o tipo mixto Un nmero significativo de pacientes (7 - 8%) que tienen AHAI por anticuerpos calientes, tienen adems aglutininas fras en su suero, que estn en bajos ttulos y no son activas a temperaturas de 30C o superior. Sin embargo, hay un grupo de pacientes que presentan anticuerpos fros con altos ttulos y con un rango trmico que llega a los 37C. Los signos y
sntomas clnicos que ellos manifiestan, se deben a una hemlisis severa sin necesidad de exposicin al fro. Se asocia a desrdenes linfoproliferativos, LES o tambin puede ser de etiologa idioptica. Los hallazgos de laboratorio muestran una PAD positiva tanto por IgG como por complemento. Los eluados muestran anticuerpos IgG inespecficos y aglutininas fras con especificidad anti I.
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1.3.4. AHAI inducida por frmacos Los medicamentos pueden causar diversos efectos colaterales, dentro de los cuales est el inducir produccin anormal de anticuerpos que provocan la destruccin inmune de glbulos rojos y otras clulas. La anemia hemoltica inmune que sufren algunos pacientes tras la administracin de ciertos frmacos tiene una incidencia baja, constituyendo entre el 12 a 18% de los casos de AHAI, cuando se usaban altas dosis de penicilina y alfa metildopa. Es importante determinar acuciosamente los frmacos que ingiere un paciente que presenta hemlisis sin una explicacin aparente, en busca de una causa etiolgica de esta situacin.
Se han descrito tres mecanismos principales por los cuales las drogas logran inducir la formacin de los anticuerpos asociados a AHAI, cuyas caractersticas principales se resumen en la tabla 8-11, (a) Mecanismo de adsorcin de la droga o hapteno (b) Mecanismo de complejo inmune; c) Mecanismo de autoanticuerpos. Recientemente se ha propuesto que todas las citopenias inmunes inducidas por drogas se inician con la interaccin de la droga o alguno de sus metabolitos, con componentes de la membrana del glbulo rojo lo que lleva a la formacin de una estructura antignica que pr oduce anticuerpos dependientes o independientes de la droga.
Tabla 8-11. Hallazgos serolgicos en AHAI por drogas Adsorcin de la droga (hapteno) Penicilina Cefalosporinas Estreptomicina No reactiva excepto que GR se recubran con la droga IgG IgG+C3d a veces No reactivo, excepto que GR se recubran con la droga Complejo inmune Quinidina
Clasificacin Tipo de droga
Autoanticuerpo Metildopa
PAI
Reactiva en presencia de la droga C3d No reactivo an en presencia de la droga
Reactiva en ausencia de la droga IgG Reactivo en ausencia de la droga
PAD Eluado
a) Adsorcin de droga (hapteno) El frmaco o alguno de sus metabolitos se fija fuerte e inespecficamente a la membrana del eritrocito e induce la produccin de anticuerpos anti-droga, los cuales se unen a la droga sin interactuar directamente con el glbulo rojo. Los anticuerpos son usualmente de tipo IgG, reactivos en caliente y no activadores del complemento, por lo que las clulas sensibilizadas son secuestradas por el SFM, con lisis extravascular. Este mecanismo se presenta en pacientes que han recibido altas dosis del frmaco. La droga
ms caracterstica es la penicilina; se ha descrito tambin en cefalosporinas, eritromicina y tetraciclinas. Hallazgos de laboratorio. Esta anemia cursa con una PAD positiva, el suero del paciente y el eluado son no reactivos, ya que se requiere clulas cubiertas con la droga para que se produzca aglutinacin. Dado que personas sanas pueden tener ttulos bajos de anticuerpos anti-penicilina, es necesario demostrar presencia de ttulos altos para implicar a la droga como causa de la anemia hemoltica. La PAD permanece positiva varias semanas despus y puede observarse un patrn de campo mixto
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en la PAD producto de que slo algunas clulas estn cubiertas con la droga (tabla 8-12) (ver captulo 29). b) Complejo inmune/neoantgenos La primera droga que se relacion con este mecanismo fue el estibofeno, posteriormente tambin se han descrito otros frmacos, entre ellos: quinidina, quinina, cefotaxima, clorambucil, clorpromacina, isoniacida, rifampicina, sulfonamidas, cefalosporina, tetraciclina y tiazidas, entre otros. El mecanismo fisiopatolgico inicialmente descrito planteaba que el frmaco se une a pr otenas plasmticas transportadoras originando un inmungeno que estimula la formacin de un anticuerpo anti-droga, ste reacciona con la droga y se forma un complejo inmune que se une inespecficamente al glbulo rojo (espectador inocente) por medio de la regin Fab del anticuerpo, conformando un complejo trimolecular (anticuerpo-drogaeritrocito) capaz de activar el complemento, con la consiguiente hemlisis intravascular. Es necesario una pequea cantidad de droga para gatillar este mecanismo en pacientes que tienen anticuerpos anti droga ya formados. Recientemente han surgido evidencias para un modelo que plantea la formacin de un neoantgeno, es decir la droga interactuara de forma no covalente con componentes de membrana for mando un deter minante antignico nuevo (constituido por la droga y componentes de la membrana), este neoantgeno estimulara al sistema inmune, se generaran los autoanticuerpos que seran capaces de fijar y activar el complemento con la consiguiente hemlisis intravascular. Hallazgos de laboratorio. La hemlisis intravascular severa induce hemoglobinuria, hemoglobinemia que frecuentemente culmina con falla renal. Las pruebas de coagulacin como el TTPA, estn prolongadas producto del consumo del factor VIII y fibringeno. La PAD es positiva slo por la presencia del complemento, el eluado es no reactivo principalmente porque las inmunoglubulinas se han perdido en los lavados. In vitro, el suero del paciente reacciona con los glbulos rojos solo en presencia de la droga o su metabolito (ver captulo 29). El tratamiento consiste en la suspensin
inmediata de la droga, acompaado de la administracin de esteriodes slo si la hemlisis es muy severa. c) Formacin de autoanticuerpos En este mecanismo la droga induce la formacin de autoanticuerpos IgG que reconocen deter minantes antignicos eritrocitarios (principalmente antgenos del sistema Rh), sin necesidad de que el frmaco est unido a los hemates. El autoanticuerpo se produce despus de varios meses de terapia continua, por lo que la hemlisis puede presentarse luego de 18 semanas a 4 aos de iniciada una terapia. La droga ms representativa de este mecanismo es la alfa-metildopa, pero tambin se incluyen L-dopa, procainamida y drogas antiinflamatorias no esteroidales. El mecanismo por el cual la droga induce la for macin de autoanticuerpos no est dilucidado, se plantea que la droga alterara directamente al sistema inmune inhibiendo la funcin de los linfocitos T supresores, o alterando antgenos propios del GR, sin embargo, no todas las investigaciones concuerdan con estos datos, por lo que se requieren ms estudios al respecto. Hallazgos de laboratorio. Los estudios hematolgicos denotan disminucin de la hemoglobina con reticulocitosis y esferocitosis. Las caractersticas serolgicas de este tipo de anemia son difer entes a las descritas previamente ya que la PAD es positiva con suero antiglobulina poliespecfico y anti-IgG. El eluado y el suero del paciente son reactivos con glbulos rojos normales en ausencia de la droga (ver captulo 29). El tratamiento habitual consiste, al igual que en las otras situaciones, en la suspensin de la droga. En caso que sea necesario transfundir, deben realizarse las pruebas pretransfusionales de rutina para determinar grupo ABO y Rh, deteccin de aloanticuerpos y prueba cruzada, los que no debieran presentar mayores interferencias y dificultades en su realizacin. 2. ANEMIAS HEMOLTICAS NO INMUNES Las anemias hemolticas extracorpusculares no mediadas por mecanismos inmunes corresponden a las asociadas a infecciones, agentes fsicos y qumicos.
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2.1. Agentes infecciosos 2.1.1. Parasitosis El Paludismo y la Babesiosis son las nicas dos parasitosis que producen anemia hemoltica adquirida. a) Paludismo o Malaria Sus agentes causales son protozoos del gnero Plasmodium, cuya transmisin natural en el husped humano son mosquitos hematfagos del gnero Anopheles. Se ha logrado erradicar el Paludismo en algunos pases de territorios templados, pero en muchos pases tropicales y subtropicales, todava sigue siendo endmica, provocando un elevado nmero de enfermos y casos fatales. Existen 4 especies de Plasmodium que provocan el Paludismo en el ser humano: P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae. El P. falciparum provoca la forma ms grave de malaria humana, la llamada terciana maligna; el P. vivax es la especie ms frecuente. La infeccin humana ocurre cuando un mosquito infectado pica para alimentarse de sangre. Es interesante anotar que en estos insectos slo las hembras son hematfagas y, si estn infectados inyectan esporozoitos al torrente sanguneo de la persona atacada. Estos parsitos delgados y mviles permanecen poco tiempo, entre 30 y 60 minutos en circulacin, luego de lo cual penetran a las clulas parenquimatosas hepticas, iniciando el ciclo exoeritroctico (fuera de la cir culacin sangunea). Dentro de la clulas hepticas, el parsito se multiplica por divisin asexual o de esquizogonia, tras lo cual, despus de 8 a 15 das, segn la especie que se trate, da origen a miles de merozoitos. Estas formas parasitarias son liberadas a la sangre, por estallido de las clulas hepticas parasitadas y algunas de ellas invaden los glbulos rojos, iniciando el ciclo eritrocitario. Dentro del glbulo rojo el parsito se multiplica nuevamente por esquizogonia, lo cual se completa entre 44 a 49 horas para P. falciparum, P. vivax o P. ovale, provocando una periocidad clnica de fiebre terciana y cerca de 72 horas para P. malariae , con patrn cuaternario. Luego de progresivas invasiones a eritrocitos, se inicia la fase sexuada de esta parasitosis. En sta, los merozoitos entran a los eritrocitos, pero ya no se multiplican y se trasforman en formas masculinas o femeninas,
llamadas micro y macrogametocitos. Slo cuando han alcanzado la condicin de gametocitos maduros son infecciosos para el mosquito Anopheles. En el estmago del insecto, los gametocitos masculinos y femeninos maduran hacia los gametos, proceso en el cual los gametos masculinos (ocho microgametos) salen del microgametocito buscando el gameto femenino por un proceso llamado exflagelacin. Cuando la fusin de ambos gametos, masculino y femenino se produce da orgen a un cigoto vermiforme y mvil que es el oocineto, el cual atraviesa la pared del intestino del mosquito, hasta llegar a la membrana basal, desarrollando all un ooquiste esfrico. Aqu, el oocisto crece debido al desarrollo de cientos y miles de esporozoitos hasta que revientan y los esporozoitos son liberados al hemocele del mosquito. Pocas horas despus, gran parte de los esporozoitos se concentran en las glndulas salivales, y as constituyen la masa del inculo infectante del plasmodio para un nuevo husped humano cuando el mosquito pica. Los parsitos que invaden los eritrocitos son los grandes responsables de las alteraciones patolgicas y fisiopatolgicas del Paludismo. El desarrollo de los esquizontes en los eritrocitos, da orgen a pigmentos intracelulares caractersticos que se observan en el interior de las clulas eritrocitarias en el frotis sanguneo. El P. vivax y P. ovale en la etapa eritrocitaria asexuada se ubican de preferencia en los reticulocitos, mientras que P. malariae parasita los eritrocitos viejos circulantes. Alteraciones hematolgicas y diagnstico. Es importante destacar que, tanto los eritrocitos parasitados como aquellos que no lo estn, presentan fragilidad osmtica alterada, lo cual trae como consecuencia hemlisis intra y extravascular. La eritropoyesis se altera por la infeccin parasitaria; sta desorganiza la liberacin de eritrocitos jvenes por la mdula sea, lo que se refleja en los frotis sanguneos, donde destacan las clulas de cambio. Cuando el Paludismo es producido por P. vivax, ovale o malariae, las secuelas patolgicas ms frecuentes son anemia de grado moderado y esplenomegalia. Las razones son variadas; por una parte son la consecuencia tanto de la hemlisis como de la baja de produccin de eritrocitos. Por otra dependen de procesos
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inmunolgicos, e incluso se postula que puede desarrollarse autoinmunidad. Adems, se pr esenta activacin del sistema del complememto con consumo de los componentes de la va clsica. En el Paludismo por P. falciparum, si individuos que no han sido inmunizados, no reciben tratamiento, se produce hemlisis masiva. El diagnstico de certeza del Paludismo, se realiza observando los parsitos en frotis de sangre o en gota gruesa. Es preferible efectuar frotis de sangre delgados, teidos con Giemsa o Wright, para mejor determinacin de la especie. Algunos prefieren los preparados en gota gruesa para detectar los parsitos. En la lectura del frotis se debe tener en cuenta que, en algunas ocasiones, las plaquetas se sobreponen en los eritrocitos lo cual puede ser confundido con plasmodio. Los parsitos presentan una cromatina prpura que no est presente en las plaquetas. Se recomienda tomar las muestras y examinar los frotis en cualquier momento, a intervalos de varios das, debido a que las infecciones no presentan una sincrona tan estricta, pues pueden existir etapas sexuales tardas. Los profesionales con experiencia en el diagnstico de laboratorio de Paludismo, aconsejan examinar los frotis de sangre como mnimo durante 15 minutos y la gota gruesa por 5 minutos. En relacin a las pruebas serolgicas que se cuentan hoy en da, no muestran gran utilidad en la infeccin aguda, pero s ayudan a detectar la infeccin en individuos que vuelven de reas endmicas. As como tambin de tamiz en donantes de sangre. Dentro de las numerosas tcnicas, la ms usada es la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). La tcnica basada en reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ha dado resultados bastante satisfactorios, que a futuro podra tener bastante utilidad. b) Babesiosis (Piroplasmosis)
Los parsitos Babesia se presentan de varias formas al interior de los eritrocitos: desde formas redondeadas u ovales y pequeas, hasta formas de anillos que se pueden confundir con las formas anulares del Paludismo. Las garrapatas duras del gnero Ixodidae, son las nicas reconocidas como vectores naturales de la Babesiosis. Lo usual, es que la garrapata al alimentarse de sangre del animal, adquiere el parsito desde un husped animal infectado y ste se multiplica y se distribuye por todo el cuerpo del vector, y pasa al humano cuando este husped es atacado por la garrapata infectada. Cabe tambin la posibilidad, que la Babesiosis sea transferida al humano por transfusin sangunea. Una vez que la Babesia entra al hospedero vertebrado, aparentemente invade al eritrocito directamente, sin tener una etapa previa heptica (exoeritrocitario) como sucede en el Paludismo. El parsito se reproduce por simple gemacin dentro del eritrocito infectado, hasta que ste se rompe y as las Babesias invaden otros eritrocitos y as se repite el ciclo. La manifestacin patolgica ms importante de la Piroplasmosis humana es consecuencia de la anemia hemoltica producida. Alteraciones hematolgicas y diagnstico. Habitualmente el diagnstico de esta infeccin se realiza por identificacin directa del parsito dentro del eritrocito, mediante frotis delgado de sangre y por gota gruesa, ambos coloreados con Giemsa. Preferentemente aparecen las forma anulares pequeos de B. miccroti, que difcilmente se pueden diferenciar de los trofozoitos juveniles de P. falciparum . La pruebas serolgicas no son satisfactorias para reemplazar los frotis de sangre. 2.1.2. Infeccin bacteriana b) Sepsis clostridial
Las garrapatas que parasitan animales domsticos y salvajes son los vectores biolgicos que trasmiten los protozoos intraeritrocitarios del gnero Babesia. Raramente se puede desarrollar la infeccin en el husped humano, lo que se caracteriza por fiebre, anemia hemoltica, ictericia, hemoglobinuria e insuficiencia renal.
Es producida por el Clostridium perfringens y ocurre despus de un aborto sptico o en asociacin con enfermedad del rbol biliar, infeccin de heridas traumticas, cncer, leucemia, etc. Frecuentemente la anemia hemoltica es fatal, ya que la hemlisis puede ser rpida y masiva.
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Probablemente en la hemlisis participan toxinas clostridiales que atacan los lpidos de la membrana. El diagnstico se sospecha cuando se presenta fiebre, ictericia y hemlisis intravascular. Se confirma con cultivos. 2.2. Venenos 2.2.1. Venenos de araas Todas las araas producen veneno, pero solo algunas son peligrosas para el hombre, estas ltimas son aquellas que tienen estructuras bucales que penetren la piel y que permiten inyectar un veneno patgeno. Los gneros ms peligrosos para el ser humano son Loxosceles y Latrodectus.
indefinido; en el 1/4 restante se presenta como aumento de volumen. En el transcurso de las horas adquiere caractersticas de dolor franco y creciente. Existen dos tipos de loxoscelismo cutneo: el necrtico (ms frecuente) y el edematoso (raro). El Loxoscelismo cutneo-visceral es la complicacin ms seria del Loxoscelismo, con un 25% de mortalidad, y se da en el 15% de los casos; es grave y de alta letalidad si no es tratado. Se inicia de manera similar al Loxoscelismo cutneo puro, pero alrededor de las 12-24 hrs. posteriores a la mordedura, se inician sntomas, signos y complicaciones derivadas principalmente de una hemlisis intravascular masiva: fiebre alta y sostenida, anemia violenta y pr ogresiva, ictericia, hematuria, hemoglobinuria que pueden conducir a insuficiencia renal (nefr osis hemoglobinrica), crisis hipertensivas, arritmias. El paciente se agrava rpidamente, aparece compromiso sensorial progresivo, que puede llegar a la inconsciencia, coma y muerte. Los exmenes de laboratorio muestran: anemia, trombocitopenia, tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) aumentados, compromiso heptico, hematuria y hemoglobinuria. Aspectos moleculares. El veneno de estas araas es claro y viscoso, contiene esterasas, fosfatasas alcalinas, y proteasas, pero lo ms importante es la esfingomielinasa D, que es el factor de necrosis drmica ms importante, ya que altera las membranas celulares, activa mecanismos de inflamacin, induciendo la quimiotaxis de neutrfilos, activa la va de complemento, causa trombosis vascular local y reacciones inmunolgicas. El uso de la antitoxina es en muchos casos poco efectivo o causa reacciones alrgicas a la inmunoglobulina antitoxina del animal en donde fue preparado el suero. Por esto, se han hecho numerosos estudios buscando el mecanismo molecular en donde se gatilla el proceso de hemlisis, para poder idear algn mtodo que permita detener la consecuencia ms grave de Loxoscelismo que es esta anemia fulminante que puede llevar a la muerte. El veneno de loxosceles presenta 2 protenas muy homlogas con actividad esfingomielinasa llamadas P1 y P2 que producen dermonecrosis en animales de experimentacin y en eritrocitos humanos induce in vitro, hemlisis mediada por complemento. Otras dos protenas homologas
Loxosceles laeta o ms bien conocida como araa de los rincones es una de las dos araas venenosas que existen en Chile, mide aproximadamente un centmetro y es de color caf pardusca.
Esta araa es de carcter tmido y de hbitos nocturnos. Afortunadamente en Chile los accidentes por mordedura de esta araa son muy infrecuentes considerando que se convive con ella quiz sin saberlo; ha sido encontrada en un 41% de las viviendas urbanas y 24% de las viviendas rurales, segn estudios hechos en el ao 1980 en la zona central de Chile.
Loxosceles laeta posee uno de los venenos ms poderosos del mundo, considerando el tamao de esta araa. El cuadro clnico que provoca se llama Loxoscelismo y puede ser mortal en algunos casos. La mordedura de araa ocurre slo en defensa propia. Puede acontecer durante todo el ao, pero es ms frecuente en primavera y verano. Generalmente sucede al comprimirla contra la piel durante la noche cuando la persona duerme (38%) o al vestirse (32%) con ropa colgada por largo tiempo en la muralla o en armarios. La mordedura es frecuente en cara y extremidades. La araa es vista en un 60% de los casos e identificada en un 13%.
Los cuadros producidos por la mordedura de las araas del gnero Loxosceles se conoce como loxoscelismo y adopta dos formas clnicas, Loxoscelismo cutneo y Loxoscelismo cutneo- visceral. El Loxoscelismo cutneo ocurre en aproximadamente un 90% de los casos, es habitualmente de comienzo brusco y en 3/4 de los casos existe dolor, prurito local o dolor
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denominadas P3 y P4 carecen de actividad. La hemlisis es dependiente del complemento, P1 y P2 no inducen hemlisis directamente, pero hacen a los eritrocitos susceptibles a lisis por complemento. In vivo existe una alta expresin de reguladores del complemento (CR1, DAF, CD59, entre otros) por lo que se creera que las toxinas de loxosceles estaran afectando a estos reguladores y as la clula sera ms sensible a la accin del complemento. El veneno de loxosceles produce una hendidura en el dominio extracelular de las glicoporinas del glbulo rojo dando origen a nuevos eptopos en donde actuara el complemento, no afectando en ninguna forma a CR1, DAF y CD59. Las glicoforinas contienen cido silico en su estructura; si se emplean neuraminidasas para sacar el cido silico de estas protenas, se obtienen glbulos r ojos sensibles al complemento por lo que se concluy que las glicoforinas ejercen un papel fundamental en la proteccin contra la accin del complemento. Las toxinas no se unen a la glicoforina purificada, por lo tanto la hendidura causada no es una accin proteoltica directa de ellas, sino que existe otr o componente que est desencadenando este cambio conformacional. Existe una correlacin de estos hechos. P2 se incorpora a la membrana dependiente de la dosis, hace que disminuyan las glicoforinas y aumenta la accin del complemento. Las toxinas participan en forma indirecta en la hemlisis; existen metaloprotenas que causan la hendidura de las glicoforinas, las toxinas seran activadores de estas metaloproteinasas. La glicoforina C tambin se ve afectada, esta protena se expresa en una amplia gama de clulas y aparece ms tempranamente en la maduracin, lo que explicara los efectos locales de la dermonecrosis causada. La identificacin del mecanismo de induccin de la susceptibilidad a lisis por complemento despus del envenenamiento abre la posibilidad del desarrollo de una estrategia teraputica ms eficaz. Al descubrir a las metaloproteinasas como las desencadenantes del proceso hemoltico, se podra elaborar un tratamiento mejor y ms efectivo que la antitoxina que se usa actualmente, dada la disponibilidad de drogas inhibitorias de estas enzimas. El mecanismo por el cual el veneno de araa induce la activacin de metaloproteinasas se desconoce.
Tratamiento. Actualmente el tratamiento incluye: Limpieza del rea afectada, fro local, elevacin y posterior inmovilizacin laxa de los miembros afectados; para el prurito se ocupa antihistamnicos H1; analgsicos; dapsona, colchicina (slo en cutneos muy graves), corticoides (discutible), suero antiloxosceles 12 ampollas (esto slo neutraliza la toxina libre en las 6 primeras horas despus de la picadura, pero el riesgo es un shock anafilctico, por la preparacin que tiene el suero en animales). Se deja que evolucione la placa, la escisin quirrgica inmediata de la herida puede ser perjudicial; el deshibridamiento y el injerto cutneo slo se reservan para cuando remiten los signos de inflamacin aguda. Dependiendo del contexto del accidente y del paciente, se debe considerar la administracin de antibiticos y profilaxis antitetnica. Se debe evaluar funcin renal, electrolitos plasmticos (especialmente el K + ), complicaciones cardiovasculares, alteraciones inmunolgicas y endocrinas. 2.2.2. Veneno de serpientes Una de las serpientes que puede llegar a causar anemia hemoltica es la Cobra. Es poco frecuente, ya que solo se presenta cuando la mordedura se produce directamente sobre un vaso sanguneo, inyectando el veneno directamente a la circulacin. Los pacientes pueden presentar anemia grave (Hb de 3-5 g/dl), reticulocitosis, leucocitosis, hiperbilirrubinemia, esferocitosis, hemoglobinemia y hemoglobinuria. Otras serpientes que pueden causar anemia hemoltica son la Marrn Rey de Australia y la Vbora de la Alfombra de Tnez. 2.2.3. Veneno de abejas Las anemias hemolticas por veneno de abejas son muy raras. Se conoce el caso de un nio que fue picado unas 200-300 veces, desarrollando una hemlisis intravascular que le provoc la muerte. 2.3. Frmacos oxidantes Ciertos fr macos pueden denaturar por oxidacin a la Hb; adems pueden actuar con el oxgeno molecular formando radicales libres y perxidos que denaturan la Hb y daa la membrana del glbulo rojo.
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Se pueden producir anemias en sujetos normales, observndose su aparicin en 1-2 semanas despus de administrar el medicamento. 2.4. Agentes fsicos 2.4.1. Quemaduras Se produce una hemlisis intravascular con presencia de esquistocitos, esferocitos y crenocitos. Un paciente que presenta un 15% de super ficie corporal quemada puede presentar hemoglobinuria moderada a marcada, en paciente con 20% de superficie corporal quemada y con quemaduras de tercer grado, la hemlisis puede ocurrir entre las 2448 horas causando destruccin de un 30% de la masa globular. La hemolisis ocurre porque el glbulo rojo no soporta temperaturas mayores a los 47C. Se pr oduce fragmentacin de las clulas, desarrollo de esferocitos por reduccin de la elasticidad de la membrana. El tratamiento que se indica es transfusin de concentrado de glbulos rojos. 2.4.2. Radiaciones ionizantes Estudios in vitro muestran que el glbulo rojo resiste dosis en el rango de 20.000 Rad. Para producir efectos letales. In vivo , ratones irradiados presentan tendencia a aglutinacin espontnea de los eritrocitos. Sin embargo, no existen claras evidencias que las radiaciones ionizantes induzcan a anemia hemoltica en humanos. En laboratorio podemos observar: anemia hemoltica, reticulocitos, hipohaptoglobinemia, hiperbilirrubinemia, hiperplasia eritroide y en casos sever os puede encontrarse hemoglobinemia y hemoglobinuria. Entre las caractersticas morfolgicas se puede observar: Cuerpos de Heinz, esquitocitos, esferocitos, eliptocitos y crenocitos. El proceso hemoltico desaparece 1-3 semanas de descontinuar el tratamiento. 2.5. Productos qumicos 2.5.1. Arsnico Hidruro arsnico, es un gas txico, que se genera por la reduccin metlica del arsnico
en pr oductos metlicos, se asocia su envenenamiento con el uso de cidos (ms frecuente), extraccin y refinacin de metales que contienen arsnico como impureza (galvanizado y soldado). Las manifestaciones clnicas aparecen a las 224 hrs. y son: dolor abdominal, nuseas, vmitos, orina de color oscura, icteria, anemia, reticulocitos, leucocitosis, hemoglobinuria, incidente renal agudo y a veces se presenta oliguria. La anemia hemoltica aparece porque la hemoglobina es capaz de fijar la arsina dentro del glbulo rojo, lo que lleva a una lisis de la clula, quizs como consecuencia de la accin de los compuestos formados en la oxidacin de la arsina. 2.5.2. Cobre La anemia asociada al Cu+2 puede deberse a: (a) Oxidacin de la Hb, (b) Inactivacin en la va glicoltica, (c) Dao de la membrana celular y (d) Aumento de la fragilidad osmtica Se asocia la anemia hemoltica como una primera manifestacin de la enfermedad de Wilson, enfermedad hereditaria en la que se acumula cobre en los tejidos. 2.5.3. Anhdrido trimetlico Es causante de anemia hemoltica y sntomas respiratorios. Anhdrido trimetlico se utiliza en la industria de marcos y manufactura de plsticos. La causa de hemolisis es poco conocida, pero se cree que mecanismos inmunolgicas pueden jugar algn papel. LECTURAS SUGERIDAS Anemias hemolticas intracorpusculares a) Membranopatas Alloisio, N. Analysis of the red cell membrane in a family with hereditary elliptocytosistotal or partial of protein 4.1. Hum Genet, 59(1):6871, 1981. Amador, M., Prez, S., Estrada, F., Ramos, M., Garca S., Carrillo-Farga, J. Las eliptocitosis hereditarias. Correlacin mor folgicamolecular. Revista Mexicana de patologa clnica 49 (4): 185-202, 2002.
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HEMATOLOGA
Captulo
ANEMIA POR HEMORRAGIA AGUDA

Milton Larrondo L.
1. Introduccin 2. Epidemiologa 3. Fisiopatologa 3.1. Transporte de oxgeno 3.2. Concentracin de hemoglobina y saturacin 3.3. Gasto cardiaco (GC) 3.4. Respuesta fisiolgica a la hemorragia 4. Tratamiento 4.1. Conducta clnica inicial 4.2. Hemorragia aguda y transfusin 4.3. Alternativas a transfusin alognica
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RESUMEN
La anemia por hemorragia aguda es la ms frecuente de las anemias agudas. Entre las causas ms comunes destacan: politraumatizados con mltiples fracturas y/o compromiso visceral, hemorragia por vrices esofgicas, ruptura artica, embarazo ectpico y hemofilia. Este captulo se refiere a la fisiopatologa y manejo de las hemorragias agudas.
1. INTRODUCCIN La anemia es definida por la reduccin en el nivel de hemoglobina (Hb) o disminucin del volumen de glbulos rojos (GR) o hematocrito (Hto) respecto a un rango de referencia de acuerdo a sexo y edad. Clnicamente se le puede clasificar como aguda o crnica. La anemia aguda est dada por una prdida de eritrocitos producto de hemlisis o hemorragia aguda. Esta ltima causal de anemia aguda es la etiologa ms frecuente en la clnica y ser referida en este captulo. 2. EPIDEMIOLOGA La incidencia de anemia aguda por hemorragia se desconoce. La gravedad clnica depende de la etiologa y si existe co-morbilidad. Entre las causas ms frecuentes estn las siguientes: Politraumatizados con mltiples fracturas y/ o compromiso visceral. Hemorragia por vrices esofgicas. Aproximadamente un 30% de pacientes cirrticos mueren por sangrado de vrices. La tasa de resangrado post terapia mdica es sobre el 60%. Ruptura artica. La mortalidad de una ruptura traumtica es de 80% previo a hospitalizar. Un aneurisma artico roto tambin conlleva una alta mortalidad, aunque reciba tratamiento quirrgico de inmediato (mortalidad sobre 70%). Embarazo ectpico. Con una deteccin precoz y manejo adecuado el pronstico es muy bueno. Mortalidad 1-2%.
Hemofilia. Un 10 a 15% de hemoflicos graves pueden desarrollar inhibidor para factor VIII y fallecer de una hemorragia aguda masiva.
Sexo. Los hombres tienen ms incidencia de anemia aguda por causas traumticas y por hemorragias digestivas altas. En mujeres pr edomina la anemia aguda de causa ginecolgica. Edad. Afecta preferentemente a adultos jvenes (traumatismos, menstruacin, embarazo ectpico). En pacientes sobre 50 aos es ms frecuente que la hemorragia aguda se adicione a un cuadro de anemia crnica. Es el caso de la hemorragia digestiva por patologa gastrointestinal o personas en terapia con anticoagulantes orales o AINEs. 3. FISIOPATOLOGA La funcin de los GR es el transporte de oxgeno (O2) desde el pulmn a los tejidos y de CO2 desde los tejidos al pulmn. Esto se realiza mediante la molcula de Hb, una protena tetramrica compuesta de grupo heme y globina. 3.1. Transporte de oxgeno Los principales deter minantes son la concentracin de Hb, la saturacin de oxgeno, el gasto cardiaco, la tasa de extraccin de oxgeno y el flujo sanguneo. Para comprender los parmetros del transporte de oxgeno stos se detallan en la tabla 9-1.
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Tabla 9-1. Transporte de oxgeno Parmetro Gasto cardiaco (GC) Contenido arterial oxgeno (CaO2) Contenido O2 venoso mixto ( CvO2) Oferta oxgeno ( DO2) Consumo oxgeno ( VO2) Tasa extraccin oxgeno Frmula VE x FC 1.34xHbxSaO2 + (0.003x PaO2) 1.34xHbxSvO2 + (0.003x PvO2) GC x CaO2 x 10 GC x (CaO2-CvO2) x 10 VO2 / DO2 Rango normal 4-6 L/min 16-22 mL/dL 12-17 mL/dL 500-750 mL/min/m2 100-180 mL/min/m2 0.23- 0.30
Hb, Concentracin hemoglobina en g/dL; VE: volumen expulsivo; FC, frecuencia cardiaca; SaO2, saturacin oxgeno arterial; SvO2:, saturacin oxgeno venosa mixta; PaO2 , Presin parcial oxgeno arterial; PvO2, presin oxgeno venosa mixta.
3.2. Concentracin de hemoglobina y saturacin La relacin de la Hb con el oxgeno sigue una curva de tipo sigmoidal. Esta curva de disociacin de la Hb permite una afinidad apropiada a situaciones de aumento del consumo tisular. La P50 es la presin de O2 a la cual el 50% de la Hb se encuentra saturada con oxgeno y normalmente es de 26.3 mm Hg. La P50 aumenta durante la anemia, hipoxia o alcalosis lo que disminuye la afinidad de la Hb por el oxgeno y mejora su entrega a nivel de los tejidos. 3.3. Gasto cardiaco (GC) El GC est determinado por el VE y la FC (tabla 9-1). En la anemia el GC aumenta porque se incrementa la fr ecuencia car diaca por estimulacin simptica a travs de receptores beta adrenrgicos, los que tambin estimulan la contractilidad del miocardio. Considerando que el corazn, a diferencia del resto de los tejidos, extrae normalmente el 80% de la oferta de oxgeno, su capacidad para aumentar el trabajo miocrdico descansa necesariamente en un incremento del flujo coronario que le permite aumentar la extraccin de oxgeno. Sin embargo, si el cuadro hemorrgico es severo (nivel de Hb < 7 g/dL) el flujo coronario se redistribuye hacia el epicardio, dejando
expuesto al tejido subendocrdico a riesgo de isquemia y eventual infarto. En relacin al resto de los rganos, stos compensan la anemia, aumentando la oferta de oxgeno tisular a travs de aumento de flujo capilar o redistribuyendo el flujo sanguneo dentro del propio rgano. Si la oferta de oxgeno se reduce (disminuye Hb por hemorragia aguda) su extraccin puede aumentar entre un 15 a 25% para mantener un consumo constante en los tejidos. Si adems aumenta el volumen circulante (manejo de hipovolemia por hemorragia) se incrementar el gasto cardiaco mejorando la disponibilidad de oxgeno tisular. En condiciones normales la oferta de oxgeno (DO2) es de 1.000 mL/min y el consumo (VO2) es de 200 mL/min. La razn normal DO2/ VO2 es de 5:1 y solo el 20% del oxgeno es extrado dejando una saturacin venosa mixta de 80%. Por lo tanto en situaciones de hipoxia (anemia severa) el paciente puede permanecer estable en la medida que aumente la extraccin de oxgeno y mantenga esta relacin sobre 2:1 (DO2/ VO2). En sujetos sometidos a hemodilucin isovolmica, en los cuales se redujo el nivel de Hb de 13 g/dL a 5.0 g/dL no se observ un incremento de lactato y el consumo aument levemente (3.07 mL O2 / Kg/ min a 3.42 mL O2 /Kg/min). Sin embargo, estos resultados si bien sugieren un bajo riesgo de isquemia
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miocrdica an con 5 g/dL de Hb, sta se produjo en condiciones de isovolemia, lo que no sucede en situacin de hemorragia aguda. 3.4. Respuesta fisiolgica a la hemorragia La anemia por un cuadro de hemorragia aguda pr oduce una reduccin de la capacidad transportadora de oxgeno junto a una disminucin del volumen intravascular, generando hipoxia e hipovolemia. La hipovolemia lleva a hipotensin arterial lo que es detectado por receptores en el bulbo carotideo, arco artico y corazn. Estos transmiten impulsos a travs de fibras aferentes del vago y nervio glosofarngeo hacia la corteza cerebral, mdula oblongada y pituitaria. En la mdula, la actividad del sistema autnomo simptico se incrementa produciendo norepinefrina en terminales nerviosos y adems epinefrina en mdula adrenal. Tambin se produce aumento de la secrecin de hormona antidiurtica a nivel de la pituitaria lo que incrementa la reabsorcin de agua en tbulos renales. La disminucin de la perfusin renal permite la secrecin de r enina por las clulas yuxtaglomerulares en las arteriolas aferentes, lo que estimula la produccin de angiotensina I la cual es convertida a angiotensina II por enzimas convertidoras. La angiotensina II produce contraccin de la
musculatura lisa arteriolar y adems estimula la produccin de aldosterona. Esta aumenta la reabsorcin de sodio desde el tbulo proximal, lo que lleva a aumento del volumen intravascular. El tono venoso aumentado permite mejorar la precarga y el volumen diastlico final y con ello incrementar el volumen expulsivo. Entonces, en este estado de hipoxia hipovolmica (hemorragia aguda) el incremento en el tono venoso por la descarga simptica permite dominar en la etapa inicial el efecto vasodilatador de la hipoxia, sin embargo si no se corrige la hipovolemia esta vasoconstriccin mantenida llevar a hipoxia tisular por hipoper fusin, luego shock, falla multiorgnica y eventualmente la muerte del paciente. 4. TRATAMIENTO Debido al riesgo vital del paciente es importante determinar la masa globular perdida y la volemia efectiva, para as definir una terapia apropiada. Por ejemplo, una hemorragia severa con prdida de 150 mL/min implica una prdida de la mitad de la volemia en 20 minutos, lo que ser fcil de reconocer por los signos de shock hipovolmico r esultante. Sin embargo, hemorragias ms leves son ms difciles de reconocer por lo que se han clasificado de la siguiente manera (tabla 9-2)
Tabla 9-2. Clases de Hemorragia Clase I II % volumen sanguneo < 15 15-30 FC Normal Aumento Presin arterial Normal N o baja Perfusin tisular Normal Baja Terapia Ninguna Cristaloides Coloides, eventual uso de GR? Cristaloides Coloides, GR Cristaloides Coloides, GR
III IV
30-40 > 40
Aumento Aumento
Baja Baja
Disminuida Disminuida
GR, glbulos rojos.
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4.1. Conducta clnica inicial A continuacin se nombra las principales conductas clnicas iniciales que se debe considerar ante un paciente con hemorragia aguda: Monitorizar la presin arterial, uso de oxmetro y monitor cardiaco Suplementar oxgeno va cnula nasal o mascarilla Instalar va venosa perifrica e infundir 2 L de solucin cristaloide Considerar transfusin si el paciente per manece hipotenso despus de administrar volumen. Vasopresores no estn indicados en shock hipovolmico Cuando el paciente es estabilizado se debern iniciar medidas especficas para el manejo de la causa de la anemia. 4.2. Hemorragia aguda y transfusin El mejor ejemplo de hemorragia aguda lo constituye el paciente politraumatizado que generar una gran demanda de componentes sanguneos al Banco de Sangre de manera inmediata poniendo a prueba el stock de seguridad de componentes sanguneos y los procedimientos establecidos de manejo de esta emergencia transfusional masiva. La indicacin clnica habitual de transfusin inmediata est dada por las siguientes condiciones: Evidencia de shock hipovolmico en paciente con presin sistlica menor a 70 mm Hg. Persistencia de presin sistlica bajo 90 mm Hg despus de administracin rpida de 2 litros de cristaloides. Paciente hipotenso, con evidencia de sangrado activo y con Hb menor a 8 g/dL. Esta indicacin se sustenta en el aumento de mortalidad de pacientes en shock hipovolmico con Hb < 8 g/dL. En el rea de r eanimacin deben estar disponibles unidades tipo O que se transfundirn sin pruebas cruzadas. Unidades grupo O Rh (-) sern usadas en mujeres en edad frtil y se debe limitar el uso de estas unidades a no ms de cuatro. Luego de 10 a 15 minutos el Banco de Sangre estar en condiciones de enviar unidades tipificadas y con pruebas cruzadas en fase inmediata (compatibilidad
ABO). La necesidad clnica inmediata de la transfusin no permite esperar hasta completar las pruebas cruzadas (fase de antiglobulina). El riesgo inmunolgico que posee esta conducta transfusional ha sido analizado en numerosos estudios y la conclusin es que la administracin en situacin de emergencia absoluta de unidades de GR tipo O sin pruebas cruzadas o ABO especfico no se ha asociado a reacciones hemolticas mayores. S se han producido reacciones por aloanticuerpos a otros grupos como Kell, Kidd o Rh pero con mnima repercusin clnica. 4.3. Alternativas a transfusin alognica En el paciente crtico, considerando las dificultades en disponer de componentes sanguneos y los riesgos de la transfusin, se han buscado alternativas. Entre ellas el uso de eritropoyetina que si bien no sirve en el manejo de la anemia aguda, se est utilizando en algunas unidades de pacientes crticos para el manejo de la anemia crnica o episodios leves de hemorragia que no requieren uso de componentes sanguneos. En relacin a sustitutos de glbulos rojos como por ejemplo soluciones de perfluorocarbonos, hemoglobina encapsulada en liposomas y otros, todava no demuestran eficacia clnica y un buen perfil de seguridad, por lo cual su uso clnico est an a nivel de investigacin bajo estrictos protocolos clnicos. LECTURAS SUGERIDAS Greenburg AG. Pathophysiology of anemia. Am J Med 101: 7-11, 1996. Hebert, P.C., Wells, G., Blajchman, M.A., et al. A multicenter, randomized, control clinical trial of transfusion requirements in critical care. N Engl J Med 340: 409-417, 1999. Hebert, P.C., Hu, L.Q., Biro, G.P. Review of physiologic mechanisms in response to anemia. Can Med Assoc J. 156: S27-40, 1997. Hebert, P.C., Wells, G.A., Marshall, J.C. et al. Transfusion requirements in critical care. A pilot sudy. JAMA 273: 1439-1444, 1995 Hsia, C. Respiratory function of hemoglobin. N Engl J Med 338: 239-247, 1998. Moore, F.A., McKinley, B.A., Moore, E.E. The
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next generation in shock resuscitation. Lancet 363: 1988-1996, 2004 Morales, D., Madigan, J., Cullinane, S., et al. Reversal by vasopressin of intractable hypotension in the late phase of hemorrhagic shock. Circulation 100: 226-229, 1999 Mullon, J., Giacoppe, G., Clagett C, McCune D, Dillard T. Transfusion of polymerized bovine hemoglobin in a patient with severe autoimmune hemolytic anemia. N Engl J Med 342: 1638-1643, 2000 Sloan, E.P., Koenigsberg, M., Gens, D., et al. Diaspirin cross-linked hemoglobin in the treatment of severe traumatic hemorrhagic shock: a randomized control efficacy trial. JAMA 282: 1857-1864, 1999 Stehling, L., Zauder, H.L. Acute normovolemic hemodilution. Transfusion 31: 857-868, 1991. Van Iperen, C.E., Gaillard, C.A, Kraaijenhagen, R.J., Braam, B.G., Marx, J.J., van de Wiel, A. Response of erytr hr opoiesis and ir on metabolism to recombinant human erythropoietin in intensive care unit patients. Crit Care Med 28: 2773-2778, 2000. Vincent, J.L., Baron, J.F., Reinhart, K., et al. Anemia and blood transfusion in critically ill patients. JAMA 288: 1499-1507, 2002. Weiskopf, R.B., Viele, M.K., Feiner, J., et al. Human cardiovascular and metabolic response to acute, severe isovolemic anemia. JAMA 279: 217-221, 1998.
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HEMATOLOGA
SECCIN III
GLBULOS BLANCOS
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HEMATOLOGA
Captulo
10
LEUCOCITOS Y SISTEMA INMUNE

Ivn Palomo G., Jaime Pereira G. y Ulises Vergara C.
1. Introduccin 2. Leucocitos 2.1. Generalidades sobre hematopoyesis 2.2. Linfocitos 2.2.1. Caractersticas generales 2.2.2. Diferenciacin de linfocitos 2.2.3. Reconocimiento antignico 2.2.4. Activacin de los linfocitos 2.3. Sistema fagoctico mononuclear 2.3.1. Monocitos 2.3.2. Macrfagos 2.3.3. Clulas dendrticas 2.4. Granulocitos 2.4.1. Neutrfilos 2.4.2. Eosinfilos 2.4.3. Basfilos 3. rganos linfoides 3.1 rganos linfoides primarios 3.1.1. Mdula sea 3.1.2. Timo 3.2. rganos linfoides secundarios 3.2.1. Ganglios linfticos 3.2.2. Bazo 3.2.3. Tejido linfoide asociado a mucosa 3.2.4. Amgdalas 4. Trnsito linfocitario
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RESUMEN
Los glbulos blancos o leucocitos incluyen linfocitos, granulocitos (neutrfilos, eosinfilos y basfilos) y monocitos, que se forman en la mdula sea a partir de clulas pluripotentes, en un proceso finamente regulado y con la participacin de diversas citoquinas y receptores para las mismas. Los linfocitos son las clulas que participan en la inmunidad adquirida o especfica. Las clulas T participan en la inmunidad celular y las clulas B en la inmunidad humoral. Una tercera subpoblacin de linfocitos, las clulas NK, participan en la inmunidad celular de tipo innata. Las clulas del Sistema Fagoctico Mononuclear (monocitos, macrfagos y clulas dendrticas) tienen como funcin fagocitar y presentar antgenos a las clulas T. Los granulocitos presentan particularidades morfolgicas y funcionales. La principal funcin de los neutrfilos es su capacidad fagoctica. En el captulo se explican los procesos de activacin, quimiotaxis, fagocitosis y bacteriolisis. En el punto 2 del captulo se describe la estructura y funcin de los diferentes tipos de leucocitos, y su nmero en sangre de individuos normales, lo cual se debe tener en cuenta al momento de interpretar los resultados de hemograma en diferentes patologas hematolgicas, tanto malignas como no malignas. Los rganos linfoides se pueden clasificar en primarios (timo y mdula sea) y secundarios (bazo, ganglios linfticos y tejido linfoide asociado a mucosas). En el timo maduran los LT y en la mdula sea los LB. En los rganos linfoides secundarios, los linfocitos toman contacto con los antgenos y es en ellos donde se genera la respuesta inmune especfica (clulas efectoras y de memoria). En estos rganos existen zonas ricas en clulas B, y otras en que, principalmente, existen clulas T. La capacidad de los linfocitos de recircular entre los rganos linfoides secundarios, vasos linfticos, conducto torcico y vasos sanguneos le permiten tomar contacto con antgenos en diferentes lugares del organismo.
1. INTRODUCCIN Los leucocitos forman parte del sistema inmune, el que se incluye entre los mecanismos biolgicos destinados a mantener la organizacin estructural y funcional de los individuos y est genticamente programado para la neutralizacin y eliminacin, tanto de agentes infecciosos, clulas y molculas extraas como de detritus celulares y clulas propias envejecidas, alteradas o transformadas. El sistema inmune es, por lo tanto, esencialmente destructivo y requiere de un sofisticado mecanismo de regulacin que permita responder agresivamente contra lo extrao o contra lo propio envejecido, alterado o transformado (concepto de inmunidad) al tiempo que se reconoce, se acepta, se tolera o no se destruye lo propio normal (concepto de tolerancia). En este captulo se revisan las caractersticas fundamentales de los glbulos blancos y la
forma como ellos se organizan en los distintos tejidos y rganos asociados al sistema inmune. 2. LEUCOCITOS El sistema inmune est constuido por clulas y mediadores solubles producidos por ests clulas (tabla 10-1). El primer paso en el desarrollo de una respuesta inmune es siempre el reconocimiento de aquello que debe ser eliminado (y que genricamente se denomina antgeno), por receptores especficos que existen en la membrana de las clulas inmunocompetentes. Las clulas del sistema inmune incluyen tanto linfocitos T, linfocitos B y clulas NK, como clulas inflamatorias y diferentes clulas fagocticas o endocticas especializadas en la captura, procesamiento y presentacin de antgenos. Desde un punto de vista funcional, las clulas y mediadores solubles del sistema inmune se han
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separado tradicionalmente, en componentes naturales o innatos (Inmunidad Innata) y componentes especficos, adquiridos o adaptativos (Inmunidad Adquirida), que han desarrollado receptores y mecanismos distintos para el reconocimiento inmunolgico. As, mientras el componente adquirido se ha desarrollado en torno al tamao y diversidad de nuestro repertorio linfocitario (estimado en 1018 linfocitos T y 1014 linfocitos B) que confiere una capacidad virtualmente ilimitada para reconocer y eliminar miles de millones de antgenos distintos, el componente natural o innato se ha desarrollado en torno a unos pocos receptores (PRR: PAMP Recognition Receptor) que reconocen patrones moleculares propios de los agentes infecciosos (PAMP: Pathogen Associated Molecular Pattern) o patrones molecular es propios de clulas pr opias envejecidas, transfor madas o tumorales (ACAMP: Apoptosis Cell Associated Molecular Pattern). Desde un punto de vista estructural en cambio, los componentes celulares del sistema inmune pueden separarse en dos compartimientos distintos y finamente regulados, que difieren en su organizacin celular y en las estrategias utilizadas en la resistencia a agentes infecciosos, en la captura y presentacin de antgenos y en la distincin entre agentes dainos y substancias inocuas: (a) el Compartimiento sistmico, que incluye mdula sea, bazo y ganglios linfticos y, (b) el Compartimiento epitelial, que incluye tejido linfoide asociado a la piel (SALT: Skin Associated Lymphoid Tissue), a mucosas (MALT: Mucosal Associated Lymphoid Tissue) y a glndulas secretoras (glndulas lagrimales, glndulas salivales y glndulas mamarias).
La especificidad de la respuesta inmune, reside siempre en los linfocitos T y linfocitos B y la eliminacin del antgeno puede hacerse en for ma directa mediante una respuesta celular citotxica (respuesta celular) o de manera indirecta a travs de la sntesis y secrecin de anticuerpos especficos, que reclutan y activan mecanismos accesorios de eliminacin (respuesta humoral). Las clulas accesorias (clulas NK, fagocitos, clulas inflamatorias y otras clulas) cumplen, en cambio, importantes funciones efectoras en la inmunidad innata y en el procesamiento y presentacin de antgenos durante la inmunidad adquirida. La expansin clonal de linfocitos T y B, es entonces un requisito necesario para el desarrollo de una respuesta inmune efectiva, pero se requieren 3 a 5 das para la generacin de linfocitos efectores diferenciados, capaces de la eliminacin especfica del antgeno. La accin de los mecanismos naturales o innatos de inmunidad ocurre de manera inmediata y puede, por lo tanto, controlar de manera rpida y efectiva la replicacin de los agentes patgenos, evitando probables daos en el lapso requerido para el desarrollo de una respuesta adquirida. Las clulas del sistema inmune innato (clulas accesorias) y del sistema inmune adquirido (linfocitos T y B), derivan de clulas troncales pluripotentes (clulas madre o stem cells) de la mdula sea, rgano en el que ocurre este proceso hematopoytico de diferenciacin y maduracin las clulas sanguneas (ver punto 2.1).
Tabla 10-1. Componentes del sistema inmune Clulas Linfocitos T y Linfocitos B* Clulas NK (clulas natural killer) Clulas dendrticas Monocitos y Macrfagos Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Mastocitos Clulas epiteliales Clulas endotetiales Otras clulas Mediadores solubles Anticuerpos* Sistema del Complemento Citoquinas y Quimioquinas Protenas catinicas Radicales libres
*, son las nicas clulas o mediadores solubles antgeno-especficos
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2.1. Generalidades sobre hematopoyesis Durante la vida fetal la hematopoyesis (ver captulo 1) ocurre en el hgado y en el bazo. A partir del nacimiento se suspende el proceso en estos rganos y se incrementa la actividad de la mdula sea, iniciada en los ltimos meses de gestacin. En la mdula sea, las clulas se desarrollan en un espacio tridimensional y en constante comunicacin y dinmica interaccin de las clulas hematopoyticas troncales (HSCs: Hematopoietic Stem Cells) con las clulas estromales del entorno local, mediante factores solubles (factores de crecimiento, citoquinas y quimioquinas) o contactos clula-clula. Las clulas hematopoyticas troncales (ver captulos 1 y 2) son elementos centrales en la formacin de celulas sanguneas a lo largo de nuestra vida. Sus capacidades de autorrenovacin y multipotencialidad, permiten su diferenciacin en distintas lneas celulares (linfocitos, clulas mieloides o eritrocitos) en los rganos hematopoyticos que proporcionan el entorno celular y molecular requerido en el proceso: (a) la estructura anatmica y disposicin tridimensional de vasos sanguneos y diferentes compartimientos celulares; y (b) estroma tisular, que incluye diversos tipos celulares (fibroblastos, adipocitos, macrfagos, linfocitos y clulas endoteliales de los sinusoides) y macromolculas de la matriz extracelular (colgeno, fibronectina, laminina, hemonectina, tenascina, trombospondina y proteoglicanos). La proliferacin y diferenciacin celular en la mdula sea, depende de la interaccin entre clulas hematopoyticas progenitoras y clulas estromales de soporte, que proporcionan los factores de crecimiento CSF, citoquinas, quimioquinas y molculas de adhesin requeridas en el proceso y en la organognesis de los rganos linfoides secundarios, tales como linfondulos, Placas de Peyer, el compartimiento linfoide del bazo (pulpa blanca) y el tejido linfoide asociado a mucosas. Para el desarrollo de linfocitos en la mdula sea, la diferenciacin a partir de HSC debe pasar por un tipo celular inter medio denominado progenitor linfoide comn (CLP: common lymphoid progenitor), en el cual el programa de diferenciacin en clulas mieloides o eritroides se ha apagado. Al parecer la subdivisin del potencial de la
clula hematopoytica precursora en los compartimientos linfoide, mieloide o eritroide depende de la expresin de los factores de transcripcin PU.1 y GATA-1. GATA-1 es un regulador positivo del desarrollo eritroide, que bloquea los programas linfoide y mieloide antagonizando con PU.1 Cuando la expresin de GATA-1 est reprimida la expresin del programa linfoide o mieloide depender de los niveles de expresin de PU.1. Altos niveles promueven la diferenciacin mieloide activando la expresin de receptores para citoquinas mieloides y bloqueando la expresin de citoquinas y sus receptores linfocides (como por ejemplo, IL-7 y su receptor IL-7R). Una vez que han abandonado el rgano linfoide primario, los linfocitos T (Timo) y linfocitos B (Mdula sea) recircularn a travs de los rganos linfoides secundarios (incluyendo ganglios linfticos y placas de Peyer), en bsqueda de antgenos. En la mdula sea las clulas hematopoyticas se distribuyen en tres compartimientos morfofuncionales: (a) compartimiento de clulas madres, (b) compartimiento mittico o de divisin y (c) compartimiento de maduracin almacenamiento. Las clulas del compartimiento stem cell (de clulas madres) corresponden a menos del 1% de las clulas de la mdula. No son identificables morfolgicamente, por lo que deben ser estudiadas en cultivos in vitro. La stem cell o clula madre pluripotente, tambin denominada CFU-ML (Unidad formadora de colonias mieloides y linfoides) tiene la capacidad de dividirse y autoperpetuarse. Da origen a dos lneas celulares principales, mieloide y linfoide. En la lnea mieloide, a partir de la CFU-GEMM (granuloctica, eritroide, monoctica y megacarioctica) se producen dos diferentes CFU encomendadas, CFU-GM (granulocito, monocito) y CFU-MegE (megacariocito, eritroide); posteriormente se generan las CFU-G, CFU-M, CFU-E, CFU-Meg. En el compartimiento mittico, a partir de las CFU de las lneas celulares especficas antes mencionadas, se generan las primeras clulas reconocibles morfolgicamente de cada lnea celular: mieloblasto en el caso de los granulocitos, que posteriormente madurar a promielocito y luego a mielocito etapa en la cual se diferencian las tres lneas especficas de
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los granulocitos (neutrfilos, eosinfilos y basfilos); las etapas posteriores de maduracin de los granulocitos corresponden a juveniles, baciliformes y segmentados. Por su parte, la serie monoctica madura en las etapas de monoblasto y monocito. De la CFU-Meg, en la lnea megacarioctica se reconoce las etapas de megacarioblasto, megacariocito y plaquetas; por su parte en la serie eritroblstica se reconocen las etapas, pr oeritroblasto, eritroblasto basfilo, eritroblasto poliromatfilo, eritroblasto ortocromtico, reticulocito y glbulo rojo. En la lnea linfoide, a partir de la CFU-L, despus de un proceso de diferenciacin y maduracin se originan los linfocitos T y linfocitos B. En el proceso de diferenciacin y maduracin de las diferentes lneas celulares, participan varios factores de maduracin y citoquinas secretadas por clulas del estroma. Existen factores que actan sobre progenitores de multilinaje: Kit ligand, GMCSF (CSF: Factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos), G-CSF (CSF de granulocitos), IL-3 (IL= Interleuquina), IL-4, IL-6, IL-11, IL-12, Flt3 ligand, Factor inhibidor de leucemia (LIF), Oncostatin (OSM). Algunos de estos factores participan tambin en la maduracin de algunas lneas celulares en particular. Entre los factores de maduracin de los granulocitos y monocitos, se reconocen a GM-CSF; G-CSF favorece la maduracin a neutrfilos, M-CSF a monocitos, IL-5 a eosinfilos y Kit ligand a basfilos. Por su parte, el regulador fisiolgico de la
maduracin eritroide es la eritropoyetina (EPO) y de los megacariocitos la trombopoyetina (TPO) tambin denominada mpl-ligand. Kit ligand tambin parece tener participacin en la maduracin eritroide. En la lnea linfoide B, que a diferencia de los linfocitos T, maduran en la mdula sea, el factor de maduracin es la IL7. Las clulas de las diferentes lneas hematopoyticas presentan receptores para los factores de maduracin antes nombrados. 2.2. Linfocitos Los linfocitos, junto con las clulas presentadoras de antgeno (CPA) son la base celular de la respuesta inmune especfica. 2.2.1. Caractersticas generales Los linfocitos constituyen aproximadamente el 20-25% de los leucocitos circulantes en el adulto (tabla 10-2). Desde el punto de vista morfolgico, en los frotis sanguneos teidos con May Grnwald-Giemsa se distinguen dos tipos: los linfocitos pequeos (7-9 m) que presentan una relacin ncleo/citoplasma alta y representan la mayora, y los linfocitos grandes (11-20 m), que presentan citoplasma ms abundante (figura 10-1). El ncleo generalmente es redondo u oval y compuesto predominantemente de heterocromatina. Los nuclolos pueden no observarse con tincin de May Grnwald-Giemsa. En los linfocitos grandes puede observarse grnulos citoplasmticos (linfocitos granulares grandes).
Tabla 10-2. Leucocitos normales en sangre perifrica de los humanos adultos normales Tipo de clula Leucocitos (totales) Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Monocitos Linfocitos % 60-65 0-4 <1 4-10 20-25 x103/L) 4 - 10 2 - 7 0 - 0,4 0,1 - 1 0,2 - 0,8 1,5 - 3,5
Figura 10-1. Microfotografa de un linfocito pequeo y grande en frotis de sangre teidos con May Grnwald Giemsa. (a) linfocito pequeo (7-9 m de dimetro), su relacin ncleo/citoplasma es alta; (b) linfocito grande (11-20 m), presenta citoplasma ms abundante.
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Los denominados linfocitos activados o reactivos corresponden a linfocitos asociados a una respuesta inmune. Estos linfocitos estimulados antignicamente se caracterizan por presentar citoplasma abundante, hiperbasfilo (azul intenso) y de bordes irregulares. Los linfocitos, al igual que otros leucocitos, se pueden movilizar (recirculacin y homing). Inicialmente se forma un pseudpodo que rodea la clula y al contraerse empuja el ncleo hacia delante quedando una cola citoplasmtica llamada urpodo (ura: cola, podi: pie), presentando la clula un aspecto de espejo de mano o pera. La velocidad es de aproximadamente 20 /minuto, la que aumenta cuando la clula es estimulada. El urpodo, adems de permitir el movimiento facilita las interacciones con otras clulas (linfocitos, macrfagos, etc.). Los linfocitos adems de presentar diferencias morfolgicas, constituyen un grupo celular funcionalmente heterogneo. Se dividen en tres grupos funcionales diferentes: los linfocitos T (LT) que participan en la inmunidad adquirida de tipo celular, los linfocitos B (LB) que participan en la inmunidad adquirida de tipo humoral y las clulas NK (Natural Killer) que no expresan marcadores de clulas T o de clulas B y que participan en la inmunidad natural o innata. En humanos, las clulas precursoras de linfocitos T y de linfocitos B, originadas a partir de la CFU-L en la mdula sea, experimentan un proceso de maduracin y diferenciacin en el timo y mdula sea, respectivamente. La mayor parte de los linfocitos que se encuentran en la sangre, linfa, ganglios linfticos y timo corresponden a subpoblaciones de linfocitos T. En la mdula sea, en cambio, el mayor porcentaje de las poblaciones linfocitarias corresponde a linfocitos B; en el bazo y amgdalas el porcentaje de ambas subpoblaciones es similar. Las clulas plasmticas generalmente presentan forma ovalada. Corresponden a las clulas efectoras de la lnea linfoide B (productoras de inmunoglobulinas). El ncleo, con una distribucin radial de la heterocromatina, est ubicado excntricamente y el citoplasma presenta una gran cantidad de retculo endoplsmico rugoso que le otorga la intensa basofilia que le caracteriza al ser teidas estas clulas con May Grnwald - Giemsa. A nivel perinuclear presenta un desarrollado aparato de Golgi (figura 10-2).
Figura 10-2. Microfotografa de una clula plasmtica.

Las clulas plasmticas presentan un dimetro de 10-25 m. Se caracterizan por presentar ncleo excntrico y basofilia citoplasmtica. Se ubican principalmente en los rganos linfoides secundarios y muy raramente en sangre perifrica.
En el estudio hematolgico de rutina de los linfocitos sanguneos slo se utiliza la tincin de May-Grnwald-Giemsa, metodologa que no permite conocer la lnea celular de los linfocitos. En caso de requerirse dicha informacin, como es el caso de diagnstico diferencial de leucemias, se utiliza citometra de flujo para identificar las subpoblaciones de linfocitos. Al respecto, el uso de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos permite identificar marcadores de superficie designados con el sistema CD (cluster designation) a modo de ejemplo se muestran algunos en la (tabla 10-3). De esta forma se reconoce como marcadores de las clulas T al complejo CD3 y a las dos subpoblaciones ms importantes de esta lnea celular se les identifica por ser CD4+ (LT helper) o CD8+ (LT citotxicos). Basndose en el patrn de secrecin de citoquinas, se reconocen dos subpoblaciones de clulas T helper: LTh1 y LTh2. Los LTh1 secretan IL-2, IFN-, IL-3 y estimulan la inmunidad mediada por clulas; los LTh2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y favorecen la respuesta inmune humoral. Por su parte, los linfocitos B se reconocen por la expresin en su membrana de inmunoglobulinas IgM y en algunos casos IgD. Adems son CD19+, CD20+, CD22+ y tambin expresan molculas MHC clase II. Las clulas NK presentan los siguientes marcadores: FcRIII (CD16), CD56 y CD57.
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Tabla 10-3. Molculas CD asociadas a linfocitos CD CD2 CD3 CD4 CD7 CD8 CD10 CD11b CD16 CD19 CD20 CD21 CD22 CD23 CD25 CD28 CD29 CD35 CD40 CD54 CD55 CD56 CD57 FcRIIa Receptor de IL-2 baja afininidad VLA () CR1 ICAM-1 DAF Sinnimo LFA-2 Expresin clula LT, clulas NK LT LT helper LT y timocitos LT citotxicos LT inmaduros Granulocitos, monocitos, NK Granulocitos, macrfagos, clulas NK Clulas B Pre-B y LB LB LB maduros LB activados LT, LB, macrfagos Activados LT citotxicos Amplia Granulocitos, monocitos, eritrocitos LB LB Amplia Amplia NK, algunos LT NK, algunos LT Funcin(es) MAC Transduccin de seales Adhesin, transduccin de seales Adhesin, transduccin de seales MAC. Con CD18 forma Mac-1 Receptor de iC3b Receptor de baja afinidad para IgG Regulacin de activacin Regulacin de activacin? Receptor de C3d y virus de Epstein Barr Ligando de CD23 MAC Receptor de IgE de afinidad intermedia Con cadena 70 KDa forma receptor alta afinidad IL-2 MAC con CDw49a,b,c,d,e,f Receptor de C3b Une CD40-L. Activacin de LB. MAC Regulador del complemento
CALLA CR3 () FcRIII
CD, cluster designation; MAC, molcula de adhesin celular; LB, linfocitos B; LT, linfocitos T; LFA, antgeno asociado a funcin de linfocito; ICAM, molcula de adhesin intercelular; VLA, antgeno muy tardo; DAF, Decay Accelerating factor; NK, clulas Natural Killer.
2.2.2. Diferenciacin de linfocitos Los linfocitos se generan a partir de la CFU-L de la mdula sea que presenta desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) en el ncleo y expresa CD34, C-Kit y HLA-DR en la membrana celular. La maduracin de ambas lneas celulares, T y B implican una etapa independiente de antgeno, que ocurre en la mdula sea (lnea B) y en el timo (lnea T), y una etapa dependiente de antgeno que en ambas lneas celulares ocurre en los rganos linfoides secundarios (ver punto 3.2). La maduracin de las clulas B se puede separar en dos estadios previos al LB maduro: Pro-B en que las clulas son TdT+, CD10+, CD19+, CD24+, CD34+, CD38+ y HLA-Dr+ y Pre-B se caracterizan por ser TdT+, CD10+, CD19+, CD20+, CD24+,
CD38+ y cadenas citoplasmticas + (de IgM). Las clulas B maduras presentan el siguiente inmunofenotipo: CD19+, CD20+, CD21+, CD22+, CD24+, IgM+, IgD+ (no siempre) y FcR+. Las etapas finales de diferenciacin de los LB tienen lugar en periferia, en algn rgano linfoide secundario (ver punto 3.2) y son antgeno dependientes. En el punto siguiente se explica muy brevemente el proceso de activacin linfocitaria que ocurre como consecuencia de la interaccin, en este caso, entre IgM o IgD de membrana de un LB y el antgeno respectivo. Los LB vrgenes expresan en su membrana IgM y IgD y son negativos para CD10, CD23, CD38 y CD77. La clula B que toma contacto con el antgeno expresa CD23;
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luego como clula precursora del centro germinal en los folculos linfoides (ver punto 3.2) el fenotipo que le caracteriza es IgM+, IgD+, CD10+, CD23-, CD38+ y CD77. Posteriormente en la zona oscura del centro germinal, las clulas (centroblastos) son IgM+, IgD-, CD10+, CD23-, CD38+ y CD77-. En la zona clara del mismo centro las clulas (centrocitos) presentan el siguiente fenotipo: IgG+ o IgM+ o IgE+, CD10+, CD23-, CD38+ y CD77-. Durante la etapa de precursor del centro germinal y centroblasto ocurre el fenmeno de mutacin somtica y entre la etapa de centroblasto y de centrocito se produce el fenmeno de cambio de clase. La ltima etapa es en la que se generan clulas plasmticas (IgG+ o IgA+ o IgE+, CD10-, CD23-, CD38+ y CD77-) y clulas de memoria (IgG+ o IgA+ o IgE+, CD10-, CD23-, CD38- y CD77-). Se distinguen dos subpoblaciones de clulas B, LB1 y LB2: la subpoblacin B1 presenta receptores BcR polirreactivos de baja afinidad y se encuentra mayoritariamente en el peritoneo y en el bazo; la subpoblacin B2, constituye la mayor parte del repertorio linfocitario B y se encuentra, fundamentalmente, en los rganos linfoides secundarios y en la sangre. La mayora de los linfocitos B1 se caracteriza por la expresin del marcador CD5 (glicoprotena monomrica de 67 kDa, propia de linfocitos T) y aunque su funcin es todava un misterio, se ha sugerido que la activacin de estas clulas conduce a la produccin de anticuerpos que proporcionan proteccin contra infecciones bacterianas durante la vida fetal, mucho antes que el repertorio linfocitario de la respuesta inmune adquirida sea completamente funcional. Adems, en el repertorio adulto, los linfocitos B1 dan origen a clulas plasmticas que secretan IgM y a una fraccin importante de clulas plasmticas productoras de IgA en el intestino. De hecho, la transferencia pasiva de linfocitos peritoneales B1 en ratones Scid (que sufren de una severa inmunodeficiencia combinada), reconstituye la produccin de IgA contra muchas bacterias intestinales. Por otro lado, la transferencia pasiva de clulas de hgado fetal o del omentum intestinal, a ratones irradiados, rpidamente reconstituye la subpoblacin B1, mientras la transferencia de precursores de mdula sea adulta reconstituye la subpoblacin B2 pero no la B1. En el repertorio linfocitario adulto, los linfocitos B1 son bastante frecuentes en la poblacin B que sufre neoplasias y en aquellos que reconocen una gran variedad de autoantgenos y reaccionan cruzadamente con antgenos bacterianos como polisacridos y
lipopolisacridos. El repertorio de receptores BcR es bastante ms limitado en los linfocitos B1 que en los linfocitos B2, sus reor denamientos gnicos V H son ms restringidos, y, como no expresan la enzima TdT (Deoxinucleotidil transferasa terminal), carecen de regiones N en las uniones VDJ. Por su parte, la maduracin de las clulas T se puede separar tambin en dos estadios previos al LT maduro: Pro-T que son TdT+, HLA-DR+, CD1+, CD2+, CD5+, CD7+, C-kit+ y CD3 citoplasmtico +, y Pre-T que son TdT+, CD1+, CD4+, CD5+, CD7+, CD8+, CD3 citoplasmtico +. Las clulas T maduras presentan el siguiente inmunofenotipo: CD2+, CD3+, CD4+ CD8+, CD7+, y TCR+ . Por otra parte, como se indic en el punto 2.2.1, en base al diferente patrn de secrecin de citoquinas, se distinguen dos subpoblaciones de clulas T helper (CD4+), LTh1 y LTh2. 2.2.3. Reconocimiento antignico Los LB y LT presentan receptores para antgenos especficos, que incluye una Ig de membrana en el Receptor de clulas B (BCR) o el heterodmero o en el receptor de clulasT (TCR). a) Receptor de linfocitos B e Inmunoglobulinas Estructura El receptor de linfocitos B (BcR), es una estructura compleja, que incluye dos subunidades estructural y funcionalmente distintas. La primera subunidad corresponde a una inmunoglobulina (Ig) de membrana, que acta como receptor clonotpico, responsable del reconocimiento especfico del antgeno (Ag). La segunda subunidad corresponde al complejo accesorio Ig/Ig, responsable del transporte y expresin de BcR en la membrana y de la transduccin de seales de activacin, cuando el receptor clonotpico se une al eptopo antignico. Todas las Igs, tanto de membrana como de secr ecin, tienen una estructura bsica constituida por 2 cadenas pesadas (H) idnticas entre s y 2 cadenas livianas (L), tambin idnticas entre s. Cadenas H y L se asocian formando una estructura simtrica, compuesta por 2 heterodmeros H/L idnticos y covalentemente
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unidos entre s por puentes disulfuro ubicados por detrs de una regin hinge o bisagra, de gran movilidad. En la regin aminoterminal de cada heterodmero existe un paratopo o sitio de combinacin para el Ag, formado por el dominio aminoterminal de cadenas pesadas y livianas. La Ig de membrana es una molcula bivalente con 2 sitios de combinacin para el Ag y monofuncional: slo tiene funcin de reconocimiento antignico. La regin carboxiterminal de las cadenas H contiene una regin hidrofbica de anclaje a la membrana y un dominio citoplasmtico. La versin soluble de una Ig (Igs) se denomina anticuerpo y se distingue de una Ig de membrana porque carece de la regin hidrofbica de anclaje a la membrana y porque es una molcula bifuncional: que conserva la capacidad para reconocer el antgeno, pero que mediante su extremo libre carboxiterminal de las cadenas pesadas (denominada regin Fc), tiene la capacidadad de reclutar y activar mecanismos efectores de respuesta inmune (estimular la fagocitosis, activar el sistema del complemento, activar citotoxicidad dependiente de anticuerpos). En las cadenas livianas (de 25 kDa) se distingue una regin o dominio variable (VL) aminoterminal de 110 aminocidos y un dominio carboxiter minal (CL) de 110 aminocidos. As, cadenas L obtenidas de Ig de membrana y de anticuerpos que reconocen distintos eptopos, tendrn distinta regin VL pero idntica regin CL. Sin embargo, diferencias en el dominio CL de cadenas livianas permiten distinguir dos clases, tipos o isotipos de cadenas L, denominados cadenas kappa () y lambda (). Las cadenas pesadas (de 50kDa) contienen un dominio variable (VH) aminoterminal de 110 aminocidos y 3 4 dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4) carboxiterminales de 110 aminocidos cada uno. Variaciones en la regin constante de las cadenas pesadas, permiten distinguir 5 clases, tipos o isotipos de cadenas pesadas, denominadas y (que contienen 4 dominios CH) y , , (que contienen 3 dominios CH).
La clase de cadena pesada de una Ig de membrana o de un anticuerpo, determina la clase, tipo o isotipo de la Ig de membrana o del anticuerpo. As, se distinguen Igs de mebrana o anticuerpos de clase IgM que contienen cadena pesada , de clase IgD que contienen cadena pesada , de clase IgG que contienen cadena pesada , de clase IgA que contienen cadena pasada y de clase IgE que contienen cadena pesada . La regin constante libre de las cadenas pesadas (regin Fc) de un anticuerpo es responsable de la funcin efectora de ese anticuerpo. Por lo tanto, las diferencias en la regin constante determinan diferencias en la funcin efectora de los anticuerpos IgM, IgG, IgA, IgE e IgD (opsonizacin, activacin del sistema del complemento, citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), presencia en las secreciones, movilizacin transplacentaria). En los linfocitos B, la Ig de membrana es siempre un monmero formado por 2 cadenas livianas y 2 cadenas pesadas. Entre los anticuerpos en cambio, es posible encontrar Ig polimricas (poli-Ig) que forman dmeros, trmeros, pentmeros o hexmeros. As, un anticuerpo de clase IgM es un pentmero o hexmero mientras IgA puede encontrarse como monmero, dmer o o trmero. La polimerizacin de esta poli-Ig ocurre por asociacin con una protena J (joining) de 15 kDa, que permanece covalentemente unida al extremo carboxilo de las cadenas pesadas del anticuerpo. Variabilidad en la especificidad antignica En humanos, la diversidad en la especificidad antignica de las Ig de membrana o de los anticuerpos se genera por recombinacin o reordenamiento gnico que ocurre al azar, durante la generacin y diferenciacin de linfocitos en la mdula sea (que acta como rgano linfoide primario central). A esta diversidad o variabilidad generada de manera antgeno-independiente (en ausencia de antgeno) por recombinacin gnica, se sumar luego la diversidad generada por mutacin en el rgano linfoide primario o, por hipermutacin en la regiones variables de cadenas pesadas y livianas, luego del reconocimiento antignico en los rganos linfoides secundarios de la periferia. En el DNA germinal de las clulas troncales
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precursoras de los linfocitos B, no existe el gen que codifica la cadena pesada , as como tampoco existe el gen que codifica la cadena liviana de una inmunoglobulinas. Durante el proceso de diferenciacin que conduce a la generacin de linfocitos B en la mdula sea, ocurrira un proceso de recordenamiento gnico (catalizado por un complejo enzimtico denominado recombinasa), que permitir ensamblar o crear el gen que codifica la cadena pesada y el gen que codifica la cadena liviana de una inmunoglobulina. La cadena pesada de una Ig est codificada por una nica familia de segmentos gnicos, minigenes o miniexones, situados en el cromosoma 14 humano. Esta familia de segmentos gnicos incluye mltiples copias de segmentos gnicos variables (segmentos VH), de diversidad (segmentos DH), segmentos de unin (segmentos J H) y segmentos gnico constantes (segmentos CH). El gen para la cadena pesada ser ensamblando a partir de un nico segmento gnico J (elegido al azar) que ser colocado junto a un nico segmento D y luego a un nico segmento V, generando as la regin del DNA que codificar la regin o dominio variable de la cadena pesada. La regin VDJ ya ensamblada se unir luego al segmento gnico C que codifica la regin o dominio constante de la cadena pesada. Se genera de esta manera el gen para la cadena pesada, conteniendo segmentos gnicos VDJC. Reordenado el gen que codifica la cadena pesada, debe efectuarse el reordenamiento gnico que conduce a la generacin del gen que codifica la cadena liviana de la Ig. La cadena liviana de una Ig est codificada por dos familias gnicas distintas: la familia gnica para la cadena kappa () situada en el cromosoma 2 humano y, la familia gnica lambda () situada en el cromosoma 22 humano. Ambas familias gnicas contienen segmentos gnicos variables (VL), segmentos gnicos de unin (JL) y segmentos gnicos constantes (CL ) a partir de los cuales debe ensamblarse un gen kappa o un gen lamda, respectivamente. b) Receptor de clulas T Estructura El receptor de linfocitos T (TcR), es un complejo glicoproteico transmembrana, que
incluye dos subunidades estructural y funcionalmente distintas (y no covalentemente unidas entre s). La primera subunidad es el receptor clonotpico, TcR o TcR, responsable del reconocimiento especfico del antgeno (Ag). La segunda subunidad corresponde al complejo accesorio CD3, responsable del transporte y expresin de TcR en la membrana y de la transduccin de seales de activacin, cuando el receptor clonotpico se ha unido especficamente al antigno. El receptor clonotpico reconoce fundamentalmente fragmentos peptdicos asociados a una molcula de presentacin antignica (molculas MHC de clase I o MHC de clase II) o antgenos glicolipdicos asociados a molculas CD1. Mientras el repertorio linfocitario B puede reconocer tanto antgenos solubles como de membrana, de naturaleza proteica, hidrocarbonada, lipdica, nucleotdica, etc., el repertorio linfocitario T reconoce, fundamentalmente, fragmentos peptdicos asociados a molcula MHC de clase I o MHC de clase II. El 90-95% de los linfocitos T corresponden a linfocitos T, que reconocen fundamentalmente fragmentos peptdicos unidos a una molcula de presentacin MHC, en la membrana de una clula presentadora de antgeno. El 5-10% restante, corresponden a linfocitos T entre los cuales se pueden distinguir linfocitos que reconocen fagmentos peptdicos unidos a molculas MHC, linfocitos T que reconocen glicolpidos unidos a molculas CD1 y finalmente, linfocito T que, como los linfocitos B, pueden reconocer directamente diversas molculas (particular mente compuestos fosforilados). El receptor clonotpico T, es un heterodmero T o T formado por dos cadenas glicoproteicas de 40 a 60 kDa, covalentemente unidas entre s por puentes disulfuro. En cada cadena del receptor clonotpico T o T, se distingue: un dominio variable (V) aminoterminal de 112 a 119 aminocidos, un dominio constante C, de 139 a 178 aminocidos, un dominio hidrofbico transmembrana de 25 aminocidos y una pequea cola citoplasmtica de 12 aminocidos. Variabilidad en la especificidad antignica De manera similar a lo que ocurre con las clulas
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precursoras de linfocitos B en la mdula sea, el DNA germinal de las clulas precursoras de linfocitos T que colonizarn el timo (rgano linfoide primario en la generacin de linfocitos T), no contiene los genes que codifican las cadenas alfa y beta o gamma y delta de los linfocitos T o T, respectivamente. Linfocitos y reconocimiento antignico Adems de presentar un receptor diferente, las clulas B y clulas T reconocen el antgeno de forma diferente; en el caso de los LB las Ig de membrana (IgM en linfocitos B vrgenes, IgG, IgA o IgE en linfocitos B de memoria), reconocen directamente el antgeno, sin intervencin de otra clula. El TCR en cambio, reconoce pptidos extraos presentados por una clula presentadora de antgeno y unido a molculas MHC (Complejo Principal de Histocompatibilidad) de clase I, si se trata de LTc y de clase II si se trata de LTh. Estos pptidos se originan durante el procesamiento del antgeno en clulas blanco (cuando son presentados en molculas MHC clase I), y en las denominadas clulas presentadoras de antgeno profesionales (cuando son presentados en molculas MHC clase II). Existe adems una subpoblacin de linfocitos T, que reconoce molculas lipdicas (lipoprotenas, glicolpidos) presentadas en el contexto de molculas CD1, en la membrana de clulas presentadoras profesionales. Las clulas NK, no expresan inmunoglobulinas de membrana ni TCR, per o presentan receptores: de activacin KAR (Killer Activating Receptor) y receptores de inhibicin KIR (Killer Inhibition Receptor). Los receptores KAR reconocen patrones molecular es hidr ocarbonados caractersticos de micr oorganismos y los r eceptores KIR reconocen molculas MHC de clase I en clulas propias; estos ltimos transducen seales de inhibicin de los mecanismos de citoxicidad. Los linfocitos T y las clulas NK son altamente efectivas en la eliminacin de clulas tumorales y clulas infectadas por virus y, aunque los receptores involucrados en el reconocimiento de la clula blanco son distintos, tanto linfocitos T como clulas NK utilizan el mismo mecanismo de citotoxicidad que involucra la liberacin de perforina, granzimas y granulisinas, y almacenados en grnulos citoplasmticos, y expresa FasL. 2.2.4. Activacin de los linfocitos La unin del antgeno con el receptor especfico
de una clula T o B activa al linfocito mediante un delicado proceso bioqumico que implica transduccin de seales al interior de la clula, generacin de segundos mensajeros (IP3, DAG, Ca2+) y fosforilacin de protenas. Protenas fosforiladas, se unen a secuencias reguladoras de genes que participan en la activacin de los linfocitos. Como consecuencia de la activacin, el linfocito sufre un proceso denominado transformacin blstica que implica una serie de cambios estructurales y bioqumicos que terminan en la formacin de una clula grande, de citoplasma basfilo (por aumento de retculo endoplsmico), ncleo laxo, semejante a un linfoblasto. La activacin linfocitaria produce una amplificacin clonal (etapa de proliferacin de clulas con la misma especificidad antignica), posteriormente ocurre una produccin de clulas efectoras, responsables de la sntesis de anticuerpos (clulas plasmticas) y de la inmunidad mediada por clulas (LT CD4+ y LT CD8+) y clulas de memoria (estas dos ltimas como parte de la etapa de maduracin). 2.3. Sistema fagoctico mononuclear Dada su r elacin ontognica, y sus caractersticas estructurales y funcionales, a los monocitos y macrfagos se les agrupa en el denominado Sistema fagoctico mononuclear (SFM), antes llamado sistema retculo endotelial. Se describir en este punto a las clulas dendrticas (DC, Dendritic Cells) por su origen comn, aunque no son principalmente fagocticas. Las clulas del SFM presentan un amplio espectro de funciones: (a) remocin de clulas muertas, senescentes, extraas, y alteradas; (b) regulacin de la funcin de otras clulas; (c) procesamiento y presentacin de antgenos; (d) participacin en reacciones inflamatorias; (e) destruccin de microorganismos y (f) destruccin de clulas neoplsicas. 2.3.1. Monocitos Los monocitos presentan un dimetro de 1215 m (figura 10-3) y representan un 4-10% de los leucocitos sanguneos (tabla 10-2). En su citoplasma tienen grnulos azurfilos o primarios que contienen hidrolasas cidas, que junto con los mecanismos oxidativos, participan en la destruccin de las partculas fagocitadas; al respecto es vlido lo que ser descrito antes para los neutrfilos (punto 2.4.1).
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al igual que los neutrfilos, en la sangre se reconocen dos compartimentos, circulante y marginal; luego pasan a los tejidos donde se transforman en macrfagos. En relacin a los monocitos los macrfagos son de mayor tamao y presentan mayor capacidad fagoctica y microbicida. Pueden permanecer vivos entre algunos meses y aos. Se encuentran en varios rganos, destacando su presencia en el hgado (clulas de Kupffer), riones, pulmones (macrfagos alveolares e intersticiales), serosas (peritoneal y pleural) bazo, ganglios linfticos, cerebro, aparato repr oductivo (testculo, ovario, tero, oviductos), hueso (osteoclastos) e intestino; tambin se encuentran en la leche materna.
Figura 10-3. Microfotografa de un monocito. Los monocitos son precursores sanguneos de los macrfagos tisulares. Presentan un ncleo excntrico arrionado.
a) Receptores de fagocitos mononucleares Los macrfagos y monocitos presentan una gama importante de receptores: para regin Fc inmunoglobulinas, complemento, lipoprotenas, citoquinas y factores quimiotcticos, entre otras molculas (tabla 10-4).
Despus de salir de la mdula sea los monocitos circulan aproximadamente 8 horas;
Tabla 10-4. Receptores de macrfagos y monocitos Receptores de Inmunoglobulinas FcRI (CD64) FcRII (CD32): A, B y C FcRIII (CD16): A y B FcRI FcRII FcRIII (CD23): A y B FcR Receptores del Complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11b/CD18) Receptores de Citoquinas TNF-R IL-1R M-CSFR IFNR Receptores de factores quimiotcticos De pptidos formilados De quimioquinas De C5a Receptor de lipopolisacrido (CD14) Receptores de lipoprotenas LDL-R Receptor scavenger (de LDL modificada) Receptores de hormonas De Glucocorticoides De Insulina De Estrgenos Otras hormonas Receptor de transferrina Receptor de lactoferrina Receptor de fibronectina
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Las Molculas de Adhesin Celular (CAM) participan en las uniones clula-clula y clulamatriz. En los monocitos y macrfagos, entre otras molculas de adhesin se han descrito las molculas LFA-1 (CD11a/CD18), Mac-1 (CD11b/CD18) y p150,95 o CR1(CD11c/CD18) de la familia integrinas y las molculas CD2 e ICAM-1 (CD54) de la superfamilia de las inmunoglobulinas (SFIg). 2.3.2. Macrfagos Los macrfagos pueden ser residentes (fijos en tejidos) o libres. Entre los primeros destacan: Macrfagos intestinales. Los macrfagos se encuentran principalmente en la lmina propia del tracto gastrointestinal. Las reas corticales ricas en linfocitos asociados a intestino (GAL) y las placas de Peyer contienen muy pocos macrfagos. Respecto a su funcin, podran participar en la presentacin antignica, y en la fagocitosis de bacterias y clulas muertas. Macrfagos del hgado. Las clulas de Kupffer se ubican en las paredes vasculares de los sinusoides hepticos. Pueden fagocitar un espectro amplio de clulas y partculas, entre ellos, liposomas, bacterias, parsitos, virus, glbulos rojos y plaquetas opsonizadas con IgG y/o complemento. Macrfagos cerebrales. Estos macrfagos son llamados clulas microgliales. La funcin de estos macrfagos no es bien conocida, posiblemente participan en la induccin de la respuesta inmune y probablemente modulen la funcin neuronal. Macrfagos peritoneales. stos se encuentran entre los macrfagos de serosas; tienen capacidad para destruir clulas neoplsicas y bacterias. En casos de peritonitis o ascitis maligna aumenta el nmero de macrfagos. Macrfagos de rganos reproductivos. Los testculos contienen un gran nmero de macrfagos. Pueden participar en la fagocitosis de espermios moribundos no eyaculados y en la destruccin de microorganismos. En los ovarios los macrfagos pueden participar en la fagocitosis de clulas degenerativas del cuerpo lteo. Macrfagos del hueso. Los osteoclastos se encargan de la resorcin sea. Macrfagos del tejido conjuntivo: Corresponden a los histiocitos.
Macrfagos renales. Son las clulas mesangiales de los glomrulos renales. Los macrfagos libres estn situados en rganos linfoides secundarios (macrfagos de los sinusoides esplnicos y de los senos medulares en los ganglios linfticos), all atrapan material extrao. Los macrfagos tienen una vida vida media mucho ms larga que los neutrfilos en los tejidos, pudiendo ser meses e incluso aos. Una subpoblacin de los monocitos y macrfagos, expresa en su superficie molculas MHC de clase II, que participan en la presentacin del antgeno a los linfocitos T helper. Por otra parte, sintetizan y secretan citoquinas como interfern (IFN) y , IL-1 y factor de necrosis tumoral (TNF). 2.3.3. Clulas dendrticas Las clulas dendrticas (DC) residen en la periferia y actan como centinelas del sistema inmune monitor eando el micr oambiente tisular perifrico y capturando antgenos en el contexto de receptores PAMP. Debido a su c a p a c i d a d migratoria nica, las clulas dendrticas pueden transportar antgenos desde la periferia a los rganos linfoides secundarios donde, luego de su maduracin, pr ocesarn y presentarn fragmentos antignicos estimulando la activacin y difer enciacin de linfocitos T-antgeno especficos. Injuria tisular, infecciones y otros factores que alteren la homeostasis tisular perifrica, proporcionarn seales de peligro que conducen a la pr oduccin local de citoquinas proinflamatorias y movilizacin de clulas DC a los rganos linfoides secundarios. En estos rganos la sntesis y secrecin concomitante de IL-12 estimular la d i f e r e n c i a c i n de linfocitos Th1. Dosis bajas de LPS (lipopolisacridos) de bacterias gram negativas favorecen el desarrollo de una respuesta Th2, mientras la exposicin a altos niveles de LPS la suprime. La inhalacin de bajas dosis de LPS a nivel respitarorio induce migracin y maduracin de DC y el desarrollo de una respuesta Th2. La inhalacin de altos niveles de LPS induce respuesta Th1 y la inhalacin de antgenos purificados no induce migracin de DC a ganglios linfticos y por lo tanto ocurre respuesta celular T. Junto a monocitos, macrfagos y linfocitos B, las DC forman la subpoblacin de clulas presentadoras de antgeno profesionales. Sin embargo, las DC
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presentan la mayor capacidad y eficiencia en el inicio y en la modulacin de la respuesta inmune. Morfolgicamente se caracteriza por la presencia de prolongaciones alrgadas que salen del cuerpo celular. Durante su maduracin, las DC sufren una serie de cambios inmuno-funcionales que les permite una mejor adaptacin a las circunstancias o eventos inmunolgicos, as consiguen una mayor especializacin en sus funciones de presentacin antignica y de proporcionar seales accesoria de coestimulacin a los linfocitos T. Se ha demostrado la existencia de distintas lneas de DC, con difer entes estadios madurativos y vas de migracin, lo que implica una distribucin anatmica diferente. A partir de la clula pluripotencial CD34+ y en presencia de GM-CSF y TNF se diferencia en: (a) CD1+, CD14-, de las que se originan las clulas de Langerhans (DC de la piel) y (b) CD1-, CD14+ que dan origen a las DC mieloides. Las clulas de Langerhans se trasladan hacia tejidos no vascularizados como la epider mis en la piel, y las DC mieloides lo hacen hacia zonas vascularizadas, localizndose en los intersticios (DC intersticiales). Una vez que las clulas de Langerhans han incorporado el antgeno en la piel, migran por la linfa hacia los ganglios linfticos donde lo presentan a las LT; las DC intersticiales, por su parte, migran hacia el bazo a travs de la sangre. La maduracin de las DC es fundamental en la iniciacin de la respuesta imune. Los estudios de maduracin in vitro de las DC se realizan a partir de monocitos obtenidos de sangre perifrica e incubados en presencia de GM-CSF e IL-4; se obtiene as una poblacin de DC inmaduras, clulas que expresan en su super ficie molculas MHC clase II en baja densidad, receptor de manosa, quimioquina CCR5 y FcR, y no expresan la molcula de adhesin ICAM-1 y molcula coestimuladora B7. En el paso a DC maduras participan LPS, y citoquinas como IL-1 y TNF. Las DC maduras expresan en su superficie altos niveles de molculas MHC clase II, molculas coestimulatorias (CD40, CD86/B7-2 y B7-1), molculas de adhesin (ICAM-1 y LFA-3) y receptores para quimioquinas como CCR7.
2.4. Granulocitos En la serie granuloctica, a partir del estadio madurativo de mielocito se reconocen tres lneas celulares diferentes: neutrfilos, eosinfilos y basfilos. En la tabla 10-2 se muestra el porcentaje que cada una de estas lneas celulares ocupa entre los leucocitos en los adultos y el nmero absoluto que representa. 2.4.1. Neutrfilos. En los adultos, los neutrfilos maduros representan aproximadamente el 65% de los 4-10 x 103/L glbulos blancos de la sangre. Los neutrfilos tienen un dimetro de 10-15 m y un ncleo segmentado con 2-5 lbulos (figura 10-4). En su citoplasma se han descrito cuatro tipos de grnulos, los primarios o azurfilos (lisosomas), secundarios (especficos), terciarios y vesculas secretoras (tabla 10-5). Los grnulos primarios, son escasos en los estadios maduros, y contienen enzimas y protenas microbicidas (entre otras, peroxidasa, lisozima, protenas catinicas) protenas (elastasa, catepsina G y otras protenas) e hidrolasas cidas (entre otras, Nacetilglucuronidasa y catepsinas B y D). Los grnulos secundarios, son los ms numerosos en los neutrfilos maduros; contienen lisozima, colagenasa, fosfatasas alcalina, lactoferrina y otras enzimas y protenas. Los grnulos terciarios contienen principalmente gelatinasa. Las vesculas secretoras, al parecer formadas por endocitosis, contienen algunas protenas plasmticas. a
In vivo, factores, tanto de tipo infecciosos como inflamatorios, influyen en estimular la maduracin y el movimiento de las DC hacia los tejidos linfoides secundarios.
Figura 10-4. Microfotografa de granulocitos maduros. (a) Los neutrfilos son clulas de 10-15 m. Debido al pH neutro de su citoplasma y contenido granular, stos no se tien con la clsica tincin hematolgica de May GrnwaldGiemsa. Una caracterstica de los neutrfilos maduros es su ncleo segmentado. Los eosinfilos (b) y los basfilos (c) tienen un dimetro similar a los neutrfilos, presentan un ncleo bilobulado y grnulos que se tien en forma caracterstica con May Grwald- Giemsa.
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Tabla 10-5. Contenido de los grnulos de los neutrfilos humanos Grnulos primarios Membrana Grnulos secundarios Grnulos terciarios CD11b (Mac-1) CD11b (Mac-1) Citocromo b558 Citocromo b558 Receptor de FMLP Receptor de FMLP Receptor de laminina Receptor de laminina Receptor de uPA CD15 CD66a CD666 Receptor de Fibronectina Subunidad de Protena G Antgeno NB1 RAP1, RAP2 Receptor de Trombospondina Receptor de TNF Receptor de Vitronectina Vesculas secretoras CD11b (Mac-1) Citocromo b558 Receptor de FMLP Receptor de uPA Fosfatasa alcalina CD10, CD13, CD45 CD16 DAF (CD55) CR1 (CD35)
CD63 CD66c CD68
Matriz Agentes microbicidas Lisozima Lisozima Mieloperoxidasa Colagenasa Defensinas Protenas catinicas Protena bactericida permeabilizante (BPI) Proteasas Elastasa Catepsina G Proteinasa 3 Lisozima
Hidrolasas cidas N-Acetilglucuronidasa Catepsinas B y D -Glucuronidasa -Glicerofosfatasa -Galactosidasa -Glucosaminidasa -Fucosidasa -Manosidasa N-Acetil--glucosaminidasa Otros Sialidasa Azurocidin cido mucopolisacrido Protena ligante de heparina Factor inactivador de C5a Sialisidasa Pro-uPA Pro-uPA/uPA Apolactoferrina Gelatinasa Protenas plasmticas: 2-Microglobulina Acetiltransferasa Tetranectina, Histaminasa Albmina, Heparinasa Otras Protena ligante de Vitamina B12 Inhibidor de protena Kinasa C Otros
FMLP, pptido formil-metil-leu-phe; uPA, Activador del plasmingeno tipo uroquinasa.
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Algunas molculas expresadas en la membrana de los neutrfilos son: (a) molculas de adhesin, entre ellas LFA-1 (CD11a), Mac-1 (CD11b), p150, 95 (CD11c), 2- integrina (CD18), ICAM-3 (CD50), L-selectina (CD62b), (b) receptores: FcRI (CD64), FcRII (CD32), FcRIII (CD16), Receptor para C5a (CD68), receptor para G-CSF (CD114), (c) ectoenzimas: aminopeptidasa N (CD13, inactiva IL-8), endopeptidasa (CD10, inactiva FMLP) y (d) otros: Decay accelerating factor (DAF, CD55), y Antgeno lencocitario comn (CD45). Una vez que los neutrfilos salen de la mdula sea, per manecen en cir culacin aproximadamente 7 horas, para luego pasar al azar a los tejidos, donde permanecen vivos 2-3 das. La produccin y destruccin diaria de neutrfilos es de 0,9x109/Kg de peso. Para que los neutrfilos puedan cumplir su funcin de fagocitar y destruir las partculas ingeridas deben movilizarse al foco infeccioso, fagocitar y destruir el contenido: a) Quimiotaxis El movimiento de los neutrfilos al sitio de infeccin es dirigido por un gradiente qumico (quimiotaxis). Entr e otr os factor es quimiotcticos, para los que estos leucocitos poseen receptores, destacan algunas protenas del complemento (C5a, C3a), pptidos formilados (Ej. N-formil-met-leu-phe, FMLP) y lpidos derivados de las bacterias, factor plaquetario 4 (PF4), metabolitos de la va de la lipoxigenasa del metabolismo del cido araquidnico, especialmente el leucotrieno B4 (LTB4), y las llamadas quimioquinas, entre ellas la IL-8. Varios de estos factores han sido clonados y secuenciados. Los factores quimiotcticos actan a bajas dosis (0,1-1mM). El efecto biolgico de los factores quimiotcticos es lograr una migracin dirigida de los neutrfilos. La respuesta leucocitaria a los factores quimiotcticos es regulada positiva o negativamente por varios estmulos fisiolgicos y farmacolgicos. Varias citoquinas, como por ejemplo, TNF e IFN favorecen la quimiotaxis. En el caso del IFN participa aumentando la hidrlisis de fosfatidilcolina por la fosfolipasa D. La desensibilizacin celular al estmulo del factor quimiotctico puede ocurrir por aumento de cAMP o degradacin del factor quimiotctico.
Adhesin de neutrfilos al endotelio Para que los neutrfilos lleguen a los tejidos infectados, junto con r ecibir la seal quimiotctica, stos deben unirse al endotelio, luego rodar sobre ste (rolling), sufrir un proceso de activacin adicional y luego participar de un pr oceso de migracin transendotelial. En este pr oceso tienen importante participacin algunas molculas de adhesin celular (captulo 12), expresadas en forma constitutiva e inducida en la membrana de los neutrfilos y clulas endoteliales. Aproximadamente la mitad de los neutrfilos circulantes forman parte del pool marginal, que mantienen interaccin intermitente con el endotelio. Las molculas de adhesin de la familia selectinas (L-selectinas, CD62L en leucocitos y E-selectinas, CD62E en clulas endoteliales) y sus ligandos, carbohidratos sialilados, son responsables del rolling de los neutrfilos sobre el endotelio. La interaccin de los factores quimiotcticos con sus respectivos receptores inicia el proceso de transduccin de seales en los neutrfilos, lo que inicialmente se asocia con expresin de molculas de adhesin de la familia integrinas, especialmente LFA-1 (CD11a-CD18) que se une a su ligando de la superfamilia de las inmunoglobulinas ICAM-1 (CD54) en las clulas endoteliales. Este ltimo tipo de interaccin resulta en un marcado incremento de la adhesin de los neutrfilos al endotelio y trmino del rolling. Luego los neutrfilos migran entre las clulas endoteliales al tejido. b) Fagocitosis La fagocitosis es un proceso que realizan diversos tipos celulares que van desde clulas epiteliales a fibroblastos y clulas del sistema inmune como monocitos-macrfagos, neutrfilos y clulas dendrticas, que son conocidas como fagocitos profesionales. El primer paso en la fagocitosis es el reconocimiento de partculas, agentes infecciosos o clulas por receptores de la membrana celular. En metazoos la fagocitosis es importante en la remocin de clulas apoptticas durante el desarr ollo y remodelamiento tisular. En mamferos es importante en la inmunidad innata y en la inmunidad adquirida y contribuye en nuestra habilidad para combatir agentes infecciosos. El proceso de formacin del fagosoma a nivel superficial, y su transformacin en fagolisosoma
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es complejo e implica uniones ligando-receptor, transduccin de seales de activacin, rearreglos locales del citoesqueleto en el sitio de internalizacin, y una serie dinmica de fusin/fisin de membrana y eventos de remodelacin. Receptores que participan en la fagocitosis Una etapa inicial de la fagocitosis es el reconocimiento, por parte de la clula fagoctica, de la partcula a ser fagocitada. Para ello las clulas fagocticas poseen 2 grupos de receptores, segn lo que son capaces de reconocer: (a) ligandos pr opios de los organismos o clulas a fagocitar y (b) molculas que se han unido a ellas y que favorecen la fagocitosis (opsoninas). Entre los receptores que unen molculas no opsnicas y que se presentan fundamentalmente los macrfagos, se encuentran: (i) los receptores scavenger que
unen varios ligandos, entre otros, protenas modificadas, polianiones (incluye cidos nucleicos), fosfolpidos cidos (incluye lipopolisacrido de bacterias Gram negativas y cido lipoteicoico de bacterias Gram positivas y (ii) el receptor de manosa, que une carbohidratos. Entre los r eceptor es de opsoninas, se distinguen: (i) los receptores de fragmento Fc de IgG (FcR) e IgA (FcR) unidos a un dmero de cadenas , los receptores del complemento y otros receptores (de colectinas y de protenas plasmticas). Los receptor es de Fc son miembr os de la super familia de las inmunoglobulinas, con 3 (FcRIA) o 2 (otros receptores Fc) dominios tipo inmunoglobulina extracelulares, un dominio transmembrana y una corta cola citoplasmtica; FcRIIIB, unido a glicofosfatidilinositol (GPI), es una excepcin. En la tabla 10-6 se muestran los diferentes FcR y el FcR, indicado las clulas que los presentan.
Tabla 10-6. Receptores de la regin Fc de IgG e IgA Receptor FcRI* FcRIIA FcRIIB FcRIIIA FcR CD CD64 CD32 CD32 CD16 CD89 Clulas Monocitos, macrfagos, Neutrfilos maduros tratados con IFN Neutrfilos maduros, monocitos Macrfagos, plaquetas Monocitos, macrfagos Linfocitos B, mastocitos Macrfagos, clulas NK Mastocitos Granulocitos, monocitos Macrfagos
* Tres locus gnicos; I, alta afinidad; II, afinidad intermedia; III, baja afinidad
Los receptores del complemento incluyen CR1, una protena de transmembrana que une C3b, y dos integrinas CD11b/CD18 y CD11c/CD18, tambin llamadas CR3 y CR4, respectivamente. Estos dos ltimos receptores unen iC3b, molcula derivada de C3b y se une covalentemente a la superficie celular. Otros receptores unen un grupo de molculas llamadas colectinas, entre ellas la protena que
une manosa (MBL), molcula que participa en la activacin del sistema del complemento y la protena C reactiva (PCR) que se puede unir por ejemplo al carbohidrato C del Streptococcus pneumoniae. Adems tambin existen receptores para algunas protenas plasmticas que se pueden unir a los microorganismos, por ejemplo r eceptores para fibringeno y fibronectina.
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Transduccin de seales en la fagocitosis Se describir el mecanismo de transduccin de seales asociados a la fagocitosis mediada por FcR. Los receptores FcRI, FcIIA y FcIIIA comparten la capacidad para activar la cascada de tirosina kinasa. Los dominios ITAM (inmunetyrosine activation motifs) de la cadena de los receptores FcR pueden ser fosforilados por tirosina kinasa de la familia SyK. Esta etapa es fundamental para la ingestin y la polimerizacin de actina. Paralelamente, la unin ligando-receptor activa la fosfolipasa C la cual desdobla el fosfatidil inositol-4,5-difosfato (PIP 2) en inositol-1,4,5-trifosfato (IP 3) y diacilglicerol (DAG). El IP3 permite que se libere Ca2+ de los depsitos citoplasmticos, el que permite dos acciones: (a) desencadena el ordenamiento de los filamentos de actina y de la protena contrctil miosina, responsables del movimiento de los neutrfilos y (b) activa la fosfolipasa A2 que convierte los fosfolpidos de membrana en cido araquidnico a partir del cual se obtienen otros metabolitos. El DAG activa la protena kinasa C que fosforila protenas que participan en los procesos de degranulacin y secrecin. La fosfolipasa D escinde fosfatidilcolina a cido fosfatdico y colina; su activacin se asocia a la unin de ligandos a receptores del complemento. Endocitosis La endocitosis, proceso por el cual el material
es introducido en la clula, puede tomar la forma de una pinocitosis (bebiendo por clulas) y fagocitosis (comiendo por clulas). La pinocitosis se refier e a ingestin de macromolculas y la fagocitosis es visible al microscopio ptico. Ambos procesos involucran invaginacin de la membrana celular y la formacin de vesculas o vacuolas (fagosomas). La mayora de las clulas pueden realizar pinocitosis, pero la fagocitosis es un proceso caracterstico de los neutrfilos, monocitos y macrfagos, y, en mucho menor grado, de los eosinfilos y basfilos. La fagocitosis de los microorganismos se ve favorecida si stos estn recubiertos (opsonizados) con IgG (subclases 1 3) y/o fracciones del complemento (C3b y/o C4b). Los neutrfilos al igual que los monocitos y macrfagos, poseen receptores para la regin Fc de IgG (FcR) y para C3b y C4b (tabla 10-7). La unin de estas opsoninas con el receptor respectivo, activa la clula fagoctica, sta emite pr olongaciones que engloban al microorganismo. El fagosoma formado por la membrana plasmtica, posteriormente se fusiona con la membrana de los grnulos citoplasmticos que descargan su contenido enzimtico en el interior del fagosoma. El DAG, a travs de la protena kinasa C que fosforila protenas, gatilla la degranulacin.
Tabla 10-7. Receptores para inmunoglobulinas y fracciones del complemento en los granulocitos y monocitos/macrfagos FcRI Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Monocitos/ macrfagos + ? FcRII + + FcRI + FcRII +? + FcRIII + + + + C5aR + + + + CR1 + + + + CR3 + + + +
FcR, Receptor para IgE (I, alta afinidad; II, afinidad intermedia); Fc, Receptor para IgG (I, alta afinidad; II, afinidad intermedia; III, baja afinidad); C5aR, receptor de C5a; CR1, receptor de C3b; CR3, receptor de iC3b.
Antes se indic el contenido de cada uno de los tres tipos de grnulos de los neutrfilos (tabla 10-5). As por ejemplo los grnulos azurfilos
contienen componentes antibacterianos; tambin contienen elementos como elastasa que puede favorecer el movimiento de los
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neutrfilos al hidrolizar algunos componentes de la matriz extracelular. Los grnulos secundarios son liberados ms fcilmente de los neutrfilos, conteniendo entre otras molculas, algunas que activan el sistema del complemento. Tambin contienen colagenasa, que al igual que la elastasa puede favorecer el movimiento de las clulas fagocticas. Por otra parte, la apolactoferrina al unir hierro puede tener un efecto antimicrobiano, entre otras razones por privar de este elemento a las bacterias. Por su parte, la gelatinasa contenida en los grnulos terciarios puede participar, junto a otros componentes, en la modificacin de la matriz extracelular durante el desplazamiento
de los neutrfilos. En otro orden, protenas de membrana de los grnulos terciarios y de las vesculas secretoras, pueden aumentar su expresin en la superficie celular, despus de la activacin. Mecanismos microbicidas Una vez fagocitados los microorganismos, stos son destruidos por mecanismos dependientes e independientes del oxgeno, tambin denominados mecanismos oxidativos y no oxidativos, respectivamente (tabla 10-6). Ambos mecanismos a menudo participan en forma sinrgica.
Tabla 10-6. Mecanismos antimicrobianos de los neutrfilos Dependientes del oxgeno Mediados por mieloperoxidasa cido hipocloroso (HOCl) Independientes de mieloperoxidasa Perxido de hidrgeno (H2O2) In superxido (O2-) Otros? Independientes del Oxgeno pH cido Lisozima Lactoferrina Defensinas Protena bactericida permeabilizante (BPI) Protenas catinicas de los grnulos
a) Mecanismos antimicrobianos dependientes del oxgeno. Durante la fagocitosis, proceso dependiente de energa, se produce un aumento del consumo de oxgeno, de la oxidacin de la glucosa y de la produccin de metabolitos del oxgeno, fenmeno tambin denominado estallido respiratorio (figura 105). La generacin de dichos metabolitos se debe a la activacin de la NADPH oxidasa que al oxidar el NADPH reduce el oxgeno molecular a in superxido (O-2), el que se convierte en perxido de hidrgeno (H2O2). Los metabolitos del oxgeno pueden actuar a travs de un
mecanismo dependiente o independiente de mieloperoxidasa (MPO), enzima presente en alta concentracin en los grnulos primarios, los que son degranulados al interior del fagosoma. La MPO, en presencia de un in haluro como Cl- (o Br-), transforma el H2O2, generada por mecanismos dependientes de oxgeno en cido hipocloroso (HOCl), un potente oxidante y antimicrobiano, (antibacteriano, antifngico, antiviral y antimicoplasma). Los radicales superxido e hidroxilo, por s solos tienen accin microbicida.
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La enfermedad granulomatosa crnica es una inmunodeficiencia primaria, causada por mutaciones que producen una prdida o inactivacin de una de las subunidades principales de la NADPH oxidasa (ver captulo 11). b) Mecanismos antimicrobianos independientes del oxgeno. Estos mecanismos funcionan en ausencia de metabolitos del oxgeno, situacin que se presenta en un ambiente anaerbico. En los mecanismos no oxidativos participan protenas y enzimas presentes en los grnulos citoplasmticos de los fagocitos (tabla 10-5). Entre otros componentes de estos mecanismos destacan: (a) la lisozima, enzima catinica que destruye el pptidoglican de la pared celular, principalmente de las bacterias Gram positivas; (b) la protena bactericida permeabilizante (BPI), protena catinica que permeabiliza la membrana bacteriana; (c) la catepsina G, una serino proteasa con actividad sobre bacterias Gram negativas y (d) las defensinas, pptidos de 29-34 aminocidos, ricos en arginina y cistena, y que presentan actividad microbicida sobre bacterias Gram positivas, Gram negativas, hongos y algunos virus. Una vez muertas las bacterias en el interior de los fagolisosomas, son degradadas por hidrolasas cidas, que por la generacin de cido lctico durante la gliclisis, encuentran su pH ptimo para actuar. 2.4.2. Eosinfilos. Los eosinfilos son clulas de aproximadamente 10-15 m de dimetro y cuyo ncleo es generalmente bilobulado (figura 10-4) y su citoplasma anaranjado con tincin de hematoxilina-eosina. Representan el 1-4% de los leucocitos sanguneos (tabla 10-2); alrededor del 99% de los eosinfilos se encuentra en los tejidos donde llegan luego de un breve paso de aproximadamente 30 minutos por la sangre, despus de salir de la mdula sea. Los eosinfilos presentan dos tipos de grnulos en su citoplasma: grnulos especficos de eosinfilos y grnulos pequeos. Los grnulos especficos, aproximadamente 20 por clula, en su centro presentan la protena bsica mayor (MBP) y algunas citoquinas; en la matriz contienen protena catinica eosinfila (ECP), peroxidasa eosinfila (EPO), neurotoxina derivada de eosinfilos (EDN) y algunas citoquinas. Los grnulos pequeos que almacenan arilsulfatasa, se encuentran en los
Figura 10-5. Mecanismos microbicidas oxidativos. Una oxidasa cataliza la reduccin de oxgeno a in superxido (O-2) a expensas del NADPH. El NADPH es regenerado a travs de la va de las hexosas. El O-2 es transformado en perxido de hidrgeno (H2O2) y O2 por la superxido dismutasa (SOD). Reacciones posteriores que comprometen al H2O2 y al O-2, llevan a la formacin de dos tipos de compuestos microbicidas: radicales libres altamente oxidantes (OH) o halgenos oxidados (por ejemplo: cido hipocloroso, HOCl).
La oxidasa dependiente de NADPH, es un complejo multienzimtico que incluye dos protenas de membrana (de dos tipos de grnulos: vesculas secretoras y grnulos secundarios) y tres citoslicas, cuando la clula est en reposo. El componente de membrana es un heterodmero formado por una protena de 91 kDa (gp91phox) y una protena de 22 kDa (p22phox). Estas protenas, junto con flavin adenin dinucletido (FAD) for man un flavocitocromo denominado citocromo b558. Adicionalmente en la membrana participa una protena de unin de nucletidos de guanina denominada rap1. La subunidad de 91 kDa presenta el sitio de unin para el NADPH. Ambas subunidades presentan grupos HEME. El componente citoplasmtico est formado por tres protenas independientes: p40phox, p74phox y p67 phox. Adems participa otra protena de unin de nucletidos de guanina, rac2; en reposo une GDP y cuando la clula es activada une GTP. Precozmente durante la activacin, las vesculas secretoras y posteriormente los grnulos secundarios, se fusionan con la membrana plasmtica, la cual durante la fagocitosis se invagina y por tanto la membrana de los fagosomas presentar las pr otenas de membrana de la NADPH oxidasa. Como consecuencia de la activacin de los neutrfilos, proceso en que p47phox es fosforilada, las protenas citoslicas son translocadas a la membrana plasmtica, for mndose y activndose el complejo NADPH oxidasa.
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eosinfilos maduros. Cuando los eosinfilos son estimulados secretan algunos mediadores derivados de membrana: Leucotrieno C4 (LTC4), leucotrieno B4, 15-HETE y PAF. Los eosinfilos pueden sintetizar varias citoquinas proinflamatorias; se ha descrito mRNA para: IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8, IL10, IL-16, factores de crecimiento (TGF, TGF, TNF, GM-CSF), IFN y algunas quimioquinas. Uno de los receptores ms importantes desde el punto de vista fisiopatolgico son los receptores de Fc de IgE de baja afinidad (FcRIII) (tabla 10-4). Los eosinfilos se acumulan en los tejidos. La quimiotaxis y la adhesin a las clulas endoteliales y a la matriz extracelular parece ser controlada por la respuesta inmune de clulas T y subsecuente liberacin de citoquinas. Las citoquinas liberadas en procesos alrgicos son las que participan en respuestas inmunes tipo Th2 (IL-4, IL-5), en cambio en la reaccin de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) se encuentran citoquinas asociadas a respuesta tipo Th1 (Ej. IL-2, IFN). La liberacin de IL-5 por LTh2 sensibilizados luego de su estimulacin con antgeno especfico, se puede asociar al desarrollo de eosinofilia durante enfermedad alrgica. Las citoquinas adems de participar en la diferenciacin de los eosinfilos a partir de los precursores, contribuyen a su acumulacin en el tejido inflamado. En esta ltima funcin participan principalmente IL-3, IL-5, GM-CSF, PF4, LTB4, IL-8 y RANTES. En la adhesin a endotelio y migracin transendotelial participan, al igual que para los neutrfilos, las molculas de adhesin celular: selectinas, integrinas y de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Algunas citoquinas (IL-3, IL-5 y GM-CSF) prolongan la sobrevida de los eosinfilos en los tejidos y aumentan su capacidad citotxica. En varias patologas aumenta la cifra absoluta de eosinfilos en la sangre (eosinoflia): infecciosas parasitarias, enfermedades alrgicas, neoplasias y algunos frmacos (ver captulo 11), y enfermedades mieloproliferativa (ver captulo 13).
2.4.3. Basfilos. Los basfilos representan menos del 1% de los leucocitos sanguneos (tabla 10-2). Al igual que los otros granulocitos maduros presentan un dimetro aproximado de 10 m. En los frotis sanguneos teidos con May-Grnwald Giemsa, los grnulos citoplasmticos cidos que se caracterizan por presentar un intenso color azul violeta, casi cubren completamente el ncleo bilobulado (figura 10-4). Los basfilos son muy similares a los mastocitos o clulas cebadas, en cuanto a la composicin de sus grnulos y a su funcin. La diferenciacin a basfilos y mastocitos desde clulas inmaduras (CD34+, c-kit-, FcRI-) ocurre a travs de varias etapas en que stos y otros marcadores de membrana se van modificando. Las clulas cebadas maduras presentan el siguiente fenotipo FcRI+ y c-kit+ y los basfilos son FcRI+, c-kit-, CD23+. Adems al igual que los eosinfilos son CD25+ y CD125+. En la diferenciacin de basfilos la principal citoquina que participa es IL-3; tambin participan GM-CSF, IL-4 e IL-5. Esta ltima pr omueve adems la diferenciacin de eosinfilos. El TGF-, en presencia de IL-3 suprime la diferenciacin de eosinfilos y favorece la diferenciacin de basfilos. Varias molculas mediadoras de inflamacin son liberadas tanto de basfilos y mastocitos por mecanismos mediados por unin de IgE u otros mecanismos. Ambas clulas contienen histamina, PAF, condroitinsulfato, LTB4, LTC4, IL4 e IL-13. Slo en los mastocitos, xido ntrico (NO), pr ostaglandinas D 2 (PGD 2 ), PGF 2 , tromboxano A2, triptasa, carboxipeptidasa A, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, TNF, TGF-, IFN; y slo en los basfilos, MIP-1. Varios factores pueden activar la secrecin de mediadores de inflamacin por parte de basfilos y clulas cebadas. Entre ellos, la unin de una molcula de IgE (o IgG) y su respectivo antgeno (alergeno) a los FcRI (o FcRII), anafilotoxinas (C3a y C5a), lectinas (ej. Concavalina A), algunas citoquinas (ej. IL-1, MIP-1). El pptido formil-met-leu-phe slo estimula la secrecin de los basfilos. Ambos tipos celulares participan en las etapas iniciales del proceso inflamatorio, pero en las etapas ms avanzadas de reparacin slo lo hacen los mastocitos. As, inicialmente ambos
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secretan mediadores inflamatorios (Histamina, IL-4, quimioquinas); solo los basfilos (IL-13); y solo los mastocitos (TNF, etc.), molculas que durante el proceso van disminuyendo. Por su parte, las clulas cebadas durante el desarrollo del proceso siguen liberando otros mediadores, ahora antiinflamatorios (IL-10, TGF-, etc.) y ms adelante, molculas que favorecen la reparacin tisular (proteinasas, factores de crecimiento y otras citoquinas). Varios frmacos antialrgicos y antiinflamatorios inhiben la secrecin de mediadores desde los basfilos y mastocitos; sus acciones son
mltiples y variadas; entre otros se incluyen agonistas de B2, antagonistas de H1, corticoides y ciclosporina A. 3. RGANOS LINFOIDES Desde un punto de vista inmunolgico, los rganos y tejidos linfoides, se pueden clasificar en primarios y secundarios (figura 10-6). Ms recientemente se han descrito los tejidos linfoides terciarios; parte de ellos son descritos aqu como tejido linfoide asociado a mucosas (punto 3.2.3) y se incluye adems en este concepto el tejido linfoide asociado a piel.
Figura 10-6. rganos linfoides. Se muestran los rganos linfoides primarios (Mdula sea y Timo) secundarios (Bazo, Ganglios linfticos: cervicales, axilares mesentricos e inguinales), tejido linfoide asociado a mucosa (GALT: intestinal; BALT: bronquial) y amgdalas (palatinas, farngea y linguales). Adems se indica el lugar de drenaje de los linfocitos desde el conducto torcico a la sangre (vena subclavia izquierda).
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3.1. rganos linfoides primarios En los rganos linfoides primarios, timo y mdula sea en el hombre, las clulas linfoides experimentan un proceso de proliferacin y difer enciacin a clulas T y clulas B, respectivamente. Este proceso no requiere presencia de antgenos extraos (antgeno independiente). All los linfocitos adquieren el repertorio de receptores antignicos especficos (LT: TCR y LB: IgM e IgD) y aprenden a distinguir entre lo propio y lo extrao. 3.1.1. Mdula sea En la mdula sea, a partir de la segunda mitad del embarazo y en el resto de la vida, ocurre la diferenciacin y maduracin de los glbulos r ojos, glbulos blancos y plaquetas (Hematopoyesis, ver punto 2.1 y captulos 1 y 2). Entre los leucocitos, tiene especial inters en este caso la maduracin de los linfocitos B. En el hombre y otros mamferos, la mdula sea es el tejido equivalente a la bolsa de Fabricio, rgano en el que se diferencian los linfocitos B en las aves; el origen de B se refiere a bolsa. La bolsa de Fabricio es un rgano linfoepitelial, que corresponde a un trozo de intestino modificado, localizado cerca de la cloaca; los folculos estn en la corteza y mdula de la bolsa. La mdula sea se encuentra en la cavidad medular de los huesos largos (principalmente en las epfisis) y en los espacios existentes entre las trabculas de los huesos esponjosos. La mdula sea est for mada por dos importantes compartimientos: vascular y hematopoytico. Los vasos sanguneos del compartimiento vascular forman un esqueleto estructural en la mdula sea. La sangre que ingresa a la mdula sea lo hace por las arterias nutricias que perforan la difisis a travs de los agujeros nutricios. Estas arterias entran en la cavidad medular y dan origen a la arteria longitudinal central, desde la cual se generan pequeos vasos que irrigan tanto la mdula como el hueso cortical. Las ramas dirigidas a la mdula descargan su sangre a capilares los cuales vacan en una extensa red de sinusoides. Los sinusoides (45 a 80 m de dimetro) estn compuestos por clulas endoteliales, una lmina basal y una capa externa de clulas reticular es; estas ltimas cubren aproximadamente el 50% de la superficie endotelial. Estos sinusoides drenan en una vena
longitudinal central, que a su vez descarga su contenido en venas que salen del hueso por el conducto nutricio. El pasaje transendotelial de clulas maduras, desde el comportamiento hematopoytico a la sangre ocurre directamente a travs de poros de migracin transitorios (4 m de dimetro) que se forman en las clulas endoteliales de los sinusoides. El compartimiento hematopoytico est for mado por los islotes de clulas hematopoyticas de las diferentes lneas celulares (serie granuloctica, serie monoctica, serie eritroblstica, serie megacarioctica y serie linfoide), en sus distintos estadios madurativos. En clulas se ubican entre los sinusoides, y entre stos y la cortical del hueso. Adems de las clulas hematopoyticas en la mdula sea tambin existen otras clulas que forman parte del denominado estroma medular. Entre ellas destacan: macrfagos, clulas reticulares y algunas clulas adiposas. Estas clulas participan activamente en la regulacin de la hematopoyesis secretando citoquinas y factores de maduracin. Adicionalmente los macrfagos fagocitan ncleos expulsados por los eritroblastos ortocromticos al madurar a reticulocitos, clulas alteradas y clulas muertas. La hematopoyesis implica un complejo proceso de maduracin y diferenciacin celular. A partir de una clula pluripotencial se originan los diferentes tipos de leucocitos (neutrfilos, linfocitos, monocitos, eosinfilos y basfilos), glbulos rojos y plaquetas. En dicho proceso participan varias citoquinas (ver punto 2.1 y captulos 1 y 2). Por otra parte, las molculas de adhesin celular (ver captulo 12) presentes en las clulas hematopoyticas y del estroma, y la matriz extracelular tienen fundamental participacin en el proceso de maduracin y focalizacin en la mdula sea. En el caso particular de los linfocitos, las clulas B maduran en la propia mdula sea. Respecto a las clulas T, si bien stas maduran en el timo, desde la mdula sea emigran clulas encomendadas a madurar como linfocitos T. Usando citometra de flujo, en mdula sea, se ha detectado una subpoblacin que coexpresa CD34 (marcador de Stem Cells), CD2, CD7 y CD3 citoplasmtico (marcadores de lnea T). Sin embargo, tambin se propone la existencia de un progenitor comn para ambos linajes celulares, B y T. Otros hallazgos indican que CD44 podra participar en el homing de las clulas linfoides que llegan al timo a madurar como clulas T.
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3.1.2. Timo La principal funcin del timo es participar en la maduracin y diferenciacin de los linfocitos T a partir de la proliferacin y diferenciacin de linfocitos troncales inmunolgicamente no competentes que llegan, en estado inmaduro, desde la mdula sea. En el humano, el timo comienza a originarse hacia el final de la sexta semana de gestacin. Para el nacimiento el timo est totalmente desarrollado. El timo es un rgano de naturaleza linfoepitelial que se ubica en el mediastino antero-superior, sobre los grandes vasos del corazn. Su tamao y grado de desarrollo varan con la edad del individuo, alcanzando su mximo desarrollo (40 a 50 gramos), cerca de la pubertad, despus de la cual empieza a involucionar, proceso que contina hasta avanzada edad. Est formado por dos lbulos, derecho e izquierdo, unidos por tejido conectivo. Ambos lbulos estn rodeados por una cpsula de tejido conectivo; sta emite numerosos tabiques al interior de los lbulos subdividindolos en miles de lobulillos de 0,5-2 mm. Cada lbulo posee una zona perifrica y ms rica en clulas, denominada corteza y la mdula. Los tabiques llegan hasta el lmite crticomedular. El estroma laxo, compuesto por clulas reticulares epiteliales entreteje la corteza y la mdula. En el retculo se encuentran linfocitos, macrfagos y clulas dendrticas interdigitantes. Las clulas retculo-epiteliales tienen un aspecto variable. Presentan prolongaciones en forma de estrella, que interaccionan entre s. En la periferia de la corteza y alrededor de los vasos sanguneos, estas clulas conforman una capa continua de clulas planas. En la mdula existen ms clulas reticulares epiteliales que en la corteza, conformando en la primera los corpsculos de Hassall. Las clulas reticulares epiteliales expresan en su superficie molculas MHC de clase I y de clase II, las que al interaccionar con las clulas linfoides son fundamentales en el proceso de maduracin de estos ltimos. Los macrfagos se encuentran en cantidad moderada en la corteza, pero son ms abundantes en la mdula. Tambin expresan molculas MHC de clase I y II.
Las clulas dendrticas interdigitantes se encuentran en abundante cantidad en el lmite crticomedular y en la mdula, se ubican entre el retculo que conforman las clulas retculoepiteliales. Al igual que estas ltimas, presentan largas prolongaciones citoplasmticas a travs de las cuales toman contacto con los linfocitos. Tambin al igual que las clulas reticularesepiteliales expresan en su membrana molculas MHC clase I y II, y participan en la maduracin de los linfocitos. Las clulas linfoides se localizan entre las mallas que dejan las clulas retculo-epiteliales y son mucho ms abundantes en la corteza que en la mdula tmica. En la corteza subcapsular exter na son clulas grandes (15 m); corresponden a linfoblastos (clulas linfoides inmaduras). En el resto de la corteza y mdula son ms pequeos. Despus de la pubertad, cuando el timo comienza a involucionar, pierde peso y aumenta progresivamente la proporcin de adipocitos (clulas grasas); sin embargo durante toda la vida persisten restos de parnquima. En el adulto una vez que se ha formado un pool de clulas T perifricas, aparentemente no es necesario la produccin de grandes cantidades de linfocitos T. Respecto a los vasos sanguneos, el timo es irrigado por sangre que fluye a travs de arterias que ingresan por la cpsula, formando arteriolas en los tabiques. Aqu se forman las vnulas interlobulares las cuales se vacan en la vena tmica eferente. Los capilares presentan un endotelio rodeado de una gruesa lmina basal. La corteza slo es irrigada por capilares, stos participan de la llamada barrera hematotmica, que protegera a las clulas linfoides en maduracin en la corteza tmica, contra sustancias antignicas circulantes. En el timo ocurre la maduracin de los linfocitos T, clulas que participan de la inmunidad celular e indirectamente en la inmunidad humoral. Clulas linfoides inmaduras llegan, desde la mdula sea (durante la gestacin: del saco vitelino, bazo e hgado) a la regin subcapsular de la corteza tmica donde se diferencian a clulas T inmaduras (timocitos). Durante el proceso de maduracin, desde clulas doble negativas (CD4-, CD8-), y CD3- y TCR- a clulas T CD4+ (LTh) o CD8+ (LTc) y CD3+ y TCR+, las clulas linfoides se movilizan desde la corteza a la mdula tmica. Durante este recorrido interaccionan con clulas reticulares epiteliales
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y clulas dendrticas interdigitantes, las cuales expresan en su membrana molculas de MHC clase I y II. En el proceso de maduracin ocurren los procesos de seleccin, positiva y negativa. En la primera, los linfocitos que a travs de su TCR reconocen las molculas MHC propias son seleccionados positivamente (pueden continuar el proceso de maduracin); los otros sufren apoptosis. Las clulas que pasan la primera etapa son sometidas a la llamada seleccin negativa, durante la cual son eliminadas (apoptosis) las que, a travs de su TCR, reconocen con alta afinidad antgenos propios en las molculas MHC de clase I o II de las clulas r eticulares-epiteliales o clulas dendrticas interdigitantes. Durante el proceso de maduracin tmica sobrevive alrededor del 5% de las clulas linfoides que proliferaron en la corteza tmica; las clulas T maduras (LTc y LTh), abandonan la mdula tmica a travs de las venas que drenan al timo. La falta de desarrollo congnita de timo se denomina Sndrome de DiGeorge. Estas personas no pueden producir linfocitos T, desarrollando una inmunodeficiencia grave. 3.2. rganos linfoides secundarios Los diferentes rganos linfoides secundarios, que incluyen los ganglios linfticos, el bazo y el tejido linfoide asociado a mucosas (MALT), cumplen importantes funciones en el sistema inmune, proporcionando una interfase entre la inmunidad innata y la inmunidad adquirida, puesto que permiten: (a) reclutar un gran nmer o de linfocitos vrgenes desde la circulacin sangunea, (b) recolectar antgenos solubles y clulas dendrticas desde los tejidos perifricos, (c) proporcionar el entorno celular y molecular necesario para el desarrollo de tolerancia antgeno especfica o para la expansin clonal de linfocitos y el desarrollo de una respuesta inmune efectiva, (d) modular la recirculacin y homing de linfocitos efectores y de memoria. 3.2.1. Ganglios linfticos Los ganglios linfticos son pequeos rganos linfoides ovales y encapsulados, de 1-3 cm de dimetro. A diferencia de otros rganos linfoides, estn interpuestos en el trayecto de los vasos linfticos, actuando como filtros a travs de los cuales pasa la linfa en su camino hacia la sangre; entre otros elementos filtran
bacterias, otros microorganismos y otras sustancias extraas. Los ganglios linfticos se encuentran en nmero variable en ciertas zonas del cuerpo, pero son ms abundantes en las regiones axilar, cervical, inguinal, en las cavidades corporales (Ej. mesenterio) y a lo largo de los vasos mayores. Los elementos de sostn del ganglio linftico son: (a) la cpsula que rodea al ganglio y est compuesta de tejido conectivo, (b) trabculas, son prolongaciones de la cpsula hacia el interior del parnquima ganglionar, y (c) tejido reticular, red tridimensional formada por clulas y fibras reticulares, suspendidas de la cpsula y trabculas, que forma la estructura del rgano. El parnquima del ganglio se divide en dos regiones: corteza y mdula. La corteza, es la zona ms externa y separada en compartimientos por las trabculas. Se distinguen las cortezas externa y profunda (o paracorteza). La corteza externa alberga los denominados folculos (o ndulos) linfoides primarios que son agregados esfricos de LB (vrgenes y de memoria). Estos ndulos pueden pr esentar un centro ger minativo, denominndose as folculos linfoides secundarios. Estos ltimos se forman cuando se desarrolla una respuesta inmune; en el centro ger minal se encuentran LB llamados centroblastos. Aqu se generaran los LB de memoria y clulas plasmticas (clulas efectoras de las clulas B). La regin perifrica de los folculos secundarios se denomina zona del manto o calota, formada por linfocitos que estn emigrando del centro germinal. La corteza externa es una zona dependiente de mdula sea o zona B. En la corteza profunda (paracorteza) no existen folculos y est poblada principalmente de clulas T. (zona dependiente de timo, zona T) Las clulas presentadoras de antgeno emigran hacia esta zona para presentar los antgenos en molculas MHC clase II a los LTh. Si stas se activan, ocurrir una expansin clonal y aumentar la anchura de la paracorteza. Las clulas T recin formadas emigran hacia los senos medulares, dejan el ganglio y van a la zona de actividad antignica. Las vnulas de endotelio columnar (HEV) estn localizadas en esta regin; a travs de este tipo de epitelio los linfocitos de la circulacin general ingresan al parnquima ganglionar. En la interaccin de los linfocitos con el endotelio y migracin transendotelial participan molculas de adhesin, en forma similar a lo descrito para
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los neutrfilos (ver punto 2.4.1.). Luego de ingresar los LB migran a la corteza y la mayora de los LT, permanecen en la corteza profunda. La mdula corresponde a la parte ms interna del ganglio. Consiste en los llamados cordones medulares constituidos por linfocitos, clulas plasmticas y macrfagos. Estos cordones estn ubicados alrededor de los senos medulares, los que convergen a la regin del hilio donde desembocan en los vasos linfticos eferentes. Los linfocitos de los cordones estn en proceso de emigrar desde la corteza para entrar en los senos medulares y as va linfticos eferentes alcanzar el conducto torcico, y luego la circulacin general (ver punto 4). Los vasos que llegan al ganglio se llaman vasos linfticos aferentes y se introducen en l por varios puntos de la superficie convexa y vacian la linfa en el seno subcapsular. Este seno se contina con los senos corticales o paratrabeculares (paralelos a las trabculas) los que descargan la linfa en los senos medulares que a su vez drenan la linfa en los vasos linfticos eferentes. stos abandonan el ganglio por el hilio; ambos vasos linfticos, aferentes y eferentes poseen vlvulas. Tambin entran y salen a travs del hilio (zona cncava del ganglio), los vasos sanguneos (arteria y vena) y nervios. Otros tejidos linfoides como las amgdalas, el bazo y el timo tienen slo vasos linfticos eferentes. Entre las funciones de los ganglios linfticos, est el filtrar la linfa que entra va vasos linfticos aferentes, as los macrfagos pueden fagocitar alrededor del 90% de los antgenos que ingresan a los ganglios. Esto causa un proceso inflamatorio con aumento de volumen del ganglio. Adems de la fagocitosis del antgeno en los ganglios linfticos, los linfocitos B y/o T toman contacto con los antgenos. Una respuesta inmune primaria (primer contacto con el antgeno especfico) se inicia con activacin de LTh vrgenes, ubicados en la corteza profunda; aproximadamente 48 horas despus de la activacin se transforman en linfoblastos los que sufren mitosis generndose a los 5 das un clon de LTh efectores y de memoria. Si el agente infeccioso es intracelular (ej. Virus) se activan los LTc que reconocen los antgenos expresados en molculas MHC de clase I. Al mismo tiempo que se activa la respuesta inmune celular los escasos LB existentes en la
corteza profunda y otros reclutados desde la corteza externa pueden endocitar el antgeno, procesarlo y presentarlo a los LTh. Por su parte, los LT CD4+ facilitan la respuesta inmune humoral, particularmente en el caso de los llamados antgenos timo dependientes. As en la paracorteza se generan pequeos focos de diferenciacin y maduracin de LB a clulas plasmticas las que secretarn anticuerpos (IgM, IgG) que llegan a la sangre va linfa eferente. Posteriormente algunos LTh y LB migran a los folculos primarios de la corteza externa amplificando la respuesta inmune. All se generan linfoblastos, llamados en este caso centroblastos. Por un proceso de maduracin y seleccin por afinidad van siendo seleccionados los que presentan mayor afinidad por el antgeno. Tambin ocurre aqu el fenmeno denominado cambio de clase o isotipo. 3.2.2 Bazo El bazo es el rgano linfoide de mayor tamao del cuerpo (aproximadamente 150 g en adultos); est situado en el peritoneo, en la regin superior izquierda del abdomen. El bazo est rodeado por una cpsula de tejido conectivo desde la cual parten trabculas hacia el parnquima del rgano. Por el hilio entran la arteria esplnica y nervios, y salen la vena esplnica y vasos linfticos. La estructura del rgano est dada por una red tridimensional de fibras y clulas reticulares, conectadas a la cpsula y trabculas (similar a los ganglios linfticos). La arteria esplnica se ramifica en las arterias trabeculares, las que al presentar un dimetro de 0,2 mm dejan las trabculas y son rodeados por linfocitos denominndose a stos vaina linftica periarterial y al vaso, arteria central. Luego sta pierde la vaina linftica y se subdivide en varias arterias penicilares, que entran a la llamada pulpa roja (ver ms adelante). El extremo de las arterias penicilares corresponden a capilares arteriales terminales que descargan la sangre en los senos esplnicos. stos drenan en las venas pequeas de la pulpa, las que van aumentando de calibre, llegando a formar la vena esplnica, que drena en la vena cava. El parnquima esplnico o pulpa esplnica, se divide en pulpa blanca y pulpa roja. La pulpa blanca est compuesta por tejido linfoide, principalmente linfocitos, estrechamente asociados a la arteria central, a cuyo alrededor
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forman la vaina linftica periarterial. En sta existen principalmente clulas T (aproximadamente 70% de CD4+ y 30% de CD8+). Las clulas B estn organizadas en folculos, generalmente incorporados en la vaina linftica periarterial. Los folculos primarios contienen clulas B no estimuladas y los folculos secundarios son sitios de activacin y proliferacin de clulas B, y contienen centro germinal. La pulpa blanca est rodeada por una delgada zona marginal que la separa de la pulpa roja, que contiene clulas B, clulas helper, macrfagos y clulas dendrticas interdigitantes (clulas presentadoras de antgeno). En la zona marginal tambin se encuentran los senos marginales; aqu es donde las clulas y antgenos transportados por la sangre tienen acceso al parnquima del bazo. As puede ocurrir: (a) contacto entre los antgenos y las clulas presentadoras de antgeno; (b) los macrfagos pueden fagocitar microorganismos y clulas senescentes; (c) clulas T y B de la sangre pueden ingresar a la pulpa blanca; y (d) los LTh, reconocen antgenos presentados en molculas MHC clase II por las clulas dendrticas interdigitantes; esto dar lugar a activacin y proliferacin clonal en la pulpa blanca (folculo secundario). A modo de resumen, los linfocitos se forman en la pulpa blanca, las clulas B de memoria y clulas plasmticas en los folculos linfticos y las subpoblaciones de clulas T en las vainas linfticas periarteriales. Los LB y LT recin formados entran en los senos marginales y emigran hacia el sitio inflamatorio, o forman parte de la reserva recirculante de linfocitos. La mayora de las clulas plasmticas emigran a la mdula sea para sintetizar y secretar anticuerpos en los senos medulares; slo algunas se quedan en la zona marginal para hacer lo propio en los senos marginales. La pulpa roja est compuesta de sinusoides venosos separados por cordones parenquimatosos, que consisten en mallas de clulas reticulares y fibras reticulares, en la que existen abundantes eritrocitos, macrfagos, linfocitos, clulas plasmticas y granulocitos. Estos macrfagos son responsables de retirar de la circulacin los glbulos rojos y plaquetas, senescentes y alterados. Desde el punto de vista inmune, el bazo presenta una funcin similar a los ganglios linfticos, la diferencia fundamental radica en
que el bazo es el ms importante sitio de respuesta inmune a antgenos circulantes y los ganglios linfticos participan en la respuesta inmune a antgenos presentes en la linfa. El concepto de respuesta inmune se refiere a la respuesta inmune innata y especfica, tanto celular (fagocitosis, activacin de clulas T) como humoral (activacin de clulas B con la consiguiente sntesis de anticuerpos). 3.2.3 Tejido linfoide asociado a mucosa En muchas regiones del cuerpo, el tejido linfoide no est encapsulado como en los ganglios linfticos y el bazo. Se trata de tejido linfoide difuso sin organizacin especial, que no se separa con precisin del tejido conectivo vecino, pero que presenta folculos linfoides aislados. A estos tejidos se le denomina tejido linfoide asociado a mucosa (MALT), las localizaciones ms caractersticas son las asociadas a la mucosa intestinal (GALT, gut) y respiratoria (BALT, broncus); tambin existe en la mucosa urogenital. Adems de linfocitos que se encuentran en mayor porcentaje, tambin se hallan linfoblastos, clulas plasmticas y macrfagos. Los folculos de los MALT son similares a los existentes en el bazo y los ganglios linfticos; las regiones centrales son ricas en clulas B, igual que los centros germinales. GALT. Todo el tracto gastrointestinal contiene MALT. Sin embargo, el intestino delgado, principalmente el leon, adems de folculos linfoides aislados, contiene conglomerados linfoides denominados placas de Peyer. stas presentan un folculo formado por clulas B, rodeado por una regin ms laxa de clulas T y macrfagos que actan como CPA. Las placas de Peyer no cuentan con vasos linfticos aferentes, pero s presentan vasos linfticos eferentes que drenan en los ganglios linfticos mesentricos. Los linfocitos llegan a las placas a travs de pequeas arteriolas que son drenadas por HEV. Si bien el leon est revestido por epitelio cilndrico simple, las zonas adyacentes a los folculos linfoides de las placas estn cubiertas por clulas de tipo escamoso (pequeas y anchas) llamadas clulas M, a travs de las cuales los antgenos luminales penetran por pinocitocis y fagocitosis. BALT. El tejido linfoide asociado a la mucosa de bronquios es, estructuralmente, similar a las placas de Peyer, presenta folculos ricos en clulas B, y sectores en que existen LT y CPA. El
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BALT se encuentra en los bronquios de todos los lbulos pulmonares; se ubica principalmente en las bifurcaciones de los bronquios y bronquiolos. Al igual que en el GALT en la zona adyacente a los folculos linfoides el epitelio cilndrico es reemplazado por clulas M descritas en el GALT. Tampoco presentan vasos linfticos aferentes, pero s eferentes y est ricamente vascularizado. La IgA es la clase de anticuerpo que ms activa y eficientemente puede ser secretada a travs del epitelio. Ello le significa una importante participacin en la defensa contra patgenos a nivel de las vas respiratorias y del tracto intestinal. En el intestino la produccin de IgA se inicia por el ingreso de los antgenos a las placas de Peyer, donde clulas T de regiones interfoliculares y clulas B foliculares, son estimuladas. Algunos de los linfocitos B se diferencian a clulas productoras de IgA y migran a la lmina propia, ubicada bajo el epitelio de mucosa. Las citoquinas ms importantes en el cambio de clase a isotipo IgA son el factor de crecimiento transformante B (TGF-B) e IL-5. Algunas clulas B activadas migran a los centros germinales de las placas de Peyer, donde ocurren proliferacin de los LT y mutaciones somticas de los genes de Ig, lo que conduce a una mayor afinidad de los anticuerpos. Los linfocitos productores de IgA pueden permanecer en la lmina propia o pueden migrar a otras mucosas u rganos linfoides. 3.2.4 Amgdalas Las amgdalas son agregados encapsulados, de manera incompleta, de folculos linfoides. Existen 3 tipos de amgdalas: (a) palatinas: bilaterales, localizadas en los lmites de la cavidad oral y la faringe; (b) farngea: nica, ubicada en el techo de la faringe nasal y (c) linguales: varias, se encuentran en superficie dorsal del tercio posterior de la lengua. Por su estratgica localizacin, las amgdalas estn directamente expuestas a tomar contacto con antgenos inhalados e ingeridos. El parnquima de los diferentes tipos de amgdalas es similar, est conformado por folculos linfoides ricos en clulas B, los que pueden presentar centros ger minales. Reaccionan a los antgenos for mando linfocitos y estableciendo una reaccin inflamatoria. La superficie de las amgdalas est recubierta por epitelio, diferente en cada caso.
4. TRNSITO LINFOCITARIO La recirculacin y homing linfocitario es un evento central en el desarrollo de una respuesta inmune efectiva, puesto que linfocitos B y linfocitos T deben interactuar primero con clulas presentadoras profesionales (clulas dendrticas y clulas dendrticas foliculares, respectivamente), antes que se produzca la necesaria colaboracin entre linfocitos T y linfocitos B. En la figura 10-7 se muestra un esquema de la recirculacin de los linfocitos. Antgenos solubles y clulas dendrticas cargadas con antgenos capturados en la periferia, son transportados va vasos linfticos aferentes hacia rganos linfoides secundarios, a los cuales debern ingresar linfocitos T y linfocitos B vrgenes, va HEV. Si los linfocitos fallan en el reconocimiento de antgenos especficos, retornarn a la circulacin (a travs de vasos linfticos eferentes que desembocarn en el conducto torcico), para entrar a un nuevo rgano linfoide secundario (recirculacin y homing). Cuando un linfocito virgen, se encuentra con el antgeno, deber decidir en el contexto de seales accesorias de coestimulacin pr opor cionadas en el rgano linfoide secundario, si desarrolla una respuesta inmune efectora que conduce a la eliminacin del antgeno o bien se hace tolerante al antgeno o muere para evitar la autoinmunidad A diferencia de los linfocitos T vrgenes, los linfocitos T efectores son capaces de producir citoquinas y eliminar el antgeno (en el caso de linfocitos T citotxicos) o bien modificar la conducta de otros leucocitos (como hacen los linfocitos T helper) y expresar molculas de adhesin y homing que les permitirn ahora migrar desde el rgano linfoide secundario al tejido perifrico por donde ingres originalmente el antgeno. La mayora de las clulas efectoras morir luego de eliminado el antgeno, pero una pequea fraccin permanecer como clulas memoria: (a) como clulas de memoria efectoras que migrarn a los tejidos perifricos o (b) como clulas de memoria centrales, que como los linfocitos vrgenes harn recirculacin y homing entre los rganos linfoides secundarios.
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Figura 10-7. Recirculacin de los linfocitos. Una vez que las clulas T y B salen de los rganos linfoides primarios como linfocitos maduros, pasan a travs de la circulacin general a los tejidos linfoides secundarios. Desde los ganglios linfticos, salen a travs de los vasos linfticos efer entes y vuelven a la circulacin general, fundamentalmente, por el conducto torcico.
LECTURAS SUGERIDAS Babior, B., NADPH oxidase: An update, Blood, 93(5):1464-1476, 1999. Degos, L., Linch, C., Lwenberg, B., Textbook of Malignant Haematology, Chapters 3, 4, Martin Dunitz, 1999. Gartner, L. y Hiatt, J., Traducido por Sapia, S., Histologa, texto y atlas, Captulos 10 y 12, Interamericana, 1997. Geneser, F., Histologa: sobre bases moleculares, Captulos 10, 11 y 16, Editorial Panamericana, 2001. Hampton, M.; Kettle, A.; Winterbown, C., Inside the neutrophil phagosome: oxidants, mieloperoxidase, and bacterial killing, Blood, 92(9): 3007 - 3017, 1998.
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HEMATOLOGA
Captulo
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ALTERACIONES NO MALIGNAS DE LOS LEUCOCITOS

Ivn Palomo G., Flavio Carrin A. y Alejandra King D.
1. Introduccin 2. Alteraciones cuantitativas de los leucocitos 2.1. Neutrfilos 2.1.1. Neutrofilias 2.1.2. Neutropenias 2.2. Eosinfilos 2.2.1. Eosinofilias 2.3. Basfilos 2.3.1. Basofilia 2.4. Monocitos 2.4.1. Monocitosis 2.5. Linfocitos 2.5.1. Linfocitosis 2.5.2. Linfopenia 3. Alteraciones funcionales de los leucocitos 3.1. Alteraciones funcionales de los granulocitos 3.1.1. Defectos de la adhesin 3.1.2. Defectos de la quimiotaxis 3.1.3. Defectos del metabolismo oxidativo 3.1.4. Defecto de los grnulos de los lisosomas 3.2. Alteraciones funcionales de los linfocitos 3.2.1. Defectos en la expresin de molculas MHC 3.2.2. Defectos de activacin y funcin de clulas T 3.2.3. Sndrome hiper IgM ligado al sexo 3.2.4. Inmunodeficiencia comn variable 3.2.5. Deficiencia selectiva de IgA 3.2.6. Deficiencia selectiva de subclases de IgG 3.3. Alteraciones funcionales secundarias de los leucocitos y en situaciones especiales 3.3.1. Sistema inmune fetal y neonatal 3.3.2. Envejecimiento y sistema inmune 3.3.3. Inmunidad y nutricin 3.3.4. Inmunodeficiencia secundaria a enfermedades crnicas 3.3.5. Inmunodeficiencia secundaria a enfermedades infiltrativas y tumorales 3.3.6. Inmunodeficiencia secundaria a terapia inmunosupresora
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RESUMEN
En este captulo se revisan las alteraciones no malignas de los denominados leucocitos o glbulos blancos, tanto cuantitativas como funcionales. Entre las alteraciones cuantitativas se analizan las causas de aumento y disminucin de los diferentes tipos de glbulos blancos y entre las alteraciones cualitativas se revisan las disfunciones de los granulocitos (especialmente neutrfilos) y los linfocitos.
1. INTRODUCCIN Los leucocitos, al igual que las dems clulas sanguneas, se forman en la mdula sea (ver captulos 1 y 2). La funcin de cada tipo de glbulo blanco (neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfocitos y monocitos) es diferente (ver captulo 10). Las alteraciones que pueden presentar los leucocitos son del tipo oncohematolgicas y no neoplsicas; estas ltimas se pueden clasificar en cuantitativas y cualitativas. Este captulo trata sobre las alteraciones no neoplsicas, as por ejemplo respecto a las alteraciones cuantitativas se describirn las situaciones patolgicas que pueden asociarse con neutrofilia, neutropenia, eosinofilia, basofilia, linfocitosis, linfopenia y monocitosis. Por otra parte, en lo que se refiere a las alteraciones cualitativas se abordaran las alteraciones funcionales de los granulocitos (defectos de la adhesin, de la quimiotaxis, del metabolismo oxidativo, de los grnulos de los lisosomas) y de los linfocitos (defectos en la expresin de MHC, de activacin y funcin de clulas T, sndrome hiper IgM ligado al sexo, inmunodeficiencia comn variable, deficiencia selectiva de IgA y deficiencia selectiva de subclases de IgG). 2. ALTERACIONES CUANTITATIVAS DE LOS LEUCOCITOS Las alteraciones cuantitativas de los leucocitos
sern desarrolladas en el siguiente orden: Granulocitos (neutrfilos, eosinfilos y basfilos), Monocitos y Linfocitos. 2.1. Neutrfilos En los adultos, los neutrfilos constituyen alrededor del 50-60% de los leucocitos circulantes lo que representa aproximadamente 2.000-7.000 neutrfilos/L. Los neutrfilos, como fagocitos, son parte de la inmunidad natural; participan en la defensa frente a microorganismos, especialmente bacterias y en procesos inflamatorios. 2.1.1. Neutrofilias Se define neutrofilia como un aumento en el recuento absoluto de neutrfilos en sangre perifrica (>7.500/L). Esto se puede producir por tres mecanismos que pueden actuar de forma aislada o conjunta: (a) incremento de la movilizacin de neutrfilos desde las reservas de la mdula sea o desde las clulas perifricas marginales, (b) trastorno en la migracin de neutrfilos hacia los tejidos perifricos, y (c) expansin de la poblacin celular debido a un aumento de la actividad mittica. En la tabla 11-1 se resumen las causas de neutrofilia.
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Tabla 11-1. Causas de neutrofilia Infecciones agudas (locales o generalizadas): bacterias, hongos, parsitos, y algunos virus. Inflamaciones: dao de tejido por quemaduras, ciruga, necrosis isqumica como en infarto agudo de miocardio, gota, enfermedad vascular del colgeno, reacciones de hipersensibilidad y procesos inflamatorios similares. Alteraciones metablicas: uremia, cetoacidosis diabtica y eclampsia. Envenenamiento por qumicos (plomo, mercurio, derivados del benceno), drogas (digitales) y veneno de insectos (araa). Frmacos: corticoides, adrenalina, epinefrina. Sndromes mielopoliferativos: leucemia mieloide crnica, policitemia vera. Cncer metastsico. Causas miscelneas: intoxicacin, hemorragia aguda, hemlisis aguda. Causas fisiolgicas: ejercicio intenso, recin nacidos, embarazo. epiteliales reconocen la invasin de estos patgenos. Es as como estas clulas inducen la produccin de mediadores pro-inflamatorios como el factor de necrosis tumoral (TNF), interleuquina-1 (IL-1), IL-6 e IL-8. Varias citoquinas, principalmente IL-6 e IL-8 provocan un aumento en el nmero de neutrfilos, aunque tambin es liberada la Mcl-1, una protena anti-apopttica lo cual aumenta la sobr evida de stos. Luego se liberan mediadores antiinflamatorios (IL-4, IL-10 e IL13) los que detendran los procesos anteriores. Inflamacin La neutrofilia relativa en pacientes con infarto agudo de miocardio (IAM) se asocia con el desarrollo temprano post-infarto de deficiencia cardaca congestiva. La neutrofilia se produce comnmente en ataques agudos de gota pudiendo alcanzar valores de 30.000 neutrfilos/L. La reaccin inflamatoria por gota parece ser el resultado de la accin de agregacin de uratos y cristales de uratos en clulas mononucleares, induciendo la secrecin de IL-1, citoquina que acta como pirgeno endgeno, y tambin tiene capacidad quimiotctica para neutrfilos. Tambin se observa neutrofilia en asociacin con glomerulonefritis aguda, fiebre reumtica y con varias enfermedades del colgeno. Hemorragias agudas Una a dos horas despus de iniciada una hemorragia aguda se presenta leucocitosis. Es mayor cuando el sangramiento ocurre en la cavidad peritoneal, espacio pleural, cavidad articular. Esto probablemente ocurre como
Infecciones Las neutrofilias pueden resultar de una infeccin, especialmente las causadas por Staphylococcus, Streptococcus, Gonococcus y Meningococcus, por algunos bacilos, as como por ciertos hongos, Spirochetas, algunos virus, Rickettsia y parsitos. En las infecciones, la cintica de los neutrfilos puede separarse en tres fases: temprana, intermedia y tarda. Durante la etapa inicial la cifra de neutrfilos circulantes disminuye levemente; luego ingr esan a la sangre, neutrfilos provenientes desde la mdula sea, perodo en el cual la vida media de stos es ms corta que lo normal. La fase intermedia se caracteriza por neutrofilia; sin embargo, si la demanda de clulas es mayor, la reserva medular se puede agotar y observarse neutropenia. En la fase tarda, el flujo de neutrfilos desde la mdula sea a la sangre disminuye y la vida media de los neutrfilos se prolonga. La presencia de fiebre, hipotermia, taquicardia y taquipnea caracteriza al denominado systemic inflammatory response syndrome (SIRS). SIRS representa la respuesta inflamatoria del organismo, sea sta debida a infeccin o no. Cuando se presenta compromiso pulmonar, vaso dilatacin con hipotensin arterial, etc. en presencia de SIRS, se denomina SIRS severo; cuando ste es causado por una infeccin se denomina sepsis. La sepsis es inducida por microorganismos o mejor dicho por sus toxinas, como son el lipopolisacrido (LPS) de bacterias Gram negativas o por compuestos celulares de Gram positivas como son el peptidoglicn y cido teicoico, as como tambin toxinas de hongos. Monocitos, macrfagos, y clulas
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resultado de la suma de efectos inflamatorios de varios componentes sanguneos. En casos de ruptura en el embarazo tubrico, el recuento puede ser tan alto como 22.000 leucocitos/L. En casos de hemorragia intracraneal o hemorragia subaracnoidea, se puede encontrar neutrofilia. Recuentos de alrededor de 30.000 leucocitos/l se puede observar en casos que presentan ruptura esplnica. En hemorragias agudas, durante las primeras 3 horas, la neutrofilia ocurre por demarginacin de los leucocitos a la circulacin y luego el aumento se debe a la salida de neutrfilos desde la mdula sea. Neoplasias malignas
por el aumento de la concentracin de hormona del crecimiento y de la citoquina inflamatoria IL-6. En contraste, el ejercicio intenso o ejercicio de larga duracin pueden suprimir la degranulacin de los neutrfilos y la produccin de oxidantes reactivos. El ejercicio estimula la liberacin de citoquinas: IL1, TNF-, e interfern (IFN-). La IL-6 e IL-8 aumentan cuando el ejercicio es ms intenso. stas provocan un incremento en el recuento de neutrfilos ya que la IL-6 ejerce efectos sobre el eje hipotlamo-adrenal, liberando glucocorticoides los cuales provocan la demarginacin de neutrfilos al torrente sanguneo. La IL-8 ejerce un efecto quimiotctico y activa los neutrfilos. Glucocorticoides
El rpido crecimiento de neoplasias puede causar neutrofilia, posiblemente como resultado de necrosis tisular en algunos sectores del tejido infiltrado. Tambin algunos tumores pueden contener y/o inducir el aumento del factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF). Neutrofilia fisiolgica El ejercicio intenso, o despus de una inyeccin con epinefrina se asocia con neutrofilia. Tambin se observa durante el embarazo y en los recin nacidos. El ejercicio provoca un aumento bifsico en el nmero de neutrfilos. El ejercicio de intensidad moderada puede reforzar en los neutrfilos la actividad de estallido respiratorio, posiblemente
Los glucocorticoides provocan neutrofilia por liberacin de neutrfilos desde la mdula sea y por demarginacin de los mismos. Esto ltimo se puede explicar porque los glucocorticoides reducen la sntesis de mRNA que codifica para la molcula de adhesin L-selectina que participa en el rolling de los leucocitos al endotelio. 2.1.2. Neutropenias Se entiende por neutropenia la disminucin del recuento absoluto de neutrfilos bajo 1.500/L. Las neutr openias se pueden clasificar dependiendo de su magnitud, en leve, moderada y mar cada (tabla 11-2). Esta clasificacin es usada para predecir el riesgo de infecciones bacterianas graves.
Tabla 11-2. Clasificacin de neutropenias segn el recuento absoluto de neutrfilos Tipo Leve Moderada Grave Neutrfilos (L) 1.000-1.500 500-1.000 <500
Las causas de las neutropenias son varias y pueden ser adquiridas o congnitas (tabla 11-3).
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Tabla 11-3. Clasificacin de neutropenias segn origen Tipo Adquiridas Subtipos Medicamentosa Infecciosa Inmune Crnica benigna Otras Asociada a enfermedades hematolgicas Asociada a enfermedades endocrinas y metablicas Asociada a carencias nutricionales Disgenesia reticular Neutropenia y alteraciones linfoides Neutropenia asociada a hemopatas constitucionales Sndrome de Shwachman-Diamond Mielokatexis Neutropenia cclica Neutropenia congnita grave Txicas Inmunolgica Virus Bacterias Aloinmune Autoinmune Ejemplos
Congnitas
Ligadas a una patologa gentica compleja
Neutropenias congnitas aisladas
a1) Neutropenias adquiridas Las neutropenias adquiridas presentan una duracin variable y, generalmente, su diagnstico se basa en el examen clnico y exmenes bsicos de laboratorio. Neutropenia medicamentosa La neutropenia asociada a frmacos se presenta ms en nios que en adultos y los mecanismos pueden ser de tipo txico o inmune. Mecanismo txico. Se produce por una supresin de la mdula sea o por la destruccin perifrica de neutrfilos. Esto es propio de la mayora de los citostticos y de otros medicamentos como zidovudina, pirimetamina, penicilinas semisintticas, cloranfenicol y clorpromazina. Generalmente, la toxicidad de los medicamentos es dosis-dependiente y con grandes variaciones individuales. La recuperacin ocurre en aproximadamente dos semanas despus de suspender el tratamiento con el frmaco involucrado.
Mecanismo inmune. En algunos individuos, determinados medicamentos inducen la sntesis de anticuerpos, los cuales pueden inhibir la granulopoyesis o causar destruccin de neutrfilos maduros. La neutropenia suele aparecer de forma aguda, observndose en la mdula sea una hipoplasia granuloctica o una detencin de la maduracin a nivel de promielocito, con incremento de los pr ecursores ms inmadur os. Los medicamentos involucrados ms frecuentemente son: fenitona, penicilina, procainamida, hidralazina y quinidina.
Neutropenia infecciosa Varias infecciones pueden dar lugar a neutropenia, con frecuencia moderada y pasajera. En la mayora de las ocasiones la etiologa es viral (hepatitis, varicela, parvovirus, VIH, sarampin, rubola, parotiditis, influenza, virus de Epstein-Barr y citomegalovirus). La neutropenia est presente durante la fase de viremia y en general se debe a un aumento de la marginacin de los neutrfilos circulantes. En los ltimos aos se ha determinado la presencia de neutropenia en los pacientes portadores de
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VIH, fenmeno que podra ser explicado por diferentes mecanismos: (a) infeccin bacteriana o por una infiltracin viral de la mdula sea, (b) terapia mielosupresiva, zidovudina, ganciclovir y sulfametoxazol trimetropin, y (d) aumento de la apoptosis. Las infecciones bacterianas tambin pueden originar neutr openia, suponiendo, generalmente un factor de gravedad, especialmente en el recin nacido. La neutropenia se debe a los cambios txicos producidos en la mdula sea como resultado de la infeccin o a una destruccin excesiva de neutrfilos. Entre estas bacterias se han observado, por ejemplo: salmonellas, brucellas, bacterias Gram negativas y micobacterias.
Neutropenia autoinmune del lactante, preescolar o primaria. La mayora de los casos se observan en nios menores de 1 ao. Suele descubrirse con ocasin de un episodio infeccioso de gravedad moderada, a veces acompaado de monocitosis y eosinofilia. La neutropenia puede variar entre moderada y grave. Los anticuerpos pueden presentar especificidad contra antgenos especficos (NA-1, NA-2, NB-1). El autoanticuerpo ms frecuente (anti-HNA1) se ha asociado a infeccin previa por Parvovirus. Los anticuerpos pueden ser IgG, IgA o IgM. En la mayora de los casos la cifra de neutrfilos se normaliza en un plazo de 12 a 24 meses despus del tratamiento de antibiticos, IgG a altas dosis y la administracin de factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). Neutropenia autoinmune del nio mayor. Puede presentarse como fenmeno aislado, asociada a otras citopenias inmunes (anemia hemoltica autoinmune y/o trombocitopenia inmune) o en el contexto de una enfermedad autoinmune de carcter sistmico (lupus eritematoso sistmico, artritis reumatoide o hepatitis crnica activa) o enfermedades linfoproliferativas malignas. El tratamiento est dirigido a la enfermedad de base. Neutropenia crnica benigna Esta denominacin incluye a un grupo de neutropenias con bajo riesgo infeccioso y de cronicidad variable. La neutropenia se puede mantener por varios aos; se han descrito remisiones espontneas. El mielograma generalmente muestra marcada hiperplasia mieloide con reduccin de las formas ms maduras. La evolucin es generalmente favorable. Otras neutropenias adquiridas Asociada a enfermedades hematolgicas. Incluye leucemias agudas, aplasia medular adquirida, sndromes mielodisplsticos, histiocitosis y enfermedades malignas con metstasis medular. Asociada a enfermedades endocrinas y metablicas. Se ha observado disminucin del nmero de neutrfilos en casos de hiper o hipotiroidismo, insuficiencia suprarrenal, panhipopituitarismo, acidemia, hiperglicemia y glucognesis. La normalizacin del recuento de neutrfilos
Neutropenia inmune Las neutropenias inmunes pueden ser alo o autoinmunes: Neutropenia aloinmune. Es propia del recin nacido y est ligada a la presencia de anticuerpos de origen materno dirigidos contra uno o varios antgenos de los neutrfilos fetales. La madre se sensibiliza contra antgenos de los neutrfilos fetales que atraviesan la barrera placentaria durante la gestacin. Los anticuerpos IgG cruzan la circulacin placentaria en sentido materno-fetal y sensibilizan los neutrfilos fetales. Anticuerpos anti-HNA-1. Se originan por la falta de expresin del receptor FcgIIIb a nivel de la membrana de los neutrfilos de la madre. Dicho receptor expresa el sistema antignico HNA-1 o NA. Anticuerpos anti-NB (HNA-2 o CD177). Se originan por la presencia de poliformismos de este antgeno en los neutrfilos de la madre.
El diagnstico se confir ma mediante la determinacin de anticuerpos antineutrfilos que reaccionan contra neutrfilos neonatales y paternos, pero no contra los maternos, en el suero de la madre y del recin nacido. La evolucin es benigna, normalizndose el nmero de neutrfilos alrededor de los dos meses de edad. Neutropenia autoinmune. Se subdivide en varios tipos segn su forma de presentacin:
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generalmente se asocia al tratamiento de la enfermedad de base. Asociada a carencias nutricionales. Carencia en vitamina B 12, folato o ms raramente, hierro, pueden acompaarse de neutropenia. Los estados de marasmo, anorexia psicgena, as como la carencia en cobre, tambin pueden producir neutropenia. a2) Neutropenias congnitas Asociadas a una patologa gentica compleja Disgenesia reticular. Se origina por ausencia de clulas madres comprometidas en la diferenciacin mielo-linfoide. En sangre perifrica, desde el nacimiento, se presenta neutropenia grave asociada a linfopenia. Tanto la mdula sea, el timo y los ganglios linfticos muestran ausencia de clulas mieloides y linfoides. El nico tratamiento eficaz es el trasplante de progenitores hematopoyticos (TPH), que se debe realizar precozmente, ya que el riesgo de infecciones bacterianas o virales de evolucin fatal es muy alto. Neutropenia y alteraciones linfocitarias. Algunas inmunodeficiencias presentan neutropenia a lo largo de su evolucin, entre otras, la hipogammaglobulinemia, la disgammaglobulinemia, la ataxiatelangiectasia y la enfermedad de ChediakHigashi. En estas patologas, la neutropenia se debe a la muerte de muchos precursores mieloides en la mdula sea. Neutropenia asociada a enfermedades hematolgicas constitucionales. Algunas de estas patologas afectan la serie granuloctica; entre otras: (a) aplasia medular: anemia de Fanconi y disqueratosis congnita evolucionan a falla medular global incluyendo la lnea mieloide; (b) alteraciones de la serie roja: se puede encontrar neutropenia en la evolucin a largo plazo de una anemia Blackfan-Diamond. Algunas anemias hemolticas presentan neutropenia asociada a hiperesplenismo. La enzimopata por dficit de hexokinasa, puede cursar con pancitopenia. Sndrome de Shwachman-Diamond. Se hereda como un rasgo autosmico recesivo, asociado con mutaciones en el brazo largo
de los cromosomas 6 12. Se caracteriza por una disminucin en la produccin y diferenciacin de los granulocitos y defectos en el crecimiento, as como tambin por insuficiencia pancretica y alteraciones osteocondrales. La neutropenia es constante y marcada (<1000 clulas/L); se pueden observar anemia y trombocitopenia. Mielokatexis. Desorden congnito de carcter autosmico dominante, caracterizado por apoptosis de los granulocitos debido a la expresin disminuida de la protena bcl-X en las clulas pr ecursoras de la mdula sea. Esta inmunodeficiencia presenta neutropenia persistente desde la infancia. Los neutrfilos de estos individuos muestran cambios degenerativos, tales como: permeabilidad aumentada a los colorantes, vacuolas citoplasmticas, ncleo picntico e hipersegmentado. Neutropenias congnitas aisladas Neutropenia cclica y Neutropenia congnita grave (Enfer medad de Kostmann). Ambas enfer medades presentan neutropenia acompaada por infecciones graves y recurr entes. La neutropenia cclica, se caracteriza por episodios recurr entes de 3-6 das aproximadamente cada 3-4 semanas, de neutropenia grave (< 200 neutrfilos/L). En la neutropenia congnita grave estos episodios la presentan constantemente. En ambas enfermedades, los episodios de neutropenia incluyen anorexia, malestar, estomatitis con lceras orales y faringitis, aunque pueden aparecer infecciones ms graves en los pacientes con neutropenias ms pr ofundas. Los pacientes con neutr openias cclicas puede ser asintmaticos. En los pacientes sintomticos, la normalizacin del recuento de neutrfilos coincide con la desaparicin de los sntomas. La aparicin de la enfermedad generalmente ocurre en la infancia, aunque se han descrito casos diagnosticados en la edad adulta. La neutropenia suele asociarse a monocitosis. El diagnstico de sospecha en pacientes con episodios cclicos de estomatitis y faringitis; requiere la realizacin de recuentos, de neutrfilos dos veces por semana durante seis semanas para poder confirmar el diagnstico. En ocasiones, la neutropenia crnica benigna muestra un patrn cclico, pero nunca presenta la regularidad que
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caracteriza a la neutropenia cclica. En la etapa inicial de neutropenia cclica, la mdula sea muestra un rpido incremento de promielocitos y mielocitos, seguido del aumento de formas ms maduras. En la enfermedad de Kostmann la mdula sea presenta un nmero normal de precursores mieloides inmaduros con una detencin madurativa en el estadio de promielocito, existiendo una marcada disminucin de las otras for mas madurativas. En ambas enfermedades se ha observado la presencia
de una mutacin en el gen que codifica para la elastasa en el cromosoma 9. 2.2. Eosinfilos 2.2.1. Eosinoflia La eosinofilia se define como recuento de eosinfilos superior a 700 clulas/L en la sangre y se presenta en muchas condiciones clnicas (tabla 11-4).
Tabla 11-4. Causas de eosinofilia Trastornos alrgicos: asma bronquial, urticaria, edema angioneurtico, fiebre del heno, sensibilidad a frmacos, tabaquismo. Enfermedades dermatolgicas: pemfigus, dermatitis hipertiforme. Parasitosis: parsitos tisulares (ej., triquinosis, equinococos, schistosomiasis); menos frecuente en el parasitismo intestinal. Sndrome de Loeffler. Infiltracin pulmonar de eosinfilos. Eosinofilia tropical (principalmente filarasis). Enfermedades hematolgicas: leucemia mieloide crnica, policitemia vera, anemia perniciosa, enfermedad de Hodgkin, post-esplenoctoma. Enfermedades malignas, especialmente con metstasis o necrosis. Post- irradiacin. Miscelneas: periartritis nodosa, artritis reumatoide, sarcoidosis, ciertos venenos. Idioptica.
Los eosinfilos, a travs de sus enzimas, pueden neutralizar mediadores de inflamacin como la histamina, la sustancia de reaccin lenta de anafilaxis (SRS-UN) y el factor activador plaquetario (PAF). Adems, los eosinfilos ejercen funciones especficas durante la infeccin parasitaria ya que pueden causar dao en los parsitos. Alergias. En estos casos, generalmente la eosinofilia es moderada (200-1.500 eosinfilos/ L) pero en algunos casos puede ser marcada, como por ejemplo, en el asma bronquial (30.000 eosinfilos/L), siendo stos frecuentemente abundantes en secreciones nasales, esputo y ronchas de individuos alrgicos. Enfermedades dermatolgicas. En estas patologas la eosinofilia se asocia ms frecuentemente con dermatitis herpetiforme, dermatitis exfoliativa, psoriasis, prurito, eccema, micosis fungoide y granulomas faciales.
Parasitosis. Las infecciones por parsitos metazoarios causan una marcada y prolongada eosinofilia; los protozoos tambin, pero con menos frecuencia. Los parsitos que enquistan, causan leve eosinofilia e inflamacin, sin embargo, los parsitos que invaden tejidos causan eosinofilia ms significativa. Un ejemplo de esto es la infeccin por Trichinella spiralis; la eosinofilia aparece a las 1-2 semanas, despus de la ingestin de alimentos infectados, alcanzando su nivel ms alto al final de la 3 semana, pudiendo persistir por 6 meses o ms. Se han descrito recuentos tan elevados como 15.000 eosinfilos/L. En la equinococosis, la eosinofilia es leve, pero ocasionalmente puede ser marcada, probablemente asociada a la filtracin de fluido cstico en los tejidos. En estadios tempranos de cisticercosis, ocurre eosinofilia moderada. Con cierta frecuencia se observa eosinofilia en Toxoplasmosis humana y en las infecciones humanas por Toxocara canis (Larva migrante visceral). En esquistosomiasis la eosinofilia puede ser observada durante el
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perodo de incubacin. En la malaria los valores de eosinofilia son variables. Las parasitosis intestinales se asocian menos frecuentemente con eosinofilia. As Enterobius vermicularis, Trichocephalo trichiuris trichiura, diferentes amebas, y los parsitos flagelados, generalmente no se asocian con eosinofilia. El sndrome de Loeffler es un cuadro caracterizado por infiltraciones pulmonares transitorias, debido probablemente a una reaccin de hipersensibilidad, donde la eosinofilia est presente. Infiltracin pulmonar de eosinfilos. A diferencia del sndrome de Loeffler que es agudo, autolimitado y benigno, la infiltracin pulmonar de eosinfilos es crnica. Se acompaa de tos, disnea, fiebre, sudoracin, malestar general y otras manifestaciones. Se caracteriza por infiltrados pulmonares bilaterales pleomrficos y eosinofilia. Puede ser producido por diferentes infecciones: tuberculosis, coccidioidomicosis, brucelosis, neumona viral o bacteriana, o puede acompaar a numerosas infecciones parasitarias causando eosinofilia. Tambin puede ser una manifestacin de enfermedades neoplsicas (Enfermedad de Hodgkin), granuloma eosinoflico, reacciones alrgicas y otras enfermedades. Eosinofilia tropical. Se encuentra en la India y al sureste de Asia. Es una respuesta inmune al parsito Wuchereria bancrofti o Brugia malayi. En el diagnstico se considera el antecedente de estada en el trpico, IgE aumentada, y anticuerpos antifilarias. Enfermedades hematolgicas. En algunas neoplasias hematolgicas se puede presentar cierto grado de eosinofilia: linfoma de Hodgkin y leucemia mieloide crnica. Irradiacin. La eosinofilia ha sido descrita en trabajadores expuestos a sustancias radioactivas y en pacientes oncolgicos post-irradiacin. Miscelnea. La eosinofilia ha sido observada en asociacin con un grupo miscelneo de patologas: Periarteritis nodosa; artritis reumatoide complicada con vasculitis y pleuritis;
casos graves de tuberculosis de los ndulos linfticos; colitis ulcerativa y malformaciones congnitas cardiovasculares. Tambin se asocia a sustancias txicas como: sulfato de cobre, alcanfor, pilocarpina y fsforo. Pacientes con alteraciones vasculares y del colgeno se han asociado a eosinofilia. 2.3. Basfilos 2.3.1. Basoflia Se define basofilia al recuento de basfilos superior a 150/L. Se puede observar en pacientes con: mixedema, colitis ulcerativa, sinusitis crnica, varicela y en algunos casos de nefrosis. Tambin se puede observar en pacientes con dficit de hierro, cncer pulmonar, leucemia mieloide crnica, policitemia vera, metaplasia mieloide agnognica, algunas anemias hemolticas crnicas, enfermedad de Hodgkin, y post-esplenectoma. La infiltracin de basfilos ha sido observada en reas de der matitis por contacto, aparentemente en respuesta a una interaccin inicial entre el antgeno y los linfocitos. La aparicin de basfilos est relacionada a ciertos tipos de hipersensibilidad y la IgE parece ser un intermediario esencial en esta reaccin. En las reacciones a los parsitos, la descarga de mediadores por los basfilos parece ayudar en la expulsin de estos organismos multicelulares. Adems, la histamina liberada por los basfilos reclutados, o por los mastocitos locales pueden modular algunas reacciones retardadas a travs del estmulo de receptores de histamina-2 en clulas como los linfocitos T. El uso de estrgenos y drogas anti-tiroideas tambin se asocian con basofilia. 2.4. Monocitos 2.4.1. Monocitosis Se entiende por monocitosis al aumento del recuento de monocitos por sobre 1000/L. Se puede presentar en algunas infecciones, neoplasias y mesenquimopatas (tabla 11-5).
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Tabla 11-5. Causas de monocitosis Infecciones bacterianas: tuberculosis, endocarditis bacteriana subaguda, sfilis y brucelosis. Durante la recuperacin de infeccin aguda y de agranulocitosis. Infecciones por protozoos y rickettsias. Enfermedades oncohematolgicas: leucemia monoctica, enfermedad de Hodgkin y otros linfomas, leucemia mieloide crnica, mieloma mltiple, enfermedad de Gaucher y enfermedad de Niemann Pick. Tumores slidos: cncer de ovario, de estmago y de mamas. Mesenquimopatas: lupus eritematoso sistmico, artritis rematoide. Enfermedad granulomatosa: sarcoidosis, colitis ulcerativa. Terapia esteroidal
Infecciones bacterianas La monocitosis puede estar presente en ciertas infecciones bacterianas, incluyendo tuberculosis activa, listeriosis, endocarditis bacteriana subaguda, septicemia, sfilis y brucelosis. La infeccin por Listeria monocytogenes produce una respuesta mononuclear en conejos y otros animales, pero rara vez en humanos. Esta bacteria en su estructura presenta lpidos (agente productor de monocitosis) que causan la respuesta de monocitos. En los pacientes se observa un aumento de TNF-, IL-1, IL-6 e IL-8. En la tuberculosis los monocitos son la principal clula en la formacin del tubrculo, donde hay una alta tasa de recambio monocito-macrfago. Esta actividad puede reflejarse en la circulacin sangunea en monocitosis, relacionada a una activa extensin del proceso de tuberculosis. La lipoarabinomanoma presente en la superficie del M. tuberculosis, cuya accin es similar al LPS interacta directamente con el complejo de membrana CD14-receptor Toll tipo 2 de los macrfagos alveolares, estimulando en ellos la liberacin de TNF- e IL-1. Tambin se ha observado un aumento de IL-4, IL-6 e IL-10. Tambin se puede presentar monocitosis en la endocarditis causada por Streptococcus viridans, pudiendo representar hasta un tercio del recuento diferencial. En la sfilis, el Treponema pallidum activa los monocitos a travs de la unin de la lipoprotena a CD14, lo que induce la secrecin de IL-1, IL6, IL-12 y TNF-. La Brucella melitensis es un patgeno intracelular facultativo que posee la capacidad de sobrevivir e incluso es capaz de multiplicarse
en el interior de las clulas fagocticas del husped. La fase bactericida de la brucelosis coincide con la participacin de la inmunidad mediada por clulas, donde proliferan los macrfagos residentes y se reclutan monocitos circulantes. Despus de la infeccin aumenta la secrecin de IL-6, IL-1 y TNF-. La interaccin de los microorganismos antes mencionados con los monocitos/macrfagos activa una serie de procesos fisiopatolgicos que tienen por finalidad iniciar una respuesta inmune mediada por citoquinas que estimulan la monopoyesis. Brevemente, algunas estructuras de membrana de los agentes etiolgicos (Lipoarabinomanona, LPS, lipoprotena, cido lipoteicoico y peptidoglican) interaccionan con el complejo CD14-receptor Toll tipo 2 4, presente en la superficie de los monocitos/ macrfagos, complejo que est unido a la protena MD2. Este complejo activa la familia de protenas kinasas con actividad mitgena (MAP-kinasa) y la estimulacin de la transcripcin del factor nuclear kB (NF-kB), previa activacin del complejo MYD88, kinasa asociada a receptor de IL-1 (IRAK) y factor asociado al receptor de TNF (TRAF6). Adems, el receptor Toll 2 4 estimula a la protena adaptadora que contiene dominio de homologa para receptor Toll/IL-1 (TIRAP), la que a su vez activa, la fosfatidilinositol 3 kinasa que estimula la transcripcin de NF-kB. Tumores slidos malignos Las neoplasias malignas, como el cncer ovrico, gstrico o de mamas, con frecuencia presentan monocitosis. El quimioatractante de macrfagos, MCP-1, es producido por las clulas epiteliales en el cncer ovrico. Cuando las clulas ovricas sufren la
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transformacin a clulas neoplsicas, comienzan a sintetizar un grupo de citoquinas, entre la que destacan IL-1, IL-6, IL-8 y TNF-, las cuales estimulan la monopoyesis. Mesenquimopatas Los macrfagos y las molculas que stos secretan son fundamentales en la inflamacin y destruccin observada en la artritis reumatoidea. Un evento temprano en la patognesis de esta enfermedad es la infiltracin de macrfagos activados en la membrana sinovial; stos
secretan citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-, IL-1 e IL-6; al igual que en las enfermedades infecciosas estas citoquinas estimulan la monopoyesis. 2.5. Linfocitos
2.5.1. Linfocitosis La linfocitosis se refiere al aumento del recuento de linfocitos superior a 4.500/L. Las principales causas de linfocitosis se indican en la tabla 116.
Tabla 11-6. Causas de linfocitosis Infecciones agudas: coqueluche, mononucleosis infecciosa y hepatitis. Infecciones crnicas: brucelosis, tuberculosis, sfilis y toxoplasmosis. Sndromes linfoproliferativos: leucemia linftica crnica y aguda, algunos casos de linfomas, enfermedad de las cadenas pesadas y leucemia de clulas vellosas. Linfocitosis relativa: exantemas, despus del estadio inicial, especialmente en paperas y rubola; durante la convalecencia de infecciones agudas; tirotoxicosis; y muchas condiciones asociadas a neutropenia. inhibicin de la transduccin de la seal quimiotctica. Se sabe que la seal intracelular de los receptores de quimioquinas, por ejemplo IL8R, depende de la unin de stos a protenas G en los linfocitos. Estas protenas G son inactivas cuando GDP se une a la subunidad de la protena, pero se activa cuando el GDP es intercambiado por GTP. Durante la unin del ligando, los receptores de quimioquinas asociados a las pr otenas G, facilitan el intercambio de GDP por GTP. Con esto, la protena G se disocia en 2 subunidades: G y G; luego se activa la enzima fosfolipasa C asociada a la membrana, que escinde el fosfatidilinositol 1,4,5 difosfato (PIP2) a la forma de segundos mensajeros intracelular es fosfatidilinositol 1,4,5, trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). IP3 moviliza el calcio desde reservorios intracelulares, para activar varias isofor mas de protenas kinasas Ca +2 dependientes las que catalizan la fosforilacin de protenas. Esto activa una serie de eventos que participan en respuestas celulares tales como quimiotaxis, desgranulacin y expresin de molculas de adhesin.
Varias infecciones por bacterias (Bordetella pertussis , Brucella spp , Mycobacterium tuberculosis, Triponema pallidum), parsitos (Toxoplasma gondii) y virus (Virus de Epstin Barr, virus Denge, virus parainfluenza e influenza, citomegalavirus) pueden asociarse a linfocitosis absoluta.
Bordetella pertussis
Es un cocobacilo Gram negativo que causa coqueluche o tos convulsiva. La linfocitosis es rara en infecciones bacterianas, excepto en la causada por Bordetella pertussis; en alrededor del 60-80% de los lactantes infectados con B. pertussis la linfocitosis es mayor que 11.000 clulas/L. La linfocitosis inducida por B. pertussis resulta de un bloqueo en la migracin de los linfocitos desde la sangre a los tejidos. El proceso involucra la adherencia de los linfocitos a receptores especficos de las clulas endoteliales ubicadas en las vnulas post-capilares, seguida de la activacin de la adenilato-ciclasa dependiente de la motilidad celular. La toxina pertussis, una toxina proteica purificada de la bacteria B. pertussis, no inhibe la unin de los linfocitos a las clulas endoteliales, pero s inhibe la migracin de los linfocitos hacia los rganos linfoides, por
Brucella spp
Las Brucellas son bacterias intracelulares facultativas. Activan la proliferacin de clulas
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NK, ya sea directamente o estimulando la produccin de IL-2 por los macrfagos y neutrfilos. Las clulas NK producen IFN- que a su vez activa a los macrfagos y promueve la lisis de las bacterias fagocitadas. As, las clulas NK constituyen una lnea de defensa en una fase inicial de la infeccin. Como las Brucellas residen en el interior de los macrfagos, sus antgenos, de los cuales se destaca el LPS, pueden ser procesados y presentados por molculas MHCII. Esto induce proliferacin clonal de linfocitos T CD4+ que en la brucelosis se caracteriza por una preponderancia de linfocitos T helper 1 (LTh1), debido a que las bacterias intracelulares estimulan la produccin de IL-12 y de IFN-. Algunos antgenos bacterianos que alcanzan el citoplasma son presentados a los LT CD8+ por molculas MHC-I, con lo cual, adems de favorecer el aumento de esta poblacin linfocitaria, se lisan las clulas infectadas y aumenta la produccin del IFN-. Se han descrito otros factores de virulencia en distintas especies de Brucellas los que provocan activacin de la respuesta inmune mediada por linfocitos. La enzima Cu-Zn superxido dismutasa (SOD) de la Brucella abortus induce la secrecin de IFN- por los LTh1 e induce una accin citotxica de los LT CD8+. Se ha sugerido que las cepas lisas de B. melitensis sobreviven mayor tiempo dentro de los macrfagos inhibiendo los mecanismos apoptticos de estas clulas, favoreciendo as una continua produccin de seales que, posteriormente, activaran la proliferacin linfocitaria.
presentadoras.
Treponema pallidum
Es una bacteria mvil y de forma helicoidal; causal de la sfilis. Los antgenos TpN17, TpN37 y TpN47 de las espiroquetas inducen respuesta de los LT. La proliferacin linfoide alcanza su mximo nivel alrededor del da 30 de la infeccin. La respuesta de los linfocitos T asociados a la infeccin por T. pallidum en humanos produce citoquinas que son caractersticas de LTh1 (IFN y IL-2).
Toxoplasma gondii
Es un protozoo intracelular que causa la toxoplasmosis. Luego de la ingestin de ooquistes, los taquizoitos son liberados en el intestino delgado e invaden las clulas epiteliales mucosas, desde donde ingresan a la circulacin. As se activa la inmunidad natural del husped; T. gondii tiene la capacidad de activar componentes de la inmunidad innata como macrfagos y clulas NK. Esto se traduce en proliferacin de clulas NK y en el aumento de secrecin de IFN-, lo cual potencia la actividad microbicida de los macrfagos. Esta activacin inmune lleva a la inhibicin de la replicacin de los taquizoitos, previo al reclutamiento de los LT y a una apropiada activacin de dichas clulas. La IL-12, secretada por los macrfagos, es mediadora principal de la produccin de IFN- por las clulas NK, mientras que otras monoquinas como TNF-, IL-1 y IL-15, potencian los efectos de IL-12. Las monoquinas antes mencionadas reclutan LT CD4+ al sitio de infeccin y al actuar en ellos la IL-12 favorece su diferenciacin en LTh1. Esta diferenciacin se produce debido a que los macrfagos productores de IL-12 inducen en el LT CD4+ la fosforilacin del transductor de seales y activador del transcripcin 4 (STAT4), un factor transcripcional involucrado en la diferenciacin de los linfocitos CD4+ a LTh1.
Mycobacterium tuberculosis
Es una bacteria intracelular facultativa, aerobia estricta; agente causal de la tuberculosis. Como respuesta al encuentr o con M. tuberculosis, los neutrfilos y monocitos liberan, entre otras citoquinas, IL-15 la cual estimula la activacin y la proliferacin de clulas NK. Al igual que en la brucelosis, luego de la respuesta natural o innata, los antgenos de las micobacterias residen en fagosomas primarios. All sus protenas son procesadas y expresadas en molculas MHC II, lo que estimula los LT CD4+ con posterior proliferacin de los mismos. Fosfoligandos producidos por esta micobacteria (isopentenil pirofosfatasa) pueden estimular LT citotxicos , y producir una proliferacin linfocitaria clonal, en ausencia de molculas
T. gondii tiene la capacidad de activar a los linfocitos T independientemente de IL-12, cuando se activa la va clsica de presentacin antignica por molculas MHC-I a los LT CD8+.
Virus Epstein-Barr (VEB) Pertenece al grupo de los virus Herpes humanos; es un virus DNA. Causa el sndrome
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de mononucleosis infecciosa (MNI) caracterizado por linfocitosis con linfocitos activados, fiebre, faringitis y linfoadenopatas. El virus se une especficamente al receptor tipo 2 del complemento en los linfocitos B (LB), lo que produce su activacin y proliferacin. En la MNI la mayora de los linfocitos activados corresponden a LT CD8+, aunque los LT CD4+ y las clulas NK tambin se encuentran aumentadas. Los linfocitos reactivos que aparecen en la circulacin se debe a que son estimulados por el reconocimiento de determinados antgenos del VEB en los LB, tales como NAs (Epstein-Barr nuclear proteins) y LMPs (latency membrane proteins). La rpida proliferacin de las clulas T activadas es responsable de la linfocitosis en sangre perifrica, de las linfoadenopatas, hepatoesplenomegalia y de la inflamacin de las amgdalas y adenoides. Virus Dengue Es un virus RNA de la familia Togaviridae; que produce un sndrome febril que puede tener complicaciones sistmicas. El virus Dengue posee una gran capacidad de replicacin en los LB y aumenta su proliferacin, ya que aumenta la secrecin de IL-6 en macrfagos, clulas endoteliales, fibroblastos y linfocitos T. Virus de Parainfluenza e Influenza Son virus RNA; ambos son agentes causales de enfermedades respiratorias. Poseen distintas glicopr otenas de super ficie que son
importantes en su interaccin con el husped: una hemaglutinina (H) que juega un rol importante en la absorcin del virus a las clulas epiteliales respiratorias, una neuroaminidasa (N) que ayuda en la penetracin del virus a la clula y una protena de fusin (F) importante en la unin virus-clula. La inmunidad humoral se desarrolla en funcin al reconocimiento de las glicoprotenas de superficie por el receptor de los linfocitos B (BCR). Los linfocitos T CD8+ responden directamente a los determinantes antignicos de H, N y F al igual que las clulas NK. Se ha encontrado aumento en la sntesis de diversas citoquinas en el sitio de infeccin tales como IL-2, IFN-, TNF-/, IL-6, IL-10, IL8 e IL-11, las que promueven la linfocitosis e inhiben la replicacin viral. Citomegalovirus (CMV) El CMV pertenece a la familia de los virus Herpes. Es un patgeno oportunista que puede producir infecciones persistentes incluso de por vida. En una primera infeccin por CMV se desarrolla una inmunidad antiviral especfica LT CD4+. La estimulacin de los LT CD4+ provoca la secrecin de IFN- lo que lleva luego, a la produccin de anticuerpos especficos por los LB y a la proliferacin de los LT CD8+. 2.5.2. Linfopenia Se define linfopenia como la disminucin del recuento de linfocitos a cifras menores de 1.500/ L. En la tabla 11-7 se encuentran las principales causas de linfopenia.
Tabla 11-7. Causas de linfopenia Inmunodeficiencias de linfocitos B o T, SIDA. Destruccin de linfocitos: radioterapia, quimioterapia. Enfermedades hematolgicas: linfoma de Hodgkin, aplasia medular, policitemia vera. apoptosis mediante alteracin directa de las mitocondrias, sin necesidad de receptores. Entre los cambios se incluye la produccin de poros de membrana que hacen perder el potencial transmembranal mitocondrial, lo que permite liberar protenas reguladoras de la apoptosis (citocromo c, Apaf-1, y caspasa 9) que inician la activacin de ms caspasas, que llevan a la apoptosis de las clulas linfoides, y por lo tanto linfopenia e inmunodeficiencias.
Alteraciones en la regulacin de la apoptosis o muerte celular programada puede llevar a inmunodeficiencias, neoplasias y fenmenos autoinmunes. La apoptosis puede ser inducida va unin ligando-receptor y por un mecanismo dependiente de mitocondrias. Quimioterapia y radiacin ultravioleta La quimioterapia y la radiacin UV inducen
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Virus de la inmunodeficiencia humana Es un virus RNA de doble hebra que pertenece a la subfamilia de los Lentivirus de la familia Retroviridae. El VIH infecta a los LT CD4+ lo que conduce a linfopenia, lo que a su vez altera la respuesta inmune. El virus ingresa al organismo directamente a travs del torrente sanguneo o a travs de las mucosas. Las primeras clulas infectadas son las clulas dendrticas, stas presentan antgenos a los LT CD4+. La glicoprotena (gp) de la envoltura viral se une a CD4 y un correceptor de quimioquinas de las clulas T (CXCR-4), luego se produce un cambio conformacional en la gp120 y otra regin de la glicoprotena (gp41), lo cual permite la entrada del RNA viral. La disfuncin inmune se debe a que los LT CD4+, necesarios para iniciar una respuesta inmune, son destruidos y alterados funcionalmente, lo cual causa un estado inmunodeficiente muy susceptible a infecciones. La respuesta innata y humoral en infeccin VIH, no puede contrarrestar la linfopenia CD4+. Se ha descrito que cambios en la regulacin de la apoptosis participa en la lisis linfocitaria. Se ha observado aumento en la expresin molculas Fas y FasL, acompaado de disminucin de protenas antiapoptticas, tales como Bc12 y Bc1XL y el concomitante aumento de protenas proapotticas como Bc1XS y Bax. Post-operatorio La ciruga y la anestesia inhiben la inmunidad celular. Se presenta linfopenia asociada a apoptosis; aumenta la expresin de Bc12. Adems, la ciruga favorece un proceso inflamatorio neuroendocrino mediado por hor monas de estrs como cortisol y catecolaminas, as como tambin citoquinas inflamatorias tales como IL-6 y TNF-.
constituyen un conjunto de sndromes caracterizados por trastornos estructurales o funcionales, lo que hace que ciertas infecciones no se controlen adecuadamente y se comporten de una manera inusual, lo que afecta el desarrollo del individuo, tanto por su frecuencia de ataque como por su severidad. Dentro de estas, se encuentran las alteraciones de granulocitos y linfocitos las cuales se describen a continuacin. 3.1. Alteraciones funcionales de los granulocitos Las alteraciones cualitativas de los granulocitos se clasifican en: defectos de la adhesin y quimiotaxis, trastornos de opsonizacin y fagocitosis y trastor nos de la actividad microbicida, que incluyen los trastornos del metabolismo oxidativo y de los grnulos o lisosomas. Estos trastor nos pueden ser constitutivos o secundarios a numerosas afecciones. 3.1.1. Defectos de la adhesin a) Dficit de adhesin de los leucocitos tipo 1 (DAL-1). Es un desorden autosmico recesivo que se debe a mutaciones de un gen del cromosoma 21q22.3 que codifica la cadena comn (CD18) de la familia integrina 2. Cada integrina 2 es un heterodmero formado de una cadena (CD11a, CD11b y CD11c) unido no covalentemente a una subunidad comn (CD18). Los heterodmeros de la familia integrina 2 incluyen CD11a/CD18 (antgeno 1 asociado a funcin linfocitaria, LFA-1), CD11b/ CD18 (antgeno 1 de macrfago, Mac1 o receptor 3 de complemento, CR3) y CD11c/ CD18 (CR4). La expresin defectuosa de CD18 determina la no expresin o expresin muy baja de CD11a, CD11b y CD11c. Las mutaciones que resultan en la falla de produccin de lasubunidad 2 funcional (mutaciones puntuales, inserciones y deleciones) causan DAL-1. La mutacin en el gen que codifica para la cadena 2 del complejo CD11/CD18 impide el ensamblaje normal del heterodmero y la traslocacin posterior a la superficie lo que afecta la adhesin de neutrfilos a clulas endoteliales y micr oorganismos, comprometiendo los procesos de fagocitosis y puesta en marcha del metabolismo oxidativo. Existen dos fenotipos clnicamente diferentes. Los pacientes con fenotipo severo (expresin de CD18 menor a 1% en leucocitos) se caracterizan por cada tarda del cordn
Plasmodium falciparum
En la malaria, los niveles de FasL soluble estn aumentados en etapas iniciales de la enfermedad y disminuyen con el tratamiento de la enfermedad. Esto sugiere que la linfopenia causada por el Plasmodium es mediado por el receptor FasL independiente de la apoptosis que inicia en las de mitocondrias. 3. ALTERACIONES FUNCIONALES DE LOS LEUCOCITOS Las alteraciones funcionales de los leucocitos
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umbilical (ms de 30 das), onfalitis, leucocitosis (mayor a 15.000/L) en ausencia de infeccin y gingivitis severa con periodontitis y reabsorcin sea alveolar. Presentan infecciones cutneas, de va area superior e inferior, intestinales y perirrectales recurrentes por Staphylococcus aureus o bacilos gram negativos. Las infecciones se caracterizan por ser necrotizantes, con tendencia a la ulceracin y tpicamente, no aparece pus en las lesiones. Los pacientes con fenotipo moderado (expresin 1-30% de CD18 en los neutrfilos) son diagnosticados, en general, ms tardamente. En ellos, con frecuencia, la cada del cordn umbilical se produce normalmente, tienen un bajo riesgo de presentar infecciones severas y una sobreviva ms larga. Sin embargo, presentan periodontitis, cicatrizacin retardada y leucocitosis. El diagnstico se basa en la demostracin de un defecto de expresin de las molculas CD11/ CD18, mediante citometra de flujo. En la forma ms severa, el pronstico es grave, recomendndose trasplante de mdula sea. En las formas ms moderadas se ha utilizado profilaxis con cotrimoxazol y tratamiento precoz con antibiticos, procurando identificar al organismo responsable mediante cultivo o biopsia del tejido afectado. b) Dficit de selectina o Dficit de adhesin de los leucocitos tipo 2 (DAL-2). Se debe a un defecto en el metabolismo de la fucosa, de herencia autosmica recesiva que conlleva una alteracin en la adicin de carbohidratos a las protenas que son ligando para las selectinas, como es el caso de Sialyl Lewis X que se encuentra en las clulas endoteliales. La selectina juega un rol importante en la respuesta inflamatoria porque facilita la accin de otros importantes receptores de adhesin. Se asocia adems con la ausencia del antgeno H en la superficie del glbulo rojo, el cual origina el fenotipo de Bombay. Los individuos que padecen esta deficiencia presentan infecciones bacterianas recurrentes incluyendo: neumona, otitis media, peridontitis, celulitis localizada sin acumulacin de pus, dimorfismo craneofacial, y dficit neurolgico. A diferencia de DAL-1 la frecuencia y severidad de las infecciones tiende a disminuir con la edad. A diferencia de DAL- 1, los granulocitos en esta patologa tienen una fagocitosis y expresin de
CD11/CD18 normal. Tanto, DAL-1 como DAL-2, son patologas caractersticas de deficiencia de molculas de adhesin. Sin embargo, estudios actuales, revelan que en la patogenia de algunas neoplasias, artritis reumatoide, trasplantes e incluso en el resfro comn la participacin de otras (nuevas) molculas de adhesin es muy importante. c) Dficit de la polimerizacin de la actina. Algunas for mas de defecto de adhesin leucocitaria con disminucin de CD11b se asocian a un trastorno de la polimerizacin de la actina, en presencia de cloruro potsico 0,6 M. Esta alteracin se acompaa de un defecto de la organizacin de los filamentos de la membrana celular, lo que origina un trastorno de quimiotaxis asociado al defecto de adhesin de los neutrfilos. 3.1.2. Defectos de la quimiotaxis a) Sndrome de hiperinmunoglobulinemia E (Hiper IgE) o Sndrome de Job. Es un sndrome, en la mayora de los casos, de herencia autosmica dominante (AD), aunque se han descrito casos de herencia autosmica recesiva y muchos casos espordicos. En los pacientes con herencia AD, el defecto gentico se localiza en el brazo largo del cromosoma 4q21. Es un sndr ome multisistmico con un inmunofenotipo caracterizado por eccema desde el nacimiento, abscesos subcutneos estafiloccicos recurrentes, abscesos pulmonares estafiloccicos, infecciones fngicas y niveles elevados de IgE (>2000 UI/mL; valor normal: 0-180 UI/mL). Se presenta adems, con compromiso del tejido conectivo como fascie tosca, hiperlaxitud, retencin de dentadura primaria, fracturas seas frecuentes y escoliosis.. Los granulocitos de estos pacientes tienen fagocitosis y accin microbicida normal. Se postula que el defecto de la quimiotaxis se debe a un aumento de la histamina por la interaccin de IgE con los mastocitos y esto interferira con la funcin de los neutrfilos. El exceso de produccin de IgE antiestafiloccica y una deficiencia en la sntesis de otros anticuerpos tambin estaran involucrados. Estudios actuales involucran a la IL-12 con los niveles elevados de IgE. La mutacin tambin alterara la funcin de las clulas T supresoras.
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En los hallazgos de laboratorio cabe destacar eosinofilia y niveles muy elevados de IgE (>2000 UI/mL). El diagnstico diferencial debe hacerse con la dermatitis atpica severa y con la Enfermedad Granulomatosa Crnica. No existe tratamiento especfico. b) Disquinesia ciliar o Sndrome de Kartagener. A diferencia del anterior, los pacientes presentan un defecto de la quimiotaxis de origen celular, por alteracin de los microtbulos. La disquinesia ciliar primaria (DCP) es una enfermedad gentica, fundamentalmente autosmica recesiva, con una prevalencia aproximada de 1/20.000 habitantes. Se caracteriza por una alteracin en la motilidad de las estructuras ciliares del organismo. En un 50% de los casos cursa con situs inversus, conocindose a la trada formada por ste, la presencia de bronquiectasias y sinusitis como sndrome de Kartagener. Las estructuras ciliares se encuentran en una variedad de rganos y epitelios del cuerpo humano: va area superior e inferior, clulas ependimales del sistema nervioso central (SNC), vasos deferentes, endometrio, crvix y trompas de Falopio, clulas sensoriales olfatorias y vestibulares, lo que condiciona las manifestaciones clnicas de la enfermedad como son la bronquitis crnica, pansinusitis, otitis crnica, esterilidad masculina y embarazos ectpicos. En los casos que no se asocian a situs inversus es necesaria una alta sospecha clnica para su diagnstico, al que se llega mediante estudios de actividad ciliar y ultraestructurales mediante biopsia de epitelio de va area superior. En general, los pacientes que se diagnostican y tratan precozmente mantienen una funcin pulmonar normal y tienen un buen pronstico a largo plazo. La migracin celular se puede medir in vivo, mediante la tcnica de la ventana cutnea de Rebuck, que consiste en realizar una abrasin en la dermis del antebrazo y colocar un cubre de vidrio que se va cambiando peridicamente y se tie, para examinar las clulas que se le han adherido. En general, se estudia la quimiotaxis in vitro, con la cmara de Boyden, que dispone de dos compartimentos separados por un filtro, con poros de mm. Las clulas se ponen en el compartimiento superior de la cmara y un agente que estimula la movilidad en el inferior, tras un perodo de incubacin, se ven las clulas que han atravesado el filtro.
c) Sndrome de Chediak Higashi (SCH). Es una enfer medad autosmica recesiva que se caracteriza por presentar albinismo oculocutneo, trastor nos neur olgicos, infecciones pigenas recurrentes y linfomas tardos en perodos de fase acelerada tarda. Esta patologa se debe a una mutacin en el gen LYST (lysososomal trafficking regulador gen) o CHS1 que se encuentra en el cromosoma 1q42.1-q42.2 . Este gen est involucrado en la generacin normal de la estructura y funcin de organelos intracelulares y expresin de algunas molculas de superficie de los leucocitos. Sin embargo, es an desconocido el mecanismo por el cual LYST funciona y por lo tanto, la fisiopatologa de (SCH) es an poco clara. El defecto gentico ms frecuente es una protena LYST truncada. Los melanocitos oculares y cutneos presentan melanosomas gigantes y aberrantes (macromelanosomas) con alteraciones de maduracin. La fusin inapropiada de lisosomas con premelanosomas resulta en la destruccin temprana y dilucin de la pigmentacin. Es as, que la coloracin del pelo es castaa clara a rubia con un brillo plateado muy caracterstico. A la microscopa de luz el pelo tiene pequeos agregados de pigmentacin fraccionada que son patognomnicos. Son caractersticas las infecciones frecuentes y recurrentes ocasionadas por organismos catalasa positivos y negativos as como, la periodontitis. La causa de muerte ms frecuente es la fase acelerada en la cual se produce hemofagocitosis e infiltracin del tejido linfohistioctico. Clnicamente es indistinguible de otros sndromes hemofagocticos. Se caracteriza por citopenias, fiebre, hepatoesplenomegalia, linfoadenopata, hipofibrinogenemia e hipertrigliceridemia. La expresin en superficie de CTL-4 que es una molcula involucrada en la finalizacin de las respuestas T es anormal en esta patologa, lo que puede explicar la fase acelerada. Los pacientes de ms edad pueden desarrollar linfomas. El diagnstico se hace mediante la demostracin en sangre perifrica de leucocitos (neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfocitos, monocitos) con grnulos gigantes anormales. Estos grnulos gigantes tambin se observan en histiocitos, precursores eritroides , neuronas, clulas de Schwann y clulas tubulares renales. La neutropenia es frecuente debido probablemente
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a destruccin intramedular. Las plaquetas tambin presentan grnulos gigantes con disminucin de ADP y serotonina, que ocasiona trombopata y tendencia a manifestaciones hemorrgicas. La quimiotaxis de monocitos y neutrfilos est disminuida probablemente por la interferencia de los macrogrnulos. La fagocitosis est normal o aumentada, pero el killing intracelular est disminuido debido a cantidades menores a las normales de enzimas de grnulos primarios. Las clulas NK, aunque presentes en nmero normal tienen una citotoxicidad prcticamente ausente. La citotoxicidad mediada por anticuerpos (ADCC) de los linfocitos est disminuida, no as la de neutrfilos y monocitos. La funcin de linfocitos B generalmente est intacta. La terapia y diagnstico debe estar dirigido a bacterias habituales pero el tratamiento debe ser ms prolongado y a ms altas dosis de frmacos que las habituales. La fase acelerada puede ser controlada con etopsido, corticoides y metotrexato intratecal. Sin embargo, en general es recurrente y refractaria a tratamiento a menos que se realice un trasplante de mdula sea, el nico tratamiento que ha demostrado ser efectivo. 3.1.3. Defectos del metabolismo oxidativo a) Dficit de mieloperoxidasa (MPO). La mieloperoxidasa es una hemoprotena de los grnulos azurfilos de neutrfilos y monocitos. Est compuesta por 2 cadenas pesadas y 2 cadenas livianas (22), de 55-60 y 10-15 kDa, respectivamente. Cataliza la conversin de H2O2 a cido hipocloroso. El dficit de mieloperoxidasa es el trastorno hereditario ms frecuente de los fagocitos. En el caso de dficit completo es de 1:4000 y en el incompleto de 1:2000. Es una patologa autosmica recesiva con rasgos de expresin variables. Numerosos estudios han demostrado que las bacterias y hongos en los neutrfilos son fagocitados normalmente y la ingestin es seguida por un estallido respiratorio normal. Sin embargo, la accin bactericida es un tanto tarda, alcanzando niveles normales slo despus de 1 a 3 horas. Por lo tanto, la mayora
de los pacientes no presentan infecciones, ya que se mantiene intacto el metabolismo oxidativo dependiente de la NADPH oxidasa con produccin de H2O2 normal o aumentada. Los sntomas clnicos que pueden presentar alguno de estos pacientes son principalmente, infecciones a diferentes cepas de Candida. Se han reportado infecciones mucocutneas, menngeas, seas y sepsis. El diagnstico puede hacerse con contadores electrnicos, que utilizan un marcador de peroxidasas para identificar los granulocitos. Estos pacientes presentan un defecto in vitro de la capacidad fungicida frente a Cndida y Aspergillus. La actividad microbicida de los leucocitos polimorfonucleares se puede valorar mediante tcnicas microbiolgicas, examinando el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) que se obtienen tras incubar los microorganismos con clulas y suero. La prueba se r ealiza fundamentalmente con Staphylococcus aureus. Tambin se pueden usar mtodos citolgicos basados en el cambio de coloracin que se pr oduce en los microorganismos al producirse la muerte del mismo. Las levaduras pierden su capacidad de teirse con Giemsa y se distinguen por su tono claro en el interior del citoplasma celular. En otras ocasiones, se utilizan colorantes vitales como el azul de metileno o el azul tripano, que se captan exclusivamente por microorganismos muertos. Slo requieren tratamiento los pacientes que desarrollan infecciones. El dficit de MPO tambin se observa en otras situaciones como embarazo, intoxicacin por plomo, enfermedad de Hodgkin, pero es ms comnmente asociado con leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crnica, mielofibrosis y sndromes mielodisplsicos. b) Enfermedad granulomatosa crnica (EGC). Es un sndrome poco comn que resulta de defectos inherentes de la funcin de los granulocitos. La enfermedad granulomatosa crnica (EGC) es un trastorno del metabolismo oxidativo, que se caracteriza por defectos de la activacin de la NADPH oxidasa, un complejo de seis protenas, habiendo un defecto de produccin de H2O2 y de in superxido provocando una disminucin en la actividad microbicida de los granulocitos.
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La reaccin NADPH + 202 NADP+ + 20-2 + + H requiere un citocromo b especfico de los fagocitos y NADPH oxidasa La NADPH oxidasa en su estado basal tiene dos componentes. Uno de ellos es un complejo asociado a membrana de los grnulos secundarios y un complejo citoslico. El complejo asociado a membrana contiene el citocromo b558, compuesto por una cadena glicosilada de 91 kD (gp91phox) y una cadena no glicosilada de 22kD (p22phox) . El complejo citoslico est compuesto por p47phox, p67phox, p40phox y rac. Todos estos componentes son necesarios para la generacin de superxido, excepto p40phox que tiene un rol regulador. En la patogenia de EGC existen 4 genes involucrados, con dos patrones de herencia: (a) CYBB (gp91phox, EGC ligada a X), (b) CYBA ( p22phox, EGC AR), (c) NCF1 (p47phox, EGC AR), y (d) NCF2 (p47phox, EGC AR). El genotipo ms comn es el ligado al cromosoma X y da cuenta del 70 % de los casos e involucra mutaciones en la cadena del citocr omo b 558 , CYBB y gp91 phox . Es la consecuencia de la ausencia de p91phox (X910), cantidades reducidas de pr otena hipofuncionante ( X91 - ) o de cantidades normales de protena no funcionante (X91+) La forma autosmica recesiva corresponde al 35% de los casos. El 5% es causada por mutaciones en p22phox. La falla de produccin de cualquiera de las cadenas del heterodmero (gp91 phox o p22 phox) previene la expresin significativa de la otra. Ya que ambas subunidades se requieren para estabilizar a la otra en la membrana. Un 25% es causada por defectos en p47phox, principalmente debidas a la falla de expresin de la protena (A470). Finalmente, menos del 5% de los casos se producen por deficiencia de p67phox los que no tiene expresin de la protena (A670). Ya que en esta patologa existe un defecto a nivel de produccin de perxido de hidrgeno y que los mecanismos distales de la va bactericida se encuentran intactos principalmente , mieloperoxidas, este trastorno se manifiesta por un killing bacteriano defectuoso e infecciones por bacterias catalasa positiva. La presentacin clnica de esta patologa es muy variable manifestndose en la mayora de los casos en el perodo de lactante o preescolar. Sin embargo, un nmero no despreciable de pacientes se diagnostican tardamente en la
infancia o en la edad adulta. La incidencia es de 1 en cada 1.000.000 de personas. Los pacientes presentan infecciones recurrentes pulmonares, cutneas, de ganglios, hepticas y tambin osteomielitis. Las bacterias involucradas son principalmente, Staphylococcus aureus , Burkholderia (Pseudomonas) cepacea, Serratia marcescens, per o tambin hongos como Nocadia y Aspergillus . Tambin son frecuentes los granulomas, especialmente, en ganglios linfticos, hgado y pulmn. Los tractos gastrointestinal y urinario se comprometen frecuentemente, incluso en ocasiones son los sitios de presentacin. Se han descrito granulomas en esfago, yeyuno, leon, colon y recto que simulan una enfermedad de Crohn. La obstruccin del tracto de salida gstrica es una manifestacin bastante comn, en algunas series hasta de 32%. El 38% de los pacientes pueden tener compromiso del tracto genitourinario lo que incluye granulomas en vejiga, obstruccin de urter e infecciones del tracto urinario. El diagnstico se confirma demostrando el trastorno del metabolismo oxidativo, para lo que clsicamente se ha utilizado la prueba de azul de tetrazolio. Este compuesto se reduce al activarse la NADPH transfor mndose en formazn y cambiando su color amarillo por un color azul oscuro, que se identifica en los granulocitos, o mediante colorimetra en extractos de polimorfonucleares, previamente activados. El consumo de oxgeno se puede medir por quimioluminiscencia. Actualmente, el metabolismo se mide por citometra de flujo, utilizando sustancias que al producirse el estallido respiratorio se oxidan y emiten fluorescencia, como la dihidrorodamina. El porcentaje de fluorescencia que se obtiene es pr opor cional al perxido de hidrgeno producido. En los pacientes con trastornos del metabolismo oxidativo no se produce esta activacin, est disminuida, o retrasada. Las tcnicas de inmunoblot, citometra de flujo y estudio molecular pueden diferenciar entre pacientes portadores de EGC ligada a cr X o AR , lo que es importante ya que la segunda forma tiene una evolucin ms benigna. Tambin es posible observar neutropenia, aumento en los niveles de inmunoglobulinas y aumento de clulas progenitoras CD34+ en mdula sea.
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El tratamiento se basa en profilaxis antimicrobianas, uso de iIFN- y trasplante de precursores hematopoyticos. c) Defectos del glutatin. El glutatin reducido juega un importante papel en la proteccin del neutrfilo. Se conocen dos defectos del metabolismo del glutatin: defecto de glutatin reductasa y defecto de glutatin sintetasa, ambos se transmiten de forma autosmica recesiva y son extremadamente raros. La glutatin reductasa tiene como misin proteger los efectos txicos del H2O2 sobre la NADPH oxidasa y los microtbulos. El dficit del glutatin produce una acumulacin txica de H2O2 y acorta el metabolismo oxidativo, aunque en general es suficiente para que la clula mantenga actividad bactericida, por lo que este trastorno no se acompaa de historia de infecciones. El pronstico es bueno y no requiere tratamiento. d) Dficit de glucosa-6 fosfato deshidrogenasa (G 6 PD). Es una de las enzimopatas ms frecuentes en humanos y afecta a 400 millones de personas en el mundo. Es una patologa ligada al cromosoma X. Esta enzima cataliza la reaccin en la va de las pentosas fosfato para generar NADPH, el cual sirve como dador de electrones en las biosntesis reductoras. La funcin principal del NADPH es reducir la forma disulfuro del glutatin a la forma sulfhidrilo (reaccin catalizada por glutatin reductasa). Este es un trastorno que se caracteriza por la disminucin de esta enzima en hemates, y leucocitos, lo que ocasiona anemia hemoltica que es la manifestacin ms frecuente. Algunos pocos pacientes tienen una deficiencia severa de G6PD (menos de 5%) con alteracin del estallido respiratorio e infecciones severas. La disfuncin de los neutrfilos es menos frecuente de lo esperado probablemente, porque tienen al menos 20% de actividad de G6PD lo que es suficiente para mantener un estallido respiratorio normal. Se han descrito infecciones bacterianas pulmonares recurrentes y muerte por sepsis por Chromobacterium violaceum y a veces simula una EGC. El diagnstico se hace mediante demostracin del defecto del metabolismo oxidativo. El diagnstico diferencial debe hacerse con otras alteraciones metablicas como la EGC y los defectos del glutatin. e) Deficiencia de catalasa: Esta enzima convierte al H 2 O 2 en agua y oxgeno. Su
deficiencia puede provocar que los granulocitos sean mas susceptibles al dao del H2O2 que lo nor mal. Los pacientes no presentan complicaciones severas por infeccin. 3.1.4. Defecto de los grnulos de los lisosomas Dficit constitucional de los grnulos especficos (DCGE). Se trata de un trastorno de carcter autosmico recesivo muy raro, que ocasiona un efecto de maduracin de las clulas, con ausencia de grnulos y de su contenido en lactoferrina y defensinas. El citoplasma de los granulocitos presenta apariencia de vidrio y el ncleo suele aparecer hiposegmentado. Se acompaa de un defecto de la capacidad de migracin de las clulas. Los pacientes presentan infecciones recurrentes frente a diversos micr oorganismos patgenos, fundamentalmente como en todos los trastornos de los granulocitos: infecciones de partes blandas, sinusitis, bronquitis y neumona. 3.2. Alteraciones funcionales de los linfocitos Las alteraciones funcionales de los linfocitos se encuentran dentro de las inmunodeficiencias primarias (IDP), las cuales son enfermedades causadas por alteraciones cualitativas o cuantitativas de uno o ms componentes especficos (linfocitos T y B) o inespecficos (complemento y clulas fagocticas) del sistema inmune que deter minan una mayor susceptibilidad a infecciones. Estn asociados a defectos genticos del sistema inmune que se manifiestan generalmente en la infancia. Dentro de este grupo de entidades se incluye, entre otras: inmunodeficiencias severas combinadas (defectos de cadena , Jak3, IL77R, RAG-1 y RAG-2), deficiencia de expresin de MHC clase II, deficiencia de CD8 o ZAP-70, deficiencia mltiple de pr oduccin de interleuquinas, deficiencia de IL-2 y las deficiencias de expresin de molculas del complejo CD3 (cadenas y ). 3.2.1. Defectos en la expresin de molculas MHC Se llam originalmente Sndrome del linfocito desnudo. Es una inmunodeficiencia heterognea desde el punto de vista gentico ya que puede producirse por mutaciones en distintas pr otenas que pr omueven la transcripcin de molculas MHC clase II. Se hereda de forma autosmica recesiva.
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El nmero de clulas T CD4+ en la mayor parte de los casos est disminuido, pero el recuento de CD8+ es nor mal. Se pr esenta con hipogammaglobulinemia y ausencia de respuesta de las clulas T a antgenos especficos, con respuesta normal a estmulos mitognicos. 3.2.2. Defectos de activacin y funcin de clulas T Estos defectos, se caracterizan por la presencia de un nmero normal de clulas T pero que no son capaces de proliferar o producir citoquinas en respuesta a estimulacin con mitgenos, antgenos u otras seales de activacin del receptor de linfocitos T (TCR). La caracterizacin a nivel molecular ha demostrado en algunos de estos casos expresin deficiente del complejo CD3/TCR debido a mutaciones que dan lugar a deficiencia selectiva de la subunidad o del CD3. Otro de estos sndromes, es la denominada deficiencia de CD8 o de ZAP-70. La ZAP-70 es una protena kinasa fundamental para los mecanismos de sealizacin intracelular del TCR. Los pacientes con esta deficiencia muestran valores normales o aumentados de linfocitos, con clulas CD4 aumentadas y ausencia de CD8. El timo muestra estructura normal, con linfocitos T doble positivos, CD4+ CD8+, LT CD4 normales y ausencia de CD8, demostrando que la ZAP 70 es crtica para la diferenciacin intratmica de esta ltima subpoblacin. In vitro, las clulas mononuclear es de estos pacientes no responden al estmulo del TCR con anti-CD3, pero la respuesta es normal cuando se estimulan con PMA + ionomicina, evidenciando un defecto temprano de la estimulacin del TCR. 3.2.3. Sndrome hiper IgM ligado al sexo Se describi en 1961 en 2 varones que presentaban un cuadro clnico similar a la agammaglobulinemia ligada al X con concentraciones de IgM srica muy elevada, ausencia de IgA e IgG muy baja (<150 mg/dL). Adems de presentar infecciones pigenas recurrentes, son susceptibles a infecciones oportunistas en particular por Pneumonicistis carinii y problemas autoinmunes, especialmente neutropenia recurrente, a menudo severa. La infeccin por Criptosporidium es causa frecuente de colangitis esclerosante con dao heptico severo. Aquellos pacientes que sobreviven ms all de la segunda dcada, presentan un mayor
riesgo de desarrollar cncer, especialmente del tracto gastrointestinal, hgado y vescula. La causa de esta patologa es un defecto molecular en un gen que codifica para el ligando del CD40 (CD40L), molcula presente normalmente en los linfocitos T activados, imprescindible para la diferenciacin y cambio de isotipo de inmunoglobulinas en los linfocitos B. Es por eso que, a pesar de que el nmero de linfocitos es normal, los niveles plasmticos de IgM se encuentran normales o aumentados mientras que los niveles de IgG, IgA e IgE se encuentran disminuidos. El gen del sndrome de hiper IgM ligado al X se encuentra en el brazo largo del cromosoma X en posicin q26. En la actualidad es posible efectuar diagnstico prenatal y de portadoras. Teniendo en cuenta que el defecto primario del sndrome se encuentra en los LT, en las ltimas clasificaciones de la OMS, el sndrome ha sido incluido en las ID combinadas. Actualmente se han descrito 4 mutaciones genticas que han dado origen a una nueva simbologa de este sndrome. HIGM1 (CD40L), HIGM2 (AID), HIGM3 (CD40), y HIGM4 (Nemo). 3.2.4. Inmunodeficiencia comn variable El trmino Inmunodeficiencia Comn Variable (IDCV) se usa para designar un grupo de sndr omes an no bien definidos, pero caracterizados por formacin defectuosa de anticuerpos y en que se han excluido otros defectos de inmunidad humoral. El patrn hereditario es variado (autosmico recesivo, dominante, ligado a X) siendo lo ms comn los casos espordicos. En poblacin de origen europeo es la ms frecuente de las inmunodeficiencias primarias especficas. Afecta en igual proporcin a hombres y mujeres, generalmente entre los 20 y 30 aos. Su incidencia se estima entre 1:50.000 a 1:200.000. Clnicamente se presenta con infecciones pigenas recurrentes que involucran odos, nariz, bronquios y pulmones. Algunos pacientes pueden presentar infecciones con grmenes inusuales como Pneumocistis carinii , micobacterias y hongos y en algunos casos enterovirus. Los pacientes son altamente susceptibles a otros patgenos entricos como Giardia lamblia y a Herpes simplex y zoster. Existe una alta incidencia de enfermedades
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malignas linforreticulares y gastrointestinales. Puede observarse una variedad de desrdenes autoinmunes (anemia perniciosa, anemia hemoltica, neutropenia). Los familiares de estos pacientes tienen una mayor incidencia de dficit de IgA, enfer medades autoinmunes y condiciones malignas. La concentracin de IgG y generalmente de IgA e IgM en el suero se encuentra reducida. El nmero de clulas B en general es normal aunque puede estar reducido, pero el defecto no se encuentra a nivel de la diferenciacin sino ms bien de la activacin in vivo de las clulas B. Cerca del 60% de los pacientes tiene una respuesta proliferativa disminuida al estimular el TCR, sin embargo no existe una anomala del mismo sino probablemente un defecto en la transduccin de seales. En ausencia de una seal apropiada por linfocitos T no se producira proliferacin, diferenciacin ni secrecin de anticuerpos por las clulas B. 3.2.5. Deficiencia selectiva de IgA Es una de las IDP ms frecuentes. Se presenta en 1:700 individuos caucsicos y 1:18.500 japoneses. El patrn hereditario es variable, en algunas familias se ha demostrado herencia autosmica recesiva y asociacin a algunos haplotipos HLA (Complejo Principal de Histocompatibilidad, MHC). Las caractersticas clnicas tambin son variables. La mayora de los individuos son asintomticos, otros tienen infecciones pulmonares. Su frecuencia es mayor en pacientes con enfermedad pulmonar crnica que en poblacin normal. El dficit de IgA se caracteriza por niveles ausentes o extremadamente reducidos de IgA srica (< de 7 mg/dL) con IgG e IgM normal en mayores de 4 aos de edad. Se supone que existe un defecto a nivel de la diferenciacin de clulas B que expresan IgA a clulas plasmticas secretoras de anticuerpos. No se encuentran anormalidades a nivel de clulas T. La deficiencia de IgA podra tratarse, de una forma de expresin menos grave de la IDCV. Las deficiencias de subclases de IgG, de IgA con deficiencia de subclases de IgG y las deficiencias de funcin de anticuerpos, tambin podran considerarse formas intermedias. 3.2.6. Deficiencia selectiva de subclases de IgG Se han descrito pacientes con nivel IgG srico
total normal y una o ms subclases de IgG bajo lo normal. Puede asociarse a niveles bajos de IgA. El dficit de IgG3 es ms frecuente en adultos y de IgG2, en nios. El nivel normal de IgG4 vara ampliamente en personas sanas, por lo que es difcil interpretar una deficiencia selectiva de IgG4. 3.3. Alteraciones funcionales secundarias de los leucocitos y en situaciones especiales 3.3.1. Sistema inmune fetal y neonatal Tanto los linfocitos T CD4+ como los T CD8+ aparecen en hgado y bazo a las 14 semanas de gestacin, luego se pr oduce aumento pr ogresivo hasta los 6 meses de vida extrauterina que declina gradualmente hasta llegar a los niveles del adulto durante la infancia. La relacin CD4/CD8 es mayor durante la vida fetal que al trmino del embarazo. As, los linfocitos T en nios de trmino estn aumentados en nmero y presentan una mayor expresin de CD38 (marcador timocitario) o CD45RA ( marcador de linfocitos T naive presente en el 90% de estos linfocitos a esta eded vs un 60% de representacin en la misma poblacin T en un adulto). Existe adems un dficit de IL-3, IL-4, IL-5 e IFN-, comparado con la produccin de los linfocitos T del adulto. Por los factores ya mencionados y por la menor expresin de molculas coestimuladoras, como por ejemplo CD40 de superficie, existe una menor colaboracin para la funcin de los linfocitos B, que tienen una menor produccin de anticuerpos. En general, las respuestas T citotxicas estn disminuidas en los recin nacidos, promediando el 30 a 60% de aquella generada por las clulas adultas. La concentracin de IgM e IgA es baja al momento de nacer, por la falta de exposicin antignica. Respecto a la IgG, el neonato depende del paso transplacentario de este anticuerpo para protegerse contra ciertos patgenos. Respecto a las concentraciones de los factores del Complemento y su actividad funcional estn disminuidos incluso en recin nacidos de tr mino y estas diferencias son an ms evidentes en prematuros.
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A pesar de esta inmunosupresin observada en el recin nacido es importante destacar que la madre, a travs de la leche materna, es capaz de proveer al recin nacido con anticuerpos y leucocitos. Dentro de estos ltimos, el 90% corresponden a neutrfilos y macrfagos mientras el 10% restante son linfocitos. 3.3.2. Envejecimiento y sistema inmune La senescencia inmunolgica se caracteriza por un cambio en el nmero y competencia de las subpoblaciones linfocitarias y de las citoquinas que ellas producen, como asimismo por un cambio en el repertorio de los linfocitos (menos clones) y cambios en la regulacin de la funcin de los monocitos/macrfagos. 3.3.3. Inmunidad y nutricin Deficiencia de nutrientes especficos se han correlacionado con alteraciones de estas importantes barreras, entre otras, la deficiencia de vitamina A, riboflavina y piridoxina. La deficiencia proteica se asocia con atrofia generalizada de la piel y, a nivel celular, puede llevar a una deplecin del nmero de linfocitos y de clulas plasmticas en el espacio intersticial de las membranas mucosas. Estas clulas juegan un rol importante en la produccin de IgA secretora, la principal inmunoglobulina de las mucosas. 3.3.4. Inmunodeficiencia secundaria a enfermedades crnicas Es un hecho conocido que despus de algunas infecciones, como por ejemplo el sarampin, el paciente que la ha experimentado queda propenso a tener otras infecciones, lo que da cuenta de un deterioro de la respuesta inmune. Este dficit suele ser transitorio en la mayor parte de las patologas infecciosas que lo producen, pero existen otras, como la infeccin por VIH que conducen a un deterioro progresivo del sistema inmune. 3.3.5. Inmunodeficiencia secundaria a enfermedades infiltrativas y tumorales Las inmunodeficiencias secundarias (IDS) se refieren a inmunodeficiencias que se desarrollan por una variedad de condiciones patolgicas (neoplasias), enfer medades metablicas, desnutricin, drogas inmunosupresoras o infecciones de las clulas del sistema inmune (virus de inmunodeficiencia humana).
Por ejemplo, se han observado diferentes alteraciones en las respuestas inmunolgicas de pacientes con cncer, tanto in vivo como in vitro, dadas por su enfermedad de base, a las cuales se les pueden agregar las propias de las terapias antitumorales correspondientes. Estos pacientes presentan una mayor susceptibilidad a infecciones, una menor respuesta en pruebas cutneas de hipersensibilidad retardada y una menor respuesta de inmunoglobulinas especficas ante vacunaciones, entre otros defectos. 3.3.6. Inmunodeficiencia secundaria a terapia inmunosupresora Las sustancias que actan sobre las clulas en divisin (agentes alquilantes, antiproliferativos, inhibidores del metabolismo de las purinas) y las radiaciones ionizantes disminuyen la produccin de linfocitos B y T en el timo y mdula sea. Los linfocitos T de memoria que circulan en la sangre y la linfa son relativamente insensibles a los tratamientos inmunosupresores, pero pueden destruirse por irradiacin linfoide total, drenaje prolongado del conducto torcico, pr ocedimiento de afresis r epetidos e inyecciones de anticuerpos antilinfocitarios, que eliminan una parte de los linfocitos T de memoria. Algunos inmunosupresores actan sobre la presentacin de antgenos a linfocitos T (IL-10, Deoxispergualina) o sobre las interaccione celular es generadoras de seales coestimuladoras (Anticuerpos anti-CD4, antiLFA-1). Otros inhiben la transcripcin de los genes de citoquinas por las clulas T activadas (Ciclosporina A, FK506, Glucocorticoides) o bloquean las seales de progresin de la fase G1 a la fase S del ciclo celular (Rapamicina, Anticuerpos anti-CD25). Las molculas que interfieren con el metabolismo de las purinas inhiben la expansin clonal de los linfocitos T activados (Azatioprina, Mizobirina, Brequinar, Mofetil micofelonato metabolizado al producto activo, el cido micofenlico en el organismo). Los agentes alquilantes (Mostaza nitrogenada, Ciclofosfamida, Clorambucil) y el Metotrexato tambin actan en este estado, pero sin ninguna especificidad frente a los linfocitos T. Adems, algunos frmacos actan sobre la diferenciacin de linfocitos T y B activados por antgenos.
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LECTURAS SUGERIDAS Alteraciones cuantitativas Ahmed, K., Al-Matrouk, K.A., Martnez, G., Oishi, K., Rotimi, V.O., Nagatake, T., Increased serum levels of inter fer on-gamma and interleukin-12 during human brucellosis. Am j Trop Med Hyg, 61(3): 425-7, 1999. Badley, A.D., Pilon, A.A., Landay, A., Lynch, D.H. Mechanisms of HIV-associated lymphocyte apoptosis. Blood, 96:2951-2964, 2000. Burke, F., Relf, M., Negus, R., Balkwill, F. A cytokine profile of normal and malignant ovary. Cytokines, 8(7); 578-585, 1996. Dale, D., Person, R., Bolyard, A., Aprikyan, A., Bos, C., Bonilla, M., Boxer, L. Kannourakis, G., Zeidler, C., Welte, K., Horwitz, M. Mutations in The gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia. Blood, 96 (7):2317-22, 2000. Denkers, E., Gazzinelli, R. Regulation and function of T-cell-mediated immunity during toxoplasma gondii infection. Clinical Microbiology Reviews, 11(4): 569-588, 1998. Dornand, J., Lafont, V., Oliaro, J. Impairment of Intramacrophagic. Brucella suis Multiplication by Human Natural Killer Cells through a ContactDependent Mechanism. Infection and Immunity, 72(4): 2003-2311, 2004. Fernandez-Prada, C., Zelazowska, E., Nikolich, M. Interactions between Brucella melitensis and Human Phagocytes: Bacterial surface OPolysaccharide inhibits phagocytosis, bacterial killing, and subsequent host cell apoptosis. Infection and Immunity, 71(4): 2110-2119, 2003. Flo, T.H., Halaas, O., Lien, E., Ryan, L., Teti, G., Golenbock, D.T., Sundan, A., Espevik, T., Human Toll-Like Receptor 2 mediates monocyte activation by Listeria monocytogenes , but not by gr oup B Streptococci or lipopolysacchride. Journal of Immunology, 164: 2064-2069, 2000. Forestier, C., Moreno, E., Merece, S. Interaction of Brucella abortus lipopolysaccharide with major histocompatibility complex class II molecules in B lymphocytes. Infections and Immunity, 67(8): 4048-4054, 1999.
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HEMATOLOGA
Captulo
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LEUCEMIAS AGUDAS
Miriam Campbell B. y Jorge Alfaro L.
Introduccin Leucemia linfoblstica aguda 1. Introduccin 2. Patognesis 3. Cuadro clnico 3.1. Aspectos generales 3.2. rganos comprometidos 4. Laboratorio 5. Diagnstico diferencial 6. Clasificacin 7. Factores pronsticos 8. Tratamiento de LLA 8.1. Quimioterapia 8.2. Tratamiento de soporte 8.3. Resultados de tratamiento de LLA 8.4. Complicaciones del tratamiento de la LLA Leucemias mieloides agudas 1. Introduccin 2. Epidemiologa 3. Etiologa 4. Presentacin clnica 5. Clasificacin de las LMA 5.1. Clasificacin segn criterios FAB
5.1.1. Leucemia mieloide aguda con mnima diferenciacin (M0) 5.1.2. Leucemia mieloide aguda sin maduracin (M1) 5.1.3. Leucemia mieloide aguda sin maduracin (M2) 5.1.4. Leucemia promieloctica aguda (M3) 5.1.5. Leucemia mielomonoctica aguda (M4) 5.1.6. Leucemia monoblstica aguda (M5) 5.1.7. Eritroleucemia (M6) 5.1.8. Leucemia megacarioblstica aguda (M7) 5.2. Clasificacin segn criterios OMS 5.2.1. LMA con alteraciones citogenticas recurrentes 5.2.2. LMA con displasia multilineal 5.2.3. LMA y sndromes mielodisplsicos relacionados a tratamiento 5.2.4. LMA no categorizada 6. Fisiopatologa 6.1. Citogentica de las LMA 6.2. Marcadores moleculares en las LMA 7. Tratamiento 7.1.Quimioterapia 7.1.1. Quimioterapia de induccin 7.1.2. Consolidacin/intensificacin 7.1.3. Mantencin 7.2. Trasplante de progenitores hematopoyticos (TPH)
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RESUMEN
Las leucemias representan las neoplasias hematolgicas ms frecuentes. Se trata de enfermedades neoplsicas de causas no bien conocidas que se caracterizan por la transformacin de clulas hematopoyticas en la mdula sea en clulas cancerosas. Estas clulas proliferan e invaden la mdula sea, el tejido linfoide y la sangre perifrica pudiendo llegar a otros tejidos. Segn el tipo de clulas que proliferan se distinguen las leucemias linfocticas y las mieloides. Segn el tipo celular y evolucin de la enfermedad se les ha clasificado leucemias agudas y crnicas. En las agudas las clulas neoplsicas son clulas inmaduras (blastos), en las crnicas las clulas invasoras son clulas de aspecto ms maduro. En este captulo se describen los dos tipos de leucemias agudas, linfoide (Leucemia linfoblstica aguda, LLA) y Leucemia mieloblstica aguda (LMA). Principalmente se describirn aspectos relativos a la fisiopatologa y al diagnstico.
INTRODUCCIN Las leucemias agudas son enfermedades hematolgicas malignas que resultan de la alteracin en la proliferacin y diferenciacin de un grupo de clulas inmaduras, de estirpe mieloide o linfoide, que reemplaza las clulas hematopoyticas normales de la mdula sea.
solo se indica el tratamiento en trminos generales para cada tipo de leucemia aguda.
LEUCEMIA LINFOBLSTICA Las leucemias agudas linfoides son ms frecuentes en los nios y las mieloides en los adultos. Desde el punto de vista clnico se caracterizan por sndrome anmico, sndr ome hemorragparo asociado a la trombocitopenia y sndrome infeccioso explicado, en parte, por la neutropenia que, generalmente, presentan estos pacientes. El laboratorio representa un importante apoyo en la etapa de diagnstico y luego durante el control de la evolucin de la enfermedad. En ese sentido los siguientes exmenes son muy importantes: Hemograma, mielograma, inmunofenotipo, cariograma y RT-PCR. Este captulo revisa especialmente la fisiopatologa y diagnstico de las leucemias agudas, linfoide y mieloide. En el captulo 30 se revisan algunos aspectos tcnicos, sin entrar en detalles, de los mtodos que son utilizados en el estudio de estos pacientes. No siendo el propsito de este libro, describir los protocolos de tratamiento quimioterpico, Myriam Campbell B. 1. INTRODUCCIN La leucemia linfoblstica (LLA) es la neoplasia ms frecuente de la infancia, constituyendo un 35 a 40 % de los cnceres en la edad peditrica, con una incidencia anual de 3 a 4 casos por cada 100.000 nios menores de 15 aos. Se presenta en todas las edades con un peak entre los 4 y 6 aos, algo ms frecuente en varones. La causa sigue siendo desconocida, si bien en un nmero muy pequeo de casos se asocia a sndromes genticos conocidos. Hasta mediados de los aos 60 era una enfermedad fatal, 80% de los pacientes fallecan antes de 6 meses. Con la mejora en el diagnstico y en la calidad del tratamiento se ha logrado curacin en ms del 70% de los casos. Se espera a futuro un logro mayor, en especial aplicando terapias adaptadas segn el riesgo, tanto para limitar la toxicidad en el grupo de bajo riesgo como para optimizar los resultados en los pacientes de riesgo mayor.
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2. PATOGNESIS En la LLA una clula progenitora linfoide sufre una alteracin gentica adquirida cuya consecuencia es una expansin clonal con detencin de la diferenciacin celular, proliferacin, crecimiento descontrolado e invasin de la mdula sea; desde all se disemina a sangre perifrica, bazo, ganglios y el resto de los tejidos, hacindose clnicamente detectable. Esta clula maligna o blasto leucmico comparte muchas de las caractersticas de los progenitores linfoides de modo que la mayora de ellos tiene un fenotipo que corresponde a la etapa de diferenciacin en la que se detuvo el desarrollo. La etiologa de esta alteracin gentica es an desconocida y se comprende poco la compleja relacin entre los factores genticos, ambientales e inmunolgicos que dan origen a la leucemia. Hay factores clsicamente asociados a la patognesis de la leucemia como la exposicin a radiacin ionizante, algunos qumicos (benceno, pesticidas) o agentes alquilantes pero excepcionalmente se encuentran como antecedente en el paciente peditrico. Del mismo modo hay condiciones genticas que tienen un mayor riesgo de presentar leucemia como trisoma 21 (1 cada 95), anemia de Fanconi (1 cada 12), sndrome de Bloom (1 cada 8), agammaglobulinemia congnita, enfermedad de Kostman. Estos cuadros son muy poco frecuentes, a excepcin de la trisoma 21, de modo que la mayora de los nios que presentan leucemia son sanos previamente. En un lactante gemelo con leucemia, sta puede presentarse tambin en el segundo gemelo, y el estudio de esta situacin ha dado importante informacin para explicar la patognesis de la LLA. En ellos es muy frecuente que el blasto leucmico tenga una translocacin que compr omete el gen MLL ubicado en el cromosoma 11 regin 23, el que se fusiona en especial con el gen AF4 presente en el cromosoma 4. Se ha logrado identificar en pares de gemelos un reordenamiento idntico de MLL , siendo ste adquirido (slo presente en los blastos y desaparece en la remisin). El desarrollo de la leucemia a pocos meses de nacer sugiere entonces que esta anomala se habra producido in tero. La translocacin ms frecuente en LLA infantil es la t(12:21) con el gen de fusin TEL/AML1, se observa en el 20%
de los casos, con edades entre 2 a 5 aos. Estudiando muestras de sangre de taln del perodo de recin nacidos de estos nios (en cartas de Gutrie) se demostr presencia de este gen de fusin, sugiriendo que se requiere un segundo evento leucemognico postnatal para el desarrollo de la LLA. Al estudiar recin nacidos sanos se ha demostrado el gen de fusin TEL/AML1 en el 1% de ellos lo que es una frecuencia muy alta por lo que es indudable que en muchos casos no se produce este segundo evento. As, aunque algunos mecanismos se han aclarado todava hay muchas preguntas sin respuesta. 3. CUADRO CLNICO 3.1. Aspectos generales Los pacientes pueden presentar un cuadro desde casi asintomtico hasta muy grave; en la mayora la historia es ms bien de corta evolucin, das o semanas (rara vez llega a meses) Los signos y sntomas reflejan la invasin medular y extramedular, especialmente importantes son las infiltraciones a nivel de hgado, bazo y ganglios; pero tambin los hay derivados de los trastornos funcionales del metabolismo patolgico de los blastos. Los sntomas y signos ms frecuentes pueden agruparse en 4 sndromes: anmico, hemorrgico, febril y tumoral: Sndrome anmico. La proliferacin de los blastos en la cavidad medular provoca desplazamiento del tejido normal y un trastorno del microambiente medular. Esto causa una anemia progresiva, sin caracteres regenerativos, es decir no se observan reticulocitos ni policromasia. La palidez de piel y mucosas es pr ogresiva. Aparecen posterior mente: fatigabilidad, disnea de esfuerzo, cefalea, irritabilidad o somnolencia, taquicardia, soplos y, ocasionalmente, insuficiencia cardaca. Sndrome hemorrgico. Su patogenia radica principalmente en la acentuada disminucin o virtual desaparicin de las plaquetas, por destruccin y desplazamiento de los megacariocitos. Las hemorragias pueden presentarse en los sitios ms diversos. Destacan las de piel y mucosas en forma de prpura petequial y equimtica, cuya intensidad vara desde algunas petequias irregular mente distribuidas hasta extensas hemorragias con o sin antecedentes de traumatismos. La epistaxis es frecuente y debido a su abundancia y
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recurrencia suele ser el primer sntoma que motiva la consulta. Otros sitios pueden ser la retina y cerebromenngeas; la hemorragia digestiva, genitourinaria o pulmonar se ve rara vez al comienzo de la enfermedad. Sndrome febril. La infiltracin de la mdula sea produce neutropenia perifrica con cifras en general inferiores a 500 granulocitos/L, lo que condiciona mayor susceptibilidad a infecciones. En un tercio de los pacientes es el cuadro febril de algunos das de evolucin, en general asociado a otros sntomas (tos, odinofagia, dolor abdominal, etc.), lo que motiva la consulta y realizacin de exmenes. En el hemograma se encuentra neutropenia, que puede estar asociada con anemia, por lo que se plantea el diagnstico de leucemia. Slo en la mitad de los casos se describen blastos por lo que no hay que esperar su presencia para sospechar el diagnstico. El sndrome febril prolongado con hemogramas repetidamente normales es muy poco probable que sea secundario a leucemia. Sndrome tumoral. La patogenia est dada por la infiltracin blstica de los diferentes rganos. Desde el punto de vista del diagnstico son importantes las del hgado, bazo, ganglios y gnadas La magnitud de la hepatomegalia es variable, desde palpaciones a nivel del reborde costal derecho, hasta grandes hepatomegalias que sobrepasan la lnea media transversal a nivel del ombligo. La consistencia es dura, el borde neto y generalmente no es sensible. La esplenomegalia es tambin de tamao variable llegando a veces a ocupar la fosa ilaca izquierda. La mayora de las veces se acompaa de hepatomegalia, siendo menos frecuente el crecimiento solitario del bazo. Los ganglios linfticos tambin participan de los procesos infiltrativos, aunque no son frecuentes las grandes adenopatas perifricas. En general no tienen periadenitis y slo son dolorosos cuando son tributarios de zonas infectadas. Algunos pacientes tienen ensanchamiento del mediastino generalmente dado por ganglios infiltrados o por el timo. A nivel de faringe y amgdala, el proceso infiltrativo puede tomar caracteres hiperplsticos con formaciones poliposas o bien ser del tipo necrtico con presencia de lceras, hemorragia e infeccin. 3.2. rganos comprometidos Por su capacidad de diseminacin, la leucemia puede comprometer cualquier rgano o sistema siendo los ms relevantes los siguientes:
Compromiso osteoarticular. Es muy importante por su frecuencia, entre 25 a 30% de los nios se quejan de dolores osteoarticulares en los inicios del cuadro leucmico, generalmente de extremidades inferiores, nocturno y puede interrumpir el sueo. Los analgsicos producen alivio incompleto. El dolor puede estar originado por infiltracin leucmica del periostio, infarto seo o expansin de la cavidad medular por las clulas leucmicas. En la radiografa puede haber diversos tipos de lesiones osteoarticulares: infiltracin y elevacin periostal, neoformacin de hueso subperistico, bandas transversales metafisiarias radiolcidas o radioopacas. Estas bandas parecen corresponder a perodos de detencin del crecimiento seo durante las fases activas de la enfermedad. Lesiones osteolticas y fracturas patolgicas se ven con alguna frecuencia, la mayor parte de las veces asintomticas. Compromiso de sistema nervioso central. Al diagnstico ocurre en menos del 5% de los casos. El paciente puede estar asintomtico y ser un hallazgo en el estudio del lquido cefalorraqudeo, o bien tener sntomas y signos secundarios a hipertensin endocraneana, tales como vmitos, cefalea, irritabilidad, rigidez de nuca, papiledema, y compromiso de nervios craneales, en especial tercero, cuarto y sexto par. Tambin se puede presentar hemorragia como consecuencia de la trombocitopenia o por leucostasia en vasos sanguneos cerebrales lo que lleva a la formacin de trombos de blastos seguido de infarto y hemorragia. Otros sntomas menos frecuentes estn dados por la infiltracin del parnquima cerebral: hemiparesia, ataxia, hipotona, hiperreflexia. Por compromiso de la mdula espinal puede haber dolor dorsal y en extremidades inferiores con dificultad en la marcha.Otra manifestacin de leucemia de SNC, ms frecuente en la recada, es el sndrome de obesidad hipotalmico, en el que por destruccin del ncleo ventromedial del hipotlamo, donde se encuentra el centro de la saciedad, se produce hiperfagia, sobrepeso y diabetes inspida. Compromiso genitourinario. El compromiso de testculo se presenta en cerca de un 10% de los pacientes, generalmente como aumento de volumen uni o bilateral, no doloroso; el compromiso de ovario es raro. La infiltracin del rin es poco frecuente, en general asintomtica, con ecotomografa es ms fcil detectarla, pero no todo aumento de volumen se debe a leucemia; otros procesos son:
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hemorragia, infeccin e hiperplasia tubular proximal. Ocasionalmente puede haber hipertensin, hematuria o insuficiencia renal. Compromiso cutneo. La infiltracin leucmica de la piel es un hallazgo frecuente en lactantes, puede ser desde nodular hasta maculopapulosa, de color rojo-violceo que se blanquea con la presin, por estar constituida en su mayor parte por capilares dilatados. Es asintomtica y se llama leucemide. 4. LABORATORIO Son comunes la anemia, neutropenia y trombocitopenia, sin embargo puede haber hemograma nor mal al diagnstico (especialmente en los pacientes con dolor seo). La anemia, con hemoglobina menor de 10 g/ dL, se observa en ms del 80% de los casos, normoctica y normocrmica con recuento bajo de reticulocitos. Los leucocitos pueden variar desde 100 a ms de 1.000.000/L (15 a 20% tiene ms de 50.000/L), generalmente asociado a neutropenia de grado variable (30% tiene menos de 500/L). El recuento de plaquetas vara desde nor mal hasta casi ausentes, en 70% hay trombopenia menor de 100.000/L, la severidad de la hemorragia se relaciona con el grado de trombocitopenia, siendo raro un sangramiento severo an con plaquetas menores de 20.000/L, a menos que haya fiebre e infeccin asociada. Tanto la anemia como la neutropenia se pueden presentar en forma aislada, no as la trombocitopenia. La presencia de blastos se observa en un 65- 70% de los casos. El diagnstico definitivo de leucemia se hace con el mielograma. En ste se observa celularidad normal a aumentada, aunque tambin puede ser hipocelular, con muestra homognea, megacariocitos disminuidos o ausentes y la celularidad est dada por blastos, generalmente 80 a 100%. Los linfoblastos son clulas inmaduras, con cromatina nuclear difusa, pueden tener uno o varios nuclolos, citoplasma basfilo, sin grnulos, a veces con vacuolas. En una mdula normal se puede encontrar < 5% de clulas inmaduras; para diagnosticar leucemia se requiere ms de 25%. Con la tincin de MayGrunwald -Giemsa o Wright, en el 95% de los casos es posible diagnosticar si la leucemia es de estirpe linfoblstica, sin embargo es muy importante realizar, en la muestra de mdula sea, estudios citoqumicos, inmunolgicos, citogenticos y moleculares que permiten una clasificacin ms completa del tipo de leucemia, lo que es fundamental para realizar un
tratamiento adecuado. En ocasiones la aspiracin de mdula sea puede ser difcil de obtener, generalmente por alta adhesividad de los blastos o por fibrosis y en estos casos se requiere biopsia de mdula sea. La distincin entre leucemia linfoblstica con compromiso de ganglios y linfoma con invasin medular es arbitraria llamndola leucemia cuando tiene ms de 25% de blastos en mdula sea y linfoma si el porcentaje es menor. Otras alteraciones de laboratorio son secundarias al volumen de clulas leucmicas y la destruccin de ellas, como el aumento de cido rico srico que refleja un aumento del catabolismo de purinas, lo que puede provocar nefropata con consiguiente insuficiencia renal. Se observa al iniciar tratamiento en pacientes con gran volumen tumoral (hiperleucocitosis, gran visceromegalia) y debe usarse medidas de prevencin de esta complicacin (hidratacin, alcalinizacin, inhibidores de xantinoxidasa, etc.). Por la lisis tumoral puede haber elevacin del fsforo srico con hipocalcemia secundaria. Por la infiltracin sea se puede presentar hiper calcemia. La lisis de blastos, la hematopoyesis inefectiva y el compromiso heptico se asocian con elevacin de la deshidrogenasa lctica srica. En la radiografa de trax se puede encontrar ensanchamiento del mediastino anterior, en especial en la leucemia de estirpe T. Los trastornos de la coagulacin son raros y se ven ms bien asociados a infeccin. 5. DIAGNSTICO DIFERENCIAL Una historia y examen fsico detallado, junto al hemograma y mielograma permite hacer el diagnstico de LLA en ms del 95% de los casos. Sin embargo, en algunos casos se debe analizar otros diagnsticos: Prpura trombocitopnico inmune. El PTI es la causa ms frecuente de prpura petequial en los nios; pueden tener antecedente de infeccin viral previa. En general los leucocitos son normales y no hay evidencia de anemia, a menos que se asocie a sangramientos y en estos casos es regenerativa con reticulocitosis. No hay visceromegalia. En el hemograma se encuentran plaquetas grandes (jvenes). La mdula sea muestra hematopoyesis nor mal con megacariocitos normales o aumentados. Anemia aplstica. Estos pacientes, adems de
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la anemia arregenerativa, pueden tener hemorragias por la trombocitopenia y fiebre e infeccin asociados a la neutropenia. Rara vez tienen adenopatas y no presentan viscer omegalia. El hemograma tiene pancitopenia persistiendo casi exclusivamente linfocitos, lo que puede hacer pensar en leucemia. El mielograma es muy hipocelular y no se observan blastos. Sndrome mielodisplstico (SMD). Estos pacientes puede tener iguales sntomas con pancitopenia perifrica, el mielograma generalmente es normo o hipercelular con signos de alteracin de la maduracin celular (displasia), es poco frecuente encontrar blastos y cuando estn presentes son menos del 25%. Este sndrome comprende 4 cuadros: Anemia refractaria, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformacin y leucemia mielomonoctica juvenil. En los nios son ms frecuentes los 2 primeros. Un 30% de los pacientes con SMD pueden presentar leucemia algunos meses despus del diagnstico. Artritis reumatoide juvenil. Cerca de un 30% de los pacientes al inicio de la leucemia pueden tener dolores osteoarticulares, generalmente artralgias pero a veces hay artritis, y pueden presentar fiebre, palidez, esplenomegalia. En el hemograma puede haber anemia normoctica leve y leucocitosis. Si no hay algn test claramente positivo para artritis reumatoide debe realizarse mielograma para descartar leucemia (siempre antes de iniciar tratamiento con corticoides). Mononucleosis infecciosa y otras infecciones virales. Los pacientes pueden tener linfoadenopata generalizada, esplenomegalia, rash cutneo, fiebre y linfocitosis. El diagnstico diferencial se hace ms difcil si est complicado con prpura trombopnico o anemia hemoltica. En el hemograma la observacin cuidadosa de los linfocitos jvenes de la mononucleosis y enfermedades virales permite diferenciar de los blastos. Es til la presencia de test positivo para deteccin de mononucleosis. En la mayora de los casos se establece el diagnstico con estos elementos pero ocasionalmente se requiere mielograma el que es normocelular y sin blastos. Reaccin leucemoide y neutropenia asociada a sepsis. Algunas infecciones, generalmente bacterianas y severas, pueden asociarse con elevado recuento de granulocitos en sangre perifrica (> 50.000/L) y en el recuento diferencial presentan clulas inmaduras, pero
siempre acompaado de formas maduras y con signos txicos y degenerativos (granulacin patolgica, vacuolas, cuerpos de Doehle, etc.). En general el diagnstico se hace por una buena evaluacin del hemograma en el que no hay hiato leucmico (clulas maduras y blastos sin for mas intermedias), con hemoglobina y plaquetas normales. Muy rara vez se requiere mielograma el que muestra hiperplasia mieloide con maduracin normal. La sepsis bacteriana tambin puede provocar neutr openia secundaria al consumo y detencin de produccin. El mielograma muestra una detencin de la maduracin en los precursores de los granulocitos y puede ser difcil diferenciar de algunos tipos de leucemia mieloide. Neuroblastoma. El modo de presentacin puede ser similar a leucemia y los neuroblastos pueden semejar linfoblastos. Cuando hay infiltracin de la mdula generalmente es en acmulos o rosetas en cambio en la leucemia es difusa. El diagnstico se facilita con los estudios de imgenes, por la aparicin de tumor mediastnico o suprarrenal y con la deteccin de catecolaminas aumentadas. 6. CLASIFICACIN En el nio el 97% de las leucemias son agudas y el 3% crnicas. La leucemia congnita es la que se presenta en las primeras 4 semanas de vida, es muy poco frecuente y generalmente de estirpe mieloide. La LLA infantil abarca varios subgrupos que se diferencian por la clnica y su diferente biologa. Se pueden clasificar por diferentes mtodos, tales como mor fologa, citoqumica, inmunofenotipo, citogentica y anlisis molecular, siendo todas estas tcnicas complementarias. Las leucemias, segn las caractersticas morfolgicas del blasto, tanto del ncleo (tamao, nuclolo) como del citoplasma (cantidad, basofilia, presencia de grnulos) y utilizando la clasificacin descrita por un comit de citlogos Franco-Amrico-Britnico (FAB) se diferencian en linfoblsticas (80%), mieloblsticas (15%) e indiferenciadas (5%). En las linfoblsticas se describen 3 subgrupos: L1, la ms comn en el nio (80%), con una clula pequea, con ncleo regular sin nuclolo y poco citoplasma, L2 son blastos de mayor tamao, con nuclolos y abundante citoplasma, L3 son clulas grandes con gran basofilia citoplasmtica y vacuolas, es la menos frecuente (2-3%).
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La importancia de las tinciones citoqumicas tales como PAS, fosfatasa cida y estearasas ha sido sobr epasada por las tcnicas inmunolgicas, a excepcin de la tincin de mieloperoxidasa que sigue utilizndose para identificar leucemia de estirpe mieloide (ver captulo 30). Los linfoblastos tienen reordenamientos de las inmunoglobulinas o de los genes receptores de las clulas T y expresan antgenos que corresponden al proceso normal de desarrollo de los linfocitos T y B, tambin pueden tener una expresin aberrante de ellos dando origen a fenotipos diferentes de los progenitores normales. Utilizando anticuerpos monoclonales, que r econocen deter minados grupos moleculares de los antgenos intracelulares o de la membrana superficial se puede identificar las diferentes etapas de diferenciacin celular y de cul estirpe es el linfoblasto. En el nio el 80-85% de las LLA son de precursores B, que segn su maduracin incluye los grupos pro B, comn, pre B y B madura. El 15 a 20% de las LLA son de estirpe T, con los subgrupos pro T, pr e T, T inter media y T madura. Esta identificacin es fundamental para dar el tratamiento adecuado a cada grupo. El estudio citogentico de la LLA actualmente detecta anomalas en el 90% de los casos. El uso de tcnicas moleculares incluyendo la reaccin de polimerasa en cadena reversa (RTPCR), anlisis de Southern blot e hibridacin con fluorescencia in situ (FISH) ha mejorado la calidad de este estudio y permite detectar translocaciones no identificables en el cariotipo y tambin diferenciar lesiones que citogenticamente parecen iguales pero son diferentes a nivel molecular (ver captulo 30). Las alteraciones pueden ser en el nmero y en la estructura de los cromosomas, se catalogan como hiper diploide con ms de 50 cromosomas, hipodiplode con menos de 46 cr omosomas y seudodiplode con 46 cromosomas con cambios estructurales de ellos. Algunas alteraciones se asocian a evolucin
desfavorable por lo que es importante detectarlas para adecuar el tratamiento. 7. FACTORES PRONSTICOS A medida que ha aumentado la intensidad de los tratamientos y la posibilidad de curacin es ms del 75%, ha cambiado la importancia de los factores pronsticos. Indudablemente hoy la calidad del tratamiento es uno de los aspectos ms relevantes. Contina siendo relevante el recuento inicial de leucocitos, con mayor probabilidad de curacin si el recuento inicial es bajo 20.000 leucocitos/L. La edad entre 2 y 10 aos es tambin favorable, en cambio los lactantes menores de un ao tienen peor pronstico. Para algunos grupos de estudio el sexo masculino es desfavorable. En los ltimos aos los investigadores del grupo alemn Berlin Frankfurt Munster (BFM) y otros han demostrado la importancia de la respuesta inicial al tratamiento como una medida de la sensibilidad a los medicamentos y que se relaciona estrechamente con el pronstico. Los anlisis moleculares parecen prometedores no solo para el diagnstico sino tambin para monitorear la respuesta a tratamiento. As se est investigando intensamente para detectar enfermedad residual midiendo los productos de fusin de genes y los inmunofenotipos aberrantes en diferentes momentos del tratamiento. Estudios recientes muestran que tanto la presencia como el nivel de enfermedad residual pueden correlacionarse con el resultado del tratamiento. Las anor malidades cromosmicas como t(9;22), t(4;11) y t(1;19) se relacionan con mal pronstico en cambio la hiperdiploida es favorable, ya que estos blastos acumulan ms metotrexato y tienen mayor propensin a la apoptosis. Segn el fenotipo las caractersticas del blasto tambin son diferentes y esto influye en el tipo de tratamiento que se debe usar, por ejemplo los blastos T requieren de una dosis mayor de metotrexato para lograr acumular ms poliglutamatos y favorecer la apoptosis (tabla 12-LLA-1).
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Tabla 12-LLA-1. Caractersticas clnicas y biolgicas de LLA en nios Estirpe blasto Linfoblasto B Linfoblasto B Linfoblasto B B madura Citogentica/ Molecular Hiperdiploide TEL /AML1 t(9;22) t(8;14) ,otras 8q24 Frecuencia (%) 25 25 3 2-3 Caractersticas Edad < 10 aos, pronstico favorable Edad 2 a 8 aos, pronstico favorable Edad mayor, leucocitosis, pronstico desfavorable Mayor frecuencia: varones, enfermedad extramedular, hiperuricemia. Buen pronstico con tratamiento intenso y de corta duracin. La mayora lactantes, con compromiso de SNC, leucocitosis, visceromegalia, pronstico desfavorable Leucocitosis, compromiso de SNC, pronstico menos favorable Varones, hiperleucocitosis, masa mediastnica, compromiso de SNC, pronstico ha mejorado con uso de metotrexato en alta dosis progenitores. Se considera curado al paciente que se mantiene en remisin por ms de 5 aos. El tratamiento incluye cuatro fases con un objetivo especfico para cada una: induccin de remisin, intensificacin o consolidacin, tratamiento del sistema nervioso central y terapia de continuacin: a) Induccin de remisin. Se considera remisin completa cuando la celularidad de la mdula sea es normal ( < de 5% de blastos), el examen fsico y los valores hematolgicos son normales. Para inducir una remisin clnica se debe erradicar el 99% de las clulas leucmicas. Esto se logra en el 85% de los casos si se usan 2 drogas (Vincristina y Prednisona) y es > 97% si se agregan 2 drogas (Asparginasa y Antraciclinas), en un perodo de 4 semanas. El 1 - 2 % de los pacientes no remiten, ya sea porque fallecen antes por infeccin o leucemia o bien porque son resistentes al tratamiento. b) Intensificacin. El objetivo es reducir la masa de clulas leucmicas antes que aparezca resistencia a drogas. Se utiliza inmediatamente despus de obtenida la remisin, en general combina varias drogas algo diferentes a las usadas en la induccin. Tiene una duracin variable de 4 a 6 meses. Inicialmente se us slo en pacientes con mal pronstico pero Riehm y colaboradores del grupo BFM
Pro B Pre B Linfoblasto T
t(4;11) /MLL Reordenado t(1;19)/E2A-PBX1 14q11, 7q35 ,7p14
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8. TRATAMIENTO DE LLA Desde los aos 70 en adelante gracias al mayor conocimiento de la enfermedad, elaboracin de nuevos frmacos, desarrollo de la terapia de apoyo y formacin de los grupos de estudio cooperativos con utilizacin de protocolos de tratamiento, ms del 70% de los pacientes pueden curar, llegando a ser adultos sanos y muchos de ellos con hijos tambin sanos. Por esto se debe ser optimista al enfrentar a la familia del paciente leucmico, con lo que se logra mayor cooperacin del nio y del ncleo familiar en la realizacin del tratamiento. El tratamiento tiene dos pilares, la quimioterapia, cuyo objetivo es hacer desaparecer el clon leucmico y la terapia de soporte que incluye el control de las complicaciones al diagnstico y durante la quimioterapia. Es fundamental que el nio sea atendido por un equipo peditrico multiprofesional y capacitado para as ofrecerle las mejores posibilidades de curacin. 8.1. Quimioterapia El propsito de la terapia es curar a los nios, erradicando las clulas leucmicas y sus
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demostraron la importancia de esta fase para todos los pacientes, lo que fue confirmado, posteriormente, por el grupo de estudio norteamericano Cancer Children (CCG) y otros. c) Tratamiento del SNC. A comienzo de los aos 70, cuando se logr obtener remisiones prolongadas en el tratamiento de los nios con LLA, se observ que hasta el 50% present recada en SNC. Por esto se desarrollaron diferentes formas de tratamiento profilctico usando quimioterapia intratecal con Metotrexato (Mtx) y radioterapia craneoespinal y ms tarde slo craneal. La introduccin de esta fase del tratamiento fue un gran avance teraputico y actualmente se inicia en la induccin, con un nmero variable de dosis de Mtx intratecal, (en algunos estudios asociado a corticoides y Citarabina) y luego se completa en la intensificacin con dosis altas de quimioterapia sistmica (Mtx +/-Citarabina) junto con varias dosis de quimioterapia intratecal, con o sin radioterapia craneal. Por los efectos adversos tardos, asociados a radioterapia, se ha disminuido progresivamente la dosis desde 24 a 18 y luego a12 Gy. Actualmente slo se irradia un grupo seleccionado de pacientes (15 a 20%), sin que por esto haya aumentado la frecuencia de recada en SNC. (< 5%). Esto ha sido posible gracias a los intensos tratamientos actuales. d) Terapia de continuacin. En los primeros pacientes que lograron remisin no se us otro tratamiento y todos recayeron en 2 a 4 meses, por lo que se dise esta fase del tratamiento. Su objetivo es destruir los blastos leucmicos remanentes, y sus progenitores, afectando en menor medida a la mdula sea y preservando la respuesta inmune del paciente. Lo ms usado es Mtx semanal con 6 Mercaptopurina diaria, en general por va oral. Los pacientes con LLA de estirpe B que logran una mayor cantidad de poliglutamatos de Mtx en los linfoblastos, tienen mayor posibilidad de curacin. Esto tambin sucede en los linfoblastos hiperdiploides y podra ser la causa del mejor pronstico que tienen los nios con esta alteracin citogentica. La adicin de pulsos (Vincristina + Prednisona y otros) ha sido usado por muchos grupos, con algunos datos que sugieren su utilidad, pero an sin demostrarla objetivamente. En los pacientes con mayor riesgo de recada se ha usado Mtx en dosis mayores, en infusin, o bien uso repetido de drogas usadas en la induccin (Asparginasa) o pares de drogas rotadas semanal o mensualmente. El tiempo ptimo que se debe tratar una LLA es entre
dos a dos aos y medio. El trasplante de clulas hematopoyticas se utiliza en un grupo seleccionado de pacientes con LLA que tienen un mayor riesgo de fracaso con la terapia habitual (10 -15% ) como por ejemplo los pacientes que remiten tardamente o tienen t (9:22) entre otros (ver captulo 16). 8.2. Tratamiento de soporte La mayora de las complicaciones al diagnstico estn relacionadas con los trastor nos metablicos y con la infiltracin leucmica de los rganos no hematopoyticos. Tambin es importante el control de las infecciones, no slo al diagnstico sino tambin durante el tratamiento quimioterpico, y de las hemorragias cuando stas se presentan. a) Complicaciones metablicas: son secundarias a la lisis de blastos, espontnea o inducida por la quimioterapia: hiperuricemia, hiperkalemia, hiperfosfatemia asociado a hipocalcemia, hiperfosfaturia. El aumento de la lisis celular genera liberacin de DNA con aumento de catabolismo de las purinas en el hgado. Se produce una hiperuricemia con aumento de la excrecin renal del cido rico lo que puede precipitar en los tbulos colectores renales y urteres y producir insuficiencia renal aguda. Se evita esta complicacin con hidratacin, alcalinizada con bicarbonato, abundante y cuidadosa y con el uso de alopurinol (10 mg/k/da) ambos se usan antes de iniciar la quimioterapia y es de especial importancia en los pacientes con leucocitos sobre 100.000/L ya que este grupo es el que tiene mayor riesgo de hiperuricemia. b) Hiperleucocitosis. En los nios con ms de 100.000 leucocitos/L, los blastos pueden obstruir los vasos de micr ocirculacin impidiendo el flujo sanguneo, o que puede producir hipoxemia local, dao endotelial, infarto y hemorragia. Se puede afectar cualquier rgano per o generalmente los que dan sintomatologa clnica son el sistema nervioso central y el pulmn. El tratamiento de la hiperleucocitosis consiste en instituir rpidamente la terapia que lleve a citorreduccin. Si esto no se puede hacer por las complicaciones asociadas o si el paciente no responde rpido debe hacerse leucofresis (o exsanguineotransfusin) o radioterapia de crneo de inmediato. En el paciente con hiperleucocitosis hay que ser muy cauto con la transfusin de concentrados de glbulos rojos,
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para no aumentar la viscosidad sangunea y agravar los sntomas. c) Infiltracin de rganos. La ms severa aunque poco frecuente es la infiltracin de estructuras mediastnicas que puede producir compresin traqueobronquial o sndrome de vena cava superior y llevar rpidamente a la muerte. El tratamiento es iniciar de inmediato la quimioterapia (generalmente con dosis bajas de corticoides) y si no responde se usa radioterapia local. La infiltracin renal puede llevar a insuficiencia renal y la leucostasia pulmonar puede provocar distress respiratorio, en ambas situaciones se debe iniciar tratamiento citorreductor de inmediato. d) Infeccin. Todo paciente leucmico con menos de 500 neutrfilos/L y fiebre debe considerarse sptico, aunque no tenga otros signos o sntomas. Esto es vlido al diagnstico y durante la quimioterapia. Se debe tomar cultivos y comenzar de inmediato tratamiento antibitico de amplio espectro. Esta conducta agresiva ha evitado la alta mortalidad que se observaba cuando no se realizaba tratamiento emprico y es el estndar actual en todos los grupos de trabajo. Las drogas especficas a usar dependen de las instituciones y se basa en los patrones de resistencia antibitica local. Generalmente incluye un agente anti-Gram negativo (betalactmico) + aminoglicsido +/agente anti-Gram positivo, todos por va parenteral. Si hay mucositis severa o esofagitis se puede asociar acyclovir; si el paciente presenta gingivitis necrotizante o infeccin perianal o signos de enteropata neutropnica debe agregarse metronidazol o clindamicina. Se espera que el paciente se haga afebril en 72 hrs. y si esto no ocurre o si se agrava (ej: shock sptico) se debe adecuar el tratamiento ya sea agregando agente anti-Gram (+) o cambiando el aminoglicsido. Si a los 7 das el paciente contina febril se debe suponer infectado por hongos, especialmente Candida Albicans o Aspergillus, y se debe agregar un antifngico. El ms efectivo para la enfermedad invasiva es la anfotericina B y debe usarse aunque no se identifique el hongo en los cultivos. La gravedad que pueden tener las infecciones bacterianas, y la alta mortalidad que se asoci a ellas en el pasado, llev a desarrollar tratamientos antibiticos profilcticos con antibiticos orales no absorbibles como gentamicina, colistin, nistatina que son utilizados por la mayora de los grupos. El riesgo de infeccin por Pneumocystis carinii en los nios con LLA es elevado cuando se realiza tratamiento
inmunosupresor intensivo y prolongado, como los que se realizan actualmente, produciendo neumonitis intersticial severa y a menudo fatal; esto llev al uso profilctico de sulfametoxazoltrimetoprim con lo que hoy este riesgo es mnimo. Adems, se demostr que los pacientes que lo reciben tienen una reduccin de la frecuencia de infecciones comparado con controles no tratados y rara vez tienen efectos adversos, por esto su uso est muy difundido. Entre las infecciones virales la varicela puede ser fatal en un nio con LLA, ya que con alta frecuencia se complica con neumonitis, hepatitis o encefalitis. Todo nio con LLA que presente varicela se debe tratar con acyclovir parenteral, con lo que se ha reducido la frecuencia de casos severos. e) Trastornos hemorrgicos. En la LLA lo ms frecuente al diagnstico es la trombocitopenia y cuando se asocia a sangramiento, especialmente de mucosas, debe hacerse transfusin de plaquetas (una unidad cada 10 kilos de peso), con una frecuencia que depender de la severidad del sangramiento. Cuando hay sepsis puede haber coagulacin intravascular, aunque es poco frecuente. Durante el tratamiento, en relacin al uso de Asparginasa, puede presentarse una coagulopata por inhibicin de la sntesis de protenas que intervienen en la coagulacin especialmente antitrombina III, protena C y pr otena S; se asocia a cuadros trombohemorrgicos en sistema nervioso central o perifricos. Cuando se ha instalado el cuadro, el tratamiento se realiza con transfusin de plasma fresco. 8.3. Resultados de tratamiento de LLA Actualmente hay tratamientos muy efectivos para LLA los que logran una curacin en ms del 70% de los pacientes. Permanentemente los grupos tratan de identificar a los pacientes que requieren menos tratamiento y a los con mayor riesgo de recada, analizando los factores pronsticos (que a su vez son dependientes del tratamiento usado) con el objetivo de dar a cada nio la mejor terapia con la menor toxicidad asociada (terapia de acuerdo al riesgo). En la tabla 12-LLA-2 se encuentran los resultados de los grupos ms reconocidos. Los protocolos del grupo BFM han sido unos de los ms ampliamente usados. En los pases en desarrollo tambin se usan tratamientos intensos, en general basados en los grupos ya descritos.
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Tabla 12-LLA-2. Resultados de tratamiento de LLA Grupo AIEOP BFM 90 CCG 1800 COALL 92 DFCI 91-01 NOPHO III SJCRH XIIIB
SLE, sobrevida libre de enfermedad
Aos del estudio 1991-95 1990-95 1989-95 1992-97 1991-95 1992-98 1994-98
Pacientes n 1194 2178 5121 538 377 1143 247
SLE a 5 aos (e.s.) % 71 (1) 78 (1) 75 (1) 77 (2) 83 (2) 78 (1) 81 (3)
El grupo nacional chileno (PINDA) ha realizado 3 protocolos consecutivos basados en los estudios del grupo BFM. El protocolo LLA PINDA 87, con 425 pacientes, tiene una sobrevida libre de eventos (SLE) a 5 aos de 60%, el LLA PINDA 92 con 407 pacientes tiene SLE a 5 aos de 67%, el protocolo LLA PINDA 96 con 723 pacientes a 5 aos tiene una SLE de 73%. El protocolo actual se inici a fines del ao 2002. 8.4. Complicaciones del tratamiento de la LLA a) Infeccin. Es la complicacin ms frecuente y se asocia a la neutropenia (descrita antes). b) Recada. Es la complicacin ms temida y se presenta en el 25 a 30% de los pacientes. Consiste en una reaparicin de la infiltracin leucmica (medular o extramedular). La ms frecuente es en mdula sea seguida por SNC y testculo. La aparicin de sta ensombrece el pronstico. La recada puede ser un hallazgo en exmenes de rutina o bien presentarse bruscamente con sntomas clnicos iguales a los que se observan al diagnstico inicial . Los pacientes que recaen deben recibir nuevamente quimioterapia sistmica y terapia especfica de acuerdo al sitio y momento de la recada. Los pacientes que recaen 6 meses despus de terminado el tratamiento pueden tener nuevamente remisiones prolongadas con una posibilidad de curar de alrededor de 30%. En cambio los que recaen intratratamiento, en especial mdula sea en el primer ao, aunque remitan tienen baja posibilidad de curar con la quimioterapia, por lo que en ellos se utiliza el trasplante de clulas hematopoyticas. c) Efectos tardos del tratamiento. Con el gran
nmero de nios curados de LLA se ha hecho evidente que hay efectos tardos secundarios a la quimioterapia y radioterapia. El reconocerlos ha sido muy importante para adecuar los tratamientos en uso tratando de evitar dicha toxicidad y tambin para cuidar la calidad de vida de los pacientes que ya la presentan: Secuela en SNC. Los pacientes que reciben radioterapia de crneo en dosis de 24 Gy o ms, pueden presentar atrofia cerebral, dilatacin de ventrculos y calcificaciones, demostrado en los estudios neurorradiolgicos. Sin embargo, es muy raro el dficit neurolgico. En cambio tienen una alta incidencia de dficit cognitivos que se traducen en trastornos de aprendizaje, especialmente si recibieron la radioterapia en los primeros aos de vida. Esto es lo que ha motivado la disminucin de las dosis en los protocolos actuales y el uso slo en los pacientes con alto riesgo de recada en SNC. An no est bien establecido el efecto tardo de la quimioterapia intratecal ni de las dosis elevadas de quimioterapia sistmica. Crecimiento. Pueden presentar talla baja los nios que recibieron radioterapia de crneo antes de los 4 aos y en dosis de 24 Gy o ms. En ellos se detecta un dficit de hormona de crecimiento. La ganancia de peso en cambio se mantiene estable y puede ser excesiva llegando a obesidad en un nmero importante de nios curados, est relacionada con muchos factores como los sicolgicos y la sobreproteccin familiar. Cardacos. Las antraciclinas pueden producir cardiotoxicidad tarda con anormalidad del llene de ventrculo izquierdo y disminucin de la contractibilidad. A menor edad del paciente el riesgo aumenta y se relaciona tambin con la
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dosis total usada. Generalmente son asintomticos pero deben ser evaluados, porque frente a grandes esfuerzos hacen insuficiencia cardaca, como por ejemplo en relacin a trabajo de parto o deportes intensos. Gnadas. Si no se ha irradiado gnadas lo habitual es una pubertad normal con reporte de numerosos embarazos normales. El riesgo de enfer medades malignas en los descendientes ha sido igual que en la poblacin general, y tampoco tienen mayor frecuencia de anomalas congnitas. La irradiacin de testculos (recada) requiere terapia de sustitucin hormonal en la pubertad y se asocia a esterilidad. d) Segunda malignidad. El riesgo es menor que en los tumores slidos. Lo ms frecuente es la presencia de tumores cerebrales, los que se han asociado a la radioterapia de crneo usada, tambin puede haber cncer de tiroides secundario a exposicin a bajas dosis de radioterapia. Se ha observado tambin leucemia mieloide aguda relacionado con uso de epipodofilotoxinas y asociado a anomalas estructurales del cromosoma 11 en regin q23, el riesgo es mayor si se usa en forma semanal.
Margolin, J., Steuber, C., Poplack D. Acute lymphoblastic leukemia en Principles and Practice of Pediatric Oncology. Pizzo P., Poplack, D., Fourth edition. Philadelphia Lippincott Williams & Wilkins, pp 488-544, 2002. Ortega, J.J. Leucemias agudas en nios en Tratado de Pediatra. Cruz, M. Octava Edicin. Madrid. Ediciones Ergon, pp 1482-1493, 2001. Schrappe, M., Reiter, A., Zimmermann, M. et al. Long term results of four consecutive trials in childhood ALL performed by the ALL BFM study group from 1981 to 1995, Leukemia 14: 2205-22,2000
LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS Jorge Alfaro L. 1. INTRODUCCIN Se denomina leucemia mieloide aguda (LMA) a un conjunto de enfermedades neoplsicas, caracterizadas por la proliferacin de clulas malignas, denominada blastos, que se acumulan en mdula sea y sangre perifrica. De origen clonal, estos blastos poseen una destinacin (committed) mieloide. El diagnstico segn la Organizacin Mundial de Salud (OMS), requiere de la presencia de 20% o ms de blastos en mdula sea. Este criterio de 20% entra a modificar lo estipulado por la clasificacin Franco-Amrico- Britnico (FAB) que estableca un 30% como criterio diagnstico. El diagnstico diferencial de una leucemia aguda se realiza mediante una serie de estudios complementarios entre s: morfolgico con tincin corriente de hemograma (May-Grunwald Giemsa), inmunofenotipo, citogentica, biologa molecular y, en algunos casos citoqumico, es esencial para la correcta tipificacin de una LMA. La informacin que se recolecta en la fase diagnstica de la enfermedad es vital, pues permite seguir la respuesta al tratamiento y definir categoras pronsticas; esta informacin ser importante en el establecimiento del pronstico y tratamiento. 2. EPIDEMIOLOGA La LMA aumenta su incidencia con la edad, con
LECTURAS SUGERIDAS Campbell, M., Ferreiro, M., Tordecilla, J. et al. Leucemia linfoblstica aguda. Caractersticas al diagnstico en 100 nios. Rev. chil. pediatr., jul. 1999, vol.70, no.4, p.288-293. Campbell, M., Salgado, C., Becker A. et al. Impr oved outcome in children with lymphoblastic leukemia in a developing country. Results of trial ALL PINDA 87. Med Ped Oncol 33: 88- 94, 1999. (Publicacin en paralelo Rev Chil Ped 70(5); 405-414, 1999). Ching-Hon, P. Childhood Leukemias. First Edition Cambridge University Press.The Edinburgh Building, Cambridge, UK,1999. Greaves, MA., Maia, A.T., Wiemels, J.L., Ford, A.M. Leukemia in twins: lessons in natural history Blood, 102 (7): 2321-2333,2003. Mahoney, Jr. D. Acute lymphoblastic leukemia in childhood en Oski, F., Principles and Practice of Pediatrics. Second Edition. Philadelphia.JB. Lippincott Company, pp 17011709, 2000.
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menos de 1:100.000 habitantes/ao para menores de 30 aos a 14:100.000 a los 75 aos, constituyendo la principal causa de leucemia aguda en adultos, a diferencia de los nios donde predominan las leucemias linfoblsticas. 3. ETIOLOGA La etiologa de las LMA es desconocida, existen factores genticos predisponentes, que suelen observarse en enfermedades congnitas como la anemia de Fanconi, sndrome de Down, ataxia telangiectasia, y mayor probabilidad entre hermanos univitelinos. Como causa externa est descrito las radiaciones provenientes de accidentes nucleares, y algunos txicos como el benceno en trabajadores expuestos a este diluyente. No se han identificado virus como en variedades linfoblsticas de leucemia, tal como el HTLV-1 con el sndrome leucemia linfoma o, el linfoma de Burkitt con el virus de Epstein Barr (VEB). 4. PRESENTACIN CLNICA Los sntomas clnicos relacionados con la LMA derivan de la infiltracin de la mdula sea con aparicin de pancitopenia, y de la infiltracin de algunos tejidos dependiendo de la variedad. Un 80% de los pacientes presentan anemia de intensidad variable, normoctica normocrmica, prpura cutneo y en mucosas, asociados a la trombocitopenia en el 60% de los casos. La manifestacin hemorrgica puede llegar a ser
ms intensa cuando se presenta una coagulacin intravascular diseminada (CID), con un importante componente fibrinoltico como ocurre en la LMA promieloctica (7590% de los casos), pero que tambin puede ocurrir en las variantes M1, M2, M4, M5 (ver punto 5). La mitad de los pacientes presenta fiebre, que al diagnstico debe ser atribuida a infeccin relacionada a neutropenia severa. La mediana de leucocitos es de 15-20 x 103/L y en el 85% se observan blastos en la sangre perifrica. En los casos pacientes de hiperleucocitosis (10% de los casos) con ms de 100 x 109/L se producen sntomas a nivel de SNC y pulmn. En estos casos se producen alteraciones en el procesamiento de las muestras, por el metabolismo propio de los blastos, por ejemplo la medicin de gases en sangre arterial se ve alterada y, no refleja la condicin clnica del paciente. A nivel de piel, se puede observar infiltracin o leucemides, siendo ms frecuente en las LMA M4 y M5, al igual que la hiperplasia de las encas. 5. CLASIFICACIN DE LAS LMA 5.1. Clasificacin segn criterios FAB La clasificacin ms usada para las LMA es la FAB, diseada en 1976 y, sujeta a varias modificaciones hasta quedar ms o menos establecida como en la tabla 12-LMA-1.
Tabla 12-LMA-1 Clasificacin FAB de las leucemias mieloides agudas Sub tipo FAB M0 M1 M3 M3v M4 M4Eo M5a M5b M6 M7 Denominacin LMA con mnima diferenciacin mieloide LMA sin maduracinM2LMA con maduracin L. promieloctica aguda L. promieloctica aguda variante microgranular L. mielomonoctica aguda L. mielomonoctica aguda variante eosinfila L. monoblstica aguda (> 80% monoblastos) L. monoctica aguda (< 80% monoblastos) Eritroleucemia L. megacarioblstica
FAB, Franco-Amrico-Britnico; LMA, leucemia mieloide aguda; L, leucemia.
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La clasificacin reconoce once subtipos, que se definen a continuacin: 5.1.1. Leucemia mieloide aguda con mnima diferenciacin (M0) Los blastos leucmicos son muy indiferenciados, y constantemente son negativos para mieloperoxidasa (MPO), sudan negro. El diagnstico se basa en la positividad de la mieloperoxidasa a nivel ultraestructural y el inmunofenotipo mieloide CD13 y/o CD33 por citometra de flujo. Tambin son negativos para antgenos de diferenciacin linfoide B y T. Seran aparentemente de peor pronstico debido a que afecta a pacientes en edad avanzada y formas hipocelulares de esta enfermedad. 5.1.2. Leucemia mieloide aguda sin maduracin (M1) Se caracteriza por una infiltracin de blastos mieloides, generalmente mayor a 90% de las clulas no eritroides. Se exige al menos un 3% de blastos mieloperoxidasa positivos. En ocasiones estos blastos pueden presentar bastones de Auer, que corresponden a grnulos primarios con forma de aguja. Esta forma de inclusin es considerada patognomnica de leucemia mieloide aguda. El inmunofenotipo caracterstico es CD33 (+), CD13 (+), CD11b (+), MPO (+), El 10% puede expresar el marcador linfoide CD7 y TdT. 5.1.3 Leucemia mieloide aguda sin maduracin (M2) Es un grupo heterogneo, que comprende todas aquellas LMA con 10% o ms de elementos de diferenciacin mieloide y menos de 20% de componente monoctico. Son frecuentes los bastones de Auer y algunos elementos displsticos. Un 18% de las LMA M2 poseen la t(8;21). 5.1.4. Leucemia promieloctica aguda (M3) La leucemia promielictica constituye el 10-15% de las LMA. Morfolgicamente los blastos promielocticos se caracterizan por la presencia de abundantes bastones de Auer, en empalizada. El ncleo del promielocito es lobulado o posee escotadura, siendo esto ms evidente en la variante hipogranular de la enfermedad. Las clulas son MPO intensamente positivas y expresan CD33 y CD13, pero son negativas para HLA-DR. Esta caracterstica es muy importante al momento del diagnstico
diferencial con las otras variedades de LMA. La citogentica de la LMA M3 es diagnstica, y corresponde a la translocacin recproca de los cromosomas 15 y 17 t(15;17) (q22;q12), aunque existen variantes de menor frecuencia como la t(11;17) y la t(5;17). En la translocacin tpica est involucrado el gen PML en el cromosoma 15 y el Receptor alfa del cido transretinoico en el cromosoma 17. Es a este nivel donde acta de manera especfica el cido transretinoico, utilizado en el tratamiento de esta variedad de LMA y que, induce diferenciacin de los blastos, disminuyendo los trastornos hemostticos asociados a esta enfermedad y mejorando significativamente la sobrevida de los pacientes. La ditesis hemorrgica asociada a la LPA es pr obablemente uno de los trastor nos hemorrgicos ms dramticos de la medicina, donde se conjugan una serie de factores entre los que se encuentran una intensa activacin de la fibrinolisis, asociada a la trombocitopenia y CID. En la clasificacin ms reciente de las LMA patrocinada por la OMS (punto 5.2.), esta variedad pasa a constituir una LMA con alteracin citogentica especfica. 5.1.5 Leucemia mielomonoctica aguda (M4) La variedad M4 posee una mezcla de blastos de origen monoctico y de origen granuloctico. Expresa intensamente HLA-DR y marcadores tanto mielocticos (CD11b, CD13) como monocticos (CD15, CD14). Para entrar en esta variedad debe tener ms de 30% de blastos de origen granuloctico y ms de 20% de monoblastos. Las alteraciones citogenticas corresponden a trisoma 4, inv(3), del (5), t(6;9) que fusiona el gen CAN con el gen DEK. La variante eosinoflica de la enfermedad, FAB M4Eo es descrita por la OMS como LMA con alteracin citogentica especfica del cromosoma 16(16q;22) siendo ms frecuente la inv(16) seguida de la t(16;16) y del(16). Corresponde al 5% de las LMA y a un 20% de las LMA M4. 5.1.6. Leucemia monoblstica aguda (M5) Para su diagnstico se requiere que al menos un 80% de las clulas no eritroides correspondan a blastos de origen monoctico. En la clasificacin FAB se distinguen: (a) M5a variedad poco diferenciada o monoblstica,
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donde el 80% de las clulas corresponde a blastos monocticos, peroxidasa (-), esterasa (+) inhibicin por fluoruro (+) y (b) variedad M5b o forma diferenciada, predomina los monocitos y promonocitos, con su caracterstica forma de ncleo arrionado y citoplasma grisceo. En caso de observarse imgenes de eritr ofagocitosis, puede encontrarse la translocacin t(8;16). Las leucemias monoblsticas se asocian con alta frecuencia a manifestaciones extramedulares, con infiltracin importante de encas, ganglios, hepato-esplnica, pulmonar y compromiso de SNC, por lo que debe de administrarse quimioprofilaxis con intratecales en todos los casos. El inmunofenotipo caracterstico es CD13(+), CD33(+), CD14(+), CD68(+), CD4(+), HLADR(+). 5.1.7. Eritroleucemia (M6) Es una proliferacin mixta de eritroblastos y blastos de origen eritroide. El diagnstico se basa en ms de 50% de eritroblastos en mdula sea y al menos un 30% de las clulas no eritroides sean blastos. Corresponde a un 4% de las LMA. En mdula sea es posible observar una intensa displasia eritropoytica, megaloblastosis y PAS positivos. Tambin es posible reconocer dos variedades: (a) M6a con maduracin, que no posee hiato de maduracin eritroide y (b) M6b sin maduracin que posee ms de un 25% de proeritr oblastos y eritroblastos basfilos. El inmunofenotipo de los blastos expresa glicoforina A, hemoglobina A, CD71(+), CD36(+), expresin de antgeno de grupos sanguneos A, B, Rh D. Las alteraciones citogenticas suelen ser complejas afectando a los cromosomas 1, 5, 7, 8 y 21.
5.1.8. Leucemia megacarioblstica aguda (M7) Esta variedad representa el 8% de las LMA. Afecta a nios con sndrome de Down y a adultos, como manifestacin de mielodisplasias transformadas o evolucin de mielofibrosis. Se asocia con frecuencia a fibrosis medular intensa, lo que dificulta la obtencin de muestras por aspiracin medular. Por esta caracterstica se le denomina tambin mielofibrosis aguda. El diagnstico de certeza requier e inmunohistoqumica, con positividad para glicoprotenas plaquetarias CD41 (GPIIb), CD42 (GPIb), CD61 (GPIIIa) y la evidencia ultraestructural de peroxidasa plaquetaria. Tambin son tiles la presencia en superficie de FVIII, betatromboglobulina, factor 4 plaquetario. El pronstico en el adulto es sombro. 5.2. Clasificacin segn criterios OMS El principio bsico de esta clasificacin es utilizar, no solamente los elementos morfolgicos, sino toda la informacin disponible, incluida la gentica, inmunofenotipo, y elementos clnicos y biolgicos que definan, de ser posible, enfermedades especficas. El recuento de blastos se realiza en 200 clulas en frotis de sangre perifrica y 500 clulas en los aspirados de mdula sea. Para pr opsito de la clasificacin se denomina blasto a la clula inmadura y tambin a elementos ms difer enciados pero r econocidamente neoplsicos, por ejemplo los promielocitos en las LPA y los monoblastos y promonocitos en las LMA mielomonoblsticas. Estos son denominados equivalentes blsticos para propsitos de los recuentos y porcentajes. La clasificacin OMS identifica LMA en cuatro grupos (tabla 12-LMA- 2)
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Tabla 12-LMA-2. Clasificacin de las LMA segn OMS LMA con alteraciones citogenticas recurrentes LMA con t(8;21)(q22;q22), (AML1/ETO) LMA con eosinfilos e inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q22), (CBFB/MYH11) Leucemia promieloctica aguda con t(15;17)(q22;q11), (PML;RAR alfa) LMA con alteraciones 11(q23) LMA con displasia de varias lneas Secundarias a SMD o SMP Sin antecedentes de SMD o SMP pero con displasia de al menos 50 % de las clulas, de al menos dos lneas celulares. LMA y SMD relacionados a quimioterapia Tipo alquilante/radiacin Relacionado uso de inhibidores de topoisomerasa LMA no categorizadas LMA, mnimamente diferenciada LMA sin maduracin LMA con maduracin LMA mielomonoctica LMA monoctica Leucemia aguda eritroide Leucemia aguda megacarioblstica Leucemia aguda basoflica Panmielosis aguda con mielofibrosis Sarcoma mieloide
LMA, leucemia mieloide aguda; SMD, sndrome mielodisplstico; SMP, sndrome mieloproliferativo.
La OMS recomienda anlisis de cariotipo, hibridizacin con fluorescencia in situ (FISH) y estudio con reaccin de polimerasa en cadena (PCR) con transcriptasa reversa (RT-PCR), para definir gnicamente algunas entidades. El umbral para una LMA se reduce a un 20% de blastos en mdula o sangre y, en los casos de LMA con alteraciones citogenticas recurrentes, se considera LMA independientemente del porcentaje de blastos. Esta disminucin de 30 a 20% se debe a que no existen diferencias en la respuesta teraputica ni sobrevida global en todos aquellos pacientes que al diagnstico poseen entre 20 y 29% de blastos, que en la previa clasificacin FAB se denominaba como sndrome mielodisplstico (SMD) tipo anemia refractaria con exceso de blastos en transformacin (AREB-T). 5.2.1. LMA con alteraciones citogenticas recurrentes El 30% de las LMA caen en esta categora, existiendo una intensa asociacin entre las alteraciones t(8;21), t(15;17), inv(16) o t(16;16) con la morfologa. A manera de ejemplo esta
ltima alteracin del cromosoma 16 se relaciona en un 30-100 % de los casos con una LMA M4Eo. Coincide adems esta categora con las LMA de buen pronstico, pues en conjunto obtienen cerca de un 80% de sobrevida libre de enfermedad (SLE). 5.2.2. LMA con displasia multilineal El diagnstico es relativamente sencillo cuando el paciente tiene historia previa de SMD o sndrome mieloproliferativo (SMP) en los 6 meses previos a la crisis de LMA. La dificultad radica cuando es un cuadro de novo, en esta situacin la presencia de displasia de varias lneas celulares sera el marcador ms confiable. El criterio OMS exige 50% de las clulas de determinada lnea con displasia. El pronstico de esta variedad de LMA es malo, con escasa respuesta a los tratamientos quimioterpicos. 5.2.3. LMA y sndromes mielodisplsicos relacionados a tratamiento Se reconocen dos tipos de entidades: (a) relacionada con agentes alquilantes y radiacin
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y (b) relacionada a inhibidores de topoisomerasa. En la primera situacin la alteracin ocurre a 4-7 aos de la exposicin del agente mutagnico; aproximadamente dos tercios presenta mielodisplasia y el porcentaje restante como LMA con elementos displsticos. En la segunda situacin se presenta como LMA de novo con componente monoctico, siendo la latencia entre la exposicin al agente y la enfermedad de 6 meses a 5 aos. 5.2.4. LMA no categorizada En esta categora se encuentran todas las LMA no mencionadas en las categoras anteriores y es semejante a la clasificacin FAB, sin embargo se ha omitido la LPA y se aaden categoras antes no mencionadas: el sarcoma granuloctico o cloroma, la mielofibrosis aguda y la leucemia basoflica aguda. 6. FISIOPATOLOGA Ms de 200 translocaciones cromosmicas y otras mutaciones han sido descritas en LMA, confirmando que se trata de una mezcla de difer entes enfer medades cuyo comn denominador es la infiltracin blstica de mdula sea, sangre y eventualmente otros tejidos. Para que esto se produzca se requieren de al menos dos eventos: Uno es el aumento de la proliferacin celular y el otro la detencin en la
maduracin, as se tiene una clula de origen clonal que se encuentra detenida en una fase de alto potencial proliferativo, ocupa los espacios medulares, inhibe la hematopoyesis normal, y explica la velocidad de presentacin clnica de la enfermedad. Tal como se estudian las leucemias en su fase diagnstica, las distintas tcnicas empleadas muestran los blastos desde perspectivas diferentes y complementarias. El estudio citogentico permite clasificar a las LMA segn categoras de riesgo, y los estudios moleculares acercan hacia los mecanismos involucrados y probablemente las nuevas formas teraputicas que debern desarrollarse a travs de este conocimiento. 6.1. Citogentica de las LMA Las actuales modalidades teraputicas en pacientes menores de 60 aos, ofrecen una probabilidad de un 80% de obtener remisin completa. Sin embargo solo un 70% se mantendr en remisin a los 5 aos de seguimiento, siempre y cuando corresponda a una de las categoras citogenticas de buen pronstico (tabla 12-LMA-3). Si las alteraciones citogenticas son de mal pronstico, este porcentaje cae a un 22%. Adems globalmente los pacientes mayores de 60 aos, poseen solo un 10% de sobrevida global a los 5 aos.
Tabla 12-LMA-3. Clasificacin pronstica de las LMA, segn anlisis citogentico Riesgo Nmero Recada (%) 28 49 50 70 80 Sobrevida a 5 aos % 74 18 10 12 9 Alteracin citogentica/molecular t(8:21)o AML1/ETO t/inv/del (16)(p13;q22) o MYH11/CBF
Favorable Intermedio Desfavorable A B RC tarda Citogentica desfavorable
86 17 457 207 70
>3 anormalidades clonales diferentes. -7, -5 del 5q, del 7q Abn 3q T(6;9)(q23;q34) o DEK/CAN Abn 11q23 T(9;22) o BCR/ABL
A, Riesgo citogentico favorable, pero con leucocitos > 20.000/L, o alteracin citogentica desfavorable adicional. B, Sin citogentica favorable o desfavorable, pero con RC post induccin RC, Remisin completa Dutch-Belgian Hemato-Oncology Cooperative Group HOVON and Swiss Leukemia Group SAKK.
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El conocimiento de las alteraciones genticas que acompaan a una LMA permite establecer distinto origen patognico y distinto pronstico, el que hay que considerar al momento de disear la estrategia teraputica. t(8;21)(q22;q22) o AML1/ETO En condiciones nor males, el gen AML1 (cromosoma 21q22) codifica para una protena que une DNA en una secuencia conocida TGTGGT, para que esto se lleve a cabo requiere formar un heterodmero con CBF (cromosoma 16q22). Una vez que se ha formado el complejo, se reclutan coactivadores que permiten la transcripcin. Esta seal se ve afectada en la t(8;21), donde el oncogn ETO (cromosoma 8q22) se une a AML1 y bloquea la accin de los coactivadores, impidiendo que los genes target se activen. La t(8;21) se encuentra aproximadamente en el 40% de las LMA FAB M2, pero no est restringida a este subgrupo. t/inv/del(16)(p13;q22) o CBF-MYH11 Otra manera de afectar el rol fisiolgico del heterodmero AML1-CBF es a travs de la inversin del cromosoma 16 (p13;q22), o una t(16;16) (p13;q22). El resultado es una protena quimrica CBF-MYH11 que inhibe directamente la transcripcin mediada por AML1. La inv(16) o t(16;16) es ms frecuente en la LMA
FAB M4Eo, aunque no es patognomnica de esta variedad. Alteraciones del cromosoma 11q23 o gen MLL (Mixed lineage leukemia) Esta alteracin puede verse en todos los tipos de LMA pero es ms frecuente en las variedades FAB M4 y M5. Aunque se han descrito ms de 30 diferentes locus que participan en esta translocacin, las ms frecuentes parejas de 11q23 son: 6q27, 9q22, 10p12, 17q21, 19p13.1. MLL interacta con una antifosfolipasa denominada Sbfl, que tendra un rol de regulador positivo en la va de seales de las kinasas. Las alteraciones del cromosoma 11(q23), suelen observarse en el 6-8% de las LMA y en el 85% de las LMA secundarias al uso de inhibidores de topoisomerasa II. 6.2. Marcadores moleculares en las LMA Desde el punto de vista molecular, existen varios mar cador es identificados que poseen implicancias pronsticas (tabla 12-LMA-4). A diferencia de las alteraciones citogenticas, las alteraciones moleculares son detectadas con tcnicas ms sensibles como la PCR. Entre estas alteraciones llama la atencin las mutaciones de FTL3, que est en un 30% de las leucemias mieloides y, puede verse asociado a otras alteraciones citogenticas. Tambin es de inters la posibilidad de encontrar inhibidores ms o menos especficos.
Tabla 12-LMA-4. Marcadores moleculares con significado pronstico adicional al anlisis citogentico Marcador Frecuencia (%) 11-32 4.5 8 36 10 11 Sobrevida Desfavorable Desfavorable NS Desfavorable Desfavorable Favorable Referencia Kondo et al, Frhling et al Nakano y et al Dhner y et al Karakas y et al Van Waalwijk y et al Preudhomme y et al
FTL3-ITD
Mutacin p53 Duplicacin en tandem MLL Alta expresin mRNA BCL2 y WT1 Alta expresin mRNA Evl1 Mutacin de CEBP
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Activacin de tirosina kinasa FTL3 Los receptores de membrana son esenciales para que la clula reciba los estmulos extracelulares y, genere una cascada de eventos intracelulares. De stos, la familia de los receptores tirosina kinasa poseen un rol fundamental. For mados por un dominio extracelular que une al ligando, uno transmembrana y un intracelular con actividad intrnseca de tirosina kinasa, es decir activan mediante fosforilacin a otras protenas modulando de esta manera las vas mensajeras intracelulares. FLT3 es un receptor de tirosina kinasa expresado en clulas hematopoyticas inmaduras y de vital importancia para el desarrollo de las stem cell y del sistema inmune. Pertenece a la familia de receptores de tirosina kinasa clase III, que incluyen a FLT3, FMS, PDGFR y Kit. Se encuentra mutado en el 30-35% de las LMA, y est asociado a un peor pronstico, aunque esta observacin debe ser validada. La mutacin ms frecuentemente encontrada es la duplicacin en tandem de pequeos fragmentos yuxtamembrana, que condiciona una actividad permanente constitutiva, produciendo junto a otr os oncogenes activados el sndrome mieloproliferativo. Tambin es posible que se encuentre alterado el sitio cataltico propiamente tal, mediante la sustitucin D835Y, donde un cido asprtico (D) es reemplazado por una tirosina (Y). Existe un enorme inters en producir inhibidores de FLT3, tanto por su alta frecuencia de alteracin en LMA, como por su asociacin con peor pronstico. En la actualidad existen varios productos reportados en ensayos clnicos fase I o II incluyendo: CEP-701, CT53518, SU5614, SU11248, PKC412. Cada uno de ellos disponibles oralmente con una potente inhibicin de FTL3. Ninguno de ellos es absolutamente especfico para FLT3, debiendo evaluarse en ensayos clnicos los efectos secundarios producto de la inhibicin de otras protenas y cul va a ser su rol en el tratamiento de estas patologas. C/EBP (CCAAT enhancer binding protein alpha) C/EBP es un factor de transcripcin que induce diferenciacin granuloctica de los precursores mieloides. Al estar mutado, no se producira la diferenciacin, quedando las clulas detenidas en un estado de blasto. Su efecto se hace sentir
principalmente en clulas con diferenciacin mielomonoctica. Estudios de transfeccin, muestran a C/EBP regulando los promotores de varios genes especficos de los granulocitos. La frecuencia de mutaciones de C/EBP es mayor en la variedad FAB M2 con citogentica normal. La t(8;21) que tambin es ms frecuente en esta variedad de LMA, produce una disminucin de la funcin C/EBP, a niveles que la hacen insuficientes para la diferenciacin granuloctica. Esto hace pensar en una va comn en la patognesis de la LMA. Es posible encontrar esta mutacin en el 15% de las LMA. Expresin gnica analizada mediante microarreglos El microarreglo (microarray) corresponde a un tcnica de biologa molecular que permite observar la expresin de mRNA de miles de genes de una clula en especial, y formar patrones de genes que se expresan ms, menos o igual que los controles. No analiza mutaciones gnicas, a menos que stas se correspondan con la expresin mRNA de uno o ms genes, que deben ser analizados mediante programas estadsticos computacionales, donde se comparan miles de genes clasificados segn rol en los procesos celulares. Los resultados preliminar es utilizando microarreglos en pacientes portadores de LMA indican que no existira tanta heterogeneidad entre las LMA como se supona. Ms bien existe una redundancia en las vas que regulan la proliferacin o maduracin de los blastos leucmicos, sugiriendo la existencia de relativamente pocas vas o mecanismos para desarrollar el fenotipo leucmico y est la mayora de ellos relacionados a alteraciones ya conocidas: t(15;17), t(8:21) e inv 16. El aporte de esta tcnica est dado por identificar grupos de pronstico diferente, posibilita identificar nuevos genes relacionados a alteraciones especficas y requiere un escaso nmero de pacientes para lograr resultados estadsticamente significativos. 7. TRATAMIENTO El tratamiento de las LMA no ha mostrado resultados tan espectaculares como los avances en el conocimiento inmunolgico y gnico de estas enfer medades. Excepto en LPA, la
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quimioterapia se ha mantenido ms o menos constante. La LMA es una enfermedad rpidamente progresiva, al momento diagnstico si no se trata es letal en el curso de das o semanas, por lo tanto de no existir una contraindicacin de peso, el tratamiento debe ser rpidamente instaurado. La quimioterapia en una LMA posee fase de induccin, consolidacin o intensificacin y mantencin. 7.1. Quimioterapia 7.1.1. Quimioterapia de induccin Los protocolos de quimioterapia de induccin incluyen una antraciclina ms arabinsido de citosina, siendo la pauta ms aceptada Daunorrubicina (DNR) 4560 mg /m2 por tres das y Ara-C 100-200 mg/m 2 en infusin continua por 7 das. Este esquema es conocido como 3+7. Con este esquema las tasas de remisin se encuentran entre 60-70%. Algunos aspectos referentes a modificaciones de este protocolo: Tercer frmaco. Se ha intentado aadir un tercer frmaco a este esquema, por ejemplo 6-tioguanina, sin embargo no ofrece ventajas en remisin completa (RC) respecto al esquema clsico y ha sido abandonado. El asociar etopsido en dosis de 75100 mg/m2 por 7 das ha sido intentado por el grupo ingls del Medical Research Council y el australiano (ALSG) sin aadir mejoras respecto al clsico 3+7, por lo tanto tampoco se utiliza en la fase de induccin. Otras Antraciclinas, como la doxorrubicina (adriamicina), mitoxantrona (MTZ) e idarrubicina (IDR) pueden ser usadas e intercambiadas sin alterar la eficacia del tratamiento, en estos casos es importante considerar que la doxorrubicina en estas dosis produce ms mucositis y no debiera elegirse en LMA. La mitoxantrona posee resultados comparables. La idarrubicina no sera mejor que la daunorrubicina siempre que se usen dosis equivalentes, en este caso 12 mg/m2 de IDR con 60 mg/m2 de DNR. Dosis de Ara-C, en induccin no se ha demostrado que las dosis intermedias 500 mg o altas 1 a 3 g/m2 mejoren la tasa de RC en LMA, estas dosis son tiles en los tratamientos de consolidacin. Una variante que se utiliza es la intensificacin secuencial, que consiste en determinar el porcentaje de blastos en el da + 15 de la quimioterapia, de ser mayor a un 5%, si indica altas dosis de AraC 1-3 g/m2, cada 12 horas en infusiones de 1 hora por 68 dosis.
A modo de resumen, la fase de induccin de quimioterapia el esquema clsico de 3+7 sera el indicado usando la dosis mxima de DNR. En caso de no lograrse una rpida reduccin de los blastos se puede intensificar de manera secuencial durante la induccin, logrando una mejor tasa de RC, cercana al 90 %. 7.1.2. Consolidacin/ intensificacin Se habla de consolidacin cuando se administra quimioterapia en pacientes en RC postinduccin con dosis semejantes o reducidas en relacin a la induccin y de intensificacin cuando se usa altas dosis de Ara-C (ADAra-C). En un trabajo donde se observa bien este efecto es en el publicado por el CALGB (Mayer y et al) en un estudio que incluy 596 pacientes que haban obtenido RC; se trataron aleatoriamente en tres grupos con 100 mg/m2, 400 mg/m2 y 3 g/m2. El grupo 100 y 400 recibi 5 das de tratamiento en infusin continua y el grupo de ADAra-C 6 dosis fraccionada cada 12 horas, das 1, 3, 5. La SLE a los 4 aos fue de 21%, 29% y 44% respectivamente. Se administran entre 23 ciclos de quimioterapia de intensificacin. 7.1.3. Mantencin La mantencin o ciclos de quimioterapia durante los 2-3 aos posteriores a la induccin de remisin no ha demostrado ser til en LMA, a diferencia de la leucemia linfoblstica aguda. 7.2. Trasplante de progenitores hematopoyticos (TPH) La mejor consolidacin de una LMA es la quimioterapia ablativa y rescate con pr ogenitores hematopoyticos, ya sea alognicos o autognicos. Esta forma radical de tratamiento no es sin embargo innocua debido al alto riesgo del procedimiento, a la toxicidad de las drogas y, en el caso de un alotrasplante a la enfermedad de injerto contra husped (GVHD). Por esta razn se excluyen de trasplante en primera remisin completa aquellas LMA de buen pronstico como son las con alteraciones citogenticas recurrentes: t(15;17), t(8;21), t(16;16) e inv 16. Todas ellas deben ser consolidadas de la manera estndar, menos la t(15;17) que posee una modalidad propia de induccin, consolidacin, mantencin y rescate en caso de recadas. Las otras LMA, en caso de tener menos de 50 aos y contar con un donante familiar HLA compatible deben ser trasplantadas en primera remisin, que es donde se obtienen los mejores resultados a largo plazo. En
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pacientes mayores, estara indicado el trasplante con tcnica no mieloablativa. Al decidir qu paciente debe ser sometido a un TPH, es necesario considerar los factores pronsticos asociados, siendo factores de mal pronstico los relacionados a LMA secundarias, mayores de 60 aos, leucocitosis mayor a 50.000/L, tipo FAB M0, M5, M6, M7, alteraciones citogenticas 3q, -5, 5q-, -7, alt 11q23, t(9;22), dificultad para entrar en RC. En todos estos casos es indispensable someter al paciente a trasplante alognico lo antes posible al alcanzar la remisin. Trasplante autognico. Existen pocos trabajos comparativos entre consolidacin con autotrasplante vs. quimioterapia convencional, siendo la mayora de ellos favorable a realizar el procedimiento. El xito de esta modalidad teraputica depende de la quimioterapia utilizada en la movilizacin, donde el objetivo central es tratar de obtener progenitores no contaminados. LECTURAS SUGERIDAS Baer, M. Manegement of unusual presentations of acute leukemia. Hematology/Oncology Clinics of North America, 7 (1); 275-292,1993. Bennett, J., Catovsky, D., Daniel, M., Flandrin, G., Galton, D., Gralnick, H., Sultan, C. Proposal for the classification of acute leukemias. Br J Haematol, 33, 451-459, 1976. Bennett, J., Catovsky, D., Daniel, M., Flandrin, G., Galton, D., Gralnick, H., Sultan, C. Proposal for the recognition of minimally differentiated acute myeloid leukemia (AML-M0). Br J Haematol, 78, 325-329, 1991. Burnett, A., Goldstone, A., Steven, R., Hann, I., Rees, J., Gray, R., et al. Randomized comparison of addition of autologous bone-marrow transplantation to intensive chemotherapy for acute myeloid leukemia in first remission: results of MRC AML 10 trial. Lancet; 351: 700-708, 1998. Cassileth, P.A., Harrington, D., Appelbaum, F.R., Lazarus, H., Rowe, J., Paietta, E. et al . Chemotherapy compared with autologous or allogeneic bone marrow transplantation in the management of acute myeloid leukemia in first remission. N Engl J Med; 3639:1649-1656, 1998.
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HEMATOLOGA
Captulo
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SNDROMES MIELOPROLIFERATIVOS CRNICOS

Guillermo J. Ruiz-Argelles, Guillermo J. Ruiz-Delgado y Guillermo Ruiz-Reyes
1. Introduccin 2. Leucemia granuloctica crnica 2.1. Anatoma patolgica 2.2. Etiopatogenia 2.3. Fisiopatologa y cuadro clnico 2.4. Diagnstico 2.5. Curso, tratamiento y pronstico 2.6. Pronstico 3. Policitemia vera 3.1. Patogenia 3.2. Epidemiologa 3.3. Datos clnicos 3.4. Estudios de laboratorio 3.5. Diagnstico 3.6. Tratamiento 4. Trombocitosis primaria 4.1. Patogenia 4.2. Datos clnicos 4.3. Estudios de laboratorio 4.4. Tratamiento 5. Mielofibrosis con metaplasia mieloide agnognica 5.1. Patognesis 5.2. Epidemiologa 5.3. Datos clnicos 5.4. Estudios de laboratorio 5.5. Tratamiento
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RESUMEN
Los sndromes mieloproliferativos malignos son un grupo de padecimientos clonales que suponen la produccin desordenada y descontrolada de elementos de la serie mieloide, eritroide o tromboctica en la mdula sea. La leucemia granuloctica crnica supone la proliferacin principalmente de clulas mieloides y es la nica de estas condiciones en la que ocurre la translocacin recproca y balanceada de material gentico de los brazos largos de los cromosomas 9 y 22. La trombocitosis primaria supone la produccin desordenada de megacariocitos y plaquetas; la policitemia rubra vera se caracteriza por produccin aumentada de clulas eritroides, mieloides y megacariocitos, en tanto que en la mielofibrosis / metaplasia mieloide agnognica hay produccin exagerada de fibras de colgeno aparentemente en respuesta a la proliferacin de elementos de serie tromboctica. Todos estos padecimientos estn relacionados entre s, y tambin con la leucemia aguda mieloblstica, en la que puede culminar la evolucin natural de cualquiera de estas entidades. La necesidad que tenemos los mdicos de encasillar en diagnsticos diferentes a condiciones patolgicas relacionadas entre s, ha hecho esta divisin un tanto artificiosa de los sndromes mieloproliferativos malignos.
1. INTRODUCCIN Se llaman sndromes mieloproliferativos (SMP) crnicos los padecimientos caracterizados por mieloproliferacin monoclonal que involucra linajes mltiples, que conservan un grado variable de maduracin celular y que tienen el potencial para seguir una evolucin clonal. Los SMP agudos corresponden a las leucemias agudas mieloblsticas. De manera simplista, se pueden reconocer, segn la lnea celular
mayormente afectada, cuatro variedades de SMP crnicos: (a) Policitemia vera (PV), (b) Trombocitosis primaria (TP), (c) Leucemia granuloctica crnica (LGC) y (d) Mielofibrosis primaria con metaplasia mieloide agnognica (MF / MMA) La clasificacin de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) organiza las enfermedades mieloproliferativas segn se indica en la tabla 13-1.
Tabla 13-1. Clasificacin de las enfermedades mieloproliferativas segn la OMS Secuencia granuloctica crnica con cromosoma Philadelphia [t(9;22)(q34;q11), BCR/ABL] Policitenia vera Trombocitosis primaria Mielofibrosis primaria con metaplasia agnognica Leucemia neutroflica crnica Leucemia eosinoflica crnica / Sndrome hipereosinoflico Sndrome mieloproliferativo Estas enfermedades mieloproliferativas crnicas son de naturaleza clonal, primitivas y no secundarias a un estmulo de tipo infeccioso u hormonal. Su patogenia es diferente de la de las leucoeritroblastosis reactivas (antes llamadas reacciones leucemoides) o de las eritrocitosis originadas, por ejemplo, por produccin excesiva de eritropoyetina. El proceso proliferativo no est limitado en forma estricta a una sola lnea hematopoytica, sino que incluye en mayor o menor proporcin a varias lneas celulares. En la figura 13-1 se seala la interrelacin que existe entre todos los SMP crnicos y las leucemias agudas mieloblsticas. Las diversas lneas celulares implicadas en los SMP derivan de un ancestro comn indiferenciado o pluripotencial y no a la clula comprometida para producir eritrocitos, granulocitos o trombocitos; en este sentido los SMP deben considerarse como padecimientos
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malignos originados en las clulas pluripotenciales hematopoyticas (CPH) o clulas troncales (stem cells)
Tambin ocasionalmente se pueden observar casos en los que predomina alguna clula madura, y existen al menos cuatro subtipos: Leucemia eosinoflica crnica, leucemia basoflica crnica, leucemia monoctica crnica y leucemia neutroflica crnica. 2.1. Anatoma patolgica La clula proliferante no es una en especial, como en el caso de las leucemias agudas, sino todas las clulas hematopoyticas, si bien predomina la serie granuloctica. El estudio de la mdula sea es de poca utilidad para el diagnstico, ya que slo se observa hiperplasia granuloctica inespecfica en ausencia de un cuadro clnico y de laboratorio caracterstico. En ocasiones existe cierto grado de fibrosis, los elementos maduros de la serie granuloctica demuestran disminucin de la fosfatasa alcalina leucocitaria y el hallazgo ms consistente y especfico es la presencia del Ph1. La proliferacin de clulas se correlaciona con crecimiento esplnico y, en menor grado, heptico; tambin se pueden encontrar hematopoyesis extramedular en estos sitios. Pocas veces hay invasin a otros tejidos. 2.2. Etiopatogenia La causa y el origen de la LGC no se conocen. Se sabe que la frecuencia aument en la poblacin japonesa expuesta a la radiacin atmica en 1945. Existe menos evidencia que en la leucemia aguda en relacin con frmacos, agentes qumicos o factores hereditarios como causas directas de la enfermedad. Se ha demostrado que existen genes alterados, que directamente se relacionan con presencia y permanencia de la entidad, los cuales se conocen como oncogenes; sin embargo, el porqu aparecen dichos genes o las alteraciones cromosmicas de la enfermedad no se ha aclarado con certeza. 2.3. Fisiopatologa y cuadro clnico En ocasiones (10 a 20%), el diagnstico se hace cuando el paciente se encuentra asintomtico, en un estudio rutinario, ya que en el hemograma por regla general se encuentran ms de 30 x 109/L leucocitos y es frecuente encontrar cifras superiores a 100 x 109/L. La anemia puede no existir y cuando se presenta suele ser moderada (menos de 10% de los pacientes requiere transfusiones inmediatamente despus de realizado el diagnstico); las plaquetas suelen estar aumentadas en la mitad de los casos y la
Figura 13-1. Interrelacin de los sndromes mieloproliferativos agudos como la leucemia mieloide aguda (LMA) con los sndromes mieloproliferativos crnicos. Leucemia granuloctica crnica (LGC; Leucemia mieloide crnica, LMC), policitemia vera (PV), trombocitosis primaria (TP), mielofibrosis con metaplasia mieloide agnognica (MF/MMA) y sndromes mieloproliferativos (SMP) indiferenciados.
2. LEUCEMIA GRANULOCTICA CRNICA La LGC, tambin llamada leucemia mieloide crnica (LMC) o leucemia mielgena crnica, es una proliferacin neoplsica predominantemente de la serie granuloctica, aun cuando se observan alteraciones en la serie roja y en las plaquetas, lo que indica el origen de la entidad en la clula madre o pluripotencial. La enfermedad se ha relacionado con una anormalidad cromosmica, la translocacin balanceada recproca entre los brazos largos de los cromosomas 22 y 9: t (9q+;22q-) que se denomina cromosoma Philadelphia (Ph1), y que se observa en ms de 90% de los pacientes. La translocacin genera el gen quimrico BCR/ABL que codifica la produccin de una protena con accin de kinasa de tir osina. A nivel internacional se considera que la incidencia es de 1 1.5 / 100.000 habitantes La entidad se puede observar a cualquier edad, pero en los nios slo constituye 3% de las leucemias en general; su frecuencia aumenta gradualmente y predomina en adultos entre los 40-50 aos. Es ms frecuente en varones que en mujeres con una relacin de tres a dos. La LGC se puede clasificar clnicamente en: Tpica (Ph1 presente), atpica (Ph1 ausente) y variedad juvenil (atpica del nio).
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trombocitopenia al momento del diagnstico es excepcional. Los sntomas ms frecuentes
al diagnstico se muestran en la tabla 13-2.
Tabla 13-2. Sntomas frecuentes en Leucemia granuloctica crnica Sntoma Debilidad Hiporexia Prdida de peso Molestias abdominales % 50-55 35-40 35-40 30-35
En la exploracin fsica se encuentra esplenomegalia en 95% de los enfermos y hepatomegalia aproximadamente en la mitad; es comn la adenomegalia moderada. La prpura o fiebre se reconocen en menos de una cuarta parte de los casos. 2.4. Diagnstico El diagnstico se basa principalmente en los hallazgos del hemograma. Cuando la leucocitosis de causa no explicada, la proliferacin de formas jvenes de la serie mieloide, la trombocitosis, etc. se asocian con esplenomegalia, las posibilidades diagnsticas diferenciales son escasas. En ocasiones, las infecciones crnicas como la tuberculosis (en especial en ancianos), los tumores que invaden mdula sea o infecciones agudas pueden simular la enfermedad. La vigilancia adecuada y el estudio integral del individuo suelen ser suficientes para aclarar el diagnstico. En casos de duda se puede recurrir a la determinacin del Ph1, o bien de los niveles de fosfatasa alcalina leucocitaria y de vitamina B12 srica. La investigacin del gen quimrico BCR/ABL empleando hibridacin in situ fluorescente (FISH) o la reaccin en cadena de la polimerasa (RT-PCR), tienen mayor sensibilidad que la investigacin del Ph1 por medio de citogentica convencional, tanto en el diagnstico como en el seguimiento de la enfer medad. La mielofibrosis primaria con metaplasia mieloide agnognica, suele ser el diagnstico diferencial ms difcil de precisar, ya que a menudo cursa con gran esplenomegalia y leucocitosis. Sin embargo, la biopsia de mdula sea que demuestra fibr osis, as como una gran esplenomegalia no proporcional a la leucocitosis moderada en pacientes usualmente mayores de 50 aos, son datos que permiten aclarar el diagnstico.
2.5. Curso, tratamiento y pronstico Una vez que se detecta la enfermedad en forma clnica tiene una duracin de aproximadamente 3 a 4 aos. La enfermedad al inicio se mantiene estable y responde en forma adecuada y rpida al tratamiento (fase crnica) despus de algunos aos la respuesta es errtica y la enfermedad se tor na ms agresiva y resistente (fase acelerada) para posteriormente en un lapso menor a un ao transfor marse en una enfer medad aguda con la presencia de numer osos blastos (ms del 20%) que finalmente termina con la vida del enfermo (fase o crisis blstica). A veces existen otros cambios diferentes a los sealados; sin embargo, la mayora de los sujetos mueren en esta fase por crisis blstica. El tratamiento difcilmente cambia el destino del paciente; es muy probable que prolongue la vida en muchos casos y en definitiva mejora la calidad de sta, por lo que siempre es recomendable. Un medicamento que se usaba es el agente alquilante conocido como busulfn; cada vez se usa menos por sus efectos adversos, aun cuando tiene la ventaja de su costo accesible; en un lapso variable entre dos y seis semanas se observa respuesta favorable en la mayora de los casos tratados con este frmaco, lo que permite reducir o en muchas ocasiones suspender el tratamiento por perodos variables. Los criterios utilizados para considerar a un enfermo con LGC en remisin clnica son los siguientes: (a) desaparicin de sntomas, (b) ausencia de visceromegalia, (c) hemoglobina superior a 10 g/dL y (d) recuento leucocitario menor de 15 x 109/L. Otro medicamento que puede utilizarse es la hidroxiurea u otro agente alquilante como el melfaln, con resultados similares. En la
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actualidad, muchos hematlogos prefieren utilizar hidroxiurea, ya que la respuesta es ms rpida y la toxicidad, menor y predecible. Otra opcin teraputica es el uso de una protena humana recombinante denominada interfern alfa (rhIFN). Este producto, obtenido por medio de ingeniera gentica, es capaz de mantener la remisin de la enfermedad y reducir la cantidad de clulas Ph1 positivas. Se utiliza a razn de 5 millones de unidades/m 2/da; algunos enfermos requieren dosis mayores o menores; tiene como inconveniente su alto costo, que se aplica en inyeccin subcutnea por tiempo prolongado y que puede causar efectos colaterales como fiebre, astenia, cefalea y dolor seo. El IFN en la actualidad es considerado el mejor tratamiento y puede combinarse con quimioterapia como la hidroxiurea o mejor an con arabinsido de citosina para potenciar su efecto. Esta es la nica terapia que prolonga la fase crnica y la supervivencia, lo que es especialmente cierto en aquellos pacientes en los cuales se obtiene la remisin citogentica de la enfermedad. El mesilato de imatinib (STI-571) es un producto que inhibe selectivamente el crecimiento del clon Ph1; es el primer ejemplo de xito de la terapia molecular del cncer y en muchos sitios es el tratamiento de eleccin en pacientes con LGC; un inconveniente es su costo sumamente elevado. Slo los pacientes con Ph1 responden al tratamiento con mesilato de imatinib. El trasplante de mdula sea es la nica opcin verdaderamente curativa en esta enfermedad; sin embargo, su costo, la necesidad de un donante HLA idntico, la enfermedad del injerto contra el husped y la edad avanzada de muchos pacientes limitan la aplicacin frecuente de esta modalidad de tratamiento. Si se renen las condiciones ideales, es la mejor opcin teraputica para los enfermos menores de 55 aos que no obtienen o mantienen la remisin citogentica con el IFN. Los mtodos moder nos de acondicionamiento no mieloablativo para llevar a cabo el trasplante de mdula sea han permitido abaratar los costos y hacer el procedimiento en pacientes de mayor edad o debilitados. En Mxico, el costo del tratamiento con imatinib durante seis meses es igual al costo de un trasplante de mdula sea, si se emplea un esquema de acondicionamiento no mieloablativo (minitrasplante). 2.6. Pronstico Depende del tiempo de evolucin antes del
diagnstico y de la clasificacin clnica de la entidad, ya que las variantes atpicas de sta suelen tener un pronstico peor. La llamada variedad juvenil es muy agresiva y presenta caractersticas clnicas atpicas como lesiones en piel, gran organomegalia y respuesta pobre al tratamiento. Hay individuos con supervivencias mayores a 10 aos y quiz esto se deba a desaparicin por reduccin mxima del clon celular Ph1; sin embargo, la supervivencia habitual oscila entre los 3 y 4 aos a partir del momento del diagnstico si el paciente recibe slo quimioterapia y mejora sensiblemente en aquellos pacientes que responden a IFN o quienes reciben trasplante de mdula sea. 3. POLICITEMIA VERA La PV, tambin llamada policitemia rubra vera o panmielosis, es una entidad proliferativa de la CPH, de inicio insidioso, curso crnico y causa desconocida. Est caracterizada por la proliferacin excesiva y sostenida de clulas eritroides, granulocticas y megacariocticas en la mdula sea. La mdula sea es hiperplsica y su crecimiento no es secundario a ningn estmulo medular reconocido. La PV es una enfermedad clonal que se origina en la CPH; aproximadamente 25% de los sujetos con PV tiene una anor malidad cromosmica reproducible y ha sido posible demostrar en algunos enfermos la presencia constante de esta anor malidad en las clulas de las lneas hemopoyticas mayores pero no en los tejidos no hemopoyticos. 3.1. Patogenia La anormalidad fundamental es la hiperplasia de los pr ecursores de glbulos rojos, granulocitos y plaquetas en la mdula sea; como resultado de ello, hay produccin excesiva de estas clulas y por tanto, aumento de su nmero en la sangre perifrica. La sobreproduccin de glbulos rojos incrementa su cifra total en el cuerpo, de manera que el volumen eritroctico est aumentado. 3.2. Epidemiologa La PV es un padecimiento raro en mexicanos; los escasos pacientes que hay tienen ancestros extranjeros, casi siempre caucsicos. Esto es confirmado por Ruiz-Argelles y colaboradores quienes encontraron solamente 3 casos en una poblacin de 8069 pacientes estudiados de junio de 1983 a marzo de 2001, lo que representa el 0.37%.
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3.3. Datos clnicos La PV es una enfermedad con numerosas manifestaciones. Los datos clnicos pueden relacionarse con las anormalidades cuantitativas o cualitativas de alguna de las tres series: roja, mieloide y plaquetaria. Es posible atribuir los sntomas y signos en gran parte al aumento de espacio vascular y volumen sanguneo y a la lentitud del flujo de la sangre como resultado del aumento de la viscosidad de sta. La PV es una entidad de las edades media y adulta; la mayora de los casos se presenta entre los 40 y 70 aos, con inicio ms frecuente alrededor de los 50 aos. Los varones padecen la entidad un poco ms que las mujeres. Los sntomas son causados, principalmente, por el volumen sanguneo aumentado y por las complicaciones trombticas y hemorrgicas. El inicio puede ser insidioso y en ocasiones el diagnstico se sospecha cuando el hemograma muestra hematocrito elevado. En algunos casos, el padecimiento slo se diagnostica luego de que ocurre una complicacin notable como hemorragia o trombosis. Los sntomas son inespecficos y pueden referirse a cualquier rgano o sistema. La mayora se relaciona con alteraciones circulatorias que resultan del aumento del volumen eritrocitario (VE). La hipervolemia e hiperviscosidad resultantes causan distensin vascular, alteracin en el flujo sanguneo e hipoxia tisular. La cefalea y los mareos son quejas frecuentes; tambin se presentan sncope, prdida de memoria, incapacidad para concentrarse e irritabilidad. Los procesos vasculares cerebrales constituyen complicaciones importantes y pueden ser causa de muerte. Los sntomas cardiovasculares son habituales, siendo la disnea el ms comn. Los sntomas gastrointestinales son frecuentes: plenitud, sed, meteorismo y estreimiento, adems de lcera pptica, hemorragia y trombosis. El dolor abdominal puede provenir de lcera, crecimiento o infarto esplnico o bien trombosis mesentrica. La esplenomegalia se presenta en dos ter ceras partes de los enfermos. Junto con la esplenomegalia, los datos ms sobresalientes en la exploracin fsica son color rojo de piel y membranas mucosas, congestin de vasos conjuntivales e ingurgitacin de venas de la retina. El color rojo de piel y mucosas es un dato notable en la mayora de los pacientes; es ms prominente
en la cara, especialmente en mejillas, odos, labios y nariz pero tambin se nota en manos y pies, aunque en menor grado. La piel tpicamente es de color rojo ladrillo, a menudo con un tinte ciantico que se marca ms en la poca de fro. Las complicaciones trombticas se presentan en 30% de los enfermos y son causa importante de morbimortalidad. 3.4. Estudios de laboratorio El dato ms importante de la PV es el aumento en el VE. Conforme la enfermedad avanza, van apareciendo anisocitosis y poiquilocitosis que llegan a ser muy acentuadas, junto con presencia de ovalocitos, eliptocitos y formas en lgrima. Un dato muy importante es que aparecen eritroblastos en circulacin. La leucocitosis es frecuente en cifras de 12 a 20 x 109/L pero ocasionalmente puede llegar a 50 x109/L. En la gran mayora de los casos, la fosfatasa alcalina de los leucocitos est aumentada, al igual que el nmero de plaquetas, 500 a 1.000 x109/L; en ocasiones se han informado marcadas como 3.000 a 6.000 x109/L. Se han encontrado anor malidades cromosmicas; las ms frecuentes son delecin del brazo largo del cromosoma 5 (5q-), ganancia de un 8 9 y delecin del brazo largo del 20. La vitamina B12 y la capacidad de fijacin de la misma estn aumentadas en muchos pacientes con PV no controlada. La necesidad de estudiar la mdula sea en la PV es controversial; algunos autores piensan que es determinante para efectuar el diagnstico; otros dicen que no lo es. Casi siempre la mdula sea es hipercelular pero se ha informado como normal. Las tres series estn hiperplsicas y reemplazan la grasa medular. Se han comunicado ligeros aumentos de reticulina o fibrosis o ambas. 3.5. Diagnstico En enfermos con valores elevados de las tres lneas celulares en sangre perifrica, con esplenomegalia y sin datos que sugieran policitemia secundaria, es fcil hacer el diagnstico de PV. Como no siempre es as, el Grupo de Estudio de PV desarroll un conjunto de criterios diagnsticos (tabla 13-3).
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Tabla 13-3. Criterios diagnsticos de policitemia vera Criterios mayores Volumen eritroctico: Varn: ms de 36 ml/kg Mujer: ms de 32 ml/kg Saturacin arterial O2 igual o mayor de 92% Esplenomegalia Criterios menores Trombocitosis mayor de 400 x109/L Leucocitosis: ms de 12 x109/L FAL mayor de 100 B12 srica mayor de lo normal y CLFB12 mayor de lo normal
FAL, fosfatasa alcalina de los leucocitos; CLFB12, capacidad libre de fijacin de B12. Se establece el diagnstico si los tres criterios mayores estn presentes o bien los dos primeros criterios mayores junto con dos menores.
3.6. Tratamiento El objetivo de la teraputica es reducir los volmenes eritroctico y sanguneo por medios que: (a) tengan la menor posibilidad de daar; (b) per mitan la mayor supervivencia; (c) permitan una vida normal y (d) sean los menos costosos y no generen problemas al enfermo. Se han utilizado flebotoma, radiacin y quimioterapia. Al momento del diagnstico deben hacerse flebotomas para llevar los volmenes eritroctico y sanguneo a lo normal lo ms rpidamente posible, a fin de eliminar los sntomas del paciente. Se pueden efectuar flebotomas cada tres das hasta obtener hematocrito normal. Cuando hay trombocitosis grave, el mejor agente es anagrelide pero es caro. La hidroxiurea y el IFN recombinante son tambin tiles en el tratamiento de los pacientes con PV y tienen menos efectos adversos que el fsforo radioactivo y el busulfn; ambos frmacos abaten las cuentas de eritrocitos, leucocitos y plaquetas. La hidroxiurea es mejor tolerada por los pacientes y ms barata que el interfern. Se pueden emplear otros agentes mielosupresores como el fsforo radiactivo (32p), pero varios estudios han demostrado que el 32p que puede ser leucemognico. La esplenectoma puede ser til en las etapas tardas de la enfermedad. 4. TROMBOCITOSIS PRIMARIA La TP tambin ha recibido los nombres de tr ombocitemia primaria, trombocitemia esencial, hemorrgica o idioptica; el padecimiento es clonal y es el prototipo de la trombocitosis autnoma. 4.1. Patogenia Son caractersticos del padecimiento la
trombocitosis, el aumento de megacariocitos, del volumen megacarioctico total y del volumen medio megacarioctico. La produccin de plaquetas puede ser incluso 15 veces mayor de lo normal. Se producen trombosis por el incremento del volumen plaquetario, aunado a una anormalidad cualitativa de las plaquetas que las hace hiperagregables. La TE, aunque es un padecimiento raro, es ms frecuente en Mxico que la PV. 4.2. Datos clnicos La TP es un padecimiento de la edad adulta, entre los 50 y 70 aos, aunque puede observarse de los 21 a los 84 aos de edad, siendo la mediana de la edad de presentacin 61 aos. Es ligeramente ms frecuente en la mujer. El dato clnico ms importante es la hemorragia y los sntomas que sugieren isquemia del sistema nervioso central e isquemia vascular perifrica. Otros datos clnicos son: debilidad, cefalea, parestesias, mareos, alteraciones visuales y prurito. La manifestacin vasoclusiva ms caracterstica es el sndrome de eritromelalgia en el que hay dolor localizado tipo quemadura, enrojecimiento y aumento de la temperatura en las porciones distales de las extremidades, que puede progresar a cianosis o necrosis de los dedos de pies o manos. 4.3. Estudios de laboratorio El dato sobresaliente es el incremento en el recuento plaquetario, ya que habitualmente las plaquetas pasan de un milln 1 (1.000x109/L); se han llegado a informar valores tan altos como 14.000x109/L. Hay aumento de micro y de macr oplaquetas, lo que refleja megacariocitopoyesis defectuosa. La leucocitosis casi nunca es mayor de 30x109/L y la anemia es leve. En la mdula sea hay
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aumento en la abundancia celular con acentuada hiperplasia megacarioctica. El cromosoma Philadelphia debe ser negativo. En ocasiones, es difcil establecer un diagnstico inequvoco
de TP. De acuerdo con lo anterior, el diagnstico de esta enfermedad es de exclusin y esto se logra si se cumplen los criterios que se indican en la tabla 13-4.
Tabla 13-4. Criterios diagnsticos de trombocitosis primaria Recuento plaquetario mayor de 600 x109/L. Hemoglobina normal o volumen eritroctico normal. Presencia de hemosiderina en mdula sea o falta de respuesta a tratamiento con hierro. Ausencia de cromosoma Philadelphia. Fibrosis del colgeno de la mdula sea: ausente o menor a un tercio de la biopsia. Sin causa de trombocitosis reactiva.
4.4. Tratamiento Los pacientes con manifestaciones hemorrgicas o vasoclusivas deben tratarse inmediatamente con agentes mielosupresores para disminuir el recuento plaquetario y con antiplaquetarios. Si el sujeto est asintomtico y tiene trombocitemia leve, la enfermedad puede seguir un curso benigno y no se requiere tratamiento. Los pacientes con TP pueden catalogarse en alto o bajo riesgo; los siguientes datos se asocian con alto riesgo: historia de trombosis o hemorragia, edad mayor de 60 aos o recuento plaquetario mayor de 1 000 x109/L (un milln de plaquetas). Los pacientes de alto riesgo deben recibir mielosupresin, en tanto que aqullos con riesgo bajo pueden ser tratados con agentes antiplaquetarios como la aspirina. Es muy probable que el tratamiento de eleccin en TP en la actualidad sea el anagrelide, frmaco que adems de inhibir la adhesividad y agregacin plaquetarias, inhibe la trombopoyesis y es muy bien tolerado; su inconveniente es el costo alto. Otros mielosupresores como los alquilantes (melfaln, busulfn, etc.) pueden ser de utilidad. Si se requiere una reduccin inmediata del recuento plaquetario, por ejemplo, en una hemorragia grave o antes de un procedimiento quirrgico, debe efectuarse plaquetafresis. El uso de agentes alquilantes produce la misma preocupacin que en el caso de la PV, ya que pueden presentarse leucemia aguda y neoplasias gastrointestinales, sobre todo si se
utilizan en forma continua. Tambin se han usado hidroxiurea e rhIFN-, los que no producen neoplasias secundarias. Igualmente se ha utilizado el pipobromn en pacientes de alto riesgo y la cuenta de plaquetas se ha reducido a menos de 600 x109/L y en muchos casos a menos de 400 x109/L. Su bajo riesgo para trombosis, leucemia aguda y tumores slidos lo cataloga como un tratamiento adecuado. La esplenectoma est contraindicada en este padecimiento. 5. MIELOFIBROSIS CON METAPLASIA MIELOIDE AGNOGNICA Ha recibido nombres diferentes y los ms comunes son osteoesclerosis, mielosis crnica no leucmica y otros. La MF/MMA est caracterizada por aparicin y crecimiento de clulas mieloides en tejidos en que no se encuentran nor malmente las clulas hemopoyticas en el adulto. Tal hemopoyesis extramedular casi siempre se asocia con fibrosis de mdula sea, que muy a menudo se ha desarrollado en ausencia de causa evidente. Es por esto que los nombres ms comnmente utilizados para designar al padecimiento son mielofibrosis y metaplasia mieloide agnognica. Parece que la MF / MMA, que daa la cavidad medular, trata de compensarse con hematopoyesis extramedular, siendo sta la metaplasia mieloide agnognica (MMA). Existen formas de MF / MMA secundarias a otros padecimientos mieloproliferativos,
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incluyendo a algunas leucemias agudas como la leucemia aguda megacarioblstica (LMA, M7 segn FAB). No se conoce la causa de la MF / MMA. Muchos casos suponen proliferacin clonal de una clula troncal mieloide anormal pero restringida. Como el tejido colgeno no es clonal, se ha especulado que la fibrosis es probablemente reactiva a la proliferacin clonal de precursores granulocticos y trombocticos y se ha sealado que algunas substancias producidas por estas clulas como el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) es en parte el responsable de la proliferacin anormal del colgeno en la cavidad medular. 5.1. Patognesis Los estudios cromosmicos de colonias de clulas progenitoras hemopoyticas han establecido que una anormalidad citogentica clonal est presente en nor moblastos, neutrfilos, macrfagos, basfilos y megacariocitos pero no en el tejido fibroso. Al inicio puede haber mielodisplasia o es posible que aparezca ms tarde como un proceso patognico dominante y lleve a granulocitopenia o trombocitopenia. A menudo se encuentra anemia que resulta de la combinacin de eritr opoyesis ineficaz, supervivencia acortada del glbulo rojo y efectos de la esplenomegalia masiva sobre la distribucin de los eritrocitos en la circulacin. En algunos casos, la hemlisis puede constituir un factor importante. 5.2. Epidemiologa No se conoce con exactitud la incidencia de la MF/ MMA pero es posible que sea de entre 0.2 y dos pacientes/100.000 habitantes. Se considera mucho ms frecuente en sujetos de raza blanca que en las poblaciones negra, japonesa o mexicana. La incidencia en varones y mujeres es aproximadamente igual. Es un padecimiento de la edad adulta y la vejez; la mediana al diagnstico es aproximadamente de 60 aos, aunque tambin se han informado casos en nios. 5.3. Datos clnicos En los pacientes jvenes, el curso casi siempre es ms agresivo que en los adultos. Alrededor de 25% de los casos est asintomtico al momento del diagnstico, el cual se efecta gracias al examen mdico realizado por otra causa. En los pacientes sintomticos se encuentran quejas inespecficas como fatiga,
debilidad, disnea y palpitaciones. Puede haber prdida de peso, pero es poco frecuente hallar anorexia y diaforesis profusa nocturna. Tambin es posible que exista dolor en el cuadrante superior izquierdo del abdomen y plenitud posprandial inmediata. En unos cuantos enfer mos, puede haber hemorragia caracterizada por equmosis fciles. Es posible que el dolor seo sea intenso, sobre todo en los miembros plvicos. La esplenomegalia est presente casi en todos los pacientes al momento del diagnstico. En una tercera parte, la esplenomegalia es leve; en otro tercio, el crecimiento es moderado y en el tercio restante, el incremento es marcado al grado que el borde inferior del bazo llega a la espina ilaca y el borde derecho cruza la lnea media. Se encuentra hepatomegalia en dos tercios de los casos. 5.4. Estudios de laboratorio La anemia est presente en la mayora de los enfermos al momento del diagnstico; en general, es leve a moderada al inicio y se acenta ms conforme la enfermedad progresa. El hallazgo tpico del padecimiento es la presencia de eritrocitos en forma de lgrima y de eritroblastos. Tambin se observan clulas fragmentadas, codocitos y con basofilia difusa. Los reticulocitos estn un poco aumentados pero pueden presentar gran variacin aun en un mismo caso. La supervivencia eritroctica est acortada en casi todos los pacientes y esto origina que la bilirrubina indirecta est aumentada. Tambin se ha informado aplasia pura de serie roja en algunos casos. No siempre es posible atribuir la anemia a produccin disminuida en una mdula fibrtica. El recuento total de leucocitos est aumentado a expensas de los granulocitos. Es infrecuente observar cifras mayores a 50 x 10 9/L. En todos los pacientes se encuentran promielocitos y mielocitos y tambin una baja proporcin de blastos. Es posible encontrar hipersegmentacin, hiposegmentacin (anomala adquirida de Pelger-Het) y granulacin anormal en los neutrfilos. La MF / MMA constituye una de las causas de leucoeritroblastosis o anemia leucoeritroblstica. En la sangre perifrica siempre se encuentran eriblastos y granulocitos jvenes, aunque sea en pequea cantidad. Las plaquetas estn aumentadas en una tercera parte o incluso en la mitad de los enfermos al momento del diagnstico, pero conforme la enfer medad avanza va apareciendo trombocitopenia. Generalmente no se obtiene muestra cuando se aspira la mdula sea. Es necesario realizar biopsia medular para poder
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demostrar la fibrosis. La tincin con plata demuestra de manera invariable la presencia de fibras de reticulina y en la mitad de los casos se encuentra gran aumento de tales fibras. No existe el mismo grado de fibrosis en toda la mdula sea. La anormalidad cromosmica ms
frecuente es la trisoma del cromosoma 8, seguida en orden decreciente por trisoma del 9 y monosoma parcial o completa del 7. El diagnstico de MF / MMA debe hacerse con base en los siguientes criterios mostrados en la tabla 13-5.
Tabla 13-5. Criterios diagnsticos de Mielofibrosis con metaplasia mieloide agnognica Esplenomegalia Leucoeritroblastosis en sangre perifrica Presencia acentuada de poiquilocitos en forma de lgrima o de gota (dacriocitos) en sangre perifrica Fibrosis en la biopsia de hueso
5.5. Tratamiento El tratamiento debe ser de apoyo y debe dirigirse a las complicaciones especficas. Muchos pacientes no necesitan tratamiento por perodos pr olongados. Las principales indicaciones de la esplenectoma son esplenomegalia dolorosa por infartos esplnicos repetidos, trombocitopenia refractaria, anemia hemoltica refractaria e hipertensin portal Algunos autores han sugerido que debe hacerse esplenectoma a todos los pacientes en cuanto se establece el diagnstico de MF / MMA. El clorhidrato de anagrelide es una presentacin oral de un derivado de imidazoquinazolina con actividad trombocitopnica en los humanos. Se ha demostrado que la droga es efectiva para disminuir las cuenta de plaquetas, interfiriendo con la maduracin de los megacariocitos. El anagrelide administrado por va oral abate las cuentas plaquetarias sin causar disminucin significativa de los glbulos blancos ni de los eritrocitos. La anemia puede mejorar con el empleo de eritr opoyetina humana recombinante; si se debe principalmente a disminucin en la produccin eritroctica, pueden utilizarse andrgenos. Cuando se demuestra que la anemia es hemoltica, est justificado administrar prednisona. La hidroxiurea reduce el tamao del hgado y del bazo y disminuye los recuentos de leucocitos y plaquetas, as como el grado de fibrosis medular, pero no mejora la anemia. Tambin se han usado interfern alfa humano recombinante, busulfn y fsforo radiactivo, con efectos indeseables ms frecuentes y graves. El trasplante de mdula
sea, cuando es posible, logra la remisin del padecimiento y la desaparicin de la mielofibrosis. LECTURAS SUGERIDAS Del Caizo, M.C., Orfao, A., Vidriales, B., LpezBerges, M.C., San-Miguel, J.F., Ruiz-Argelles, G.J. Leucemias agudas megacarioblsticas. Sangre (Barc) 1993; 38:167-70. Devine, S.M., Hoffman, R., Verma, A., Shah, R., Bradlow, B.A., Stock, W. et al. Allogeneic blood cell transplantation following reducedintensity conditioning is effective therapy for older patients with myelofibrosis with myeloid metaplasia. Blood 2002; 99:2255-8. Gilbert, H.S. Current management in polycythemia vera. Sem Hematol 2001;38(Suppl 2): 25-8 Gilbert, H.S. Diagnosis and treatment of thr ombocythemia in myeloproliferative disorders. Oncology 2001;15:989-96. Gmez-Almaguer, D. Leucemias crnicas En Fundamentos de Hematologa, Ruiz-Argelles, G.J. (ed.), Editorial Mdica Panamericana. Ciudad de Mxico, 2003. pp. 261-278. Guilhot, F., Chastang, C., Michallet, M. et al. Interferon alfa-2b combined with cytarabine versus interferon alone in chronic myelogenous leukemia. N Engl J Med 1997;337:223-229.
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HEMATOLOGA
Captulo
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SNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRNICOS

Pablo Bertin C-M., Mauricio Ocqueteau T., Alejandro Majlis L. y Carmen Salgado M.
1. Introducccin Leucemia linftica crnica 1. Introduccin 2. Fisiopatologa 3. Clnica 4. Laboratorio 5. Tratamiento 5.1. Tratamiento segn estados de la clasificacin de Rai y Binet 5.2. Estrategias teraputicas 5.3. Criterios de respuesta a tratamiento Linfomas Linfoma de Hodgkin 1. Introduccin 2. Patologa 3. Etapificacin 4. Tratamiento 4.1. Tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, etapa precoz 4.2. Tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, etapa avanzada 5. Valoracin de las masas residuales en la enfermedad de Hodgkin Linfomas no Hodgkin del adulto 1. Introduccin 2. Patogenia 3. Patologa 4. Historia Natural 4.1. Linfomas de bajo grado 4.2. Linfomas de grado intermedio 4.3. Linfomas de alto grado 5. Diagnstico 5.1. Anatoma patolgica 5.2. Citogentica, biologa molecular y citometra de flujo 6. Diagnstico de extensin 7. Tratamiento 7.1. Manejo de los linfomas de bajo grado (LBG) 7.2. Manejo de los linfomas de grado intermedio 7.3. Manejo de los linfomas de alto grado Linfoma no Hodgkin Peditrico 1. Introduccin 2. Epidemiologa 3. Etiologa 4. Clasificacin 5. Clnica 6. Diagnstico y etapificacin 7. Factores pronsticos 8. Tratamiento 8.1. Terapia de apoyo 8.2. Tratamiento especfico Gammapatas monoclonales 1. Introduccin 2. Estudio inmunolgico de las gammapatas monoclonales 2.1. Pesquisa de una protena monoclonal 2.2. Identificacin de una protena monoclonal 2.3. Cuantificacin de inmunoglobulinas 2.4. Viscosidad srica 2.5. Beta-2 microglobulina 2.6. Protena C reactiva 2.7. Interleuquina-6 2.8. Estudios inmunolgicos en orina 3. Gammapata monoclonal de significado incierto 3.1. Aspectos generales 3.2. Evolucin de las MGUS en el tiempo 4. Mielona mltiple 4.1. Conceptos preliminares a) Incidencia b) Patogenia c) Manifestaciones clnicas d) Pronstico 5. Variedades infrecuentes de mielona mltiple y otras gammapatas 5.1. Mieloma indolente 5.2. Leucemia de clulas plasmticas 5.3. Mieloma osteoesclertico 5.4. Plasmocitoma extramedular 5.5. Plasmocitoma seo solitario 5.6. Macroglobulinemia de Waldenstrom (MW) 5.7. Enfermedad de cadenas livianas 5.8. Amiloidosis primaria 5.9. Enfermedad por cadenas pesadas 6. Diagnstico diferencial entre MGUS y MM 7. Tratamiento 7.1. Terapia de apoyo 7.2. Tratamiento citotxico
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RESUMEN
La leucemia linftica crnica (LLC), los linfomas, y las gammapatas monoclonales malignas (GMM), son incluidas en los sndromes linfoproliferativos. En este captulo se describen los avances en fisiopatologa y diagnstico. El tratamiento solo es planteado en trminos generales, pues no es el propsito de este libro.
INTRODUCCIN Los sndromes linfoproliferativos crnicos (SLPC) incluyen una variedad de enfermedades: leucemia linftica crnica (LLC), linfomas, y mieloma mltiple y otras gammapatas monoclonales. En los ltimos aos se han realizado importantes avances en fisiopatologa y diagnstico de estas enfermedades. El diagnstico junto con considerar las manifestaciones clnicas, requiere de la citologa e inmunofenotipo, y en algunos casos del estudio citogentico y molecular. Este captulo revisa los aspectos ms relevantes de la fisiopatologa de cada una de estos SLPC, como tambin las estrategias diagnosticas. Respecto a los aspectos metodolgicos de las pruebas de laboratorio utilizadas en diagnstico se recomienda revisar el captulo 30.
La causa de LLC es desconocida. Se describe, a diferencia de otras leucemias, una tendencia familiar. No est asociada a radioterapia ni quimioterapia previa. Su evolucin es variable con sobrevida media entre 2 y 12 aos, lo que ha permitido agrupar a los pacientes segn factores pronsticos que permiten predecir el curso de la enfermedad. A diferencia de otras neoplasias, su diagnstico no siempre implica tratamiento. La necesidad de tratamiento se fundamenta en el estadio y los factores pronsticos. Hasta la fecha no hay tratamiento curativo para este tipo de leucemia, pero los tratamientos han evolucionado obtenindose mayores porcentajes de remisin completa (RC) y prolongacin de sobrevida en pacientes con enfermedad avanzada. 2. FISIOPATOLOGA La LLC es una neoplasia de linfocitos morfolgicamente maduros. En 95% de los casos es de estirpe B. Es la leucemia ms frecuente en el mundo occidental (25-30% de los casos), al menos en pases anglosajones. No hay datos confiables de incidencia en nuestro medio. Es una enfermedad que habitualmente se presenta despus de los 60 aos y su frecuencia aumenta con la edad. Es rara en pacientes menores de 40 aos. No est asociada a radiacin, quimioterapia o factores ambientales. Es una enfermedad caracterizada por acumulacin de linfocitos ms que por proliferacin de stos. Esto se relaciona
LEUCEMIA LINFTICA CRNICA Pablo Bertin C-M. 1. INTRODUCCIN La leucemia linftica crnica (LLC) es una neoplasia monoclonal de linfocitos B que expresan CD5, que se caracteriza por la acumulacin de estos linfocitos en los tejidos linfticos, hematopoyticos y en sangre perifrica. Es la leucemia ms frecuente en el mundo occidental. Afecta mayoritariamente al sexo masculino 2:1 y su incidencia aumenta notablemente sobre los 60 aos.
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con alteracin de la apoptosis y la expresin de BCL-2. La mayora de las clulas se encuentran en la fase G0 del ciclo celular. Es frecuente la asociacin con fenmenos autoinmunes y de ellos los ms frecuentes son la anemia hemoltica autoinmune y la trombocitopenia autoinmune que pueden aparecer en el curso de la evolucin y estar ausentes al momento del diagnstico. El diagnstico diferencial debe incluir a otros sndromes linfoproliferativos crnicos y en la actualidad el mtodo de eleccin es la citometra de flujo que puede realizarse en mdula sea o sangre perifrica. Se han descrito mltiples alteraciones citogenticas clonales siendo la ms frecuente la delecin 13q. La siguen en orden decreciente la delecin 11q. trisomia 12, delecin 17p, delecin 6q y traslocaciones de 14q. Con los mtodos de estudio actual se puede encontrar alteraciones citogenticas clonales en 80% de los pacientes. El mtodo recomendado es la tcnica de FISH. El cariotipo es de poco rendimiento por la dificultad en obtener mitosis. Estudios recientes han demostrado que la existencia o ausencia de mutaciones del gen VH de la cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) tienen carcter pronstico. La ausencia de mutacin en estos genes es considerada de mal pronstico. En estudios realizados por microarrays de DNA ha aparecido el nivel de expresin de ZAP70 como pronstico y esta expresin tiene una buena correlacin con la presencia o ausencia de mutacin del gen de cadena pesada de Ig, por lo tanto tambin tiene valor pronstico. 3. CLNICA En la actualidad un nmero importante de pacientes consulta antes de tener sntomas, habitualmente por hallazgo de linfocitosis en el hemograma solicitado por alguna enfermedad no relacionada. Los sntomas clsicos incluyen fatigabilidad, baja de peso e infecciones bacterianas recurr entes especialmente respiratorias. Para for mular el diagnstico se requiere linfocitosis absoluta de 5000 x L persistente por ms de un mes.
Los criterios diagnsticos aceptados por el grupo internacional de trabajo de LLC (1989) son los siguientes: Linfocitosis sobre 10.000 x L con linfocitos de aspecto maduro. b) Aspirado de mdula sea con ms de 30% de linfocitos. c) Linfocitosis perifrica que expresa fenotipo B consistente con LLC. a) El diagnstico se confirma si al criterio (a) se agrega el (b) o el (c). Si la linfocitosis es menor a 10.000/L deben estar presentes los criterios (b) y (c). El grupo de trabajo del National Cancer Institute (1996) recomienda los siguientes criterios diagnsticos: a) Linfocitosis mayor de 5000/L con menos de 55% de las clulas atpicas; (i) las clulas deben expresar mar cador es B con antgenos de diferenciacin CD19, CD20, CD23 y CD5; (ii) expresar cadena liviana monoclonal y (iii) baja densidad de Ig de superficie. b) Aspirado de mdula sea con ms de 30% de linfocitos. Al examen fsico es posible encontrar adenopatas, siempre debe evaluarse bilateralmente las zonas cervicales, supraclaviculares, axilares e inguinales. Debe pesquisarse hepato o esplenomegalia. Existen dos sistemas de etapificacin para los pacientes que permiten con la evaluacin fsica inicial ms el hemograma asignarlos a un grupo determinado. Los sistemas de etapificacin o estadios han tenido una gran utilidad en la evaluacin de pacientes individuales para deter minar progresin de enfer medad y respuesta al tratamiento. Sin embargo su mayor utilidad es que ha per mitido evaluar el pronstico y efectividad de tratamientos en pacientes que de otra manera seran muy heterogneos. Estos dos sistemas son el de Rai que comprende 5 estadios y el de Binet que tiene 3 estadios. Posteriormente el de Rai fue revisado y se asign 3 grupos de pacientes segn riesgo. En la tabla 14-LLC-1 se muestra la clasificacin de Rai original y modificada.
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Tabla 14-LLC-1. Sistema de clasificacin de Rai para la LLC Estado 0 I II III IV Clasificacin Bajo riesgo Riesgo intermedio Riesgo intermedio Alto riesgo Alto riesgo Descripcin Linfocitosis Linfocitosis*, linfoadenopata Linfocitosis + esplenomegalia, Linfoadenopata Linfocitosis + anemias Linfocitosis + trombocitopenia Anemia +/- esplenomegalia Linfoadenopatas Sobrevida media (aos) >10 >8 6 2 2
+/+/+/+/-
*Linfocitosis: recuento de linfocitos >5.000/L. Anemia: hemoglobina <11g/dL. Trombocitopenia: plaquetas <100x103/L.
Una versin ms simplificada que la original propuesta por Rai, es hoy en da aceptada por los investigadores y consta de tres grupos con diferencias significativas de sobrevida entre cada grupo, es la propuesta por Binet (tabla 14-LLC-2),
y se basa en el nmero de reas comprometidas, el nivel de hemoglobina, y el recuento de plaquetas. Esta clasificacin resulta ser ms prctica para la evaluacin de las decisiones clnicas.
Tabla 14-LLC-2. Sistema de clasificacin de Binet para LLC Estado A B C Recuentos sanguneos Hb >10 g/dL y plaquetas >100x109/L. Hb >10 g/dL o plaquetas >100x103/L. Hb 10 g/dL o plaquetas <100x103/L o ambos. reas involucradas <3 >3 Cualquier nmero Sobrevida media (aos) >10 7 2
El curso de la enfermedad depende del estado y los factores pronsticos del paciente y la mayora de los casos es estable o lento en los estados iniciales, sin embargo algunos casos no son predecibles, lo que ha motivado la bsqueda de otros factores pronsticos. Es importante consignar en cada visita del paciente los sntomas y los hallazgos al examen fsico con especial nfasis en cuanto a palidez, peso, adenopatas y visceromegalia. 4. LABORATORIO Para plantear el diagnstico de LLC histricamente los elementos ms importantes han sido el hemograma con observacin del frotis sanguneo y la biopsia de mdula sea.
Basado en la morfologa se describen tres tipos de LLC: (a) la forma tpica tiene un 90% de clulas pequeas, (b) la forma prolinfoctica tiene entre 11 y 54% de prolinfocitos y (c) la forma atpica con morfologa heterognea pero menos de 10% de prolinfocitos. A estos criterios, que mantienen su vigencia, se debe agregar la citometra de flujo (tabla 14-LLC-3) estudio citogentico por FISH eta 2 microglobulina (2 m) y LDH. Deseable es agregar ZAP-70 como predictor de mutacin de genes VH de la cadena pesada de Ig y CD38. Entre los exmenes de imgenes son tiles la radiografa de trax y la tomografa axial compuesta (TAC) o ecotomografa abdominal. En casos especiales y con la sospecha
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diagnstica se debe obtener recuento de reticulocitos y prueba de Coombs. Es frecuente en estos pacientes la hipogammaglobulinemia por lo que deben medirse. La biopsia de mdula sea puede mostrar infiltrado nodular, intersticial o difuso con sobrevidas medias de 90, 46 y 28 meses, respectivamente. El tiempo de doblaje de linfocitos es til tanto
del punto de vista pronstico como referencia para el inicio de tratamiento. Si el tiempo de doblaje es inferior a un ao debe considerarse inicio de tratamiento. El nivel de 2m es inversamente proporcional al pronstico y de alguna manera traduce masa tumoral.
Tabla 14-LLC-3. Diagnstico por citometra de flujo de sndromes linfoproliferativos crnicos B CD5 + + CD23 + +/CD43 + +/+ + CD25 + CD10 +/+/CD11c +/+ -
LLC-B LPL LCEM LCV LCM LCF
LLC-B, leucemia linftica crnica B. LPL, leucemia prolinfoctica. LCEM, linfoma clulas esplnicas marginales. LCV, leucemia clulas velludas. LMC, linfoma clulas del manto. LCF, linfoma folicular.
El estudio realizado por Dohner y colaboradores sobre las alteraciones citogenticas ms frecuentes en LLC (delecin 17p, delecin 11q, trisomia 12, cariotipo normal y delecin 13q), mostr medianas de sobrevida de 32, 79, 114, 111 y 133 meses, respectivamente. Hasta la fecha no hay oncogenes especficos en LLC. Habitualmente hay sobre-expresin de BCL-2 y raramente BCL-3. Las mutaciones de P53 se asocian a progresin de la enfermedad. El estudio en pacientes con LLC familiar, y sus familiares no afectados hasta la fecha no ha demostrado genes de predisposicin especficos. 5. TRATAMIENTO El tratamiento en LLC vara desde la peridica observacin clnica con tratamiento de episodios intercurrentes de complicaciones infecciosas, inmunolgicas o hemorragias a una variedad de opciones teraputicas que incluyen corticoesteroides, agentes alquilantes, anlogos de las purinas, quimioterapia combinada, anticuerpos monoclonales y trasplante de progenitores hematopoyticos (TPH).
LLC es una enfermedad hasta ahora no curable, se presenta en personas mayores y la mayora de las veces su progresin es muy lenta por lo que, en general, su tratamiento es conservador. Los meta-anlisis de estudios randomizados controlados no demuestran ventajas en la sobrevida en tratamiento precoz comparado a terapia diferida en pacientes con estados tempranos de la enfermedad como tampoco en el uso de quimioterapia combinada incorporando antraciclinas comparado a monoterapia con agentes alquilantes en pacientes con estados avanzados. Una variedad de factores clnicos deben ser tomados en cuenta en pacientes en diferentes estados para decidir la necesidad de terapia. Entre ellos debemos tener presentes 2m, tiempo de doblaje linfocitario, citogentica, CD38 y Zap-70. Las complicaciones infecciosas bacterianas en la enfer medad avanzada se asocian a hipogammaglobulinemia. Las infecciones por Herpes Zoster son frecuentes. El diagnstico temprano de infecciones permite un tratamiento oportuno lo cual incide en la sobrevida de los pacientes.
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Las segundas neoplasias y las leucemias secundarias pueden ocurrir en un porcentaje pequeo de pacientes. La transformacin a linfoma de clulas grande (Sndrome de Richter) empeora el pronstico con sobrevida inferior a un ao, un 20% de los pacientes tienen mejor sobrevida con quimioterapia combinada. La anemia hemoltica y trombocitopenia autoinmune pueden ocurrir en pacientes con LLC en cualquier estado. Estos pacientes deben recibir esteroides en lo posible antes de la quimioterapia. Tratamientos alter nativos incluyen gammaglobulina endovenosa, ciclosporina, esplenectomia e incluso radioterapia del bazo. 5.1. Tratamiento segn estados de la clasificacin de Rai y Binet a) Pacientes estado 0 de Rai o A de Binet Es el estado indolente, de bajo riesgo, por naturaleza. No est indicado el tratamiento. Meta-anlisis de 6 estudios randomizados que comparan terapia inmediata versus terapia diferida con clorambucil no demuestran diferencias en la sobrevida a 10 aos. Uno de ellos reporta aumento de neoplasias secundarias en los pacientes tratados. An no existen resultados con el uso de Fludarabina o anticuerpos monoclonales en este estado. Si en este estado hay factores de mal pronstico se debe vigilar a los pacientes en forma ms frecuente para determinar progresin a otro estado y necesidad de tratamiento. Pacientes estado I y II de Rai y B de Binet La observacin est indicada para los pacientes asintomticos. En los pacientes con grandes adenopatas debe usarse hidratacin y alopurinol para prevenir el sndrome de lisis tumoral (SLT) antes de comenzar quimioterapia. Entre estos ltimos se utilizan: Agentes alquilantes orales (Clorambucil o Ciclofosfamida) con o sin corticoides. Anlogos de las purinas: Fludarabina, 2 CDA o Pentostatina. El tratamiento con anlogos de purinas est asociado a efectos txicos: infecciones en neutropenia, herpes. Anemia hemoltica y trombocitopenia persistente. Estos pacientes deben recibir profilaxis con trimetropim-sulfa y aciclovir durante la terapia y hasta 6 meses despus de finalizada sta.
Quimioterapia combinada: CVP: ciclofosfamida + vincristina + prednisona. CHOP: ciclofosfamida + doxorubicina + vincrisyina + prednisona Fludarabina + ciclofosfamida Fludarabina + clorambucil Fludarabina + ciclofosfamida Fludarabina + ciclofosfamida + rituximab Se podra referir radioterapia localizada en reas de grandes masas y/o radioterapia esplnica para tratar el hiperesplenismo. Los anticuerpos monoclonales (Alemtuzumab Campath-1H y Rituximabo Mabthera) estn bajo estudios clnicos. El TPH est bajo estudios clnicos.
c) Pacientes estado III y IV de Rai y C de Binet Bsicamente la indicacin es la misma que para el estado anterior. En general requieren ms medidas de soporte transfusional. 5.2. Estrategias teraputicas a) Agentes alquilantes El de uso ms comn en LLC es el clorambucil que produce su efecto antitumoral unindose en forma covalente al DNA, RNA y protenas celulares. Ha sido usado por 50 aos y la dosis diaria recomendada es de 0.1 mg/kilo o intermitentemente cada 2 semanas en dosis de 0.4 mg/kilo que puede aumentarse en 0.1 segn toxicidad hasta obtener la mxima respuesta. La tasa de respuesta es de 40-60% con 4-10% de respuesta completa. b) Anlogos de nuclosidos La fludarabina es el anlogo ms usado en LLC y ha mostrado actividad significativa. Su mecanismo de accin es a tres niveles: ocasiona quiebres del DNA, induce apoptosis y es txico para las mitocondrias. Est disponible en forma inyectable y oral, la droga parece ser igualmente activa en forma endovenosa (ev) que oral pero como la absorcin oral es 50% debe aumentarse la dosis. La dosis ev recomendada es de 25 mg/ m2 por da por 5 das cada 4 semanas. La respuesta es de 45% en pacientes que antes no han recibido tratamiento con 3 a 20% de respuesta completa. Se asocia a intensa mielosupresin e infecciones.
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c) Corticoesteroides Son linfotxicos y actan sobre clulas con mutaciones de P53 . Se usan asociados a quimioterapia o como paliativo. Dosis usuales son de Prednisoma 1 mg/kilo hasta el control de los sntomas y disminucin progresiva hasta llegar a das alternos. d) Anticuerpos monoclonales Rituximab. Anticuerpo monoclonal murino humanizado contra el antgeno de superficie CD20, que juega un rol importante en la activacin, proliferacin y diferenciacin de las clulas B. Su actividad antitumoral sera a travs de la activacin de complemento, citotoxicidad mediada por anticuerpos y tambin induccin directa de la apoptosis. La dosis usual es de 375 mg/m2 semanal por cuatro semanas o asociada a quimioterapia. Alemtuzumab. Anticuerpo monoclonal murino humanizado contra el antgeno de superficie CD52. Los mecanismos de accin son iguales a rituximab. La dosis usual es de 30 mg, tres veces a la semana por 12 semanas. Puede usarse por va endovenosa o subcutnea. Se asocia frecuentemente a infecciones oportunistas. e) Radioterapia Inicialmente muy usada en el tratamiento de LLC para tratar grandes masas o gran esplenomegalia con hiperesplenismo. Actualmente se utiliza en ambas indicaciones cuando stas no responden a la quimioterapia y combinada con quimioterapia en el sndrome de Richter. f) Esplenectoma Indicada en pacientes con hiperesplenismo que
no ha respondido a la quimioterapia o anemia hemoltica o trombocitopenia autoinmune que no responde a corticoides. g) Trasplante de progenitores hematopoyticos Como LLC es una enfermedad incurable con los tratamientos convencionales, existe inters en esta enfer medad, especialmente en los pacientes jvenes. Adems con los avances recientes en la identificacin de factores biolgicos de riesgo que indican enfermedad agresiva (genes VH no mutados, Zap70, deleciones 11q y 17p) es posible identificar pacientes con muy mal pr onstico con tratamiento convencional que podran beneficiarse de TPH. El TPH anlogo tiene mortalidad de 11% con sobrevida a tres aos de 79% y recaida de 41% en el mismo perodo. No es curativo. El TPH alognico tiene mortalidad de 40% con sobrevida a tres aos de 55% y recaida de 25% en ese perodo. Podra haber efecto injerto versus leucemia. 5.3. Criterios de respuesta a tratamiento Como en todas las neoplasias hematolgicas se sabe que si no hay RC no hay posibilidad de curacin. Hasta ahora los tratamientos previos a fludarabina no han sido significado curacin. Con fluradabina y los tratamientos combinados basados en ste frmaco han aumentado el nmero de pacientes que obtienen RC; no se sabe an si esto aumentar la SLE. La tabla 14-LLC-4. Muestra los criterios aceptados de respuesta en LLC.
Tabla 14-LLC-4. Criterio de respuesta clnica en LLC (NCI-CLLWG) Remisin completa No sntomas No hepatoesplenomegalia, o linfoadenopata Estructura normal de la mdula sea. Remisin parcial Disminucin del recuento de linfocitos en un 50% o ms. Disminucin de las linfoadenopatas y/o esplenomegalia en un 50% o ms. Avance de la enfermedad Aumento de la infiltracin. Aumento de la hepatoesplenomegalia. Aumento del recuento de linfocitos ms de un 50%. Transformacin en otra enfermedad ms agresiva.
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Es importante al enfrentarse a un paciente determinado establecer el estado, los factores pronsticos, edad, enfermedades asociadas y perfomance status antes de decidir si el paciente requiere o no tratamiento. Estableciendo el pr onstico del paciente se tendr una estimulacin de sobrevida muy confiable. A ms larga sobrevida, menos necesidad de tratamiento. LECTURAS SUGERIDAS Cheson, et al . National Cancer Institutesposored working group guidelines for CLL. Blood; 87:4990-4997, 1996. Crespo, M., Bosch, F., Villamor, N., Bellosillo, B., Colomer, D., Rozman, M., Marce, S., LopezGuillermo, A., Campo, E. Monserrat, E. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulinvariable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med.;348(18):1764-75, 2003. Dohner, H., Stilgenbauer, S., Benner, A., Leupolt, E., Krober, A., Bullinger, L., Dohner, K.,Bentz, M., Lichter, P. Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med.;343(26):1910-6, 2000. Neoplastic Diseases of the Blood. Wiernik. 3rd. Ed. Churchill Livingstone. OBrian and Keating. Diagnosis and Treatment of Chr onic Lymphocytic Leukemia. Rassenti, LZ, Huynh, L, Toy, TL, Chen, L, Keating, MJ, Gribben, JG, Neuberg, DS, Flinn, IW, Rai, KR, Byrd JC, Kay NE, Greaves A, Weiss A, Kipps TJ. ZAP-70 compared with immunoglobulin heavychain gene mutation status as apredictor of disease progression in chronic lymphocytic leukaemia. N Engl J Med.; 351(9):893-901, 2004. Wintrobes Clinical Hematology, Johnston J, Chapter 92. Chronic Lymphocytic Leukemia. P2429-2463. www.cancer.gov/cancertopics/pdq www.hematology.org www.asheducationbook.org www.bloodmed.com
LINFOMAS LINFOMAS DE HODGKIN Alejandro Majlis L. 1. INTRODUCCIN En 1832 Thomas Hodgkin describi en 7 pacientes una enfermedad primitiva de los ganglios linfticos diferente a los procesos reactivos de stos, ocasionados por alteraciones inflamatorias. En un estudio posterior se confirm que slo 4 de los 7 enfermos tenan la enfer medad de Hodgkin (Linfoma de Hodgkin), correspondiendo 2 de los casos a sfilis y linfosarcoma. En 1892 Ster nberg describi la clula considerada como patognomnica del Linfoma de Hodgkin y Reed perfil sus caractersticas de multinuclearidad y gigantismo denominndose desde entonces estas clulas, necesarias para realizar el diagnstico de Linfoma de Hodgkin, clulas de Reed-Sternberg (R-S). Los trabajos de Seif y Spriggs, en 1967, definieron la naturaleza maligna de la enfermedad y el origen clonal de la misma mediante estudios citogenticos. La incidencia de esta enfermedad tiene un carcter bimodal con mayor incidencia a los 25 aos y con un nuevo aumento pasados los 55 aos. Es posible que este aspecto tenga una relacin epidemiolgica con mayor implicacin en jvenes del virus de Epstein Barr (EBV) y de la forma de esclerosis nodular con implicacin mediastnica. La mayor incidencia, por otra parte, en jvenes plantea problemas especiales respecto a la toxicidad del tratamiento sobre todo por la afectacin de la funcin reproductiva genital originada por la quimioterapia, la del aparato cardiovascular y la relacionada con el desarrollo seo cuando la quimioterapia se aplica en etapas en las que ste no ha finalizado. A partir de los aos 50 y hasta los aos 70 se logr la curacin del 75% de los casos. Este xito teraputico, slo similar al conseguido en Medicina en la diabetes mellitus o la anemia de Biermer, ha sido la conjuncin de una definicin precisa en cuanto a la difusin y extensin de la enfermedad y a la aplicacin de tcnicas teraputicas eficaces, radioterapia y quimioterapia tipo (MOPP), tanto en la enfermedad ganglionar como en las formas diseminadas.
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La idea fundamental que dirigi el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin fue considerar que su difusin se realizaba por contigidad y de una manera precisa de unos grupos ganglionares a otros y por otra parte que sobre el territorio ganglionar comprometido, las radiaciones tenan un efecto dosis letal para el tumor. Los radioterapeutas Gilbert, Peters y Kaplan aplicar on estos conceptos a los enfermos, definiendo para ello, previamente y con toda precisin, la extensin patolgica de cada caso clnico, haciendo de la laparotoma una tcnica fundamental durante esta etapa en la que el dominio de la radioterapia fue absoluto y prcticamente exclusivo para los estadios no diseminados. 2. PATOLOGA La clsica clula asociada con linfoma de Hodgkin es la clula de R-S cuyo origen ahora se sabe proviene de una poblacin monoclonal de linfocitos B, posiblemente derivada de centro germinal. El ambiente alrededor de la clula neoplsica varia desde predominancia de linfocitos pequeos en Hodgkin predominio linfoctico a una extensa fibrosis colgena en
Hodgkin esclerosis nodular. El fenotipo clsico de la clula de R-S es CD15 (+), CD30 (+), CD45 (-). El diagnstico diferencial del linfoma de Hodgkin del linfoma B rico en clulas T o del linfoma anaplsico CD30 (+) puede ser difcil y se r equiere r evisin por un experto hematopatlogo. La clasificacin WHO/OMS (tabla 14-LH-1), agrupa bajo la denominacin de linfoma de Hodgkin clsico a los subtipos esclerosis nodular, celularidad mixta, variante linfocito depletado o rico en linfocitos para destacar sus similitudes patolgicas y clnicas y distinguirlos del linfoma de Hodgkin nodular predominio linfoctico. El linfoma de Hodgkin esclerosis nodular es el ms comn de los subtipos (6080%), se presenta generalmente en mujeres jvenes, con masa mediastnica. El subtipo celularidad mixta es el segundo ms frecuente (15-30%), y se presenta con mayor habitualidad en hombres mayores. El linfoma Hodgkin nodular predominio linfoctico difiere de los otros subtipos en que la clula maligna es inmunofenotpicamente similar a otros linfomas B, expresa CD20(+) pero no expresa CD30.
Tabla 14-LH-1. Linfoma de Hodgkin (Clasificacin OMS/ WHO) Predomino linfoctico nodular Linfoma de Hodgkin clsico Esclerosis nodular Celularidad mixta Rico en linfocitos Deplecin linfocitaria
Los estudios citogenticos en el linfoma de Hodgkin es posible realizarlos en el 80% de los casos y aproximadamente la mitad presenta anomalas cromosmicas. Las alteraciones numricas pueden afectar a todos los cromosomas excepto al 13 y al Y, sin embargo las alteraciones estructurales afectan, particularmente, a los cromosomas 12 y 13 en su brazo corto. Las citoquinas segregadas por las clulas de RS y por las del estroma tienen una expresin clnica, biolgica, inmunolgica e incluso en las implicaciones del EBV y con los oncogenes. Los datos histopatolgicos que se encuentran en el ganglio linftico del Linfoma de Hodgkin sugieren un proceso de naturaleza inflamatoria
e inmune. Las manifestaciones clnicas B, como fiebre y sudoracin, es posible que se deban a la accin de ciertas citoquinas, as como la presencia de eosinofilia. Las citoquinas que se producen en el Linfoma de Hodgkin corresponden a la IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, TNF, TNF y el GM-CSF. En el citoplasma de la clula de R-S se ha demostrado trascripcin de mRNA para IL-5 el cual es un factor de crecimiento de los eosinfilos, que correspondera en estos casos con la presencia en sangre perifrica de eosinofilia y con la infiltracin de eosinfilos en el ganglio linftico. Los eosinfilos y las clulas de R-S expresaran el antgeno CD23 que es el receptor para la IgE, la cual tambin se encuentra elevada en estos casos de Linfoma de Hodgkin
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En la clula de R-S se expresa el CD25 o antgeno TAC que es la cadena liviana del IL-2R que muestra una alta afinidad por esta protena y que permite la internalizacin de la IL-2. Los pacientes con sntomas B tienen niveles de IL2R ms altos que los que no presentan sntomas B y stos se encuentran ms elevados en los estadios IVB. La IL-6 es una citoquina pluripotente que est implicada en la diferenciacin terminal de las clulas B y en la secrecin de molculas de Ig. La IL-6 se ha mostrado como un factor de crecimiento en el plasmocitoma, linfoma de clulas T y enfermedad de Castelman. En la clula de R-S se detecta mRNA especfico para IL-6 y ello se ha observado tambin mediante tincin con anticuerpo anti-IL-6. La produccin de IL-6 podra proceder de la propia clula de R-S, o lo que es ms probable, de linfocitos T CD4 activados que rodean a esta clula y que pueden estimularla mediante la produccin de esta citoquina. La IL-9 es un factor de crecimiento de clulas T que tiene efecto sobre la eritropoyesis y la megacariocitopoyesis. Mediante la tcnica de Nothernblot se ha encontrado la IL-9 en el linfoma Ki-1 y en el linfoma de Hodgkin, ambos procesos con antgeno CD30+. Es posible que la IL-9 tenga un papel en el crecimiento de los linfomas anaplsicos, ya que el gen de esta citoquina se encuentra en el cromosoma 5q 31 a 35 y un nmero importante de estos linfomas presentan una traslocacin que afecta al cromosoma 5q35. 3. ETAPIFICACIN Las clasificaciones para determinar el estadio son descripciones anatmicas de los sitios con afectacin tumoral, que nos indican la mayor o menor extensin de la enfermedad en el momento del diagnstico. La determinacin de la extensin de la enfermedad en pacientes diagnosticados de enfermedad de Hodgkin, as como en la mayora de los tumores malignos, cumple varios objetivos: Ofrece informacin pronstica de gran importancia para planificar el tratamiento y sirve para comunicar de forma uniforme los resultados de los tratamientos,
favoreciendo la comparacin entre ellos. No obstante, no hay que olvidar que un sistema de estadiaje es un intento de establecer categoras con lmites precisos dentro de una enfermedad (el cncer) difcil de delimitar y donde, para hacerlo manejable, necesariamente hay que omitir detalles clnicos. Por todo ello, cualquier clasificacin debe estar sujeta a cambios y perfeccionamientos segn se progrese en el conocimiento de la historia natural de la enfermedad y de las tcnicas de deteccin de la diseminacin, as como en el conocimiento de sus factores pronsticos. As, una clasificacin clnica no debe ser el nico parmetro a tener en cuenta para planificar el tratamiento, sino que adems, deben considerarse otra serie de caractersticas, tanto del tumor como del paciente, que en ocasiones son de gran importancia. La primera clasificacin clnica, para la enfermedad de Hodgkin, fue desarrollada en 1965 en la Reunin de Rye que, basndose en la clasificacin previa de Peters divida la enfermedad en cuatro estadios segn estuvieran afectas una (I) o ms regiones linfticas (II) por arriba o debajo del diafragma, afectacin linftica a ambos lados del diafragma (III) o afectacin difusa o diseminada de uno o ms rganos o tejidos extralinfticos (IV). Cada estadio era clasificado como A o B, segn la ausencia o presencia de sntomas constitucionales (fiebre, sudoracin nocturna, prurito y/o prdida de peso) y como E para describir la afectacin localizada de un rgano o sitio extralinftico. El sistema de clasificacin, aceptado internacionalmente en la actualidad, para la enfermedad de Hodgkin, es el llamado sistema de Ann Arbor (tabla 14-LH-2), donde se intr odujeron tres modificaciones a la clasificacin de Rye: a) Se introduce la letra E, para indicar los rganos afectos por extensin directa de la enfermedad desde los ganglios linfticos adyacentes, y dejaba de considerarse equivalente a la enfermedad diseminada. b) La afectacin esplnica se suscribe con la letra S, y c). Deja de considerarse el prurito como sntoma constitucional.
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Tabla 14-LH-2. Clasificacin Etapificacin Ann Arbor Estadio I: rea ganglionar nica (I) u rgano o sitio extranodal nico (IE) Estadio II: Dos o ms regiones ganglionares al mismo lado del diafragma (II), o extensin localizada extraganglionar con una o ms regiones gaglionares al mismo lado del diafragma (IIE). Estadio III: Compromiso ganglionar a ambos lados del diafragma (III) el cual puede estar acompaado por extensin extralinftica localizada (IIIE) o compromiso esplnico (IIIS). Estadio IV: Compromiso de uno o ms tejidos u rganos extra ganglionares (mdula sea), con o sin compromiso ganglionar. A: Asintomtico. B: Fiebre >38 C, sin foco infeccioso. Sudoracin nocturna. Prdida de peso >10% del basal en los ltimos 6 meses. E: Enfermedad extraglanglionar. X: Enfermedad voluminosa (>10 cm dimetro mayor, masa mediastnica >1/3 dimetro torcico)
El estudio incluye historia de sntomas B, examen fsico, tomografa axial computada (TAC) de trax, abdomen y pelvis y a veces de cuello, hemograma con velocidad de sedimentacin eritrocitaria (VHS), per fil bioqumico con LDH y biopsia de mdula sea. El cintigrama de galio es til al diagnosticar reas ocultas al TAC y en la evaluacin de respuesta al tratamiento, sobre todo en masas residuales. Recientemente se ha incorporado la tomografa por emisin de positrones (PET scan) utilizando fluodeoxiglucosa basado en aumento del metabolismo de la glucosa en tumores malignos. El PET scan en linfoma de Hodgkin ha logrado aumentar el estadio en el 58% de los casos catalogados como estadio I-II clnico. La negativizacin del examen en el curso de quimioterapia se correlaciona con buen pronstico e identifica casos refractarios o recadas en forma temprana. 4. TRATAMIENTO La realizacin de la laparotoma es hoy una rareza en la determinacin del estadio del linfoma de Hodgkin; ello se debe a la precisin de las tcnicas radiolgicas para la valoracin de las lesiones, a la combinacin de radioterapia y quimioterapia en las formas con gran masa tumoral e incluso en estadios I y II, y asimismo a la introduccin de ciertos protocolos de quimioterapia eficaces y menos txicos que el mecloretanuria, vincrstina, predrisona y procarbocina (MOPP).
El MOPP clsico que fue durante mucho tiempo el protocolo de referencia, ha quedado prcticamente relegado como tratamiento de primera lnea. Ello se debe a la mayor eficacia de otros protocolos como el doxorrubicina, becomicina, vinblastina, dacarbocina (ABVD) y sobr e todo a la menor toxicidad, particularmente sobre la esfera reproductiva y sobre la capacidad leucemognica. Por ltimo, ha sido importante la precisin de los factores pronsticos que influyen en la evolucin de la enfermedad y el impulso dado a los tratamientos de rescate. La introduccin de la quimioterapia de intensificacin con trasplante de mdula sea o de clula germinal hematopoytica perifrica consigue una supervivencia libre de recada entre un 20-50% de los casos en un grupo heterogneo de pacientes que comprende enfermedad primaria refractaria, recada refractaria, segunda remisin completa o recada posterior a la segunda remisin completa. Asimismo se ha suscitado la introduccin de la intensificacin como tratamiento de primera lnea en formas en estadio IV con particular mal pronstico y como primer tratamiento de rescate en las recadas que han sido tratadas previamente con quimioterapia. El estadiaje clnico de la enfermedad de Hodgkin, es decir examen fsico y TAC de trax, abdomen y pelvis, da que el 90% de los pacientes son catalogados como etapa precoz (Ann Arbor I-II). El cintigrama de galio es de
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ayuda frente a masas sospechosas y en la evaluacin de la respuesta a tratamiento. En la experiencia de MD Anderson, el cintigrama de galio resulta positivo en el 93% de los casos previos a quimioterapia correlacionndose a la vez con la sobrevida libre de enfermedad (SLE), el 30% de los pacientes con galio positivo postquimioterapia tienen recada frente al 3% de aquellos con galio negativo post-tratamiento. Sin embargo la laparotoma exploradora es el procedimiento que con ms exactitud informa de la extensin de la enfermedad sobre todo por la posibilidad de encontrar enfermedad esplnica o heptica oculta. En general se considera que 1/3 de los enfermos clnicamente en etapas I o II pasan a etapas avanzadas despus de la etapificacin quirrgica, elevndose a 50% en los casos con sntomas constitucionales. Despus de realizar todos los procedimientos de etapificacin incluido el quirrgico, el 60% de los pacientes se catalogan como etapa avanzada (estadios III-IV). Est claro que la laparotoma exploradora agrega en la etapificacin del paciente; sin embargo hay que considerar la morbimortalidad quirrgica inmediata y el incremento en el riesgo de infecciones neumocsicas post esplenectoma. La primera modalidad teraputica con xito fue la radioterapia. En estadios precoces patolgicos, I-A, I-B, II-A y II-B sin compromiso mediastnico los mejores resultados con
radioterapia corresponden al grupo de Kaplan de la Universidad de Stanford en que la radioterapia nodal total dio prcticamente un 100% de remisin completa (RC) con 80% de SLE prolongada, con una supervivencia global de 85-88% dado por la posibilidad de rescate con quimioterapia de los pacientes que recaen. Sin embargo, estos resultados no se han reproducido en otros centros, reportndose el doble de tasa de recada comparada a la serie de Stanford. En general, en estadios patolgicos (EP) I-II la SLE despus de tratamiento con radioterapia es de 80% con variaciones de acuerdo con factores pronsticos tales como histologa (celularidad mixta) y elevada velocidad de sedimentacin especialmente post-tratamiento. Ya que 20- 30% de los pacientes con estadios clnicos (EC) I-IIA tienen enfermedad abdominal oculta, el resultado a largo plazo de la poblacin tratada solo con radioterapia da una tasa de recada que flucta entre 14 a 39%, llegando en la serie de Miln a 41%. De esta manera se iniciaron una serie investigaciones tanto en EE.UU. como en Europa tratando de individualizar el tratamiento de las etapas tempranas segn factores de riesgo. De la necesidad de obtener los mejores resultados con la menor toxicidad, se clasifica los linfomas de Hodgkin en grupo de etapa precoz y etapa avanzada (tablas 14-LH-3 y 14-LH-4).
Tabla 14-LH-3. Estratificacin del Linfoma de Hodgkin para tratamiento Etapa precoz Estadio I/II Sin enfermedad voluminosa Sin sntomas B Etapa avanzada Estadio III/IV Estadio II con enfermedad voluminosa Sntomas B
Tabla 14-LH-4. Factores de mal pronstico en linfoma Hodgkin avanzado Albmina: < 4 g/dl Hemoglobina: <10.5 g/dl Sexo masculino Estadio IV Edad: 45 aos Recuento glbulos blancos: > 15.000/L Recuento de linfocitos: <600/L o <8% del total de los leucocitos
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4.1. Tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, etapa precoz En pacientes con estadio patolgico I-II se ha comparado radioterapia en manto sola con radioterapia en manto ms quimioterapia consistente en el protocolo MOPP. La SLE fue de 67% en el grupo de radioterapia (RT) contra 91% en el grupo de RT + quimioterapia (QT), siendo la sobrevida de 90% y 95%, respectivamente, diferencia no significativa. Este ltimo punto remarca el hecho de que los pacientes que recaen post R T se rescatan exitosamente con QT en el 85% de los casos. El anlisis multivariable demostr que RT sola, enfer medad voluminosa y sntomas B se relacionaban con riesgo de recada. La experiencia con estudios randomizados con estadiaje clnico IA-IIA entre RT ya sea en manto con o sin extensin a rea para-artica, o irradiacin nodal subtotal con proteccin de pelvis, comparndolo con quimioterapia (MOPP o ABVD), la SLE a 10 aos fue de 62% en el grupo de RT contra 88% en el grupo de terapia combinada. Nuevamente la sobrevida global es similar. De esta manera, la laparotoma no tiene indicacin actualmente en el manejo habitual del linfoma de Hodgkin, recomendndose terapia combinada. Varios estudios han demostrado que quimioterapia breve (2-4 ciclos) seguido de radioterapia es altamente efectivo en etapas precoces de linfoma de Hodgkin con SLE >94% con media de seguimiento 2-3 aos. Dentro de las opciones de quimioterapia, ABVD ha demostrado ser mejor que MOPP y menos txico e igualmente efectivo que MOPP/ABV constituyendo el tratamiento estndar actual. En relacin al nmero de ciclos (2 vs. 4) o campo de radioterapia (campo comprometido vs. campo extendido) estn en curso trabajos randomizados para su definicin. Los pacientes con etapa precoz pero con factores de mal pronstico (tabla 14-LH-4) requieren 6 ciclos de quimioterapia con radioterapia sobre las reas de gran volumen. 4.2. Tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, etapa avanzada Se considera enfermedad de Hodgkin avanzada, los estadios IV, masa mediastnica superior a 15 cm y los estadios IIIB, sobre todo con compromiso de ganglios plvicos. En estos casos el esquema estndar es ABVD por 6-8 ciclos y la radioterapia juega un
importante rol; en los pacientes con enfermedad avanzada y con gran masa, tratados nicamente con quimioterapia, el 75% de las recadas ocurren exclusivamente en sitios de compromiso inicial de la enfermedad, con menos de 10% de recadas tanto en sitios de compromiso inicial como nuevos sitios de enfermedad y solo 15% de recadas solo en sitios no comprometidos inicialmente. En contraste en enfer mos tratados con quimioterapia y radioterapia sobre las reas inicialmente comprometidas, en la experiencia del Southeastern Cancer Study Group, las recadas en el rea irradiada son menos del 3%. Regmenes de quimioterapia nuevos, se estn estudiando y se comparan con la experiencia de ABVD. Un esquema poco txico pero bastante activo es el esquema etopsido, vinblastina, doxorrubicina (EVA), con un seguimiento de 10 aos en casos de enfermedad avanzada, logra remisin completa en un 94% de los casos con SLE de 73%. El rgimen de Stanford V (medoretamina, doxorubicina, vinblastina, bleomicina, etopsido, pr ednisona y R T en sitios comprometidos) implica quimioterapia semanal por 12 semanas, alter nando agentes mielotxicos con agentes no mielotxicos, adems de radioterapia en sitios de enfermedad voluminosa. Con este esquema se logr SLE de 89% con seguimiento medio de 5 aos. El otro esquema proviene del grupo cooperativo alemn que ha estudiado un rgimen de dosis escalonado y acelerado en etapas avanzadas; randomiz ciclofosfamida, vincristina, procarbacina, prednisona (COPP)/ABVD vs. Bleomicina, etipsido, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, procarbocina, prednisona (BEACOPP) vs. BEACOPP con dosis escalonadas. La SLE a 5 aos fue 69% vs. 76% vs. 87%, sin embargo la sobrevida global a 5 aos fue 83% vs. 88% vs. 91%. Estn en curso estudios randomizados entre ABVD ms/sin RT vs. BEACOPP ms/sin RT para poder definir la mejor terapia en casos avanzados. 5. VALORACIN DE LAS MASAS RESIDUALES EN LA ENFERMEDAD DE HODGKIN La enfermedad o masa residual es la lesin que permanece estable despus de un tratamiento y requiere que se establezca el criterio de malignidad o de lesin fibrosa benigna residual La enfermedad de Hodgkin es una neoplasia que responde muy bien a los tratamientos con quimioterapia y/o radioterapia, con un ndice de respuestas completas (RC) que oscila entre
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el 70-100% de los casos. A pesar de ello, un 10-20% de los pacientes en RC recaen de su enfermedad, de donde se deduce que quedaba enfermedad tras el tratamiento. Por otra parte, en algunos pacientes tras el tratamiento persisten imgenes radiolgicas residuales de difcil valoracin, y donde la decisin de continuar o suspender el tratamiento es muy importante. Por todo ello, en los ltimos aos est tomando gran importancia definir la respuesta al tratamiento tan precisamente como sea posible, con el fin de poder detectar, por una parte, aquellos pacientes en los que persiste enfermedad a pesar de una remisin completa clnica y, por otra, diferenciar si unas imgenes residuales tras un tratamiento representan residuos fibrticos, enfer medad activa persistente o ambos. El problema de la masa residual, tras un tratamiento en la enfermedad de Hodgkin, se presenta con relativa frecuencia, sobre todo cuando existen volmenes tumorales importantes (Bulky) y/o afectacin mediastnica. La nica manera de llegar a un diagnstico correcto de las caractersticas de la masa residual es la obtencin de material histolgico por biopsia. Sin embargo en mltiples ocasiones, la masa residual es pequea, los pacientes han sido irradiados o la obtencin de material fibrtico plantea dudas sobre lo adecuado de la muestra, todo lo cual limita su interpretacin. La presencia de una masa residual en el mediastino, tras un tratamiento con quimioterapia y/o radioterapia afecta a un 64% de los pacientes, pero es ms frecuente, entre el 83-88%, en los pacientes con masa Bulky mediastnica. La gammagrafia con galio-67 es el mtodo ms til para reevaluar la masa residual, en pacientes diagnosticados de enfermedad de Hodgkin, tras el tratamiento, siendo adems el mtodo ms sencillo y menos invasivo de hacerlo, a la vez que monitoriza la respuesta al tratamiento. Varios estudios han valorado el significado de una gammagrafia positiva, con galio-67, tras el tratamiento con quimioterapia y radioterapia. El PET scan da informacin de compromiso ganglionar y a futuro puede validarse como estudio de rutina en masa residual. Tratamiento de las recadas El tratamiento de las recadas de pacientes
tratados inicialmente con radioterapia pueden ser con quimioterapia convencional y buenos resultados. En caso de r ecada postquimioterapia o refractario a los esquemas de primera lnea, la intensificacin de dosis con trasplante autlogo logra remisiones completas prolongadas en el 50% de los casos de segunda RC y alrededor de 10-15% de los casos linfoma de Hodgkin primario refractario. El mejor ndice pronstico es demostrar quimiosensibilidad, lo que se logra con dos a cuatro ciclos de esquemas de rescate como ASHAP [doxorubicina (Adriamycin), metilprednisolona (Solumedrol), arabinsido de citosina a dosis altas y cisplatino (platino)], Ifosfamida-VP-16, a la vez que se logra movilizar y recolectar los pr ogenitores hematopoyticos para el trasplante autlogo. El trasplante autlogo en recada de linfoma de Hodgkin es el tratamiento estndar de las recadas postquimioterapia. Se estn investigando los trasplantes alognicos, ablativos y no mieloablativos; los resultados son promisorios en los casos que tienen donante. LECTURAS SUGERIDAS Ar mitage, J.O., Early bone marrow transplantation in Hodgkins disease. Ann Oncol, 5 Suppl 2: 161-3, 1994. Bonadonna, G., Zucali, R., Monfardini, S. Combination chemotherapy of Hodgkins disease with adriamycin, bleomycin, vinblastine, and imidazole carboximide versus MOPP. Cancer, 36: 252-259, 1975. Branson, K., et al., Role of Nonmyeloablative Allogeneic Stem-Cell Transplantation After Failure of Autologous Transplantation in Patients With Lymphoproliferative Malignancies. J Clin Oncol, 20(19): 4022-4031, 2002. Brizel, D., Prosnitz, L., Winer, E. Combination Chemotherapy with and without adjuvant radiotherapy for advanced Hodgkins disease: The Duke University and Southeastern Cancer Study Group Experience. Adjuvant Therapy of Cancer VI, ed. S. SE. Philadelphia: W B Saunders. 610-622, 1990. Brusamolino, E., Lazzarino, M., Orlandi E. Earlystage Hodgkins Disease: Long-term results with radiotherapy alone or combined radiotherapy and chemotherapy. Ann Of Oncol 1992, 1994. 5((Suppl. 2)): 101-106.
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LINFOMAS NO HODGKIN DEL ADULTO Alejandro Majlis L. 1. INTRODUCCIN Los linfomas no Hodgkin (LNH) son un grupo de tumores del sistema linfoide que involucran a las poblaciones celulares que intervienen en la respuesta inmune. El incremento de su frecuencia en un 150% desde 1940 hasta los ltimos aos de la dcada de los 80, establece un importante problema de salud pblica. Este espectacular aumento en frecuencia no se puede atribuir solamente a la epidemia del SIDA, sino que algunos agentes etiolgicos parecen tener una creciente importancia. En la actualidad se conocen algunos datos epidemiolgicos de gran inters que pudieran explicar este crecimiento. Por ejemplo, se ha observado un mayor nmero de casos en poblaciones en contacto con herbicidas, asocindose este factor sobre todo con linfomas foliculares de clulas grandes. Algo parecido ocurre con los pesticidas, sin embargo estos factores no explican el aumento observado en reas urbanas donde se ha visto tambin un incremento. Volviendo a los herbicidas existe un curioso paralelismo entre el momento de su incremento en uso y el aumento en la incidencia de estos linfomas. Otros factores como radiacin, factores nutricionales, ingesta medicamentosa, etc., no se han podido relacionar con tanta fidelidad como los factores anteriormente aludidos. El papel de algunos virus y de estados de inmunodeficiencia en la linfomognesis parece decisivo. 2. PATOGENIA La accin de los distintos agentes etiolgicos produce, como consecuencia, una serie de alteraciones genticas que constituyen la base de los mecanismos patognicos de la enfermedad. En el proceso de reordenamiento normal, ya sea del gen de las inmunoglobulinas (Igs) en el caso de los linfocitos B o de los receptores T (TCR) en los linfocitos T, se ponen en marcha una serie de mecanismos enzimticos por recombinasas que actan en diferentes puntos en la secuencia de la produccin de esos receptores. Errores en esas recombinasas por
difer entes causas, pueden provocar reordenamientos genticos anormales, que son los que, eventualmente, pr oducen la transformacin maligna en un punto donde se ha producido un bloqueo en la diferenciacin normal de estas clulas. El reordenamiento cromosmico anormal, antes aludido, puede ser provocado por diferentes factores, se ha visto que exposiciones intensas incluso de corta duracin a pesticidas pueden incrementar la for macin de dichos reordenamientos, por ejemplo causando una inversin en el cromosoma 7 (Inv 7), t (13, q35), que afectara a los genes de los TCR. Es posible que exista cierta especificidad de agentes en relacin a distintos reordenamientos que podra explicar la distinta frecuencia de linfomas en diferentes localizaciones geogrficas. Los procesos de reordenamiento principalmente ocurren a nivel en que la secuencia variable (V) del gen de la inmunoglobulina se une a las secuencias de unin (J) y de diversidad (D) genmica y en el punto de cambio de isotipo de Ig que tiene lugar en los linfocitos B perifricos maduros. Estos dos fenmenos son gobernados por la activacin o inhibicin de otras estructuras genmicas como oncogenes activadores y supresores y por diferentes citoquinas que transmitiran las seales. Entre stas parece ser que la IL-4, IL-5, IFN- y TGF- podran intervenir en el proceso de cambio de isotipo de Igs. Estas lesiones genticas, en un tiempo fueron atribuidas al azar, sin embargo recientemente se han conocido otros mecanismos que a travs de la produccin de dao oxidativo pudieran tener un papel primordial. El hecho que determinados genes y no otros sean los que se ven involucrados se debe a mecanismos conformacionales moleculares en momentos fisiolgicos donde se estn produciendo fenmenos normales. Por ejemplo el reordenamiento de los receptores hace que se aproximen geomtricamente, al plegarse y abrirse segmentos genmicos muy alejados espacialmente. Translocaciones cromosmicas especficas son asociadas directamente con subtipos de linfomas de clulas B. El estudio de estas translocaciones han dado importante informacin en los mecanismos patognicos de los linfomas. Las translocaciones ms frecuentes son: (a) t(14;18) que resulta en la sobreexpresin del gen BCL-2, presente en 85% de
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los linfomas foliculares, (b) t (11;14) con sobreexpresin de cclina D1, presente en prcticamente todos los linfomas del manto, (c) t(8;14), t(2:8) y t(8;22) de los linfomas Burkitt, con fusin de un gen de cadena pesada (H, heavy) o liviana (L, light) de Ig al gen promotor de factor de trascripcin C-MYC. El gen de factor de trascripcin BCL6, capaz de reordenamiento con mltiples genes, se encuentra preferentemente en linfomas de clulas grandes difuso, y se asocia a la sobreexpresin de mRNA para BCL-6 de buen pronstico, comparado con BCL-6 negativo; y (d) t(2;5) (p23;q35), que fusiona el gen ALK con nucleofosmina, se asocia a linfoma anaplstico
Ki-1 (CD30) positivo, con buen pronstico. En la tabla 14-LNH-A-1 se describen las alteraciones cromosmicas mejor conocidas hoy en da y que se relacionan directamente con determinados grupos especficos de linfoma. Todas estas alteraciones que, sin duda, pueden tener lugar al azar o continuamente a lo largo de la vida de un individuo, no tendran mayor importancia si funcionaran efectivamente otros mecanismos reguladores. En algunas circunstancias el equilibrio impuesto por estos mecanismos reguladores se interrumpe y da lugar a la limfomagnesis.
Tabla 14-LNH-A-1. Principales alteraciones citogenticas en linfomas no Hodgkin Translocacin t(8;14) (q24;q23.3) t(8;22) (q24;q32.3) t(2;8) (p11-p12;q24) t(14;18) (q32;p21) t(11;14) (q13;q32) t(2;5) (p23;q35) t(3;14) Tipo de linfoma Burkitt Burkitt Burkitt/ Inmunoblstico Folicular Difuso clulas grandes Linfoma del manto Anaplstico K1 Difuso clulas grandes Frecuencia 100% 100% 20% 90% 30% 50% Oncogn Funcin Factor de transcripcin Factor de transcripcin Factor de transcripcin Anti-apoptosis
C-MYC C-MYC C-MYC B-CL-2
BCL-1 (ciclina D1)
Regulador ciclo celular
BCL-6
Factor de Transcripcin
En primer lugar con la edad se altera la inmunidad celular o ms concretamente la funcin de las clulas T supresoras, de igual modo la respuesta humoral hacia antgenos exgenos disminuye y paradjicamente se pr oduce un aumento de fenmenos autorreactivos o autoinmunidad. Con estos fenmenos se produce un desbalance entre clulas B y T que da lugar a que las clulas T no sean capaces de regular las clulas B. Este hecho puede predisponer a una mayor y progresiva
autonoma de estas clulas B con las consecuencias lgicas en la linfomognesis. Las diferentes inmunodeficiencias asociadas como la enfermedad de Wiscott-Aldrich, ataxia telangiectasia, inmunodeficiencias ligadas al cromosoma X, etc., se han asociado desde hace muchsimo tiempo con una mayor incidencia de linfomas. A la vista de los mecanismos de regulacin de la respuesta inmune es ms sencillo explicarse la asociacin.
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Actualmente se sabe que algunos virus tienen un importante papel, en la linfomognesis as por ejemplo, el virus de Epstein-Barr (EB) participa en la transformacin maligna de linfomas Burkitt, en linfomas de alto grado inmunoblstico asociado con el SIDA, Linfoma de Hodgkin y el virus HTLV-1 en el sndrome de leucemia-linfoma T asociado. El caso del linfoma Burkitt, que es el mejor conocido, puede servir de paradigma para explicar la accin de otros virus en la produccin de la neoplasia linfoide. En el linfoma Burkitt en un 80% de los casos se produce la translocacin t(8;14) (q24, q32) y en casi todos los restantes la translocacin t(2; 8) t(8; 22). Las secuencias genticas involucradas son, por un lado, los genes de las cadenas pesadas de las Igs en el cromosoma 14 o de las cadenas livianas kappa (K) y Lambda () en los cromosomas 2 y 22, respectivamente y la secuencia del protooncogn C-MYC situado en el cromosoma 8. Esta translocacin pone en contacto el citado C-MYC con secuencias promotoras de las cadenas H de las Igs. La distribucin de los puntos donde se produce la translocacin marca una diferencia fenotpica y patolgica establecindose dos tipos de linfomas Burkitt: el endmico y el espordico. El endmico, que ocurre en frica Ecuatorial, se asocia uniformemente con la infeccin por virus de EB y en estos casos no se produce reordenamiento del C-MYC , ocurriendo la mayor parte de los puntos de desprendimiento fuera de la secuencia genmica del C-MYC. En cambio en el linfoma Burkitt espordico las translocaciones ocurren por encima o dentro de la unidad de trascripcin C-MYC en el cromosoma 14 y en este caso C-MYC se encuentra reordenado. La asociacin con el virus EB en este caso es slo del 20-30% en EE.UU y en algunos pases de Sudamrica es el 50-60%. En qu condiciones se produce la transformacin maligna en el caso de linfoma Burkitt endmico?. Una infeccin mantenida (malaria) produce un incremento de precursores B sobre todo clulas pre-B y para su regulacin una continua presencia de clulas T para intentar controlar el proceso; por otro lado el continuo estmulo a la proliferacin que el virus de EB produce sobre las clulas B, proporciona el marco ideal de posibilidad de linfomognesis, es decir un descontrol de la exagerada proliferacin de clulas B las cuales tienen que continuamente reordenar sus genes de Igs. Esto hace probable un incremento en lesiones y
reordenamientos genticos que involucran a CMYC. Otra paradigmtica alteracin gentica sera la producida por la translocacin t(14;18) (Q32, Q21) presente en un 85% de los linfomas foliculares y en un 20-40% en los difusos de clulas grandes. En este caso el protooncogn BCL-2 situado en el cromosoma 18 y que codifica una protena situada a nivel de la membrana mitocondrial, tiene como funcin normal la inhibicin de la apoptosis o muerte celular programada. Este gen est inactivado en la mayora de las clulas normales del cuerpo y solo est activado en algunos tipos de clulas tales como las neuronas y en las clulas progenitoras de la mdula sea, donde la inhibicin de la muerte celular es un proceso fundamental necesario para mantener estas clulas. La mantencin de la homeostasis de las dems clulas requiere un balance entre proliferacin y muerte. En el caso de la t(14,18) el oncogn BCL-2 se pone en contacto con regiones promotoras del gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Esto trae como resultado la expresin normal del gen BCL-2 y la sobreexpresion de su protena , la cual a su vez produce una inhibicin de la apoptosis, lo cual es una caracterstica de los linfomas de bajo grado. Estos linfomas se caracterizan por su ritmo proliferativo bajo y se pueden entender conceptualmente como desrdenes de acumulacin de clulas ms que de proliferacin. Sin embargo, la larga duracin de la vida de las clulas conlleva una mayor posibilidad de produccin de lesiones genticas que, eventualmente, llevaran a la transformacin maligna celular. Otra lesin gentica, la t(11; 14), pone en contacto el locus BCL-1 que es el mismo gen llamado Prad-1, de gran importancia en la progresin celular a travs del ciclo celular. Esta translocacin se ha asociado con linfomas del manto (centrocticos de Kiel) hasta en un 73% de los casos. Otras translocaciones como la t(14;19) donde se involucra el oncogn BCL-3, o la t(10;14) o la t(2;5), son translocaciones asociadas a subtipos concretos de linfoma. 3. PATOLOGA La clasificacin histopatolgica es el primer eslabn para poder conocer la historia natural de la enfermedad y el pronstico en este grupo tan heterogneo de neoplasias.
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A lo largo de las ltimas dcadas han ido apareciendo diferentes clasificaciones que inciden ms o menos en aspectos morfolgicos o aspectos inmunolgicos. La clasificacin de Rappaport que an siendo limitada, fue ampliamente usada y goz de gran predicamento en EE.UU por su utilidad clnica. Las clasificaciones ms usadas son la Working formulation (WF), sobre todo en EE.UU y la clasificacin de Kiel, prcticamente limitada a Europa.
Desde el punto de vista conceptual y biolgico, es ms precisa y completa la clasificacin de Kiel, al partir de conceptos de desarrollo antignico de los linfocitos e incorporando conceptos inmunolgicos e histognicos coherentes. Divide a la poblacin en dos grupos de riesgo y la ltima versin que se indica en la tabla 14-LNH-A-2, incorpora nuevas entidades con particularidades propias.
Tabla 14-LNH-A-2. Clasificacin de Kiel de los linfomas no Hodgkin Linfomas de clulas B Bajo grado Linfoma linfoctico y plasmoctico Leucemia de clulas peludas Linfoma linfoplasmocitoide plasmoctico Linfoma plasmoctico Linfoma centroblstico-centroctico Centroctico Alto grado Centroblstico Inmunoblstico Burkitt Linfoblstico Tipos raros Linfomas de clulas T Bajo grado Linfoma linfoctico (CLL) y plasmoctico Micosis fungoide Linfoepiteloideo (Linfoma de Lennert) Angioinmunoblstico(AILD, LgX) Zona T Clulas pequeas pleomrfico (HTLV -/+) Alto grado Clulas medianas y grandes pleomrfico (HTLV -/+) Inmunoblstico (HTLV -/+) Clulas grandes anaplstico (K-1 +) Linfoblstico
La WF (tabla 14-LNH-A-3) en realidad no es una clasificacin sino una reordenacin por subgrupos de linfomas en torno a tres grupos generales de linfomas de diferente historia natural y pronstico. Si desde el punto de vista patolgico no es tan correcta como la clasificacin de Kiel, a efectos clnicos s es
bastante reproducible y til. Un gran problema es que, recientemente, se han incorporando nuevas entidades clnico patolgicas y otras que no estn recogidas especficamente en esta clasificacin y cuya presencia se difumina entre los distintos grupos de sta.
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Tabla 14-LNH-A-3. Clasificacin de los linfomas no Hodgkin segn la Working Formulation (1992) Bajo grado Linfoma Linfoctico difuso de clulas pequeas Linfoma linfoctico plasmocitoide Linfoma folicular de clulas pequeas hendidas Linfoma folicular mixto Linfoma del manto Linfoma monocitoide clulas B Grado intermedio Linfoma folicular de clulas grandes Linfoma difuso de clulas pequeas hendidas Linfoma difuso mixto Linfoma difuso clulas grandes hendidas Linfoma difuso clulas grandes no hendidas Linfoma de Lennert Alto grado Inmunoblstico plasmocitoide Inmunoblstico clulas T Inmunoblstico epitelioide Inmunoblstico clulas claras Linfoblstico Linfoma de clulas pequeas no hendidas (Burkitt y no-Burkitt) Linfoma de clulas T Aild-Like Linfoma Anaplsico K-1 Leucemia-Linfoma de clulas T del adulto Miscelnea: Angiotrpico, Micosis fungoide, Histioctico, Compuesto
Sin duda las diferencias entre ambas clasificaciones ha llevado a que no exista concordancia entre patlogos de ambos continentes y que se hable un lenguaje distinto, sobre todo en entidades nuevas y que los resultados no se puedan comparar. En respuesta a esto un grupo de patlogos form un Grupo Internacional de Estudio de los Linfomas,
principalmente como un foro para la discusin de estas nuevas entidades, dando lugar a una nueva clasificacin que abarcara las dos clasificaciones previas, as como las nuevas entidades, naciendo la Revised EuropeanAmerican Lymphoma (R.E.A.L.), la que fue base de la clasificacin de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS/WHO) (tabla 14-LNH-A-4).
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Tabla 14-LNH-A-4. Clasificacin WHO/ R.E.A.L. Neoplasias de precursores clulas B Leucemia/Linfoma linfoblstico precursor B Neoplasias clulas B maduras Leucemia linfoctica crnica clulas B/Leucemia prolinfoctica/ Linfoma de linfocitos pequeos. Linfoma linfoplasmocitoide (Inmunocitoma) Linfoma de clulas del Manto Linfoma centro folicular, predominio folicular (Subtipo linfoma centro folicular, difuso clulas pequeas) Linfoma clulas B zona marginal Extranodal (linfoma MALT) Nodal (clulas B monocitoide) Linfoma clulas B zona marginal esplnico (linfocitos peludos circulantes) Leucemia clulas peludas Plasmocitoma/Mieloma Linfoma difuso clulas grandes B Linfoma Burkitt / Leucemia clulas Burkitt
Neoplasias de clulas T y Natural Killer Neoplasia de precursores clulas T Linfoma linfoblstico de precursor clulas T Neoplasias de clulas T maduras (perifricas) y Natural Killer Leucemia Linfoctica crnica de clulas T/ leucemia prolinfoctica Leucemia linfoctica de grandes grnulos Micosis fungoides/ sndrome de Sezary Linfoma de clulas T perifricas, inespecfica Linfoma angioinmunoblstico Linfoma angiocntrico Linfoma anaplstico de clulas grandes (clulas T y nulas) Linfoma de Hodgkin Predominio linfoctico nodular Linfoma de Hodgkin clsico Esclerosis nodular Celularidad mixta
4. HISTORIA NATURAL Conforme la WF los LNH se dividen en tres grupos de riesgo diferenciado: bajo grado, grado intermedio y alto grado. 4.1. Linfomas de bajo grado En los linfomas de bajo riesgo de malignidad, los ms frecuentes sin duda son los linfomas foliculares (mixtos o de clula pequea hendida) que constituyen en torno a un 50% de los pacientes. En este caso las clulas neoplsicas,
que corresponden a linfocitos B, for man agregados foliculares que tienden a recordar los folculos linfoides normales. Sus caractersticas citolgicas se parecen a algunas de las clulas del centro germinal normal. Como se describir en el punto 7 (tratamiento) estos linfomas tienen un poder proliferativo pequeo y se presentan en la mayora de las ocasiones en estadios avanzados III o IV del sistema Ann Arbor en ms del 80% de los casos. A pesar de lo extenso de su afectacin, slo en torno a un 10-15% de los pacientes presentan
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sntomas constitucionales. La mdula sea se encuentra muy frecuentemente afectada macr oscpicamente con caractersticos infiltrados paratrabeculares. Como ya se indic, estos linfomas foliculares se caracterizan por presentar una traslocacin (14,18) en un 85-90% de los casos y el gen BCL2 involucrado en esta anormalidad gentica representa no solo una marca para poder localizar y diagnosticar la enfermedad sino que su amplificacin, por efecto de la traslocacin, ocasiona una inhibicin de la apoptosis lo cual acarrea la acumulacin progresiva de clulas de larga duracin. Otra entidad de este grupo es el linfoma de linfocitos pequeos que difiere solo formalmente de leucemia linftica crnica; esta neoplasia expresa CD5 en la mayor parte de los casos y puede representar un bloqueo en la maduracin terminal de una clula B hacia una clula plasmtica. Con frecuencia estos pacientes presentan con hipogammaglobulinemia e inmunodeficiencia humoral adems de los fenmenos autoinmunes. El grupo de los linfomas linfoplasmocitoides como enfermedad Waldenstrom (especficamente cuando secreta IgM) representan un paso ms en la maduracin del linfocito y suelen presentar con adenopatas perifricas generalizadas y afectacin hepatoesplnica y de medula sea. Muy recientemente se ha introducido el concepto de linfoma de MALT que representa un grupo de linfomas que suelen ocurrir en reas extranodales tales como el estmago y el pulmn. Antiguamente fueron denominados seudo-linfomas. En estudios recientes se conoce que las clulas en estos linfomas son monoclonales y CD5 negativas. Estos linfomas tienden a recaer en reas extranodales, pero usualmente no se diseminan a la mdula sea o a ganglios linfticos y usualmente tienen un buen pronstico. La entidad recientemente descrita como linfoma monocitoide B se considera por algunos como la variedad ganglionar de estos linfomas MALT extranodales. 4.2. Linfomas de grado intermedio Los linfomas del grupo inter medio de malignidad tambin abarcan a otras tantas entidades histopatolgicas diferenciadas, sin embargo su comportamiento clnico y su
respuesta al tratamiento parece ser mucho ms homognea. El paradigma de este grupo por su frecuencia lo constituye el linfoma difuso de clulas grandes de la WF, centroblstico en la clasificacin de Kiel. Este grupo de linfomas se presenta en reas extranodales hasta en un 40% de los casos. Al igual que su mayor poder proliferativo, la frecuencia de sntomas B es tambin mucho mayor que en los linfomas de bajo grado. Estos linfomas, a diferencia de los de bajo grado de malignidad, en un 30-40% de los casos presentan en estadios I-II de Ann Arbor y no infrecuentemente la presentacin es extranodal. Otro grupo denominado linfoma del manto (mantle cell lymphoma) sera conceptualmente la forma inicial de lo que en su variedad difusa se ha denominado, linfoma linfoctico intermedio en EE.UU y linfoma centroctico en la clasificacin de Kiel. Su historia natural, pronstico y tratamiento son actualmente motivo de discrepancias y amplio debate. Caractersticamente expresan CD5 y con mayor proporcin a otros tipos de linfomas las cadenas livianas de las Igs son de tipo lambda (). 4.3. Linfomas de alto grado Los linfomas de alto grado de malignidad como el linfoblstico y Burkitt con sus distintas variedades son muy poco frecuentes en los adultos, por lo que son escasos los estudios que se han publicado. Son linfomas con un alto grado de proliferacin y con gran fr ecuencia se diseminan precozmente al sistema nervioso central, mdula sea y sangre perifrica. El linfoma linfoblstico presenta un inmunofenotipo de clulas T inmaduras en ms del 85% de los casos, expresando Tdt (desoxitimidin transferasa terminal) junto a los marcadores de clulas T CD2 y CD7; el 15% restante de los linfomas linfoblsticos corresponde a estirpe celular B expresando IgM citoplasmtica junto a antgeno pan B CD19, CD20 junto a CD10 (CALLA). Dentro de la presentacin clnica, el mediastino est comprometido hasta en un 50% de los casos, existiendo alto riesgo de compromiso extranodal, principalmente en el sistema nervioso central. Adems de la diseminacin frecuente al sistema nervioso central (SNC), mdula sea y sangre perifrica, en los varones, los testculos son frecuentemente afectados, ya
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sea en el momento de su presentacin o en la recidiva de la enfermedad. El linfoma Burkitt difiere en su presentacin clnica dependiendo de su variedad endmica o no endmica. En su forma endmica es frecuente su presentacin en grandes masas ganglionares en la regin mandibular sobre todo en los nios. En la forma no endmica sin embargo su presentacin ms frecuente es en forma de grandes adenopatas, sobre todo en el abdomen o bien afectacin intestinal a nivel ileocecal. La afectacin primaria de otros rganos como la mama, tiroides, riones o huesos no es rara y como se mencion la recidivas o diseminacin al (SNC) son frecuentes. 5. DIAGNSTICO 5.1. Anatoma patolgica El diagnstico histolgico es el primero que realiza el patlogo y es el que permite clasificar el tumor. Sin embargo debido a la dificultad de este cometido, al existir gran variabilidad en el diagnstico entre patlogos e incluso en el mismo patlogo, era necesario utilizar otras tcnicas ms objetivas. Gracias al reciente desarrollo tecnolgico, varias metodologas que permiten aportar informacin complementaria y valiossima al diagnstico morfolgico, han sido utilizadas y son mencionadas en el punto 5.2. 5.2. Citogentica, biologa citometra de flujo molecular y
reordenamientos genticos de segmentos gnicos conocidos como oncogenes o genes que codifican las Igs, TCR, etc. (ver captulo 30). Con estas tcnicas se puede conocer y definir la naturaleza de pequeas poblaciones celulares que constituyen muchas veces la poblacin neoplsica. Su utilidad prctica se destaca cuando se analizan derrames pleurales o asciticos sospechosos o cuando se analiza un aspirado de mdula sea y un aspirado de un ndulo o masa a cualquier nivel. Estas tcnicas pueden detectar una clula maligna entre 100 clulas y esta sensibilidad ha sido multiplicada apreciablemente mediante la tcnica reaccin de la polimerasa en cadena (PCR) que es capaz de encontrar un clula entre 100.000 o ms y que se vislumbra como una tcnica que debe ser rutinaria. Mediante sondas conocidas es posible determinar mediante la tcnica de PCR si un determinado fragmento gentico se encuentra reordenado en el material estudiado. Este mtodo presenta extraor dinaria importancia cuando se estudia la presencia de enfermedad residual mnima. En el trasplante de mdula sea, as como en otras circunstancias se estn llevando a cabo trabajos realmente importantes a este respecto, que pueden cambiar muchos conceptos formalmente establecidos hasta ahora, como son los criterios de curacin y significados de alteraciones genticas mantenidas. La citometra de flujo es una tcnica que se aprovecha de las propiedades visuales de la tecnologa del lser y de computadores automatizados que distribuyen las poblaciones celulares, frente a distintas propiedades como el tamao, o la birr efringencia cuando previamente se han teido con colorantes que mar can cidos nucleicos, antgenos de membrana, u otras molculas de forma que se puedan conocer las diferentes poblaciones que forman parte del tumor analizado (ver captulo 30). Con esta tecnologa se puede conocer el contenido de DNA, la fraccin de clulas que se encuentran en fase proliferativa activa, y en los distintas fases del ciclo celular. Estas proporciones varan entre diferentes tumores y concretamente existen claras diferencias entre los distintos grupos del linfomas de WF y sus propiedades proliferativas y contenidos en el DNA y RNA. Estas propiedades son tan interesantes que numerosos trabajos han correlacionado las caractersticas propias de estos tumores con el pronstico. Por otra parte, utilizando anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos, diferentes antgenos expresados en la membrana o en
La citogentica (ver captulo 30) es una tcnica de difcil realizacin y que probablemente ser sustituida con otras ms sencillas de hacer e interpretar. En el punto 2 se mencionaron algunas de estas alteraciones como la t(8,14), t(2,8) o t(8,22) en el linfoma Burkitt y la t(14,18) en los linfomas foliculares o las expresadas en la tabla 14-LNH-A-1 y que son relacionadas con determinados tipos morfolgicos de linfomas y lo que es tambin importante con caractersticas clnicas y pronsticas. Por tanto, mediante este mtodo se consigue informacin valiosa de determinadas alteraciones genticas que, a su vez, proporciona medios de conocer la biologa del tumor y en muchos casos su pronstico. Con sondas de DNA y RNA y mediante las tcnicas Southern Blot o Northern Blot se puede deter minar la pr esencia de
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citoplasma de las clulas neoplsicas pueden ser detectados, ya sea en tejido fresco, o en parafina, o en un lquido corporal. Estos antgenos son expresados en diferentes momentos dentro del ciclo celular y tambin dependiendo de si la clula se encuentra en forma activada o latente. Algunos antgenos detectados por anticuerpos monoclonales como el Ki-67 o PCNA (Proliferative Cellular Nucleolar Antigen), se correlacionan con el poder proliferativo del tumor. Otros anticuerpos como Ki-1 sirven para definir clulas que muy posiblemente repr esenten una entidad clinicopatolgica diferenciada. Otr os anticuerpos monoclonales sirven para poder conocer el inmunofenotipo de las clulas al expresar stas determinados antgenos de un cierto linaje celular. Su caracterizacin permite conocer el tipo celular o lnea inmunofenotpica de la neoplasia estudiada y su diferente biologa y/o pronstico. Con los mtodos antes mencionados se puede definir con mayor precisin las caractersticas biolgicas de estas clulas, comparado con el solo anlisis morfolgico de ellas. Finalmente, la tcnica de microarray (microarreglo) ha sido usada para definir la expresin gnica de varias neoplasias linfoides y compararlas con la expresin gnica en poblaciones linfoides normales. Esta tcnica se ha aplicado a linfomas de clulas grandes con el fin de identificar patr ones de expresin gnica que se correlacionen a pronstico, lo que permitira focalizar las terapias en relacin a genes activados o inhibidos, lo que se correlacionara a pronstico. 6. DIAGNSTICO DE EXTENSIN La evaluacin pretratamiento de estos linfomas va enfocada a conocer su extensin y aquellos factores pronsticos que permiten saber el riesgo y por tanto ajustar el tratamiento conforme a ste. Esta evaluacin consiste en trminos generales en las siguientes pruebas diagnsticas: a) Historia completa y examen fsico con especial inters en presencia de adenopatas, aumento del tamao de rganos como el hgado y el bazo, exploracin del anillo de Waldeyer, testculos, presencia de lesiones drmicas, examen neurolgico completo, etc. b) Perfil sanguneo y bioqumico con especial inters en la LDH, 2 microglobulina y albmina. c) Radiografa de trax. d) TAC (Tomografa axial computarizada) de
abdomen y/o trax, dependiendo de los hallazgos de la radiografa de trax. e) Biopsia bilateral de mdula sea. f) Otras pruebas opcionales seran: Radiografas del tracto digestivo en pacientes con sangre oculta en heces o afectacin del anillo de Waldeyer. g) Puncin lumbar con citologa, as como TAC craneal en pacientes que presenten hallazgos neurolgicos, linfoma testicular, linfoma linfoblstico o que tengan afectacin de mdula sea por linfoma del grupo intermedio o alta de la WHO. h) Pruebas de funcionalidad pulmonar y cardiaca sern realizadas en aquellos pacientes donde bien la radioterapia o drogas como adriamicina van a administrarse. i) Pruebas de biologa molecular o anlisis de inmnofenotipo, al igual que marcadores de proliferacin se realizarn en la medida de las posibilidades diagnsticas del centro. 7. TRATAMIENTO 7.1. Manejo de los linfomas de bajo grado (LBG) a) LBG estadio I-II La lenta progresin de los linfomas foliculares y su clasificacin como linfomas de bajo grado, al dar la impresin de ser tumores de buen pronstico, se han convertido en los principales obstculos para el avance en la bsqueda de su curacin. La realidad es que la supervivencia global a 10 aos es solo 40%, la que vara entre 70% en etapas I-II y 30% en etapas IV. Si bien el pronstico en etapas precoces es favorable, el pronstico a mediano plazo es malo en las etapas avanzadas que son las ms comunes, ya sea por la natural progresin de la enfermedad, como por su transformacin a un linfoma ms agresivo, linfoma difuso de clulas grandes, siendo el riesgo de transformacin de 44% a 5 aos y 67% a 10 aos. Esta transformacin determina mayor resistencia a tratamiento con una supervivencia post-transformacin de 20% a 2 aos. ltimamente se tiende a enfocar a los linfomas foliculares desde sus inicios como una enfer medad sistmica. A travs de la etapificacin clnica, examen fsico, radiografa de trax, tomografa computada de abdomen y pelvis y biopsia de mdula sea en cresta iliaca bilateral, el 15% de los linfomas foliculares son catalogados en etapas I-II. Si a esto se le agrega lapar otoma exploradora, se encuentra
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enfermedad abdominal oculta en 40-60% de los casos, es decir solo el 6% de los pacientes son realmente etapas I-II. En el 85%-90% de los linfomas foliculares se encuentra la t(14;18), pudindose detectar an en etapas tempranas a travs de PCR en sangre y mdula sea. Esta tcnica es capaz de detectar entre 1/100.000 hasta 1/1.000.000 de clulas con el reordenamiento de BCL-2-JH. Segn estudios realizados en Hospital MD Anderson (MDACC) en linfomas foliculares en etapas iniciales (I-II), se encontr que el 73% de los casos fueron positivos en la deteccin de este reordenamiento en la sangre. Esto indicara que la enfermedad es sistmica desde sus inicios. Si bien es cierto que los estadios precoces son raros, fue en esta poblacin donde primero se vio la posibilidad de una prolongada supervivencia libre de enfermedad. Dentro de los primeros intentos teraputicos estuvo la radioterapia, ya sea con campos limitados al rea afectada o con extensin regional o an como radioterapia nodal completa (RNC). El utilizar campos irradiados restringidos requiere un estudio de etapificacin agresivo, con laparotoma y esplenectoma. De lo contrario si la etapificacin es solo clnica, se recomienda radioterapia nodal completa para tratar la enfer medad oculta. Sin embargo la RNC presenta severa toxicidad gastrointestinal y medular, incluyendo mielodisplasia, lo que hace difcil su aplicacin. En la experiencia sin laparotoma de etapificacin del Hospital St Bartoholmew con radioterapia (RT) solo sobre las reas afectadas, la supervivencia libre de enfermedad (SLE) a 10 aos fue de 50% y la supervivencia actuarial a 5 aos fue de 79%. En Princess Margaret con R T sobre campos afectados o RT regional, la SLE a 10 aos fue de 53% y la supervivencia especfica por enfermedad fue de 74%. En Stanford, con una poblacin tratada ms joven que el promedio en que 1/3 fue sometida a etapificacin quirrgica, la SLE a 10 aos fue de 54%. Visto de otra manera, en etapas precoces los linfomas foliculares tratados con RT a 10 aos tienen un 50% de recadas y un 25% de ellos fallecen a causa de la enfermedad. En un intento por mejorar los resultados se ha agregado quimioterapia. En la experiencia de MDACC se utiliz COP-Bleo (Ciclofosfamida, Oncovin, Prednisona-Bleomicina) y en los pacientes con factores de riesgo tal como LDH elevada, masa voluminosa o compromiso extranodal se agreg doxorrubicina (CHOPBleo), administrndose RT solo en los sitios
comprometidos. La SLE y la supervivencia global a 5 aos fue de 74% y 89%, respectivamente, lo que es claramente superior a la SLE de 40-50% que se obtiene con RT sola. La experiencia de St Bartholomew con quimioterapia ms RT es similar. Es decir, con el enfoque de terapia asociada actualmente se est obteniendo que un importante porcentaje de linfomas foliculares en etapas precoces se mantengan sin evidencia de enfermedad por tiempo prolongado; si esto corresponde a curacin requiere de un seguimiento ms prolongado. b) LBG estadio III-IV Frente a la gran mayora de los linfomas de bajo grado que se estadifican como etapas IIIIV (>85%), inicialmente cay un manto de pesimismo (enfer medad incurable) y de abandono (watch/wait, w/w abstencin teraputica, observacin) a pesar de ser una entidad ampliamente respondedora a un gran espectro de dr ogas ya sea como monoquimioterapia (clorambucil, ciclofosfamida, fludarabina, prednisona) o en combinacin (COP, CHOP, ESHAP), a la vez que responden a RT y terapias biolgicas (interfern, anticuerpos monoclonales). Entre los tratamientos con monoquimioterapia, el cloranbucil es tal vez el ms ampliamente difundido, demostrando que es bien tolerado, con respuestas de 70%, con un 30% de remisiones completas y con una duracin media de la remisin tpicamente de 2 aos, pero con la mayora de los pacientes eventualmente falleciendo de linfoma. En el National Cancer Institute de EE.UU se compar en etapas III-IV, la poltica de watch/ wait (w/w) contra terapia agresiva (PROMACEMOPP) ms R T en aquellos pacientes que alcanzaron remisin completa. La poblacin se randomiz equilibradamente y es comparable en cuanto a edad, sexo, e histologas, excepto en relacin a sntomas B que predominan en el grupo tratado. A los 5 aos, solo el 35% de los pacientes en w/w no han requerido algn tratamiento y el 15% han transformado a una histologa ms agresiva (tabla 14-LNH-A-5). La supervivencia gobal es similar, reflejando probablemente el rescate que se obtiene al tratar la progresin pero la SLE es 12% en w/w contra 51% en tratamiento precoz y la posibilidad de estar continuamente libre de enfermedad solo se logra con tratamiento precoz (51% vs. 0%). Hay que destacar que solo en la poblacin libre
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de enfermedad se puede eventualmente hablar de curacin (tabla 14-LNH-A-6). Igualmente hay que destacar que la calidad de vida es superior para los enfermos que recibieron tratamiento precoz ya que 51% han logrado la remisin continua mientras que la mayora de los w/w han recibido tratamiento continuo debido a los pobres resultados de la quimioterapia en este grupo en el momento de la pr ogresin. En la experiencia con poliquimioterapia se observa posiblemente una
respuesta ms rpida y sobre todo en pacientes de mayor riesgo esta puede ser mejor, lo cual es difcil de probar en un estudio, ya que, posiblemente, frente a un enfermo de riesgo (ej. sntomas B, masa mediastnica, compromiso extranodal) se escoja poli-quimioterapia con doxorrubicina. En MDACC con estadios avanzados (IV) tratados con CHOP se obtuvo un 77% de remisiones completas pero con una curva de continua recada.
Tabla 14-LNH-A-5. Distribucin por estadio Ann Arbor de la poblacin en observacin y en tratamiento precoz (Estudio SWOG) Estadios Ann Arbor III- A III-B IV- A IV- B En observacin (%) 16 0 82 2 En tratamiento (%) 20 2 62 16
Tabla 14-LNH-A-6. Resultados entre observacin y tratamiento precoz en Linfomas no Hodgkin grado bajo, seguimiento medio 5 aos, estadios III-IV En observacin Nmero pacientes Pacientes vivos Pacientes fuera de tratamiento Pacientes vivos sin enfermedad Pacientes continuamente libres de enfermedad c) Nuevas estrategias El sello de los linfomas foliculares es la t(14;18), presente en el 85% de los casos, esta traslocacin causa una transposicin del gen BCL-2, que normalmente se encuentra en el cromosoma 18 banda 21 a un nuevo lugar en el cromosoma 14, al lado de la banda q32 justamente prximo al gen de la cadena pesada de Ig (JH). Este cambio genera un nuevo cromosoma con la traslocacin t(14;18), en donde el gen BCL-2 se activa, posiblemente como consecuencia de la proximidad con las secuencias promotoras de inmunoglobulinas, (JH). Este reordenamiento ocurre dentro de una zona pequea del BCL-2, llamada mbr (major breakpoint regin) en el 85% de los casos y en un 10% ocurre el punto de quiebre denominado 41 83% 31% 12% 0% Tratamiento precoz 43 84% 58% 51% 51%
mcr (minor clust regin). Se ha comprobado, por PCR, la presencia del gen en todas las etapas clnicas, previo tratamiento. En aquellos en que eran positivos previo tratamiento (CHOP) en que clnicamente se lograba remisiones completas, la mayora persistan positivos para bcl-2 por PCR. Tanto en la experiencia de Griben como de Cabanillas se demuestra que el rgimen CHOP es incapaz de inducir remisiones completas moleculares. La importancia de sta se puede inferir de dos estudios; en el primero Gribben demostr que pacientes sometidos a megadosis de quimioterapia con radioterapia seguido de trasplante autlogo de mdula sea lograban negativizar el PCR en mdula sea en un 57%. Ninguno de estos casos recay despus de un seguimiento de 6 aos. En cambio en los pacientes en que el PCR postrasplante era
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persistentemente positivo, 71% recayeron. En otro grupo los resultados de PCR fluctuaron entre positivo y negativo. Su evolucin demostr una frecuencia de recada intermedia de 36%. Estos resultados no demuestran, definitivamente, si las clulas de linfoma residuales provienen del
tumor no erradicado o provienen de la mdula reinfundida, pero s demuestran que la persistencia de positividad por PCR despus de trasplante es el ms firme indicador pronstico de recada (tabla 14-LNH-A-7).
Tabla 14-LNH-A-7 Relacin entre remisin molecular y clnica (n:134). Categoras postratamiento Gupo 1: PCR negativo inmediatamente persistentemente postABMT Gupo 2: PCR post-ABMT pero revierte a normal varios meses despus. Grupo 3: PCR positivo persistentemente post-ABMT. Grupo 4: PCR fluctuante entre positivo y negativo post-ABMT una muestra positivo y otra negativo al mismo tiempo.
ABMT, Trasplante Autlogo de Mdula sea.
n 58
Recadas (%) 0
19
35 22
71 36
Dentro de las drogas activas en linfomas foliculares, destaca la Fludarabina, con alta actividad como agente nico o en combinacin en terapias de primera lnea o tratamiento de recadas post CHOP. El esquema FND (Fludarabina, mitoxantrona, Dexametasona), logra excelente respuestas clnicas con alto porcentaje de remisiones moleculares. Las terapias con inclusin de anticuerpos monoclonales rpidamente han ganado aceptacin como un importante componente en los tratamientos de los linfomas de clulas B, tanto de bajo grado como agresivos. Estos anticuerpos tienen varios mecanismos de accin incluido activacin del complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, bloqueo de receptor y activacin de apoptosis. Rituximab (Mabthera) un anticuerpo monoclonal anti-CD20, induce respuesta completa y parcial en 50 a 60% de los linfomas foliculares indolentes, con sobre 40% de posibilidad de responder en caso de recada tratada nuevamente con el anticuerpo. Dado la baja posibilidad de mielosupresin o efectos adversos, comparado a esquemas de quimioterapia, es una buena opcin en pacientes con recada de linfoma de bajo grado.
La no existencia de toxicidad cruzada con quimioterapia, los diferentes mecanismos de accin y la sinergia tanto in vitro como in vivo, han llevado a mltiples trabajos de combinacin de quimioterapia con Rituximab. En todos ellos, se ha demostrado un beneficio en trminos de respuestas totales, SLE y remisiones moleculares. ltimamente se ha demostrado que la mantencin cada 6 meses con Rituximab por 2 aos ha resultado en una alta taza de SLE. Anticuerpos murinos incorporando radioinmunoterapia con 131 I (tositumomab) o Yttrium90 (90Y) (ibritumomab) han dado buenos resultados en trabajos de investigacin al igual que antigen CD22 o anticuerpos anti-idiotipo. 7.2. Manejo de los linfomas de grado intermedio Los linfomas de grado intermedio, definidos de acuerdo a la WF, o agresivos segn OMS/WHO fueron el primer grupo de enfermedades linfoproliferativas que lograron ser curables, y es donde en los ltimos 25 aos ha habido un gran nmer o de ensayos clnicos e investigacin. El ms comn de los linfomas de este grupo es el linfoma difuso de clulas
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grandes, que constituye el 33% de todos los linfomas. La mayora (90%) son de estirpe celular B. El linfoma folicular de clulas grandes, es tambin de grado intermedio aunque tiende a comportarse ligeramente ms indolente que su contraparte difusa, pero se considera de grado intermedio. Hay consenso en que estas dos patologas son curables, aun en etapas avanzadas. En cuanto al linfoma inmunoblstico considerado en la WF como de alto grado, su comportamiento clnico y su respuesta a tratamiento difiere poco del linfoma difuso de clulas grandes, por lo que se considerar, al igual que el linfoma de clulas grandes K-1 positivo, en este grupo para fines de evaluacin y teraputica. En este grupo de linfomas si se obtiene remisin completa y se mantiene por ms de tres aos, la posibilidad de recada es muy escasa, por lo tanto la mayora de los pacientes despus de este periodo se pueden considerar curados. Hay que hacer la salvedad que los linfomas foliculares de clulas grandes pueden tener recadas ms tardas. En cuanto a los linfomas difusos mixtos ocurren ms infrecuentemente, la mayora son de estirpe celular T y pueden ser incluidos en la categora de linfomas de clulas T perifricos, siendo el linfoma de Lennert una variacin de este subtipo. La experiencia es escasa y la potencialidad de cura es menor. En cuanto a los linfomas difusos de clulas pequeas hendidas, son tumores muy particulares por lo que nos referiremos a ellos en forma separada. Antes de evaluar la terapia de los linfomas de grado intermedio es importante considerar clasificarlos segn factores pronsticos. El conocido estadiaje Ann Arbor por s solo no es adecuado. Bastantes estudios han confirmado que aspectos clnicos como LDH, Beta2-microglobulina (2m), masa y tamao tumoral, estado funcional (perfomance status), nmero de sitios extranodales y nmero de sitios nodales correlacionan bien con el pronstico de los linfomas de clulas grandes. Muchos de estos factores son interrelacionados. Es as como los niveles de 2m y LDH pretratamiento reflejaran la masa tumoral y algunas caractersticas inherentes al tumor en su relacin con el husped y la respuesta inmunolgica de este hacia la neoplasia correlacionndose claramente con el pronstico. En el ltimo tiempo se ha validado el uso del Inter national Index, un sistema de estratificacin sencillo y capaz de predecir la supervivencia de enfermos con linfoma de grado intermedio. ste es el resultado de un estudio cooperativo entre 16 instituciones de EE.UU,
Europa y Canad en que se analizaron 2031 pacientes con diagnstico de linfoma difuso mixto, difusos de clulas grandes o inmunoblstico, todos tratados con esquemas basados en doxorrubicina. El sistema se elabor con el fin de predecir la supervivencia global basndose en aspectos clnicos que reflejaran el crecimiento y potencial invasivo del tumor (estadio Ann Arbor, LDH, nmero de sitios de enfermedad extranodal), la respuesta del paciente al tumor (Perfomance Status) y la capacidad del paciente de tolerar el tratamiento intensivo (edad, perfomance status). El anlisis concluy que cinco caractersticas pretratamiento tenan significancia; edad (60 vs >60 aos), estadio Ann Arbor (I-II vs III-IV), nmero de sitios de enfer medad extranodal (1vs >1), perfomance status (0/1 vs 2) y LDH (normal vs elevada). Cada una de estas variables se asocian en forma independiente y comparable con el riesgo de fallecer del paciente, por lo que el riesgo relativo puede ser caracterizado por la adicin de los diferentes factores de riesgo presentes al momento del diagnstico. De esta manera se configuran 4 grupos de riesgos basados en el nmero de factores desfavorables, relacionndose su puntuacin con la obtencin de remisin completa y la supervivencia libre de recada y supervivencia global (tabla LNH-A-8). Una observacin importante es la relacin existente entre obtencin de remisin completa y la supervivencia tanto libre de enfermedad como global. El inconveniente de este sistema es el uso de variables subjetivas como son estado funcional (perfomance status) adems de que discrimina en diferentes grados de riesgo; bajo, bajo-intermedio, alto-intermedio y alto, lo cual dificulta la decisin teraputica para aquellos grupos intermedios. La 2m ha demostrado utilidad en discriminar como factor pronstico cuando su valor es >1.5 veces el valor normal entre pronstico muy favorable (83% SLE a 3 aos, con 93% sobrevida global) y muy mal pronstico (24% SLE a 3 aos, con 46% sobrevida global). La expresin de la protena BCL-2 en linfomas de clulas grandes B ha sido reportado como factor adverso, mientras la expresin de BCL6 se correlaciona con mejor resultado. La utilidad de un ndice de riesgo, es agrupar los casos por histologa y factores de riesgo en enfoques teraputicos diferentes, lo que permite discriminar en la intensidad de la terapia de acuerdo con pronstico. De esa manera se pueden comparar resultados en estudios de poblaciones de riesgo similar tratados con terapias de baja intensidad (CHOP o similar) intermedio (Mabthera CHOP) o alto riesgo (trasplante).
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Tabla 14-LNH-A-8. Distribucin de los grupos de riesgo de acuerdo a la puntuacin de International Index, correlacin con remisin completa (RC) post-tratamiento, supervivencia libre de enfermedad (SLE) y supervivencia global International Index 0,1 2 3 4,5 Riesgo Bajo Bajo-Intermedio Alto-Intermedio Alto RC % 87 67 55 44 SLE a 5 aos (%) 70 50 49 40 Sobrevida global a 5 aos (%) 73 51 43 26
Manejo de los linfomas de grado intermedio La mayora de la literatura publicada hasta ahora, se basa en el estadio Ann Arbor y de esta manera se ha visto que en enfer medad localizada (AA I-II) el manejo solo con radioterapia da una SLE de 25-30%, cuando se agrega quimioterapia la supervivencia global y la SLE se incrementan a 60-90%, pero como se vio antes persiste la discrepancia en la definicin a travs de AA de enfermedad mnima o voluminosa. La literatura parece apoyar la idea de que etapas AA I-II sin enfer medad voluminosa pueden ser curados en un 75-80% con una combinacin de quimioterapia que contenga doxorrubicina. La dosis de quimioterapia puede ser reducida de los usuales 6 ciclos a 3, consolidando luego con radioterapia sobre los sitios comprometidos. En cuanto al tratamiento de las etapas avanzadas de linfomas de clulas grandes no hay duda del papel de la quimioterapia, la que se inici al principio de la dcada del 70 utilizando ciclofosfamida, vincristina, prednisona con (CMOPP) o sin procarbazina, (COP). Luego se agreg adriamicina crendose el CHOP llegando a ser el rgimen ms ampliamente conocido y luego en los mediados de los 80 se crearon regmenes intensos basados en las hiptesis de Goldie y Coldman que supona la aparicin espontnea va mutacin de clulas tumorales
resistentes a una o ms drogas, independiente de la exposicin de esta clula a una determinada droga. Al exponer la poblacin tumoral al mximo de dr ogas posibles precozmente se evita la supervivencia y posterior progresin de clulas tumorales resistentes. La otra hiptesis en boga en ese perodo fue la de Hryniuk y Bush concerniente a la intensidad de dosis que postulaba que la muerte de la clula tumoral se relacionaba a la intensidad de un programa de tratamiento, calculado por los miligramos de droga por semana. De esta manera se crearon los regmenes llamados de tercera generacin basados en estas dos teoras; mximo nmero de drogas, a dosis mxima en un perodo de tiempo mnimo. Los regmenes creados obtenan RC en el rango de 70-80% pero con un seguimiento escaso y una edad media de 45 aos, reportndose diferentes tasas de recada, en un rango de 30-40%. En vista de esta discordancia el SWOG realiz un estudio randomizado en 899 pacientes con linfomas de grado inter medio o alto, excluyendo los linfoblsticos, entre CHOP, m-BACOD, MACOPB y ProMACE-CytaBOM. La randomizacin fue homognea en relacin a edad, histologa y factores de riesgo. La respuesta a tratamiento fluctu entre 80 y 87%, con RC entre 44 y 56%, sin diferencia significativa en cuanto a supervivencia libre de enfer medad y supervivencia global (tabla 14-LNH-A9).
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Tabla 14-LNH-A-9. Relacin entre tratamiento, remisin completa molecular y recada de enfermedad
Tratamiento CHOP-B ATT Total
n 20 23 43
RC molec 4(20) 19(83) 23
Recadas en RC molec 0 0 0
Fallas molec 16(80) 4(17) 20
Recadas en fallas molec 5(31) 2 (50) 7(35)
RC, remisin completa; ( ), porcentaje; molec, molecular
El gran avance de los ltimos aos es la incorporacin de los anticuerpos monoclonales. El uso de anticuerpo anti-CD20 (Rituximab = Mabthera) ha demostrado mejor SLE y sobrevida global. La combinacin Rituximab con esquema tipo CHOP se ha convertido en el estndar para linfoma agresivo con factores de riesgo como edad avanzada. El grupo francs GELA demostr en un estudio fase III en Linfomas clulas grandes CD20 (+) en edades entre 60 y 80 aos Rituximab-CHOP versus CHOP remisin completa (75 vs 63%), SLE a 2 aos (57% vs 38%) y sobrevida global a 2 aos (70% vs 57%) favoreciendo la combinacin Rituximab CHOP sobre CHOP solo, considerndose actualmente la combinacin Rituximab-CHOP el esquema sobre el que se debe comparar nuevos protocolos teraputicos. Esto ha llevado a investigar el uso de intensificacin con altas dosis de quimioterapia seguido de trasplante autlogo de clulas troncales hematopoyticas (TCTH-A), como parte de la terapia inicial en pacientes con factores de mal pronstico. En esta lnea, recientemente se present la experiencia del Groupe OuestEst des Leucmies et des Autres Maladies du Sang (GOELAMS) en 197 pacientes con Linfoma no Hodgkin agresivo, descartando linfoblstico, manto y Burkitt, con mximo 2 factores de riesgo segn IPI (Indice de Pronstico Internacional). Se randomiz entre CHOP x 8 vs. quimioterapia induccin seguido de autotrasplante. El resultado fue similar en pacientes con bajo IPI, es decir bajo riesgo, y mejor SLE y sobrevida global en pacientes de alto riesgo. Esto confirma la hiptesis que al diferenciar las terapias segn factores de riesgo, debe intensificarse el tratamiento en la poblacin de alto riesgo, quedando el esquema CHOP o similar para riesgos bajos. Estn en curso investigaciones con
intensificacin de dosis junto a uso de anticuerpos monoclonales. Terapia de rescate A pesar de los avances, tanto en el conocimiento de la enfermedad como de su tratamiento, persiste una poblacin ya sea refractaria a la terapia inicial o que presentan recada. Esto ha derivado en la investigacin de los regmenes llamados de rescate principalmente con altas dosis de quimioterapia con soporte de TCTHA. En este punto lo fundamental es la sensibilidad del tumor a la quimioterapia. La supervivencia de los pacientes que son primariamente refractarios a su quimioterapia inicial es prcticamente cero. De la misma manera en los enfermos que han recado, pero permanecen respondedores a los tratamientos de rescate (recada sensible) la SLE a 3 aos es alrededor de 36% contra 14% en pacientes resistentes a terapia, siendo la variable quimiosensible o quimiorresistente el ms importante factor en relacin a predecir la respuesta a TCTH-A. En cuanto a qu quimioterapia usar, al principio de la dcada de los 80, se inici una serie de protocolos ensayando drogas sin resistencia cruzada con la quimioterapia inicial, generalmente en base a doxorrubicina. El primer rgimen llamado MIME (Metil-GAG, Ifosfamida, Metotrexato, y Etoposido) dio una RC de 33% con una supervivencia a 3 aos de 20%. Posteriormente, basndose en la observacin del sinergismo entre platino y altas dosis de Ara-c se ide el rgimen DHAP (Dexametasona, altas dosis de Ara-c, Platino) obtenindose RC prolongada en 29%. El ms reciente esquema de rescate, fundamentalmente para pacientes tratados previamente con CHOP o regmenes similares, es la integracin de dos regmenes MINE (Mesna, Ifosfamida, Mitoxantrona, Etopsido)
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llegando a mxima respuesta y luego cambiar a ESHAP (Etopsido, Solomedrol, altas dosis de Ara-c, Platino) consolidando con altas dosis de quimioterapia (BEAC) y TCTH-A. La respuesta global a 28 meses es de 44% de RC mantenidas con 50% de supervivencia. Si se desglosa la poblacin en linfomas inter medios o transformados, se encuentra que los LGI tienen a 22 meses una supervivencia de 58% con 55% de RC mantenidas en contraste con los linfomas transformados en que la supervivencia es 38% a 14 meses con solo 20% de RC mantenidas a 8 meses. Hay que destacar que estos resultados se obtienen en pacientes respondedores a la induccin con MINE-ESHAP como requisito para la consolidacin con TCTH-A. Los no respondedores tanto como los transformados tienen un peor pronstico. Ahora bien, qu papel juega en las recadas sensibles una mayor intensificacin con TCTHA, es una pregunta con una respuesta clara. En 1988 se inici el estudio cooperativo entre Europa, Australia y USA, denominado estudio de PARMA. En este estudio, se trataron 163 pacientes con LNH grado intermedio y 52 pacientes con alto grado, todos en recada posterapia con Doxorubicina. Los pacientes fueron tratados con DHAP (Dexametasona, altas dosis de Ara-C, Platino); aquellos que respondieron despus de dos cursos de quimioterapia (r ecada sensible) fueron randomizados entre 4 cursos ms o consolidacin con BEAC (BCNU, Etopsido, AraC, Ciclofosfamida) seguido de TCTH-A. De 215 pacientes enrolados, el 58% fue sensible al tratamiento de rescate, 25% tuvo remisin completa y 34% remisin parcial, y por lo tanto randomizados. La SLE a 5 aos fue de 46% en el grupo trasplantado y 12% en el grupo de quimioterapia sin trasplante (p= 0.001) y la supervivencia global fue 53% y 32%, respectivamente (p=0.038). Se concluy que en los pacientes en r ecada, sensibles a quimioterapia, el tratamiento con altas dosis de quimioterapia con TCTH-A mejora la SLE y la supervivencia global en comparacin a la terapia estndar. La experiencia de agregar anticuerpos monoclonales a los esquemas de rescate y de consolidacin mejora los ndices de respuesta y eventualmente la sobrevida libre de enfermedad y sobrevida global. Como se indic antes, son los pacientes que no alcanzan remisin completa en los primeros ciclos de tratamiento los que tienen pocas posibilidades de lograrlo con los subsiguientes
ciclos, siendo esto vlido tanto en casos sin previo tratamiento como a aquellos en recada. Esto ha llevado a plantear la opcin de trasplante alognico, especialmente no mieloablativo (mini-trasplante) como una opcin en casos primariamente refractarios o recadas postrasplante. La experiencia es alentadora, con SLE sobre 50%, lo que abre una nueva opcin a pacientes de muy mal pronstico. 7.3. Manejo de los linfomas de alto grado Corresponden a esta categora el linfoma de clulas pequeas no hendidas, linfoma linfoblstico y linfoma inmunoblstico. Tal como se mencion anterior mente, el linfoma inmunoblstico, a pesar de ser agresivo y con alta fase S, se considera una variante de los linfomas difusos de clulas grandes, y se trata como tal. El linfoma de clulas pequeas no hendidas, consistente de dos variantes patolgicas, tipo Burkitt y no Burkitt, que no difieren en su presentacin clnica ni en la respuesta a tratamiento, siendo ms frecuente en nios, pero en relacin a infeccin por HIV, su frecuencia ha aumentado en la poblacin adulta relacionndose claramente a las alteraciones inmunolgicas secundarias a la infeccin por este virus. Este tumor de clulas B, tiene el ms alto ndice de crecimiento dentro de las neoplasias, siendo su diagnstico una emergencia oncolgica, por lo que se debe iniciar tratamiento a la brevedad. Dado su gran sensibilidad a la quimioterapia y su alto ndice mittico, estos pacientes tienen elevado riesgo de complicarse con sndrome de lisis tumoral, por lo que todas las medidas profilcticas deben tomarse y en caso de complicarse se deben implementar medidas de sostn tales como hemodilisis e ingreso a una unidad de cuidados intensivos, con lo que se logran claras posibilidades de curacin. Dada la alta tendencia a compromiso del SNC, es mandatorio su evaluacin inicial y nfasis en la profilaxis durante el tratamiento. En MDACC se ha usado un esquema de HyperCVAD con buena tolerancia y respuesta similares a esquemas ms complicados y txicos (BFM). Los linfomas linfoblsticos, son tumores de clulas T, cuya frecuencia no es superior al 5% de los linfomas en adulto, siendo el linfoma ms frecuente en nios. Frecuentemente se presenta en hombres jvenes, con masa mediastnica, y sndrome de vena cava superior. El compromiso
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de mdula sea es frecuente y biolgicamente es la misma entidad que la leucemia linfoblstica aguda de clulas T y debe tratarse como tal . El uso de esquemas tipo CHOP dan una supervivencia inferior a 10% a dos aos, con una media de 17 meses. Recientemente, en estas dos entidades, se ha comunicado del uso de altas dosis de Ara-c y Metotrexato alternando con altas dosis fraccionadas de ciclofosfamida, vincristina y doxorrubicina junto a terapia intratecal, producen RC en un rango de 80-90% con SLE a 2 aos de alrededor 6070%. Manejo de Linfoma del Manto Esta entidad recin es reconocida a partir de la clasificacin REAL, en que se une morfologa y origen de la clula neoplsica. La clasificacin de la OMS la describe como de tamao intermedio con cromatina nuclear irregular, es la contraparte de clulas normales de los folculos primarios y de la zona del manto de los folculos secundarios. La arquitectura del ganglio es generalmente difusa, pero puede ser nodular debido al crecimiento centrpeto de las clulas desde la zona del manto, obliterando los folculos ger minales (simula Linfoma folicular) y de ah la confusin en clasificaciones antiguas al calificarlo de linfoma de bajo grado. El inmunofenotipo es: CD20(+), CD5(+), CD10(-), CD23(-). Citogenticamente, la marca es la t(11;14)(q3;q32), con sobre-expresin de cclina D1, la que acorta la fase G1, facilitando el paso a fase S. Clnicamente, se presenta en estadios avanzados, III-IV, con compromiso medular (92%) y gastrointestinal (88%) el que es en forma difusa y multicntrico. En este ltimo caso destaca el compromiso de colon en la forma de papulosis linfomatoide (80%) y gstrico (60%). El Linfoma del Manto es una enfermedad sistmica, con compromiso usual gastrointestinal, mdula sea/ sangre y adenopatas. Los esquemas basados en doxorubicina clsicos (CHOP, ASHAP) dan una sobrevida libre de enfermedad de 1.5 aos con una sobrevida global de 3 aos. Anlogos de Purinas (Fludarabina) no demuestran mejores resultados; las respuestas son cortas, con recadas continuas, precoces a diferencia de Linfomas foliculares de bajo grado. En agregar Rituximab a los esquemas CHOP no mejoraron los resultados. El esquema HyperCVAD que
combina ciclofosfamida fraccionada con doxorubicina, vincristina y dexa, alternando con dosis altas de metotrexato y ARA-C son los primeros en lograr altas tasas de remisiones completas con sobrevida libre de enfermedad francamente superior a esquema CHOP. El esquema HyperCVAD mejora sus resultados al agregar Rituximab, con remisin completa de 87%, con sobrevida libre de enfermedad a 3 aos de 67% y sobrevida global de 81%. Otras estrategias como quimioterapia altas dosis secuenciales incluyendo Rituximab han dados resultados similares a R-HyperCVAD. Nuevas estrategias como trasplante alognico no mieloablativo ha dado excelentes resultados en una poblacin de alto riesgo o recada y junto con los agresivos esquemas de primera lnea actualmente disponibles, permiten buena opcin de curacin sobre todo en pacientes menores de 65 aos. Manejo Linfomas de Zona Marginal El trmino linfoma de zona marginal (MZL) comprende 3 subtipos, nodal, primario esplnico, extranodal y de tipo linfoma asociado a mucosa (MALT), este ltimo el ms frecuente y conocido como linfoma MALT gstrico. La clula neoplsica es un linfocito maduro, tpicamente expresan CD20(+), CD79(+), CD5(-), CD10(-),CD 23(-), y expresan el antgeno asociado a zona marginal CD21 y CD 35. La demostracin de restriccin de cadena liviana de Inmunoglobulina es importante en la diferenciacin con procesos inflamatorios crnicos. La no expresin de CD5 permite la diferenciacin con linfoma del manto y linfoma de linfocitos pequeos, la no expresin de ciclina D1 lo diferencia con linfoma de manto y la no expresin de CD10 los diferencia de linfomas foliculares. El ms estudiado y frecuente linfoma MALT gstrico, se origina en una infeccin crnica por H Pylori, logrndose regresin completa post erradicacin con antibiticos del agente causante. Es importante recalcar que la involucin post erradicacin del H Pylori tarda no menos de 6 meses en hacerse evidente, por lo que su seguimiento y controles endoscpicos deben ser cada 6 meses. Las otras manifestaciones clnicas de esta variedad de Linfoma comparten el comportamiento clnico de lesin indolente y de buen pronstico vital aun con persistencia de lesin. Salvo en el caso gstrico, en que el tratamiento es antibiticos, no est definido el tratamiento, sugiriendo manejo local, ciruga o radioterapia y no esquemas agresivos de quimioterapia.
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Hay una extensa variacin geogrfica en la incidencia de los LNH del nio a travs del mundo, desde 6,1/milln nios (<15 aos) en Inglaterra y Japn a 90,1/milln reportado en frica, particularmente en relacin a incidencia de linfomas a clulas B. En EE.UU los linfomas corresponden al 13% de los cnceres peditricos, representando los LNH el 60% de ellos. En Chile, por los datos registrados en el Programa Infantil de drogas antineoplsicas (PINDA), los LNH corresponden al 7,5% de todas las neoplasias en menores de 15 aos, con una incidencia anual de 25 casos. Existe un claro predominio del sexo masculino con una relacin de 2:1 segn las distintas casusticas. La mayor incidencia es entre los 7 a 10 aos, pudiendo ser afectadas todas las edades.
LINFOMA NO HODGKIN PEDITRICO 3. ETIOLOGA Carmen Salgado M. 1. INTRODUCCIN Los linfomas no Hodgkin (LNH) peditricos representan un grupo heter ogneo de enfermedades que difieren del adulto en que son casi siempre diseminados, difusos y de alto grado de inmadurez, de lnea T o B, con frecuente compromiso extranodal, medular o Sistema nervioso central (SNC). En las ltimas dcadas el tratamiento quimioterpico ha mejorado considerablemente la sobrevida, y ms recientemente una mejor caracterizacin clnica y biolgica ha permitido la identificacin de diversos subtipos de LNH, que difieren en su pronstico y tratamiento. En el futuro el mejor conocimiento de la patogenia molecular de estos tumores permitir desarrollar estrategias especficas al tipo celular del tumor lo que ofrecer una esperanza para mejorar la sobrevida de los pacientes en etapas avanzadas o resistentes, y reducir los efectos adversos asociados al tratamiento. 2. EPIDEMIOLOGA Los linfomas son la tercera neoplasia ms frecuente en pediatra, despus de las leucemias y tumores del SNC. Es uno de los pocos tumores peditricos cuya incidencia ha aumentado en las ltimas 3 dcadas por razones an no bien dilucidadas. Como en la mayor parte de los cnceres, la etiopatogenia contina siendo un tema de mltiples investigaciones; pero hay algunos hechos que estn involucrados en su patogenia: a) Alta actividad del tejido linfoide durante la infancia y la adolescencia. Esto se traduce en un alto ndice de reordenamiento molecular para producir inmunoglobulinas (Igs) especficas y otros factores requeridos para la respuesta inmune nor mal. La transformacin maligna puede ocurrir en cualquiera de las subpoblaciones de las clulas linfoides cuando se producen defectos genticos secundarios a delecin, mutacin o traslocacin, lo que puede interrumpir el reordenamiento normal de los genes. b) Rol viral. Hay evidencias que incriminan a los virus en la patogenia de algunos linfomas; as el retrovirus HTLV-1 se ha involucrado en una forma de sndrome leucemia/linfoma a clulas T del adulto, particularmente en Japn hecho que no se ha encontrado en los LNH-T del nio. El virus de Epstein Barr (VEB) ha sido fuertemente ligado a linfomas B, basado en el descubrimiento de presencia de copias del VEB en el genoma del DNA de las clulas del linfoma de Burkitt africano asociado a ttulos altos de anticuerpo (VCA) en la gran mayora de los casos de regiones tropicales (95%), en contraste con regiones templadas donde slo se ha demostrado en 20-25% de los casos. El
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conocido tropismo del VEB por las clulas B asociado a infecciones repetidas especialmente malaria, y desnutricin, produciran una inmunosupresin en las clulas T e hiperplasia de clulas B que potenciaran el efecto de infeccin por el VEB; una consecuencia de ello sera un aumento en la posibilidad de cambios genticos incluyendo la traslocacin caracterstica que compromete el brazo largo del cromosoma 8 (regin q23; q32) como parte de la t(8:14) (q24; q32); t(2:8)(p12;q24) y t(8:22) (q24;q11) que se ve en 85% de los casos; esto permite plantear que dichos tumores se originan como consecuencia de cambios genticos y la infeccin viral inmortalizara clulas con una traslocacin especfica. Las traslocaciones cromosmicas comprometen el oncogn C-MYC localizado en el brazo largo del cromosoma 8 y los genes de Igs, lo que es caracterstico en linfoma Burkitt. El virus de inmunodeficiencia humana (VIH) como resultado de una profunda deplecin de clulas T helper predispone a una variedad de tumores incluyendo linfoma B, linfoma Hodgkin, LNH-T y Sarcoma de Kaposi. Las caractersticas de los linfomas asociados a VIH son habitualmente la localizacin extranodal especialmente de piel. En los LNH-T las anormalidades cromosmicas son heterogneas. En el linfoma anaplstico de clulas gigantes en nios se ha descrito una traslocacin especfica t(2:5(p23;q 35) en ms del 80% de
los casos que produce una fusin de los genes de nucleofosfomina (NPM) del cromosoma 5 con el gen de tirosina kinasa ALK del cromosoma 2, cuya consecuencia an no est bien definida, ste es encontrado en la mayora de las proliferaciones celulares de clulas T o nulas, favoreciendo una proliferacin celular con disminucin de la apoptosis. c) Inmunodeficiencias. Varias de las inmunodeficiencias congnitas y adquiridas se asocian con LNH: Ataxia telangectsica, Sndrome de Wiskott Aldrich, inmunodeficiencia severa combinada, agammaglobulinemia, deficiencia de IgA, e Inmunodeficiencias secundarias a trasplantes de rganos. 4. CLASIFICACIN Han existido varias clasificaciones (Rappaport, Kiel, Working formulation) cuyo mayor problema ha sido la diversidad de criterios para su diagnstico lo que implicaba formulaciones de diversos nombres para similares entidades y con dudosa validez prctica y cientfica en cada una de ellas. En la actualidad, en la prctica peditrica hay un mayor consenso para utilizar la clasificacin REAL (Revised European American Lymphoma Classification) diseada en 1993, que es una actualizacin del esquema de Kiel, incorporando el inmunofenotipo y dividiendo los LNH en neoplasias de clulas B o T y clasificndolas como de alto o bajo grado de malignidad (tabla 14-LNH-P-1).
Tabla 14-LNH-P-1. Comparacin de clasificacin de Kiel y REAL para LNH Peditrico Kiel Burkitts REAL Burkitts (42%) Clulas B alto grado Tipo Burkitts (4%) Precursor B linfoblstico (5%) Precursor T linfoblstico ( 20%) Difuso clulas gigantes B (3%) (Mediastnico esclerosante primario 0.4%) Perifrico clulas T inespecfico y clulas grandes T Anaplstico clulas gigantes T o nulas (Ki-1 +)
Linfoblstico B Linfoblstico T Centroblstico B Inmunoblstico Pleomrfico y clulas grandes T Anaplstico a clulas gigantes (Ki-1 +)
REAL = Revised European American Lymphoma classification
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En nios prcticamente todos los LNH son difusos y predominantemente de 3 tipos: a) Linfoma linfoblsticos En general corresponden al 24-30% de los LNH y hay 2 categoras: (i) precursores clulas T (90%) y (ii) precursores de clulas B (5%). Desde el punto de vista morfolgico son indistinguibles de la LLA; son TdT (+) y los precursores de clulas T co-expresan (CD2, CD3, CD7, CD5, los precursores de clulas B co-expresan (CD19, CD22, Cd79 y en menor proporcin CD10 y HLA-DR.-Clnicamente comprometen mediastino, ganglios perifricos, piel, hueso con o sin compromiso de mdula sea o SNC. b) Linfoma a clulas B maduras Burkitts o tipo Burkitts Corresponden al 42-50% de los casos; son caractersticamente de clulas redondas pequeas con nuclelos mltiples y abundante citoplasma basoflico y con vacuolas. Inmunolgicamente expresan Ig de superficie y otros marcadores de clulas B y son TdT (-). La mayor parte de los casos tienen una traslocacin que compromete el oncogn CMYC: t(8:14), t(2:8) y t(8:22) que se ve en 15% de los casos. Comprometen predominantemente abdomen y ganglios perifricos. c) Linfoma anaplstico de clulas gigantes Representan el 10-15% de los LNH en nios. El diagnstico se basa en los criterios morfolgicos por clulas de gran tamao pleomrficas con ncleos mltiples y uno o ms nuclelos muy prominentes y en la expresin en las clulas tumorales de los antgenos CD30 ( Ki-1), EMA y del receptor de IL2. La traslocacin t(2:5)(p23;q35) ha sido descrita en ms del 80% de los casos y puede ser detectado por PCR e inmunohistoqumica. Las clulas expresan marcadores de clulas T o nulas. Desde el punto de vista clnico se caracterizan por compromiso ganglionar perifrico, mediastnico o intraabdominal, por la frecuencia de sntomas B y compromiso extranodal, en particular piel y pulmn. 5. CLNICA Los LNH peditricos se presentan generalmente con evidencia de enfermedad generalizada. Son
neoplasias de crecimiento muy rpido, siendo el tipo de tumor que ms frecuentemente se asocia a emergencias oncolgicas, ya sea por compresin del tumor en estructuras vecinas (sndrome de compresin de vena cava superior), o por liberacin de metabolitos que conducen a alteraciones metablicas severas (sndr ome de lisis tumoral). Pueden comprometer cualquier grupo ganglionar o compromiso extranodal, siendo los ms habituales: hueso, piel, mdula sea, testculos y SNC. Habitualmente la clnica de presentacin se correlaciona con el subtipo celular de LNH. A continuacin se describen los sitios ms frecuentes de presentacin de LNH peditrico en EE.UU, Europa y Chile: Compromiso Abdominal. Es la presentacin ms frecuente de los LNH tipo Burkitts, manifestndose como masa abdominal de rpido crecimiento, que se inicia ms comnmente en el leon terminal, pudiendo dar sntomas sugerentes de una invaginacin intestinal o sangramiento, con o sin perforacin del intestino, con rpida invasin del mesenterio e infiltracin del rin, hgado y bazo. Compromiso mediastnico. Se presenta en el 25-30% de todos los LNH, especialmente en el linfoma linfoblstico y algunos linfomas a clulas gigantes. Pueden presentar derrame pleural de tipo hemorrgico y sntomas de obstruccin de vena cava superior, como: disnea, obstruccin respiratoria, ingurgitacin yugular, edema facial y derrame pericrdico. Habitualmente se asocia a adenopatas supraclaviculares, y tiene alta tendencia a comprometer mdula sea y SNC. Enfermedad localizada. Cualquier grupo ganglionar puede comprometerse, siendo ms frecuentes la regin de cabeza y cuello, incluyendo anillo de Waldeyer y huesos faciales y compromiso cutneo. Compromiso del SNC. El compromiso del SNC primario es raro excepto postransplante de rganos, pero el compromiso secundario a la diseminacin de la enfermedad es frecuente, particularmente en el linfoma linfoblstico y el linfoma tipo Burkitts. Se manifiesta por sndrome de hipertensin endocraneana o sndrome menngeo, compr omiso de nervios craneanos o convulsiones.
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En la tabla 14-LNH-P-2 se resumen las caractersticas histolgicas, inmunolgicas,
citogenticas y clnicas de los LNH peditricos.
Tabla 14-LNH-P-2. Caractersticas histolgicas, inmunolgicas, citogenticas y clnicas de los LNH peditricos Caractersticas Localizacin tpica Citomorfologa Histologa Inmunofenotipo Linfoblstico Mediastino anterior y medio L1 - L2 Linfoblstico Lnea T (90%) Lnea B (5%) TdT (+) Citogentica Heterogneo Tipo Burkitts Abdomen L3 Clulas pequeas no clivadas IgS (+ Lnea B TdT (-) t (8.14) t (2:8) t (8:22) Anaplstico a clulas gigantes Ninguna especfica Clulas grandes plemrficas Lnea T o nula CD 30(+) t (2.5)
LNH, linfomas no Hodgkin; L1, L2, L3, clasificacin FAB; IgS = inmunoglobulina de superficie
6. DIAGNSTICO Y ETAPIFICACIN Despus de una anamnesis cuidadosa y exhaustivo examen fsico, las investigaciones deben estar destinadas a establecer, lo ms rpido posible, el diagnstico y la extensin de la enfermedad para iniciar el tratamiento adecuado. A menos que el diagnstico se pueda establecer por la citologa de un derrame corporal o mdula sea, la biopsia de la masa debe realizarse por el mtodo menos invasivo si no se trata de una masa resecable, obteniendo material necesario para estudio histolgico, de inmunofenotipo, citogentico y de biologa molecular. Una vez certificado el diagnstico, todos los pacientes
deben ser sometidos a estudios de mdula sea (mielograma), puncin lumbar para estudio de lquido cefalorraqudeo (LCR), estudios de imgenes: radiografa trax, tomografa axial computarizada, (TAC), de abdomen y del sitio primario del tumor; cintigrama seo, resonancia nuclear magntica (RNM) cerebral en caso sospechoso de compr omiso de SNC y exmenes de laboratorio que incluyen: Hemograma, estudios de funcin heptica y renal, deshidrogenasa lctica, cido rico, calcemia, fosfemia y electroforesis de protenas. En la tabla 14-LNH-P-3 se muestra la etapificacin ms usada para el LNH del nio. Todos los tumores primarios mediastnicos y abdominales difusos se consideran etapa III.
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Tabla 14-LNH-P-3. Etapificacin Murphy modificada para LNH peditrico Etapa I II Caractersticas Tumor nico nodal o extranodal, excepto abdomen y mediastino. Un tumor extranodal con compromiso ganglionar regional. Tumor abdominal resecable. Dos o ms reas ganglionares al mismo lado del diafragma. Tumor primario intratorcico. Tumor abdominal difuso, no resecable. Tumor epidural o paraespinal. Dos reas ganglionares a distinto lado del diafragma. Cualquiera de los anteriores con compromiso inicial del SNC o mdula sea (< 25% blastos).
III
IV
7. FACTORES PRONSTICOS Con el tratamiento quimioterpico agresivo actual, la posibilidad de curacin es sobre 70% en los distintos subtipos de LNH. Cada tipo requiere un tratamiento especfico por lo que el ms significativo factor pronstico en la actualidad parece ser la eleccin de la terapia correcta, basado en un meticulosa definicin del tipo de tumor. Otros factores importantes son: Etapa clnica. Pacientes en etapas avanzadas (III o IV) tienen peor pronstico, debiendo utilizar terapias ms intensas para aumentar la sobrevida. Los hechos clnicos que persisten como factores adversos en la actualidad son: En LNH-B, (i) la presencia de infiltracin de mdula sea >70%, el compromiso inicial del SNC y los niveles elevados de LDH; (ii) la falta de respuesta precoz al tratamiento (persistencia de masa tumoral >30% despus de los primeros ciclos de quimioterapia). En el LNH anaplstico el compromiso inicial de mediastino, piel, seo, pulmonar y la presencia de sntomas B.
grupo de trabajo, cercanas al 80% en los diferentes subgrupos de LNH. El tratamiento tiene dos pilares fundamentales: la terapia de apoyo y la terapia especfica. 8.1. Terapia de apoyo Es comn en todo tipo de LNH y en general, en todo paciente con cncer. Contempla el manejo de las complicaciones de la enfermedad (sndrome anmico, hemorragparo, infeccioso, alteraciones metablicas, nutricionales y psicolgicas) y de su tratamiento. Especial mencin requiere el manejo de la prevencin y manejo del SLT, que es frecuente de observar en este tipo de tumor, cuyo tratamiento adecuado per mite evitar la nefropata por cido rico, que aparece como consecuencia de la rpida destruccin de la clulas tumorales. La prevencin se realiza mediante una hidratacin vigorosa, antes del inicio de la quimioterapia con 3000-4000 mL/ m2/da; diuresis forzada (Furosemida 0,5-1 mg/ Kg) si fuera necesario con el objeto de mantener una diuresis entr e 100-250 ml/m 2 /h; alcalinizacin de la orina y el uso de alopurinol. El uso profilctico de urato oxidasa (uricozime) una enzima uricoltica natural que cataliza la oxidacin de cido rico a alantoina que es 510 veces ms soluble que el cido rico y fcilmente excretada por el rin y ampliamente usada en los protocolos de los franceses (SFOP) ha reducido los riesgos de lisis teraputica especialmente en LNH-B en etapas avanzadas; por lo que se considera til su uso en la
8. TRATAMIENTO Con los avances obtenidos en los ltimos aos especialmente en lo relacionado a un mejor conocimiento de la biologa de estos tumores la sobrevida libre de enfermedad (SLE) de estos pacientes ha alcanzado cifras, en los distintos
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actualidad frente a pacientes con alto riesgo de SLT, como pacientes con grandes masas abdominales, y/o hiperleucocitosis. 8.2. Tratamiento especfico El tratamiento especfico debe plantearse de acuerdo al subtipo de LNH y a su etapa clnica, y factores pronsticos. Consta de tres pilares: a) Ciruga. En general debe reservarse para biopsia o reseccin de masas residuales despus de un tratamiento intensivo. La ciruga inicial extensa est fuertemente contraindicada, especialmente en localizaciones mediastnicas y abdominales extensas. b) Radioterapia. Probablemente tenga un rol en el control de la enfermedad refractaria y en pacientes con linfoma primario del SNC. c) Quimioterapia. Es la modalidad de tratamiento en todos los tipos de LNH considerando que se trata de una enfermedad generalizada y su protocolo est directamente relacionado al tipo y etapa clnica del linfoma. Muchos esquemas de tratamiento se han empleado en el tratamiento de los LNH: Etapas localizadas. Requieren terapia menos intensa que etapas avanzadas, excepto en linfomas linfoblsticos. Tanto los grupos americanos Pediatric Oncology Group (POG) y Childrens Cancer Study Group (CCSG) han reportado cursos cortos de quimioterapia (aproximadamente 6 meses) usando los pr otocolos clsicos con Ciclofosfamida, Vincristina, Metotrexato y Prednisona (COMP) o Ciclofosfamida, Doxorubicina, Vincristina y Prednisona (CHOP), con sobrevidas superiores al 90%. En el caso de los linfomas linfoblsticos los estudios del POG reportaron resultados inferiores, por lo que actualmente todos los grupos cooperativos han excluido este tipo de linfoma de los cursos cortos de quimioterapia, utilizando regmenes de mayor duracin tipo leucemia linfoblstica. Etapas avanzadas: Linfomas linfoblsticos. El uso de regmenes de quimioterapia intensa similares a la leucemia linfoblstica ha per mitido alcanzar sobrevida libre de eventos entre 75-90%. Los mejores resultados se han obtenido con protocolos
como BFM 90, LSA2 L2 modificado, St Jude RH y LMT- 81. La profilaxis del SNC con quimioterapa intratecal (QT IT) y altas dosis de metotrexato es necesaria en todos los pacientes en etapas avanzadas, pudiendo omitirse la radioterapia de crneo excepto en pacientes con compromiso inicial del SNC. Linfomas B. Con protocolos modernos la sobrevida es cercana al 90%. (Protocolos de la SFOP; BFM y POG). La quimioterapia til consiste en regmenes intensos de corta duracin (6 meses) utilizando agentes alquilantes junto a otros agentes activos como metotrexato en dosis intermedias o altas, vincristina, antraciclinas, etopsido y dosis altas de aracytin, especialmente en pacientes con factores adversos. La Radioterapia local no juega ningn rol y la profilaxis del SNC con drogas intratecales parece ser suficiente. El manejo de complicaciones al ingreso y durante el tratamiento es fundamental. Linfomas anaplsticos a clulas gigantes. Los mejores resultados se han obtenido con protocolos similares a clulas B (Protocolos BFM, SFOP, Ingleses). Se debe estratificar el tratamiento de acuerdo a factores de riesgo, siendo los factores de mayor riesgo el compromiso inicial de mediastino, piel y/o visceral.
Las futuras estrategias de tratamiento estn dirigidas a utilizar la menor intensidad de quimioterapia posible, sin disminuir la efectividad, con el objeto de evitar toxicidad a corto y largo plazo. Se utilizarn terapias especficas (anticuerpos monoclonales de mayor uso en los linfomas de alto grado del adulto) y se evaluar el uso de tcnicas de deteccin de enfer medad residual en la evolucin y tratamiento de los pacientes. LECTURAS SUGERIDAS Eden, O.B. Lymphomas. In Pediatric. Hematology. Lilleyman, J., Hann, I., Blanchette, V. (eds.) Churchill Livinstone. HarcourBrace and Company; pp. 565-573, 1999. Harris, N.L., Jaffe, E.S., Stein, H. et al. A Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms: A proposal From the International Lymphoma Study Group. Blood 84(5); 13611382,1994.
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GAMMAPATAS MONOCLONALES Mauricio Ocqueteau T. 1. INTRODUCCIN Las discrasias de clulas plasmticas (CPs) constituyen un grupo heterogneo de enfermedades que se caracterizan por una expansin de CPs monoclonales, es decir, con origen en un clon celular singular, en la mdula sea, y por la produccin de una inmunoglobulina monoclonal, tambin llamada pr otena o componente M (CM). Las inmunoglobulinas monoclonales producidas por las CPs patolgicas suelen migrar en la fraccin gamma () cuando son sometidas a una electroforesis, razn por la cual estas discrasias son tambin denominadas gammapatas monoclonales. En tr minos generales, la protena monoclonal al igual que ocurre con las Igs normales- est constituida por dos cadenas pesadas de igual clase y subclase (cadenas H) y dos cadenas ligeras del mismo tipo (cadenas kappa, lambda, ). Sin embargo, en algunas discrasias es posible detectar slo a un fragmento de la molcula de Ig, como ocurre en la enfermedad por cadenas pesadas o livianas, con expresin exclusiva de las cadenas , en el primer caso y en el segundo (tambin conocida como enfermedad de Bence-Jones). As, salvo estas ltimas excepciones, las Igs comprometidas en estas entidades son estructuralmente similares a su contrapartida normal, estando presentes en cantidades elevadas simplemente por el gran nmero de CPs clonales que las originan. Desde el punto de vista funcional se ha logrado demostrar, en ensayos in vitro, actividad de anticuerpo contra distintos antgenos, principalmente de origen bacteriano y, ms an, contra pr otenas autlogas (factores de coagulacin, antgenos eritroides, protenas del SNC, etc). Sin embargo, en la inmensa mayora de los pacientes no se logra demostrar una actividad especfica de la inmunoglobulina monoclonal. Desde un punto de vista clnico, el hecho de tener su origen en un clon celular nico monoclonal- no necesariamente significa que se trate de una neoplasia, si bien el concepto inverso es vlido para todos los cnceres (es decir, todos ellos son de origen monoclonal), dado que existen diversos ejemplos de expansiones monoclonales que nunca llegan a constituir una neoplasia, al menos clnicamente
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evidente. El ejemplo ms caracterstico de expansin de CPs que permanece bajo control sin progresin hacia tumor de crecimiento continuo se denomina gammapata monoclonal de significado incierto (ms conocida por sus siglas anglosajonas MGUS, monoclonal gammopathy of undetermined significance),
mientras que el ejemplo ms genuino de pr oliferacin de CPs que escapa a los mecanismos de control y desarrolla una enfermedad maligna lo constituye el mieloma mltiple (MM). La incidencia de las distintas gammapatas monoclonales est representada en la tabla 14-GM-1.
Tabla 14-GM-1. Incidencia y frecuencia relativa de las diferentes formas de Gammapata Monoclonal Gammapata Monoclonal MGUS Mieloma Mltiple Macroglobulinemia de Wldenstrom Enfermedad de Cadenas Livianas Enfermedad de Cadenas Pesadas Amiloidosis Crioglobulinemia
* Nmero de casos nuevos/100,000 habitantes por ao.
Incidencia 1 5% 3 5* < 1* < 1* < 1* < 1* < 1*
Frecuencia relativa 65 70% 12 20% 1 4% < 1% < 1% 2% < 1%
2. ESTUDIO INMUNOLGICO DE LAS GAMMAPATAS MONOCLONALES Dado que el captulo 30 se refiere a los mtodos de estudio de las GM, aqu slo se aplicar, resumidamente, un esquema operacional para el estudio de las GM (tabla 14-GM-2). 2.1. Pesquisa de una protena monoclonal La protena monoclonal se detecta por una imagen muy particular en el estudio electrofortico de las protenas sricas y/o urinarias, electroforesis que puede realizarse en soportes de acetato de celulosa o agarosa. La imagen consiste en una fraccin proteica concentrada, de mayor o menor intensidad, dependiendo de su concentracin, y de lmites muy netos con migracin desde las globulinas 2 hasta las globulinas . En el densitograma es caracterstica la presencia de una curva aguzada, elevada y de base estrecha, en relacin con el sitio de migracin de la protena monoclonal.
El componente monoclonal corresponde al producto de la secrecin de muchas clulas provenientes de un clon nico de clulas plasmticas. Son protenas homogneas, idnticas entre s, lo que explica su migracin puntual en la electroforesis de protenas (EFP). Mediante la EFP pueden diferenciarse los componentes monoclonales de los policlonales, correspondiendo estos ltimos a respuestas inmunolgicas fisiolgicas a las estimulaciones antignicas importantes como son las infecciones. En ocasiones existiendo una neoplasia monoclonal de clulas plasmticas, el CM no aparece en la EFP sricas. Esta circunstancia puede observarse en la enfermedad de cadenas livianas, mieloma IgD, enfermedad de cadenas pesadas y en el mieloma no secretor, afeccin en la cual la protena monoclonal, indetectable en sangre y orina, puede observarse e identificarse en el interior de los plasmocitos de la mdula sea por inmunofluorescencia directa.
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Tabla 14-GM-2. Estudio inmunolgico de las GM En sangre (suero) Electroforesis de protenas Inmunoelectroforesis de protenas (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, , ) Inmunofijacin de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, , ). Cuantificacin de inmunoglobulinas Viscosidad srica 2-microglobulina Protena C reactiva (PCR) IL-6 En orina Proteinuria Proteinuria 24 hrs. Electroforesis de protenas (orina concentrada) Inmunoelectroforesis de protenas (cadenas livianas y = protenas de Bence Jones) Inmunofijacin de cadenas livianas de inmunoglobulinas
2.2. Identificacin de una protena monoclonal Frente a la pesquisa de un CM electrofortico o an sin detectarlo claramente cuando se sospecha un mieloma mltiple, macr oglobulinemia, amiloidosis u otras enfermedades relacionadas, se debe realizar una inmunoelectroforesis o una inmunofijacin de inmunoglobulinas sricas. Inmunoelectroforesis. Esta tcnica es muy til para la identificacin de la protena monoclonal, es decir la clase de cadena pesada y el tipo de cadena liviana de la inmunoglobulina comprometida. Brevemente, consiste en una electr oforesis srica seguida de una inmunoprecipitacin de las cadenas pesadas y livianas de las inmunoglobulinas que contiene la muestra empleando antisueros poli, tri y monovalentes en geles de agarosa. Inmunofijacin. Esta tcnica, permite objetivar con bastante certeza la cadena pesada y liviana de la inmunoglobulina monoclonal del paciente, empleando al igual que la inmunoelectroforesis, la muestra a investigar (en 6 diferentes posiciones) en placas de agarosa para obtener, por electroforesis, la separacin de las protenas de acuerdo con su carga neta. En la segunda etapa se aplican los anticuerpos
monoespecficos en 5 de los 6 trazados electroforticos para que la fijacin ocurra. El informe y por ende el diagnstico se facilita puesto que el procedimiento permite comparar el nivel de migracin del CM, si lo hay, con las lneas de precipitacin de las cadenas monoclonales comprometidas. La inmunofijacin puede realizarse en suero, orina, lquido cefalorraqudeo, etc. y posee una mayor sensibilidad y poder de resolucin que la inmunoelectroforesis. 2.3. Cuantificacin de inmunoglobulinas La cuantificacin o dosificacin de inmunoglobulinas se realiza mediante tcnicas de inmunodifusin radial y ltimamente por nefelometra. Su medicin permite establecer un ndice pronstico (enfermedad benigna o maligna), mantener un control evolutivo del tratamiento y detecta precozmente el inicio de una inmunodeficiencia. 2.4. Viscosidad srica Los pacientes portadores de una GM pueden evolucionar con sntomas de hiperviscosidad. La hiperviscosidad se define en base al aumento de la viscosidad relativa del suero sanguneo comparada con el agua. El valor normal es de
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1.8, es decir el suero sanguneo es hasta 1,8 veces ms viscoso que el agua. Las manifestaciones clnicas suelen aparecer con cifras de 5 a 6 y comnmente esto ocurre cuando el CM corresponde a IgM, IgG3 e IgA. 2.5. Beta-2 microglobulina Esta protena que forma parte de la estructura de las molculas clase I del Sistema Principal de Histocompatibilidad (cadena liviana del heterodmero) se encuentra en la superficie de todas las clulas nucleadas. Puede medirse en suero como en orina y sus niveles constituyen un factor pr onstico en los sndromes linfoproliferativos, particularmente en el MM. Los pacientes con niveles elevados tienen una sobrevida significativamente ms corta que los portadores de GM con niveles normales. Las cifras elevadas se relacionan con activacin y destruccin de linfocitos. Los valores normales son 1.15-2.03 mg/L. Como se excreta por el tbulo renal puede aumentar en las insuficiencias del rin. 2.6. Protena C reactiva La cuantificacin de la PCR srica es empleada comnmente para objetivar la presencia de un proceso inflamatorio, aunque inespecficamente. Los niveles de esta protena se elevan en los pacientes con GM particularmente en el MM. La IL-6 estimula la produccin de PCR y la medicin de sta, por lo tanto, indirectamente refleja los niveles de IL-6. Su valor normal es hasta 0.6 mg/dL. 2.7. Interleuquina-6 Siendo la IL-6 un factor de crecimiento de la clula plasmtica tumoral, un aumento de su nivel srico, constituye un ndice de malignidad, severidad y, por ende, de mal pronstico de las GM. La IL-6 srica es indetectable en sujetos sanos o en MGUS, (<1 pg/mL), a diferencia de los enfermos con gammapatas monoclonales malignas (GMM), en los cuales los niveles pueden ser de 20, 30 o ms pg/mL. 2.8. Estudios inmunolgicos en orina Estos estudios inmunolgicos deben realizarse en orina total de 24 horas, porque es importante conocer el total de la proteinuria diaria y porque para varias tcnicas se requiere concentrar la orina 50, 100 200 veces, para pesquisar
concentraciones mnimas de las protenas monoclonales excretadas. La electroforesis de protenas ha de hacerse con orina concentrada, particularmente cuando la proteinuria es pequea, para destacar el CM urinario en el trazado electrofortico, para lo cual se utilizan soportes de acetato de celulosa o agar osa. La inmunoelectr oforesis y/o inmunofijacin de protenas urinarias tienen por objeto identificar las protenas de Bence Jones, que como se dijo corresponden a las cadenas livianas monoclonales o de las molculas de inmunoglobulinas. Las protenas de Bence Jones pueden observarse durante la evolucin de una GM tpica y en la enfermedad de cadenas livianas en la cual hay una gran produccin de cadenas livianas o monoclonales. 3. GAMMAPATA MONOCLONAL DE SIGNIFICADO INCIERTO 3.1. Aspectos generales La MGUS es la alteracin clonal ms frecuente de las CPs, presente entre un 1% y un 5% de la poblacin mayor de 50 aos y hasta en un 10% de los mayores de 80 aos cuando se analiza la presencia de una protena monoclonal con tcnicas como la electroforesis de acetato. Sin embargo, si se utilizan tcnicas de mayor sensibilidad estas cifras se elevan an ms. As, se han reportado incidencias de hasta un 5% en individuos sanos entre 22 y 65 aos y de 78% sobre los 55 aos cuando se utiliza electroforesis de acetato de alta resolucin. Esta entidad se caracteriza por la proliferacin de un clon singular -o en un 2 a 3% de los casos de dos clones diferentes- de CPs, con la capacidad de producir una protena monoclonal, pero en ausencia de elementos sugerentes de MM, macroglobulinemia, amiloidosis, etc. En trminos generales, los pacientes con MGUS presentan un componente-M < 3g/dL, menos de un 10% de CPs en mdula sea, escasa o nula cantidad de protena-M en la orina y ausencia de compromiso sistmico como lesiones seas, anemia, hipercalcemia o compromiso de la funcin renal. 3.2. Evolucin de las MGUS en el tiempo Desde el punto de vista evolutivo, la MGUS puede dar origen a un MM caracterstico, situacin que se observa, sin embargo, en slo una minora de los pacientes. En el clsico estudio de la Clnica Mayo, de 241 pacientes seguidos durante 24 a 38 aos, 42 de ellos
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(17,4%) desarrollaron un MM, 7 (2,9%) una macroglobulinemia y 8 (3,3%) una amiloidosis primaria; un 10% adicional de pacientes incrementaron el componente monoclonal en suero, aunque sin llegar a tener elementos clnicos de enfermedad. Considerando esta informacin, la tasa actuarial de transformacin de las MGUS es de 14% a 10 aos y de 29% a 20 aos, para los casos con IgG como protenaM, y de 18% y 37%, respectivamente, para aquellas MGUS IgA. Sin embargo, tanto en el estudio de la Clnica Mayo como en otros no se ha podido establecer patrones que permitan predecir con claridad qu grupo de enfermos tiene un mayor riesgo de sufrir progresin a MM. Por esta razn, y desde el punto de vista clnico, la progresin desde una entidad benigna a una maligna est definida por dos grupos de signos, que requieren necesariamente de un seguimiento estrecho del paciente: (a) Un aumento sostenido en la cantidad del componente monoclonal detectable en el suero y (b) la aparicin de dolores seos con lesiones lticas seas no detectadas previamente. La aparicin de cualquiera de estos signos es evidencia suficiente para evaluar la enfermedad como progresiva, de modo que se requiere una intervencin teraputica en la mayora de los casos que la presentan. 4. MIELOMA MLTIPLE 4.1. Conceptos preliminares El MM es una neoplasia de la lnea linfoide B caracterizada por la acumulacin en mdula sea de una poblacin clonal de clulas de esta estirpe en su estadio final de diferenciacin, es decir, de clulas plasmticas, y por la produccin de lesiones osteolticas (y el dolor seo secundario a ellas) que, junto a la presencia e incremento del componente M (ya sea en suero y/u orina), representan los hallazgos patolgicos ms frecuentes de la enfermedad. Las primeras observaciones sobre esta enfermedad fueron realizadas por Henry Bence-Jones en el ao 1845, aunque los trminos de mieloma mltiple o enfermedad de Kahler no fueron introducidos sino hasta los aos 1873 y 1889, respectivamente. A continuacin se resumen algunas caractersticas epidemiolgicas, biolgicas y clnicas ms relevantes de la enfermedad: Incidencia El MM tiene su mayor incidencia durante la 7 y 8 dcada de la vida, si bien un nmero
significativo de casos son diagnosticados en edades ms tempranas (un 15% de los casos tienen menos de 50 aos). El nmero de casos nuevos por cada 100.000 habitantes y ao es de 3 a 5, por lo que el MM constituye aproximadamente el 1% de todas las neoplasias y el 10% de las neoplasias hematolgicas. En USA esto representa alrededor de 14.000 casos nuevos al ao, con una incidencia mayor en la poblacin de raza negra. Patogenia La mayora de los tumores de clulas B se origina a partir de clulas B del centro germinal (CG) o post-CG. En el CG es donde las clulas B modifican su DNA a travs de una hipermutacin somtica y seleccin antignica, junto al reordenamiento de las cadenas pesadas. En el caso tanto de las MGUS como en MM las CPs clonales son, mayoritariamente, clulas B post-CG en las que destaca una baja tasa proliferativa hasta etapas avanzadas de la enfermedad. Por otro lado, estudios recientes de nuestro grupo muestran que las CPs clonales presentes en los pacientes con MM presentan una expresin significativamente mayor de molculas asociadas a proliferacin celular como IL-6 y Ki67 al compararlas con las CPs normales policlonales. Este hecho demuestra que, si bien la proporcin de clulas en ciclo celular activo en el MM es relativamente baja comparada con otros tumores, esta proporcin es de todos modos mayor que en las CPs normales. En el mismo sentido, las proporcin de CPs en fase S de ciclo celular es levemente superior en los pacientes con MM que en las CPs de sujetos normales. Estos datos parecen avalar el hallazgo de una mayor tasa proliferativa en las CPs clonales que las normales. Sin embargo, quiz el dato ms llamativo es la importante diferencia en la pr opor cin de CPs con apoptosis espontnea, claramente inferior en los pacientes con MM que en las CPs de sujetos normales. Una posible interpretacin que resulta de la combinacin de esta informacin es que, mientras el balance entre la actividad proliferativa versus la apoptosis espontnea est en un relativo equilibrio en las CPs de sujetos normales, este equilibrio est claramente desviado en las CPs de pacientes con mieloma hacia un mayor crecimiento neto de la poblacin celular, tanto por una leve mayor proliferacin como, en forma muy significativa por una importante disminucin de la muerte celular espontnea en esta entidad. Esta situacin biolgica est presente en otras entidades neoplsicas de baja agresividad como el linfoma
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no Hodgkin folicular, en que se ha demostrado que el elemento ms importante no es, al menos en los primeros aos de la enfermedad, un incremento en la proliferacin celular sino una inhibicin de la apoptosis dada por la sobreexpresin gentica y funcional del gen bcl2 en ese caso en particular. Toda esta informacin biolgica, muy sucintamente mencionada a continuacin, est cobrando gran relevancia en la planificacin y diseo de nuevas estrategias teraputicas, como ser comentado en la seccin de tratamiento del MM. Papel de IL-6 y va de la ciclina D1. Durante la ltima dcada ha quedado demostrado por diversos grupos que uno de los factores de crecimiento ms importantes para las CPs en el MM es la IL-6, que se acompaa, adems, de un aumento en la expresin de la fraccin soluble de su receptor. El origen de este aumento y su accin es tanto autocrino (origen en las propias CPs) como paracrino -a partir del estroma medular- y ocurre en respuesta a otras citoquinas como el factor de necrosis tumoral (TNF) o el interfern alfa (IFN). As, en etapas iniciales de la enfer medad, las CPs son dependientes de IL-6 para su proliferacin, de modo que la suspensin de esta citoquina en estudios in vitro se acompaa de una reduccin en la tasa proliferativa de las clulas tumorales y de un aumento de su apoptosis espontnea. A medida que la enfer medad avanza, y pr obablemente como consecuencia de alteraciones adicionales en genes reguladores del ciclo celular, esta dependencia de IL-6 se pierde y las CPs son capaces de mantener un ritmo proliferativo elevado an en su ausencia. Recientemente se ha demostrado que los niveles elevados de IL-6 estimulan la expresin de ciclina D1, con un aumento consecuente en la proporcin de CPs reclutadas a ingresar al ciclo celular y, por tanto, a un aumento en la proliferacin celular. Apoyando esta va se ha encontrado una asociacin entre los niveles de expresin de ciclina D1 y la masa tumoral, junto a un incremento en antgenos asociados a proliferacin celular como, por ejemplo, Ki67 que ya ha sido mencionado- y a una mayor inmadurez celular. Por el contrario, se ha descrito variantes de IL-6 con menor afinidad por la gp130 (constituyente esencial del receptor de IL6) que se asocian a un down regulation en la expresin de ciclina D1, lo que se acompaa a su vez de una menor tasa proliferativa y de un aumento en la apoptosis en las CPs en lneas celulares. Finalmente, resulta interesante la observacin de que en casos de MGUS las CPs no tendran niveles incrementados de IL-6, lo
que apoya el papel de esta va regulatoria en el crecimiento tumoral en esta enfermedad. A nivel clnico resulta interesante que la protena C reactiva (PCR) es regulada en su produccin precisamente por la IL-6, por lo que la medicin de este marcador se correlaciona con los niveles de la interleuquina estimuladora y, por lo tanto, de la actividad tumoral. Genes supresores de tumores. Existen algunas evidencias preliminares sobre el papel de genes supresores en el caso del MM. As, se ha encontrado mutacin de p53 en un subgrupo de pacientes, aunque con baja frecuencia. Otro gen supresor es p16, que compite con la ciclina D1 en su unin a CDK4/CDK6, inhibiendo la actividad kinasa de este complejo. Esto resulta en un aumento en la defosforilacin de pRb (gen de retinoblastoma) y en un aumento del arresto celular en fase G1 (es decir, limita la capacidad proliferativa). La inactivacin de este gen, presente en una serie de tumores, ha sido descrita en algunos casos de MM, tanto a nivel estructural (cr omosmico) como por hipermetilacin, con la consiguiente prdida de accin represora sobre el complejo ciclina D1/ CDKs, como se ha evidenciado tanto en lneas celulares de MM como en casos al momento del diagnstico. Un tercer gen supresor en estudio es p21, tambin inhibidor de kinasas dependientes de ciclinas (CDKs) y que contribuyen a mantener pRb en estado defosforilado. Se ha podido demostrar que en la mayora de los casos de MM este gen se encuentra expresado en forma constitutiva y que esta expresin aumenta con el uso de dexametasona (droga conocidamente inductora de apoptosis en CPs mielomatosas) y disminuye con niveles elevados de IL-6. Todos estos datos ponen en evidencia la importancia del balance entre el estmulo proliferativo inducido por citoquinas particularmente IL-6, sobre la va de las ciclinas, por un lado, y del efecto contrario dado por las protenas inhibidoras de estas kinasas, como p16 y p21 por otro, en la regulacin del ciclo celular en las CPs del MM. Apoptosis de CPs. La apoptosis (muerte celular programada) es un proceso complejo en su regulacin. Una de las familias de genes ms ampliamente estudiados en los ltimos aos es la familia de BCL-2, dentro de la cual existen genes con accin pro-apopttica (BAX, BCL-X(S)) y otro con funcin antiapoptosis (BCL-2, BCLX(L) Mcl-1). En el caso del MM no est an bien caracterizado el estatus de esta familia de genes. Sin embargo, se han encontrado diferencias en la expresin de BCL-2 entre CPs de pacientes
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con MM y MGUS versus las CPs de plasmocitosis reactivas, con menor expresin en estas ltimas y mayor expresin en MM en estadios avanzados. Adems, el grupo de la Clnica Mayo ha reportado recientemente que las CPs de MGUS tendran un ndice apopttico mayor que en casos de MM. Por otro lado, diferentes estudios han mostrado que BCL-2, BCL-X (L) y Mcl-1 estn expresados en prcticamente el 100% de las lneas celulares de MM y la inhibicin de ellos (por ejemplo por medio de la utilizacin de oligonucletidos anti-sense) induce una rpida apoptosis en las clulas tumorales. Una segunda va de regulacin de apoptosis en MM, aparentemente independiente de BCL-2, est constituida por la va de APO/FAS (CD95). Al respecto, se ha podido ver que la apoptosis inducida por el ligando de CD95 (CD95L) se correlaciona con los niveles de CD95 expresados en las CPs en forma independiente del estatus de BCL-2. En trminos generales, y como se mencion al inicio del apartado de patogenia, la apoptosis espontnea en las CPs clonales en el MM est disminuida con respecto a las CPs normales, lo que, a igual o mayor nivel de proliferacin celular, resulta finalmente en una ganacia neta de masa tumoral. Papel del estroma en las discrasias de CPs. Durante los ltimos aos se ha puesto especial nfasis en el papel que parece jugar el estroma en MM a travs de la accin paracrina de IL-6 (producida por las clulas dendrticas del estroma), el posible rol de la infeccin por virus Herpes tipo 8, o el importante rol de la va de RANK/OPG, que ser desarr ollado ms adelante. c) Manifestaciones clnicas Dolor seo. El sntoma ms tpico y frecuente del MM es el dolor seo, que se puede encontrar en un 70-75% de los pacientes en el momento del diagnstico. Esta incidencia parece haberse reducido en las ltimas dcadas debido probablemente al diagnstico precoz, siendo actualmente de alrededor de un 40%; sin embargo, persiste como un problema importante, ya que puede condicionar fracturas en hueso patolgico en hasta un 80% de los casos durante la evolucin de la enfermedad. Este dolor se debe a la presencia de lesiones (osteoporosis, osteolisis o fracturas patolgicas) generalmente de fcil reconocimiento por medio de mtodos radiolgicos convencionales y en que nuevas tcnicas como la resonancia magntica han mejorado an ms su deteccin.
Sus localizaciones ms frecuentes comprenden estructuras propias del esqueleto axial, es decir, el crneo (imagen de apolillamiento), la columna vertebral (aplastamientos vertebrales y fracturas), las costillas, la pelvis y los huesos largos a nivel proximal. Estas lesiones tienen un origen multifactorial, destacando en su generacin el reclutamiento y activacin de osteoclastos secundaria a la presencia de citocinas como el TNF, la interleuquina-1 beta (IL-1) o IL-6, previamente conocidas como osteoclast activating factor (OAF). Recientemente se ha descrito al menos otras dos vas de activacin de osteoclastos importantes en este proceso, como son el sistema RANKL/OPG y la protena inflamatoria de macrfagos o MIP-1. El primer sistema ha cobrado gran relevancia en el ltimo tiempo, ya que RANKL corresponde al receptor de activacin del ligando de NF-B (factor nuclear B) que parece ser una va crucial en el crecimiento de las CPs clonales y se ha convertido en un novedoso e interesante blanco teraputico para pacientes de mal pronstico. As, RANK est presente en precursores monocticos y osteoclastos y su activacin gatilla la diferenciacin y actividad osteoclstica. Esta accin pro-reabsorcin sea es contrarrestada por molculas como osteoprotegerina u OPG, que antagoniza su efecto y protege de la reabsorcin sea. En este sentido, existen evidencias de que las clulas estromales de mdula sea en el MM expresan ms RANKL y menos OPG, logrando como efecto neto un aumento de la reabsorcin sea final al provocar un desbalance en este equilibrio entre reabsorcin/proteccin. Por ltimo, se ha demostrado que si bien en las fases iniciales de la enfermedad la actividad osteoblstica est preservada, y an aumentada, durante la evolucin sta se deprime progresivamente. Las bases bioqumicas y moleculares de esta inhibicin no estn claras, por lo que no sern ahondadas en este libro. Manifestaciones neurolgicas. Con relativa frecuencia existen en el MM otras dos manifestaciones clnicas asociadas a la patologa sea, como son la hipercalcemia y las alteraciones neurolgicas. Estas ltimas se presentan frecuentemente como radiculopatas o como un sndrome de compresin medular, motivadas por la compresin de una raz nerviosa por una lesin vertebral o por el compromiso, ya sea traumtico (secundario a una fractura por aplastamiento) o por el crecimiento de un plasmocitoma (tumor de CPs) a la cavidad medular, respectivamente. Si bien
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existen casos en que la manifestacin neur olgica es dependiente de una polineuropata secundaria a la presencia de paraproteinemia, esta situacin es ms bien excepcional. En estos casos la protena anmala actuara como anticuerpo dirigido contra determinantes antignicos de la mielina. Hipercalcemia. La presencia de hipercalcemia (>10,5 mg/dL tras correccin por los niveles de albmina) ocurre en alrededor de un tercio de los pacientes. Dentro de su patogenia se ha descrito una alteracin en el balance entre la actividad osteoclstica (reabsorcin sea) y la osteoblstica (formacin sea), de modo que la primera prevalece sobre la segunda (este punto se coment ms extensamente en el apartado i). Este desbalance estara explicado por la presencia y mayor actividad de ciertas interleucinas hasta hace poco denominadas como osteoclast activating factors (OAF) y que hoy sabemos corresponden esencialmente al TNF y a la IL-1, ambos influenciados estrechamente por la actividad de IL-6 y a la va de RANKL/OPG. Sntomas generales. En los pacientes con MM es frecuente la pr esencia de sntomas constitucionales, tales como astenia, prdida de peso, fatigabilidad, etc., muchas veces relacionados a la presencia de anemia y, en algunas oportunidades, al estado de hipermetabolismo que implica la enfermedad tumoral, como ocurre durante la progresin de la enfermedad o en los infrecuentes casos de leucemia de CPs. Sndrome anmico. El valor medio de la hemoglobina (Hb) en la mayor parte de las series de pacientes con MM al diagnstico es de alrededor de 10,5 g/dL, existiendo grados variables de anemia en el 60-70% de los casos. Adems, alrededor de un 20-25% de ellos presentan anemia severa, con valores de Hb inferiores a 8,5 g/dL. La anemia en el MM es de origen multifactorial en que, adems del mecanismo clsico de anemia de enfermedades crnicas, existen otros factores de importancia, como son: (a) reemplazo de la hematopoyesis nor mal por CPs tumorales, (b) actividad regenerativa disminuida del tejido hematopoytico residual, (c) insuficiencia renal, (d) deficiencia de hierro, y (e) disminucin de la sobrevida del glbulo rojo. Adems, en los ltimos aos ha quedado de manifiesto el papel de la eritropoyetina (Epo) y otras citocinas en la patogenia de la anemia en el MM, sugirindose que en estos enfermos existira una respuesta
inadecuada a la Epo (para el grado de anemia) y/o una respuesta proliferativa disminuida de las clulas eritropoyticas a niveles normales de esta sustancia. Por ltimo, se ha demostrado que algunas citocinas (IL-1, TNF, TGF e IFN-) pueden disminuir tanto la eritropoyesis como la produccin de Epo. Insuficiencia renal. La falla renal es un rasgo caracterstico del MM y es uno de los factores pronsticos ms importantes, representando la segunda causa de muerte en estos pacientes. Aproximadamente un 30% de los pacientes presentan niveles de creatinina 2 mg/dL al momento del diagnstico, incidencia que aumenta durante el curso de la enfermedad. Sin embargo, la mayora de los enfermos son asintomticos. Su etiologa es tambin multifactorial, influyendo en ella la eliminacin de cadenas ligeras, hipercalcemia (estas dos causas presentes en un 90% de los casos afectados) e hiperuricemia, deshidratacin, infecciones urinarias a repeticin, hiperviscosidad, uso de drogas nefrotxicas (especialmente antibiticos), amiloidosis e infiltracin tumoral. El tr mino rin mielomatoso se usa para designar la formacin de cilindros tubulares y est invariablemente asociado a la presencia de proteinuria de BenceJones (cadenas ligeras monoclonales en la orina). Infecciones bacterianas. Constituyen la principal causa de morbilidad y mortalidad en el MM, siendo su incidencia global entre 0,5 y 3 episodios infecciosos por paciente/ao (alrededor de 7 a 15 veces superior a la poblacin normal de la misma edad). La causa ms importante es la alteracin de la inmunidad humoral, tanto por depresin de la produccin nor mal de inmunoglobulinas (hipogammaglobulinemia) como por un hipercatabolismo de las mismas. Otros factores que parecen influir en la predisposicin a las infecciones incluyen: (a) supresin de la produccin de anticuerpos y de la proliferacin de clulas B por parte de los monocitos/ macrfagos estimulados por las CPs mielomatosas; (b) reduccin en la produccin de interleucina 4 (IL-4), responsable de la activacin inicial de las clulas B en reposo; (c) pr esencia de clulas T con actividad inmunosupresora; (d) defectos en la inmunidad celular (disminucin de clulas CD4 y alteracin de las clulas NK); (e) alteracin funcional de la actividad del complemento; (f) presencia de granulocitopenia, secundaria tanto a infiltracin medular como al tratamiento quimioterpico; y (g) insuficiencia renal.
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Los focos y agentes ms frecuentemente comprometidos son el pulmonar (neumococo) y el urinario (bacilos gram negativos). Si bien la mayor parte de las infecciones en el MM son de origen bacteriano (90%), tambin se reconocen en estos pacientes infecciones de origen viral (Herpes Zoster) y fngicas (Cndida Albicans, etc). Otras manifestaciones clnicas. El sndrome de hiperviscosidad es menos frecuente que en otros sndromes linfoproliferativos (por ejemplo Macroglobulinemia de Waldenstrm), pero puede presentarse en algunos casos de mielomas IgA o IgG3. Otro problema de relativa frecuencia lo constituye la amiloidosis, presente en alrededor de un 10-15% de los casos, generalmente mielomas Bence-Jones con excrecin de cadena ligera lambda. d) Pronstico La evolucin de los pacientes portadores de MM es muy variable, con casos que cursan con una enfermedad agresiva que los lleva a la
muerte en pocos meses y otros con un curso estable y sobrevida que puede superar incluso los 10 aos, situndose la mediana de supervivencia en torno a los 3 aos. Esta variabilidad en el curso clnico se debe a la presencia de diferentes factores pronsticos, entre los que destacan el estado general, la edad, la presencia de insuficiencia renal, la anemia, la hipercalcemia y la hipoalbuminemia. En cuanto al tipo de MM, parecen ser de peor pr onstico el IgD y el Bence-Jones. La clasificacin pronstica ms utilizada hasta ahora es la de DurieSalmon, resumida en la tabla 14GM-3. En los ltimos aos se han reconocido nuevos factores pronsticos como el nivel de beta-2-microglobulina, de IL-6, protena C reactiva, la actividad proliferativa de las CPs (el llamado labelling index), la expresin de ciertos antgenos en las clulas plasmticas, las alteraciones cromosmicas particularmente la monosoma del cromosoma 13-, la hipodiploida y la expresin del gen de resistencia mltiple a drogas (MDR-1), algunos de los cuales sern revisados brevemente.
Tabla 14-GM-3. Criterios de Etapificacin de Durie-Salmon Estadio I (baja masa tumoral: < 0,6 x 1012/m2) Hemoglobina > 10 g/dL IgG < 5 g/dL; IgA < 3 g/dL; Bence Jones < 4g/24h Nivel de calcio normal Presencia de mximo una lesin osteoltica Estadio II (masa tumoral intermedia: 0,6 1,2 x 1012/m2) Criterios intermedios entre estadio I y III Estadio III (alta masa tumoral: > 1,2 x 1012/m2) Hemoglobina < 8,5 g/dL IgG > 7 g/dL; IgA > 5 g/dL; Bence Jones > 12 g/24h Nivel de calcio > 12 mg/dL (ajustado por la albmina srica) Presencia de lesiones osteolticas mltiples A B Creatinina < 2 mg/dL Creatinina 2 mg/dL
2-microglobulina. La 2M es hoy en da uno de los factores pronsticos ms relevantes y se correlaciona estrechamente tanto con la masa tumoral, el compromiso renal y la clasificacin de Durie-Salmon. Sin embargo, como factor independiente es capaz de predecir la supervivencia mejor que cualquiera de los otros parmetros, por lo que debe estar incorporado en los protocolos de estudio y tratamiento en todos los pacientes.
Protena C reactiva. La concentracin de la PCR es un reflejo de la actividad de IL-6, un factor fundamental en la proliferacin y sobrevida de las CPs. El valor predictivo de este parmetro parece ser independiente de la 2M, lo que ha permitido construir algoritmos de estratificacin de riesgo basados en estos dos parmetros fcilmente disponibles en la mayora de los laboratorios en nuestro pas y de bajo costo.
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ndice proliferativo de las CPs. El PCLI (plasma cell labelling index) refleja la actividad proliferativa de las CPs que suele incrementarse con la progresin de la enfer medad. La sobrevida de los pacientes con PCLI < 3% es de 56 meses, que disminuye a 19 meses cuando este valor es 3%. Citogentica. Las alteraciones de la composicin cr omosmica tienen un reconocido valor en enfer medades hematopoyticas como las leucemias. Hasta hace pocos aos la informacin en el MM era escasa debido a que este es un tumor de clulas esencialmente maduras con baja tasa proliferativa y menor posibilidad de obtener metafases analizables. Sin embargo, entre un 30 y 50% de los pacientes tienen un cariotipo anormal (20-30% al diagnstico y 35-60% postratamiento o durante su evolucin). Por otro lado, con tcnicas de mayor sensibilidad como hibridacin in situ (FISH) o citometra de flujo se puede observar cantidades anormales de DNA (aneuploidas de DNA) en hasta un 80% de los casos. Las alteraciones ms frecuentemente encontradas son traslocaciones (51%) y trisomas (45%). De particular inters ha resultado el valor pronstico ominoso de la prdida de un cromosoma 13 (monosoma 13) o de alteraciones de 11q. Por ltimo, en los ltimos 2 aos se ha puesto nfasis a la caracterizacin de patrones genotpicos utilizando tecnologas moleculares de ltima generacin como los mtodos de microarreglos (microarrays), que permiten evaluar en una misma muestra varios cientos o incluso miles de genes y comparar este patrn en las distintas entidades que comprenden las gammapatas clonales. Adems, esta forma de caracterizacin genotpica permitir en un futuro no slo predecir el comportamiento ms o menos agresivo en un paciente en particular, sino localizar aquellos grupos de genes que tienen mayor relevancia en la patogenia de la enfermedad y, por tanto, podran permitir el diseo de estrategias teraputicas ms especficas que la quimioterapia convencional. 5. VARIEDADES INFRECUENTES DE MIELOMA MLTIPLE Y OTRAS GAMMAPATAS 5.1. Mieloma indolente
M > 3g/dL pero < de 4,5g/dL y > 10% de CPs atpicas en mdula sea. Estos pacientes suelen ser asintomticos y no requieren tratamiento hasta que se evidencie una progresin de la enfermedad, lo que ocurre con una mediana de 26 meses. 5.2. Leucemia de clulas plasmticas Los pacientes con esta inhabitual presentacin (< 5% de los pacientes) tienen un recuento absoluto de CPs 2 x 10 6 /L. Se debe diferenciar entre la variedad de novo y la transfor macin en LCP de un mieloma previamente conocido. El tratamiento de estos pacientes suele ser ineficaz y la mediana de supervivencia es de slo 2 meses. 5.3. Mieloma osteoesclertico La principal caracterstica de esta enfermedad es la pr esencia de una polineuropata inflamatoria crnica desmielinizante causante de gran incapacidad motora. Esta alteracin apar entemente es secundaria a una inmunoglobulina con toxicidad para las fibras nerviosas perifricas. Adems, en esta variedad es frecuente la asociacin de alteraciones endocrinolgicas (sndrome de POEMS). La mdula sea de estos pacientes usualmente tienen proporciones normales de CPs (< 5%) y el diagnstico debe confirmarse con la biopsia de una lesin ltica. Desde un punto de vista bioqumico, y comparado con los pacientes con MM clsico, estos pacientes suelen exhibir niveles ms elevados de IL-1, TNF- e IL-6, pero niveles inferiores de TGF-, con un desbalance que favorece las citoquinas proinflamatorias. 5.4. Plasmocitoma extramedular Esta rara entidad suele afectar con mayor frecuencia el tracto respiratorio superior aunque ocasionalmente afecta el tracto digestivo y otros rganos, en ausencia de criterios diagnsticos de un MM convencional. El tratamiento, al igual que en el caso de un plasmocitoma seo solitario, es con radioterapia, con lo cual se observan excelentes resultados, incluyendo la curacin en muchos de ellos. 5.5. Plasmocitoma seo solitario
Corresponde a pacientes con criterios diagnsticos inequvocos de mieloma pero en ausencia de anemia, insuficiencia renal, hipercalcemia o lesiones lticas mltiples. Estos pacientes tienen usualmente niveles de protena
Corresponde a una lesin osteoltica nica constituida por CPs clonales, en ausencia de infiltracin en mdula sea. Suelen tener cantidades pequeas de componente M ya sea
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en suero y/o en orina, la que desaparece tras radioterapia sobre la lesin. Lamentablemente slo un 50% de estos casos puede ser curado, dado que la otra mitad de los pacientes evoluciona hacia un MM clsico en los aos siguientes. En este sentido, una experiencia preliminar de nuestro grupo muestra que, an en ausencia de criterios clsicos de MM en mdula sea, en aproximadamente un 50% es posible demostrar la presencia de CPs clonales en mdula sea por medio de citometra de flujo, sugiriendo que desde un comienzo se trata de un MM con manifestacin primariamente tumoral y no infiltrativa. 5.6. Macroglobulinemia de Waldenstrm (MW) Entidad descrita por primera vez en 1944 por Waldenstrm en 2 pacientes con fatiga, sangramiento de mucosas, adenopatas y anemia normocmica asociada a un aumento de la viscosidad plasmtica secundaria la presencia de grandes cantidades de protena IgM circulante. A nivel de mdula sea se observa una infiltracin de clulas linfoplasmocitoides productoras de la protena IgM monoclonal, con frecuente presencia de basfilos tisulares (mastocitos) que ayudan en el diagnstico. La edad media de presentacin es sobre los 60 aos, siendo ms frecuente en el sexo masculino. Si bien la presencia de hiperviscosidad es la regla, slo un 20% presenta sntomas relacionados a ella (cefalea, alteraciones visuales, etc.). En todo caso, elevaciones de sobre 4 veces el valor normal confiere un riesgo de complicaciones clnicas que obligan a considerar la plasmafresis como una de las medidas teraputicas. En alrededor de un 10% de los casos se observa una neuropata desmielinizante sensitivo-motora crnica a nivel perifrico; en la mitad de estos casos la paraprotena IgM est dirigida contra los epitopes carbohidratos de la glicoprotena asociada a la mielina (MAG). En trminos generales la MW tiene una evolucin larvada, con una mediana de supervivencia de alrededor de 5 aos. 5.7. Enfermedad de cadenas livianas La enfermedad de cadenas livianas o mieloma de Bence Jones se caracteriza por la produccin monoclonal exclusivamente de la cadena ligera kappa o lambda, en ausencia de la cadena pesada correspondiente. En esta entidad es frecuente la asociacin a dao renal de diversa magnitud secundario al paso de esta
inmunoglobulina a travs de la membrana glomerular. Adems, y especialmente cuando la cadena ligera es de tipo lambda, la deposicin de esta protena a nivel del glomrulo y mesangio puede dar origen a una amiloidosis renal capaz de producir un sndrome nefrtico frecuentemente irreversible. 5.8. Amiloidosis primaria Se caracteriza por la formacin de fibrillas con configuracin espacial de tipo a partir de cantidades variables de cadenas ligeras monoclonales, siendo mucho ms frecuente de observar en casos de clonalidad . Al igual que el MM, la amiloidosis suele presentarse durante la sptima dcada de la vida (mediana 62 aos) y se caracteriza clnicamente por fatigabilidad, baja de peso, compromiso del estado general y alteraciones neurovegetativas (parestesia, mareo, sncope, etc) que resultan progresivas y muy limitantes; asimismo, un tercio de los pacientes presenta sindrome nefrtico. Esta enfermedad suele ser tratada en forma similar al MM; sin embargo, la respuesta suele ser pobre, con compromiso progresivo que lleva inexorablemente a la muerte. 5.9. Enfermedad por cadenas pesadas Corresponden a enfermedades linfoproliferativas infrecuentes caracterizadas por la produccin monoclonal de Igs que carecen de cadenas ligeras. El primer reporte fue hecho en un caso de cadena pesada y se conoce por enfermedad de Franklin. Sin embargo, dentro de estos sndromes es ms frecuente la enfermedad por cadenas o enfermedad de Seligmann. El menos frecuente (alrededor de 30 casos reportados) compromete a la cadena . Cadenas pesadas . La edad media es de 60 aos y usualmente se presenta con un cuadro semejante a un linfoma agresivo, con adenopatas, compromiso del estado general, anemia, fiebre y hepatoesplenomegalia y raramente a diferencia del MM tradicional- con lesiones osteolticas. Si bien hay casos de evolucin prolongada, la enfermedad suele cursar agresivamente, con una mediana de supervivencia de alrededor de 12 meses. Cadenas pesadas . La mayor parte de los pacientes son de origen mediterrneo, con una presentacin en edades ms precoces que las otras variantes (segunda a tercera dcada de la vida). La enfer medad compr omete frecuentemente el tracto digestivo, con
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sndrome de malaabsorcin como sntoma habitual de presentacin y tiene una evolucin agresiva y fatal. Cadenas pesadas . En esta entidad es frecuente encontrar hepatoesplenomegalia y, en cambio, es infrecuente la presencia de lesiones osteolticas. La electroforesis de protenas puede ser normal, pero en dos tercios de los casos se observa proteinuria monoclonal. El curso clnico puede ser variable, con evolucin incluso durante varios aos. 6. DIAGNSTICO DIFERENCIAL ENTRE MGUS Y MM Adems de la dificultad para definir el grupo de pacientes con riesgo de progresar hacia un tumor clnico, la diferenciacin inicial entre MGUS y MM en algunos pacientes puede presentar dificultades, dado que los parmetros clnicos hasta ahora utilizados no son suficientes para discriminar correctamente en todos los casos, razn por la cual el diagnstico se realiza en presencia de un grupo de criterios clnicos como los definidos por el Committee of the Chronic Leukemia-Myeloma Task Force, 1973 (tabla 2). Asimismo, la cantidad de componente-M srico suele ser uno de los parmetros de mayor utilidad, dado que, mientras mayor sea ste, mayor es la probabilidad de que se trate de un proceso maligno. Los niveles de hemoglobina, el porcentaje de CPs en mdula sea, la presencia de hipercalcemia, lesiones lticas seas, afectacin renal, etc., se utilizan en el diagnstico diferencial entre estas dos entidades. Sin embargo, existen casos de MGUS
que presentan, por ejemplo, valores de componente-M mayor de 3g/dL mantenidos en el tiempo, nivel utilizado como punto de corte en el caso de la IgG. Una caracterstica que parece tener importancia en el diagnstico diferencial es el ndice de proliferacin celular (labelling index), que corresponde a la cuantificacin del nmero de CPs en fase de sntesis de DNA durante el ciclo celular, aunque este mtodo presenta una tasa de falsos negativos elevada (hasta un 30% en la evaluacin de pacientes con MM). Por ltimo, los niveles de IL-6, citoquina relacionada a la proliferacin de las CPs, estn incrementados en una minora de los pacientes portadores de MGUS, mientras que se elevan en el 35% a 42% de los portadores de MM. Recientemente nuestro grupo ha reportado el valor del patrn inmunofenotpico evaluado por medio de citometra de flujo como la metodologa con menor ndice de error en esta discriminacin. As, mientras en el MM las CPs son siempre clonales en ausencia de CPs normales, en prcticamente el 100% las MGUS es posible demostrar la coexistencia de CPs clonales del todo similar es a las CPs pr esentes en pacientes con MM- con CPs policlonales inmunofenotpicamente normales. Ms an, con este tipo de metodologa es posible evidenciar la naturaleza aneuploide de las primeras junto a la diploide de las segundas (figura 14-GM-1). Resulta interesante cmo este hecho explicara la diferencia muchas veces utilizada como otro criterio clnico diferencial- en la presencia de hipogammaglobulinemia residual en el MM pero no en las MGUS, que mantienen una produccin basal normal de Igs por parte de estas CPs residuales.
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Figura 14-GM-1. Diferencias genotpicas de CPs de MM y MGUS. (A): en los pacientes portadores de un mieloma mltiple se observa slo una poblacin de clulas plasmticas cuyo patrn inmunofenotpico ms frecuente es el representado en esta figura, con expresin intensa de CD38 y CD56, en ausencia del antgeno CD19 propio de las clulas linfoides B, incluidas las CPs normales. Por ltimo, la expresin citoplasmtica de slo una cadena liviana de las Igs (restriccin de cadena liviana) demuestra la naturaleza clonal de estas clulas. (B): se observa la coexistencia de dos subpoblaciones de CPs. La primera es enteramente similar a las clulas mostradas en A y corresponden al componente de CPs clonales; la segunda poblacin, generalmente minoritaria, presenta un patrn diferente, con expresin clara de CD19 en ausencia de CD56 y, a nivel citoplasmtico, tanto la cadena kappa como lambda. Esta ltima corresponde a la fraccin de CPs normales policlonales y la coexistencia de estas dos subpoblaciones de CPs es el patrn inmunofenotpico ms caracterstico de los pacientes con MGUS. Debido a que la figura no es a color en A las poblaciones de inters aparecen en negro y en B en negro y plomo.
De cualquier modo, y en un sentido clnico prctico, es importante sealar que sigue siendo fundamental el seguimiento clnico de los pacientes, con mediciones peridicas de su
componente-M srico y evaluacin de posibles sntomas relacionados, para intentar pesquisar los casos de MM verdadero (tabla 14GM-4) o aquellos casos de MGUS en transformacin.
Tabla 14-GM-4. Criterios diagnsticos de Mieloma Mltiple Criterios Mayores Plasmocitoma en biopsia tisular Plasmocitosis medular 30% Cuantificacin de la Protena Monoclonal IgG > 3500 mg/dL IgA > 2000 mg/dL Bence Jones 1g/24h Criterios menores Plasmocitosis medular 10 29% Protena M presente en niveles inferiores a los descritos en criterios mayores Lesiones osteolticas Disminucin en las Inmunoglobulinas no comprometidas en el componente M IgM < 50 mg/dL IgA < 100 mg/dL IgG < 600 mg/dL
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El diagnstico se confirma con al menos un criterio mayor y uno menor o tres criterios menores. 7. TRATAMIENTO El detalle del tratamiento en esta enfermedad es complejo y excede los objetivos de esta publicacin, por lo que nos remitiremos a un resumen conceptual de los elementos ms importantes: 7.1. Terapia de apoyo Considerando la naturaleza crnica y hasta ahora no curable de esta enfermedad y las mltiples alteraciones clnicas que puede producir, resulta fundamental la evaluacin constante y el tratamiento de complicaciones como el dolor seo y fracturas patolgicas, anemia, hipercalcemia, etc. Junto a esto, el apoyo sicolgico resulta fundamental como lo es en cualquier patologa de carcter crnico, especialmente en las de naturaleza neoplsica, y no se deben escatimar medios para mejorar la calidad de vida de los pacientes. 7.2. Tratamiento citotxico Los pacientes inicialmente asintomticos usualmente tienen una masa tumoral relativamente baja y una velocidad de progresin lenta. En este grupo no se ha demostrado un beneficio en trminos de mediana de supervivencia con tratamiento citotxico precoz. Por esta razn en etapas iniciales de la enfermedad slo est indicado un seguimiento cercano, usualmente evaluando parmetros sencillos como hemograma y cuanta del componente M mediante una electroforesis de protenas. Por el contrario, en aquellos pacientes sintomticos y/o con enfermedad de alta masa tumoral o progresiva est justificado el tratamiento, dado que mejora en forma significativa tanto la calidad como la mediana de supervivencia. El tratamiento considera dos formas esencialmente distintas como son: Dosis convencionales. Las drogas clsicamente ms utilizadas son la combinacin de Melfaln (usualmente 0,2 mg/Kg) y Prednisona (usualmente 2 mg/Kg) dados durante 4 das cada 4 a 6 semanas. Esta terapia suele ser relativamente bien tolerada y poco txica y permite un buen control de la enfermedad tanto en trminos subjetivos como objetivos. As, alrededor de un 50-70% de los pacientes logra
una disminucin en su sintomatologa despus de 3 a 6 meses de tratamiento, lo que suele acompaarse de una reduccin en la masa tumoral, pero muy infrecuentemente de una desaparicin del componente M, que se mantiene evidente en la mayora de los casos. En aquellos casos que no responden a estas medidas o que se presentan con alteraciones agudas como insuficiencia renal una segunda alter nativa consiste en quimioterapia endovenosa. Si bien existen diferentes pr otocolos en este sentido, una de las combinaciones de drogas ms utilizadas son la Vincristina, Adriamicina y Dexametasona (VAD), que resulta en un rpido alivio sintomtico en hasta dos tercios de los casos, con escasa toxicidad a la mdula sea normal. Sin embargo, debe enfatizarse que con cualquiera de estas alternativas teraputicas la remisin completa de la enfermedad (ausencia de componente monoclonal en suero y desaparicin de la plasmocitosis medular) slo se logra entre un 5 y 8% como mximo. Dosis altas y trasplante de mdula sea. Dado que el incremento menor de dosis de agentes alquilantes no ha logrado un impacto mayor en la sobrevida de los pacientes, se ha intentado un aumento mayor en dosis capaces de producir aplasia medular- apoyado por una reconstitucin de la mdula sea a travs de trasplante de progenitores hematopoyticos autlogos (recolectados del mismo paciente previamente). As, la experiencia inicial del grupo francs demostr recientemente que este tipo de terapia es capaz de lograr una remisin completa de la enfermedad (ausencia de plasmocitosis medular y desaparicin del componente M) en hasta un 50% de los pacientes, logrando una significativa mayor sobrevida comparado con dosis convencionales. Esta experiencia preliminar ha sido repetida por diversos autores y se considera hoy en da que, si bien no logra una curacin de la enfermedad, obtiene un incremento tanto en la sobrevida libre de progresin como en la sobrevida global de alrededor de un ao comparado con la terapia de dosis convencional (SLP 32 vs 20 meses y SG 54 vs 42 meses). Ms an, un grupo multicntrico internacional ha demostrado recientemente que el trasplante en tandem (dos trasplantes autlogos seguidos) logra mejorar todava ms estos resultados. Esto ha significado que en pacientes jvenes (hasta 60 o incluso 65 aos) con enfermedad agresiva el trasplante de mdula sea sea, actualmente, la alternativa de eleccin en casi todos los grupos clnicos. Con respecto al trasplante alogeneico
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-esto es, a partir de un donante histocompatible relacionado- la experiencia es menor esencialmente por la edad de la mayora de los pacientes (lo que disminuye la probabilidad de disponer de un donante) y por la toxicidad propia de l, que en distintas series llega incluso al 50%. Sin embargo, tanto la ausencia de contaminacin tumoral de la mdula sea injertada como el posible efecto de sta sobre las CPs tumorales residuales (efecto injerto contra mieloma) han logrado la curacin de un reducido nmero de pacientes y puede ser una alter nativa a evaluar en grupos seleccionados de pacientes. Una alternativa actualmente en activa evaluacin es el uso del llamado trasplante no mieloablativo o minitrasplante, que consiste en un condicionamieto (terapia pre-trasplante) reducido y esencialmente inmunosupresor enfocado a permitir una coexistencia entre la mdula sea del husped y la del donante, siendo esta ltima la encargada de lograr el efecto antitumoral. Una ventaja de esta modalidad es su bajo perfil de toxicidad, con mortalidad que se ha reducido hasta un 10 a 15% y que permite su uso en personas mayores. Sin embargo, su real utilidad en MM est an por definirse. Otras drogas. Otras vas teraputicas interesantes de cara al futuro lo constituyen drogas que modulan la respuesta inmune o la actividad celular como respuesta a las CPs tumorales. En esta lnea de pensamiento estn drogas como la Talidomida y el Revimid, que en diferentes ensayos clnicos han logrado respuestas en hasta un tercio de pacientes con MM refractarios o progresivos ante terapias tradicionales y estn siendo objeto de estudios en primera lnea actualmente. Otra droga de gran inters es el inhibidor de proteosoma Velcade, que acta en la va de RANKL/OPG mencionada previamente y que ha logrado respuesta en pacientes refractarios a toda terapia, incluyendo trasplante, talidomida, etc. Por ltimo, y en trminos generales, esperamos que el conocimiento cada vez ms ntimo de las vas regulatorias del crecimiento y apoptosis de las CPs mielomatosas, as como del papel y vas de accin del estroma medular, nos lleven a dar un paso hacia el diseo de terapias ms orientadas a la patogenia de la enfermedad y permitan, en un futuro la curacin de los pacientes que la sufren.
LECTURAS SUGERIDAS Advances in Biology and Therapy of Multiple Myeloma. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program) 248-278, 2003. Davies, F.E., Dring, A.M., Cheng, L., et al. Insights into the multistep transformation of MGUS to myeloma using microarray expression analysis Blood 102 (13): 4504-4511, 2003. Fenton, R., Jacobson, J., Kuehl, W.M., et al. New insights into role of microenvironment in multiple myeloma. Lancet;355:248-50, 2000. Hallek, M., Bergsagel, P., Anderson, K.C. Multiple myeloma: increasing evidence for multistep transformation process. Blood 91:321, 1998. Kawano, M.M., Mihara, K., Huang, N. et al. Differentiation of early plasma cells on bone marrow stromal-cells requires interleukin-6 for escaping from apoptosis. Blood;85:487-94, 1995 Klein, B., Zhang, X.J., Lu, Z.Y., Bataille, R. Interleukin-6 in human multiple myeloma. Blood; 85:863-72, 1995 Kyle, R.A., Therneau, T.M., Rajkumar, S.V. et al. A long-term study of prognosis in monoclonal gammopathy of undetermined significance. N Engl J Med; 346:564-92, 2002. Kyle, R.A. The gammmapathies. Seminars in Hematology 32(1):4-79,1995 Kyle, R.A. Monoclonal gammapathies In Clinical Immunology: Principles and Practice, Rich, R.R., Fleischer, T., Schwartz, B.D., Shearer, W.T., Strober, W., (eds.) Mosby-Year Book, Inc USA. captulo 116 pp 1801-1811, 1996. Lemoli, R.M., Martinelli, G., Zamagni, E. et al. Engrafment, clinical and molecular follow -up of patients with multiple myeloma who were reinfused with highly purified CD34+ cells to support single or tandem high-dose chemotherapy. Blood;95:2234-9, 2000. Lichstentein, A., Tu, Y., Fady, C. et al. Interleukin-6 inhibits apoptosis of malignant plasma cells. Cell Immunol 162:248-55, 1995.
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HEMATOLOGA
Captulo
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SNDROMES MIELODISPLSTICOS
Juan Tordecilla C. e Ivn Palomo G.
1. Introduccin 2. Clasificacin de los SMD 3. Patognesis de los sndromes mielodisplsticos 4. Diagnstico 4.1. Alteraciones morfolgicas 4.1.1. Alteraciones citolgicas generales 4.1.2. Alteraciones morfolgicas en los diferentes tipos de SMD 4.2. Alteraciones citogenticas 4.3. Alteracin molecular 4.4. Alteraciones inmunolgicas 4.5. Alteraciones enzimticas 4.6. Cultivos de mdula sea 5. Sndromes mielodisplsticos en pediatra 6. Evaluacin diagnstica de mielodisplasia 7. Tratamiento de los SMD 7.1. Estrategias generales de tratamiento 7.2. Tratamiento de los SMD en pediatra
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RESUMEN
Los Sndromes Mielodisplsticos (SMD) son un grupo heterogneo de hemopatas clonales. Su patogenia es desconocida; se han descrito diversas anomalas, tanto de la biologa de la stem cell, como de su control funcional por el microambiente medular, as como numerosas alteraciones citogenticas y moleculares, ninguna de las cuales ha resultado especfica. La expresin clnica est dominada por las consecuencias de una combinacin variable de citopenias perifricas, en el contexto de una mdula sea hipercelular con signos de displasia. Los SMD se han clasificado en 5 tipos: Anemia refractoria (AR) AR con sideroblastos en anillo, AR con exceso de blastos, AR con exceso de blastos en transformacin y leucemia mielomonoctica. Ms recientemente la OMS propuso algunas modificaciones. La aplicacin sistemtica del estudio citogentico de los SMD es importante debido a que aporta informacin complementaria a la citologa. Este captulo trata sobre las caractersticas de laboratorio, tanto de sangre perifrica como de mdula sea, de los diferentes tipos de SMD y algunos aspectos de su patogenia.
1. INTRODUCCIN Los SMD, son probablemente el grupo de enfermedades hematolgicas clonales de mayor frecuencia. Este hecho y su tendencia a evolucionar a Leucemia mieloide aguda (LMA), ha convertido a este grupo heterogneo de enfermedades en foco de numerosos estudios, cuyos principales objetivos han sido clarificar su etiopatogenia, desarrollar clasificaciones con valor pronstico y biolgico, y adems evaluar distintas modalidades de tratamiento. Se estima que la incidencia de los SMD es de 4-12/100.000 habitantes por ao, pudiendo llegar a 30/100.000 habitantes por ao en los individuos mayores de 70 aos. La aparicin en la edad peditrica y en el adulto joven es rara y con poca frecuencia se han descrito algunos casos de SMD familiar. 2. CLASIFICACIN DE LOS SMD En 1975, el grupo Francs-Americano-Britnico (FAB), realiz una clasificacin de las leucemias agudas (LA), reconociendo que no todos los pacientes con citopenias en sangre perifrica y displasia en mdula sea progresaban a LA.
Realizaron una distincin entre LA con inicio rpido y un grupo de alteraciones que presentando algunas caractersticas de LA, a diferencia de stas, rara vez necesitaban tratamiento inmediato; a este grupo de desrdenes, que afectaba a pacientes mayores de 50 aos les denominaron Sndromes Mielodisplsticos. En 1980 el grupo FAB revis una serie ms grande de pacientes con el propsito de deter minar las alteraciones morfolgicas especficas de ellos. Esto condujo a una definicin amplia de los SMD en cinco subgrupos (tabla 15-1). Los criterios empleados en esta clasificacin se basan en el porcentaje de blastos en mdula sea y en sangre perifrica, nmero absoluto de monocitos circulantes, presencia de bastones de Auer, porcentaje de sideroblastos en anillo, todo junto con rasgos morfolgicos dishemopoyticos de grado variable. Los cinco grupos son los siguientes: anemia refractaria (AR), AR con sideroblastos en anillo (ARS), AR con exceso de blastos (AREB), AR con blastos en transfor macin (AREB-t) y leucemia mielomonoctica crnica (LMMC).
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Tabla 15-1. Clasificacin FAB de los Sndromes Mielodisplsticos Subgrupo Blastos sangre perifrica % <1 <1 <5 <5 < 5** Blastos en mdula sea % <5 <5 5-20 21-29* 0-20 Sideroblastos mdula sea % < 15 > 15 Variable Variable Variable Monocitos ( /L) <1x103 <1x103 <1x103 Variable >1x103 Grado de disheritropoyesis + + ++ +++ ++
AR ARS AREB AREB-t LMMC
* Algunos autores consideran la aparicin de bastones de Auer. * * En ocasiones > 5%
Aunque esta clasificacin ha tenido una aceptacin generalizada, tiene algunas limitaciones, como por ejemplo, que no considera el cariotipo. Por esta razn, a principios del ao 2001, un comit de expertos de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) propuso una nueva clasificacin (tabla 15-2). Existe adems otro grupo de SMD que son secundarios a exposiciones de diversos elementos, como benceno, metales pesados, pesticidas, radiacin ionizante, tolueno, sustancias utilizadas en quimioterapia y que son dainas para la mdula sea, etc 3. PATOGNESIS DE LOS SNDROMES MIELODISPLSTICOS La mielodisplasia est considerada como una
familia de desrdenes clonales caracterizada por hematopoyesis inefectiva y susceptibilidad a leucemia aguda en un plazo variable. La proliferacin clonal es la consecuencia de una mutacin somtica adquirida que confiere una ventaja proliferativa a estas clulas. Esta clonalidad puede ser determinada por anlisis citogentico y por hibridizacin fluorescente in situ (FISH) de las anormalidades cromosmicas, anlisis por southern blot de alteraciones genticas e inactivacin del cromosoma X. Aunque la celularidad medular habitualmente est aumentada en la mielodisplasia, hay discrepancia con las citopenias perifricas lo que estara explicada por un aumento en la muerte celular programada (apoptosis).
Tabla 15-2. Clasificacin de la OMS para los Sndromes Mielodisplsticos Subtipo morfolgico AR ARS Citopenia refractaria con displasia multilineal* AREB Tipo 1 Tipo 2 Sndrome 5qSMD inclasificable Blastos en sangre perifrica (%) <1 <1 <1 1-20 1-20 11-20 <5 <1 Blastos mdula sea (%) <5 <5 <5 5-20 5-10 11-20 <5 <5 Indiferente Indiferente Indiferente Solo 1 lnea no eritroide Sideroblastos mdula sea (%) < 15 > 15 Indiferente** Indiferente Displasia
Solo eritroide Solo eritroide Al menos de 2 lneas hematopoyticas*** Indiferente
* Bicitopenia o pancitopenia ** si > 15% se denomina citopenia refractaria con displasia multilineal con sideroblastos en anillo *** se considera displasia de una lnea si > 10% de clulas de esa lnea presentan displasia AR, anemia refractaria; ARS, AR con sideroblastos en anillo; AREB, AR con exceso de blastos
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Varias citoquinas o ligandos que tienen pr opiedades pro-apoptticas como la interleuquina 1b (IL-1b) factor de necrosis tumoral (TNF) y el ligando de fas (Fas-L), estaran no regulados en la mielodisplasia. En la mielodisplasia las clulas pluripotenciales hematopoyticas (CPH) son genticamente inestables y susceptibles de lesiones como una mutacin dominante sobre el resto de las clulas normales y como estas clulas muestran una evolucin clonal tienen tendencia a mltiples mutaciones genticas y a desarrollar leucemia. Debe existir un evento gentico inicial desconocido sobre la CPH que forma parte de una patognesis con mltiples etapas, lo que va seguido de una inestabilidad cariotpica clonal. Actualmente no se conocen defectos genticos que estn especficamente asociados con la mielodisplasia, aunque hay anormalidades cromosmicas y moleculares recurrentes. Hay una relativamente alta frecuencia de mutaciones del gen RAS y especficamente del N-RAS que est asociada con una transformacin rpida a leucemia. Existe una incidencia aumentada de Leucemia mielomonoctica juvenil en pacientes con Neur ofibromatosis tipo 1 lo que ha proporcionado algunas claves que implican la presencia de un gen RAS anor mal en la caracterstica hipersensibilidad de las clulas leucmicas al factor estimulante de colonias granulocito-macrfago (GM-GSF). Hay prdida de la heterogocidad del gen NF-1, as que la regulacin nor mal del RAS por la neurofibromina, se pierde resultando en la activacin de esta va. Tambin se han descrito mutaciones puntuales del gen p53; los pacientes con un clon anormal estn marcados por un isocromosoma 17q tienen a menudo una mutacin del p53 en estas clulas. Otras mutaciones han sido descritas en los genes NRAS y NB1. En los blastos de tipo mieloide existe expresin de la glicoprotena p170 y est incrementada en los pacientes con SMD, lo que representa la accin del gen de resistencia mltiple a drogas.
4. DIAGNSTICO Las manifestaciones clnicas en los pacientes afectados de SMD generalmente son consecuencia del grado de citopenia existente. Los sntomas ms frecuentes incluyen fiebre y sangramiento. En un tercio de los casos puede encontrarse esplenomegalia, casi siempre relacionada con el diagnstico de LMMC. 4.1. Alteraciones morfolgicas 4.1.1. Alteraciones citolgicas generales Un elemento fundamental en el diagnstico son las alteraciones morfolgicas cualitativas en una o ms series hematopoyticas que aparecen tanto en sangre perifrica como en mdula sea (tabla 15-3) y deben estar presentes, como mnimo, en el 10% de las clulas de cada una de las series. a) Sangre perifrica Aparecen una o ms citopenias, siendo la anemia la ms frecuente, se observa en alrededor del 85% de los casos, acompaada de macrocitosis moderada, adems puede encontrarse doble poblacin. Es frecuente encontrar eliptocitos, esquistocitos, punteado basfilo y eritroblastos. Estas alteraciones reflejan la eritropoyesis anormal que resulta de un desbalance entre la proliferacin y diferenciacin eritroide, y la apoptosis. Las alteraciones granulomonocitarias en el momento del diagnstico estn presente en alrededor del 50% de los pacientes. Es frecuente encontrar neutr openia acompaada de hipolobulacin (Pseudo-Pelger) y de hipogranulacin, con el consiguiente defecto funcional de estas clulas. La leucocitosis con incremento absoluto de monocitos (>1x109/L) se relaciona con la existencia de LMMC. La trombocitopenia est presente en el 30% de los casos al momento del diagnstico. Las plaquetas son gigantes, anor malmente alargadas e hipogranulares. Raramente puede observarse trombocitosis, la que se asocia con delecin del brazo largo del cromosoma 5, lo que confirma el sndrome 5q.
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Tabla 15-3. Alteraciones morfolgicas observadas en los SMD Sangre perifrica Diseritropoyesis Macrocitosis moderada Normocroma Poiquilocitosis Punteado basfilo Clulas rojas nucleadas Aumento de eritroblastos Anomalas Neutropenia Pseudo Pelger-Huet Hipo o hipergranulacin Distribucin irregular de la cromatina nuclear Trombocitopenia Plaquetas alargadas Hipogranulacin Hipergranulacin Mdula sea Cambios megaloblsticos Multinuclearidad Fragmentacin nuclear Alteraciones citoplasmticas Sideroblastos en anillo Hiperplasia Hipogranulacin Granulaciones mixtas Aumento de la basofilia citoplasmtica Anomalas nucleares Presencia de blastos con o sin alteraciones nucleares Micromegacariocitos Megacariocitos con pequeos ncleos mltiples redondeados Ncleos bilobulados Hipogranulacin Reduccin del nmero de megacariocitos
Disgranulopoyesis
Dismegacaripoyesis
b) Mdula sea La mdula sea generalmente se presenta hipercelular, pero hay un pequeo porcentaje de pacientes que puede presentar mdula sea hipocelular. La serie eritroide generalmente se encuentra hiperplsica, con alteraciones estructurales citoplasmticas, entre las que destacan la presencia de vacuolas y la basofilia intensa, alteraciones nucleares e incremento del nmero de eritroblastos hasta en un 50%. En esta diseritropoyesis suele observarse glbulos rojos macrocticos, que pueden ir acompaados de glbulos rojos normo y microcticos. Los eritroblastos presentan displasia, tanto en el ncleo como en el citoplasma, y pueden ser PAS+. La serie granuloctica usualmente est aumentada y muestra las alteraciones morfolgicas descritas en sangre perifrica. Adicionalmente se observan granulaciones
mixtas y la persistencia de basofilia citoplasmtica. Las caractersticas y porcentaje de blastos son factores determinantes en la clasificacin y les confiere un valor pronstico. La serie megacarioctica frecuentemente est aumentada a expensas de micromegacariocitos. La dismegacariopoyesis est presente en la mitad de los pacientes en el momento del diagnstico, se encuentran alteraciones de tamao, nucleares y citoplasmticas. 4.1.2. Alteraciones morfolgicas en los diferentes tipos de SMD a) Anemia refractaria Corresponde al 10 a 15% de los casos. La anemia es el principal hallazgo. En sangre perifrica se observa: macrocitosis, poiquilocitosis y anisocitosis moderada. Maduracin megaloblastoide, glbulos rojos nucleados displsticos. Reticulocitopenia, a veces puede existir un aumento en el porcentaje de reticulocitos, policromasia, el recuento de blancos es normal o levemente disminuido < 1%
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de blastos y las alteraciones disgranulopoyticas son menores. El recuento plaquetario es normal o levemente disminuido; en la mdula sea se encuentra celularidad normal o aumentada, puede ser hipocelular; se observa tambin hiperplasia eritroctica con diseritropoyesis (maduracin megaloblastoide) formas bizarras, gigantes y multinucleadas. Pueden verse sideroblastos. Disgranulopoyesis leve: hipo o hiperplasia granuloctica, disociacin de maduracin ncleo-citoplasmtica. La dismegacariocitopoyesis es leve. Se han descrito casos con citopenia refractaria sin diseritropoyesis. b) Anemia refractaria con sideroblastos en anillo Su diagnstico es excepcional y debe siempre descartarse una enfermedad constitucional como una citopata mitocondrial. Corresponde al 1 a 2 % de los nios. Sangre: desde el punto de vista de la serie roja hay una combinacin de macrocitosis y microcitosis con hipocroma. Ocasionalmente hay slo macrocitosis. Hay numerosos siderocitos. La disgranulopoyesis es leve, el recuento de blastos es bajo y la cifra de glbulos blancos es normal o ligeramente disminuida. Las alteraciones de los megacariocitos son leves, el recuento plaquetario es normal o bajo. Mdula sea: La celularidad est moderada o marcadamente hipercelular. Hiperplasia eritroctica marcada. Los sideroblastos anillados corresponden al >15% de todas las clulas nucleadas, tienen un mnimo de 5 grnulos y cubren al menos el 30% de la cir cunferencia del ncleo. La granulopoyesis es nor mal o hay leve disgranulopoyesis. La cifra de blastos corresponde a >5% de todas las clulas nucleadas. La dismegacariopoyesis es discreta. Los depsitos de fierro estn marcadamente aumentados. c) Anemia refractaria con exceso de blastos Se observa entre un 20 a 25% de los casos de mielodisplasia. Los enfer mos pueden presentarse con sntomas de anemia, fiebre o manifestaciones hemorrgicas. Sangre: La anemia puede ser macroctica o microctica. Pueden verse sideroblastos. Pueden existir
glbulos r ojos displsticos circulando. Granulocitos displsticos estn siempre pr esentes. Hiposegmentacin nuclear, neutrfilos hipogranulares, granulacin anormal. Basfilos y eosinfilos con hipogranulacin. Pueden existir hasta 5% de blastos. Mdula sea: Hiposegmentacin nuclear (PseudoPelger-Huet) o hipersegmentacin, pseudonuclolo, hipogranulacin, granulacin anormal, aspecto monocitoide. La cifra de blastos est entre 5 a 20%. Existe franca dismegacariopoyesis, hiper o hipoplasia de megacariocitos, for mas bilobuladas o mononuclear es, aumento de los micr omegacariocitos, vacuolizacin citoplasmtica y acmulos de megacariocitos. d) Anemia refractaria con exceso de blastos en transformacin Corresponde a un 25 a 30% de los casos. Los pacientes en este grupo presentan transformacin desde un SMD a una leucemia aguda, habitualmente en un corto perodo. Sangre: Anemia macroctica. Existe franca disgranulopoyesis y dismegacariopoyesis. Granulocitos anormales y puede haber aumento de los monocitos. Mdula sea: habitualmente hiper celular, per o puede ser nor mo o hipocelular. Existe disgranulopoyesis y dismegecariopoyesis. La cifra de blastos est entre 20 a 30%. Se pueden observar bastones de Auer. 4.2. Alteraciones citogenticas Las alteraciones del cariotipo estn presentes en el 30-50% de los SMD. La investigacin de la citogentica en la mdula sea, suplementada con FISH es esencial en la evaluacin de una mielodisplasia. Se ha observado una mayor incidencia de la prdida total o parcial de cromosoma, seguida por la existencia de trisomas (tabla 15-4). Las translocaciones son menos frecuentes y afectan fundamentalmente a los cromosomas 1, 3, 5, 7 y 17. Las alteraciones complejas, denominadas as porque incluyen ms de tres cromosomas ocurren en el 15% de los SMD primarios y 50% en los SMD secundarios. Son ms frecuentes las alteraciones de los cromosomas 5 y 7.
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Tabla 15-4. Alteraciones citogenticas ms frecuentes en los SMD Alteracin Delecin parcial de un cromosoma Prdida de un cromosoma Ganancia de un cromosoma Translocaciones Localizacin 5q, 20q, 7q, 11q, 12q, 13q Monosoma 7 y 17, prdida del Y Trisoma 8, 11, 21 t(3; 3) (q21; q26) t(1; 7) (p11; p11) t(5; 17) (p11; p11) t(7; 17) (p11; p11) t(5; 7) (q11; p11) Involucran a ms de dos cromosomas iso (17q) inv (3) (q21; q26)
Alteraciones complejas Otras
Recientemente se ha estudiado el acortamiento de la longitud de los telmeros en el momento del diagnstico, esto indicara un peor pronstico en el paciente. Tambin se ha infor mado un discreto incremento en la actividad de la telomerasa, en el 60% de los pacientes, lo que tambin implicara mal pronstico. La aplicacin sistemtica de estudios citogenticos en los SMD es importante, ya que aporta infor macin complementaria a la citologa y permite el establecimiento de entidades citolgica-citogenticas. FISH (ver captulo 30) permite observar alteraciones que no son detectadas por citogentica convencional. En los casos que se detectan cariotipos complejos se puede aplicar FISH multicolor, tales como M-FISH o SKY (Spectral Kariotyping) que per miten detectar mayor nmero de alteraciones citogenticas. Si se emplea HGC (Hibridacin Genmica Comparada) se puede detectar ganancias o prdidas de material gentico. En el ltimo tiempo se han presentado estudios en SMD con tecnologa de microarreglos (microarray) de expresin, lo cual permite conocer los mecanismos moleculares implicados en estos sndromes y as establecer conductas teraputicas especficas. Adems es
capaz de discriminar SMD de bajo riesgo, alto riesgo y poblacin normal. Hoy en da, la aplicacin de estas tcnicas es limitada, debido a su elevado costo econmico. Las anormalidades citogenticas no estn asociadas con un subtipo especfico de mielodisplasia a diferencia de la leucemia mieloide aguda. 4.3. Alteracin molecular Las mutaciones ms frecuentes son las que comprometen a la familia del gen RAS (tabla 15-5). stas se han identificado hasta en el 40% de los pacientes estudiados, la ms comn es la de los N-RAS que presenta alta asociacin transformacin a leucemia aguda. Le sigue en orden de frecuencia las mutaciones en el gen FMS, presente en el 10% de los pacientes con SMD. Ambas mutaciones son ms frecuentes en LMMC. Tambin se ha observado la expresin de la glicoprotena p-170; en blastos con fenotipo mieloide inmaduro se encuentra aumentada en el 50% de los pacientes con SMD de alto riesgo. Esta protena es codificada por gen de resistencia a multidrogas (MDR-1), lo que puede explicar la pobre respuesta al tratamiento quimioterpico en esta patologa.
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Pueden observarse alteraciones en los genes bc12 y p53 que participan en el mecanismo de regulacin de la muerte celular (apoptosis), al
encontrarse alteradas, llevara a una apoptosis excesiva y prematura.
Tabla 15-5. Alteraciones moleculares ms frecuentes en los SMD Gen RAS (N K) FMS P53 MDR 2 BCL 2 MDR 1 Tipo de Alteracin Mutacin puntual (codn 12-13-61) Mutacin puntual (codn 969 301) Mutacin (por delecin de un alelo) Sobre-expresin de protenas Frecuencia (%) 10 - 40 5 - 10 5 70 30 30
4.4. Alteraciones inmunolgicas Con respecto a la inmunidad humoral, un tercio de los pacientes con SMD presentan un aumento de las inmunoglobulinas sricas, con aumento de los valores de IgG e IgA. Los estudios inmunofenotpicos de los pacientes con SMD siguen siendo por el momento escasos. La mayor parte de la informacin disponible se centra en el estudio de precursores blsticos, especialmente CD34+, cuando el paciente sufre evolucin a leucemia aguda. Tambin existe relacin entre la disminucin de la expresin de CD11b o el aumento de la expresin de los antgenos CD34, HLA-DR, CD13 y CD33 en mdula sea y el riesgo de transformacin a leucemia aguda. Aunque los trabajos en este mbito son escasos, sugieren la utilidad del inmunofenotipo en la caracterizacin diagnstica de los pacientes con morfologa y citogentica dudosa. 4.5. Alteraciones enzimticas Se ha encontrado aumento en los niveles sricos de la enzima lctico deshidrogenasa (LDH); segn algunos investigadores esto podra conferir valor pronstico independiente.
En algunos pacientes se ha observado ausencia de la enzima glutation-transferasa-theta-1, que participa en la desintoxicacin de cancergenos ambientales; esta ausencia incrementa el riesgo de adquirir SMD secundarios. 4.6. Cultivos de mdula sea En cultivos de mdula sea de pacientes con AR, ARS y LMMC se ha observado incremento en el nmero de las unidades formadoras de colonia de granolocitos-monocitos (GM-CFU), pero se encuentran disminuidas en pacientes con AREB y AREB-t. 5. SNDROMES MIELODISPLSTICOS EN PEDIATRA Los SMD constituyen un grupo heterogneo de hemopatas clonales infrecuentes en nios. Su frecuencia es de 1,7 casos por milln de nios en riesgo. La primera clasificacin de SMD en nios se estableci atendiendo a la existencia de condiciones genticas predisponentes o de antecedentes de quimioterapia precedentes. Segn esto se clasifican como se indica en la tabla 15-6.
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Tabla 15-6. Clasificacin de los SMD peditricos
SMD asociado a enfermedad gentica o alteraciones cromosmicas (30%). - Sndrome de Down - Neurofibromatosis - Sndrome de insuficiencia medular congnita - SMD/LAM con anormalidades en 5q y 7q SMD secundarios a quimioterapias previas SMD primarios - Clasificacin FAB: AR, ARSA, AREB, AREB-t, LMMC - Clasificacin OMS: AR, AREB I y II, LMMJ (SMD7SMP)
En la infancia los SMD corresponden a un grupo heterogneo de desrdenes clonales de la clula madre (stem cell) hematopoytica caracterizados por hematopoyesis inefectiva asociada con mdula sea frecuentemente hipercelular, muerte celular intramedular aumentada y citopenias perifricas de severidad variable. Estos pacientes evolucionan en un 20 a 30 % de los casos a una leucemia aguda habitualmente de tipo mieloide en un plazo menor de 2 aos, a diferencia de los adultos, y la pr ogr esin de la enfer medad est caracterizada por expansin del clon anormal e inhibicin de la hematopoyesis normal. La incidencia es relativamente baja representando un 3 a 5 % de las enfermedades hematolgicas malignas de la niez. Otras estadsticas la refieren como fase previa en 15% de las leucemias mieloides agudas y en general la cifra aceptada es de 0.5 a 1 por 1.000.000 de nios menores de 15 aos. Existe un predominio en los varones. El primer intento sistemtico para la clasificacin fue aportado por el grupo FrancoAmericano-Britnico (FAB) en 1982 (tabla 151). Sin embargo y a pesar de ser la clasificacin ms ampliamente aceptada, es parcialmente aplicable en nios. En la actualidad y luego de un consenso internacional, el grupo catalogado como LMMC ha sido reemplazado por el de Leucemia mielomonoctica juvenil, que incluye la pr eviamente llamada leucemia mielomonoctica crnica, la leucemia mieloide crnica juvenil y el sindrome de monosoma 7 infantil, debido a sus similitudes clnicas y biolgicas que sugieren variables de la misma enfer medad. Otr o factor importante de considerar en los nios es que los SMD estn asociados, en un alto porcentaje de casos, a una enfermedad con anomalas constitucionales como son la anemia de Fanconi, la enfermedad
de Shwachman-Diamond, la neurofibromatosis tipo 1, el sndrome de Down, las neutropenias congnitas severas incluida la Enfermedad de Kostmann y la trisoma 8. Adems deben incluirse los pacientes con alteraciones displsticas y antecedentes de terapia citotxica as como la anemia aplstica que haya recibido tratamiento inmunosupresor. Tambin se han descrito casos familiares de mielodisplasia, sin aparente enfer medad congnita ni anormalidad gentica, en que ms de un miembro de la familia ha desarrollado mielodisplasia o leucemia mieloide aguda. Hay reportes de hermanos con mielodisplasia y monosoma 7. En varios casos el desarrollo de la enfermedad ha sido asociada con la evolucin de una anormalidad citogentica en la mdula sea, a menudo monosoma 5 7. Leucemia mielomonoctica juvenil La leucemia mielomonoctica juvenil (LMMJ) es una rara anormalidad clonal de las CPH que se manifiesta como una enfer medad mielopr oliferativa en los nios y es probablemente un puente entre trastorno mieloproliferativo y mielodisplasia. Existe pr oliferacin de la lnea granuloctica y monoctica as como tambin anormalidades de la serie eritroide y megacarioctica. Se le ha denominado tambin leucemia mieloide crnica juvenil, sndrome de monosoma 7 infantil, leucemia crnica juvenil y leucemia mielomonoctica crnica. La incidencia de LMMJ es alrededor de 1.3 por 1.000.000 de nios menores de 15 aos, constituye un 2% de las leucemias en el nio y un 20-25% de SMD peditricos. El 75% de los casos se presenta en nios menores de 3 aos
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y en un 10% de los casos est asociado a neurofibromatosis tipo1. El hemograma y mielograma siempre muestra proliferacin mielomonoctica. Hay infiltracin heptica, esplnica, ganglionar, drmica y del tracto respiratorio. Una de las caractersticas ms relevantes de la LMMJ es su habilidad para for mar espontneamente colonias de granulocitomacrfagos y su marcada sensibilidad al factor de crecimiento granulocito-macrfago (GMGSF) confir ma el diagnstico. Existe hipergammaglobulinemia policlonal y puede confundirse con enfermedades infecciosas como Epstein-Barr, Citomegalovirus, Herpes 6 y Micoplasma. Diagnstico. De acuerdo a la recomendacin actual se exigen los siguientes requisitos para el diagnstico: Hallazgos clnicos sugerentes: Hepatoesplenomegalia, linfoadenopata, palidez, fiebre y rush cutneo; laboratorio: recuento de leucocitos > 10.000/L, recuento de monocitos > 1.000/L, presencia de precursores mieloides en sangre perifrica, hemoglobina fetal aumentada para la edad (> 10%); mdula sea: < 20% de blastos , cromosoma Filadelfia (-) y no existencia de rearreglo bcr-abl; anor malidad clonal citogentica, incluida la monosoma 7 hipersensibilidad in vitro al GM-CSF de los progenitores mieloides Se requieren todos los criterios de laboratorio y al menos 2 de los criterios medulares para hacer el diagnstico. El pronstico depende de la edad, de la profundidad de las citopenias encontradas, del nmero de blastos y de las alteraciones citogenticas. En la actualidad el tratamiento de eleccin en la mayora de los casos de mielodisplasia es el trasplante de mdula sea pero existen situaciones en que la quimioterapia y/o el tratamiento de sostn dan una mejor sobrevida a los pacientes. En el ltimo tiempo ha habido una preocupacin mayor para esta heterognea enfermedad lo que ha llevado a un mejor registro, al aumento de casos reportados y a un mejor diagnstico y manejo. As se han llevado a cabo 2 simposios del grupo europeo de trabajo en SMD en la infancia (1997 y 2000), en los que diferentes grupos inter nacionales, con un alto volumen de pacientes, han reportado sus resultados. En un trabajo retr ospectivo de Niemeyer y colaboradores, publicado en 1997 y en el que analiza 110 pacientes peditricos con LMMC da una sobrevida de 39% a 5 aos a los pacientes
sometidos a trasplante de mdula sea y de slo un 6% para los no trasplantados. Los factores pronsticos fueron la edad, el recuento plaquetario y la hemoglobina fetal al diagnstico. Passmore y colaboradores mostraron su experiencia en 1995 con 68 nios mielodisplsticos y la sobrevida global a 5 aos fue de 31.9%. En su grupo encontr un 55% de alteraciones citogenticas siendo la ms comn el compromiso del cromosoma 7 y como factores pronsticos adversos se destac el recuento plaquetario (< 33.000/L), la cifra de hemoglobina fetal (>15%) y las alteraciones citogenticas complejas desarrollando un sistema de score para evolucin pronstica de sobrevida. En una publicacin reciente de Luna-Fineman y colaboradores en San Francisco con 167 pacientes con SMD y trastornos mielopr oliferativos, los nios fueron reclasificados de acuerdo a la recomendacin actual: mielodisplasias, leucemia mielomonoctica juvenil y trastor nos mieloproliferativos asociados. La sobrevida total fue de 25% a 16 aos y la transformacin a leucemia se observ en un 32% de los casos. Los hallazgos pronsticos favorables fueron la edad menor de 2 aos y la hemoglobina fetal < 10%. En nuestro pas la experiencia publicada tambin es escasa y los casos fueron clasificados de acuerdo a FAB. Se ha observado una alta evolucin a leucemia aguda y una sobrevida de 47% a 5 aos haciendo la salvedad que eran slo 17 pacientes y la mayora correspondier on a anemia refractaria. En el grupo PINDA (Programa Infantil Nacional de Cncer) ha habido preocupacin constante por este tipo de pacientes y aunque el nmero es pequeo no existe un consenso sobre el diagnstico, su clasificacin y menos an en el tratamiento. Actualmente se usa un protocolo de trabajo como una herramienta para intentar clasificar en forma adecuada a estos pacientes y sugerir un tratamiento acorde. El protocolo considera los cinco tipos de SMD de la clasificacin FAB y se agrega el grupo de leucemia mielomonoctica juvenil. Recientemente la OMS ha propuesto para los SMD y mieloproliferativos infantiles usar el trmino citopenias refractarias cuando se cumplen al menos 2 de los siguientes criterios diagnsticos: sndrome citopenia mantenida inexplicada (anemia, neutropenia o trombocitopenia), mielodisplasia morfolgica al menos bilineal, anormalidad citogentica clonal adquirida en clulas hematopoyticas, blastos aumentados (>5%). En la tabla 15-7 se enumeran las categoras diagnsticas de enfermedad mielodisplsica y mieloproliferativas en nios.
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Tabla 15-7. Categoras diagnsticas de Enfermedad Mielodisplstica y Mieloproliferativa en nios Enfermedad mielodisplstica/mieloproliferativa Leucemia mielomonoctica juvenil (LMMJ) Leucemia mielomonoctica crnica secundaria (LMMC) Leucemia mieloide crnica BCR-ABL negativa (LMC cromosoma Filadelfia negativo) Sndrome de Down Trastorno mieloproliferativo transitorio Leucemia mieloide aguda en Down Sndrome mielodisplstico Citopenia refractaria (< 2% blastos en sangre y < 5% en mdula sea) Anemia refractaria con exceso de blastos (AREB) (2- 19% de blastos en sangre y 5 - 19% de blastos en mdula sea) Anemia refractaria con exceso de blastos en transformacin (AREB-T) (20 - 29% de blastos en sangre o mdula sea) Los sndromes mielodisplsticos primarios de los nios se asocian con anomalas citogenticas en un 50% de los casos y en un 90% en pacientes con mielodisplasia inducida por terapia. En los nios con mielodisplasia hay una marcada predominancia de monosoma 7, pero tambin se observa esta anormalidad en nios con leucemia o mielodisplasia que ocurre en pacientes con desr denes medulares congnitos. La delecin del cromosoma 5 es raro en nios a diferencia de los adultos. 6. EVALUACIN DIAGNSTICA DE MIELODISPLASIA El diagnstico de los SMD es de exclusin, por lo que es necesario descartar la existencia de grupo de entidades con caractersticas morfolgicas similares antes de establecer el diagnstico final, entre ellos podemos citar: anemia megaloblsticas, leucemias agudas, anemia aplsica, entre otras. Algunos investigadores han propuesto criterios mnimos para el diagnstico. Entre estos criterios propuestos destacan: presencia de megacariocitos multinucleados, mieloblastos agranulares o con presencia de bastones de Auer, neutrfilos agranulares, diseritropoyesis, sideroblastos en anillo y alteraciones del cariotipo. En el diagnstico se debe incluir: historia clnica detallada, historia familiar de leucemia o alteraciones constitucionales congnitas. Antecedentes de terapia citotxica o exposicin a radiacin. Examen fsico: bsqueda de desrdenes congnitos (anemia de Fanconi, enfermedad de Shwachman, Neurofibromatosis, sndrome de Down, enfermedad de Kostmann, Noonan. Laboratorio: Hemograma, reticulocitos, volumen corpuscular, plaquetas, VHS; pruebas de coagulacin, estudio de funcin heptica y renal, LDH, fosfatasas alcalinas leucocitarias. deter minacin de Inmunoglobulinas, test de HAM, hemoglobina fetal pretransfusin, serologa para virus de Epstein-Barr, Citomegalovirus, Parvovirus, Herpes 6, Micoplasma, VIH, cultivo de linfocitos. Mdula sea: aspirado para morfologa y tincin de fierro (hemosiderina), inmunofenotipo, citogentica, biopsia medular. El ndice pronstico internacional (IPSS). Utiliza para determinar el score, el porcentaje de blastos en mdula sea el cariotipo y la citogentica (tabla 15-8).
Tabla 15-8. ndice de pronstico internacional (IPSS) 0 Blastos Mdula sea (%) Cariotipo Citogentica <5 bueno 0/1 0.5 5 10 intermedio 2/3 1 malo 1.5 11 20 2 21 30
El IPSS permite clasificar a los pacientes en
grupos de riesgo (tabla 15-9).
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Tabla 15-9. Clasificacin de grupo de riesgo segn IPSS Grupo de riesgo Bajo Intermedio 1 Intermedio 2 Alto
IPSS, ndice pronstico internacional
IPSS 0 0.5 - 1 1.5 2 2.5 o +
Sobrevida a 2 aos 76% 52% 40% 30%
Sobrevida a 5 aos 55% 22% 10% 0%
Una vez que se determina el grupo de riesgo del paciente y adems se sabe su clasificacin dentro de los SMD, se puede tomar una decisin para un mejor tratamiento. 7. TRATAMIENTO DE LOS SMD Este es un grupo heterogneo de enfermedades en que la conducta clnica vara y la apr oximacin teraputica es a veces controversial. Es de mucha importancia tener bien caracterizado cada paciente para clasificarlo en la forma adecuada. El tratamiento ptimo no ha sido bien definido. La heterogeneidad clnico biolgica de los SMD y la diversidad de tratamientos disponibles con diferente intensidad y toxicidad, reflejan la ausencia de un tratamiento efectivo para la mayora de los casos. Ello obliga a individualizar el tratamiento de estas enfermedades segn la edad, estado general del paciente y la severidad del SMD. En cada caso, un diagnstico preciso y la determinacin del IPSS son esenciales para trazar un plan teraputico. 7.1. Estrategias generales de tratamiento Tratamiento de soporte Muchos pacientes con SMD presentan citopenias leves y estables durante largo tiempo. Cuando las citopenias se agravan es necesario realizar transfusiones, ya sea de glbulos rojos para la anemia y plaquetas para tratar trombocitopenias sintomticas. Cuando los requerimientos de transfusiones de glbulos rojos son elevados, se requiere utilizar conjuntamente quelantes de fierro, con el fin de evitar la sobrecarga tisular. Tambin se debe administrar antibiticos, en caso de infecciones que son las ms frecuentes en estos pacientes.
Trasplante de progenitores hematopoyticos El trasplante de stem cells es la nica alternativa teraputica curativa disponible, pero esta estrategia asume un alto riesgo de mortalidad. Se recomienda trasplantar lo antes posible a todos los pacientes menores de 40 aos, y a los mayores de edad cuando hay citopenias graves o exceso de blastos. Otros investigadores recomiendan que el trasplante se realice en forma precoz en los pacientes con SMD de alto riesgo, esperando que tengan una progresin a un SMD de menor riesgo. Existen varias modalidades de trasplante de progenitores hematopoyticos: TPH alognico de donante relacionado, PH alognico de donante no relacionado, TPH de sangre perifrica, TPH autlogo y Mini trasplantes. Quimioterapia El empleo de la monoquimioterapia a bajas dosis es de dudosa eficacia, siendo probablemente el Melfaln y el Topotecan los frmacos ms eficaces. Factores de crecimiento hematopoytico No eliminan los SMD, pero al aumentar los recuentos de las clulas sanguneas pueden reducir la cantidad de transfusiones en algunos pacientes. Hay distintos tipos de factores de crecimiento, que pueden usarse solos o en forma combinada. El potencial teraputico de la Eritropoyetina (Epo) recombinante en el tratamiento de la anemia sintomtica en los pacientes con SMD. En los ltimos aos se ha utilizado Epo combinndola con factores estimuladores de colonias de granulocitos (G-CSF) y granulocticamacrofgica (GM-CSF) obtenindose respuesta entre el 40 60%.
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Actualmente se estudia la interleuquina 11 (IL11), ya que parece ser til para el mejoramiento de la trombocipenia de algunos pacientes, pero an no se ha entregado datos certeros sobre su utilidad. Terapia inmunosupresora Se utilizan en pacientes jvenes con SMD, que presentan una mdula sea hipoplsica (<15% de celularidad), que suelen presentar cariotipo normal y nmero de blastos normal en mdula. El tratamiento con Globulina Antitimocito (ATG) y Ciclosporina (Cy), ha demostrado una eficacia en estudios que el 34 y 47%, respectivamente, de los pacientes con SMD tratados, los cuales no requirieron ms transfusiones, presentaron un decrecimiento de la progresin de la enfermedad y un aumento de la sobrevida. Hoy en da, aunque se observan respuestas significativas, es importante tener presente los efectos secundarios que puede presentar el paciente, como fiebre, urticaria, anafilaxis que raramente se presenta pero es severa, en el caso de ATG y daos en el rin, hipertensin arterial en el caso de la Cy. Por esta razn, en algunos pacientes se pone en duda su utilidad. Inductores de diferenciacin En algunos casos, pueden inducir a la stem cell a un funcionamiento ms eficiente, procediendo mayor nmero de clulas sanguneas maduras. La Citarabina en bajas dosis, cuyos efectos hasta hoy en da no se sabe si estn ligados a induccin de diferenciacin o a la toxicidad, ha sido ampliamente estudiada, con tasas de respuestas completa menores al 20%, sin beneficio clnico significativo y con efectos secundarios importante en la mitad de los pacientes. Los derivados de la vitamina D3, que in vitro tiene un claro efecto diferenciador, en la clnica no han proporcionado resultados significativos. El cido transretinoico (ATRA) ha sido en utilizado en for ma aislado como agente diferenciador, obtenindose respuestas solo en un 10% de los pacientes. El uso de ATRA asociado con otros agentes inductores de diferenciacin celular podra ser beneficioso, ya que su respuesta se ve aumentada en un 20%.
Agentes desmetilizantes Azacitidina (AZA) es un anlogo de la pirimidina, que inhibe a la DNA metiltransferasa, que es la enzima responsable de la metilacin del DNA dando como resultado DNA hipometilado produciendo cambios en la expansin de transcripcin. El uso de AZA reduce el riesgo de transformacin a leucemia, mejora la calidad de vida, pero no altera de manera significativa la sobrevida global del paciente. La Decitabina es otr o agente hipometilizante con el que se ha obtenido un 50% de respuesta hematolgica global. Futuras estrategias que an estn en estudio pueden optimizar los tratamiento con estos agentes, combinndolos con G-CSF y Fluradabina; estudios preliminares muestran una respuesta hematolgica del 64% en pacientes con anormalidades citogenticas de riesgo favorable o intermedio. Inhibidores de apoptosis En los pacientes con SMD se ha descrito un aumento de la apoptosis, lo que origina una hematopoyesis ineficaz y citopenias perifricas. El incremento del fenmeno de apoptosis se ha relacionado con la activacin intrnseca de los mecanismos de muerte celular o preferentemente inducido por ciertas citoquinas (como el Factor de Necrosis Tumoral (TNF- )). Estudios experimentales han demostrado que la Amifosfatina puede ser un inhibidor potencial de la actividad de las citoquinas. Adems es un agente que tiene la capacidad de proteger tejidos finos normales, pero no protege a las clulas tumorales, por lo que podra utilizarse junto con quimioterapia, pero esto no se ha podido comprobar en un ciento por ciento. Inhibidores de la angiognesis Recientemente se ha descrito un aumento en la angiogensis en mdula sea como parte de los mecanismos que contribuyen a explicar la hematopoyesis ineficaz. Por este motivo se ha estudiado el uso de la Talidomida, dada su capacidad antiagiognica in vitro. Los resultados del tratamiento con la Talidomida han sido, en general, muy pobres, menores al 30%, y presentan una alta toxicidad. La mayor tasa de respuesta se obtiene en los pacientes con SMD de bajo riesgo.
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7.2. Tratamiento de los SMD en pediatra A continuacin se indica una pauta de terapia para cada grupo de enfermos basada en la clasificacin actual y la experiencia de grupos internacionales colaborativos. Anemia refractaria. En este grupo de pacientes se tomar una conducta conservadora si el estudio citogentico es nor mal y no es dependiente de transfusiones. Se har un tratamiento denominado multifactorial con: Vitamina C 100 mg da oral. cido flico 1 mg da oral. Riboflavina 5 mg da oral (comprimido de 10 mg). Complejo vitamnico B1, B6, B12 (Tol 12 suspensin ) 10 ml da. Prednisona 5 mg da por medio oral. Si el paciente tiene un recuento plaquetario mayor de 50.000 se usar adems: Vitamina B6 (Piridoxina) 200 mg intramuscular (IM) bisemanal. Vitamina B12 100 ug IM semanal. Si el paciente es dependiente de transfusiones, presenta citogentica anormal o tiene un curso evolutivo agresivo o de progresin: Trasplante de mdula sea, alognico, relacionado. Anemia refractaria con sideroblastos en anillo En pediatra esta patologa es excepcional y es muy importante descartar una citopata mitocondrial, entidad que presenta anemia sideroblstica, vacuolas en mieloblastos y eritroblastos inmaduros y estudio citogentico normal. Puede evolucionar por largos perodos con anemia como citopenia nica, compromiso neurolgico cortical progresivo, acidosis metablica y compromiso multiorgnico. La citopata mitocondrial no corresponde a un sndrome mielodisplstico. Si el paciente tiene una enfermedad estable se debe efectuar tratamiento multifactorial. En cambio, si el paciente tiene dependencia transfusional o presenta una anormalidad citogentica como una delecin del brazo largo del cromosoma 5 (5 q-) se debe intentar un trasplante de mdula sea. Anemia refractaria con exceso de blastos y Anemia refractaria con exceso de blastos en transformacin. Si el paciente tiene adems un sndrome de Down se indica Quimioterapia de Leucemia mieloide aguda (LMA). Si el paciente tiene una cifra de blastos > 15 % en mdula sea y una alteracin citogentica habitual de LMA (ej. t (8;21), t (15;17), inv(16): Efectuar quimioterapia de LMA. Si el paciente presenta una monosoma 7: trasplante de mdula sea. Intentar el
trasplante en forma precoz una vez hecho el diagnstico por la peor evolucin en estado evolutivo o en progresin. Leucemia mielomonoctica juvenil Si el paciente es menor de 2 aos y enfermedad estable: Conducta expectante. Evaluar el uso de cido retinoico 40 mg/m2/da oral. Uso de factor estimulante de colonias de granulocitos en neutropenia: 5 ug/kg/da. Si el paciente es > 2 aos, tiene Hb fetal aumentada para la edad, alteracin citogentica o monosoma 7 o dependencia transfusional debe efectuarse trasplante de mdula sea de donante familiar compatible. Si el paciente no tiene donante para el trasplante, considerar la quimioterapia de LMA. LECTURAS SUGERIDAS Aric, M., Biondi, A., Pui, CH. Juvenile myelomonocytic leukemia Blood, 90:4794884, 1997. Bargay, J. Trasplantes de Clulas Progenitoras Hematopoyticas en Sndromes Mielodisplsicos Vamos avanzando?. Hematologa (edicin especial). 87(6): 394 398, 2003. Cazzola, M. Alternatives to Conventional or Myeloblative chemotherapy in Myelodysplastic Dyndr ome. International Journal of Hematology. 72(2): 134 138, 2000. Fernndez, N., Hernndez, C., Hernndez, P. Tratamiento de los Sndromes Mielodisplsicos con cido retinoico asociado con otros agentes inductores de la maduracin celular. Revista Cubana hematologa inmunologa hemoterapia. 12(1): 125 129, 1997. Fernndez, N., Hernndez, P. Sndromes Mielodisplsicos, Biologa y Clnica. Revista Cubana hematologa inmunologa hemoterapia. 16(1): 5 20, 2000. Fernndez, N. Clasificacin de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) de los Sndromes Mielodisplsicos. Hematologa (edicin especial). 87(6): 18 20, 2002. Fundacin Internacional de A. Aplsica y SMD. Sndromes Mielodisplsicos. 2000. Disponible en www.aplastic.org/docs/Sndrome Mielodisplsicos.docs. Consultado en marzo de 2004.
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HEMATOLOGA
Captulo
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GENERALIDADES SOBRE TRASPLANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYTICOS

Julia Palma B. y Oscar Gonzlez R.
1. Introduccin 2. Fundamento y objetivos del TPH 3. Tipos de TPH 3.1. TPH alognico 3.2. TPH autlogo 4. Fuente de precursores hematopoyticos 4.1. Progenitores obtenidos de la mdula sea 4.2. Progenitores obtenidos de la sangre perifrica 4.3. Progenitores obtenidos de la sangre de cordn 5. Etapas del TPH 5.1. Planificacin 5.2. Preparacin 5.3. Acondicionamiento 5.4. Trasplante 5.5. Implante 5.6. Recuperacin a corto plazo 5.7. Recuperacin a largo plazo 6. Indicaciones del TPH
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RESUMEN
El aumento progresivo del trasplante de progenitores hematopoyticos (TPH) como tratamiento de enfermedades hematolgicas, oncolgicas y hereditarias es la culminacin de ms de cuatro dcadas de investigacin. Estudios efectuados en modelos animales tuvieron gran importancia para entender las bases biolgicas de la inmunologa de los trasplantes. As pudo definirse la gentica del Sistema Principal de Histocompatibilidad (MHC, HLA). El concepto de proteger con injertos compatibles de mdula sea (MO) despus del uso de quimiorradioterapia fue luego aplicado al tratamiento de humanos con enfermedades malignas del sistema hematopoytico. Las drogas inmunosupresoras se desarrollaron con el fin de disminuir la severidad de la reaccin inmunolgica entre el injerto y el husped. En los ltimos 35 aos ha habido un crecimiento exponencial del TPH, realizndose inicialmente entre hermanos HLA idnticos y desarrollndose posteriormente los de donante familiar no idntico y donantes alternativos no emparentados. La morbilidad y la mortalidad asociada han disminuido notablemente en las ltimas dcadas debido al uso de regmenes de acondicionamiento menos txicos, cambio en las pautas de inmunosupresin y mejora en los tratamientos de soporte. El objetivo principal del TPH es curar enfermedades que seran fatales sin este tratamiento. Despus de utilizar altas dosis de quimioterapia, radiacin o ambas, la mielopoyesis es insuficiente y se restaura por medio del TPH (stem cells o clulas madre), que son capaces de reproducir todas las lneas celulares hematopoyticas. Actualmente las fuentes de obtencin de progenitores hematopoyticos son la MO, la sangre perifrica y el cordn umbilical. Existen tres tipos de TPH: autlogo, alognico y singnico. En el trasplante autlogo, se utilizan las propias clulas del paciente previamente extradas de la MO o recolectadas de su torrente circulatorio mediante separacin celular por afresis. En el trasplante alognico las clulas progenitoras se pueden obtener de MO, sangre perifrica o sangre de cordn umbilical del donante. Se selecciona al donante que tenga la mayor histocompatibilidad con el receptor. Si no existe donante familiar adecuado, se inicia una bsqueda a travs de registros internacionales autorizados de MO y cordn umbilical.
1. INTRODUCCIN La reconstitucin hematopoytica parcial o total posterior a la aplicacin de clulas progenitoras madre provenientes de la MO, movilizadas en la sangre perifrica (SP) u obtenidas de la sangre del cordn umbilical (SCU) es una modalidad teraputica conocida en la actualidad como TPH. El aumento pr ogr esivo del TPH como tratamiento de enfermedades hematolgicas, oncolgicas y hereditarias es la culminacin de ms de cuatro dcadas de investigacin. Los intentos iniciales en los aos 50 de trasplantar clulas vivas de un individuo a otro fueron observados con gran escepticismo, considerndose que la barrera inmunolgica frente a tejidos ajenos no podra ser sobrepasada. El primer TPH en un modelo animal se comunic en 1939. Las explosiones atmicas de Hiroshima y Nagasaki en 1945 mostraron por primera vez el efecto letal de la radiacin.
Posteriormente, se descubri que la muerte poda evitarse en los roedores al ser sometidos a irradiacin en dosis letales, si se protega el bazo o si, posteriormente, se reinfunda mdula sea autloga. Estas observaciones hicieron pensar, por primera vez, que los pacientes con leucemia podran ser irradiados con el objetivo de destruir las clulas malignas de la mdula sea. Si bien la teora era correcta, inicialmente el procedimiento se limit a pacientes de muy alto riesgo, sin otra posibilidad de tratamiento curativo. Los primeros resultados clnicos fueron muy desilusionantes. Slo sobrevivieron aquellos enfermos trasplantados de un gemelo idntico. En estas primeras etapas se conoca muy poco sobre inmunologa clnica y muchos investigadores se desalentaron y abandonaron los estudios. No fue hasta la dcada de los 60, fecha en que se describe el Sistema Principal de Histocompatibilidad (MHC, HLA en humanos), cuando se da inicio a los TPH en pacientes adultos con patologas oncolgicas. El primer
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trasplante exitoso en un paciente peditrico con un sndrome de inmunodeficiencia severa combinada se comunic en 1968. En los aos posteriores se introdujeron nuevos mtodos de inmunoterapia, quimioterapia en altas dosis y diagnstico de enfermedad residual. A partir de 1985, el desarrollo de esta rama de la hemato-oncologa ha escalado peldaos importantes. De esta forma en la actualidad el TPH representa una modalidad teraputica primaria y curativa para patologas que no tendran otra opcin teraputica. En los ltimos 35 aos ha habido un crecimiento exponencial del TPH, realizndose inicialmente entre her manos HLA idnticos y desarrollndose, posterior mente, los de donante familiar no idntico y donantes alternativos no emparentados. 2. FUNDAMENTO Y OBJETIVOS DEL TPH Los objetivos primordiales en los pacientes sometidos a un TPH pueden ser : (a) sustituir el sistema hematopoytico del paciente en forma total o parcial por uno sano, esto debido a estar total o parcialmente defectuoso, insuficiente o con compromiso neoplsico y (b) permitir un tratamiento antineoplsico en dosis muy elevadas, las que normalmente originaran mielosupresin prolongada o definitiva, seguidas de un rescate celular con progenitores hematopoyticos (PH) autlogos. Este tipo de trasplante se fundamenta en la necesidad de aplicar quimioterapia en dosis muy altas (mieloablativas) para lograr el control de la enfermedad oncolgica de base. Solo se plantea realizar este tipo de TPH si la enfermedad de base se encuentra controlada y en remisin completa (RC) morfolgica, molecular o por imgenes. Se podra resumir que los principales objetivos de los TPH son: Sustituir MO enferma alterada en forma parcial o total, por una sana y funcional (para patologas como la anemia aplstica severa, anemia drepanoctica o de clulas falciformes, las talasemias mayores, etc.). Sustituir la MO y restaurar su funcin normal despus de que se hayan administrado altas dosis de quimioterapia y/o radioterapia para tratar una neoplasia que no pudo erradicarse con otras modalidades teraputicas. En este rubro se encuentran la mayora de los trasplantes de tipo autlogo. Sustituir la MO por una funcional y sana genticamente para prevenir o restaurar el dao como consecuencia de una enfermedad gentica (tal como el sndrome
de Hurler y la adrenoleucodistrofia). Sustituir la MO que ha sido infiltrada por clulas neoplsicas por una sana y funcional (para las leucemias agudas y crnicas, sndromes mielodisplsicos, etc.)
3. TIPOS DE TPH En la actualidad, existen distintos tipos de TPH, los que pueden ser realizados de diversas for mas y el nombre que reciben est determinado por lo general del origen de los PH a transplantar. De esta forma el TPH puede ser autlogo cuando los PH se obtienen del mismo paciente, o de tipo alognico, cuando los PH provienen de un donante, ya sea familiar o no emparentado. 3.1. TPH alognico
Existen diferentes tipos de TPH alognicos dependiendo bsicamente del origen de los PH y parentesco entre el donante y el receptor, adems del grado de histocompatibilidad HLA entre ambos. De esta forma los TPH alognicos pueden a su vez dividirse en: Singnicos, cuando los PH son obtenidos de un gemelo univitelino idntico (hermano homocigoto); en este caso comparten el mismo HLA. Alognico familiar, cuando los PH han sido obtenidos de un donante familiar, generalmente hermano. Estos, a su vez, pueden ser de un familiar idntico (comparten el mismo sistema HLA) o parcialmente compatible si existe una diferencia inmunolgica mnima en el sistema HLA (mismatch menor). Alognico de donante no emparentado, cuando los PH han sido obtenidos de un donante no familiar (banco de PH de MO o SCU). Al igual que el primer grupo, estos pueden dividirse en HLA idnticos o no HLA idnticos. Haploidnticos, cuando el donante es un familiar que comparte la mitad de los genes HLA con el receptor; generalmente uno de los padres del paciente. 3.2. TPH autlogo
En los trasplantes de tipo autlogo el paciente recibe sus propios PH previamente recolectados y criopreservados. El trasplante autlogo se ha utilizado primordialmente en el tratamiento de tumores slidos o para aquellos pacientes con una hemopata maligna en los que no se haya encontrado un donante compatible.
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4. FUENTE DE PRECURSORES HEMATOPOYTICOS Los PH pueden ser obtenidos de diferentes fuentes: MO, SP y SCU. Inicialmente los TPH fueron llamados trasplantes de mdula sea, debido primordialmente a que la MO era la fuente clsica donde se obtenan los PH. Con el uso de otras fuentes de PH, actualmente el trmino utilizado es el de TPH. 4.1. Progenitores obtenidos de la mdula sea Los progenitores de la MO se obtienen bajo anestesia general por medio de aspiracin directa del hueso por mltiples punciones en la cresta iliaca y menos frecuentemente en esternn y en tibias. Las punciones se realizan con agujas tipo Janshidi, en pequeos volmenes que no deben sobrepasar los 4 ml para evitar la contaminacin con sangre perifrica. La MO es recolectada en una bolsa especial con anticoagulante para luego ser filtrada. La cantidad de MO o de PH a recolectar variar considerablemente con el peso de cada paciente. En trminos generales se recomienda por lo menos 3 a 5 x 108 clulas totales/kg de peso del receptor para garantizar el implante del injerto. Posteriormente, la MO puede ser infundida al receptor, o bien ser llevada al laboratorio para distintos procesamientos si es necesario, a modo de ejemplo: purga de clulas tumorales en caso de TPH autlogo, leucorreduccin, criopreservacin, etc. 4.2. Progenitores obtenidos de la sangre perifrica Obtencin de PH por medio de una afresis, previa movilizacin de los PH a la sangre perifrica con factores estimulantes de las colonias, quimioterapia, o ambos. Los PH obtenidos por afresis de la sangre perifrica han ido substituyendo a la MO paulatinamente sobre todo para los trasplantes autlogos, trasplantes alognicos en adultos y actualmente en nmero creciente en trasplantes peditricos. La movilizacin de progenitores depender, primordialmente, del tipo de paciente y su patologa. Existen varios protocolos para movilizar, uno de los ms recomendados es el factor estimulante de colonias granulocticas (GCSF) en 10 g/kg subcutneo cada 12 horas por tres a cinco das consecutivos dependiendo de la cifra de leucocitos en el hemograma. La leucofresis puede hacerse en una a cinco
sesiones, dependiendo del nmero de clulas planeadas a trasplantar. La preferencia actual de utilizar PH de tipo perifrico en comparacin con los PH provenientes de la MO se basa, fundamentalmente en tres ventajas: (a) su rpida reconstitucin hematolgica, (b) la facilidad de obtencin y (c) la seguridad del procedimiento. Otra ventaja que ha sido atribuida a los PH obtenidos por afresis es que probablemente puedan estar libres de contaminacin tumoral. Sin embargo, est aseveracin es muy controvertida ya que algunos otros autores han encontrado importante contaminacin tumoral en las cosechas celulares posteriores a las afresis. 4.3. Progenitores obtenidos de la sangre de cordn La presencia de PH en la SCU se demostr por primera vez en 1974; diez aos ms tarde se demostr adems que estos PH se diferenciaban de los que se encuentran en la MO por su estado de madurez, siendo los PH de la SCU clulas ms primitivas. La SCU representa la porcin de sangre fetal circulante que permanece en la placenta y en el cordn umbilical posterior al parto. A pesar del pequeo volumen en que estas clulas cir culan, la concentracin sangunea de PH en la SCU es suficiente como para permitir la reconstitucin hematopoytica por medio de un trasplante de PH en los humanos. La mayora de los trasplantes se han realizado en la poblacin peditrica. La tcnica de recoleccin es fcil de realizar. Una vez que el recin nacido nace, el cordn umbilical se pinza precozmente (menos de 35 segundos) a 5 cm de la cicatriz umbilical con dos pinzas y a continuacin se corta el cordn. La sangre se obtiene durante el alumbramiento o inmediatamente posterior al mismo por venopuncin y drenaje por gravedad, recolectndose en una bolsa estril con anticoagulante. Posteriormente la bolsa es enviada al banco de sangre donde se lleva a cabo los contr oles de calidad y la criopr eservacin de los progenitores. Comparado con los PH de la mdula sea, los PH obtenidos de la SCU tienen un potencial importante de diferenciacin al ser stos ms inmaduros, adems, la barrera de disparidad en los antgenos de HLA, importantes para la aceptacin del injerto, puede tener cierto grado de disparidad entre el donante y el husped. Una de las principales desventajas la SCU es el escaso nmero de PH, sobre todo cuando el peso del paciente a trasplantar sobrepasa los
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20 kilos. En la actualidad existen protocolos de investigacin que tratan de expandir estos PH sin que exista diferenciacin celular, con el principal objetivo de utilizarlos para pacientes peditricos de mayor peso o incluso en pacientes adultos. En la actualidad existen pr otocolos experimentales que no solo expanden estos progenitores de SCU, tambin plantean la posibilidad de combinar dos o ms unidades de SCU, esto en pacientes adultos. 5. ETAPAS DEL TPH En la preparacin de un trasplante, se reconocen las siguientes etapas: Planificacin, preparacin, acondicionamiento, trasplante, espera del implante, recuperacin despus del implante (a corto plazo) y recuperacin a largo plazo. A continuacin se describen dichas etapas: 5.1. Planificacin Perodo de gran actividad en el cual se organizan todos los asuntos sociofamiliares para efectos de la estada en la unidad de trasplante. Generalmente hay enfermos que deben viajar largas distancias hasta el lugar del centro de trasplante. En este perodo se realiza el estudio de HLA (tipaje HLA), se estudia los fenotipos HLA del paciente y sus familiares mas cercanos (padres y hermanos) para establecer quien es el mejor donante posible (HLA matching de donante y receptor). Hermanos HLA idnticos son los mejores candidatos para ser elegidos como donantes, pero slo 30-35% de los pacientes en Estados Unidos y Europa tienen donantes potenciales dentro del grupo familiar prximo; en nuestra experiencia peditrica el 40% de los pacientes tiene un donante de este tipo. En los ltimos 10 aos se ha podido establecer que donantes voluntarios de mdula sea tienen combinaciones fenotpicas HLA-idnticas al receptor, aunque no emparentados directamente, tambin son buenos candidatos para ser elegidos como donantes. Los donantes no emparentados se inscriben, voluntariamente, en bancos internacionales de mdula sea y estn dispuestos a donar tejido hematopoytico cuando sea necesario. Esta labor, altamente altruista, es de gran valor para el funcionamiento de los bancos de mdula. El NMDP (Programa Americano de Donantes de Mdula sea, National Marrow Donor Program) se estableci en 1986 y est actualmente unido a ms de 100 instituciones
inter nacionales autorizadas para realizar trasplantes no relacionados de mdula sea y sangre de cordn umbilical (International Bone Marr ow Trasplant Registry, IBMTR). Actualmente se cuenta con cerca de 5.000.000 de donantes de diversas nacionalidades y grupos tnicos. El centro trasplantador al que acude el paciente solicita al NMDP/IBMTR buscar un donante idneo para el enfermo. La bsqueda se inicia en el archivo general; al identificarse un donante potencial se contacta con el centro correspondiente para evaluar mdicamente al donante y efectuar estudios de histocompatibilidad de alta resolucin. Luego se extrae la mdula sea al donante y se enva al centro donde se encuentra el paciente recibiendo el acondicionamiento previo al trasplante. Al da siguiente, se infunde la mdula sea. Cuando la fuente de progenitores es la sangre de cordn umbilical, se reserva la unidad de sangre de cordn umbilical criopreservada en un banco de donantes y se formaliza una fecha para recepcionar la unidad en el centro trasplantador pr evio al inicio del acondicionamiento. Cuando la unidad se encuentra en el centro que realizar el trasplante se inicia la etapa siguiente. Los registros de donantes de gran volumen han proporcionado mdulas compatibles a un nmero creciente de pacientes. Los avances tecnolgicos en inmunohistocompatibilidad han aumentado considerablemente la sensibilidad de los mtodos de estudio en humanos, llegando a requerirse centros dedicados solo a este aspecto del trasplante. En esta etapa de planificacin se incluye adems una evaluacin nutricional y un examen dental completo con tratamiento de las piezas comprometidas con el objetivo de obtener la mejor condicin clnica del paciente al momento de efectuarse el trasplante. Tambin es fundamental contar con el consentimiento infor mado de la familia, discutindose previamente con ellos los procedimientos a efectuar y los posibles efectos colaterales a corto y largo plazo. La duracin aproximada de esta etapa de planificacin es de un mes. 5.2. Preparacin
Este perodo incluye una evaluacin mdica completa y orientacin al paciente y su familia mediante clases tericas y por medio de manuales. En este perodo es tambin
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fundamental la educacin impartida por el personal de enfermera. En el caso del paciente peditrico es muy importante la comunicacin con la familia para hacerles partcipes de los cuidados del nio. Durante la preparacin del trasplante se debe instalar un catter venoso central, preferentemente de doble o triple lumen debido a la gran cantidad de medicacin por va intravenosa que requieren estos pacientes (antibiticos, transfusiones, nutricin). La duracin de esta etapa es de aproximadamente 2-3 semanas. 5.3. Acondicionamiento Tradicionalmente, se ha descrito que esta etapa tiene tres objetivos, a saber: (a) lograr el control de la potencial enfermedad residual con dosis altas de quimio radioterapia, (b) crear espacio para que se alojen los progenitores infundidos y (c) lograr una adecuada inmunosupresin que impida el rechazo de las nuevas clulas infundidas. Este perodo consiste en la administracin de quimioterapia y/o radioterapia en altas dosis, con el objeto de destruir la mayor cantidad posible de clulas tumorales, previamente no destruidas con dosis convencionales en el caso de enfermedades malignas, de crear espacio para el implante del nuevo injerto y tambin de inmunosuprimir al paciente para evitar el rechazo de los progenitores infundidos. La duracin es variable y es generalmente de 6 a 8 das. El rgimen de condicionamiento ideal es el que elimina, en su totalidad, las clulas malignas del husped, tiene baja morbilidad y mortalidad, y permite suficiente inmunosupresin para evitar las alteraciones inmunolgicas que se presentan debido a la inoculacin de clulas inmunolgicamente activas y por lo tanto capaces de montar una respuesta inmune en un donante que tiene un sistema inmune con igual capacidad de rechazo inmunolgico y enfermedad injerto contra husped (GVHD, Graft versus Host Disease). En la actualidad, no existe un solo rgimen de condicionamiento perfecto, ya que las recadas postrasplantes continan ocurriendo y la toxicidad asociada al procedimiento sigue siendo importante a pesar de una larga experiencia de ms de 30 aos. La radioterapia corporal total, sobre todo en un nio en pleno crecimiento y desarrollo, puede producir un gran nmero de complicaciones tardas, como por ejemplo: enfermedad crnica pulmonar, leucoencefalopatas, cataratas, segunda malignidad, hor monopatas y trastornos de la fertilidad. Estas complicaciones, tambin se ven en el adulto trasplantado. En el
futuro, idealmente se podra eliminar la radioterapia corporal total si existieran combinaciones sinrgicas de drogas igualmente efectivas que la combinacin con radioterapia. Actualmente, existen nuevos esquemas de acondicionamiento de baja intensidad para realizar los denominados mini trasplantes. En stos, se usa quimioterapia de menor intensidad seguido de infusin de precursores hematopoyticos y una potente inmunosupresin que permita el implante de las clulas infundidas y el control tumoral. El objetivo es poder realizar trasplantes en pacientes en los cuales los regmenes mieloablativos convencionales causaran una muy alta morbimortalidad peritrasplante. Se aplic preferentemente en adultos, pero en la actualidad se encuentra tambin en uso en pediatra en pacientes de muy alto riesgo (pacientes con alto riesgo de muerte por toxicidad acumulada), constituyendo un rea de gran inters de investigacin clnica. 5.4. Trasplante
La mdula sea, sangre perifrica movilizada o sangre de cordn umbilical se infunde despus de completar el acondicionamiento. Las clulas son administradas por una vena a travs de un catter venoso central. Duracin: desde 20 minutos (PH de SCU o haploidnticos), 1 a 2 horas (PH de SP) y hasta 6 a 8 horas (PH de MO). En el TPH con PH criopreservados es necesaria la descongelacin rpida en un bao termorregulado a 37C. 5.5. Implante El xito de los TPH depende de la posibilidad de colonizar la mdula del receptor con PH del donante. Despus de un trasplante exitoso el receptor se trasforma en quimera inmunolgica al producir clulas hematopoyticas de otro individuo genticamente distinto a pesar de su compatibilidad. El implante demora entre 10 a 28 das despus del trasplante. Para evaluar el proceso se efectan exmenes hematolgicos diarios. La primera seal que el TPH fue exitoso es el aumento del recuento de glbulos blancos, seguido de glbulos rojos y plaquetas. Durante este perodo hay que estar atentos a las complicaciones infecciosas, principalmente por patgenos bacterianos, hongos y virus. La morbilidad y la mortalidad asociada al proceso del TPH han disminuido notablemente en las ltimas dcadas debido al uso de regmenes de acondicionamiento menos
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txicos, cambio en las pautas de inmunosupresin y mejora en los tratamientos de soporte. Sin embargo, el riesgo de mortalidad relacionada al trasplante, que se produce en los primeros 100 das no causada por recada de la enfermedad de base, sigue existiendo, siendo el factor de riesgo ms importante la enfer medad injerto contra husped (GVHD aguda) y en segundo lugar las infecciones. La GVHD se define como la resultante del reconocimiento como extraos de antgenos del receptor por parte de los linfocitos T del donante. Para que ocurra dicha complicacin deben cumplirse las siguientes condiciones: (a) el implante debe contener clulas inmunocompetentes, (b) el receptor debe tener aloantgenos que difieran de los del donante o reconocer autoantgenos en forma inadecuada y (c) el receptor deber ser incapaz de producir respuesta inmune contra el injerto. La GVHD aguda es aquella que se produce durante los primeros 100 das posterior al trasplante, inicindose habitualmente la segunda semana, tiene una incidencia variable de un 5-80% y afecta clsicamente 3 rganos diana (blanco): piel, hgado e intestino. Se reconocen variados factores de riesgo de infecciones en el TPH destacando: la enfermedad de base, el tipo de trasplante, el acondicionamiento utilizado, la duracin de la neutropenia, la ruptura de barrera muco cutnea, la GVHD y su tratamiento como tambin el grado de inmunodeficiencia en los distintos perodos del trasplante. Existen adems numerosos cambios ocurridos en el tiempo que inciden en el desarrollo de los distintos cuadros infecciosos, stos son: nuevos agentes oportunistas emergentes, cambios en la susceptibilidad a los agentes infecciosos, nuevos regmenes de acondicionamiento, donantes alternativos y distintos grados de inmunodeficiencia. Actualmente no es posible describir las infecciones asociadas al TPH sin tomar en cuenta el compromiso inmune del husped. Es por esto que se reconocen diferentes fases en los receptores de TPH, las que se asocian a infecciones por diferentes patgenos oportunistas. Estas fases son tres: Pre implante (0 30 das), Post implante (30 100 das) y Post trasplante tarda (> 100 das). Fase 1. El defecto del husped en este perodo es fundamentalmente la neutropenia asociada
a catter venoso central (CVC) y ruptura de barreras. Se ha descrito en las distintas series desde un 80 a 100% de fiebre asociada a neutropenia en pacientes peditricos sometidos a TPH alognico y autlogo. La explicacin de este hecho est dada en gran parte por los regmenes de acondicionamiento mieloablativos utilizados, la aplasia medular severa secundaria, y la disrupcin de barreras naturales. En los pacientes que desarrollan neutropenia y fiebre se ha observado que un 30 a 50% presenta fiebre de origen desconocido, un 25 a 50% bacteremia sin foco y un 15 a 20% infecciones localizadas asociadas o no a infecciones del CVC. Los agentes bacterianos identificados con mayor frecuencia como causantes de infecciones severas en estos pacientes son en un 70% Gram (+) y en un 25% Gram (-). Segn investigaciones publicadas existira un mayor porcentaje de bacteremia con mayor mortalidad en el TPH alognico respecto del autlogo que se relacionara con un mayor tiempo de neutr openia, uso de acondicionamiento ms mieloablativo e inmunosupresor y la existencia de diferencias inmunolgicas de histocompatibilidad entre donante y receptor. Fase 2. En esta fase de post-implante la alteracin inmune del husped es el resultado de la nueva ontogenia, GVHD y tratamiento inmunosupresor derivado de su tratamiento y tipo de trasplante. En este periodo aumenta la prevalencia de infecciones fngicas por Candida spp, Aspergillus spp y P carinii como tambin virus, especialmente citomegalovirus (CMV), por lo que es fundamental realizar una vigilancia activa con deteccin precoz de infeccin a travs de reaccin de polimerasa en cadena o antigenemia para CMV. Fase 3. En la ltima fase el husped puede presentar inmunodeficiencia 2 a GVHD crnico con supresin celular especfica, disminucin de funcin retculo-endotelial y dficit de subclases IgG, todo lo cual lo hace susceptible a presentar infecciones por patgenos bacterianos capsulados, Candida spp y Virus Varicela Zoster. Es importante destacar que en el TPH los cuadros de diagnstico diferencial de lesiones cutneas, neumonitis post-TPH, hepatitis, cistitis hemorrgica y otros incluyen habitualmente variados patgenos microbianos, causas inmunolgicas como tambin derivadas de la quimioterapia y/o radioterapia. Frente al TPH se deben aplicar medidas pasivas
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(aislamiento del paciente, lavado de manos, filtro HEPA presin positiva, uso de mascarilla y uso de flujo laminar en algunos centros), aceptndose internacionalmente que lo ms importante es el lavado de manos y el uso de presin positiva. Asimismo, las medidas activas que se puede adoptar incluyen: descontaminacin intestinal, profilaxis antibitica, profilaxis antifngica y profilaxis antiviral. 5.6. Recuperacin a corto plazo Durante este perodo se espera el desarrollo y maduracin del sistema inmunitario y se debe tratar cualquier complicacin que pueda surgir. Por otra parte, es el momento en el cual aparece la GVHD crnica pudiendo requerirse de medicacin especfica para su tratamiento. La duracin de este perodo es de unos 365 das. 5.7. Recuperacin a largo plazo Es importante evaluar en este perodo las complicaciones tardas, las que incluyen: GVHD crnica, trastornos de crecimiento y desarrollo, cardiopatas secundarias a quimioterapia, bronquiolitis obliterante, alteraciones de la fecundidad, etc. Este perodo se inicia a contar de los 100 das. La reconstitucin de la hematopoyesis y de la inmunidad innata se objetiva mediante el implante perifrico, lo cual ocurre habitualmente dentro del primer mes postrasplante. Sin embargo, la reconstitucin del sistema inmune especfico celular y humoral es ms prolongado, difcil de evaluar y dependiente de numerosas variables como tipo de trasplante, presencia de GVHD y tratamiento inmunosupresor. Este proceso de inmunorreconstitucin dura como mnimo 12 meses, logrndose en la mayora de los casos a los 24 meses. Durante los primeros 6 meses del TPH se observa habitualmente un nmero disminuido de clulas CD4+, con clulas NK y clulas CD8+ normales o aumentadas y deficiente respuesta pr oliferativa. Estas alteraciones son ms frecuentes en el TPH alognico que en el autlogo y evidentemente ms prolongadas si el TPH fue depletado de clulas T. Las clulas CD20+ suelen estar disminuidas durante 2 a 6 meses despus del TPH. Las inmunoglobulinas empiezan a aumentar 3-4 semanas despus del TPH, siendo la IgE la primera en ascender. La produccin de IgG e IgA es habitualmente deficitaria hasta 6 a 18 meses despus del TPH si el paciente ha sido
sometido a un TPH con deplecin de linfocitos T o si presenta GVHD crnica. El paciente trasplantado debe llegar, a largo plazo, llevar una vida normal, idealmente inmunorreconstituido y de un punto de vista infeccioso, vacunado contra los patgenos habituales. 6. INDICACIONES DEL TPH Actualmente se efecta un gran nmero de trasplantes en el mundo, considerndose muy importante para el resultado final realizar el trasplante de manera precoz (en el caso de un paciente con leucemia, aquel con buen estado clnico general y baja masa tumoral), lo que en trminos oncolgicos se denomina remisin completa (RC). El trasplante es considerado como terapia de eleccin en algunos tipos especficos de leucemia (leucemia mieloide crnica) o insuficiencias medulares (anemias aplsticas severas y Anemia de Fanconi, etc.). Consiste tambin en el nico tratamiento curativo en inmunodeficiencias combinadas severas y otras inmunodeficiencias primarias como sndrome de Wiskott Aldrich y Chediak Higashi. En otras patologas, como anemia de clulas falciforme o talasemias, el rol es de carcter curativo slo en las formas ms severas. En las tablas 16-1 y 16-2 se resumen en forma muy general, las indicaciones de TPH en este momento, para ambos pacientes portadores de enfer medades congnitas y adquiridas, respectivamente. En adultos y nios la principal indicacin de TPH es la patologa oncolgica. Los criterios generales para indicar un trasplante en ambos grupos de pacientes son: (a) bajas tasas de curacin con quimioterapia (QT) no mieloablativa, (b) la mortalidad esperada con el trasplante no debe ser mayor que la con QT o probabilidad de recada y (c) los trasplantes de hermanos compatibles son la mejor opcin. No obstante, es importante recalcar que las indicaciones en nios son mucho mayores que en los adultos, as como tambin la sobrevida esperada en los distintos tipos de TPH. En nios, el 80% de las indicaciones de TPH son enfermedades oncolgicas de muy alto riesgo y est recomendado realizarlo en los siguientes casos: TPH alognico en Leucemia linfoblstica aguda (LLA) en RC1 en pacientes de muy alto riesgo con: t (9;22), BCR/ABL al
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Tabla 16-1. Indicaciones generales de trasplante en enfermedades congnitas Alognico Inmunodeficiencia congnita combinada Aplasia medular de Fanconi Talasemia mayor Drepanocitosis Eritroblastopenia de Blackfan-Diamond Neutropenia de Kostmann Sndrome de Wiskott-Aldrich Osteopetrosis juvenil Tesaurismosis Enfermedad granulomatosa crnica Autlogo Ninguna
Tabla 16-2. Indicaciones generales de trasplante en enfermedades adquiridas Alognico Neoplsicas Leucemias agudas Leucemia mieloide crnica Leucemia linftica crnica Linfomas no-hodgkinianos 2 Enfermedad de Hodgkin 2 Mieloma mltiple Histiocitosis 2 Amiloidosis 2 Sndromes mielodisplsicos No Neoplsicas Aplasia medular severa Hemoglobinuria paroxstica nocturna
1 2
Autlogo Leucemias agudas Leucemia mieloide crnica 2 Leucemia linftica crnica 2 Linfomas no-hodgkinianos Enfermedad de Hodgkin Mieloma mltiple Histiocitosis 2 Amiloidosis 2 Sndromes mielodisplsicos 2 Tumores slidos 1 Enfermedades autoinmunes 2
Goldman et al, BMT 1988 Preferentemente dentro de protocolos de investigacin clnica.
diagnstico, falla a la induccin, mala respuesta a prednisona ms t (4;11) o reordenamiento MLL en < de 1 ao o inmunofenotipo T o proB o MO (M3) al da 15 o recuento de leucocito >100.000/L o enfermedad mnima residual > 1/103 preconsolidacin; en RC2 recada medular precoz o muy precoz, r ecada con inmunofenotipo T y controversial en RC3. TPH alognico de donante familiar como primera opcin teraputica en Leucemia mieloblstica aguda (LMA) de alto riesgo en RC1, el trasplante autlogo es una opcin teraputica en pacientes con LMA en RC2, donde la purga no est demostrada como necesaria.
TPH alognico de donante familiar idntico como primera opcin teraputica en Leucemia mieloide crnica (LMC) en fase crnica.
En adultos, las principales indicaciones de TPH autlogo son Mieloma mltiple y recada de Linfomas de mediano y alto grado. En todas las dems patologas el TPH autlogo es parte de protocolos de intensificacin o rescate, pero los resultados son controversiales y la indicacin es una decisin local. El TPH alogenico tiene como indicacin principal las leucemias agudas en especial la (LLA) del adulto cuyos resultados con quimioterapia convencional son muy pobres. Muchos centr os estn dejando actualmente, de lado el TPH alognico como
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terapia de rescate en la mayor parte de las patologas salvo que el paciente sea menor de 30 aos y tenga un donante full match relacionado. En los pacientes mayores de 50 aos, en especial con diagnstico de leucemia mieloide crnica y en menor grado leucemias agudas, el enfoque actual es, en forma creciente, el TPH no mieloablativo (mini-alotrasplante). Estos estudios se encuentran en fase II o III. Los avances en quimioterapia y terapias biolgicas como anticuerpos monoclonales e inhibidores especficos como el STI 571 (Glivec ), cido Transretinoico y Trixido de Arsnico estn siendo preferidos por los hematlogos de adultos respecto del TPH en espera de los resultados que estas nuevas terapias pueden brindar. El TPH es el tratamiento de eleccin de algunas patologas oncolgicas de alto riesgo y definitivo de una serie de patologas no malignas, tanto en nios como adultos. En general, hay consenso internacional que deben cumplirse ciertos requisitos mnimos para el adecuado funcionamiento de una unidad de trasplante. Como gua existen las recomendaciones de la Escuela Europea de Hematologa (EEH) y del Comit Europeo de Trasplante de Mdula sea. Estas recomendaciones son las siguientes: el trasplante debe efectuarse en unidades que cuenten con personal mdico y de enfermera debidamente entrenado para resolver los problemas que se puedan presentar. Segn recomendaciones de la EEH, es exigible un mnimo de 20 trasplantes anuales para acreditar un centro de trasplante tanto peditrico como de adultos. Crear un buen programa de trasplantes de mdula sea exige un trabajo en equipo y su adecuado desarrollo supone un enorme desafo para cualquier sistema de salud, ya sea pblico o privado. LECTURAS SUGERIDAS A European reference protocol for quality assessment and clinical validation of autologous haematopoietic blood progenitor and stem cell grafts. Serke S, Johnsen HE. Bone Marrow Transplant. 27(5):463-70, 2001.
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HEMATOLOGA
Captulo
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TRASPLANTE DE CLULAS TRONCALES DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL DE DONANTES NO RELACIONADOS: TECNOLOGA Y RESULTADOS CLNICOS
Pablo Rubinstein
1. Introduccin 2. Ventajas hipotticas del trasplante de sangre de cordn de donantes no relacionados con el receptor 3. Mtodos 3.1. Recoleccin de sangre de cordn 3.2. Consentimiento informado de la madre 3.3. Identificacin de unidades y especmenes 3.4. Reduccin de volumen 3.5. Exmenes 3.6. Congelamiento y descongelamiento de la sangre de cordn 4. Estudios clnicos 4.1. Datos sobre los pacientes y seleccin de trasplantes 4.2. Anlisis estadsticos 4.3. Prendimiento de los trasplantes de sangre de cordn 4.4. Histocompatibilidad 4.5. Enfermedad Trasplante contra Husped 4.6. Eventos Relacionados al Trasplante 4.7. Recidiva leucmica 4.8. Sobrevida sin eventos negativos 4.9. Avances recientes para mejorar el pronstico, especialmente en adultos 5. Conclusiones
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RESUMEN
El descubrimiento de la presencia de clulas troncales hematopoyticas, en la sangre de cordn umbilical, abri la posibilidad de obtener tejido para el reemplazo de la mdula, a partir de un componente tradicionalmente desechado. La creacin de bancos que almacenan sangre de cordn para su uso en enfermos no relacionados ha iniciado una revolucin en las posibilidades del tratamiento de pacientes que, anteriormente, no tenan ninguna posibilidad de obtener un donante histocompatible. Debido a sus propiedades biolgicas, las clulas inmunes de la sangre de neonatos son menos capaces de inducir reacciones de injerto contra husped y esta fuente es, por tanto, menos problemtica como trasplante alognico. En este captulo se revisan los aspectos ms salientes de la donacin y adquisicin de sangre de cordn para trasplantes, las tcnicas para su procesamiento y congelacin, las precauciones necesarias para su envo desde los Bancos hacia los Centros de Trasplante y, finalmente, se analizan los datos clnicos ms recientes, usando la informacin del National Cord Blood Program de Nueva York. Los resultados indican que esta fuente de clulas troncales puede servir a pacientes de diversas edades, no slo nios pequeos, y que puede alcanzar sobrevidas comparables a la mdula sea y a la de las clulas movilizadas con factores de crecimiento.
1. INTRODUCCIN La sangre fetal/neonatal atrapada en la circulacin placentaria y en el segmento inicial de la vena umbilical despus del ligamiento del cordn (denominada Sangre de Cordn o SDC) fue utilizada con xito como substituto de la sangre donada por voluntarios para la transfusin clnica desde antes de la Segunda Guerra Mundial. La utilidad de la SDC se extendi bastante: en los EEUU todava se administraba como Placental/Umbilical Cord Blood en las transfusiones de sangre en algunos Hospitales en New York y en otras ciudades durante la dcada de los sesenta y todava se practica en otras partes del mundo (Halbrecht, 1939). La transfusin de un paciente de 16 aos con leucemia aguda con sangre de cordn de 8 donantes no relacionados, en 1970, fue seguida de prendimiento (engraftment) temporal de clulas progenitoras de, por lo menos, la serie eritroide (Ende, M. y Ende, N., 1972). En esa publicacin, ellos atribuyeron el prendimiento observado a la presencia de clulas troncales hematopoyticas (CTH) en la sangre de cordn utilizada en la transfusin. En comparacin con el tejido hematopoytico de donantes adultos, los autores expresaron que se cree que el tejido hematopoytico fetal es ms tolerante hacia el husped que los trasplantes obtenidos de la medula sea de adultos. A pesar de que este estudio fue ignorado por muchos aos, la sangre de cordn contiene efectivamente abundante cantidad de
CTH y clulas progenitoras, que se demuestran por el desarr ollo de colonias celulares hematopoyticas en cultivos con factores de crecimiento, (Knudtzon, 1974). Knudtzon indic en la discusin de sus observaciones, que siendo la concentracin de estas clulas tan alta en la sangre de cordn como en la mdula sea, la sangre de cordn podra ser usada como fuente de CTH para la recuperacin de la funcin medular en seres humanos cuya mdula ha sido destruida. La caracterizacin y cuantificacin de CTH mejor notablemente durante la dcada de los ochenta. En 1982 Nakahata y Ogawa demostraron que las colonias de tipo GEMM (en que, a partir de una sola clula, granulocitos, eritrocitos, macrfagos y megacariocitos) contienen clulas generadoras de colonias no diferenciadas y que al ser traspasadas a otras placas de cultivo producen colonias GEMM. An ms, Koike y colaboradores observaron que las clulas productoras de estas colonias podan ser congeladas en nitrgeno lquido y descongeladas tiempo despus sin perder su capacidad de multiplicarse y formar colonias en cultivo, y sugirieron que estas clulas podran ser almacenadas para ser usadas en trasplantes, especialmente en casos de enfermedades genticas. Besalduch, en su tesis doctoral de la Universidad de Valencia, hizo la misma sugerencia y tambin postul que la tolerancia inmunolgica caracterstica de los neonatos podra ser suficiente para permitir hacer estos trasplantes, a pesar de incompatibilidades en el sistema HLA. Ms adelante, Boyse,
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Broxmeyer y Douglas propusieron que la cantidad de CTH en recolecciones de sangre de cordn, congeladas adecuadamente, podran ser suficientes para conseguir la restauracin de la mdula destruida y participaron en un trasplante exitoso de sangre de cordn a un nio con anemia de Fanconi. Una veintena de trasplantes de sangre de cordn de hermanos, tanto HLA-idnticos como parcialmente incompatibles fueron efectuados entre 1989 y 1993 (Revisin por Wagner, J. y colaboradores, 1995). Los primeros dos trasplantes de sangre de cordn de donantes no relacionados (1993), fueron recolectados, preparados y congelados por el primer Banco de Sangre Placentaria (hoy llamado Programa Nacional de Sangre de cordn), establecido en el New York Blood Center. Hasta febrero de 2005, este Programa ha proporcionado trasplantes hematopoyticos a ms de 1700 pacientes en Amrica, Europa, Asia y Australia-Nueva Zelandia. Numerosos bancos de SDC para uso pblico se han establecido posteriormente en Europa, EEUU, el lejano Oriente, Australia y otros pases. Algunos de estos bancos han organizado el NETCORD, una red de bancos de sangre de cordn muy preocupada por los aspectos de calidad tcnica, que propuso el establecimiento de Estndares Internacionales, hoy integrados en el NETCOD-FACT Standard for Accreditation, recomendado por la mayora de las organizaciones de trasplante de clulas troncales hematopoyticas. En este captulo, examinaremos aspectos de la tecnologa actual del Banco de Sangre de cordn y haremos una sntesis breve de los resultados obtenidos hasta ahora con los trasplantes de sangre de cordn a receptores no relacionados. 2. VENTAJAS HIPOTTICAS DEL TRASPLANTE DE CTH CON SANGRE DE CORDN DE DONANTES NO RELACIONADOS CON EL RECEPTOR Desde la partida, se esperaban ventajas importantes de los trasplantes de sangre de cordn con respecto a los de mdula sea donada tambin por individuos no relacionados. La base de esa expectativa era la relativa inmadurez del sistema inmunolgico y su consecuencia, bien conocida, la posibilidad de inducir tolerancia inmunolgica frente a aloantgenos codificados por el sistema mayor de histocompatibilidad HLA (Human Leucocyte Antigen). Se esperaba que esta inmadurez resultara en una mayor facilidad para
controlar la incidencia de la enfermedad de injerto contra husped (Graft-versus-Host Disease, GvHD) y su severidad clnica cuando existen incompatibilidades (mismatches), es decir, distintos determinantes antignicos heredados como alelos del sistema HLA. De esta manera, se podra efectuar trasplantes parcialmente histoincompatibles en pacientes cuyos antgenos HLA son poco frecuentes, por lo que no se encuentran donantes completamente HLA-compatibles (matched). Por razones obvias, este es un problema mayor para los enfer mos de grupos tnicos minoritarios. Aunque los mecanismos celulares de la GvHD y su relacin con los que median el efecto GvL (Graft vs Leucemia) son todava slo parcialmente conocidos; existe una clara asociacin estadstica entre GvHD y GvL. Esta asociacin sugiri que el efecto GvL pudiera ser menos efectivo cuando se usa sangre de cordn y que la reduccin de GvL pudiera causar un aumento de la frecuencia de las recidivas. Como se ver ms adelante, esta contingencia no se ha materializado. La posibilidad de efectuar trasplantes de clulas troncales, clnicamente tiles aunque histo-incompatibles, es particularmente importante para personas de grupos tnicos minoritarios, para los que existen menos donantes voluntarios. Tambin se anticip correctamente que, por hallarse las unidades de sangre de cordn congeladas y listas para el trasplante, se podra ahorrar tiempo en el proceso de bsqueda y despus de hallado el trasplante, proceder con preparacin del paciente con la certidumbre de contar con el injerto, en lugar de slo tener la esperanza de que un voluntario inscrito en el Registro de donantes llegue a la donacin en la prctica (Van Rood JJ, Oudshorn, M. 1988). La larga vida media, hasta ahora no determinada, pero ciertamente mayor de diez aos, hacen a la sangre de cordn muy atractiva en casos de leucemia aguda en que la velocidad con que se trasplanta es fundamental para el xito del trasplante. La obvia utilidad de esta fuente de clulas troncales ha motivado amplio inters y se han creado numerosos Bancos de sangre de cordn alrededor del mundo, en Norteamrica as como Europa, Extremo y Mediano Oriente, Australia, y se ha comenzado a estudiar su implementacin en Sudamrica. Adems, se han organizado muchos Bancos de sangre de cordn privados, para familias, con fines de lucro. Estos bancos no consideran los problemas potenciales de los trasplantes
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autlogos en leucemias infantiles, motivando seria inquietud por parte de organismos profesionales y de las agencias regulatorias de salud pblica y de organismos preocupados por factores ticos (American Academy of Pediatrics, 1999). Varias publicaciones se refieren a la organizacin y las tcnicas utilizadas en nuestro Programa y a los resultados clnicos de los trasplantes que demuestran la utilidad de esta fuente de clulas troncales. 3. MTODOS 3.1. Recoleccin de sangre de cordn Hay dos mtodos en uso para efectuar la recoleccin usando la vena umbilical del segmento del cordn proximal a la placenta; el ms antiguo, durante la tercera fase del parto (con la placenta todava en el tero) y el otro, dentro de los 15 minutos siguientes a la expulsin placentaria. El primer mtodo, que hemos utilizado desde el ao 1993, requiere un soporte para suspender la placenta con la cara fetal hacia abajo y el cordn suspendido. La sangre de los vasos placentarios baja a la vena umbilical del cordn y la distiende, permitiendo su extraccin por puncin y almacenamiento en una bolsa plstica para Transfusin con anticoagulante CPD-A. Este mtodo est completamente libre de riesgos para el donante y su madre, ya que no afecta el manejo del parto en manera alguna, en tanto que el segundo mtodo exige una pequea desviacin durante la tercera fase. Este ltimo, a diferencia del anterior, requiere por lo tanto, el consentimiento informado materno previo a la extraccin. 3.2. Consentimiento informado de la madre Existe acuerdo en cuanto al momento en que debe obtenerse, dependiendo de la tcnica utilizada. Como en otros tipos de consentimiento, la madre debe ser informada de su derecho de rehusar su participacin y no donar para trasplante, o de restringir su donacin, por ejemplo, al uso de la sangre para investigacin y no para trasplante clnico. La madre deber dar su consentimiento para varias cosas, permitiendo especficamente: El uso de la sangre de cordn para trasplante. Ser entrevistada para pr oporcionar infor macin sobre la etnicidad y antecedentes patolgicos de la familia, y
posibles antecedentes de enfermedades infecciosas o genticas. La revisin de las historias clnicas, suya y del recin nacido, para buscar informacin sobre posibles riesgos de enfermedades transmisibles. La obtencin de dos muestras de sangre materna (volumen total <15ml) para la determinacin del tipo HLA, pesquisa de enfermedades infecciosas, para referencia futura, etc. La obtencin de una pequea muestra de saliva del recin nacido para cultivo de CMV. Que el Programa comunique los resultados de las pruebas a efectuarse sobre las sangres del infante y de la madre al mdico designado por la madre.
3.3. Identificacin de unidades y especmenes Para evitar la posibilidad de confusiones y errores, todas las muestras y documentos pertenecientes o referentes al donante y a su madre deben llevar la misma identificacin, un nmero ID nico con sufijo P (placentaria) o M (materna). El nmero es correlativo para las muestras obtenidas en el mismo Hospital y se asigna en cdigo de barras y en caracteres legibles visualmente. Es de importancia fundamental que los reportes y, en general, toda la comunicacin respecto a un donante, se haga con referencia a este nmero ID y que toda transferencia al computador o a la impresora se efecte leyendo el cdigo de barras con un instrumento adecuado (escner o, como mnimo, un light-pen.) 3.4. Reduccin de volumen Con el aumento del nmero de las unidades mantenidas en el Banco, el espacio destinado al inventario (nmero y capacidad de los tanques de nitrgeno lquido) constituye un factor limitante. Esta limitacin hace necesario el desarrollo y validacin de una tcnica para reducir el volumen de las unidades de sangre de cordn, para aumentar la capacidad de los espacios que mantienen temperaturas criognicas. Varios mtodos han sido explorados y considerados como tiles. El primero y ms usado en la actualidad se basa en la facilitacin de la sedimentacin de los eritrocitos en la sangre de cordn, permitiendo la eliminacin de ms o menos la mitad del volumen de la unidad. El mtodo consigue la reduccin del potencial- (zeta) usando almidn hidroxi-etlico (Rubinstein y colaboradores,
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1995) permitiendo la separacin de los glbulos rojos con una centrifugacin liviana (50 x G por 6 minutos). El plasma sobrenadante incluye ms del 90% de las clulas nucleadas (principalmente leucocitos). La concentracin de estas clulas se hace por centrifugacin (400 x G por 15 minutos), permitiendo obtener unidades de volumen constante (20 ml), a las que agregamos 5 ml de solucin de criopreservacin (di-metil sulfoxido al 50%). La recuperacin de clulas nucleadas en promedio, es de 92% y el de clulas progenitoras (formadoras de colonias hematopoyticas o CD34+) es casi del 100%. El uso de unidades de volumen constante facilita substancialmente el congelamiento gradual y su automatizacin. Dos procedimientos para automatizar el procesamiento han sido ofrecidos comercialmente: el sistema BioSafe (Sepax) y el BioArchive (Ther mogenesis) que automatizan el pr ocesamiento y el congelamiento, respectivamente. Otros sistemas de procesamiento automatizado han sido anunciados por empresas, que los pondrn en el mercado prximamente. 3.5. Exmenes En nuestro Banco, tratamos de minimizar la cantidad de sangre usada en exmenes de laboratorio. Como la sangre de cordn normalmente posee un recuento de glbulos blancos de 10-15 x 106 /ml, y la dosis de clulas adecuada para el trasplante es de 2,5 x 107 por Kg de peso del receptor eventual, cada ml de sangre provee clulas suficientes para Kg y no debe perderse innecesariamente por exceso de volumen de muestra en estas pruebas. Es necesario convencer a los laboratorios encargados de requerir la menor cantidad de sangre posible. La masa eritrocitaria sedimentada puede ser usada para investigar fenotipos de hemoglobinas anormales y tambin para extraer DNA genmico de los leucocitos (principalmente granulocitos) y clulas eritroides inmaduras, til en la tipificacin de HLA. El plasma separado permite ahorrar sangre en los estudios bacteriolgicos y de marcadores de enfermedades infecciosas, incluyendo HIV, HTLV, HBV, HCV, sfilis y recientemente, en los EEUU, el West Nile virus. Recuentos celulares en la sangre y en la suspensin celular final deben hacerse para asegurar la calidad del procesamiento as como la cantidad de clulas presentes en el trasplante. Es interesante que la presencia de eritrocitos nucleados en el
recuento no falsea los resultados: estos recuentos no estiman directamente el nmero de clulas troncales, sino solamente de clulas ya diferenciadas que anticipan la velocidad del proceso de prendimiento del trasplante. Los recuentos de estas ltimas son slo sustitutos, y los eritrocitos nucleados predicen muy bien la velocidad del prendimiento despus del trasplante (Stevens CE y colaboradores, 2002). La tipificacin ABO y Rh es tambin necesaria y contribuye a una mejor caracterizacin del producto. 3.6. Congelamiento y descongelamiento de la sangre de cordn Como ya se ha dicho, es importante reducir el volumen de la sangre a congelar por varias razones, incluyendo el ahorro de espacio y la automatizacin del proceso de congelacin. Otra ventaja es la menor cantidad de solucin crioprotectora de di-metil sulfoxido (DMSO) que podra ser infundida al paciente (el DMSO es un frmaco de cierto peligro, ya que produce bradicardia, a veces marcada y, raramente, letal). El DMSO se introduce a la suspensin celular final lentamente, con agitacin orbital y manteniendo la temperatura por debajo de 10C. La recuperacin de clulas viables depende tambin del mtodo de descongelacin. Se r ecomienda la descongelacin rpida sumergiendo la unidad (previamente mantenida a -196C) en un recipiente con agua tibia a 37C con agitacin constante. Inmediatamente de la vuelta al estado lquido, se diluye la suspensin celular en un volumen igual (25 ml) de salino fisiolgico estril conteniendo, en lo posible, 1% de dextrano 40 y 1% de albmina humana. La viabilidad de la suspensin as diluida es estable por lo menos por una hora. Si adems se extrae el sobrenadante despus de centrifugar y se reemplaza por 50 ml de diluyente, la viabilidad se mantiene por varias horas y la infusin retiene mucho menos DMSO. 4. ESTUDIOS CLNICOS En el curso de los 12 aos de este Programa, ms de 1700 enfermos han recibido trasplantes de sangre de cordn umbilical preparados por el New York Blood Center. Los primeros 562 enfermos as transplantados fueron reportados en 1998. A continuacin describiremos, br evemente, los hallazgos clnicos ms importantes, incluyendo los resultados de trasplantes posteriores a 1998.
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4.1. Datos sobre los pacientes y seleccin de trasplantes Las caractersticas clnicas y demogrficas de
enfermos transplantados se resumen en la tabla 17-1.
Tabla 17-1. Caractersticas clnicas y demogrficas de 1300 participantes (excluyendo los que previamente recibieron otros trasplantes y los receptores de trasplantes mltiples) Caracterstica Sexo Masculino Femenino 741 (57%) 559 (43%) Nmero (%)
Edad (aos) 0-1 286 (22%) 2-5 287 (22%) 6-11 303 (23%) 12-17 166 (13%) > 18 258 (20%) (mediana = 7.2 aos, promedio = 11.9 aos) Grupo tnico (Desconocido = 15) Asitico 49 (4%) Africano 210 (16%) Hispnico 261 (20%) Aborigen americano 9 (1%) Caucsico europeo 717 (56%) Oriente Medio 37 (3%) Otro 2 (0.2%) Centro de Trasplante (nacionalidad) EE.UU 1,005 (77%) No-EE.UU. 295 (23%) Diagnstico Leucemia 829 (64%) LLA 393 (30%) LMA 291 (22%) LMC 113 (9%) Otra 32 (2%) Mielodisplasia 59 (5%) Linfoma 27 (2%) Enfermedad gentica 329 (25%) Anemia Aplstica Severa 39 (3%) Otros 16 (1%) Grado de Avance de la leucemia (LLA, LMA, LMC) (grado no diagnosticado = 16) Temprano 198 (25%) Intermedio 330 (42%) Avanzado 253 (32%) Para encontrar unidades de sangre de cordn, los centros de trasplantes hematopoyticos envan una solicitud (Search Request). Esta solicitud incluye informacin sobre el enfermo, su edad, peso, diagnstico y grado del desarrollo de la enfermedad, y los grupos sanguneos (ABO/Rh) y tisulares (HLA). En lo posible, tambin incluyen los fenotipos HLA de
los padres y hermanos. Estos datos se usan para interrogar la base de datos en busca de unidades compatibles con el receptor. La determinacin de compatibilidad (matching) para cada uno de los alelos de los loci HLA se establece dividiendo el nmero de especificidades HLA compartidas por el dador
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y el paciente por el nmero total de especificidades consideradas, generalmente 6, dos por cada uno de los tres loci utilizados en esta determinacin. La tipificacin de HLA ha progresado notablemente en los ltimos diez aos, habindose descubierto un polimorfismo mucho mayor que el conocido anteriormente y que se resuelve a nivel de la secuencia de los genes respectivos. Las tcnicas, llamadas de alta resolucin (designado como nivel allico [allele level]). permiten precisar la secuencia de los nucletidos en las regiones codificantes de estos polimorfismos. En el caso de la sangre de cordn se ha hecho general la determinacin de los alelos de los genes HLA-A, -B y DRB1; HLA-A y -B con resolucin serolgica y DRB1 con alta resolucin. Un efecto negativo de los trasplantes con incompatibilidades de HLA-A, B y -DRB1 slo discernibles con alta resolucin ha sido demostrado en trasplantes de mdula de donantes adultos, incluyendo muy recientemente a HLA-C. En el caso de la sangre de cordn, la evidencia del efecto deletreo de incompatibilidades discernibles solamente con alta resolucin se restringe a HLA-DRB1. Recientemente, hemos podido confirmar que si un donante de sangre de cordn es homocigoto para uno de los tres loci HLA, y el receptor es heterocigoto para el mismo alelo, en ausencia de otras incompatibilidades, el trasplante tiene el mismo pronstico que si fuera un match perfecto. La homocigocidad en los donantes aumenta significativamente la oportunidad de encontrar donantes ptimos de sangre de cordn. Los tipos HLA de donante y receptor se confirman en ambos, el Banco de sangre de cordn y el Centro de Transplantes, incluyendo la alta resolucin de HLA-DRB1, para disminuir la probabilidad de errores. Las dos variables ms importantes para la seleccin de unidades, histocompatibilidad y dosis de clulas nucleadas, son estadsticamente independientes. Es posible, por lo tanto, escoger el trasplante de acuerdo a diferentes esquemas de valores relativos para estas dos variables, por s, o en combinacin con otras. Peridicamente (a los tres, seis y doce meses, y luego anualmente) los Centros de Trasplante envan informacin a nuestro Banco, sobre la marcha clnica de los pacientes. Estos datos permiten constatar el efecto clnico a corto y largo plazos y constituyen el Control de Calidad definitivo para el Banco de Sangre de cordn. 4.2. Anlisis estadsticos En la presentacin de los resultados aqu
incluidos, hemos utilizado las tcnicas habituales en los estudios sobre los resultados de trasplantes de mdula, para calcular la significacin estadstica de las diferencias entre grupos. La probabilidad de engraftment del trasplante, as como la incidencia de eventos de riesgo relacionados con el trasplante, las recidivas y la sobrevida, son tradicionalmente estudiados con el mtodo de Kaplan-Meyer, que per mite analizar muestras cuyos participantes tienen seguimientos variables e incompletos. En esta tcnica, el denominador (nmero total de participantes) disminuye cuando se materializa un riesgo que impide al paciente obtener subsecuentemente el prendimiento. Los pacientes que caen en esta categora son censurados (censored) y el denominador se ajusta, disminuyendo con cada caso censurado. Recientemente se ha hecho popular el uso de la estadstica llamada cumulative engraftment with competing risks en que el denominador se mantiene constante y el riesgo de obtener el prendimiento del trasplante se computa separadamente del riesgo de otros puntos finales (endpoints): falla del trasplante, recidiva de la enfermedad, muerte del paciente por cualquier causa, etc. La influencia de distintos factores sobre estos aspectos del trasplante se evala con anlisis univariados usando las estadsticas del logrank y de Wilcoxon generalizado. Este ltimo, tambin llamado test de Breslow, aplica una correccin a las comparaciones de acuerdo con el nmero de pacientes que permanecieron activos en cada momento de su seguimiento (este nmer o es mximo en el perodo inmediato al trasplante). La comparacin de datos asignados a categoras predefinidas (ejemplo: infantes vs. nios vs. adultos) se hace con tablas de co-tabulacin, usando las tcnicas 2 llamadas Fishers exact test, el de Pearson o el test de Mantel-Haenzel (linear-by-linear). Para los anlisis multivariados de distribuciones como en el prendimiento del trasplante y la sobrevida, se usa la regresin logstica de Cox, comprobando que los riesgos de las categoras sean pr opor cionales o introduciendo corr ecciones apr opiadas para lograr la proporcionalidad. 4.3. Prendimiento de los trasplantes de sangre de cordn Se ha definido el momento del prendimiento como la recuperacin de un recuento absoluto de 500 neutrfilos/l, mantenido por lo menos durante tres das consecutivos (se considera
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alcanzado en el primer da). En general se considera como lmite mximo del tiempo al da 42 (trasplante = da 0) y as lo hemos hecho en algunos anlisis, pero en los anlisis
multivariados se incluyen tambin los trasplantes que prenden despus del da 42 (tabla 17-2).
Tabla 17-2. Anlisis multivariado del prendimiento del trasplante al da +77. Variables Dosis de clulas nucleadas/Kg Histocompatibilidad (Nivel de Match) 6/6 5/6 4/6 3/6 Centro de trasplante no en USA Profilaxis de GvHD con Methotrexate No S Sin respuesta Diagnstico de Anemia de Fanconi, Anemia Aplstica Severa o LMC Nmero 1211 59 430 655 84 272 791 182 255 182 RR* (95% C.I.) 1.5 (1.4-1.6) 1.6 (1.2-2.2) 1.0 (0.9-1.2) Referencia 0.8 (0.6-1.04) 0.7 (0.6-0.8) Referencia 0.7 (0.6-0.9) 0.6 (0.5-0.7) 0.8 (0.6-0.9) p < 0.001 0.001 1.0 0.10 < 0.001
< 0.001 < 0.001 0.009
De acuerdo al test de Kaplan-Meyer, el 92.7% de los trasplantes prendieron, aunque el 12.7% lo hizo despus del da 42. Una serie de variables son reconocidas como influyentes sobre la velocidad del prendimiento de las series mieloide y megacarioctica (alcanzando recuentos de 500 neutrfilos y de 50.000 plaquetas/l, respectivamente) (19,38,46). La ms dramtica es la dosis de clulas (el nmero de clulas nucleadas viables por Kg de peso del receptor) (tabla 17-2; figura 17-1). La edad del paciente no alcanza significacin estadstica independiente en los tests multivariados aunque s la alcanza en los univariados, probablemente debido a la conjuncin entre la edad y el peso del paciente (el peso, obviamente, hace variar la dosis celular). En estudios recientes, hemos constatado que si se agrega la variable dosis de clulas progenitoras (formadoras de colonias) por Kg de peso (del paciente) al anlisis multivariado, esta variable desplaza a la dosis celular total por Kg de peso del paciente - como influencia independientemente significativa sobre la velocidad del prendimiento medular. Observaciones similares hechas an ms
recientemente usando como ndice la dosis de clulas que expresan el marcador CD34+, confirman la semejanza numrica de las clulas que expresan CD34 con las clulas formadoras de colonias. La influencia de los eritrocitos nucleados en este aspecto es muy interesante. Tradicionalmente se ha presumido que los eritroblastos (hemoglobinizados pero an con ncleo), por tratarse de clulas ya comprometidas con un linaje hematopoytico, no se correlacionan con la probabilidad del prendimiento y su velocidad. De aqu se lleg a la suposicin de que en unidades de sangre de cordn con un elevado recuento de eritroblastos, estas clulas deberan restarse del recuento total de clulas nucleadas. En un nuevo estudio, sin embargo, hemos encontrado que la dosis de eritroblastos tambin predice por s misma la velocidad del prendimiento y que, por lo tanto, estas clulas deben considerarse en la dosis celular total. Esta observacin facilita la estimacin de la dosis total, ya que la mayora de los instrumentos que recuentan clulas sanguneas automticamente no pueden diferenciar los eritroblastos de los linfocitos.
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Figura 17-1. Prendimiento post-trasplante de la serie mieloide: influencia de HLA y de la dosis de clulas por kg.
4.4. Histocompatibilidad La influencia de la histocompatibilidad entre donante y receptor ha sido ms difcil de demostrar, aunque tanto nuestros datos de 1998 como los de Eurocord en receptores de trasplantes de sangre de cordn de donantes no r elacionados demostraron la mayor velocidad en alcanzar el prendimiento que se obtiene con una mejor compatibilidad para los antgenos HLA. Otras series de pacientes no consiguieron demostrar esta asociacin. Pensamos que la diferencia residi en la falta de poder estadstico de esas series, con menor nmero de pacientes. Nuestros datos actuales en los EEUU, en un total de 1293 trasplantes no relacionados, confir ma la asociacin estadstica como significativa. La mediana del tiempo necesario para obtener 500 neutrfilos/ l fue de 23 das para receptores de trasplantes compatibles (designados 6/6) y de 28 das para los incompatibles (principalmente 5/6 y 4/6) (figura 17-1). Algo similar ocurre con la velocidad del prendimiento de las plaquetas: 67 das para alcanzar 50,000 plaquetas/l con los trasplantes 6/6 y 88 das para los 5/6 (P = 0.013). Sin embargo, comparando los dos grupos ms numerosos, la velocidad del prendimiento mieloide de los trasplantes con una incompatibilidad solamente (5/6), es idntica a la de los con dos (4/6).
4.5. Enfermedad Trasplante contra Husped Existe acuer do general sobr e la menor frecuencia y severidad de la GvHD con los trasplantes de sangre de cordn. Los aspectos clnicos del sndrome agudo son muy parecidos a los que siguen al trasplante de mdula sea, aunque la intensidad del tratamiento requerido es menor. Algunos especialistas han llegado a sugerir que se trata de una enfer medad diferente, por esa razn. Los factores que influencian el GvHD post-trasplante de mdula tambin se manifiestan en el caso de los de sangre de cordn, incluyendo la edad del paciente. El efecto de la incompatibilidad HLA se ve claramente en nuestra serie, en que la frecuencia de GvHD severa, es decir de Grados III y IV, fue del 8.3% en los receptores de trasplantes completamente compatibles (6/6) en comparacin con 24% para los dems trasplantes (P = 0.03). En el nmero total de pacientes transplantados con nuestras unidades de sangre de cordn hasta agosto de 2004, la incidencia de esta complicacin fue baja, significativamente menor que la de los receptores de trasplantes de mdula sea. La correlacin con la compatibilidad HLA, entre el nmero de antgenos incompatibles (0, 1, 2, o ms) y la severidad del GvHD agudo (grados 0-I, II o III-
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IV), es fuerte, especialmente utilizando la estadstica de Mantel-Haenzel en que las dos variables se relacionan linealmente: 2 con 1df = 12.3, P<0.001. La figura 17-2 muestra que el riesgo relativo de hacer GvHD de grado 2 es
ms bajo para los trasplantes ms compatibles. Esta asociacin se demostr como independiente en tests multivariados que incluan la edad, el diagnstico, la ubicacin del centro de trasplantes, etc.
Figura 17-2. Enfermedad injerto contra husped (GvHD) y Match HLA.
Otras series de pacientes, sin embargo, no han demostrado la asociacin con HLA, probablemente a consecuencia del pequeo tamao de la muestra respectiva. La GvHD crnica, que se diagnostica despus de los 100 das del trasplante, se present en casi un tercio de los enfermos trasplantados, principalmente con carcter limitado y se asoci fuertemente con la previa existencia de GvHD aguda (P < 0.001) pero, sorprendentemente, no con HLA. Posiblemente se explique por el tamao de la muestra. 4.6. Eventos relacionados al trasplante Los eventos relacionados al trasplante (Transplant-related events, TRE) incluyen la falla del trasplante, la reconstitucin autloga, el recibir un nuevo trasplante de clulas troncales y la muerte por cualquier causa. Su incidencia est fuertemente asociada con el
diagnstico y grado de avance (especialmente en malignidades), la compatibilidad HLA y la dosis celular (tabla 17-3) y, ms dbilmente, con la edad y la seropositividad del paciente para anti-CMV. Los riesgos relativos ms altos de sufrir TRE afectan a los pacientes receptores de trasplantes con 2 antgenos HLA incompatibles y a los receptores de las dosis celulares ms bajas. La asociacin se confir ma como independiente, en los tests multivariados. Analizando la influencia de estas mismas variables en la probabilidad de sufrir TRE despus del prendimiento del trasplante (tabla 17-4), las diferencias ms interesantes son la disminucin de la influencia de la dosis celular en los tests multivariados y el fortalecimiento de la asociacin con la edad del enfermo. El efecto de incompatibilidades HLA se manifest, sin cambios, despus del prendimiento del trasplante.
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Tabla 17-3. Variables que influencian la probabilidad de sufrir TRE (Regresin de Cox) Variable Dosis de clulas nucleadas (log. nat.) Match para HLA 6/6 5/6 4/6 3/6 Centro fuera de EE.UU LLA, LMA, LMC de alto riesgo Paciente no Caucsico Serologa anti- CMV pre-trasplante Negativa Positiva No determinada N 1267 61 445 675 86 280 251 560 605 536 126 RR (95% IC) 0.66 (0.59-0.75) 0.5 (0.3-0.8) 0.8 (0.6-0.9) Referencia 0.9 (0.7-1.3) 1.4 (1.2-1.4) 1.3 (1.1-1.6) 1.2 (1.0-1.4) Referencia 1.4 (1.1-1.9) 1.3 (1.1-1.5) p < 0.001 0.002 0.005 0.7 < 0.001 0.007 0.038
0.005 0.008
TRE = Eventos relacionados con el trasplante (transplant-related events) RR = riesgo relativo 95% IC = intervalo de confianza de 95% P = probabilidad asociada con el RR.
4.7. Recidiva leucmica Esta complicacin se presenta con diferente frecuencia en pacientes con distintos tipos de leucemias o linfomas y, tal como en el caso de los trasplantes de mdula sea, se asocia fuertemente con el diagnstico (la frecuencia en las leucemias mieloides agudas es 45%, en las leucemias linfoides agudas es 28% y en las leucemias mieloides crnicas es 17 %, y, especialmente, con el grado de avance de la enfermedad al momento del trasplante. La mayor parte de las recidivas ocurre en los primeros seis meses post-trasplante, pero algunos casos han sido reportados hasta dos aos despus. Esta tendencia a la recidiva temprana y a la falta de los casos tardos que se ven despus de trasplantes de mdula, ocurren tambin en el caso de los linfomas.
Curiosamente, la frecuencia de la recidiva es semejante a lo que ocurre con la mdula sea, aunque se podra haber esperado un incremento importante debido a la posibilidad de una disminucin de la respuesta trasplante antileucemia (graft-vs.-leukemia, or GvL) tal como la que se ve en el caso de la respuesta trasplante anti-husped (GvHD). La probabilidad de recidiva es menor en pacientes que han sufrido GvHD aguda severa (grado III y IV) quienes recidivaron en un 9%, comparado con el 29% de los que no tuvieron esta complicacin (p < 0.02). Lo mismo ocurre con los pacientes que desarrollaron GvHD crnica, posiblemente debido a la relacin con la GvHD aguda. La recidiva, por lo tanto, no es ms frecuente en los trasplantes con sangre de cordn que en los de otras fuentes de clulas troncales.
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Tabla 17-4. Recidiva en pacientes trasplantados por leucemia o linfoma, a los cinco aos del trasplante (Regresin de Cox) Variables: Dosis total de clulas nucleadas (log. nat.) Nmero de mismatches 0 1 2 3 Riesgo (Categoras de IBMTR para LLA, LMA, LMC) Bajo Intermedio Alto Otra leucemia o linfoma Edad < 6 aos (al hacer el trasplante) N 802 31 315 412 44 187 313 247 55 258 RR (CI =95%) 1.2 (0.8-1.6) p 0.4 0.15 0.5 0.8
0.5 (0.2-1.3) 1.1 (0.8-1.6) Referencia 0.9 (0.4-1.9) Referencia 1.5 (0.9-2.4) 2.8 (1.7-4.6) 3.7 (2.0-6.7) 1.3 (0.8-2.0)
0.14 < 0.001 < 0.001 0.3
4.8. Mortalidad Los aspectos generales de la mortalidad de los pacientes trasplantados con sangre de cordn se resumen en la tabla 17-5 A, y los de la mortalidad relacionada con el trasplante en la B. Se acostumbra a considerar ms especialmente la sobrevida, es decir, la fraccin de los pacientes trasplantados que per manecen vivos al cumplirse un determinado perodo despus del trasplante. Se usan como ndices, caractersticas de la sobrevida (por ejemplo, la sobrevida tres aos con un trasplante completamente funcional y sin recidiva de la enfermedad se llama sobrevida sin eventos negativos, (Event-free survival o EFS). La EFS es ms alta para los pacientes con enfermedades genticas
que para los que se transplantan por leucemias. Las probabilidades de EFS y los intervalos de confianza de 95% son, respectivamente, 48% (40%-55%) y 27% (23%-31%) tres aos posttrasplante, la ltima muy similar a la de los pacientes con mielodisplasia y anemia aplstica severa: 29% (23%-35%), tambin a los tres aos. El grado de avance de la enfermedad al momento del trasplante, la dosis celular transplantada y la compatibilidad HLA son, nuevamente, los factores que mejor se asocian con la pr obabilidad de EFS en anlisis multifactoriales. En las enfermedades genticas, el factor ms importante ha sido el pas donde se encuentra el centr o de trasplantes, especialmente al comienzo de la experiencia de los centros. La edad de los pacientes (o la dosis celular trasplantada) tambin se manifest como independientemente significativa.
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Tabla 17-5. Mortalidad asociada al trasplante Mortalidad total a los cinco aos del trasplante Dosis celular/Kg (natural log) HLA mismatches (en el sentido de rechazo) 0 1 2 3 Centro fuera de EEUU LLA, LMA o LMC de alto riesgo Enfermo no-Caucsico Serologa anti-CMV pre-trasplante Negativa Positiva No determinada N 1205 54 497 594 61 263 247 542 577 511 118 RR (95%IC) P 0.68 (0.61-0.75) < 0.001 0.5 (0.3-0.8) 0.9 (0.7-1.02) Referencia 1.07 (0.8-1.5) 1.3 (1.1-1.6) 1.6 (1.3-1.8) 1.2 (0.99-1.3) Referencia 1.2 (0.90-1.5) 1.3 (1.1-1.5) 0.002 0.096 0.7 0.001 < 0.001 0.060 0.2 0.004
Mortalidad relacionada con el trasplante (al final del primer ao) Dosis celular/Kg (log nat) 1205 0.62 (0.55-0.71) < 0.001 Nmero de mismatches (en el sentido de rechazo) 0 53 0.5 (0.3-0.8) 1 497 0.9 (0.7-1.02) 2 594 Referencia 3 61 1.1 (0.8-1.6) Centro fuera de EEUU 263 1.5 (1.2-1.8) LLA, LMA o LMC de alto riesgo 247 1.3 (1.04-1.6 Enfermo no-Caucsico 542 1.2 (1.0-1.4) Serologa anti-CMV pre-trasplante Negativa 577 Referencia Positiva 511 1.4 (1.1-1.9) No determinada 118 1.3 (1.1-1.5)
0.007 0.073 0.6 < 0.001 0.017 0.032 0.013 0.008
4.9. Avances recientes que mejoran el pronstico, especialmente en adultos A pesar de la mejora de la sobrevida de los pacientes transplantados con sangre de cordn en los ltimos aos, es innegable que la probabilidad de sobrevida a largo plazo contina siendo baja, al igual que en el caso de los trasplantes de mdula sea entre norelacionados. Si se considera, adems de la naturaleza maligna de las enfermedades que motivan estos trasplantes, la toxicidad de los regmenes condicionantes y las devastadoras consecuencias inmediatas y alejadas de la GvHD, es obvio que los riesgos que acompaan al trasplante son muy graves. En el caso de la sangre de cordn, el xito de esta teraputica reside en la disminucin de la GvHD, pero est limitado por la pequea magnitud de los inventarios de sangre de cordn (la mayor parte de los trasplantes sern incompatibles) y por la escasa celularidad de la mayora de las unidades existentes (menor velocidad del prendimiento
y mayor probabilidad de que infecciones graves ocurran durante e inmediatamente despus del prolongado perodo de aplasia). La atencin de los especialistas ha enfocado especialmente el segundo de los problemas, la dosis de clulas trasplantadas. Para aumentar el nmero de estas clulas, se ha ensayado sin xito hasta ahora, la expansin de clulas progenitoras, con diversas estrategias de cultivo en presencia de factores de crecimiento hematopoyticos. Los ensayos que se han reportado expanden, a veces marcadamente, los nmeros de clulas CD34+ pero no mejoran su capacidad de acelerar el prendimiento. Recientemente se han aumentado las dosis celulares haciendo trasplantes de dos o ms unidades simultneamente, los que han sido muy exitosos. Otro mtodo acompaa al trasplante de sangre de cordn con la infusin simultnea de clulas CD34+, purificadas de la mdula sea de un pariente parcialmente histocompatible con el enfermo o, incluso, de
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donantes totalmente no compatibles. Adems, la introduccin de regmenes condicionantes no completamente ablativos, que disminuyen el perodo de aplasia y la probabilidad de infecciones letales post-trasplante, ha demostrado una promesa importante. Aunque es muy temprano para una evaluacin definitiva de estos mtodos, es indudable que el problema de las dosis celulares podr ser superado en el futuro muy prximo, con lo que la incompatibilidad inmunolgica para HLA permanecera como la mayor barrera para la sangre de cordn. En este caso, la solucin ser terminar con la insuficiencia de unidades de sangre de cordn de los diferentes grupos tnicos para suplir las necesidades de la mayora de los pacientes. 5. CONCLUSIONES El progreso en la utilizacin de la sangre de cordn umbilical como fuente de clulas troncales, para la reconstitucin de la mdula sea ha sido comparativamente muy rpido: en once aos se ha demostrado la utilidad de esta fuente celular y se ha desarrollado una red de bancos alrededor del mundo para la recoleccin de este recurso y su almacenamiento. Esta red ya pr ovee una parte importante de los trasplantes en la actualidad: ms de la mitad del total de los trasplantes hematopoyticos en Japn y aproximadamente la mitad de los trasplantes peditricos en EEUU usan sangre del cordn. Los resultados clnicos han sido demostrados como equivalentes a los obtenibles con la mdula sea donada por individuos no relacionados con el receptor y en algunos casos como superior a ellos. Las ventajas logsticas sugieren que en pocos aos ser posible evitar la donacin de mdula sea o de clulas tr oncales movilizadas por voluntarios y los riesgos involucrados, a la vez que se agiliza el proceso de encontrar un donante adecuado para cada enfermo que lo requiere. Es interesante que el costo de un programa nacional es menor con sangre de cordn que con donantes voluntarios. El uso de donantes voluntarios implica la necesidad de reemplazar los voluntarios que abandonan el sistema despus de un perodo. En contraste con la sangre de cordn, que permanece viable por muchos aos hasta que se necesita, los voluntarios viajan, se enferman, envejecen, cambian de opinin y dejan de ser voluntarios, etc. Adems del gran nmero de unidades de sangre de cordn requeridas para mejorar la
compatibilidad HLA y el pronstico de los enfermos trasplantados, la tecnologa, que avanza decididamente hacia la automatizacin, todava debe superar otr os desafos importantes. En primer lugar, la estandarizacin de procedimientos en la preparacin de unidades y su caracterizacin, para que los clnicos puedan elegir una unidad de cualquier proveniencia solamente en base a factores tcnicos y cientficos. Ha habido progreso importante a nivel inter nacional en la promulgacin de estndares de calidad y mecanismos para la acreditacin de bancos de sangre de cordn (NETCORD-FACT) pero queda mucho por hacer en esta esfera. En el mbito de la investigacin, hay un campo enorme que se desenvuelve en gran parte como consecuencia de los bancos de sangre de cordn: la provisin de clulas troncales para estirpes celulares no hematopoyticas. La demostracin de clulas hepticas, miocrdicas, nerviosas y mesenquimticas, con el genotipo del donante, a partir de sangre de cordn ha abierto posibilidades insospechadas sobre la base del fenmeno de troncalidad (stemness). Para mayor infor macin sobre clulas mesenquimticas ver el captulo 2 de este libro. Finalmente, el hallazgo de clulas de estas y otras estirpes, en receptores de trasplantes de sangre de cordn humana ha revolucionado las expectativas de desarrollar, a corto o mediano plazo, tratamientos basados en teraputica celular y regeneracin tisular sin tener que utilizar elementos celulares embrionarios. LECTURAS SUGERIDAS American Academy of Pediatrics Work Group on Cord Blood Banking. Cord blood banking for potential future transplantation: subject review. Pediatrics 1999;104:116-118. Beatty, P.G., Mori, M., Milford, E. Impact of racial genetic polymorphism on the probability of finding an HLA-matched donor. Transplantation 1995; 60:778-783. Besalduch, J. Naturaleza y caractersticas de los precursores Granuloctico-macrofgicos en Sangre de Cordn (tesis doctoral) 1985, Universitat de Valncia, Valencia, Spain. Boyse, E.A., Broxmeyer, H.E., Douglas, G.W. Pr eservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood. U.S. Patent 5,004,681 4/02/1991.
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HEMATOLOGA
Captulo
18
ENFERMEDADES LISOSOMALES E HISTIOCITOSIS

Erna Raimann B., J. Francisco Cabello A., Claudio Cruzat C., Carlos Rodrguez-Galindo e Ivn Palomo G.
ENFERMEDADES LISOSOMALES 1. Introduccin 2. Enfermedades lisosomales 2.1. Esfingolipidosis 2.1.1. Antecedentes generales 2.1.2. Enfermedad de Gaucher 2.1.3. Enfermedad de Niemann Pick 2.2. Otras Enfermedades lisosomales HISTIOCITOSIS 1. Introduccin 2. Etiologa y epidemiologa de la histiocitosis 3. Ontogenia y fisiopatologa de las clulas histiocticas y dendrticas 4. Morfologa, localizacin e inmunofenotipo de clulas dendrticas e histiocticas 5. Clasificacin de la histiocitosis 6. Afecciones relacionadas con las clulas dendrticas 6.1. Histiocitosis de clulas de Langerhans 6.2. Proceso de clulas dendrticas secundario 6.3. Xantogranuloma juvenil y afecciones asociadas 6.4. Histiocitomas solitarios de clulas dendrticas con fenotipos variables, dendrocitomas. 7. Afecciones relacionadas con los macrfagos 7.1. Sndromes hemofagocticos 7.2. Reticulohistiocitoma y retculohistiocitosis multicntrica 7.3. Enfermedad de Rosai-Dorfman
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RESUMEN
Las lipoidosis se refiere a un grupo heterogneo de alteraciones en el metabolismo de los lpidos. En este captulo nos referiremos a ciertos errores innatos del metabolismo que, agrupados en el contexto de las Enfermedades Lisosomales, comparten la caracterstica que pueden presentarse con sntomas o signos clnicos o de laboratorio que pueden ser de importancia para el hematlogo. La Enfermedad de Gaucher ocupa un lugar principal por ser la ms frecuente de las enfermedades lisosomales y porque las manifestaciones clnicas comprenden el compromiso hematolgico, visceral y seo. La presencia de las clulas de Gaucher en la mdula sea permite muchas veces al hematlogo sospechar el diagnstico de esta enfermedad en un paciente que pudo haber sido derivado para estudio por una pancitopenia, hepatoesplenomegalia o hiperesplenismo. La Enfermedad de Niemann Pick es otra esfingolipidosis que puede presentar clulas anormales a la visin experta del hematlogo. Las mucopolisacaridosis, las oligosacaridosis, las mucolipidosis y la Enfermedad de Pompe suelen no tener manifestaciones de la esfera hematolgica, pero pueden presentar alteraciones que catalogadas como hallazgos en el anlisis de sangre perifrica o en la mdula sea, pueden orientar al clnico experimentado. La Histiocitosis representa un grupo de enfermedades en que proliferan clulas dendrticas y/o macrfagos, tanto neoplsicas como no-neoplsicas. Las histiocitosis se clasifican segn la clula de origen; clulas dendrticas o macrfagos. En el primer grupo se encuentra la Histiocitosis de clulas de Langerhaus. Aqu se describirn las principales caractersticas de las Histiocitosis clnicamente ms importantes.
ENFERMEDADES LISOSOMALES Erna Raimann B. y J. Francisco Cabello A. 1. INTRODUCCIN El tr mino lipoidosis se refiere convencionalmente a las alteraciones en el metabolismo de los lpidos. Se suele entender que secundaria a esta alteracin ocurre un depsito de lpidos que puede identificarse por mtodos diagnsticos convencionales. El carcter inespecfico de esta definicin ha obligado a reconocer diferentes entidades dentr o de enfer medades antiguamente agrupadas dentro del captulo de las lipoidosis y que no necesariamente corresponden a defectos primarios del metabolismo de un lpido. Hoy en da, es posible encontrar algunas de estas condiciones en los captulos referidos a enfermedades de depsito, o bien, clasificadas segn el organelo donde ocurre el defecto enzimtico o el depsito del lpido. Otras condiciones como las dislipidemias, los desrdenes del metabolismo del colesterol o de la sntesis de cidos biliares, si bien corresponden a alteraciones del metabolismo
de los lpidos, suelen considerarse en captulos diferentes. En virtud de la orientacin de este libro, se han seleccionado las condiciones relacionadas a alteraciones del metabolismo de los lpidos que al parecer tienen mayor implicancia en la prctica clnica y de laboratorio del hematlogo. Es as que se revisar en mayor extensin la Enfermedad de Gaucher y la de Niemann Pick, dos esfingolipidosis que por su frecuencia y por la forma de presentacin pueden corresponder a un diagnstico diferencial importante. De manera ms somera, se describirn otras enfermedades lisosomales que no se presentan frecuentemente en la consulta hematolgica. 2. ENFERMEDADES LISOSOMALES Comprenden las entidades clnicas que se producen por el defecto de cualquiera de las enzimas lisosomales. Actualmente se reconocen cer ca de 40 alteraciones distintas con caractersticas clnicas diversas. Las enfermedades lisosomales se pueden clasificar en grupos distintos, entre los cuales vale la pena destacar las esfingolipidosis, las
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mucopolisacaridosis, las oligosacaridosis, las mucolipidosis y la glicogenosis tipo II (enfermedad de Pompe). 2.1. Esfingolipidosis
Pick B y recientemente para otras Enfermedades Lisosomales, como las Mucopolisacaridosis tipo I, II y VI, y la Enfermedad de Pompe. 2.1.2. Enfermedad de Gaucher La enfermedad de Gaucher es considerada la ms frecuente de las enfer medades por depsito lisosomal. Se produce por el dficit de la enzima lisosomal glucocerebrosidasa (figura 18-EL-1) y se transmite de manera autosmico recesiva. Fisiopatologa Se presenta con una frecuencia aproximada de 1:60.000 recin nacidos en todo el mundo, pero es ms frecuente en poblacin juda ashkenazi, donde su prevalencia llega a ser de 1:855. Presentacin clnica Se reconocen tres tipos clsicos de presentacin asociados al dficit de glucocerebrosidasa, sin embargo, algunos prefieren describir un continuo de presentaciones desde una forma neonatal letal hasta el paciente asintomtico. Enfermedad de Gaucher tipo I. La enfermedad de Gaucher tipo I, o forma no neuronoptica, se caracteriza por el compromiso visceral, hematolgico y seo, as como por la ausencia de compromiso neurolgico primario. Los pacientes inician las manifestaciones clnicas en la edad peditrica, con epistaxis frecuentes, hematomas o equimosis ante traumas mnimos, y otras alteraciones asociadas a la trombocitopenia. En el estudio se constata, frecuentemente, tr ombocitopenia como hallazgo ms llamativo en sangre perifrica, pero es posible reportar desde el momento de la aparicin de los sntomas una bi o pancitopenia, en concomitancia con una visceromegalia, donde el predominio de la esplenomegalia es caracterstico y llega a producir un abdomen prominente en los pacientes afectados. La trombocitopenia suele explicarse en los primeros aos de evolucin por un secuestro esplnico de plaquetas y por lo mismo mejora significativamente con la esplenectomia, hoy contraindicada por asociarse a un empeoramiento del compromiso seo y ante la existencia de terapias especficas. El bazo puede llegar a volmenes de 1500-3000 cc en contraste con los 50-200 cc de volumen promedio en el adulto. Habitualmente dentro de la primera dcada de la vida se presentan
2.1.1. Antecedentes generales Los esfingolpidos son lpidos de membrana complejos derivados de la ceramida en cuyo catabolismo requier en de hidr olasas lisosomales. La deficiencia de estas enzimas, producen un depsito progresivo de estos compuestos en los rganos afectados y variadas consecuencias funcionales. De esta manera, las esfingolipidosis son un subgrupo de enfermedades por depsito lisosomal que pueden manifestarse de diversas formas, predominantemente con sntomas como hepatoesplenomegalia (Gaucher y Niemann Pik A y B), dis y desmielinizacin central y perifrica (leucodistrofia metacromtica y enfermedad de Krabbe), y desrdenes con depsito neuronal predominante (gangliosidosis). la enfermedad de Farber y la enfermedad de Fabry tienen presentaciones nicas y no asimilables a estos grupos. Avances importantes han acontecido en este grupo de condiciones en su enfrentamiento teraputico en los ltimos aos. La terapia de reemplazo enzimtico, largamente anhelada para otros errores innatos del metabolismo, vio en la Enfermedad de Gaucher la primera condicin donde se lograba, a travs de esta aproximacin teraputica, detener la progresin del depsito de esfingolpidos, abriendo el camino para la Enfermedad de Fabry, Niemann
Figura 18-EL-1. Esquema en que se muestra la alteracin metablica de la Enfermedad de Gaucher.
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las primeras crisis seas, que son episodios intensos de dolor, de ubicacin en caderas, rodillas o superficie de huesos largos como el fmur, y que obedecen a procesos de necrosis avascular, lesiones lticas o pequeos infartos seos. Con el avance de los aos, la visceromegalia suele estabilizarse, pero los
sntomas seos pr ogresan, llevando a osteoporosis, fracturas patolgicas, deformacin sea y frecuentemente los pacientes tienen indicacin de reemplazos articulares en edades tempranas (figura 18-EL-2). El compromiso pulmonar es inhabitual, pero constituye una causa importante de mortalidad cuando se
Figura 18-EL-2. Paciente con enfermedad de Gaucher. Paciente de 28 aos, esplenectomizado, con severa enfermedad sea, sin acceso a reemplazo enzimtico. Se observa: (A) la severa alteracin de la morfologa de la cabeza femoral producto de una secuela de necrosis avascular, (B) la osteoporosis y deformacin en frasco de Erlenmeyer en la Rx de fmur distal y (C) la infiltracin medular en la Resonancia Nuclear Magntica de fmur.
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presenta y debe ser monitorizada. Puede presentarse como compromiso intersticial, como consolidaciones alveolares/lobares o como hipertensin pulmonar. El compromiso neurolgico puede presentarse secundario a la patologa sea (colapso vertebral, compromiso de plexos o nervios perifricos por compresin sea) o hematolgica (hematomas subdurales u otros fenmenos hemorragparos en el sistema nervioso central). Enfermedad Gaucher tipo II. La enfermedad de Gaucher tipo II, o forma neuronoptica aguda, se manifiesta antes de los dos aos de vida, con un curso rpido y progresivo, donde la presencia de signos piramidales (opisttonos, espasticidad, trismus), compromiso bulbar (estridor, trastornos de la deglucin), epilepsia mioclnica y alteracin de la oculomotricidad (apraxia, fallas en el inicio de la mirada sacdica, nistagmo optokintico) son caractersticos. Estos nios mueren habitualmente en los primeros aos de vida. Enfermedad Gaucher tipo III. La enfermedad de Gaucher tipo III, o forma neuronoptica crnica, se manifiesta con signos neurolgicos progresivos que pueden iniciarse antes de los dos aos de vida, pero que evolucionan sin un patrn caracterstico, donde ocasionalmente la alteracin de la oculomotricidad puede ser el nico sntoma detectable, constituyendo un sntoma importante a evaluar en pacientes considerados con la forma I. Se reconocen dos for mas adicionales de presentacin. Una forma perinatal letal, con piel ictiosiforme (nio colodion) o como un hidrops no inmune. La for ma denominada cardiovascular se presenta con calcificacin de la vlvula mitral y artica, asociada ocasionalmente a esplenomegalia leve, opacidades cor neales y oftalmoplegia supranuclear. Diagnstico El diagnstico de todas las formas descritas se basa en la determinacin de una actividad deficiente de la enzima glucosilceramidasa en leucocitos u otras clulas nucleadas. El anlisis de mutaciones del gen GBA (cr 1q21) est disponible habitualmente para las mutaciones ms frecuentes. Existen cuatro mutaciones de presentacin ms habitual (N370S, L444P, 84GG, IVS2+1) que dan cuenta del 90% de los alelos en poblacin judo ashkenazi y de cerca de un 50-60% en poblacin no juda, donde
usualmente se encuentra una mutacin conocida y una de presentacin inhabitual. El aspirado de mdula sea no se indica cuando se sospecha la enfermedad si se dispone de la actividad enzimtica, sin embargo, los pacientes con Gaucher suelen ser sometidos a este procedimiento diagnstico como parte del estudio de su pancitopenia o hepatoesplenomegalia. En este aspirado pueden reconocerse macrfagos llenos de lpidos, con un citoplasma con aspecto de seda arrugada que capta la tincin de PAS y un ncleo excntrico, conocida como clula de Gaucher, que en ojos de un patlogo experimentado constituye un medio diagnstico importante. Se ha descrito la presencia de pseudo-clulas de Gaucher en una variedad de condiciones tales como: leucemia granuloctica crnica, talasemias, mieloma mltiple, enfermedad de Hodgkin, linfomas plasmacitoides y SIDA (pacientes infectados por Mycobacterium avium). Tratamiento El tratamiento comprende tres aspectos importantes que deben ser llevados a cabo por un equipo multidisciplinario. Estos son la evaluacin peridica, el manejo de los sntomas y la reduccin de la acumulacin de glicosilceramida. Si bien la existencia de reemplazo enzimtico ha evitado la aparicin de muchos sntomas y por tanto ha disminuido el nmero de acciones orientadas al manejo de los sntomas a lo largo del mundo, existen muchos pases en que los pacientes no pueden acceder al tratamiento por su alto costo. Estos pacientes slo recibirn tratamiento sintomtico, que comprende la transfusin de concentrados de plaquetas u otros hemoderivados; analgsicos para las crisis seas; cirugas de reemplazo articular; aporte de suplementos como los bifosfonatos en pacientes con baja densidad sea. La esplenectomia debe ser evitada ya que produce empeoramiento de los sntomas seos, aunque sin acceso a la Terapia de Reemplazo Enzimtico (TRE), a veces constituye la nica alternativa para manejar los sntomas secundarios al aumento de volumen del bazo o al hiperesplenismo. El trasplante de medula sea ha visto limitado su uso en pacientes con enfermedad de Gaucher tipo I por la alta morbilidad y mortalidad del procedimiento. Sin embargo, en pacientes con la forma neuronoptica crnica, pueden verse beneficiados corrigiendo el defecto metablico
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y mejorando el compromiso hematolgico y visceral. En algunos pacientes se ha reportado la estabilizacin de la enfermedad sea y de los sntomas neurolgicos. La enfermedad de Gaucher fue la primera enfermedad lisosomal que hace ya 12 aos cuenta con TRE y ya cerca de 3.000 pacientes la han recibido a lo largo de todo el mundo. Esta aproximacin teraputica se basa en la administracin de enzima recombinante, sintetizada en cultivos celulares en base a la secuencia de la enzima humana, de manera de superar el bloqueo en la va catablica y producir una remocin efectiva del sustrato acumulado previamente. Infusiones regular es de imiglucerasa (Cerezyme), producen mejora en los sntomas hematolgicos y viscerales en los
primeros 6-12 meses de tratamiento (figura 18EL-3). Esto repercute positivamente en la calidad de vida de estos pacientes, logrando disminuir el ausentismo escolar o laboral, permitindoles llevar una vida prcticamente normal. El compromiso seo revierte de manera menos predecible, lo que posiblemente est en relacin con el estado seo previo del paciente, logrando mejores efectos cuando el tratamiento se inicia precozmente. El compr omiso neurolgico de las formas neuronopticas de la enfermedad de Gaucher no responden a la TRE debido a la accin de la barrera hematoenceflica. Sin embargo, puede indicarse la TRE para el manejo de los sntomas no neurolgicos de manera de mejorar la calidad de vida de estos pacientes.
Figura 18-EL-3. Respuesta a terapia de reemplazo enzimtico en la Enfermedad de Gaucher. Hepatoesplenomegalia masiva en paciente de 9 aos con Enfermedad de Gaucher y la respuesta a la TRE. (A) antes y (B) despus de 6 meses de tratamiento.
La terapia de inhibicin de sustrato busca restaurar la homeostasis metablica limitando la cantidad de sustrato precursor sintetizado. Durante los ensayos clnicos se han evidenciado frecuentes efectos adversos que han limitado su uso, por lo que est restringido a los casos muy ocasionales de reacciones severas de hipersensibilidad a la TRE. La terapia gnica est an bajo investigacin.
Interesantes apr oximaciones han sido publicadas, pero todava no se logra una respuesta sostenida en el tiempo para los efectos teraputicos por parte de los modelos utilizados hasta ahora. 2.1.3. Enfermedad de Niemann Pick La enfermedad de Niemann Pick actualmente es considerada un grupo heterogneo de
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enfermedades de herencia autosmico recesiva que, originalmente, se clasificaban clnicamente en los tipos A, B, C y D. Fisiopatologa Hoy se reconoce que los tipos A y B de la enfermedad de Niemann Pick corresponden a desrdenes por depsito de esfingomielina por dficit de esfingomielinasa y que los tipos C y D son pr oducidos por un defecto de la esterificacin del colesterol. Presentacin clnica La enfermedad de Niemann Pick tipo A se presenta con un inicio insidioso en los primeros meses de vida con dificultades en la alimentacin e infecciones respiratorias frecuentes. La hepatomegalia es un hallazgo importante y predomina sobre la esplenomegalia, como un elemento distintivo con la enfermedad de Gaucher. El compromiso neurolgico aparece caractersticamente luego de un perodo de 6 meses, con prdida del contacto visual e hipotona que se sucede con una paresia espstica progresiva y la aparicin de sntomas extrapiramidales. En el examen oftalmolgico, es posible encontrar una mancha rojo cereza similar a la de las gangliosidosis hasta en un 50% de los casos y en el aspirado de mdula sea se pueden encontrar macrfagos con citoplasmas llenos de lpidos, similares a las clulas de Gaucher. La radiografa de trax puede mostrar un patrn reticular, que hace confundir el diagnstico con el de una tuberculosis miliar, pero que obedece al depsito intersticial pulmonar de esfingolpidos. Las imgenes del sistema nervioso central muestran atrofia, caractersticamente de predominio en cerebelo. El deterioro es progresivo y los paciente fallecen los primeros dos o tres aos de vida. La enfermedad de Niemann Pick tipo B es una enfermedad de inicio ms tardo y se presenta con hepatoesplenomegalia en nios entre los 2-5 aos que habitualmente no presentan compromiso neurolgico. Ocasionalmente se reportan casos con ataxia y dficit cognitivo. El compromiso hematolgico secundario a la pancitopenia es causa habitual de manifestaciones tales como epistaxis o equmosis ante traumas mnimos asociados a trombocitopenia. Estos pacientes presentan tambin compromiso pulmonar, manifestado como infecciones frecuentes u ocasionalmente
como un hallazgo en una radiografa de trax. Con el tiempo, el compromiso pulmonar puede llevar a insuficiencia respiratoria crnica y a un cor pulmonale. El compromiso heptico puede avanzar hacia la cirrosis. El crecimiento de estos pacientes puede estar disminuido. Las manifestaciones de esta enfermedad pueden ser tan leves que se manifiestan en pacientes adultos, y si bien la sobrevida estar en relacin a la intensidad de los sntomas, usualmente es cercana a lo normal. Diagnstico Ya desde la descripcin por parte de Ludwick Pick en 1927, se reconoci que las clulas depositadas en esta enfermedad eran diferentes a las descritas en la Enfermedad de Gaucher, por lo que se llam a esta entidad esplenomegalia de clulas lipoides. Estas clulas han sido descritas en pacientes con Enfer medad de Wolman, enfermedad de depsito de esteres de colesterol, deficiencia de lipoprotein-lipasa y algunos pacientes con gangliosidosis GM1. Esta clula es ms pequea que la clula de Gaucher, mide aproximadamente 25-75 m, usualmente tiene un ncleo, y su citoplasma est lleno de partculas o gotas de lpidos, que al ser de tamaos unifor mes, dan a la clula esta caracterstica espumosa (foamy cells), tambin descrita como en panal de abeja. Bajo luz polarizada, estas partculas son birrefringentes, y bajo la luz UV, aparecen amarillo-verdosas o con un tono caf. En secciones congeladas, estas partculas tien positivas para la tincin Sudan Black B. La reaccin de Schultz para colesterol es positiva en la mayor parte de los casos, siendo negativa para las clulas de Gaucher. Otra diferencia es la pobre tincin con PAS. La caracterstica del material intracelular azuloso en la mdula sea le da el nombre del histiocito azul mar (sea-blue histiocyte). Ultra estructuralmente, la clula Niemann Pick contiene numerosas inclusiones granulares en el citoplasma. Estas inclusiones pueden aparecer como lamelares, teniendo una periodicidad de unos 50 A y son ms frecuentes a medida que avanza la edad del paciente. En contraste con las clulas de Gaucher, estos cuerpos de inclusin reaccionan dbilmente a la fosfatasa cida. Estas clulas se originan de clulas progenitoras de la medula sea, por lo que es raro no encontrar al menos algunas de estas clulas en todos los tejidos. El diagnstico se basa en la determinacin de
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una actividad deficiente de esfingomielinasa. El estudio de mutaciones del gen ubicado en el cromosoma 11 (11p15.4-p15.1) est disponible y tiene utilidad pronstica limitada. Tratamiento El manejo de la enfermedad de Niemann Pick se basa en la monitorizacin de los sntomas y de su progresin. Est abierta la posibilidad para el uso de la terapia de reemplazo enzimtico en las formas con ausencia de compromiso neurolgico, para las cuales existen estudios clnicos ya en marcha. 2.2. Otras Enfermedades Lisosomales Existen otras enfermedades lisosomales donde el hematlogo puede jugar un rol en la pesquisa de nuevos casos o en el manejo de los mismos, que debe ser multidisciplinario. No es raro que el hematlogo sea el primero en sospechar una de estas enfermedades al examinar a un paciente referido por una pancitopenia, esplenomegalia o en el diagnstico diferencial de leucemias o linfomas. Tal como se mencionaba en la seccin referida a Enfermedad de Gaucher, el anlisis del aspirado de mdula sea suele ser de gran trascendencia para sospechar el diagnstico, a pesar que hoy existen anlisis ms simples y menos invasivos para lograr la confirmacin diagnstica de estas enfermedades. Mucopolisacaridosis Las mucopolisacaridosis (MPS) son un grupo de enfermedades que comparten la caracterstica de una acumulacin crnica y progresiva de diferentes glicosaminoglicanos que son degradados defectuosamente en los lisosomas. Segn el/los glicosaminoglicanos acumulados, se determinarn los sntomas que comprenden un espectro de presentaciones, entre las cuales destacan las dismorfias faciales, las displasias seas, las opacidades cor neales, hepatoesplenomegalia, alteraciones cardiacas, anormalidades neurolgicas y la reducida sobrevida. La mucopolisacaridosis tipo I (MPS I) presenta un espectro de presentacin clnica, siendo la enfermedad de Hurler la ms severa y la enfermedad de Scheie la forma ms leve. La
primera representa el prototipo de todas las mucopolisacaridosis, con retraso en el desarrollo psicomotor en el primer ao de vida y frecuentes infecciones respiratorias, que se suceden ms adelante con el establecimiento macrocefalia, piel gruesa, opacidades corneales, hepatoesplenomegalia, displasia sea y una serie de dismorfias faciales que dan un aspecto en grgola a la cara de estos pacientes. Las alteraciones seas llevan a retraso del crecimiento y severas deformidades de tronco y extremidades. Los pacientes con la forma severa de la enfer medad fallecen en los primeros aos de vida. Los pacientes con la enfermedad de Scheie presentan sntomas leves, a veces casi imperceptibles de la misma enfermedad a pesar de compartir el mismo defecto bioqumico con los pacientes con el fenotipo severo. La mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) o enfermedad de Hunter difiere de los otros tipos por ser la nica con herencia ligada al X. Se asemeja a la MPS I con la diferencia que no tiene opacidades cor neales. Tambin puede encontrarse un espectro de presentaciones desde formas severas hasta formas leves. En la mucopolisacaridosis tipo III (MPS III) o enfer medad de Sanfilippo predomina el compromiso del sistema nervioso central y los sntomas somticos suelen ser moderados. Los sntomas principales aparecen despus de los 3 aos de vida como prdida de habilidades adquiridas, alteraciones de conducta y epilepsia. La hepatomegalia y las alteraciones seas son ms leves que en los otros tipos. Se reconocen cuatro variantes bioqumicas distintas, con diferencias imperceptibles clnicamente, con excepcin de la tipo A que suele ser la ms severa. La mucopolisacaridosis tipo IV (MPS IV) o enfermedad de Morquio se caracterizan por el compromiso seo severo que da lugar a una displasia espondiloepifisiaria, talla baja, defor midad torxica y genu valgo. Las opacidades corneales son leves y no hay dismorfias. La mucopolisacaridosis tipo VI (MPS VI) o enfermedad de Maroteaux Lamy se presenta con un fenotipo similar al Hurler, pero sin compromiso neurolgico (figura 18-EL-4).
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Figura 18-EL-4. Paciente con mucopolisacaridosis VI (Enfermedad de Maroteaux Lamy). (A), Paciente de 4 aos con historia de infecciones respiratorias frecuentes, aparicin progresiva de dismorfias faciales observadas, opacidades corneales, hipoacusia, apnea obstructiva, limitacin progresiva de la marcha y disostosis mltiple. (B), En la radiografia lateral de columna dorsal, se observa la alteracin en la morfologa de los cuerpos vertebrales, con vrtebras en cabeza de pescado. (Fotografa autorizada por la madre del paciente).
La mucopolisacaridosis tipo VII (MPS VII) o enfermedad de Sly presenta quizs el espectro ms amplio de presentaciones desde el hidrops fetal a individuos prcticamente normales. La mucopolisacaridosis tipo IX (MPS IX) o dficit de hialuronidasa es la forma ms recientemente descrita en 1996 en una paciente aislada. En la mdula sea de pacientes con MPS, es posible observar histiocitos que contienen grnulos metacromticos conocidos como cuerpos de Reilly o de Alder-Reilly. Si bien esto no constituye un elemento diagnstico importante, su hallazgo casual unido a las caractersticas descritas deben hacer plantear el diagnstico de estas condiciones. Dentro de las mucolipidosis, la enfermedad de las clulas I (I-cell disease, mucolipidosis II), se caracteriza por presentar caractersticas clnicas similares a la mucopolisacaridosis tipo I (enfermedad de Hurler), pero anlisis normal
de mucopolisacridos en orina. Presentan dismorfias, retardo del desarrollo psicomotor, cardiopata (compromiso mitral y/o artico y miocar diopata), disostosis mltiples, infecciones respiratorias frecuentes y muerte habitualmente en la primera dcada de la vida. Originalmente fue descrita en 1967 como una condicin que semejaba la enfermedad de Hurler, pero en la que destacaba la presencia de numerosas inclusiones de fase densa en el citoplasma de fibroblastos provenientes de individuos afectados. Estas clulas fueron llamadas clulas de inclusin (inclusin cells, abreviadas como I-cells). Ms tarde fueron descritas las alteraciones bioqumicas propias de esta condicin. El trmino mucolipidosis fue acuado posteriormente para denominar un grupo de condiciones que reunan caractersticas comunes con las mucopolisacaridosis y las esfingolipidosis. Enfermedad de Pompe En la enfermedad de Pompe, es posible observar vacuolas de glicgeno en fibroblastos, msculo
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y mdula sea, aunque prcticamente en todos los tejidos examinados en especmenes de autopsia. Estos pacientes se presentan en una forma infantil, juvenil o adulta. La forma infantil es la ms caracterstica y severa, con una hipotona severa de inicio en el recin nacido, una lengua prominente, y un corazn con una hipertrofia concntrica severa. Las formas tardas suelen manifestarse con alteraciones motoras en un patrn mioptico y el compromiso cardiaco es mnimo o ausente. Es posible encontrar linfocitos vacuolados en ciertas oligosacaridosis como la sialidosis, manosidosis, fucosidosis, y en la enfermedad de Salla. Su frecuencia es baja y los fenotipos clnicos semejan a las mucopolisacaridosis.
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HISTIOCITOSIS Claudio Cruzat C., Carlos Rodrguez-Galindo e Ivn Palomo G. 1. INTRODUCCIN El trmino histiocitosis se refiere a un grupo de alteraciones proliferativas de clulas dendrticas y/o macrfagos (neoplsicas y no-neoplsicas; malignas y de comportamiento biolgico variable). El histiocito identifica un grupo de clulas del sistema inmune formado por la lnea monocito/macrfago y las clulas dendrticas o accesorias. Todas ellas tienen participacin en la identificacin y procesamiento de antgenos. Sin embargo, mientras que la funcin principal de las clulas de la lnea monoctica es la fagocitosis, el papel de las clulas dendrticas es exclusivamente el procesamiento y presentacin de antgenos a las clulas efectoras, con mnima o nula capacidad fagocitaria. Estas diferencias en funcin son importantes para entender las desigualdades en la presentacin clnica entre los distintos sndromes Las clulas dendrticas incluyen, a su vez, a las clulas indeter minadas, los dendrocitos drmicos, las clulas dendrticas interdigitantes, las clulas dendrticas foliculares (clulas reticulares dendrticas), las clulas reticulares fibroblsticas y a las clulas de Langerhans (CLs). 2. ETIOLOGA Y EPIDEMIOLOGA DE LAS HISTIOCITOSIS Las proliferaciones de clulas histiocticas y dendrticas se encuentran entre las enfermedades ms infrecuentes que afectan los tejidos linfoide y hematopoytico. Ellas representan menos del 1% de los tumores que comprometen ndulos linfticos. Junto a los escasos datos epidemiolgicos disponibles, la incidencia real de estas enfermedades se ve afectada por la similitud morfolgica e inmunofenotpica entre clulas reticulohistiocticas y linfoides, con pocos marcadores especficos para el lineaje celular macrofgico y dendrtico, a la hora de definir el diagnstico, y por la histrica dificultad para distinguir proliferaciones reactivas de procesos neoplsicos de estas clulas. No existen diferencias sustantivas en su distribucin geogrfica, racial y etaria, aunque segn el caso suelen ser ms comunes en la
infancia. Su etiologa exacta no es conocida y, debido a su baja frecuencia, no ha habido avances significativos en este sentido, aunque se involucran aspectos genticos e infecciones virales. 3. ONTOGENIA Y FISIOPATOLOGA DE LAS CLULAS HISTIOCTICAS Y DENDRTICAS La mayora de estas clulas se origina de clulas madre hematopoyticas; durante el proceso de diferenciacin migran a los tejidos perifricos. Sin embargo, fagocitos y clulas accesorias, se considera que representan dos lneas paralelas e independientes de diferenciacin. Los fagocitos, cuyo rol mayor es la remocin y procesamiento de partculas antignicas, derivan de monocitos circulantes que cruzan las paredes vasculares para entrar, principalmente, a los rganos linfoides y del sistema retculoendotelial; por lo tanto, no es sorprendente que la distincin entre leucemia monoctica y sarcoma histioctico sea difcil o ambigua. Sin embargo, los macrfagos no son clulas re-circulantes, por lo que la mayora de los sarcomas histiocticos se presenta como una masa tumoral localizada sin una fase leucmica. Los macrfagos de ndulos linfticos tienen acentuada actividad para enzimas lisosomales, incluyendo fosfatasa cida y esterasas no especficas. Bajo ciertas condiciones, estas clulas pueden desarrollar actividad fagoctica; sin embargo, sta no es una caracterstica prominente en malignidades histiocticas, siendo ms comn en proliferaciones noneoplsicas de histiocitos, tales como el sndrome hemofagoctico. La actividad para lisozima y alfa-1-antitripsina es una cualidad de la mayora de los macrfagos, pero disminuye con la fagocitosis y es ms prominente en histiocitos epitelioides que forman granulomas. Las clulas dendrticas se encuentran en cantidades traza por todo el organismo, siendo su rol principal la presentacin de antgenos a los linfocitos. Muchas de ellas, con diferencias sutiles en su fenotipo, han sido descritas en sangre, piel y rganos linfoides. Derivan de un precursor hematopoytico CD34+. En cultivos celulares in vitro, bajo la accin de GM-CSF y TNF, hacia el 3 5 da, una clula CD34+ forma dos poblaciones celulares, una CD1a+/CD14- y otra CD14+/CD1a-, siendo la segunda la ms predominante. Hacia el da 7, el 3 al 8% del total de las clulas se hace doblemente positiva
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(CD1a+/CD14+), alcanzando esta condicin el 20 38% de las clulas entre el da 8 y 10. La aparicin de esta subpoblacin doblemente positiva, se correlaciona con la desaparicin progresiva de la lnea celular CD14+/CD1a-, sugiriendo que esta poblacin ha ido adquiriendo el marcador CD1a. Hacia el da 10 12, la poblacin doblemente positiva comienza a desaparecer, y el da 14 la mayora de las clulas expresan poca cantidad de CD14, manteniendo la expresin de CD1a. Ambas poblaciones celulares CD1a y CD14+, expresan niveles distintos de una serie de marcadores CD y HLA-II. As CD1b y CD1c se expresan en ms altos niveles en las clulas CD1a+ que en las clulas CD14+. Inversamente, CD11b, CD32 y CD36 son ms intensamente expresados en las clulas CD14+ que en las clulas CD1a+. La molcula CD72 nicamente se expresa en las clulas CD1a+, mientras que CD2, CD9 y el receptor para M-CSF lo hace en las clulas CD14+. Hacia el da 14 las caractersticas fenotpicas de estas poblaciones celulares, cambia. Las clulas CD1a+ expresan bajos niveles de CD72 y altos niveles de E-caderina, una molcula expresada en las CLs, comprometida en la interaccin entre stas y los queratinocitos. Tambin expresan el antgeno Lag (grnulo asociado a Langerhans). Por el contrario, las clulas CD14+ presentan bajsimos niveles de CD72, Lag, y E-caderina, expresando en forma exclusiva CD9, CD2, CD68, factor XIIIa. Hacia el da 13 14 las clulas CD1a+, presentan los grnulos de Birbeck. Finalmente, los precursores CD1a+ producen las tpicas CLs en la epidermis, caracterizadas por la expresin de CD1a+, grnulos de Birbeck, antgeno Lag, y E-caderina, mientras que los precursores CD14+ producen clulas dendrticas halladas en sangre y epidermis, expresando el factor XIIIa, CD68, CD9 y CD2. Por otro lado, las clulas CD14+/CD1a-, que expresan el receptor para M-CSF, en presencia de este factor estimulador disminuyen la expresin de CD2, CD40, CD80 y CD83, y ms an de los CD86, HLA-DR y HLA-DQ, expresando a su vez altos niveles de CD9 y CD11b. Este cambio fenotpico tambin lleva a un cambio morfolgico de estas clulas, las cuales adquieren la morfologa de macrfago. Las clulas dendrticas derivadas de las poblaciones celulares CD1a+/CD14- y CD14+/ CD1a-, poseen la capacidad de inducir la proliferacin de linfocitos T CD45RA+. Las clulas dendrticas interdigitantes (CDI) y las clulas de Langerhans (CL) presentan
antgenos a los linfocitos T. Las clulas dendrticas foliculares (CDF), cuyo origen parece ser no-hematopoytico (clula madre pluripotencial mesenquimtica), presentan antgenos a linfocitos B. Ellas atrapan y almacenan complejos antgeno-anticuerpo en organelos denominados icosomas, pudiendo permanecer almacenados en esta condicin por muchos aos. Debido a la retencin antignica en la superficie celular, se produce un estado prolongado de reaccin al antgeno, que es relevante en la memoria inmunolgica. Las clulas reticulares fibroblsticas (CRF) son de origen ms bien mesenquimtico que hematopoytico, expresan actina msculo liso, y estn involucradas en el transporte de citoquinas y otros mediadores. Debido a su origen mesenquimal, las neoplasias de FRCs no son incluidas en la clasificacin OMS sobre tumores linfoides y hematopoyticos. Sin embargo, deben ser consideradas en el diagnstico diferencial de neoplasias de origen en IDCs y FDCs. 4. MORFOLOGA, LOCALIZACIN E INMUNOFENOTIPO DE CLULAS DENDRTICAS E HISTIOCTICAS Las clulas dendrticas e histiocticas se encuentran presentes, en pequeas cantidades, en todo el organismo, principalmente en rganos del sistema reticuloendotelial sangre y piel. Morfolgicamente, muchas de ellas muestran similitud con elementos celulares mieloides y linfoides, con algunos marcadores inmunofenotpicos comunes a linfocitos, aunque en general no expresan receptores de clulas T ni reordenamiento gnico de inmunoglobulinas, siendo as problemtica la deteccin de clonalidad en el diagnstico de rutina. Los macrfagos, en ndulos linfticos, se ubican a nivel sinusal, paracortical y en centros germinales. Son clulas grandes con bordes mal definidos; el citoplasma fuertemente basoflico no pironinoflico ayuda a distinguir histiocitos de clulas linfoides grandes. Su forma irregular es producto de procesos pseudopdicos y semejan clulas reticulares. Los fagocitos tienen abundantes lisosomas primarios y secundarios junto a un gran complejo de Golgi. Dependiendo de su estado reactivo, pueden incluir numerosos fagosomas y cuerpos extraos. El ncleo es oval o hendido, de cromatina fina y nuclolo inconspicuo. Su
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inmunofenotipo es: Fc y R(+), CD21(+), CD4(+), CD68(+), Lisozima(+), Fagocitosis(+), esterasas no-especficas (+), CD3(-), y CD20(-). Las clulas dendrticas interdigitantes estn presentes fundamentalmente en el paracortex de los ganglios linfticos. Son clulas grandes con ncleos profundamente indentados y nuclolo inconspicuo; el citoplasma es abundante, plido y mal definido. Cuando se encuentran en gran cantidad, producen un aspecto moteado en el rea paracortical. Al igual que las clulas de Langerhans, de las cuales parecen originarse, contienen grnulos intracitoplasmticos de Birbeck que son visibles bajo el micr oscopio electrnico. Su inmunofenotipo es: HLA-DR(+), prot S-100(+), CD21(-), CD4(-), CD3(-), y CD20(-). Las clulas dendrticas folicular es se encuentran en centros germinales de folculos linfoides y constituyen una red caracterizada por complejas prolongaciones celulares unidas por desmosomas. El citoplasma de estas clulas no es discernible por microscopa de rutina y su ncleo es grande e irregular con inconspicuo nuclolo. Su inmunofenotipo es: HLA-DR(+), prot S-100(-), CD21(++), CD4(-), CD3(-), y CD20(-). Las clulas de Langerhans son clulas dendrticas que residen principalmente en la piel, dentro del estrato suprabasal del epitelio escamoso, y constituyen cerca del 4% de las clulas epidrmicas. Las CLs tambin pueden ser encontradas en otros sitios, incluyendo: boca, esfago, pulmn, cerviz, dermis, timo y ganglios linfticos. Estas clulas miden entre 1020 mm, y son reconocidas histolgicamente por su ncleo hendido o lobulado de cromatina fina e inconspicuo nuclolo, y citoplasma amplio suavemente acidfilo. Su inmunofenotipo es: CD1a(+), prot S-100(+), CD4(+), CD21(-), CD3(-), y CD20(-). 5. CLASIFICACIN DE LA HISTIOCITOSIS Las histiocitosis fueron descritas por primera vez en 1865, con la caracterizacin de los primeros casos de histiocitosis de clulas de Langerhans. Desde entonces, una mejor comprensin de la patognesis y una mejor caracterizacin de los diversos sndromes, ha dado lugar a la identificacin de las histiocitosis como un grupo de enfermedades con un amplio espectro de presentacin clnica y severidad. La Sociedad de Histiocitosis, en conjunto con el Comit de Pr oliferaciones de Clulas Reticulares/
Histiocticas de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), r eclasific este grupo de enfermedades en 1997. Debido a que el origen de las Histiocitosis, neoplsico o reactivo, no est claro, se les separa en dos grupos: las de comportamiento biolgico variable y las verdaderamente malignas. Luego cada una de las dos categoras se subdivide en afiliacin con clulas dendrticas, macrfagos, y monocitos, esta ltima en la categora maligna (tabla 18-H-1). Slo se tratarn los desrdenes no malignos que vinculan a las clulas dendrticas y macrfagos, por considerar al resto como tema relacionado con Leucemias y Linfomas. 6. AFECCIONES RELACIONADAS CON LAS CLULAS DENDRTICAS 6.1. Histiocitosis de Clulas de Langerhans Desde su descripcin original en el siglo XIX hasta 1983, en que se le denomina Histiocitosis de clulas de Langerhans, esta histiocitosis ha recibido varias denominaciones: enfermedad de HandSchuller-Christian, enfermedad de Letterer-Siwe, granuloma eosinoflico seo, e histiocitosis X. La Histiocitosis de Clulas de Langerhans (HCL), es una enfermedad actualmente definida como una acumulacin o proliferacin de una poblacin clonal de clulas con fenotipo similar al de las CL, que ha sido arrestada en un estado temprano de activacin y que es funcionalmente deficiente. Esta enfermedad puede manifestarse como una lesin solitaria de hueso, con remisin espontnea, o con compromiso multisistmico que amenaza la vida del paciente. Afecta a hombres y mujeres por igual, a cualquier edad, pero es ms frecuentemente diagnosticada en nios (50% de los casos). Aunque existe cierta confusin relativa a una nomenclatura universalmente aceptada, la HCL es un trmino que abarca las denominaciones clsicas de Granuloma Eosinfilo, la enfermedad de Hand-Schuller-Christian y la enfermedad de Letterer-Siwe. Sin embargo, el espectro clnico de las HCL no se limita a los sndromes clsicos; estas afecciones representan variaciones en la localizacin y extensin del compromiso por un mismo proceso patolgico. Las lesiones solitarias de hueso, son halladas frecuentemente en nios de entre 5 y 15 aos de edad, y la HLC multisistmica en nios menores de 2 aos.
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Tabla 18-H-1. Clasificacin actual de las alteraciones histiocticas Alteraciones con comportamiento biolgico variable Relacionadas con clula dendrticas Histiocitosis de clulas de Langerhans Procesos secundarios de clulas dendrticas Xantogranuloma juvenil y alteraciones asociadas Histiocitomas solitarios de clulas dendrticas con fenotipos variables Tumor de clulas Dendrticas, de fenotipo especfico: interdigitantes, foliculares Relacionadas con macrfagos Sndromes hemofagocticos Linfohistiocitosis hemofagoctica primaria (familiar y espordica producida por infecciones virales) Sndromes hemofagocticos secundarios Asociados a infeccin. Asociados a procesos malignos Otros Enfermedad de Rosai-Dorfman (histiocitosis sinusal con adenopatas masivas) Histiocitoma solitario con fenotipo de macrfago Alteraciones malignas Relacionadas con monocitos Leucemias (clasificacin FAB) Leucemia monoctica M5 a y b Leucemia mielomonoctica M4 Leucemia mielomonoctica crnica Tumor o sarcoma monoctico extramedular Relacionadas con clulas dendrticas Sarcoma histioctico relacionado con la clula dendrtica (localizado o diseminado) de fenotipo especfico: clula dendrtica folicular, clula dendrtica interdigitante, etc. Sarcoma de clulas dendrticas, sin otra especificacin (NOS) Relacionadas con el macrfago Sarcoma histioctico relacionado con el macrfago (localizado o diseminado)
La prevalencia es de 2 a 5 por 1.000.000 de nios. En contraste con las CLs normales, las clulas de la HCL se encuentran en continua proliferacin, expresando ciertos marcadores antignicos. En las lesiones se encuentra una poblacin monoclonal de histiocitos CD1a+, con fenotipo similar al de CL. Otras clulas presentes en la lesin son linfocitos T, macrfagos y eosinfilos. Estudios de clonalidad de estas clulas CD1a+, podran indicar que la HLC es un desorden neoplsico con comportamiento biolgico variado y no necesariamente refleja un proceso maligno. Tanto la morfologa de las lesiones, como los
signos y sntomas clnicos sugieren que las citoquinas pueden jugar un rol importante en la patognesis de la enfermedad. Recientes estudios han demostrado una alta expresin de variadas citoquinas en las lesiones de la HCL, la mayora son producidas por clulas T, sugiriendo un importante rol de estas clulas en la enfer medad. Varias de estas citoquinas contribuyen de manera directa a las secuelas patolgicas de la HCL, ya que contribuyen a la fibrosis, resorcin sea y necrosis. La principal manifestacin de la HCL es la acumulacin de CLs, parcialmente activadas, en tejidos tales como la piel o hueso, lo que hace sospechar de un problema a nivel de trfico celular. Un modelo que intentara explicar la migracin normal de estas clulas hacia los rganos linfoides, indica que las CLs en forma
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fisiolgica expresan el receptor CCR6, cuyo ligando es la protena MIP-3/CCL20, la cual es secretada por los queratinocitos cutneos en casos de inflamacin. Cuando las CLs son atradas por el aumento de la expresin de MIP3/CCL20, son activadas por mediadores inflamatorios locales, que hacen disminuir la expresin del receptor CCR6 y estimulan la expresin de un nuevo receptor denominado CCR7, cuyos ligandos (ELC)/CCL19 y (SLC)/ CCL21 son expresados por rganos linfoides. Recientemente se demostr que las CLs de la HCL coexpresaban ambos receptores, CCR6 y CCR7. Por lo tanto la expresin de MIP-3a/ CCL20 por los queratinocitos, comprometera a la piel, y por macrfagos y osteoblastos, comprometera a los huesos. Mientras que la expresin de (ELC)/CCL19 y (SLC)/CCL21 por los rganos linfoides, comprometera a los mismos en la enfer medad. En otras enfermedades histiocticas tambin se ha observado una coexpresin de ambos receptores, lo que sugerira que esto es una caracterstica general de las histiocitosis. El nmero de CLs aumenta en los ganglios linfticos de los pacientes con enfermedades virales, lo que sugerira que la HCL representara una reaccin contra algn virus. Manifestaciones clnicas La HCL puede afectar a varios rganos diferentes, incluyendo la piel, el sistema seo, ndulos linfticos, glndula pituitaria, sistema nervioso central (SNC), hgado, bazo, tracto gastrointestinal, pulmn y mdula sea. El compromiso de la piel se ha observado en ms del 50% de los nios con HCL, y en cerca del 10% los casos se reporta como el nico sitio afectado. A menudo constituye la primera manifestacin de la enfermedad. Cualquier parte de la piel puede ser afectada. Las lesiones son escamosas y eritematosas parecidas a la dermatitis seborreica, a veces dolorosas al tacto. El sistema esqueltico es el ms frecuentemente afectado; aproximadamente el 90% de los pacientes desarrollan lesiones eas durante el curso de la enfermedad. El signo ms comn de compromiso seo es la inflamacin con dolor, siendo los huesos del crneo los ms frecuentemente afectados, seguidos por los huesos largos de la extremidad superior, y otros huesos planos como las costillas, pelvis y vrtebras.
El compromiso seo en algunos casos puede ser encontrado en forma fortuita en radiografas seas, con lesiones de tipo osteoltico. El compromiso de ganglios linfticos puede deberse a reacciones de lesiones seas o de la piel, sin embargo puede estar circunscrita a uno o ms ndulos linfticos. Los sitios comnmente afectados son las reas cervicales y la ingle, pero pueden estar afectadas otras reas. Una de las manifestaciones tardas ms reconocidas es la diabetes inspida, que ocurre en alrededor del 25% de los pacientes, generalmente de modo tardo, muchas veces sin relacin con la presencia de enfermedad activa. En aos recientes, sin embargo, ha quedado claro que la diabetes inspida es solamente una manifestacin ms de un complejo compromiso del sistema nervioso central. Las lesiones de la HCL tienen predileccin por el eje hipotalmico/hipofisario, lo que pr ovoca alteraciones de comportamiento, apetito, regulacin de la temperatura, diabetes inspida, retardo en el crecimiento, deficiencia en la produccin de hormona tirodea, pubertad precoz o retardada, amenorrea, etc. En estos casos, los estudios de resonancia magntica muestran una tpica imagen de infiltracin del tracto hipotlamohipofisario, as como ausencia del tpico punto brillante en la neurohipfisis. Una minora de pacientes desarrolla un complejo sndrome degenerativo caracterizado por ataxia y, en algunos casos, regresin intelectual. Este sndr ome degenerativo suele ocurrir tardamente, tpicamente varios aos despus de terminar el tratamiento, y no parece asociarse a enfermedad activa. Las biopsias del cerebelo en estos pacientes no muestran infiltracin de CLs, pero revelan una gliosis progresiva, que conduce a una atrofia cerebelar. La afectacin del sistema nervioso central suele estar en relacin con enfermedad sistmica o mltiples recurrencias de enfermedad poliosttica. La hepatomegalia puede ser primaria o secundaria al aumento de tamao de los ganglios linfticos en la vena porta. La ascitis causada por la hipoalbuminemia es un signo clnico de disfuncin heptica, la cual tambin puede manifestarse por ictericia y prolongacin del tiempo de protrombina. En casos de afectacin heptica severa, se produce fibrosis de las vas biliares que da lugar a colangitis esclerosante. En esos casos, la hepatopata progresa independientemente de la actividad
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de la HCL; y en muchos casos es irreversible y requiere un trasplante heptico. La esplenomegalia suele ocurrir casi exclusivamente en pacientes con afectacin sistmica, y puede estar asociada a una o ms citopenias. Con respecto al tracto gastrointestinal, los sntomas y signos ms comunes, son los vmitos, diarrea (con o sin sangre), mala absorcin, etc. El compromiso pulmonar puede darse en forma aislada o como parte de una HCL multisistmica en pacientes de menos de 2 aos. La forma aislada es casi exclusiva de los adultos, y est relacionada con el consumo de tabaco. Se han propuesto diferentes hiptesis para explicar la asociacin entre la HCL pulmonar y el tabaquismo. El humo del cigarro induce la secrecin de pptidos de clulas neur oendocrinas pulmonares (pptidos semejantes a bombesina) y de glucoprotenas. Estos pueden promover la secrecin de citoquinas, estimulando histiocitos y fibroblastos, lo que parece preceder a la fibrosis pulmonar. En estos casos, la enfermedad suele regresar al suspender el consumo de tabaco. Se manifiesta por una taquipnea con hundimiento de las costillas y tos no productiva. Los estudios radiolgicos muestran infiltrados difusos en etapas tempranas de la enfermedad y un patrn en panal de abejas con grandes bulas, e incluso neumotrax en etapas ms avanzadas; en etapas tardas hay cambios de enfisema y fibrosis intersticial. De manera similar a los cambios a largo plazo que ocurren en el hgado (y en cierta manera en el eje hipotalmico/hipofisario), la progresin de la fibrosis puede ser independiente de la presencia de enfermedad activa. Es importante reconocer que la HCL pulmonar aislada de los adultos no es una enfermedad clonal como el resto de sndromes; es claramente reactiva y en la prxima clasificacin de la Sociedad del Histiocito, esta forma clnica va a ser excluida del grupo de las histiocitosis. Las CLs no parecen ser un constituyente normal de la mdula sea, aunque otras clulas dendrticas pueden hallarse. La pancitopenia tiene un origen multifactorial. Por un lado, si bien puede no haber una infiltracin franca de la mdula sea por CL, existe disfuncin hematopoytica, seguramente como consecuencia de la disregulacin inmunolgica. Por otra parte, las alteraciones hematolgicas
estn asociadas con la hepatoesplenomegalia. La afectacin del sistema hematopoytico tiene un claro valor pronstico adverso. Los pacientes con enfermedad localizada (piel, hueso, ndulo linftico) tienen buen pronstico, y la mayora de las veces no requieren ningn tratamiento. Por otro lado los que presentan compromiso multisistmico, generalmente nios de menos de 2 aos, tienen peor pr onstico. Debido a la variedad de presentaciones clnicas y de comportamiento biolgico, la Sociedad del Histiocito ha propuesto un sistema de estadiaje en el que se incluyen el nmero de rganos (enfermedad unisistmica o multisistmica) y el compromiso de los llamados rganos de riesgo (sistema hematopoytico, hgado, bazo, y pulmn). Pacientes con afectacin de uno de estos cuatro sistemas son considerados de alto riesgo y requieren tratamiento ms intensivo. Si bien clsicamente la edad (menos de 2 aos) ha sido considerada un factor de pronstico adverso, los resultados del estudio LCH-II demuestran que no lo es como factor independiente. Diagnstico Todo paciente con sospecha de una HCL, debe ser sometido a una gran variedad de exmenes de laboratorio y de imagenologa. Inicialmente se debe hacer una evaluacin clnica del paciente (temperatura, peso, talla, presencia de linfoadenopatas, lesiones de encas, tamao del hgado y bazo, fiebre, anorexia, diarrea, rash cutneo, falta de crecimiento, etc.). Las pruebas de laboratorio mnimas que se requieren son: Hemograma/VHS, niveles de: hierro srico, transferrina, ferritina srica, perfil heptico y renal, pruebas de coagulacin, radiografas de trax y de esqueleto, y osmolaridad urinaria. Si hay evidencia de una HCL multisistmica se requiere de aspiracin de mdula sea con tincin para CD1a y tipificacin HLA. De acuerdo a los resultados de laboratorio y antecedentes clnicos se prosigue con otros exmenes ms especficos: Tomografa computacional (TC) de alta resolucin, pruebas de funcin respiratoria, biopsia pulmonar y un lavado bronco alveolar, biopsia intestinal, biopsia heptica, imgenes de resonancia magntica (IRM)), evaluacin neurolgica y test psicolgicos, pruebas para evaluacin endocrina, radiografas dentales, audiograma. El diagnstico definitivo de HCL se basa en pruebas inmunohistoqumicas de biopsias que
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revelan la positividad para CD1a o microscopia electrnica que muestra la presencia de grnulos de Birbeck. Una histologa compatible, con positividad para CD1a es diagnstica de HCL; no es necesario realizar microscopia electrnica en esos casos. Para realizar un buen diagnstico es importante tomar una biopsia adecuada, fijando el tejido
en medio pr opicio. La mayora de los anticuerpos anti-CD1a necesitan de tejidos frescos y congelados. Para evitar realizar nuevas biopsias, el tejido obtenido debe ser repartido en bloques para congelar unos, conservar otros y estudiar por microscopia electrnica los restantes. Otros marcadores de CLs, incluyendo los ya nombrados se indican en la (tabla 18-H2).
Tabla 18-H-2. Fenotipo de Clulas de Langerhans y Clulas de la HCL Clulas de Langerhans Activada + + + + + + +
Marcador HLA DR CD1a Grnulos de Birbeck CD4 B7 Receptor IL-2 S100

HCL, Histiocitosis de Clulas de Langerhans
Normal + + + +
Clulas HCL + + + + + + +
Tratamiento El tratamiento que reciben los pacientes depende del tipo de compromiso orgnico que presentan, basndose en pruebas de laboratorio y nmero de rganos comprometidos. As los enfermos se pueden clasificar en tres grupos: (a) pacientes con riesgo multisistmico (afectacin de rganos de riesgo), (b) pacientes con bajo riesgo multisistmico (sin afectacin de rganos de riesgo), y (c) pacientes con compromiso de un solo sistema Enfermedad multifocal sea y con compromiso localizado sitio especial. La definicin de sitio especial incluye la afectacin de cuerpo vertebral con compr omiso radicular, y pacientes con enfermedad de crneo, en un grupo de huesos del macizo facial que han sido considerados de mayor riesgo de desarrollar enfermedad en el sistema nervioso central. Segn el compromiso orgnico se utilizan protocolos quimioteraputicos. Para pacientes con enfermedad sea solitaria, el curetaje de la lesin es suficiente. Pacientes con enfermedad sea multifocal requieren tratamiento sistmico. Generalmente, un tratamiento con prednisona y vinblastina por 6 meses es efectivo. El protocolo actual de la Sociedad del Histiocito (LCH-III) recomienda tratamiento con una
induccin de 6 semanas con prednisona diaria y vinblastina semanal, seguida de un tratamiento de mantenimiento con pulsos de vinblastina y prednisona cada tres semanas hasta completar 6 meses. Pacientes con enfer medad multisistmica de bajo riesgo (sin afectacin de los rganos de riesgo anterior mente nombrados) son curables con el mismo tratamiento de prednisona y vinblastina. El problema en estos pacientes es la alta incidencia de recadas (entre un 30 y un 40% de casos), por lo que pueden ser indicados tratamientos ms prolongados. El protocolo LCH-III est randomizando a los pacientes a recibir tratamiento por 6 12 meses. Para los pacientes con enfermedad multisistmica de alto riesgo es necesario un tratamiento ms agresivo, dado que la mortalidad es cercana al 40% En el protocolo LCH-II se evalu de manera randomizada la incorporacin de etopsido a un tratamiento basado en prednisona, vinblastina, y 6mercaptopurina. Los resultados de dicho protocolo no demostraron ninguna ventaja de la adicin de etopsido. En el protocolo actual LCH-III, estos pacientes van a ser randomizados a recibir metotrexate, a dosis intermedias durante la induccin, y a dosis bajas durante el mantenimiento, junto a un esquema clsico de prednisona, vinblastina, y 6-mercaptopurina.
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El tratamiento de los pacientes en recada depende del grado de afectacin. Para pacientes con recadas seas, un tratamiento similar al recibido inicialmente todava puede ser efectivo. Otra alternativa es la administracin de dosis bajas semanales de metotrexate con 6-MP diaria. Debido a que las lesiones lticas seas son debidas en parte a la activacin de los osteoclastos por la liberacin de citoquinas, el uso de indometacina o bifosfonatos ha demostrado ser eficaz. Para pacientes con mltiples recadas, o pacientes con enfermedad multisistmica, la 2-clorodeoxiadenosina, sola o combinada con ara-C, puede inducir remisiones. Finalmente, debido al origen hematopoytico de las clulas de Langerhans, el trasplante de alognico de clulas madre debe ser considerado en aquellos casos refractarios. 6.2. Proceso secundario de clulas dendrticas No todas las proliferaciones de las clulas dendrticas, particularmente de las CLs, son HCL. CLs reactivas han sido descritas en ndulos linfticos afectados con linfomas malignos, en timo con miastenia gravis, y en asociacin con otros tumores. Esta observacin no tiene r elevancia clnica ya que no existe una propagacin de CDs en otros rganos. 6.3. Xantogranuloma juvenil y afecciones asociadas El xantogranuloma juvenil (JXG), es una afeccin familiar auto-curativa, de muy baja frecuencia, que se presenta en la infancia. Se manifiesta por compromiso cutneo semejante a la HCL y puede presentar mltiples ndulos subcutneos, no asociados a problemas de colesterol. La histopatologa est caracterizada por un componente formado, en proporciones variables, de histiocitos (algunos de los cuales son xantomatosos) y por clulas gigantes tipo Touton. Estas lesiones han sido asociadas con otras patologas tales como Neurofibromatosis, Leucemia Mieloide Crnica, HCL y rara vez en la Enfermedad de RosaiDorfman. El fenotipo de las clulas encontradas en estas lesiones generalmente es S100-, Fascina +, Factor XIIIa +, CD68 +, Ki-M1P + y CD1a -. Algunos reportes han informado que el JXG puede afectar a tejidos profundos, y al igual que otras dolencias sistmicas compromete mltiples sitios incluyendo vsceras. El JXG puede ser diagnosticado por los hallazgos histopatolgicos, y confirmados por la caracterstica fenotpica anteriormente descrita.
6.4. Histiocitomas solitarios de clulas dendrticas con fenotipos variables, dendrocitomas Son lesiones de la piel, formadas por clulas de fenotipo indeter minado, generalmente descritos en adultos. Se han reportado dos formas clnicas. La primera es una lesin localizada en el tejido subcutneo que es curada por escisin. La segunda es una lesin menos circunscrita, o manifestada por mltiples ndulos que pr ogresan con serias consecuencias. Esta ltima forma ha sido encontrada principalmente alrededor de la cabeza, cuello e intracranealmente. Las lesiones a primera vista se parecen mucho a las lesiones de la HCL, pero el fenotipo es diferente. Las clulas son CD1a+, con escaso o ningn grnulo de Birbeck, y variablemente son S100+, CD68+ y Factor XIIIa+, expresando fuertemente fascina. 7. AFECCIONES RELACIONADAS CON LOS MACRFAGOS 7.1. Sndromes hemofagocticos Son sndromes caracterizados por la proliferacin de clulas mononucleares fagocticas no malignas: monocitos y macrfagos que se mezclan con linfocitos en todo el sistema fagoctico mononuclear (SFM) (mdula sea, bazo, hgado y ganglios linfticos). Su presentacin clnica ms caracterstica es: fiebre prolongada, hepatoesplenomegalia y citopenias. Pueden aparecer sntomas neurolgicos. La principal forma de este sndrome es la Linfohistiocitosis Hemofagoctica Familiar (LHF), que se presenta comnmente durante los primeros meses de vida y que tiene una sobreviva promedio, sin tratamiento, de 2 meses desde el comienzo de la enfermedad. Es de herencia autosmica recesiva, y se caracteriza por un sndrome hiperinflamatorio severo con activacin de macrfagos y linfocitos T. En el origen del sndrome se encuentra una deficiencia severa de la actividad de las clulas natural killer y los linfocitos citotxicos. Se distinguen tres tipos de LHF (tipos 1 3). En un 30-40% de los pacientes, esta deficiencia es debida a una mutacin del gen de la perforina (LHF tipo 2). La perforina se colocaliza con la granzima B en los grnulos de las clulas citotxicas, y es secretada en el momento de la interaccin entre la clula diana y la clula
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efectora. La perforina es una protena similar a las protenas del complejo del complemento, que da lugar a la formacin de poros en la clula diana, ocasionando muerte celular por osmosis y la entrada de la enzima proteoltica granzima B. Su patrn de transmisin es de tipo autosmico recesivo, los portadores suelen tener niveles inferiores de perforina, pero ello no resulta en disfuncin inmunolgica. En un 30-35% de los casos, existe una mutacin del gen hMunc 13-4 (LHF tipo 2). Hmunc 13-4 es esencial en el proceso de formacin de los grnulos citotxicos que precede a la fusin de la vescula con la membrana, y su deficiencia da lugar a una exocitosis granular deficiente. En el 30-40% restante de casos, la base molecular de la enfermedad no se conoce (LHF tipo 1). Como resultado de estos dficit, los pacientes suelen desarrollar una reaccin hiperinflamatoria compensatoria (y por falta de retroalimentacin negativa), generalmente en respuesta a una infeccin durante los primeros meses de vida, lo cual da lugar a una hiperactivacin de los macrfagos. Dicha activacin macrofgica resulta en una infiltracin de rganos y hemofagocitosis. Por otra parte, la liberacin descontrolada de citoquinas, como IL-2 e interferones causa elevada fiebre, fallo capilar (edema, derrames pleurales, ascitis) y fallo heptico. Una segunda forma es el llamado Sndrome Hemofagoctico asociado a virus (SHAV), que puede afectar a todas las edades y que al igual que la LHF, est asociado a una alta mortalidad. Se caracteriza por tener como antecedente una infeccin generalmente viral (Epstein Barr, Citomegalovirus, Adenovirus). En este caso, la infeccin viral no controlada da lugar a una activacin mantenida del sistema macrofgico. De manera similar al SHAV, existen otros sndromes hemofagocticos secundarios a otras enfermedades, principalmente enfermedades neoplsicas. Epidemiologa . Alrededor del 70% de los pacientes con LHF la desarrolla antes del ao de edad. La incidencia ha sido estimada en 1.2 por 1.000.000 de nios nacidos vivos, por ao, afectando a hombres y mujeres por igual. El SHAV y los sndromes secundarios suelen aparecer ms tardamente. Signos y sntomas comunes. Los hallazgos ms comunes de los Sndromes Hemofagocticos son la fiebre alta y la hepatoesplenomegalia. Tambin se describen adenopatas, rash cutneo, ictericia y edema. Una proporcin
importante de nios con LHF desarrollan afectacin del sistema nervioso central, caracterizada por estupor progresivo, y en algunos casos meningismo. La incidencia de afectacin del sistema nervioso central es mayor en aquellos pacientes en los que el diagnstico no se realiza a tiempo. Laboratorio. Al comienzo la enfermedad se caracteriza por las citopenias (trombocitopenia, anemia y en menor grado neutropenia). El aumento de la actividad de las transaminasas hepticas indica la infiltracin heptica de la enfer medad as como la toxicidad de la hiper citoquinemia sobre el parnquima heptico. Es muy tpica la elevacin de la dehidrogenasa lctica, cuya monitorizacin es muy importante para evaluar la respuesta al tratamiento y anticipar recadas. Es muy tpico de los sndromes hemofagocticos la presencia de hipertrigliceridemia, que es secundaria a la inhibicin de la lipoprotein lipasa por los elevados niveles de interfern. Otros hallazgos sricos incluyen aumento de ferritina, hiponatremia y disminucin de protenas como la albmina. Una proporcin importante de pacientes presentan pleocitosis. Con el transcurso de la enfermedad aparecen los pr oblemas de coagulacin, producto, principalmente, de la hipofibrinogenemia. El hallazgo de ausencia de funcin de clulas NK es diagnstico de la enfermedad. Histopatologa y Citologa. El principal hallazgo es una acumulacin linfohistioctica, no maligna, en el SFM. Los histiocitos aparecen activados y la hemofagocitosis es un hallazgo esencial, pero no especfico. La hemofagocitosis ms comnmente afecta a los eritrocitos pero tambin ocasionalmente a las plaquetas y a los leucocitos. Los rganos ms frecuentemente comprometidos son el hgado, bazo, ndulos linfticos, mdula sea y SNC. No hay hallazgos histolgicos y/o citolgicos que sean especficos de un Sndrome Hemofagoctico. El diagnstico se basa en investigaciones clnicas y de laboratorio, incluyendo estudios de la actividad de clulas NK, y estudios genticos. Si en una primera observacin de mdula sea no hay evidencia de hemofagocitosis, no se debe excluir la posibilidad de un Sndrome Hemofagoctico. Diagnstico diferencial. Generalmente se plantea diagnstico diferencial para leucemias, linfomas, anemia aplsica, y sndromes mielodisplsicos. Por otro lado, existen enfermedades que pueden desarrollar un sndrome macrofgico activo debido
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a fallos en el sistema de inmunidad celular, tales como el Sndrome Linfoproliferativo ligado a X, el Sndrome de Chdiak-Higashi y el Sndrome de Griscelli. El diagnstico se basa en los hallazgos clnicos, de laboratorio e histopatolgicos. Es importante destacar que el diagnstico en los sndromes hemofagocticos es ante todo de sospecha. Es comn que la primera examinacin de la mdula sea no revele hemofagocitosis. De hecho, es ms efectiva la biopsia heptica que el aspirado de mdula sea. Desafortunadamente, la
situacin clnica de estos pacientes es tal que no est indicada la biopsia heptica. Por lo tanto, la decisin de iniciar tratamiento debe ser tomada sin documentacin histolgica en muchas ocasiones; la severidad del cuadro clnico es tal que la impresin clnica debe dictar el comportamiento a seguir, de lo contrario solamente cabe esperar un empeoramiento progresivo e irreversible. El diagnstico de LHF se puede establecer si por lo menos uno de los dos criterios est presente: Diagnstico molecular consistente con LHF o por lo menos 5 de los 8 criterios indicados en la tabla 18-H-3.
Tabla 18-H-3. Criterios diagnsticos para LHF (segn la Sociedad del Histiocito) Criterios clnicos Fiebre Esplenomegalia Criterios de laboratorio Citopenias (afectando 2 de 3 lneas en sangre perifrica): Hemoglobina (<9 g/dL), plaquetas (<100x109/L), neutrfilos (<1.0x109/L) (En recin nacidos < 4 semanas, Hemoglobina <10 g/dL). Hipertrigliceridemia y/o hipofibrinogenemia (Triglicridos 265 mg/dL), fibringeno (1.5 g/L) Histopatologa Hemofagocitosis en mdula sea, bazo o ganglios linfticos, sin evidencia de malignidad. Nuevos criterios: Actividad de clulas NK baja o ausente Ferritina srica 500 g/L Niveles de CD25 soluble (receptor de IL-2) 2400 U/mL
Tratamiento. El tratamiento de los sndromes hemofagocticos debe contemplar tres componentes: a) Correccin de la hiperactivacin macrofgica y la tormenta de citoquinas causante de la severidad del cuadro; para ello los pacientes deben recibir una induccin con dosis altas de dexametasona, durante 6 a 8 semanas, a la vez que se inicia ciclosporina, que se mantendr por varios meses; b) Citorreduccin de macrfagos, mediante el uso de quimioterapia, generalmente etopsido, una droga de gran actividad frente a clulas del sistema monoctico y macr ofgico; se r ecomienda una citorreduccin agresiva durante las semanas de induccin, con pulsos cada tres semanas en la
fase de mantenimiento; y c) Correccin del defecto inmune; que suele ser autolimitado en los casos de SHAV, pero que require trasplante alognico de progenitores hematopoyticos en los casos de LHF. Hay que tener en cuenta que hay que monitorizar la afectacin del sistema nervioso central. En aquellos pacientes con pleocitosis al diagnstico, est indicada la quimioterapia intratecal hasta la normalizacin. 7.2. Retculohistiocitoma y Retculohistiocitosis multicntrica Los Retculohistiocitomas Drmicos solitarios o mltiples, son lesiones inusuales que han sido descritas en recin nacidos, per o ms
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comnmente en hombres adultos jvenes, en cualquier sitio del cuerpo. La Retculohistiocitosis Multicntrica es una enfermedad del adulto y que compromete a la piel, huesos, articulaciones y muy raramente a los ganglios linfticos. Estas lesiones estn formadas por clulas grandes, ricas en citoplasma homogneo y cristalino, que se tie levemente con PAS. Estudios inmunohistoqumicos confirman la naturaleza macrfago de las clulas. 7.3. Enfermedad de Rosai-Dorfman La Histiocitosis Sinusal con Linfoadenopata Masiva (Enfermedad de Rosai-Dorfman) se describe como una proliferacin histioctica poco frecuente, definida habitualmente por los hallazgos histolgicos como una histiocitosis idioptica segn los datos recogidos en la literatura. Se presenta ms frecuentemente en las primeras dcadas de la vida. La afeccin se caracteriza por la presencia de linfoadenopatas indoloras, sobre todo en la regin cervical. Aproximadamente un 50% de los pacientes tienen afectacin extranodal, que es exclusiva (sin afectacin ganglionar) en muchos de ellos, lo cual hace el diagnstico de esta enfermedad ms difcil. La afectacin extraganglionar parece limitarse a las estructuras de la cabeza y cuello. Tpicas son la infiltracin de rbitas, afectacin intracraneal (similar a meningiomas), y la afectacin de estructuras del sistema digestivo y respiratorio alto. Histolgicamente, la arquitectura linfoganglionar est alterada por marcada dilatacin sinusal con borramiento de folculos y centros ger minales; los senos distendidos y ectsicos se encuentran ocupados por una poblacin celular polimorfa donde destacan histiocitos grandes con acentuada fagocitosis de linfocitos, eritrocitos o neutrfilos. A diferencia de los sndromes hemofagocticos, no existe digestin de las clulas fagocitadas, que se encuentran ntegras en el citoplasma del histiocito, un fenmeno conocido como emperipolesis. Citolgicamente, los frotis por
aspiracin con aguja fina son densamente celulares, con muchos histiocitos, linfocitos fagocitados y un background de leucocitos reactivos. Se ha demostrado que el proceso no es clonal. Aunque se le clasifica como una afeccin que afecta a los macrfagos, estas clulas son an ms complejas, tienen ciertas enzimas y marcadores de macrfagos; esterasas y fosfatasas en gran cantidad, CD68 y alfa-1antitripsina, respectivamente. Sin embargo comparten marcadores tpicos de las clulas dendrticas: S100, E catepsina, Fascina, y en ocasiones tambin expresan CD1a. De acuerdo a estas caractersticas, estas clulas se asemejan ms a las CDs sinusales. La mayor parte de casos de Rosai-Dor fman se resuelven espontneamente. En aquellos casos sintomticos puede ser necesario el tratamiento sistmico. Los corticoides son la primera lnea de tratamiento, aunque las respuestas no suelen ser muy notables. Diversas combinaciones de quimioterapia han sido evaluadas, aunque las respuestas son anecdticas. Finalmente, en casos con compresin de estructuras vitales est indicada la ciruga. A modo de resumen el diagnstico de las Histiocitosis contina siendo fundamentalmente de tipo histopatolgico o citolgico. Las clulas que se presentan en uno u otro desorden, son la base para definir la enfermedad, por ej. las clulas dendrticas tipo Langerhans, son el sine qua non de la HCL; clulas dendrticas drmicas e intersticiales son las responsables del JXG e Xantoma diseminatum; los macrfagos son las clulas predominantes de los sndromes hemofagocticos, etc. La inmunohistoqumica es un importante aporte al diagnstico. Usando un amplio panel de anticuerpos que reconocen distintos marcadores de clulas dendrticas, se obtiene el tipo celular predominante en una lesin, y por ende define a la enfermedad involucrada (tabla 18-H-4).
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Tabla 18H-4. Clulas involucradas en las Histiocitosis Histiocito Clula de Langerhans Clulas indeterminadas Clulas dendrticas activadas Clulas dendrticas interdigitantes Dendrocitos dermales e intersticiales Clulas dendrticas foliculares Clulas dendrticas sinusales Macrfago Fenotipo CD1a, Langerina, S100, Grnulos de Birbeck CD1a, Langerina, S100 HLA-II, Fascina,CD68, S100 Fascina, S100, CD83, DC-Lamp Desorden Histiocitosis de clulas de Langerhans. Histiocitoma de clulas dendrticas / tipo clula indeterminada. Histiocitoma de clulas dendrticas / tipo clula activada. Hiperplasia de clulas dendrticas e histiocitoma de clulas dendrticas, tipo clula interdigitante. Xantogranuloma familiar, xantoma diseminatum. Histiocitoma de clulas dendrticas/tipo clula dendrtica folicular. Posible enfermedad de RosaiDorfman. Desrdenes hemofagocticos
Factor XIIIa, Fascina; CD68 CD21, Ki-M4, DC35, S100+/-, Fascina Ki-M9, Fascina, CD68, S100 CD68, LN5
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HEMATOLOGA
SECCIN IV
HEMOSTASIA Y TROMBOSIS
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HEMATOLOGA
Captulo
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HEMOSTASIA PRIMARIA
Mara Teresa Santos D., Eduardo Aranda L., Juana Valls G. e Ivn Palomo G.
1. Introduccin 2. Aspectos generales de la Trombopoyesis 3. Estructura de las plaquetas 3.1. Membrana de las plaquetas 3.1.1. Glicoprotenas 3.1.2. Receptores no glicoproticos 3.2. Grnulos plaquetarios 3.2.1. Grnulos alfa 3.2.2. Grnulos densos 3.3. Citoesqueleto plaquetario 3.4. Sistema de membrana interno 3.4.1. Sistema canicular abierto 3.4.2. Sistema tubular denso 4. Envejecimiento y remocin plaquetaria 4.1. Fenmenos asociados con el envejecimiento de las plaquetas en la circulacin 4.1.1. Densidad 4.1.2. Contenido granular 4.1.3. Membrana plaquetaria 4.2. Remocin fisiolgica de plaquetas 4.2.1. Mecanismo inmune de remocin plaquetaria 4.2.2. Mecanismos no inmunes de remocin plaquetaria
5. Formacin del trombo plaquetario 5.1. Adhesin y extensin de las plaquetas 5.2. Agregacin plaquetaria 5.3. Secrecin y reclutamiento 5.4. Consolidacin del trombo 6. Secuencia bioqumica de activacin plaquetaria 6.1. Receptores plaquetarios que participan en la transduccin de seales 6.2. Protenas G 6.3. Fosfolipasa C 6.4. Calcio 6.5. Fosfolipasa A2 6.6. Fosforilacin de protenas en las plaquetas 6.6.1. Protena kinasa C 6.6.2. MAP kinasas 6.6.3. Tirosina kinasas 6.6.4. Fosforilacin en tirosina y funcin plaquetaria 6.6.5. Sealizacin a travs de GPIIbIIIa 6.7. Kinasas lipdicas 6.8. Fosforilacin de protenas e inhibicin plaquetaria 6.9. Reorganizacin del citoesqueleto.
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Resumen
La hemostasia primaria, es parte de un proceso ms amplio como es la hemostasia que impide el sangramiento anormal. La hemostasia primaria incluye la fase de vasoconstriccin y la fase endotelialtrombocitaria. En este captulo se abordar, principalmente, la segunda fase que tiene como resultado la formacin de un tapn plaquetario. En el captulo se aborda bsicamente los siguientes aspectos: la trombopoyesis (brevemente pues es tratado en el captulo 1), la estructura plaquetaria, el envejecimiento y los mecanismos que condicionan la remocin de las plaquetas desde la circulacin por parte del sistema fagoctico mononuclear, los fenmenos de adhesin, extensin, secrecin y agregacin plaquetaria, y finalmente se abordan las molculas y procesos bioqumicos que ocurren durante la activacin plaquetaria.
1. INTRODUCCIN La hemostasia es un proceso complejo que permite prevenir, de forma continua, la prdida espontnea de sangre y detener la hemorragia causada por daos al sistema vascular; implica la hemostasia primaria, la hemostasia secundaria (coagulacin) y la fibrinolisis. La hemostasia primaria incluye la fase de vasoconstriccin y la fase endotelialtrombocitaria. La fase de vasoconstriccin puede aclararse ms al indicar que cuando se produce una herida o incisin en la piel, la prdida de sangre es mnima al comienzo, aumentado despus, progresivamente. Esto obedece a que se produce una vasoconstriccin local rpida, por estimulacin directa de los nervios simpticos existentes en la pared de los vasos. La fase endotelial-trombocitaria que tiene como resultado la formacin de un tapn inestable de plaquetas (3-5 minutos); en esta etapa adems tiene lugar una vasoconstriccin por estmulo qumico, provocada por sustancias vasoconstrictoras liberadas desde los grnulos plaquetarios, como la serotonina, o sintetizadas por las plaquetas activadas como el tromboxano A2. Por su parte la coagulacin (ver captulo 20) corresponde a una cascada de activacin proteoltica de factores plasmticos que conducen a la formacin de trombina la cual actuando sobre el fibringeno permite la formacin de fibrina; la estabilizacin y fijacin del cogulo ocurre en 5-10 minutos.
El restablecimiento de la situacin hemosttica normal ocurre en 48-72 horas; este proceso incluye la fibrinolisis (ver captulo 20) que corresponde a la destruccin enzimtica de la red de fibrina. A modo de informacin preliminar, las plaquetas son elementos celulares anucleados que se originan por fragmentacin del citoplasma de los megacariocitos en la mdula sea, desde donde pasan a la circulacin, permaneciendo all alrededor de 8 das antes de ser removidas por el sistema fagoctico mononuclear (SFM). Las plaquetas son participantes esenciales en el proceso de hemostasia primaria. Estas clulas circulan normalmente como elementos de forma discoide, y en respuesta a un dao vascular sufren cambios de forma, emiten seudopodios, secretan el contenido de sus grnulos y remodelan su membrana. La principal funcin de las plaquetas es evitar la prdida de sangre por adhesin a la pared del vaso daado e interaccin con otras plaquetas, formando la base del tapn hemosttico. Este proceso involucra fenmenos de adhesin, secrecin y agregacin plaquetaria, estrechamente relacionados entre s. Adems, para producir una hemostasia completa, es necesaria la activacin del sistema de la coagulacin, que da lugar a la generacin de trombina y a la transformacin de fibringeno en fibrina, que estabiliza el tapn hemosttico. Las plaquetas activadas tambin contribuyen a la generacin de trombina proporcionando una superficie cataltica donde se ensamblan factores de la
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coagulacin plasmticos y/o liberados por las propias plaquetas activadas. 2. ASPECTOS GENERALES DE LA TROMBOPOYESIS Todas las clulas hematopoyticas derivan de las clulas pluripotentes (stem cells) con capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en cualquier clula sangunea (ver captulos 1 y 2). Las plaquetas se originan por fragmentacin del citoplasma de los megacariocitos que residen en la mdula sea, en un proceso biolgico nico que resulta en clulas anucleadas, las que pasan a la circulacin sangunea. 2.1. Estadios madurativos Los precursores megacariocticos no pueden ser distinguidos morfolgicamente de otras clulas precursoras de la mdula sea. El estadio BFU: MK requiere 21 das para dar origen a CFUMK (unidad for madora de colonias megacariocticas) un estadio que en alrededor de 11 das da origen al progenitor ms maduro, LD-CFU-MK (LD, baja densidad) da origen a algunas colonias de megacarioblastos con baja celularidad y alto contenido de DNA; esto ltimo ocurre porque disminuye la multiplicacin celular y aumenta la endocitosis. Las clulas de los estadios BFU-MK y CFU-MK son CD34+, no as LD-CFU-MK. Los megacarioblastos son las clulas de transicin entre precursores y las clulas reconocibles morfolgicamente. Es una clula pequea de 18 m de dimetro, mononuclear, expresa marcadores especficos, pero an no es r econocible mor folgicamente. Los promegacariocitos son de mayor tamao (20 m). Se observa el sistema de demarcacin de membrana (SDM) poco desarrollado, presenta abundantes ribosomas y el ncleo comienza a lobularse. El ncleo en algunos casos se observa en forma de herradura, el citoplasma es basfilo y abundante. Los megacariocitos granulares continan aumentando de tamao (35 m) y representan alrededor del 55% de la poblacin megacarioctica en mdula sea. Finalmente los megacariocitos maduros, las clulas ms grandes de la mdula sea (50-80 m), se caracterizan por presentar ncleo multilobulado y poliploide, citoplasma acidfilo, con pocas mitocondrias, SDM desarrollado y grnulos citoplasmticos. El proceso de maduracin megacarioctica
demora 10 das. Los megacariocitos maduros representan el 0.02-0.05% de la poblacin celular total en la mdula sea. El nmero normal de megacariocitos maduros es de 6.1x 106/ Kg y presenta una ploida de 16N. En el feto, se han encontrado en hgado, bazo y mdula sea. En adulto los megacariocitos se pueden detectar en todos los rganos mayores pero preferentemente en la mdula sea. El desarrollo de la ploida durante la maduracin est dada por divisiones nucleares sucesivas sin divisin celular (endomitosis); el ncleo se divide a razn de mltiplos de 2 (2N, 4N, 6N, etc.). El modelo clsico de ploida es 16N, con tres ciclos endomitticos. Desde el segundo estadio madurativo (promegacariocitos) con un contenido de 8N, los megacariocitos son capaces de dar origen a plaquetas; dependiendo de la ploida dan origen a plaquetas con distinta forma y densidad. Un megacariocito es capaz de producir entre 1000 y 5000 plaquetas (pr oduccin proporcional a ploida); el ncleo y citoplasma restante son fagocitados por macrfagos cercanos. La liberacin de plaquetas a la circulacin se explica por dos modelos: (a) en el modelo proplaquetas el SDM organizara el citoplasma de tal forma que formara un seudopodio, que a travs de los sinusoides se extiende a circulacin y por efecto de la misma se fragmentara y liberara plaquetas a circulacin y (b) en el segundo modelo el SDM no organiza el citoplasma pero es igualmente importante, ya que se fragmenta la membrana redundante y se liberan plaquetas. 2.2. Regulacin La regulacin del proceso megacarioctico se realiza por un mecanismo humoral en el que se responde al nmero de plaquetas en circulacin. En este pr oceso participa una serie de citoquinas, siendo la ms importante la trombopoyetina (TPO). La TPO es una glicoprotena de 15-48 kDa que se produce en el hgado y riones, siendo el primero el lugar de mayor produccin. La TPO es sintetizada en forma constitutiva y liberada a la circulacin segn la unin a su receptor (cMPL). La TPO (c-MPL ligand) presenta un 75% de homologa en la secuencia aminoacdica, con la eritropoyetina.
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La TPO se une al receptor c-MPL ubicado en los megacariocitos, estimulando as la maduracin megacarioctica con el consiguiente aumento de ploida y maduracin citoplasmtica. El cMPL estimula segundos mensajeros que activan la tirosina kinasa JACK2 y la fosforilacin de protenas que activan la trascripcin STAT. Las JACKs tirosinas kinasas de la familia de las JANUS kinasa no tienen actividad tirosina kinasa intrnseca por lo que deben unirse a otras protenas kinasas (PTK). La activacin de JACK lleva a la fosforilacin de protenas estimuladoras y activadoras de la transcripcin, las llamadas STAT; stas una vez fosforiladas pueden traslocarse al ncleo de la clula y activar la transcripcin. 3. ESTRUCTURA DE LAS PLAQUETAS Las plaquetas (trombocitos) son elementos celulares anucleados de 1.5-3 m de dimetro y en reposo presentan una forma discoide. Como antes se indic se originan por fragmentacin del citoplasma de los megacariocitos. Los principales componentes de las plaquetas son la membrana plasmtica, los grnulos, el citoesqueleto y el sistema de membrana interno (los sistemas canicular abierto y el sistema tubular denso), existen tambin otras estructuras tales como lisosomas, grnulos de glicgeno y mitocondrias, y ocasionalmente inclusiones de lpidos (figura 19-1).
3.1. Membrana plaquetaria La membrana plasmtica de las plaquetas es considerada de importancia crtica en la fisiologa de la hemostasia. Posee una serie de receptores funcionales especficos y adems durante la agregacin y transfor macin plaquetaria provee de una superficie esencial para la aceleracin de la coagulacin sangunea (fosfolpidos de membrana). Media en las interacciones con el medio externo y contiene las estructuras que permiten la transmisin de seales bioqumicas (activantes o inhibidoras) al interior de la clula. Durante el proceso de secr ecin, se pr oduce la fusin de las membranas de los grnulos intraplaquetarios con la membrana plasmtica a travs del sistema canalicular abierto, lo que permite la exposicin de antgenos internos en la superficie de la plaqueta. Por ejemplo la P-selectina de los grnulos alfa o la GP53 de la membrana de los lisosomas, haciendo que la membrana de la plaqueta dependa del grado de activacin de la clula. Este aspecto se pone tambin de manifiesto en lo que se refiere a la composicin de los fosfolpidos. En las plaquetas, al igual que las membranas plasmticas de otras clulas, la membrana plaquetaria est formada por una doble capa fosfolipdica con una distribucin asimtrica que se transforma por la activacin celular. 3.1.1. Lpidos Alrededor del 23% del peso seco de las plaquetas humanas corresponde a lpidos, porcentaje del cual un 75-80% son fosfolpidos (FL) y el resto son lpidos neutros (triglicridos, colesterol libre y esterificado y cidos grasos libres), presentes en distintas proporciones. Los FL estn constituidos por fosfatidlcolina (PC) (38,98% de los FL totales), fosfatidletanolamina (PE) (28,90%) esfingomielina (SP) (14,98%), fosfatidlserina (PS) (19,97%) y fosfatidlinositol (PI) (5,99%). Tambin se detectan, en menores cantidades cardiolipina, lisolecitina y otros fosfoinostidos.
Figura 19-1. Principales componentes estructurales de las plaquetas.
Entre los principales componentes de las plaquetas humanas, expresado como peso hmedo se incluyen: agua 77%, protenas 14.8%, lpidos 4.98%, carbohidratos 1.94%, RNA 0.20%, aminocidos 0.59%, nucletidos de adenina 0.20% y glutatin reducido 0.23%.
Como se ha indicado, los fosfolpidos se encuentran formando una bicapa, con los grupos polares orientados hacia el citoplasma o hacia la superficie externa de la clula y las zonas no polares en el centro de la bicapa. Los fosfolpidos presentan una distribucin asimtrica en la membrana: la SP se encuentra, predominantemente, en la capa externa, la mayor parte de PS y PI se encuentran solo en la
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parte interna en las plaquetas en reposo, mientras que la PC y PE se encuentran en las dos caras de la bicapa. La disposicin de los fosfolpidos en la membrana tiene una importancia funcional. La localizacin de los fosfoinostidos en la capa interna facilita su hidrlisis por la fosfolipasa C para formar diacl glicerol e inositol trifosfato, importantes mediadores de la activacin plaquetaria. Por otra parte, la presencia en la capa interna de los fosfolpidos aninicos (PS y PE), responsables de la actividad procoagulante, hace que esta actividad solo se manifieste en plaquetas activadas cuando se produce su traslocacin a la capa externa. La asimetra en los fosfolpidos de la membrana es mantenida por las enzimas aminofosfolpido translocasa y escramblasa, lo que depende de la concentracin de calcio intracitoplasmtico, ATP y temperatura. Los lpidos plaquetarios tienen tanto un papel estructural como metablico, participando como mediadores lipdicos de la activacin plaquetaria y en procesos de transmisin de seales. Recientemente se han descrito zonas especializadas de la membrana plaquetaria ricas en glicolpidos, tambin llamados rafts de membrana, que se asocian a la sealizacin de las plaquetas a travs de receptores inmunolgicos. Estas regiones especializadas son ricas en colesterol, esfingolpidos y cidos grasos saturados y se unen internamente al citoesqueleto y externamente a otras protenas, por lo que pueden participar en la transmisin de seales. 3.1.2. Glicoprotenas Muchos de los procesos en que participan las plaquetas son mediados por las glicoprotenas (GP) de membrana. Las GP se identificaron, inicialmente, por marcacin con radio-istopos y migracin en geles de poliacrilamida-SDS, por lo que su nomenclatura corresponde a las bandas de migracin (I, II, III, etc.). En la tabla 19-1 se enumeran las glicoprotenas mayores de la membrana plaquetaria y sus correspondientes ligandos. Varias de ellas pertenecen a la familia de molculas de adhesin, denominadas integrinas. Las integrinas son heterodmeros constituidos por
dos subunidades y que pueden unir uno o ms ligandos y participan activamente en los procesos adhesivos y agregatorios en las plaquetas. Se les denomina integrinas por su capacidad para conectar actividades biolgicas entre la zona externa de la membrana y el citosol. GPIIb-IIIa. La GPIIb-IIIA (CD41-CD61) es el receptor plaquetario para el fibringeno y otras protenas adhesivas como el factor von Willebrand, fibronectina y vitronectina. Es la protena ms abundante de la superficie plaquetaria, constituyendo alrededor del 15% de la masa proteica de la membrana (figura 192) Las plaquetas en reposo expresan alrededor de 40.000-50.0000 copias por clula y existe un compartimento inter no asociado a la membrana de los grnulos alfa, que se expresa en la superficie al activarse las plaquetas. En este complejo glicoproteico, especialmente en la GPIIIa, se encuentra la mayora de los sistemas antignicos plaquetarios (ver tabla 19-2). La formacin de puentes de fibringeno entre receptores GPIIb-IIIa de plaquetas contiguas es requisito indispensable para la formacin de agregados plaquetarios y la unin a las dems protenas adhesivas facilita la adhesin de las plaquetas con el endotelio daado. Estructuralmente, esta integrina est formada por un dominio extracelular, una secuencia transmembrana y un corto dominio citoplasmtico. Esta estructura permite la transmisin bidireccional de seales entre ambas caras de la membrana plaquetaria lo que, como veremos ms adelante, tiene importantes implicaciones en la secuencia activacinagregacin plaquetaria. Por otra parte, el complejo GPIIbIIIa interviene en la retraccin del coagulo, uniendo la red de fibrina extracelular al sistema contrctil en el interior de la plaqueta. La importancia de este receptor se pone de manifiesto en las anomalas clnicas detectadas en la tr omboastenia de Glanzman, una enfermedad hemorrgica congnita, que se caracteriza por una falta total o parcial de GPIIbIIIa en los pacientes. Tambin se evidencia en el efecto clnico-farmacolgico de los bloqueantes de este receptor, utilizados en la teraputica antiplaquetaria en intervenciones de alto riesgo trombtico.
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Tabla 19-1. Glicoprotenas mayores de la membrana plaquetaria Glicoprotena GPIIb-IIIa Designacin CD CD41-CD61 Integrina IIb3 Ligando Fibringeno, FvW, fibronectina, vitronectina Vitronectina, FvW fibringeno, trombospondina Colgeno Fibronectina FvW Trombina Colgeno, trombospondina Colgeno CD62P Funcin Agregacin
Receptor de vitronectina GPIa-IIa GPIc-IIa GPIb-IX-V
CD51-CD61
v3
Adhesin
CD49b-CD29 CD49e-CD29 CD42b,cCD42a, CD42d CD36
21 51
Adhesin Adhesin Adhesin Agregacin Adhesin Agregacin Adhesin Interaccin plaquetaleucocito Interaccin endotelio
GPIV GPVI GMP-140 (P-selectina) PECAM-1
CD31
CD, cluster of differentation; FvW, factor von Willebrand.
Figura 19-2. Esquema que representa la estructura del complejo GPIIb-IIIa. Estructuralmente GPIIb/IIIa es un heterodmero de las glicoprotenas IIb (IIb) y IIIa (3) asociadas entre s de forma no covalente. A su vez, la integrina IIb est formada por una subunidad extracelular de 125 kDa unida mediante un puente disulfuro a otra subunidad ms pequea de 25 kDa, que incluye un dominio transmembrana y un corto dominio citoplasmtico. Por su parte, la integrina 3 est formada por una nica cadena de 95 kDa, con un largo dominio extracitoplasmtico, una secuencia transmembrana, y una cadena citoplasmtica. Estas caractersticas estructurales permiten que el receptor participe en la transmisin bidireccional de seales entre ambas caras de la membrana. Presenta 3 dominios de unin al fibringeno, dos de ellos en IIb (fibringeno y RGD) y uno en 3 (dodecapptido). El dominio RGD es clave para la unin del fibringeno y de otras protenas que contengan esta secuencia, mientras que los otros dominios se cree que participan en la estabilizacin de la unin del fibringeno al receptor.
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GPIa-IIa. La GPIa-IIa (CD49b-CD29), integrina 21 participa en la adhesin plaquetaria al colgeno de la matriz subendotelial. GPVI. La GPVI es un miembro importante de las inmunoglobulinas en las plaquetas, y junto con GPIa-IIa (21) acta como receptor del colgeno. GPIb. La GPIb (CD42b, c) es un heterodmero compuesto de una cadena (143 kDa) y una cadena (23 kDa), unidas por puentes disulfuro. En la membrana plaquetaria se encuentra formando complejo con la GPIX (CD42a) y con la GPV (CD42d) (figura 19-3). La GPIb se compone de dos subunidades unidas por puentes disulfuro y pertenece a la familia de las protenas ricas en leucina (LRG). El complejo GPIb-IX-V acta como receptor para el factor von Willebrand, interaccin esencial en el fenmeno de adhesin de las plaquetas a la pared del vaso daado y tambin juega un papel importante en la activacin de las plaquetas por la trombina. Existen unas 25.000 copias de GPIb y GPIX y aproximadamente la mitad de GPV por plaqueta. Al contrario de lo que ocurre con GPIIb-IIIa, la activacin plaquetaria reduce el nivel de exposicin de este complejo en la membrana plaquetaria, ya que se redistribuye en las membranas del sistema canalicular abierto, un pr oceso mediado por el citoesqueleto plaquetario. Adems, la activacin de las plaquetas produce la activacin de calpanas, proteasas dependientes de calcio, que degradan el complejo, liberando GPIb y GPV. La degradacin por calpana de GPIb libera un fragmento denominado glicocalicina, que puede detectarse en el plasma normal (1-3 g/ ml) y se encuentra elevado en pacientes con trombocitopenia debida a un aumento de destruccin plaquetaria, lo que se ha utilizado para distinguir de trombocitopenia por defecto de produccin plaquetaria. La unin GPIb-IX-V-FVW se incrementa a flujos sanguneos elevados, posiblemente debido a un cambio conformacional por el flujo tanto del
complejo glicoproteico como del FVW, lo que facilita una unin efectiva entre las plaquetas y el endotelio. Tambin, como se ha visto recientemente, GPIb-IX-V contribuye junto a GPIIb-IIIa a la unin plaqueta-plaqueta durante el crecimiento del trombo, en este caso mediado por el FvW liberado por las plaquetas ya adheridas. Otra funcin importante de GPIbIX-V es mediar en la activacin y secrecin plaquetaria inducida por las fuerzas de cizalladura elevadas, como puede suceder en zonas de estenosis. El complejo GPIb-IX-V tiene tambin dos lugares especficos de reconocimiento para la trombina en GPIb y GPV. Existe evidencia de que el punto de unin de alta afinidad para la trombina en GPIb facilita la respuesta de las plaquetas a este importante agonista fisiolgico, adems de las respuestas a la trombina mediadas por los receptores activados por proteasas (PAR). En este sentido, las plaquetas de los pacientes con sndrome de Bernard Soulier que presentan deficiencias en GPIb-IX-V, o el bloqueo con anticuerpos monoclonales anti-GPIb hace que las plaquetas respondan de modo defectuoso a pequeas concentraciones de trombina. GPIb une tambin factores del sistema intrnseco de la coagulacin, como el kiningeno de alto peso molecular, FXI y FXII. Otra contribucin potencialmente importante del complejo GPIbIX-V es la aceleracin de la generacin de trombina en la superficie de plaquetas activadas, ya que la trombina unida a GPIb incrementa la exposicin de fosfolpidos procoagulantes de las plaquetas. Finalmente, la interaccin de GPIb-IX-V con la trombina y con el FVW, que a su vez facilita la interaccin plaqueta-colgeno inicia la compleja secuencia de transmisin de seales que da lugar a la reorganizacin del citoesqueleto, el aumento del calcio citoslico y la activacin del receptor GPIIb-IIIa. Por ello, el papel de este receptor, todava no totalmente caracterizado, es ms importante de lo que hasta hace poco se crea en la biologa plaquetaria.
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Figura 19-3. Esquema que representa la estructura del complejo GPIb-IX-V.
GPIV. La GPIV (CD36) est presente sobre la superficie de las plaquetas y otras clulas (monocitos, eritrocitos, clulas endoteliales). La GPIV ha mostrado tener propiedades de receptor de colgeno, involucrada en las etapas iniciales de la adhesin de plaquetas al colgeno. Adems la GPIV une trombospondina, cidos grasos y lipoprotenas oxidadas. Un aspecto curioso de esta glicoprotena es que se encuentra ausente en 4-7% de sujetos japoneses normales, aunque despus se comprob que esto tambin ocurre en otras poblaciones como individuos sub-saharianos en Africa y en mucha menor proporcin (0.3%) en otras etnias. P-selectina. La P-selectina (CD62P) es una glicoprotena perteneciente a la familia de las Selectinas, presente en los grnulos alfa y que se expresa en la superficie de las plaquetas activadas. Tambin se encuentra en los grnulos Weibel-Palade de las clulas endoteliales. La funcin principal de esta GP es mediar la interaccin entre plaquetas y leucocitos mediante la unin de la P-selectina expuesta en las plaquetas y su receptor, la P-selectina glicoprotena-1 (PSGL-1) en los leucocitos. La
unin leucocito-plaqueta se refuerza adems mediante la unin GPIIb-IIa en las plaquetas y el receptor CD11-CD18 (Mac-1) en leucocitos mediante puentes de fibringeno. Recientemente se ha comprobado que la Pselectina puede unirse tambin a GPIb en las plaquetas y que las plaquetas tambin poseen PSGLP-1, lo que permite la interaccin plaquetaendotelio mediado por P-selectina endotelial, as como la participacin de estos ligandos en la estabilizacin de los agregados plaquetarios. Adicionalmente, la unin de P-selectina a los monocitos induce en los mismos la expresin de factor tisular y promueve la formacin de fibrina. Estudios recientes sugieren que la emisin de micropartculas por las plaquetas activadas, que expresan P-selectina, pueden contribuir por este mecanismo al proceso de la coagulacin y jugar un papel en las interacciones entre las clulas sanguneas. PECAM-1. PECAM-1 (CD31) es una protena de 130 kDa, miembro de la Superfamilia de las Inmunoglobulinas (SFIg), que se expresa en las plaquetas, clulas endoteliales, monocitos, granulocitos y clulas T. Es un importante
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mediador de la interaccin entre leucocitos y clulas endoteliales, aparentemente interviniendo en la migracin transendotelial de los neutrfilos. La funcin de PECAM-1 en plaquetas es an desconocida, pero se supone podra participar en la interaccin plaqueta/ endotelio ya que ratones deficientes en esta pr otena tienen un tiempo de sangra prolongado.
Sistemas antignicos plaquetarios Las plaquetas poseen tres tipos de sistemas antgnicos: (a) Antgenos compartidos con los glbulos rojos, (b) Antgenos de histocompatibilidad (HLA1) y (c) Antgenos plaquetarios especficos (HPA Human platelet antigen). Entre estos ltimos se conocen suficientemente bien cinco sistemas antignicos (HPA-1 a HPA-5) y otros en estudio (tabla 19-2).
Tabla 19-2. Sistemas antignicos plaquetarios Sist. HPA HPA-1 HPA-2 HPA-3 HPA-4 HPA-5 HPA-6W HPA-7W HPA-8W HPA-9W HPA-10W Antgeno HPA-1a HPA-1b HPA-2a HPA-2b HPA-3a HPA-3b HPA-4a HPA-4b HPA-5a HPA-5b HPA-6bW HPA-7bW HPA-8bW HPA-9bW HPA-10bW Fenotipo(%) 67.9 26.5 99.3 14.5 87.7 64.1 >99.9 >0.2 99.2 20.6 <1 <1 <1 Glicoprotena GPIIIa GPI GPIIb GPIIIa GPIa GPIIIa GPIIIa GPIIIa GPIIb GPIIIa Polimorfismo Leu/Pro 33 Thr/Met145 Ile/Ser 843 Arg/Gln 143 Lys/Glu 505 Gln/Arg 489 Ala/Pro 407 Cys/Arg 636 Met/Val 837 Arg/Gln 62
3.1.3. Receptores no glicoproteicos Desde un punto de vista funcional, a los receptores no glicoproteicos se les puede clasificar en: receptores activadores (Ej. ADP, epinefrina, serotonina, PAF, trombina, tromboxano A2), receptores inhibidores (Ej. prostaglandinas I2 y E1, prostaglandina D2, adenosina) y receptores de frmacos (figura 19-4) El mecanismo general involucrado el la transduccin de la seal lo podemos resumir de la siguente manera. Cuando un agonista se une a una protena receptor se inicia una secuencia de eventos, donde la seal biolgica es traslocada a un efector celular especfico. Despus de la interaccin de un agonista con receptores asociado a protena G (o receptores de siete dominios hidrofbicos), la sealizacin se inicializa con la activacin de protenas heterotrimricas que unen protena G, las que
estn ntimamente asociadas con el receptor. La seal es posteriormente propagada a travs de la disociacin en una subunidad G y un dmero G , y cada uno de los cuales puede activar molculas efectoras especficas como por ejemplo: adenilato ciclasa, fosfolipasa C, canales inicos, etc. A pesar que distintos receptores asociados a protena G parecen funcionar a traves de diferentes vas de transduccin de la seal, es tambien evidente que en ciertos puntos, a traves de la cascada de activacin, que estas vas pueden comunicarse. Es as que, la interaccin de un agonista a un receptor puede influir la respuesta celular a otro agonista independiente que interacciona con un receptor distinto. Este fenmeno de intercomunicacin entre vas, es el fenmeno de sinergismo, en el cual la respuesta causada por dos agonistas agregados juntos es mayor que la suma aritmtica de sus respuestas individuales, causada por cada agonista.
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Figura 19-4. Representacin esquemtica de los principales receptores de las plaquetas.
Receptor de ADP El ADP es el principal agonista fisiolgico que induce la agregacin plaquetaria in vivo. La existencia de un receptor de ADP fue definida sobre la base de los datos farmacolgicos como un receptor responsable de la agregacin inducida por ADP, la movilizacin de calcio intracelular, y la inhibicin de la adenilato ciclasa. Este receptor fue llamado P2T (T por trombocitos) El primer receptor purinrgico P2Y1 que fue clonado, tambin se encontr en plaquetas humanas. Este receptor contiene 373 aminocidos, y tiene la clsica estructura del receptor acoplado a protena G. Se identific un segundo receptor para ADP en plaquetas, el receptor P2Y12. La importancia de este receptor se manifiesta, por los efectos de clopidogrel, una droga antitrombtica, la cual despus de ser metabolizada en el hgado, acta como un antagonista irreversible para P2Y12. Los mecanismos de sealizacin utilizados por estos receptores para inducir la activacin plaquetaria son: P2Y1 est acoplado a Gq y la interaccin de este receptor plaquetario est asociado
con el cambio de forma, la elevacin del calcio intracelular mediada por la fosfolipasa C y la activacin de la integrina IIb3 y la iniciacin de la agregacin. P2Y12 est acoplado a la inhibicin de la adenilato ciclasa a travs de una protena Gi2, y es necesario para la formacin y estabilizacin de agregados plaquetarios grandes.
El receptor P2Y1 se encontr, por estudios de inmunolocalizacin, en la membrana plasmtica de las plaquetas, pero una mayor proporcin de los receptores se encontr en el pool de membranas internas (membranas de grnulos y del sistema canicular abierto) junto al receptor Tromboxano prostanoide (TP) Receptor de Trombina La trombina, una serino proteasa, es quizs el ms efectivo activador plaquetario y tiene un reconocido protagonismo en promover la for macin de trombos. En plaquetas, la trombina evoca cambio de forma y liberacin del contenido de grnulos plaquetarios. Tambin activa la sntesis y liberacin de tromboxano A2, la movilizacin de P selectina (CD62P) y ligando CD40 hacia la superficie plaquetaria, y la activacin de GP IIb/IIIa. La
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activacin de las plaquetas por trombina se realiza a travs de mltiples receptores sobre la superficie plaquetaria incluyendo el complejo GPIb/V/IX y los receptores activados por proteasas (PARs). En plaquetas humanas, la trombina interacta y activa dos receptores PAR que estn acoplados a miembros de la familia de protenas G: PAR1. Es el principal receptor en plaquetas humanas, est acoplado a Gq, G12/13 y G2/i. PAR4. Est asociado a Gq y G12/13 y es activado cuando la trombina rompe su dominio N terminal, en un sitio especfico.
accin de otros agonistas. Las plaquetas tienen receptores, predominantemente, del tipo 2adrenrgicos, y su estimulacin inhibe la va de la adenilato ciclasa, acoplado a una protena G, del tipo Ni, regulada por el balance entre GTP y GDP. El peso molecular del receptor es 64 kDa y consiste de una sola cadena polipeptdica con siete dominios transmembrana. El nmero estimado de receptores flucta entre 100 a 400 por plaqueta. Receptor de serotonina (5-HT) Otro agonista plaquetario es 5-hidroxitriptamina (5HT) o serotonina, que es liberado por las plaquetas agregadas en el sitio del dao vascular. Las plaquetas acumulan serotonina por un proceso activo, dentro de sus grnulos densos y poseen receptores de serotonina (5HT2A) acoplados a protenas que unen GTP (protenas G). La activacin del receptor acoplado a una protena Gq conduce a la activacin de fosfolipasa C (PLC), y as la generacin de segundos mensajeros: diacil glicerol (DAG) e inositol- 1,4,5 trifosfato (IP3), los que conducen a la activacin de protena kinasa C y la movilizacin de Ca2+ intracelular, respectivamente, molculas asociadas con la activacin plaquetaria. Si bien, 5-HT es un agonista muy dbil, potencia la agregacin plaquetaria cuando se usa como agonista la epinefrina o el PAF. 3.2. Grnulos plaquetarios Las plaquetas contienen un nmero variable de grnulos, morfolgicamente diferentes cuando se observan al microscopio electrnico. Se han empleado una gran variedad de tcnicas, incluyendo el fraccionamiento subcelular, inmunoqumica, radioautografa, histoqumica para desarrollar el conocimiento actual del contenido de los grnulos plaquetarios. Los grnulos que presentan las plaquetas son los grnulos alfa, los densos y los lisosomas. 3.2.1. Grnulos alfa Los grnulos alfa son los grnulos ms abundantes de las plaquetas y tiene un dimetro entre 200-400 nm; cada plaqueta presenta de 35 a 40 grnulos , constituyendo el 15 % del volumen total de las plaquetas. stos almacenan un nmero importante de protenas, la mayora proveniente del plasma, algunas de las cuales juegan un importante rol en la hemostasia
El mecanismo de activacin consiste en la escisin de una zona especfica del receptor exponindose un nuevo aminocido terminal que lleva una secuencia aminoacdica especfica que interacciona con un dominio intramolecular del receptor induciendo una respuesta transmembrana que involucra la activacin de la fosfolipasa C, la fosfoinositol-3 quinasa y la quinasa RhoA/Rho. El receptor para trombina consiste en una protena de 66 kDa, con siete dominios hidrofbicos transmembrana. El nmero de copias por plaquetas es de alrededor de 1.800. Receptor de Tromboxano A2 El receptor de tromboxano A2 (TP) ha sido clonado e identificado como una protena de 37 kDa, consistente en una cadena polipeptdica, con siete dominios hidrofbicos transmembrana. El TXA2 activa las plaquetas por unin a un receptor especfico asociado a protena G, miembros de la familia Gq y G 12/13. La activacin plaquetaria a travs de Gq activa la fosfolipasa C, mientras que G12/13 regula la fosforilacin de miosina de cadena liviana (MLC), a travs de la activacin Rho kinasa. La densidad de los receptores TXA2 es de 1500 receptores por plaquetas. La distribucin clulas y tejidos del receptor TP esta ntimamente relacionada con la enzima tromboxano sintetasa. Ya que el tr omboxano A2 tiene una vida media extremadamente corta, y acta como un autocoide, la distribucin tisular concordante entre la tromboxano sintetasa y TP facilita la rpida accin de TXA2 Receptores adrenrgicos La unin de epinefrina (adrenalina) induce agregacin sin cambio de forma y potencia la
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primaria, como el fibringeno. Otras protenas son especficas de linaje, como el factor plaquetario 4 y -tromboglobulina (tabla 19-3). Algunas de las protenas contenidas en estos alfa grnulos pueden tambin proveer un grado adicional de regulacin del balance entre la formacin del cogulo y su disolucin. Otras
protenas de los alfa grnulos son los factores de crecimiento o componentes de la matriz extracelular. Una deficiencia congnita de los alfa grnulos se llama Sndrome de las plaquetas grises.
Tabla 19-3. Contenido de los grnulos plaquetarios Grnulos Alfa Contenido Protenas especficas (PF4, -Tromboglobulina,IIb3); Protenas adhesivas (Fibringeno, Factor von Willebrand, Fibronectina, Trombospondina, Vitronectina, P-selectina); Protenas del sistema hemosttico (Factor V, FVIII, FXI, Protena S, kiningeno de alto peso molecular, plasmingeno, t-PA, inhibidor-1 activador del plasmingeno, -2 antiplasmina, -2 macroglobulina, -1 antitripsina, Gas6); Factores de Crecimiento (PDGF, EGF, TGF); Otros: Albmina, IgG, IgA, Osteonectina ADP, ATP, GTP, GDP, Ca2+, Mg2+, serotonina, fosfato Proteasas (elastasa, colagenasa, proteasas neutras); fosfatasas/sulfatasas (glicerol fosfatasa, arilfosfatasa, arilsulfatasa); glucosidasas (hexosaminidasa, -glucoronidasa, heparinitasa)
Densos Lisosomas
PF4, Factor plaquetario 4; t-PA, Activador Tisular del Plasmingeno; Gas6, Growth arrest - specific gene 6; PDGF, Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas; EGF, Factor de Crecimiento Epidrmico.
3.2.2. Grnulos densos Los grnulos densos (tabla 19-3) se caracterizan por su alta densidad electrnica que le confiere el elevado contenido de calcio y fsforo inorgnico (50% del total). El calcio forma un complejo macromolecular con la serotonina (5 hidroxitriptamina, 5-HT) y nucletidos de adenosina (ATP, ADP) Los grnulos densos contienen el 60% de los nucletidos de adenina de las plaquetas, el resto, fundamentalmente ATP, es metablico y se emplea en las funciones celulares. La liberacin del contenido de los grnulos densos, particularmente del ADP y 5HT juega un papel importante en la amplificacin de la respuesta plaquetaria al estmulo y en el crecimiento del trombo. 3.2.3. Lisosomas Son estructuras citoslicas similares a los grnulos de pequeo tamao 175-200 nm, contienen proteasas, fosfatasas, sulfatasas y ectoglucosidasas (tabla 19-3). Su funcin est relacionada con la destruccin intracelular de partculas extraas. Su contenido se libera al exterior por una fuerte estimulacin de las
plaquetas y se ha detectado la exposicin de protenas lisosmicas en la membrana de las plaquetas activadas como la CD63, que se utiliza como un mar cador de fuerte activacin plaquetaria. La liberacin de su contenido en proteasas como la elastasa o la colagenasa en la proximidad del vaso sanguneo afectado, contribuye al dao endotelial. 3.3. Citoesqueleto plaquetario El citoesqueleto plaquetario es el responsable de mantener la estabilidad de la membrana, su for ma discoide y las modificaciones morfolgicas que stas experimentan cuando son activadas. Otra funcin importante del citoesqueleto es servir de punto de unin de molculas de sealizacin que se traslocan desde el citosol, for mando complejos multimoleculares de sealizacin. De este modo, el citoesqueleto regula la organizacin espacial de la clula y la integracin de mecanismos bioqumicos que conducen a las respuestas celulares. El citoesqueleto est compuesto de polmeros de tubulina y actina, y otras protenas asociadas.
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En el citoesqueleto se pueden distinguir tres estructuras: Esqueleto citoplasmtico. Contiene una alta proporcin de actina, la protena ms abundante en la plaqueta. En la plaqueta en reposo esta actina se encuentra formando filamentos que tienen uniones cruzadas con otras protenas, lo que condiciona la formacin de una malla tridimensional que funciona como un esqueleto celular. Esqueleto de membrana. Est for mado tambin por filamentos de actina y se encuentra dispuesto inmediatamente por debajo de la membrana celular. Microtbulos. stos se disponen en una banda circunferencial que est situada inmediatamente por debajo del esqueleto de la membrana y su funcin principal es mantener la forma discoide de las plaquetas en estado de reposo. El citoesqueleto proteico fundamental de los microtbulos est formado por polmeros de tubulina unidos a polipptidos de alto peso molecular a la membrana. Las subunidades de tubulina (alfa y beta tubulinas), se congregan en forma reversible en largos polmeros llamados microtbulos. La actina tambin se congrega en forma reversible, en polmeros polarizados, los cuales comprenden los apoyos de una malla citoplasmtica rgida, tanto en plaquetas en reposo como activadas. Mientras circula en la sangre, el 40% del total de actina de las plaquetas en reposo est ensamblada entre 2000 a 5000 filamentos. Protenas contrctiles de las plaquetas Las plaquetas son particularmente ricas en protenas contrctiles, representando alrededor del 50% del total de las protenas plaquetarias. Varias respuestas plaquetarias incluyendo secrecin, cambio de forma, agregacin y retraccin del cogulo, requieren la fuerza generada por protenas contrctiles. A continuacin se describen algunas propiedades bioqumicas de las protenas contrctiles de las plaquetas: Actina. La actina (42 kDa) es la protena ms abundante del citosol plaquetario, representa el 20-30% del total de las protenas plaquetarias. La -actina es el mayor componente de actina muscular. La actina existe en dos formas como
monmero (G-actina) y polimerizada (F-actina). En las plaquetas en reposo 30-40% de la actina est polimerizada en filamentos. La polimerizacin de los monmeros de actina es prevenida por protenas como profilina. La actina tiene un sitio de unin para un compuesto nucletido dimetal, usualmente ATP-Ca2+, la unin del nucletido sirve para estabilizar la estructura de monmero, as, si no ocurre esta unin, los monmeros son rpidamente denaturados. En bajas concentraciones de sal y nucletidos bivalentes, la actina permanece en forma monomrica, subiendo las concentraciones de Ca 2+ y Mg2+ ocurre la polimerizacin sobre la larga hebra de F-actina. Cuando se polimeriza la actina, el ATP unido es hidrolizado a ADP, as el nucletido unido a F-actina es ADP. Los filamentos de F-actina contienen 2 hebras de monmeros de actina ordenados en dos hlices entrelazadas. Existen tres tipos de protenas que se unen a actina: (i) Protenas que se unen a monmeros G-actina estabilizndolos, (ii) Protenas camping que se unen a los filamentos de Factina ter minal y van inhibiendo la polimerizacin al final de stos, y (iii) Protenas que se unen a filamentos de F-actina favoreciendo su estabilizacin. Profilina. Es una protena de 15 kDa que se encuentra en gran cantidad en las plaquetas; for ma un complejo reversible con los monmeros de actina llamado profilactina, su funcin es recargar con ATP las subunidades de actina-ADP desprendidas de los filamentos de actina para reincorporarlos y alargar la estructura filamentosa. Gelsolina. Es una protena de 91 kDa. Requiere Ca2+. Convierte geles de F-actina en soluciones menos viscosas. Se encuentra en plaquetas y plasma. Clasificada como una protena camping se une al extremo terminal de los micr ofilamentos. Presenta 6 dominios homlogos repetidos (14 kDa cada uno) que contienen 3 sitios de unin a actina. Gelsolina aumenta el porcentaje de nucleacin de los monmeros de actina a filamentos entrelazados Se produce el acortamiento de los filamentos probablemente por el aumento en el nmero de ncleos. Similarmente a la profilina, se for man complejos de actina-gelsolina, transitoriamente durante la activacin plaquetaria.
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Tropomiosina. La tropomiosina plaquetaria (28 kDa) es ms pequea que la tropomiosina muscular, la tropomiosina plaquetaria une 6 molculas de actina cuando sta se encuentra saturada con tropomiosina, otras protenas de unin a actina slo pueden interactuar con microfilamentos terminales. Caldesmon. Es una protena de 80 kDa, contiene distintos dominios de unin a actina, tropomiosina, miosina y calmodulina. La unin es regulada por el Ca2+. Protena de unin a actina. Esta protena (abp, Actin Binding Protein) es un dmero de alto peso molecular y representa el 2-3% del total de las protenas plaquetarias, su principal actividad se asocia a entrecruzamiento de los filamentos de actina para formar un gel, los filamentos forman una red donde stos son perpendiculares unos con otros. (ABP) es una fosfoprotena que contiene 2 molculas de fosfato por molcula. Al mover una molcula de fosfato se pierde su capacidad de entrecruzamiento. Una kinasa dependiente de cAMP cataliza la fosforilacin de la ABP. Talina. Protena de 235 kDa, se encuentra en altas concentraciones en plaquetas. Se une a vinculina y ambas protenas pueden interactuar con protenas de transmembrana de la familia de las integrinas. Vinculina. Protena globular de 130 kDa. No es una protena integral de membrana pero participa en anclaje de filamentos de actina a membranas. Miosina. Representa un 2-5% del total de protenas plaquetarias. Es un hexmero de 480 kDa, cada molcula de miosina contiene 2 cadenas pesadas de 20 kDa y 2 cadenas livianas de 20 y 16 kDa. La cadena pesada de miosina es una estructura polar, la parte C-terminal de la cadena pesada de miosina forma una cabeza globular. Las regiones -hlice de las 2 cadenas pesadas interactan para formar una cola enrollada del filamento de miosina. kinasa de cadena liviana de miosina. Esta protena es inactiva a menos que se aada Ca2+ y ste se encuentre unido a calmodulina. La kinas de cadena liviana de miosina contiene 3 dominios distintos: una regin N-terminal con funcin desconocida, un centro cataltico y una regin C-terminal regulatoria de la unin a calmodulina.
Calmodulina. Protena acdica de 17 kDa con 4 sitios de unin para Ca2+. Esta protena regula la dependencia de Ca2+ de muchas protenas incluyendo la kinasa de cadena liviana de miosina. 3.4. Sistema de membrana interno Las plaquetas tienen dos sistemas de membrana internos, el Sistema canicular abierto y el Sistema tubular denso. 3.4.1. Sistema canicular abierto El sistema canicular abierto, a menudo llamado sistema canicular conectado a la superficie, est formado por invaginaciones de la membrana plasmtica al interior de la clula, (estructura nica con 15-20 aberturas) el cual interconecta con otros, al igual que el sistema tubular denso. El sistema canicular abierto juega un papel importante en la fisiologa de las plaquetas humanas, aumentando la superficie total de contacto, permite el intercambio de sustancias en profundidad, como tambin ofrece un sitio para la salida del contenido de los grnulos alfa y una ruta para la incorporacin de material soluble y particulado desde el medio que las rodea, in vivo el plasma. 3.4.2. Sistema tubular denso El sistema tubular denso; est constituido por canales delgados internos con un contenido amorfo que aparece cerca de los microtbulos y rodea a los organelos. Tiene funciones similares a las del retculo endoplsmico liso de otras clulas. Es un regulador de la activacin plaquetaria mediante la liberacin o secuestro de calcio inico, del cual es su principal depsito. Tambin contiene enzimas oxidativas y enzimas del metabolismo de prostaglandinas. 4. ENVEJECIMIENTO Y REMOCIN PLAQUETARIA Normalmente las plaquetas circulan 8 a 10 das en un nmero que va desde 140.000 a 400.000 clulas/uL. El 30% de las plaquetas circulante se encuentra secuestradas por el sistema fagoctico mononuclear (SFM), especialmente del bazo. La desaparicin de las plaquetas de la circulacin, ya sea como parte de un proceso de envejecimiento fisiolgico o como manifestacin de destruccin aumentada, ha sido motivo de intensa investigacin.
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La supervivencia de las plaquetas en la circulacin se puede estudiar mediante distintas tcnicas; la ms aceptada es la marcacin de una muestra de plaquetas con un istopo radioactivo (51Cr o 111In), que se reinyecta y se mide la desaparicin de la radioactividad en el tiempo. Las curvas de sobrevida, obtenidas con esta tcnica, en condiciones normales han mostrado una desaparicin de la radioactividad que sigue una funcin de tipo lineal; esto significa que las plaquetas en la circulacin sufren un proceso de envejecimiento y son removidas en funcin de su edad. 4.1. Envejecimiento de las plaquetas en la circulacin Durante su envejecimiento en la circulacin, las plaquetas sufren una serie de cambios fsicos, bioqumicos y funcionales que determinan en forma importante su heterogeneidad. De la gran variedad de cambios demostrados durante el envejecimiento de las plaquetas, algunos han sido mejor caracterizados, e incluso se ha sugerido pudieran representar marcadores de su edad. Entre stos, es importante analizar los cambios en la densidad, contenido granular y en estructuras de membrana, como representativos de tres compartimentos de las plaquetas que sufren modificaciones con la edad en la circulacin. 4.1.1. Densidad Aunque la heterogeneidad de densidad de las plaquetas est determinada en gran medida a nivel de la mdula sea durante la megacariopoyesis, al envejecer en la circulacin stas cambian de densidad en un sentido que depende de la especie en estudio. As, las plaquetas humanas y de algunas especies de primates, aumentan de densidad con la edad. En caninos, conejos y monos rhesus la densidad de las plaquetas disminuye con su edad. Dado que el cambio de densidad de las plaquetas con la edad es dependiente de la especie estudiada, no se pueden extrapolar los resultados obtenidos en otras especies para analizar la relacin entre la heterogeneidad fsica de las plaquetas humanas y su edad en la circulacin. El conocer la relacin densidad/edad de las plaquetas circulantes en distintas especies, es de gran utilidad desde un punto de vista experimental, ya que da la posibilidad de estudiar plaquetas de diferente edad en estado estacionario.
4.1.2. Contenido granular Durante el envejecimiento de las plaquetas en la circulacin el contenido de algunos de los componentes de los grnulos especficos cambia en relacin a su edad. Con respecto a los grnulos alfa, tanto las plaquetas humanas como caninas con la edad acumulan fibringeno en la circulacin, lo que indicara que el fibringeno intraplaquetario provendra del exterior y no por sntesis megacarioctica. En cuanto al comportamiento de los grnulos densos con el envejecimiento en plaquetas humanas y caninas el contenido de serotonina (5-Hidroxitriptamina) aumenta con la edad de las plaquetas en la circulacin, implicando un proceso de acumulacin in vivo de la amina. Este cambio tambin es til experimentalmente, ya que se puede utilizar como marcador de edad plaquetaria. 4.1.3. Membrana plaquetaria A nivel de la membrana plaquetaria se ha observado que las plaquetas humanas de baja densidad, enriquecidas con plaquetas jvenes, expresan 55% ms antgenos del sistema HLA clase I que las plaquetas de alta densidad, las que tienen en promedio mayor edad. Estas observaciones sugieren que los antgenos de este sistema pudieran perderse con el desgaste y envejecimiento de las plaquetas en la circulacin. No se ha demostrado prdida de otras glicoprotenas de membrana (GPIIb-IIIa) con el envejecimiento. La expresin de CD36 (GPIV) y la exposicin de CD62P (P-selectina), no presentan diferencias en subpoblaciones plaquetarias de alta densidad (PAD) y de baja densidad (PBD) humanas, lo que permite concluir que no cambian, significativamente, con la edad de las plaquetas en la circulacin. Por otra parte, en plaquetas envejecidas se ha descrito aumento de la expresin de fosfatidlserina (FS) y aumento de la IgG asociada a las plaquetas (PAIgG) (ver punto 4.2). 4.2. Remocin fisiolgica de plaquetas Algunas alteraciones o cambios descritos en plaquetas que envejecen en la circulacin, si
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bien constituyen marcadores inequvocos de edad (ej. densidad, 5-HT) parecen no ser determinantes de la remocin de las clulas de la circulacin. Los macrfagos del SFM (bazo e hgado y en menor grado de la mdula sea) deben detectar cambios asociados al envejecimiento plaquetario que activan su remocin. Aqu se resumirn los dos mecanismos propuestos para la eliminacin de clulas envejecidas en otros sistemas: mecanismo no inmune y mecanismo inmune. 4.2.1. Mecanismo inmune de remocin plaquetaria La PAIgG aumenta con la edad de las plaquetas en la circulacin. La evidencia se basa en: a) la subpoblacin de plaquetas de alta densidad (PAD) humanas, enriquecida con plaquetas de mayor edad, expresan mayor PAIgG que la subpoblacin de plaquetas de baja densidad (PBD), enriquecida con plaquetas jvenes, (b) la subpoblacin PBD caninas (de mayor edad promedio), expresan mayor PAIgG que la subpoblacin PAD, y (c) en el modelo de supresin de la trombopoyesis, en el cual se obtienen plaquetas que envejecen in vivo, la PAIgG aument progresivamente con la edad de las plaquetas en la circulacin. Posiblemente esto se explique por la aparicin de neoeptopo(s) en alguna de las protenas de membrana, lo que se poda asociar a la unin de anticuerpos naturales. Un fenmeno similar ha sido descrito en glbulos rojos; los eritrocitos senescentes expresan un neoeptopo en la protena banda 3. Al estudiar la especificidad de los autoanticuerpos antiplaquetarios (que explican el aumento de la PAIgC en plaquetas envejecidas), se ha observado que: (a) las plaquetas no expresan banda 3, por lo que esta protena no participara en el mecanismo de remocin fisiolgica de las plaquetas, como lo hace en los eritrocitos, (b) Otro neoantgeno, descrito en las plaquetas envejecidas in vitro, expresado por la GPIIb-IIIa (eptopo del anticuerpo 5E5), tampoco parece jugar un papel relevante. Como demostracin experimental del mecanismo de remocin inmune se ha observado que las plaquetas frescas sensibilizadas con anticuerpo anti-Pl A1 presentaron mayor interaccin con monocitos estimulados (por IFN), que las no sensibilizadas. En ambos tipos de plaquetas un escaso porcentaje de stas expuso FS y la PAIgG fue
significativamente mayor en las sensibilizadas. Dicha interaccin fue inhibida por bloqueo de los FcR de los monocitos con IgG purificada. Por otra parte, aparentemente el receptor de fragmentos del complemento, CR2 no participara en la remocin fisiolgica de plaquetas. 4.2.2. Mecanismos no inmunes de remocin plaquetaria La exposicin de FS aumenta en las plaquetas envejecidas; esto se basa en las siguientes evidencias: (a) un mayor porcentaje de PAD humanas que PBD, expone FS, (b) plaquetas de perro envejecidas en circulacin exponen ms FS que las plaquetas jvenes, y (c) las PAD humanas presentan mayor cantidad de Ca2+. La exposicin de FS es una de las manifestaciones tempranas de apoptosis, precediendo la fragmentacin del DNA (en clulas nucleadas) y la prdida de la integridad de membrana. Los cambios nucleares son a menudo considerados como un sello o marca de la muerte celular programada o apoptosis; sin embargo, en las clulas anucleadas, como las plaquetas, al parecer no sera un elemento indispensable como evento iniciador. Las plaquetas podran ser capaces de sufrir cambios similares a los observados en los eventos apoptticos de las clulas nucleadas. Pareciera que las plaquetas contienen componentes moleculares de la apoptosis que participan a nivel citoplasmtico. Las plaquetas envejecidas in vitro presentan prdida de la asimetra fosfolipdica y activacin de la caspasa 3. Por otra parte, se ha descrito que el envejecimiento in vivo de las plaquetas se asocia con activacin de la apoptosis, encontrndose que sus mitocondrias sufren importantes cambios en la integridad de su membrana, antes que una seal clsica de apoptosis, como es la exposicin de FS, sea observada. Como evidencia experimental de la interaccin a travs de mecanismo no inmune, se ha observado que plaquetas almacenadas ms de 6 das (concentrado de plaquetas de Banco de Sangre) presentan mayor interaccin con monocitos estimulados, que las plaquetas frescas. En ambos tipos de plaquetas la PAIgG fue nor mal y la expresin de FS fue significativamente mayor en las almacenadas. Dicha interaccin fue inhibida con liposomas de FS y con anticuerpo monoclonal anti-CD36.
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El conjunto de estas observaciones permite postular que en el fenmeno de remocin fisiolgica de las plaquetas envejecidas desde la cir culacin, participara ms de un mecanismo: (a) mecanismo inmune explicado por el aumento de PAIgG autloga sobre las plaquetas envejecidas que promueve la interaccin con FcR de los monocitos, y (b) mecanismo no inmune, en el cual la exposicin de FS en la cara externa de la membrana de las plaquetas envejecidas (por apoptosis), con participacin del receptor CD36 y eventualmente otro receptor que reconozca fosfolpidos como su ligando natural. 5. FORMACIN DEL TROMBO PLAQUETARIO En respuesta a un dao vascular las plaquetas, que nor malmente circulan como clulas aisladas, se encuentran con el entor no trombognico de la matriz subendotelial. Esto inicia interacciones entre las protenas adhesivas de la pared como el factor von Willebrand y los correspondientes receptores en la membrana plaquetaria. Esta etapa adhesiva facilita, a su vez, la interaccin de las plaquetas con el colgeno y el inicio de la etapa de activacin. Posteriormente se genera trombina, que es tambin un fuerte inductor de activacin en las plaquetas. La activacin produce cambios estructurales en la membrana, y cambios de forma con emisin de pseudpodos si estn circulantes. Tambin se inicia una secuencia de pr ocesos bioqumicos, que propician la agregacin y la liberacin al medio extracelular de pr oductos granular es y productos metablicos liberables como el tromboxano A2 (TXA2). Algunas de estas substancias liberadas por las plaquetas (ADP, serotonina, TXA2, etc.) son tambin estmulos plaquetarios que refuerzan la activacin y la agregacin, y promueven el reclutamiento de nuevas clulas al trombo en for macin. Finalmente, las plaquetas activadas desarrollan una actividad procoagulante que favorece la formacin de fibrina y la consolidacin del trombo (figura 195) En condiciones normales estos mecanismos controlan la hemorragia. Sin embargo, en condiciones patolgicas los mecanismos de control pueden fallar, produciendo trombosis o diatesis hemorrgica.
Figura 19-5 - Secuencia de formacin del trombo plaquetario.
5.1. Adhesin y extensin de las plaquetas El proceso de adhesin comprende el transporte de las plaquetas hacia la superficie reactiva y la interaccin de los receptores de la membrana plaquetaria con sus ligandos en las estructuras de la pared lesionada. Entre las protenas adhesivas de la matriz se incluyen: colgeno, fibronectina, factor von Willebrand, laminina, vitr onectina y trombospondina. Varias glicoprotenas de membrana plaquetaria y sus ligandos extracelulares (tabla 19-1) pueden mediar la adhesin plaquetaria al endotelio lesionado. Las plaquetas no se adhieren a las clulas vasculares endoteliales normales, pero en reas de lesin endotelial s lo hacen a varios componentes del tejido conectivo subendotelial. En los segundos siguientes a la lesin, las plaquetas se adhieren y se activan con el colgeno del subendotelio vascular a travs de la GPIa-IIa y GPVI. Esta interaccin es estabilizada por la interaccin adhesiva entre el complejo GPIb-IX-V y el factor von Willebrand
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(FVW), una glicoprotena plasmtica adhesiva que permite a las plaquetas permanecer unidas a la pared del vaso a pesar de la elevada fuerza de cizalla. El FVW tambin tiene dominios de unin para el colgeno subendotelial. La adhesin y activacin de las plaquetas por el colgeno induce la activacin del complejo GPIIb-IIIa que tambin participa en la adhesin plaquetaria, sobre todo en condiciones de alta velocidad de cizalla local, unindose al factor FVW. Una vez adheridas al subendotelio, las plaquetas se extienden sobre la superficie y luego se unen plaquetas adicionales (reclutamiento). Fuerza de cizalla La fuerza mecnica ms relevante en la hemostasia es la fuerza de cizalla. El trmino shear tiene el significado de movimiento deslizante entre dos planos adyacentes, mientras el concepto stress denota fuerza por unidad de rea. La sangre es un fluido viscoso con flujo laminar, el que se entiende por el tipo de movimiento en el que el fluido se mueve como una serie de lminas individuales, con cada estrato movindose a una velocidad diferente de sus lminas vecinas. La fuerza de cizalla, por tanto, se define como la fuerza de unidad por rea entre lminas, expresndose en dinas/cm2. El valor de esta fuerza de cizalla local es cero en el centro del vaso y mximo en la periferia, donde tienden a estar las plaquetas. La fuerza de cizalla en venas es de menos de 2 dinas/cm2, en arterias es de 20-30 dinas/cm2 y en arterias estenosadas pueden ser mayor a 200 dinas/cm2. La agregacin plaquetaria en respuesta a valores elevados de shear stress depende de la presencia del FVW plasmtico y los complejos receptores GPIb-IX-V y GPIIb-IIIa. El FVW es una protena plasmtica multimrica, que tiene sitios de unin para dichos receptores plaquetarios y para constituyentes del subendotelio (colgeno tipo I, III y VI). La unin del FVW con el complejo GPIb-IX-V es fundamental para la adhesin y agregacin. La unin de la GPIIb-IIIa al FVW en condiciones estticas es mnima, pero en plaquetas bajo el efecto de la fuerza de cizalla la interaccin presenta la misma intensidad que con la GPIb-IX-V. Estos complejos glicoproteicos tienen sitios de unin para el FVW inducibles por la fuerza de cizalla. Solo una minora de las plaquetas une al FVW y la unin es reversible y
no saturable. Tambin se ha observado que los multmeros ms grandes de FVW promueven una agregacin ms efectiva y que el efecto de la fuerza de cizalla en la formacin del trombo plaquetario en el complejo in vivo es potenciado por agonistas qumicos. Esta puede ser la razn por la que los infartos pueden ocurrir en pacientes con un grado relativamente bajo de estenosis, el efecto de la fuerza de cizalla es sobre los receptores plaquetarios, ms que sobre el FVW mismo. En cuanto a la inhibicin de estos procesos plaquetarios activados por la fuerza de cizalla, se ha visto que el cAMP o el cGMP inhiben la adhesin y la agregacin. La aspirina tiene un pequeo efecto en inhibir la agregacin inducida por la fuerza de cizalla. Agentes fibrinolticos inhiben la respuesta plaquetaria a la fuerza de cizalla, debido a la protelisis del FVW por la plasmina y t-PA. El mecanismo exacto por el cual la fuerza de cizalla induce agregacin plaquetaria no se conoce. Se ha observado una elevacin del Ca+2 citoplasmtico. Los multmeros de FVW interactan con la GPIb, causando aumento de calcio y la agregacin plaquetaria, efectos que seran potenciados por la unin del FVW al complejo activado GPIIb-IIIa en presencia de ADP liberado por las plaquetas activadas. Se sabe que la participacin de una compleja red de seales intracelulares, en que participan diversas protenas kinasas e interacciones entre las protenas de membrana plaquetaria con el citoesqueleto, como se comentar ms adelante. La fuerza de cizalla, adems de actuar sobre las plaquetas, tambin provoca en las clulas endoteliales la secrecin de prostaciclina (PGI2), la cual tiene accin vasodilatadora e inhibe la agregacin plaquetaria. Tambin secreta xido ntrico (NO), un potente vasodilatador e inhibidor de la adhesin y agregacin plaquetaria. El recuento de las plaquetas y la fuerza de cizalla estn dir ectamente relacionadas con la frecuencia de colisin (nmero de contactos plaqueta-plaqueta por unidad de tiempo) y eficiencia de colisin (colisiones plaquetarias que resultan en adhesin o agregacin), pr omoviendo por tanto la agregacin plaquetaria.
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En la circulacin sangunea, la fuerza de cizalla elevada (debido al flujo sanguneo rpido), tiende en parte a diluir las molculas procoagulantes y previenen la formacin de fibrina insoluble. El fenmeno trombognico es multifactorial y hay mayor propensin a que ocurra cuando el flujo sanguneo es lento. Como se ha indicado, las plaquetas no se adhieren a una capa de clulas endoteliales intactas, aunque estn sujetas a una elevada fuerza de cizalla, pero s lo hacen fuertemente a un subendotelio expuesto. Se han estudiado diversas molculas del subendotelio para intentar definir qu molcula es la ms importante en mediar la adhesin bajo el efecto de la fuerza de cizalla: (i) El colgeno fibrilar tipo I y III est presente en altas concentraciones en arterias y ambos unen FvW. Los monmeros de FVW muestran dos sitios de unin para estos tipos de colgeno, de los cuales solo uno es relevante. El tipo VI tambin une este factor, pero est en menor cantidad en sector arterial. Este tipo de colgeno no responde a la fuerza de cizalla elevada, pero s a baja fuerza de cizalla, unindose as a las plaquetas; este hecho sugiere que el colgeno tipo VI media la adhesin plaquetaria en vnulas y capilares, donde la fuerza de cizalla es menor; (ii) El FVW subendotelial, derivado de clulas endoteliales, puede ser ms activo que el FVW plasmtico en la iniciacin de la adhesin a flujo lento, pero por s solo no promueve la adhesin plaquetaria en ausencia de shear stress; sin embargo, en compaa de otros componentes, baja el nivel del umbral de esta fuerza para que se produzca la adhesin; (iii) El fibringeno tambin se encuentra en la superficie del endotelio vascular y junto a la fibrina en placas aterosclerticas. La fibrina tambin une a las plaquetas y se ha visto que en fuerzas de cizalla elevadas la formacin de trombo plaquetario sobre la fibrina es relativamente ms dependiente de FVW y GPIb, mientras que en niveles ms bajos es relativamente ms dependiente de GPIIb-IIIa; (iv) Otras molculas implicadas en la adhesin y que interactuaran con las glicoprotenas plaquetarias son laminina, trombospondina, fibulina-1 y fibr onectina. La fibulina-1,
recientemente descrita, es una protena que puede asociarse a otros constituyentes de la matriz como la laminina y la fibronectina y tambin al fibringeno; favorece la adhesin mediante formacin de puentes de fibringeno con las plaquetas. La fibronectina media la adhesin plaquetaria a travs de su unin a GPIcIIa y GPIIb-IIIa en las plaquetas. La trombospondina se piensa que se une a CD36. 5.2. Agregacin plaquetaria La agregacin plaquetaria es el proceso de unin de las plaquetas entre s para formar el trombo. Entre los agonistas plaquetarios que se han estudiado in vitro, los que tienen mayor relevancia fisiolgica parecen ser la trombina, el ADP, la adrenalina, el colgeno, y el cido araquidnico. En la tabla 19-4 se muestran los agonistas, clasificados segn su capacidad de activacin plaquetaria. Como agonistas fuertes se consideran los que pueden inducir la secrecin con independencia de la agregacin, y a altas concentraciones, de modo independiente a la sntesis de tromboxano. En cambio los agonistas dbiles requier en agregacin y sntesis de tromboxano para una respuesta completa. Si la activacin se realiza en plaquetas en suspensin, la primera respuesta morfolgica al inductor es su cambio de forma, de disco a esfera con emisin de pseudpodos. Desde el punto de vista bioqumico, es necesario el cambio conformacional del receptor GPIIb-IIIa a la forma adhesiva, capaz de unir fibringeno y formar puentes entre plaquetas fsicamente prximas para producir agregacin plaquetaria con cualquier inductor. La unin del fibringeno, a su vez, refuerza la activacin plaquetaria, y favorece la secuencia bioqumica que lleva a la secrecin y la sntesis de TXA2. El uso de tcnicas agregomtricas ha permitido el estudio bioqumico y fisiopatolgico de este proceso. La agregometra ptica es el mtodo ms utilizado y el que ha proporcionado ms informacin sobre la fisiopatologa plaquetaria y el efecto de frmacos antitrombticos.
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Tabla 19-4. Agonistas ms comunes que inducen respuesta plaquetaria Fuerza del estmulo Dbil Intermedia Fuerte
PAF, Platelet activating factor
Agonista ADP, adrenalina, colgeno (dosis baja), vasopresina, Serotonina, PAF Tromboxano A2 Trombina, colgeno (dosis alta), ionforo A23187
5.3. Secrecin y reclutamiento La reaccin de liberacin consiste en la extrusin de los grnulos citoplasmticos y su contenido al medio extracelular. La secrecin de los grnulos requiere una menor estimulacin que la de los grnulos densos o lisosomas. Este proceso es dependiente del calcio citoslico. Morfolgicamente, en una primera etapa, se produce la centralizacin de los grnulos y posteriormente una fusin de los mismos con la membrana del sistema canalicular abierto y la ulterior salida a travs de los poros que comunican este sistema con el exterior. La secrecin tiene una gran importancia funcional ya que amplifica la respuesta activante del estmulo inicial en las plaquetas secretoras. Adicionalmente, el liberado de las plaquetas activadas es un agonista fisiolgico complejo que promueve la activacin de otras plaquetas induciendo el reclutamiento, una etapa esencial en el crecimiento del trombo. Estudios recientes indican que tanto la secrecin plaquetaria como la actividad reclutadora de los liberados de las plaquetas activadas se modulan por su interaccin con otras clulas sanguneas. La interaccin leucocito-plaqueta inhibe, mientras que la interaccin eritrocito-plaqueta incrementa la reactividad plaquetaria. Estos son pr ocesos regulados bioqumicamente y modifica el efecto de algunos fr macos antitrombticos, especialmente de la aspirina. Por otra parte, las substancias liberadas o expuestas en la membrana de las plaquetas activadas participan en las interacciones de las plaquetas con las restantes clulas sanguneas y el endotelio.
5.4. Consolidacin del trombo La activacin plaquetaria libera factores de la coagulacin contenidos en sus grnulos y convierte la superficie de las plaquetas en una superficie procoagulante que contribuye a la generacin de trombina. Tambin el dao al endotelio inicia la cascada de la coagulacin que culmina en la generacin de trombina y en la transformacin de fibringeno en fibrina. La formacin de trombina es la etapa final de la hemostasia primaria. La fibrina formada, se intercala entre las clulas del trombo plaquetario y en la superficie externa del mismo. El trombo se consolida mediante la retraccin del cogulo, un proceso mediado por GPIIb-IIIa, que asocia fuertemente las clulas a la fibrina, haciendo el tapn hemosttico prcticamente impermeable y capaz de resistir la presin del flujo sanguneo. La activacin de las plaquetas con colgeno o trombina produce la emisin de microvesculas, con un dimetro de 200-800 nm. En general exponen fosfolpidos procoagulantes y pueden unir algunos factores de coagulacin como Xa, Va, protena S y fibrina, por lo que se cree contribuyen a la actividad procoagulante y a la for macin del trombo. Tambin se ha comprobado que pueden exponer P-selectina, y por tanto interaccionar con otras clulas que unen el ligando, como leucocitos u otras plaquetas. 6. SECUENCIA BIOQUMICA DE LA ACTIVACIN PLAQUETARIA La activacin plaquetaria es un proceso modulado dinmicamente por seales activantes e inhibidoras a las que se encuentra
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expuesta la superficie de la clula. Como se ha mencionado, entre los agonistas plaquetarios se incluyen macromolculas de la matriz subendotelial (colgeno, FVW) hormonas cir culantes (adrenalina, vasopresina), substancias generadas en la lesin vascular como trombina, substancias liberadas por las plaquetas activadas (ADP, TXA2, serotonina) o generadas por otras clulas. Las substancias inhibidoras ms relevantes son la prostaciclina, el xido ntrico y las ecto-ADP-asas de membrana, que ejercen una funcin tromborreguladora. Las plaquetas poseen diversos mecanismos y
estrategias por los que los estmulos extracelulares se transmiten al interior de la clula, que resulta en la respuesta funcional apropiada. Esto se lleva a cabo con la participacin de distintos mecanismos complejos y altamente coordinados de transmisin de seales, an no bien caracterizados. Estos incluyen, los receptores, la activacin de protenas que unen nucletidos de guanina (protenas G), metabolismo del fosfatidlinositol, metabolismo del cido araquidnico, movimientos de calcio, reorganizacin del citoesqueleto y diversos procesos de fosforilacin de protenas en serina/ treonina y/o en tirosina que juegan un papel esencial en la transmisin de seales (figura 19-6).
Figura 19-6. Transduccin de seales en la activacin plaquetaria. Aunque los distintos agonistas plaquetarios muestran diferencias especficas en los mecanismos de transduccin de seales, tambin existen elementos comunes. Algunos agonistas solubles como la trombina o el TXA2 actan a travs de receptores unidos a protenas G, que activan la fosfolipasa beta (PLC), iniciando el metabolismo del fosfatidlinositol para dar lugar a la formacin de diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3), que a su vez, activan a la protena kinasa C (PKC) y promueven el aumento de la concentracin de calcio en el citosol [Ca2+]i. En cambio, la sealizacin a travs de receptores integrina inician la seal por activacin de protena (s) kinasas, que a su vez se requieren para activar a la fosfolipasa gamma (PLC), lo que igualmente inicia el metabolismo del fosfatidlinositol. El aumento de calcio citoslico [Ca2+]i, a su vez, activa varios procesos dependientes de calcio, como la activacin de la kinasa de la cadena ligera de la miosina (MLCK), que participa en el cambio de forma de las plaquetas, la activacin de la fosfolipasa A2 (PLA2), que libera cido araquidnico (AA) de los fosfolpidos para la sntesis de TXA2 y de otros eicosanoides o la polimerizacin de actina y la reorganizacin del citoesqueleto, que permite el ensamblaje de molculas de sealizacin. La activacin de la PKC fosforila P-47 (pleckstrina), que contribuye al proceso secretor. PKC y tirosina kinasas participan en el cambio conformacional de GPIIb-IIIa a la forma adhesiva, capaz de unir fibringeno, que es el punto central del proceso agregatorio. A su vez, la unin del fibringeno al receptor inicia otra cascada de sealizacin mediada por fosforilacin de protenas en residuos tirosina.
6.1. Receptores plaquetarios que participan en la transduccin de seales. Los receptores plaquetarios, en lo que se refiere a los mecanismos de sealizacin, pueden dividirse en dos grandes grupos. Por una parte, los que inician la sealizacin por protenas G y
responden a agonistas solubles como la trombina, el tromboxano o el ADP y por otra, los receptores integrina cuyo mecanismo de sealizacin se inicia por fosforilacin de protenas en tirosina, aunque en ambos casos, la fosforilacin de protenas juega un papel
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importante en la sealizacin subsiguiente. Los receptores unidos a protenas G, tienen un dominio extracelular, siete dominios transmembrana unidos entre s y un corto dominio intracelular al que se acopla la protena G. Los receptores integrina tienen en comn que pueden enviar seales de modo bidireccional entre sus dominios extracelulares e intracelulares. El ejemplo ms representativo es el receptor GPIIb-IIIa. Como se muestra esquemticamente en la figura 19-6, los dos tipos de receptores activan una fosfolipasa C (PLC) que inicia el metabolismo del fosfatidlinositol. Sealizacin iniciada por el TXA 2 . La interaccin del TXA2 con su receptor se acopla a Gq y G12/G13 y como se ha dicho, activa a la PLC, mientras G12/G13 regula la fosforilacin de MLCK. El aumento del calcio citoslico y la activacin de PKC, activa al receptor GPIIb-IIa y el proceso secretor. Sealizacin iniciada por trombina. La trombina estimula a las plaquetas por varios receptores, incluyendo el complejo GPIb-IX-V y los conocidos como receptores activados por proteasas (PAR). En plaquetas, la trombina acta sobre PAR-1 y PAR-4, ambos unidos a protenas G (Gq y probablemente, G12/13), aunque PAR1 se cree que puede actuar tambin sobre Gi. El efecto de trombina sobre PAR-1 inicia diversas vas sealizadoras y activacin de varias kinasas incluyendo tirosina, serina/treonina, MAPK y PI3K (ver ms adelante). PAR-4 tambin inicia la activacin, pero es menos efectivo que PAR1. La activacin del complejo GPIb-IX-V y de los receptores PAR, activa la PLC, iniciando el metabolismo de fosfoinostidos (figura 19-6), que concluye con la activacin de GPIIb-IIIa. A los mecanismos sealizadores que regulan la actividad de GPIIb-IIIa, nos referiremos ms adelante. Sealizacin iniciada por el ADP. Como se ha mencionado anteriormente, el ADP estimula a las plaquetas a travs de dos receptores purinrgicos, P2Y1 y P2Y12. El receptor P2Y1 est unido a Gq y su activacin se asocia con la PLC, mientras que P2Y12 se asocia a Gi, y acta inhibiendo la adenilato ciclasa, lo que potencia la activacin plaquetaria por inhibicin de la sntesis de AMPc. Ambos receptores tienen un papel complementario, el P2Y1 inicia la activacin y el P2Y12 la mantiene. La activacin plaquetaria mediada por ADP tiene un papel importante en la activacin plaquetaria en
sistemas de flujo elevado y en el reclutamiento plaquetario. El bloqueo de P2Y12 por tienopiridinas (ticlopidina, clopidogrel) en pacientes con patologa vascular, ha mostrado un efecto equivalente al de la aspirina como droga antitrombtica. 6.2. Protenas G Las pr otenas G son una familia de guanosintrifosfato hidrolasas compuestos de subunidades y g. Se han identificado, al menos 20 isoformas de la cadena , 5 y 10 . Las subunidades y g forman un complejo que puede unirse a diferentes unidades para formar el heterodmero. Es la subunidad la que se utiliza para clasificar las protenas G. Se localizan en la cara interna de la membrana donde sirven de puente entre los receptores de membrana y molculas efectoras intracelulares, que generan segundos mensajeros o regulan canales inicos. Funcionan como interruptores moleculares, cambiando entre una conformacin inactiva en la que unen GDP a la forma activa en la que unen GTP. En las plaquetas las protenas G mejor caracterizadas son: Gq, G12, Gi y Gs. Gq y G12 se asocian a la activacin de PLC. La sealizacin va Gi o Gs regula la formacin AMPc mediante inhibicin de la actividad de la adenilato ciclasa (Gi) o su activacin (Gs), respondiendo a seales activantes o inhibidoras, respectivamente. La activacin de la adenilato ciclasa por un estmulo inhibidor (ej. prostaciclina) va Gs, aumenta la tasa de ampc, que activa una protena kinasa (PKA) que se opone al aumento del calcio citoslico e inhibe la activacin (figura 19-6). 6.3. Fosfolipasa C. El estmulo plaquetario a travs de un receptor que sealiza por Gq o G12 induce la activacin de PLC, que inicia el metabolismo del fosfatidl inositol y la formacin de importantes mediadores lipdicos: el diacilglicerol (DAG) y el inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3). El DAG activa la protena kinasa C (PKC) que media en varios aspectos de la activacin plaquetaria, ej. el cambio conformacional del receptor GPIIb-IIIa. El IP3 induce la liberacin del calcio del sistema tubular denso produciendo un aumento del calcio citoslico. Este aumento del calcio citoslico, a su vez iniciar la activacin de los procesos dependientes del calcio en la plaqueta, indispensables para la continuacin del proceso activante (figura 19-6). 6.4. Calcio. El incremento de calcio en las
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plaquetas activadas est regulado por su liberacin de los depsitos intracelulares por un mecanismo asociado a IP3 y su entrada a travs de canales de calcio en la membrana. Una va importante de entrada de calcio es el regulado por el contenido de calcio de los depsitos o SMCE (store-mediated calcium entry), un proceso todava no resuelto, en el que se han propuesto mecanismos de fosforilacin de protenas en serina/treonina y en tirosina. El nivel de calcio en el citoplasma de las plaquetas se encuentra tambin regulado por las tasas de AMPc en la clula. 6.5. Fosfolipasa A2. La fosfolipasa A2 (PLA2) libera cido araquidnico (AA) de la posicin 2 de los fosfolpidos de la membrana, que es el paso inicial y limitante en la sntesis de eicosanoides. De las distintas fosfolipasas celulares la PLA2 citoslica de 85 kDa es la encargada de liberar AA. La activacin de cPLA2 est regulada por la tasa de calcio citoslico, necesario para la unin de la enzima a la membrana, y su fosforilacin en los residuos Ser505 y Ser727 por la p38 MAPK y MNK1 kinasas, respectivamente. El AA liberado se metaboliza por la ciclooxigenasa (COX-1) o endoperxido sintetasa a endoperxidos cclicos PGG2/PGH2, compuestos proagregatorios muy inestables que se transforman por la tromboxano sintetasa a TXA2. El AA liberado, tambin se metaboliza por la 12-lipoxigenasa de las plaquetas al hidroxicido 12-HETE, que junto con restos de AA libre en los segundos iniciales de la activacin plaquetaria participa en el metabolismo transcelular de eicosanoides con otros tipos celulares de la sangre. Esta comunicacin bioqumica mediada por eicosanoides entre distintos tipos celulares modifica la r eactividad de las clulas participantes y contribuye a los efectos de las interacciones celulares entre las plaquetas, otras clulas sanguneas y el endotelio. Desde un punto de vista funcional, la sntesis de TXA2 es relevante como amplificador de la respuesta plaquetaria e inductor del reclutamiento. Recientemente se ha evidenciado su capacidad para inducir exposicin de fosfatidlserina en un porcentaje de eritrocitos normales, que adquieren as un fenotipo protrombtico. La inhibicin de la COX-1 por aspirina, y consecuentemente de la sntesis de TXA2, reduce en un 25% la aparicin de eventos isqumicos en pacientes con patologa vascular.
6.6. Fosforilacin de protenas en las plaquetas. Entre las kinasas con mayor inters para la funcin de las plaquetas estn la protena kinasa C (PKC), la kinasa de la cadena ligera de la miosina (MLCK), las mitogen-activated kinasas (MAPKs), la protena kinasa A (PKA) y las pr otenas tirosina kinasas (PTKs) principalmente. 6.6.1. Protena kinasa C. La PKC es en realidad una familia de kinasas que fosforilan protenas en los aminocidos serina/treonina. Actualmente se conocen nueve miembros de esta familia de kinasas codificadas por genes distintos, de las que seis se han encontrado en las plaquetas. Es una enzima citoslica que requiere para su activacin DAG. El DAG formado, como se ha dicho, por la PLC actuando sobre el PIP2, queda unido a la membrana de la plaqueta, y la PKC citoslica pasa a la membrana unindose al DAG para ser activada en presencia de calcio y de fosfatidlserina. La activacin de esta kinasa da lugar a la fosforilacin de una protena de 47 kDa denominada pleckstrina, de funcin no bien esclarecida, aunque se piensa que participa en el proceso de liberacin plaquetaria, y se utiliza como marcador experimental de la activacin de la kinasa. Los steres de forbol producen experimentalmente una estimulacin directa de la PKC asociada a la agregacin de las plaquetas. Esta accin se ha sugerido que pueda estar mediada por la fosforilacin del dominio citoplasmtico de 3 de la GPIIb-IIIa lo que podra facilitar la unin del fibringeno y por tanto la agregacin. Se ha sugerido que la PKC puede contribuir tanto a la activacin de las plaquetas como a su inhibicin, posteriormente. El efecto inhibidor podra tener lugar reduciendo la actividad de la PLC o, como se ha descrito ms recientemente, por el efecto de su substrato fosforilado, la pleckstrina, que forma un complejo con otra enzima para bloquear la sealizacin calcio dependiente. El aumento del calcio citoplasmtico mediado por el IP3 tambin activa a la MLCK que cuando est asociada a la calmodulina fosforila la cadena ligera de la miosina (20 kDa), la cual participa en el proceso de cambio de forma de la plaqueta. 6.6.2. MAP kinasas. Otros mecanismos interesantes de fosforilacin en las plaquetas activadas son los mediados por las MAP kinasas (MAPK) que son serina/treonina kinasas. Su actividad est a su vez regulada por fosforilacin en tirosina y/o en serina/treonina. Las MAPK
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participan, activamente, en la transmisin del estmulo de clulas nucleadas donde juegan un papel central en los procesos de diferenciacin y proliferacin celular. La estimulacin de las plaquetas produce la activacin de la cascada de MAPK, de las que hasta ahora se conocen tres: p42 MAPK, p44 MAPK, p38 MAPK. La estimulacin de las plaquetas con trombina activa a la p42 MAPK y la p38 MAPK. Esta ltima, es conocido que fosforila a la PLA2 citoslica, aumentando su actividad cataltica. 6.6.3. Tirosina Kinasas. La primera protena tirosina kinasa (PTK) identificada por Hunter y Sefton fue la protena transformadora del virus del sarcoma de Rous, una protena de 60 kDa denominada pp 60src. Las protenas tirosina kinasas que hoy conocemos pueden clasificarse en dos grupos: (a) los receptores con actividad tirosina kinasa, que poseen un dominio extracelular y participan en la sealizacin de factores de crecimiento y hormonas como la insulina, y (b) las PTKs intracelulares, que carecen por tanto de dominios extracelular o transmembrana. Estas ltimas son las ms abundantes e importantes en la regulacin de la funcin de las plaquetas. Se cree que los receptores que poseen actividad tirosina kinasa se autofosforilan en su dominio citoplasmtico al recibir el estmulo e inician as la cascada de sealizacin. Sin embargo, la activacin de las PTKs intracelulares requiere la participacin de otr os mediadores transmembrana y/o intracelulares que conecten la seal del receptor de membrana con las kinasas. El modo en que esto ocurre no es conocido y ser probablemente, por su importancia, un objetivo en la investigacin en los prximos aos. En la actualidad se han identificado distintos grupos de PTKs no receptoras. Estos incluyen las conocidas como src, FAK, syk, JAK y csk, entre otras, siendo las mencionadas las ms asociadas a la transmisin del estmulo en las plaquetas. En realidad, cada uno de estos tipos de PTKs es una familia compuesta por varios miembros que comparten entre s distintos grados de homologa. Por ejemplo, la familia src est compuesta por 8 tirosina kinasas: fyn, lyn, hck, yes, lck, fsr, blk e yrk. De ellas, las cuatro primeras se han identificado en las plaquetas y
adems, varias de ellas pueden presentarse en distintas isoformas. Sus masas moleculares aproximadas son: fyn 59-60 kDa, lyn 54-58 kDa y hck 61 kDa. Src es la tirosina kinasa ms prominente, y constituye el 0,2-0,4% de las protenas totales de las plaquetas, mientras el resto presenta concentraciones entre 10 y 50 veces menores que src. La figura 19-7A muestra, como ejemplo, los componentes estructurales comunes a las PTKs de la familia src. Constan de un dominio cataltico, tambin denominado SH-1. El dominio SH-2, de aproximadamente 100 aminocidos presenta una caracterstica muy interesante, y es que puede unirse a otras protenas que tengan una secuencia especfica de aminocidos conteniendo una o varias tirosinas fosforiladas. El dominio SH-3 de aproximadamente 75 aminocidos, que de un modo anlogo, es capaz de asociarse a secuencias ricas en prolina de otras protenas. La capacidad de estas regiones SH-2 y SH-3 para ensamblar a las PTKs entre s o con otras protenas es el mecanismo por el cual las PTKs participan en la formacin de complejos multimoleculares de sealizacin. Hay que indicar que estos dominios SH-2 y SH-3 no son exclusivos de las PTKs, sino que aparecen en un gran nmero de protenas de otro tipo, como pr otenas del citoesqueleto o protenas sealizadoras. De este modo puede producirse la interaccin protena-protena entre dominios SH-2 y residuos fosforilados en tirosina o dominios SH-3 y regiones ricas en prolina, respectivamente. De esta forma se pueden formar una gran variedad de complejos entre protenas que presentan en su secuencia uno o varios de estos motivos estructurales. Adems las PTKs de la familia src pueden acilarse en su extremo N-terminal, permitiendo el anclaje de la PTK a la membrana celular. En estado inactivo, src presenta una fosforilacin en la tirosina 527. Esto provoca que la molcula se pliegue sobre s misma, de forma que se una Y527 intramolecularmente con su propio dominio SH-2 (figura 19-7B). Se crea as una estructura cerrada de la protena, en la que no estn accesibles el dominio kinasa ni los dominios SH-2 y SH-3. No est claro cul es la kinasa que provoca esta fosforilacin inactivante, aunque podra tratarse de la kinasa csk.
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Figura 19-7. Estructura (A) y esquema de activacin (B) de la protena kinasa src.
Cuando la plaqueta se activa, una fosfatasa no identificada defosforila Y527, lo que provoca que se despliegue la kinasa, adoptando una conformacin en la que son accesibles todos sus dominios. Adicionalmente, se requiere la autofosforilacin de Y416 para activar completamente la kinasa. En su extremo Nterminal src presenta varios puntos fosforilables por PKC. Se ha postulado que la fosforilacin de estas serinas por PKC podra aumentar la afinidad de src por sus substratos. Una vez activada, la kinasa src se trasloca al citoesqueleto, donde se encuentra asociada con distintas protenas de sealizacin, como la
fosfatidlinositol 3-kinasa (PI3-K), o la tirosina fosfatasa PTP1B. La tirosina kinasa Syk (72 kDa) se detect, en las plaquetas, en 1992. Presenta dos dominios SH-2 y se activa rpidamente (10 segundos) cuando las plaquetas se estimulan con trombina. Sin embargo, su activacin completa solo ocurre despus de la unin del ligando a la GPIIb-IIIa. Su actividad est regulada por fosforilacin, aunque se desconoce si se trata de una autofosforilacin o si sta se produce por otras kinasas. Se ha asociado con los receptores del colgeno y los del tipo Fc-RIIA, ya que su
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actividad aumenta rpidamente al estimular los mismos. La tirosina kinasa FAK (125 kDa), no tiene dominios SH-2 ni SH-3. Su actividad se regula por fosforilacin en tirosina, probablemente por autofosforilacin, en plaquetas estimuladas, lo que puede permitir que por esta va pueda asociarse a otras protenas, kinasas o no, que posean secuencias SH-2. La fosforilacin de la kinasa FAK ocurre en etapas tardas de la agregacin de las plaquetas y depende totalmente de la activacin del receptor GPIIbIIIa y de la reorganizacin del citoesqueleto. En este sentido se ha comprobado que su activacin no tiene lugar en plaquetas de pacientes con tromboastenia de Glanzmann. Las tirosinas kinasas JAK son en realidad una familia de protenas (JAK 1, JAK2, JAK3) que tambin se autofosforilan en tirosina, en plaquetas estimuladas con trombina. Estas tirosinas kinasas carecen de dominios SH-2 y SH-3. Se piensa que la PTKs estn localizadas en la parte interna de la membrana plasmtica, desde donde estn bien situadas para servir de nexo entre los receptores transmembrana, las protenas del citoesqueleto y diversos sistemas enzimticos del citoplasma que participan en el sistema de sealizacin. En relacin a su funcin, aunque no bien esclarecida en la actualidad, se piensa que van a propiciar y a regular interacciones protena-protena, que a su vez van a favorecer la relocalizacin de molculas sealizadoras en el interior de la clula a posiciones efectivas para su accin. Esto es importante, por ejemplo, en relacin a los complejos de kinasas-fosfatasas necesarios para asegurar el control ajustado de los procesos de fosforilacin, o de las molculas de sealizacin que se traslocan del citoplasma al citoesqueleto reorganizado despus de la activacin de las plaquetas (como varias de las fosfolipasas C, tirosina kinasas, etc.), donde se ensamblan para formar complejos multimoleculares que pueden presentar unas estructuras parecidas a las zonas de adhesin focal presentes en otras clulas. Adems de las PTKs existen en las plaquetas tirosina fosfatasas. Hasta el momento se han identificado tres: PTP1B, SPH-1 y SPH-2. Su papel est pr obablemente asociado al mantenimiento de un nivel bajo de protenas fosforiladas en tirosina en las plaquetas en reposo. Esto se infiere del hecho de que un inhibidor de las mismas, el pervanadato, produce un espectacular incremento de la
fosforilacin en tirosinas y adems induce agregacin plaquetaria. El papel regulador de las tirosina fosfatasas es importante, ya que hoy existe evidencia de que la de fosforilacin en tirosina en las plaquetas que controla su funcin es un fenmeno muy regulado y modulado por la accin coordinada de las tirosina kinasas y fosfatasas. Sin embargo, probablemente su papel va ms all de limitarse a mantener el nivel de fosforilacin controlado, ya que existen evidencias de su participacin en el proceso de activacin de alguna kinasa, como es el caso de la sr c, al que nos hemos referido anteriormente. 6.6.4 Participacin de la fosforilacin en tirosina en aspectos funcionales de las plaquetas. El hecho de que la fosforilacin de protenas en tirosina en las plaquetas pudiese jugar un papel en la funcin de las plaquetas, empez a sospecharse a partir de 1986 en que el Dr. Golden y colaboradores encontraron que las plaquetas expresaban altos niveles de la tirosina kinasa pp60src. Tambin se encontr que la estimulacin de las plaquetas con trombina produca fosforilacin en residuos tirosina en varias protenas plaquetarias. Asimismo, se comprob que la aparicin de nuevas protenas fosforiladas en tirosina se produce no solo con trombina, sino tambin con otros agonistas plaquetarios. El siguiente e importante paso que puso en evidencia la relevancia de esta va de sealizacin en las plaquetas, fue su asociacin con algunos aspectos de la actividad del receptor GPIIb-IIIa, que es una etapa comn a la agregacin de las plaquetas inducida por todos los agonistas. La asociacin entre la unin del fibringeno al receptor GPIIb-IIIa y la subsiguiente fosforilacin de protenas en tir osina se confir m en pacientes con tromboastenia de Glanzmann que presentan un defecto en este receptor de membrana. Otro aspecto que confirma la importancia de esta ruta metablica en la funcin de las plaquetas deriva del uso de inhibidores especficos de las kinasas/fosfatasas. En este sentido se ha comprobado la inhibicin de la agregacin y de la secrecin de las plaquetas producida por su tratamiento con inhibidores especficos de las tirosina kinasas. La inhibicin de las tirosina kinasas reduce la liberacin del cido araquidnico de los fosfolpidos de las plaquetas y la sntesis de TXA2 mientras que el vanadato, una substancia que inhibe las tirosina fosfatasas, produce agregacin plaquetaria y
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liberacin de cido araquidnico. Estudios recientes en plaquetas tratadas con aspirina han puesto en evidencia que la fosforilacin en tirosinas es tambin un elemento esencial en el control de la funcin plaquetaria por vas COX1 independientes. Teniendo en cuenta que uno de los primeros aspectos que se relacionaron con la fosforilacin en tirosinas de las plaquetas fue la unin del fibringeno a la GPIIb-IIIa y la importancia de esta glicoprotena en la hemostasia y la trombosis, sta es una de las vas que presentan actualmente ms inters (ver punto 6.6.5). 6.6.5. Sealizacin a travs de la glicoprotena GPIIb-IIIa La glicoprotena GPIIb-IIIa (IIb3), como se ha comentado antes, es especfica de las plaquetas y de su clula precursora el megacariocito, y pertenece a la familia de los receptores integrinas. Es capaz de unir protenas que poseen la secuencia RGD (Arg-Gly-Asp), entre las que se incluyen el factor von Willebrand, el fibringeno, la fibronectina, y la vitronectina. En las plaquetas en reposo, el receptor presenta una conformacin inactiva incapaz de unir protenas adhesivas solubles. Sin embargo, cuando se produce la estimulacin plaquetaria, sufre un cambio conformacional que le permite la unin de los ligandos adhesivos. Esta modificacin del receptor a la forma adhesiva tiene lugar por mecanismos bioqumicos intracelulares de transmisin de la seal conocidos como sealizacin de dentro a fuera (inside-out) del receptor. Por otra parte, la unin del fibringeno a la conformacin activa del receptor inicia otra secuencia de procesos bioqumicos en direccin de fuera a dentro de la membrana (outside-in) que refuerza el proceso de agregacin. Un aspecto importante, y actualmente no completamente resuelto de este proceso, es el mecanismo bioqumico por el cual se produce el cambio conformacional del receptor a la forma adhesiva por mecanismos inside-out. Se cree que este efecto podra estar mediado por: (a) modificaciones en el dominio citoplasmtico del receptor, inducido por diversos mediadores intracelulares o (b) por protenas de membrana que puedan unirse a la integrina. La participacin de los dominios citoplasmticos de IIb o 3 en el cambio conformacional del
receptor derivan de observaciones en mutaciones naturales o experimentales en esta zona del receptor. En este sentido, se han descrito alteraciones en dos pacientes con una variante de la Tromboastenia de Glanzmann que presentan anormalidades genticas en la regin citoplasmtica de 3. En ambos casos los pacientes tienen alteraciones hemorrgicas de moderadas a severas, y a pesar de tener niveles normales de IIb3 sus plaquetas activadas no unen fibringeno ni agregan. Reproduciendo estas mutaciones en un sistema experimental como las clulas CHO a las que se hace que expresen IIb3, se ha confirmado que producen alteraciones en la afinidad de la glicoprotena para unir ligandos adhesivos. Esto confirma la implicacin de la zona 3 citoplasmtica en esta etapa inicial de activacin. Es posible que el cambio de afinidad del receptor se produzca por la unin a la zona citoplasmtica de molculas reguladoras. Se ha comprobado la existencia de varias de estas molculas en experimentos in vitro . Estas incluyen, por ejemplo, pr otenas del citoesqueleto (F-actina, -actinina, talina) o molculas de sealizacin (pp125FAK, calreticulina, 3-endonexina), aunque en la actualidad no existe evidencia de que esto tenga lugar en las plaquetas in vivo . De entre ellas, la 3 endonexina se ha comprobado que adems de tener capacidad para unirse a la zona citoplasmtica de la 3, puede modular la afinidad del receptor. No obstante, en la actualidad no existe evidencia de que estas uniones tengan lugar en plaquetas intactas. Entre las protenas de membrana que podran interaccionar con el receptor para cambiar su afinidad se han descrito varias que coinmunoprecipitan con la integrina como la calveolina, la CD47 y varias protenas tirosina kinasas. Otra posible va para inducir el cambio conformacional del receptor a la forma adhesiva es la fosforilacin de los dominios citoplasmticos del receptor. Se ha sugerido la participacin de procesos de fosforilacin tanto en serina/treonina como en tirosina. La participacin funcional de las fosforilaciones en tirosina en el cambio conformacional del receptor deriva de las observaciones iniciales del Dr. Shattil utilizando el anticuerpo monoclonal PAC-1, que reconoce especficamente la forma activa del receptor que ha sido posteriormente confirmado por otros autores. No es conocido sin embargo, si
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la fosforilacin es el mecanismo efector de la activacin del receptor, o si esta fosforilacin es una etapa necesaria para producir el ensamblaje del dominio citoplasmtico de 3 con otras molculas intracelulares que tengan dominios SH-2. Como hemos indicado anteriormente, la unin del fibringeno a la configuracin activa del receptor va a iniciar un proceso secuencial de sealizacin outside-in del que van a depender en ltimo termino la adhesin de las plaquetas a la matriz subendotelial, el tamao de los agregados plaquetarios, la retraccin del cogulo y la actividad procoagulante de las plaquetas. En esta etapa es importante la oligomerizacin del receptor, el agrupamiento de varios receptores unidos por protenas adhesivas en el plano de la membrana y la unin por puentes de fibringeno entre plaquetas contiguas. De este modo, la seal extracelular se transmite al interior de la clula y el receptor, adems de actuar como punto de unin de ligandos adhesivos se comporta como un emisor de seales a travs de la membrana hasta la zona intracelular (figura 19-5). En esta etapa, adems de la propia integrina participan molculas de sealizacin y protenas del citoesqueleto, propicindose la polimerizacin de la actina, el ensamblaje del citoesqueleto y la formacin de complejos multimoleculares por las interacciones protena-protena. 6.7. Kinasas lipdicas Un aspecto reciente e interesante es la participacin de una kinasa lipdica en este sistema de sealizacin de las plaquetas, la PI3K. Este enzima fosforila los inositoles en la posicin 3 del anillo bencnico, para formar PI(3,4)P2 y PI(3,4,5)P3. Existen dos isoformas de la enzima, activables por fosforilacin en tirosina. El inicio de su actividad est asociada a la activacin de la GPIIb-IIIa ya que se presenta alterada en pacientes con tromboastenia de Glanzmann y se bloquea con RGDS o inhibicin de tirosina kinasas con tyrphostin. Se ha visto que esta enzima co-precipita con las PTKs syk y src en lisados de plaquetas activadas. Su papel no est todava bien definido pero utilizando la wortmanina (un inhibidor de esta enzima) se ha visto que la agregacin plaquetaria se hace reversible posiblemente por inhibicin de la activacin sostenida del receptor. Tambin se ha descrito que la inhibicin de la PI3-K bloquea parcialmente la sealizacin outside-in del
receptor GPIIb-IIIa en el ensamblaje de la actina, y en la agregacin de las plaquetas. La PI3-K se trasloca al citoesqueleto y en esta localizacin subcelular se ha comprobado que se asocia a travs de una regin SH-3 a la kinasa de adhesin focal FAK que tiene una secuencia rica en prolina. 6.8. Fosforilacin en la inhibicin plaquetaria En los puntos anteriores se han descrito los mecanismos de activacin de las plaquetas mediados por GPIIb-IIIa, pero tambin son de inters fisiopatolgico sus vas de inhibicin. La prostaciclina actuando a travs de una protena G especfica activa a la adenilciclasa y a la protena kinasa A (PKA) dependiente del AMPc. Otr o importante tromborregulador del endotelio, el xido ntrico, activa una kinasa dependiente de la guanilato ciclasa, la protena kinasa G (PKG). Se piensa que tanto la PKA como la PKG tienen un efecto inhibidor sobre la GPIIbIIIa a distintos niveles de la transduccin del estmulo, aunque el mecanismo ltimo no es todava conocido. Un posible mecanismo de esta accin es la fosforilacin de una protena de 50 kDa denominada VASP, que se asocia a la actina. VASP se fosforila en serina por substancias que activan a la PKA y a la PKG, y esta fosforilacin se asocia a una inhibicin de la funcin de las plaquetas. 6.9. Reorganizacin del citoesqueleto El citoesqueleto de las plaquetas contiene dos componentes estructurales basados en filamentos de actina: (a) filamentos de actina que se encuentran en el citoplasma y median fenmenos de contraccin y (b) el citoesqueleto submembranoso, unido a la membrana citoplasmtica y que regula su for ma y estabilidad. En plaquetas en reposo, slo el 3040% de la actina est polimerizada en filamentos. Una modificacin importante que tiene lugar como consecuencia de la activacin de las plaquetas, es la reorganizacin de su citoesqueleto. Esto resulta en un rpido incremento de la polimerizacin de la actina y en la formacin de un entramado de nuevos filamentos en la periferia de la parte interna de la membrana plasmtica. Cuando se produce la agregacin plaquetaria, la reorganizacin del citoesqueleto se intensifica y esto resulta en una asociacin de la GPIIb-IIIa, varias protenas que se unen a la actina y molculas de sealizacin con el citoesqueleto reorganizado. El
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ensamblaje de la glicoprotena a las estructuras del citoesqueleto se piensa que regula las propiedades adhesivas del receptor y estabiliza la unin del fibringeno al mismo por mecanismos an no clarificados. Durante mucho tiempo se ha considerado la reorganizacin del citoesqueleto como un componente principalmente mecnico del sistema contrctil, responsable, por ejemplo, del cambio de forma de las plaquetas, la emisin de pseudpodos y la retraccin del cogulo. Los datos en la literatura de los ltimos aos hacen evidente que el citoesqueleto juega tambin un papel muy importante en la transmisin de seales a travs de la membrana y en la regulacin de los mecanismos de sealizacin en las plaquetas. Existe un gran nmero de molculas que en las plaquetas en reposo se encuentran en el citoplasma y que como consecuencia de la activacin se relocalizan en el citoesqueleto. Entre stas se encuentran varias protenas tirosina kinasas, fosfolipasas y otras molculas de sealizacin. De este modo, el citoesqueleto reorganizado da soporte para que se produzca el ensamblaje de glicoprotenas, protenas contrctiles del propio citoesqueleto y diversas molculas de sealizacin (PTKs, PI3-K, PLC, etc.) para for mar los complejos multimoleculares que se cree regulan la respuesta funcional de las plaquetas. Aunque el mecanismo exacto de la remodelacin del citoesqueleto no es completamente conocido, se ha implicado la participacin activa en el mismo tanto de las protenas G de bajo peso molecular (rho, rac) como la mediacin del metabolismo del fosfatidlinositol regulando los mecanismos de polimerizacin de la actina a travs de efectos en sus protenas asociadas (ej. profilina). La funcin de estos complejos multimoleculares en el citoesqueleto podra ser la unin de receptores glicoprotenas con otras pr otenas celulares como sistema de sealizacin hacia el citoplasma de la clula. Si se impide la reorganizacin del citoesqueleto por el tratamiento de las plaquetas con citocalapsina D (una substancia que inhibe la polimerizacin de la actina) se inhibe la activacin mediada por protenas G de la PLC, disminuye la activacin inicial de la GPIIb-IIIa, y se inhibe la fosforilacin de protenas en tirosina dependientes de GPIIb-IIIa. Esto implica una regulacin por la polimerizacin de la actina y la reorganizacin del citoesqueleto de estos procesos cruciales en la transmisin del estmulo en las plaquetas.
Adems de la conocida funcin contrctil del citoesqueleto y su papel esencial en la retraccin del cogulo, el ensamblaje de la actina y de sus protenas asociadas, toma un papel protagonista en el escenario de la activacin de las plaquetas. Consideraciones finales y perspectivas futuras en estudios de transduccin de seales Las bases moleculares de la activacin de las plaquetas podran ser vistas como un gran puzzle, en cuya construccin se ha avanzado mucho en los ltimos aos, y del que conocemos actualmente la existencia de muchas piezas, pero an falta saber dnde y cmo colocar cada una de ellas, para tener una perspectiva completa. Puntos claves de este puzzle son los receptores de membrana, la reorganizacin del citoesqueleto y los mecanismos bioqumicos de transduccin de seales que integran la respuesta funcional de las plaquetas. Un factor comn que parece implicado en la regulacin de todos estos puntos claves es la fosforilacin de aminocidos especficos en serina, treonina, y especialmente en tirosina. Se ha hecho tambin evidente que existen mecanismos que regulan dnde y cundo deben activarse las diferentes protenas kinasas o fosfatasas, aunque el funcionamiento de estos mecanismos de regulacin todava es poco conocido. La idea que podra extraerse de la informacin actualmente disponible, es que los procesos de fosforilacin se comportan como elementos coordinadores del trfico de seales que llegan a la clula. Esta accin podra tener lugar por una parte, diversificando adecuadamente la seal inicial de membrana para que llegue a las distintas vas metablicas cuya accin conjunta sea necesaria para la respuesta final de la clula. Por otro lado, parece que puedan actuar integrando y asociando las molculas de sealizacin adecuadas y adems, que esto tenga lugar en la localizacin subcelular necesaria. Estas funciones pueden llevarlas a cabo facilitando, como se ha dicho, las interacciones protena-protena dentro de la clula. Esto tiene lugar debido a la existencia de secuencias especficas en algunas de estas protenas que son susceptibles de unirse a substratos fosforilados en otras, como las secuencias SH-2 y SH-3, formando un entramado. Existen adems otras protenas que tambin
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contribuyen al ensamblaje de los complejos de sealizacin como las protenas adaptadoras, protenas mantenedoras del complejo de sealizacin o protenas de anclaje, que amplan el repertorio de posibilidades por los que puede realizarse el ensamblaje de protenas y la formacin de complejos multimoleculares. Estos elementos estructurales, en distintas combinaciones, pueden dar lugar a diferentes respuestas bioqumicas o funcionales en las clulas. En las plaquetas se ha descrito la existencia de un cierto nmero de molculas adaptadoras (Grb2, shc, vav, c-Cbl, crkl y paxillina), que contienen uno o varios de los motivos estructurales necesarios para propiciar y ampliar las interacciones protenas-protenas mediadas por tirosina kinasas. El estudio de su funcin, de su papel, y de su localizacin en el puzzle de la transduccin del estmulo en las plaquetas, ser un rea frtil de investigacin en los prximos aos. Finalmente se puede sealar, que el avance en el conocimiento de los mecanismos bioqumicos de transduccin de seales permitir el diagnstico de defectos congnitos o adquiridos de la funcin plaquetaria no caracterizados previamente. Por ejemplo, defectos en las distintas etapas de sealizacin mediadas por el receptor GPIIb-IIIa o participacin de estos mecanismos en plaquetas con distintos polimorfismos en las glicoprotenas de membrana. Tambin el avance de los conocimientos en esta rea podra propiciar el desarrollo de nuevas estrategias farmacolgicas antitrombticas. Por ejemplo, varios de los ltimos estudios con substancias que bloquean la unin del fibringeno a la GPIIb-IIIa estn mostrando resultados clnicos favorables en pacientes de alto riesgo trombtico.
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HEMATOLOGA
Captulo
20
SISTEMA DE LA COAGULACIN Y SISTEMA FIBRINOLTICO

Ivn Palomo G., Patricia Fardella B. y Jaime Pereira G.
1. Introduccin 2. Sistema de la coagulacin 2.1.Nomenclatura 2.2. Secuencia clsica de las reacciones 2.2.1. Va intrnseca 2.2.2. Va extrnseca 2.3. Estructura, sntesis y funcin de los factores de la coagulacin 2.3.1. Estructura genrica de las enzimas de la coagulacin 2.3.2. Estructura y activacin de los factores del sistema de contacto 2.3.3. Factores vitamina K dependientes 2.3.4. Factor tisular 2.3.5. Cofactores V y VIII 2.3.6. Complejos macromoleculares 2.3.7. Fibringeno, trombina, factor XIII y formacin de fibrina 2.4. Vida media de los factores 2.5. Sistema de la coagulacin in vivo 2.6. Regulacin del sistema de la coagulacin 2.6.1. Sistema antitrombina III 2.6.2. Sistema de la protena C 2.6.3. Inhibidor de la va extrnseca 2.6.4. Inhibidor de proteasas dependiente de protena Z 2.6.5. Anexinas 3. Sistema fibrinoltico 3.1. Componentes del sistema fibrinoltico 3.1.1. Plasmingeno 3.1.2. Activadores del plasmingeno 3.1.3. Plasmina 3.2. Regulacin del sistema fibrinoltico 3.2.1. PAI-1 y PAI-2 3.2.2. Alfa 2 antiplasmina 3.2.3. Inhibidor fibrinoltico dependiente de trombina
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Resumen
La hemostasia es el proceso por el cual se detiene el sangrado despus que se ha producido la ruptura de un vaso. En este proceso intervienen los vasos sanguneos y fenmenos de vasoconstriccin, las estructuras de soporte, las plaquetas y su interaccin con los vasos a travs del Factor von Willebrand, la cascada de coagulacin con sus dos vas (extrnseca e intrnseca) que trasformar el tapn plaquetario en un cogulo estable. Este proceso est finamente regulado por sistemas anticoagulantes naturales que inactivan los factores activados; entre stos, encontramos a la antitrombina III que es uno de los principales anticoagulantes, el sistema de la protena C y S y el inhibidor del factor tisular. Otro proceso importante es el de fibrinolisis, es decir la ruptura de los cogulos de fibrina para recanalizar el vaso y finalmente la reparacin de ste. Hasta hace unos aos atrs se describa que la cascada de la coagulacin era iniciada por activacin de la va intrnseca a travs de los factores de contacto; en la actualidad se sabe que la cascada es iniciada a travs de la va extrnseca, con activacin del factor VII por el factor tisular y que posteriormente se activan los factores de la va intrnseca de la coagulacin. Cabe destacar el rol de la trombina como una de las principales protenas de la coagulacin, la cual cumple mltiples funciones; agonista en la agregacin plaquetaria por accin sobre el receptor de trombina de la plaqueta, activador de factores de coagulacin como factor VIII, V y XI, transformar el fibringeno en fibrina y activar al factor XIII para que estabilice los monmeros de fibrina. Participa en la activacin de la protena C como anticoagulante natural a travs de su unin con la trombomodulina y, finalmente, activar el inhibidor de la fibrinolisis (TAFI). Otra protena de la coagulacin que debe destacarse es la plasmina, la cual al actuar sobre el fibringeno produce los productos de degradacin del fibringeno o FDP, los cuales tienen una actividad que favorece los fenmenos hemorrgicos, ya que por una parte interfieren con la polimerizacin de la fibrina y por otra producen disfuncin plaquetaria. Cuando acta sobre la fibrina rompe las uniones covalentes de los dmeros de fibrina produciendo fragmentos conocidos como dmero D. Adems la plasmina biodegrada algunos factores de coagulacin como el factor V, VIII, IX y XI. La prdida por cualquier razn del balance entre factores procoagulantes y anticoagulantes, producir trastornos que se pueden traducir clnicamente en episodios de hemorragias o trombosis.
1. INTRODUCCIN El concepto de hemostasia incluye los mecanismos que permiten detener el sangrado una vez producida la ruptura de un vaso sanguneo y mantener la sangre en forma fluida. Para facilitar su comprensin a la hemostasia se le separa, en hemostasia primaria y hemostasia secundaria. En la primera participan los vasos sanguneos, estructuras de sostn (vasoconstriccin) y las plaquetas que van a formar el tapn plaquetario (ver captulo 19). La denominada hemostasia secundaria se refiere al sistema de la coagulacin en que participan una serie de protenas plasmticas, las que una vez activadas van a formar fibrina que es la que da consistencia al tapn plaquetario. El proceso de coagulacin es autorregulado por la activacin de anticoagulantes naturales para impedir la propagacin del cogulo. Finalmente es el sistema fibrinoltico el encargado de iniciar
el proceso de reparacin de los vasos por medio de la degradacin de la fibrina. El sistema de la coagulacin est formado por protenas plasmticas solubles llamadas factores de la coagulacin, los que interactan en una serie de reacciones enzimticas en cadena para transformar el fibringeno soluble del plasma en un cogulo de fibrina, que se localiza en el sitio de ruptura vascular. Este sistema contiene varios mecanismos de regulacin necesarios para delimitar el proceso de la coagulacin, evitando el riesgo de generacin de fibrina en el resto del sistema vascular. La ausencia o disminucin de uno de los factores de la coagulacin altera el sistema y de acuerdo a la magnitud se va a manifestar como una enfermedad hemorrgica. Por otra parte, la ausencia, disminucin o disfuncin de alguna pr otena r eguladora del sistema de la
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coagulacin podra asociarse a fenmenos de trombosis. Situaciones similares se han descrito cuando se altera el sistema fibrinoltico. 2. SISTEMA DE LA COAGULACIN 2.1. Nomenclatura Los factores de la coagulacin son protenas,
fosfolpidos, lipoprotenas y calcio inico. Estos factores han sido denominados por nmeros romanos de I a XIII, de acuerdo con el orden de su descubrimiento y no al orden en que intervienen en el proceso o cascada de la coagulacin. En la tabla 20-1 se enumeran los factores de la coagulacin y se indican sus sinnimos y funciones.
Tabla 20-1. Nomenclatura y funcin de los factores de la coagulacin Factor I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII PK HMWK XIII Sinnimo Fibringeno Protrombina Factor tisular, tromboplastina tisular Calcio Factor lbil, proacelerina No asignado Proconvertina, Factor estable Globulina o Factor antihemoflico A Factor Christmas o antihemoflico B Factor Stuart Prower Factor antihemoflico C Factor de Hageman Precalicrena o Factor de Fletcher Ciningeno de alto peso molecular Factor estabilizador de la fibrina Funcin Estructural Serino Proteasa Cofactor/iniciador Cofactor Serino proteasa Cofactor Serino proteasa Serino proteasa Serino proteasa Serino proteasa Serino proteasa Cofactor Transglutaminasa
Los factores circulan en la sangre en forma inactiva, como cimgenos, excepto el factor III (factor tisular, FT) que normalmente no est en el plasma sino que se expresa sobre la superficie de diversas clulas, entre otras, monocitos, clulas endoteliales activadas y fibroblastos. Cuando un factor se activa, es decir, se transforma en enzima, se le agrega la letra a a la designacin numrica (por ejemplo el factor IX activado se designa como IXa). Existen varias excepciones a esta terminologa, el factor II (protrombina) en su forma activa se le conoce como trombina, ms que como IIa y cuando el factor I (fibringeno) sufre proteolisis parcial por la accin de trombina, se denomina fibrina, la cual constituye el producto final de la cascada de la coagulacin. El factor tisular y el calcio no son cimgenos y no tienen forma activada. Los cimgenos son activados a enzimas por una proteolisis parcial (figura 20-1). Un cimgeno es a su vez sustrato de una enzima que lo antecede en la secuencia de reacciones. Como enzima acta sobre otro sustrato que lo sigue
en la secuencia transformndolo a su vez en enzima.
Figura 20-1. Representacin esquemtica de la activacin de los factores de la cascada de la coagulacin. Los factores circulan como protenas inactivas (cimgenos) hasta que se activan a enzimas por proteolisis parcial.
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Los factores V y VIII circulan como procofactores y participan como activadores no proteolticos (cofactores) de enzimas, para ello deben activarse, denominndose Va y VIIIa. 2.2. Secuencia clsica de las reacciones Aunque la activacin in vivo de la coagulacin ocurre en for ma diferente a lo que, clsicamente, se ha conocido como va intrnseca y va extrnseca, esta forma de abordar el proceso de la coagulacin es til fundamentalmente para una mejor comprensin de las pruebas de laboratorio. En la va intrnseca participan los factores intrnsecos de la sangre, y la va extrnseca se caracteriza por requerir una sustancia activadora extrnseca, el factor tisular (FT) (figura 20-2). Cada va comprende reacciones entre un grupo especfico de factores.
Una vez activado el factor XIIa cataliza la conversin del factor XI (ciningeno) a XIa y en presencia de iones calcio el factor XIa activa al factor IX a IXa. El factor IXa junto al VIIIa se unen a fosfolpidos de membrana y en presencia de calcio forman el complejo tenasa que transforma el FX a FXa. A partir de la activacin del FX ambas vas continan una va comn hasta la formacin de fibrina. El factor Xa se une al factor Va sobre la superficie de una membrana fosfolipdica en presencia de calcio, generando el complejo protrombinasa que convierte la protrombina en trombina. Al romperse la protrombina se forma trombina y se libera un fragmento proteico de mayor tamao que es el fragmento 1+2 de la protrombina. El sustrato natural de la trombina es el fibringeno, al actuar la fibrina sobre l se generan fibrinopptidos A y B y los monmeros de fibrina que posteriormente se polimerizan y for man un cogulo de fibrina estable. Inicialmente los monmeros de fibrina se entrelazan por uniones no covalentes, pero el factor XIIIa crea un cogulo estable. 2.2.2. Va extrnseca La va extrnseca comprende la participacin del factor VII (protena plasmtica) y el factor tisular (cofactor), los cuales forman un complejo que se une a la superficie fosfolipdica por medio de puentes de calcio. El complejo FT-FVIIa activa el factor X a factor Xa. Como antes se indic a partir de la activacin del FX la secuencia de reacciones es la misma que si la activacin del sistema se iniciara por la va intrnseca. 2.3. Estructura, sntesis y funcin de los factores de la coagulacin Usando tcnicas de biologa molecular se ha podido conocer la ubicacin cromosmica y secuencia nucleotdica de los genes que codifican los factores de la coagulacin. En la tabla 20-2 se resumen las caractersticas estructurales, cinticas y funcionales de los factores de la coagulacin.
Figura 20-2. Esquema clsico de la coagulacin con las vas intrnseca, extrnseca y comn.
2.2.1. Va intrnseca La va intrnseca se inicia con la activacin del factor XII sobre superficies con carga negativa como protenas de la matriz, una de ellas es el colgeno; en esta reaccin interviene la calicrena y el ciningeno de alto peso molecular (HMWK) constituyendo el sistema de contacto. En condiciones in vitro , la super ficie de activacin o contacto corresponde al vidrio del tubo que contiene la sangre y se utilizan activadores como el kaoln, slica y otros.
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Tabla 20-2. Caractersticas de los factores de la coagulacin Factor I II III V VII VIII IX X XI XII PK HMWK XIII PM (kDa) 340 72 37 300 53 300 57 67 160 80 120 100 300 Sitio de sntesis Hgado Hgado Monocitos, Endotelio no vascular Hgado 2 Hgado 2 Hgado Hgado Hgado Hgado Hgado Hgado Hgado Hgado, Megacariocitos Nivel plasmtico 2.500 100 0 10 0 0.1 5 10 5 30 50 50 10 Nivel hemosttico1 >50 mg/dL 15 25% 10 15% 10 15% 10 20% 10 20% >20% 10% 10 15%
3 3
2 3%
1 El porcentaje expresa la cantidad mnima del factor que permite una hemostasia adecuada en condiciones fisiolgicas. Se considera que la actividad promedio normal para la poblacin es de 100%. 2 Los factores V y VII tambin se sintetizan en otros sitios. 3 Su disminucin no afecta la capacidad hemosttica del organismo. Su disminucin s afecta las pruebas de la coagulacin in vitro.
2.3.1. Estructura genrica de las enzimas de la coagulacin Los factores XII, XI, IX, X, VII, II y precalicrena una vez activados son enzimas que pertenecen a la misma familia de las proteasas digestivas,
tripsina y quimiotripsina. Por su potente actividad proteoltica procoagulante y por actuar en el interior de los vasos sanguneos, estos factores requieren de regulacin muy precisa. Su estructura se muestra en la figura 20-3.
Figura 20-3. Esquema de la estructura de los factores II, VII, IX, X, XI, XII y PK.
497
Las enzimas de la coagulacin son de mayor peso molecular que la tripsina y la quimiotripsina; tienen varios sitios funcionales y un sitio cataltico ubicado en la mitad del extremo carboxilo-terminal de las molculas. Estructuralmente corresponden a las llamadas serino-proteasas que poseen un residuo de cido asprtico (D), serina (S) e histidina (H) en el sitio cataltico. Esta zona es la encargada de la ruptura de los enlaces peptdicos, de reconocer los sustratos macromoleculares y de interactuar con los inhibidores que regulan su actividad. Cerca del extremo amino-terminal de factores vitamina K dependiente (Factores II, VII, IX y X), se encuentra un dominio rico en residuos de acido -carboxiglutmico. Esta regin consta de un sitio de reconocimiento que dirige la carboxilacin luego de su sntesis, y de 10 a 12 residuos de cido -carboxiglutmico, que unen calcio e interactan con las membranas celulares, hecho de gran importancia durante la activacin del sistema de la coagulacin. Las protenas C, S y Z, inhibidores naturales de la coagulacin (ver punto 2.6.2 y 2.6.4), tambin son protenas vitamina K dependientes. 2.3.2. Estructura y activacin de los factores del sistema de contacto La va intrnseca se inicia con la activacin de los factores del sistema de contacto, en el que participan los factores XII, precalicrena (PK) y el cofactor HMWK, los cuales activan al factor XI. Los factores contacto interrelacionan con el sistema del complemento, la pro-renina, bradicinina y plasmingeno (figura 20-4).
El factor XII es una glicoprotena formada por una cadena polipeptdica (80 kDa), que se activa por proteolisis dando lugar a fragmentos menores, algunos de ellos con actividad enzimtica. La precalicrena (100 kDa) forma complejo 1:1 con el HMWK. Por proteolisis genera su forma activa, la calicrena, en que est formada por 2 cadenas polipeptdicas, una pesada (52 kDa) y una liviana (33 kDa) unidas por puentes disulfuro. El HMWK (120 kDa) circula en complejo con el factor XI y las PK, facilitando la adhesin de estos factores a la superficie de contacto. La activacin de este sistema se inicia por la adherencia del factor XII a superficies con carga negativa a travs de una secuencia aminoacdica con carga positiva. La unin produce un cambio conformacional que lo hace muy sensible a la autoactivacin por cantidades traza de factor XIIa. Sustancias inertes como el vidrio, kaoln, cido elgico y celita activan el factor XII; esta propiedad se usa in vitro para activar el factor XII y realizar las pruebas de coagulacin que se utilizan en la prctica clnica. Tambin existen activadores biolgicos como el colgeno, el cartlago articular y la piel, entre otros. La formacin de complejos entre el HMWK, la PK y el factor XI favorece su unin a superficies donde las proenzimas sufren una proteolisis limitada por accin del factor XIIa. Este ltimo convierte la PK y el factor XI en serino proteasas activas: calicrena y factor XIa, respectivamente. La calicrena activa el factor XII adherido a superficies en una reaccin ms rpida que la autoactivacin inicial. La calicrena hidroliza el HMWK liberando bradiquinina, que acta como vasodilatador y aumenta la permeabilidad vascular. La molcula de HMWKa tiene ms afinidad por las superficies aninicas y ms actividad como cofactor en la generacin de calicrena y factor XIa. Adems, la calicrena activa directamente al plasmingeno transformndolo en plasmina, escinde el C3b del complemento y convierte la pro-renina en renina. As, la activacin del sistema de contacto asocia el mecanismo de la coagulacin con la respuesta inflamatoria y la reparacin tisular. Las deficiencias de los factores de contacto son
Figura 20-4. Funcin de los factores de contacto en otros sistemas fisiolgicos.
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muy poco frecuentes en clnica. Se manifiestan por un tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) prolongado en ausencia de sangrado. El dficit hereditario de Factor XII es el ms frecuente dentro del grupo de los factores de contacto y es heredado en forma autonmica recesiva. Los niveles plasmticos en el homocigoto son <0.01 U/mL y en el heterocigoto 0.17-0.83 U/mL. Como se seal previamente son pacientes que no sangran y pueden tener tendencia a la trombosis. La prolongacin del TTPA es importante en el homocigoto y de menor magnitud en el heterocigoto. El diagnstico se confir ma cuantificando este factor. El dficit de precalicrena es un desorden poco frecuente y con pocas manifestaciones clnicas; sin embargo se manifiesta como un TTPA muy prolongado sin tendencia al sangrado. Se hereda en forma autosmica recesiva, los heterocigotos tienen niveles intermedios de precalicrena. Si se realiza un estudio de mezcla 1:1 con plasma normal y se deja incubar durante 10 min y el TTPA corrige se sospecha un dficit de precalicrena. El dficit congnito de ciningeno de alto peso molecular es el menos frecuente dentro de su grupo. El factor XI es un homodmero (160 kDa) compuesto por dos subunidades idnticas unidas por enlaces disulfuro. Es codificado en el brazo largo del cromosoma 4. En circulacin tambin forma un complejo con el HMWK. Su activacin rompe cada subunidad en un sitio, originando una estructura tetramrica, con 2 cadenas pesadas y 2 livianas; estas ltimas tienen el sitio activo. El factor XI activa al factor IX en presencia de calcio. En condiciones fisiolgicas es inhibido por antitrombina III, a1 antitripsina y por el inhidor liberado de plaquetas anti-Xa. 2.3.3. Factores vitamina K dependientes Los factores serino proteasas II, VII, IX y X, adems de las protenas reguladoras C, S y Z dependen de la vitamina K para expresar su potencial procoagulante y anticoagulante respectivamente. Estas protenas tienen 10 a 12 residuos de cido glutmico cerca del extremo amino-terminal llamados dominios Gla (figura 20-5), los cuales se generan en la
carboxilacin del glutamato por la enzima carboxilasa vitamina K dependiente, localizada en la membrana del retculo endoplsmico rugoso. Los dominios Gla permiten unir calcio, hecho que favorece la unin a los fosfolpidos aninicos de las superficies celulares activadas, especialmente las plaquetas.
Figura 20-5. Gamma-carboxilacin de los factores vitamina K dependientes.
La vitamina K necesaria para la sntesis de estos factores debe estar en su forma reducida (Vitamina K-Hidroquinona, KH2); en el hgado se encuentra en estado de quinona, la que debe ser reducida por la vitamina K reductasa a KH2 que participa en el proceso de carboxilacin del glutamato. Luego sta se oxida por accin de la carboxilasa a vitamina K epxido y sta por la epxido reductasa es reducida a vitamina K quinona, completando as el ciclo de la vitamina K. La estructura de la vitamina K se muestra en la figura 20-6.
Figura 20-6. Estructura qumica de la vitamina K.
La carboxilasa dependiente de vitamina K es una pr otena de transmembrana (758 aminocidos) que se encuentra en el retculo
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endoplsmico rugoso. Su extremo aminoter minal es hidrofbico, presenta varios dominios transmembrana y est en contacto con el citoplasma de la clula. El extremo carboxiterminal es hidroflico y est en contacto con el lumen del retculo endoplsmico rugoso (figura 20-7).
aminocidos ubicados en el extremo aminoterminal. El propptido se une al sitio de unin de la enzima, el cual es distinto al sitio activo de la misma. Los factores vitamina K dependientes son sintetizados en forma de precursor (pre-pro-protena). El propptido permite la traslocacin del precursor a travs de una pre-convertasa en la membrana del retculo endoplsmico rugoso en donde es sintetizada. La pre-secuencia se adhiere a un pptido seal ubicado en el lumen del retculo endoplsmico y as la pr o-protena es reconocida por la carboxilasa. Tambin se ha visto que mutaciones puntuales, en este propptido reducen o eliminan sustancialmente la carboxilacin del sustrato en cultivos celular es. Luego que se produce la carboxilacin la protena sangunea es transportada al aparato de Golgi, en donde el propptido es removido y el factor vitamina K dependiente sale a circulacin en forma de zimgeno. El propptido es el mejor determinante de afinidad de las protenas vitamina K dependientes para la carboxilasa, mientras que los dominios vecinos Gla parecen jugar un rol menos importante en su reconocimiento. Existe marcada homologa entre los propptidos de los diferentes factores vitamina K dependientes humanos, lo que supone similar afinidad por la carboxilasa. Farmacolgicamente, los antagonistas de la vitamina K poseen estructuras similares a los distintos tipos de vitamina K, as los derivados de las indandiona simulan la vitamina K epxido, actuando como sustrato de la enzima vitamina K epxido reductasa dando lugar a una molcula similar pero no igual a vitamina K quinona, la cual no podr ser convertida en vitamina K hidroquinona, producindose carencia de esta ltima y generando factores inactivos. Por otro lado, los derivados de la cumarina, que poseen una estructura muy similar a vitamina K quinona compiten como sustrato por la vitamina K quinona reductasa que las convierte en una molcula similar a la vitamina K hidroquinona pero que no es funcional. El dficit de vitamina K o su inhibicin por cumarnicos se traduce en sntesis heptica y secrecin a la sangre, d e f a c t o r e s vitamina K dependiente descarboxilados o parcialmente carboxilados, sin capacidad para unir calcio y fijarse a las membranas, y por lo tanto con una escasa o nula funcin procoagulante. Los factores dependientes de vitamina K son
Figura 20-7. Funcin de la vitamina K en la biosntesis de los factores II, VII, IX y X.
La -glutamil carboxilasa cataliza dos reacciones qumicas: (a) adicin de dixido de carbono (CO2) al glutamato formando Gla y (b) oxidacin de la vitamina K hidroquinona a vitamina K 2,3 epxido, con la concomitante formacin de oxgeno y agua. Se ha visto in vitro que en presencia de concentraciones adecuadas de sustrato se forma Gla y vitamina K epxido en relacin 1:1. Este aparente acoplamiento de la epoxidacin y -carboxilacin sugiere que existe un mecanismo por el cual la enzima utiliza la energa liberada por la oxidacin de vitamina K y la conduce a la reaccin de -carboxilacin. En el paso de vitamina K hidroquinona a vitamina K epxido se sintetiza un intermediario, vitamina K alkoxide, el cual acta sobre el grupo -metileno del glutamato y formando un intermediario del glutamato llamado glutamato carbonion; luego por la adicin de CO2 a este intermediario se forma el Gla. En la carboxilasa existen dos cistenas catalticas (Cys99 y Cys950), una cistena que acta como una base dbil y cataliza la desprotonizacin de KH2 y formando as al intermediario alkoxide; la otra cistena coordina al CO2 catalizando el acceso de esta molcula al glutamato carbonion y for mando Gla. Mutaciones en dichas cistenas causan marcada disminucin en la actividad de la carboxilasa. Los factores vitamina K dependientes unen un pr opptido de aproximadamente 18
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esencialmente sintetizados en los hepatocitos. Los macrfagos tambin sintetizan los factores II, VII, IX y X, y las clulas endoteliales tienen la capacidad de sntesis y secrecin de la protena S. 2.3.4. Factor tisular El FT es una protena de transmembrana que se expresa en la mayora de las clulas no vasculares. Acta como receptor, y al mismo tiempo, como cofactor del factor VII. El FT (45 kDa) est compuesto de 263 aminocidos de los cuales 219 se localizan en el dominio extracelular, 23 en la porcin transmembranal y 21 en el dominio intracelular (figura 20-8).
La expresin anormal del FT juega un papel importante en la actividad procoagulante observada en la coagulacin intravascular diseminada, sepsis, cncer, trombosis arterial, y otras patologas. Existe una asociacin entre el FT y los procesos malignos; es as como el FT se ha relacionado con fenmenos de invasin y metstasis tumoral. Los eventos proteolticos que se generan en el cncer son dependientes de la expresin del FT, el cual se encarga de la formacin de una cubierta de fibrina en la superficie de clulas malignas que entran a la circulacin sangunea despus de desprenderse de un tumor primario; esta cubierta de fibrina protege a las clulas tumorales circulantes de la actividad inmunolgica del organismo hasta que se puedan adherir al endotelio de un lecho capilar y establecerse como una lesin metastsica. En las lesiones ateromatosas el FT se localiza alrededor del centro necrtico rico en lpidos, por ello se postula que el colesterol LDL y los lpidos oxidados inducen la expresin del FT. Por otro lado, la protena C reactiva, asociada a procesos inflamatorios, tambin induce la expresin del FT sobre las superficies celulares. 2.3.5. Cofactores V y VIII Los cofactores V y VIII presentan bastante homologa estructural (figura 20-9) y funcional.
Figura 20-8. Estructura general del factor tisular y del factor VII. F1 y F2, dominios fibronectina tipo 3; EGF, Factor de crecimiento endotelial; , dominio Gla.
En muchos tejidos el FT forma complejo con fosfolpidos de membrana que aceleran la coagulacin, ya que proveen sitios de unin para que los factores de la coagulacin reaccionen sobre superficies celulares. El gen que codifica el FT est localizado en el cromosoma 1p21-p22 y consiste en 6 exones y 5 intrones. El FT en condiciones normales no circula en el plasma; su expresin en superficie de los monocitos y en las clulas endoteliales puede ser inducida por lipopolisacridos, bacterias y citoquinas inflamatorias. Su expresin intravascular puede contribuir al estado procoagulante asociado con inflamacin o infeccin. La principal funcin del FT es formar complejo con el factor VII e iniciar la va extrnseca de la coagulacin.
Figura 20-9. Secuencia estructural de los cofactores V y VIII, y mecanismo de activacin mediado por trombina.
La trombina es la protena de la coagulacin que activa a los Factores V y VII, aunque tambin pueden ser activados por el factor Xa. Este proceso de activacin como cofactores se expresa pr eferentemente luego de una proteolisis limitada por accin de trombina, y consiste en la remocin del dominio B, de la molcula, formndose una cadena liviana y una
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pesada. Ambos factores activados se unen con gran afinidad a fosfatidilserina, translocada al exterior de la membrana de clulas activadas, especialmente las plaquetas. La interaccin ocurre a travs de la cadena liviana compuesta por los dominios A3-C1-C2. El factor VIIIa facilita la accin del factor IXa sobre el factor X, en el complejo tenasa y el factor Va favorece la accin del factor Xa sobre la protrombina a travs de la formacin del complejo protrombinasa. Ambas reacciones ocurren en presencia de calcio y fosfolpidos. Los factores V y VIII han sido denominados factores lbiles, porque se inactivan y degradan con gran rapidez, y por la facilidad con que se pueden activar in vitro. a) Factor V El factor V es sintetizado en los hepatocitos, en las clulas del sistema fagoctico mononuclear y en los megacariocitos. Es una glicoprotena de una sola cadena (300 kDa) activada por la trombina o el factor Xa. La proteolisis de 3 enlaces peptdicos da origen al factor Va; la cadena pesada (110 kDa) y la cadena liviana (78 kDa) se unen por enlaces no covalentes (figura 20-10).
complejo protrombinasa se efecta en la superficie de las membranas plaquetarias (fosfolpidos) y (c) la deficiencia de factor V se asocia a enfermedad hemorrgica. Las deficiencias hereditarias de factor V se transmiten en forma autonmica recesiva y producen sangrado leve a moderado. La magnitud del sangrado no tiene correlacin estricta con los niveles de factor en el plasma y se correlacionara mejor con los niveles de factor V plaquetario. Los pacientes heterocigotos en general son asintomticos. Estos pacientes pueden tener prolongacin del TTPA, TP y tiempo de sangra y tambin pueden observarse deficiencias combinadas de V y VIII. b) Factor VIII El factor VIII es sintetizado en los hepatocitos, el tejido esplnico y el tejido linfoide. Es sintetizado como una protena de cadena nica (300 kDa), luego es glicosilado y escindido en dos cadenas (figura 20-11). La estructura heterodimrica es mantenida por calcio. El factor von Willebrand (FVW) que es una protena de alto peso molecular promueve la asociacin entre ambas cadenas del FVIII, adems lo estabiliza, transporta, y regula su actividad en el plasma. Tambin el FVW protege al factor VIII plasmtico de su activacin por el factor Xa, por esta razn los pacientes portadores de enfermedad de von Willebrand tienen niveles ms bajos de factor VIII.
Figura 20-10. Esquema de la estructura del factor V y la activacin de ste para originar el Factor Va.
El 20 a 25% del factor V se encuentra en los grnulos de las plaquetas y es secretado durante la activacin de stas. El factor V plaquetario es fisiolgicamente significativo porque: (a) las plaquetas tienen sitios de unin para FVa en su membrana, (b) el ensamblaje del
Figura 20-11. Estructura del factor VIII y su activacin por trombina. FVW, Factor von Willebrand.
La trombina hidroliza al factor VIII unido a FvW en tres enlaces Arg-Ser (figura 20-13). El factor VIIIa se libera del FVW pudiendo unirse a
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plaquetas activadas o superficies fosfolipdicas, promoviendo la activacin del factor Xa. El factor VIIIa, a diferencia del factor VIII, pierde su capacidad para unirse al FVW. 2.3.6. Complejos macromoleculares En la secuencia de reacciones de la coagulacin existen tres instancias en que se forman complejos esenciales en el proceso. Estos complejos macromoleculares se ensamblan sobre la superficie de clulas estimuladas que se ubican en los sitios de injuria vascular. La formacin de estos complejos enzimticos facilita la interaccin entre sus componentes, acelerando y proporcionando relevancia fisiolgica a las reacciones en que participan. a) Complejo FT-FVII Cuando se expresa el factor tisular sobre clulas activadas se unen trazas de FVIIa presentes en la circulacin, al FT formando el complejo FTFVIIa, lo que constituye la primera etapa de la denominada va extrnseca. La capacidad cataltica del complejo FT-VIIa es 800 a 900 veces mayor que la actividad del factor VIIa en solucin. El complejo FT-VIIa activa no solo al factor X, sino que tambin al factor IX (figura 20-12) actualmente se sabe que este complejo es el que inicia el proceso de la coagulacin in vivo. As la activacin del FIX por el FXI no parece estrictamente necesaria; el complejo FT-VIIa acta como puente entre la va extrnseca a la va intrnseca (ver punto 2.5).
b) Complejo FIXa-FVIIIa El complejo macromolecular formado por el factor IXa con su cofactor VIII es ensamblado sobre fosfolpidos de membrana en presencia de calcio y su principal funcin es la activacin del factor X, de all el nombre de complejo tenasa. La activacin del factor IX es relativamente lenta; en comparacin con otras proteasas no requiere de cofactores y puede efectuarse sobre las membranas celular es o en solucin. El ensamblaje del complejo requiere la unin del factor VIIIa y del IX a fosfolpidos aminocidos. La interaccin de ambos induce un cambio conformacional del factor IXa que favorece la proteolisis parcial que ejerce el FXIa. En presencia de fosfolpidos y Ca2+, la Vm de la activacin del factor X por el IXa es 10.000 veces mayor en presencia de VIIIa que en su ausencia. La deficiencia congnita de factor IX se conoce como hemofilia B y tiene manifestaciones clnicas similares a la hemofilia B. Su frecuencia es menor. c) Complejo protrombinasa El complejo protrombinasa est formado por los factores Xa y Va (cofactor), y se forma sobre la superficie fosfolipdica en presencia de calcio (figura 20-13).
Figura 20-13. Modelo de activacin de la protrombina por el complejo protrombinasa. La interaccin de los residuos -carboxiglutmicos de los factores vitamina K dependientes Xa y protrombina facilita la exposicin de los sitios de unin a membrana de estos factores. el cofactor Va unido a fosfatidlserina en las membranas celulares facilita el ensamblaje del complejo protrombinasa, actuando el factor Ixa sobre la protrombina. Figura 20-12. Funcin del FT en la activacin de la coagulacin. La expresin del FT en la superficie de algunas clulas y la formacin de complejo con el factor VII inicia la va extrnseca.
El factor X circula como una glicoprotena de 2 cadenas unidas por puentes disulfuro. Es activado por el complejo FT-VIIa y el complejo
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tenasa (ver punto 2.3.6.b). El factor Va favorece que se produzca un cambio conformacional en el sitio activo del factor Xa lo que le permite interactuar en forma ptima sobre la protrombina para generar trombina. La velocidad de activacin de la protrombina por el complejo protrombinasa es 300.000 veces mayor que por el factor Xa aislado. 2.3.7. Fibringeno, trombina, factor XIII y formacin de fibrina Los principales componentes de la etapa final
de la formacin del cogulo y su estabilizacin son la trombina, el fibringeno y el factor XIII. a) Fibringeno Es una protena estructural que circula en el plasma en una concentracin que vara entre 200-300 mg/dL; tambin se encuentra en los grnulos de las plaquetas, donde ingresa por endocitosis desde el plasma. El fibringeno es una glicoprotena dimrica (340 kDa) compuesta por dos mitades idnticas, cada una compuesta por 3 cadenas peptdicas idnticas A, B y (figura 20-14).
Figura 20-14. Estructura del fibringeno
Los 16 aminocidos del extremo aminoter minal de las cadenas A for man el fibrinopptido A (FpA) y los 14 aminocidos del extremo N-terminal de la cadena B forman el fibrinopptido B (FpB). La sntesis de las cadenas est codificada por 3 genes diferentes; luego de su ensamblaje y glicosilacin de las cadenas B y A, la molcula madura es secretada por las clulas del parnquima heptico a la circulacin. Las dos mitades de la molcula, hacia el extremo amino-terminal de sus 3 cadenas estn unidas por puentes disulfuro, y los extremos N-terminales de las 2 cadenas A y 2 cadenas estn unidas entre s por los mismos enlaces. Esta asociacin conforma un dominio central llamado E.
Los extremos carboxi-terminales de los 3 pares de cadenas se extienden en sentido opuesto desde el dominio central, dando origen a 2 regiones perifricas denominados dominios D. El fibringeno es una protena reactante de fase aguda por esta razn sus niveles plasmticos pueden aumentar varias veces sobre el nivel normal en respuesta a la inflamacin o a cuadros infecciosos agudos. Pueden producirse diferentes trastor nos genticos que conducen a hipofibrinogenemia, disfibrinogenemia o afibrinogenemia; las manifestaciones clnicas pueden ser hemorragias, tendencia a trombosis, trastornos de la cicatrizacin o pueden cursar asintomticos. La alteracin gentica ms frecuente es la disfibrinogenemia y se transmite
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en forma autonmica dominante, por lo que al menos el 50% de los integrantes de una familia son sintomticos. Al laboratorio presentan prolongacin del tiempo de trombina, con niveles de fibringeno normal o disminuido segn se trate de hipofibrinogenemia o disfibrinogenemia; el TTPA y el TP pueden estar discretamente prolongados. b) Trombina La trombina, generada a partir de protrombina por accin del complejo protrombinasa, es la ltima serino proteasa que participa en la cascada de la coagulacin. La trombina consta de 2 cadenas unidas por un puente disulfuro. Los residuos His, Asp y Ser, caractersticos del sitio activo de las serino proteasas, se encuentran en la cadena B pesada. En la molcula de fibringeno rompe los enlaces Arg16-Gly17 de las cadenas A y Arg14-Gly15 de las cadenas B. Como consecuencia se escinden el FpA y luego el FpB; ocurrido esto la molcula de fibringeno se transforma en monmero de fibrina. Una vez que se forma el monmero de fibrina, la trombina se une a l y queda protegida de sus inhibidores naturales, sin embargo contina ejerciendo su actividad por lo que puede amplificar su propia formacin y activar las plaquetas. La molcula de trombina tiene 3 sitios de unin y un sitio cataltico. Los tres sitios de unin son de reconocimiento de fibringeno y otros sustratos (S), el sitio de unin de la heparina, en el cual la heparina se une a Antitrombina III para aproximarla a la trombina (H) y el sitio de unin a fibrina (F) a travs del cual la trombina se une a la fibrina despus de que ha transformado el fibringeno. Finalmente el centro cataltico o C es el sitio en el cual la trombina escinde los sustratos. En suma podemos resumir la actividad de la trombina como: accin sobre el fibringeno transformndolo en fibrina, activacin de los factores V, VIII, XI y XIII de la coagulacin, unin al receptor de trombina de las plaquetas activndolas e inhibicin de la fibrinolisis ya que activa al inhibidor de la fibrinolisis activada por trombina (TAFI). La trombina tambin tiene efectos regulatorios en el sistema de la coagulacin: (a) inhibe su pr opia generacin al actuar sobre la protrombina, rompiendo enlaces en dos
regiones de la molcula, desconectando el dominio de los cidos carboxiglutmico e impidiendo la unin a fosfolpidos y (b) promueve activa el sistema anticoagulante natural por medio de la activacin de la protena C por medio de su unin a la trombomodulina. La protena C inactiva los factores Va y VIIIa (ver punto 2.6.2.a). Factor XIII El factor XIII es una protena (320 kDa) tetramrica compuesta por 2 cadenas a y 2 cadenas b. Corresponde a una transglutaminasa, la nica enzima de la coagulacin que no es serino proteasa; la accin cataltica se localiza en la cadena a, que tiene varios residuos SH, uno ubicado en el centro. Para su activacin el factor XIII requiere trombina y calcio. La trombina hidroliza un enlace ArgGly de las cadenas a, facilitando la unin de calcio; ste induce un cambio conformacional que expone un residuo de cistena en el sitio activo. Los genes del factor XIII se localizan en el cromosoma 6 y sus defectos se transmiten en forma autonmica recesiva. Formacin de la fibrina La conversin del fibringeno soluble en un polmero insoluble de fibrina ocurre en tres etapas: Accin de la trombina sobre el fibringeno. La tr ombina r ompe enlaces Arg-Gly liberando los dos FpA de los extremos Nterminales de las cadenas A, y despus los 2 FpB de las cadenas B. La estructura restante, 2(,,), corresponde al monmero de fibrina. Polimerizacin espontnea de los monmeros de fibrina mediante asociacin no covalente (figura 20-15). La prdida de los FpA expone sitios de unin en el dominio E central de los monmeros, que interactan con sitios complementarios de la cadena del dominio D de un monmero adyacente. La unin forma un dmero que es la unidad estructural bsica de la malla de fibrina. Por otra parte, la prdida del FpB expone sitios de unin en el dominio D que promueve el contacto D-D produciendo el crecimiento lateral de la malla.
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Figura 20-16. Actividad de transglutaminacin del factor XIIIa. Figura 20-15. Polimerizacin de la fibrina.
2.4. Vida media de los factores La remocin de los factores de la coagulacin desde la circulacin se asocia a la prdida de los residuos de cido silico que contienen los carbohidratos. Este fenmeno expone otros carbohidratos terminales como fructosa y galactosa, para los cuales existen receptores en hepatocitos y clulas de Kpfer. La unin inicial a los receptores es seguida de la internalizacin por endocitosis de los factores en vesculas recubiertas de clatrina. El tiempo medio de decaimiento del 50% del factor de la concentracin inicial de cada uno de los factores en la sangre es distinto y sus valores se muestran en la tabla 20-3. En clnica es importante conocer estos parmetros, porque determina la periodicidad con que debe realizarse la infusin endovenosa de cada factor.
Estabilizacin del cogulo por formacin de enlaces covalentes entre grupos -amino de lisina y -carboxilo de glutamina. El enlace covalente que se forma entre molculas adyacentes de fibrina ocurre por accin del factor XIIIa, una transglutaminasa (figura 2016). Al comienzo estos enlaces covalentes se producen entre las cadenas en las zonas de unin D-D, estabilizando longitudinalmente el monmero de fibrina. Luego se extienden con entrecruzamientos progresivos que ligan una cadena con 2 cadenas de una cadena vecina aumentando notoriamente la rigidez. El cogulo adquiere resistencia, tanto a la ruptura mecnica como a la accin de la plasmina.
Tabla 20-3. Muestra la vida media de cada factor de la coagulacin expresado en horas Factor I (Fibringeno) II (Protrombina) III V VII VIII IX X XI XII PK (Precalicrena) HMWK (Ciningeno de alto peso molecular) XIII Vida media en circulacin (horas) 96 - 120 72 - 96 12 12 8 - 12 18 - 30 24 - 48 60 50 - 70 35 35 240
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2.5. Sistema de la coagulacin in vivo Las vas fisiolgicas que operan in vivo parecen ser diferentes a las descritas en la figura 18-2 (in vitro). Al respecto, algunos antecedentes son los siguientes: (a) los individuos con deficiencia de alguno de los factores de contacto (FXII, PK, HMWK) presentan alteracin de las pruebas de la coagulacin, pero no sufren hemorragias, a diferencia de lo que ocurre en la deficiencia de otros factores del sistema de la coagulacin. Lo anterior indicara que los factores de contacto no participan en el sistema de la coagulacin in vivo, (b) se sabe que el FT que se expresa en sitios vasculares en donde se ha producido una injuria, en monocitos estimulados y en las clulas endoteliales, es capaz de iniciar la coagulacin, (c) el complejo FT-VIIa, no slo activa al factor X, sino que tambin al factor IX, estableciendo as un puente entre las denominadas vas intrnseca y extrnseca.
El modelo operativo actual del sistema de la coagulacin in vivo (figura 20-17) se inicia con la expresin del FT sobre la membrana celular, especialmente a nivel de componentes del subendotelio, expuesto a las protenas de la sangre en los sitios de ruptura vascular. Como antes se indic, el FT forma un complejo con trazas de FVIIa circulante; el complejo FT-VIIa formado activa los factores IX y X a FIXa y FXa, respectivamente. Estos factores activados realimentan la formacin de factor VIIa. Este proceso conduce a la formacin de trombina que activa los cofactores V y VIII e induce la agregacin de las plaquetas, construyendo as la superficie de reaccin y receptores para varios factores de la coagulacin. Adems la trombina activa al factor XI, el que activado (FXIa) acta como proteasa del FIX, activndolo a FIXa.
Figura 20-17. Secuencia postulada de las reacciones de la coagulacin in vivo. Se inicia el proceso con la formacin del complejo FT-FVIIa, que activa los factores IX y X generndose inicialmente pequeas cantidades de trombina. sta activa los factores V y VIII amplificando el proceso.
La generacin inicial de factor Xa, desencadena un efecto inhibitorio del Inhibidor de la Va Extrnseca (IVE) (ver punto 2.6.3). El complejo IVE/ Xa inhibe el FT/VIIa previniendo la ulterior produccin de factores Xa y IXa a travs de esta va. En estas condiciones el factor Xa adicional slo puede ser producido por el complejo tenasa. 2.6. Regulacin del Sistema de la coagulacin La localizacin y la limitacin del proceso hemosttico a los sitios de dao vasculares es la principal caracterstica del sistema hemosttico. Existen 4 sistemas anticoagulantes naturales: el Sistema Antitrombina III-Heparina, el Sistema de la protena C, el Inhibidor de la Va extrnseca
(IVE), y el Inhibidor de proteasas dependiente de protena Z. 2.6.1. Sistema antitrombina III La antitrombina III (ATIII) es una glicoprotena que pertenece a la familia de las serpinas. Neutraliza las proteasas de la coagulacin (trombina, FIXa, FXa, FXIa y FXIIa) formando complejos con los factores activos. La heparina acelera la inactivacin de las proteasas en aproximadamente mil veces. La heparina y el heparn sulfato son polmeros heterogneos de cido iurnico y glucosamina sustituido con grupos N-sulfatos y O-sulfatos. En la sangre no existe heparina circulante, pero el
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endotelio vascular es rico en proteoglicanos con cadenas laterales de heparina/heparn que son necesarias para el reconocimiento por la ATIII.
La ATIII neutraliza las proteasas de la coagulacin a travs de la interaccin de un sitio reactivo (arginina) y un centro activo (serina) (figura 20-18).
Figura 20-18. Inhibicin de serino proteasas por la antitrombina III en presencia de heparina. La ATIII neutraliza las proteasas de la coagulacin (ej. trombina) formando un complejo 1:1 con ellas. La unin de heparina a los residuos de lisina de la ATIII induce un cambio conformacional de la molcula, aumentando alrededor de 1.000 veces la velocidad de formacin del complejo.
El sistema ATIII-heparina es el mecanismo principal de neutralizacin de los factores activados de la va intrnseca. El factor VIIa y la pr otena C activada son mnimamente inactivados por este sistema. Otras reacciones en que no participan serino protesas no son afectadas por el sistema ATIII-heparina. 2.6.2. Sistema de la protena C El sistema protena C inhibe dos cofactores: el factor Va y el factor VIIIa. Este sistema est constituido por la protena C, la protena S y la trombomodulina. a) Protena C. Es una glicoprotena (62 kDa) dependiente de vitamina K que circula en el plasma como precursor de serino proteasa, en una concentracin de 3 a 5 mg/L. Es sintetizada en el hgado y secretada como un polmero de cadena nica. Las protenas de este sistema anticoagulante natural (protena C, protena S y trombomodulina) tienen 3 regiones comunes: (a) dominios Gla donde se encuentran los dominios carboxiglutmicos necesarios para la interaccin con la membrana celular, (b) regin homloga al factor de crecimiento epidrmico, y (c) regin del sitio activo que posee
65% de homologa a la quimotripsina. El receptor de protena C es una protena de transmembrana expresada en las clulas endoteliales. Une la PC a travs de los dominios Gla y contribuye a la activacin de la protena. b) Protena S. Es la nica protena dependiente de vitamina K que no es una enzima, sino que es un cofactor de la protena C activada. Es una protena de cadena nica de 69 kDa en la que se distinguen 4 dominios (figura 20-23): (a) dominio Gla que contiene 12 residuos de cido carboxiglutmico, (b) una regin sensible a la trombina, (c) cuatro dominios tipo factor de crecimiento epidrmico y (d) una regin carboxiloterminal distinta a otros factores vitamina K dependiente; participa en la interaccin con la C4bBP (protena de unin de C4b). En el plasma la protena S circula en dos formas, 40% en forma libre y 60% unida a la C4bBP. c) Trombomodulina. Es una glicoprotena de transmembrana (74 kDa) que une especficamente trombina y acta como cofactor para la activacin de la protena C por trombina (figura 20-19).
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En la figura 20-20 se muestra, esquemticamente, la accin inactivadora que la PCa presenta sobre los factores Va y VIIIa.
Figura 20-19. Mecanismo de activacin de la protena C (PC). La formacin de un complejo entre la trombina y la trombomodulina (TM) induce un cambio conformacional de la trombina. Este complejo reconoce la conformacin estabilizada de la protena C, la cual de esta forma es activada (Pca). Esta protena acta con un cofactor como es la protena S (PS).
Figura 20-20. Inactivacin de los factores Va y VIIIa por la protena C (PCa)
carboxilo-terminal cargado positivamente. El complejo factor VII-FT puede ser inhibido slo despus que se ha iniciado el proceso de la coagulacin. La reaccin de inhibicin requiere la presencia del factor Xa, que es el producto directo de la reaccin del FVII-FT sobre sus sustratos. El IVE no es miembro de las serpinas sino que pertenece a un grupo de inhibidores de serino proteasas tipo Kunitz. El IVE se encuentra en el plasma en dos formas con distinto peso molecular, 33 kDa y 40 kDa. Las clulas endoteliales son su principal fuente y en el plasma aproximadamente el 50% se encuentra asociado a lipoprotenas. Las plaquetas contienen el 8% del IVE de la sangre en grnulos distintos a los y en lisosomas; el IVE es secretado durante la activacin plaquetaria.
Para que la protena C cumpla su funcin anticoagulante debe ser activada (APC) sobre la superficie de las clulas endoteliales, donde se forma un complejo reversible de alta afinidad entre la trombina y la trombomodulina. Este complejo activa catalticamente a la protena C, la cual se disocia rpidamente de este complejo. 2.6.3. Inhibidor de la va extrnseca La regulacin del complejo macromolecular, factor VII-FT, est mediado por el Inhibidor de la va extrnseca (IVE). El IVE es una molcula cargada negativamente en su extremo amino terminal, seguida por tres dominios inhibitorios tipo Kunitz y un extremo
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El IVE puede unirse al FXa e inhibir su funcin enzimtica en una reaccin que requiere el dominio Gla del FXa. Sin embargo, el dominio Gla y el calcio son necesarios para la inhibicin del FVIIa-FT por el IVE. La inhibicin ocurre en 2 etapas: (a) el IVE se une al FXa en presencia de calcio en una reaccin que requiere el sitio activo del FXa, y (b) el complejo IVE-FXa se une al FXa-FT por un mecanismo que necesita FXa en su conformacin dependiente de calcio. En este paso el complejo IVE-FXa acta unindose al factor VIIa-FT en una conformacin que permite que un segundo dominio inhibitorio del IVE interacte con el FVIIa. 2.6.4. Inhibidor de proteasas dependiente de protena Z La protena Z (PZ) es un factor vitamina K dependiente (62 kDa). Su organizacin gnica en el cromosoma 13 y su estructura molecular son muy similares a los factores VII, IX, X, y protena C, pero en contraste a stos, la tpica trada de activacin (histidina, serina, cido asprtico) est ausente, por lo tanto, la PZ no tiene funcin proteoltica (serino proteasa). En su extremo amino terminal posee un dominio rico en cido carboxiglutmico que le sirve a la protena para interactuar con las membranas celulares en presencia de calcio, que al mismo tiempo sirve como cofactor para la inhibicin del factor Xa por el Inhibidor de proteasas dependiente de protena Z (ZPI). La PZ humana tiene una vida media de 2,5 das y su concentracin normal en el plasma va desde 1,9 a 3,9 g/mL. Como otros factores vitamina K dependiente, los niveles de PZ en pacientes con tratamiento cumarnico y en recin nacidos son menores. La actividad procoagulante del factor Xa es inhibida en presencia de PZ. Esta inhibicin es mediada por otra protena, el inhibidor de proteasas dependiente de protena Z (ZPI) que circula en el plasma formando complejos con PZ. Ambas son sintetizadas mayoritariamente en el hgado y estn codificadas en el cromosoma 13. El ZPI es una glicoprotena (72 kDa) de cadena nica que pertenece a la superfamilia de las serpinas, inhibidoras de serino proteasas. El ZPI, en presencia de PZ y de calcio inico
inhibe rpidamente el factor Xa sobre superficies celulares en presencia de calcio. Para esto se han descrito dos vas: (a) La PZ y el factor Xa formaran un complejo en la superficie fosfolipdica que luego sera reconocido por ZPI, y (b) la PZ y ZPI formaran un complejo en circulacin que luego se unira al factor Xa adosado a la superficie fosfolipdica. El resultado final de cualquiera de las dos vas es la formacin de un complejo dependiente de calcio que contiene PZ, factor Xa y ZPI. La inhibicin por parte del sistema ZPI se produce antes de la formacin del complejo protrombinasa (FXa-FVa). El factor XIa es inactivado por ZPI en una reaccin que no requiere la presencia de PZ, fosfolpidos o calcio, y adems no es afectada por la presencia de HMWK. La heparina aumenta esta inhibicin y la prolonga en el tiempo. Aunque la relevancia de esta inhibicin es incierta, aparentemente el ZPI compite con otros inhibidores del factor XIa y tambin bloquea la activacin del factor IX que luego formara parte del complejo tenasa. 2.6.5. Anexinas Las anexinas constituyen una superfamilia de protenas que se caracterizan por la presencia de una endonexina que media la unin del calcio con los fosfolpidos. Ms de 90 anexinas han sido encontradas en 45 especies. Las anexinas son consideradas primariamente como una protena intracelular, compuestas de una superficie cncava y una convexa de acuerdo a la imagen cristalogrfica. Las anexinas tienen una particular predileccin a unirse a fosfolpidos aninicos y aunque son intracelulares, algunas de ellas se exteriorizan y ejercen diferentes actividades biolgicas como por ejemplo: la anexina A1 inhibe la inflamacin, la anexina A2 funciona como receptor de t-PA y regula la formacin de plasmina sobre la superficie celular. La importancia de las anexinas ha quedado demostrada recientemente al encontrarse que las anexinas A2 y A5 juegan un papel importante en la fisiopatologa de la fibrinlisis que se produce en la leucemia aguda promieloctica, donde se han encontrado altos niveles de anexina A2; por otra parte, la deficiencia de Anexina A5 se ha asociado con trombosis.
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3. SISTEMA FIBRINOLTICO Los mecanismos de regulacin de la coagulacin sangunea dependen de procesos que se llevan a cabo sobre la clula endotelial. La fibrinlisis es un proceso enzimtico compuesto por una serie de activadores e inhibidores, los cuales regulan la conversin de la proenzima circulante, plasmingeno, en la enzima activa, plasmina, la cual produce finalmente la lisis de la fibrina. 3.1. Componentes del Sistema Fibrinoltico Los componentes del sistema fibrinoltico son el plasmingeno (Pg), los activadores del plasmingeno (tipo tisular y urokinasa), plasmina, inhibidores de los activadores del plasmingeno 1 y 2 (PAI-1 y PAI-2) y la 2 antiplasmina. 3.1.1. Plasmingeno. El Pg es el cimgeno de la enzima fibrinoltica plasmina; es una glicoprotena monocatenaria de 92 kDa y 790 aminocidos. Es sintetizada en el hgado, presenta una concentracin plasmtica de 20 mg/dL y su vida media es de 2,2 das. El gen que codifica esta protena est localizado en el cromosoma 6. Existen dos isoenzimas presentes en el plasma denominados Pg1 y Pg2 pr esentando una idntica secuencia aminoacdica, pero se diferencian en algunas propiedades fisicoqumicas, entre stas su contenido de carbohidratos y su afinidad por los activadores. La regin amino terminal presenta 5 dominios con forma de asas denominadas kringles en donde se ubican las regiones de unin a la lisina y por medio del cual el Pg se une especficamente a la fibrina, como tambin a clulas endoteliales, lo que favorece su activacin. Hacia su extremo carboxilo terminal se encuentra el sitio activo, el cual est compuesto principalmente por serina, cido asprtico e histidina. En su forma nativa el plasmingeno contiene cido glutmico en su extremo amino terminal denominndose Glu-plasmingeno, pudiendo ser convertido por pequeas concentraciones de plasmina en Lis plasmingeno, el cual posee mayor sensibilidad por los activadores, como tambin mayor afinidad por la fibrina.
3.1.2. Activadores del plasmingeno La activacin del Pg se produce por la escisin del enlace Arg560-Val por accin de diversos activadores, los cuales se dividen en activadores extrnsecos (activador tisular y tipo uroquinasa) (figura 20-21), intrnsecos, y exgenos (teraputicos). Adems existen algunos potenciadores de estos activadores como son las protenas de la matriz extracelular y la membrana de las clulas endoteliales.
Figura 20-21. Activadores del plasmingeno
a) Activador de Pg tipo tisular (t-PA). El t-PA es una serinopr oteasa codificada en el cromosoma 6. Tiene un peso molecular de 68 kDa y 530 aminocidos; presenta una vida media de 5 minutos y una concentracin plasmtica de 2 g/L. El t-PA es sintetizado por las clulas endoteliales como una enzima monocatenaria, pero en el plasma por accin de plasmina, calicrena o factor Xa es convertida en una molcula de 2 cadenas lo que va a provocar un aumento en la afinidad por fibrina y producto de esta unin el t-PA potencia su actividad. En su estructura presenta dominios homlogos a otras protenas, por ejemplo un dominio finger similar a fibronectina, tambin posee 2 dominios kringles homlogos a los del Pg. La funcin de estas estructuras es la unin especfica a la fibrina formando un complejo ternario entre el Pg, el t-PA y la fibrina provocando un cambio conformacional en la enzima y el sustrato, lo que favorece la formacin local de plasmina y la degradacin de fibrina. b) Activadores del Pg tipo uroquinasa (UK) y pro-uroquinasa (scu-PA). La UK es una serinoproteasa bicatenaria similar a la tripsina,
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compuesta por dos cadenas polipeptdicas de 20 y 34 kDa unidas por un puente disulfuro. Se encuentra en la orina humana donde es secretada por clulas renales. Activa directamente del Pg mediante la escisin de un enlace Arg560Val con formacin de Gluplasmina, pero a diferencia del t-PA, carece de afinidad especfica por la fibrina, activando tanto al Pg circulante como al unido a la fibrina. La scu-PA es una glicoprotena (54 kDa), precursora inactiva de la UK presente en el plasma, a una concentracin de 4 g/L. Es activada por la plasmina al hidrolizar el enlace Lis158-Ile. En su estructura presenta un dominio kringle homlogo al Pg pero no contiene dominios finger, lo que podra explicar su poca afinidad por la fibrina. 3.1.3. Plasmina La molcula de plasmina est compuesta por una cadena pesada A que se origina del extremo amino terminal y una cadena liviana B que forma el extremo carboxilo terminal y contiene el sitio cataltico de la molcula. El plasmingeno es convertido en plasmina por ruptura de una unin peptdica en la posicin Arg560-Val561. La plasmina circulante provoca una proteolisis parcial el grupo carboxiterminal del fibringeno generando los productos de degradacin del fibringeno o PDF (X, Y, D y E), los cuales
interfieren con la polimerizacin de la fibrina solubilizndola y conduciendo por tanto a la hemorragia. Los fragmentos D y E se unen a la membrana plaquetaria ocasionando disfuncin plaquetaria y contribuyendo a la hemorragia. La plasmina acta tambin sobre la fibrina liberando el dmero D (D-D) y puede activar el complemento, especialmente la fraccin C1 y C3 y eventualmente las fracciones C8 y C9, con lisis de glbulos rojos y lisis plaquetaria. En la Coagulacin Intravascular Diseminada (CID) aumentan los PDF, hecho que junto a la disminucin progresiva y rpida del recuento plaquetario, y prolongacin de los tiempos de coagulacin (Tiempo de protrombina y Tiempo de tromboplastina parcial activada, entre otros), contribuyen a su diagnstico (ver captulo 23). Los PDF tienen accin inhibitoria sobre la trombina, inhiben la polimerizacin de la fibrina e inhiben la agregacin plaquetaria. Por lo tanto tienen accin anticoagulante propia. De esta manera, una fibrinlisis extensa produce un efecto antihemosttico importante. 3.2. Regulacin del sistema fibrinoltico El sistema fibrinoltico es inhibido a nivel de la plasmina por accin de la 2 antiplasmina o a nivel de los activadores del plasmingeno por el PAI-1 y PAI-2 (figura 20-22).
Figura 20-22. Regulacin del sistema fibrinoltico.
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3.2.1. PAI-1 y PAI-2 El PAI-1 es el inhibidor primario del t-PA y uPA en el plasma. El PAI-1 es una glicoprotena de 52 kDa (379 aminocidos) y pertenece al grupo de las serpinas, con las cuales tiene un 30-50% de homologa. Reacciona con el t-PA de cadena nica y doble y con el u-PA de cadena doble, pero la capacidad de inhibir el u-PA de cadena nica es muy limitada. El gen del PAI-1 se encuentra en el cromosoma 7 y est estrechamente ligado al gen de la fibrosis qustica. El PAI-1 est presente en el plasma y en sitios extracelulares, donde forma complejo con la vitronectina y las plaquetas (grnulos ); es almacenado y sintetizado en las clulas endoteliales y hepatocitos. El PAI-1 es el ms activo inhibidor del plasmingeno. Sus niveles normales son 0.568 U/mL para su actividad y 6-600 ng/mL para el antgeno; estos rangos tan amplios sugieren que puede comportarse como un reactante de fase aguda. Las deficiencias congnitas de PAI-1 producen sangrados prolongados en presencia de pruebas de coagulacin normales, excepto por un acortamiento del tiempo de euglobulinas que indica fibrinlisis. El PAI-2 tiene un espectro de accin similar al PAI-1, inhibe los activadores del plasmingeno con menor eficiencia que el PAI-1. El PAI-2 se encuentra en residuos de placenta humana y en los macrfagos. No se ha podido medir en el plasma en condiciones basales pero suele aumentar en el primer trimestre del embarazo. 3.2.2. Alfa 2 antiplasmina Es una glicoprotena de cadena nica de 70 kDa. Pertenece al grupo de las serpinas, la concentracin en el plasma es de 7 mg/dL y su vida media es de 3 das. Es sintetizada en el hgado y se une al plasmingeno (70%) o queda en su forma libre que tiene menos actividad inhibidora. La alfa 2 antiplasmina en el plasma reacciona rpido con la plasmina, primero a travs de los sitios de unin a lisina y posteriormente formando complejo estable con la cadena liviana de la plasmina. La alfa 2 antiplasmina unida a la fibrina es ms
resistente a la inactivacin, porque los sitios de unin de lisina estn unidos a fibrina y no estn disponibles para la unin de los inhibidores. La alfa 2 antiplasmina se puede unir a la fibrina por el entrecruzamiento con la cadena alfa, inducido por el factor XIII, lo que produce la resistencia a la lisis que presentan los cogulos de fibrina entrecruzados. Su concentracin plasmtica puede ser medida en forma funcional (en general cromognica) o inmunolgica. Tambin se pueden medir los complejos de alfa 2 antiplasmina-plasmina por tcnicas inmunolgicas las cuales indican activacin in vivo de la fibrinlisis. Los defectos hereditarios de alfa 2 antiplasmina producen hemorragias severas en los pacientes homocigotos (niveles de actividad 0.02-0.15 U/ mL) y leve hasta asintomtico en heterocigotos (niveles de actividad 0.35-0.70 U/mL), se trata de deleciones que se manifiestan por alteracin de las pruebas funcionales. Los ensayos habituales de coagulacin son normales y ocasionalmente puede observarse un estudio de lisis de euglobulinas acortado, pero en general no hay evidencias de hiperfibrinlisis 3.2.3. Inhibidor fibrinoltico dependiente de trombina El inhibidor de la fibrinolisis activado por trombina (TAFI: Trombin Activable Fibrinolysis Inhibitor) es una protena plasmtica de 60 kDa que circula en el plasma en concentraciones de 75 nM, es un zimgeno que es activado a una enzima tipo carboxipeptidasa B mediante una ruptura del aminocido arginina, reaccin que es catalizada por la trombina. El TAFI cataliza la ruptura en los residuos arginina y lisina de la regin carboxiterminal de la fibrina, como consecuencia de esto la retroalimentacin positiva sobre la activacin del plasmingeno es eliminada y el proceso de fibrinoltico suprimido. La trombina, generada en altas concentraciones al formarse el cogulo de fibrina, se une al cofactor celular trombomodulina que puede activar al TAFI en cantidades suficientes, con una eficiencia cataltica 1250 veces mayor que la trombina sola. El TAFI activado (TAFIa) in vitro puede romper los residuos carboxiterminales de varios pptidos, incluyendo pptidos biolgicamente activos como bradicinina y anafilotoxinas.
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Normalmente los residuos de lisina de la regin carboxiterminal de la fibrina se unen con una elevada afinidad al plasmingeno y al activador tisular del plasmingeno (t-PA) generando plasmina sobre el cogulo de fibrina. La activacin del TAFI durante la formacin del cogulo de fibrina resulta en la eliminacin de los residuos de lisina y en consecuencia en una menor produccin de plasmina. Condiciones clnicas que se relacionan a hiperfibrinlisis: Excesivo activador del plasmingeno: enfermedad benigna o maligna de prstata, terapia tromboltica, neoplasias (leucemia aguda promieloctica). Deficiencia de los inhibidores: enfermedad heptica, amiloidosis, trastornos hereditarios. Enfermedad heptica y trasplante heptico: el hgado es incapaz de degradar los activadores de plasmingeno y plasmina.
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HEMATOLOGA
Captulo
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TROMBOCITOPENIAS Y TROMBOCITOPATAS
Jaime Pereira G., Diego Mezzano A. y Vicente Vicente G.
1. Introduccin 2. Trombocitopenias 2.1. Trombocitopenias hereditarias 2.1.1. Generalidades 2.1.2. Trombocitopenias amegacariocticas 2.1.3. Trombocitopenia y radio ausente 2.1.4. Sndrome de Wiskott-Aldrich y Trombocitopenia ligada a X 2.1.5. Sndrome velocardiofacial 2.1.6. Enfermedades relacionadas a MYH9 2.2. Trombocitopenias adquiridas 2.2.1. Trombocitopenias por disminucin de la produccin a) Hipoplasia megacarioctica inducida por drogas b) Hipoplasia megacarioctica asociada a infeccin viral 2.2.2. Trombocitopenias por aumento de la destruccin a) Trombocitopenias inmunes a1) Trombocitopenias autoinmunes primarias Prpura trombocitopnico inmunolgico agudo Prpura trombocitopnico inmunolgico crnico a2) Trombocitopenias autoinmunes secundarias Trombocitopenias asociadas al uso de drogas Trombocitopenia inducida por heparina a3) Trombocitopenias aloinmunes Prpura aloinmune neonatal Prpura postransfusional b) Trombocitopenias no inmunes b1) Prpura trombtico trombocitopnico/sndrome hemoltico urmico b2) Trombocitopenia del embarazo b3) Preeclampsia/eclampsia b4) Trombocitopenia asociada a infeccin b5) Trombocitopenia asociada a exposicin a superficies no biolgicas 2.2.3. Trombocitopenia por secuestro esplnico 2.2.4. Trombocitopenia dilucional 3. Trombocitopatas 3.1. Trombocitopatas hereditarias 3.1.1. Defectos hereditarios de la adhesin plaquetaria a) Patologa del complejo glicoproteico Ib-IX-V: Sndrome de Bernard-Soulier y seudo-von Willebrand. a1) Sndrome de Bernard-Soulier (SBS) a2) Sndrome de seudo-von Willebrand
b) Patologa de los receptores plaquetarios del colgeno: complejo glicoproteico Ia-IIa, GPVI, GPIV. b1) Patologa del complejo GPIa-IIA b2) Patologa de la GPVI b3) Patologa de la GPIV 3.1.2. Defectos hereditarios de la agregacin plaquetaria: Tromboastenia de Glanzmann 3.1.3. Defectos congnitos de la secrecin plaquetaria: Anormalidades granulares. a) Sndrome de las plaquetas grises b) Deficiencia en el almacenamiento de grnulos c) Deficiencia combinada de grnulos y d) Alteracin plaquetaria tipo Quebec 3.1.4. Defectos hereditarios en los mecanismos implicados en la transmisin de seales de activacin plaquetaria. a) Defectos en los receptores para agonistas b) Defectos en otros elementos intraplaquetarios implicados en la activacin: protenas G, enzimas efectoras, segundos mensajeros, fosforilacin de protenas. c) Defectos en el metabolismo del cido araquidnico y/ o en la produccin de tromboxano A2. 3.1.5. Alteraciones congnitas de la actividad procoagulante de las plaquetas 3.1.6. Otras trombocitopatas 3.2. Trombocitopatas adquiridas 3.2.1. Asociadas a enfermedades sistmicas a1) Trombocitopata urmica a2) Anomala funcional de las plaquetas en insuficiencia heptica a3) Alteraciones plaquetarias inducidas por la ciruga con circulacin extracorprea a4) Disfuncin plaquetaria en leucemias, mielodisplasias y disproteinemias 3.2.2. Disfunciones plaquetarias inducidas por drogas y alimentos b1) Aspirina y antiinflamatorios no esteroideos (AINE) b2) Antibiticos -lactmicos b3) Heparina y fibrinolticos b4) Drogas que aumentan la concentracin de cAMP y Cgmp en plaquetas b5) Expansores de volumen b6) Otras sustancias y frmacos
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RESUMEN
Las trombocitopenias y las trombocitopatas constituyen entidades clnicas de ocurrencia frecuente y que pueden obedecer a defectos de tipo hereditario o adquirido. Las trombocitopenias de origen hereditario se presentan como trombocitopenias aisladas en el perodo de recin nacido, habitualmente con alteraciones del tamao de las plaquetas (macro o micro-trombocitopenias). Entre las trombocitopenias adquiridas se pueden distinguir aquellas por disminucin de la produccin de plaquetas como resultado de la supresin de la megacariopoyesis por drogas o alcohol. Las trombocitopenias producidas por un acortamiento de la supervivencia plaquetaria pueden ser el resultado de la accin de autoanticuerpos (prpura trombocitopnico inmunolgico primario o secundario) o aloanticuerpos (prpura aloinmune neonatal y prpura postransfusional). Existe un nmero importante de trombocitopenias por aumento de la destruccin no inmune de plaquetas; en estos casos, generalmente la trombocitopenia es una manifestacin ms de entidades clnicas complejas y heterogneas (ej. Prpura trombtico trombocitopnico, eclampsia). Ms raramente la disminucin del recuento de plaquetas se debe a aumento del secuestro esplnico o a prdida aguda de sangre sin reemplazo de plaquetas. Los defectos funcionales de las plaquetas tambin pueden ser hereditarios o adquiridos. Entre los primeros, los ms prevalentes son los defectos de agregacin/secrecin, probablemente debidos a fallas en la transduccin de seales. Las disfunciones ms graves, que tradicionalmente sirven de modelos para la enseanza de la fisiologa y fisiopatologa plaquetarias, como el Sndrome de Bernard-Soulier y la Enfermedad de Glanzmann son de ocurrencia excepcional. Los defectos funcionales adquiridos de las plaquetas son extremadamente frecuentes, y entre ellos, los secundarios a la ingestin de drogas como la aspirina y los antiinflamatorios no esteroidales llevan la delantera. Adems, varias enfermedades sistmicas (ej., insuficiencias renal y heptica, leucemias, mielomas, sndromes mieloproliferativos y otras) se acompaan de disfunciones plaquetarias que a menudo plantean problemas clnicos serios.
1. INTRODUCCIN Las disminucin del nmero de plaquetas (trombocitopenias) y las alteraciones de su funcin (trombocitopatas) son condiciones clnicas frecuentes que se pueden originar por defectos de tipo hereditario o presentarse en forma adquirida. Especialmente entre las condiciones adquiridas, el desorden puede afectar aisladamente a las plaquetas o acompaar las manifestaciones clnicas de otras patologas. Este captulo contiene una clasificacin general de las trombocitopenias y de las anomalas funcionales hereditarias y adquiridas de las plaquetas, con un anlisis de la patogenia, fisiopatologa y clnica de los defectos ms relevantes. 2. TROMBOCITOPENIAS 2.1. Trombocitopenias hereditarias 2.1.1. Generalidades Las trombocitopenias hereditarias representan
un muy pequeo por centaje de las trombocitopenias que se pueden observar en la prctica clnica. Incluso en nios, cuando se excluyen las infecciones y las tromboctopenias asociadas a quimioterapia y solamente se consideran las trombocitopenias aisladas, sobre el 90% de los casos corr esponder a trombocitopenias de origen inmune primarias o secundarias. Slo recientemente el desarrollo en la identificacin de defectos moleculares, ha per mitido definir mejor los casos de trombocitopenias no inmunes de origen hereditario. Desde el punto de vista de su clasificacin, las trombocitopenias hereditarias se han dividido clsicamente segn el tamao de las plaquetas y sus caractersticas en el frote de sangre perifrica, elementos que se consideran importantes en el diagnstico de las trombocitopenias hereditarias. Sin embargo, tambin contribuyen a la sospecha diagnstica, la historia familiar, la no respuesta al tratamiento de trombocitopenia inmune (PTI) y defectos asociados (tabla 21-1).
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Tabla 21-1. Elementos que permiten sospechar la existencia de una trombocitopenia hereditaria Historia familiar de trombocitopenia Ausencia de respuesta a tratamiento de trombocitopenia autoinmune, incluyendo esplenectoma Frotis de sangre perifrica: tamao anormal, ausencia de grnulos alfa (plaquetas grises), cuerpos de Dhle Sangrado desproporcionado al recuento de plaquetas Comienzo en etapa de recin nacido Defectos asociados: ausencia de radio, retardo mental, falla renal, sordera, cataratas o desarrollo de leucemia. Trombocitopenia estable a travs de los aos
Historia familiar. Aunque es un elemento inespecfico, la presencia de una historia familiar de trombocitopenia sugiere fuertemente la existencia de una trombocitopenia hereditaria, especialmente si han sido afectados ms de dos miembros del grupo familiar estrechamente relacionados. Aunque muchos tipos de trombocitopenias hereditarias se transmiten en forma autosmica dominante, existen varias que se heredan ligadas al sexo o en for ma autosmica recesiva, lo que significa que el nio afectado puede representar al propsito o caso ndice. Ausencia de respuesta al tratamiento de PTI. Despus de la historia familiar, el elemento clnico ms importante para sospechar una trombocitopenia hereditaria es la falta de respuesta a tratamiento especfico de trombocitopenia inmune. Los criterios para definir refractariedad al tratamiento no se encuentran bien definidos, aunque se acepta que un aumento del recuento de plaquetas superior a 30.000/l sobre el basal, con alguno de los tratamientos empleados, constituye una respuesta adecuada. Formas asociadas. Se ha descrito una serie de manifestaciones clnicas que en pacientes con tr ombocitopenia persistente, per miten sospechar la existencia de una trombocitopenia hereditaria. Estas formas clnicas que pueden estar presentes en el paciente o en miembros de su familia, incluyen: ausencia de radio, sordera a tonos altos, falla renal, vula bfida, arco artico a derecha, infecciones frecuentes, eccema e historia familiar de leucemia. Examen del frote de sangre perifrica. A pesar de la disponibilidad y superioridad en muchos aspectos de los contadores hematolgicos, la
inspeccin visual del frote de sangre contina siendo fundamental en la evaluacin del tamao de las plaquetas. La existencia de plaquetas gigantes sugiere un sndrome de BernardSoulier o defectos tipo anomala de MayHegglin. La presencia de cuerpos tipo Dhle tambin sugiere anomala de May-Hegglin. Plaquetas de muy pequeo tamao son propias del sndrome de Wiskott-Aldrich. 2.1.2. Trombocitopenias amegacariocticas Las tr ombocitopenias amegacariocticas congnitas (TAMC) se presentan tpicamente como una trombocitopenia muy profunda que aparece durante los primeros das de vida hasta el primer mes. Este cuadro se confunde frecuentemente con el prpura trombocitopnico aloinmune neonatal, pero en este caso el recin nacido no responde a las transfusiones de plaquetas si stas son no compatibles y se demuestran anticuerpos antiplaquetarios especficos. El diagnstico se establece con el estudio de mdula sea, que demuestra ausencia de megacariocitos. Es frecuente la asociacin a alteraciones ortopdicas o neurolgicas. La complicacin ms grave de este cuadro es la hemorragia intracraneana, que se puede presentar hasta en un 25% de los casos. Una proporcin similar de casos progresa a una aplasia medular dentro de los primeros 5 aos de vida. El defecto que origina este cuadro se encuentra en la mayora de los casos en una mutacin en el receptor de trombopoyetina, c-mpl, que se traduce en una ausencia de proliferacin de los megacariocitos. 2.1.3. Trombocitopenia y radio ausente El diagnstico clnico de esta condicin se basa en la existencia de una trombocitopenia
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neonatal grave acompaada de las formas fsicas caractersticas. Estas formas no slo se limitan a la ausencia de radio sino que tambin puede observarse otras alteraciones ortopdicas a nivel del cbito, hmero y tibia. Los pacientes con trombocitopenia y radio ausente presentan episodios hemorrgicos graves que incluyen hemorragia intracraneana y sangrado gastrointestinal. A diferencia de las TAMC el recuento de plaquetas tiende a mejorar con el tiempo, llegando incluso a nor malizarse alrededor del ao de vida. Sin embargo, no es infrecuente la persistencia de una trombocitopenia leve que se mantiene e incluso se puede agravar en la edad adulta. 2.1.4. Sndrome de Wiskott-Aldrich y trombocitopenia ligada a X El sndrome de Wiskott-Adrich (SWA) y la trombocitopenia ligada a X (TLX) se caracterizan por presentar plaquetas de muy pequeo tamao. El SWA tambin incluye una alteracin grave del sistema inmune que es responsable de las infecciones recurrentes, alergias, enfer medades autoinmunes y neoplasias linforreticulares. Los pacientes con TLX presentan slo sntomas mnimos de inmunodeficiencia. El SWA es una enfermedad poco frecuente con una incidencia aproximada de un caso por cada 250.000 personas en la poblacin Europea. La frecuencia de TLX es desconocida. Patogenia. El SWA y la TLX son causadas por mutaciones en un gen localizado en el brazo corto del cromosoma X, que codifica para una protena de 502 aminocidos (WASp). Hasta ahora han sido identificadas sobre 100 mutaciones diferentes, la mayora del tipo sustitucin nucleotdica. No se ha encontrado una correlacin genotipo-fenotipo, aunque mutaciones sin sentido y que alteran el marco de lectura se asocian a for mas con inmunodeficiencia ms grave. La protena WASp es una protena intracelular rica en prolina expresada exclusivamente en clulas de linaje hematopoytico. Pertenece a una familia de protenas involucradas en transduccin de seales desde receptores a la actina. En ausencia de WASp existe un defecto en todos los procesos que se relacionan directamente con reorganizacin de la arquitectura del citoesqueleto, especialmente movilidad celular y fagocitosis. La disminucin progresiva en el nmero y funcin de las clulas T es el fenmeno ms importante en la alteracin del sistema inmune observada en el SWA, aunque tambin
se han descrito anomalas a nivel de los macrfagos y clulas dendrticas. Cuadro clnico. Los pacientes con TLX presentan desde el nacimiento tendencia al sangrado anor mal, mientras que en los pacientes con SWA a esto se suma la inmunodeficiencia, que se agrava durante la infancia. Sin embargo, el grado de inmunodeficiencia puede ser muy variable, incluso en miembros afectados dentro de la misma familia. La tendencia hemorrgica puede ir desde prpura cutneo leve a episodios hemorrgicos graves con hemorragia intracraneana o gastrointestinal. La disfuncin inmune se manifiesta por aumento de la susceptibilidad a las infecciones, eccema, fenmenos autoinmunes, vasculitis, enfermedades inflamatorias del tubo digestivo y aumento en la incidencia de sndromes linfoproliferativos. La supervivencia media de los pacientes con SWA es de alrededor de 15 aos. Las causas de muerte son las infecciones, hemorragias y las neoplasias. Diagnstico. La alteracin de laboratorio ms constante es la trombocitopenia, con plaquetas de muy pequeo tamao (VPM <5fl). Los estudios funcionales plaquetarios habitualmente slo demuestran una disminucin leve a moderada del pool de depsito. Es habitual que la tendencia hemorrgica sea mayor a la esperada para el recuento de plaquetas de los pacientes. Durante la infancia y edad adulta se observa una disminucin progresiva del nmero de linfocitos T, defectos de proliferacin y alteracin para inducir pr oduccin de anticuerpos. 2.1.5. Sndrome velocardiofacial Otra forma de trombocitopenia con similitud a la TLX, per o con plaquetas de tamao aumentado, es el sndrome velocardiofacial (SVCF), tambin conocido como sndrome de DiGeorge. El SVCF se asocia a mutaciones o deleciones en el cromosoma 1q22 y 10p4. El SVCF se caracteriza por la existencia de paladar hendido, malformaciones cardacas, facies tpica y retardo mental. En la mayora de los pacientes las hemorragias estn ausentes o son muy leves y los estudios de laboratorio de la funcin plaquetaria son normales. Debido a que las deleciones de 1q22 incluyen el gen de la GPIb, los pacientes con SVCF son heterocigotos para el sndrome de Bernard-Soulier. Algunos pacientes exhiben un defecto de aglutinacin con ristocetina y presentan episodios
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hemorrgicos graves. Es importante sealar que en el SVCF puede existir tambin una tr ombocitopenia de origen inmune que responder a tratamiento especfico. 2.1.6. Enfermedades relacionadas a MYH9 Las formas ms frecuentes de trombocitopenias hereditarias se caracterizan por presentar plaquetas de tamao aumentado (macrotrombocitopenia), entre las cuales las ms comunes pertenecen a un grupo denominado enfermedades relacionadas a MYH9. Entre stas, se distinguen la anomala de May-Hegglin y los sndromes de Sebastian, Fetchner y Epstein, enfer medades de transmisin autosmica dominante y causadas por mutaciones de MYH9, gen que codifica para la cadena pesada de la miosina no muscular IIA (NMMHC-IIA). Desde que se clon el gen, se han descrito ms de 20 mutaciones en 65 familias no relacionadas estudiadas a nivel mundial. Desde el perodo de recin nacido todos los individuos afectados presentan macrotrombocitopenia y cuerpos de inclusin en los leucocitos. Durante la infancia y algunos de ellos en la edad adulta, presentan sordera neurosensorial, cataratas y glomerulonefritis. Desde el punto de vista clnico y de laboratorio los diferentes sndromes que comprenden este grupo son muy difciles de separar y actualmente se acepta que ellos no representan entidades diferentes, sino ms bien esta sera una enfermedad nica con un espectro clnico heterogneo. Patogenia. La miosina no muscular IIA es una enzima hexamrica compuesta de dos cadenas pesadas y cuatro cadenas livianas. La dimerizacin de las cadenas pesadas lleva a la formacin de una estructura polar con dos regiones bien definidas: en el extremo terminal N, una estructura globular con sitios de unin para ATP y actina involucrados en actividad motora y en el extremo terminal C, formacin de una hlice alfa con funciones reguladoras. Las mutaciones de MHY9 que afectan el dominio motor se asocian ms frecuentemente a compromiso renal grave mientras que alteraciones en el extremo C se observan en familias sin dao renal. Sin embargo, la misma mutacin se ha encontrado en pacientes con diferentes manifestaciones clnicas, sugiriendo que el fenotipo resulta de una interaccin compleja entre el MHY9 afectado y genes modificadores. La tr ombocitopenia es el r esultado de
trombopoyesis inefectiva, ya que el nmero de megacariocitos y la supervivencia plaquetaria son normales y la esplenectoma no mejora el recuento de plaquetas. La tendencia al sangrado en estos pacientes parece ser mayor que lo esperado para el recuento de plaquetas, sugiriendo un defecto funcional asociado. La agregacin y secrecin plaquetarias son habitualmente normales, pero con alteraciones en el cambio de forma, proceso que requiere de un funcionamiento adecuado de NMMHCIIA. Las inclusiones leucocitarias se observan en alrededor del 25-75% de los neutrfilos, siendo mucho ms raras en los eosinfilos o monocitos. Estas inclusiones fusiformes de 2-7m de dimetro se ubican en la periferia de la clula y se tien de azul con May-Grnwald-Giemsa; debido a su semejanza, se les ha denominado cuerpos de Dhle-simil. Estas inclusiones estn formadas por ribosomas y microfilamentos de 7-10 nm de dimetro. An se desconoce la patogenia de la insuficiencia renal en este grupo enfermedades, en pacientes con dao renal se ha encontrado que la NMMHC-IIA se encuentra anormalmente distribuida tanto en las clulas mesangiales como tubulares y los podocitos muestran fusiones segmentarias y focales. Manifestaciones clnicas. En orden de frecuencia, las manifestaciones clnicas de las enfermedades relacionadas a MHY9 son la ditesis hemorrgica, la sordera a tonos altos, compromiso renal y cataratas. Los sangrados son habitualmente leves, aunque excepcionalmente pueden presentar hemorragias graves. Generalmente las manifestaciones hemorrgicas aparecen durante la infancia y se mantienen invariables durante toda la vida; las equmosis, epistaxis y menorragias son los sntomas ms frecuentes. Las otras manifestaciones asociadas se pueden presentar en la infancia o en la edad adulta. Diagnstico. La nica caracterstica de laboratorio constante en las enfermedades relacionadas a MHY9 es la macrotrombocitopenia. En el frote de sangre perifrica lo habitual es que entre un 5-50% de las plaquetas pueden presentar un tamao mayor al de los eritrocitos. La mayora de los pacientes cursan con trombocitopenia leve a moderada, pero algunos pueden presentar un recuento de plaquetas normal. Los contadores
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hematolgicos tienden a subestimar el recuento y tamao de las plaquetas, por lo que se recomienda realizar un examen microscpico de la sangre perifrica. Esto tambin permitir observar los cuerpos de Dhle-smiles. 2.2. TROMBOCITOPENIAS ADQUIRIDAS 2.2.1. Trombocitopenias por disminucin de la produccin La trombocitopenia adquirida por disminucin de la produccin se observa en forma frecuente y predecible en la aplasia medular, infiltracin maligna de la mdula sea, quimioterapia y
radiacin. Asimismo, la trombocitopenia es parte de la pancitopenia observada en deficiencias nutricionales de folato, vitamina B12 y, ocasionalmente, fierro. Estas condiciones se discuten en otros captulos de este texto. Analizamos aqu aquellos cuadros en que la trombocitopenia resulta de una reduccin selectiva o ausencia de megacariocitos a nivel de la mdula sea, con presencia normal de las otras series hematopoyticas. Esta condicin que se denomina aplasia o hipoplasia megacarioctica pura adquirida, puede ser secundaria a una variedad de etiologas entre las que destacan drogas, infecciones y alteraciones inmunolgicas (tabla 21-2).
Tabla 21-2. Clasificacin de las trombocitopenias adquiridas Por disminucin de la produccin de plaquetas Hipoplasia/aplasia megacarioctica Infecciones virales Drogas y alcohol Por aumento de la destruccin de plaquetas Mecanismos inmunolgicos Trombocitopenias autoinmunes Trombocitopenia inmune primaria Prpura trombocitopnica inmune Aguda Crnica Trombocitopenias inmunes secundarias Enfermedades autoinmunes Generalizadas (Ej. Lupus Eritematoso Sistmico) rgano especficas (Ej. Tiroiditis) Enfermedades linfoproliferativas Leucemia linftica crnica Linfomas Mieloma mltiple Tumores slidos Infeccin por HIV Post-trasplante de mdula sea Infecciones virales Drogas (Sales de oro, quinidina, heparina) Trombocitopenias aloinmunes Prpura aloinmune neonatal Prpura post-transfusional Mecanismos no inmunolgicos Prpura trombtica trombocitopnica Sndrome hemoltico urmico Trombocitopenia incidental del embarazo Trombocitopenia asociada a infecciones Por secuestro esplnico de plaquetas (hiperesplenismo) Por prdidas y dilucin durante la transfusin masiva de sangre
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a) Hipoplasia megacarioctica inducida por drogas Algunas drogas tienen un efecto sobre los megacariocitos que es relativamente especfico, ya sea como r espuesta idiosincrsica o dependiente de la dosis. Las drogas que con mayor frecuencia se asocian a reduccin aislada de los megacariocitos son la clorotiazida, alcohol y estrgenos. En individuos susceptibles, la clorotiazida puede inducir una trombocitopenia leve o moderada que se recupera espontneamente en alrededor de 2 semanas despus de retirar la droga. La ingestin de grandes cantidades de alcohol puede causar una supresin selectiva de la produccin de plaquetas, con trombocitopenia leve a moderada, que se puede agravar por la presencia simultnea de esplenomegalia, desnutricin o insuficiencia heptica. El uso prolongado de dietilestilbestrol u otr os pr eparados de estrgenos se asocia ocasionalmente a trombocitopenia en individuos susceptibles, la cual puede tardar hasta dos meses en recuperarse despus de la suspensin de la hormona. b) Hipoplasia megacarioctica asociada a infeccin viral Varios tipos de infecciones virales son capaces de afectar selectivamente la trombopoyesis. Destaca la infeccin por virus del sarampin, varicela, citomegalovirus, mononucleosis infecciosa y dengue. Ocasionalmente el virus de la hepatitis B puede producir una trombocitopenia amegacarioctica aislada. Desde el punto de vista mor folgico la trombocitopenia asociada a infeccin viral se caracteriza por vacuolizacin de los megacariocitos, inclusiones y degeneracin nuclear. En algunas infecciones virales (rubola, varicela) la trombocitopenia puede ser agravada por la destruccin perifrica de las plaquetas por accin de complejos inmunes. 2.2.2. Trombocitopenias por aumento de la destruccin La remocin acelerada de las plaquetas desde la cir culacin obedece a dos grandes mecanismos: inmunolgico, en el cual la destruccin plaquetaria es mediada por anticuerpos y/o complejos inmunes, y mecanismo no inmunolgico o por aumento de consumo (tabla 21-2).
a) Trombocitopenias inmunes Las plaquetas pueden ser retiradas pr ematuramente de la circulacin por mecanismos inmunes en los que pueden participar aloanticuerpos, autoanticuerpos, anticuerpos dependientes de droga y posiblemente complejos inmunes. El denominador comn de todos estos procesos es una retirada acelerada de las plaquetas, con acortamiento de la supervivencia, lo que se traduce en una disminucin del nmero de plaquetas circulantes. En la tabla 21-3 se clasifican los diferentes tipos de trombocitopenias inmunes segn la naturaleza del anticuerpo responsable. a1) Trombocitopenias autoinmunes primarias El prpura trombocitopnico inmune primario (PTI) es una de las causas ms frecuentes de trombocitopenia aislada encontrada en la prctica mdica. La enfermedad es causada por autoanticuerpos que se unen a estructuras de la membrana plaquetaria, acortando su supervivencia. La presentacin clnica es muy variable, desde casos agudos muy sintomticos, a hallazgos fortuitos de trombocitopenia asintomtica. Debido a sus diferencias clnicas, teraputicas y posiblemente fisiopatolgicas, se discutir en forma separada el PTI crnico del adulto y el PTI agudo, cuadro que se presenta fundamentalmente en nios. Prpura trombocitopnico inmunolgico agudo El PTI agudo es una enfermedad de los nios, habitualmente autolimitada, que se presenta comnmente con una historia corta de sangrado mucocutneo en nios de 2 a 10 aos de edad, de cualquier sexo. La incidencia es de alrededor de 1 caso por 100.000 nios. Es muy frecuente el antecedente de una infeccin viral reciente o vacunacin. En el momento de la presentacin la trombocitopenia es generalmente grave y sintomtica, con recuentos de plaquetas menores a 20.000/l. El examen fsico muestra petequias, equimosis y signos de sangrado mucoso. Ocasionalmente se puede presentar sangrado gastrointestinal o genitourinario (<2% de los casos). En la etapa aguda existe riesgo de hemorragia intracraneana, aunque ste es bajo (<1%). La evolucin caracterstica de la PTI aguda en la infancia es hacia la remisin espontnea la que se alcanza en un promedio
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de 1 a 2 meses en el 80% de los casos. El diagnstico de PTI agudo del nio est basado principalmente en la historia, examen fsico, recuento sanguneo completo y frotis de sangre perifrica para excluir otras causas de trombocitopenia aguda. Pruebas adicionales son generalmente innecesarias y no se debieran utilizar en for ma rutinaria para hacer el diagnstico. El estudio de la mdula sea se debera reservar para establecer el diagnstico en pacientes con trombocitopenia persistente o resistentes al tratamiento. Patogenia. La estrecha relacin entre el desarrollo de PTI agudo e infeccin viral ha llevado a proponer una serie de mecanismos que tienen relacin con este tipo de infecciones, para explicar la destruccin de las plaquetas: (a) interferencia del virus con la maduracin de los megacariocitos, (b) reactividad cruzada de anticuerpos anti-virales con las plaquetas, (c) unin de complejos inmunes virus-antivirus a la superficie plaquetaria y (d) produccin de un autoanticuerpo verdader o. De estos mecanismos, el que ha encontrado mayor evidencia experimental es aquel relacionado a la pr oduccin de autoanticuerpos antiplaquetarios verdaderos. De hecho, se ha demostrado produccin de IgG por parte de linfocitos esplnicos de nios con PTI agudo, la que se une en forma especfica a estructuras de la membrana de las plaquetas. Por otra parte, en el suero de nios portadores de PTl agudo, se han descrito anticuerpos que reconocen la GPV de la membrana plaquetaria. Tratamiento. La mayora de los nios portadores de PTI agudo no requiere tratamiento especfico; de hecho, alrededor del 80% de ellos evoluciona a la remisin completa sin necesidad de esteroides o esplenectoma, dentro de los seis meses de iniciado el cuadro. Pacientes con recuentos de plaquetas >20.000/l no se deberan hospitalizar si estn asintomticos o presentan slo prpura leve. Tratamiento especfico estara indicado en pacientes que tienen <20.000 plaquetas/l o en aqullos con recuentos <50.000 pero con sangrado mucocutneo significativo. En estos casos el uso de corticosteroides ha mostrado ser de algn
beneficio. Habitualmente se utiliza 1-2 mg/kg/ da o 60 mg/m2/da de prednisona oral por 21 das, aunque tambin un esquema que usa 4 mg/kg/da de prednisona oral por 7 das ha mostrado un beneficio similar. En varios estudios que han utilizado dosis muy altas de corticosteroides (10 a 50 mg/kg/da de metilprednisolona por 7 das), se ha observado recuperacin del recuento de plaquetas similar al obtenido con el uso de inmunoglobulina intravenosa (IgIV). Existe evidencia que con el uso de IgIV se produce una recuperacin del recuento de plaquetas ms rpida que con corticoster oides o sin tratamiento. Se recomienda tratar con IgIV a todos los nios portadores de PTI agudo que independiente del recuento de plaquetas presenten hemorragias graves con riesgo vital o a aqullos que se presentan con <10.000 plaquetas/l. La dosis recomendada es de 1 g/kg por un da o 2 g/kg administrada en 2-5 das. Se ha demostrado que la globulina anti-Rh(D) intravenosa aumenta el recuento de plaquetas en forma significativa en el PTI agudo del nio; sin embargo, la velocidad de recuperacin pareciera ser menor que la obtenida con el uso de IgIV. La dosis utilizada vara entre 25 y 75 g/kg por 2-5 das. Numer osos estudios muestran a la esplenectoma como una terapia efectiva en el PTI agudo, aunque no existe evidencia que permita definir las indicaciones apropiadas, el momento de realizarla y sus riesgos potenciales. Se ha sugerido que la esplenectoma estara indicada cuando la trombocitopenia persiste por ms de 12 meses despus del diagnstico, con sntomas de sangrado y recuento de plaquetas <10.000/l, asumiendo falla o respuesta transitoria al uso de IgIV o anti-Rh(D). Prpura trombocitopnico inmunolgico crnico El PTI crnico se caracteriza clnicamente por la aparicin de hemorragias mucocutneas de comienzo gradual, frecuentemente precedido por una historia larga de equimosis espontneas, epistaxis y menorragia. Entre otras diferencias con el PTI agudo, el PTI crnico es ms habitual en adultos, con mayor frecuencia de presentacin en mujeres (tabla 21-3).
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Tabla 21-3. Diferencias entre PTI agudo y crnico Caractersticas Edad de comienzo Mujeres:hombres Antecedente de infeccin Recuento de plaquetas Inicio de sntomas Duracin Remisin espontnea PTI aguda 2 9 aos 1:1 Presente < 20.000/l Abrupto 2 6 semanas > 80% de los casos PTI crnica 20 40 aos 3:1 Ausente 20.000 100.000/l Gradual Aos Infrecuente
Etiologa y patogenia. Desde la demostracin por Harrington que la infusin de plasma de pacientes con PTI induca trombocitopenia en voluntarios, numerosas observaciones han confirmado el concepto que la destruccin acelerada de plaquetas en el PTI crnico obedece a la accin de autoanticuerpos que reconocen estructuras de la membrana plaquetaria. La trombocitopenia sera el resultado de un aumento en la destruccin extravascular de las plaquetas cubiertas con anticuerpos a nivel del sistema fagoctico mononuclear (SFM). Sin embargo, estudios cinticos realizados en pacientes con PTI crnico, han demostrado tambin una respuesta inapropiada de la mdula sea, con grados variables de disminucin de la produccin de plaquetas, lo que contribuira al desarrollo de trombocitopenia. Estudios inmunohematolgicos muestran en forma consistente que sobre el 90% de los casos de PTI crnico presentan anticuerpos antiplaquetarios de clase IgG, aislados o en combinacin con IgM o IgA. Utilizando tcnicas con captura de antgenos (ver captulo 31) se ha encontrado que la mayora de los anticuerpos estn dirigidos primariamente contra las glicoprotenas (GP) IIb-IIIa, Ib-IX y menos frecuentemente contra la GPIa-IIa y GPIV. A pesar de que estos autoanticuerpos parecen estar involucrados en la patogenia del PTI crnico, an es motivo de controversia la utilidad de su bsqueda para el diagnstico clnico y tratamiento de los pacientes. Sin embargo, debido a que las GP mayores de las plaquetas son importantes receptores funcionales, es posible observar ocasionalmente un defecto de funcin de las plaquetas asociado a la presencia de estos autoanticuerpos. Este fenmeno se ha demostrado en pacientes en los cuales a pesar de obtener un aumento en el nmero de plaquetas circulantes, persisten los sntomas de sangrado. En estos casos, se ha
postulado que la unin del anticuerpo en la cercana de los sitios activos de las GPs, interferira con la unin de los ligandos, lo que se traducira en alteracin de la respuesta de las plaquetas al dao vascular. Diagnstico. Los elementos fundamentales en los que se basa el diagnstico del PTI crnico en el adulto son la historia, el examen fsico y el recuento sanguneo completo con examen microscpico de la sangre perifrica. La historia clnica tiene como objetivos determinar el tipo y gravedad del sangrado mucocutneo, as como descartar el uso de dr ogas que potencialmente pueden pr oducir trombocitopenia o agravar las manifestaciones clnicas de la enfermedad (ej. aspirina). El examen fsico est dirigido a evaluar manifestaciones de sangrado, su gravedad y a excluir otras causas de trombocitopenia. Un recuento sanguneo completo y una cuidadosa observacin del frotis de sangre perifrica son esenciales en el diagnstico del PTI. Es importante en la evaluacin de un recuento de plaquetas anormalmente bajo, descartar la seudotrombocitopenia, que en la mayora de los casos resulta de la aglutinacin in vitro de las plaquetas en presencia de EDTA. No se considera necesario el uso de otras pruebas de laboratorio si, la historia, examen fsico y recuento sanguneo, son compatibles con el diagnstico de PTI. Si se encuentra elementos atpicos, podra estar indicada la realizacin de pruebas adicionales de laboratorio. Entre otros, se considera apropiado descartar la infeccin por virus de la inmunodeficiencia humana en pacientes con factores de riesgo. El examen de la mdula sea se debera efectuar como parte de la evaluacin en pacientes sobre los 60 aos y en aqullos candidatos a esplenectoma. El estudio de anticuerpos unidos a las plaquetas (IgG asociada a plaquetas, PAIgG), anticuerpos libres en el suero y especificidad antignica de
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los anticuerpos (ver captulo 31), no se ha demostrado de utilidad en la evaluacin inicial de los pacientes con sospecha de PTI. Tratamiento. En pacientes con recuentos de plaquetas superiores a 50.000/l, asintomticos o con prpura leve no es necesario iniciar tratamiento especfico y se debera mantenerlos slo en observacin. En el resto de los casos se debera iniciar tratamiento, para lo cual se dispone de varias opciones: Glucocorticoides. El uso de corticosteroides constituye el tratamiento estndar inicial en los adultos portadores de PTI. Se recomienda iniciar el tratamiento con prednisona 1 mg/ kg/da. Con este rgimen 70 a 90% de los casos responde con aumento del recuento de plaquetas y atenuacin de los sntomas de sangrado. El efecto de los corticosteroides se evidencia alrededor de los 7 das y es mximo a las 2-3 semanas. A largo plazo, no ms del 15% de los pacientes tratados con corticoides experimentar remisin permanente.
prueba de Coombs directa positiva, y cada leve y transitoria de la hemoglobina. Otros tratamientos. En pacientes que ya han sido esplenectomizados y refractarios al tratamiento con corticosteroides existen numerosas opciones teraputicas; sin embargo, no hay estudios controlados que permitan determinar su efectividad y tasa de efectos adversos. El tratamiento con inmunosupresores se ha demostrado eficaz en algunos casos. Azatioprina y ciclofosfamida como agentes nicos o en combinacin con prednisona, pueden producir incrementos en el recuento de plaquetas, aunque se requiere de varios meses de tratamiento. Danazol, un andrgeno modificado que carece de efectos masculinizantes, se ha usado como sustituto de los corticosteroides. En dosis de 400 a 800 mg por da induce respuestas parciales en un 10 - 80% de los casos publicados, pero su empleo se asocia a toxicidad heptica.
a2) Trombocitopenias inmunes secundarias La trombocitopenia inmune puede aparecer como complicacin de una gran variedad de enfermedades sistmicas, siendo habitualmente indistinguible del PTI crnico. La asociacin con lupus eritematoso sistmico (LES) es muy frecuente, presentndose hasta en un tercio de los casos. El PTI crnico se puede asociar a anemia hemoltica autoinmune (sndrome de Evans) o combinarse con autoanticuerpos que reaccionan con factores de la coagulacin y neutrfilos. Otras enfermedades autoinmunes asociadas a PTI crnico son la enfermedad de Graves, la tiroiditis de Hashimoto, miastenia gravis, esclerodermia, enfermedad mixta del tejido conectivo, sndrome de Sjgren, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y cirrosis biliar. El PTI crnico tambin se ha asociado a enfermedades linfoproliferativas como linfoma de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, mieloma mltiple, macroglobulinemia de Waldenstrm y leucemia linftica crnica. Enfermedades infecciosas que se asocian a la aparicin de PTI crnico incluyen citomegalovirus, mononucleosis infecciosa, hepatitis B, Micoplasma pneumoniae, leptospirosis, tuberculosis y toxoplasmosis. En pacientes portadores de infeccin por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) hasta 40% de los casos puede desarrollar un cuadro de PTI crnico, que a veces es el signo de presentacin de la infeccin. En su patogenia juegan un papel muy importante la presencia de complejos
Esplenectoma. Esta forma de tratamiento estara indicada en aquellos casos que no responden a corticosteroides o requieren dosis muy altas para mantenerse en remisin. Alrededor de 70% de los casos tendr alguna for ma de respuesta inmediata a la esplenectoma; en la mayora de los casos normalizando el recuento de plaquetas. A largo plazo alrededor de dos tercios de los pacientes esplenectomizados permanecern en remisin, la mitad de ellos con recuentos de plaquetas >100.000/l. Inmunoglobulina G intravenosa. En el PTI del adulto la IgGIV se utiliza fundamentalmente cuando se requiere aumentar transitoriamente el recuento de plaquetas, especficamente en aquellos pacientes con <50.000 plaquetas/l y hemorragias con riesgo vital. La dosis recomendada es de 0,5-1 g/kg administrada en 2 a 5 das. Inmunoglobulina anti-Rh(D). La infusin de inmunoglobulina anti-Rh(D) (anti-D) en pacientes adultos no esplenectomizados portadores de PTI crnico produce un aumento transitorio del recuento de plaquetas que dura tpicamente 2-3 semanas; en individuos esplenectomizados la respuesta es menos consistente. El efecto adverso ms importante es la hemlisis con
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inmunes que contienen componentes de la membrana plaquetaria y anticuerpos de tipo IgG dirigidos contra una regin especfica de la GPIIIa. Trombocitopenia inmune asociada al uso de drogas La aparicin de trombocitopenia aguda grave en relacin al uso de drogas es una complicacin
reconocida desde hace ms de 100 aos. Numerosas drogas son capaces de inducir trombocitopenia mediante un mecanismo inmune. En la tabla 21-4 se muestran aquellas dr ogas con ms de cinco referencias independientes de asociacin a tr ombocitopenia y en las cuales se ha demostrado su efecto por pruebas in vitro o por reexposicin a la droga.
Tabla 21-4. Drogas involucradas en trombocitopenia inmune Droga Acetaminofeno Acido valproico Aspirina Carbamazepina Cefalotina Clorotiazida Clortalidona Difenilhidantona Digoxina Furosemida Heparina Meticilina Metildopa Quinidina Quinina Ranitidina Rifampicina Sales de oro Sulfonamidas Vancomicina Reexposicin + + + + Anticuerpo dependiente de droga in vitro + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + +
Criterios importantes que permiten determinar la existencia de una trombocitopenia inducida por droga incluyen: (a) la terapia con la droga sospechosa precede a la trombocitopenia; (b) la recuperacin de la trombocitopenia es completa y mantenida despus de suspender la droga; (c) la droga era la nica utilizada al inicio de la trombocitopenia; (d) se excluyen otras causas de trombocitopenia; y (e) la reexposicin a la droga sospechosa se asocia con recurrencia del cuadro. A estos criterios se puede agregar la demostracin en el laboratorio de un anticuerpo que reacciona contra las plaquetas en presencia de la droga. Patogenia. En la mayora de los casos los
anticuerpos inducidos por drogas se unen a las plaquetas especficamente a travs de su regin Fab y no en la forma de complejos inmunes. Las glicoprotenas de la membrana plaquetaria IIb-IIIa y Ib-IX constituyen los blancos antignicos ms frecuentes. Se ha propuesto que la respuesta inmune se iniciara por unin de la droga a los componentes de la membrana induciendo un cambio estructural o formando un complejo droga-protena (neoantgeno). Otras drogas inducen trombocitopenia por formacin de autoanticuerpos verdaderos, que no requieren la droga para reaccionar con las plaquetas como es el caso de la metildopa y sales de oro. Un nmero reducido de drogas, entre las que se incluye la penicilina, se unen a
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la membrana plaquetaria induciendo la formacin de anticuerpos dependientes de hapteno. Trombocitopenia inducida por heparina (TIH) Aunque en estricto sentido esta trombocitopenia es el resultado del uso de una droga, su patogenia nica, cuadro clnico y frecuencia de presentacin, hacen necesario considerarla en forma separada. La administracin de heparina endovenosa o subcutnea es una causa reconocida de tr ombocitopenia. La frecuencia de esta complicacin vara de 1-5% en diferentes estudios. En la TIH se han descrito dos formas: (a) tipo I, por accin directa de la heparina sobre las plaquetas, que no est mediada inmunolgicamente y que es habitualmente leve, y (b) tipo II, o inmune, por accin de un autoanticuerpo antiplaquetario dependiente de heparina. Lo ms importante de este cuadro es que los pacientes que presentan una trombocitopenia profunda asociada al uso de heparina, se complican paradjicamente de fenmenos de trombosis arterial y, menos frecuentemente, venosa. Patogenia. La TIH tipo II se asocia a la presencia de anticuerpos que estn dirigidos contra el complejo formado por la heparina y el factor plaquetario 4 (PF4), protena bsica que se encuentra normalmente en los grnulos alfa de las plaquetas. Los complejos inmunes formados entre el PF4, la heparina y el anticuerpo, son reconocidos por el receptor FcRIIa de las plaquetas, lo que induce su activacin, liberacin del contenido de sus grnulos y agregacin. Simultneamente, los heparinoides presentes sobre la superficie de la clula endotelial unen PF4 y se forma el complejo con el anticuerpo, lo que resulta en dao de la clula endotelial que se podra transformar as en una superficie protrombtica. Estudio de laboratorio . El anticuerpo dependiente de heparina se puede demostrar mediante tcnicas inmunolgicas (ELISA) o
funcionales. El ensayo de ELISA ms ampliamente utilizado se basa en la capacidad del anticuerpo de unirse al complejo PF4heparina fijado a una fase slida. Los ensayos funcionales dependen de la propiedad que tienen los anticuerpos dependientes de heparina de activar las plaquetas. Con este fin se ha utilizado la agregacin plaquetaria en presencia del anticuerpo y heparina o la liberacin de 5HT marcada con 14C en las mismas condiciones. Tratamiento. En la mayora de los pacientes que presentan una TIH la suspensin de droga es seguida por una rpida recuperacin del recuento de plaquetas. En aquellos casos en que no se puede prescindir de tratamiento anticoagulante, se ha obtenido buenos resultados con la utilizacin de anlogos de heparina sin reactividad cruzada con el anticuerpo (Danaparoid). En estos casos tambin se ha usado inhibidores directos de trombina tales como lepirudina y argatroban. a3) Trombocitopenias aloinmunes Las trombocitopenias aloinmunes resultan de la accin de aloanticuerpos que reconocen antgenos especficos sobre la membrana de las plaquetas, dando origen a dos entidades clnicas bien definidas: prpura aloinmune neonatal (PAIN) y prpura post-transfusional (PPT). Los antgenos plaquetarios, de acuerdo a su origen y distribucin se pueden clasificar en dos grupos: (a) aloantgenos compartidos con otras clulas sanguneas (ej., antgenos de los sistemas ABH, Lewis, P, I/i) y con clulas de otros tejidos (molculas clase I del sistema HLA) y (b) los aloantgenos plaquetarios especficos. Los aloantgenos plaquetarios especficos se generan por sustituciones aminoacdicas nicas de las glicoprotenas mayores de la membrana de las plaquetas. Estas sustituciones son reconocidas por aloanticuerpos antiplaquetarios. Los aloantgenos plaquetarios especficos, su localizacin, base molecular y frecuencia de expresin se muestran en la tabla 21-5.
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Tabla 21-5. Caractersticas de los aloantgenos plaquetarios especficos Sistema Alelos Sinnimos Localizacin Base molecular Frecuencia fenotpica(%)* 97.9 28.8 99.3 14.6 80.9 69.8 >99.9 <0.1 99.0 19.7 2.4 0.2 <0.01 0.6 <1.6 <0.25 0.4 0.25
HPA-1
HPA-1a HPA-1b HPA-2 HPA-2a HPA-2b HPA-3 HPA-3a HPA-3b HPA-4 HPA-4a HPA-4b HPA-5 HPA-5a HPA-5b HPA-6w HPA-6bw HPA-7w HPA-7bw HPA-8w HPA-8bw HPA-9w HPA-9bw HPA-10w HPA-10bw
PlA1, Zwa PlA2, Zwb Kob, Sibb Koa, Siba Leka, Baka Lekb, Bakb Pena, Yukb Penb, Yuka Brb Bra Caa, Tua Mo Sra Maxa Laa Groa Iya Sita
GPIIIa GPIb GPIIb GPIIIa GPIa GPIIIa GPIIIa GPIIIa GPIIb GPIIIa GPIIIa GIb GPIa
Leu33 Pro33 Thre145 Met145 Ile843 Ser843 Arg143 Glu143 Gln505 Lys505 Arg489 Glu489 Pro407 Ala407 Arg636 Glu636 Val837 Met837 Arg62 Glu62 Arg633 His633 Gly15 Gln15 Thre799 Met799
Prpura aloinmune neonatal El PAIN es una incompatibilidad feto-materna causada por aloinmunizacin de la madre a antgenos plaquetarios fetales. Su incidencia es de 1:2.000 a 1:3.000 embarazos y a diferencia de la enfermedad hemoltica del recin nacido, puede ocurrir hasta en un 30% de los casos durante el primer embarazo. El PAIN se presenta tpicamente como una trombocitopenia aislada en un recin nacido (RN) aparentemente sano. En aquellos RN con trombocitopenia ms grave se puede encontrar sangrado cutneo (petequias y equimosis) y sangrado mucoso que se manifiesta en las primeras horas de vida. En la mayora de los casos, el PAIN es una enfermedad benigna autolimitada, que remite espontneamente entre 2 y 15 das; sin embargo, en casos graves puede observarse hemorragia visceral e intracraneana. Esta ltima complicacin se puede presentar en forma antenatal o perinatal en un 10 a 20% de los pacientes con PAIN, lo que puede provocar secuelas neurolgicas e incluso la muerte. Patogenia. El PAIN es causado por la transferencia placentaria de aloanticuerpos
desde la madre al feto debido a sensibilizacin a antgenos plaquetarios fetales durante el embarazo. Sobre el 50% de los casos de PAIN en poblaciones caucsicas resulta de una incompatibilidad dentro del sistema HPA-1 (PlA); la incompatibilidad que compromete el sistema HPA-5 (Br) es la segunda causa ms frecuente en dichas poblaciones. Se ha descrito casos de PAIN por incompatibilidad materno fetal contra cualquiera de los otros aloantgenos plaquetarios descritos. Estudio de laboratorio. Utilizando tcnicas serolgicas modernas (ver captulo 31), es posible demostrar en el suer o mater no anticuerpos que reaccionan con las plaquetas paternas en prcticamente todos los casos de PAIN. La tipificacin antignica de las plaquetas maternas y paternas es tambin til en el estudio del PAIN, especialmente en aquellos casos en que no se encuentra anticuerpos en el suero de la madre. Tratamiento. En la mayora de los casos, el PAIN es clnicamente leve y no se necesita un tratamiento especfico. La recuperacin del recuento de plaquetas ocurre en 1 a 2 semanas,
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aunque excepcionalmente sta puede durar meses. La transfusin de plaquetas es el tratamiento de eleccin en los casos graves sintomticos. Se debe transfundir idealmente plaquetas compatibles con el aloanticuerpo materno; en este caso la mejor alternativa es utilizar plaquetas de la madre, lavadas para eliminar el plasma que contiene el anticuerpo e irradiadas para evitar la enfermedad injerto versus husped transfusional. El uso de IgGIV en dosis de 400g/kg/da por 5 das produce un acortamiento del perodo de trombocitopenia, aunque su efecto no se observa antes de las 24 horas. En los embarazos siguientes, si el padre es homozigoto para el antgeno se asume que el feto ser afectado; si es heterocigoto la presencia del antgeno en las plaquetas fetales se puede determinar mediante tcnicas de biologa molecular utilizando amniocitos. En las mujeres en riesgo se puede conocer el recuento de plaquetas fetales mediante puncin per cutnea del cordn umbilical, tan precozmente como a las 20 semanas de embarazo. Si se demuestra trombocitopenia, la alternativa de tratamiento ms aceptada en este momento es el uso en la madre de IgGIV, en dosis de 1g/kg/semana, sola o asociada a prednisona. Prpura post-transfusional El PPT se caracteriza por aparicin de trombocitopenia aguda grave, aproximadamente 5-10 das despus de una transfusin sangunea. En el 90% de los casos se trata de mujeres multparas que reciben su primera transfusin. Su incidencia se desconoce, aunque se han descrito no ms de 200 casos. La transfusin que desencadena esta condicin puede ser de cualquier hemocomponente y habitualmente se acompaa de una reaccin transfusional febril. En el suero del paciente se encuentra siempre un potente alaoanticuerpo antiplaquetario, en el 90% de los casos con especificidad anti-HPA1a. La patogenia de esta condicin es desconocida pero se ha propuesto tres teoras para explicar la destruccin de las plaquetas: (a) adsorcin de antgeno soluble presente en el producto sanguneo a las plaquetas del receptor; (b) unin de complejo inmune compuesto por aloantgeno/aloanticuerpo, y (c) produccin de autoanticuerpos producidos en paralelo con la respuesta aloinmune. El diagnstico se basa en la demostracin del aloanticuerpo antiplaquetario en pacientes con cuadro clnico compatible. La evolucin del PPT
es hacia la remisin espontnea en el curso de 1 a 6 semanas, excepto en aquellos casos en que la trombocitopenia causa algn episodio de hemorragia fatal. En pacientes con trombocitopenia grave y hemorragias con riesgo vital el uso de plasmafresis se acompaa de rpida recuperacin del recuento de plaquetas y regresin de la sintomatologa. Tambin se ha obtenido buenos resultados con el uso de IgGIV 0.4g/kg/da por 5 das. La transfusin de plaquetas es habitualmente de muy limitada efectividad. b) Trombocitopenias no inmunes b1) Prpura trombtico trombocitopnico/ sndrome hemoltico urmico El prpura trombtico trombocitopnico (PTT) y sndrome hemoltico urmico (SHU) son dos enfermedades multisistmicas que se caracterizan por la existencia de trombocitopenia, anemia hemoltica microangioptica, alteraciones neurolgicas, insuficiencia renal y fiebre, secundarias a trombosis de la microvasculatura arterial. Clnicamente, la diferenciacin entre estos dos sndromes se sustenta en el mayor compr omiso neurolgico en el PTT y predominio de la disfuncin renal en el SHU; sin embargo, la superposicin entre los dos cuadros es amplia y su diferenciacin es muchas veces arbitraria. El PTT es una enfermedad de comienzo brusco con una pntada clsica que comprende tr ombocitopenia, anemia hemoltica micr oangioptica, fiebre, compr omiso neurolgico e insuficiencia renal. Ya que es necesario iniciar precozmente el tratamiento, los criterios de diagnstico se han reducido y actualmente se presume la existencia de un PTT frente a cualquier anemia hemoltica microangioptica asociada a trombocitopenia, no explicada por otras causas. El SHU es clsicamente una enfermedad renal caracterizada por una microangiopata renal tr ombtica, tr ombocitopenia y anemia hemoltica microangioptica. La Escherichia coli 0157:H7 es un agente etiolgico importante en el SHU en nios y ocasionalmente en los adultos. Los nios que presentan un SHU asociado a diarrea epidmica generalmente no requieren de plasmafresis y evolucionan hacia la recuperacin espontnea. Otras condiciones asociadas a PTT/SHU se muestran en la tabla 21-6.
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Tabla 21.6. Asociaciones clnicas y etiologa en prpura trombtica trombocitopnica y sindrome hemoltico urmico Idioptica Familiar Inducida por drogas Quinidina, ticlopidina, clopidogrel, mitomicina C, cisplatino, gemcitabina, Embarazo y puerperio Diarrea infecciosa Infeccin por E coli 0157:H7 Trasplante de mdula sea Enfermedades malignas y autoinmunes Patogenia. El dao endotelial sistmico es un elemento comn en la patogenia del PTT y SHU. El dao endotelial se acompaa de liberacin de multmeros del factor von Willebrand (FVW) de tamao inusualmente grande. La presencia de estos multmeros ha sido descrita en el plasma de pacientes que presentaban PTT recurrente, durante la etapa de remisin clnica. Una proteasa plasmtica que escinde el FVW es la responsable de disminuir el tamao de los multmeros en el plasma normal. Deficiencia de esta proteasa se ha encontrado tanto en pacientes que exhiben la forma recurrente familiar como espordica de la enfermedad. En estos ltimos la deficiencia de la proteasa est asociada a la presencia de autoanticuerpos especficos. De esta for ma, la evidencia disponible sugiere que la deficiencia constitucional o adquirida de la proteasa que escinde al FVW, juega un papel fundamental en la patogenia del PTT. Es necesario sealar que se ha descrito deficiencia de esta proteasa en otras condiciones clnicas diferentes de PTT/SHU tales como uremia, insuficiencia heptica, LES y post-operatorio, aunque excepcionalmente llega a valores menores al 10% de actividad de la enzima. Diagnstico. Los criterios primarios sobre los que se basa el diagnstico de esta condicin son la anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. La importancia diagnstica de la presencia de glbulos rojos fragmentados (esquistocitos) en la sangre perifrica, obliga a una revisin cuidadosa del frotis de sangre en todos los casos sospechosos. El aumento de dehidr ogenasa lctica (LDH) suele ser importante reflejando tanto la hemlisis como el dao tisular. A pesar de la extensa agregacin de las plaquetas en la microvasculatura, no se evidencia consumo de factores de coagulacin ni generacin de trombina; pruebas tales como tiempo de pr otr ombina, tiempo de tromboplastina parcial activado, concentracin de fibringeno y niveles de dmero D son habitualmente normales. La medicin de la actividad de la proteasa que escinde al FVW es muy compleja desde el punto de vista tcnico y generalmente disponible slo en laboratorios especializados. Tcnicas de desarrollo reciente, que utilizan la capacidad del FVW de unirse al colgeno en directa relacin a la presencia de multmeros de alto peso molecular, han facilitado el diagnstico clnico. Sin embargo, ser necesario determinar su especificidad y sensibilidad en gran nmero de pacientes, para definir su real utilidad en el diagnstico y manejo del PTT/SHU.
Tratamiento. La plasmafresis es el elemento ms importante en el tratamiento de PTT/SHU y no existe evidencia actual que otros tratamientos adicionales cambien la evolucin de los pacientes. La plasmafresis se debe realizar diariamente removiendo al menos un volumen plasmtico, el que se reemplaza con plasma fresco congelado o sobrenadante de crioprecipitado. El beneficio terico del uso de sobrenadante de crioprecipitado se basa en su menor contenido de FVW y que estudios retrospectivos sugieren un mayor beneficio. La duracin del tratamiento depende de la respuesta, constituyendo el recuento de plaquetas uno de los parmetr os ms importantes a evaluar. La persistencia de la trombocitopenia o su profundizacin es indicacin de intensificar la terapia, lo que habitualmente significa aumentar el volumen de recambio a 1.5 volemias y eventualmente la adicin de glucocorticoides va oral (prednisona 1 mg/kg/da) o parenteral (metilprednisonlona 125 mg dos veces al da). Tpicamente los pacientes que responden al tratamiento lo hacen dentro de la primera semana, sin embargo,
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existen casos que requieren un tiempo mucho mayor. Una vez que se alcanza la remisin, la intensidad y frecuencia de la plasmafresis se debe reducir gradualmente hasta suspenderla por completo. b2) Trombocitopenia del embarazo Estudios recientes han demostrado que durante un embarazo no complicado existe una disminucin del recuento de plaquetas de alrededor de 10% con respecto a los valores basales, lo cual se hace ms evidente durante el tercer trimestre. En aproximadamente un 810% de las embarazadas la cada del recuento de plaquetas es mayor, constituyendo una trombocitopenia moderada asintomtica, que se ha denominado trombocitopenia incidental del embarazo. Este cuadro se caracteriza por una trombocitopenia leve o moderada, no complicada por hemorragia, que tpicamente se detecta en el tercer trimestre o inmediatamente previo al parto. La condicin, tambin conocida como trombocitopenia asociada a embarazo o trombocitopenia gestacional, es responsable de alrededor de 75% de los casos de trombocitopenia que ocurren durante el embarazo. La trombocitopenia incidental del embarazo es un diagnstico de exclusin en mujeres sanas con recuentos de plaquetas que raramente son inferiores a 70.000/l; de hecho, el 90% de los casos presentan ms de 100.000 plaquetas/l. La causa de esta trombocitopenia es desconocida, pero se ha sugerido que podra corresponder a una exacerbacin de un proceso fisiolgico de remocin de plaquetas durante el embarazo. El tratamiento de esta condicin debe ser conservador ya que no existe riesgo de sangrado en las madres y no se ha descrito casos de trombocitopenia fetal o del recin nacido. b3) Preeclampsia/eclampsia La trombocitopenia ocurre en tasas de 15-20% en casos de preeclampsia y sobre 40% en pacientes con eclampsia. En la gran mayora de los casos sta es leve o moderada, aunque existen casos que presentan trombocitopenia grave. Un subgrupo de pacientes puede presentar hemlisis microangioptica, elevacin de las enzimas hepticas y trombocitopenia (sndrome de HELLP), cuadro que representa una for ma grave de preeclampsia, con mortalidad materna que vara entre 1-3% de los casos. La patogenia de la trombocitopenia en la
preeclampsia es motivo de controversia, aunque se ha sugerido como principal mecanismo el aumento en la destruccin de las plaquetas. En algunos pacientes se demuestra aumento en la generacin de trombina, lo que podra contribuir a la trombocitopenia por activacin y consumo. El tratamiento primario de la preeclampsia y sindrome HELLP es la induccin del parto, lo cual mejora la trombocitopenia en el curso de los das siguientes. b4) Trombocitopenia asociada a infeccin La trombocitopenia se puede presentar como una complicacin de infecciones bacterianas, virales, por hongos o protozoos. En la mayora de los casos de trombocitopenia asociada a infeccin se encuentra acortamiento de la supervivencia de las plaquetas e hiperplasia megacarioctica. En un subgrupo de pacientes con infecciones graves, la coagulacin intravascular diseminada (CID) con generacin de trombina y consumo de plaquetas, puede ser el mecanismo predominante de la trombocitopenia. El aumento de PAIgG en una proporcin de los pacientes con septicemia ha llevado a sugerir una naturaleza inmune en estos casos. En pacientes con infeccin por VIH/SIDA, la trombocitopenia resulta de una combinacin de destruccin inmunolgica y compromiso de la mdula sea (ver punto 2.2.2, a2). Otros mecanismos involucrados en la trombocitopenia de las infecciones comprenden activacin de las plaquetas inducida por mediadores de la inflamacin o productos bacterianos, dao endotelial, vasculitits difusa y supresin medular como ocurre en infecciones virales. El reconocimiento precoz y tratamiento adecuado de la infeccin son las medidas ms importantes en el manejo de la trombocitopenia asociada a infeccin. La recuperacin del recuento de plaquetas es habitualmente paralelo a la resolucin del cuadro infeccioso. Las transfusiones de plaquetas no son necesarias a menos que el recuento de plaquetas sea menor de 20.000/l o existan condiciones asociadas que puedan determinar un sangrado grave. b5) Trombocitopenia asociada a exposicin a superficies no biolgicas La introduccin de superficies extraas en la circulacin se asocia a consumo selectivo de plaquetas. En el caso de ciruga con circulacin extracorprea (CEC), existe un amplio espectro de alteraciones hemostticas, entre las cuales destaca la trombocitopenia y la disfuncin
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plaquetaria transitoria (ver punto 3). En la CEC, el recuento de plaquetas habitualmente disminuye en un 30-50% debido fundamentalmente a hemodilucin, secuestro, destruccin en el oxigenador y aumento de la fibrinolisis. El tiempo de sangra (TS) se encuentra con frecuencia desproporcionadamente largo en relacin al recuento de plaquetas. La hemorragia en estos pacientes se controla adecuadamente con la transfusin de plaquetas. Aun cuando en pacientes portadores de vlvulas cardacas protsicas existe un acortamiento de la supervivencia de las plaquetas, la trombocitopenia es muy infrecuente y cuando sta ocurre, es leve. La insercin de catteres, especialmente en pacientes peditricos se ha asociado infrecuentemente a trombocitopenia por aumento del consumo de plaquetas. 2.2.3. Trombocitopenia por secuestro esplnico La esplenomegalia de cualquier etiologa se puede acompaar de trombocitopenia de grado variable, aunque la hemorragia espontnea en esta situacin es una complicacin extraor dinariamente infrecuente. Los megacariocitos en la mdula sea se encuentran habitualmente nor males o levemente aumentados en nmero. Es frecuente la asociacin con neutropenia y anemia leve. En sujetos normales alrededor del 30% de la masa de plaquetas se encuentra en el bazo; en pacientes con esplenomegalia el secuestro esplnico puede ser mayor al 80% de las plaquetas, lo que determina una disminucin del nmero de plaquetas circulantes. La esplenectoma estara indicada slo en aquellos casos en que la magnitud del secuestro se traduzca en citopenias sintomticas (ej. hemorragias o infecciones). 2.2.4. Trombocitopenia dilucional En pacientes que reciben transfusin masiva de sangr e se observa frecuentemente trombocitopenia como resultado del efecto directo de la hemodilucin; la disminucin del recuento de plaquetas en estos casos muy rara vez alcanza niveles por debajo de las 50.000
plaquetas/l. Por otra parte, durante la transfusin masiva de sangre se ha descrito tambin la existencia de disfuncin plaquetaria y alteraciones de la hemostasia secundaria, propios de la terapia de reemplazo. La trombocitopenia puede adems agravarse por aumento del consumo de plaquetas si el paciente desarrolla una CID. La transfusin de plaquetas estara indicada slo si la trombocitopenia est contribuyendo en forma significativa al defecto hemosttico. 3. TROMBOCITOPATAS 3.1. Trombocitopatas hereditarias Las plaquetas desempean un papel principal en la hemostasia, y tambin en la trombosis (ver captulo 19). Se adhieren fcilmente al subendotelio expuesto en las zonas de lesin, se activan, inducindose los procesos de agregacin y secrecin. Las plaquetas adheridas/agregadas favorecen la activacin local de la coagulacin, desencadenando la formacin de un trombo de clulas sanguneas y fibrina que sella el vaso de forma estable. En condiciones patolgicas, un exceso de adhesividad y reactividad plaquetaria puede favorecer el desarrollo de trombosis. La relevancia fisiolgica de la funcin plaquetaria se manifiesta en que tanto la reduccin significativa del nmero de plaquetas circulantes como las alteraciones que afectan su funcin pueden traducirse en hemorragias, las cuales pueden ser de gran severidad y comprometer la vida de los individuos afectados. Se revisar sucintamente las disfunciones plaquetarias, sus bases moleculares y los aspectos clnicos de las alteraciones cualitativas hereditarias de las plaquetas ms frecuentes. Aunque cualquier alteracin de las plaquetas puede comprometer la globalidad de su funcin, por razones expositivas stas han sido ordenadas segn la funcin principalmente afectada por el defecto hereditario: defectos de adhesin, defectos de agregacin, defectos de secrecin, defectos de transmisin de seales de activacin, defectos de la actividad procoagulante, y otros defectos (tabla 21-7).
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Tabla 21-7. Clasificacin de las Trombocitopatas congnitas Alteraciones en la capacidad de adhesin Sndrome de Bernard-Soulier (SBS): Defecto en GPIb-IX-V Enfermedad de seudo von Willebrand : Defecto en GPIb-IX-V Deficiencia en la interaccin con colgeno: Defecto en GPIa-IIa o GPVI Defectos de la agregacin plaquetaria Tromboastenia de Glanzmann: Defecto en GPIIb-IIIa Deficiencias de los grnulos plaquetarios y/o secrecin Deficiencia de los grnulos (pool de almacenamiento): : Sndrome de plaqueta gris y Sndrome de Quebec Alteraciones en la transmisin de seales de activacin Deficiencias de receptores de agonistas Defectos en protenas G Defectos en enzimas efectoras (fosfolipasas, nucletido ciclasas) Defectos de la movilizacin de segundos mensajeros (IP3, calcio, etc.) Defectos especficos en la va metablica del cido araquidnico Defectos de la actividad procoagulante de las plaquetas Sndrome de Scott; Sndrome de Stormorken; SBS Otros defectos Sndrome de Wiskott-Aldrich Sndrome de Down, macrotrombocitopenias constitucionales 3.1.1. Defectos hereditarios de la adhesin plaquetaria En situaciones fisiolgicas las plaquetas circulan libremente en la sangre sin adherirse a las clulas endoteliales, pero en respuesta al dao vascular, las plaquetas se adhieren a elementos de la matriz subendotelial expuesta. Esta adhesin plaquetaria, primer eslabn en la cadena de la respuesta hemosttica, depende principalmente de la interaccin del receptor plaquetario IbIX-V con el factor von Willebrand (FVW) del subendotelio, y a ella contribuye tambin la adhesin al colgeno mediada por el complejo glicoproteico Ia-IIa y/o otros receptores del colgeno. Defectos en alguno de estos receptores, principalmente del complejo Ib-IXV, se traducen en alteracin de la adhesin plaquetaria. a) Patologa del complejo glicoproteico IbIX-V: Sndrome de Bernard-Soulier y seudovon Willebrand. El receptor Ib-IX-V es un macrocomplejo formado por las GPs Ib (143 kDa), Ib (22 kDa), IX (20 kDa), y V (83 kDa), asociadas en relacin estequiomtrica 2 Ib: 2 I: 2 IX: 1 V. Estas GPs pertenecen a la familia de protenas con dominios ricos en leucina, y son fruto de la expresin de genes localizados en los cromosomas 17p12 (GPIb), 22q11.2 (GPIb), 3q29 (GPV), y 3q21 (GPIX). La expresin del receptor en la membrana plaquetaria, de unas 25.000 copias por plaqueta, est sujeta a un estricto control fisiolgico. As, la expresin de Ib, Ib, y IX es conjunta, mientras que la GPV puede expresarse individualmente pero en menor proporcin que cuando estn presentes el resto de las cadenas. Una descripcin detallada de las caractersticas estructurales y funcionales de este complejo est fuera del objetivo de este captulo. El complejo Ib-IX-V cumple dos funciones esenciales para la adecuada participacin de las plaquetas en la hemostasia. La primera es facilitar la adhesin inicial de las plaquetas a las zonas de lesin vascular actuando como el receptor principal del FVW unido al colgeno
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expuesto en el subendotelio. La segunda es actuar como receptor de alta afinidad para la trombina, potente agonista plaquetario, facilitando la activacin local de las plaquetas ante bajas concentraciones de este agonista. La importancia de estas funciones se refleja claramente en los dos tipos de trastornos hemorrgicos asociados a deficiencias hereditarias de este complejo, el sndrome de Bernard-Soulier (SBS), y la enfermedad de seudo-von Willebrand. a1) Sndrome de Bernard-Soulier (SBS) Este sndrome, identificado por primera vez por Bernard y Soulier en 1948, es una ditesis hemorrgica congnita caracterizada por la presencia de trombocitopenia, macroplaquetas, tiempo de sangra prolongado, y retraccin del cogulo normal. Patogenia. La mayor alteracin funcional de las plaquetas SBS es su nula o escasa capacidad de adhesin al subendotelio vascular, por la ausencia o disfuncin del complejo Ib-IX-V. La deficiencia de este receptor condiciona otras caractersticas fenotpicas de las plaquetas SBS: su incapacidad para aglutinar normalmente en presencia de FVW normal e inductores como la ristocetina o la botrocetina, y una reactividad disminuida frente a bajas dosis de trombina, que es indicativa del papel que juega el complejo Ib-IX-V como receptor plaquetario para este agonista. Por otra parte, la actividad coagulante de las plaquetas SBS puede ser normal, pero tambin puede encontrarse aumentada o disminuida. Las alteraciones de la capacidad procoagulante pueden estar relacionadas con el hallazgo de una organizacin anormal de los fosfolpidos de la membrana de las plaquetas SBS. La transmisin gentica del SBS es habitualmente autosmica recesiva, y con frecuencia existe consanguinidad entre los individuos afectados. Considerando el nmero de casos identificados en distintos pases del mundo, se estima que la prevalencia del SBS es aproximadamente de 1 caso por cada milln de personas. Generalmente, slo los sujetos homocigotos manifiestan signos de la enfermedad, mientras que los heterocigotos son asintomticos. Desde el punto de vista molecular, el SBS es una patologa muy heterognea, que puede ser causada por distintas deleciones, inserciones, y mutaciones puntuales en los genes que
codifican las protenas que integran el complejo. Hasta la fecha, todas las alteraciones moleculares en pacientes con SBS han sido localizadas en los genes de las GPIb, Ib, y IX, y ninguna en la GPV. Curiosamente, casi la mitad de estas alteraciones genticas afectan a las regiones ricas en leucina o las secuencias que las flanquean, enfatizando la importancia de estas regiones para la expresin y funcionalidad del receptor Ib-IX-V. La tabla 21-8 resume las principales alteraciones genticas identificadas hasta ahora en sujetos con SBS. Existen bases de datos accesibles por Internet donde obtener informacin actualizada sobre las alteraciones moleculares en el SBS (http://www.bernardsoulier.org/). Es importante resaltar que la identificacin de estas alteraciones moleculares, y su reproduccin en modelos celulares experimentales contribuye enormemente a comprender mejor la fisiopatologa del SBS, los mecanismos que regulan la biosntesis y expresin del complejo Ib-IX-V, y la interrelacin entre la estructura del complejo y su funcin. Clnica. La sintomatologa caracterstica del SBS se centra en episodios de hemorragia, fundamentalmente de localizacin cutneomucosa, que se presentan desde la infancia. Los ms comunes son epistaxis (70%), equimosis espontneas (58%), metrorragias (44%), gingivorragias (42%), y sangrados gastrointestinales (22%). La intensidad de estos procesos de sangrado es variable, pudiendo aumentar o disminuir con la edad. El riesgo de sangrado frente a ciruga, extracciones dentarias, o traumticos es muy alto. Laboratorio. El diagnstico de laboratorio del SBS se establece con un tiempo de sangra prolongado, trombocitopenia moderada a severa, y la presencia de macroplaquetas, algunas incluso del tamao de los linfocitos. La clave del diagnstico del SBS es la deficiente aglutinacin plaquetaria inducida con agentes como el antibitico ristocetina o el veneno botrocetina, proceso que requiere una adecuada interaccin entre el FVW y el complejo GPIbIX-V. Por el contrario, la agregacin plaquetaria inducida por otros agentes (ADP, adrenalina o colgeno) es normal o mnimamente alterada. El anlisis de la expresin de GPs de membrana (mediante ensayos de unin con anticuerpos especficos mar cados radiactivamente, citometra de flujo, tcnicas electroforticas, u otros mtodos) lleva a confirmar la disminucin o ausencia de los elementos constituyentes del complejo Ib-IX-V.
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Tabla 21-8. Alteraciones moleculares identificadas en pacientes con Sndrome de Bernard-Soulier o Enfermedad de seudo-von Willebrand
Genotipo Homocigosis Heterocigosis Transm. dominante Doble heterocigosis Homocigosis Homocigosis Doble heterocigosis Homocigosis Doble heterocigosis GPIb Doble heterocigosis Homocigosis Homocigosis Doble heterocigosis Mutacin 103Adel 259C T T283 C T317 del 476T C C557 T Fenotipo Delecin Mutacin puntual Mutacin puntual Delecin Mutacin puntual Mutacin puntual Alteracin proteica Lys19 Arg codn 21 codn stop Leu57 Phe GPIb muy sensible a proteasas Cys65 Arg Protena que no liga FVW Leu76 Arg Codn 125 stop Leu129 Pro129 Unin deficiente de FVW Ala156 Val Variante Bolzano, unin anormal de FVW, normal de trombina Glu181 Lys Protena no funcional Leu179 del Variante Nancy I, prdida de funcin. Cys209 Ser209 GPIb no se une a GPIb Met239 Val Mayor afinidad por FVW Enfermedad seudo-von Willebrand Thr294 stop Trp343 stop Cambio de fase, terminacin prematura Ser444 stop Cambio de fase, Terminacin prematura Cambio de fase en Tyr492, terminacin prematura, sntesis de porcin citoslica de GPIb Trp498 stop Cambio del sitio de unin de GAA en el promotor Trp21 stop Terminacin prematura Delecin de un alelo Tyr88 Cys, GPIb no asociada a GPIb Ala108 Pro GPIb no asociada a GPIb Cys8 Arg Asp21 Gly Asn45 Ser Phe55 Cys73 Cys97 Trp126 ser Tyr Tyr stop
A595-A630 del C625-C627 del 715T A 805A G
Delecin mltiple Delecin Mutacin puntual Mutacin puntual
Homocigosis Doble heterocigosis Doble heterocigosis Homocigosis Homocigosis Doble heterocigosis Homocigosis Doble heterocigosis Homocigosis Doble heterocigosis Homocigosis Doble heterocigosis GPIb Doble heterocigosis Doble heterocigosis
T972-G975 del G1119 A T1418 ins C1421 A A1438 del A1565-T1566 del
Delecin Mutacin sin sentido Insercin Mutacin sin sentido Delecin Delecin
G1584 A C133 G G159 A C336 del A360 G G419 C
Mutacin sin sentido Mutacin puntual Mutacin puntual Delecin Mutacin puntual Mutacin puntual
GPIX
Homocigosis Doble heterocigosis Homocigosis Heterocigosis Homocigosis Homocigosis Homocigosis Homocigosis
T37 G A77 G A143 G T179 G233 G305 G393 C A A A
Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin sin sentido
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Pruebas complementarias para el diagnstico de laboratorio del SBS son una menor interaccin ex vivo de las plaquetas con superficies recubiertas de FVW, o la ausencia de agregacin plaquetaria ante la exposicin a altas velocidades de turbulencia (alto shear rate). Tratamiento. La teraputica de los pacientes SBS se fundamenta en primer lugar en medidas educativas de conducta, a fin de evitar situaciones de riesgo traumtico. As, la higiene dental y la vigilancia odontolgica para evitar intervenciones dentales, son recomendaciones primarias. La anemia, generalmente leve a moderada, puede tratarse con aporte farmacolgico de hierro. El uso de frmacos antifibrinolticos o de desmopresina (DDAVP) puede ser til en algunos individuos SBS, pero no hay certeza de su eficacia generalizada en todos los pacientes. Recientemente tambin se ha sugerido la utilidad potencial de la infusin de factor VIIa para detener el sangrado nasal en enfermos SBS, aunque este tratamiento es an experimental. La transfusin de concentrados plaquetarios es hoy da la terapia estndar para prevenir o tratar las hemorragias, a pesar del riesgo implcito de isoinmunizacin y transmisin de enfermedades. Por ltimo, en mujeres se ha sugerido que los anticonceptivos orales pueden ser beneficiosos para el control de las menorragias. a2) Sndrome de seudo-von Willebrand La enfermedad de seudo-von Willebrand, o enfermedad de von Willebrand plaquetaria, tiene una gran similitud fenotpica con la enfermedad de von Willebrand tipo IIB, pero su diferencia radica en que la causa del seudovon Willebrand no es un defecto hereditario en la sntesis y/o funcin del FVW, sino en la expresin en la superficie de las plaquetas de un complejo Ib-IX-V con una extraordinaria capacidad de unin al FVW plasmtico. Se manifiesta por una hiperagregabilidad plaquetaria a dosis bajas de ristocetina o botr ocetina, (tambin presente en la enfermedad de von Willebrand tipo IIB). Esta hiperreactividad conduce a la agregacin plaquetaria espontnea y aclaramiento de las plaquetas y del FVW del plasma. Consecuencia de ello, es una trombocitopenia habitualmente leve, un tiempo de sangra moderadamente prolongado, y niveles disminuidos de FVW con una desproporcionada reduccin de las formas de alto peso molecular. Asimismo, las plaquetas de pacientes con seudo-von Willebrand
muestran una pobre capacidad de adhesin a superficies subendoteliales bajo condiciones de circulacin a alta velocidad de turbulencia. Recientemente, se han identificado dos mutaciones puntuales en varias familias afectadas de seudo-von Willebrand. Estas mutaciones se localizan en el dominio funcional aminoterminal del gen que codifica la GPIb. Son los cambios Gly/Val en el aminocido 233, y Met/Val en residuo 239. El hecho de que estos residuos se localizan en el bucle de la Ib que separa la regin de dominios ricos en leucina de la secuencia de tirosinas sulfatadas implicada en la unin del FVW, hace pensar que tales residuos son cruciales para la adecuada orientacin espacial del dominio funcional de la GPIb. De hecho, estudios de modelado molecular sugieren que la sustitucin Met239Val produce un cambio conformacional relevante en la GPIb. Los pacientes con seudo-von Willebrand manifiestan sangrado mucocutneo leve a moderado. Su manejo teraputico en lo referente a las medidas educativas genricas es similar al usado en pacientes con SBS. En funcin de la intensidad hemorrgica, y de la severidad de la trombocitopenia, se ha de considerar como opcin la transfusin de plaquetas. En la pr evencin y resolucin de eventos hemorrgicos, se ha de tener presente que el uso de agentes que aumenten la concentracin plasmtica de FVW (por ejemplo con concentrados comerciales de FVIII/FVW, o la administracin de desmopresina) tiene el riesgo potencial de agravar la trombocitopenia, por la mayor velocidad de aclaramiento de las plaquetas con FVW unido. En algunos pacientes se ha usado con xito la infusin de dosis bajas de crioprecipitado, sin causar trombocitopenia. b) Patologa de los receptores plaquetarios del colgeno: complejo glicoproteico Ia-IIa, GPVI, GPIV. El colgeno subendotelial tambin es importante en el pr oceso de adhesin plaquetaria, especialmente en sitios con flujos sanguneos de baja velocidad de turbulencia (low shear rate). El colgeno no slo favorece la adhesin inicial de las plaquetas a esta estructura, sino tambin es un importante agonista que potencia y contribuye a la subsiguiente activacin y agregacin de las plaquetas, favoreciendo la formacin del trombo hemosttico. En la actualidad, las glicoprotenas plaquetarias reconocidas como
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los principales receptores del colgeno del subendotelio son el complejo GPIa-IIa, y la GPVI. No obstante, se ha sugerido que otras protenas como el complejo GPIb-IX-V o la GPIV puedan participar, directa o indirectamente, en esta funcin. b1) Patologa del complejo GPIa-IIA El receptor GPIa-IIa es un heterodmero formado por la asociacin no covalente de las integrinas adhesivas Ia (2) y IIa (1). Este complejo se corresponde con el heterodmero VLA-2 de los linfocitos. Los genes que codifican estas GPs han sido secuenciados y, como los de otros receptores plaquetarios (Ib-IX-V o GPIIb-IIIa), son genes altamente polimrficos. La deficiencia de GPIa-IIa se asocia a hemorragias mucocutneas de moderada intensidad. Un polimorfismo silente 807C/T en el gen de la GPIa, ligado al sistema antignico HPA 5a/b, parece determinar por un mecanismo no aclarado el grado de expresin del complejo Ia-IIa en la superficie plaquetaria. Varios estudios han analizado el papel de este polimorfismo en la incidencia de enfermedad cardiovascular obteniendo resultados no concluyentes. Tambin se ha descrito la aparente influencia del polimorfismo en la susceptibilidad al sangrado de pacientes con bajos niveles de FVW plasmtico o plaquetario, y en la variable adhesin plaquetaria al colgeno que muestran individuos sanos. Como otras integrinas, el complejo GPIa-IIa parece experimentar una transfor macin conformacional para aumentar la interaccin con su ligando. As en recientes estudios usando fragmentos solubles de colgeno se ha mostrado que la unin de colgeno a GPIa-IIa aumenta tras la activacin de las plaquetas por distintos agonistas. El mecanismo subyacente al cambio conformacional que sufre la GPIa-IIa tras la activacin de las plaquetas es an oscuro, pero parece implicar a otros receptores como GPVI, el otro receptor del colgeno, o los receptores de ADP. Asimismo, parece que los dominios intracitoplasmticos ricos en cistena de la cadena IIa tienen un papel principal en la activacin conformacional de este receptor de colgeno. Se han descrito dos casos de trastornos hemorrgicos asociados a deficiencia de GPIaIIa en mujeres en las que curiosamente se observ la recuperacin de la reactividad plaquetaria al colgeno al alcanzar la menopausia, lo que sugiere cierta dependencia
hormonal de la expresin de este receptor. El hecho de que se haya demostrado una amplia variabilidad de expresin de GPIa-IIa en sujetos normales en asociacin con el polimorfismo silente 807 C/T, cuestiona si los casos descritos como deficiencias congnitas de este receptor lo son realmente o representan los extremos de menor expresin dentro de la normalidad. b2) Patologa de la GPVI La GPVI es la otra glicoprotena con una funcin claramente demostrada de receptor plaquetario para el colgeno. GPVI es una protena transmembrana perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas, cuya estructura recuerda a la de la GPIb al poseer los dominios globulares de unin al ligando el extremo amino terminal, bien separados de la superficie plaquetaria por un fragmento mucnico muy glicosilado y rico en serina y treonina que asemeja al macroglicopptido de GPIb. La GPVI se asocia en su porcin transmembrana con la cadena gamma del receptor Fc, formando un complejo funcional que per mite la transmisin de seales de activacin por colgeno de for ma bidireccional. En esa transmisin de seales juega tambin un papel relevante la interaccin de la porcin citoslica de GPVI con las fosforilasas de la familia src como Fyn y Lyn. Este mecanismo de transmisin va GPVI/Fc se asemeja al usado por los receptores inmunes, particular mente los receptores de clulas T. Se han identificado ciertos agonistas como CRP (collagen related peptide) o la toxina convulxina, que parecen transmitir seales de activacin de forma especfica a travs de GPVI. La estructura genmica de GPVI consta de ocho exones que codifican una protena de 339 aminocidos, 62 kDa tras la glicosilacin, restringida a los megacariocitos y las plaquetas. Adems de los dos receptores mencionados arriba, distintas evidencias sugieren que otras protenas pueden tambin tener algn papel en la interaccin de las plaquetas con el colgeno. Tal es el caso del complejo GPIb-IX-V que, sobre todo bajo condiciones de flujo de alta velocidad de turbulencia, parece mediar en la unin de las plaquetas a las fibras de colgeno usando al FVW como protena puente. As se ha visto que ciertos anticuerpos contra GPIb inhiben la activacin por colgeno. Asimismo, recientes estudios sugieren que la GPV tendra un papel importante en este proceso, ya que las plaquetas de ratones deficientes en GPV muestran una reactividad disminuida a
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colgeno. En la poblacin japonesa se ha identificado los nicos casos de pacientes con trastornos hemorrgicos moderados con afectacin del receptor GPVI. Uno de ellos se describe como un trastorno hemorrgico adquirido debido a la presencia de autoanticuerpos contra esta protena. En los otros tres casos, la deficiente adhesin y agregacin plaquetaria a colgeno parece causada por la ausencia congnita, menos del 10%, de GPVI en las plaquetas. Hasta la fecha no se han identificado las alteraciones moleculares subyacentes en los casos descritos de deficiencias de la GPVI. b3) Patologa de la GPIV. La GPIV, tambin llamada GPIII o CD36 (88 kDa), es una protena plaquetaria implicada en la unin a la trombospondina y en la interaccin de las plaquetas con los monocitos. Existe controversia acerca de si esta protena acta tambin como receptor de colgeno. Los primeros estudios in vitro sugirieron su participacin en la adhesin de las plaquetas a superficies recubiertas de colgeno, y en la transmisin de seales de activacin por este agonista. Sin embargo, la prevalencia de individuos con niveles bajos de CD36 es alta, aproximadamente el 3% en las poblaciones japonesa y africana, y un 0.3% de los caucsicos, y estos sujetos agregan normalmente a colgeno y no manifiestan episodios de sangrado. Por ltimo, se ha sugerido la participacin en la interaccin colgeno-plaqueta de otras protenas como CD31, y la potencial existencia de receptores especficos para los subtipos de colgenos I y III. Globalmente, la informacin actualmente disponible pone de manifiesto que distintas pr otenas actan sinrgicamente en la interaccin plaqueta-colgeno. Las principales son GPIa-IIa y GPVI que funcionan coordinadamente bajo un modelo de dos etapas-dos sitios. Segn este modelo, las plaquetas se adhieren inicialmente al colgeno a travs de GPIa-IIa, y/o indirectamente a travs de FVW-GPIb-IX-V. Esta interaccin ocasiona la transmisin de seales de activacin que pr ovoca un cambio confor macional del complejo GPIa-IIa para alcanzar su estado de alta afinidad por el colgeno, y un enlentecimiento de la plaqueta que se desplaza sobre el subendotelio expuesto. La GPVI, receptor de menor afinidad para el colgeno, no slo consolida la unin al colgeno, sino que
tambin transmite seales de activacin que propician la activacin plaquetaria generalizada, la secrecin y la agregacin. La importancia fisiolgica y la transcendencia clnica de los receptores de colgeno han sido puestas de manifiesto no slo por los avances derivados de estudios in vitro, sino tambin por la identificacin de unos pocos pacientes con trastornos hemorrgicos asociados con niveles reducidos de estos receptores, o con la existencia de anticuerpos contra ellos. El primer caso se identific en la dcada de los ochenta, y hasta la fecha solo se han descrito no ms de 10 sujetos con aparente alteracin de los receptores de colgeno, GPIa-IIa o GPVI. Esto repr esenta una incidencia muy baja en comparacin con la de otras deficiencias de receptores adhesivos plaquetarios como GPIbIX-V (SBS) o GPIIb-IIIa (Tromboastenia de Glanzmann). Muy pr obablemente, la redundancia de receptores para el colgeno es la razn subyacente tanto a la escasez de pacientes identificados con deficiencia especfica de la adhesividad y reactividad plaquetaria al colgeno, como del hecho de que los pacientes descritos con dficit singular de Ia-IIa o de CD36 muestren un fenotipo de sangrado moderado o nulo, que no requiere en general tratamiento alguno. La escasez de pacientes con patologa en estos receptores del colgeno, GPs Ia-IIa o VI, los que adems presentan un fenotipo de sangrado muy moderado, no debe interpretarse como una evidencia de una participacin poco relevante en la funcin hemosttica de las plaquetas, al igual que la ausencia de sangrado espontneo tras tratamiento con aspirina o clopidogrel no es argumento contra el establecido potencial antitrombtico de estos frmacos. Sin duda, el desarrollo de modelos animales con deficiencias combinadas de los distintos receptores de colgeno ayudar a clarificar su funcin. Asimismo, nuevos estudios clnico epidemiolgicos permitirn clarificar su papel como factor de riesgo tr ombtico o hemorrgico, al menos bajo determinadas condiciones fenotpicas, y su posible valor como blanco de nuevos frmacos antitrombticos. 3.1.2. Defectos hereditarios de la agregacin plaquetaria: Tromboastenia de Glanzmann Para una hemostasia eficaz, las plaquetas inicialmente adheridas a la zona de la lesin tienen que activarse y unirse a las plaquetas vecinas formando agregados de creciente
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tamao hasta la formacin, con la incorporacin de una red de fibrina, del trombo estable que sella la fisura. Este proceso de agregacin est mediado principalmente por la formacin de puentes de fibringeno entre complejos IIb-IIIa de plaquetas vecinas. El complejo IIb-IIIa es un heterodmero dependiente de la presencia de calcio formado por las integrinas IIb (136 kDa) y IIIa (110 kDa), asociadas de forma no covalente. Este receptor es el ms abundante en las plaquetas, 50.000 copias en la superficie de las plaquetas no activadas y una cantidad similar en el interior (sistema canalicular y grnulos alfa). Los genes de GPIIb (17 Kb, 30 exones) y de GPIIIa (46 Kb, 15 exones) estn localizados en la regin q2123 del cromosoma 17, y muy prximos entre s lo que explica su expresin coordinada durante la megacariocitopoyesis. El complejo IIb-IIIa acta como el principal receptor plaquetario del fibringeno, aunque tambin es capaz de unirse a otras protenas adhesivas como el FVW, la fibronectina, o la vitronectina. La unin a estos ltimos ligandos se pr oduce a nivel de una secuencia caracterstica Arg-Gly-Asp (RGD). Estos sitios de unin RGD son crpticos en circunstancias normales, pero resultan expuestos durante el pr oceso de la activacin plaquetaria. Actualmente se conoce muy bien que la unin de fibringeno al complejo IIb-IIIa inicia el trfico de seales de activacin primero desde fuera hacia dentro de la plaqueta, y luego desde dentro hacia fuera, procesos que favorecen y potencian la activacin y la agregacin con otras plaquetas. En ese proceso bidireccional de transmisin de seales participan numerosas pr otenas especializadas. Las anomalas congnitas del complejo IIb-IIIa son responsables del trastor no hemorrgico identificado por Glanzmann en 1918, y conocido en su honor como Tromboastenia de Glanzmann (TG). Patogenia. La patologa molecular del complejo IIb-IIIa que da lugar a la TG ha sido caracterizada en ms de 60 pacientes de distintos lugares de mundo, y puede consultarse de for ma actualizada en una base de datos de acceso libre en internet (Glanzmann Thromboastenia Database WWW URL http://med.mssm.edu/ glanzmanndb). Las tablas 21-9 y 21-10 resumen la patologa molecular (deleciones, inserciones, inversiones, y mutaciones puntuales con y sin sentido) de los genes de las GP IIb y IIIa identificadas hasta ahora en pacientes con TG.
Conviene destacar que las alteraciones moleculares responsables de los distintos tipos de TG, son modelos idneos para el estudio profundo de la biosntesis del complejo IIb-IIIa, la dependencia estructural de su funcionalidad, y los mecanismos reguladores de la interaccin plaqueta-plaqueta. Por otra parte, la identificacin precisa de las alteraciones subyacentes en los pacientes con TG abre la puerta a la posibilidad en un futuro de tratamiento y curacin de estos enfermos mediante una terapia gnica adecuada. La TG es una enfermedad heterognea, a semejanza del SBS. Histricamente se han definido dos tipos de TG. El tipo I se caracteriza por la ausencia total (<5%) de GPIIb-IIIa en la membrana plaquetaria, la carencia de fibringeno acumulado en los grnulos plaquetarios, y la falta de retraccin del cogulo. Por el contrario, en la TG tipo II las plaquetas tienen un 10-20% de GPIIb-IIIa residual, cierta cantidad de fibringeno granular (30-60% del contenido normal), y ocurre la retraccin del cogulo aunque est disminuida. Esta clasificacin de la TG es til para describir a los pacientes tromboastnicos clsicos, y tratar de asociar su sintomatologa con las alteraciones moleculares subyacentes, pero no implica la existencia de categoras distintas de la enfermedad. Adems, en la ltima dcada se han identificado sujetos con fenotipo de TG, pero con un nivel de expresin de GPIIb-IIIa normal o casi normal. stas seran variantes de la TG, en las que la deficiencia de GPIIb-IIIa es cualitativa y no cuantitativa. La TG se transmite, al igual que el SBS, de manera autosmica recesiva. Su prevalencia en la poblacin general es 1-2 casos por milln de habitantes, pero es mucho ms frecuente en comunidades con alto grado de consanguinidad. En general, la enfermedad se manifiesta con relevancia clnica exclusivamente en sujetos homocigotos, mientras que los sujetos heterocigotos son asintomticos, incluso cuando tienen slo el 50% de molculas de complejo IIb-IIIa. Laboratorio. Los principales hallazgos de laboratorio en los pacientes con TG son un tiempo de hemorragia prolongado, un recuento y morfologa plaquetaria normales, ausencia o disminucin de la retraccin del cogulo, y ausencia de agregacin en respuesta a mltiples agonistas plaquetarios (ADP, colgeno, cido araquidnico y trombina). La aglutinacin con ristocetina es normal en su primera fase, pero
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Tabla 21-9. Pacientes con Tromboastemia de Glanzmann y mutaciones en GPIIb

Genotipo Heterocigoto Doble Homocigoto Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Homocigoto Homocigoto Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Homocigoto Homocigoto Homocigoto Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Homocigoto Heterocigoto Doble Homocigoto Heterocigoto Doble Exon 30 4 18 29 4 17 17 4 16 14 29 12 8 17 17 5 15 20 25 4 28 11 12 23 23 12 5 1 13 6 13 29 30 17 18 23 23 4 12 28 17 26 26 5 21 2 12 18 Mutacin 3077G A IVS3(-3)-418del 1787T C IVS29(+2)T C 480C G 1750C T 1750C T 527C T IVS15(-1)del 1413C G 3015insG 1063G A 818G A 1750C T 1750C T 620C T IVS15(+1)G A IVS19(-2)A G 2473-2478del/ins 526C G 2929C T 959T C Desconocido 1063G A Desconocido 2333A C Desconocido 2333A C Desconocido 1073G A 575-580ins IVS1-9del4.5kb 1346G A 641T C 1366-1371del IVS29(+2)T C 3094TGins 1750C T IVS17(-1)G A 2333A C 2333A C 526C T 1073G A 2941C T 1750C T IVS25(-3)C G 2609C A IVS5(+2)C A 2113T C 288delC 1063G A 1787T C Fenotipo Mutacin puntual Alteracin proteica Arg1026Gln(Arg995Gln) Sin transcripcin Ala(106)-Gln(111)del Ile596Thr(I565Thr) Val(951)-Lys(989)del Ser(129)-Ser(161)del Arg584X(Arg553X) Arg584X(Arg553X)
Delecin en lectura Mutacin puntual Delecin en lectura Delecin en lectura Mutacin sin sentido Mutacin sin sentido Desconocido Mutacin puntual Pro176Leu(Pro145Leu) Desconocido Mutacin sin sentido Tyr471X(Tyr440X) Insercin fuera de lectura Cambio de fase de lectura Mutacin puntual Glu355Lys(Glu324Lys) Mutacin puntual Gly273Asp(Gly242Asp) Mutacin sin sentido Arg584X(Arg553X) Desconocido Mutacin sin sentido Arg584X(Arg553X) Desconocido Mutacin puntual Thr207Ile(Thr176Ile) Delecin fuera de lectura Terminacin prematura Delecin fuera de lectura Terminacin prematura Delecin/Insercin, en lectura Leu(786)-(795)del ins Mutacin puntual Pro176Ala(Pro145Ala) Mutacin sin sentido Arg977X(Arg946X) Mutacin puntual Phe320Ser(Phe289S) Sin transcripcin Mutacin puntual Glu355Lys(Glu324Lys) Sin transcripcin Mutacin puntual Gln778Pro(Gln747Pro) Sin transcripcin Mutacin puntual Gln778Pro(Gln747Pro) Sin transcripcin Mutacin puntual Arg358His(Arg327His) Insercin en lectura Arg192Thr193 (Arg161Thr162) Delecin fuera de lectura Terminacin prematura Mutacin puntual Gly449Asp(Gly418Asp) Mutacin puntual Leu214Pro(Leu183Pro) Delecin en lectura Val(425)Asp(426)del Desconocido Delecin en lectura Val(951)-Lys(989)del Insercin fuera de lectura Cambio de fase de lectura Mutacin sin sentido Arg584X(Arg553X) Desconocido Delecin en lectura Asp(585)-Gln(626)del Mutacin puntual Gln778Pro(Gln 747Pro) Mutacin puntual Gln 778Pro(Gln 747Pro) Mutacin puntual Pro176Ala(Pro145Ala) Mutacin puntual ARG358H(ARG327H) Mutacin sin sentido Gln (950X) Pro(917-950)del Desconocido Mutacin sin sentido Arg584X(Arg553X) Delecin en lectura Val868-Val909del Mutacin sin sentido Ser901X(S870X) Insercin fuera de lectura Terminacin prematura Mutacin puntual Cys705Arg(Cys674Arg) Delecin fuera de lectura Terminacin prematura Mutacin puntual Glu355Lys(Glu324Lys) Mutacin puntual Ile596Thr(Ile565Thr)
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Tabla 21-10. Pacientes con Tromboastenia de Glanzmann y mutaciones en GPIIIa

Genotipo Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Heterocigoto Doble Exon 2 4 9 5 4 9 5 3 1 5 Heterocigoto Doble Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Heterocigoto Doble Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Heterocigoto Doble Heterocigoto Doble Homocigoto Homocigoto Homocigoto Homocigoto Heterocigoto Doble 6 11 8 11 13 9 6 6 4 11 4 6 15 11 15 9 5 12 5 6 11 Mutacin IVS2(+1)G T 563C T IVS9ins3-4kb 718C T 433G T 1199G A 719G A 262C T IVS1-5Aluinv15kb + IVS1del11kb IVS5(+1)G A 917A C 1757G T 1053-1058del 1702T C 2031-2041del IVS9Alu-2163 o 2166del11.2kb 847delGC 863T C 428T G 1758 T C 433G A 917A C 2332T C Desconocido 1791delT 2248C T 1260G-A+1143C A 725G 1924G 718C 917A 1813G A T T C A Fenotipo Delecin fuera de lectura Mutacin puntual Insercin fuera de lectura Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin sin sentido Inversin/Delecin Delecin/Insercin fuera de lectura Mutacin puntual Mutacin puntual Delecin/Insercin, en lectura Mutacin puntual Delecin fuera de lectura Delecin fuera de lectura Delecin fuera de lectura Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Desconocido Delecin fuera de lectura Mutacin sin sentido Delecin/Insercin, en lectura Mutacin puntual Mutacin sin sentido Mutacin puntual Mutacin puntual Mutacin puntual Alteracin proteica Terminacin prematura Ser188Leu(Ser162Leu) Sin transcripcin Arg240WTrp(Arg214Trp) Asp145Tyr(Asp119Tyr) Cys400Tyr(Cys374Tyr) Arg240Gln(Arg214 Gln) Arg88X(Arg62X) Sin transcripcin Terminacin prematura His306Pro(His280Pro) Cys586Phe(Cys560Phe) 351-353del Met351ins Cys568Arg(Cys542Arg) Terminacin prematura Terminacin prematura Terminacin prematura Leu288Pro(Leu262Pro) Leu143Trp(Leu117Trp) Cys586Arg (Cys560Arg) Asp145Asn(Asp119Asn) Hys306Pro(Hys280Pro) Ser778Pro(Ser752Pro) Sin transcripcin Arg750X(Arg724X) Lys(350)Ser(396)del/Val(350)Ser(351)ins Arg242Gln(Arg216Gln) Gln642X(Gln616X) Arg240Trp(Arg214Trp) Hys306Pro(Hys280Pro) Gly605Ser(Gly579Ser)
la segunda onda puede estar disminuida si se usan dosis bajas, u ocurrir en ciclos reversibles si se usan dosis muy altas. A diferencia del SBS, las plaquetas tr omboastnicas se unen normalmente a fibras de colgeno, y al tejido subendotelial expuesto, aunque la agregacin subsiguiente est severamente reducida al no producirse el adecuado proceso de activacin mediado por el complejo IIb-IIIa. La actividad procoagulante de estas plaquetas se describi como reducida en los primeros estudios, pero posteriormente se ha mostrado como normal en distintos pacientes. Asimismo, en algunos pacientes se ha descrito un defecto en la formacin de micropartculas y en la generacin de trombina. Por ltimo, el nivel de expresin de GPIIb-IIIa, que puede cuantificarse por numerosas tcnicas, oscila entre menos del 5%
en las formas clsicas hasta ms del 50% en las variantes. Clnica. La naturaleza del sangrado en la TG incluye casi siempre prpura, menorragia especialmente en la menarquia, epistaxis y sangrado gingival. Con menor frecuencia se pr oduce tambin hematuria y sangrado gastrointestinal, y son raros los casos de hemartrosis o hematomas en vsceras. El sangrado por traumas o quirrgico puede ser sever o, frecuente por ejemplo en las extracciones dentales sin previa profilaxis. El embarazo y sobre todo el parto y el puerperio, son tambin situaciones de alto riesgo hemorrgico para estos pacientes. La severidad de las hemorragias en la TG es impredecible, pues vara considerablemente entre los
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pacientes, incluso entre familiares directos, y tiende a disminuir con la edad. No obstante se puede clasificar la TG como una enfermedad hemorrgica severa, pues la mayora de los pacientes afectados que sangran requieren soporte transfusional. Tratamiento. El manejo clnico de los enfermos con TG guarda semejanza con el de pacientes SBS, y debe incluir en primer lugar medidas educativas de comportamiento genrico (higiene bucal, revisin mdica rutinaria, etc.). Se debe proveer soporte transfusional previo a la realizacin de procedimientos invasivos, incluso en pacientes sin historia previa de sangrado severo. La alta probabilidad de recibir transfusiones tambin hace recomendable la administracin precoz de vacunas contra la hepatitis. Asimismo, se recomienda el uso de productos filtrados para disminuir el riesgo de aloinmunizacin y transmisin de CMV, y si es posible de plaquetas HLA compatibles. Adems del riesgo de inmunizacin HLA, similar a la de otros sujetos, en los pacientes con TG existe el riesgo adicional de isoinmunizacin y generacin de anticuerpos contra el complejo IIb-IIIa, que hagan ineficaces las plaquetas transfundidas. Ante un cuadro hemorrgico agudo en un paciente TG con un alto ttulo de anticuerpo anti-GPIIb-IIIa, puede plantearse la conveniencia de realizar un recambio plasmtico. En algunos enfer mos el uso de agentes antifibrinolticos, cidos e-aminocaproico o tranexmico, puede ser til para la profilaxis del sangrado en situaciones como las extracciones dentarias, pero su eficacia generalizada no est demostrada. Igualmente se ha sugerido la utilidad de agentes tpicos (celulosa empapada en cido tranexmico, tr ombina local, microfibras de colgeno) para el control del sangrado mucoso activo en la TG. Recientemente, se han tratado algunos pacientes tromboastnicos con rFVIIa, con resultados hemostticos favorables. No obstante, y de forma similar al SBS, este tratamiento es todava experimental, y se ha descrito un caso de tromboembolismo asociado a la teraputica con este frmaco. Por ltimo, dos pacientes con TG han sido sometidos a trasplante de mdula sea con resultados satisfactorios. Combinado con la terapia de transfer encia gnica, el trasplante de progenitores hematopoyticos podra ser una opcin interesante para los pacientes con las formas ms graves de TG en un futuro prximo.
3.1.3. Defectos congnitos de la secrecin plaquetaria: Anormalidades granulares. Tras la adhesin al subendotelio, las plaquetas sufren un cambio estructural y morfolgico, desarrollando pseudpodos, e inician una reaccin de liberacin por la cual los productos contenidos en los grnulos a (factor 4 plaquetario, -tromboglobulina, trombospondina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, fibringeno, FVW) y de los grnulos (ADP, ATP, calcio, serotonina) son liberados al exterior. La exteriorizacin del contenido de los grnulos tiene lugar a travs de una reaccin de exocitosis, por la que las membranas de los organelos se fusionan con los del sistema canalicular abierto tras el aumento en la concentracin de calcio citoplasmtico. El proceso de liberacin amplifica la activacin, que como consecuencia conlleva la agregacin plaquetaria. Las alteraciones congnitas en el almacenamiento plaquetario comprenden un grupo heterogneo de trastornos en que puede existir una deficiencia de grnulos o de su contenido. Bsicamente, se clasifican como defectos los que afectan a los grnulos densos (deficiencia de almacenamiento de grnulos ), a los grnulos (deficiencia de almacenamiento de grnulos o sndrome de las plaquetas grises), o tanto a grnulos densos como (deficiencia de grnulos y ). En conjunto, estas alteraciones cursan con una ditesis hemorrgica moderada, que se caracteriza por tendencia al sangrado mucocutneo espontneo, tras intervenciones quirrgicas o en el postparto. El tiempo de sangra por lo general est aumentado, y sobre todo, se incrementa de forma marcada tras la ingesta de aspirina. Generalmente se observa ausencia de la segunda onda de agregacin tras activacin con ADP o epinefrina, y una disminucin de la agregacin al colgeno o trombina. a) Sndrome de las plaquetas grises El sndrome de plaquetas grises se caracteriza por una ausencia de grnulos a reconocibles morfolgicamente en las plaquetas y en los megacariocitos de los individuos afectos, mientras que los grnulos y lisosomas estn presentes en cantidades normales. Como consecuencia, las plaquetas muestran una deficiencia severa, aunque no una ausencia completa de protenas sintetizadas en el megacariocito y contenidas en los grnulos . Sin embargo, la glicoprotena plaquetaria caracterstica de la membrana de este tipo de
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grnulos, la selectina P (GMP-140), s est presente y se exter naliza en cantidades nor males tras activacin con trombina, indicativo de que en realidad, estas plaquetas s contienen las membranas de dichos grnulos. El defecto en este sndrome parece residir en la incapacidad para el almacenamiento en los grnulos de las pr otenas endgenas sintetizadas por megacariocitos. As, la liberacin al estroma medular del factor de crecimiento derivado de plaquetas puede explicar la fibrosis medular observada en estos casos, y este defecto en el almacenamiento tambin puede ser responsable de concentraciones plasmticas elevadas de factor 4 plaquetario y de -tromboglobulina. Clnicamente se caracteriza por manifestaciones mucocutneas hemorrgicas moderadas, y fundamentalmente con sangrado postquirrgico o postraumtico, aunque tambin puede ser asintomtica. Es tambin tpica una macrotrombocitopenia moderada, con cifras que pueden variar en un mismo individuo a lo largo de su vida (25 a 150 x 109/litro). El frotis de sangre perifrica muestra plaquetas grandes, plidas, con formas ovales. El aspirado medular muestra un nmero aparentemente normal de megacariocitos, con un incremento en la trama reticulnica, fundamentalmente alrededor de stos. Los estudios de agregacin plaquetaria son variables: generalmente se observan defectos en la agregacin a trombina y colgeno, mientras que con ADP o epinefrina tienden a estar menos alteradas. Sin embargo, tambin se han descrito agregaciones normales a todos los agonistas. Los estudios inmunolgicos o la electroforesis en gel de poliacrilamida demuestran la deficiencia en las protenas granulares como fibringeno, FVW, trombospondina, factor 4 plaquetario, factor de crecimiento derivado de plaquetas y tromboglobulina en lisados de plaquetas o en el sobrenadante tras su activacin. La microscopa electrnica demuestra una ausencia selectiva de grnulos , con un nmero normal de grnulos densos. Se desconoce el modo exacto de transmisin gentica de esta patologa, debido al escaso nmero de individuos descritos, aunque la presencia de la enfermedad en dos hermanos varn y mujer- sugiere que se trata de una herencia autosmica. La anomala molecular especfica responsable de este cuadro no ha sido todava descrita. Las medidas generales para el tratamiento de
esta enfermedad son similares a las de la TG. La respuesta a la desmopresina es variable, pero parece mejorar en parte la funcin hemosttica, y los pacientes tambin se pueden beneficiar de la terapia antifibrinoltica. El tratamiento de los episodios hemorrgicos severos requiere la transfusin de concentrados de plaquetas. b) Deficiencia en el almacenamiento de grnulos La deficiencia en grnulos puede ser un trastorno plaquetario hereditario aislado, o un componente de enfermedades hereditarias multisistmicas. Dentro de estas ltimas se reconoce el sndrome de Hermansky-Pudlak (albinismo oculocutneo, acmulo excesivo de material de tipo ceroide en clulas del sistema mononuclear-fagoctico, fibrosis pulmonar variable, enfermedad inflamatoria intestinal, y ditesis hemorrgica), el sndrome de ChediakHigashi (albinismo oculocutneo parcial, grnulos lisosomales gigantes e infecciones pigenas frecuentes), y el sndrome de WiskottAldrich. Otras enfermedades que se han asociado a deficiencia de grnulos densos son el sndrome de Ehler-Danlos, la osteognesis imperfecta y la trombocitopenia con ausencia de radio, aunque esta relacin est menos establecida. En la deficiencia de grnulos , el contenido granular de ADP, ATP, serotonina, calcio y pirofosfato estn disminuidos. La relacin ATP/ ADP, medida en lisados plaquetarios est aumentada, lo que traduce niveles normales de ATP en otros compartimientos generados para el metabolismo plaquetario. La disminucin de ADP, y posiblemente de serotonina, secretados por las plaquetas, contribuye en la alteracin funcional y en la propagacin del tapn hemosttico. La etiologa de la deficiencia primaria de almacenamiento de grnulos es desconocida, pero podra haber un defecto intrnseco en los precursores hematopoyticos. En el sndrome de Her mansky-Pudlak parece haber una deficiencia completa en la formacin de grnulos , de acuerdo a los hallazgos de la microscopa electrnica de plaquetas y de megacariocitos, y a la ausencia de CD63 o granulofisina (protena de la membrana de grnulos densos, de lisosomas y de melanosomas). En el resto de las formas de deficiencia de grnulos las membranas de los grnulos densos s parecen formarse, pero no se rellenan de forma adecuada. Por ello, los
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defectos en la secrecin de diferentes substancias contenidas en estos grnulos tambin son variables, y generalmente la de nucletidos cclicos es la ms afectada. La deficiencia de grnulos se caracteriza por una ditesis hemorrgica moderada, con sangrado mucocutneo, como epistaxis, petequias, menorragia, y sangrado postquirrgico o postparto. Los pacientes con deficiencias de grnulos como parte del sndrome de Hermansky-Pudlak suelen tener hemorragias ms severas e incluso pueden ser letales. Aunque los recuentos de plaquetas pueden estar discretamente disminuidos, por lo general son normales. Los estudios de agregacin son variables, habindose descrito un nmero de pacientes con deficiencias de grnulos y normalidad en estos anlisis. Generalmente, la segunda onda de agregacin con ADP y epinefrina suele estar ausente, y la respuesta a bajas dosis de colgeno suele ser deficiente. La valoracin de la respuesta a dosis elevadas de trombina (mxima liberacin) ayuda a distinguir las alteraciones de la liberacin (agregaciones normales) de las deficiencias en los grnulos (agregaciones reducidas). El luminmetro o el lumiagregmetro permiten comprobar una reduccin en la liberacin de ATP mediante anlisis de la luminiscencia. La mepacrina, debido a su alta afinidad por el ATP se localiza en los grnulos densos, y la reduccin de la fluorescencia emitida medida mediante microscopa o citometra ayuda al diagnstico. El anlisis bioqumico de diferentes sustancias intragranulares, como el ATP, ADP, calcio o serotonina est reducido, mientras que la relacin ATP: ADP est aumentada. La 14Cserotonina es captada en plaquetas deficientes en grnulos , pero puesto que no puede ser incorporada en estos organelos, se cataboliza rpidamente. En estudios de secrecin plaquetaria usando 14C-serotonina, se observa caractersticamente un por centaje de incorporacin menor al nor mal en estos pacientes. Aunque en las plaquetas carentes en grnulos densos una proporcin importante de la serotonina es catabolizada, en pacientes con sndrome de Hermansky-Pudlak la prdida del marcador radioactivo es todava ms acusada. La reduccin o la ausencia de grnulos densos pueden ser confirmadas por microscopa electrnica de plaquetas fijadas en presencia de calcio. En ausencia de otras anomalas congnitas o de una deficiencia asociada de grnulos , la
deficiencia de grnulos se transmite como rasgo autosmico dominante. Las otras formas de deficiencias de grnulos con alteraciones constitucionales (sndromes de HermanskyPudlak, Chediak Higashi y la trombocitopenia con ausencia de radio) tienen una herencia autosmica recesiva, excepto el sndrome de Wiskott Aldrich, que lo hace como rasgo ligado al cromosoma X. El sndrome de Hermansky-Pudlak tiene una base molecular heter ognea, con la participacin de diferentes genes. Hasta la fecha se ha identificado tres genes responsables de la enfermedad denominados HPS1, HPS2, y HPS3. El primero, HPS1, se localiza en el cromosoma 10q23.1, tiene 20 exones, y codifica una protena de 700 aminocidos cuya funcin es todava poco clara pero que parece estar implicada en la organelognesis. En poblacin de Puerto Rico se ha reportado numerosos casos de este sndrome, y en esta poblacin la alteracin gentica ms frecuente es una duplicacin de 16 pares de bases en el exn 15. El gen HPS2, tambin llamado AP3BA, codifica la subunidad B3A del complejo adaptador AP3, que juega un papel clave en la formacin de vesculas y el almacenamiento de protenas, a partir de estructuras membranosas como el aparato de Golgi. Por ltimo, se ha comunicado que alteraciones moleculares en el gen HPS3, cromosoma 3q24, se asocian al fenotipo de HPS. La funcin de la protena codificada por HPS3, 1000aa 114kDa, es an desconocida. Informacin ms detallada sobre las caractersticas de estos genes y las mutaciones identificadas en ellos se puede obtener en Inter net (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?CMD=search&DB=omim; cdigos de entrada 604982, 603401, 606118). Las medidas generales para el tratamiento de esta enfermedad son similares a las indicadas en deficiencias de grnulos . La transfusin de plaquetas es el tratamiento ms efectivo en episodios de sangrado de pacientes con deficiencias de grnulosd, pero debido a su carcter moderado, a veces stas no son necesarias. Los crioprecipitados pueden corregir el tiempo de sangra en estos pacientes, pero el mecanismo de este beneficio es an desconocido. Lo mismo ocurre con la desmopresina, que tambin puede ser de utilidad en un nmero de pacientes con este defecto.
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c) Deficiencia combinada de grnulos y La deficiencia combinada de grnulos y se caracteriza por una reduccin parcial y variable en el nmero de estos grnulos, y una expresin clnica heterognea. Por lo general, la reduccin en grnulos es mayor que la de . A diferencia del sndrome de las plaquetas grises, en la que la selectina P est presente en cantidades normales, el contenido en esta glicoprotena en las plaquetas de pacientes con deficiencias combinadas est reducido, lo que facilita el diagnstico. Otros hallazgos de laboratorio, sus manifestaciones clnicas y el tratamiento no difieren a los sealados en deficiencias aisladas de grnulos . En casos espordicos se ha descrito asociacin con neoplasias hematolgicas, lo que ha sugerido que en este cuadro pudiera haber un protooncogen que regulara la maduracin de megacariocitos y de neutrfilos. La presentacin familiar de estos cuadros sugiere una herencia autosmica. d) Alteracin plaquetaria tipo Quebec Este es un raro trastorno autosmico dominante que se caracteriza por cifras nor males o disminuidas de plaquetas, sangrado mucocutneo que puede ser severo y muy tardo tras un traumatismo, y que generalmente no responde adecuadamente a transfusiones de plaquetas. Se asocia a un aumento de expresin y almacenamiento de ur oquinasa en megacariocitos y plaquetas, generacin de plasmina intraplaquetaria, degradacin de las protenas de los grnulos alfa (entre ellos el factor V plaquetario), uroquinasa plasmtica normal o aumentada, aumento de productos de degradacin del fibringeno sin aumento del Dmero D, y ausencia de agregacin plaquetaria con epinefrina. Refrenda este mecanismo patognico el hecho que la terapia con inhibidores de la fibrinolisis (ej., cido tranexmico) es el nico tratamiento efectivo conocido en este sndrome. 3.1.4. Defectos hereditarios en los mecanismos implicados en la transmisin de seales de activacin plaquetaria En muchos pacientes la funcin de las plaquetas est alterada, con fallos en la agregacin y/o la secrecin, a pesar de la ausencia de alteraciones congnitas de los grnulos plaquetarios o de los receptores adhesivos. En estos casos, es posible que la patologa subyacente sea un defecto hereditario de la activacin plaquetaria. Este proceso es un complejo fenmeno que
incluye la unin de agonistas a sus receptores especficos, la transmisin de seales de activacin generalmente por acoplamiento del receptor con protenas G, la activacin de enzimas efectoras como nucletido ciclasas o fosfolipasas, la generacin o movilizacin de segundos mensajeros (nucletidos cclicos, inositoles fosfato, calcio, etc.). Subsiguientemente, se produce la cascada de cambios bioqumicos (fosforilacin de protenas, activacin de receptores, secrecin etc.) y estructurales (cambio de forma, reorganizacin del citoesqueleto, emisin de seudpodos) que caracterizan el estado de plaqueta activada. Reconocida la transcendencia fisiolgica del pr oceso de la activacin plaquetaria e identificados sus elementos clave, resulta claro que la deficiencia hereditaria de alguno de estos elementos puede reflejarse en un funcionamiento anormal de las plaquetas. Dada la variedad de elementos potencialmente afectados, los pacientes con deficiencias de la activacin plaquetaria constituyen un conjunto muy heterogneo, que agrupamos ms para simplificar la clasificacin global de las trombocitopatas, que por verdadera similitud de las alteraciones especficas subyacentes. A pesar de dicha heterogeneidad, estos pacientes se asemejan fenotpicamente, cursando con ditesis hemorrgicas muy moderadas, similares por ejemplo a las de sujetos tratados con aspirina, y de localizacin cutneo-mucosa. En general, no requieren tratamiento, y son suficientes medidas educativas de prevencin de riesgo. Ante situaciones de riesgo hemorrgico previsible (exodoncia, intervenciones quirrgicas), puede plantearse el uso preventivo de desmopresina o antifibrinolticos, per o en ocasiones las hemorragias son ms graves y es necesaria la transfusin de componentes sanguneos. Considerando el carcter generalmente moderado del trastorno hemorrgico asociado a esta patologa, que normalmente no requerir atencin mdica, no es de extraar que una alta proporcin de los individuos afectados no sean diagnosticados, y por ello su incidencia es desconocida. No obstante, la mayora de las disfunciones plaquetarias diagnosticadas en el laboratorio corresponden a esta categora, con una incidencia global bastante mayor que el de otras trombocitopatas ms clsicas como el SBS o la TG. En ausencia de pruebas ms especficas para la caracterizacin del defecto subyacente, los hallazgos tpicos en pacientes con patologa de
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la activacin son cifras normales de plaquetas, pruebas de coagulacin y nivel de FVW normal, y un tiempo de sangra normal o alargado. El cambio de forma y la aglutinacin inducida por ristocetina no suelen estar afectados, mientras que la agregacin plaquetaria con dosis moderadas o bajas de la mayora de agonistas muestra generalmente disminucin del porcentaje mximo de agregacin y/o ausencia de la segunda onda de agregacin. A dosis altas de agonistas el patrn de agregabilidad puede nor malizarse. En algunos casos se ha conseguido caracterizar de forma precisa la alteracin molecular responsable de la alteracin funcional de la activacin plaquetaria, y estos casos son descritos con ms detalle en el siguiente punto (b de 3.1.4). a) Defectos en los receptores para agonistas Las plaquetas cuentan con una batera de receptor es para mltiples agonistas no adhesivos muy amplia y diversa. La mayora de ellos, per o no todos, son protenas pertenecientes a la familia de receptores formados por una nica cadena polipeptdica con siete dominios transmembrana, y cuyas porciones intracitoslicas se acoplan a protenas G que median la transmisin de las seales de activacin de las enzimas efectoras. En este grupo se encuadran como principales los receptores para ADP, epinefrina, trombina, factor activador de plaquetas o PAF, vasopresina, serotonina, y tromboxano A2. Adems, para algunos de estos agonistas existen varios subtipos de receptores, y como es obvio todos ellos son blanco potencial de alteraciones moleculares que se traducen en defectos funcionales de la activacin. Las plaquetas disponen de al menos tres subtipos de receptores purinrgicos de ADP: (a) P2Y1, ligado a la subunidad Gq, cuya activacin se asocia a aumentos de IP3 y DAG, y salida de calcio desde el retculo endoplsmico; (b) P2Y12 (tambin llamado P2TAC, P2cyc o P2Yadp), ligado a la protena Gi, asociada a disminucin de la adenilato ciclasa y consecuente disminucin del AMPc intracelular, lo que desencadena la agregacin macr oscpica y la estabilizacin de los agregados; y (c) P2X1, un receptor que acta como canal de calcio, activado por ATP externo, y cuyo papel fisiolgico an est insuficientemente aclarado, aunque parece regular positivamente la respuesta de las plaquetas al colgeno. Se han identificado dos pacientes no relacionados, con una aparente
deficiencia congnita de la agregacin inducida por ADP. En ambos casos, los estudios con anlogos de ADP, mostraron una reduccin significativa en el nmero de sitios de unin. Tambin se constat un patrn anormal de fosforilacin inducida por ADP, y la incapacidad de este agonista para inhibir la generacin de AMPc en plaquetas estimuladas con prostaglandina E1. Este patrn clnico-funcional es comparable al de sujetos o animales tratados con tienopiridinas, y es sugerente de una deficiencia de los receptores P2Y12. De hecho, en uno de estos enfermos se ha identificado la presencia en heterocigosis de una delecin de dos nucletidos en el gen del receptor P2Y12, que causa la aparicin de un codn stop prematuro y la sntesis de una protena carente de 28 residuos en el extremo amino terminal. Esta alteracin se transmite de for ma autosmica recesiva, y su presencia en otros pacientes con afectacin de las respuestas al ADP est por demostrarse. No obstante, en algunos pacientes con secrecin plaquetaria alterada, pero grnulos y formacin de TXA2 nor males, se sospecha la presencia en heterocigosis de sta u otra alteracin molecular del receptor P2Y12. Respecto de los otros receptores de ADP, se ha comunicado un paciente con una aparente deficiencia congnita del receptor P2Y1, todava no confirmada ni caracterizada. Tambin se ha descrito un paciente con un trastorno hemorrgico severo asociado a un defecto hereditario recesivo, consistente en la delecin de una leucina en el segundo dominio transmembrana del receptor P2X1. Las plaquetas poseen r eceptores 2adrenrgicos implicados en la inhibicin de la adenilato ciclasa mediante acoplamiento a travs de la protena Gi. La interaccin de la epinefrina con su receptor tambin promueve la agregacin inducida por otros agonistas dbiles como el ADP, poniendo de manifiesto la importancia fisiolgica del sinergismo entre distintos agonistas plaquetarios. Se han descrito tres casos de defectos congnitos de la secrecin y /o la agregacin inducida por epinefrina, asociados a una disminucin significativa de los receptores 2-adrenrgicos. En estos casos, la clnica hemorrgica es discreta, y la alteracin molecular subyacente no es conocida. En contraposicin con estas trombocitopatas de deficiencia funcional de los receptores de ADP o epinefrina, se ha descrito un trastorno denominado sndrome de las plaquetas
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viscosas, caracterizado por una hiperagregacin de las plaquetas al estimularlas con estos agonistas. Clnicamente, los pacientes con este sndrome sufren trombosis coronarias o en el sistema nervioso central, frecuentemente asociadas a situaciones de estrs emocional. La base molecular de este exceso de funcin an se desconoce. Una de las consecuencias genricas de la activacin de las plaquetas es la generacin de tromboxano A2, que acta potenciando la respuesta inicial en la misma y en otras plaquetas. El receptor de TXA2, del que existen en las plaquetas dos isofor mas - y diferenciadas slo en el extremo carboxilo terminal y en su capacidad de activar la adenilato ciclasa, es una protena con siete dominios transmembrana que activa el ciclo de los fosfoinositoles por acoplamiento a la protena Gq. En la poblacin japonesa se han identificado familias con trastor nos hemorrgicos moderados de transmisin dominante, que presentan una mutacin puntual (Arg/Leu 60) en el gen que codifica el receptor plaquetario de TXA2. Esta mutacin, localizada en la porcin citoplasmtica del receptor, parece afectar su capacidad para transmitir seales de activacin tras la unin del ligando. El PAF es un ter fosfolipdico de propiedades antiinflamatorias producido por las plaquetas, leucocitos y otras clulas. El PAF es un potente agonista capaz de inducir secrecin y agregacin plaquetaria de for ma dosis dependiente. Sus respuestas estn mediadas por un receptor de siete dominios transmembrana acoplado a protenas G, que inducen la inhibicin de la adenilato ciclasa y a la activacin de la fosfolipasa C. Indirectamente, tambin activa la fosfolipasa A2 provocando la liberacin de cido araquidnico de la membrana plaquetaria. En 1984 se comunic anecdticamente un caso de aparente deficiencia especfica de la respuesta plaquetaria a PAF sin detallar el tipo de anomala, pero no hay constancia en la literatura de otros pacientes con alteraciones similares. Para terminar esta seccin es obligado hacer mencin sucinta a la trombina, el ms potente activador de las plaquetas capaz de inducir respuestas de activacin a concentracin subnanomolar en cuestin de segundos. Se ha demostrado que el complejo Ib-IX-V acta como receptor plaquetario para la trombina, lo que podra explicar la menor reactividad de las
plaquetas SBS a este agonista. Adems de este complejo, las plaquetas humanas poseen otros receptores de trombina (PAR1 y PAR 4, Protease Activator Receptors) pertenecientes a la familia de receptores de siete dominios transmembrana que se activan por proteolisis, y transmiten las seales de activacin mediante acoplamiento a distintas protenas G. Estos receptores son activados por un novedoso mecanismo de proteolisis de una porcin del dominio extracelular de la molcula, que genera un nuevo extremo N-terminal, que acta como un ligando o agonista intramolecular para el propio receptor. El hexapptido SFLLRN-NH2 incluido en el nuevo extremo amino terminal se denomina pptido activador del receptor de trombina (TRAP, Thrombin Receptor Activating Peptide). Hasta la fecha, no se han descrito patologas plaquetarias relacionadas con alteraciones especficas en estos receptores. b) Defectos en otros elementos intraplaquetarios implicados en la activacin: protenas G, enzimas efectoras, segundos mensajeros, fosforilacin de protenas Las protenas G son un grupo heterogneo de protenas heterotrimricas, , que actan como nexo de unin entre receptores de membrana y las enzimas efectoras intracelulares. Los r eceptores activos pr omueven el intercambio del GDP unido a la subunidad G no activa por GTP, y la disociacin de G de las subunidades G, lo que provoca su activacin. Posteriormente, la actividad de GTPasa de G y la participacin de protenas reguladoras extrnsecas, favorece la hidrlisis del GTP a GDP y la subsiguiente desactivacin de G y su reasociacin con G hasta el siguiente ciclo de activacin del receptor. Debido a su papel modulador en el proceso de la activacin, las protenas G son una importante causa potencial de defectos constitucionales de la funcin plaquetaria. Este es el caso de una paciente con trastorno hemorrgico leve, caracterizado por alteraciones en la agregacin, la secrecin, la liberacin de cido araquidnico, y la movilizacin del calcio en respuesta a diversos agonistas. En esta paciente, se ha demostrado la asociacin de estas alteraciones con una deficiencia cuantitativa hereditaria, (menos del 50%) de la protena Gq. Los niveles de otras protenas G (Gi, G12, G13) son normales en esta paciente, resaltando la especificidad de la anomala. Un fenotipo similar de funcin plaquetaria ha sido encontrado en ratones deficientes de Gq.
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Los sistemas enzimticos efectores (fosfolipasas, nucletido ciclasas), son otro importante eslabn en la cadena reguladora de la activacin plaquetaria, al ser los generadores de los segundos mensajeros que promueven o inhiben ese proceso de activacin. La fosfolipasa C, particularmente la isoforma B, es responsable de la rpida hidrlisis de fosfoinositoles que ocurre durante la activacin inducida por la unin de muchos ligandos a sus receptores. Como consecuencia, se genera diacilglicerol (DAG), e inositol 1,4,5- trifosfato (IP3), y se moviliza el calcio de los depsitos intracelulares. Existe en la literatura mencin a varios pacientes con defectos de agregacin y secr ecin asociados con una aparente deficiencia en la movilizacin del calcio intraplaquetario tras la activacin con varios agonistas. Estudios especficos en dos de estos pacientes mostraron un defecto en la sntesis de DAG e IP 3 y en la fosforilacin de la pleckstrina tras la activacin con agonistas. Por el contrario se poda inducir activacin directa de la PKC con DiC8, y la subsiguiente secrecin y fosforilacin de protenas. En uno de los pacientes se ha demostrado que una disminucin selectiva de la fosfolipasa C-2 es muy probablemente la causa de la alteracin funcional. En lnea con este hallazgo, recientes estudios han demostrado que los neutrfilos de ratones deficientes en fosfolipasa C-2 manifiestan una disminuida capacidad de movilizacin de calcio. En los ltimos aos, varios autores han identificado pacientes con fenotipo de sangrado moderado y un patrn de agregacin y secrecin plaquetaria alteradas, en los que se sospecha una alteracin en las vas de hidrlisis de los fosfoinositoles y/o de la fosforilacin de protenas tras la activacin con agonistas. En algunos de estos pacientes se ha demostrado con ensayos especficos una disminucin significativa de la capacidad de sntesis de IP3, de la movilizacin de calcio, o de la fosforilacin de protenas como pleckstrina. Sin embargo, la localizacin precisa de la alteracin en la cascada de componentes de la transmisin de seales de activacin est por establecerse. La activacin del complejo GPIIb-IIIa, necesaria para la unin de fibringeno y la posterior agregacin plaquetaria es un proceso que conlleva la transmisin de seales de activacin de dentro hacia fuera. Los elementos implicados en este proceso no han sido esclarecidos completamente, aunque hay evidencias de una participacin muy relevante de la activacin de
la PKC y la fosforilacin de la pleckstrina. Fallos en la transmisin de las seales conducentes a la activacin del complejo IIb-IIIa parecen ser la causa de los fenotipos hemorrgicos y de funcin plaquetaria parecidos a la TG que muestran algunos pacientes con niveles normales de complejos IIb-IIIa no mutados. Se sospecha actualmente que este tipo de defecto a nivel de la activacin del complejo IIb-IIIa, cuya localizacin precisa no se ha identificado y puede ser heter ognea, puede ser el mecanismo comn de los fallos de agregacin, esencialmente en la primera onda, que muestran muchos pacientes. c) Defectos en el metabolismo del cido araquidnico y/o en la produccin de tromboxano A2. La liberacin de cido araquidnico desde los fosfolpidos de la membrana y su oxigenacin a tromboxano A2, es uno de los procesos clave de la activacin plaquetaria. El tromboxano A2 liberado es un potente agonista que incrementa la activacin a travs de su unin a un receptor propio de siete dominios transmembrana acoplado a protenas G. La mayora del tromboxano A2 se genera por accin secuencial de las enzimas fosfolipasa A2, prostaglandina H sintetasa (ciclooxigenasa-1 o COX-1), y tromboxano sintetasa. La alteracin hereditaria de cualquiera de estos sistemas enzimticos puede dar lugar a una disminuida capacidad de sntesis de tr omboxano A 2, y consiguientemente a una disfuncin plaquetaria similar a la causada por el tratamiento con aspirina, que acetila en forma irreversible la COX-1. El patrn general de agregacin muestra una disminucin de la respuesta al ADP, colgeno o epinefrina, con una llamativa prdida de la segunda onda de agregacin. Se han descrito varios pacientes con anomalas en la fosfolipasa A2, que muestran este patrn de agregacin anormal, pero con agregacin normal en respuesta a cido araquidnico. La identidad de este fallo no se ha aclarado en todos los casos y puede ser heterognea. En otros casos con patrones de respuestas similares, no se confirma anomalas intrnsecas de esta enzima, y el fallo parece secundario a la movilizacin de calcio alterada tras activacin por agonistas, con una deficiente activacin de la fosfolipasa A2. Deficiencias cuantitativas o cualitativas de ciclooxigenasa o de tromboxano sintetasa, han sido identificadas en varios pacientes. En estos casos la respuesta de agregacin al cido araquidnico es muy
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deficiente. A falta de otras tcnicas ms especficas de identificacin de estas enzimas, ambas trombocitopatas pueden distinguirse por la respuesta de agregacin a la prostaglandina H2, que es normal en el caso del dficit de ciclooxigenasa y anormal si la deficiencia es de la enzima tromboxano sintetasa. Una respuesta normal a los anlogos sintticos del tromboxano A2, ayuda a discernir estos cuadros de las patologas que afectan al receptor del tromboxano o a su mecanismo de transmisin de seales. 3.1.5. Alteraciones congnitas de la actividad procoagulante de las plaquetas Cuando las plaquetas se activan se produce la exter nalizacin de fosfolpidos de carga negativa, en especial la fosfatidilserina. Este proceso contribuye en la funcin hemosttica, ya que estos fosfolpidos de carga negativa soportan el ensamblaje de los complejos procoagulantes tenasa (VIIIa-IXa), que activa el factor X, y protrombinasa (Va-Xa), que activa el factor II. La consecuencia final es la generacin local de trombina, y subsiguientemente de la fibrina que estabiliza el trombo sobre la zona de lesin vascular. Clsicamente, la contribucin de las plaquetas al proceso de la coagulacin se ha definido como actividad factor 3 plaquetario. Se ha identificado una patologa congnita denominada Sndrome de Scott, causada por una deficiencia congnita autosmica recesiva, en alguna de las enzimas responsables de la exter nalizacin de fosfatidilserina, como la fosfatidiltranslocasa. En los pacientes afectados de este sndrome, la capacidad de ensamblaje del complejo protrombinasa, y con ello de formar trombos estables est disminuida, lo que favorece una sintomatologa hemorrgica que incluye el sangrado excesivo tras extracciones dentarias, traumatismos, o ciruga, epistaxis y hematomas. La presencia de un tiempo de sangra normal, un tiempo de protrombina en suero anormal, y la ausencia de un patrn de sangrado mayoritariamente mucocutneo, permiten diferenciar los defectos congnitos de la actividad procoagulante de otros desrdenes plaquetarios cualitativos. El tratamiento de los pacientes con este tipo de patologa se ha basado mayoritariamente en la transfusin de plaquetas o sangre total. Un paciente ha sido tratado de manera eficaz con concentrados de complejo protrombnico, sin embargo estos frmacos pueden inducir trombosis por lo que su utilizacin, si procede, se ha de restringir a episodios de sangrado severo.
Adems del sndrome de Scott, se han descrito otras condiciones clnicas asociadas a una anor mal actividad procoagulante de las plaquetas. Tal es el caso del sndrome de Stor morken, caracterizado por la sobreexpresin de actividad procoagulante en las plaquetas incluso en ausencia de agentes estimuladores, por lo que se conoce tambin como anomala inversa al sndrome de Scott. Este fenmeno se refleja tambin en la deteccin, mediante citometra de flujo, de una unin aumentada de anexina V a las plaquetas no estimuladas, y en la presencia en el plasma rico en plaquetas de los pacientes afectados de una concentracin anormalmente alta de microvesculas. Paradjicamente, la existencia en estos enfermos de unas plaquetas en per manente estado procoagulante no se traduce en una predisposicin a la trombosis, sino que se manifiesta clnicamente con tendencia moderada al sangrado. Este fenotipo clnico concuerda con la observacin en cmara de perfusin sobre colgeno, flujo a 650-2600 s-1, de una menor capacidad de formacin de trombos a pesar de una adhesin plaquetaria normal. A diferencia del sndrome de Scott, la alteracin de Stor morken parece ser multifactorial, e incluye, adems de la alteracin de la capacidad procoagulante, otras anomalas como asplenia, supervivencia plaquetaria reducida, miosis, dislexia, fatiga muscular, e histiocitosis. 3.1.6. Otras trombocitopatas Adems de las alteraciones mencionadas arriba, se han identificado pacientes que manifiestan anormalidades de la funcin plaquetaria de difcil inclusin en los grupos anteriores, y que en ocasiones parecen tambin ligadas a desrdenes sistmicos. Este es el caso del sndrome de Wiskott-Aldrich, mencionado brevemente en la seccin de dficit de grnulos densos. Se trata de un trastorno hereditario raro, 4 casos por milln, ligado al cromosoma X que afecta a las plaquetas y adems a los linfocitos T. Clnicamente se caracteriza por la presencia de trombocitopenia, inmunodeficiencia, y eczema. Son frecuentes en estos enfermos las infecciones de repeticin, las hemorragias, aparicin de un linfoma, y complicaciones autoinmunes. La severidad de la enfermedad es variable incluso entre individuos de una misma familia, pero se puede clasificar como un trastorno severo. Las plaquetas, de pequeo tamao, muestran varias anormalidades, la ms llamativa un dficit
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severo del pool de nucletidos de adenina, que impide el normal feedback positivo durante la activacin y la agregacin plaquetaria. Tambin se ha descrito un defecto en el metabolismo energtico de las plaquetas. El tiempo de sangra suele ser prolongado, ms all de lo esperable considerando la intensidad de la trombocitopenia. La esplenectoma suele corregir, al menos temporalmente, la trombocitopenia y el defecto en el tamao plaquetario, y tiene un efecto positivo sobre la funcin plaquetaria. Siendo una opcin vlida de tratamiento sobre todo en aquellos pacientes con sangrado intenso, se ha de considerar el mayor riesgo de infecciones postquirrgicas en estos enfermos. El sangrado activo se trata con transfusiones de plaquetas irradiadas, y preferiblemente de donantes CMV negativos. Finalmente, el trasplante de mdula sea antes del inicio de una inmunodeficiencia intensa, puede curar el trastorno y es recomendable si se dispone de un donante histocompatible. En pacientes jvenes puede ser vlido el trasplante de donantes compatibles no relacionados y/o de clulas de cordn umbilical. En algunos pacientes la alteracin molecular responsable de esta enfermedad se ha localizado en el gen que codifica la llamada protena del sndrome de Wiskott-Aldrich, una molcula que acta como regulador clave del ensamblaje del citoesqueleto plaquetario, donde interacciona con otras protenas especficas de la transmisin de seales de activacin como la GTPasa Cdc42 o protenas adaptadoras de la familia Src como p47nck. Otros enfermos con el sndrome de Wiskott-Aldrich no muestran mutaciones en el gen de esa protena, lo que indica la implicacin de otros genes en la patognesis de la enfermedad. En algunos pacientes, se han detectado alteraciones a nivel de la glicoprotenas adhesivas de la membrana plaquetaria como CD43 o sialoforina, GPIb, GP Ia, GPIIb-IIIa, o GPIV. Informacin detallada y actual sobre las alteraciones moleculares hasta ahora identificadas como causantes de este sndrome se puede obtener en Internet (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
query.fcgi?CMD=search&DB=omim; cdigo de entrada 301000). Adems del sndrome de Wiskott-Aldrich, se han descrito alteraciones de la estructura y/o funcin de las plaquetas en asociacin con otros desrdenes sistmicos como el sndrome de Down, y algunas macrotrombocitopenias constitucionales. Estas ltimas son un conjunto de sndromes, de herencia autosmica dominante, que cursan con trombocitopenia, plaquetas de gran tamao, escasa ditesis hemorrgica y ausencia de alteraciones valorables en los estudios funcionales. La reciente identificacin de una misma anomala gentica en las macrotrombocitopenias asociadas a inclusiones ribosmicas en los leucocitos y/o a sndromes Alport-like (nefropata e hipoacusia), indica que forman un grupo de sndromes relacionados (sndrome de May-Hegglin, sndrome de Sebastian, sndrome de Epstein y sndrome de Fechtner). La deteccin de macrotrombocitopenia en pacientes con microdelecin del cromosoma 22q11 y sndrome velocardiofacial determina un segundo grupo de macrotrombocitopenias. Finalmente, quedaran las macrotrombocitopenias no asociadas a inclusiones leucocitarias ni a otras anomalas, de etiopatogenia desconocida. En estos casos, no se han identificado an los mecanismos aberrantes responsables de las anomalas plaquetarias. 3.2. Trombocitopatas adquiridas La anomala funcional plaquetaria ocurre en numerosas condiciones clnicas adquiridas. Destacamos aqu las patologas ms frecuentes de este tipo, y que son clnicamente relevantes, pues muchas alteraciones funcionales no tienen una correlacin clnica evidente o demostrada y se expresan slo como hallazgos de laboratorio. La tabla 21-11 muestra una clasificacin general de los defectos plaquetarios adquiridos.
Tabla 21-11. Anomalas funcionales adquiridas de las plaquetas Asociadas a enfermedades sistmicas Uremia Insuficiencia heptica Anticuerpos antiplaquetarios Ciruga con circulacin extracorprea Leucemias y mielodisplasias Disproteinemias Por drogas, alimentos, especies y vitaminas
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3.2.1. Asociadas a enfermedades sistmicas a1) Trombocitopata urmica La insuficiencia renal crnica (IRC) evoluciona con una alteracin compleja de la hemostasia, en que clnicamente coexisten los riesgos de hemorragia y trombosis. Ya en 1827 Richard Bright destacaba la alta frecuencia de hemorragia purprica en pacientes con IRC. De hecho, la progresin natural de la enfermedad lleva a la hemorragia, determinante mayor de mortalidad hasta el advenimiento de la hemodilisis. En 1974, a pocos aos de introducido ese tratamiento dialtico, Lindner y colaboradores, advertan respecto al acelerado desarr ollo de arteriosclerosis y de su complicacin trombtica como causa de muerte en sus pacientes. Este viraje en el enfoque del problema hemosttico se confirma al constatar la menor frecuencia de publicaciones recientes sobre la patogenia de la hemorragia en IRC en comparacin con el creciente inters en aclarar los mecanismos de la aterosclerosis y trombosis asociada al sndrome urmico, principal causa de muerte en pacientes en dilisis crnica.
Patogenia El agravamiento metablico producido durante el curso natural de la IRC no modificada por la dilisis conduce en forma inexorable a la hemorragia. Existe un defecto de hemostasia primaria, comprometiendo los fenmenos dependientes de la interaccin plaquetaendotelio y que clnicamente se manifiesta por hemorragias cutneas y mucosas. La tabla 2112 resume las alteraciones descritas en los distintos componentes del sistema de hemostasia primaria que explican la tendencia hemorrgica. Dejando de lado algunas discrepancias entre las diversas publicaciones, la observacin de la tabla indica que existira anomala en casi todas las etapas del proceso de hemostasia primaria. De hecho, en los ltimos 25 aos se ha podido anticipar que cada nuevo avance en el conocimiento de los mecanismos de disfuncin plaquetaria, de alteraciones del FVW y de la patologa vascular iba seguido de cerca por la descripcin de similar alteracin en los pacientes con IRC.
Tabla 21-12 Patogenia del defecto hemorrgico en la uremia Alteraciones de la funcin plaquetaria - Defecto de agregacin de las plaquetas - Defecto de secrecin de las plaquetas - Aumento de actividad de adeninil ciclasa, de cAMP y cGMP plaquetarios - Disminucin de ADP, ATP y 5-HT granulares - Defecto en la liberacin de calcio intraplaquetario - Defecto en metabolismo del araquidonato, con sntesis disminuida de TxA2 - Defecto de glicoprotenas Ib y IIb-IIIa de membrana plaquetaria Disminucin de la concentracin de plaquetas o de la masa plaquetaria total Defectos cualitativos y/o cuantitativos del factor von Willebrand Alteracin de la relacin plaquetas-pared vascular - Defecto de adhesividad plaquetaria al subendotelio - Aumento de la produccin de prostaciclina - Aumento de la produccin de xido ntrico, inducido por cido guanidinosuccnico Activacin sistmica de la coagulacin Activacin de la fibrinolisis sistmica Contribucin de la anemia
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La mayora de los estudios sobre el defecto hemosttico en la uremia ha abor dado aisladamente la patogenia de la hemorragia y la aterotrombosis, asumiendo implcitamente que son procesos independientes. Sin embargo, est bien documentado que la IRC cursa con un proceso inflamatorio sistmico, con aumento de citoquinas inflamatorias, reaccin de fase aguda, disfuncin endotelial y activacin del sistema de la coagulacin y de la fibrinolisis, todos procesos presentes desde fases tempranas de la enfermedad. El conjunto de estos procesos determina un perfil de laboratorio muy similar al de la CID crnica, subclnica, en que la progresin de estos procesos y el balance entre ellos puede determinar la tendencia clnica: hemorragia o trombosis. Estos procesos ocurren durante el curso natural de la enfermedad, en ausencia de tratamiento dialtico. El defecto de hemostasia primaria se pesquisa por prolongacin del TS presente en ms de 50% de los pacientes con IRC (creatinina srica promedio de 11 mg/dL) antes de ingresar a programas de hemodilisis. Siendo el nico mtodo disponible para detectar fallas de hemostasia primaria in vivo, el TS se ha usado como indicador de riesgo de hemorragia. Sin embargo, la informacin disponible es an insuficiente para afirmar que dicha prueba sea un buen predictor de hemorragia. De hecho, la hemorragia clnica es infrecuente en pacientes con IRC en etapa pre-dialtica, an con TS anormalmente prolongado. Sin embargo, los pacientes pueden presentar hemorragias graves, particularmente en relacin a ciruga, trauma o lesiones anatmicas del tubo digestivo. La dilisis, extracorprea o peritoneal, compensa metablicamente a los pacientes, impidiendo que la incidencia de hemorragias aumente notoriamente con la progresin de la enfermedad. Al contrario, como se indic antes, la IRC en sus etapas avanzadas en dilisis se asocia ms a complicaciones aterotrombticas. La tabla 21-12 muestra que las anomalas pr opuestas para explicar el porqu del alargamiento del TS son multifactoriales. El TS se correlaciona en forma directa con creatinina srica, disfuncin plaquetaria, reduccin del ATP intraplaquetario e intensidad de la anemia. Entre stos, sin embargo, los nicos determinantes independientes del TS son la creatinina srica y el defecto funcional plaquetario. Es poco pr obable que cada uno de los defectos enumerados en la tabla tenga una patogenia independiente del resto y s es factible que la mayora de ellos estn encadenados en una
cascada patognica jerarquizada, con factores causales anteriores, capaces de desencadenar el desequibrio hemosttico. Tradicionalmente se ha atribuido el defecto hemosttico a una alteracin funcional plaquetaria, y se han comunicado alteraciones de adhesin, agregacin, secrecin y actividad procoagulante plaquetarias. Sustancias ajenas a las plaquetas, presentes en el plasma urmico (toxinas urmicas), parecen ser relevantes en la patogenia de estos defectos. Ello explicara que la transfusin de plaquetas sea generalmente inefectiva en el manejo de la hemorragia y en la correccin del TS en la uremia. Entre las posibles toxinas urmicas, el cido guanidinosuccnico, se ha descrito recientemente como inductor de la sntesis de NO por plaquetas y endotelio, lo que podra explicar disminucin de la respuesta plaquetaria a agonistas, el defecto de adhesin y la prolongacin del TS. En esta lnea, se ha observado que el TS se acorta con la administracin de monometil-L-arginina, inhibidor de la produccin de xido ntrico (NO), en voluntarios sanos. Por otro lado, la activacin de la coagulacin (con aumento de la generacin intravascular de trombina) y de la fibrinolisis (con aumento de la produccin de plasmina), relacionadas al proceso inflamatorio urmico, podran dar cuenta de los defectos granulares y de glicoprotenas de membrana, que contribuyen en la disfuncin plaquetaria. Los pacientes con IRC, ya antes de ingresar a programas de dilisis, tienen aumento de protenas de fase aguda en el plasma, por ej., fibringeno, protena C reactiva, -1 antitripsina. Asimismo, la concentracin de FVW, protena sensible a la inflamacin, est generalmente aumentada en el plasma; este aumento se acompaa de una actividad comnmente normal de su funcin, medida como cofactor ristocetina. La distribucin multimrica del FVW es tambin nor mal. La disociacin entre concentracin antignica y funcin del FVW, con aumento del primero, compensara la relativa deficiencia funcional, por lo que se estima que las alteraciones del FVW no tienen participacin mayor en la patogenia del defecto de adhesividad plaquetaria. La anemia de la IRC se relaciona a la prolongacin del TS y, en estudios ex vivo, con el defecto de adhesividad plaquetaria. La correccin de la anemia mejora parcialmente el defecto de hemostasia primaria. Este mecanismo no es exclusivo de la IRC y se presenta en anemias de otras etiologas, pero debe tenerse en cuenta en
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el tratamiento y prevencin de hemorragias en los pacientes urmicos. El consumo de drogas que inhiben la funcin plaquetaria potencia el defecto de hemostasia primaria aumentando el riesgo de hemorragia. Algunos pacientes presentan, adems, trombocitopenia; sta, que habitualmente es leve, puede orientar respecto a la etiologa de la IRC, pero si el conteo es superior a 100.000 plaquetas/L, el hallazgo tiene baja incidencia en la manifestacin hemorrgica.
Tratamiento Diversas terapias se han propuesto para prevenir o tratar la hemorragia urmica (tabla 21-13). El ingreso de los pacientes a programas de dilisis detiene la progresin del deterioro metablico y disminuye notoriamente la incidencia de hemorragias en relacin a la era pre-dialtica. No existe consenso respecto al mecanismo de esta mejora, y especficamente hay controversia si la dilisis mejora o empeora la funcin plaquetaria ex vivo.
Tabla 21-13. Tratamiento del defecto hemorrgico en la uremia Hemodilisis o peritoneodilisis Correccin de la anemia: transfusin de eritrocitos o administracin de eritropoyetina Transfusin de crioprecipitados Desmopresina Estrgenos conjugados Inhibidores de NO sintetasa cido tranexmico
La correccin del hematocrito a niveles sobre 30%, por transfusin de eritrocitos o por tratamiento con eritropoyetina recombinante, acorta el TS y parece disminuir las hemorragias en la IRC. Algunos autores reportan tambin una mejora de la adhesin y agregacin plaquetarias inducidas por eritropoyetina, independiente del alza de hematocrito. La transfusin de crioprecipitados se us inicialmente en forma emprica, observndose un acortamiento transitorio del TS que facilita la realizacin de procedimientos quirrgicos o invasivos en pacientes con IRC. Su mecanismo de accin permanece an desconocido, aunque se asoci al aumento en el plasma de la concentracin de componentes del complejo FVW/FVIII. El uso de crioprecipitados se ha discontinuado por los riesgos inherentes a su transfusin, por el desconocimiento de su mecanismo de accin y porque su eficacia no ha sido confirmada. En la actualidad su uso se ha reemplazado por la 1-deamino-8-D-arginina vasopresina (desmopresina), un anlogo de la hormona antidiurtica sin efecto vasopresor, y que constituye uno de los pilares en el tratamiento o prevencin de la hemorragia urmica. En dosis de 0.3 mg/kg, diluido en 50100 mL de solucin salina y con infusin endovenosa lenta (30-45 minutos), acorta el TS en una proporcin variable de pacientes
urmicos (hasta 75%). El efecto sobre el TS es transitorio, (alrededor de 4 horas), asociado a aumento de FVIII:c, FVW:Ag y FVW:RCo y aparicin en la circulacin de multmeros de alto peso molecular. Por otro lado, en pacientes urmicos con niveles muy elevados de componentes del complejo FVW/FVIII, algunos investigadores no han observado acortamiento del TS despus de la administracin de desmopresina. Mecanismos distintos a cambios cualitativos o cuantitativos del complejo FVW/ FVIII pueden estar involucrados en el efecto benfico de la desmopresina, ya que, como se discuti antes, no existe evidencia an de que alteraciones de este complejo participen en la patogenia de la hemorragia urmica. Los efectos adversos asociados a la administracin de esta dr oga incluyen taquicar dia, enrojecimiento facial, retencin de agua e hiponatremia, aunque estos ltimos dos efectos no se presentan en pacientes con deterioro grave de la funcin renal. El uso de estrgenos conjugados, en dosis de 0.6 mg/kg/da durante 5 das induce un acortamiento del TS, detectable entre los das 5 y 7 y que se prolonga hasta 2 semanas. Esta terapia no es efectiva si se requiere una inmediata mejora del TS, pero es la nica que produce un acortamiento prolongado del TS cuando se busca un efecto hemosttico duradero. El mecanismo
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de accin de los estrgenos se explicara por su capacidad de reducir la expresin de NO sintetasas y, consecuentemente, limitar la sntesis de NO endotelial y plaquetario en la uremia, mecanismo postulado para explicar la anormalidad del TS. En efecto, se ha comunicado que la inhibicin de la sntesis de NO en voluntarios sanos mediante administracin experimental de monometil-L-arginina acorta el TS, pero esta aproximacin teraputica no ha sido probada en pacientes con IRC. El cido tranexmico, en dosis orales de 20-25 mg/kg/da durante 6 das acorta el TS en 67% de los pacientes con IRC avanzada antes de ingresar a programas de dilisis. Este efecto ya se evidencia en algunos enfermos despus de 1-2 das de tratamiento. El cido tranexmico mejora tambin la agregacin y secrecin plaquetarias ex vivo. Esta sustancia desplaza al plasmingeno de la superficie de la fibrina, pues ocupa los sitios de unin a lisina del plasmingeno, inhibiendo su unin a residuos de lisina en la malla de fibrina. En la IRC, el efecto del cido tranexmico sobre las variables de hemostasia primaria parece mediado por inhibicin de la actividad, no de la generacin, de plasmina, pues se asocia a normalizacin de los niveles plasmticos de productos de degradacin de fibringeno/fibrina, pero sin reduccin de los complejos plasminaantiplasmina en la cir culacin. Simultneamente, se observa una cada de la concentracin de plasmingeno, probablemente por depuracin acelerada de los complejos plasmingeno-cido tranexmico. Estas observaciones sugieren que la fibrinolisis juega un papel importante en la patogenia del defecto de hemostasia primaria en la uremia. a2) Anomala funcional de las plaquetas en insuficiencia heptica Patogenia El riesgo de sangrado en pacientes con insuficiencia heptica crnica es alto. Adems de la hipertensin portal (vrices esofgicas, hemorroides, gastritis), que precipitan la hemorragia, con frecuencia se observa esplenomegalia con hiperesplenismo y leve trombocitopenia, activacin intravascular de los sistemas de la coagulacin y fibrinolisis, disfibrinogenemia y coagulacin intravascular diseminada subclnica. Alrededor de 40% de los pacientes con cirrosis heptica presentan TS prolongado, relacionado a la gravedad del dao heptico, medido por aumento de bilirrubina
srica. Esta alteracin de hemostasia primaria debiera ser considerada durante la evaluacin de pacientes para procedimientos invasivos o ciruga. La prolongacin del TS podra explicarse por defectos de adhesin y de agregacin plaquetaria, tambin descritos en cirrosis heptica de diversas patogenias. El defecto funcional se ha confirmado usando un analizador de funcin plaquetaria desarrollado recientemente (PFA-100), y que detecta bien el efecto de la anemia en la disfuncin hemosttica. Se han propuesto varias causas para explicar los defectos plaquetarios. La situacin de proteolisis aumentada, a travs de plasmina, trombina u otras proteasas, podra inducir una activacin intravascular de las plaquetas. En efecto, a plasmina y otras proteasas se les ha atribuido la reduccin de actividad cofactor ristocetina del FVW cir culante en esta enfermedad. Disminucin del contenido de cido araquidnico en la membrana, aumento de productos de degradacin de fibringenofibrina y sntesis de fibringeno cualitativamente anormal podran contribuir tambin al defecto de agregacin plaquetaria descrito. En estos enfermos se ha comunicado que 64% de pacientes con enfermedad heptica crnica de diferentes etiologas presentan autoanticuerpos plaquetarios, dirigidos contra glicoprotenas Ib, IIb-IIIa o ambas, hallazgo que no est relacionado al recuento de plaquetas en sangre o a la etiologa de enfermedad heptica. Estas observaciones podran contribuir al defecto de agregacin y reduccin cuantitativa de GPIb en la cirrosis heptica. La progresin de esta enfermedad se asocia con aumento de la produccin de xido ntrico. Este aumento se ha demostrado especficamente en neutrfilos y monocitos de pacientes cirrticos, que al ser coincubados con plaquetas inducen un mayor aumento de cGMP y mayor inhibicin de la agregacin que la observada con neutrfilos y monocitos obtenidos de sujetos control. Tratamiento Para manejar el riesgo hemorrgico en pacientes con cirrosis se ha empleado desmopresina, que administrada en forma intravenosa o subcutnea acorta el TS. No se ha demostrado que la transfusin de concentrados plaquetarios sea de utilidad para acortar el TS o mejorar la funcin plaquetaria en esta enfermedad. Incluso, la recuperacin post-transfusional de plaquetas en pacientes con hiperesplenismo est disminuida en proporcin inversa al tamao del bazo.
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a3) Alteraciones plaquetarias inducidas por la ciruga con circulacin extracorprea Patogenia La CEC se complica de hemorragias en 5-10% de los pacientes, frecuencia bastante mayor que la ciruga comn. Aunque en ms de 50% de los casos esta complicacin es de causa quirrgica, el resto responde a una alteracin del sistema hemosttico. Descontando el hecho de que una proporcin de pacientes llega a la ciruga usando drogas antiplaquetarias, la patogenia del transtorno hemosttico es multifactorial: heparinizacin del paciente, disminucin de la concentracin de plaquetas y factores de la coagulacin por hemodilucin y consumo, activacin de la fibrinolisis, contacto de la sangre con superficies no biolgicas, hipotermia, traumatismo celular, interfase gassangre, perturbaciones reolgicas. Sin embargo, la ms significativa de las alteraciones es la disfuncin plaquetaria asociada a la CEC, un factor causal mayor de hemorragia, y presente tanto con el uso de oxigenadores de burbuja como de membrana. Los potenciales factores adversos presentes durante la CEC que explicaran las alteraciones cuantitativas y funcionales de las plaquetas actan a travs de activacin plaquetaria, fragmentacin celular y dao de membrana: (a) La activacin plaquetaria puede ser causada por varios factores: adhesin y agregacin de las plaquetas a fibringeno adsorbido en super ficies del cir cuito extracorpreo, trauma mecnico, exposicin de las plaquetas a trazas de trombina, plasmina, ADP o proteasas derivadas de activacin del complemento, hipotermia o, en el caso de los oxigenadores de burbuja, a la interfase airesangre; (b) La fragmentacin celular, inducida por el traumatismo fsico, la activacin de las plaquetas o la activacin del complemento, produce micropartculas plaquetarias que circulan y exponen fosfolpidos procoagulantes; (c) El dao de membrana se expresa en reduccin del nmero de receptores de fibringeno, de GPIb, o de receptores 2 adrenrgicos. Todas estas noxas se traducen en prolongacin del TS, reduccin de la agregacin y secrecin plaquetarias ex vivo, reduccin de la aglutinacin plaquetaria con ristocetina, deficiencia del compartimiento de depsito por liberacin de contenidos de grnulos densos y alfa y aparicin de micropartculas plaquetarias en la circulacin. En general, la intensidad de las alteraciones plaquetarias est relacionada a la duracin de
la CEC y ellas revierten espontneamente varias horas despus de terminada la ciruga. Dicha reversibilidad es un factor importante a considerar cuando se evala reintervenciones quirrgicas en pacientes con hemorragias a travs de drenajes, pues el tiempo juega a favor de la resolucin espontnea de la complicacin. Tratamiento No est demostrado que la realizacin de TS preoperatorio identifique a los pacientes con tendencia a sangrar ms durante la ciruga con CEC y sin historia clnica previa de hemorragias anormales. La transfusin profilctica de plaquetas para prevenir una excesiva hemorragia quirrgica no es una buena indicacin en el paciente habitual, pero la transfusin debe estar fcilmente accesible en enfermos con reintervenciones o con cirugas prolongadas. La complicacin hemorrgica se controla habitualmente bien mediante la transfusin de plaquetas. Estos pacientes tambin pueden responder a la infusin de DDAVP. Si la hemorragia no es controlada con estas medidas, generalmente se considera la reexploracin quirrgica para identificar el sitio dominante de la hemorragia. En los ltimos aos se ha propiciado el uso de aprotinina, un pptido inhibidor de sernproteasas, para reducir el sangrado intra y postoperatorio y limitar el empleo de transfusiones en pacientes sometidos a ciruga con CEC. El efecto de la aprotinina sera mediado por su accin anticoagulante, antifibrinoltica y, posiblemente, antiinflamatoria. No existe evidencia suficiente an para afirmar que la droga reduce la activacin plaquetaria inducida por plasmina y otras proteasas. La dosificacin usual de aprotinina (280 mg en 20 minutos inmediatamente antes de la ciruga, 280 mg en la solucin de cebado del circuito e infusin continua de 70 mg/hora durante la operacin), se ha demostrado que reduce significativamente el sangrado en estos pacientes. El uso repetido de aprotinina puede complicarse con reacciones anafilcticas al pptido. Estudios recientes revelan que el cido tranexmico, en dosis de 1g intravenoso en 20 minutos antes de la incisin quirrgica, 500 mg en la solucin de cebado e infusin continua de 400 mg/hora durante la operacin, tiene un efecto similar a la aprotinina en el control del sangrado en pacientes con ciruga con CEC electiva. El costo del cido tranexmico es significativamente menor que el de aprotinina, un aspecto muy importante a considerar cuando se decide la
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terapia en estos pacientes. Se estn introduciendo al uso clnico circuitos extracorpreos recubiertos de heparina para limitar la activacin de la coagulacin y de las plaquetas. Los primer os resultados son satisfactorios en cuanto reducen la activacin plaquetaria in vivo y la prdida de sangre postoperatoria. a4) Disfuncin plaquetaria en leucemias, mielodisplasias y disproteinemias Patogenia Variadas alteraciones morfolgicas y funcionales de las plaquetas se han descrito en enfermedades mieloproliferativas crnicas: alteraciones de forma y tamao, alteraciones de agregacin y secrecin en respuesta a agonistas habituales (ADP, epinefrina, colgeno), defecto de actividad procoagulante. Estas anomalas pueden originarse a nivel de receptores para algunos agonistas en la membrana plaquetaria, en la liberacin y metabolizacin del cido araquidnico, en la transduccin de estmulos o en deficiencia de contenidos granulares. Alrededor de 30% de los pacientes pueden presentar hemorragias mucocutneas en algn momento de su evolucin. Paradjicamente, en este grupo de enfermedades, una proporcin de enfermos puede tambin complicarse con trombosis arterial o venosa. No existe factores que anticipen el riesgo de hemorragia o trombosis en estos pacientes y las pruebas de laboratorio comnmente usadas (TS, conteo de plaquetas, agregacin y secrecin plaquetaria in vitro), no sirven para predecir el riesgo de una u otra complicacin. Alteraciones similares a las anteriores se han descrito en leucemias agudas, sndromes mielodispsticos y leucemia por clulas peludas. Sin embargo, es la trombopenia habitual de estas enfer medades la que condiciona mayormente el riesgo de hemorragia. Anomalas de la funcin plaquetaria se observan tambin en pacientes con mieloma mltiple IgA, IgG, macroglobulinemia de Waldenstrm y, ocasionalmente en gammapata monoclonal benigna. El TS puede estar prolongado as como puede observarse alteraciones de agregacin y secrecin plaquetarias, retraccin del cogulo
y limitacin de la actividad procoagulante de las plaquetas. Los defectos plaquetarios son causados por la protena monoclonal y estn directamente relacionados a la concentracin de la paraprotena, que puede adsorberse a la membrana plaquetaria. En efecto, la anomala puede corregirse al normalizar la concentracin de la protena o puede reproducirse al incubar plaquetas nor males con el plasma disproteinmico. Debe tenerse claro que estas afecciones se asocian a otras causas de hemorragia, como sndrome de hiperviscosidad, trombocitopenia por compromiso medular, amiloidosis con deficiencia adquirida de factor X, activacin de la fibrinolisis y alteraciones en la polimerizacin de la fibrina. En la mayora de los casos, una o ms de estas anomalas explican la hemorragia. Tratamiento La prevencin y manejo de hemorragias estn orientados al control de la enfermedad basal. Como las alteraciones son intrnsecas a las plaquetas, la transfusin de plaquetas es la terapia de eleccin, aunque de efecto transitorio. 3.2.2. Disfunciones plaquetarias inducidas por drogas y alimentos El uso de drogas es la causa ms frecuente de disfuncin plaquetaria adquirida, y la lista de drogas reportadas con efecto antiplaquetario supera las 100. La importancia clnica de este efecto es variada: slo para escasas drogas que prolongan el TS existe evidencia inequvoca de asociacin causal a hemorragias; otras se asocian a pr olongacin del TS, per o no se ha demostrado que su empleo cause sangrado patolgico; en fin, otras pueden solamente afectar la funcin de las plaquetas ex vivo o in vitro. En relacin a drogas involucradas en hemorragias, su efecto antiplaquetario no es habitualmente suficiente por s para causar una hemorragia en individuos sanos, pero su combinacin con otras condiciones que afectan la hemostasia (por ej., ciruga, infecciones, enfermedad de von Willebrand subyacente, tratamiento anticoagulante), exacerban el riesgo de sangrado patolgico. Un listado con drogas asociadas a disfuncin plaquetaria se presenta en la tabla 21-14.
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Tabla 21-14. Drogas y otras sustancias que inhiben la funcin plaquetaria Antiinflamatorios no esteroidales Aspirina Indometacina, naproxeno, ibuprofeno, diclofenaco, fenilbutazona, otros Sustancias desarrolladas primariamente como drogas antiplaquetarias Inhibidores del receptor de ADP: ticlopidina, clopidogrel Antagonistas de GPIIb-IIIa: anticuerpos monoclonales (abciximab), pptidos cclicos (epitifibatide), peptidomimticos (tirofiban, lamifiban) Antibiticos -lactmicos: penicilinas, cefalosporinas. Otros: nitrofurantonas, miconazole Drogas que afectan la hemostasia: anticoagulantes, fibrinolticos, antifibrinolticos. Heparina Estreptoquinasa, activador tisular del plasmingeno, uroquinasa Otros: sulfato de protamina, cido e-aminocaproico Drogas que aumentan el cAMP y cGMP plaquetarios Dipiridamole, prostaciclina y anlogos Nitroglicerina y smiles, nitroprusiato Otras drogas usadas en enfermedades cardiovasculares Diltiazem, nifedipino, nimodipino, verapamil, quinidina Expandidores de volumen Dextrano, hidroxietil-almidn Drogas psicotrpicas Amitriptilina, imipramina, nortriptalina, clorpromazina, flufenazina, prometazina, trifluoperazina, haloperidol Anestsicos Locales: procana, tetracana, cocana, butacana, dibucana, otras... Generales: halotano Drogas oncolgicas Daunorrubicina, mitramicina, BCNU, quimioterapia combinada, vincristina, otros Antihistamnicos Clorfeniramina, difenilhidramina, otros. Medios de contraste Iopamidol, iotalamato, ioxalato, diatrizoato Etanol Alimentos, especias y vitaminas cidos grasos omega-3, extracto de cebolla, ajoene, crcuma, comino, vitaminas E y C, otros.
(Tabla adaptada de George J.N. y Shattil S.J., N Engl J Med 1991; 324: 27-39).
Algunas drogas han sido especficamente diseadas para interferir la funcin plaquetaria y ser usadas en la prevencin o tratamiento de trombosis arteriales. Entre ellas, ticlopidina y clopidogrel, (dirigidas contra el receptor P2Y12 del ADP en plaquetas), y antagonistas del complejo glicoproteico IIb-IIIa (anticuerpos monoclonales, pptidos cclicos y peptidomimticos). Otros analgsicos antiinflamatorios, como la aspirina y el grupo de los antiinflamatorios no esteroideos, no diseados originalmente como antitrombticos, inhiben tambin la funcin plaquetaria. Aunque esta alteracin se puede asociar a prolongacin
del TS, prueba que mide hemostasia primaria in vivo, una minora de los pacientes presenta sntomas hemorrgicos derivados de su empleo. b1) Aspirina y antiinflamatorios no esteroideos (AINE) La aspirina (cido acetilsaliclico) es la droga que acumula la evidencia ms convincente de que su accin antiplaquetaria tiene relacin con sangrado anor mal. La aspirina acetila irreversiblemente la serina en posicin 529 de la ciclooxigenasa plaquetaria, cerca del sitio cataltico de la enzima. El grupo acetilo obstruye
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el canal hidrofbico de la enzima por donde el cido araquidnico accede a su sitio activo, bloqueando as su metabolizacin a endoperxidos cclicos PGG2 y PGH2, y por ende, la sntesis de tromboxano A 2. Esta inhibicin ocurre por toda la vida de la plaqueta en la cir culacin. Por su parte, los antiinflamatorios no esteroideos, como el ibuprofeno, inhiben en forma competitiva, reversible, el sitio cataltico de la ciclooxigenasa, bloqueando la sntesis de tromboxano por algunas horas, mientras dura el efecto de la dosis administrada. La aspirina y AINEs prolongan el TS y bloquean la agregacin y secrecin plaquetarias, sin afectar la adhesividad. En individuos sanos la prolongacin del TS causada por aspirina en dosis nica tan baja como 80 mg/kg es modesta (1.2 a 2 veces el tiempo pre-droga). La prolongacin del TS es significativamente mayor en individuos con defectos hemostticos preexistentes, hereditarios o adquiridos, por ej., en individuos con hemofilia o enfermedad de von Willebrand o en pacientes urmicos. La anormalidad en la agregacin plaquetaria inducida por aspirina puede durar hasta una semana, hasta que una suficiente proporcin de plaquetas no afectadas reemplace en la circulacin a las inhibidas por la droga. Idntico efecto pr oduce la aspirina sobre la ciclooxigenasa endotelial; sin embargo, ste es de corta duracin, presumiblemente por la capacidad de la clula endotelial de resintetizar ciclooxigenasa. En contraste con la aspirina, la prolongacin del TS inducida por la mayora de los AINEs es de corta duracin, usualmente, 48 horas. El significado clnico de la ingestin de aspirina sobr e la hemostasia de individuos aparentemente sanos es poco claro. Si bien aumenta la frecuencia e intensidad de equmosis, epistaxis y prdida de sangre por el tubo digestivo, estas manifestaciones son habitualmente de poca relevancia clnica. La gastritis hemorrgica ocasionalmente se asocia al uso de aspirina. Algunos estudios revelan aumento del sangrado quirrgico, especialmente en ciruga con CEC, en pacientes bajo efecto de aspirina, pero otros no confirman estos hallazgos; en todo caso, ellos no se acompaan de mayor morbilidad perioperatoria. Se recomienda, sin embargo, evitar el uso de aspirina en cirugas en que an sangrados de baja magnitud son riesgosos, por ejemplo, neurociruga, ciruga ocular. Debe tenerse en cuenta, adems, que el etanol u otras drogas
con efecto antiplaquetario pueden potenciar la inhibicin inducida por aspirina. b2) Antibiticos -lactmicos Varios antibiticos que comparten un anillo lactmico prolongan el TS y alteran la agregacin plaquetaria y la aglutinacin inducida por ristocetina. Dicho efecto est relacionado a la dosis, aparentemente es reversible, y es muy frecuente en el ambiente clnico hospitalario. El efecto aparece 1-3 das despus del inicio de la terapia y se observa especialmente en pacientes que reciben altas dosis de estos antibiticos. Sin embargo, el contexto clnico en que se observa el defecto, (enfermos graves y con otras alteraciones hemostticas), impide atribuir las eventuales hemorragias a la disfuncin plaquetaria. b3) Heparina y fibrinolticos La heparina no slo inhibe la generacin y accin de trombina, sino tambin afecta la funcin plaquetaria. Esta accin parece estar mediada por la menor disponibilidad de trombina, por interaccin de la heparina con receptores plaquetarios y por reduccin de las funciones plaquetarias dependientes de FVW, posiblemente por unin de heparina a dominios especficos del FVW. Sin embargo, no existe evidencia directa que culpe a las plaquetas de contribuir a las hemorragias causadas por la terapia con heparina. El uso en dosis far macolgicas de estreptoquinasa, activador tisular del plasmingeno (t-PA) y de uroquinasa se asocia a hemorragia. En su patogenia se reconoce efecto combinado de la hiperfibrinolisis y de lesiones de vasos sanguneos. La generacin intravascular de plasmina altera la funcin plaquetaria por varios mecanismos, observndose tanto efectos de activacin in vivo, como inhibicin de la funcin plaquetaria: sta puede explicarse por refractariedad posterior a su activacin, por inhibicin de la agregacin inducida por las altas concentraciones de productos de degradacin de fibringeno/fibrina, por degradacin de GPIb y posiblemente de GPIIb-IIIa, y por desagregacin de plaquetas mediada por efecto de plasmina sobre el fibringeno que est cohesionando las plaquetas en un agregado. En todo caso, no existe evidencia slida que implique a estos defectos plaquetarios en la patogenia de las hemorragias observadas
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durante el tratamiento tromboltico. Sin embargo, adems de la suspensin de las drogas fibrinolticas y de la reposicin de fibringeno, empricamente se transfunde plaquetas para mejorar la hemostasia primaria en estos pacientes. b4) Drogas que aumentan la concentracin de cAMP y cGMP en plaquetas El aumento de cAMP en las plaquetas prolonga el TS e inhibe la activacin plaquetaria. Dicho aumento es inducido por drogas que estimulan la adenilil ciclasa (infusin de PGE1, prostaciclina y anlogos estables) as como por drogas que inhiben la fosfodiesterasa plaquetaria (dipiridamol, cafena, teofilina). Sin embargo, no existe evidencia inequvoca que el empleo de estas sustancias se complique de hemorragias. La inhalacin de NO y drogas que aumentan el cGMP en las plaquetas, como nitroprusiato, producen inhibicin de la agregacin/secrecin plaquetarias y prolongan el TS; sin embargo, la traduccin clnica de estas observaciones no se conoce. b5) Expansores de volumen El dextrano 40 o 70 kDa infundido se adsorbe a la superficie de las plaquetas y puede interferir la agr egacin, secrecin y actividad procoagulante plaquetarias por varias horas. Dichos efectos se acompaan en una proporcin de pacientes con prolongacin del TS. Por estas razones se ha usado el dextrano en la profilaxis de trombosis perioperatoria. No se ha reportado sangrado excesivo con su empleo, excepto si se asocia a heparina. Tambin, altas dosis de hidroxietil almidn (> 20 ml/kg) pueden predisponer a sangrado anormal, especialmente si se asocia a heparina en dosis profilctica. b6) Otras sustancias y frmacos Como se enumera en la tabla 21-14, numerosas otras drogas, alimentos o condimentos se han relacionado con inhibicin de la funcin plaquetaria. La traduccin clnica de estos efectos es infrecuente, de poca relevancia, y su comunicacin en la literatura es mayoritariamente anecdtica. La irrelevancia clnica de estos efectos se ejemplifica con el uso de inhibidores de la recaptura de serotonina en el tratamiento de la enfermedad depresiva; consistentemente inducen una reduccin del contenido de serotonina intraplaquetaria, lo que se puede reflejar en un falso defecto de la
secrecin plaquetaria ex vivo cuando la prueba se realiza mediante marcaje de plaquetas con serotonina radioactiva; sin embargo, estas drogas no afectan el TS y la agregacin plaquetaria es nor mal. Asimismo, existe abundante literatura que relaciona el efecto de los cidos grasos omega-3 con la reduccin de agregacin/secrecin plaquetarias y prolongacin del TS. En este caso los cidos omega -3, entre ellos el eicosapentaenoico, desplazan parcialmente al cido araquidnico en los fosfolpidos de membrana, disminuyendo la pr oduccin de tromboxano A 2 ; simultneamente, la metabolizacin de eicosapentaenoico concluye en la generacin de tromboxano A3, sin la capacidad agonista de las plaquetas y actividad vasoconstrictora que tiene el tromboxano A2. Sin embargo, la ingestin de cidos grasos omega-3 o de peces ricos en estas sustancias, no se asocia con sangrado anormal. Extractos de cebolla, ajoene, que corresponde a un compuesto obtenido del ajo, crcuma y otros condimentos y alimentos tambin son inhibidor es de la funcin plaquetaria, sin mayor relevancia en sangrado anormal.
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HEMATOLOGA
Captulo
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HEMOFILIAS, ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND Y OTRAS ALTERACIONES HEREDITARIAS DE LA COAGULACIN

Mario Donoso S., Ivn Palomo G., Carmen Gloria Artigas A. y Jaime Pereira G.
1. Introduccin 2. Hemofilia 2.1. Hemofilia clsica o tipo A 2.2. Hemofilia tipo B 2.3. Diagnstico 2.4. Cuadro clnico y conducta 2.4.1. Conceptos generales 2.4.2. Sangrado en sitios especiales 2.4.3. Rehabilitacin 2.4.4. Procedimientos diagnsticos y teraputicos 2.4.5. Inhibidores 2.5. Terapia de reemplazo 2.5.1. Tipos de terapia de reemplazo 2.5.2. Clculo de dosis del factor a administrar 2.5.3. Forma de administrar el factor deficitario 2.6. Terapia gnica 2.7. Terapia asociada 3. Enfermedad de von Willebrand 3.1. Factor von Willebrand 3.1.1. Estructura 3.1.2. Biosntesis y secrecin 3.1.3. Funcin 3.1.4. Regulacin de los niveles sanguneos
3.2. Clasificacin y patologa molecular de la enfermedad de von Willebrand 3.2.1. EvW tipo 1 3.2.2. EvW tipo 2 3.2.3. EvW tipo 3 3.3. Clnica 3.4. Diagnstico 3.4.1. Pruebas de screening 3.4.2. Pruebas especficas 3.4.3. Pruebas para diagnstico de subtipos 3.5. Tratamiento 4. Otras alteraciones hereditarias de la coagulacin 4.1. Alteraciones de fibringeno 4.1.1. Afibrinogenemia 4.1.2. Disfibrinogenemia 4.2. Dficit de factor XIII 4.3. Dficit de protrombina 4.4. Dficit de factor V 4.5. Dficit de factor VII 4.6. Dficit de factor X 4.7. Dficit de factor XI 4.8. Dficit de factor XII 4.9. Dficit de precalicrena 4.10. Dficit de kiningeno de alto peso molecular (HMWK) 4.11. Deficiencia de 2 antiplasmina
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RESUMEN
En este captulo se describen los aspectos ms relevantes de las enfermedades hemorragparas hereditarias de la coagulacin. Las hemofilias se clasifican en tipo A y B, segn se trate de una deficiencia del factor VIII IX, respectivamente. Ambas alteraciones son hereditarias y estn ligadas al cromosoma X, por lo cual la mayor frecuencia se presenta en en varones. Generalmente los nios heredan un gen mutado (XH) de su madre portadora (XH/X), pero cerca del 30% de los casos sufren una mutacin espontnea, sin historia familiar de hemofilia. El diagnstico se establece con pruebas de coagulacin para determinar la concentracin plasmtica del factor VIII y IX. Las Hemofilias dependiendo de la deficiencia del factor involucrado, se clasifican en leves, moderadas o graves. La Enfermedad de von Willebrand (EvW) es considerada el trastorno ms frecuente de la hemostasia, caracterizada por un defecto cuantitativo y/o funcional del factor von Willebrand (FVW). El FVW es una glicoprotena adhesiva de alto peso molecular sintetizada por las clulas endoteliales y los megacariocitos; juega un rol fundamental en la hemostasia primaria y tiene la capacidad de unirse y transportar al FVIII coagulante (FVIII:C). Dependiendo de la deficiencia, la EvW se ha clasificado en tres tipos principales. La EvW tipo 1 se caracteriza por alteraciones cuantitativas parciales del FVW; la EvW tipo 2 corresponde a alteraciones cualitativas o disfuncionalidad del FVW y de acuerdo al fenotipo de la enfermedad la EvW tipo 2 se divide en cuatro variantes 2A, 2B, 2M y 2N; la EvW tipo 3 se refiere a la deficiencia total o presencia de trazas de FVW, siendo la forma grave de la enfermedad. El diagnstico de la EvW depende de varias pruebas de laboratorio. Aunque con menos frecuencia que el dficit del FVW y los factores VIII y IX, tambin se puede presentar dficit o alteraciones funcionales de otros factores: fibringeno, factor XIII, protrombina, factor V, factor VII, factor X, factor XI, factor XII, precalicrena y kiningeno de alto peso molecular.
1. INTRODUCCIN Las enfermedades hemorragparas son una importante causa de consulta mdica, y su diagnstico, si bien puede ser sugerente desde el punto de vista clnico, requiere de la participacin del laboratorio. Las hemofilias han sido consideradas graves trastornos de la coagulacin sangunea. La hemofilia A se caracteriza por una deficiencia del factor VIII y la hemofilia B por la deficiencia del factor IX, siendo ms frecuente la primera. La EvW se caracteriza por disminucin de la cantidad o alteracin de la funcin del FVW y es mucho mas frecuente que la hemofilia A. Otros factores de la coagulacin, aunque con menos frecuencia que la EvW y las hemofilias, tambin se pueden ver afectados, en cantidad y/o funcin; a modo de ejemplo: fibringeno, protrombina, factor VII, factor X y factor XI. 2. HEMOFILIA La hemofilia es una patologa de la cual todos han escuchado algo, con diversos enfoques y
niveles de conocimiento, casi siempre asociados a una gran cantidad de mitos que no corresponden ni superan, la realidad de sus caractersticas. Es una enfermedad hemorrgica congnita que cursa con deficiencia de los factores de la coagulacin VIII o IX. Estas deficiencias estn ligadas al cromosoma X, de rasgos recesivos, con manifestaciones clnicas de riesgo hemorrgico y daos articulares, y que se transmiten por las mujeres y son padecidas por los hombres. Estas deficiencias se deben a distintos tipos de mutaciones ya sean puntuales, deleciones, inserciones, inversiones o grandes reorganizaciones en los genes que codifican estas protenas. Todos los episodios de sangrado en los pacientes con hemofilia se expresan como emergencia mdica. La gran carga de enfermedad que genera la hemofilia la transforma en una patologa indicadora de la capacidad y calidad de gestin para implementar el diagnstico y seguimiento de las discrasias trombo-hemorrgicas y de la medicina transfusional de un pas.
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2. 1. Hemofilia clsica o tipo A La hemofilia A es producida por el dficit cuantitativo del factor VIII coagulante; es congnita, hereditaria, ligada al sexo y con una tasa de mutacin en la cual cerca de un 40% de los casos no tiene antecedentes familiares conocidos (mutaciones de novo). Su frecuencia, vlida para todas las poblaciones humanas, se estima entre 15-20/10.000 varones. Gen y FVIII El gen del factor VIII est localizado en la regin distal del brazo largo del cromosoma X a nivel de la banda Xq28. Tiene una longitud de 186 kb y presenta 25 intrones y 26 exones. El gen codifica un mRNA de 9 kb, que traduce una protena de 2351 aminocidos (Aa), que incluyen un pptido seal de 19 Aa y una protena madura de 2332 Aa. La estructura primaria del FVIII muestra 3 tipos distintos de dominios incluyendo una regin triplicada de aproximadamente 330 Aa (dominios A), una regin nica de 980 Aa (dominio B) y una regin carboxi-terminal duplicada de 150 Aa (dominios C), las que estn en el siguientes orden: NH2.A1-A2-B-A3-C1-C2.COOH (ver captulo 20). Alteraciones genticas Las alteraciones genticas descritas en hemofilia A incluyen sustituciones nucleotdicas puntuales, deleciones, inserciones, duplicaciones e inversiones: Sustituciones nucleotdicas puntuales. Constituyen en conjunto, el tipo de mutacin ms frecuente en la hemofilia A. Las mutaciones nonsense (aparicin de un codn stop produciendo la interrupcin temprana de la sntesis del FVIII) corresponden a pacientes con hemofilia A severa; en cambio las mutaciones puntuales encontradas en hemofilia A moderada o leve del tipo missense (aparicin de un codn correspondiente a un Aa distinto). Este ltimo tipo de mutaciones tambin se encontr en pacientes con el fenotipo severo. El fenotipo clnico de la hemofilia A en distintos pacientes con la misma mutacin puntual, no siempre resulta igual. Deleciones. Las deleciones observadas van desde 1 a 210 kb. El 95% de las deleciones se asocia con el fenotipo severo. Los pacientes con hemofilia A severa causada por deleciones, presentan cinco veces ms riesgo de desarrollar
inhibidor que aquellos con otro tipo de mutacin. Inserciones. Se han descrito pocos casos de inactivacin insercional del gen del FVIII y todos ellos conducen a hemofilia A severa. Dos de ellos involucran la insercin, en el exn 14, de secuencias ajenas al gen del FVIII como es el elemento L1 (secuencias repetitivas humanas que representan retro-transposones no virales). Duplicaciones. Las duplicaciones son inusuales. La duplicacin de 23 kb del intrn 22 insertado entre los exones 23 y 24. Inversiones. Una disrupcin del gen del FVIII, debida a una inversin que separa a los exones 1-22 de los exones 23-26, aproximadamente en 500 Kb, es infrecuente. Esta inversin es el resultado de una recombinacin homloga intracromosmica, debida a la presencia de secuencias repetidas denominadas F8A, que transcriben en forma opuesta y que estn presentes en el brazo Xq, fuera y dentro del intrn 22 del gen del FVIII. Laboratorio y tratamiento: aspectos generales. El diagnstico de laboratorio se basa en la cuantificacin del factor VIII fraccin coagulante. El tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) oscila desde normal hasta muy prolongado. El tiempo de sangra (mtodo de Ivy) y recuento plaquetario pueden ser normales (ver punto 4 y captulo 31). Los recursos teraputicos biolgicos que se utilizan son los crioprecipitados. Son una buena alter nativa en ausencia de concentrados liofilizados que son la mejor opcin por la elevada seguridad biolgica, facilidad de transporte y administracin, previa capacitacin del enfermo y su entorno (ver punto 7). 2.2. Hemofilia tipo B La hemofilia B, producida por el dficit cuantitativo del factor IX, es congnita, hereditaria, ligada al sexo y con una frecuencia aproximada de 1,5/100.000 habitantes. Gen y FIX El gen del factor IX est localizado en la regin distal del brazo largo del cromosoma X a nivel de la banda Xq27.1-27.2. ste tiene una longitud de 34 kb, contiene 7 intrones y 8 exones que codifican una protena madura de 415 aminocidos. La estructura comienza con
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el amino terminal Tyr; los primeros 46 residuos son producidos por el segundo y tercer exn, y comprenden la regin Gla; los residuos 47 a 127 representan las dos regiones homlogas al factor de crecimiento epidrmico (EGF); los aminocidos 128 a 195 son codificados por el exn 6; los finales 220 residuos son codificados por los 2 ltimos exones y contienen los componentes del sitio activo, el carboxilo terminal o Aa 415 Thr. Alteraciones genticas Ms de 2.100 mutaciones estn registradas en una base de datos internacional (www.kcl.ac.uk/ ip/petergreen/haemBdatabase.html). Muchos pacientes con hemofilia B tienen mutaciones puntuales; la naturaleza de las mutaciones determina los niveles de actividad del FIX. Ms de un tercio de las mutaciones afecta a residuos de arginina, donde se produce una mutacin de tipo nonsense, resultando una molcula disfuncional. Un primer grupo de mutaciones consiste en grandes deleciones y reordenamiento causando deficiencia severa de FIX. Estos pacientes son propensos a desarrollar reacciones anafilcticas graves cuando comienzan con la terapia de reemplazo; estas reacciones se asocian con el desarrollo de inhibidores del FIX. El segundo grupo consiste en el fenotipo Leyden que es causado por varias mutaciones diferentes en la regin promotora del gen FIX. En estos pacientes los niveles de FIX son menores del 1% en la infancia, pero en la pubertad ellos aumentan gradualmente los niveles del factor y alcanzan niveles hasta 70%; en estos pacientes, el gen del FIX solo llega a ser transcripcionalmente activo despus de la pubertad bajo la influencia de la testosterona. El tercer grupo involucra mutaciones missense en la secuencia del propptido del FIX, resultando en una marcada disminucin de la afinidad del factor anormal por la carboxilisa dependiente de vitamina K. Estos pacientes tienen niveles normales del FIX, pero debido a la marcada sensibilidad a antagonistas de la vitamina K, luego de la administracin de anticoagulantes orales, desarrollan una severa reduccin de FIX, que incrementa el riesgo de sangrado. Dos diferentes mutaciones del tipo missense en la alanina 10 han sido descritas: alanina por valina y alanina por treonina. La alanina 10 del dominio del pro-pptido, est en una posicin esencial para el enlace de la
carboxilasa que modifica los residuos del cido glutmico en el dominio GLA. Laboratorio y tratamiento: aspectos generales. El diagnstico de laboratorio se basa en la cuantificacin del factor IX. El TTPA se puede presentar desde normal hasta muy prolongado (ver punto 4 y captulo 31). El tiempo de sangra y recuento plaquetario pueden ser normales. Los recursos teraputicos biolgicos que se utilizan son el plasma fresco y los concentrados liofilizados; estos ltimos, al igual que en la hemofilia A, son la mejor opcin por la elevada seguridad biolgica, facilidad de transporte y administracin, previa capacitacin del enfermo y su entorno (ver punto 7). 2.3. Diagnstico El diagnstico de hemofilia debe estar basado en una cuidadosa y exhaustiva anamnesis pasiva y activa. El antecedente clnico prima sobre los resultados de exmenes bsicos de laboratorio de coagulacin. Slo la cuantificacin del factor deficiente y los estudios complementarios, como funcin plaquetaria y otros, permiten establecer un adecuado diagnstico diferencial con otros sndromes hemorragparos. Los elementos anamnsticos a considerar son los siguientes: a) Todo sangrado desproporcionado a la causa que lo origin, amerita investigacin acusiosa. Debe tenerse presente que los sangrados espontneos no existen; al trauma subliminal no se le adjudica adecuadamente su real valor. Por lo anterior, las actividades de la vida diaria son un trauma permanente, incluido el estrs patolgico en el mbito psquico o social, que juega un importante rol predisponente o agravante. b) Hay que considerar cuidadosamente la pr esencia de equmosis, hematomas, hemartrosis, epistaxis, alveolorragias postextraccin dentaria, hematuria, sangrado quirrgico inmediato o tardo de cualquier magnitud, sin relacin a la complejidad del cuadro clnico o la tcnica utilizada. El sangrado exagerado en las mujeres de la familia, objetivado su historia gineco-obsttrica, como menstruaciones, abortos, partos, cesreas o la magnitud del sangrado en las primeras relaciones sexuales tienen gran valor predictivo.
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La tabla 22-1 muestra una clasificacin clnica de los pacientes con hemofilia.
Tabla 22-1. Clasificacin clnica de las personas con hemofilia A o B Hemofilia severa Concentracin Generalmente 1% plasmtica del factor Causas de sangrados Frecuencia de sangrados Desarrollo de hemartrosis Hemofilia moderada Generalmente entre el 1-5% Hemofilia leve Generalmente 5% Pueden sangrar con lesiones importantes, y ciruga. Podran nunca tener un problema hemorrgico Raramente
Hemorragias espontneas Pueden sangrar por lesiones insignificantes 1 a 2 veces por semana Todos los pacientes Aproximadamente 1 vez al mes Podra presentar
El TTPA puede ser normal y si es anormal, sugiere hemofilia tipo A o tipo B, condicin frustra, mujeres portadoras de hemofilia u otras coagulopatas adquiridas o congnitas, se utiliza para monitorear tratamiento con heparina de alto peso molecular o detectar presencia de inhibidores. El tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de sangra (mtodo de Ivy) generalmente son normales. Ante sospecha clnica estos resultados justifican cuantificar los factores VIII y IX. Otros exmenes de sangre pueden estar acorde con la condicin general o especfica de salud del paciente. Las radiografas articulares pueden mostrar desde normalidad a severas alteraciones de partes blandas y duras. Slo imageneologa de muy alta resolucin puede mostrar alteraciones en etapas incipientes. No es aconsejable hacerlas en forma seriada si no hay una relacin causa / efecto directa en lo teraputico inmediato. La tomografa axial computarizada tiene gran valor diagnstico. La resonancia nuclear magntica puede detectar precozmente pseudotumores hemoflicos y hematomas de escaso volumen especialmente en el sistema nervioso central. Las ecotomografas slo son tiles en control evolutivo de hematomas conocidos u ocultos de mayor volumen. El diagnstico diferencial, puede plantear dificultades. En estos casos es necesario considerar la coexistencia de otras patologas congnitas y adquiridas, especialmente aquellas relacionadas con enfermedades transmitidas por sangre o derivados.
2.4. Cuadro clnico y conducta 2.4.1. Conceptos generales Dada la especial carga sicolgica y social que denota el sangrado -en cualquiera circunstancia- se recomienda desde el primer momento, tranquilizar al enfermo y su familia, escuchndole con la mayor atencin su opinin en la etiologa de la hemorragia y en la orientacin teraputica, pero al mismo tiempo, estar muy atento a la posibilidad de que el enfermo baje el perfil de gravedad de la situacin debido a la angustia, negacin o ambas que sobre el problema de base (hemofilia) o sobreagregado (hemorragia, complicaciones o secuelas). El primer episodio bien tratado condiciona la evolucin y el pronstico posterior y se evitan complicaciones y secuelas permanentes, por lo que ante la duda siempre debe aplicarse terapia de remplazo (TR) y/o terapia asociada (TA), fro y/o compresin local antes de iniciar cualquier procedimiento diagnstico. No deben aplicarse inyectables intramusculares y siempre, y tan pronto como se pueda, se deben extraer todos los cogulos con posterior aseo quirrgico y aplicacin de TR y TA con el objeto de no aumentar las superficies sangrantes y, por tanto consumo de factores. Con el mismo propsito, en ciruga se debe evitar al mximo la elecrocoagulacin dando mxima preferencia a la sutura anatmica y la derivacin a centro especializado. La obtencin de muestras para
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exmenes complementarios slo se har luego de iniciar la TR y TA. 2.4.2. Sangrado en sitios especiales Sistema nervioso central. En pacientes hemoflicos toda cefalea es un proceso expansivo intracraneano hemorrgico, hasta demostrar lo contrario. Los sangrados intracraneanos son responsables hasta del 70% de las muertes de estos pacientes dentro de las primeras 72 horas por ausencia de un adecuado y oportuno diagnstico y/o ausencia de tratamiento en calidad y cantidad. En el sistema nervioso perifrico la gravedad se expresa por la compresin de estructuras nobles. Cuello, garganta, trax, aparato digestivo y abdomen. En estas localizaciones todas las hemorragias tienen extremo potencial de gravedad por compresin de estructuras nobles o capacidad de hemorragia exsanguinizante en corto tiempo. El abdomen per se presenta grandes dificultades de diagnstico diferencial porque pr esentan clnica y exmenes complementarios similares con la patologa abdominal habitual. Por ejemplo, la hemorragia que afecta al msculo psoas ilaco y las estructuras nerviosas que lo atraviesan complican el diagnstico diferencial con apendicitis aguda, hemartrosis coxofemoral, hemorragia renal o de la va urinaria. Hemartrosis. Las hemartrosis son la primera causa de consulta, conlleva dolor exquisito, progresivo e invalidante. Es la causa de graves deformaciones msculo-esquelticas y consiguiente severo dao e impacto sicosocial. Es imprescindible tener presente que slo basta la declaracin del enfermo que siente dolor o de hemorragia, situacin conocida como aura para que exista una hemartrosis incipiente que debe ser tratada inmediatamente instaurando TR y TA. Adems es caracterstica la ausencia de la causa / efecto con la magnitud del trauma al cual se le podra adjudicar la etiologa del episodio hemorrgico. El uso de vendas en las rodillas es aceptable slo si se aplican con criterio de prevencin en la formacin de vrices; el ejercicio permanente y sistemtico, y estimulado por el entorno (familia y equipo de salud) fortalece los msculos lo que genera, articulaciones protegidas, secrecin de endorfinas, mejora de la autoestima sicolgica y fsica, autonoma y autovalencia. Hematomas. Los hematomas constituyen una
emergencia mdica y son la segunda causa de consulta. Los hematomas simples como las equimosis, habitualmente slo requieren compresin y fro local. Los hematomas complicados generan un tercer espacio por hemorragia persistente de instalacin subrepticia o veloz y que comprometen estructuras nobles y afectan en forma severa y permanente, la funcin, estructura o ambas. Hematuria. Por su aparicin espectacular y preocupante, la hematuria necesita que previamente se tranquilice al enfermo y a su familia. En el 90% de los casos es un proceso benigno autolimitado y raramente pone en peligro la vida del enfermo, excepto que existan fenmenos asociados. Los tres primeros das se manejan slo con reposo en cama e ingestin de lquidos en cantidad suficiente para obtener diuresis de 3.000 ml/da. Si la hematuria contina, a lo anterior se agrega prednisona en dosis de 1 mg/kg/da en dos dosis y si an persiste se debe agregar TR en dosis de ataque, habitualmente nica de un 40%. Si contina se utiliza TR 30% en tres dosis diaria hasta mejora. No se debe usar antifibrinolticos, hasta verificar que el sangrado sea urinario bajo. Sangrado ginecolgico y obsttrico. Las mujeres portadoras de hemofilia o con factores VIII o IX subnormales o con Enfermedad de von Willebrand, pueden presentar copiosos y prolongados flujos rojos. Son caractersticas las menometrorragias y sangrado mayor que lo normal en los partos. Otro dato que no se menciona en la literatura es el sangrado -como una regla- posterior a la ruptura del himen en la primera relacin sexual, dato que habitualmente no se investiga y que otorga antecedente hemorrgico importante. 2.4.3. Rehabilitacin La rehabilitacin msculo-esqueltica, como secuela de criterios obsoletos, de limitar o simplemente prohibir los ejercicios fsicos o como complicacin de hemartrosis se combate eficientemente con la estimulacin de ejercicios isomtricos en for ma per manente para fortalecer la musculatura y la administracin profilctica de TR en nios y adolescentes o de demanda muy precoz en adultos. 2.4.4. Procedimientos diagnsticos y teraputicos Los procedimientos diagnsticos o teraputicos cruentos -incluye punciones diagnsticas o
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teraputicas- deben realizarse con idntica conducta a la tomada en ciruga. Otros procedimientos diagnsticos invasivos o teraputicos no cruentos como endoscopas digestivas, urinarias, operatoria odontolgica o vacunas pueden realizarse con el mayor de los cuidados y as evitar el uso de TR pero con TA. Cirugas, tratamientos odontolgicos (con la excepcin de operatoria sin anestesia) u otros pr ocedimientos cruentos incluidas las punciones, deben considerarse como una ciruga mayor, por lo que deben instaurarse TR y TA. 2.4.5. Inhibidores Los inhibidores o anticuerpos anti-FVIII o -FIX son un importante problema mdico y econmico; se observan en aproximadamente un 5-20% de los enfermos con hemofilia, siendo ms frecuentes en hemofilia tipo A (98%) y menos en hemofilia tipo B (2%). Estudios prospectivos de incidencia en pacientes previamente tratados muestran 8 casos nuevos por 1.000 pacientes/ao. Los eptopos que reconocen los inhibidores del FVIII estn concentrados en los dominios A2, A3 y C2. Los inhibidores son ms frecuentes en los primeros aos de la vida y aparecen pocos das despus de la exposicin al factor (aproximadamente a los 9 das). Su mayor incidencia se relaciona con el uso de factores recombinantes (m/m 25%) y hay brotes transitorios con determinados procesos de fabricacin de los concentrados. Se sospecha su aparicin cuando hay persistencia del sangrado pese a que la TR ha sido instaurada previo clculo de la necesidad del factor deficiente. Adems se observa alteracin progresiva del TTPA o del TP, o disminucin hasta la desaparicin del factor plasmtico deficiente (FVIII o FIX) (unidades Bethesta). Su presencia puede confirmarse con las pruebas habituales de laboratorio diluyendo plasma del enfermo con plasma normal (test de Bethesda). En nios menores de 10 aos se recomienda determinarlos cada 3-6 meses o cuando hay menos de 100 das entre episodios, anualmente o antes de intervenciones quirrgicas electivas. Se clasifican como bajos respondedores a los de bajo ttulo (< 10 UB) y como altos respondedores a los con ttulo alto (> 10 UB). El manejo clnico de los inhibidores, utilizando estrategias de bajo perfil econmico, consiste
en: (a) aumentar la dosis de factor hasta tener un valor teraputico de factor circulante, (b) administrar corticoides en dosis >1 y < 2 mg/ kg/peso, por todo el tiempo que sea necesario, (c) indicar infusin contnua de liofilizados en las dosis convencionales, (d) realizar plasmafresis con reposicin de plasma normal, (e) indicar infusin de factores por largo tiempo e (f) utilizar inmunosupr esores como ciclofosfamida hasta desaparicin del inhibidor. Otras alternativas muy efectivas pero, de muy alto costo econmico, es el uso de factores recombinantes de alta pureza o de origen no humano (porcino) en dosis de 50-150 UI/kg, poco eficaz si hay > 5 UB, presenta reacciones transfusionales (2-3%), trombocitopenia transitoria (30-60 minutos), respuesta anamnstica al humano 56%, al porcino 69% (disponibilidad limitada) y factor VII activado. 2.5. Terapia de reemplazo 2.5.1. Tipos de terapia de reemplazo La terapia de reemplazo incluye: concentrado de FVIII, crioprecipitado, concentrado de FIX y plasma fresco congelado. El concentrado de FVIII es un preparado comercial liofilizado del factor. Estos productos se pueden clasificar en tres categoras: (a) productos recombinantes, como por ejemplo Kogenate, Bioclate y Helixate, (b) productos purificados de anticuerpos monoclonales, que incluyen AHF-M de la Cruz Roja, Hemofil M, y Monoclate P; y (c) productos de factor VIII intermedios y de alta pureza, que incluyen Humate P y Alphanate (ambos se pueden usar en el tratamiento de la EvW), Koate HP y Profilate SD. Los concentrados de FVIII derivados de plasma se elaboran a partir de lotes de plasma provenientes de muchos donantes (mximo 60,000 donantes). Los concentrados de FVIII fabricados actualmente no se estabilizan con albmina. El FVW no est presente en concentrados de FVIII r ecombinantes o purificados por inmuno-afinidad. Los concentrados liofilizados de FIX preparados a partir de plasmas y tratados al calor, se distribuyen bajo una variedad de marcas. Desde comienzo de los noventa se han introducido nuevos productos con inactivacin viral. Estos productos se clasifican en dos categoras: (a) productos puros de FIX que incluyen Alphanine SD y Mononine; y (b) concentrados de complejo de FIX, que incluyen Konyne 80 y Bebulin. Los
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concentrados de FIX recombinantes, estabilizados con azcares, tambin se encuentran disponibles. 2.5.2. Clculo de dosis del factor a administrar En la TR, que corresponde a la reposicin temporal del factor deficiente en calidad y cantidad, la magnitud y el tiempo de administracin est en relacin con la gravedad
del cuadro hemorragparo. La cantidad de unidades a administrar es un clculo sencillo que necesita conocer el tipo de hemofilia, el porcentaje en que se desea aumentar la cantidad de factor in situ, el peso del enfermo, la presentacin y la potencia del producto a administrar. A continuacin un ejemplo de cmo hacer el clculo de la cantidad de factor necesaria: = = = = = 50 kg 40% 50 x 40 = 2.000 unidades de factor 1.000 U.I. F VIII 2.000 U.I. F IX
Peso del enfermo Porcentaje de aumento deseado Nmero de unidades a administrar Para hemofilia tipo A, el resultado se divide por dos Para hemofilia tipo B, el resultado no se divide El criterio para definir el aumento deseado del factor vara segn el tipo de hemorragia que se est r esolviendo y la secuencia de administracin es segn el tipo de hemofilia y el tipo de hemorragia. Si se usa crioprecipitado, el resultado se divide por 100, obtenindose el nmero de bolsas de crioprecipitados que se solicitar. Si se usa plasma, el nmero de unidades calculadas, es el mismo volumen de plasma a administrar. Si se usan concentrados liofilizados, se elige siempre la aproximacin mayor. Si se trata de enfermo peditrico o de poco peso y, hay otro(s) enfermo(s), es posible utilizar un vial en tantas dosis como sea prctico y necesario repartir. Las reacciones transfusionales son las de un producto sanguneo y se tratan como tales. 2.5.3. Forma de administar el factor deficitario
terapia de remplazo de mantencin es el tiempo durante el cual es administrada la TR de mantencin y que transforma al enfermo en sujeto apto para diagnstico o tratamiento cruento. Este perodo cubre desde el comienzo de los primeros signos, sntomas o ambos, hasta el alta mdica cuyo criterio es la completa mejora fsica y funcional. Esta actividad reviste enorme importancia en la prevencin de complicaciones y secuelas (artrosis, pseudotumores, etc.). El alta mdica se otorga entre los 2 das para algunas causas mdicas y 15 das para el resto de las mdicas y quirrgicas; en este ltimo caso los puntos se retiran el da 15 o ms. Este perodo incluye la fibrinolisis primaria que es responsable de los sangrados tardos y que con cierta frecuencia aparecen desvinculados con el diagnstico o la tcnica empleada. 2.6. Terapia gnica
Dosis de ataque. Es la cantidad de TR que inicia el tratamiento la que puede ser nica si su administracin es oportuna en tiempo y en cantidad suficiente. Es determinante en forma radical y definitiva en la evolucin futura del enfermo. Dosis de mantencin. Corresponde a la dosis posterior a la de ataque y es variable segn las caractersticas clnicas. En los casos quirrgicos comienza a la salida de pabelln. El intervalo de administracin de la terapia de remplazo es la secuencia en el tiempo con que debe administrarse la TR en su dosis de mantencin; en hemofilia tipo A, cada 8 horas y en hemofilia tipo B, cada 12 horas. El tiempo mnimo de administracin de la
Estn en investigacin varios mtodos para la transferencia de genes de los factores VIII y IX. Ninguna ha sobresalido como superior, pero s se ha logrado un avance considerable en expresin del factor despus de la transferencia in vivo de vectores en modelos animales, lo que ha llevado a la consideracin del desarrollo de pruebas clnicas para ambos factores. En la ltima dcada, varios laboratorios han hecho importantes contribuciones en este campo. Durante los primeros ensayos, se insert DNA complementario (cDNA) del factor VIII o IX en clulas desarrolladas en cultivos. Luego, las clulas modificadas se retornaron al animal donante. Desafortunadamente, las clulas modificadas expresaron mejor los factores de la coagulacin en el cultivo (ex vivo) que en el animal (in vivo). Esto condujo a ensayos para
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transferir el cDNA insertndolo en vectores que luego fueron administrados directamente a los animales, ya fuera por va intravenosa o intramuscular. Hubo algn xito en la expresin de cantidades subteraputicas de protena expresada a largo plazo con ambos mtodos o an cantidades nor males que circularon transitoriamente durante algunos meses. No obstante, slo recientemente los vectores mejorados han proporcionado resultados suficientemente alentadores para realizar pruebas clnicas en seres humanos. 2.7. Terapia asociada La TA es la administracin de frmacos que estimulan, favorecen o preservan el cogulo por un tiempo mayor que el fisiolgico con el objeto de disminuir la cantidad y tiempo de administracin de la TR. Para ello se utilizan antifibrinolticos, inhibidor de proteasas, desmopresina, analgsicos y anestsicos. Antifibrinolticos. Per miten asegurar la estabilidad del cogulo reduciendo al mnimo el sangrado tardo. Al mismo tiempo poseen accin analgsica y antiinflamatoria. El cido tranexmico se administra por va oral (cada 8 horas) o intravenosa (continua) en dosis de 30 a 50 mg/kg/da, tpica o en colutorios en concentracin de 1.000 mg/l, por un mnimo de 10 das. Est indicado en todos los procesos hemorrgicos con excepcin absoluta en la hematuria con etiologa desconocida o alta y en hipersensibilidad al frmaco. Inhibidor de proteasas. Se utiliza en dosis pr eoperatoria de 500.000 U en bolo. Intraoperatorio 250.000 U cada hora de operacin, por va intravenosa. Desmopresina. La desmopresina es un anlogo sinttico de la vasopresina natural, 1-diamino8-D-arginina vasopresina (DDAVP). Libera rpidamente FVIII, FVW y activador del plasmingeno desde sus lugares de almacenamiento. Se usa en dosis 0,30,4 g/ kg, puff nasal, en hemofilia tipo A variedad leve, moderada y algunos tipos de EvW por dos das seguidos y repetir al 5 da. Cogulo de fibrina en aerosol. Se utiliza sobre heridas quirrgicas limpias previo lavado con antifibrinolticos. Prednisona o equivalente. Se usa como analgsico, antiinflamatorio, antipirtico e inmunosupresor en dosis de 0,1 a 1,0 mg/kg/
da en forma puntual o continua, por va oral o intravenosa (equivalente). Analgesia. El dolor en hemofilia es un signo capital desde el comienzo de la expresin clnica, por tanto, cohibirlo en forma oportuna y eficaz, es prioritario. El uso de opiceos debe ser absolutamente puntual y muy justificado, otros analgsicos/antiinflamatorios no tienen contraindicacin absoluta, con excepcin del cido acetilsaliclico. Anestsicos. Tanto en su va de administracin y su eleccin, slo estn condicionadas por las necesidades especficas. Cuando ellas incluyan punciones en sitios de alto riesgo (subclavia, peridural, etc.) deben cumplirse previamente las indicaciones de haber iniciado con anterioridad la TR y la TA. 3. ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND La enfermedad de von Willebrand (EvW) fue reportada por primera vez en 1926 por Erik von Willebrand en una familia de Finlandia, quien la describi como un trastorno hemorragparo diferente a la hemofilia, al que denomin pseudohemofilia. El doctor von Willebrand observ que la enfermedad se presentaba en ambos sexos y en varios miembros de la familia, cuyo sntoma caracterstico era la epistaxis (sangrado nasal), y que los hallazgos de laboratorio ms importantes eran la prolongacin del tiempo de sangra y la normalidad del recuento de plaquetas. En la dcada de los sesenta se demostr que la enfermedad se explicaba por la deficiencia de un nuevo factor plasmtico distinto al factor VIII coagulante (FVIII), que se denomin factor von Willebrand (FVW). La deficiencia de este factor se asociaba a bajos niveles de FVIII, indicando la estrecha relacin entre ambas protenas plasmticas. En la dcada de los ochenta, mediante la clonacin del gen del FVW, se lograron establecer las bases moleculares que producen la enfermedad. La EvW se considera el sndrome hemorragparo hereditario ms frecuente de la poblacin. Se ha observado que afecta a las diferentes etnias de modo similar. Debido al modo de herencia autosmico, hombres y mujeres estaran afectados en igual proporcin, sin embargo, la menstruacin, el embarazo y el parto producen una frecuencia mayor de EvW sintomtica en la mujer; algunos estudios indican que el 60% de
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los pacientes con EvW son mujeres. La prevalencia de la EvW es del orden del 1% sin diferencias entre etnias. Las pruebas de screening poblacionales no slo detectan pacientes sintomticos, sino que tambin asintomticos o levemente sintomticos con bajos niveles de FVW. 3.1. Factor von Willebrand 3.1.1. Estructura La EvW es causada por la deficiencia o anormalidad del FVW. El gen que codifica el FVW
se localiza en el cromosoma 12 (p13.2) y posee 52 exones. El producto primario del gen del FVW est formado por 2.813 aminocidos (un pptido seal de 22 aminocidos, un propptido de 741 aminocidos y la molcula madura de FVW de 2.050 aminocidos). El peso molecular del FVW maduro es 270 kDa. En la figura 22-1 se representan los dominios A, C y D que conforman un monmero de FVW. La unidad madura de FVW presenta 12 Nglicosilaciones y 10 O-glicosilaciones, que representan aproximadamente el 19% de su peso molecular.
Figura 22-1. Estructura del FVW. Se indican los dominios estructurales y los sitios de unin para diferentes molculas.
3.1.2. Biosntesis y secrecin El FVW es sintetizado en los megacariocitos y en clulas endoteliales. Luego de la eliminacin del pptido seal en el retculo endoplsmico (RE), el proFVW forma dmeros mediante la formacin de puentes disulfuro entre residuos de cistena ubicados en el extremo C-terminal (dominio CK). Posteriormente los dmeros de proFVW son transportados al aparato de Golgi donde polimerizan con otros dmeros mediante la formacin de puentes disulfuro a travs de sus extremos N-terminales (dominios D3). Mientras que el 99% de los propptidos son eliminados, contina la glicosilacin iniciada en el RE y se adiciona sulfato inorgnico en algunas N-glicosilaciones. Finalmente los multmeros son almacenados en los cuerpos de WeibelPalade de las clulas endoteliales y en los grnulos alfa de las plaquetas. 3.1.3. Funcin El FVW participa en la adhesin de las plaquetas a las zonas de dao vascular y en el transporte y estabilizacin del FVIII.
El FVW se une al tejido conectivo subendotelial (principalmente colgenos) a travs del dominio A3 y a travs del dominio Al a la glicoprotena Ib (GPIbdel complejo Ib/IX/V de las plaquetas, formando un puente entre las dos molculas, participando as en la adhesin plaquetaria. Por otra parte el FVW, por medio de la secuencia RGD (Arginina, cido glutmico y cido asprtico) del dominio C2 se une al complejo glicoproteico IIb-IIIa (GPIIb-IIIa) de las plaquetas activadas, contribuyendo a la agregacin plaquetaria, que por su parte une fibringeno y recluta ms plaquetas para la formacin del tapn hemosttico. Ambas interacciones del FVW son expresadas en los multmeros de alto peso molecular. Slo los multmeros de FVW de gran tamao son hemostticamente activos. El FVW es el transportador especfico del FVIII en el plasma. Se une al FVIII de modo no covalente a travs del dominio D. Cada monmero de FVW posee un dominio D para el FVIII, no obstante in vivo, slo el 1-2% de los monmeros de FVW estn ocupados con FVIII. Esto explica que los multmeros de alto peso molecular no ejercen una funcin esencial para
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el transporte del FVIII. El complejo formado FVIII/ FVW, permite que el FVW proteja al FVIII de la inactivacin por la protena C activada, FIX activado y FX activado en el plasma, prolongue su vida media en circulacin, y lo transporte por un lado hasta el sitio de injuria vascular para la formacin plaquetario y fibrina y por otro lado hasta el lugar donde se llevar a cabo su catabolismo. Debido a esto, niveles bajos de FVW se asocian a una disminucin de FVIII. La vida media del FVIII asociado a FVW es de 1220 horas, mientras que libre puede reducirse hasta 2 horas. 3.1.4. Regulacin de los niveles sanguneos La concentracin normal de FVW en el plasma flucta entre 4 a 24 pg/mL (10 pg = a 1 UI). Los niveles de FVW estn relacionados con los grupos sanguneos ABO y Lewis, la raza y la edad. La concentracin plasmtica de FVW es 25% menos en individuos de grupo O, que en personas que tienen grupos A, B y AB. Los individuos del grupo O que adems son Le(a,b+) y por lo tanto, secretores (Se/se o Se/ Se) poseen niveles de FVW 11% menores que las personas grupo O, no secretoras. El genotipo del locus secretor es determinante de los niveles plasmticos de FVW. Los individuos homocigotos para el gen Se funcional (Se/Se) tienen niveles de FVW plasmtico ms altos que los heterocigotos (Se/se). Por otra parte, la concentracin de FVW aumenta con el envejecimiento, embarazo y en respuesta a varios estmulos: estrs adrenrgico (ejercicio, trauma, ciruga), vasopresina, hormona del crecimiento y estrgenos. Probablemente estos estmulos actan sobre las clulas endoteliales induciendo la liberacin de FVW almacenado en los cuerpos de Weibel-Palade. El aclaramiento del FVW de la circulacin ocurre en dos fases. La fase inicial es rpida con una vida media de 4.5 horas, seguido por una etapa ms lenta con un tiempo medio de desaparicin de 20 horas. Slo los multmeros intracelulares almacenados en los cuerpos de Weibel-Palade o en los grnulos alfa de las plaquetas, estn compuestos por subunidades intactas, mientras que los que estn en circulacin contienen fragmentos de subunidades. El principal mecanismo que reduce el tamao de los multmeros de FVW involucra una proteolisis especfica, lo que explica el amplio espectro de tamaos de multmeros en circulacin, desde dmeros de 500 kDa hasta multmeros de 20.000 kDa. La enzima ADAMTS-13, una
metaloproteinasa disminuye el peso molecular de los multmeros de FVW causando un corte entre los aminocidos Tyr842 y Met843. 3.2. Clasificacin y patologa molecular de la enfermedad de von Willebrand La EvW es causada por un defecto cuantitativo o cualitativo del FVW (Tabla 22-1). Dependiendo de la deficiencia, la EvW se ha clasificado en tres tipos principales. La EvW tipo 1 se caracteriza por alteraciones cuantitativas parciales del FVW; la EvW tipo 2 incluye casos que presentan anormalidades cualitativas de la estructura y funcin del FVW, la EvW tipo 2 se divide en cuatro variantes 2A, 2B, 2M y 2N, de acuerdo al fenotipo de la enfermedad y la EvW tipo 3 se refiere a la deficiencia total o presencia de trazas de FVW. A continuacin se describen las principales caractersticas de los tipos y subtipos de EvW. 3.2.1. EvW tipo 1 La EvW tipo 1 se caracteriza por presentar una deficiencia parcial del FVW. Los niveles plasmticos del FVW presentan una reduccin del 15 al 50%, pero no existe anormalidad en su funcin. La distribucin de los multmeros en el plasma es normal. Se han descrito subgrupos de la EvW tipo 1 de acuerdo a los niveles plasmticos relativos de FVW, lo que indica que existen distintos mecanismos fisiopatolgicos. Generalmente el fenotipo se hereda de modo autosmico dominante. Algunos individuos heter ocigotos son portadores asintomticos. Las alteraciones genticas descritas consisten principalmente en pequeas deleciones, cambios en el marco de lectura y mutaciones sin sentido. Ocasionalmente, la EvW tipo 1 se hereda como una caracterstica dominante con alta penetrancia y niveles marcadamente disminuidos de FVW; este fenotipo puede ser causado por dominancia negativa: mutaciones sin sentido en un alelo impiden el transporte intracelular y la secrecin del producto del gen normal. 3.2.2. EvW tipo 2 a) EvW tipo 2A Cualquier mecanismo que reduzca la concentracin de los multmeros de alto peso molecular del FVW puede afectar su actividad hemosttica. En la EvW tipo 2A la adhesin
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plaquetaria dependiente del FVW est alterada por ausencia de multmeros de alto y mediano peso molecular. En la mayora de los casos se hereda de modo autosmico dominante, aunque tambin existen variantes recesivas. Se han descrito al menos 24 mutaciones sin sentido (20 en el dominio A2 y 4 en el dominio A1), producidas por dos mecanismos posibles: - Mutaciones del grupo 1, alteran el transporte intracelular del FVW e impiden el ensamblaje, almacenamiento y secrecin de los multmeros de alto peso molecular, - Mutaciones del grupo 2, provocan en los multmeros una mayor susceptibilidad a la proteolisis in vivo, son ms sensibles a la ADAMTS-13. Ambos grupos de mutaciones causan ausencia de los multmeros de alto peso molecular del FVW. Algunas mutaciones sin sentido en el dominio CK del extremo C-terminal impiden la formacin del puente disulfuro necesario para formar los dmeros. Otras mutaciones sin sentido, pequeas deleciones e inserciones en el dominio D2 se caracterizan por disminucin de los multmeros de alto peso molecular y aumento de los dmeros de FVW. b) EvW tipo 2B La EvW tipo 2B se caracteriza por un aumento de la afinidad del FVW mutante por la GPIbde las plaquetas. Al parecer esto produce la unin de los multmeros de alto peso molecular a la superficie plaquetaria in vivo, seguido por el aclaramiento de ambos, produciendo trombocitopenia leve. Generalmente los multmeros de alto peso molecular no se detectan en el plasma y los multmeros restantes no son hemostticamente activos. En la mayora de los casos la herencia es de tipo autosmico dominante. Se han descrito 18 mutaciones, la mayora sin sentido y afectan al dominio Al donde se encuentra el sitio de unin a la GPIb. c) EvW tipo 2M La EvW tipo 2M (M = Multmero) se caracteriza por una disminucin de la afinidad del FVW a las plaquetas, con una normal distribucin de los multmeros del FVW en el plasma. Se hereda de modo autosmico dominante. Se han descrito 17 mutaciones y todas afectan al dominio Al disminuyendo la afinidad por la GPIb. d) EvW tipo 2N La FVW tipo 2N ( N = Normanda) posee niveles
normales de FVW, con una distribucin normal de los multmeros en el plasma, como tambin las funciones de adhesin a las plaquetas son normales. Se han descrito 15 mutaciones sin sentido en los dominios D y D3. Estas mutaciones del FVW provocan un defecto en la unin al FVIII, disminuyendo la vida media de este ltimo; esto explica que la concentracin de FVIII se reduzca en al menos un 25% de lo normal, asemejndose a la hemofilia A leve, excepto por su patrn de herencia autosmica. Los pacientes que presentan este subtipo de EvW son homocigotos para este tipo de alelo, por lo tanto la herencia es autosmica recesiva. La herencia conjunta de un alelo mutado de EvW tipo 2N con un alelo mutado del tipo 1 (heterocigoto compuesto) puede dar origen a un fenotipo variable de la EvW tipo 1. 3.2.3. EvW tipo 3 La EvW tipo 3 es la forma menos frecuente y la ms severa de todas. Los pacientes presentan un dficit completo o casi total del FVW. Debido a la ausencia de FVW para transportar y estabilizar al FVIII, los afectados presentan alteracin de la hemostasia primaria y de la coagulacin sangunea. El FVIII es usualmente inferior al 10% de lo normal y excepcionalmente menos del 1%. Las mutaciones ms comunes consisten en deleciones totales o par ciales del gen, mutaciones sin sentido y mutaciones del splicing o de cambio de marco de lectura que impiden la sntesis del FVW. Se hereda de modo autosmico y se presenta slo en pacientes homocigotos para los dos alelos mutantes. Los heterocigotos para dos alelos mutantes distintos (heterocigotos compuestos) generalmente son asintomticos y poseen niveles de FVW normales o levemente disminuidos. La homocigosidad para deleciones gnicas, se asocia a la aparicin de aloanticuerpos anti-FVW, los cuales pueden hacer inefectiva la terapia de reemplazo o pueden desencadenar reacciones anafilcticas en estos pacientes. Dentro de los diferentes tipos de EvW, el tipo 1 es el ms frecuente (el 60-80 % de los casos). El tipo 2 representa el 7-30% de los pacientes y el tipo 3 el 5-20% de los casos. La distribucin para el subtipo 2A es 30%, 2B 28%, 2M 8% y 2N 34%. En la tabla 22-2 se muestra la clasificacin revisada de la EvW.
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Tabla 22-2. Clasificacin revisada de la enfermedad de von Willebrand Tipo 1 2A 2M 2B 2N 3 3.3. Clnica Los sntomas ms comunes en la EvW son las hemorragias mucocutneas, siendo ms frecuentes la epistaxis y la menorragia, reflejando el defecto caracterstico en la adhesin plaquetaria. Otr os sntomas hemorrgicos tambin frecuentes son equimosis, hemorragia luego de pequeos cortes o heridas leves y sangrado gingival. La hemorragia posterior a extracciones dentales es comn. La expresin clnica de la EvW es usualmente leve en el tipo 1 y aumenta en los tipos 2 y 3. Sin embargo, la severidad de las manifestaciones hemorrgicas puede variar, incluso dentro de la misma familia, y a travs del tiempo en un mismo individuo. Esto puede deberse a la variable penetrancia y expresividad de la enfermedad. Debido a que el FVIII est levemente disminuido en la EvW tipo 1, defectos severos de la coagulacin son infrecuentes y son principalmente post-trauma. Contrariamente, los tipo 2N y 3 pueden presentar niveles suficientemente bajos de FVIII como para desarrollar hemorragias articulares o de tejidos blandos, semejantes a los observados en pacientes con hemofilia. Se ha descrito que la EvW tiene una frecuencia de 13% en mujeres que sufren de menorragia. El embarazo, generalmente es bien tolerado, en la mayora de las pacientes (excepto tipo 3) los niveles de FVW y FVIII circulantes aumentan, aunque pueden ocurrir algunas complicaciones hemorrgicas. El riesgo de hemorragia durante el parto no aumenta en estas pacientes, debido Caractersticas Deficiencia cuantitativa parcial de FVW Variante cualitativa con disminucin de la funcin plaquetaria y prdida de multmeros de alto peso molecular Variante cualitativa con disminucin de la funcin plaquetaria y conservacin de los multmeros de alto peso molecular Variante cualitativa con aumento de la afinidad del FVW por la GPIb Variante cualitativa con defecto de unin del FVIII al FVW Ausencia total del FVW detectable y marcada disminucin del FVIII a los niveles aumentados de FVW y FVIII plasmticos. Despus del parto estos niveles bajan rpidamente, por lo que el riesgo de hemorragia postparto aumenta y las pacientes deberan ser monitorizadas por al menos una semana despus. Las mujeres embarazadas con el tipo 2B pueden presentar complicaciones durante el parto. El aumento de FVW mutado en el plasma promueve la aparicin de trombocitopenia prolongada. El desarrollo de aloanticuerpos anti FVW es poco comn. Todos los casos descritos han ocurrido en pacientes con EVW tipo 3 con cantidades no detectables de FVW. 3.4. Diagnstico La EvW debera sospecharse en cualquier paciente que presente hemorragia mucocutnea con recuento de plaquetas normal. El espectro de la gravedad de la EvW es amplio, variando entre escasos y dudosos sntomas hemorrgicos hasta episodios que pueden amenazar la vida. Esto no slo se debe a lo heterogneo de los defectos del gen, sino tambin a la influencia ejercida por otros genes (genes del sistema ABO, sistema secretor). Adems, de las condiciones fisiolgicas y patolgicas pueden influir en los niveles de FVW. Por lo tanto, el diagnstico de la EvW depende de varias pruebas de laboratorio y puede requerir anlisis repetidos de los pacientes como de los familiares. Las pruebas de laboratorio usadas para diagnosticar la EvW (ver captulo 31) se agrupan en pruebas de screening, las cuales permiten
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evaluar inicialmente a un paciente con sndrome hemorragparo y pruebas especficas necesarias para realizar el diagnstico de EvW. 3.4.1. Pruebas de screening Tiempo de sangra (TS). Esta prueba puede reflejar las alteraciones cuantitativas o cualitativas de las plaquetas y del FVW, as como alteraciones de la pared de los vasos sanguneos. El TS en la EvW grave (tipo 3 y algunos subtipos 2) est siempre prolongado. En las for mas leves de la enfer medad generalmente est nor mal o levemente alterado. Debido a la baja sensibilidad, especificidad y escasa reproducibilidad, la utilidad clnica de esta prueba es limitada. Mtodos con alta fuerza de cizalla. El equipo Platelet Function Analyser, PFA-100 desarrolla un modelo que simula la hemostasia primaria, proporcionando todas las condiciones que ocurren in vivo cuando se realiza un TS. Este mtodo utiliza un sistema con alta fuerza de roce similar a la encontrada en las arteriolas. La sensibilidad y especificidad del PFA-100 es mayor a la observada en el TS, por lo que superara las debilidades de ste; sin embargo, an existen limitaciones para detectar casos con EvW leve y distinguirlos de personas normales con niveles bajos de FVW:Ag. Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA). Esta prueba puede estar prolongada en pacientes con EvW. Sin embargo, pacientes con formas leves de la enfermedad usualmente tienen valores normales o cerca de lo normal, por lo que el TTPA no es una prueba sensible para la EvW. Un resultado normal de TTPA y/o de TS no descartan el diagnstico de EvW. 3.4.2. Pruebas especficas Factor von Willebrand antignico (FVW:Ag). La concentracin plasmtica de FVW est disminuida en personas con defectos cuantitativos (EvW tipo 1 y 3), mientras que pueden ser normales en las variantes de la EvW tipo 2. Actividad del FVW como cofactor de la ristocetina (FVW:RCo). Esta prueba estudia la capacidad de unin del FVW con la GPIb. Debido a que los grandes multmeros del FVW son necesarios para la aglutinacin inducida por ristocetina, la razn FVW:Ag/FVW:RCo en el tipo 2A (ausencia de multmeros de alto peso molecular) est francamente disminuida
respecto a individuos normales. El tipo 2M (interaccin alterada de los multmeros con la GPIb) tambin presenta disminucin de dicha razn. Los individuos portadores de EvW tipos 1, 2N y 3 se caracterizan por tener normal la razn antes mencionada. Actividad coagulante del FVIII (FVIII:C). Debido a que la secrecin del FVIII, as como su vida media dependen del FVW, generalmente los valores de FVIII:C son paralelos al FVW:Ag. Esta prueba es fundamental para la deteccin de pacientes del tipo 2N. 3.4.3. Pruebas para diagnstico de subtipos Estas pruebas no son necesarias para hacer el diagnstico de EvW, pero s para realizar el diagnstico diferencial entre los diferentes subtipos. Agregacin plaquetaria inducida por ristocetina (RIPA). Depende de la concentracin de FVW y de su afinidad por la GPIb. La prueba es indetectable en pacientes con EvW tipo 3, pero puede ser normal en pacientes tipo 1. En pacientes 2A y 2M el resultado de la prueba es muy bajo o ausente. La prueba RIPA es muy til para detectar pacientes con EvW tipo 2B, ya que presentan agregacin plaquetaria a bajas concentraciones de ristocetina (0,6 mg/mL), lo cual no ocurre en plasma rico en plaquetas de individuos normales. Anlisis multimrico del FVW plasmtico. Los multmeros de alto y mediano peso molecular estn ausentes en la EvW tipo 2A y los de alto peso molecular usualmente ausentes en el tipo 2B. Capacidad de unin del FVW al colgeno (FVW:CB). La unin del FVW al colgeno fijo en microplaca depende slo de los multmeros de alto peso molecular. La razn FVW:Ag/ FVW:CB permite distinguir entre EvW tipo 1 o tipo 2. Capacidad de unin del FVW al FVIII. Esta prueba distingue la EvW tipo 2N, ya que en este subtipo el FVW presenta disminucin en su capacidad de unin al FVIII. Consecuencias diagnsticas En algunas ocasiones el diagnstico de EvW presenta dificultades; los motivos pueden ser debido a que la EvW no presenta sntomas especficos y el fenotipo de los transmisores heterocigotos puede no ser igual. El diagnstico
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se basa en la historia clnica y en pruebas de laboratorio. Su diagnstico considera tres criterios: (a) es una patologa hereditaria, (b) el sndr ome hemorragpar o es de tipo mucocutneo y (c) se debe a una alteracin del FVW (cuantitativa o cualitativa). Al interpretar los resultados de las pruebas de laboratorio que evalan el FVW (FVW:Ag, FVW:RCo) se debe tener en consideracin que el FVW es una protena de fase aguda; aumenta su concentracin plasmtica en varias condiciones, tanto fisiolgicas (ejercicio, embarazo) como patolgicas. El hecho que el rango de referencia normal sea amplio y que adems se vea influido por otros factores (grupo ABO, edad, y otros), complica la interpretacin de los resultados de laboratorio. Por ello el diagnstico de la EvW tipo 1, en especial sus formas ms leves, es el que presenta mayor dificultad. Los sntomas de EvW no son especficos y otras condiciones fisiopatolgicas pueden cursar con sndrome hemorragparo mucocutneo, como el sndrome de Bernard Soulier y el uso de frmacos antiplaquetarios. Otras condiciones difciles de distinguir son la pseudo-EvW o EvW tipo plaquetario y la EvW adquirida. Ambas cursan con bajo nivel de FVW:Ag y distribucin irregular de los multmeros de FVW plasmtico. La pseudo-EvW es muy similar a la EvW tipo 2B, pero en el primer caso la alteracin est en las plaquetas; la GPIb presenta una afinidad aumentada por el FVW. Esta alteracin puede ser distinguida de la EvW tipo 2B agregando crioprecipitado al plasma rico en plaquetas del paciente en la prueba RIPA; en la pseudo-EvW, el crioprecipitado induce agregacin plaquetaria, mientras que ello no ocurre en el tipo 2B. La EvW adquirida se refiere a una condicin donde se asocia hemorragia espontnea, disminucin de los niveles plasmticos de FVW y TS prolongado; se presenta generalmente en adultos y sin historia familiar de EvW. La mayora de los casos se asocian a enfermedades autoimnunes o sndromes linfoproliferativos, lo que sugiere una causa imnunolgica. Algunos pacientes no presentan esas enfermedades subyacentes y slo cerca del 50% de los afectados posee autoanticuerpos anti-FVW. La distribucin de los multmeros de FVW en el plasma puede ser normal o pueden estar ausentes los multmeros de alto peso molecular; en este caso puede ser difcil de distinguir de la EvW tipo 2A.
3.5. Tratamiento El tratamiento de la enfermedad de Von Willebrand tiene el propsito de normalizar el tiempo de sangra, y el trastorno de coagulacin sangunea. Para conseguir esto, tanto el FVW:Ag y el FVIII:C deben aumentar en el plasma. El manejo de la enfermedad depender del tipo de EvW de que se trate; algunos elementos generales son los siguientes: a) Induccin de la liberacin de FVW desde las reservas tisulares usando DDAVP. b) Tratamiento de reemplazo. Estos incluyen crioprecipitados y concentrados de factores liofilizados; dos marcas actualmente disponibles son Humate-P y Alphanate SD. Desarrollo de anticuerpos inhibidores luego del TR. En algunos pacientes el TR puede inducir la formacin de inhibidor es que pueden complicar el tratamiento de los episodios hemorrgicos cuando los ttulos de los anticuerpos inhibidores son muy altos. c) Antifibrinolticos. Son medicinas que ayudan a impedir que un cogulo de disuelva. Son tiles en EvW Se usan despus de epistaxis y sangrados orales, entre otr os. Son antifibrinolticos el cidoaminocaproica y cido tranexnico. 4. ALTERACIONES HEREDITARIAS DE LOS FACTORES DE LA COAGULACIN Aunque con menos frecuencia que el dficit del Factor von Willebrand, y los factores VIII y IX, tambin se puede presentar dficit o alteracin funcional de los siguientes factores: fibringeno, factor XIII, protrombina, factor V, factor VII, factor X, factor XI, factor XII, precalicrena y kiningeno de alto peso molecular. Estas alteraciones son descritas brevemente a continuacin. 4.1. Alteraciones del fibringeno Las alteraciones del fibringeno pueden ser cuantitativas o cualitativas. Las primeras incluyen ausencia de fibringeno (afibrinogenemia) o disminucin de su concentracin plasmtica (hipofibrinogenemia). Las alteraciones cualitativas se refiere a alteraciones funcionales del fibringeno (disfibrinogenemia). La estructura molecular del fibringeno fue descrita en el captulo 20. 4.1.1. Afibrinogenemia Los desrdenes congnitos del fibringeno se
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deben a alteraciones en el cromosoma 4 (q26q28) donde se localiza el gen. Los heterocigotos presentan hipofibrinogenemia y los homocigotos afibrinogenemia. El diagnstico se realiza precozmente cuando se presenta sangrado prolongado en el mun umbilical. Las manifestaciones clnicas incluyen hemorragia gastrointestinal y de mucosas. Tambin se ha observado un incremento en la incidencia de abortos durante el primer trimestre de gestacin y hemorragia postparto. Adems, en un 20% de pacientes con afibrinogenemia se observa hemartrosis, per o no con la intensidad que se presenta en los pacientes con hemofilia. Los pacientes con afibrinogenemia, hipofibrinogenemia o disfibrinogenemia, presentan prolongacin del TP, TTPA y TT. 4.1.2. Disfibrinogenemia A partir de 1965, se han descrito alrededor de 200 familias que representan disfibrinogenemia. La forma hereditaria es causada por mutaciones en los genes que codifican para las cadenas A, B del fibringeno. Las disfibrinogenemias son denominadas segn la ciudad de origen de los pacientes, o la ciudad del hospital donde el paciente fue estudiado. Si hay ms de una disfibrinogenemia diferente de la misma ciudad se agrega un nmero romano despus del nombre de la ciudad. El trmino hipodisfibrinogenemia es usado cuando la disfibrinogenemia heredada se asocia con disminucin de fibringeno en el plasma. Aproximadamente se han informado 240 alteraciones en el gen fibringeno. Las alteraciones de la molcula del fibringeno se expresan en la mayora de los pasos de formacin y estabilizacin de fibrina. El defecto ms comn es la alteracin en la polimerizacin de fibrina. En algunos pacientes el cogulo de fibrina es resistente a la fibrinolisis, por lo que en ellos se presenta tendencia a la trombosis. El modelo de herencia es casi siempre autosmico dominante. Un poco ms de la mitad de los pacientes no presenta sangrado o trombosis, mientras que el 25% presenta sangrados y 20% trombosis. La trombosis resulta de una falla en la fibrina para unir plasmingeno o t-PA. Las manifestaciones de sangrado incluyen epistaxis, equmosis, menorragia, hematomas, hemartrosis, sangrado postoperatorio y sangrado postparto. La mayora de los episodios de sangrado son leves o moderados. Las manifestaciones trombticas incluyen tr ombosis venosa profunda,
tromboflebitis, embolia pulmonar y trombosis arterial. Entre las pruebas de screening, el TP es ms sensible que el PTT para pesquisar disfibrinogenemia con tendencia al sangrado. La concentracin de fibringeno plasmtico puede ser baja o normal. La disfibrinogenemia adquirida se puede presentar en pacientes con enfer medad heptica grave o tambin puede estar asociada a neoplasias y en enfermedades autoinmunes. Como prueba de confirmacin, junto al TT se debe cuantificar el fibringeno como antgeno (ELISA u otro mtodo). Las hemorragias pueden ser manejadas con transfusiones de plasma y crioprecipitado. Frmacos fibrinolticos son usados en pacientes con tendencia a la trombosis. 4.2. Dficit de factor XIII A partir de 1944 en que se describi el dficit del factor estabilizador de fibrina (factor XIII) se han descrito mas de 200 casos. Este dficit es un trastorno raro (1:2.000.000), transmitido como un rasgo autosmico recesivo. El factor XIII est presente en plasma y plaquetas; aproximadamente 50% de su actividad est en las plaquetas. Est formado por 2 sub-unidades distintas, A y B (ver captulo 20). La subunidad A es sintetizada en los megacariocitos, monocitos y macrfagos, y su gen se encuentra en el cromosoma 6p24-25. La subunidad B no cataltica estabiliza la subunidad A y es sintetizada por los hepatocitos; es codificada en el cromosoma 1q31-32. La actividad cataltica responsable de la formacin de enlaces covalentes en la fibrina es la subunidad A en el plasma. Existen 3 formas distintas de deficiencia de factor XIII, basado en si la subunidad A y subunidad B estn presentes o ausentes: (a) deficiencia tipo I: la concentracin ambas subunidades est disminuida, (b) deficiencia tipo II: la subunidad A ausente y la subunidad B presente, y (c) deficiencia tipo III: existe deficiencia selectiva de la subunidad B. Como esta deficiencia es autosmica recesiva, solo los homocigotos son clnicamente sintomticos. Los homocigotos que han sido descritos en literatura con frecuencia son nios
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de enlaces consanguneos. Se han descrito mutaciones y deleciones en los genes que codifican para ambas subunidades, aunque con mayor frecuencia en el gen que codifica para la subunidad A. Generalmente los pacientes presentan niveles plasmticos de factor XIII <1%. El estado homocigoto se caracteriza por sangrado grave del cordn umbilical, hemorragia intracraneal, cicatrizacin anormal y abortos espontneos recurrentes. Se ha descrito dficit adquirido de factor XIII asociado al desarrollo de anticuerpos anti-factor XIII, en pacientes en los que se han indicado ciertos medicamentos (dilatin, isoniazidas, penicilina), y en pacientes con gammapata monoclonal, con prpura de Henoch-Schlein, enfermedad heptica, enfermedad de Chron y colitis ulcerativa. La sensibilidad del cogulo de fibrina en urea 5M es la prueba de laboratorio ms usada; los cogulos formados en ausencia de factor XIII se disuelven rpidamente en urea; (normal: alrededor de 24 horas). Sin embargo, el ensayo ms sensible es medir la estabilidad de la unin covalente del cogulo de fibrina. Tambin se utilizan pruebas de base inmunolgica como ELISAs especficos para cada subunidad del factor XIII. Como tratamiento, en estos pacientes se utiliza terapia de reemplazo (plasma fr esco o crioprecipitado). 4.3. Dficit de protrombina El primer caso de hipoprotrombinemia fue descrito en 1969. Se han descrito alrededor de 100 casos de hipoprotrombinemia hereditaria; se trata de un desorden autosmico recesivo. El gen que codifica para protrombina se localiza en el cromosoma 11. Clnicamente se manifiesta como sndrome hemorragparo; la hemorragia espontnea es infrecuente y el sangrado post-traumtico es comn. El sangrado por el mun del cordn umbilical es frecuente en los recin nacidos afectados. Tambin se ha descrito hemartrosis, epistaxis, menstruacin aumentada y sangrado postparto. Se han sido descrito 2 variantes de hipoprotrombinemia: disprotrombinemia, e
hipoprotrombinemia propiamente tal; esta ltima parece ser ms comn. En los casos de disprotrombinemia heterocigota se encuentra protrombina normal y anormal en el plasma (protrombina de Cardeza y Papua); la protrombina Barcelona, cuyos portadores son homocigotos, se caracteriza por la sustitucin de cistena por arginina en el residuo 273. El screening de hemostasia se caracteriza por TS normal, TTPA y TP prolongado, y TT normal. El diagnstico requiere estudio del factor II por pruebas de coagulacin (estudio funcional) y con pruebas de base inmunoqumica (ej. ELISA). Como tratamiento se utiliza plasma fresco congelado. Se agrega vitamina K en caso que el problema de la deficiencia sea esta vitamina. 4.4. Dficit de factor V La deficiencia hereditaria de factor V es una enfermedad infrecuente, con una incidencia de 1 en 1 milln de personas. Se ha descrito en varias partes del mundo y es transmitida como un rasgo autosmico recesivo. Se manifiesta clnicamente slo en pacientes homocigotos. La deficiencia de factor V se expresa como un sndrome hemorrogparo. Los trastor nos hemorrgicos incluyen: (a) Dficit verdadero de factor V en homocigotos y heterocigotos; y (b) carencia de factor V y factor VIII combinado. El factor V Quebec ha sido descrito como un desorden de sangrado de herencia autosmica dominante y presenta sangrados graves despus de traumatismos. Al parecer forma parte de un trastorno en que las diferentes protenas de los grnulos alfa de las plaquetas sufren degradacin. Otras mutaciones asociadas a deficiencia de factor V, son las siguientes: (a) Y1702C, causa frecuente de deficiencia de FV en la poblacin italiana, (b) factor V Stanford, mutacin que causa la prdida de un sitio de activacin por trombina (R1545V) y la terminacin prematura de traduccin en el aminocido 1560, y (c) factor V New Brunswick, cuya mutacin en Ala221Val interfiere con la estabilidad del factor V a 37C. Los pacientes experimentan epistaxis espontnea, menorragia, y excesivo sangrado despus de extracciones dentales o de procedimientos quirrgicos.
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Los pacientes presentan TS normal, TTPA y PT levemente prolongado, y TT normal. 4.5. Dficit de factor VII Se han descrito menos de 200 casos con deficiencia de factor VII aunque se estima una frecuencia en la poblacin de alrededor de 1:500.000. La condicin es heredada como un rasgo autosmico recesivo. Pr oducen deficiencias marcadas en homocigotos y moderadas, usualmente sin manifestaciones clnicas, en heterocigotos. El factor VII es sintetizado principalmente en el hgado y circula en el plasma en una concentracin de aproximadamente 0.5 g/mL. El gen que lo codifica est localizado en el cromosoma 13 (13q34); consiste en 9 exones. Codifica una protena madura de 406 aminocidos, que tiene un dominio terminal (Gla) modificado por carboxilacin de residuos de cido glutmico, dos dominios con homologa al factor de crecimiento epidrmico (EGF1 y 2), y un C-terminal con dominio serino-proteasa. La ausencia total de factor VII en el plasma, por lo general es incompatible con la vida, y los individuos mueren un poco despus del nacimiento debido a hemorragia grave. Se han descrito varios polimorfismos en el gen factor VII y algunos han mostrado relacin con niveles plasmticos factor VII. Se han descrito alteraciones cualitativas y cuantitativas del factor VII. Entre las manifestaciones clnicas se incluyen: epistaxis espontnea, hematomas subcutneos, hemorragias genitourinarias y gastrointestinales, y hemartrosis. Hemorragia en el sistema nervioso se puede presentar en el periodo neonatal. Estos pacientes presentan TS normal, TTPA normal, TP prolongado y TT normal. Su deficiencia se confirma con pruebas factor especfico. El dficit adquirido de factor VII (dficit de vitamina K, enfermedad heptica, terapia con anticoagulantes orales) debe ser considerado antes de hacer diagnstico de deficiencia hereditaria. En el tratamiento de estos pacientes se utiliza plasma fresco congelado o complejo protrombina. 4.6. Dficit de factor X La incidencia de esta enfermedad es de 1/ 500.000 personas. Se hereda como rasgo
autosmico recesivo incompleto y las alteraciones genticas y manifestaciones clnicas son semejantes a las del dficit de factor VII. El gen que codifica el factor X, al igual que para el factor VII, se encuentra en el brazo largo de cromosoma 13. El gen consiste en ocho exones, cada uno codifica un dominio especfico funcional dentro de la protena. Tanto la estructura gnica como la secuencia aminoacdica muestran la homologa con otros factores de coagulacin dependientes de vitamina K. Los pacientes con esta deficiencia presentan sangrado nasal, hemartrosis, hematomas y sangrado de mucosas. En el laboratorio se observa prolongacin del PT y TTPA. El TT es normal y el TS se presenta prolongado en algunos pacientes. El tratamiento utilizado es el reemplazo del factor X con plasma fresco congelado o con concentrados de complejo de protrombina. 4.7. Dficit de factor XI El dficit de factor XI se transmite como rasgo autosmico recesivo incompleto. La incidencia se estima en 1 en 1 milln de personas. Una mayor frecuencia este desorden se observa en personas de descendencia juda, con una frecuencia estimada de 5-11% en los judos Ashkenazi. Esta enfermedad se manifiesta en homozigotos o dobles heterozigotos con sntomas hemorrgicos moderados, generalmente secundarios a traumatismos y heridas. Se han descrito 3 tipos de mutaciones: (a) mutacin tipo I, resulta en una interrupcin del splicing; (b) mutacin tipo II, resulta en un codon stop y en la obtencin de una molcula no funcional y (c) mutacin tipo III, resulta en una substitucin de aminocidos y obtencin de una molcula disfuncional. Los pacientes con mutacin del tipo II presentan una gran tendencia al sangrado. Las mutaciones tipo II y III son comunes en judos Ashkenazi. En general todas las mutaciones del factor XI resultan en una disminucin de la protena proporcional a la actividad coagulante de factor XI. La mayora de las mutaciones se encuentran en los exones 9 y 10.
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La deficiencia del factor XI produce manifestaciones hemorrgicas, despus de intervenciones quirrgicas o traumatismos; el sangrado espontneo es muy rar o. Son infrecuentes la hemartrosis, el sangrado retroperitoneal y craneal. Otras manifestaciones hemorrgicas espontneas como menorragia, gingivorragia o epistaxis, pueden presentarse ocasionalmente. El diagnstico de la deficiencia del factor XI se puede realizar en tres situaciones: (a) a partir del estudio clnico de pacientes con tendencia hemorrgica, (b) en la evaluacin de un TTPA prolongado, y (c) en el estudio familiar de un paciente con diagnstico de dficit de factor XI. Pruebas de factor especfico se deben utilizar en el diagnstico. El tratamiento incluye transfusin de plasma fresco congelado, concentrado de factor XI sometido a procesos de inactivacin viral, frmacos antifibrinolticos y desmopresina. 4.8. Dficit de factor XII La deficiencia de factor XII es heredada como un rasgo autosmico recesivo. Esta deficiencia ha sido identificada en 1.5 - 3% de los donantes de sangre. Generalmente no se asocia con manifestaciones hemorrgicas. En el laboratorio se caracteriza por TTPA prolongado. Se requiere de pruebas factor especfico para el diagnstico. 4.9. Dficit de precalicrena La deficiencia de precalicrena, aparentemente, es heredada como un rasgo autosmico recesivo, sin embargo la informacin gentica es insuficiente. La mayor parte de pacientes son negros y la incidencia de consanguinidad es importante. Los heterocigotos con aproximadamente el 50% del nivel plasmtico normal pueden ser pesquisados. En la mayora de los casos se ha observado ausencia de precalicrena. Se ha pesquisado alteraciones en la fibrinolisis, quimiotaxis, respuesta inflamatoria. La importancia clnica del dficit de precalicrena es desconocida. El dficit de precalicrena se expresa en una moderada prolongacin del TTPA. El TP y TS son normales. El tiempo de lisis euglobulina se
pr esenta pr olongado. La alteracin se caracteriza por una activacin anormalmente lenta de la fase de contacto. 4.10. Dficit de kiningeno de alto peso molecular (HMWK) Esta deficiencia se hereda como un rasgo autonmico recesivo. Estudios inmunolgicos revelan la ausencia de kiningeno en los homocigotos, y 50% del nivel normal en los heterocigotos. Este defecto no se asocia con sangrado excesivo ni con trombosis. En el laboratorio se manifiesta con prolongacin del TTPA. El tiempo de lisis de euglobina est prolongado. 4.11. Deficiencia de 2 antiplasmina Sangrado importante incluyendo hemartrosis, fue asociado con deficiencia de 2 antiplasmina. Esta alteracin se hereda como rasgo autonmico recesivo, en el cual los heterocigotos tienen deficiencias detectables de esta antiproteasa, pero solo la mitad sangra. El sangrado presumiblemente es el resultado de lisis prematura del tapn hemosttico causando una regularidad en la actividad de plasmina.
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HEMATOLOGA
Captulo
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ALTERACIONES HEMORRAGPARAS ADQUIRIDAS DE LA COAGULACIN

Patricia Fardella B. e Ivn Palomo G.
1. Introduccin 2. Coagulacin intravascular diseminada 2.1. Tipos de CID 2.2. Etiologas 2.3. Elementos que gatillan la CID 2.4. Eventos fisiopatolgicos 2.5. Caractersticas clnicas 2.6. Laboratorio 2.7. Criterios diagnsticos 2.8. Tratamiento 3. Deficiencia de vitamina K 3.1. Causas de deficiencia de vitamina K 3.2. Diagnstico 3.3 Tratamiento 3. Alteraciones hemostticas en enfermedades hepticas 4.1. Enfermedades hepticas y fisiopatologa de la hemostasia 4.1.1. Hepatitis aguda 4.1.2. Enfermedad heptica crnica 4.1.3. Colestasia 4.1.4. Enfermedad heptica neoplsica 4.1.5. Cirugas 4.1.6. Trasplante heptico 4.2. Laboratorio 4.3. Tratamiento 5. Inhibidores adquiridos de la coagulacin 5.1. Inhibidores de factor VIII 5.1.1. Clasificacin 5.1.2. Caractersticas 5.1.3. Deteccin 5.1.4. Tratamiento 5.2. Inhibidores de factor IX 5.3. Inhibidores de factor XI 5.4. Inhibidores de factor V
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Resumen
Los trastornos hemorragparos adquiridos de la coagulacin son varios y pueden estar asociados a enfermedades sistmicas o a la presencia de anticuerpos que inhiben a los factores de coagulacin. En este captulo se describirn los fundamentos fisiopatolgicos, caractersticas clnicas, hallazgos de laboratorio y aspectos bsicos del tratamiento de los trastornos ms importantes de este tipo: coagulacin intravascular diseminada (CID), deficiencia de vitamina K, alteraciones hemostticas en enfermedades hepticas, e inhibidores adquiridos de la coagulacin. Para entender este captulo se requiere conocimiento previo de los sistemas de la coagulacin y sistemas fibrinoltico (captulo 20), algunos aspectos de hemostasia primaria (captulo 19) y pruebas de laboratorio de hemostasia (captulo 31).
1. INTRODUCCIN Los desrdenes adquiridos de la coagulacin corresponden a diferentes tipos de trastornos de la hemostasia, los cuales pueden estar asociados a enfermedades sistmicas o la presencia de anticuerpos que actan como inhibidores de los factores de coagulacin. Sin embargo, considerando su relevancia clnica y la gravedad que, en general, ellos involucran, los grandes sndromes adquiridos ms importantes son la coagulacin intravascular diseminada (CID) y los trastornos producidos en la enfermedad heptica. La CID es un trmino utilizado para describir un sndr ome de activacin anor mal de la coagulacin que resulta en generacin exagerada de trombina, lo cual condiciona un consumo de las protenas anticoagulantes naturales, de los factores de coagulacin y activacin de la fibrinolisis. Todo lo anterior tiene como traduccin clnica un sndrome hemorrgico y de tr ombosis de la microcirculacin que va a perpetuar el dao orgnico que pasa a ser mltiple y puede ocasionar la muerte. La enfermedad heptica tambin condiciona alteraciones mltiples de la coagulacin, considerando que el hgado es uno de los principales rganos que intervienen en la sntesis y degradacin de protenas. En presencia de dao heptico se afectan tanto la hemostasia primaria, secundaria, anticoagulantes naturales y fibrinolisis, como consecuencia de deficiencias de mltiples factores de la coagulacin (Factores vitamina K
dependientes, adems de factor V y fibringeno), 2 antiplasmina, plasmingeno, protena C (PC) y protena S (PS). La deficiencia de vitamina K, en general, se observa en pacientes que se encuentran en tratamiento anticoagulante oral con frmacos que inhiben su accin, en trastor nos nutricionales como son una dieta deficitaria, situacin que se presenta en alcohlicos o pacientes hospitalizados y en trastornos de la absorcin ocasionados por enfermedades intestinales o por uso de frmacos. Los inhibidores especficos de la coagulacin son menos conocidos por tener una menor frecuencia en clnica, sin embargo cuando ellos estn presentes pueden ocasionar cuadros hemorrgicos graves. En este captulo se abordarn los aspectos fundamentales de la fisiopatologa y clnica de cada una de estas entidades. 2. COAGULACIN INTRAVASCULAR DISEMINADA La CID es un desorden complejo de la coagulacin con una fisiopatologa que es variable y dependiente en gran medida del evento que lo gatilla; todo ello condiciona una gran variabilidad en los elementos fisiopatolgicos, de laboratorio y manifestaciones clnicas que hacen de este cuadro una situacin difcil para el clnico. Sin embargo, se puede decir que la CID es una alteracin trombohemorrgica sistmica que
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se presenta en algunas situaciones clnicas bien definidas y que se acompaa de alteraciones de laboratorio que indican activacin de pr ocoagulantes, activacin fibrinoltica, consumo de inhibidores de la coagulacin y evidencias bioqumicas de dao o falla orgnica. A pesar de que las manifestaciones hemorrgicas son ms evidentes, razn por la que muchos autores la consideran como un sndrome hemorrgico sistmico; la trombosis microvascular y a veces de grandes vasos, es una de las responsables de perpetuar el dao orgnico mltiple que acompaa a esta condicin y que finalmente puede lleva a la muerte del paciente. En las dcadas pasadas, a la CID se la denomin coagulopata de consumo, sin embargo este trmino no es adecuado porque muchos elementos no son consumidos sino que biodegradados por el sistema fibrinoltico. Posteriormente se us el trmino sndrome de defibrinacin el cual tampoco es apropiado, llegando finalmente a la denominacin de CID que es el que se usa actualmente. 2.1. Tipos de CID a) CID aguda descompensada. Es el cuadro ms conocido, grave y que en muchos casos lleva a la muerte del paciente. Se producen hemorragias y trombosis de la microcirculacin y los exmenes de laboratorio muestran alteraciones evidentes. b) CID crnica compensada. Son cuadros de larga data, asociados a una condicin crnica como enfer medades cardiovascular es, autoinmunes, renales, vasculares, desrdenes hematolgicos, neoplasias, dao heptico crnico, eclampsia, etc. En general son asintomticos y se descubren al realizar las pruebas de coagulacin, las que estn alteradas en grado moderado. c) Fibrinolisis primaria. Corresponde a estados en los cuales los hallazgos de laboratorio y las complicaciones clnicas, son dominados por los efectos de la fibrinolisis y fibrinogenolisis. Es un trastorno infrecuente, provocado la mayora de las veces por intervenciones quirrgicas en tejidos ricos en activadores del plasmingeno, como la prstata y los rganos pelvianos. Como no existe accin de la tr ombina las manifestaciones clnicas son de tipo hemorrgico. Hay degradacin generalizada de fibringeno por lo que no hay aumento de los
productos de degradacin de la fibrina (PDF) especficos de la fibrina (dmero D), pero s de los productos de degradacin del fibringeno. El control de la fibrinolisis est adems limitado por las bajas concentraciones plasmticas de alfa2-antiplasmina, y cuando este inhibidor est disminuido, el efecto sistmico de la plasmina es mayor. Una diferencia fundamental respeto los cuadros de CID, la cual involucra aumento de trombina como elemento principal. La caracterstica de laboratorio ms importante es el tiempo de lisis de euglobulinas, que mide la actividad fibrinoltica en el plasma, el cual est acortado, situacin que no se observa en la CID. 2.2. Etiologas La CID se ha asociado a mltiples entidades clnicas bien definidas, las que se mencionan a continuacin: a) Septicemias. La sepsis bacteriana se asocia a menudo con CID y puede ser causada por grmenes Gram negativos (endotoxina 1) o por Gram positivos (mucopolisacridos). El mecanismo de produccin es la activacin directa de ambas vas de la coagulacin (intrnseca y extrnseca; ver captulo 20) por componentes de membrana especficos del micr oorganismo, endotoxinas o mucopolisacridos, con activacin de plaquetas, monocitos/macrfagos y polimorfonucleares, que a su vez liberan material procoagulante de diversa ndole, los que tienden a perpetuar las condiciones necesarias para la generacin de trombina. Las endotoxinas activan el Factor XII y Factor XI, lo cual junto a la activacin plaquetaria y de monocitos, pueden activar cada uno por s mismo la coagulacin. Las endotoxinas tambin pueden liberar citoquinas como factor de necrosis tumoral alfa (TNF-), interleukina 1 (IL-1) y activar el sistema del complemento; lo cual produce destruccin endotelial y perpeta el dao multiorgnico. b) Trauma severo. El gatillamiento es por combinacin de mecanismos, que incluyen liberacin de grasas y fosfolpidos desde el tejido a la circulacin, hemlisis y dao endotelial. c) Accidentes obsttricos. Dentro de este grupo encontramos la embola de lquido amnitico, desprendimiento placentario, feto muerto retenido, eclampsia y aborto. Son cuadros agudos y graves que comprometen la vida de la madre y el feto. La causa de la activacin sistmica de la coagulacin es la liberacin de tejidos que expresan factor tisular
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y fosfolpidos aninicos. A continuacin se sealan algunas de las caractersticas de cada una de estas situaciones: Embola de lquido amnitico. ste parece ser el ms agudo y catastrfico de todos los accidentes obsttricos, ya que el lquido amnitico es un potente activador de coagulacin. El paso de lquido amnitico a la circulacin produce falla respiratoria aguda, colapso circulatorio, shock y CID. Desprendimiento placentario. En este caso pasan a la circulacin enzimas o tejidos, incluyendo material tipo tromboplastina que seran los responsables de activar la coagulacin. El grado de separacin placentaria se correlaciona con la extensin de la CID. Sndrome de feto retenido. Se observa presencia de CID en el 50% de los casos despus de las 5 semanas de producida la muerte, debido al paso de tejido fetal necrtico a la cir culacin mater na. Inicialmente se presenta con caractersticas de CID crnica compensada la que en un momento no determinado se transforma en un cuadro agudo. El tratamiento es simple cuando se trata de un feto nico, y consiste en extraer el feto de la cavidad uterina, sin embargo cuando hay muerte de un feto en presencia de un embarazo mltiple el manejo de este cuadro es complejo. En la eclampsia, en general se presenta un cuadro de CID rgano especfico, a nivel de placenta y rin, que en 10 a 15% puede transformarse en CID aguda. Abortos provocados. Se puede observar CID compensada o aguda cuando en la maniobra abortiva se han utilizado sustancias hipertnicas o cuando ha evolucionado como un aborto sptico.
e) Neoplasias hematolgicas. Las neoplasias hematolgicas tambin pueden asociarse a CID; las leucemias agudas y en especial la promieloctica o M3, mielomonoctica o M4 y monoltica o M5, pueden presentar esta complicacin. Tambin se ha observado en pacientes con metaplasia mieloide agnognica, policitemia vera y hemoglobinuria paroxstica nocturna. Dentro de este grupo la ms frecuente es la leucemia promieloctica en la cual la CID puede ser causa de muerte en las primeras etapas, ya que la quimioterapia puede desencadenar o agravar el cuadro hemorrgico el cual se asocia a hiperfibrinolisis. f) Hemlisis intravascular. En este grupo se incluyen las reacciones hemolticas transfusionales, transfusin masiva, anemias hemolticas intravasculares graves (Ej. mordedura de araa), anemia hemoltica micr oangioptica (AHM). Adems debe incluirse el Prpura trombocitopnica trombtica (PTT), Sndrome hemoltico urmico (SHU) y AHM inducida por quimioterapia. La faceta comn de la AHM es el dao endotelial, que causa adhesin y agregacin de plaquetas y la formacin de trombina en pacientes con PTT y SHU. La disminucin adquirida de la proteasa que escinde los multmeros del Factor von Willebrand (FVW) lleva a la acumulacin de multmeros de alto peso molecular que favorecen los fenmenos trombticos a nivel de la microcirculacin. La posibilidad de activar la coagulacin es independiente de la magnitud del fenmeno hemoltico, pudiendo incluso desencadenarse con hemlisis de poca magnitud y el mecanismo sera la liberacin de fosfolpidos de la membrana y de ADP de los glbulos rojos. g) Diferentes virus, incluyendo el virus de la inmunodeficiencia adquirida (HIV), se han asociado con CID, siendo ms comunes los de la varicela, hepatitis y citomegalovirus. El mecanismo desencadenante no est clarificado, pero se postulan una reaccin antgenoanticuerpo asociada con activacin de la va intrnseca de la coagulacin, una reaccin anormal de las plaquetas, y/o una activacin de la va extrnseca por liberacin de factor tisular por el endotelio daado. h) Quemaduras extensas. Las quemaduras pueden desarrollar fenmenos de CID; los mecanismos son mltiples e incluyen la destruccin de tejidos con paso de enzimas o material tisular a la circulacin y la microhemlisis con liberacin de fosfolpidos de
d) Neoplasias. La CID es una complicacin hemosttica bien conocida en los tumores slidos. En algunos casos el cuadro es de tipo crnico y presenta slo alteraciones de laboratorio, pero en algunos pacientes puede ser un cuadr o agudo. Se observa ms frecuentemente en pacientes con neoplasias avanzadas, cncer de mama y cuando existe presencia de necrosis en el tumor. El mecanismo de activacin no es claro, pero existen estudios que indican que el factor tisular expresado en la superficie de las clulas tumorales estara involucrado. Adems algunos reportes sealan una sobrevida menor en los pacientes que desarrollan CID, independiente del estadio tumoral.
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membrana y ADP desde los glbulos rojos. i) Elementos protsicos. Las vlvulas de Le Veen o Denver para r ealizar shunts peritoneovenosos o pleurovenosos en terapias paliativas, puede desencadenar fenmenos de CID aguda. Lo mismo se ha observado con el uso de balones de contrapulsacin artico, que pueden desencadenar fenmenos de CID crnica compensada o aguda. Estos elementos protsicos exponen la sangre a sustancias extraas y pueden de esta forma activar la coagulacin. j) Trastornos vasculares. Las patologas vasculares tambin se asocian a CID. El sndrome de Kasabach-Merrit corresponde a la asociacin de hemangiomas cavernosos y CID; alrededor de 25% de los pacientes con hemangiomas cavernosos gigantes presentan una CID crnica compensada, que puede evolucionar a un cuadro agudo por causas desencadenantes que no estn bien establecidas. En pacientes que presentan telangectasia hemorrgica familiar tambin ocurre un fenmeno semejante, con una incidencia de CID crnica compensada de alrededor de 50%. Tambin se ha observado en pacientes con enfermedad de pequeos vasos, como fenmenos vasoespsticos, angiopata diabtica grave y angiopatas asociadas a enfermedades autoinmunes. 2.3. Mecanismos que gatillan la CID Los diferentes agentes etiolgicos activan el sistema de la coagulacin en diferentes puntos. La va ms importante de activacin es la va extrnseca por medio del factor tisular, el cual activa al factor X, para posteriormente generar trombina. Por mecanismos de retroalimentacin la trombina activa los factores de la va intrnseca, lo que contribuye a una mayor formacin de trombina. La va intrnseca tambin puede ser activada en forma directa. La activacin del factor XII determina la activacin de la va de las kininas a travs de trasformacin de pre-kalikreina en kalikr eina. La kalikreina transfor ma el plasmingeno en plasmina. Tambin debe destacarse la accin de citoquinas y de pptidos vasoactivos para iniciar y perpetuar la CID. El TNF, IL-1, IL-6 e interfern (IFN-) participan en la activacin de la coagulacin. Tambin se ha observado que TNF, IL-1, IL-6 y endotoxinas inhiben la actividad de la trombomodulina endotelial y soluble; este
hecho deter mina una disminucin de la actividad anticoagulante natural a travs de la PC y PS, favoreciendo los fenmenos trombticos (ver captulo 20). Estos eventos producen mayor dao endotelial, creando un crculo vicioso que lleva a un mayor dao orgnico. 2.4. Eventos fisiopatolgicos Las alteraciones fisiopatolgicas de la CID son complejas. Una vez que la coagulacin ha sido activada por diferentes eventos (ver punto 2.2), la presencia de trombina y de plasmina en la circulacin deter minarn los fenmenos fisiopatolgicos de este cuadro. a) Generacin de trombina. En modelos animales se encontr que la generacin de trombina est exclusivamente mediada por la va extrnseca involucrando al factor VIIa y factor tisular. La inhibicin del factor VIIa o factor tisular suprimi totalmente la generacin de trombina inducida por endotoxinas, mientras que la inter ferencia de la va intrnseca de la coagulacin no interfiri en la activacin de la coagulacin. La trombina cumple diversas funciones en la hemostasia: transforma fibringeno en fibrina; activa a los factores XI, VIII y V; activa al Factor XIII, que es el encargado de estabilizar la fibrina; es un potente agonista plaquetario; se une a la trombomodulina para activar PC; libera al inhibidor de la fibrinolisis activado por trombina (TAFI). b) Inhibidores naturales de la coagulacin. Los principales anticoagulantes fisiolgicos parecen verse afectados. Los niveles plasmticos de AT, III estn marcadamente disminuidos como resultado de la coagulacin, degradacin por elastasa liberada por neutrfilos activados y sntesis alterada de AT, III. Tambin se ha descrito alteraciones en el sistema de la PC. c) Defectos del Sistema fibrinoltico. El sistema fibrinoltico es inhibido en el momento de mxima activacin. La inhibicin se asocia un aumento plasmtico de los niveles del inhibidor del activador del fibringeno tipo 1 (PAI-1). Aunque hay actividad fibrinoltica en respuesta a la formacin de fibrina, el nivel de actividad es insuficiente para contrarrestar el depsito de fibrina sistmico. Al producirse un aumento de la actividad de la
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trombina, ella rompe al fibringeno, liberando fibrinopptidos A, B y fibrina. Esta fibrina soluble, va a ir a formar polmeros de fibrina que son estabilizados por la accin de factor XIII. Por otra parte el aumento de la actividad de plasmina tambin acta sobre el fibringeno, transformndolo en PDF. Estos PDF son de varios tipos, X, Y, D, E. Los FDP X e Y van a interferir en la polimerizacin normal de la fibrina y junto con los PDF D y E producen disfuncin plaquetaria. Ambas situaciones contribuyen con el fenmeno hemorrgico. La plasmina adems acta sobre la fibrina, que cuando ha sido estabilizada por el factor XIII va a dar origen al dmero D que es un sensible marcador de trombosis. Finalmente la plasmina tambin es capaz de biodegradar los factores V, VIII, IX y XI. Todos estos productos pueden ser detectados en el laboratorio y contribuyen a realizar el diagnstico de CID. 2.5. Caractersticas clnicas Las manifestaciones clnicas estn determinadas muchas veces por la condicin desencadenante de la CID, en pacientes crticamente enfermos. Los signos ms frecuentes son de tipo hemorrgico, destacando el prpura y petequias; en los pacientes sometidos a ciruga o trauma, el sangrado de los sitios comprometidos y sitios de puncin es otro hallazgo frecuente.
Tambin puede manifestarse por trombosis de la microcirculacin que afecta la funcin renal, pulmones (sndrome de distress respiratorio del adulto) y cerebro. Las lesiones necrticas de la piel pueden ser frecuentes y su manifestacin ms severa es la prpura fulminante que se puede observar en la meningococcemia. La pr esencia de AHM tambin es una manifestacin frecuente. 2.6. Caractersticas de laboratorio El diagnstico se basa en la deteccin de indicadores in vivo de activacin de la coagulacin en pacientes sin evidencias de formacin localizada de trombos. El tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) suelen estar pr olongados. Hay biodegradacin inducida por plasmina de varios factores (FV, FVIII, FIX y FXI). El tiempo de trombina (TT) generalmente est alargado por disminucin del fibringeno y efecto de los productos de degradacin del fibringeno (PDF). El recuento de plaquetas suele estar disminuido en la CID, aunque con rangos muy variables, desde cifras tan bajas como 2.000-3.000/L a 100.000/L (normal: 150.000-400.000/L). En la tabla 23-1 se muestra un cuadro diferencial entre CID descompensada, CID crnica y Fibrinolisis primaria.
Tabla 23-1. Diferencias entre CID aguda descompensada, CID crnica y Fibrinolisis primaria CID aguda descompensada Recuento de plaquetas Fibringeno PDF Factor V Factor VIII Lisis de euglobulinas Test sulfato de protamina Negativo Positivo CID crnica -N -N- - -- Negativo Positivo Fibrinolisis primaria N Positivo Negativo
PDF: productos de degradacin de la fibrina; : disminuido; : aumentado; N: normal
2.7. Criterios diagnsticos En general la CID se encuentra en un contexto clnico bien definido, en un paciente grave, con
manifestaciones hemorrgicas y con menos frecuencia, evidencia de trombosis. Los criterios diagnsticos de laboratorio, se sealan a continuacin:
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Evidencias de activacin procoagulante: elevacin del fragmento 1-2 de protrombina, elevacin de fibrinopptido A y B, y elevacin del dmero D. Evidencias de activacin de la fibrinolisis: elevacin del dmero D, elevacin de los PDF, y elevacin de los niveles de plasmina. Evidencias de consumo de inhibidores: disminucin de ATIII, disminucin de 2antiplasmina, y disminucin de PC y protena S. Evidencias de laboratorio de dao orgnico: elevacin de LDH, elevacin de creatinina, disminucin del pH, disminucin de pO2.
2.8. Tratamiento Los aspectos fundamentales del tratamiento de la CID son los siguientes: a) Control de la causa. Es uno de los elementos ms importantes ya que la exposicin prolongada a agentes desencadenantes puede agravar la CID. La eliminacin de la causa de la CID puede ser rpida en las pacientes obsttricas, a travs de una cesrea o la evacuacin uterina. En el paciente crtico cursando una sepsis grave, debe realizarse un rpido control de la infeccin y del compromiso hemodinmico a la que ella conduce. Las fracturas deben ser estabilizadas y los tejidos necrticos retirados. b) Minimizar la lesin endotelial. Se debe detener el proceso inflamatorio local. El tratamiento del shock en la restauracin de la microcirculacin se refiere a corregir la actividad proteoltica local y de la liberacin precoz de mediador es inflamatorios por medios farmacolgicos. c) Terapia de reemplazo. Est indicada slo en pacientes que presentan sangrado. El consumo de factores de coagulacin puede ser corregido con crioprecipitados, concentrados de plaquetas y plasma fresco congelado. Esta terapia puede reducir la tendencia al sangrado. La terapia con plasma fresco o crioprecipitados, aporta tanto factores procoagulantes como anticoagulantes naturales. d) Inhibir las proteasas de la coagulacin. La inhibicin de la trombina es fundamental en el tratamiento de la CID. Una de las formas de inhibir las proteasas es con el uso de heparina, sin embargo sta puede agravar seriamente la
hemorragia de muchos pacientes. La heparina en dosis bajas por va subcutnea o en dosis teraputica endovenosa es recomendada slo en pacientes con CID compensada. En pacientes con feto muerto retenido en el contexto de un embarazo gemelar, puede ser de gran utilidad para evitar que una CID crnica se trasforme en aguda, permitiendo as que el feto vivo llegue a una edad gestacional que le per mita sobrevivir. En pacientes que sangran, la heparina no debiera ser usada, a excepcin de casos crticos en que la reposicin de los componentes de coagulacin falla para detener una hemorragia masiva y no se dispone de otras terapias como ATIII, en estos casos puede usarse en infusin continua en dosis bajas. El uso de heparina no es recomendado en pacientes con CID y sepsis. ATIII. La ATIII es un potente anticoagulante natural que se une a los factores de coagulacin activados. Adems induce la liberacin de prostaciclina desde la pared del vaso, la cual tiene un marcado efecto antiinflamatorio. La ATIII debe usarse como monoterapia y no asociada a heparina para no agravar los sntomas hemorrgicos. La dosis es 1.500 a 3.000 unidades/da por 2 das. Inhibidores sintticos de proteasas. Se puede utilizar infusin continua de ofgabexate mesilate (FOY) o nafamostat mesilate (FUT). Estudios multicntricos controlados muestran que son efectivos en mejorar la respuesta clnica, el recuento de plaquetas y el TP comparado con la ATIII.
e) Administracin de otros anticoagulantes naturales. Son ms efectivos que la heparina ya que no exacerban la tendencia al sangrado. PC activada. puede inhibir la generacin de trombina y acelerar la actividad fibrinoltica. La dosis es de 5.000 a 10.000 unidades por 2 das. En el momento actual tanto la AT III como la PC activada recombinante humana seran las mejores alter nativas de manejo para pacientes con CID aguda. Inhibidor del Factor Tisular. Es una intervencin teraputica lgica, ya que el factor tisular es uno de los principales implicados en la etiopatogenia. El inhibidor del factor tisular es un potente inhibidor de
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la va extrnseca de la coagulacin; se une a factor Xa para inhibir el complejo factor VIIafactor tisular. Existen estudios clnicos que estn en marcha. f) Antifibrinolticos. Pueden ser utilizados en leucemia promieloctica aguda, ya que en ella se observa sndrome hemorrgico asociado a hiperfibrinolisis. Se utiliza cido tranexmico por va oral o endovenosa. 3. DEFICIENCIA DE VITAMINA K La vitamina K fue descubierta en 1929 y ella juega un rol importante en la coagulacin ya que interviene en la carboxilacin de las protenas de la coagulacin como son los factores II, VII, IX y X, y las protenas C y S que son anticoagulantes naturales. La vitamina K produce carboxilacin del cido glutmico transfor mndolo en carboxiglutmico, a travs de una enzima carboxilasa que es vitamina K dependiente (ver captulo 20). La vitamina K se transforma en epxido-vitamina K, la cual a travs de una epxido reductasa vuelve a transformarse en vitamina K, para continuar el ciclo. La accin de la epxido reductasa es bloqueada por la warfarina (anticoagulante oral) produciendo una acumulacin de la forma epxica. Al alterarse la carboxilacin del cido glutmico se altera la carboxilacin de las protenas de la coagulacin antes sealadas a su forma activa, ya que la carboxilacin permite a los factores unirse al calcio; los productos descarboxilados son conocidos como PIVKA (protein induced in vitamin K absence, protenas inducidas en ausencia de vitamina K), los cuales tienen una actividad biolgica muy reducida. La alteracin de la carboxilacin puede estar determinada por ausencia de la vitamina o por alteracin de la funcin heptica. Existen tres tipos de vitamina: K 1 o phylloquinona, que se encuentra en los vegetales verdes; K2 o menaquinona producida por bacterias de la flora intestinal, es la principal forma de depsito heptico; y K3 o menadiona vitamina K obtenida de la madre. 3.1. Causas de deficiencia de vitamina K Ingesta inadecuada: dieta pobre en pacientes con aporte parenteral prolongado sin aporte.
Malabsorcin: en ausencia de sales biliares por obstruccin de conductos biliares o por mala absorcin intestinal secundaria a enfermedades inflamatorias del intestino. Alcoholismo Dr ogas: Cumarnicos (war farina, acenocumarol, raticidas) Antibiticos, (cefalosporinas), salicilatos, megadosis de vitamina E, y anticonvulsivantes.
3.2. Diagnstico La tendencia al sangrado aparece cuando los niveles de factores de coagulacin son < 30 35%. En general se prolonga el TP, el cual evala prcticamente todos los factores vitamina K dependiente, excepto el factor IX. Cuando la deficiencia es ms severa puede prolongarse el TTPA. El TT siempre es normal. Al realizar en el laboratorio estudios de mezcla de plasma del paciente ms plasma normal en relacin 1:1, estos tiempos se normalizan; ello indica que la prolongacin del TP y eventualmente el TTPA se deben al dficit de factores de la coagulacin y no a la presencia de inhibidores especficos de la coagulacin. Si el paciente ha recibido vitamina K recientemente, puede haber normalizacin del factor VII, pero los factores II y X an estarn disminuidos. 3.3. Tratamiento A los pacientes que presentan esta deficiencia se debe administrar 5 mg de esta vitamina por va subcutnea por 3 das. La ausencia de respuesta indica que existe dao heptico. 4. ALTERACIONES HEMOSTTICAS EN ENFERMEDADES HEPTICAS El hgado es el principal sitio de sntesis de protenas procoagulantes, fibrinolticas e inhibitorias de la coagulacin. Los trastornos de la hemostasia asociados a desrdenes hepticos presentan dos mecanismos: disminucin de la sntesis de protenas de la coagulacin, de la fibrinolisis e inhibitorias, y disminucin del aclaramiento de los componentes hemostticos activados. Las enfermedades hepticas tales como cirrosis y hepatitis, afectan la capacidad de sntesis del rgano. Los cambios hemostticos son frecuentemente sutiles. La prolongacin del TP
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es considerado un signo de gravedad de la enfer medad y puede ser causado por disminucin de la sntesis de los factores vitamina K dependientes, baja ingesta de la misma vitamina o mala absorcin de sta. Aumento de la actividad fibrinoltica y trombocitopenia tambin pueden presentarse en la enfermedad heptica. 4.1. Enfermedades hepticas y fisiopatologa de la hemostasia 4.1.1 Hepatitis aguda En pacientes con hepatitis aguda, el sndrome hemorragparo es raro. La alteracin de laboratorio ms frecuente es trombocitopenia leve, clnicamente insignificante (100.000150.000 plaquetas/ L). La patognesis parece ser variada y compleja, incluyendo: (a) esplenomegalia, (b) disminucin de la produccin plaquetaria por infeccin viral de los megacariocitos, (c) interaccin directa entre el virus y plaquetas en circulacin produciendo fagocitosis, (d) activacin de plaquetas y remocin pr ematura de stas desde la circulacin, y (e) destruccin plaquetaria mediada por complejos inmunes y anticuerpos. La tr ombocitopenia leve se resuelve rpidamente durante el estado de recuperacin de la hepatitis. La trombocitopenia moderada es sugerente de un pronstico desfavorable. Las anormalidades funcionales de las plaquetas son usualmente leves y de poca significancia clnica. El mecanismo por el cual estas alteraciones plaquetarias ocurren no est bien definido. Las anor malidades de los factores de la coagulacin se reflejan en prolongacin del TP (TP), asociado con la gravedad del dao celular y sin considerar la etiologa especfica de la enfer medad; el TP predice mejor que la bilirrubina, transaminasas o albmina srica el dao heptico. Una condicin de produccin deficiente puede ser relacionada con una deficiencia de la vitamina K. La sntesis de los factores vitamina K dependientes puede ser interrumpida debido a perodos prolongados de desnutricin o uso prolongado de antibiticos de amplio espectr o. Los factores II (protrombina), VII y X se presentan ms frecuente y marcadamente disminuidos que el factor IX y otros factores no dependientes de vitamina K. Los factores V, XI y XIII son sintetizados por el hgado, pero no son vitamina K dependientes;
todos estos factores son deficientes en pacientes con enfermedad heptica grave. Los niveles plasmticos de FXII, pre-kalicrena (PK), kiningeno de alto peso molecular (KHMW) tambin pueden estar disminuidos. El dficit de los factores del sistema de contacto no interviene en la patognesis del sndrome hemorragparo. El incremento del factor VIII es independiente del aumento del FVW, lo que se debe a la accin de dicho factor como reactante de fase aguda en respuesta a la inflamacin. Tambin existe evidencia que el FVIII puede presentar anor malidades cualitativas pudiendo encontrarse un TTPA prolongado. El fibringeno puede estar normal o aumentado (reactante de fase aguda). Tambin se puede encontrar hipofibrinogenemia debido a disminucin en la sntesis por el hepatocito, siendo un indicador desfavorable en el pronstico de hepatitis aguda. Rara vez se encuentra una disfibrinogenemia en hepatitis aguda, siendo ms comn en hepatitis fulminante, en donde se observa prolongacin del TT con niveles normales de fibringeno. Los pacientes con hepatitis fulminante pueden desarrollar CID, en donde se observa una marcada hipofibrinogenemia en asociacin con trombocitopenia, y altos niveles de PDF. El dao hepatocelular marcado, asociado a la infeccin viral puede gatillar la liberacin de sustancias procoagulantes desde el hepatocito necrtico, expresin de factor tisular sobre clulas mononuclear es sanguneas o clulas endoteliales, liberacin de mediadores inflamatorios (IL-2 o TNF) y acumulacin de los factores de la coagulacin activados por una disminucin en el flujo del sistema portal. La CID puede verse favorecida por un descenso en el aclaramiento de los factores de la coagulacin por el hgado y disminucin de los niveles de las protenas reguladoras de la coagulacin, debida a una menor sntesis ms que por consumo. 4.1.2. Enfermedad heptica crnica En pacientes con hepatitis crnica o cirrosis se puede observar trastornos en la hemostasia primaria, secundaria, fibrinolisis y anticoagulantes naturales. Lo anterior conduce a manifestaciones especialmente de tipo hemorrgico, pero en algunos escasos pacientes podran presentarse tambin fenmenos trombticos. A continuacin se observan las
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alteraciones que se pueden observar en la hemostasia primaria y secundaria: Alteraciones de la hemostasia primaria. Consisten en trombocitopenia de grado variable que parece ser causada por un aumento del pool esplnico. En individuos normales ste corresponde a un tercio de la masa plaquetaria total, mientras que en la enfermedad heptica crnica con esplenomegalia congestiva puede alcanzar al 60-90% del total de las plaquetas del cuerpo. Tambin se observa destruccin plaquetaria mediada por anticuerpos, acompaado de la incapacidad de la mdula sea para compensar con un aumento de la produccin de plaquetas. Las anormalidades en la funcin de stas son atribuidas a presencia de PDF en el plasma que inhiben la agregacin plaquetaria, disminucin de nucletidos adenina totales asociados con un aumento de ATP/ADP en el medio, aumento del colesterol en la membrana plasmtica y disminucin de los mecanismos de seal de transmembrana plaquetaria. En pacientes alcohlicos, la trombocitopenia es causada adems porque el alcohol disminuye la sntesis de plaquetas por los megacariocitos y existe dficit de folato. Alteraciones de la hemostasia secundaria. Estas alteraciones se deben a que la prdida progresiva de los hepatocitos conduce a una disminucin en los niveles plasmticos de todos los factores de la coagulacin por disminucin en su sntesis (excepto el FVIII). La disminucin de los factores vitamina K dependientes se correlaciona con la gravedad de la enfermedad, sin embargo la disminucin del FV predice mejor la extensin del dao heptico. Los niveles de fibringeno se encuentran normales o aumentados, aunque en etapas avanzadas se puede observar una hipofibrinogenemia leve a moderada. Varios mecanismos pueden explicar esto: (a) disminucin en la sntesis, (b) prdida en los espacios extravasculares (edema, ascitis), (c) CID, generalmente crnica, y (d) aumento del catabolismo por plasmina. Un porcentaje alto de los pacientes presentan disfibrinogenemia, en donde el fibringeno tiene un excesivo contenido de cido silico (similar al fibringeno fetal); la disfibrinogenemia se detecta al laboratorio por un TT prolongado con fibringeno nor mal o slo levemente disminuido y PDF nor mal o levemente aumentado.
La concentracin de los factores del sistema de contacto y el FXIII, disminuyen los primeros por una baja en la sntesis y el segundo por consumo. En estos pacientes se puede observar CID crnica; con acortamiento de la vida media del fibringeno, aumento del fibrinopptido A, del complejo fibringeno/fibrina de alto peso molecular y aumento de dmero D lo anterior se puede explicar por un acelerado catabolismo del fibringeno y posiblemente de otros factores de la coagulacin sensibles a la trombina. El posible mecanismo sera la liberacin de sustancias procoagulantes al torrente sanguneo desde los hepatocitos necrticos. La disminucin de los anticoagulantes naturales se traduce en disminucin de ATIII, PC, PS y cofactor II-heparina y se correlaciona con la gravedad del dao heptico. La presencia de fibrinolisis aumentada se observa en dao heptico ter minal y se caracteriza por una disminucin en el tiempo de lisis de euglobulinas, hipofibrinogenemia y aumento de los PDF sricos. Se debe a un aumento de los activadores del plasmingeno, especialmente activador tisular del plasmingeno (t-PA), y una disminucin del aclaramiento heptico de los inhibidores de los activadores del plasmingeno, especialmente PAI-1; la 2-antiplasmina tambin disminuye. Todo esto contribuye a que ocurra: (a) disminucin del plasmingeno, (b) aumento del fibrinopptido B y de los PDF y (c) aumento del complejo plasmina/ 2 -antiplasmina. La hiperfibrinolisis es una causa importante del sndrome hemorragparo en la enfermedad heptica avanzada. La magnitud del sangramiento en la enfermedad heptica crnica se relaciona con la magnitud de la trombocitopenia, disminucin de la funcin plaquetaria, de los factores de coagulacin y la presencia o no de hiperfibrinolisis; todos ellos relacionados a la gravedad del dao heptico. En algunos pacientes con dao heptico grave se puede observar fenmenos trombticos como consecuencia de una disminucin severa de las protenas anticoagulantes naturales (ATIII, PC y S), cuyo manejo es muy difcil, ya que el riesgo hemorrgico de ellos prcticamente contraindica la anticoagulacin.
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4.1.3. Colestasia Una obstruccin en el tracto biliar puede causar disminucin en la absorcin de la vitamina K1 dependiente de sales biliares en el intestino delgado, producindose en estos pacientes una disminucin de los factores VII, X, II y IX, mientras que otros factores pueden permanecer normales o aumentar como es el caso de los factores VIII, V y fibringeno, y los anticoagulantes naturales PC y ATIII. 4.1.4. Enfermedad heptica neoplsica En neoplasia primaria avanzada y en presencia de metstasis heptica, las anormalidades hemostticas son similares a las encontradas en pacientes con enfer medad hepatocelular avanzada, con la diferencia que en las neoplasias el fibringeno y a veces el FV, estn aumentados. Un TT prolongado es mucho ms frecuente en pacientes con hepatocarcinoma que en pacientes con cirrosis heptica, probablemente porque en estos pacientes se ha descrito la presencia de disfibrinogenemia (fibringeno rico en cido silico); adems tienen protrombina no carboxilada. 4.1.5. Cirugas La ciruga en pacientes con enfer medad heptica avanzada y coagulopata significativa est asociada con una gran incidencia de sangrado anormal y muerte. La ciruga mayor (shunt porto-sistmico, ortopdica) provoca la liberacin de grandes cantidades de activador del plasmingeno desde los tejidos injuriados, lo cual puede sobrepasar transitoriamente los mecanismos de compensacin en los pacientes con dao heptico, produciendo una hiperfibrinolisis primaria y sangrado severo. Tambin tienen alto riesgo de sangrado las cirugas a la vescula y del tracto biliar. En hepatectoma parcial por trauma heptico tambin puede presentarse un sndrome hemorragparo. Los pacientes a los que se les implanta un shunt peritoneo-venoso tienen alto riesgo de cursar con CID, debido al paso de clulas y sustancias procoagulantes desde el lquido asctico a la circulacin. Este cuadro puede ser limitado si antes de instalar el shunt se realiza drenaje del lquido asctico o reduciendo el flujo del lquido dentro del conducto. En raras ocasiones el shunt debe retirarse por la CID.
4.1.6 Trasplante heptico Alteraciones hemostticas severas son comnmente observadas en trasplantes hepticos, siendo el perodo ms crtico la breve fase anheptica que ocurre durante el procedimiento quirrgico y las primeras horas despus de la restauracin de la circulacin al injerto. Esto, debido a que la coagulopata se cree es una consecuencia de la prdida de la sntesis de los factores de la coagulacin. No est clar o si la liberacin de sustancias tromboplsticas por dao endotelial y la prdida del aclaramiento heptico de los factores de la coagulacin activados durante un perodo de coagulacin intravascular y consumo de factores juega un rol importante en la coagulopata durante el perodo anheptico. Se ha observado en algunos casos un aumento de la actividad fibrinoltica debida al aumento del activador tisular del plasmingeno (t-PA) plasmtico y disminucin del PAI-1 durante la fase anheptica y despus de la recirculacin. Tambin se puede observar una trombocitopenia marcada durante y despus del trasplante lo que contribuye al sangrado perioperatorio. Si el injerto es bien preservado, las alteraciones de la coagulacin se resuelven rpidamente, pero si el hgado trasplantado es rechazado, los defectos hemostticos persisten tendiendo a aumentar la complicacin por activacin de los sistemas de la coagulacin y fibrinoltico. 4.2. Laboratorio En pacientes con dao heptico crnico la evaluacin de la hemostasia debe ser completa, no basta con realizar recuento de plaquetas, TP y TTPA, ya que stos pueden cursar con CID crnica, hiper fibrinolisis primaria y disfibrinogenemia. El recuento de plaquetas puede estar disminuido. El TP y TTPA estn frecuentemente prolongados por la disminucin de todos los factores de la coagulacin (excepto FVIII). La administracin de vitamina K muchas veces logra algn grado de correccin del TP; si no hay correccin la alteracin se debe atribuir al dao heptico. Como los factores V y VII son sintetizados por el hgado, pero slo el FVII es vitamina K dependiente, una disminucin de
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ambos es consistente con una enfermedad heptica, mientras que una reduccin del slo FVII es consistente con una deficiencia de vitamina K. En cirrticos el TP es mejor predictor, a largo plazo, de falla hepatocelular que los niveles sricos de albmina, acetilcolinesterasa y colesterol. El fibringeno en presencia de disfibrinogenemia puede encontrarse normal pero el TT estar prolongado. El tiempo de lisis en estos casos estar normal. En presencia de hiperfibrinolisis el paciente presenta niveles muy bajos de fibringeno, tiempo de lisis de euglobulinas acortado, indicando la actividad fibrinoltica sobre el fibringeno. El tiempo de trombina (TT) tambin estar prolongado. La CID crnica es menos frecuente y habitualmente cursa con trombocitopenia leve o recuento normal de plaquetas, discreta prolongacin del TP, TTPA y TT los tiempos y fibringeno normal o levemente disminuido. Los PDF estn discretamente aumentados y el dmero D est elevado. 4.3. Tratamiento La terapia debe ser enfocada al sitio, naturaleza y extensin del sangrado. Siempre es prudente la administracin de vitamina K1 (10-20 mg iv) y observar el efecto en el TP 6-8 horas despus. El plasma fresco congelado contiene todos los factores e inhibidores de la coagulacin presentes en la circulacin sangunea, por lo que tericamente es el tratamiento ms adecuado para corregir los mltiples defectos encontrados en enfermedades hepticas. En la prctica este reemplazo es difcil por las grandes cantidades de plasma requeridos para corregir el TP cuando est prolongado (20-30 mL/Kg.). La transfusin de concentrados plaquetarios puede ser til en pacientes con trombocitopenia marcada y sangrado importante. El aumento del recuento plaquetario puede ser menor a lo esperado debido al secuestro esplnico de las plaquetas transfundidas. En la preparacin de cirugas mayores, el recuento plaquetario debera mantenerse >100.000/ L. Siempre es de utilidad el uso de antifibrinolticos (cido tranexmico), por va oral o endovenosa, especialmente cuando el paciente tiene hiperfibrinolisis primaria.
En pacientes sometidos a trasplante heptico se ha demostrado til para disminuir el sangrado en forma profilctica tanto la aprotinina como el cido tranexmico por va endovenosa. En casos de mayor gravedad se pueden usar los concentrados de complejos de protrombina, en donde la adicin de pequeas cantidades de plasma normal y heparina a los frascos de estos concentrados trombognicos inactivan proteasas activadas y minimizan el riesgo trombtico de estos concentrados. 5. INHIBIDORES ADQUIRIDOS DE LA COAGULACIN Los inhibidores adquiridos de la coagulacin son anticuerpos circulantes que neutralizan en forma especfica la actividad procoagulante de varios factores de coagulacin produciendo sangramiento. Estos inhibidores son diferentes a los anticuerpos antifosfolpidos (anticoagulante lpico), ya que stos son inhibidores inespecficos que se asocian a fenmenos trombticos. Los inhibidores especficos pueden ser de dos tipos: (a) Aloanticuerpos, asociados a trastornos congnitos de la coagulacin; y (b) Autoanticuerpos, asociados a pacientes con y sin trastornos inmunes (postparto, ancianos, enfermedades autoinmunes). Los inhibidores de factor VIII son los ms frecuentes. 5.1. Inhibidores de factor VIII La incidencia de inhibidores en pacientes hemoflicos es de aproximadamente el 15%. Existe una predisposicin gentica a la formacin de inhibidores, siendo ms frecuente en: afroamericanos, hermanos de pacientes con inhibidor, disminucin de HLA A1 y ausencia de HLA CW5. Existe un grupo pequeo que tiene bajos ttulos y en ellos el inhibidor puede desaparecer a pesar de continuar con el uso de factor VIII. Sobre el 95% de inhibidores ocurren en pacientes portadores de hemofilia grave. Tambin se puede observar en ancianos, postparto (3-12 meses) y en enfermedades autoinmunes; como se dijo previamente estos son autoanticuerpos.
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5.1.1. Clasificacin Una forma de cuantificar los inhibidores es determinando las unidades Bethesda (UB) o bien las unidades Oxford (1 UB = 1.21 U Oxford). 1 UB de actividad de inhibidor es la que disminuye el TTPA en un 50% del basal. La determinacin de estas unidades permite clasificar a los pacientes en altos o bajos respondedores. Los respondedores de alto ttulo presentan niveles > 10 U Bethesda y representan ms del 60% de los pacientes. Por su parte los bajo respondedores presentan < 5 U Bethesda y corresponden a alrededor del 25% de los pacientes. El clasificar los pacientes en altos y bajos respondedores permite elegir la terapia a utilizar (ver punto 5.2.4). La presencia de inhibidores es menos frecuente en enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistmico (LES), asma, enfermedad intestinal inflamatoria, eritema multiforme, reaccin a drogas como penicilina y pnfigo. Tambin se puede observar presencia de inhibidores en portadores de gammapatas monoclonales, neoplasias y embarazo, sin embargo cerca de la mitad de los casos de inhibidores espontneos se ve en pacientes sanos, especialmente en los primeros meses postparto y en ancianos. La frecuencia de sangrado es mayor y la mortalidad es alta, sin embargo, puede haber remisin espontnea. 5.1.2. Caractersticas Los inhibidores son de origen oligoclonal. En general son de clase IgG y menos frecuentemente IgM. El factor VIII es una protena que contiene una cadena pesada y una liviana con diferentes dominios (A1-A2- B- A3- C1- C2) (ver captulo 20). En general los anticuerpos estn dirigidos contra los ubicados en las regiones A2 y C2. La reaccin entre el FVIII y los anticuerpos es tiempo dependiente, por lo que se describen dos tipos de reacciones: Reaccin tipo 1: En exceso de anticuerpo, resulta una completa neutralizacin del factor VIII y es irreversible. Es frecuente en hemoflicos transfundidos. Aportando dosis altas de factor VIII se pueden conseguir niveles hemostticos. Reaccin tipo 2: Los anticuerpos son de baja afinidad por factor VIII; la reaccin es reversible, por lo que generalmente
persisten niveles detectables de FVIII. Este tipo de reaccin se ve en autoanticuerpos adquiridos en forma espontnea. 5.1.3. Deteccin Se sospecha la presencia de inhibidores cuando en un paciente hemoflico el cuadro clnico se hace ms severo, no responde bien a la terapia de reemplazo y requiere mayores dosis de terapia para estabilizarse. En pacientes no hemoflicos se caracteriza por la aparicin espontnea de cuadros hemorrgicos en presencia de un TTPA prolongado. Cuando se sospecha un inhibidor, en presencia de TTPA prolongado, se debe realizar un estudio de mezcla en relacin 1:1 (plasma normal: y plasma del paciente). Esto permite determinar si la prolongacin del TTPA se debe a dficit de factores de la coagulacin o a la presencia de un inhibidor. Cuando el TTPA no corrige al realizar la mezcla se est frente a la presencia de un inhibidor. Muchas veces estos inhibidores son de accin lenta, por lo que un estudio de mezcla puede corregir cuando el TTPA se hace de inmediato pero al incubar a 37C por 2 horas se detecta el inhibidor. 5.1.4 Tratamiento Para el tratamiento de la presencia de inhibidores de FVIII se utilizan dos estrategias: (a) Prevenir la formacin de inhibidores por induccin de tolerancia; la que se puede lograr con exposiciones precoces y continuas a FVIII, y (b) Bloquear las clulas T que intervienen en la formacin de inhibidor. Para pacientes con sangrado con bajo nivel de inhibidor y bajo respondedor: se pueden usar dosis altas de FVIII. Si no responde o es alto respondedor con ttulos altos se puede usar FVIII de porcino o productos by-passing, tales como FEIBA, KONYNE-80 o rVIIa. Cuando se ha usado factor VIII de porcino tambin deben determinarse los ttulos de inhibidores. FEIBA. Este producto se trata de un complejo protrombnico; contiene factor VII principalmente en la forma activada, y factores II, IX y X en formas no activadas. El producto contiene casi igual actividad de factores del complejo protrombnico que de factor VIII inhibitor by-passing. Adems contiene 1-6 U/ml de FVIII coagulante antignico. Est indicado para el control de sangrado
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espontneo y para ciruga en pacientes portadores de inhibidores de FVIII o FIX. Tambin se ha usado en pacientes con inhibidores adquiridos de FVIII, XI y XII; hay un caso reportado donde fue efectivo en un paciente con inhibidor de factor von Willebrand. Pacientes con ttulos de inhibidor < 5 pueden usar factor antihemoflico; pacientes con ttulos de inhibidor entre 5-10 pueden usar ambos y pacientes con ttulos > 10 deben usar productos by-passing. Se puede usar asociado a antifibrinolticos, pero es preferible que stos sean usados 12 horas despus. La dosis habitual es de 75-100 U/Kg. cada 12 horas y la velocidad de infusin no debe ser superior 2 U/Kg./minuto. Se debe monitorizar la aparicin de signos de CID. Los pacientes con inhibidores adquiridos de FVIII, IX o XII, tienen tendencia a sangrar y a hacer fenmenos trombticos. No hay experiencia en nios ni en embarazadas. Complejo de Factor IX KONINE-80. Este complejo contiene factor II, IX, X y bajos niveles de FVII. Niveles de 20% son requeridos para una hemostasia normal, niveles bajo 5% se asocian a hemorragia. El factor IX transfundido tiene una vida media de 24 horas.
anticuerpos de isotipo IgG y la reaccin es tiempo dependiente. El tratamiento se realiza con plasma fresco, plasmafresis y productos by-passing (complejo protrombnico y rVIIa) Los anticuerpos espontneos o autoanticuerpos son ms frecuentes; son de clase IgG e IgM y se pueden encontrar en pacientes con enfermedades autoinmunes (LES, AR), pero raramente se manifiestan con hemorragia. En la mayora de los casos no se necesita terapia. 5.4. Inhibidores de factor V Los inhibidores de factor V son muy raros. Cuando se presentan pueden ser de isotipos IgG, IgM o IgA. La duracin es menor de 10 semanas y si hay sangrado requieren de tratamiento con concentrados plaquetarios o productos by-passing. El diagnstico se hace cuando se presenta prolongacin del TP y del TTPA y prolongados y tiempo de trombina normal. LECTURAS SUGERIDAS Advis, P. y Garca, H. Coagulacin Intravascular Diseminada En: Hematologa; diagnstico y teraputica, Osorio G. (ed.) Liendo, F., Anguita, T., Ros, E., Gutirrez, J. y Vargas, L. (coeds.) Editorial Mediterrneo. Captulo 37, 1998, pp. 457-460. Bick, R., Disseminated intravascular coagulation. Current concepts of etiology, pathophysiology, diagnosis and treatment. Hematol Oncol Clin N Am, 2003;17:149-76 Dalmau, A., Sabate, A., Koo, M., Bartolome, C., Rafecas, A., Figueras, J., Jaurrieta, E. The prophylactic use of tranexamic acid and aprotinin in orthotopic liver trasplantation: A comparative study. Liver traspl 2004;10:279-84. Gando, S. Disseminated intravascular coagulation in trauma patients. Semin Thromb Hemost 2001;27:585-92. Gerlach, H., Slama, K.J., Bechstein, W.O., Lohmann, R., Hintz, G., Abraham, K., Neuhaus, P., Falke, K. Retrospective statistical analysis of coagulation parameters after 250 liver transplantations. Semin Thromb Hemost 1993;19:223-32.
Se debe monitorizar la aparicin de CID o trombosis. Se sugiere usar heparina 2-5 IU/ml, sin embargo la trombosis puede ocurrir an con el uso de heparina. La dosis recomendada en pacientes con inhibidor es de 75 IU/Kg. cada 12 horas. Los pacientes con inhibidores autoinmunes se benefician con terapia inmunosupresora (ciclofosfamida, corticoides, azathioprina, ciclosporina, vincristina). Al inicio de la terapia se puede usar plasmafresis para disminuir la concentracin plasmtica de los anticuerpos. 5.2. Inhibidores de factor IX La incidencia inhibidores de factor IX es de 3%; se ven en deficiencias graves de factor IX. Son de clase IgG y su reaccin con FIX es menos dependiente del tiempo. La terapia es igual que para inhibidores de factor VIII, con altos y bajos respondedores. Inhibidores espontneos son muy raros, se tratan con inmunosupresores. 5.3. Inhibidores de factor XI La presencia de inhibidores de factor XI en dficit hereditario es infrecuente. Son
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HEMATOLOGA
Captulo
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TROMBOFILIAS
Jaime Pereira G., Guillermo Conte L. e Ivn Palomo G.
1. Introduccin 2. Trombofilias hereditarias 2.1. Deficiencia de antitrombina III 2.2. Deficiencia de protena C 2.3. Deficiencia de protena S 2.4. Factor V Leiden y resistencia a la protena C activada 2.5. Mutacin G20210A del gen de la protrombina 2.6. Disfibrinogenemias hereditarias 2.7. Deficiencia hereditaria de factor XII 3. Trombofilias adquiridas 3.1. Sndrome antifosfolpidos (SAF) 3.1.1. Anticuerpos antifosfolpidos 3.1.2. Antgenos 3.1.3. Patognesis 3.1.4. Clnica 3.1.5. Diagnstico 3.1.6. Tratamiento 3.2. Cncer 3.2.1. Molculas procoagulantes 3.2.2. Sistema fibrinoltico 3.2.3. Citoquinas 3.2.4. Interacciones celulares 3.3. Sndromes mieloproliferativos 3.4. Hemoglobinuria paroxstica nocturna 3.5. Sndrome nefrtico 4. Trombofilias por mecanismo mixto 4.1. Hiperhomocisteinemia 4.1.1. Patogenia 4.1.2. Diagnstico 4.2. Aumento de los niveles de factores de la coagulacin 5. Estrategia diagnstica
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RESUMEN
La trombofilia se ha definido como una condicin que predispone a la trombosis, como consecuencia de factores genticos, adquiridos o ambos. Entre los factores genticos que predisponen a la trombosis se encuentran las deficiencias de protenas anticoagulantes naturales tales como antitrombina III, protena C y protena S, y el aumento de funcin de algunos factores de la coagulacin (factor V Leiden y protrombina G20210A). Todos estos defectos presentan una mayor tendencia a la trombosis venosa la cual es de grado variable dependiendo del tipo de deficiencia. La trombofilia adquirida comprende una serie heterognea de defectos que a pesar de su inequvoca asociacin con un estado de hipercoagulabilidad, su patogenia es mayormente desconocida. Las trombofilias adquiridas de mayor relevancia clnica, ya sea por su gravedad o frecuencia incluyen el sndrome antifosfolpido, las enfermedades malignas, el sndrome nefrtico y enfermedades de la clula troncal hematopoytica. Existen algunas condiciones clnicas que predisponen a la trombosis cuyo origen es por un mecanismo mixto no habindose aclarado el grado de contribucin de factores genticos o adquiridos. Dos ejemplos de estas condiciones lo representan la hiperhomocisteinemia y el aumento en la concentracin de algunos factores de la coagulacin. La investigacin de laboratorio de las trombofilias debe estar enfocada hacia a aquellos pacientes en los cuales la probabilidad de obtener un resultado positivo es mayor o los hallazgos signifiquen un cambio en la conducta teraputica.
1. INTRODUCCIN El trmino trombofilia fue utilizado por primera vez por Egeberg en el ao 1965 en la descripcin de una familia con tendencia a la trombosis, en la que se demostr un dficit de antitrombina III. Posteriormente esta definicin se ha ampliado, incluyendo a cualquier paciente que presente una tendencia anormal a desarrollar fenmenos trombticos. El diagnstico inicial de trombofilia se hace inicialmente sobre bases clnicas cuando el paciente presenta una o ms de las caractersticas que se muestran en la tabla 24-1. Entre los pacientes que se presentan
clnicamente como portadores de trombofilia se puede distinguir dos categoras: (a) aquellos portadores de condiciones protrombticas heredables o trombofilia hereditaria, en los que esta condicin es el resultado de un defecto especfico a nivel de los mecanismos anticoagulantes naturales o de protenas procoagulantes (tabla 24-2) y (b) los pacientes portadores de una serie heterognea de condiciones clnicas que se asocian a un aumento del riesgo de desarrollar trombosis, lo que se conoce como trombofilia adquirida. En estos casos, la fisiopatologa es compleja y generalmente obedece a una combinacin de defectos del sistema hemosttico.
Tabla 24-1. Caractersticas clnicas de las trombofilias Historia familiar de trombosis Trombosis en paciente joven Trombosis recurrente Trombosis venosa idioptica o secundaria a estmulo mnimo (por ej: embarazo) Trombosis arterial y venosa Resistencia a la heparina Necrosis cutnea inducida por cumarnicos Prpura fulminans neonatal Trombosis venosa en sitio inusual
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Tabla 24-2. Causas de trombofilia Trombofilias hereditarias Factor V Leiden Mutacin G20210A del gen de protrombina Deficiencia de antitrombina III Deficiencia de protena C Deficiencia de protena S Disfibrinogenemia Deficiencia de factor XII Trombofilias adquiridas Sndrome antifosfolpido Cncer Sndromes mieloproliferativos Hemoglobinuria paroxstica nocturna Sndrome nefrtico
2. TROMBOFILIAS HEREDITARIAS La trombofilia hereditaria se podra definir como una tendencia al tromboembolismo venoso, determinada genticamente. Los defectos dominantes o combinaciones de defectos leves, se pueden presentar a edades tempranas, en forma recurrente y con historia familiar. Rasgos leves pueden descubrirse slo por estudio de laboratorio. Los defectos genticos que predisponen a la trombosis no inducen un riesgo permanente o continuo, sino que bajan el umbral frente a las interacciones con el medio ambiente. El trmino trombofilia hereditaria reconoce la existencia de un defecto gentico que predispone a la trombosis; sin embargo, debido a la naturaleza episdica de los eventos trombticos, ste requiere interactuar con otro factor (gentico o adquirido) para precipitar la enfermedad clnica. A continuacin se analizar las bases genticas y la fisiopatologa de los defectos ms comunes y en los cuales se encuentra bien establecida su predisposicin a la trombosis. Existen reportes de otras causas de trombofilia hereditaria tales como la disfibrinogenemia, alteraciones del sistema fibrinoltico, deficiencia de cofactor II de la heparina o trombomodulina, que son muy poco frecuentes o su asociacin con trombosis no ha sido claramente definida. Para facilitar la comprensin de este captulo es conveniente conocer en forma previa los aspectos consignados en el captulo 20. 2.1. Deficiencia de antitrombina III La deficiencia de antitrombina III (ATIII), el primer defecto de anticoagulante natural descrito, se demostr por primera vez en una familia con historia de trombosis venosa recurrente y niveles de ATIII entre 40-50%.
La herencia del defecto es del tipo autosmico dominante, por lo que afecta ambos sexos en igual proporcin. En la poblacin general la frecuencia de deficiencia sintomtica de ATIII ha sido estimada entre 1:2000 a 1:5000. Sin embargo, la deficiencia asintomtica puede ser tan frecuente como 1:600. En pacientes no seleccionados con historia de tromboembolismo venoso, la frecuencia es de 1,1%; en pacientes seleccionados es alrededor de 2%. La mayora de los pacientes son heterocigotos con niveles de ATIII entre 40-70%. Desde el punto de vista fenotpico se distinguen dos tipos de deficiencia de ATIII. En la deficiencia clsica o tipo I, que es el resultado de una sntesis disminuida de la protena biolgicamente normal, la actividad y el antgeno de ATIII se encuentran proporcionalmente reducidos en el plasma. En el tipo II, que se produce por defectos moleculares discretos, la actividad funcional se encuentra muy disminuida mientras que la determinacin inmunolgica (cantidad de la protena) es normal. En la mayora de los casos de deficiencia de ATIII se han demostrado defectos a nivel del gen, los que se encuentran registrados en bases de datos de actualizacin peridica. Deleciones mayores del gen son relativamente poco frecuentes y no se encuentra en ms del 10% de los casos de deficiencia tipo I. En este tipo, se han descrito ms de 100 diferentes defectos a nivel del gen, correspondiendo la mayora (> 80%), a mutaciones puntuales, tambin se han encontrado inserciones o deleciones cortas, que se traducen en trmino prematuro de la sntesis de ATIII o en molculas inestables o no secr etadas. La deficiencia tipo II es habitualmente causada por mutaciones puntuales que provocan sustituciones nicas de
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aminocidos que llevan a la sntesis de una protena disfuncional. Las caractersticas fenotpicas de la protena puede dar indicios sobre la regin del gen que se encuentra comprometida. En este sentido, se pueden distinguir las mutaciones que afectan el sitio reactivo de la protena de aquellas que comprometen el sitio de unin a heparina. Existen defectos genticos con efectos pleiotrpicos, que generalmente se localizan cerca del extremo C-terminal de la protena; esta regin se ha demostrado fundamental para la estabilidad de la protena y transmisin de cambios conformacionales. En los defectos tipo II, el riesgo de trombosis es diferente segn sea el sitio compr ometido de la molcula; individuos portadores heterocigotos de defectos a nivel del sitio de unin a heparina tiene un bajo riesgo de trombosis, a pesar de que en el ensayo funcional la capacidad de cofactor de la heparina de la ATIII est disminuida. En pacientes portadores de defectos a nivel del sitio activo, la tendencia a la trombosis es similar a la encontrada en los defectos de tipo I. Aproximadamente 55% de los pacientes con deficiencia familiar de ATIII presentarn episodios de trombosis venosa a lo largo de su vida; cerca de la mitad de ellos har su primer episodio antes de los 40 aos. En alrededor del 40% de los casos la manifestacin clnica inicial es espontnea, mientras que en el 60% restante est relacionada a embarazo, parto, uso de anticonceptivos orales, ciruga o trauma. Los sitios de presentacin ms frecuentes de la trombosis son las venas de las extremidades inferiores y mesentricas. Cerca del 60% de los pacientes portadores de deficiencia de ATIII desarrolla tromboembolismo venoso recurrente y el 40% de los casos presenta signos clnicos de embolia pulmonar. Una serie de condiciones clnicas se asocian a reduccin de los niveles de ATIII en la sangre. La tr ombosis aguda y la Coagulacin Intravascular Diseminada (CID) reducen significativamente los niveles de ATIII. Disminucin de la concentracin de ATIII se observa en la insuficiencia heptica, en el sndr ome nefrtico y en usuarias de anticonceptivos orales; en el embarazo normal los valores de ATIII no cambian, pero s estn reducidos en la preeclampsia y eclampsia. El uso de heparina disminuye los niveles de ATIII en alrededor de un 20-30% del valor basal, por aumento de la excrecin del inhibidor.
Debido a las numerosas condiciones que afectan los niveles de ATIII, el diagnstico de la deficiencia hereditaria es difcil. Aunque un valor normal descarta razonablemente la deficiencia, niveles bajos deben ser evaluados en el contexto clnico del paciente y generalmente la determinacin se debe repetir en condiciones basales. 2.2. Deficiencia de protena C En 1981 Griffin y colaboradores describieron varios individuos pertenecientes a la misma familia, que presentaban niveles de protena C (PC) de aproximadamente 50% e historia de episodios de trombosis venosa recurrentes. La protena C activada inactiva los factores V activado y VIII activado y adems posee actividad profibrinoltica y antiinflamatoria (ver captulo 20), lo que explica que su deficiencia se asocie a un aumento en el riesgo de presentar eventos trombticos. La deficiencia de PC se hereda en forma autosmica dominante y su expresin clnica es similar al dficit de ATIII. Aproximadamente el 70% de los portadores del defecto presentarn uno o ms episodios de trombosis venosa. En cerca del 70% de los pacientes, el episodio inicial se presenta en forma espontnea y el 30% restante asociado a algn factor de riesgo transitorio. En alrededor de 50% de los casos el primer episodio de trombosis ocurre antes de los 50 aos. Los sitios ms comunes de presentacin de la trombosis son las venas de las extremidades inferiores, ileofemorales y mesentricas. Alrededor del 60% de los casos desarrolla tromboembolismo recurrente y un 40% presenta evidencias de embolia pulmonar. Una caracterstica clnica especial de la deficiencia hereditaria de PC es la ocurrencia de trombosis venosa superficial y trombosis de venas cerebrales. La necrosis cutnea inducida por cumarnicos se ha asociado a la presencia de deficiencia heterocigota de PC. Este sndrome se presenta tpicamente durante los primeros das de uso de la terapia anticoagulante oral, habitualmente cuando se administra una dosis de carga. Las lesiones cutneas aparecen inicialmente como mculas eritematosas en las extremidades y tronco, que posteriormente evolucionan a lesiones necrticas. La patogenia de esta manifestacin se atribuye a un estado transitorio de hipercoagulabilidad dado por la rpida cada de la PC y factor VII y mantencin de los niveles de los otros factores dependientes de vitamina
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K para su sntesis. Muy raramente, recin nacidos pueden desarrollar un cuadro de prpura fulminans en asociacin a niveles de PC menores de 1%, como resultado de un defecto homocigoto o doble heterocigoto en el gen de la PC. Es importante sealar que en numerosas familias se han encontrado individuos heterocigotos con niveles bajos de PC, pero que no desarrollan trombosis. Lo mismo ocurre con los padres de recin nacidos homocigotos que debutan con un cuadro de prpura fulminans, los que siendo heterocigotos obligados muy raramente presentan trombosis. Por otra parte, estudios de prevalencia en poblacin normal han encontrado una frecuencia del defecto tan alta como 1:200 individuos sanos, de los cuales slo unos pocos desarrollan cuadros de trombosis. Estas observaciones sugieren que otros factores no bien conocidos probablemente contribuyen a modular la expresin fenotpica de la deficiencia hereditaria de PC. La frecuencia de deficiencia de PC en pacientes no seleccionados con trombosis venosa es de 3.2% y 4.0% en pacientes seleccionados (menores de 45 aos y con historia familiar). En la poblacin general la frecuencia del defecto vara considerablemente dependiendo de los estudios entre 1:200 a 1:700 individuos sanos. La deficiencia de PC es un desorden heterogneo y se presenta de dos formas desde el punto de vista fenotpico. La deficiencia tipo I en que la actividad y el nivel de antgeno de la protena muestran un disminucin concordante. El tipo II se caracteriza por una disminucin de la actividad con antgeno normal, lo que traduce una molcula de PC anormal. El gen que codifica para la PC se ha localizado en el cromosoma 2q13-q14, tiene un tamao de alrededor de 11 kb y comprende 9 exones. La base de datos actualizada del gen contiene los registros de sobre 160 mutaciones diferentes que r esultan en deficiencia tipo I o II. Sorprendentemente cerca del 60% de las mutaciones que causan un defecto tipo I son missense y alrededor de un tercio ocurre en dinucletidos CpG. En este caso probablemente el cambio de aminocido lleva a alteracin en la interaccin intramolecular con defectos de plegamiento y degradacin intracelular acelerada. Las mutaciones missense en los defectos tipo II estn localizados preferentemente en zonas relevantes para la
funcin de la protena (propptido de escisin, interaccin con trombomodulina, sitio activo, sitio de unin a sustrato). Los niveles de PC en adultos se distribuyen en forma logartmica y el 95% de los valores vara entre 70% y 140%. Los niveles de PC en los recin nacidos son 20-40% el valor de los adultos y los recin nacidos de pretrmino tienen valores an menores. Deficiencia adquirida de PC se observa en insuficiencia heptica, sepsis, CID, postoperatorio, quimioterapia en cncer de mama, uso de Lasparaginasa. Una for ma muy grave de deficiencia adquirida de PC se ve en pacientes con prpura fulminans y CID en infecciones bacterianas o virales graves. En el embarazo normal los niveles de protena C permanecen dentro de rangos normales. Los cumarnicos reducen la PC funcional y en menor grado la antignica, por lo que el diagnstico de deficiencia heterocigota en pacientes con tratamiento anticoagulante oral es particularmente difcil, sugirindose realizar las determinaciones al menos una semana despus de suspendidos los cumarnicos. 2.3. Deficiencia de protena S En el ao 1984 se describi por primera vez una familia en la que varios miembros presentaban niveles bajos de protena S (PS) y una marcada historia de tromboembolismo venoso recurrente. La presentacin clnica de los pacientes con deficiencia hereditaria de PS es similar a aquellos con deficiencia de ATIII o PC. Los individuos con deficiencia heterocigota de PS presentan habitualmente trombosis venosa profunda, embolia pulmonar y en alrededor de 40% de los casos, tromboflebitis superficial. Tambin se ha descrito trombosis de venas axilares, mesentricas y cerebrales. La edad media de aparicin del primer episodio de trombosis es 28 aos, con un rango entre 15 y 68 aos. Un 55% de los casos se presenta en forma espontnea y en el resto est asociada a un factor precipitante identificable. La deficiencia homocigota o heter ocigota compuesta es muy infrecuente y generalmente se presenta como un cuadro de prpura fulminans grave en el perodo neonatal. La prevalencia de la deficiencia de PS en la poblacin general es desconocida aunque se estima como muy baja. Un estudio mostr una prevalencia de deficiencia de PS en la poblacin escocesa entre 0.03% y 0.13%. En trombosis venosa familiar, la prevalencia del defecto se
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ha encontrado entre 2% y 10% de los pacientes, dependiendo del criterio de seleccin. El riesgo de trombosis asociado a la deficiencia hereditaria de PS es un problema an no resuelto. Se ha reportado que el riesgo a lo largo de la vida de presentar trombosis venosa en portadores heterocigotos es de 5 a 11 veces comparado con familiares no portadores. Sin embargo, en estudios casos-controles, basados en poblacin, no se encontr un riesgo aumentado de trombosis entre los portadores de la deficiencia. Se ha sugerido que el riesgo de trombosis estara asociado al defecto gentico subyacente, variando entre distintas familias portadoras de diferentes tipos de mutaciones. Por otra parte, varios otros factores, hereditarios o adquiridos, pueden aumentar el riesgo de trombosis en los individuos portadores de deficiencia de PS. Entre estos se incluye, anticonceptivos orales, embarazo, parto y puerperio, factor V Leiden y protrombina G20210A. El diagnstico de la deficiencia hereditaria de PS es difcil debido a limitaciones tcnicas y genticas. La existencia en el plasma de la forma libre de la PS y del complejo PS-C4BP+ (ver captulo 20) es una dificultad para las determinaciones antignicas y funcionales. Adems los niveles plasmticos de PS estn sujetos a variaciones por influencias biolgicas, fisiolgicas y patolgicas. Los hombres tienen niveles ms altos que las mujeres; en el embarazo y en usuarias de anticonceptivos orales los niveles de PS son significativamente menores; los recin nacidos presentan niveles bajos de PS total pero altos de PS libre. La deficiencia de PS se ha clasificado desde el punto de vista fenotpico en tres tipos: (a) tipo I, en la cual existe una reduccin concordante entre el nivel de PS total, PS libre y actividad, (b) tipo II, se refiere a un defecto funcional de la molcula, encontrndose en el laboratorio niveles normales de antgeno de PS libre y total, pero reduccin de la actividad, y (c) un segundo defecto de tipo cuantitativo, tipo III, define un fenotipo en el que la PS libre est disminuida per o con niveles nor males de PS total. Recientemente se ha propuesto que los tipos I y III se agrupen juntos como un defecto cuantitativo de la PS, ya que en ambos casos existe una disminucin de la PS libre plasmtica. Las mutaciones en el gen de la PS responsables de la deficiencia hereditaria se encuentran registradas en bases de datos actualizadas. El
anlisis gentico molecular de las mutaciones en pacientes con deficiencia de PS se ve complicado por la existencia de un pseudogen con un 97% de homologa con el gen verdadero. La ltima versin de la base de datos contiene 131 mutaciones deletreas diferentes y 30 polimorfismos del gen. Alrededor del 95% de los casos presenta un defecto cuantitativo (tipo I o III) y el 55% un defecto cualitativo (tipo II). La mayora de las lesiones genticas que causan deficiencia tipo I son sustituciones nucletidos nicos, inserciones o deleciones. La deficiencia adquirida de PS se observa en el embarazo y con el uso de anticonceptivos orales. Reduccin de los niveles de PS se encuentran tambin durante episodios tromboemblicos agudos y en la CID. La C4BP es una protena de fase aguda lo que explicara la disminucin de la actividad de la PS en las condiciones anteriores y en otras patologas inflamatorias, probablemente por un aumento de la forma acomplejada, inactiva de la protena. 2.4. Factor V Leiden y resistencia a la protena C activada En 1993 Dahlback describi una familia en la cual varios de su miembros presentaban resistencia a la accin de la protena C activada (RPCA), fenmeno que se asociaba a un aumento en el riesgo de trombosis venosa. Posteriormente se demostr que este defecto era el resultado de una mutacin puntual del Factor V de la coagulacin (G1691A), que se traduce en el cambio de una arginina por una glutamina en el aminocido 506 de la protena (R506Q). Este cambio se traduce en una alteracin en la inactivacin del factor Va por la PC activada, ya que el primer sitio de corte de la enzima es precisamente a nivel de la arginina 506. Adems se ha demostrado recientemente que el FV constituye un cofactor en la accin anticoagulante de la PC activada, funcin que tambin se encuentra comprometida en el FV Leiden. Este defecto molecular provoca que el FV Leiden se inactive 10 a 20 veces ms lentamente que la forma nativa, llevando a una excesiva generacin de trombina, lo que se traduce en un aumento en el riesgo de trombosis venosa de 6 a 8 veces el de la poblacin general. Es importante sealar que un 5-10% de los individuos con RPCA no son portadores de la mutacin R506Q. Adems se ha demostrado recientemente que la RPCA por s misma, independiente de la presencia de FV Leiden, constituye un factor de riesgo para trombosis venosa.
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Numerosos estudios han demostrado que la presencia de RPCA o mutacin R506Q del FV se asocia a un aumento del riesgo de trombosis. La prevalencia reportada para RPCA y/o FV Leiden en pacientes con trombosis vara ampliamente (4-64%) dependiendo de los criterios de seleccin y del origen tnico de las poblaciones estudiadas. Las prevalencias ms altas se encuentran entre pacientes jvenes altamente seleccionados con trombofilia no explicada. En pacientes consecutivos portadores de trombosis venosa profunda, la prevalencia de RPCA es de alrededor de un 20%. A pesar de las variaciones en la frecuencia del defecto, existe actualmente consenso que la RPCA es el factor de riesgo hereditario ms comn para trombosis venosa. El riesgo relativo de trombosis en los individuos afectados ha sido calculado en el rango de 30140 veces en los homocigotos y 6 a 8 veces para los heterocigotos. La prevalencia del FV Leiden en la poblacin general es mayor entre Caucsicos, encontrndose los valores ms altos en poblaciones del norte de Europa. Si se considera en conjunto el desequilibrio de ligamiento entre el FV Leiden y otros polimorfismos del FV, los patrones de distribucin geogrfica sugieren un efecto fundador, es decir, todos los individuos que portan la mutacin R506Q comparten un ancestro comn. La alta frecuencia de FV Leiden en algunas poblaciones sugieren que ste confera un efecto pr otector durante la evolucin. Por ejemplo, la hipercoagulabilidad asociada a la presencia de R506Q pueden haber otorgado proteccin contra sangrado excesivo durante el parto. La ciruga, el uso de anticonceptivos orales y la naturaleza sedentaria de la vida moderna constituyen factores circunstanciales de riesgo a los cuales no se encontraban expuestos nuestros ancestros. La trombosis venosa profunda es la manifestacin clnica ms comn de la RPCA; la embolia pulmonar y la tromboflebitis superficial tambin se observa en forma ocasional. La embolia pulmonar parece ser menos frecuente entre portadores homocigotos de R506Q que en homocigotos o portadores heterocigotos de deficiencia de PC, PS o ATIII. La mayora de los estudios de casos y controles no han podido demostrar una asociacin clara entre RPCA y trombosis arterial, aunque sta se ha descrito en algunos pacientes heterocigotos y homocigotos. La penetrancia de la trombosis en individuos portadores de RPCA es altamente variable, algunos jams desarrollan trombosis mientras otros presentan episodios recurrentes a edad
temprana. A la edad de 50 aos alrededor del 75% de los portadores heterocigotos permanecen libres de eventos trombticos, cifra que se reduce a un 40% entre los homocigotos. La edad media de presentacin del primer episodio de trombosis en individuos heterocigotos no seleccionados es de 43 aos; en familias tromboflicas, la edad media de comienzo para portadores heterocigotos seleccionados es de 23 aos. Estas cifras son comparables a las encontradas para pacientes portadores de deficiencia hereditaria de PC. El riesgo de trombosis de los individuos no depende solamente de la presencia de la mutacin R506Q, sino tambin de la coexistencia de otros factores de riesgo genticos o adquiridos. Esto ha quedado demostrado en numerosos estudios en que se ha encontrado una alta incidencia de trombosis en individuos portadores de la mutacin R506Q en combinacin con hiperhomocisteinemia, deficiencias de PC, PS o ATIII. Factores de riesgo adquiridos que se asocian a trombosis en pacientes con RPCA son el uso de anticonceptivos orales, trauma y ciruga. 2.5. Mutacin G20210A del gen de la protrombina La mutacin G201210A del gen de la protrombina fue descrita en el ao 1996 por Poort y colaboradores, en un estudio que consideraba al gen de la protrombina como un candidato para trombosis en familias con historia de enfermedad tromboemblica. Esta mutacin consiste en una transicin G A en la regin 3 no traducida del gen que codifica para la protrombina. Estudios de haplotipo sugieren que esta mutacin habra nacido como un fundador nico 20.000 a 30.000 aos atrs. La prevalencia en la poblacin general tiene relacin con el origen tnico de sta, encontrndose en Europa en alrededor del 2% de la poblacin (rango 0.7-4%). La prevalencia ms alta se observa en la regin sur de Europa (aproximadamente 3%) y la ms baja en la regin norte (1.7%). En Estados Unidos la prevalencia es de alrededor de 2% pero con amplia variacin segn la raza. Esta mutacin es poco comn en Africa, Asia y en nativos americanos. Desde su primera descripcin se encontr que los portadores heterocigotos del defecto pr esentaban niveles de pr otrombina significativamente ms altos (130%; rango, 95178%) comparados con los homocigotos para la forma 20210 GG (105%; rango, 55-156% ). Los individuos portadores de la forma 20210
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AA tienen niveles de factor II de alrededor de 170%. Debido a que el riesgo de trombosis venosa aumenta con los niveles de protrombina, se hipotetiz que la hiperprotrombinemia sera el mecanismo fisiopatolgico de la propensin a la trombosis. Esta hiptesis se ha comprobado recientemente en un estudio en el que observ que en familias portadores del defecto el anlisis de ligamiento demostr que la mutacin G20210A influa simultneamente sobre el nivel de protrombina y el riesgo de trombosis. Desde el punto de vista molecular la mutacin G A causa una ganancia de funcin debido a un aumento en el reconocimiento del sitio de escisin a nivel de 3, con aumento del procesamiento del extremo 3 del gen. El resultado neto de este fenmeno es una acumulacin de mRNA y aumento de la sntesis de protrombina. Estudios in vitro han confirmado la hiptesis que la hiperprotrombinemia es importante en la gnesis de la trombosis venosa. Butenas y colaboradores, usando un modelo in vitro de coagulacin iniciada por factor tisular, demostraron que niveles de protrombina de 150%, manteniendo un nivel normal de todos los procoagulantes y anticoagulantes naturales, resultaba en un aumento significativo de la generacin de trombina. Otros estudios han demostrado adems que niveles altos de protrombina, pueden inhibir la inactivacin del factor Va mediada por PCA. Numerosos estudios de casos y controles han demostrado consistentemente la asociacin entre pr otr ombina G20210A y tromboembolismo venoso. En el estudio original de Poort se encontr un riesgo relativo de casi 3 veces; estudios posteriores han reportado riesgos relativos entre 2 y 12 con la mayora de ellos entre 2 y 3. A pesar de que la mayor parte de la evidencia hasta ahora sugiere que la protrombina G20210A es un factor de riesgo real, aunque dbil, para trombosis venosa, la homocigocidad no confiere un riesgo tan significativo como se observa en los defectos homocigotos de PC, PS o FV Leiden. Aunque la mutacin G20210A es un factor de riesgo de trombosis relativamente dbil, se dispone de mucha evidencia que demuestra que este defecto puede interactuar con otros factores de riesgo conocido y aumentar as su potencial protrombtico. De estas asociaciones la ms estudiada es aquella con el FV Leiden. Varios estudios de casos y controles muestran que el riesgo de trombosis aumenta significativamente
cuando existe coherencia de los 2 defectos (riesgo relativo alrededor de 20 veces). El efecto de la mutacin G20210A sobre el riesgo de trombosis en otros defectos tromboflicos (deficiencias de PC, PS, ATIII, hiperhomocisteinemia) no est suficientemente demostrado. El uso de anticonceptivos orales y el embarazo constituyen situaciones en que el riesgo de trombosis aumenta considerablemente en presencia de la mutacin G20210A. En usuarias de anticonceptivos orales portadoras de la mutacin el riesgo relativo de enfermedad tromboemblica aumenta cerca de 16 veces, situacin similar a la reportada para el embarazo (riesgo relativo de 8 a 25 veces). Varios estudios han demostrado la asociacin de la mutacin G20210A y FV Leiden con mala historia obsttrica, especficamente, aborto de segundo trimestre, placenta previa, retardo de crecimiento intrauterino y preeclampsia. Su papel en el aumento del riesgo de trombosis en la terapia de reemplazo hormonal no se ha establecido. Hasta ahora no es claro el papel que pueda jugar la mutacin G20210A en la enfermedad trombtica arterial. Aunque varios estudios no han demostrado asociacin de la mutacin con infarto de miocardio y accidente cerebrovascular en poblaciones mayores, varios estudios sugieren que puede ser importante en la gnesis de ateroesclerosis prematura, especialmente asociada a otros factores de riesgo como cigarrillo e hipertensin. 2.6. Disfibrinogenemias hereditarias Los defectos cualitativos del fibringeno se heredan habitualmente en forma autosmica dominante. Existe un gran nmero de mutaciones que comprometen al gen del fibringeno, por esta razn, la expresin fenotpica de las disfibrinogenemias hereditarias es muy heterognea, presentndose como hallazgo en personas asintomticas, como ditesis hemorrgica o predisposicin a la trombosis. Alrededor de 20 variantes de la molcula de fibringeno se han demostrado asociadas a enfermedad tromboemblica. Los defectos funcionales del fibringeno tales como liberacin anormal de los fibrinopptidos A y B o alteracin en la polimerizacin de la fibrina, no son fciles de relacionar con la tendencia protrombtica en los pacientes. En algunas disfibrinogenemias se ha encontrado unin anormal de la trombina a la fibrina; en pacientes homocigotos para este tipo de
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alteracin, se ha observado un fenotipo clnico grave con tr ombosis recurr ente a edad temprana. Se ha sugerido que la alteracin en la unin de trombina a fibrina, resultara en un aumento en la trombina libre en la circulacin y generacin de un estado protrombtico. Otras mutaciones del fibringeno se asocian a defectos en la polimerizacin de la fibrina y con una resistencia a la lisis por plasmina. Los defectos funcionales del fibringeno se pueden evidenciar en el laboratorio por prolongacin de los tiempos de trombina y reptilasa y deter minacin del nivel de fibringeno. Las mediciones funcionales de fibringeno resultan ser significativamente inferiores a las antignicas. 2.7. Deficiencia hereditaria de factor XII Los pacientes portadores de deficiencia de factor XII (FXII), se presentan con tiempo de tr omboplastina parcial activado muy prolongado, en ausencia de manifestaciones hemorrgicas. La ausencia de manifestaciones clnicas en los pacientes con deficiencias de FXII, pre-calicrena o kiningeno de alto peso molecular, son una evidencia de que estos factores no son esenciales para la hemostasia
in vivo. Sin embargo, numerosos casos de enfermedad tromboemblica venosa y arterial se han reportado en pacientes con deficiencia de FXII, incluyendo el primer paciente descrito con este defecto (Mr. Hageman). La tendencia a la trombosis en la deficiencia hereditaria de FXII se ha atribuido a un disminucin en la capacidad fibrinoltica del plasma. La magnitud del pr oblema no se ha dimensionado adecuadamente; algunos estudios han encontrado que alrededor de 8% de los pacientes con deficiencia de FXII presentan episodios trombticos venosos o arteriales, incluyendo infarto de miocardio en personas jvenes. Otras observaciones han demostrado que la heterocigocidad para deficiencia de FXII no constituira un factor de riesgo de trombosis. La solucin de esta controversia requiere de estudios ms grandes en familias deficientes de FXII y seguimiento clnico prolongado.
3. TROMBOFILIAS ADQUIRIDAS La trombofilia adquirida es un factor de riesgo especfico de tromboembolismo venoso, el que comparado con aquellos que no lo presentan es bajo en relacin a otros factores adquiridos de mayor frecuencia. Esto se resume en la tabla 24-3.
Tabla 24-3. Factores de riesgo para tromboembolismo venoso Condiciones Ciruga mayor o trauma mayor Historia de tromboembolismo venoso Trombofilia adquirida Anticuerpos antifosfolpidos Anticuerpos anticardiolipinas elevados Inhibidores no especficos (ej. anticoagulante lpico) Cncer Enfermedad mdica mayor con hospitalizacin Edad > 50 aos > 70 aos Embarazo Terapia estrognica Contraceptivos orales Terapia reemplazo hormona Moduladores de receptores de estrgeno selectivo Tamoxifeno Raloxifeno Obesidad Mixto (hereditario, adquirido) Hiperhomocisteinemia Riesgo relativo 5-200 50
2 10 5 5 5 10 7 5 2 5 3 13 3
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Es posible que en un paciente se puedan presentar simultneamente varios factores y que la presencia de trombosis sea la culminacin de la suma de estos. Son elementos diagnsticos de importancia de las tromboflias adquiridas, la posibilidad de su aparicin en cualquiera etapa de la vida, y de ser una posible etiologa en pacientes ancianos con trombosis venosa profunda espontnea sin historia de trombosis previa. Otro carcter importante es que se pueden desencadenar trombosis venosas y arteriales en diferentes localizaciones, lo cual implica en ocasiones diferente diagnstico diferencial. 3.1. Sndrome antifosfolpido (SAF) El Sndrome antifosfolpido (SAF) se caracteriza por la presencia de anticuerpos antifosfolpidos (aFL), trombosis arterial o venosa recurrente o abortos espontneos, y en ocasiones trombocitopenia autoinmune. Los anticuerpos aFL son un grupo heterogneo de anticuerpos de clase IgG e IgM que adems de encontrarse en el SAF se asocian a enfermedades del tejido conectivo, infecciones y drogas. Wasserman en 1906, utilizando un mtodo de fijacin de complemento fue el primero que pesquis estos anticuerpos. Posteriormente durante la Segunda Guerra Mundial, se detectaron individuos positivos para serologa de sfilis y que no presentaban evidencias de infeccin treponmica (falsos positivos); la prueba serolgica utiliza una mezcla antignica que contiene cardiolipina (CL). Diez aos ms tarde Conley y Hartman demostrar on, a travs de pruebas de coagulacin, la presencia de un anticoagulante circulante. Dos dcadas despus, Feinstein y Rapaport confirmaron la existencia de esta actividad anticoagulante en pacientes portadores de Lupus eritematoso sistmico (LES) y la denominaron anticoagulante lpico (AL). En 1983, Harris y colaboradores, mediante un radioinmunoanlisis que utiliza CL en fase slida, aumentar on significativamente la sensibilidad en la pesquisa de los anticuerpos aFL respecto a las pruebas serolgicas para sfilis; desde entonces se denomin anticar diolipina (aCL) a los anticuerpos aFL detectados por este mtodo. Posterior mente, en varios laboratorios desarr ollar on un ELISA para pesquisar anticuerpos aCL, mtodo evaluado por primera vez en un taller internacional realizado en 1986.
En 1983 Hughes describe la asociacin de anticuerpos aFL y trombosis arteriales y venosa, y en 1985 propone el nombre de sndrome anticardiolipinas, pero finalmente Harris y colaboradores en 1987 lo cambian a SAF. Actualmente en clnica, la pesquisa de los aFL se realiza por ELISA (anticuerpos aCL) y por pruebas de coagulacin (AL). Los anticuerpos aFL son la causa ms frecuente de trombofilia adquirida asociada con trombosis arterial o venosa, o ambas. Pueden localizarse en cualquier vaso arterial o venoso, como trombosis venosa profunda con embolia pulmonar secundaria, trombosis de arterias coronarias, trombosis cerebro vascular, crisis isqumicas transitorias, trombosis de vasos retinales o trombosis vascular placentaria. En general su diagnstico clnico se basa en la existencia de una trombosis asociada con un AL persistente, detectado por estudios de coagulacin especializados y/o la presencia de ttulos elevados de anticuerpos aCL IgG y/o IgM. 3.1.1. Anticuerpos antifosfolpidos El SAF se pr esenta en pacientes con autoanticuerpos con especificidad por protenas que se unen a dichos fosfolpidos (ver punto 3.1.3.). Sin embargo, existen otras causas asociadas a anticuerpos aFL, como por ejemplo infecciones, que determinan la presencia de anticuerpos con especificidad por fosfolpidos aninicos como CL; stos deben ser considerados en for ma separada al SAF autoinmune. En la actualidad los anticuerpos aFL se clasifican en 4 grupos (tabla 24-4). No se dispone de mucha informacin en relacin a la prevalencia de anticuerpos aFL, especialmente en individuos asintomticos. Se ha descrito entre un 1-5% en jvenes sanos, pero su incidencia aumenta con la edad y en enfermedades crnicas coexistentes. En pacientes con LES, la prevalencia de anticuerpos aFL flucta entre 12-30% para anticuerpos anticardiolipinas (aCL), y entre 1534% para AL. En Chile existe un solo estudio, de Palomo, I., Pereira, J. y colaboradores, que revela que el 60% de 90 pacientes con LES presentaba algn tipo de anticuerpos aFL y, de ellos el 44.4%, eran anticuerpos aCL, y establecen la existencia de 3,3% de anticuerpos aCL en el grupo control sano.
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Tabla 24-4. Clasificacin de pacientes con anticuerpos antifosfolpidos SAF autoinmune Primario Secundario (Asociado a LES u otras enfermedades del tejido conectivo) Anticuerpos aFL estimulados por infeccin No asociados a trombosis Sfilis, enfermedad de Lyme, Virus Epstein Barr, Citomegalovirus Posible asociacin con trombosis Varicela, VIH, hepatitis C Anticuerpos aFL asociados a cncer Sndromes linfoproliferativos Leucemia de clulas vellosas Anticuerpos aFL inducidos por medicamentos Fenotiazinas, quinidinas, quinina, penicilina sintticas, hidralazina, alfa interfern Anticuerpos aFL prevalentes en la poblacin general
En los pacientes sanos no existe informacin suficiente que per mita establecer qu porcentaje de los que presentan anticuerpos aFL podran presentar en el futuro un evento trombtico, o un aborto secundario a SAF. En cambio, la posibilidad en un paciente con LES y anticuerpos aFL de desarrollar un SAF, flucta entre 50-70%, en un seguimiento a 20 aos. Lo que es de gran importancia para el clnico, es que pacientes con anticuerpos aFL tienen un mayor riesgo de desarrollar trombosis, y por lo tanto podran ser tributarios de un tratamiento preventivo, aun cuando ste, solo es aplicable en casos de trombosis previa. Los factores de riesgo son: antecedentes de trombosis, presencia de AL, y anticuerpos aCL IgG en ttulos altos y persistentes; estos factores aumentan el riesgo de trombosis en 5 veces o ms. 3.1.2. Antgenos Los anticuerpos aFL deben su nombre al hecho que hasta hace algunos aos se crea que reconocan fosfolpidos aninicos. Actualmente se sabe que en realidad tienen especificidad contra algunas protenas con afinidad por dichos fosfolpidos. Varias protenas han sido descritas como blanco de anticuerpos aFL, entre ellas: 2GPI, protrombina, protena C, protena S, anexina V, kiningeno de alto y bajo peso molecular, trombomodulina, factor V y factor VII.
En 1990 tres grupos independientes, Galli y colaboradores, McNeil y colaboradores, y Matsuura y colaboradores, demostraron que los anticuerpos aFL requeran un cofactor plasmtico, la protena 2GPI, para unirse a los fosfolpidos aninicos. La 2GPI es tambin conocida como apoprotena H, por su asociacin en el plasma con otras lipoprotenas y porque alrededor del 40% de la 2GPI plasmtica est unida a triglicridos. Durante los ltimos aos, se ha avanzado en el conocimiento del papel que juega la 2GPI en la unin de los anticuerpos aFL, especficamente: (a) Dominios de unin de la 2GPI para la CL y los anticuerpos anti-2GPI, (b) frecuencia de anticuerpos anti-2GPI en series clnicas y (c) posibles mecanismos trombognicos de dichos anticuerpos. La 2GPI es una protena plasmtica sintetizada en el hgado y que se une a molculas con carga negativa, como fosfolpidos aninicos, heparina y lipopr otenas, y a plaquetas activadas. Esta protena inhibe la va intrnseca de la coagulacin in vitro , la actividad protrombinasa de las plaquetas y la agregacin plaquetaria inducida por ADP. Sin embargo, la funcin de la 2GPI in vivo es an desconocida. Es una glicoprotena formada por una cadena polipeptdica de 326 aminocidos y que posee un peso molecular aproximado de 50 kDa.
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Presenta cinco dominios de aproximadamente 60 residuos, cada uno con patrones altamente conservados de prolina, triptfano y cistena, estos ltimos responsables de los dos puentes disulfuro intradominio. Los dominios I-IV presentan la estructura tpica de los miembros
de la superfamilia de protenas de control del complemento (CCP) tambin llamados, por su forma, dominios sushi. El quinto dominio en cambio, que se encuentra hacia el extremo carboxilo, presenta 82 aminocidos que incluyen dos cistenas adicionales (figura 24-1).
Figura 24-1. Estructura de la 2GPI.
El gen que codifica para la 2GPI humana fue clonado y secuenciado, y expresado en clulas eucariticas. La secuencia aminoacdica deducida a partir del cDNA es de 345 aminocidos que incluye 19 residuos correspondientes a un pptido seal Nterminal, no presente en la protena madura. Dominios de unin de la 2GPI. Con el propsito de identificar el (los) eptopos de la 2GPI a los que se unan la CL y los anticuerpos anti- 2GPI, se han usado bsicamente dos estrategias, uso de pptidos sintticos y mutantes, con los que se han realizado ensayos de inhibicin competitiva: Unin a fosfolpidos. Se ha demostrado que la CL se une a la secuencia aminoacdica C 281KNKEKKC 288 presente en el quinto dominio de la 2GPI. La presencia de cuatro lisinas (K), carga positivamente dicha secuencia (figuras 24-1 y 24-2). Por modelamiento computacional de la estructura ter ciaria de la protena, establecieron que dicha regin se encuentra en la superficie de la molcula.
Unin de los anticuerpos anti-2GPI. Varias investigaciones han permitido establecer que los anticuerpos aCL presentan especificidad contra eptopos crpticos ubicados en el primer y cuarto dominios de la pr otena y que se expresan como consecuencia de un cambio conformacional de la 2GPI al unirse sta a fosfolpidos aninicos, formando el complejo 2GPI-FL aninico (figura 24-2).
3.1.3. Patognesis Normalmente los fosfolpidos hexagonales de las clulas endoteliales estn unidas a protenas de unin a fosfolpidos, como 2 GPI y protrombina. Cuando se desencadena un SAF, estas protenas de unin a fosfolpidos aninicos dejan de estar unidas a las clulas endoteliales, ya que stos son ocupados por anticuerpos aFL, o sus niveles plasmticos disminuyen. Existen diversos mecanismos que influyen en su patognesis del SAF, ya sea por interferencia en los sistemas de anticoagulantes naturales, en el endotelio vascular, en las plaquetas, en
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Figura 24-1. Unin de los anticuerpos anti-2GPI
los leucocitos, especialmente en los monocitos y en la fibrinlisis: a) Mecanismos sobre los anticoagulantes naturales Disminucin del efecto anticoagulante de anexina V en el sinciotrofoblasto y en las plaquetas. Inter ferencia en el sistema PC (trombomodulina-PC-PS), en sus diferentes niveles: o Inhibicin de la formacin de trombina (activa la PC) por inhibicin de actividad de protrombinasa. o Disminucin de la activacin de PC por el complejo trombomodulina-trombina. o Inhibicin de la confor macin del complejo PC. o Inhibicin de la actividad de la PC activada (PCa). o Unin a Factor Va y VIIIa protegindolos de la proteolisis de la PCa. o Deficiencia de PS. Inhibicin de la actividad del inhibidor de la va del factor tisular (TFPI) y por ende aumentar la actividad del factor tisular. Disminucin de la actividad de la antitrombina III, ya sea porque algunos
anticuerpos aFL reconocen un eptopo de la trombina, o a travs de un mecanismo de reaccin cruzada con heparina o molculas heparinoides que son polianinicos. b) Mecanismos sobre el endotelio Activacin del endotelio mediado por anti-2GPI determinando un aumento en la exposicin de molculas de adhesin celular (ICAM-1, VCAM1 y E-selectina) y del factor tisular. Adhesin de leucocitos al endotelio inducida por anticuerpos aFL. Anticuerpos aFL que reconocen anexina V inducen apoptosis en las clulas endoteliales. En casos de trombosis arterial y SAF, se ha detectado aumento de endotelina-1 plasmtica que juega un rol en el tono vascular, vasoespasmo y oclusin arterial tromboltica. La activacin del complemento, con dao endotelial, podra jugar un rol en trombosis asociada a anticuerpos aFL y prdidas fetales.
c) Mecanismos sobre las plaquetas Potencian la activacin plaquetaria: las plaquetas de pacientes con SAF presentan mayor expresin de CD63 y liberan mayor cantidad de P-selectina al plasma que las plaquetas de individuos normales. Tambin se ha observado aumento de la expresin de GPIIb-IIIa.
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Los anticuerpos aFL estimulan la agregacin plaquetaria. Se ha observado aumento de sntesis in vitro de tromboxano A2.
d) Mecanismos sobre leucocitos En pacientes con SAF se ha observado estimulacin de monocitos con expresin de factor tisular, lo cual no se observa en casos de pacientes asintomticos con anticuerpos aFL. Activacin y degranulacin de neutrfilos.
isqumicas transitorias. El resto de trombosis arteriales se dividen en coronarias (23%) y el resto (27%) incluyendo estas ltimas: subclavia, renal, retinal o pedias. Existen tambin fenmenos emblicos arteriales secundario a vegetaciones de la vlvula mitral o artica. Las manifestaciones clnicas del compromiso de capilares, arteriolas o vnulas, son a veces indistinguibles de un sndrome hemoltico urmico (SHU), de un prpura trombocitopnico trombtico (PTT), u otras microangiopatas trombticas, a veces slo diagnosticada por biopsia. Manifestaciones neurolgicas
e) Mecanismos sobre la fibrinolisis Disminucin de la fibrinolisis mediada por aumento del inhibidor del activador del plasmingeno tisular-1 (PAI-1) y por accin de anti-2GPI, que inhibe la anti-activacin de factor XII, y como resultado la disminucin de kalikreina y urokinasa. SAF es frecuente de encontrar en jvenes con crisis isqumicas transitorias o accidentes vsculo-cerebrales (AVC), especialmente cuando no existen factores de riesgo de enfermedades cerebrovasculares. Los infartos del sistema nervioso central (SNC) son generalmente pequeos sin evidencia de vasculitis en la biopsia. En pacientes con LES se puede presentar embolia cerebral, y en otros casos trombosis recurrentes del SNC, llevan a una demencia por infartos mltiples. Otros sndromes neurolgicos que se presentan son: migraa, sndrome de Sneddon (AVC, hipertensin arterial y lvido reticularis), sndrome de Guillan-Barr, corea, convulsiones, mielitis transversa, encefalopata, trombosis venosa cerebral, pseudotumor cerebri, mononeuritis mltiple o amaurosis fugaz. Manifestaciones cardacas El SAF se asocia a enfermedad coronaria, pudiendo condicionar infarto agudo de miocardio en personas jvenes, y debe sospecharse cuando no existen factores de riesgo de enfermedad coronaria, o existen evidencia de oclusin coronaria trombtica o embolia sin evidencia angiogrfica de enfermedad ateroesclertica. El SAF puede ser la causa de oclusiones de bypass o stent coronarios. El compromiso valvular mitral y/o artico con engrosamiento, vegetaciones, regurgitaciones y estenosis se pueden demostrar con el examen de ecografa transesofgica. Manifestaciones obsttricas El SAF se asocia con complicaciones del embarazo como abortos, retar do del
3.1.4. Clnica Los pacientes con SAF pueden presentar tromboembolismo arterial o venoso espontneo que puede comprometer cualquier localizacin u rgano. Esta trombosis se observa en un 30% de los pacientes con anticuerpos aFL. Se estima una incidencia de 2,5 eventos trombticos por 100 pacientes/ao, de ellos 2/3 son venosas y 1/3 arteriales. No existen diferencias clnicas en cuanto a que el SAF sea primario o secundario. Su sintomatologa se relaciona con la naturaleza y tamao del vaso comprometido, y de su agudeza o cronicidad, presentndose a veces con escasos sntomas. De acuerdo al tamao del vaso afectado, determinar una insuficiencia de un rgano que tendr dos orgenes: una microangiopata tr ombtica o isquemia secundaria a tromboembolismo. La trombosis venosa es la manifestacin ms frecuente del SAF, especialmente de extremidades inferiores; en seguimiento de 6 aos flucta de un 29-55% de los pacientes, de los cuales ms de la mitad presentan embolia pulmonar. Las trombosis aparecen en forma espontnea, o por factores predisponentes: reposo, traumas, ciruga, anticonceptivos orales, etc. Las trombosis arteriales son menos frecuentes y se manifiestan como isquemia o infarto. El cerebro es el rgano ms comprometido (50%) en la forma de accidente vascular o crisis
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crecimiento intrauterino, sndrome de Hellp (hemlisis, elevacin de transaminasas y trombocitopenia asociado a preeclampsia) oligohidroamnios, insuficiencia tero placentaria y preeclampsia. Pacientes con anticuerpos aFL tienen una alta incidencia de abortos recurrentes desde las 10 semanas o ms de embarazo, aunque en forma ms aislada pueden existir abortos de las primeras nueve semanas de embarazo. En ocasiones se asocia a trombocitopenia en la madre. Estas complicaciones son frecuentes cuando los niveles de anticuerpos aCL persisten altos por ms de 3- 4 meses. El mecanismo exacto no se conoce, pero se postula que est condicionado a insuficiencia placentaria como resultado de una mala perfusin placentaria y trombosis. En este mecanismo intervendra un desplazamiento por anticuerpos aFL, de anexina V; sta es una protena anticoagulante que se une a fosfolpidos aninicos, y que existe en la interfase maternofetal a nivel de las vellosidades placentarias. Manifestaciones renales Depender del tipo de vaso afectado, si es de grandes vasos puede desencadenar trombosis de la vena o arteria renal, infarto renal, hipertensin, insuficiencia renal aguda o crnica, proteinuria, hematuria o sndrome nefrtico. Si el evento trombtico se presenta a nivel de capilares, arteriolas o vnulas se puede observar insuficiencia renal aguda que a menudo requiere dilisis o microangiopata tr ombtica semejando SHU, PTT o hipertensin. Se ha descrito infarto de prstata y testculo secundario a SAF. Manifestaciones pulmonares El SAF puede deter minar una trombosis espontnea de los vasos pulmonares, o manifestarse como una hipertensin pulmonar, embolia pulmonar, hemorragia alveolar o sndrome de distress respiratorio agudo. Manifestaciones oftalmolgicas La expresin oftalmolgica del SAF puede expresarse como trombosis de la vena central de la retina (TVCR) y de la arteria retinal, y amaurosis fugaz y retinitis. Manifestaciones gastrointestinales El tr omboembolismo de grandes vasos
secundario a SAF puede manifestarse de diversas maneras: Trombosis de vena mesentrica y vena porta, sndrome de BuddChiari, infarto heptico, intestinal o esplnico, perforacin esofgica, colitis isqumica, infarto de la vescula biliar alitisica, pancreatisis o ascitis. Manifestaciones endocrinas Se ha descrito infarto de la glndula suprarrenal o insuficiencia y necrosis de glndula pituitaria o insuficiencia de ella. Manifestaciones hematolgicas Las manifestaciones hematolgicas del SAF incluyen: anemia hemoltica, SHU, PTT y CID en casos de SAF catastrfico. Las complicaciones hemorrgicas son muy raras ya que, en general, la trombocitopenia es moderada en un 20-40% de los pacientes; se ha observado la presencia de anticuerpos antiglicoprotenas plaquetarias (GPIIb-IIIa o GPIb-X) o sensibilizacin de las membranas plaquetarias activadas por anticuerpos aFL y secuestro de las plaquetas de la circulacin. Manifestaciones cutneas La lvido reticularis se observa en un 11-22% de los pacientes y se debe a trombosis capilar que determina una stasis vascular cutnea caracterizada por un moteado ciantico de la piel. Esta trombosis puede manifestarse adems como hemorragia, prpura necrosante o gangrena perifrica. Manifestaciones miscelneas Necrosis avascular sea o perforacin del septum nasal. SAF catastrfico El SAF catastrfico se define como un cuadro clnico que compromete al menos tres sistemas del organismo en un perodo de das o semanas con evidencias histopatolgicas de oclusiones mltiples de vasos grandes o pequeos. En 2/ 3 son mujeres jvenes cercanas a los 40 aos y se caracteriza por una tormenta trombtica con tromboembolismo venoso masivo, con insuficiencia respiratoria, AVC, alteracin de enzimas hepticas, dao renal, insuficiencia suprarrenal y reas de infarto en piel. La mayor parte de los casos son SAF primario y una minora tienen LES u otras enfermedades autoinmunes
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como sndrome de Sjogren, escleroderma o artritis reumatoide. La trombosis es una microangiopata aguda de pequeos vasos que desencadena una falla orgnica mltiple. El rgano comprometido con mayor frecuencia es el rin (78%), seguido de los pulmones (66%), SNC (56%), corazn (50%) y piel (50%). El compromiso renal puede requerir dilisis en el 25% de los casos y se asocia a hipertensin a menudo maligna. Pueden desarrollar insuficiencia suprarrenal y CID (25% de los pacientes). Es un sndrome con una mortalidad de un 50% por falla multiorgnica, y no existe un tratamiento establecido. Se ha obtenido buena respuesta en un pequeo grupo de pacientes con una combinacin de anticoagulantes y esteroides, ms plasmafresis o IgG intravenosa (IgG IV). 3.1.5. Diagnstico Actualmente el diagnstico de SAF se basa en el consenso logrado en Sapporo, Japn (1999). Dicho consenso estableci que debe existir 1/2 criterios clnicos y 1/2 criterios de laboratorio: a) Criterios Clnicos Los criterios clnicos incluyen trombosis vascular y morbilidad del embarazo: Trombosis vascular. Consiste en uno o ms episodios clnicos de trombosis arterial, venosa o de pequeos vasos en cualquier tejido u rgano. La trombosis debe estar confirmada por imagenologa o Doppler o histopatologa, con excepcin de trombosis venosa superficial. La histopatologa no debe demostrar evidencia significativa de inflamacin del vaso sanguneo. Morbilidad del embarazo. Se divide en 3 categoras: Categora A: consiste en uno o ms muertes no explicables de fetos morfolgicamente normales, a las 10 o ms semanas de gestacin. Categora B: consiste en una o ms prdidas prematuras de neonatos morfolgicamente normales a las 34 semanas de gestacin o antes, debido a preeclampsia severa o eclampsia o insuficiencia placentaria severa. Categora C: consiste en tres o ms abortos espontneos consecutivos sin explicacin antes de las 10 semanas de gestacin seguidos de alteraciones hormonales o anatmicas de la madre o alteraciones cromosmicas de ambos padres.
b) Criterios de Laboratorio Los dos criterios de laboratorio son la presencia y persistencia de anticuerpos aCL o AL. Los anticuerpos aCL deben ser de clase IgG y/o IgM, y estar presentes en ttulos medios o altos medidos por ELISA dependiente de 2GPI. en dos o ms ocasiones en un periodo mnimo de 6 semanas. No estn incluidos los anticuerpos aCL IgA, anti-2GPI y anticuerpos aFL contra fosfolpidos diferentes a CL como fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina o contra otras protenas como protrombina, anexina V, PC o PS. En el ELISA aCL de fase slida, la CL se fija en pocillos de la microplaca donde formar complejo con la 2GPI presente en el suero fetal bovino utilizado en la prueba y en el suero en estudio (donde tambin podra existir anticuerpos aCL). Luego se agrega un segundo anticuerpo (ej. anti-IgG) conjugado con una enzima (generalmente fosfatasa alcalina) y finalmente la reaccin se revela agregando el sustrato adecuado. La presencia de AL detectado en la sangre en dos o ms ocasiones en un perodo de seis semanas. EL AL, determinado con plasma pobre en plaquetas, debe ser detectado en las siguientes etapas: (a) Prolongacin de una prueba de coagulacin dependiente de fosfolpidos (tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA), tiempo de coagulacin con Kaolin (KCT), tiempo de veneno de vbora Russel diluido (DRVVT), tiempo de protrombina diluido (dTP) o tiempo de textarin; se recomienda utilizar dos pruebas de distinta fase: ej. va intrnseca: KCT y va extrnseca: dTP); (b) Despus de repetir la prueba de coagulacin usando una mezcla (1:1) de plasma en estudio y plasma normal, se mantiene alterada; (c) acortamiento o correccin de la prueba de coagulacin prolongada al agregar un exceso de fosfolpidos (lisado de plaquetas). Se deben excluir otras alteraciones de la coagulacin (inhibidor de Factor VIII o heparina). 3.1.6. Tratamiento Las recomendaciones teraputicas actuales para el SAF se basan en estudios observacionales de la asociacin de anticuerpos aFL y trombosis, especialmente trombosis recurrente. Considerando que sus manifestaciones son fundamentalmente de trombosis arteriales o venosas el tratamiento est centrado en el uso de anticoagulantes. En su fase aguda se indica
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heparina seguida de tratamiento anticoagulante oral (TACO), por periodos variables de acuerdo al cuadro clnico y a la clase y concentracin de anticuerpos aFL presente. El uso de heparina estndar en pacientes con AL puede ser complejo, ya que ste prolonga el TTPA lo que hace difcil el control de la heparina. El uso de heparina de bajo peso molecular (HBPM), que no altera el TTPK ni el TT y su monitoreo, se requiere solo en altas dosis teraputicas, embarazo o cierto grado de insuficiencia renal. Es la mejor indicacin para el tratamiento inicial de la trombosis venosa o arterial, seguido de TACO con un periodo de sobreposicin de cinco das. Los pacientes con tr omboembolismo espontneo y SAF deben ser tratados con TACO por largo tiempo, ya que tienen una alta recurrencia de trombosis (50-70%), al no recibir TACO en alta intensidad y al contrario con International normalized ratio (INR) mayor de 3, se obtienen los mejores resultados, aunque se asocia a alto riesgo de sangrado. Sin embargo, estudios prospectivos concluyen que INR en rango de 2-3 2-2.8 son efectivos. El uso de aspirina no trae beneficios adicionales y aumenta el riesgo de sangrado. No se ha establecido la duracin del TACO en el SAF, aunque se recomienda un mnimo de 6 meses ante un episodio de trombosis venosa profunda; sin embargo aquellos casos con trombosis venosa recurrente o accidente vascular isqumico debe mantenerse por largo tiempo. Deben considerarse en esto la localizacin y extensin de la trombosis y otros factores de riesgo agregados reversibles o irreversibles, junto al riesgo de sangrado de acuerdo a la edad y tiempo de administracin del TACO. En ocasiones el AL prolonga el TP y es difcil el control de TACO, sin embargo el uso de una tromboplastina insensible al AL puede ser de utilidad. El solo hecho de tener un ttulo alto de anticuerpos aCL no sera indicacin de TACO, pero debe estudiarse cada caso en particular. Es as como una historia familiar de complicaciones por SAF, pacientes con LES y SAF con alteraciones de laboratorio o con otros factores de riesgo de trombosis, tendran
indicacin de TACO. Una alternativa al TACO en paciente con LES tratado con cido acetilsaliclico, sin trombosis, es el uso del antimalrico hidroxicloroquina que tendra algn efecto antitrombtico. Tratamiento de SAF y Embarazo. El tratamiento profilctico con HBPM ha permitido llevar a buen trmino el embarazo de pacientes con SAF. El uso de 40 mg de enoxaparina o 5000 U subcutneas diarias han sido las dosis utilizadas durante el embarazo y durante 6 semanas del puerperio. En el caso de SAF se han utilizado simultneamente aspirina y HBPM, aun cuando sus resultados no estn suficientemente evaluados. El uso de aspirina en bajas dosis 7581 mg/da y heparina estndar, 5000 U subcutnea cada 12 horas han sido de utilidad en pacientes con abortos recurr entes y anticuerpos aFL. En pacientes refractarios a TACO, con tr ombocitopenia inmune grave o contraindicacin a heparina, est indicado el uso de esteroides. Bick R. clasific las trombosis asociadas a anticuerpos aFL en seis tipos, lo cual tiene un sentido prctico en relacin a la teraputica: (a) Tipo I (trombosis venosa profunda con o sin embolia pulmonar), Tipo II (trombosis de arteria coronaria, trombosis de arteria perifrica, trombosis artica, trombosis de la arteria cartida), (c) Tipo III (trombosis de arteria de la retina, trombosis de vena de la retina, trombosis cerebro vascular, crisis isqumicas transitorias), (d) Tipo IV (mezclas de los tipos I, II, y III, (e) Tipo V (trombosis vascular placentaria, prdida fetal frecuente en el primer trimestre del embarazo, prdidas fetales del segundo y tercer trimestre del embarazo, (f) Tipo VI (anticuerpos aFL sin manifestaciones clnicas aparentes). 3.2. Cncer La trombosis es una manifestacin muy comn en los pacientes con enfermedades malignas, asociacin descrita por primera vez en al ao 1865 por Armand Trousseau. Esta complicacin ocurre en forma espontnea, despus de ciruga o en pacientes que reciben quimioterapia. La enfer medad tr omboemblica puede ser tambin la primera manifestacin de una neoplasia oculta subyacente. La frecuencia de trombosis es diferente segn el tipo de cncer, observndose en algunos de ellos (ej: pulmn,
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pncreas), una frecuencia mayor de complicaciones trombticas. Por otra parte, se ha sugerido que la trombosis se puede asociar a un peor pronstico y peor supervivencia cuando se compara con pacientes portadores del mismo tipo de tumor que no han presentado eventos trombticos. La patogenia de la trombosis en el cncer comprende una compleja relacin entre las
clulas tumorales, el paciente y el sistema hemosttico, incluyendo activacin del sistema de la coagulacin y fibrinoltico, alteracin del endotelio vascular y estimulacin de mecanismos procoagulantes sobre la superficie de monocitos y plaquetas circulantes. Los diferentes mediadores en la interaccin entre sistema hemosttico y las clulas tumorales se muestran en la tabla 24-4.
Tabla 24-4. Activacin de la hemostasia mediada por las clulas tumorales Mediadores Procoagulantes Factor tisular Protena procoagulante del cncer Mediadores Profibrinolticos Activador tisular del plasmingeno (t-PA) Activador del plasmingeno tipo urokinasa (u-PA) Receptor de uPA (uPAR) Inhibidores de los activadores del plasmingeno (PAI-1 y -2) Citoquinas IL-1 Factor de necrosis tumoral (TNF-) Factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF)
3.2.1. Molculas procoagulantes Las clulas tumorales a travs de la expresin de molculas procoagulantes son capaces de activar la coagulacin; las ms caracterizadas hasta ahora son el factor tisular (FT) y la protena procoagulante del cncer (PCa). El FT, que constituye el iniciador natural del mecanismo de la coagulacin est sobreexpresado sobre la superficie de muchos tipos de clulas tumorales. El FT no se expresa sobre las clulas epiteliales normales pero s lo hace como resultado de la transformacin maligna. La expresin de FT no slo se correlaciona con el grado de desdiferenciacin histolgica de la clula tumoral sino que tambin parece alterar el fenotipo de sta. Por ejemplo, aparte de su funcin procoagulante, el FT juega un papel importante en la capacidad de crecimiento del tumor y en la produccin de metstasis. La PCa es una cistena-endopeptidasa de 68 kDa, presente en muchas clulas tumorales, que tiene la capacidad de activar directamente al factor X (FX) de la coagulacin. La activacin del FX se logra por escisin de la cadena pesada
en un sitio diferente del que lo hacen otros activadores conocidos del factor. El antgeno de PCa es posible demostrarlo en el suero de pacientes con cncer y ha sido incluso propuesto como un mar cador tumoral sensible y especfico. La PCa se ha encontrado aumentada hasta en un 85% de los pacientes con cncer. 3.2.2. Sistema fibrinoltico Las clulas tumorales expresan en su superficie todos los elementos que participan en la regulacin del sistema fibrinoltico; los dos tipos de activadores del plasmingeno (t-PS y u-PA), los dos inhibidores de los activadores del plasmingeno (PAI-1 y PAI-2) y el receptor de u-PA (u-PAR). La activacin del sistema fibrinoltico sobre la superficie de las clulas tumorales es importante en la patogenia de los defectos hemorrgicos vistos en algunos tipo de enfer medades malignas (leucemia promieloctica) y tambin en la capacidad de invadir y generar metstasis. Por otra parte, un defecto en la capacidad fibrinoltica, observado en algunos tipos de tumores, contribuye a la generacin de un estado procoagulante.
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3.2.3. Citoquinas Las clulas tumorales tienen la capacidad de producir una serie de mediadores inflamatorios que pueden producir efectos procoagulantes importantes sobre el endotelio vascular. Por ejemplo, el factor de necrosis tumoral- (TNF) y la interleuquina-1 (IL-1) inducen la expresin de FT sobre las clulas endoteliales y disminuyen la expresin de la protena anticoagulante trombomodulina, fenmenos que transfor man el endotelio nor mal antitrombtico en uno protrombtico. La secrecin por las clulas tumorales del factor de crecimiento vascular y endotelial (VEGF) induce aumento de la permeabilidad vascular y juega un papel fundamental en la neovascularizacin del tumor. 3.2.4. Interacciones celulares La interaccin de las clulas tumorales con las clulas del husped constituye otro mecanismo importante de alteracin del sistema hemosttico y generacin de complicaciones tromboemblicas. Esta interaccin puede ser directa entre clulas, mediada por molculas de adhesin o en forma indirecta a travs de la liberacin de citoquinas. Un ejemplo del primer mecanismo lo constituye la activacin de las plaquetas mediada por las clulas tumorales y la induccin de interacciones adhesivas entre las clulas endoteliales y las clulas tumorales, mediadas por la glicoprotena IIb/IIIa plaquetaria. El estado protrombtico de los pacientes con cncer se puede traducir en un evento trombtico como primera manifestacin de esta condicin o como tromboembolismo venoso en pacientes con cncer ya diagnosticado, en cualquier etapa de su enfermedad. Estas complicaciones incluyen fenmenos tromboemblicos postoperatorios, inducidos por quimioterapia o de catteres venosos centrales. Como ya fue sugerido por Trousseau, la trombosis venosa puede ser la primera manifestacin de una enfermedad neoplsica. Se ha demostrado que en pacientes con trombosis venosa o embolia pulmonar, en ausencia de otros factores de riesgo, la probabilidad de tener un cncer oculto puede ser de hasta un 10%. Sin embargo, estudios de exploracin tratando de demostrar un tumor en pacientes con una trombosis venosa han mostrado ser de muy bajo rendimiento, por lo
que parece prematuro recomendar esta prctica en cualquier paciente que se presente con una trombosis venosa no explicada. En pacientes portadores de enfermedades malignas demostradas, los fenmenos trombticos se pueden presentar en cualquier momento de su evolucin. La ciruga en los pacientes con cncer representa un factor de riesgo muy importante, encontrando en algunas series seleccionadas cifras de trombosis venosa de sobre un 20%, especialmente asociadas a reposo prolongado. El riesgo de trombosis en pacientes no sometidos ciruga reciente ha sido evaluado principalmente en cncer de mama. En pacientes portadoras de cncer de mama etapa II que reciben quimioterapia, la incidencia de trombosis venosa es alrededor de un 7%. La adicin de tamoxifeno aumenta significativamente el riesgo de aparicin de fenmenos tromboemblicos en este tipo de pacientes. Por ltimo los pacientes usuarios de catteres venosos centrales presentan un riesgo marcado de desarrollar trombosis axilar o subclavia. Adems los catteres por s mismos, son trombognicos, a pesar del uso de heparina. 3.3. Sndromes mieloproliferativos Los sndr omes mielopr oliferativos son neoplasias de la clula troncal hematopoytica (ver captulo 13). La trombosis y la hemorragia representan complicaciones frecuentes en estos cuadros. La trombosis se puede presentar hasta en un 30% de los pacientes con policitemia vera siendo los fenmenos tr ombticos ms frecuentes los infartos de miocardio, cerebral y esplnico, y la trombosis de las venas hepticas (sndrome de Budd-Chiari); tambin se observa trombosis venosa profunda y tromboembolismo pulmonar. La alta frecuencia de fenmenos tr omboemblicos en los sndromes mieloproliferativos sugiere la existencia de un estado de hipercoagulabilidad. El mecanismo del riesgo aumentado de trombosis en estos cuadros es motivo de debate. Se ha sugerido que el recuento de plaquetas elevado en conjunto con una serie de alteraciones de la funcin plaquetaria, contribuiran a este estado de hipercoagulabilidad. Entre las alteraciones funcionales plaquetarias se ha encontrado hiperagregabilidad y posiblemente alteracin en la capacidad procoagulante de las plaquetas, fenmenos que pueden asociarse a un estado protrombtico.
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3.4. Hemoglobinuria paroxstica nocturna Las alteraciones de membrana caractersticas de la hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN) estn involucradas en las manifestaciones clnicas de la enfermedad tales como hemlisis intravascular crnica, hemoglobinuria, citopenias y trombosis (ver captulo 8). Una particularidad de la trombosis en la HPN es su predileccin por los vasos intraabdominales incluyendo la circulacin portal, mesentrica, heptica y renal. El segundo sitio ms comn de compromiso es el sistema venoso cerebral. El inicio de los episodios de trombosis es independiente de la duracin de la enfermedad o del grado de hemlisis. El mecanismo que predispone a la trombosis en la HPN es mayormente desconocido. Se ha sugerido que las alteraciones de membrana de los leucocitos los hacen susceptibles a la lisis por complemento con liberacin de sustancias procoagulantes a la sangre. Las plaquetas tambin muestran esta misma sensibilidad al dao por complemento que se traduce en hiperagregabilidad y aumento de la actividad procoagulante. 3.5. Sndrome nefrtico El sndrome nefrtico se caracteriza por prdida de grandes cantidades de protena por la orina (>3.5g/da) e hipoalbuminemia concomitante (<3.0 g/dl). La trombosis de la vena renal, que se mencionaba como causa de este cuadro, es ahora considerada una complicacin con una frecuencia que puede ser tan alta como el 33% de los casos. Los fenmenos trombticos pueden comprometer cualquier territorio vascular, lo que confir ma un estado de hipercoagulabilidad. Debido a que en el sndrome nefrtico existe prdida de gran cantidad de protenas, la concentracin de los factores hemostticos se puede ver afectada. Cuatro alteraciones del sistema de la coagulacin se han invocado como causa de la hipercoagulabilidad en el sndrome nefrtico: (a) aumento de algunos factores de la coagulacin (fibringeno, FV y FVII), (b) disminucin de inhibidores, especficamente de ATIII, (c) defecto de fibrinolisis y (d) aumento del nmero y de la agregabilidad de las plaquetas. 4. TROMBOFILIA POR MECANISMO MIXTO 4.1. Hiperhomocisteinemia La homocisteina es un aminocido intermedio
de tipo sulfidrilo que se forma durante la conversin de metionina a cistena. La homocisteina est presente normalmente en el plasma a bajas concentraciones (5-15 umol/L). La hiper homocisteinemia es un factor establecido independiente de riesgo vascular incluyendo la trombosis, aunque existe menos evidencia de que la normalizacin de sus niveles, disminuya este riesgo. El metabolismo de la homocistena tiene dos caminos enzimticos principales: la transulfuracin para formar cistationina, o a travs de la remetilacin para formar metionina (figura 24-3). La cistationina--sintetasa (CBS) cataliza la condensacin de la homocistena y serina para formar cistationina, utilizando piridoxal fosfato (vitamina B6) como cofactor. La remetilacin posee dos vas alternativas: (a) En una va, 5-metiltetrahidrofolato es el dador de un grupo metil y la cobalamina (vitamina B12) acta como cofactor, y (b) en la otra va, la betana acta como donante del grupo metilo y la reaccin es catalizada por la betanahomocistena metiltransferasa. Las deficiencias hereditarias de las enzimas necesarias para la remetilacin o transulfuracin pueden resultar en niveles elevados de homocistena, as como defectos adquiridos de los cofactores. La hiperhomocisteinemia est determinada por alteraciones genticas o nutricionales o alteraciones metablicas como la insuficiencia renal crnica o el hipotiroidismo. La hiperhomocisteinemia puede ser clasificada de acuerdo a los niveles de homocistena en 3 grupos: Grave (concentracin plasmtica >100 mol/ L) Moderada (concentracin plasmtica 25 a 100 mol/L) Leve (concentracin plasmtica 16 a 24 mol/L)
La hiper homocisteinemia grave es generalmente causada por la deficiencia homocigota de la enzima CBS. Esta causa retardo mental, cristalino ectpico, alteraciones esquelticas y enfermedad trombtica arterial y venosa precoz y grave. La hiperhomocisteinemia moderada o leve est deter minada por defectos hereditarios o adquiridos del metabolismo de la homocistena. Dentro de estos, la deficiencia heterocigota de CBS es la ms comn (0.3 a 1,4% de la poblacin
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Figura 24-3. Metabolismo de la homocistena. PLP, Piridoxal-5-fosfato; FAD, Flavin Adenin Dinucletido.
caucsica). Las mutaciones de la enzima metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) deter minan grados variables de hiperhomocisteinemia. Una alteracin de la va de remetilacin de homocisteina a metionina est determinada por una mutante termolbil de la MTHFR, que se traduce en una reduccin de su actividad. Esta variante de la enzima se produce por una transicin CT en el codn 677 que resulta en un cambio de alanina a valina en la protena madura y que disminuye su actividad en un 5060% en el estado homocigoto. La prevalencia de esta mutacin en la poblacin general es de alrededor de un 5% en caucsicos, 30% en eur opeos y japoneses y un 11% en afroamericanos. En pacientes portadores de enfermedad coronaria se ha encontrado una prevalencia de la mutacin de 17%. La presencia de esta mutacin no est siempre asociada a aumento en los niveles de homocistena, lo que indica que la expresin fenotpica est probablemente influida por otros factores. Por ejemplo, pacientes homocigotos para la for ma ter molbil de la MTHFR o heter ocigotos para deficiencia de CBS, presentan hiperhomocisteinemia especialmente si coexisten con bajas concentraciones sricas de cido flico.
4.1.1. Patogenia Los mecanismos por los cuales la hiperhomocisteinemia induce aterognesis y trombognesis no se encuentran totalmente dilucidados. Estudios in vivo en animales han demostrado que la homocistena causa descamacin endotelial, proliferacin de clulas musculares lisas y engrosamiento de la ntima. Estudios in vitro han encontrado que el dao por homocistena requiere cobre y oxgeno y es pr evenido por catalasa pero no por superxido dismutasa, sugiriendo que el perxido de hidrgeno sera responsable del dao de la clula endotelial. Otros efectos de la homocistena sobre los vasos sanguneos y sistema hemosttico incluyen: dao directo de la clula endotelial a travs de la oxidacin del colesterol LDL. Inhibicin de la expresin de trombomodulina y la activacin de PC y supresin de la expresin de heparan sulfato, y aumento de la unin a lipoprotena a fibrina. De esta manera se altera el mecanismo de los anticoagulantes naturales y se disminuye la respuesta fibrinoltica. Es importante sealar que la mayora de los estudios sobre los efectos in vitro de la homocistena se han demostrado usando concentraciones muy altas de sta, al menos un orden de magnitud superior a la concentracin plasmtica.
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Estudios ms recientes in vivo han entregado abundante evidencia de que la hiperhomocisteinemia produce alteraciones funcionales de los vasos sanguneos; en este sentido, el aumento en el estrs oxidativo y los niveles de especies reactivas de oxgeno, jugaran un papel fundamental en estos cambios vasculares inducidos por hiperhomocisteinemia. Aparte de la alteracin vascular funcional, tambin se ha demostrado que los niveles aumentados de homocistena promueven el desarrollo de lesiones ateroesclerticas per se o las aumenta cuando se asocia a otros factores de riesgo. Causas de hiperhomocisteinemia Causas adquiridas de hiperhomocisteinemia incluyen la deficiencia de folato, vitaminas B6 y B12, cofactores esenciales en su metabolismo. Otra causa frecuente de niveles elevados de homocistena es la insuficiencia renal crnica. Drogas que interfieren con el metabolismo del folato, tales como metotrexato y anticonvulsivantes, de la vitamina B12 como xido ntrico y de vitamina B6 como teofilina, pueden provocar alzas moderadas en los niveles de homocistena. Defectos genticos que se caracterizan por niveles muy elevados de homocistena presentan un riesgo muy alto de desarrollar precozmente complicaciones vasculares arteriales y venosas graves. Debido a que los pacientes con homocistinuria presentan lesiones ateroesclerticas graves, se postul que la hiper homocisteinemia moderada podra constituir un factor de riesgo para enfermedad arterial, lo que se ha comprobado en una serie de estudios epidemiolgicos. Hiperhomocisteinemia y riesgo vascular La mayora de los estudios de casos y controles o seccionales cruzados, han demostrado una asociacin entre la hiperhomocisteinemia y dao vascular, en la forma de enfermedad coronaria, cerebrovascular o arterial perifrica. Sin embargo, en estudios prospectivos en sujetos sanos al momento de enrolarlos, los resultados son controvertidos ya que de 12 estudios de este tipo solamente en 5 de ellos se encontr asociacin entre hiperhomocisteinemia y riesgo cardiovascular. Estudios prospectivos en pacientes portadores de enfermedad coronaria al momento de ingresar al estudio, han mostrado una relacin
muy significativa entre los niveles de homocistena y muerte cardiovascular. Estudios de meta-anlisis demuestran un riesgo vascular cuando se combina enfermedad coronaria con homocigotos del alelo 677T y bajos niveles de folatos, sin embargo, este polimorfismo no siempre se asocia a hiperhomocisteinemia. Estudios de meta-anlisis han demostrado que el riesgo de incidencia de un primer episodio de trombosis venosa es 2.5 veces el riesgo normal y del homocigoto para MTHFR C677T es 1 si no se asocia a deficiencia de cido flico. Recientes estudios plantean que esta mutacin puede proteger del cncer del colon y de leucemia linftica. 4.1.2. Diagnstico La homocistena plasmtica existe libre o unida a protenas y se mide como homocistena plasmtica total (rango 6 a 15 mol/L). El diagnstico se hace midiendo la homocistena plasmtica despus de una noche de ayuno. En caso de que sus valores sean normales, se puede efectuar una carga de L-metionina oral 100 mg/kg con medicin de sus niveles a las 4 y 6 horas, cuyo percentil 90 es de 41.3 mol/L y 58.8 mol/L, respectivamente. Deben determinarse los niveles de cido flico srico y de vitamina B 12 y eventualmente demostrar la mutacin C677T para MTHFR. 4.2. Aumento de los niveles de factores de la coagulacin El aumento moderado de los niveles plasmticos de los factores de la coagulacin VIII, IX y XI se han asociado a un aumento marcado del riesgo de trombosis venosa. Niveles muy altos de factor VIII y IX se asocian a riesgo de trombosis venosa recurrente. El origen adquirido o hereditario de estos niveles elevados de factores es motivo de debate, aunque se acepta que tiene un importante componente hereditario especialmente a nivel del FVIII. El mecanismo responsable de la hipercoagulabilidad en esta situacin no se ha aclarado, aunque se ha encontrado recientemente un aumento importante en la generacin de trombina en el plasma de pacientes con niveles elevados de FIX y FXI.
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5. ESTRATEGIA DIAGNSTICA La evaluacin indiscriminada de laboratorio en todo paciente que presenta un episodio de tr omboembolismo venoso, no aparece justificada en el momento actual. Aparte de constituir una prctica de muy alto costo, los resultados generalmente no se traducirn en cambios de conducta y la identificacin de factores de riesgo no modificables generarn una ansiedad innecesaria en pacientes y parientes asintomticos. Pacientes con trombosis arterial no representan buenos candidatos para investigar defectos tromboflicos hereditarios. El estudio de trombofilia debera enfocarse a aquellos pacientes en los cuales los hallazgos de laboratorio son con mayor probabilidad positivos o cambiarn conductas teraputicas.
Entre stos se incluye a pacientes jvenes (menor es de 45 aos) con trombosis inexplicada, recurrente o en sitios inusuales, mujer es con mala historia obsttrica y potenciales usuarias de anticonceptivos orales con historia personal o familiar de trombosis. La investigacin de laboratorio a parientes de primer grado de portadores de defectos tromboflicos es motivo de controversia y en caso de hacerlo debe ser acompaada de una cuidadosa explicacin de los resultados y consejera especializada. El estudio de laboratorio debe contemplar un panel mnimo de pruebas que incluyen los defectos de mayor prevalencia en la poblacin y aquellos que aun siendo de baja frecuencia, se asocian a riesgo alto de trombosis (tabla 245).
Tabla 24-5 Panel mnimo de estudio de las trombofilias Antitrombina III, ensayo funcional Protena C, ensayo funcional Protena S libre, ensayo antignico Resistencia a la protena C activada Mutacin G20210A de la protrombina Anticuerpos antifosfolpidos (AL, Ac aCL) Homocistena plasmtica
AL, Anticoagulante lpico, Ac aCL, Anticuerpos anticardiolipina
El momento en que se realiza el estudio de laboratorio tambin es una variable importante a considerar. Los episodios tromboemblicos agudos, con o sin tratamiento concomitante, pueden influir de modo importante en los resultados y dificultar su interpretacin. Por esta razn se recomienda efectuar la investigacin de laboratorio 6 meses despus del episodio agudo. Debido a que el uso de anticoagulantes orales afecta los valores de la PC, PS el estudio no se debiera realizar antes de dos semanas de suspendido el tratamiento. LECTURAS SUGERIDAS Trombofilias hereditarias Bauer, K.A. Hypercoagulable states In : Hematology basic principles and practice, Hoffman, R., Benz, E.J., Shattil, S.J., Furie, B., Cohen, H.J., Silberstein LE. 2nd Edition. Churchill Livingstone, New York, 1995, pp. 1781-1795.
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HEMATOLOGA
Captulo
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TRATAMIENTO ANTITROMBTICO
Jorge Aldunate O. y Mara Jess Vial C.
1. Introduccin 2. Frmacos antiplaquetarios 2.1. Mecanismo de accin de los antiplaquetarios 2.2. Uso de pruebas de laboratorio para el control del tratamiento con antiplaquetarios 2.3. Bases farmacolgicas de los frmacos antiplaquetarios 2.3.1. cido acetilsaliclico 2.3.2. Clopidogrel 2.3.3. Dipiridamol 2.3.4. Eptifibatide 2.3.5. Ticlopidina 2.3.6. Tirofiban 3. Anticoagulantes 3.1. Anticoagulantes parenterales: heparinas 3.1.1. Historia de las heparinas 3.1.2. Composicin qumica de la heparina 3.1.3. Mecanismo de accin de la heparina: Efecto sobre la AT-III 3.1.4. Uso de pruebas de laboratorio para el control del tratamiento con heparina 3.1.5. Farmacocintica de las heparinas 3.1.6. Efectos secundarios y reacciones adversas del uso de heparinas 3.1.7. Contraindicaciones 3.1.8. Indicaciones teraputicas
3.2. Anticoagulantes orales 3.2.1. Generalidades 3.2.2. Mecanismos de accin de los anticoagulantes orales 3.2.3. Frmacos anticoagulantes orales disponibles en Chile 3.2.4. Interacciones de los anticoagulantes orales 3.2.5. Mecanismos de interaccin fa rmacolgica 3.2.6. Efectos secundarios de los anticoagulantes orales 3.2.7. Monitorizacin del tratamiento anticoagulante oral 3.2.8. Indicaciones clnicas de la terapia anticoagulante oral 3.2.9. Contraindicaciones de terapia anticoagulante oral 3.2.10. Resistencia a los anticoagulantes orales 4. Frmacos fibrinolticos 4.1. Proceso fibrinoltico 4.2. Uso mdico del proceso fibrinoltico 4.3. Frmacos anticoagulantes fibrinolticos disponibles en Chile. 5. El futuro en el tratamiento antitrombtico
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RESUMEN
La trombosis puede producir la obstruccin de un vaso sanguneo y est implicada en varias enfermedades de alta morbimortalidad (infarto de miocardio, infarto cerebral, tromboembolismo pulmonar). La respuesta hemosttica, es la sumatoria de eventos celulares y plasmticos. Ambos tipos de procesos pueden ser afectados por frmacos que cuando previenen la formacin y el crecimiento de un trombo, o cuando lisan un trombo existente, se les conoce como agentes antitrombticos. Actualmente, existen tres clases de frmacos disponibles para uso clnico: los agentes antiplaquetarios, los medicamentos anticoagulantes y las drogas trombolticas. Los frmacos antiplaquetarios son un grupo de medicamentos que acta sobre la agregacin plaquetaria, siendo el ms clsico el cido acetilsaliclico. Su accin se produce al inhibir irreversiblemente el metabolismo de produccin del cido araquidnico de las plaquetas, evitando su agregacin y por ende el crecimiento del trombo. Los frmacos anticoagulantes evitan el crecimiento del trombo, siendo la heparina el anticoagulante de uso parenteral ms utilizado, acta potenciando el efecto de la Antitrombina III, anticoagulante natural y que tiene la capacidad de neutralizar algunos de los factores activados de la coagulacin, fundamentalmente la trombina o factor II, el factor X activado, el factor IX activado y el factor XI activado. Los anticoagulantes orales pertenecen a dos grandes familias de drogas, las cumarinas y las inandionas, siendo los ms utilizados, el acenocumarol y la warfarina. Su mecanismo de accin es interferir en la sntesis de vitamina K, y por ello, afectando la produccin de los factores de la coagulacin IX, X, VII, II, y de las protenas C y S, todos los cuales son dependientes de la vitamina K. El objetivo principal del tratamiento anticoagulante oral es mantener niveles ptimos de anticoagulacin para evitar episodios trombticos o recurrencias. Los frmacos fibrinolticos activan la plasmina, proteasa que acta sobre las molculas de fibrina que forman parte del cogulo y por tanto provocando su lisis y permitiendo la recanalizacin de los vasos sanguneos que se encuentran obstruidos. Este tipo de tratamiento antitrombtico es el nico tratamiento verdaderamente curativo, aunque tiene importantes riesgos hemorrgicos.
1. INTRODUCCIN Alrededor de 1850, Rudolf Virchow, patlogo alemn, postul dos trminos asociados a la inflamacin de las venas, la trombosis y la embolia. En una vena, localmente se podan asociar tres elementos: (a) cambios en la pared de los vasos por dao del endotelio, (b) disminucin del flujo sanguneo (stasis sanguneo) y (c) cambios en la sangre (hipercoagulabilidad). Esta trada de elementos, hoy conocida como la trada de Virchow, daban cuenta de la generacin de un trombo venoso, el cual si se soltaba y circulaba por la sangre, se transformaba en un mbolo. Hoy en da, se sabe que si se produce una seccin de un vaso, se activa un conjunto de clulas y protenas que transporta la sangre, interactuando con la pared lesionada. Tales elementos activados provocan la conversin de la sangre, desde su estado lquido a una sustancia slida (cogulo) que se deposita
alrededor y en el interior de la pared actuando como tapn, proceso conocido como hemostasia. Si en lugar de existir una ruptura del vaso, en la parte interna de su pared se produce una grieta o una rugosidad, se activarn los mismos mecanismos y se producir tambin un cogulo en el interior del vaso, en este caso, se habla de trombosis. La trombosis, es una complicacin importante de varias condiciones mdicas y quirrgicas, que pueden ser prevenidas o ser efectivamente tratadas. Hemostasis y trombosis La respuesta hemosttica es la sumatoria de eventos celulares y plasmticos, siendo los primeros ms significativos en las arterias, por su accin rpida y los segundos, por ser ms lentos, ms importantes en la respuesta de las venas.
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Ambos tipos de pr ocesos, celulares y plasmticos, se interrelacionan y se amplifican, pero tambin se regulan, impidiendo que el fenmeno hemosttico se generalice, provocando una oclusin general de los vasos sanguneos. Es importante sealar aqu, que independiente de cul sea el mecanismo ms importante, siempre se activan, los procesos celulares y plasmticos: a) Procesos celulares. Son generados principalmente por las plaquetas. stas actan per se y por la liberacin de factores propios. Adems, la vasoconstriccin permite la accin de las plaquetas (ver captulo 19). La funcin primordial de las plaquetas es agregarse para for mar el tr ombo (primera etapa de la hemostasia). Esta funcin est determinada por 4 caractersticas: (a) capacidad de adhesin. Al adherirse las plaquetas al endotelio vascular lesionado, liberan sustancias que ayudan a contrarrestar la lesin, entre ellas destaca la serotonina un potente agente vasoconstrictor que pr oduce contraccin de las clulas vasculares musculares lisas, reduciendo, el flujo sanguneo; (b) liberacin de grnulos desde el interior de la plaqueta, hacia la superficie. Esta reaccin se desencadena por accin de la trombina, el colgeno o el ADP. La liberacin de los grnulos genera liberacin de ADP y otros agonistas plaquetarios, creando una reaccin en cadena, aumentando la agrupacin plaquetaria, proceso que se conoce como activacin plaquetaria, (c) una agregacin plaquetaria reversible, en un primer momento, y luego (d) la agregacin irreversible, que aparece cuando se organiza el trombo. En la adhesin de las plaquetas a la pared del
vaso sanguneo tiene un rol fundamental el factor de von Willebrand (ver captulos 19 y 20). La adhesin provoca la liberacin de los grnulos plaquetarios, que llevan a que las plaquetas cambien su forma, exponiendo ms molculas, GPIIb-IIIa, que posibilita la agregacin plaquetaria mediante puentes de fibringeno. La sumatoria de estos eventos produce el tapn plaquetario, el que al depositarse sobre endotelio sano, hace que este tejido libere substancias que tienen efecto antiagregante plaquetario provocando la limitacin del crecimiento del tapn de plaquetas. El AMP cclico tiene un efecto opuesto al ADP, ya que inhibe la agregacin plaquetaria; as los metabolitos que aumentan el AMPc como la prostaciclina (PGI2) y el xido ntrico endoteliales contrarrestan la agregacin. b) Procesos plasmticos. La reaccin bioqumica central del proceso de coagulacin, es la transformacin de fibringeno a fibrina, molcula que al polimerizar produce un soporte donde se depositan clulas y factores sanguneos que llevan a la generacin del cogulo o el trombo, segn sea la lesin que haya sufrido el vaso sanguneo. Una serie de protenas presentes en el plasma (factores de la coagulacin) producidas principalmente en el hgado, reaccionan en cascada, activndose, pr oduciendo la coagulacin de la sangre (ver captulo 20). La activacin de la coagulacin lleva a la transformacin de protrombina a trombina, molcula que a su vez transforma el fibringeno a fibrina (figura 25-1).
Figura 25-1. Esquema del Sistema de la coagulacin.
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Frmacos antitrombticos La trombosis puede producir la obstruccin de un vaso sanguneo y est implicada en varias enfermedades de alta morbimortalidad (infarto del miocardio, infarto cerebral, tromboembolismo pulmonar). Actualmente, tres clases de frmacos estn disponibles para ello: agentes antiplaquetarios, frmacos anticoagulantes y medicamentos trombolticos. Los primeros dos grupos previenen la formacin y crecimiento del trombo, mientras que el tercer grupo lisa el trombo previamente existente. En este captulo se describirn los aspectos ms relevantes sobre estos tres tipos de frmacos. 2. FRMACOS ANTIPLAQUETARIOS Las plaquetas participan en la hemostasis, pero tambin en condiciones patolgicas de tromboembolismo intravascular (ver captulo 19). La base de estos trastor nos, es la agregacin plaquetaria, por eso esta etapa es blanco de los frmacos que buscan evitar o controlar la activacin plaquetaria en sitios sin ruptura del endotelio.
En los sitios donde exista lesin o disfuncin endotelial, las plaquetas se adhieren mediante receptores especficos localizados en su membrana (GPIb) al factor de von Willebrand, el cual a su vez, se une al colgeno del subendotelio vascular; la adhesin plaquetaria estimula la secrecin de ADP, a partir de los grnulos densos y estimula la actividad de la enzima fosfolipasa C, presente en la membrana plaquetaria y cuya funcin es desencadenar la sntesis de cido araquidnico, prostaglandinas y tromboxano A2. Luego, la activacin de las plaquetas tiene lugar por dos vas principales, la va de la ciclooxigenasa y una va dependiente de ADP. Las plaquetas activadas liberan ADP y activan la fosfolipasa A 2 . Lo anterior tiene como consecuencia, la hidrlisis del cido araquidnico pr esente en la super ficie plaquetaria, el cual es metabolizado por la ciclooxigenasa para formar prostaglandinas G2 y H2, y finalmente tromboxano A2 por accin de la enzima tromboxano sintetasa (figura 252).
Figura 25-2. Esquema representativo de la sntesis de tromboxano A2.
2.1. Mecanismo de accin de los antiplaquetarios Los medicamentos que afectan a las plaquetas han tenido un gran desarrollo en los ltimos aos, principalmente por su utilidad para prevenir y tratar el desarr ollo de la aterotrombosis. Un frmaco antiplaquetario ideal es aquel que afecta solo una actividad enzimtica en una va metablica de la clula. En tr minos generales los fr macos antiplaquetarios, segn su mecanismo de accin, se diferencian segn sea su efecto, reversible o irreversible, es decir, si actan inhibiendo reversiblemente una actividad enzimtica de las plaquetas o si su accin sobre
la funcin enzimtica plaquetaria, es permanente. El ms clsico de los frmacos antiplaquetarios es sin lugar a dudas, el cido acetilsaliclico (AAS), conocido por aspirina. Su accin se produce al inhibir irreversiblemente, inhibiendo la enzima prostaglandina H sintetasa, enzima que sintetiza la prostaglandina H2, precursor de la formacin del tromboxano A2. La aspirina acetila el grupo hidroxilo de la serina 529 de la enzima, la cual tiene dos actividades catalticas difer entes, por una parte acta como ciclooxigenasa I (COX I), participando en la formacin de la prostaglandina G2, y tambin lo hace como hidroperoxidasa reduciendo dos
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electrones de esa prostaglandina y produciendo as, Prostaglandina H2 . La O-acetilacin provoca la prdida permanente de la actividad Cox I, en cambio, la actividad de peroxidasa no es afectada. La inactivacin de la Cox I es la base de la accin antitrombtica de la aspirina, pero tambin es la causa de su principal efecto adverso, el sangramiento gstrico. Existen dos tienopiridinas, la ticlopidina y el clopidogrel, que afectan irreversiblemente la agregacin plaquetaria dependiente de ADP. Aunque no est claramente demostrado, se postula que ambos frmacos actuaran a travs de un(os) metabolito(s) intermediario(s), que se originara(n) en el hgado. La inactivacin por las tienopiridinas produce el bloqueo del receptor P2Y12 de las plaquetas, sitio donde fisiolgicamente se une el ADP necesario para la agregacin plaquetaria. El clopidogrel acta ms rpido que la ticlopidina. La Cox I, la GP IIb/IIIa, el receptor de prostaglandina H 2 / tromboxano A 2 y el receptor P2Y12 son protenas plaquetarias posible de inhibir por accin medicamentosa. Se ha estudiado principalmente, la inhibicin reversible de la GP IIb/IIIa, la cual no muestra un efecto clnico beneficioso, peor an, se provoca un aumento de los sangramientos dosis dependiente. En cambio, frmacos que actan como antagonistas de la GP IIb/IIIa s tienen utilidad clnica (tirofiban y eptifibatide). En el caso del dipiridamol, su mecanismo de accin es poco claro, se conoce que incrementa los niveles de AMP cclico por inhibicin de la fosfodiesterasa, y por ende, inhibe la reutilizacin de adenosina, es poco eficaz por s solo aunque parece potenciar la accin antiplaquetaria de la aspirina. 2.2. Uso de pruebas de laboratorio para el control del tratamiento con antiplaquetarios En general, los frmacos antiplaquetarios, inhiben la agregacin plaquetaria, pero no parecen afectar ni la viabilidad ni el recuento de plaquetas. La forma de controlar la accin de los agentes antiplaquetarios es midiendo el resultado de su accin farmacolgica, por ello, es esperable la prolongacin del tiempo de sangra. Por otra parte, es importante la monitorizacin del hematocrito y de la hemoglobina para pesquisar eventuales hemorragias ocultas, secundarias al tratamiento.
2.3. Bases farmacolgicas de los frmacos antiplaquetarios 2.3.1. cido acetilsaliclico La capacidad del AAS de actuar como antiagregante plaquetario define sus usos clnicos en la prevencin del infarto agudo de miocardio (IAM) y en la disminucin del riesgo de trombosis en portadores de prtesis de vlvulas cardacas. Los efectos analgsicos, antipirticos y antiinflamatorios del AAS se deben a las asociaciones de las porciones acetilo y salicilato de la molcula intacta, como tambin a la accin del metabolito salicilato activo. Al administrarse por va oral, su absorcin es rpida. Un alto porcentaje del frmaco se une a protenas, lo cual produce que en casos de hipoalbuminemia aumenta la concentracin plasmtica, con concentraciones bajas de albmina del frmaco. Se elimina por va renal como cido saliclico libre y como metabolitos conjugados. Como antitrombtico, las indicaciones son pr evencin y tratamiento de tr ombosis venosas o arteriales y en la prevencin del infarto de miocardio en pacientes con angina inestable. La dosificacin como antitrombtico es una dosis de 100 a 300 mg/da, luego de un IAM o de un accidente isqumico transitorio. En el uso como antitrombtico de la aspirina, las reacciones adversas ms comunes como nuseas, vmitos, diarrea, epigastralgia, y gastritis, no son muy frecuentes, debido a las bajas dosis requeridas para accin antiplaquetaria, respecto de las dosis utilizadas para sus acciones analgsica, antipirtica y antiinflamatoria. En pacientes con antecedentes de lcera pptica, gastritis o anormalidades de la hemostasis, hay que evaluar las ventajas de su uso respecto del riesgo de hemorragias. Al administrarse puede interaccionar con otr os medicamentos que se unen a las protenas, por ej., tiroxina, penicilina sdica, fenitona, produciendo cambios en las dosis requeridas de estos frmacos. Potencian su efecto de los anticoagulantes orales lo cual puede llevar a valores de INR (ver punto 32.7) por encima de los r equeridos como prevencin trombtica.
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2.3.2. Clopidogrel Se administra en dosis de 75 mg/da. A las 2 horas, se observa inhibicin de la agregacin plaquetaria y el estado estacionario se alcanza entre el 3 y 7 das, con una inhibicin del 40% al 60% de la agregacin plaquetaria. El Clopidogrel se metaboliza muy rpidamente, por lo que la molcula original se encuentra en cantidades mnimas en la circulacin, y adems tiene una alta unin a protenas plasmticas. Se excreta por va renal (50%) y por las deposiciones (45%). El frmaco es bien tolerado, presentando efectos adversos similares que la aspirina. Se debe administrar con precaucin en pacientes con riesgos de hemorragia. En casos de ciruga programada, el clopidogrel se debe suspender 7 das antes, ya que prolonga el tiempo de sangra y no debe usarse en casos de lcera pptica sangrante y de hemorragia intracraneana. El clopidogrel interacciona con otros antiplaquetarios como el AAS; se debe tener en consideracin el efecto sinrgico sobre la agregacin plaquetaria. Con las heparinas, el activador tisular del plasmingeno recombinante (rt-PA) y los anticoagulantes orales, pueden ocurrir efectos sinrgicos sobre la coagulacin. 2.3.3. Dipiridamol En dosis de 300 a 600 mg/da dipiridamol, se usa conjuntamente con anticoagulantes orales, en la prevencin del tromboembolismo originado en las vlvulas cardacas mecnicas. La absorcin es variable y lenta, lo mismo que sus niveles plasmticos, que alcanzan su peak mximo a los 90 minutos. Se metaboliza en el hgado por glucuronoconjugacin y se elimina por va biliar, mediante el pr oceso de recirculacin entero-heptica. Las reacciones adversas ms frecuentes son nuseas, vmitos, diarrea y cefalea. En dosis altas produce hipotensin por ser un fuerte vasodilatador, por lo cual su uso debe evitarse en pacientes con trastornos hemodinmicos. Al asociar dipiridamol con otr os agentes antiplaquetarios, con heparina, con anticoagulantes orales, o con trombolticos (estreptoquinasa o uroquinasa) hay que evaluar las ventajas de su uso con el aumento del riesgo hemorrgico.
2.3.4. Eptifibatide La principal indicacin de eptifibatide es la prevencin del IAM y por ende de la muerte en pacientes con angina inestable o con IAM no Q, cuando ellos requieren tratamientos con intervencin coronaria percutnea, como tambin en pacientes sometidos a angioplasta coronaria transluminal percutnea (ACTP) y aterectoma. Se administra simultneamente en inyeccin endovenosa asociado a una solucin para infusin. En pacientes con angina inestable o IAM no Q, se inicia el tratamiento con una dosis de 180 mg/kg seguido de una infusin continua de 2 ng/Kg/minuto hasta por 72 horas. Si durante el tratamiento, se realiza algn procedimiento intervencionista, la infusin debe seguir por 24 horas post-intervencin. En cambio, si el paciente requiere de ciruga de urgencia, la infusin debe suspenderse de inmediato. La contraindicacin ms importante de uso de eptifibatide es una hemorragia activa importante de cualquier origen; el uso clnico en otras situaciones como INR > 2,0, trombocitopenias, entre 50.000 a 100.000 plaquetas/L, patologas hematolgicas, etc., deben ser evaluadas segn las condiciones particulares del paciente a tratar. Por otra parte, la reaccin adversa ms descrita al usar este medicamento es la hemorragia. El riesgo de hemorragia es ms comn en el sitio de acceso, en aquellos pacientes sometidos a intervencin arterial percutnea. El uso de eptifibatide a dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel y anticoagulantes orales debe evitarse, pues se potencia su accin; en cambio, no est claramente definido qu ocurre al asociar este medicamento con frmacos trombolticos. 2.3.5. Ticlopidina La ticlopidina, luego de una administracin oral de 250 mg, se absorbe rpidamente y alcanza su peak plasmtico a las 2 horas; se absorbe ms de un 80%. Presenta alta afinidad por las protenas plasmticas y su metabolizacin heptica es casi en un 100%. Se indica principalmente, como alternativa a otros agentes antiplaquetarios, en dosis de 250 500 mg da. Las reacciones adversas ms observadas son:
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diarrea, nuseas, dispepsia, prurito y dolor gastrointestinal. La ticlopidina puede aumentar la accin de la antipirina y puede ocasionar lo mismo con otr os fr macos que tengan metabolismo heptico. Como en otr os antiplaquetarios, las contraindicaciones ms importantes del uso de ticlopidina son los trastornos hemostticos o las hemorragias activas. 2.3.6. Tirofiban Este medicamento se usa en forma endovenosa en pacientes coronarios (angina inestable) para prevenir eventos isqumicos, en especial si se les r ealizar aterectoma o angioplasta coronaria. En pacientes con angina inestable o IAM no Q, inicialmente se administra en infusin de 0,4 g/kg/min por 30 minutos, luego en una dosis de mantenimiento de 0,1 g/kg/min. La
infusin debe mantenerse por 12 a 24 horas luego de la angioplasta o de la aterectoma en estos pacientes se combina con heparina, pero debe suspenderse si el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) supera los 180 segundos. En procedimientos como una angioplasta o una aterectoma, el tirofiban se inicia con un bolo de 10 g/kg administrado en 3 minutos, luego en una infusin de mantenimiento de 0,15 g/kg/min, la que se debe mantener por 36 horas, siempre que el TTPA sea <180 seg. En nefrpatas crnicos la dosis debe ser un 50% del resto de los pacientes. El tirofiban est contraindicado en pacientes con hemorragias masivas actuales, accidentes vasculares enceflicos hemorrgicos, aneurismas o con antecedentes de reacciones adversas al frmaco. Los frmacos antiplaquetarios disponibles en Chile, se detallan en la tabla 25-1.
Tabla 25-1. Frmacos antiplaquetarios disponibles en Chile Frmaco Agrastat Artevil Ateroclar Cardioaspirina Dipiridamol Ecotrin Integrilin Persantin Plaquetil Plavix Thrombo AS Ticinil Ticlid Principio activo Tirofiban Clopidogrel Clorhidrato de ticlopidina cido acetilsaliclico Dipiridamol cido acetilsaliclico Eptifibatide Dipiridamol Clorhidrato de ticlopidina Clopidogrel cido acetilsaliclico Dipiridamol Clorhidrato de ticlopidina Presentacin Vial de 50 ml contiene 12,5 mg. Comprimidos recubiertos de 75 mg Grageas de 250 mg Comprimidos microencapsulados de 100 mg Comprimidos de 75 mg Comprimidos con recubrimiento entrico de 325 mg o 100 mg Inyeccin en bolo: 10 ml, 2 mg/ml. Infusin endovenosa:100 ml, 0,75 mg/ml Cpsulas de 250 mg Grageas de 75 mg Comprimidos recubiertos de 75 mg Comprimidos con recubrimiento entrico de 100 mg Cpsulas de 75 mg Comprimidos recubiertos de 250 mg Laboratorio Merck Sharp & Dohme Drugtech Drugtech Bayer Laboratorio Chile GlaxoSmithKline Schering Plough Essex Boehringer Ingelheim Rider Sanofi-Synthelabo Merck Labomed Sanofi-Synthelabo
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3. FRMACOS ANTICOAGULANTES Los frmacos anticoagulantes se agrupan en dos tipos, parenterales y orales. 3.1. Anticoagulantes parenterales: heparinas 3.1.1. Historia de las heparinas La heparina fue descubierta en 1916 por McLean, aislndola del hgado (de ah su nombre). Desde el principio se observ una accin anticoagulante, permitiendo conservar sangre sin que sta se coagulara. Se utiliz como tratamiento anticoagulante por primera vez en 1938, en un tromboembolismo pulmonar y desde entonces se crey que los efectos anticoagulante-antitrombina y antitrombtico iban ntimamente unidos, utilizndose las pruebas de coagulacin (tiempo de coagulacin en tubo y posteriormente TTPA y/o tiempo de trombina) para controlar la dosis a administrar. En un principio slo exista una sal sdica, lo que obligaba a su administracin por va endovenosa. La obtencin de una sal clcica a inicios de los aos 1970 permite su uso subcutneo y de esta forma su aplicacin como profilaxis. En 1980 se fracciona buscando evitar efectos secundarios (trombocitopenia) y casualmente se halla una fraccin que posee actividad antitrombtica pero carece de la actividad antitrombina. 3.1.2. Composicin qumica de la heparina Se deben distinguir entre la heparina no fraccionada o tradicional y la heparina fraccionada o de bajo peso molecular. Heparina no fraccionada Es una sustancia natural, presente en todos los vertebrados. Hallndose particularmente en el hgado, pulmn e intestino de los mamferos. En condiciones normales no existe heparina en circulacin y su equivalente sera el sulfato de heparn (un heparinoide), que se encuentra en el endotelio, en contacto con la sangre y contribuira a la no trombogenidad del endotelio vascular. La heparina no posee un peso molecular fijo ya que est formado por mltiples cadenas de pesos moleculares variables lo que le otorga una gran heterogeneidad. Todas las cadenas
estn integradas por la combinacin de dos azucares, el cido urnico y la glucosamina. La longitud de cada cadena es variable y aunque la mayora de las cadenas poseen ms de 18 azcares, la media es de 50 azcares por cadena, con un peso molecular medio de 15 kDa. A pH fisiolgico es un compuesto aninico, por eso se fija de forma inespecfica a numerosos compuestos biolgicos y protenas plasmticas, provocando que la actividad farmacolgica se presente sobre otros sistemas distintos de la coagulacin sangunea (metabolismo lipdico, crecimiento celular, fibrinolisis, inflamacin, etc.) La heparina se une a la antitrombina III (AT-III) uno de los inhibidores naturales del sistema de la coagulacin, a travs de una combinacin de 5 azcares sucesivos (pentasacrido). Esto aumenta muy significativamente la capacidad anticoagulante de la AT-III (ver captulo 20). Para que se produzca el efecto anticoagulante es necesario que la AT-III neutralice la enzima coagulante activa: factor II activado o trombina, factor X activado (FXa) y factor IX activado) (FIXa). Esta neutralizacin se realiza mediante dos mecanismos: a) Mecanismo de estabilizacin. Zonas de la molcula de heparina, distintas del pentasacrido, se unen a los factores de la coagulacin activos y permiten que la AT-III confor macionalmente modificada por el pentasacrido se pueda unir al sitio activo. En este caso la molcula de heparina debe ser lo suficientemente larga como para permitir que por un lado se una a la superficie del factor y por otro a la AT-III. b) Mecanismo de inhibicin del centro activo. Por neutralizacin mediante unin con el centro activo de la AT-III, que ha sufrido un cambio alostrico al fijrsele el pentasacrido. No todos los factores de la coagulacin que pueden ser inhibidos por la AT-III requieren la accin de los dos mecanismos para neutralizar su actividad coagulante. As, mientras que la trombina precisa de los dos mecanismos, al FXa le es indiferente el tamao de la molcula. La heparina se dosifica en Unidades Internacionales (UI), por referencia a un estndar, variando la cantidad de miligramos en relacin al nmero de Unidades que posee. Por definicin una UI es igual a una Unidad AT y una unidad anti-FXa.
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Heparina fraccionada o de bajo peso molecular Se producen por la despolimerizacin, qumica o enzimtica de la heparina convencional. Existe una gran proporcin de cadenas que poseen 18 azcares o sea 5 kDa; por debajo de esta longitud los efectos de la heparina cambian desde el punto de vista enzimtico, como su farmacocintica. Por lo anterior, las heparinas de bajo peso molecular, poseen poca accin inhibidora de la trombina y en cambio conservan la accin inhibidora sobre el FXa. Dado que varan los mtodos utilizados para la preparacin de las distintas heparinas, se ha hecho difcil consensuar sobre la UI a elegir y ya que todas poseen actividad antiXa se ha escogido esta propiedad para definir las unidades, pero este trmino se halla sujeto a variaciones por el mtodo usado en la determinacin del FXa, dficit de un estndar y la falta de contribucin de la longitud de la cadena al efecto anticoagulante. En la prctica se debe tener en cuenta que a pesar de que las actividades son equivalentes, los productos son distintos entre s y no pueden ser intercambiados. La nadroparina (Fraxiparina) y la enoxiparina (Clexane) poseen pesos moleculares similares (4,5 kDa), aunque difieren en el mtodo usado para su obtencin despolimerizando la heparina tradicional; vara tambin la dosificacin: la nadroparina clcica se expresa en unidades propias (Choay), mientras que la enoxiparina sdica lo hace en miligramos. Hoy existe un estndar internacional, una UI anti-FXa al que se refieren las dos heparinas: 1 Unidad Instituto Choay (Unidades Fraxiparina) = 0.41 UI y 1 mg de enoxiparina (Clexane) = 100 UI. 3.1.3. Mecanismo de accin de la heparina: Efecto sobre la AT-III Las heparinas no fraccionadas, actan potenciando el efecto de la AT-III, anticoagulante natural que tiene la capacidad de neutralizar algunos de los factores activados de la coagulacin, fundamentalmente la trombina (factor IIa), el F-Xa, F-IXa y F-XIa. Esta neutralizacin se realiza por bloqueo del centro activo, en una unin que se realiza con lentitud, pero la velocidad de esta reaccin
puede acelerarse por cambios alostricos (de estructura terciaria) de la AT-III, como los que se producen al unirse esta protena con la heparina, especialmente con el fragmento pentasacrido de la heparina. Algunos factores de la coagulacin activados, como la trombina, para ser neutralizados rpidamente por la AT-III, necesitan la unin de la heparina, por ello cuando la heparina es de cadena corta, como sucede con las heparinas de bajo peso molecular no se produce esta neutralizacin. Esta circunstancia explica la ausencia de actividad antitrombnica de las heparinas de bajo peso molecular. En cambio s poseen la capacidad de potenciar la neutralizacin de aquellos factores activados que no requieren ser inmovilizados por la heparina para su rpido acoplamiento con la ATIII, como sucede con el FXa. 3.1.4. Uso de pruebas de laboratorio para el control del tratamiento con heparina El mecanismo de accin de las heparinas de bajo peso molecular, limitado al FXa explica que slo altere moderadamente el TTPA, ya que no se altera la trombina y slo afecta al FXa, mientras que en el caso de la heparina no fraccionada, se produce adems una marcada reduccin de la trombina, prolongando el TTPA. Es por lo tanto, la prueba que se ha seleccionado para comprobar su efecto cuando se usa la heparina no fraccionada. Si solo se usara el tiempo de trombina, se limitara el estudio de su efecto sobre esta protena. En el caso de las heparinas de bajo peso molecular, la alteracin que producen del TTPA es muy moderada, no sirviendo esta determinacin para controlar su efecto. Para su monitorizacin se debera usar la cuantificacin del FXa; esta tcnica es engorrosa y difcilmente se realiza de urgencia. 3.1.5. Farmacocintica de las heparinas Heparina no fraccionada La farmacocintica de la heparina no fraccionada tiene en cuenta su cantidad. As a bajas dosis o a las dosis habituales, las cadenas de alto peso molecular de que est formada esta heparina, se eliminan por un sistema saturable en el sistema reticuloendotelial o en el endotelio. La cintica de aclaramiento plasmtico se denomina no-lineal puesto que las constantes de aclaramiento dependen de la dosis y la va
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de administracin. La vida media plasmtica es de 60 a 90 minutos. Por lo anterior, en caso de querer realizar una heparinizacin mediante administracin discontinua por va endovenosa, deben practicarse inyecciones cada dos horas, aumentar este intervalo somete al paciente a periodos de fuerte anticoagulacin, seguidos de periodos en que no se detecta heparina. Cuando se realiza una heparinizacin por va endovenosa continua, el tiempo que se tarda en alcanzar un equilibrio es de 6 horas, por ello se aconseja antes de iniciar esta forma de tratamiento, administrar una alta dosis inicial de heparina para de esta for ma alcanzar rpidamente el rango teraputico. Entonces se provoca una situacin en que no existe una relacin simple entre la concentracin alcanzada y la dosis administrada, ya que la eliminacin de la heparina es ms rpida cuando son menores las concentraciones. Si se inyecta heparina clcica subcutnea el peak plasmtico se alcanza a las 2 a 3 horas de la inyeccin y su aclaramiento plasmtico se ver influenciado por la velocidad de absorcin y su eliminacin. Su biodisponibilidad es excelente. Las dosis diarias son casi idnticas a las usadas en tratamiento curativo y deben realizarse dos inyecciones diarias. Cuando se administran pequeas cantidades de heparina sta se elimina por el sistema reticuloendotelial o el endotelio, pero este sistema es saturable, y cuando se alcanza se produce una eliminacin renal, cuya velocidad es mucho ms lenta (3 a 4 horas). Aunque esta dosis raramente se alcanza en tratamientos habituales. Existen situaciones en que se produce una absorcin de la heparina por protenas del tipo reactivo (Fibringeno, fibronectina, etc.) impidiendo su accin. Esta circunstancia debe conocerse cuando al intentar monitorizar un tratamiento heparnico se observa que no aumenta la capacidad de alterar el TTPA con la dosis administrada, obligando a aumentar la cantidad de heparina a administrar y llegando a sospechar una resistencia a la heparina. Dado que la heparina se neutraliza por el sistema reticuloendotelial y el endotelio, existe una gran variabilidad entre individuos, as, como en el mismo individuo, vara con el tiempo y el estado del sujeto. Si a esto agregamos los efectos
neutralizantes de las protenas plasmticas, se comprende la necesidad de monitorizar este tratamiento. Heparina de bajo peso molecular La administracin de la heparina de bajo PM se realiza por va subcutnea, alcanzando un peak plasmtico a las 2 3 horas. Las pocas cadenas largas que poseen estas heparinas se neutralizan por el sistema reticuloendotelial pero con un menor aclaramiento. El resto de cadenas pequeas se elimina por el rin de for ma muy lenta. La vida media de la eliminacin de la actividad anti FXa es de 3 a 4 horas. El tiempo medio de permanencia de la heparina de bajo PM en el compartimento plasmtico es de varias horas, permitiendo la administracin de slo una a dos inyecciones al da. Si no existe insuficiencia renal, no es necesario monitorizar la cantidad de heparina de bajo PM a administrar, dada la poca variabilidad interindividual que existe y las pocas variaciones que se producen en el transcurso del tiempo. Al ser la heparina un anticoagulante ser incompatible con el uso simultneo de otros frmacos antitrombticos entendindose como tales los antiagregantes plaquetarios (aspirina, ticlopidina, etc.), fibrinolticos y anticoagulantes orales (warfarina y acenocumarol), dado que se potencian sus efectos anticoagulantes y aumentan el riesgo de efectos secundarios. Sin embargo, a esta premisa deben realizarse varias observaciones: Heparina y anticoagulante oral. La heparina posee una accin inmediata, mientras que los anticoagulantes orales tardan ms de un da en presentar su accin anticoagulante, por lo tanto, cuando se desea pasar de tratamiento inyectable a oral, si se suprimiera la heparina para iniciar tratamiento con los anticoagulantes orales existira un periodo en que el enfermo no se hallara correctamente anticoagulado. Por lo anterior, debe iniciarse el tratamiento con anticoagulantes orales sin retirar el tratamiento heparnico, y monitorizar el efecto que produce el anticoagulante oral, con el tiempo de protrombina (TP) y cuando se alcanza el nivel de anticoagulacin esperado se suspende la administracin de heparina. Heparina y aspirina. En algunos enfermos y todava en el plano experimental, se asocia la administracin de heparina con pequeas
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cantidades de aspirina, as se observa en pacientes sometidos a tratamientos con angioplastas o en accidentes isqumicos miocr dicos. Los resultados se hallan pendientes de validacin por expertos mundiales, por lo tanto, no es aconsejable esta asociacin como una norma. Heparina y fibrinolticos. Al finalizar un tratamiento fibrinoltico debe instaurarse siempre un tratamiento con heparina, con el objetivo de evitar la retrombosis. Este se inicia inmediatamente o cuando se ha alcanzado un nivel adecuado de fibringeno, que impide la aparicin de hemorragias. 3.1.6. Efectos secundarios y reacciones adversas del uso de heparinas Hemorragias. En la literatura se describe un 2 5% de cuadros hemorrgicos severos dados por sangramientos intracraneanos, retroperitoneales, intramusculares, llegando a producir un sndrome compartamental. En estos casos si el sangramiento es leve se debe bajar la dosis de heparina o suspender la inyeccin hasta evidenciar que ya no existe sangramiento y en casos ms severos se recomienda el uso de sulfato de protamina. Los hematomas en sitios de puncin o hematurias son complicaciones altamente frecuentes. Trombosis o trombocitopenia. Puede aparecer en los primeros das del tratamiento de cantidad moderada y corrige al suspender la inyeccin de heparina. Existen algunos cuadros de trombocitopenia severa a los pocos das de iniciado la inyeccin de heparina, es grave y se asocia a cuadros trombticos. Las causas en ambos casos es la existencia de anticuerpos antiplaquetarios inducidos por la heparina. 3.1.7. Contraindicaciones Se considera contraindicacin absoluta al tratamiento heparnico: (a) cuadro hemorragparo grave activo o la posible aparicin de un cuadro hemorragparo, ya sea gastrointestinal, intervencin neuroquirrgica, accidente vascular reciente o la existencia de una tr ombocitopenia severa y (b) hipersensibilidad a las heparinas o presencias de trombocitopenia secundaria a la heparina. Si se est frente a cualquiera de las circunstancias antes mencionadas, es recomendable instalar un filtro de vena cava en caso de sufrir una trombosis venosa profunda (TVP). Esta medida
tambin se utiliza en caso de recidiva de trombosis en un paciente en tratamiento anticoagulante. Las heparinas de bajo PM no atraviesan la barrera placentaria, por lo que su uso durante el embarazo se presenta seguro para la paciente y el feto, ya que no existen estudios que demuestren su fetotoxicidad ni efectos sobre la funcin reproductora o de tipo mutagnico. 3.1.8. Indicaciones teraputicas La heparina no fraccionada est indicada en la prevencin de tromboembolismo pulmonar (TEP), en el tratamiento de la TVP y embolia pulmonar, en el tratamiento inicial de los pacientes con angina inestable e IAM; en los pacientes que sern sometidos a ciruga cardiaca en que se utilizar bypass cardiopulmonar, ciruga vascular, angioplasta coronaria o instalacin de stent. En pacientes con TEP las dosis de heparina no fraccionada se ajustan al TTPA de 1.5 a 2.5 (paciente/control). La heparina de bajo PM se utiliza para la prevencin de tromboembolismo venoso, en el tratamiento de TVP de TEP y en el manejo temprano de pacientes con angina inestable. En la tabla 25-2 se muestran las recomendaciones para el uso de heparina no fraccionada y heparina de bajo PM, segn el tipo de patologa. 3.2. Anticoagulantes orales 3.2.1. Generalidades Variadas investigaciones cientficas en las ltimas dos dcadas han llevado a un notable mejoramiento de los resultados de la terapia anticoagulante oral y junto con ello, han aumentado las indicaciones mdicas. En estos avances se incluye la definicin de adecuadas indicaciones mdicas, la identificacin del rango teraputico ptimo para cada patologa y la estandarizacin de las pruebas de laboratorio que permiten un control seguro de la terapia. La dosificacin de la terapia y el tiempo en que el paciente se mantiene en rango teraputico ptimo son dos de los factores ms importantes en la efectividad teraputica y en la reduccin de las complicaciones hemorrgicas. Idealmente, el INR International Normalized Ratio (ver punto 3.2.7) debera mantenerse en rango teraputico la mayor parte del tiempo,
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Tabla 25-2. Recomendaciones para el uso de heparinas Heparina de bajo peso molecular Patologa Profilaxis tromboembolismo venoso Ciruga general y Ciruga ortopdica Tromboembolismo venoso Enfermedad coronaria Bolo de 5.000 U y continuar con 35.000 a 40.000 U en 24 horas en infusin ev. Se debe ajustar dosis segn TTPA Bolo de 5000 U y continuar con 35.000 a 40.000 U en 24 horas en infusin ev. Se debe ajustar dosis segn TTPA Bolo de 5.000 U y continuar con 32.000 a 40.000 U en 24 horas en infusin ev. Se debe ajustar dosis segn TTPA Bolo de 5.000 U y continuar con 32.000 U en 24 horas en infusin ev. Se debe ajustar dosis segn TTPA Heparina no fraccionada Clexane 5000 U c/8 - 12 horas 60 mg cada da 60 mg cada da 80 mg cada 12 horas 60 mg cada 12 horas 60 mg cada 12 horas 60 mg cada 12 horas Fraxiparina 90 UI cada 12 horas 90 UI cada 12 horas 90 UI cada 12 horas
90 UI cada 12 horas 90 UI cada 12 horas 90 UI cada 12 horas
Angina inestable Infarto agudo miocardio Trombolisis coronaria

ev, endovenoso;
Bolo de 5.000 U y continuar con 24.000 U en 24 horas en infusin ev. 60 mg cada 12 Se debe ajustar dosis segn TTPA horas
90 UI cada 12 horas
pero muchos factores influyen en el logro de este objetivo. stos incluyen factores fisiolgicos y farmacolgicos, tales como la interaccin con frmacos o enfermedades que afectan la biodisponibilidad del anticoagulante; la dieta, factores gastrointestinales que afectan la disponibilidad de vitamina K; o factores fisiolgicos que afectan la sntesis o metabolismo de los factores de coagulacin dependientes de vitamina K. Adems, factores intrnsecos del paciente como la adherencia al tratamiento son tambin muy importantes. Junto a lo antes descrito se requiere una adecuada monitorizacin de la terapia por parte del laboratorio, mediante la determinacin del TP y una ptima comunicacin mdico-paciente. Esto ltimo con el propsito de conocer antecedentes del paciente, como por ejemplo patologas del mismo y otros frmacos que pueda estar recibiendo.
3.2.2. Mecanismo de accin de los anticoagulantes orales La sntesis de los factores de coagulacin se realiza, principalmente, en el hgado y en el endotelio vascular. Los principales factores e inhibidores de la coagulacin de sntesis heptica, sin incluir la fibrinolisis, son los factores IX, X, V, II (protrombina), fibringeno, protena C y S, AT-III y factor VII. De todos ellos, los factores IX, X, VII, II, protena C y S son dependientes de vitamina K. La actividad de la vitamina K sobre dichos factores no est directamente relacionada con la sntesis, sino con modificaciones qumicas finales que multiplican por varios logaritmos su actividad. La vitamina K es un cofactor para la gammacarboxilacin de los residuos de cido glutmico en el extremo N-terminal de la molcula de las protenas dependientes de
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vitamina K (figura 25-3). Esta carboxilacin est catalizada por la carboxilasa que utiliza como cofactor la forma reducida de la vitamina K (vitamina KH2) (ver captulo 20).
Figura 25-3. Esquema de gammacarboxilacin de las protenas dependientes de vitamina K.
Figura 25-4. Esquema de la reaccin de reciclaje de vitamina K.
Durante la reaccin de gammacarboxilacin ocurre el reciclaje de vitamina K (figura 25-4). La vitamina KH2 se oxida a vitamina K epxido (se almacena de esta forma). Para ser usada nuevamente, debe ser reconvertida en vitamina K, lo que se realiza mediante una reduccin mediada por la vitamina K epxido reductasa. Luego, se reduce a vitamina KH 2 por una reaccin catalizada por la vitamina K reductasa.
Los fr macos anticoagulantes inhiben la vitamina K epxido reductasa y la vitamina K reductasa, por ende disminuyen los niveles de vitamina KH2, lo que impide la carboxilacin de los factores de coagulacin vitamina K dependientes. En la tabla 25-3 se indica la vida media de estos factores.
Tabla 25-3. Vida media de factores de coagulacin Protena Factor II Factor VII Factor IX Factor X Protena C Protena S 3.2.3. Frmacos anticoagulantes orales disponibles en Chile Los anticoagulantes orales pertenecen a dos grandes familias de drogas: las cumarinas y las Vida media (Hrs) 60 4-6 20-24 48-72 6 42 inandionas. Los anticoagulantes que se comercializan en Chile pertenecen a la familia de las cumarinas y son el acenocumarol y la warfarina (tabla 25-4).
Tabla 25-4. Tipos de agentes anticoagulantes disponibles en Chile Compuesto Nombres comerciales y Laboratorio que distribuye Presentacin Acenocumarol Neo-sintrom (Novartis) Coarol (Andrmaco) Isquelium (Rider) Comprimidos de 4 mg Comprimidos verde claro de 2.5 mg Comprimidos durazno de 5 mg Warfarina Coumadn (Bristol-Myers Squibb)
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En Espaa el fr maco ms utilizado es acenocumarol; en Francia se usa Previscan de 20 mg que es una inandiona; y en los pases anglosajones se utiliza la warfarina sdica, que
es el medicamento con el que se han realizado la mayor parte de los estudios y los ensayos clnicos.
Tabla 25-5. Caractersticas de los anticoagulantes disponibles en Chile Acenocumarol Administracin Absorcin Concentracin plasmtica mxima Fijacin protenas plasmticas Duracin de efecto anticoagulante Vida media Biotransformacin Eliminacin Barrera hematoenceflica Atraviesa barrera placentaria Leche materna
* En EEUU existen formas inyectables.
Warfarina Oral * Rpida, gastrointestinal 1 a 9 hrs. 97% 2 a 5 das 36 a 42 hrs. Hgado y riones Orina y heces S S Indetectable
Oral Rpida, gastrointestinal 1 a 3 hrs. 98.7% 2 das 8 a 11 hrs. Hgado y riones Orina y heces S S Indetectable
En las primeras horas de iniciada la terapia anticoagulante oral se produce un rpido descenso del factor VII y de las protenas C y S (vida media ms corta; tabla 25-3), que conlleva cierta tendencia procoagulante en los pacientes. Este efecto de tipo procoagulante, se produce durante los tres primeros das de tratamiento, para luego continuar con su accin anticoagulante. Este estado procoagulante puede verse agravado en individuos con dficit congnito de protena C, en los que se puede desencadenar cuadros de trombosis, a modo de ejemplo, necrosis drmica. Por todo ello, se recomienda, en todos los casos, iniciar el tratamiento anticoagulante oral manteniendo simultneamente la terapia con heparina y luego suspenderla al alcanzar los niveles de INR deseados, lo que ocurre en 4 5 das, aproximadamente. Los ltimos aos se ha estudiado el rol de otra protena dependiente de vitamina K en los procesos de coagulacin, como es la protena Z, la cual es una protena de 62 kDa, que acta como
cofactor de la inhibicin del FXa por el inhibidor de proteasa dependiente de protena Z (IPZ). La protena Z aumenta ms de 1000 veces la inhibicin del FXa que realiza el IPZ, en presencia de Ca +2 y fosfolpidos, pero no afecta la inhibicin del FXIa que realiza el IPZ. En la prctica, lo anterior se traduce en que pacientes con bajos niveles de protena Z, presentan tendencia al sangramiento, en cambio, si el bajo nivel de protena Z est asociado a la presencia de la mutacin del factor V Leiden produce una alta frecuencia de fenmenos tromboemblicos. 3.2.4. Interacciones de los anticoagulantes orales La vitamina K se encuentra ampliamente distribuida en los alimentos, especialmente en los vegetales de hoja verde (tabla 25-6). Otra fuente importante est dada por la flora bacteriana intestinal normal. Es una vitamina liposoluble, por lo que requiere de la presencia de grasas, las que son aportadas por la dieta, para su absorcin y metabolismo.
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Tabla 25-6. Alimentos con mayor contenidos de vitamina K Alimento Vitamina K (g/100 g) 1428 540 400 360 310 308 262 251 250 238 210 193 190 81 60 57 40 47 25
T verde (infusin) Perejil Hoja de espinaca Cscara de pepino Cilantro Bruselas T negro (infusin) Nabos Berros Brcoli Lechuga Salsa de soya Cebollines Mayonesa Cscara de manzana verde Coliflor Palta Poroto soya Kiwis La respuesta a los anticoagulantes orales est influenciada por factores farmacocinticos y metablicos, dentro de los cuales est su mecanismo de accin y el metabolismo de la vitamina K. La mayora de los pacientes que estn en terapia anticoagulante oral estn polimedicados y/o sufren otras enfermedades, por ende pueden existir interacciones farmacolgicas importantes. Estas interacciones pueden producir aumento o disminucin de la accin esperada del anticoagulante oral. Si la interaccin aumenta el efecto del anticoagulante, puede llevar a producir sangramientos y si la disminuye puede mantener el riesgo trombtico. Un elemento muy importante a considerar es el tipo de anticoagulante usado, en general, la mayora de los trabajos publicados de interaccin de frmacos han sido realizados con warfarina y vitamina K, lo que se explica por ser publicaciones en lengua inglesa. Por otra parte, en la literatura existen reportes contradictorios para la interaccin de un mismo frmaco con anticoagulantes orales, es el caso del paracetamol, que segn algunos autores pr oduce aumento del efecto de los anticoagulantes orales, en cambio, otros refieren disminucin de su accin. En el caso de algunas familias de frmacos, ej. Los antibiticos macrlidos, para algunos se ha referido que interactan aumentando el efecto de la warfarina
(eritromicina y claritromicina) en cambio, otros (roxitromicina y azitromicina) disminuyen su accin. Por estas razones el tratamiento anticoagulante oral (TACO) requiere control peridico y a veces se debe anticipar e incrementar la frecuencia de los controles, hasta que se logre un nuevo equilibrio en otro nivel de dosis. 3.2.5. Mecanismos de interaccin farmacolgica Algunos medicamentos potencian y otros inhiben el efecto de los anticoagulantes orales (tabla 25-7). Potencian efecto del anticoagulante Por disminucin de la flora bacteriana intestinal que provoca deficiencia de vitamina K: antibiticos (cotrimoxazol, ciprofloxacino, amoxicilina con o sin clavulnico y metronidazo). Por desplazamiento de las protenas plasmticas o inhibicin del citocromo P450: amiodarona, antidepresivos tricclicos, inhibidor es de enzima convertidora, hipolipemiantes, cimetidina, fenilbutazona, alopurinol.
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Por efecto antiagregante plaquetario: aspirina, antiinflamatorios no esteroidales, penicilina en altas dosis.
Por disminucin de absorcin: colestiramina, sucralfato. Por induccin enzimtica en el hgado: fenobarbital, rifampicina. Por incremento de factores de coagulacin: estrgenos (anticonceptivos orales, terapia de reemplazo hormonal).
Inhiben efecto del anticoagulante Ingesta elevada de vitamina K: alimentos ricos en vitamina K o suplementos vitamnicos.
Tabla 25-7. Frmacos que interactan con los anticoagulantes orales Aumentan la respuesta Acetaminofeno cido acetilsaliclico cido etacrnico cido mefenmico cido nalidxico Alcohol (intoxicacin aguda) Alopurinol Amiodarona Antidepresivos tricclicos Cefamandol Cimetidina Clofibrato Cloramfenicol Co-trimoxazol Danazol Diazxido Diflunisal Disulfiram Eritromicina Esteroides anabolizantes Disminuyen la respuesta Alcohol (alcoholismo crnico) Anticonceptivos orales Azatioprina Barbituratos Carbamazepina Ciclosporina Corticosteroides Colestiramina Dicloxacilina Griseofulvina Mercaptopurina Nafcilina Rifampicina Espironolactona Trazodona Sucralfato Vitamina K Estreptoquinasa Eutirox Fenilbutazona Fenoprofeno clcico Fluoroquinolonas Gemfibrozilo Glucagn Hidrato de cloral Ibuprofeno Indometacina Isoniacida Itraconazol Ketoprofeno Lovastatina Meclofenamato Metronidazol Miconazol Metil-tiouracilo Neomicina Omeprazol Propafenona Propil-tiouracilo Pentoxifilina Piroxicam Propanolol Propoxifeno Quinina Quinidina Quinolonas Salicilatos Sulfinpirazona Sulfonamidas Sulindac Tamoxifeno Tetraciclinas Tiazidas Uroquinasa Vacuna antigripal Vitamina E
3.2.6. Efectos secundarios de los anticoagulantes orales Los efectos secundarios anticoagulantes orales. No hemorrgicos Necrosis drmica. Su ocurrencia es excepcional. Aparece bruscamente entre el tercer y quinto da de tratamiento y es causado por una extensiva trombosis de vnulas y capilares del tejido al uso de
adiposo subcutneo. La patognesis de este cuadro y el porqu de la localizacin es an desconocido. Se ha asociado a casos de dficit de protena C o S, en estos pacientes se produce un descenso adicional de estos inhibidores cuando slo ha comenzado a descender el factor VII, pero los factores II y X son an normales, pero tambin se han reportado casos en individuos no deficientes. Por esto, se intenta evitar las anticoagulaciones bruscas e intensas en la etapa inicial y mantener heparina hasta alcanzar el INR deseado.
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Alopecia. Es casi siempre parcial, su frecuencia oscila entre el 1 - 5 %. Se observa desde el primer trimestre de tratamiento con anticoagulantes orales y rara vez obliga a interrumpir el tratamiento. Sndrome del dedo prpura. Dedos de ambos pies fros y cianticos que se atribuyen a microembolizacin del material de la placa ateromatosa calcificada. Es raro y no es exclusivo del tratamiento anticoagulante oral. Alergia o rash cutneo. Es raro y un cuadro urticariforme o una vasculitis, pueden obligar a cambiar de anticoagulante. Osteopenia. Es un efecto secundario muy debatido. Pareciera que la vitamina K aumenta la actividad osteoblstica, postulndose que sus inhibidores haran lo contrario; el efecto parece mnimo (muy inferior al de la heparina) y generalmente carente de significacin clnica, incluso en el periodo de climaterio. Embriopatas. Mantener la terapia anticoagulante oral durante el embarazo, conlleva riesgo (1-5%) de inducir anomalas fetales: hipoplasia nasal, condrodisplasia punctata en las epfisis, xifoescoliosis, braquidactilia, entre otras malformaciones. Efectos hemorrgicos El efecto ms caracterstico y potencialmente grave de los anticoagulantes orales es la hemorragia. Segn su severidad pueden ser: Crticas. Aquellas que ocurren a nivel del sistema nervioso central. Son infrecuentes (1% de los casos), aunque pueden ser de alta letalidad. Mayores. Tienen su origen en el tubo digestivo, espacio retroperitoneal, pulmn y suprarrenales. Son potencialmente letales y requieren hospitalizacin para su adecuado manejo mdico. Menores. Muy frecuentes. Se trata de gingivorragia, epistaxis, hematomas, equimosis, hipermenorrea y principalmente hematuria. En los casos de complicaciones hemorrgicas, se debe controlar el tratamiento anticoagulante oral con el TP y evaluar otros factores causales. Sin embargo, cualquiera sea el valor del INR, el objetivo es detener el sangramiento y para ello se debe seguir las siguientes conductas: Si el INR es < 2.0: buscar causa local.
Si el INR est dentro del rango teraputico ptimo, se suspende una dosis de anticoagulante oral y se busca otras causas. Luego reanudar el tratamiento anticoagulante oral, en las mismas dosis preestablecidas y controlar a los 5 das. Si el INR est una unidad por sobre el ptimo, suspender el anticoagulante oral durante 1 da, luego se reinicia con el mismo esquema previo y se controla en una semana. Si el INR est hasta dos unidades por sobre el ptimo, se suspende el anticoagulante oral durante 2 das, y se reinicia con una dosis 25% menor a la dosis previa. Si el INR est hasta ms de dos unidades por sobre el ptimo, se suspende el anticoagulante oral durante 2 das, y se administra vitamina K (fitomenadiona, konakion).
Una dosis de 5 mg EV de vitamina K, normaliza el INR en 6 horas y causa siempre cierto grado de r efractariedad al reintroducir el anticoagulante oral, que dura entre 5 a 7 das, tras el episodio hemorrgico. En pacientes con INR hasta 7, se aconseja administrar media ampolla en agua por va oral, en INR sobre 7 y hasta 10, administrar 5 mg endovenoso (1/2 ampolla de 10 mg) y en INR sobre 10, una ampolla EV. En caso necesario, se puede aportar plasma fresco. Cada unidad de plasma fresco por peso del paciente incrementa entre un 4 y un 7% el complejo protrombnico y lo hace de forma inmediata. Para revertir del efecto del anticoagulante oral sin presencia de sangramiento, pero con INR sobre rango teraputico ptimo, se puede: (a) suspender dosis, (b) administrar 0.5-1 mg EV de vitamina K para INR hasta 10 y (c) administrar 3-5 mg EV de vitamina K para INR mayor a 10. 3.2.7. Monitorizacin del tratamiento anticoagulante oral El objetivo principal de la monitorizacin del tratamiento anticoagulante oral es mantener niveles ptimos de anticoagulacin para evitar episodios trombticos o recurrencias y prevenir hemorragias secundarias. El control del laboratorio es necesario para adecuar la dosis farmacolgica de cada paciente, por lo tanto debe ser desarrollado con alta
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calidad tcnica y estandarizado. El TP es el examen utilizado para monitorizar el tratamiento anticoagulante oral; es simple y de bajo costo. Es sensible a la disminucin de tres de los cuatro factores dependientes de vitamina K (II, VII, X). El TP se define como el tiempo en segundos requerido para que se forme un cogulo de fibrina en una muestra de plasma citratado a la cual se ha agregado tromboplastina y calcio. La tromboplastina se refiere a un extracto tisular de cerebro, pulmn o placenta que contiene factor tisular y los fosfolpidos necesarios para promover la activacin del FX por el FVII. A lo largo del tiempo se han observado ciertos inconvenientes en la monitorizacin de la terapia anticoagulante oral, dependientes de la determinacin del TP, que son: factores preanalticos (toma de muestra inadecuada); factores analticos (reactivos de tromboplastinas de diferente sensibilidad) y factores postanalticos (diferentes formas de expresin de resultados: tiempo de coagulacin en segundos, actividad de protrombina en porcentaje y mediante el ndice INR (Inter national Normalized Ratio). Todo lo anterior trae como consecuencia que existan distintos grados de anticoagulacin en los diversos hospitales, por ende dificulta la comparacin interlaboratorios y que exista dificultad en establecer una estandarizacin universal del tratamiento anticoagulante oral (rango teraputico ptimo). Los reactivos de tromboplastinas tienen distinta sensibilidad frente a la accin de los anticoagulantes orales, dependiendo de su fuente de origen, contenido en fosfolpidos y su preparacin. Una tromboplastina poco sensible produce menor prolongacin del tiempo de protrombina que una ms sensible al dficit de factores de coagulacin dependientes de vitamina K. La sensibilidad de una tromboplastina puede ser medida a travs de su ISI (International Sensitivity Index), que es el valor de la pendiente de la recta de regresin, que relaciona los valores obtenidos con cualquier tromboplastina, versus la de referencia. Tromboplastinas altamente sensibles tienen un ISI aproximado de 1,0. El valor ISI de las tromboplastinas vara, adems, segn el mtodo utilizado para realizar el TP (manual o automatizado) y segn el equipo utilizado. En EEUU y Canad, se emplearon, durante muchos aos, tromboplastinas procedentes de cerebro de conejo que eran menos sensibles al
dficit de factores dependientes de vitamina K. Posteriormente, se desarrollaron tromboplastinas mucho ms sensibles (de cerebro humano), que se comenzaron a utilizar en Inglaterra. Al incrementarse los viajes transocenicos de pacientes anticoagulados, se observ que los pacientes europeos con INR de 2,5 presentaban en Norteamrica INR de 1,5 que se consideran insuficientes, mientras que los americanos anticoagulados con INR de 2,0, presentaban en Europa INR de 5,0; evidentemente elevados, lo que generaba modificaciones en las dosis y mayores complicaciones hemorrgicas. En 1977, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) estableci un preparado de cerebro humano como la primera tromboplastina de referencia internacional. Posteriormente, este primer estndar fue reemplazado por otras tromboplastinas de referencia primaria y secundaria y actualmente son utilizadas tromboplastinas recombinantes. Los reactivos de tromboplastinas que se comercializan deben traer la informacin de su ISI, que indica la sensibilidad de la tromboplastina. La OMS recomienda que para el control del TACO, slo se usen tromboplastinas con ISI<1,5. Existen tambin varias, entre 1 y 1,5, que se consideran vlidas pero no ptimas. El sistema INR es la escala universal para expresar el tiempo de protrombina en terapia anticoagulante oral. El empleo del INR se extiende en Europa desde 1985 y desde 1990 es adoptado por Norteamrica. Corresponde al cuociente entre el TP del paciente expresado en segundos y el TP de un control normal, elevado al ISI. El clculo del INR se obtiene mediante la frmula: INR = (PT paciente en seg/ PT control en seg) ISI. El INR por lo tanto es la razn del TP que se habra obtenido si hubiese usado la tr omboplastina de referencia internacional de la OMS. 3.2.8. Indicaciones clnicas de la terapia anticoagulante oral En la prctica, las prescripciones de TACO son realizadas por mdicos de diversas especialidades como: cardilogos, neurlogos, hematlogos, inter nistas, reumatlogos, cirujanos vasculares, perifricos, etc. Se indica en toda patologa en la cual existe el riesgo de embolia sistmica, tanto como profilaxis primaria o secundaria. Las principales indicaciones de TACO, se resumen en la tabla 25-8.
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Tabla 25-8. Indicaciones clsicas de la terapia anticoagulante oral Patologa TVP distal sintomtica TEP + TVP proximal TVP - TEP idioptico (ms de un episodio), TVP primer episodio con factores de riesgo transitorios: cirugas, traumas, inmovilizacin, uso estrgenos TVP TEP por coagulopatas, malignidad o sndrome Antifosfolpidos Accidente vascular enceflico emblico Profilaxis trombosis venosa en cirugas de cadera y ginecolgicas o pacientes oncolgicos con catter subclavio, cncer mama estadio IV en quimioterapia. Infarto miocardio con o sin trombolisis Infarto miocardio con o sin trombolisis asociado a fibrilacin auricular, disfuncin ventricular y/o auricular izquierda o trombo intracavitario. Fibrilacin auricular Cardioversin de arritmias supraventriculares Rango INR ptimo 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 Duracin 6-12 semanas 6 meses Indefinido 3 - 6 meses Indefinido Indefinido 3 meses 3 meses Indefinido Indefinido 3 sem. preCV y 6 sem. postCV Indefinido Indefinido Indefinido Indefinido Indefinido Indefinido Indefinido 3 meses Indefinido Indefinido Indefinido Indefinido Indefinido Indefinido
Estenosis mitral y/o regurgitacin mitral con antecedentes de embolismo 2-3 sistmico, fibrilacin auricular, dilatacin auricular izquierda mayor a 5.5 cm. Enfermedad reumtica de vlvula mitral en ritmo sinusal cuando existen factores de riesgo de co-morbilidad: tamao aurcula izquierda, edad, estabilidad 2-3 hemodinmica, embolia sistmica o fibrilacin auricular crnica o paroxstica. Prolapso de vlvula mitral ms fibrilacin auricular, TIA, AVE, embolismo 2-3 sistmico. Calcificacin del anillo mitral + fibrilacin auricular o embolismo sistmico 2-3 Ateromas articos mviles o placas ateromatosas mayores a 4 mm. 2-3 (por ecografa transesofgica) Pacientes con un episodio de trombosis y presencia de un foramen oval 2-3 persistente (excepto si se cierra) Endocarditis infecciosa en vlvula natural o bioprtesis 2-3 Prtesis valvular biolgica mitral o artica 2-3 Prtesis valvular biolgica mitral o artica + FA, trombo auricular, 2-3 embolismo sistmico Prtesis valvular mecnica mitral 3-4 Prtesis valvular mecnica artica 2,5 3,5 Insuficiencia arterial aguda de EEII (tromboembolectoma) 2-3 Bypass infrainguinal y otras reconstrucciones vasculares 2-3 Sndrome antifosfolpido 34
TVP, Trombosis venosa profunda; TEP, Tromboembolismo pulmonar; preCU, precardioversin; postCU, postcardioversin; TIA, Accidentes isqumicos transitorios; AVE, Accidente vascular enceflico; FA, fibrilacin auricular; EEII, extremidades inferiores.
Algunas recomendaciones en relacin al TACO, son las siguientes: El American College of Chest Physician (ACCP) recomienda la anticoagulacin oral permanente en todas las vlvulas mecnicas. El rango teraputico ptimo en pacientes con prtesis valvular mecnica, ha sido un aspecto muy discutido entre las sociedades cientficas relacionadas. La European Society of Cardiology difiere con la ACCP respecto a las recomendaciones de terapia
anticoagulante oral en prtesis valvulares cardacas, en general, la ACCP recomienda INR ms bajos. Actualmente, la intensidad de anticoagulacin en prtesis valvulares mecnicas depende del tipo de vlvula y su per fil hemodinmico, y del sitio de implantacin. El European Working Group recomienda INR entre 3.0 y 4.5 para pacientes con vlvulas mecnicas de primera generacin (Starr-Edwards, Bjrk-Shiley estndar). Para vlvulas de segunda
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generacin (St. Jude, Medtronics, Monostrut) el INR debe estar entre 3.0 y 3.5 para prtesis en posicin mitral y entre 2.5 y 3.0 para prtesis artica En el caso de estenosis mitral y/o regurgitacin mitral, si ocurre un episodio de trombosis, a pesar de una adecuada terapia con anticoagulantes orales, se recomienda aumentar el rango de INR a 2.5 3.5 o agregar aspirina. No se recomienda el TACO en enfermedad de vlvula artica, a menos que exista otra condicin que lo justifique. El embarazo se asocia a un estado de hipercoagulabilidad determinado por un aumento de los factores de coagulacin y disminucin de la actividad fibrinoltica. Esto se traduce, en la prctica, en mayor riesgo materno de complicaciones trombticas. Si la paciente est recibiendo TACO, es habitual la necesidad de controles repetidos que se traducen muchas veces en un incremento de la dosis habitual de anticoagulantes. Los anticoagulantes orales atraviesan la barrera placentaria y su uso puede asociarse a embriopatas como por ejemplo: hipoplasia nasal, alteraciones en la calcificacin de las epfisis, muerte fetal, cuando la madre est expuesta a ellos entre la 6 y 12 semana de gestacin, a dao neurolgico del nio por malformaciones del sistema nervioso central, por hemorragia cerebral durante todo el embarazo y a mayor incidencia de abortos. Se estima que el riesgo de embriopata flucta entre 3 y 4% y el riesgo de dao neurolgico del feto sera de 2%. Sin embargo, por lo poco frecuente que es la condicin de embarazo en paciente con TACO, la verdadera incidencia de estas complicaciones no es bien determinada. Por otro lado, la gran mayora de los casos graves reportados corresponden al perodo en que no se haba unifor mado el uso de las tromboplastinas, poca en la cual se usaban altos niveles de anticoagulacin. Hasta ahora no existe un acuerdo universal con respecto al esquema ideal de TACO, que evite la teratogenicidad, con mnimo riesgo de complicaciones trombtico. Actualmente los esquemas ms utilizados, una vez confirmado el embarazo son los siguientes: (a) manejar con heparina todo el embarazo y (b) anticoagular con heparina estndar o heparinas de bajo PM hasta la semana 13 de embarazo, para luego reiniciar TACO oral hasta la mitad del tercer trimestre, y despus continuar con heparina hasta el parto.
3.2.9. Contraindicaciones de terapia anticoagulante oral Las contraindicaciones de TACO oral se clasifican en: Absolutas: Hemorragia masiva activa. Mayores: Aneurisma intracraneal y ciruga en presencia de hemorragia activa grave del SNC, accidente vascular enceflico en evolucin, retinopata hemorrgica, hipertensin arterial severa no controlada, coagulopatas congnita (Hemofilia, Enfermedad de von Willebrand), y embarazo. Menores: Pacientes alcohlicos, trastornos mentales severos (falta de adherencia a tratamiento), insuficiencia renal crnica, hipertensin arterial, traumatismo crneoenceflico (3-4 semanas), lcera pptica activa, cirrosis heptica con vrices esofgicas, enfer medad Inflamatoria Intestinal, trombocitopenia (50.000-100.000 plaquetas/ L). 3.2.10. Resistencia a los anticoagulantes orales Los motivos por los que los pacientes pueden mostrar una aparente resistencia a los anticoagulantes orales, pueden resumirse en dos grupos: Resistencia adquirida. Habitualmente debida a un aumento en la ingesta de vitamina K de origen medicamentoso o con los alimentos (dietas para adelgazar, ricas en verduras). Otro subgrupo abarcara a aquellos pacientes con alteraciones en el metabolismo del anticoagulante, como disminucin de la absorcin o aumento del aclaramiento. Tambin algunas drogas son capaces de inhibir el efecto de los anticoagulantes: colestiramina que disminuye la absorcin, los barbituratos, alcohol, aloperidol, griseofulvina y el meprobamato que aumentan la biotransformacin del ismero S de la warfarina. Algunos frmacos pueden interferir aumentando la sntesis de factores de coagulacin, como los contraceptivos orales y los corticosteroides. Resistencia hereditaria. Se ha postulado que es causada por la presencia de una enzima anormal o un receptor que muestra una afinidad disminuida por los cumarnicos o aumentada por la vitamina K. Esta forma de resistencia es
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extremadamente rara y ha sido descrita en un escaso nmero de pacientes. La actitud teraputica depende del tipo de resistencia: Ajustes en la dieta o en el tratamiento del paciente, resolvern el problema en un gran nmero de casos. En otros el cambio de aumento de la dosis de anticoagulante o el cambio entre frmacos distintos puede resultar una aproximacin aceptable. 4. FRMACOS FIBRINOLTICOS 4.1. Proceso fibrinoltico En la disolucin del cogulo juega un rol central la plasmina, esta es una serinoproteasa que se origina a partir del plasmingeno, protena de una cadena polipeptdica, que sufre una ruptura hidroltica del enlace peptdico entre la arginina 561 y la valina 562, originndose as una molcula de dos cadenas peptdicas unidas por enlaces S-S (ver captulo 20). La ruptura hidroltica del plasmingeno es catalizada por el activador tisular del plasmingeno (t-PA), la uroquinasa y una protena bacteriana, la estreptoquinasa (figura 25-5). La plasmina, acta sobre las molculas de fibrina que forman parte del cogulo y libera las clulas que forman parte de l, producindose la recanalizacin del vaso sanguneo que estaba obstruido. La fibrina no circula libre en la sangre, ya que para su activacin se requiere que el plasmingeno y el t-PA se unan a porciones bien especficas de las molculas de fibrina del cogulo, simultneamente. Adems, un potente inhibidor de la plasmina, el factor 2antiplasmina, se encuentra en altas concentraciones en la sangre y rpidamente inactiva las pocas molculas de plasmina que circulan libres.
4.2. Uso mdico del proceso fibrinoltico Desde los aos 50, se ha pensado utilizar el mecanismo fibrinoltico como blanco de accin de frmacos antitrombticos. Lamentablemente, la falta de pureza de las preparaciones utilizadas, el desconocimiento de la regulacin del mecanismo fibrinoltico, la presencia del inhibidor 2-antiplasmina, y la activa degradacin de la plasmina libre, etc., han sido causales de que recin en los ltimos aos, se haya logrado actuar eficazmente sobre el cogulo que est bloqueando la circulacin sangunea. Todos los frmacos disponibles para uso clnico son activadores de plasmina. Se trata de la uroquinasa, activador tisular del plasmingeno (t-PA) y la estreptoquinasa, todos los cuales tienen como requerimiento bsico para actuar, la pr esencia de una gran cantidad de plasmingeno. Esta situacin ocurre en trombos pequeos, por ejemplo los que se encuentran en las arterias coronarias, pero que no ocurre en trombos largos y de gran tamao, como sucede en las oclusiones de arterias de mayor calibre y en las trombosis venosas profundas. Un ejemplo de los resultados mdicos de la tromblisis, es la controversia an presente del uso de estos frmacos en el TEP. Se ha descrito que los agentes trombolticos producen una resolucin precoz al usarse asociados a heparina, si se compara con los resultados obtenidos con heparina sola. Adems, se ha descrito que el uso de agentes trombolticos reduce la mortalidad de pacientes con TEP masivos, probablemente dado por mejorar el flujo sanguneo pulmonar y secundariamente el trabajo del ventrculo derecho. La discusin se origina en que si son suficientes las ventajas de usar trombolticos con el riesgo de producir hemorragias importantes. Normalmente, las vas de la coagulacin y de la fibrinolisis estn reguladas para proteger al organismo de la hemorragia y de la formacin de trombo no asociado a rupturas vasculares. En esta regulacin juega un rol clave, la trombomodulina, protena que lleva a la trombina a actuar como enzima anticoagulante al activar la protena C, pero por otra parte, hace que la trombina acte como anti-fibrinoltica, al activar al inhibidor de la fibrinolisis activable por trombina (TAFI). 4.3. Frmacos anticoagulantes fibrinolticos disponibles en Chile
Figura 25-5. Esquema del sistema fibrinoltico
En la actualidad, en nuestro pas se encuentran
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disponibles dos productos fibrinolticos, Streptase (Laboratorio Aventis) y el Kabikinase (Laboratorio Pharmacia & Upjohn); ambos productos contienen estreptoquinasa. La estreptoquinasa, se purifica a partir del filtrado de cultivos de estreptococos beta hemolticos del grupo C. Acta produciendo activacin del plasmingeno a plasmina. Su vida media vara de 12 a 85 minutos, dependiendo de si el paciente ha sufrido exposicin previa a estreptococos, ya que es inactivada por anticuerpos antiestreptococos circulantes. Las indicaciones clnicas son las que rigen la va de administracin. Se usa administracin local, para recanalizar los vasos coronarios en el IAM, as como tambin en las embolias de las arterias perifricas y en la limpieza de cnulas arteriovenosas. Se usa la va sistmica, en el TEP masivo, en las TVP de venas abdominales, en las enfermedades crnicas oclusivas de las arterias, incluidas las oclusiones de los vasos oftlmicos centrales. Las principales reacciones adversas ms importantes que manifiesta el uso de estreptoquinasa, son las hemorragias de cualquier origen y volumen. En for ma espordica se presentan cefaleas, hipotensin brusca, nuseas, arritmias ventriculares por sobrecarga y urticaria. La estreptoquinasa interacciona con todos aquellos frmacos que afectan el sistema de la coagulacin, potenciando la accin del acenocumarol y la warfarina, as como de los antiagregantes plaquetarios. 5. EL FUTURO EN EL TRATAMIENTO ANTITROMBTICO El aumento de las expectativas de vida de la poblacin ha producido que el nmero de pacientes que requier e de tratamiento antitrombtico, tambin se incremente. Por otra parte, las condiciones de sedentarismo, el estrs, el hbito de fumar, el uso de anticonceptivos hor monales tambin ha provocado que la poblacin en riesgo de problemas trombticos aumente. Por ello, son cada vez ms las lneas de investigacin que buscan nuevos frmacos, en lo posible de alta efectividad y que tengan las menores reacciones adversas posible, as como que no interaccionen con otros frmacos, ya que muchos de los pacientes, en especial aqullos que reciben TACO, son polimedicados.
Ejemplos de nuevos antitrombticos son: la hirudina y sus derivados, que inhibe a la trombina, el desarrollo de bloqueadores del sitio activo del factor IXa o anticuerpos contra el complejo IX / IXa; tambin se encuentran en desarrollo inhibidores del factor X a. Otras investigaciones se han centrado en activadores de la actividad anticoagulante intrnseca, o en la modulacin de la actividad fibrinoltica. En el caso del laboratorio clnico, tambin existen avances. Se conoce que en los estados de hipercoagulabilidad, como son: la TVP y el TEP, se produce incrementos en la produccin de fibrina, la cual cuando es metabolizada por el sistema fibrinoltico produce numerosos fragmentos solubles, llamados productos de degradacin de la fibrina (PDF), entre ellos el llamado dmero D (D-D). Hoy en da, se utiliza la medicin cuantitativa del dmero D, para evaluar los estados de hipercoagulabilidad. La obtencin de un valor negativo en la determinacin por ELISA de este parmetro es una evidencia muy significativa para descartar TVP o TEP. En pacientes, que han sufrido episodios trombticos y que luego han sido anticoagulados, al utilizar la medicin de dmero D para monitorizarlos, se ha demostrado que los valores del parmetro tienden a disminuir, lo cual evidencia que el tratamiento est siendo efectivo y se est produciendo la degradacin del trombo. Adems, se discute en la literatura, cul es el tiempo necesario de tratar con TACO a los pacientes que han sufrido un episodio trombtico, tratamientos que muchas veces se alargan innecesariamente, lo cual puede evitarse al utilizar este parmetro objetivo del estado de la coagulabilidad del paciente y tomar una adecuada decisin de alta.
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SECCIN V
LABORATORIO
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Captulo
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SANGRE PERIFRICA Y MDULA SEA: MUESTRAS Y VALORES DE REFERENCIA

Ivn Palomo G., Marcelo Alarcn L., Claudio Cruzat C. y Eduardo Retamales C.
1. Introduccin 2. Anticoagulantes 2.1. cido etilendiaminotetractico 2.2. Citrato de sodio 2.3. Heparina 3. Recoleccin de sangre perifrica 3.1. Sistemas de recoleccin de muestras 3.2. Tipos de puncin 3.2.1. Puncin venosa 3.2.2. Puncin capilar 3.3. Almacenaje y transporte 3.4. Frotis sanguneo 4. Obtencin de mdula sea 4.1. Aspirado de mdula sea 4.2. Biopsia de mdula sea 5. Tincin de May-Grnwald Giemsa 6. Unidades hematolgicas internacionales 7. Valores de referencia normal
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RESUMEN
El estudio de la sangre perifrica (aspectos citolgicos y cuantitativos) es fundamental en la etapa de diagnstico y control de la evolucin en las enfermedades hematolgicas. En algunas patologas con compromiso de la mdula sea es necesario su estudio. Este captulo se refiere, en trminos generales, a los procedimientos de coleccin de sangre (puncin venosa y puncin capilar) y mdula sea (mielograma y biopsia de mdula sea), y a la tincin de hematologa clsica (tincin de May Grnwald-Giemsa).
1. INTRODUCCIN El estudio de la sangre perifrica y mdula sea son procedimientos fundamentales en el diagnstico y de control de la evolucin de las enfer medades hematolgicas. Estos procedimientos son dependientes de la calidad de las muestras la cual debe ser recolectada, identificada, transportada y almacenada adecuadamente para no provocar hemlisis, todo lo cual contribuir a un buen anlisis de la muestra. Este captulo revisa los aspectos ms importantes sobre recoleccin de muestras de sangre perifrica y de mdula sea, y la tincin de hematologa clsica (tincin de May Grnwald-Giemsa). Adicionalmente se incluyen tablas con valores de referencia normal. 2. ANTICOAGULANTES
Las sales de sodio o potasio son los tipos de anticoagulantes ms efectivos y usados, puesto que no se produce hemlisis ni deformacin celular, y evitan la agregacin plaquetaria. 2.1. cido etilendiaminotetractico La coagulacin requiere de iones calcio (Ca2+), por lo que su quelacin inhibe el proceso. El quelante ms usado en hematologa es el cido etilendiaminotetractico (EDTA); la concentracin recomendada es de 1 a 1.5 mg/ mL de sangre. Un exceso de EDTA afecta a los glbulos rojos y leucocitos, altera el volumen corpuscular medio (VCM) y causa cambios degenerativos, respectivamente. Una concentracin de 2 mg/mL puede disminuir el hematocrito y la velocidad de sedimentacin eritrocitaria (VHS) y aumentar la concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM). 2.2. Citrato de sodio
Cuando la sangre se recibe en frascos sin anticoagulantes sta se coagula dentro de los 5 a 10 minutos de recolectada la muestra. Luego se produce la retraccin del cogulo liberndose el suero (carece de plaquetas y factores de la coagulacin) el que se emplea en estudio bioqumicos. Cuando se requiere obtener plasma (contiene los factores de la coagulacin), estudiar algunas propiedades de la sangre total o analizar algunos de sus componentes celulares es necesario agregar un anticoagulante. Es importante el tipo de anticoagulante, la concentracin del mismo y la relacin sangre:anticoagulante; cuando sta es incorrecta pueden ocurrir importantes errores.
El citrato de sodio es el anticoagulante por eleccin para las pruebas de hemostasia (Ej. Tiempo de protr ombina y Tiempo de tromboplastina parcial activada, entre otras). El ms usado es la sal trisdica pues preserva muy bien los factores de la coagulacin. Inhibe la coagulacin por precipitacin de los iones calcio. La concentracin sugerida es de 3.2% (109 mM) y se debe usar en una relacin 9:1; esta relacin es aconsejada para hematocritos normales; en casos de anemia y policitemia se debe ajustar dicha relacin. 2.3. Heparina La heparina se obtiene a partir de tejido bovino
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o porcino; corresponde a polmeros de cido idurnico y glucosamina, altamente sustituidos por grupos N-sulfato y O-sulfato. Su estructura es similar al heparn sulfato un glicosaminoglicano presente en la superficie de las clulas endoteliales. La inhibicin de la coagulacin la realiza aumentando significativamente la velocidad de accin de la antitrombina III, inhibidor natural de las serino proteasas de la coagulacin. No afecta el VCM y causa menos hemlisis que el EDTA. La concentracin recomendada es de 15 a 20 UI/ mL de sangre. Provoca un color azulado en los frotis de sangre perifrica teidos con May Grnwald-Giemsa debido a que modifica el pH, y altera el recuento de leucocitos por causar agregacin leucocitaria. Se utiliza para anticoagular la sangre que se recolecta para la prueba de fragilidad osmtica. Es el nico anticoagulante que adems de usarse para r ecolectar sangre, se utiliza como tratamiento anticoagulante. 3. RECOLECCIN DE SANGRE PERIFRICA 3.1. Sistemas de recoleccin de muestras Los tubos son los elementos ms usados para la recoleccin de muestras de sangre. Estos pueden ser al vaco (aspiran automticamente la sangre) o no, de plstico o vidrio, con o sin anticoagulante. Pueden diferenciarse por el color de la tapa del tubo, segn si contienen o no anticoagulante y en el primer caso identifican el anticoagulante; los colores usados inter nacionalmente son: r ojo (sin anticoagulante), lila (EDTA), celeste (citrato de sodio). Antes de la recoleccin de la muestra, el primer paso es una adecuada identificacin del (los) tubo(s) en que se depositar la muestra; al menos debe incluir el nombre y apellido del paciente, examen, y fecha. 3.2. Tipos de puncin 3.2.1. Puncin venosa Cuando se debe realizar una puncin venosa (flebotoma), siempre que sea posible, se debe explicar al paciente el procedimiento que se le realizar, puesto que la flebotoma produce ansiedad en algunos casos lo que puede afectar algunas pruebas de laboratorio, como por ejemplo causar leucocitosis (aumento del recuento de leucocitos).
El material a usar en la puncin venosa debe ser estril (jeringa desechable). El tamao de las agujas depender de la cantidad de sangre a recolectar y de la edad del paciente; una combinacin de un nmero y una letra indica el dimetro y longitud, as por ejemplo la ms usada 21G1 indica que la aguja tiene un dimetro de 21 mm y 4 cm de longitud. Generalmente las venas a puncionar son las ubicadas en la fosa anterocubital. Se deben descartar las zonas que presentan hematomas, quemaduras, cicatrices y edema. En caso de mastectoma, se debe puncionar el brazo contrario, puesto que en esa regin ocurre linfostasis. Las posibles venas a puncionar deben ser evaluadas aplicando un torniquete por un perodo no superior a 1 minuto, ya que un mayor tiempo se asocia con hemoconcentracin y actividad fibrinoltica. Antes de la puncin se debe limpiar la zona elegida con un algodn impregnado en alcohol 70%, luego se debe fijar la vena traccionando suavemente la piel, introducir la aguja en el mismo sentido de la vena y liberar inmediatamente el torniquete; la sangre debe ser aspirada suavemente. Luego se retira la jeringa y con un algodn se presiona el lugar de puncin para evitar sangramiento. Antes de depositar la sangre en el(los) tubo(s) se retira la aguja, la sangre se agrega lentamente por las paredes del tubo. Luego de tapar ste (si no es al vaco) y si la sangre fue recolectada en un tubo con anticoagulante, se mezcla inmediatamente por inversin en forma suave, para evitar alteraciones y dao celular. 3.2.2. Puncin capilar Cuando por diversas razones no se puede realizar la puncin venosa o la cantidad de la muestra requerida es pequea, se puede obtener sangre por puncin capilar. La sangre capilar es obtenida por una puncin con una lanceta; en adultos y nios el lugar a eleccin es la parte lateral de un dedo de la mano y en recin nacidos es la parte lateral de la planta del pie. Se debe hacer una puncin fuerte y certera, se elimina la primera gota de sangre y para tener una adecuada recoleccin se debe presionar muy suavemente, evitando la salida de lquido tisular. 3.3. Almacenaje y transporte Dentro de la primera hora de tomada la muestra de sangre los cambios en las clulas sanguneas
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son imperceptibles; stos se hacen ms evidentes a partir de las tres horas hasta completarse a las 8 horas, a temperatura ambiente. Las alteraciones incluyen: leucocitos vacuolados, cambios degenerativos en el ncleo, crenacin de los glbulos rojos, incremento del hematocrito, disminucin de la VHS, alteracin en el recuento de reticulocitos, plaquetas y leucocitos, los cuerpos de Dhle tienden a desaparecer con el tiempo, y tambin alteracin del tamao y distribucin de las plaquetas. Todas estas alteraciones son evitables si la muestra de sangre se almacena a 4C. Cuando una muestra de sangre va a ser transportada se deben tomar precauciones para evitar las alteraciones descritas; aunque el transporte se realice entre lugares cercanos se aconseja hacerlo en contenedores refrigerados. Las condiciones para las pruebas de coagulacin son ms exigentes y se describen en el captulo 31. 3.4. Frotis sanguneo El examen microscpico de un frotis de sangre perifrica es muy importante para el estudio inicial de varias patologas hematolgicas tanto de la serie roja, serie blanca y plaquetas. El frotis sanguneo se puede realizar a partir de muestras anticoaguladas con EDTA dentro de las 2 horas posteriores a la recoleccin. Sin embargo, aunque es preferible que ste se realice inmediatamente despus de recolectada la sangre, sin mediar uso de anticoagulante; esto porque se ha visto que algunos pacientes presentan satelitismo plaquetario asociado a EDTA, debido a que las plaquetas se adhieren a neutrfilos, causando as trombocitopenia. Los portaobjetos a utilizar deben haber sido desengrasados previamente. Al realizar un frotis sanguneo se debe colocar una gota de sangre de 3 mm de dimetro en un extremo del portaobjetos y, rpidamente, con un cubre objetos se debe tocar la gota de sangre y esperar que sta se distribuya a todo el ancho del cubreobjeto, seguidamente con este ltimo en un ngulo de 45 se realiza un rpido movimiento del mismo hacia el otro extremo del portaobjeto; as la gota de sangre se distribuir en el frotis (figura 26-1).
Figura 26-1. Frotis sanguneo. Tomar la lmina por la parte inferior, procurando que la superficie superior de sta quede totalmente despejada. Desplazar el cubreobjeto en forma diagonal desde el rea izquierda hacia la derecha. Una vez realizado el contacto con la muestra, levantar y bajar el cubreobjeto de manera suave (sin perder contacto). Posteriormente arrastrar el cubreobjeto con la muestra de manera firme y rpida hacia el lado opuesto. La muestra debe quedar homognea (sin burbujas de O2).
La densidad celular del frotis permite reconocer tres zonas: una zona de alta densidad celular (cabeza del frotis), una zona de densidad intermedia (cuerpo del frotis) y una zona de baja densidad (cola del frotis). Dos factores que influyen en la calidad del frotis son el ngulo y tamao de la gota. As una gota muy grande produce un frotis largo y grueso, una gota pequea origina un frotis corto y pequeo. Un buen frotis debe cubrir aproximadamente el 80% del largo del portaobjeto, debe tener una cola redondeada y lados visibles, sin irregularidades o agujeros. Actualmente existen equipos automatizados que realizan frotis sanguneos; depositan una gota de sangre en un portaobjeto y la desplazan por capilaridad. Una de las desventajas de esta tcnica es la mala distribucin de los leucocitos; los monocitos y neutrfilos tienden a distribuirse en el extremo de la cola del frotis, lo que aumenta el nmero de linfocitos. Adems del trauma celular que se ocasiona, lo que es particularmente notorio en los sndromes linfoproliferativos.
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4. OBTENCIN DE MDULA SEA 4.1. Aspirado de mdula sea Al igual que el hemograma, el mielograma, es un examen fundamental para realizar el diagnstico de varias patologas hematolgicas. El mielograma corresponde a un estudio citolgico cuantitativo y cualitativo de mdula sea obtenida por aspiracin. Lugar de toma de muestra. La mdula sea se encuentra preferentemente en los huesos planos y epfisis de los huesos largos, por ello los principales sitios de puncin segn edad son los siguientes: (a) En nios menores de 2 aos se utiliza preferentemente el tercio superior de la cara interna de la tibia y la espina psterosuperior, (b) en nios mayores de 2 aos, jvenes se prefiere el ester nn y alternativamente las espinas iliacas pstero y ntero-superiores o apfisis espinosa de las vrtebras lumbares 1era a 4ta. El esternn, es el hueso ms usado para aspirar mdula sea, la posicin ms frecuente es cerca de su extremo proximal, bajo el ngulo de Louis. Puncin, aspirado y preparacin de los frotis. Previa desinfeccin de la piel y uso de anestesia local (piel y periostio), se introduce en el hueso un trocar especial para mielograma (figura 262). Una vez retirado el mandril del trocar se adapta a ste una jeringa y se aspira 0.51 mL de contenido medular con el cual se realizan varios frotis. stos son teidos igual que los frotis de sangre perifrica con tincin de MayGrnwald Giemsa (ver punto 5). Para una mayor informacin sobre mielograma ver captulo 24.
4.2. Biopsia de mdula sea El estudio histolgico de la mdula sea (Biopsia) proporciona informacin respecto a la densidad y constitucin celular del tejido hematopoytico y sobre la topografa del tejido medular. En general, se recurre a la biopsia de mdula sea en las siguientes situaciones: (a) cuando el cuadro clnico y los hallazgos del hemograma justifican el procedimiento, como complemento o certificacin diagnstica; (b) cuando, habiendo realizado dos o ms punciones para mielograma, no se obtuvo muestra o sta fue insuficiente para poder realizar un informe adecuado; y (c) para etapificacin de neoplasias hematolgicas (ver captulo 27). Toma de muestra y procesamiento tcnico. La biopsia de mdula sea transcutnea se realiza, bajo anestesia local, con trcar de Jamshidi desde la cresta ilaca pstero-superior o, dependiendo de la edad del paciente, se elige el hueso a puncionar considerando la mayor actividad hematopoytica esperable y/o el sitio especfico de localizacin de alguna lesin blanco a estudiar. La muestra (cilindro de mdula sea), en su procesamiento de rutina, se fija en Bouin o formalina al 10% y luego se decalcifica con cido ntrico al 7%. Al cabo de esto (aproximadamente 24-48 hrs.), se efecta el procesamiento histolgico, el cual requiere 12-24 hrs. y consiste en deshidratacin del tejido, inclusin en parafina, corte, tincin con hematoxilina-eosina y montaje. De esta manera, la biopsia por puncin de mdula sea permite una completa evaluacin histolgica de las clulas hematopoyticas y del estroma. En caso necesario, se pueden realizar tcnicas especiales de histoqumica e inmunohistoqumica. 5. TINCIN DE MAY GRNWALD-GIEMSA Desde hace muchos aos la tincin de May Grnwald-Giemsa ha sido usada para teir tanto los frotis de sangre perifrica como de mdula sea. Es considerada una tincin policroma porque posee eosina y azul de metileno, el Giemsa contiene adems, azul de eosina. Esta tincin permite reconocer las diferentes clulas sanguneas y sus diferentes estadios madurativos, tanto en clulas normales como patolgicas. El frotis sanguneo se deja secar a temperatura ambiente. Se debe identificar con el nombre del
Figura 26-2. Trocar para mielograma
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paciente en el sector de la cabeza del frotis. El metanol fija las clulas al portaobjeto; el tampn cambia el pH del medio y los reactivos se fijan a sus estructuras celulares, proceso pH dependiente. La oxidacin del azul de metileno y la eosina forman el complejo tiazin-eosinato, que tie los componentes neutros, de color azul. El azul de metileno (bsico) tie adems a las sustancias cidas (o basfilas), como el RNA y ciertas protenas citoplasmticas. Por su parte, la eosina (cida) tie sustancias bsicas (o eosinoflicas) como la hemoglobina o los grnulos de los eosinfilos. Los frotis deben estar secos antes de su estudio al microscopio. Actualmente existen tinciones comerciales que usando bsicamente los mismos reactivos, el proceso puede durar 1 minuto (tincin de Wrights). Los laboratorios que procesan un gran nmero de muestras pueden utilizar mtodos automatizados para la tincin de los frotis de sangre perifrica; los principios utilizados en la fijacin y tincin son los mismos del mtodo manual. El examen del frotis sanguneo debe incluir observacin con al menos dos aumentos
difer entes del microscopio. La primera observacin debe hacerse con objetivo de 40x (o 10x segn experiencia y costumbre del profesional) para observar la distribucin de los eritrocitos y leucocitos. Luego se hace la observacin en inmersin para realizar la frmula leucocitaria y estudiar la citologa de los glbulos rojos, glbulos blancos y plaquetas. As, a modo de ejemplo: (a) en los glbulos rojos se analiza la eventual presencia de alteraciones del tamao (anisocitosis; microcitosis y macrocitosis), de la forma (poiquilocitosis: codocitos, esferocitos, esquistocitos, etc.), presencia de inclusiones (cuerpos de Howell-Jolly, etc.) y alteraciones en el color (hipocromia), (b) en los leucocitos (granulaciones txicas de los neutrfilos, linfocitos reactivos, blastos, etc.) y (c) en las plaquetas (trombocitopenia, trombocitosis, macroplaquetas). 6. UNIDADES HEMATOLGICAS INTERNACIONALES En la actualidad, se recomienda expresar los resultados de los parmetros biolgicos de acuerdo con el llamado sistema internacional de unidades (sistema SI) (tabla 26-1).
Tabla 26-1. Unidades bsicas del Sistema Internacional (SI) Parmetro Longitud Masa Tiempo Corriente elctrica Temperatura termodinmica Intensidad lumnica Cantidad de substancia Unidad bsica Smbolo Metro Kilogramo Segundo Amperio Kelvin Candela Mol m Kg s A K cd Mol
La existencia de parmetros con valores superiores o inferiores a la unidad fundamental ha obligado, para facilitar la expresin de los resultados, a emplear mltiplos o submltiplos
de los mismos, cada uno de los cuales posee un prefijo que debe ser colocado junto al signo que representa la unidad fundamental (tabla 26-2).
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Tabla 26-2. Prefijos recomendados para los mltiplos y submltiplos de las unidades bsicas. Factor 1012 109 106 103 102 101 10-1 10-2 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18 Prefijo Tera Giga Mega Kilo Hecto Deca Deci Centi Mili Micro Nano Pico Femto Atto Smbolo T G M K H D d c m n p f A
El empleo del sistema SI en los laboratorios clnicos favorece la estandarizacin de mtodos y unifica la forma de expresar los resultados, facilitando con ello la comparacin de los estudios realizados en laboratorios y pases diferentes. Por ello, el International Council for Standadization in Haematology (ICSH), la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) y la World Association of Societies of Pathology (WAPS) nombres en espaol y siglas en ingls han elaborado una declaracin conjunta sobre el uso del sistema SI, que consta de los siguientes apartados fundamentales: (a) se r econoce la aceptacin del sistema internacional de unidades SI, (b) la unidad del volumen es el litro que se expresa con el smbolo L (o l), (c) para representar los mltiplos y submltiplos de unidades, se emplear solamente el prefijo correspondiente,
(d) la concentracin de substancias se expresar siempre en relacin al litro, y (e) en el caso de substancias cuya composicin qumica es conocida se recomienda emplear el mol para indicar la cantidad de las mismas. En hematologa, la introduccin del sistema SI ha supuesto un cambio relativamente importante en la expresin de los resultados, aunque mucho menor que el observado en el campo de la qumica clnica, donde ha creado ciertas dificultades de incorporacin a la prctica clnica diaria. De acuerdo con el sistema SI desaparecen, entre otras, expresiones tan familiares al hematlogo como el milmetro cbico (mm3), las micras cbicas (3), las gammas (g) o los tanto por ciento (%) (tabla 26-3).
Tabla 26-3. Expresin de los parmetros hematolgicos bsicos segn el sistema SI Parmetro Concentracin de hemoglobina Hematocrito Recuento de hemates VCM HCM Recuento de leucocitos Recuentos de plaquetas Recuento de reticulocitos Velocidad de sedimentacin globular Sistema clsico 15 g/dL 45% 5 millones/mm3 86 3 30 g() 5.000/mm3 240.000/mm3 60.000/mm3 5 mm/hr Sistema SI 150 g/L 0.45* 5 x 1012/L (5T/L) 86 fL 30 pg 5 x109/L (5G/L) 240x109/L (240G/L) 60x109 (60G/L) 5 mm/h
* En el sistema SI, el hematocrito carece de unidad ya que sta corresponde al cociente L/L. (T/L) = Tera-Hemates/L (G/L) = Giga-leucocitos/L; Giga-plaquetas/L; Giga-reticulocitos/L mm3 o L
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El significado del sistema SI y su relacin con el sistema clsico empleado para expresar las
unidades hematolgicas, se comprender mejor con los ejemplos que se refieren en la tabla 26-4.
Tabla 26-4. Tabla de conversin de las unidades clsicas al sistema SI de los principales parmetros usados en hematologa Parmetro Concentracin de hemoglobina Hematocrito Recuento de hemates VCM HCM Recuentos de leucocitos Recuento de plaquetas Reticulocitos Bilirrubina srica Sideremia Fibringeno cido flico Transferrina Vitamina B12 Unidades clsicas g/dL % Millones/mm3 3 g () x mm3 x mm3 x mm3 mg/dL g/dL mg/dl mg/dl mg/dl pg/dL Factor de conversin 10 0.01 1012 1 1 106 106 106 17.1 0.1791 0.02941 2.265 0.1136 0.7378 Sistema SI g/L 1012/L (T/L) FL Pg 109/L (G/L) 109/L (G/L) 109/L (G/L) mol/L mol/L mol/L mol/L mol/L mol/L
(T/L) = Tera-hemates/L (G/L) = Giga-leucocitos/L; Giga-plaquetas/L; Giga-reticulocitos/L
Recuentos celulares Clsicamente, el recuento de hemates, de leucocitos y de plaquetas se ha expresado en nmero de clulas por mm3 de sangre: hemates (4.5-5.5 millones/mm3), leucocitos (5.00010.000/mm3) y plaquetas (150.00-350.000/ mm3). La primera modificacin para adaptar estas expresiones al sistema SI fue emplear mltiplos de 10 para expresar el nmero de clulas y
substituir el mm3 por su equivalente, el microlitro (L). Con ello, la nueva forma de expresin fue: hemates (4.5-5.5 x 106/L), leucocitos (5-10 x 103 /L) y plaquetas (150 - 350 x 103 /L). No obstante, la determinacin de expresar cualquier cantidad de substancia en relacin al litro (1 L 106 L) hizo que la forma de expresin definitiva de estos parmetros fuera: hemates (4.5-5.5 x 1012 /L), leucocitos (5-10 x 109 /L) y plaquetas (150 -350 x 109 /L).
Ej: Recuento de leucocitos 5x109 = 5.000.000.000 = 5.000.000 = 5.000.000 = 5.000 / mm3 L 1.000 cc 1 cc 1.000 mm3
Hematocrito La forma clsica de expresar el hematocrito (Hto) en porcentaje (%) ha sido substituida por las unidades correspondientes de acuerdo con el sistema SI. Debido a que el Hto corresponde a la relacin existente entre el volumen de hemates y el de sangre total, su unidad resulta de un cociente entre dos unidades de volumen
idnticas (L/L), por lo que equivale a 1. De acuerdo con ello, un Hto de 45% corresponde segn el sistema SI a 0.45 L/L o simplemente 0.45. Concentracin de hemoglobina Este es el parmetro hematolgico cuya forma de expresin ha sido ms discutida. As,
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mientras se ha preconizado expresarlo en milimoles por litro (mmol/L), todava se considera aceptable hacerlo en gramos por litro (g/L). La variacin del nuevo valor con respecto al de concentracin de hemoglobina expresada en unidades clsicas (g/dL) es pequea. ndice eritrocitario La adopcin del sistema SI ha supuesto tambin un importante cambio en la expresin de los resultados correspondientes al volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM), si bien
no ha supuesto una modificacin de su valor absoluto. De acuerdo con el sistema clsico, el VCM se expresaba en (3); la HCM, en (g) o gammagamma () y la CHCM en g/dL. Segn el sistema SI, el VCM debe expresarse siempre en femtolitros (fL); la HCM, en picogramos (pg), y la CHCM, en gramos por litro (g/L). 7. VALORES DE REFERENCIA NORMAL En las tablas 26-5 a 26-9 se mostrarn los valores de los parmetros hematolgicos utilizados con ms frecuencia en clnica.
Tabla 26-5. Valores normales del hemograma en adultos, segn sexo Parmetro Hemoglobina Hematocrito Hemates VCM HCM CHCM Reticulocitos VHS Plaquetas Leucocitos Unidades g/L 1012/L fL pg g/L mm/h 109/L 109/L Hombres 140 - 175 0.38 - 0.52 4,5 - 5,9 Mujeres 123 - 153 0.35 - 0.47 4,1 - 5,1
80 - 96 28 - 33 320 - 360 5 - 20 4-7 150 - 400 4.5 - 11.0 5 - 12
Tabla 26-6. Valores normales de leucocitos totales y subpoblaciones leucocitarias Leucocito Totales Basfilos Eosinfilos Baciliformes Segmentados Linfocitos Edad Lactantes-nios Adultos Lactantes adultos Lactantes adultos Lactantes adultos Lactantes adultos Lactantes nios menores 7-14 aos Adultos Monocitos Lactantes adultos Nmero absoluto (/l) 5.000 - 15.000 4.500 - 11.000 <50 <500 <500 2.000 - 8.000 3.000 - 10.000 2.000 - 8.000 1.500 - 6.000 <1000
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Tabla 26-7. Valores normales de parmetros de hierro, cido flico y vitamina B12 Parmetro Hierro srico TIBC Porcentaje de Saturacin Ferritina srica cido flico Vitamina B12 Unidades g/dL g/dL % ng/mL ng/mL pg/mL 29 - 455 3.6 - 17.8 200 - 950 Hombres 80 - 180 200 - 400 15 - 45 7 - 140 Mujeres 50 - 150
Tabla 26-8. Valores normales del mielograma Clula Mieloblastos Promielocitos Neutrfilos totales Mielocitos Juveniles Baciliformes Segmentados Eosinfilos totales Mielocitos Juveniles Baciliformes Segmentados Basfilos y mastocitos Serie eritrocitaria total Proeritroblastos Eritroblasto basfilo Eritroblasto policromtico Eritroblasto ortocromtico Linfocitos Clulas plasmticas Monocitos Megacariocitos Clulas reticulares Razn mieloide:eritroide % 0.2 1.5 2.1 4.1 49.2 65 8.2 15.7 9.6 24.6 9.5 15.3 6.0 12 1.2 5.3 0.2 - 1.3 0.4 2.2 0.2 2.4 0 1.3 0 0.2 18.4 33.8 0.2 1.3 0.5 2.4 17.9 29.2 0.4 4.6 11.1 26.2 0.4 3.9 0 0.8 0 0.4 0 0.9 1.5 - 3.3
Tabla 26-9. Valores normales de pruebas de la hemostasia
Prueba Tiempo de sangra Tiempo de protrombina (TP) Tiempo de trombina (TT) Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) Tiempo de coagulacin Productos de degradacin del fibringeno (PDF)
Unidades min seg seg seg min g/ml
Valor normal 3 9,5 12 14 10 15 20 40 5 15 < 10
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HEMATOLOGA
Captulo
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HEMOGRAMA, MIELOGRAMA Y BIOPSIA DE MDULA SEA

Ivn Palomo G., Claudio Cruzat C., Marcelo Alarcn L., Marianela Agurto O. y Eduardo Retamales C.
1. Introduccin 2. Hemograma 2.1. Glbulos rojos 2.1.1. Anlisis cuantitativo a) Hematocrito b) Hemoglobina c) Recuento de glbulos rojos d) Constantes hematolgicas e) Recuentos de reticulocitos f) ndice ictrico g) Velocidad de eritrosedimentacin 2.1.2.Anlisis citolgico a) Alteraciones del tamao b) Alteraciones del color c) Alteraciones en la forma d) Inclusiones intraeritrocitarias 2.2. Glbulos blancos 2.2.1. Anlisis cuantitativos a) Recuento de leucocitos b) Frmula leucocitaria 2.2.2. Anlisis cualitativo a) Neutrfilos b) Linfocitos 2.3. Plaquetas 2.3.1. Anlisis cuantitativo a) Recuento de plaquetas 2.3.2. Anlisis citolgico
2.4. Contadores celulares 2.4.1. Principio de los contadores celulares 2.4.2. Tipos de contadores 2.4.3. Muestra de sangre 2.4.4. Aseguramiento de la calidad 2.4.5. Procedimientos e instrucciones 2.4.6. Fuentes de error 2.4.7. Limitaciones del sistema 2.4.8. Confiabilidad de los resultados 2.4.9. Correlacin con frotis sanguneo 2.5. Recomendaciones para la interpretacin del hemograma 3. Estudio de mdula sea 3.1. Mielograma 3.2. Biopsia de mdula sea 3.2.1. Aspectos generales 3.2.2. Mdula sea normal a) Distribucin de la mdula hematopoytica y celularidad b) Clulas hematopoyticas normales c) Composicin celular de la mdula sea y relacin mieloide/eritroide 3.2.3. Alteraciones estructurales y anormalidades morfolgicas en la biopsia de mdula sea. a) Alteraciones generales b) Biopsia de mdula sea en enfermedades hematolgicas especficas
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RESUMEN
El diagnstico de enfermedades hematolgicas requiere el estudio cuantitativo y cualitativo de las clulas de sangre perifrica. Entre los aspectos cuantitativos del hemograma se incluye, entre otras, las siguientes determinaciones: recuento de glbulos rojos, recuentos de leucocitos totales y de subpoblaciones, recuento de plaquetas. Actualmente los recuentos pueden ser realizados con contadores celulares. Los aspectos cualitativos se refieren a las caractersticas citolgicas de las tres lneas celulares. El estudio de la mdula sea a travs de mielograma y/o biopsia es requerido para el diagnstico de ciertas enfermedades hematolgicas, como por ejemplo las de tipo hipoplsticas y las infiltrativas.
1. INTRODUCCIN El hemograma es un examen hematolgico fundamental. El estudio cuantitativo y citolgico de las clulas sanguneas, permite avanzar significativamente en la mayora de las enfermedades hematolgicas, en que los glbulos rojos, leucocitos y/o plaquetas se ven afectados, ya sea por la falta de produccin en la mdula sea o por destruccin perifrica. Por su parte, el mielograma (estudio citolgico de la mdula sea) constituye el examen necesario para confir mar un diagnstico planteado con el estudio de sangre perifrica (hemograma) o para avanzar en el diagnstico de enfermedades ms complejas. Adicional o alternativamente, segn el caso, el estudio de mdula sea se puede realizar a travs de una biopsia. En este captulo se describir brevemente los diferentes componentes del hemograma, como tambin los aspectos fundamentales del mielograma y la biopsia de mdula sea.
2. HEMOGRAMA 2.1. Glbulos rojos 2.1.1. Anlisis cuantitativo a) Hematocrito El hematocrito corresponde al volumen de glbulos rojos expresado porcentualmente respecto a un volumen de sangre; de esta forma provee un valor estimativo del grado de anemia. El valor del hematocrito se obtiene por centrifugacin de sangre anticoagulada. El procedimiento es simple y reproducible. Brevemente, a un capilar (7.5 cm x 1 mm), se agrega sangre anticoagulada con EDTA y luego de sellar un extremo se centrifuga (5 min. a 12.000 r.p.m). Realizado el procedimiento se pueden distinguir tres capas: glbulos rojos, buffy coat (glbulos blancos y plaquetas), y plasma. El por centaje de hemates (hematocrito), se obtiene a partir de una tabla graduada. La tabla 27-1 muestra los valores normales segn sexo y edad.
Tabla 27-1. Valores normales de hematocrito Edad Recin nacido Lactante-nio Hombre adulto Mujer adulta (%) 50-65 32-42 42-52 38-45 SI 0.50-0.65 0.32-0.42 0.42-0.52 0.38-0.45
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Entre las observaciones del mtodo se encuentran: (i) un exceso de EDTA causa una disminucin del hematocrito, (ii) en muestras analizadas entre 6 a 8 horas de tomadas stas, aumenta el hematocrito, (iii) en la lectura se debe descartar el buffy coat, ya que un nmero elevado de leucocitos y/o plaquetas altera el resultado, (iv) las muestras que presentan cogulo deben ser descartadas ya que el hematocrito se encontrar disminuido. Entre los aspectos a controlar en el mtodo estn la adecuada homogeneizacin de la muestra, y el tiempo y velocidad de la centrifugacin La determinacin del hematocrito tambin se puede realizar en contadores celulares (ver punto 2.4). b) Hemoglobina La funcin primordial de la hemoglobina, principal protena de los glbulos rojos, es
transportar el oxgeno y el dixido de carbono hacia y desde los tejidos, respectivamente. Su determinacin ayuda a establecer el grado de la anemia. Para determinar la concentracin de la hemoglobina en la sangre, se utiliza el mtodo de la cianmetahemoglobina (HiCN), recomendado por el International Committee for Standarization in Hematology (ICSH). Brevemente, la sangre es diluida con el reactivo de Drabkin (incluye ferricianuro de potasio y cianuro de potasio). Todos los tipos de hemoglobina son oxidadas por el ferricianuro de potasio a metahemoglobina, que en presencia de ferricianuro de potasio forma un compuesto estable, cianmetahemoglobina, cuya concentracin es directamente proporcional a la absorbancia determinada a 540 nm. Para determinar la concentracin de las muestras se debe interpolar en una curva de calibracin previamente preparada usando un estndar. Junto con las muestras se debe procesar controles. En la tabla 27-2 se muestra los valores normales segn edad y sexo.
Tabla 27-2. Valores normales de hemoglobina Edad Recin nacido Lactante-nio Hombre adulto Mujer adulta g/dL 15-20 11-15 14-17,5 12,5-15, 0 g/L 150-200 110-150 140-175 125-150
Entre las desventajas del mtodo de la cianmetahemoglobina se encuentran: (i) el reactivo de Drabkin es muy sensible a la luz, por lo que se debe guardar en oscuridad, (ii) leucocitosis marcada, muestras lipmicas, hemoglobinas S y C (resistentes a la hemlisis), hiperglobulinemia (Ej. Macroglobulinemia de Waldestrns), producen una turbidez que puede afectar la lectura, (iii) la carboxihemoglobina demora cerca de una hora en convertirse en cianmetahemoglobina, por lo que en individuos muy fumadores, podran obtenerse valores errneos de hemoglobina. c) Recuento de glbulos rojos El recuento de hemates solo se debe realizar en contadores celulares (ver punto 2.4.)
d) Constantes hematolgicas La relacin entre hematocrito y hemoglobina o recuento de glbulos rojos permite obtener ndices que ayudan a clasificar las anemias segn el tamao y cromia de los glbulos rojos: normocticas-normocromas, macrocticas y microcticas-hipocromas. Las constantes ms usadas son Volumen Corpuscular Medio (VCM) y Concentracin de Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM). A continuacin se indican las frmulas y valores normales de ambos ndices: La VCM es el volumen de los glbulos rojos expresado en femtolitros (fL), 10-15 L: VCM: Hematocrito (%) x10 . Recuento de glbulos rojos (x106/L)
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Los glbulos r ojos son considerados normocticos cuando el VCM flucta entre 80100 fL, microcticos cuando el valor es inferior a 80 fL (ej. anemia ferropriva) y macrocticos cuando el valor es superior a 100 fL (Ej. anemia megaloblstica) La CHCM se expresa en gramos por declitros, pero formalmente expresada en porcentaje. CHCM: Hemoglobina (g/dL) x 100 . Hematocrito (%)
e) Recuento de reticulocitos Los reticulocitos son eritrocitos jvenes que contienen remanentes de cido ribonucleico (RNA), mitocondrias y ribosomas. Son teidos con azul cresil brillante, el cual hace precipitar los elementos antes mencionados. Se debe evitar confundir los reticulocitos con cuerpos de Heinz o cuerpos de Howell Jolly. Para hacer el recuento de reticulocitos se hacen 2 frotis de una mezcla de sangre con azul cresil brillante al 1% y se cuentan 1000 glbulos rojos en la zona donde no se superponen, anotndose los reticulocitos encontrados. Los glbulos rojos a los que con el microscopio ptico se les reconoce dos o ms partculas de color azul son considerados reticulocitos. El porcentaje de reticulocitos, por mtodo microscpico se obtiene con la siguiente frmula:
El valor de referencia normal de la CHCM es de 32 a 36%. Valores inferiores a 32% los presentan los hemates hipocromos, (Ej. anemia ferropriva, talasemias).
Porcentaje de reticulocitos:
Nmero de reticulocitos contados x 100 Nmero de glbulos rojos contados reticulocitosis. En cambio, cuando la eritropoyesis no es adecuada (Ej. anemia aplstica), se presenta una disminucin del recuento reticulocitario. Los reticulocitos, adems de expresarse como porcentaje tambin se pueden expresar como recuento absoluto; para esto ltimo se necesita el recuento de glbulos rojos. El porcentaje de reticulocitos se debe corregir segn el grado de anemia que presente el paciente; en casos de anemia, el porcentaje de reticulocitos puede verse falsamente elevado porque hay menos glbulos r ojos; la correccin se hace considerando un hematocrito normal:
Actualmente el recuento de reticulocitos se puede determinar por citometra de flujo; el RNA es marcado con tiazol orange. El resultado se puede informar en porcentaje y como nmero absoluto de reticulocitos; este mtodo es estadsticamente ms significativo puesto que permite analizar un nmero mucho mayor de clulas. En los adultos el 0.2 a 2% de las clulas eritroides circulantes corresponden a reticulocitos; en recin nacidos la cifra es superior (2 a 6%). Cuando aumenta la eritropoyesis, como por ejemplo en las anemias hemolticas se presenta
Porcentaje de reticulocitos corregido:
% reticulocitos x Hto del paciente . Hto normal (hombre: 45%, mujer: 40%) otra correccin que se indica en la siguiente frmula:
Cuando se observan reticulocitos de estrs (de mayor tamao) se debe aplicar adicionalmente
Indice de Produccin Reticulocitaria:
% reticulocitos corregido_______ Tiempo de maduracin de reticulocitos desplazados, basado en el Hto, 2 grado de la anemia puede llegar hasta 3 das, as el recuento de reticulocitos se podra dividir por das obtenindose el ndice de produccin reticulocitario; como una forma de simplificar
Esta ltima correccin considera el tiempo de maduracin de los reticulocitos, este tiempo normalmente es de 2 das en mdula sea y 1 da en circulacin; este ltimo dependiendo del
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el clculo se estima un perodo de maduracin de 2 das. El ndice r eticulocitario es fundamental al momento de clasificar la anemia en estudio como regenerativa o arregenerativa. f) ndice ictrico El grado de ictericia del plasma, basado en una semicuantificacin, como ndice ictrico, al leer el resultado del hematocrito realizado por centrifugacin, puede apoyar el diagnstico diferencial de las anemias. As, por ejemplo, el aumento de la concentracin de bilirrubina srica, podra estar asociada a anemia hemoltica, particularmente extramedular. Este examen se basa en la comparacin del color del plasma con diferentes diluciones de una solucin de dicromato de potasio 1%. El informe se expresa en unidades (valor normal: <5U); una unidad de II equivale aproximadamente a 1 mg/ dL de bilirrubina. g) Velocidad de eritrosedimentacin La velocidad hemtica de sedimentacin (VHS) es usada como apoyo al diagnstico y control de la evolucin de las enfer medades inflamatorias (Ejs: lupus eritematoso sistmico, artritis reumatoidea) o infecciones (Ejs: neumona, pielonefritis). El mtodo ms aceptado por la ICSH es el del Westergren; ste mide la tasa de sedimentacin de los glbulos rojos en el plasma; es obtenida por medicin de la distancia entre el menisco del plasma hasta el lmite superior de la columna de los glbulos rojos y se expresa en mm/hora. La VHS depende de la cantidad de eritrocitos, contenido plasmtico, y factores mecnicos y tcnicos. Ciertas enfer medades pueden causar la formacin de roleaux (pilas de monedas), producto de alteraciones en las globulinas sricas y el fibringeno plasmtico, situacin en la que los eritrocitos tienden a aglutinarse aumentando la VHS. En esta tcnica se usa sangre anticoagulada con EDTA, la cual se diluye con citrato de sodio 3.2% en una relacin 1:4. Se debe asegurar que no existan cogulos en la muestra, adems, el mesn en que se realiza el examen no debe presentar vibracin, ni existir altas temperaturas cerca del ensayo; si la concentracin del anticoagulante es superior a la recomendada disminuye la VHS. El uso de heparina como anticoagulante aumenta la VHS. La presencia de sickle cells y esferocitos impiden la formacin de pilas de monedas, disminuyendo la VHS. Los valores normales son los siguientes: nios <10 mm/Hr, hombres <50 aos 4-7 mm/Hr, >50 aos <20 mm/Hr;
mujeres, <50 aos 5-12 mm/Hr, >50 aos <30 mm/Hr. Entre las enfermedades que alteran la VHS se pueden citar solo, a modo de ejemplos: policitemia (disminuye la VHS), por el contrario: neumona, sepsis y mieloma mltiple (aumentan la VHS). En la actualidad existen mtodos automatizados para determinar la VHS, as por ejemplo el sistema Ves-Matic usa un sensor optoelctrico que mide los cambios de la opalescencia de la columna de la VHS; la sangre es adicionada en tubos especiales con anticoagulante, los que se ubican en el instrumento, en un ngulo de 18 (grados) y el resultado se obtiene en 20 minutos. 2.1.2. Anlisis citolgico a) Alteraciones del tamao Las alteraciones del tamao del glbulo rojo (anisocitosis) son de dos tipos: macrocitosis (eritr ocitos de mayor tamao que lo normal:>100 fL) y microcitosis (eritrocitos de menor tamao). La macrocitosis es caracterstica de la anemia megaloblstica (dficit de vitamina B12 y/o cido flico; ver captulo 7). Tambin se puede observar cierto grado de macrocitosis en algunos pacientes con aplasia medular. Otro ejemplo de macrocitosis no megaloblstica se puede observar en algunas hepatopatas. Los hemates de los recin nacidos son de mayor tamao que en el adulto. Los glbulos rojos microcticos se observan en la anemia ferropriva, talasemias y en algunos pacientes con anemias secundarias a enfermedades crnicas. b) Alteraciones del color Las alteraciones del color se refier en a modificaciones en el contenido hemoglobnico. La hipocr oma es consecuencia de una disminucin del contenido hemoglobnico eritrocitario. Los eritrocitos policromatfilos (tonalidad azul griscea por el contenido de RNA) corresponden a reticulocitos, los que aumentan en las anemias regenerativas. Ante la presencia de policromatofilia es recomendable realizar recuento de reticulocitos. La anisocroma se refiere a la coexistencia de eritrocitos hipocromos y normocromos.
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c) Alteraciones en la forma Las alteraciones de la forma de los glbulos rojos (poiquilocitosis) obedecen a diversas causas, entre otras: diseritropoyesis, causas hereditarias
y accin de diversos agentes sobre eritrocitos normales. En la figura 27-1 se muestran las alteraciones morfolgicas ms frecuentes de los eritrocitos.
Figura 27-1. Alteraciones morfolgicas de los glbulos rojos. Fila superior de izquierda a derecha (Esferocito, Dianocito y Esquistocito) y fila inferior en el mismo sentido (Dacriocito, Estomatocito y Crenocito).
En la diseritropoyesis se pueden observar eritrocitos con poiquilocitosis variada. En caso de causas hereditarias suele predominar un tipo de alteracin mor folgica. Entre las poiquilocitosis, destacan: Esferocitos. Son glbulos rojos que en lugar de presentar forma bicncava como en los glbulos rojos normales presentan forma esfrica. A modo de ejemplo se puede mencionar la esferocitosis hereditaria y la anemia hemoltica inmune (ver captulo 8). Eliptocitos u ovalocitos. Son eritrocitos que presentan una forma ovalada. Se observan en la eliptocitosis hereditaria (ver captulo 8). Adems suelen encontrarse en anemias microcticas. Acantocitos (spurr cells). Corresponden a eritrocitos un tanto esferoidales que presentan pr ominencias super ficiales alargadas distribuidas en forma irregular. Los acantocitos se presentan en la acantocitosis (enfermedad congnita), en hepatopatas, y en postesplenectomizados. Dianocitos (target cells). Son hemates que poseen un exceso de superficie, por lo que se forma una zona central con mayor contenido hemoglobnico. Se observan en las talasemias (ver captulo 8), anemia ferropriva (ver captulo 6) y en ciertas enfermedades hepticas.
Esquistocitos. Son fragmentos de eritrocitos. Suelen observarse en anemias hemolticas de origen mecnico, anemias hemolticas microangiopticas, (Ej. coagulacin intravascular diseminada (ver captulo 23). Dacriocitos. Corresponden a eritrocitos en forma de lgrimas o gotas; se observan en mielofibrosis, talasemias y policitemias. Estomatocitos. Son eritrocitos con hendidura central en forma de boca. Se observan en la estomatosis hereditaria y afecciones hepticas. Crenocitos (Burr cells). Habitualmente corresponden a artefactos; en caso de ser ver daderos cr enocitos se asocia a deshidratacin, carcinoma gstrico y uremia. Drepanocitos o hemates falciformes (Sickle cells). Son glbulos rojos en forma de hoz. Se observan en casos de anemia drepanoctica, un tipo de hemoglobinopata (ver captulo 8). d) Inclusiones intraeritrocitarias En ocasiones, los eritrocitos pr esentan inclusiones de diversa naturaleza: Punteado basfilo. Se refiere a la presencia de punteado mltiple que se tie con colorantes bsicos. Equivalen a hemates jvenes con
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restos de RNA. Se presentan en talasemias e intoxicacin por plomo, entre otras situaciones. Granulacin azurfila. Son pequeas granulaciones de color violeta prpura en los glbulos rojos; corresponden a restos de ncleo de eritroblastos. Se observan en sndromes diseritropoyticos congnitos y/o adquiridos. Anillos de Cabot. Corresponde a restos de microtbulos de eritroblastos que quedan, despus de mitosis anormal, en los hemates. Su pr esencia indica alteracin de la eritropoyesis. Se pueden observar en la anemia megaloblstica, en las anemias hemolticas. Cuerpos de Howell Jolly. Son restos de cromatina que persisten en el interior del eritrocito. Suelen observarse en individuos postesplenectomizados o en pacientes con anemia megaloblstica; en este ltimo caso constituyen un signo perifrico de diseritropoyesis. Eritroblastos. Son clulas inmaduras de la serie roja, cuya caracterstica principal es la presencia de ncleo. Su presencia en sangre perifrica, corresponde a un signo de intensa regeneracin eritroblstica, pero tambin se pueden presentar en el contexto de una reaccin leucoeritroblstica la que podra estar asociada a infiltracin medular (mieloptisis). Cuerpos de Pappenheimer. Son grnulos siderticos de color prpura en la periferia del eritrocito. Suelen encontrarse en anemias con alteraciones en la incorporacin del hierro a la hemoglobina, como por ejemplo: anemias sideroblsticas, talasemias e intoxicacin por plomo. Cuerpos de Heinz. Corresponden a precipitados de hemoglobina desnaturalizada. Se presentan en caso de anemia hemoltica intracorspuscular por dficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenada (G6PD) y anemias hemolticas inducidas por frmacos. Recuento de leucocitos:
Parsitos. La parasitosis intraeritrocitaria ms caracterstica es la malaria. Los plasmodios realizan parte de su ciclo vital en el interior de los glbulos rojos; toman una forma anillada que contiene un pequeo ncleo central correspondiente al tr ofozoito. Entre las parasitosis extraeritrocitarias se encuentra la enfermedad de chagas, en la cual se observan tripanozomas en circulacin. 2.2. Glbulos blancos Las alteraciones que pueden presentar los leucocitos en el hemograma son de dos tipos, cuantitativos y cualitativos (citolgicos). A continuacin se describirn brevemente ambos tipos de alteraciones: 2.2.1. Anlisis cuantitativos a) Recuento de leucocitos El recuento normal de leucocitos flucta entre 5.00010.000/L y en recin nacidos entre 15.000-20.000/L. El recuento leucocitario se realiza en forma manual o en contadores celulares (ver punto 2.4.). En el caso del mtodo manual se utiliza una cmara de Neubauer la que consta de dos reas cuadradas de 3x3 mm (9 mm2). Est dividida en nueve cuadrados de 1x1 mm; el cuadrado central (retculo de Thomas ) est dividido en 25 cuadrados. Al instalar el cubrecmara se produce una distancia de 0.1 mm, con lo cual el volumen total de la cmara es de 9 mm3. Antes de realizar el recuento, la sangre debe ser diluida 1:10 1:20 con el diluyente Hayem B (contiene cido actico que destruye los glbulos rojos y azul de metileno que tie los ncleos de leucocitos). Realizado el recuento de los glbulos blancos encontrados en los 4 cuadrantes externos de la cmara, el clculo final se obtiene por la siguiente frmula:
Nmero promedio de clulas contadas x factor de dilucin rea contada (mm2) x la profundidad de la cmara
Algunas patologas de la mdula sea liberan eritroblastos hacia periferia. Si hay ms de 10 eritroblastos por 100 leucocitos en el frotis sanguneo, el recuento de leucocitos debe ser corregido, puesto que estara falsamente
aumentado. Esto ocurre porque el reactivo Hayem B destruye solo las clulas no nucleadas, razn por la que los eritroblastos no son destruidos. Para corregir el recuento se utiliza la siguiente frmula:
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Recuento de leucocitos corregido:
Recuento de leucocitos no corregido x 100 (eritroblastos/100 leucocitos) + 100 La frmula leucocitaria mide el porcentaje de cada subpoblacin leucocitaria en la muestra de sangr e. El aumento o disminucin del porcentaje de un tipo de leucocitos en particular puede ser solo relativa (porcentual) o bien absoluta (verdadera); para obtener este ltimo valor se debe considerar el recuento total de leucocitos. As por ejemplo, 70% de linfocitos, en el contexto de un hemograma que tiene 2.000 leucocitos/L corr esponde a una linfocitosis relativa (1.400 linfocitos/L), pero en un hemograma con 50.000 leucocitos/L se trata de una linfocitosis absoluta (35.000 linfocitos/L). Los valores normales se indican en la tabla 27-3.
b) Frmula leucocitaria El extendido o frotis sanguneo, es un elemento muy importante en la realizacin del hemograma. Es posible obtener informacin con respecto a la morfologa de las tres series sanguneas glbulos rojos, leucocitos, y plaquetas. Adicionalmente, el citohematlogo experimentado puede tener una apreciacin sobre aspectos cuantitativos: ndices hematolgicos, recuento de leucocitos y recuento de plaquetas. Los frotis sanguneos y su estudio deben cumplir ciertas condiciones para que sean de utilidad: grosor, calidad de la tincin y lugar del frotis donde se realiza la observacin. En cuanto a su tincin se usa la de May Grnwald - Giemsa (ver captulo 23, punto 5).
Tabla 27-3. Rango de referencia normal de subpoblaciones leucocitarias % Basfilos Eosinfilos Neutrfilos Linfocitos Monocitos 01 04 46 73 18 44 39 Nmero absoluto (x103/L) 0 0.1 0 0.3 1.3 6.7 0.9 3.2 0.12 0.6
En trminos generales a los glbulos blancos se les puede clasificar en polimorfonucleares (neutrfilos, eosinfilos y basfilos) y los mononucleares (linfocitos y monocitos). En cuanto a los leucocitos el anlisis citolgico del frotis sanguneo entrega informacin sobre aspectos cualitativos y cuantitativos de los diferentes leucocitos y permite detectar la eventual presencia de clulas anormales. Aumento o disminucin en el nmero absoluto de algunas subpoblaciones de leucocitos puede orientar al diagnstico de enfermedades infecciosas, inflamatorias, y procesos proliferativos. En trminos generales, las alteraciones cuantitativas pueden ser de tres tipos: (a) Aumento de una subpoblacin de leucocitos, (b) disminucin de una subpoblacin de leucocitos, y (c) presencia de clulas inmaduras o blastos. El sufijo filia, significa un incremento por sobre lo normal de una poblacin determinada, y el
sufijo penia se usa para indicar disminucin en una poblacin de leucocitos. Aumento de una subpoblacin de leucocitos Neutrofilia. Valor normal de neutrfilos en circulacin es 46-73%. Se habla de neutrofilia cuando el valor es superior a 6.7 x 103/L. Se observa neutrofilia en casos de ejercicios en exceso o brusco, estrs e hipoxia; en estos casos no se trata de un aumento de la granulopoyesis sino que un aumento de la demarginacin de neutrfilos que se encuentran en el pool marginal que est en la pared endotelial; se trata de pseudoneutrofilias explicadas por cambios en su distribucin. En infecciones de tipo bacteriano se produce neutrofilia por aumento de la granulopoyesis; posteriormente los neutrfilos migran al sitio de infeccin (tejido) para llevar a cabo su accin fagoctica. Tambin se presenta neutrofilia en situaciones clnicas asociadas a los excesos de metabolitos
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como ocurre en la uremia, la gota y la acidosis diabtica; y por sustancias qumicas como por ejemplo el plomo, el mercurio y los corticoides. Eosinofilia. La eosinofilia (>500/L) se observa en las siguientes enfermedades: Enfermedades alrgicas (asma, alergias medicamentosas, eccema atpico, urticaria y otras), parasitosis (hidatidosis, triquinosis, cisticercosis y otras), ingesta de medicamentos, y enfermedades de la piel (eccema, pnfigo, psoriasis, dermatitis herpetiforme). Monocitosis. Se habla de monocitosis cuando el recuento de monocitos es >1000/L. Esta situacin se presenta en: recuperacin de enfermedades agudas, infecciones bacterianas, enfermedades reumticas y enfermedades autoinmunes (LES, artritis), en enfermedades hematolgicas, tales como Leucemia mieloide aguda, Leucemia mielomonoctica crnica (SMD), Leucemia aguda mielomonoctica (FABM4) y monoctica (FAB-M5), y en tipo de destruccin de tejidos tales como accidentes y cirugas muy extensas. En situaciones que pueden presentar una fase de recuperacin medular, como por ejemplo, postquimioterapia, post-trasplante de mdula sea, recuperacin de aplasia medular, y de agranulocitosis, suele observarse como primer signo de generacin mieloide un incremento transitorio de monocitos; esto se explica porque el perodo de maduracin de los monocitos en la mdula sea es ms corto que en los neutrfilos. Basofilia. Los basfilos son los leucocitos que se presentan en menor de proporcin en la sangre perifrica. Se presenta basofilia en: Alergias, post-irradiacin, cirrosis y Sndromes mieloproliferativos crnicos (Leucemia mieloide crnica y Policitemia vera). Linfocitosis. Entre las causas ms importantes de linfocitosis destacan: infecciones virales (Mononucleosis infecciosa, tos ferina, rubola, varicela, influenza, hepatitis, citomegalovirus) y leucemia linftica crnica. Disminucin de una subpoblacin de leucocitos Neutropenia. Se define como neutropenia a un valor absoluto de neutrfilos en sangre perifrica menor a 1.5x103/L; neutropenia leve se define como 1 - 1.5 x 10 3/L, y de neutropenia marcada o agranulocitosis cuando el recuento es inferior a 0.5 x 103/L. En los nios menores
de 1 ao de edad, se define como neutropenia cuando la cifra es inferior a 1.0x103/L. En la mayora de los casos de agranulocitosis, el riesgo de infeccin es muy marcado, pudiendo incluso producirse infeccin por la flora comensal. La neutropenia puede producirse por diversas causas, que pueden ser de origen central o perifrico: De origen central: (a) por defectos de la produccin, neutropenias hipoplsicas: congnitas e inducidas por frmacos, (b) por granulocitopoyesis ineficaz, dficit de vitamina B 12 y/o cido flico) y (c) por liberacin disminuida de neutrfilos desde la mdula sea. De origen perifrico: (a) por destruccin excesiva o de salida a los tejidos (inmunolgicas, idioptica, neonatal, inducida por fr macos) y (b) pseudoneutropenias, en las cuales existe un aumento del compartimiento marginal con respecto al circulante.
Linfopenia. Es el descenso de la cifra de linfocitos por debajo de 1.5x103/L. Se puede observar durante el curso de Sndrome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA (infeccin por VIH). Presencia de clulas inmaduras o blastos La existencia en sangre perifrica de clulas inmaduras, de la serie roja o serie leucocitaria, es siempre patolgico. Serie roja. La presencia de eritroblastosis puede ocurrir como respuesta a un estmulo extramedular (eritroblastosis fetal, sndromes hemolticos intensos) o tener un origen medular de diferente tipo (diseritropoyesis congnita o adquirida). En la Eritroleucemia o Enfermedad de Di Guglielmo (Leucemia mieloide aguda tipo M6, segn, FAB presenta eritroblastos), pero tambin se puede observar en otras infiltraciones medulares. Serie leucocitaria. En las leucemias agudas depender de la lnea celular el tipo de blastos que se puede observar en periferia. Se les clasifica en dos grandes grupos, tipo mieloide y tipo linfoides. En su diferenciacin se utilizan criterios morfolgicos, inmunofenotpicos y citoqumicos. En los linfomas que se leucemizan aparecen clulas linfoides reactivas. En otros sndromes
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linfoproliferativos, los elementos linfoides circulantes suelen presentar caractersticas mor folgicas que orientan a un tipo de diagnstico, como por ejemplo la tricoleucemia y la enfermedad de Szary. 2.2.2. Anlisis cualitativo Algunas alteraciones morfolgicas que se pueden presentar en neutrfilos y linfocitos de sangre perifrica, pueden ser de valor diagnstico. a) Neutrfilos Alteraciones de la granulacin. La denominada granulacin txica corresponde a un aumento de grnulos primarios, con abundante actividad mieloperoxidasa y suele presentarse en el curso de infecciones bacterianas. Otras alteraciones citoplasmticas menos frecuentes en neutrfilos son los llamados cuerpos de Dhle, inclusiones ovaladas compuestas fundamentalmente de RNA, situadas en la periferia del citoplasma de los neutrfilos. En las anomalas de Alder Reilly y de ChediakHigashi, se presentan grnulos gigantes en los leucocitos, que se originan por fusin de grnulos. Alteraciones del ncleo. Normalmente el ncleo de los neutrfilos tiene entre 3 a 4 lbulos; se puede observar aumento en e l n m e r o de lbulos (neutrfilos polisegmentados) en la anemia megaloblstica. Una alteracin congnita de la segmentacin nuclear de los neutrfilos, denominada anomala de Pelger-Huet, que se caracteriza por presentar ncleo bilobulado, con una especial condensacin cromatnica en alrededor del 90% de los neutrfilos. Estos neutrfilos presentan un trastorno gentico, en que solo maduran hasta la etapa de baciliforme, dando origen a una pseudo-desviacin a la izquierda sin que exista infeccin. Reaccin leucemoide. Es una leucocitosis reactiva que puede aparecer como una forma de respuesta medular a una causa subyacente. Se caracteriza por cambios hematolgicos que semejan una Leucemia Mieloide Crnica. En Recuento de plaquetas:
general cursa con un recuento leucocitario superior a 20x103/L, con presencia de formas inmaduras en sangre perifrica. Puede presentarse en infecciones bacterianas y virales, alergias, enfermedades inflamatorias o que cursan con necrosis tisular, y asociadas a algunos frmacos (corticoides, adrenalina, litio). En pacientes afectados con el Sndrome de Down, se ha descrito este cuadro en los recin nacidos pero en forma transitoria. Reaccin leucoeritroblstica. La leucoeritroblastosis es un trmino utilizado para describir la presencia de clulas inmaduras de las series mieloide y eritroide en sangre perifrica. Generalmente se acompaa de anemia; puede o no existir compromiso de las plaquetas. b) Linfocitos Existe un pequeo grado de pleomorfismo en los linfocitos. En el curso de ciertas infecciones virales (mononucleosis infecciosa, infeccin causada por el virus de Epstein Barr y en otras enfermedades virales relacionadas), pueden observarse linfocitos con citoplasma ms abundante con distintos grados de basofilia (leve, moderada e intensa), cuya forma se adapta a los glbulos rojos vecinos, reciben el nombre de linfocitos activados o reactivos. 2.3. Plaquetas 2.3.1. Anlisis cuantitativo a) Recuento de plaquetas El recuento de plaquetas se puede realizar con microscopio de contraste de fase y con contadores hematolgicos (ver punto 2.4). En el primer caso el recuento se realiza en una cmara de Neubauer, especficamente en el retculo de Thomas. El rango de referencia normal es 150 350 x103/L. Se utiliza muestra de sangre anticoagulada con EDTA, la cual es diluida (1:100) con oxalato de amonio, que lisa las otras clulas. Despus de 20 minutos de cargada la cmara se hace el recuento de plaquetas con objetivo 40x. El nmero de plaquetas se obtiene con la siguiente frmula:
Nmero de clulas contadas x factor de dilucin 10 nor malmente se observan entre 8 y 20 plaquetas por campo.
Una estimacin del recuento plaquetario debe realizarse en el frotis sanguneo teido con MayGrnwald Giemsa en objetivo de inmersin;
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2.3.2. Anlisis citolgico Adems del recuento, al igual que en las otras lneas celulares, interesa la morfologa de las plaquetas. Al usar sangre sin anticoagulante para hacer los frotis sanguneos, las plaquetas tienden a for mar agregados de distintos tamaos, lo que no sucede cuando se utiliza con sangre anticoagulada con EDTA, caso en el cual se distribuyen uniformemente por toda la extensin. Despus de una hemorragia o en casos de anemia ferropriva, el tamao de las plaquetas puede ser variable y su nmero puede aumentar. En ciertas hemopatas pueden observarse plaquetas gigantes o con signos de displasia. Se ha observado que la sangre anticoagulada con EDTA-Na 2 pr esenta aglutinacin plaquetaria lo que podra ser informado como trombocitopenia al realizar un recuento de plaquetas en contadores celulares, situacin que debe ser pesquisada al observar el frotis sanguneo. La adsorcin de las plaquetas en la superficie de los neutrfilos o satelitismo plaquetario puede ser una causa de falsa trombocitopenia en el recuento automtico; de ser as solo la observacin al frotis permitir pesquisar este fenmeno cuya causa se desconoce. La trombocitopenia (recuento de plaquetas <140x103/L) puede deberse a alteraciones de la mdula sea (trombocitopenias centrales) o a una afeccin de las plaquetas circulantes (trombocitopenias perifricas). Entre las causas de trombocitopenias centrales se distinguen: (a) depresin medular por infecciones, agentes txicos, (b) invasin de la mdula sea por clulas anmalas (leucemias, linfomas), (c) insuficiencia medular (aplasia, mielodisplasias, mielofibrosis). Las trombocitopenias perifricas pueden deberse a causa inmunolgica o a hiper consumo. En el primer caso, la trombocitopenia puede estar mediada por alo o autoanticuerpos. La trombocitopenia por consumo aumentado se presenta en sepsis, hiperesplenismo, procesos microangiopticos y CID (ver captulo 19). En pacientes con trombocitopenias, las macroplaquetas se asocian a plaquetas ms jvenes (plaquetas reticuladas y se observan en trombocitopenia regenerativas o perifricas. En los sndromes mielodisplsticos es posible observar plaquetas gigantes, degranuladas, vacuoladas y con grnulos gigantes.
La trombocitosis (aumento del recuento plaquetario) puede ser primaria como trombocitemia esencial y otros sndromes mieloproliferativos, o secundaria. En este ltimo caso se trata de trombosis reactiva que se puede presentar en cualquier patologa inflamatoria, como por ejemplo en trastornos inflamatorios crnicos: artritis reumatoidea, fiebre reumtica, colitis ulcerosa, TBC y cirrosis heptica; recuperacin de infeccin aguda; deficiencia de hierr o, anemia megaloblstica; anemia hemoltica; enfermedad de Hodgkin y otros. 2.4. Contadores celulares 2.4.1. Principio de los contadores celulares El primer contador automtico de clulas sanguneas fue descrito por W. Coulter en 1956. El principio del mtodo est basado en que el equipo utiliza un sistema de medicin no ptico y provee un rango de cuantificacin que excede las 6.000 clulas individuales por segundo, con un intervalo de tiempo de 15 segundos. Una suspensin de elementos formes es impulsada a travs de un orificio, simultneamente con una corriente elctrica. Las clulas sanguneas, individualmente pasan a travs del orificio generando un cambio de impedancia (resistencia) en la apertura, este pulso vara con el tamao de la clula, de esta manera, el equipo contabiliza las clulas individuales y provee una distribucin del tamao (figura 27-2). El nmero de clulas cuantificadas por muestra es aproximadamente 100 veces mayor que los recuentos microscpicos, reduciendo de esta manera el error estadstico en 10 veces. Los contadores modernos an siguen usando este sistema, es el mtodo de referencia para recuentos celulares.
Figura 27-2. Principio de contadores celulares.
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La pr ogresiva incorporacin de autoanalizadores al laboratorio hematolgico ha logrado un mejoramiento, no slo en la rapidez y precisin, sino tambin en la confiabilidad de los resultados, orientado a la tipificacin de las anemias, por cuanto junto a la concentracin de hemoglobina, proporcionan en for ma sistemtica otros parmetros eritrocitarios de gran valor clnico, tales como el recuento de hemates, el hematocrito y los valores hematimtricos: VCM, HCM, CHCM, dispersin de la hemoglobina (HDW) y rea de distribucin del glbulo rojo (RDW). Si bien el empleo de autoanalizadores hematolgicos ha mejorado el diagnstico de las anemias, el anlisis de la morfologa eritrocitaria mediante observacin microscpica de un frotis de sangre perifrica bien realizado y teido constituye todava un procedimiento diagnstico fundamental, ms an en algunas patologas eritrocitarias, como por ejemplo en la esferocitosis hereditaria o en la eliptocitosis congnita donde la observacin morfolgica de los hemates constituye el principal criterio diagnstico, de la misma manera ocurre con la leucemia de clulas vellosas. La presencia de nuevos parmetros puede indicarnos la heterogeneidad de la poblacin eritrocitaria, como lo es el RDW, o los histogramas de distribucin que son sumamente tiles para confirmar el grado de anisocitosis en una primera parte, como diagnstico diferencial de anemias en la segunda (figura 27-3).
separar las poblaciones. Impulsos de dispersin en ngulo bajo entregan informacin sobre el tamao celular. Impulsos de dispersin en ngulo alto facilitan informacin sobre la complejidad interna de las clulas. Otr os analizadores poseen cubculos independientes para eritrocitos y leucocitos. En el de eritrocitos se encuentra una apertura de 50 m y en el de los leucocitos de 100 m. En cada apertura se realizan 3 recuentos de 4 segundos y se obtiene el promedio. En la primera, el sistema identifica los eritrocitos como aquellas partculas de volumen igual o mayor que 36 fL, adems realiza el recuento de plaquetas, las cuales tienen un volumen entre 2 y 20 fL. En la cmara de leucocitos, posterior a una dilucin con diluyente isotnico, se aplica agente lisante que destruye la membrana citoplasmtica de eritrocitos y leucocitos, permaneciendo los ncleos intactos. As las partculas que midan 35 fl, son contadas como leucocitos. En el caso de presencia de ncleos de eritroblastos, stos sern contabilizados y declarados con una seal de alerta por el equipo; su existencia se debe confirmar en el frotis sanguneo. Los ltimos se deben descontar del recuento de leucocitos. Actualmente existen contadores hematolgicos que incluyen adems de los valores hematimtricos ya conocidos (VCM, HCM y CHCM), el ndice RDW que corresponde a la heterogeneidad en los tamaos celulares de los glbulos rojos conocida como anisocitosis en el frotis de sangre perifrica, se expresa como una desviacin estndar en fL o como un coeficiente de variacin (porcentual). De la misma manera, singular relevancia tienen los histogramas de glbulos rojos cuyo estimador de distribucin eritrocitaria dependiente del contenido hemoglobnico y grado de dispersin, HDW. El disponer del RDW y HDW permite mejorar el significado de la heterogeneidad del volumen celular y de la hemoglobina, relacionada con diversas patologas hematolgicas. Las muestras con un valor de RDW bajo o nor mal (aproximadamente 14%) tienen generalmente una poblacin homognea y un histograma de distribucin por tamao de carcter gaussiano, a diferencia de las que poseen un RDW alto (generalmente mayor de 18%) que tienen poblaciones celulares heterogneas directamente relacionadas con el grado de anisocitosis observados en el frotis de sangre perifrica. Existen evidencias de que el
Figura 27-3. Histograma de glbulos rojos. (a) hemates normales, (b) eritrocitos microcticos.
En este contexto, es importante seleccionar un analizador para el laboratorio de hematologa que responda a las necesidades y proyecciones del usuario. Para el recuento diferencial de las cinco poblaciones celulares, algunos analizadores automatizados emplean el Adaptative Cluster Analysis System. Las clulas blancas se analizan mediante citometra de flujo utilizando un lser semiconductor. Una dispersin a doble ngulo proporciona dos tipos de informacin para
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RDW en la mayora de los casos sera til para detectar estados tempranos de deficiencia de hierr o, cido flico o vitamina B 12 . Un incremento en el RDW sera sugerente de una deficiencia nutricional precoz, especialmente con respecto al hierro. Tambin sera til en la diferenciacin de las anemias microcticas hipocrmicas como son la anemia ferropnica y la -Talasemia heterocigota. Es de inters la presencia de histogramas de distribucin celular de carcter bimodal (donde en muchos casos el volumen corpuscular medio resultara ser normal por compensacin de tamaos) que generalmente se hallan asociados a pacientes con algunas de las deficiencias nutricionales bajo tratamiento, pacientes con deficiencias mixtas, pacientes transfundidos y sndromes mielodisplsicos. Algunos contadores incluyen la IRF (Fraccin de Reticulocitos Inmadura) y el MRV (Volumen Medio de Reticulocitos). Estos parmetros se presentan ms sensibles que el recuento de reticulocitos en la respuesta medular de pacientes con anemia, incluidos recin nacidos, enfermedades crnicas, respuesta a terapias de anemias (eritropoyetina, hierro, B12, folato), respuesta medular a mielosupresin, pacientes trasplantados y evaluacin de anemias y de actividad de eritropoyetina. El histograma de glbulos rojos, muestra la grfica del tamao (en fL) en el eje X y la relacin relativa en el eje Y. Es usado para determinar el tamao promedio, distribucin del tamao, y subpoblaciones. Este histograma representa la distribucin normal de eritrocitos. La cola de la curva representa la coincidencia del pasaje de clulas al mismo tiempo. 2.4.2. Tipos de contadores En la actualidad, en el pas se utilizan los siguientes modelos de contadores hematolgicos: Abbott Cell Dyn 3500-3700-4000, Celdyn 1400-1500-1600-1700, Bayer Advia 60, Coulter automticos Act8-Actdiff-T540-890- TJ-STKSMAXM-Onyx-Gen S, Coulter CBC 5, Clay Adams, Spirit, Erma Ermax 18, Hycel modelo Celly-Diana 5, Medonic Mimer - CA- 530, CA620, Micros OT 18 ABX Cobas, , Meter Tech Excel 300-500-710, Nihon Kohden Celltac automticos, Nihon Kohden Celltac MEK Serie 5000, Serono, Sysmex K4500 - SF3000 KX21N, Pentra 60.
2.4.3. Muestra de sangre La muestra debe ser extrada con anticoagulante. El anticoagulante que presenta mejores propiedades para el almacenamiento de la muestra es la sal dipotsica del cido etilendiaminotetractico (K2EDTA), en una concentracin entre 1,5 mg/mL de sangre. Antes de ser procesadas las muestras de pacientes deben ser mezcladas rigurosamente a lo menos 20 veces, o en su defecto, por 3 a 5 minutos en un mezclador mecnico. La muestra debe ser procesada dentro de las 8 horas desde la toma de muestra, pero a 4 C se puede cuantificar hasta en un periodo de 27 horas. 2.4.4. Aseguramiento de la calidad Calibrador En el pasado algunos modelos de contadores hematolgicos requeran ser calibrados por el usuario para distinguir los glbulos rojos, blancos y plaquetas. Los actuales modelos incluyen la hemoglobina, recuentos y volmenes celulares. De todas maneras, se les debe contr olar la exactitud a travs de calibradores sanguneos. Los calibradores son comercializados por los mismos proveedores de equipos y traen registrado el intervalo de cada parmetros hematolgico. En su defecto, localmente con sangre preservada pueden ser preparadas por el laboratorio, procedimiento descrito en el documento WHO LAB/97.2. El recuento de eritrocitos y leucocitos debe ser cuantificado por mediciones repetidas usando pipetas calibradas para diluir la sangre en cmaras de recuento celular. Un nmero significativo de clulas deben ser contadas para obtener la distribucin del error a 2 %. En el caso de la hemoglobina, debe ser obtenida por un mtodo de referencia (ICSH, The International Council for Standardization in Haematology). La calibracin debe realizarse cuando el equipo es instalado, cuando se cambia algn repuesto y, con una periodicidad de a lo menos una a dos veces en el ao. 2.4.5. Procedimientos e instrucciones a) Los controles internos de sangre preservada pueden ser de produccin de laboratorio o comerciales, los cuales permiten evaluar la precisin y reproducibilidad de los equipos. Deben ser probados al inicio de la rutina de
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trabajo diario y graficar cartas controles de Levey Jennings para identificar errores sistemticos. b) Los factores que deben verificarse en el control de los equipos y reactivos son: fecha de vencimiento de los reactivos, estabilidad elctrica, permeabilidad de los drenajes, presin de vaco, identificar fugas a travs de los sellos, indemnidad de las tuberas y mantener niveles de reactivos y desechos. c) Es importante conocer el ruido electrnico y el material particulado del diluyente, se espera que los valores sean los siguientes: Recuento de glbulos rojos menor de 0.03 x 1012/L, Recuento de glbulos blancos menor de 0.04 x 10 9 /L, Hemoglobina menor de 0.2 g/L, Recuento de plaquetas menor de 5 x 109/L. d) Dependiendo de las instrucciones del proveedor el instrumento debe ser cebado con muestra fresca antes de iniciar la rutina diaria. e) En centros donde se procesen ms de 100 muestras debe realizarse un control diario de los parmetros absolutos, para detectar resultados fuera del rango establecido de las 2 desviaciones estndares. f) Mantener permeable la apertura de recuento celular con agua destilada para evitar el depsito de sales cuando no se utilice el equipo y, en el caso de obturacin se puede destapar con cepillo delgado efectuando flujos repetidos de diluyente. Cuando se trate de depsitos de protenas se debe mantener la apertura con una solucin de detergente (bao) u otra solucin recomendada por el proveedor. g) Registre las actividades de calibracin y control interno, mantencin de laboratorio, reparacin y repuestos, visita de servicio tcnico y mal funcionamiento. 2.4.6. Fuentes de error Las principales fuentes de error son las siguientes: mezcla insuficiente, dilucin errnea, error del volumen de la alcuota, fluctuacin del voltaje e inter ferencia con otro equipo, presencia de burbujas de aire, defecto en la aspiracin por fuga, prdida de vaco, apertura obstruida, contaminacin del diluyente, presencia de trazas de agente ltico o detergente, presencia de crioaglutininas, glbulos rojos fragmentados o extremadamente microcticos.
Entre las causas de una falsa trombocitopenia se encuentra la aglutinacin de plaquetas o bien que stas se encuentren en forma de satlite alrededor de glbulos blancos. Las plaquetas aglutinadas pueden observarse en el lado derecho del histograma correspondiente. Por otro lado, se debe confir mar con la observacin marginal del frotis sanguneo la presencia de plaquetas gigantes. Estas clulas exceden el tamao de los eritrocitos y aparecen a la derecha del histograma de las plaquetas o a la izquierda del histograma de glbulos rojos. Algunos instrumentos cuantifican la presencia de eritroblastos como linfocitos, simulando de esta manera recuento leucocitarios elevados. 2.4.7. Limitaciones del sistema Los contadores diferencian a eritrocitos, leucocitos y plaquetas, en general, clulas sanguneas no conductoras de electricidad que estn suspendidas en una solucin electroltica tamponada y que son pasadas a travs de un orificio, entre dos electrodos. La interrupcin de las clulas no conductoras modifican la carga elctrica produciendo un pulso. El nmero total y la amplitud de cada pulso es proporcional al recuento celular y volumen medido, respectivamente. Las limitaciones de este mtodo estn relacionadas con los tipos de partculas que se encuentran en el flujo; como condicin bsica: (a) Las partculas en estudio deben ser menos conductoras de electricidad que el medio en que estn disueltas y (b) El tamao de las partculas a medir deben estar entre el 2 y el 60 % del dimetro de la apertura. 2.4.8. Confiabilidad de los resultados En las distintas etapas del procesamiento de las muestras, la preanaltica, analtica y postanaltica debe validarse los resultados antes de emitir un informe: (a) Interrelacionar la condicin clnica del paciente, (b) Contrastar con el frotis sanguneo, (c) Relacionar con otros exmenes solicitados en el mismo laboratorio, (d) Trazabilidad del control de calidad, (e) Diferencia con exmenes anteriores del paciente. En este caso no debiera diferir para: hemoglobina en 2 g/dL, VCM en 6 fL, HCM en 5 pg, recuento de leucocitos de normal a anormal y de anormal a muy anormal, recuento de plaquetas en 50 %.
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2.4.9. Correlacin con frotis sanguneo El frotis sanguneo no siempre es solicitado con todos los parmetros que involucran a un Hemograma. Si el profesional citomorflogo requier e corr elacionar los valores hematimtricos y recalificar la fr mula diferencial, es necesario realizar la extensin para corroborar la hiptesis diagnstica. Las circunstancias en que se debe revisar el frotis son las siguientes: (a) solicitud del recuento sanguneo por primera vez con valores hematimtricos anormales, (b) semanalmente en pacientes oncolgicos, (c) visita de pacientes hematolgicos ambulatorios, (d) semanalmente en pacientes en radioterapia o quimioterapia, (e) pacientes neonatos o peditricos, (f) pacientes con linfoadenopata y hepatoesplenomegalia, (g) cuando el contador hematolgico presenta una alerta electrnica (asterisco) en algunos de los estimadores sanguneos. 2.5. Recomendaciones para la interpretacin del hemograma El subprograma de morfologa hematolgica del
Programa de Evaluacin Externa de la Calidad (PEEC) del Instituto de Salud Pblica (ISP) de Chile, ha acordado algunas recomendaciones para la interpretacin del hemograma en morfologa hematolgica de la lnea linfoide. An no han acordado el consenso para glbulos rojos, granulocitos y plaquetas. Respecto a la expresin cuantitativa y su relacin con adverbio de cantidad se recomienda: hasta 10% (escaso, leve, discreto, algunos), 10-30% (regular cantidad, moderada cantidad) y >30% (abundantes, relevante). El porcentaje de clulas caracterizadas de la serie blanca deben ser contadas respecto de la serie representada. Ejemplo, porcentaje de linfocitos con basofilia leve y citoplasma abundante, respecto del total de linfocitos. En la tabla 27-4 se indican las caractersticas citolgicas de consenso, para serie linfoide, establecidas por un grupo de expertos del subprograma de morfologa hematolgica (PEEC, ISP).
Tabla 27-4. Caractersticas citolgicas de consenso para serie linfoide para ser utilizadas en informes de hemograma Nomenclatura Equivalente
Densa, madura, compacta.
Cuadros hematolgicos
Consenso Tipo de cromatina

Cromatina madura Condensada
Leucemia prolinfoctica T y B, linfoma esplnico de clulas vellosas, leucemia de clulas plasmticas, linfoma centrofolicular, linfoma linfoplasmoctico, LLC, LLG, linfocito mediano, inmunocito. Linfoma esplnico de clulas vellosas, LLC, LLC de clulas B Leucemia de las clulas vellosas , LLA-L1 Linfoma de clulas grandes, linfoma de manto de clulas blsticas, sndrome de Richter, LLA-L3, linfoma linfoblstico B.
Grumosa
Condensada en grumos.
Homogneo Cromatina inmadura Laxa Reticular, semilaxa, finamente dispersa, fina, inmadura, granular Picntico, dispersa, algodonosa, punteada, hipercromtica, cuarteada, trazos lineales.
No recomendados Tipo de ncleo Formas regulares
Redondo
Redondeado, contorno regular, Leucemia de las clulas vellosas, variante de borde regular ovalado. leucemia de clulas vellosas, LLA-L3, LLC, LLAL1, normales, linfocitos reactivos.
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continuacin Tabla 27-4

Formas irregulares Indentado, hendico, clivado, Linfoma folicular, LLC atpica, leucemia de las escotado, fisurado, abollonado, clulas vellosas, mononucleosis infecciosa, lobulado. coqueluche. Arrionado Leucemia de clulas vellosas. Pleomrfico Bilobulado, foliado, plegado, Linfomas bifoliado, polimorfo. Cerebriforme Cerebroideo, circonvoluciones. Sndrome de Szary Multilobulado, en flor Flower cell, atrebolado, ptalos LLTA en flor , polilobulado. Pseudo pelger-huet Tipo pelger, pelgeroide SMD Polisegmentado Policitos, hipersegmentado SMDC Ovalado, boca de pez, plegado, serpentino, vesicular, en Leucemia de clulas plasmticas (mitosis) mitosis (anafase). Nuclolo nico (central o no). Mltiples nuclolos Varios nuclolos, muchos nuclolos 1 a 2 nuclolos 3 a 4 nuclolos Nuclolo pequeo Nuclolo grande Nuclolo prominente Leucemia prolinfoctica. LLA-L3, linfoma de clulas grande. Hendido
No recomendados Tipo de Nuclolo Cantidad
Tamao Visualizacin
No recomendados Relacin ncleo/ citoplasma Relacin Tipo de citoplasma Cantidad
LLA-L1. LMA, SMD. LLC LLA-L2 Linfoma de manto con caractersticas blsticas, sndrome de Richter, leucemia prolinfoctica B, linfoma difuso de clulas grandes B, LLA-L3 Nuclolo visible Evidente, notorio. LLA-L2 No visible Ausente, indistinguible, poco LLA, LLC, linfoma de manto, linfoma esplnico evidente (FAB), de clulas vellosas, linfocito normal, linfocito Escasamente visible. normal, inmunocito, linfocito reactivo. Muy pequeo, perifrico, no aparente, esbozo, bien delineado, distintivo, poco notorio, uno o ms notorios.
Relacin N/C alta (*) Relacin N/C baja (**) Escaso Regular cantidad Abundante Granulacin txica Vacuolado Agranular Hipogranular Cuerpos de dhle Grnulos azurfilos bastones de auer Regular Prolongaciones citoplasmticas Muy escaso Moderada cantidad Granulacin patolgica
LLA-L1, inmunocito LLA-L2, infecciones virales Linfoma linfoplasmoctico, LLC, linfoma de manto. LLA-L2 Linfocitosis B policlonal, tricoleucemia. Infecciones bacterianas LLA-L3 SMD SMD, leucemia promieloctica variante SMD LLG, leucemia agresiva de clulas tipo NK. LMA Leucemia de clulas vellosas, variante de Leucemia de clulas vellosas, linfoma esplnico de clulas vellosas. Linfocitos reactivos, tipo Downey
Inclusiones
Degranulado Grnulos, granulaciones
Forma
Borde irregular
Tipo bello y protrusin, vellosidades, proyecciones finas, proyecciones gruesas e irregulares. A specto ameboideo, monocitoides, fusiforme
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No recomendados No consensuados Apenas visible, con protrusiones, amplio vellos en los polos
Posicin del ncleo Ubicacin Central (no se informa) Excntrico No recomendados No consensuados Basofilia citoplasmtica Intensidad Centrocitoide en mitosis
Normal, LLA LLG, leucemia de clulas plasmticas, Linfocito reactivo. LLA
Ubicacin
No recomendados No consensuados Elementos celulares Indiferenciado Restos de gmprecht Blastos pequeos Blastos medianos Blastos grandes Linfoide Serie normal
Basofilia leve LLA-L1 Basofilia moderada Linfocitos reactivos Basofilia intensa Leucemia prolinfoctica T Reborde hiperbasfilo Perifrica, borde citoplasmtico, Linfocitos reactivos. contorno citoplasmtico. Basfilo, marcadamente basfilo, discreta, profunda. Borde hiperbasfilo, citoplasma hiperbasfilo LLA, LMA
Linfocito mediano Linfocito grande Linfoblasto Prolinfocito Linfocito reactivo Activado, virocito, atpico. Linfocitos tipo downey Inmunoblasto Inmunocito Plasmoblasto Plasmocito Serie normal Mieloblasto Promielocito Mielocito Juvenil Baciliforme Neutrfilo Eosinfilo Basfilo Monoblasto Promonocito
Linfocito pequeo 6 10 m 11 15 m 16 25 m
Caractersticas normales Linfocitosis reactiva Linfocitosis reactiva LLA LLC Virosis Mononucleosis infecciosa, hepatitis, herpes, toxoplasma, citomegalovirus. Hanta Hanta MM, leucemia linfoplasmoctica MM
Mieloide
12-15 Serie mieloide normal 15-20 m 16-25 m 12 a 18 m 10 - 15 m 12-14 m 12-14 m 12-14 m 10-13 m
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Eritroide Monocito Serie normal Proeritroblasto Eritroblasto basfilo Eritroblasto Policromtico Eritroblasto Ortocromtico Serie normal Megacarioblasto Promegacariocito megacariocito 15 a 30 glbulos rojos normales, 7 a 9 . 20-25 m 15-18 m 8 - 12 m 9-10 m plaquetas normales, 2 a 3 m 20-45 m 20-80 m 80 m o ms
Trombocitoide
(*) citoplasma ocupa < 20% de la superficie celular (**) citoplasma ocupa > 20 % de la superficie celular LLC, leucemia linftica crnica; LLA, leucemia linfoblstica aguda; LLTA, linfoma leucemia T del adulto; LMC, leucemia mieloide Crnica; SMD, sndromes mielodisplsticos; LLG, linfocito grande granular; MM, mieloma mltiple.
3. ESTUDIO DE MDULA SEA 3.1. Mielograma Adems del hemograma, el mielograma es un examen fundamental para realizar diagnstico de varias patologas hematolgicas. En el nacimiento, la mayora de los huesos tienen clulas hematopoyticas, luego las clulas adiposas comienzan a poblar la mdula sea y en los adultos solo el esqueleto axial y la parte proximal de los huesos largos mantienen capacidad hematopoytica. La obtencin de la muestra de mdula sea, su estudio micr oscpico, requier e pr eparacin especializada. El mielograma corresponde a un estudio citolgico cuantitativo y cualitativo de la mdula sea, la que es obtenida por aspiracin. El mielograma debe ser precedido por el informe de uno o ms hemograma(s) que justifiquen su realizacin. Indicaciones. Entre las indicaciones del mielograma se incluyen: Bicitopenia o pancitopenia, anemias refractarias, anemia macroctica, sndromes mieloproliferativos, leucemias agudas y sndromes linfoproliferativos crnicos. Lugar de toma de muestra. Considerando que la mdula sea se encuentra preferentemente en los huesos largos, los principales sitios de puncin, segn edad son los siguientes: (i) en nios menores de 2 aos se utiliza preferentemente el tercio superior de la cara interna de la tibia y la espina iliaca pstero-
superior y (ii) en nios mayores de 2 aos, jvenes y adultos se prefiere el esternn a la altura del segundo espacio intercostal y alternativamente las espinas iliacas antero y pstero-superior, o apfisis espinosa de las vrtebras lumbares 1era a 4ta. Puncin, aspirado y preparacin de los frotis. En la puncin se usa material estril; se desinfecta la zona a puncionar, luego se infiltra la piel y el periostio con un anestsico local (Ej: lidocaina al 2%). Posteriormente se inserta el trocar para mielograma; se retira el estilete y con una jeringa se aspira aproximadamente 0.5 mL. El contenido se vierte en un reservorio con solucin de EDTA para evitar la agregacin de las plaquetas y coagulacin sangunea; tambin puede colocarse directamente en varios portaobjetos. Luego se procede a preparar los frotis y teirlos como se describi para sangre perifrica. De ser necesario se separa una fraccin de la muestra para anlisis por citometra de flujo y/o estudio citogentico. Informe. El informe del mielograma incluye aspectos cuantitativos y citolgicos. El estudio cuantitativo incluye una estimacin de la celularidad, cantidad de megacariocitos, recuento diferencial de la serie granuloctica, recuento total de serie eritroblstica y serie agranuloctica. El estudio citolgico del mielograma se realiza con aumento menor (10x) e inmersin (100x). En el primer caso, el propsito es estimar la densidad celular (celularidad) y observar la cantidad de megacariocitos y eventual presencia de grupos de clulas metastsicas. La celularidad se debe estimar en base a la proporcin de clulas
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hematopoyticas versus las clulas adiposas. Un aspecto importante a observar con aumento menor es determinar si la celularidad es heterognea (diversidad de lneas celulares y estadios madurativos) u homognea (predominio de un solo tipo de clulas, Ej: leucemias agudas). La celularidad es diferente segn la edad del paciente, as en nios la mdula contiene pequeas cantidades de grasa y en adultos mayores puede llegar a un 50-70%. La observacin con aumento de inmersin
permite realizar el recuento diferencial de clulas y el estudio citolgico de las diferentes lneas celulares (serie granuloctica, con estadios madurativos; serie agranuloctica y serie eritroblstica). El recuento diferencial se realiza en > 300 clulas nucleadas. En adultos las proporcin mieloide:eritroide (M:E) es de 1.53.3. Los valores normales se muestran en la tabla 27-2.
Tabla 27-4. Valores normales en mdula sea Rango (%) Neutrfilos totales Mieloblastos Promielocitos Mielocitos Juveniles Baciliformes Segmentados Eosinfilos totales Mielocitos Juveniles Baciliformes Segmentados Basfilos y mastocitos Serie Eritrocitaria total Proeritroblastos Eritroblasto Basfilo Eritroblasto Policromtico Eritroblasto Ortocromtico Linfocitos Clulas plasmticas Monocitos Megacariocitos Clulas reticulares Razn mieloide:eritroide 49.2 65 0.2 1.5 2.1 4.1 8.2 15.7 9.6 27.6 9.5 15.3 6.0 12 1.2 5.3 0.2 1.3 0.4 2.2 0.2 2.4 0 1.3 0 0.2 18.4 33.8 0.2 1.3 0.5 2.4 17.9 29.2 0.4 4.6 11.1 23.2 0.4 3.9 0 0.8 0 0.4 0 0.9 1.5 - 3.3
El informe del mielograma debe incluir: (a) celularidad, (b) megacariocitos, (c) recuento diferencial (mieloblastos, promielocitos, mielocitos, juveniles, bacilifor mes y segmentados neutrfilos, eosinfilos, linfocitos, clulas plasmticas y eritroblastos), (d) indicar el sitio de puncin y cantidad de material medular obtenido, (e) breve comentario sobre los hallazgos cuantitativos y citolgicos de cada serie celular (serie granuloctica, serie agranulocitica, serie eritroblstica y serie megacarioctica); y (f) conclusin.
La muestra de mielograma se obtiene por aspirado medular. ste no permite informar sobre la estructura medular, ya que este tejido se disocia durante la aspiracin. El mielograma proporciona mayor infor macin sobre la citologa de las clulas en estudio. Antecedentes sobre las caractersticas del mielograma en las diferentes patologas hematolgicas se describen en los respectivos captulos en que stas son desarrolladas. Las caractersticas de la biopsia de mdula sea en
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patologas hematolgicas son descritas a continuacin. 3.2. Biopsia de mdula sea 3.2.1. Aspectos generales La biopsia de mdula sea corresponde al estudio histolgico del tejido medular hematopoytico obtenido mediante puncin sea dirigida, donde se analiza cuantitativa y cualitativamente las series celulares mieloeritroide, linfoide y megacarioctica, las caractersticas generales del estroma, la estructura del hueso que lo contiene y, eventualmente, se identifican fenmenos inflamatorios especficos e inespecficos y procesos infiltrativos exgenos o metastsicos. La biopsia medular proporciona informacin respecto a la densidad, topografa y constitucin celular del tejido hematopoytico. En relacin a toma de muestra y procesamiento tcnico, ver captulo 26. La tincin histolgica de rutina, en el procesamiento habitual de la muestra de mdula sea, es la hematoxilina-eosina (tincin corriente). Sin embargo, en caso necesario, se pueden efectuar tinciones histoqumicas
especiales, tales como: Van Gieson (fibras de colgeno), Gomori (fibras de reticulina), Azul de Prusia (hemosiderina), Rojo Congo (amiloide), Grocott (hongos), Zielhl Neelsen (bacilos cido alcohol resistentes), PAS (mucosustancias) y Giemsa (como complemento de la tincin Hematoxilina-eosina). De una muestra incluida en parafina se pueden obtener cortes para realizar tcnicas inmunohistoqumicas con anticuerpos monoclonales, particularmente tiles para: definir estirpes celulares y tipificacin de neoplasias (citoqueratinas, vimentina, antgeno leucocitario comn, etc.), determinar clonalidad de infiltrados linfoides (CD3, CD/20, kappa, lambda, etc.), identificar marcadores tumorales, oncopr otenas y factor es de proliferacin celular (CEA, alfafetoprotena, p53, Ki-67, etc.) e incluso, reconocer algunos microorganismos (citomegalovirus, bacilo de Koch, pneumocistis carinii, virus Epstein Barr, etc.). Para optimizar el rendimiento del examen bipsico e incrementar la certeza diagnstica del patlogo, los hallazgos histolgicos siempre deben correlacionarse con el cuadro clnico del paciente y los resultados del hemograma y mielograma. Las indicaciones de biopsia de mdula sea se indican en la tabla 27-5.
Tabla 27-4. Indicaciones de la biopsia de mdula sea por aguja Para precisar y/o definir diagnstico, cuando existe sospecha clnica de las siguientes condiciones: Procesos mieloproliferativos Procesos linfoproliferativos Mieloma de clulas plasmticas Anemia aplstica Metstasis Amiloidosis Enfermedades granulomatosas crnicas Enfermedades metablicas del hueso Enfermedades de depsito Alteraciones de los depsitos de hierro Para etapificar y evaluar respuesta a tratamiento en linfomas y leucemias. Cuando, habiendo realizado dos o ms punciones para mielograma, no se obtuvo muestra o sta fue insuficiente para poder realizar un informe adecuado. megacariocitos, (e) linfopoyesis, (f) porcentaje de eosinfilos, clulas plasmticas y mastocitos, (g) presencia de otras clulas:histiocitos, metastsicas, (h) contenido de hemosiderina, (i) alteraciones del estroma:fibrosis, necrosis,
Cuando se estudia la mdula sea mediante biopsia por puncin con aguja, se deben evaluar los siguientes parmetros: (a) celularidad, (b) relacin Mieloide/Eritroide, (c) maduracin de series mieloide y eritroide, (d) nmero de
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granulomas, y (f) anormalidades seas. 3.2.2. Mdula sea normal La mdula sea es una estructura mesenquimtica compleja, constituida por precursores hematopoyticos y elementos estr omales heterogneos. La clulas hematopoyticas, incluyendo granulocitos, monocitos, eritrocitos, linfocitos, plaquetas e histiocitos, son derivadas de clulas medulares multipotenciales (Stem-cells). Los elementos de sostn estn representados por clulas estromales (adipocitos, fibroblastos y clulas reticulares), vasos sanguneos, fibras nerviosas, pequeas cantidades de reticulina, matriz extracelular y citoquinas de regulacin. As constituida, la mdula hematopoytica se encuentra ocupando los espacios interseos o intertrabeculares del hueso. El tejido seo que la contiene, con su estructura de matriz calcificada y revestimiento osteoblstico y osteoclstico se organiza en hueso compacto y esponjoso. a) Distribucin de la mdula hematopoytica y celularidad La mdula sea puede ser mdula roja conteniendo clulas hematopoyticas o m d u l a amarilla representada predominantemente por tejido adiposo. La distribucin de la mdula hematopoytica es dependiente de la edad. En el neonato, las cavidades medulares de la mayora de los huesos estn casi completamente ocupadas por clulas hematopoyticas proliferantes y, a medida que el individuo crece, la mdula roja se contrae centrpetamente, siendo reemplazada por mdula adiposa. En la vida adulta, la mdula hematopoytica est confinada principalmente al esqueleto axial, esternn y pelvis. Adems, en repuesta a las demandas, el volumen medular ocupado por tejido hematopoytico se expande. Celularidad. La celularidad medular se define como el porcentaje de mdula sea ocupado por clulas hematopoyticas. Porcentaje de celularidad = rea medular total - rea ocupada por grasa. La celularidad de la mdula sea depende de la edad del paciente, localizacin en el esqueleto (sitio de toma de la muestra), tamao del espcimen tisular obtenido y, en menor medida, de factores tcnicos en el procesamiento
histolgico. La estimacin y determinacin de la celularidad en la biopsia de mdula sea puede realizarse subjetivamente, o bien mediante mtodos ms objetivos como histomorfometra o anlisis computarizado. En relacin a la edad, la mdula sea de los recin nacidos es extremadamente celular (90100%, con escasas clulas adiposas) y disminuye aproximadamente 10% por cada dcada de vida. Los individuos menores de diez aos tienen una celularidad alrededor de un 80%; esta cifra baja al 50% hacia los treinta aos, mantenindose relativamente estable hasta los setenta aos, en que disminuye a un 30%. El descenso del porcentaje de cavidad medular ocupado por clulas hematopoyticas es consecuencia tanto de una disminucin ver dadera en la cantidad de tejido hematopoytico como tambin de una prdida de sustancia sea y su reemplazo por tejido adiposo en los espacios medulares. En cuanto a la localizacin en el esqueleto, la cr esta ilaca contiene menos tejido hematopoytico que el esternn, pero ms que las costillas. La celularidad de las vrtebras lumbares es aproximadamente 10% mayor que la celularidad de la cresta ilaca. Las vrtebras son tambin ms celulares que el esternn. El tamao de la muestra es importante ya que muchas veces en un mismo espcimen de biopsia hay reas hipocelulares y reas de celularidad conservada, por lo cual se requiere una muestra representativa (ptimamente 1,5 cm de longitud y sin alteraciones dependientes de la mantencin y del traslado de la muestra). Con respecto al procesamiento tcnico, las muestras sometidas a descalcificacin e inclusin en parafina evidencian una celularidad aproximadamente 5% ms baja que aqullas embebidas en resinas plsticas. b) Clulas hematopoyticas normales La mdula hematopoytica normal consiste en una poblacin heterognea de clulas en difer entes estados de diferenciacin y maduracin, mientras la sangre perifrica contiene solamente clulas en estados de maduracin terminal. Una Stem-cell multipotencial da origen a todos los tipos de clulas mieloides: granulocitos y sus precursores, eritrocitos y sus precursores, macrfagos/monocitos y sus precursores, megacariocitos y sus precursores y mastocitos (ver captulos 1 y 2).
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La mdula sea normal contiene adems, en adicin a las clulas mieloides, pequeas cantidades de clulas linfoides (incluyendo clulas plasmticas) y clulas estromales, como ya se mencion anteriormente. A continuacin, para poder comprender e interpretar los procesos patolgicos primarios y secundarios que afectan la mdula, se describirn las caractersticas morfolgicas normales de cada una de las lneas celulares de diferenciacin hematopoytica en la Biopsia de mdula sea, recordando que las stemcells no son reconocibles histolgicamente. Serie eritroide El trmino eritroblasto incluye todos los precursores eritroides reconocibles, mientras el trmino normoblasto se aplica cuando la eritropoyesis es normoblstica. Durante el proceso de maduracin, la relacin ncleo / citoplasma disminuye, la cromatina nuclear se hace ms densa y picntica, el nuclolo aparece menos prominente, el citoplasma acumula hemoglobina (va perdiendo su basofilia) y finalmente la clula madura pierde su ncleo. Los eritroblastos se desarrollan en estrecha proximidad a un macrfago, creando imgenes conocidas como islas eritroides, correspondientes a varias generaciones concntricas de eritroblastos asociados a un macrfago, donde las clulas ms cercanas al macrfago son ms inmaduras que las perifricas. La eritropoyesis ocurre relativamente cer cana a los sinusoides medulares. En las secciones histolgicas, los precursores inmaduros son menos numerosos que los eritroblastos tardos. Existen algunas caractersticas tiles para distinguir precursores eritroides de otras clulas hematopoyticas, tales como: (a) islas eritroides conteniendo precursores de distinto tamao y diferente maduracin; (b) condensacin cromatnica homognea en eritroblastos tardos, a diferencia del aspecto granular de la cromatina en clulas linfoides; (c) distribucin cohesiva de los eritroblastos; (d) forma redondeada de los ncleos y (e) en eritroblastos tempranos, basofilia citoplsmica intensa con una pequea zona de tincin negativa adyacente al ncleo (Golgi). En los casos de rpida regeneracin medular o cuando la eritropoyesis es anormal (como ocurre por ejemplo en la mielodisplasia), se observa islas eritroblsticas con precursores en
un mismo estado de maduracin (clulas inmaduras). Serie granuloctica La serie granuloctica incluye neutrfilos, eosinfilos y lnea basfilo / mastocito. Existen al menos cuatro generaciones de clulas identificables entre el precursor granulocitomonocito (no reconocible morfolgicamente) y el granulocito maduro: mieloblasto, promielocito, mielocito y metamielocito. Durante el proceso de maduracin, la relacin ncleo / citoplasma disminuye (> del 20 % de citoplasma), la cromatina nuclear se hace ms densa y gruesa, los nuclolos aparecen menos prominentes y el citoplasma acumula grnulos lisosomales (primarios azurfilos) que ms tarde se tornan especficos (grnulos secundarios). Los mieloblastos son los primeros precursores granulocticos identificables histolgicamente. Se caracterizan por un tamao celular similar a un proeritroblasto (15-20 micrones), pero de forma ms irregular, tienen un ncleo grande redondo u oval localizado centralmente, cromatina fina dispersa y varios nuclolos. Aunque pueden contener grnulos citoplsmicos (tipos II y III), estas clulas generalmente se definen como carentes de granulacin. En el contexto de mielopoyesis anormal (leucemia mieloide aguda y sndromes mielodisplsticos), clulas primitivas con grnulos pueden ser aceptadas como mieloblastos. En la mdula sea normal, los mieloblastos son sobrepasados en nmero por los promielocitos y mielocitos. Los promielocitos son algo ms grandes que su clula antecesora (16-25 micrones), su ncleo es excntrico, a veces levemente indentado, el citoplasma es ms amplio, contiene abundantes granulaciones azurfilas y muestra un rea plida perinuclear (Golgi). Los mieloblastos son HLADR+ y pueden expresar CD-34, mientras que los promielocitos son negativos para HLA-DR y CD-34. Los mielocitos (12-18 micr ones) y metamielocitos (10-15 micrones) son clulas ms pequeas, con citoplasma abundante, cromatina densa, nuclolo indistinguible, ncleo progresivamente indentado y con granulaciones especficas. Clulas en banda (baciliforme) y clulas segmentadas (polimorfonucleares) representan el estado de maduracin terminal de la serie granuloctica. En el corte histolgico teido con Hematoxilina-eosina, los eosinfilos
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muestran ncleo bilobulado y grnulos eosinoflicos grandes y refrctiles, los neutrfilos evidencian polisegmentacin nuclear y grnulos suavemente eosinoflicos; los grnulos basoflicos son solubles en agua, por lo tanto los basfilos maduros no son identificables en especmenes de biopsia procesados en forma habitual (fijacin acuosa). Con respecto a la disposicin histolgica de los precursores granulocticos, los mieloblastos se encuentran en pequeo nmero principalmente a nivel paratrabecular o cercano a las arteriolas. A medida que se produce la maduracin, los precursores se ubican ms profundamente en los cordones hematopoyticos, pero lejos de los sinusoides. Cuando alcanzan el estado de metamielocito, se desplazan hacia los sinusoides, donde los granulocitos segmentados cruzan las paredes vasculares para entrar a la circulacin. Las clulas cebadas (mastocitos), ntimamente relacionadas con los basfilos, se diferencian de stos por sus caractersticas nucleares y la disposicin de sus grnulos. Los mastocitos son raros de ver en la mdula sea normal y difciles de reconocer en las secciones histolgicas teidas con Hematoxilina-eosina; sin embargo, son fcilmente identificables con tincin de Giemsa. Se distribuyen irregularmente en la cavidad medular, siendo ms numerosos cerca del endostio, en relacin con la adventicia de pequeos vasos sanguneos y en la periferia de agregados linfoides. Serie monoctica Monocitos y macrfagos se derivan de un precursor comn con los granulocitos. Los monoblastos son clulas ms grandes que los mieloblastos y, junto a los promonocitos, son difciles de identificar en los cortes histolgicos. Los promonocitos maduran a monocitos, los cuales migran hacia la sangre perifrica. Los monocitos se reconocen histolgicamente como clulas de ncleo lobulado ms grandes que los neutrfilos y, en individuos normales, slo pequeo nmero de ellos se distribuye al azar en la mdula. Los monocitos maduran a macrfagos tanto en la mdula como en otros tejidos. Los macrfagos se identifican como clulas grandes de distribucin irregular en la mdula sea, presentan un ncleo pequeo (a veces no visible segn el plano de corte) y abundante citoplasma, en ocasiones con detritus de
fagocitosis. Algunos macrfagos se encuentran asociados a eritroblastos, clulas plasmticas o ndulos linfoides. Serie megacarioctica Los megacariocitos (grupos II y III) se derivan de un proceso madurativo de endomitosis continua de los megacarioblastos (megacariocitos grupo I). Los megacariocitos son las clulas ms grandes de la mdula sea normal, tienen citoplasma abundante y ncleo lobulado. Se encuentran en los cortes histolgicos asociados con los sinusoides y distantes de las trabculas seas, a veces muestran figuras mitticas y, en ocasiones, pierden su citoplasma (ncleo desnudo). Es importante recordar que los megacariocitos individuales son muy grandes (30-160 micrones), por lo cual un slo plano de corte no permite una adecuada valoracin del tamao celular y del grado de lobulacin nuclear. Morfolgicamente, los megacariocitos tambin pueden evidenciar imgenes de emperipolesis (seudofagocitosis de otras clulas hematopoyticas). Cuando la hematopoyesis es normal, los megacariocitos no forman grupos de ms de 2 3 clulas; as, grandes agregados de megacariocitos slo se observan bajo condiciones anormales (mdula regenerativa, post-quimioterapia, trasplante de mdula sea). Junto a esto, la disposicin paratrabecular de estas clulas slo se identifica en hematopoyesis anormal. La cuantificacin de megacariocitos puede realizarse mediante conteo por unidad de rea o subjetivamente (nor males, disminuidos o aumentados en nmero). Linfopoyesis Los linfocitos, similar a otras clulas hematopoyticas, se derivan de Stem-cell multipotenciales. La mdula sea contiene clulas maduras y clulas precursoras de ambas lneas linfoides (T y B). Las primeras clulas linfoides identificables morfolgicamente son los linfoblastos, caracterizados por elevada relacin ncleo/citoplasma (< de 20 % de citoplasma), cr omatina dispersa, ncleo redondo u oval, uno a dos nuclolos y fino margen citoplsmico basoflico no granular. Los linfocitos maduros son levemente ms grandes que los eritrocitos y se caracterizan por escaso citoplasma, ncleo redondeado, cromatina densa y nuclolo inconspicuo. Histolgicamente, la mdula sea normal contiene linfocitos intersticiales dispersos y, a veces, pequeos agregados o folculos
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linfodeos. Aproximadamente 10% de las clulas medulares son linfocitos, con una relacin LT/LB de 6:1. Los linfocitos suelen concentrarse alrededor de vasos arteriales, cercano al centro de los cordones hematopoyticos. Clulas plasmticas Los plasmocitos representan el producto madurativo terminal de la lnea linfoide B. Estas clulas se caracterizan por un ncleo excntrico de cromatina granular (en rueda de carreta) y abundante citoplasma basoflico con una prominente zona Golgi paranuclear. La mdula sea normal contiene clulas plasmticas intersticiales dispersas, preferentemente localizadas pericapilares y, a veces, asociadas con macrfagos. c) Composicin celular de la mdula sea y relacin mieloide/eritroide El trmino mieloide puede ser usado con dos significados diferentes. Primero, para referirse a todas las clulas derivadas de la Stem-cell mieloide (incluyendo las series eritroide, granuloctica, monoctica y megacarioctica); o bien, para indicar solamente la lnea granuloctica/monoctica (como en la expresin mieloide-eritroide). Histolgicamente, la mdula sea normal contiene, en pr omedio 60% de clulas granulocticas, 20% de clulas eritroides, 10% de linfocitos, 1-4% de clulas plasmticas y pequeos por centajes de otras clulas hematopoyticas, siendo el conteo de megacariocitos de 7-15 clulas por mm2. La relacin mieloide/eritroide (M/E) normal es de 1,5/1 a 3/1. Cuando la biopsia es celular y la relacin M/E es menor de 1,5/1 se habla de hiperplasia eritroide. Las causas ms frecuentes son: anemia hemoltica, anemia megaloblstica, hemorragia crnica, policitemia, eritroleucemia,etc. La hipoplasia eritroide se encuentra en casos de toxicidad por drogas, infecciones virales, irradiacin, hipoplasia idioptica y otras. 3.2.3. Alteraciones estructurales y anormalidades morfolgicas en la biopsia de mdula sea. a) Alteraciones generales Desviaciones patolgicas de la celularidad a) Mdula sea hipocelular. Exceptuando edad avanzada, se considera hipocelular cuando la
mdula tiene una celularidad menor a 20-25%. b) Mdula sea hipercelular. Exceptuando individuos menores de diez aos, se considera hipercelular cuando la mdula tiene una celularidad mayor a 75-80%. Puede haber disminucin o proliferacin de algunas o todas las series celulares. Causas de mdula sea hipocelular: Idioptica, congnita, exposicin a txicos, medicamentos, irradiacin, anemia refractaria, infecciones crnicas, mielofibrosis, hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN), otras. Causas de mdula sea hipercelular: leucemias, reacciones leucemoides, sndromes mieloproliferativos, procesos linfoproliferativos, sndromes mielodisplsticos, anemia hemoltica, otras. Fibrosis La fibrosis de la mdula sea es un fenmeno relativamente comn en asociacin con una amplia variedad de condiciones patolgicas. Puede ser de dos tipos: aumento del Retculo y aumento del colgeno (detectada mediante tincin de reticulina y tincin tricrmica, respectivamente). La fibrosis puede aparecer como un proceso difuso, por ejemplo en la mielofibrosis primaria, o bien ser focal y en par ches, como en las metstasis. Su cuantificacin se grada de 0 a 4 +. La fibrosis colgena representa una etapa tarda de mayor compromiso. La mayora de los individuos hematolgicamente nor males tiene una reticulina de grado 0 a 1, aunque ocasionalmente algunos sujetos pueden tener un grado 2. Los principales procesos patolgicos que evidencian fibrosis medular son: Sndromes mieloproliferativos crnicos, metstasis de carcinoma, linfoma de Hodgkin, granulomas y enfermedad renal crnica. Necrosis Las condiciones patolgicas ms frecuentemente asociadas con necrosis de la mdula sea son: leucemias, metstasis, infecciones por bacterias Gram negativas, tuberculosis y efecto quimioterpico. La causa primaria de la necrosis medular es la isquemia, de tal forma que las secciones histolgicas muestran necrosis coagulativa o fibrinoide.
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Granulomas Los granulomas son colecciones de histiocitos epitelioides, con o sin clulas gigantes multinucleadas, con o sin necrosis, frecuentemente rodeados por linfocitos y plasmocitos. Las principales causas de granulomas en la mdula son: tuberculosis miliar, sarcoidosis, brucelosis, infecciones fngicas, mononucleosis infecciosa y linfomas. Ciertas condiciones pueden simular granulomas, tales como: metstasis de carcinoma, linfoma de clulas grandes y agregados de mastocitos. Amiloidosis El amiloide es un depsito hialino amorfo extracelular que puede encontrarse en casos de: amiloidosis primaria, enfermedad inflamatoria crnica y gammapatas monoclonales. La tincin de Rojo Congo es muy til para su identificacin histolgica. Metstasis Las lesiones metastsicas frecuentemente se asocian con grados variables de fibrosis y pueden evidenciar reas de necr osis. Habitualmente son osteolticas pero puede haber reaccin osteoblstica, especialmente en casos de carcinoma prosttico, mamario o renal. La extensin del compr omiso medular metastsico flucta entre mnima infiltracin focal (micr ometstasis) a un completo reemplazo de la mdula sea por clulas tumorales. El estudio inmunohistoqumico ayuda a detectar y tipificar estas lesiones. La biopsia es ms efectiva que el mielograma en la deteccin de metstasis. Transformacin gelatinosa Consiste en la acumulacin medular de cido hialurnico (material gelatinoso), frecuentemente asociado con involucin grasa e hipoplasia de mdula sea. Este fenmeno puede ser confundido con necrosis, amiloidosis o edema. El material gelatinoso reacciona positivamente con las tinciones de PAS y Alcian Blue. Cambios post-quimioterapia e irradiacin Consisten en acentuada hipocelularidad, edema y dilatacin vascular, necrosis, fibrosis variable e incremento del nmero de macrfagos.
Depsitos de hierro El hierro es almacenado en macrfagos de la mdula sea como hemosiderina (agregados insolubles) y menos abundantemente como ferritina (soluble). La tincin histoqumica de Perls es una de las ms utilizadas para identificar hemosiderina. Los depsitos de hierro se cuantifican como ausentes, disminuidos, normales o aumentados. Las enfermedades asociadas con aumento de los depsitos de hierro son: anemias hemolticas y megaloblsticas, anemia de las enfermedades crnicas, anemia sideroblstica, hemosiderosis y hemocromatosis. La disminucin de los depsitos de hierro puede observarse asociada con la HPN. b) Biopsia de mdula sea en enfermedades hematolgicas especficas Sndromes mielodisplsticos Celularidad: aumentada; ocasionalmente puede ser normo o hipocelular. Serie eritr oide: mor fologa anor mal, principalmente cambios megaloblsticos y, en frotis, presencia de sideroblastos en anillo. Serie granuloctica: aumento de for mas inmaduras (porcentaje de blastos inferior al 5%), hiper o hipogranulacin citoplsmica, hiper o hiposegmentacin nuclear. Megacariocitos: aumentados, presencia de formas atpicas, micromegacariocitos. Alteraciones de la topografa celular. Fundamentalmente presencia de agregados de mieloblastos y promielocitos en el centro del tejido medular, lejos de estructuras vasculares y de la superficie endostal del hueso trabecular (Localizacin Anor mal de Precursores Inmadur os-ALIP). Adems, se observa disposicin peritrabecular de clulas eritroides y megacariocitos. Cambios en el estroma. Fibrosis focal o difusa, presencia de edema y clulas inflamatorias. Cambios mielodisplsticos, similares a los sndr omes mielodisplsticos, han sido observados en varias condiciones tales como endocrinopata, enfermedades autoinmunes y VIH SIDA. Sin embargo, estos cambios displsticos no son clonales y por lo tanto no se asocian con alteraciones citogenticas.
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La clasificacin morfolgica de los sndromes mielodisplsticos se basa fundamentalmente en el porcentaje de blastos en la mdula y sangre perifrica; tipo y grado de displasia; presencia de sideroblastos en anillo. Leucemia mieloide aguda La mdula sea es hipercelular, con un 20 % o ms de blastos de linaje no linfoide. Con tincin de Giemsa se evidencian los blastos, ya que el nuclolo se hace prominente y el citoplasma se observa celeste. No se identifican elementos maduros de la serie blanca. Los promielocitos anormales en la leucemia promieloctica aguda, los monoblastos y promonocitos en la leucemia monoctica aguda y los megacarioblastos en la leucemia megacarioctica aguda son considerados equivalentes blsticos para los propsitos de establecer un diagnstico de Leucemia Mieloide Aguda. Los eritroblastos no son incluidos en el conteo de blastos. Los megacariocitos y la serie roja estn marcadamente disminuidos. Ocasionalmente, la mdula puede ser normo o hipocelular pero, hay incremento de los blastos, sin evidencia de maduracin de la serie blanca. Enfermedades mieloproliferativas crnicas En las enfermedades mieloproliferativas crnicas (leucemia mieloide crnica, mielofibrosis idioptica crnica, policitemia vera, tr ombocitemia esencial) la mdula es fundamentalmente hipercelular, con marcado aumento del retculo y, en algunos casos fibrosis colgena. Los megacariocitos estn aumentados y pueden ser nor motpicos o atpicos dependiendo de la entidad especfica. Leucemia mieloide crnica (granuloctica). La biopsia de mdula sea es hipercelular debido principalmente a incremento de neutrfilos y sus precursores. Se observa maduracin de la serie mieloide con numerosos granulocitos segmentados. La relacin M/E es de 10:1 o ms. Tambin estn aumentadas las for mas inmaduras de la serie blanca y, en algunos casos, el revestimiento paratrabecular formado por precursores granulocticos inmaduros alcanza un espesor de 5-10 clulas (en contraste a los 2-3 estratos celulares observados normalmente). Sin embargo, el conteo de blastos es menor a 10% (ms de 10% indica transformacin a una fase acelerada). Los eosinfilos pueden estar sustancialmente incrementados en algunos pacientes. Los megacariocitos estn
frecuentemente aumentados, pero pueden ser nor males en nmero o estar levemente disminuidos. La mor fologa de los megacariocitos habitualmente es normotpica, pero muchas veces son ms pequeos y con ncleo hipolobulado. La serie eritroide est disminuida. Mielofibrosis idioptica crnica. Se caracteriza morfolgicamente por proliferacin de clulas granulocticas y megacariocticas maduras e inmaduras en la mdula sea, asociado a fibrosis medular de grado variable. As, los cambios histolgicos varan desde una panhiperplasia hasta un cuadro de reemplazo de los elementos medulares por fibrosis. En las fases tempranas de la enfermedad (estado prefibrtico), la mdula sea es hipercelular, con significativo aumento del nmer o de neutrfilos y abundantes megacariocitos marcadamente atpicos. Aunque existe una cierta desviacin a izquierda de la granulopoyesis, los Clusters de mieloblastos no son significativos (menos de 5-10%). Los megacariocitos atpicos se disponen en la vecindad de trabculas seas y sinusoides, la fibrosis reticulnica es mnima o ausente. En la fase tarda (estado fibrtico), se observa prominente fibrosis reticulnica y colgena con marcada hipocelularidad representada por aislados focos de clulas mieloides inmaduras y megacariocitos atpicos. Caractersticamente, se observa aumentado nmer o y dilatacin de sinusoides con hematopoyesis intrasinusoidal. Raras veces, en esta fase, la mdula puede ser hiper o normocelular. La serie eritroide est muy disminuida. Policitemia vera. La celularidad medular est aumentada (rango de 35-100%), con una proliferacin eritroide, megacarioctica y granuloctica (pan mielosis). La relacin M/E es de 1:1 en favor de la serie roja. Los megacariocitos son atpicos, la eritropoyesis es nor moblstica y la granulopoyesis es morfolgicamente normal. El porcentage de mieloblastos no est aumentado. La combinacin de hiperplasia eritroide y abundantes megacariocitos atpicos es caracterstica. Los depsitos de hemosiderina estn disminuidos o ausentes y el retculo est siempre aumentado. En la policitemia secundaria, la hiperplasia eritroide se acompaa de series granuloctica y megacarioctica normales. Trombocitemia esencial. La mdula sea es moderadamente hipercelular, caracterizada por
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una proliferacin de megacariocitos maduros, grandes a gigantes y levemente atpicos. Las series granuloctica y eritroide estn habitualmente disminuidas y no presentan alteraciones de maduracin. Enfermedades linfoproliferativas de linaje T y B Linfoma linfoblstico/Leucemia linfoblstica aguda (FAB - L1, L2 y L3). La mdula sea se encuentra extensamente infiltrada por linfoblastos en una distribucin difusa o intersticial, infrecuentemente en parches o focal, acompandose de una marcada reduccin en la hematopoyesis normal. Los blastos linfoides son clulas inmaduras habitualmente monomorfas, de ncleo ovoide vesiculoso, cromatina fina, nuclolo prominente y escaso citoplasma. Para su correcta tipificacin es necesario el mielograma. La tincin del cido Perydico Schif f (PAS) es la tcnica histocitoqumica ms comnmente utilizada como complemento diagnstico de esta neoplasia, sin ser especfica. Los linfoblastos por lo general evidencian grnulos citoplsmicos PAS positivos. El estudio inmunofenotpico es muy importante para el correcto diagnstico entre los marcadores ms estudiados se encuentran CD3, CD5, CD10, CD19, IgC, IgS y TdT (ver captulos 14 y 30) Leucemia linfoctica crnica/ Linfoma de clulas maduras. Las Leucemias Linfoides Crnicas son el resultado de una proliferacin monoclonal de linfocitos de aspecto maduro. La mayora de estas leucemias son del tipo B. Los linfocitos neoplsicos son tpicamente pequeos, con escaso citoplasma, ncleo redondo, cr omatina densa y nuclolo inconspicuo. Los prolinfocitos son un componente frecuente, pero no exceden el 10% de las clulas tumorales. El compromiso medular es usualmente intersticial o difuso, pero un pattern nodular tambin puede ser observado. La infiltracin linfomatosa de la mdula sea habitualmente se presenta en forma de ndulos en las reas paratrabeculares. Sin embargo, en ocasiones el compromiso es difuso (como se observa en las leucemias), en estas circunstancias, el diagnstico diferencial entre leucemia y linfoma debe hacerse clnicamente. La biopsia es un excelente mtodo para detectar compromiso medular por linfoma, sta no debe utilizarse para la subclasificacin histolgica de las neoplasias linfoides, en estos casos es menester realizar biopsia de un linfonodo compr ometido. Los linfocitos maduros expresan los siguientes marcadores
de anticuerpos monoclonales: CD19 +, CD20 +, CD 22 dbil, CD23 +, CD38 -/+ y CD5 +, adems expresin de IgS con monoclonalidad. Tricoleucemia. Es una neoplasia de clulas linfoides pequeas de tipo B que compromete mdula sea y sangre perifrica. Las clulas vellosas son de tamao pequeo a mediano con ncleo ovoide, redondo o indentado, cromatina dispersa homognea (menos densa que la de linfocitos normales), ausencia de nuclolo y citoplasma relativamente abundante con bordes celulares prominentes y halo claro perinuclear (imagen en huevo frito). El pattern de infiltracin medular es difuso o intersticial, las clulas se disponen separadas entre s, rodeadas por una fina pero bien constituida malla de reticulina. En ocasiones, el compromiso de la mdula puede ser en par ches, per o sin configurar agregados nodulares. La mdula es normo o hipercelular. Los tricoleucocitos expresan los siguientes marcadores de anticuerpos monoclonales (inmunofenotipificacin): CD19 intenso, CD22, CD79b y FMC-7 medio, adems CD11c, CD25 y CD103. La expresin IgS es asimismo intensa. Son CD5 y CD23 negativos. Neoplasias de clulas plasmticas (Mieloma mltiple). El Mieloma de clulas plasmticas corresponde a una proliferacin monoclonal neoplsica de plasmocitos y linfocitos plasmacitoides con compromiso multifocal de la mdula sea. El diagnstico diferencial con otras neoplasias de clulas plasmticas debe hacerse mediante una combinacin de hallazgos patolgicos, radiolgicos, clnicos y de laboratorio. En la mdula sea, ms de un 5% de clulas plasmticas se considera plasmacitosis; en estos casos, los plasmocitos son morfolgicamente normales y se ubican de preferencia en los espacios perivasculares. Como criterio mayor, para el diagnstico de Mieloma se requiere ms de un 30% de clulas plasmticas. Las clulas neoplsicas muestran grados variables de displasia, desde clulas plasmticas morfolgicamente muy similares a las normales, hasta clulas plasmacitoides atpicas y multinucleadas o francamente blsticas. El patrn de infiltracin medular puede ser: a) intersticial; b) nodular o en bandas gruesas; y c) difuso (mdula completamente reemplazada). Pueden observarse, adems, cuerpos eosinoflicos de Russell (intracitoplasmticos) y de Dutcher (intranucleares). Alteraciones adicionales incluyen: aumento del retculo, infiltrados linfoide, hipervascularizacin y, a veces,
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presencia de granulomas. Los cambios seos descritos son osteoporosis difusa y lesiones lticas. La plasmacitosis medular en el rango de 10-30%, como criterio diagnstico menor, debe asociarse con otros hallazgos (radiolgicos y clnicos) para confir mar Mieloma. Con propsitos pronsticos, un informe de biopsia medular con diagnstico de Mieloma debe incluir: (a) Extensin de la infiltracin (estado histolgico), (b) patrn de infiltracin y (c) caractersticas citolgicas de las clulas neoplsicas (grado histolgico). Un importante nmero de enfer medades se asocia con plasmacitosis medular reactiva; por ejemplo, sndromes autoinmunes, hipergammaglobulinemia, cirrosis heptica, etc. Las clulas plasmticas expresan el siguiente inmunofenotipo: CD38, antgeno de clulas plasmticas, una minora expresa CD10, HLA-DR y CD20. Linfoma de Hodgkin. Se describen cambios reactivos de la mdula sea asociados con Enfermedad de Hodgkin linfoganglionar, tales como: hipercelularidad (hiperplasia granuloctica), aumento de macrfagos y clulas plasmticas, eritropoyesis disminuida y megacariocitos normales o incrementados. La infiltracin medular por Linfoma de Hodgkin ocurre en 5-15% de los pacientes no tratados, siendo ms frecuente en hombres, en individuos de mayor edad y en aquellos casos de subtipo histolgico desfavorable. La biopsia de mdula sea es fundamental para la etapificacin del Linfoma de Hodgkin (ya que la puncin para mielograma a menudo resulta en blanco). El diagnstico de compromiso medular se basa en el hallazgo de clulas de Reed Sternberg o variantes mononucleares, en el marco de un estroma fibroso, con abundantes fibroblastos, y pr opor ciones variables de linfocitos normotpicos, eosinfilos, neutrfilos y clulas plasmticas. La fibrosis est siempre presente y vara de leve a intensa. El patrn de infiltracin por lo general es difuso, pero puede ser focal. La celularidad habitualmente est aumentada. La identificacin de clulas de Reed Sternberg en la mdula no es indispensable si el diagnstico se ha hecho previamente en biopsia de linfonodo. La subclasificacin de la Enfermedad de Hodgkin no puede hacerse sobre la base de histologa medular. En la actualidad, las tcnicas inmunohistoqumicas y la citometra de flujo no slo constituyen un
importante complemento en el estudio de las malignidades hematolgicas, sino que muchas veces stas son esenciales para un adecuado diagnstico en linfomas y leucemias. El inmunofenotipo clsico es: CD19, CD20, CD22, CD74, CDw75, CD45RA y LCA. LECTURAS SUGERIDAS Atlas de Hematologa. Nagoya University, School of Medicine. Department of Medicine. The Branch Hospital. December, 1996. Bain, B.J., Clark, D.M., Lampert, I.A., Wilkins, B.S. Bone marrow pathology. third edition. blackwell science, 2001. Fourcade, C.H. et al. Reticulocyte Analysis Provided by the Coulter GEN.S: Significance and Interpr etation in Regenerative and Nonregenative Hematologic Conditions. Laboratory Hematology 5:153-158, 1999. Guas Tcnico-Metodolgicas Laboratorios Clnicos. Ministerio de Salud. Series Minsal 03: Guas Metodolgicas. Divisin de salud de las Personas; 1: 22-23, 1998. Naeim, F. Atlas of bone marrow and blood pathology. W.B. Saunders co., 2001. Recommendations for Reference Method for Haematology in Human Blood (ICSH Standard 1995) and Specifications for International Haemiglobincyanide Standard (4th edition). Journal of Clinical Pathology; 49: 271-4, 1996. Sans Sabrafen, J. Hematologa Clnica. 4 edicin, Harcourt, caps.14,18, 2002. Stone, R., Harrison: principios de medicina interna. Mc Graw Hill.15a edicin, 2002. pp. 835-850 Wittels, B. Surgical pathology of bone marrow. core biopsy diagnosis. Major problems in pathology. vol 17, W.B. Saunders co.,1985. World Health organization classification of tumours. Pathology and genetics: tumours of haematopoietic and lynphoid tissues, 2001.
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HEMATOLOGA
Captulo
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ESTUDIO DE LABORATORIO DE ANEMIAS NUTRICIONALES

Ivn Palomo G., Fernando Pizarro A., Manuel Olivares G., Miguel Arredondo O., Marcelo Alarcn L. y Gonzalo Pombo V.
1. Introduccin 2. Mtodos de laboratorio para estudio de las anemias hipocromas 2.1. Etapas de la deficiencia de hierro 2.2. Diagnstico de laboratorio de la deficiencia de hierro 2.3. Diagnstico diferencial 3. Estudio de laboratorio de las anemias megaloblsticas 3.1. Estudio de anemia megaloblstica 3.1.1. Hemograma 3.1.2. Mielograma 3.1.3. Bioqumica srica 3.1.4. Vitamina B12 y cido flico 3.1.5. Prueba teraputica 3.2. Pruebas para diagnstico de anemia perniciosa 3.2.1. Endoscopa con biopsia duodenal 3.2.2. Anticuerpos anti-factor intrnseco 3.2.3. Pruebas de Shilling 3.3. Otras pruebas
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RESUMEN
Las anemias nutricionales (dficit de hierro; dficit de vitamina B12 o cido flico) requieren del laboratorio para su diagnstico y control de tratamiento. En este captulo se describen las pruebas de laboratorio utilizadas en el diagnstico de la anemia ferropriva (ej. Hierro srico y ferritina srica) y anemia megaloblstica (ej. mielograma, nivel srico de las vitaminas involucradas).
1. INTRODUCCIN Las caractersticas de las anemias ferropriva y megaloblstica fueron descritas en los captulos 6 y 7, respectivamente. El diagnstico diferencial de las anemias microcticas hipocromas (entre las que se encuentra la anemia ferropriva) y de las anemias macrocticas (entre las que se ubica la anemia megaloblstica), requiere un importante apoyo de laboratorio. En este captulo, primero se abor da el diagnstico diferencial de las anemias hipocromas, destacndose la utilidad de las pruebas que son fundamentales en el diagnstico de anemia ferropriva: hierro srico, capacidad total de combinacin de hierro por la transferrina (TIBC), saturacin de transferrina y ferritina srica. Posteriormente se muestran las pruebas que son usadas en el diagnstico de las anemias megaloblsticas: hemograma, mielograma, nivel srico de vitamina B12 y cido flico, y otras pruebas. 2. MTODOS DE LABORATORIO PARA ESTUDIO DE LAS ANEMIAS HIPOCROMAS La anemia hipocroma se observa en el dficit de hierro, talasemia, enfermedades crnicas, saturnismo y anemia sideroblstica. La deficiencia de hierro es la principal causa de anemia en la poblacin mundial. Esta deficiencia afecta a los lactantes y adolescentes debido a sus mayores requerimientos determinados por
el crecimiento; y a mujeres en edad frtil por la prdida de hierro debido al sangrado menstrual o a las mayores necesidades de este mineral por el embarazo. 2.1. Etapas de la deficiencia de hierro La anemia ferropnica se define como el descenso de la concentracin de la hemoglobina en sangre secundaria a una disminucin de la concentracin de hierro en el organismo, ya sea por un aporte insuficiente, un aumento del consumo o a un exceso de las prdidas. El desarrollo es progresivo y se realiza a travs de varias etapas (figura 28-1). Primero ocurre un agotamiento de los depsitos de hierro que se caracteriza por una reduccin de la ferritina srica por debajo de lo normal (deficiencia latente de hierro o deplecin de los depsitos). Al progresar el dficit se compromete el aporte de hierro a los tejidos (eritropoyesis deficiente en hierro) que se caracteriza en forma precoz por un aumento de la concentracin srica del receptor de transferrina, presentndose ms tardamente una reduccin de la saturacin de la transferrina y un aumento de la protoporfirina libre eritrocitaria. En esta etapa ya se aprecia una reduccin de la sntesis de hemoglobina, sin embargo su concentracin an no cae por debajo del lmite normal. Finalmente se llega a la etapa ms severa de la deficiencia en la cual se constata una anemia microctica e hipocroma. Habitualmente en la deficiencia de hierro de origen nutricional la anemia es leve (excepto en el prematuro), de modo que ante anemias moderadas o severas se debe pensar en otras causas que lleven al dficit de hierro, tales como malabsorcin, sangrado crnico, etc.
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Figura 28-1. Etapas de la deficiencia de hierro.
Las principales causas de anemia ferropnica se describen en la tabla 28-1.
Tabla 28-1. Causas de deficiencia de hierro Disminucin de los depsitos de hierro al nacer Prematuros, gemelos, ligadura precoz del cordn, hemorragias perinatales Aporte insuficiente Dieta con bajo contenido de hierro Baja biodisponiblilidad del hierro de la dieta Sndromes de malabsorcin Diarrea crnica o a repeticin Giardiasis masiva Prdidas aumentadas Hemorragias ocultas o evidentes (patologa intestinal, ginecolgica, etc.) Parsitos hematfagos Aumento de requerimientos Crecimiento Embarazo 2.2. Diagnstico de laboratorio de la deficiencia de hierro Para el diagnstico de la deficiencia de hierro se cuenta con una serie de pruebas de laboratorio. Se dispone de un grupo de anlisis sencillos de realizar y de bajo costo los que se utilizan en la pesquisa de esta patologa y otros ms complejos y ms costosos que se emplean para su confirmacin. Entre los primeros se encuentran la medicin de la hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio y prueba teraputica. Los exmenes
confirmatorios incluyen las mediciones de la saturacin de la transferrina, protoporfirina libre eritrocitaria, receptor de transferrina srico y ferritina srica e intraeritrocitaria. La medicin de la concentracin de hemoglobina es un examen que se puede realizar en una muestra sangunea capilar o venosa. Este parmetro mide la ltima etapa de la carencia de hierro y su especificidad va a depender de la prevalencia del dficit de este mineral en la poblacin o grupo a estudiar. La superposicin que existe entre los valores
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normales y anormales de hemoglobina es un hecho a considerar en la interpretacin de este examen. El hematocrito, si bien es ms simple de realizar, es algo menos sensible que la hemoglobina en la deteccin de anemia. El volumen corpuscular medio para que tenga valor debe ser medido con un contador electrnico de eritrocitos. Se puede realizar en una muestra sangunea capilar o venosa. Cabe sealar que en el recin nacido y embarazada existe una macrocitosis fisiolgica. La microcitosis no es exclusiva de la deficiencia de hierro, tambin se puede apreciar en otras condiciones en las que existe un defecto de la hemoglobinizacin de los precursores eritroides (talasemia, infeccin o inflamacin crnica, intoxicacin plmbica, anemias sideroblsticas, etc.). Al comenzar el descenso en la concentracin de hemoglobina en la deficiencia de hierr o puede que no se aprecie la microcitosis. En los contadores electrnicos de eritrocitos ms avanzados se pude cuantificar el ancho de la distribucin del volumen de los eritrocitos (RDW: Red Distribution Width), el que se encuentra aumentado en algunas variedades de anemias, entre ellas la ferropriva. La prueba teraputica certifica la existencia de la anemia ferropriva. Esta es una prueba fcil de realizar a escala individual, pero difcil en el mbito poblacional. Consiste en administrar hierro medicinal en una dosis teraputica (3-5 mg/kg de hierro elemental en nios y 80 mg diarios en adultos, fraccionado en dos dosis) durante un mes. Se considera que la prueba es positiva cuando el aumento de la concentracin de hemoglobina es igual o superior a 1 g/dl. Una prueba positiva indica que el sujeto es verdaderamente anmico ferroprivo, incluso a pesar que pueda tener una hemoglobina dentro de los lmites normales. Una prueba negativa, siempre que el sujeto haya recibido el hierro en dosis y tiempo adecuados, indica la inexistencia de una anemia ferropriva, no excluyendo una deficiencia de hierro en una etapa previa a la anemia. Una opcin es la de administrar una dosis de hierro polimaltosato (100 mg) o hierro sorbitex (600 mg), por va IM, valorando el pico reticulocitario entre el 7mo 10mo da. Otras posibilidades son que el sujeto sea nor mal a pesar de tener una hemoglobina levemente disminuida o corresponder a una anemia de otro origen. La protoporfirina libre eritrocitaria aumenta cuando existe una disminucin del hierro disponible en el eritroblasto para combinarse
con la protoporfirina y formar el hem, es por ello que se eleva en la eritropoyesis deficiente en hierro. Al contar con hematofluormetros esta medicin es sencilla de realizar, bastando para su determinacin una gota de sangre, por lo que se puede realizar en una muestra capilar. Valores aumentados se encuentran tambin en la intoxicacin plmbica y en la anemia de la inflamacin/infeccin aguda y crnica. Las mediciones del hierro srico, TIBC y saturacin de la transferrina se utilizan frecuentemente como exmenes de confirmacin de la deficiencia de hierro. El TIBC constituye una medida de la cantidad de transferrina cir culante, pr otena que normalmente se encuentra saturada en un tercio de su capacidad. Estos parmetros requieren de una macro muestra sangunea obtenida en ayunas y en material libre de minerales. Por otra parte el hierro srico y saturacin de la transferrina presentan una gran variabilidad, existiendo importantes fluctuaciones diarias (ciclo circadiano) e inter-das. En la eritropoyesis ferropnica ocurre una disminucin del hierro srico y un aumento de la transferrina, lo que determina que en esta condicin exista una reduccin de la saturacin de la transferrina. En la infeccin/inflamacin aguda o crnica se encuentran disminuidos el hierro srico, TIBC y saturacin de la transferrina. Por otra parte una reduccin del TIBC se encuentra en el kwashiorkor, sndrome nefrtico y enteropata perdedora de protenas. Recientemente se encuentra disponible la cuantificacin del nivel srico del receptor de transferrina, parmetro que ya se altera en la deficiencia tisular de hierro incipiente. Estudios en adultos han demostrado que este parmetro tiene una alta sensibilidad y especificidad en la deteccin de la deficiencia de hierro. Un estudio reciente en lactantes ha demostrado que su sensibilidad no es tan alta como en el adulto si bien posee una gran especificidad. En el mercado, existen varios kits para su medicin los que tienen valores que no son comparables hasta que no se disponga de un estndar internacional de referencia. Este parmetro se eleva en la deficiencia de hierro y en la hiperplasia eritroide que es un acompaante de algunas anemias como la hemoltica. La gran limitacin de esta medicin es su elevado costo y su gran ventaja es que no se altera en los procesos infecciosos/inflamatorios agudos o crnicos. En condiciones normales circula una pequea
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cantidad de ferritina en el plasma que se cuantifica por medio de una tcnica de ELISA. Su concentracin es directamente proporcional al contenido de hierro de los depsitos y slo se encuentra reducida en la deficiencia de hierro. Sin embargo, la ferritina srica es un reactante de fase aguda por ello aumenta en la inflamacin/infeccin aguda o crnica. Tambin se encuentra aumentada en la necrosis heptica. Se estima que existe una deplecin de los depsitos de hierro cuando la ferritina desciende bajo 10 ug/L en el nio y de 12 ug/L en el adulto. En sujetos con infeccin/inflamacin una ferritina mayor de 50 ug/L descarta la existencia de una deplecin de los depsitos de hierro.
Ciertos parmetros de laboratorio tales como la hemoglobina, hematocrito y volumen corpuscular medio (tabla 28-2), saturacin de la transferrina, protoporfirina libre eritrocitaria, ferritina srica (tabla 28-3) y receptor de transferrina, experimentan modificaciones con el desarrollo, condicin que deben ser tenida en cuenta. La hemoglobina presenta variaciones durante el embarazo y en la altitud. En sujetos que viven en la altura los valores de referencia se deben incrementar a partir de los 1000 metros. Tambin se debe realizar una correccin en los individuos fumadores.
Tabla 28-2. Lmites inferiores normales para hemoglobina (Hb), hematocrito (Hto) y volumen corpuscular medio (VCM) Edad Hb Nacimiento 1 mes 2 meses 3 meses 0,5-1,9 aos 2-4 aos 5-7 aos 8-11 aos 12-14 aos Mujer Hombre 15-17 aos Mujer Hombre 18-49 aos Mujer Hombre Embarazada 1er trim. 2 trim. 3er trim. Hto (g/dL) 13,5 10,7 9,4 9,5 11,0 11,0 11,5 12,0 12,0 12,5 12,0 13,0 12,0 14,0* 11,0** 10,5** 11,0** VCM (%)
(fL)
33 34 35 36 36 37 36 38 37 40
70 73 75 76 78 77 79 78 80 80
* Lmites propuestos por CDC 13,5 g/dL y OMS 13,0 g/dL ** Lmites propuestos por OMS
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Tabla 28-3. Lmite inferior normal para ferritina srica (FS) y saturacin de la transferrina (Sat Tf), y lmite superior normal para protoporfirina eritrocitaria libre (PLE). Edad 6 - 12 meses 13 - 24 meses 2 - 6 aos 7 - 12 aos Adultos
GR, glbulos rojos
FS (g/L) 10 10 10 10 12
Sat Tf (%) 9 9 9 11 16
PLE (g/dL GR) 120 100 80 70 70
Las pruebas de laboratorio confirmatorias se emplean para la deteccin de la deficiencia de hierro: (a) antes de la aparicin de la anemia, y (b) para la confirmacin de la etiologa ferropriva especialmente en estudios poblacionales, y en el mbito individual cuando no se obtuvo una respuesta teraputica satisfactoria, al igual que si existen dudas de la etiologa ferropriva de la anemia. Como la sensibilidad y especificidad de los indicadores de laboratorio en la valoracin del estado frrico difieren considerablemente, el dficit de hierro puede detectarse ms precisamente en estudios poblacionales usando una batera de exmenes. En la seleccin de los exmenes a utilizar se debe considerar el tipo de muestra sangunea (capilar o venosa), equipamiento y facilidades de laboratorio, rapidez deseada de obtencin de los resultados, costo y prevalencia de la carencia de hierro. Tambin deben considerarse en esta seleccin, la existencia de otras condiciones que puedan complicar el diagnstico. Como criterio para el diagnstico de anemia ferropriva se exige una reduccin de la Hb (o Hto) junto con una prueba teraputica positiva, o una reduccin de la hemoglobina sumado uno o ms de los otros exmenes de laboratorio alterados. Para el diagnstico de deficiencia de hierro sin anemia se exige Hb (o Hto) normal sumado a dos o ms de los otros exmenes de laboratorio alterados. Deplecin de los
depsitos de hierro se diagnostica cuando existe slo una FS bajo el lmite normal. 2.3. Diagnstico diferencial En el diagnstico diferencial de la anemia ferr opriva se deben considerar otras condiciones. Muy importantes por su prevalencia, en ciertos perodos del ciclo vital, son los procesos inflamatorios/infecciosos agudos o crnicos. Estos cuadros se pueden acompaar de una anemia, microctica (si son crnicos), disminucin del hierro srico, TIBC, Sat Tf, aumento de la PLE y de la FS. En las infecciones/inflamaciones agudas estas alteraciones pueden persistir hasta 3 semanas despus de resuelto el proceso. La talasemia menor es una patologa ms frecuente de lo que se piensa. Esta se caracteriza por una anemia microctica hipocroma con un ancho de distribucin de los eritrocitos, PLE, Sat Tf y FS normales. La intoxicacin plmbica, segn su severidad, se asocia a anemia microctica, con punteado basfilo de los eritr ocitos y protoporfirina libre eritrocitaria muy elevada. Cabe recordar la posibilidad de una falsa anemia, debido a que el lmite inferior de lo normal de la concentracin de hemoglobina corresponde a 2 desviaciones estndar del promedio encontrado en una poblacin normal, y por tanto es posible encontrar un 2,5% de sujetos normales por debajo del lmite recomendado para definir anemia (tabla 28-4).
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Tabla 28-4. Diagnstico diferencial de anemias hipocromas Anemia Ferropriva Talasemia Enfermedades crnicas N Intoxicacin plmbica N N N Anemias sideroblsticas crnicas N N N
Ferritina srica Receptor transferrina Saturacin transferrina Protoporfirina libre eritrocitaria
N No N N
3. ESTUDIO DE LABORATORIO DE LAS ANEMIAS MEGALOBLSTICAS Las anemias megaloblsticas tienen en comn una alteracin en la sntesis del DNA por carencia de vitamina B12 y/o cido flico, con la consiguiente falla en la maduracin y multiplicacin de las clulas hematopoyticas, dando lugar a alteraciones morfolgicas y funcionales de los glbulos rojos, leucocitos y plaquetas (ver captulo 7). La vitamina B12 se obtiene de productos animales (carne, leche y derivados) y el cido flico, principalmente de los vegetales verdes, carnes rojas poco cocidas, y cereales. A continuacin se describen, brevemente, las principales pruebas de laboratorio que son utilizadas en el diagnstico de las anemias megaloblsticas: 3.1. Estudio de anemia megaloblstica 3.1.1. Hemograma
En el frotis sanguneo generalmente se observa anisocitosis, macrocitosis, poiquilocitosis e inclusiones citoplasmticas (cuerpos de Howell Jolly, punteado basfilo y anillos de Cabot). Con respecto a los glbulos blancos, generalmente se observan neutrfilos hipersegmentados (ncleo con ms de cinco lobulaciones). Se debe tener en consideracin que no todas las anemias macrocticas, tienen caractersticas de megaloblsticas. 3.1.2. Mielograma La muestra de aspirado de mdula sea (ver captulo 26), permite observar las caractersticas citolgicas de la mdula sea (mielograma). En los pacientes con anemia megaloblstica la mdula sea se caracteriza por presentar aumento de la densidad celular e hiperplasia eritroblstica con alteraciones de maduracin ncleo-citoplasmticas. Adems la serie granuloctica y megacarioctica, generalmente presenta normalidad cuantitativa pero con alteraciones citolgicas. 3.1.3. Bioqumica srica
En el hemograma, adems de la presencia de anemia macroctica (VCM: >100 fL), se puede observar leucopenia con presencia de granulocitos de mayor tamao, as como tambin trombocitopenia con presencia de macroplaquetas. La caracterstica de anemia arregenerativa que presenta la anemia megaloblstica al momento del diagnstico (sin tratamiento) se puede comprobar con el ndice reticulocitario (ver captulo 27).
La enzima lctico deshidrogenasa (LDH) aumenta en los pacientes con anemia hemoltica y en la eritr opoyesis ineficaz o muerte intramedular por la liberacin de la LDH intraeritrocitaria. La bilirrubina con predominio de la forma indirecta puede estar aumentada por un incremento del catabolismo de la hemoglobina. La hormona estimulante de la glndula tiroides (TSH) se debe cuantificar para descartar patologa tiroidea.
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3.1.4. Vitamina B12 y cido flico Ante la sospecha de anemia megaloblstica se determina la concentracin de cobalamina (vitamina B 12) y folato srico. Adems es recomendable cuantificar el folato intraeritrocitario; ste no se altera por la dieta o hemlisis de la muestra. Los valores normales de la vitamina B12 srica oscilan entre 200 y 900 pg/mL, los de folato srico entre 2,5 a 20 ng/ mL y los de folato intraeritrocitario entre 93641 ng/mL. En la determinacin de los niveles sricos de vitamina B12 y cido flico se han utilizado mtodos con base microbiolgica y radioinmunoensayo; actualmente se utiliza ELISA de fase slida. 3.1.5. Prueba teraputica En caso de no contar con la metodologa diagnstica (punto 3.1.4) puede realizarse la denominada prueba teraputica. Esta consiste en la administracin de dichos co-factores, pero una por vez, y observar la aparicin de un pico reticulocitario entre el da 3-5 despus de la inyeccin. Se indica cianocobalamina (1.000 ug) va intramuscular; en caso que no se observe el pico reticulocitario, se administra acido flico (15 mg), por la misma va, valorndose dicho pico en un lapso similar. 3.2. Pruebas para diagnstico de anemia perniciosa 3.2.1. Endoscopa con biopsia duodenal. La presencia de gastritis atrfica con ausencia de clulas parietales y principales junto a metaplasia intestinal es caracterstico de la anemia per niciosa. Se puede encontrar aclohidra con elevacin del pH gstrico entre 6.8-7.2, tras la administracin de histamina. 3.2.2. Anticuerpos anti-factor intrnseco Para pesquisar los anticuerpos anti-Factor intrnseco el mtodo ms utilizado es ELISA de fase slida. Brevemente, en pocillos de poliestireno se fija el factor intrnseco (FI); luego para evitar uniones inespecficas se bloquea con albmina bovina. Se agrega el suero del paciente, luego se agrega un anticuerpo antiIgG humana conjugada con fosfatasa alcalina y posteriormente el sustrato. La reaccin da positiva en los pocillos cuyo suero del paciente presenta autoanticuepos anti-FI de isotipo IgG. Este ensayo es sensible y bastante especfico. Otros anticuerpos que se detectan en un alto
porcentaje en pacientes con anemia perniciosa, pero cuya especificidad es baja, ya que pueden estar presentes en otras enfer medades autoinmunes, son los siguientes: anticuerpos anti-clulas parietales, anticuerpos anti-tiroideos y anticuerpos anti-msculo liso. 3.2.3. Prueba de Shilling Esta es una prueba clsica, pero dada la dificultad para realizarla no se utiliza en la prctica clnica. La prueba de Schilling mide la absorcin de vitamina B12 radiactiva en presencia y ausencia de factor intrnseco. Es muy til para establecer el diagnstico en pacientes que han sido tratados y estn en remisin clnica, pero en los que existen dudas respecto a la validez del diagnstico. La prueba se realiza mediante la administracin por va oral de vitamina B12 marcada radiactivamente, seguida al cabo de 16 horas de una dosis de refuerzo parenteral (1.000 mg de B12) para evitar el depsito heptico de la B12 radiactiva. A continuacin se determina el porcentaje de material radiactivo en la orina de 24 horas (valor normal >9% de la dosis administrada). Una excrecin urinaria reducida (<5% si la funcin renal es normal) indica una disminucin de la absorcin de vitamina B12. Esta prueba (Schilling I) puede repetirse (Schilling II) empleando cobalto radiactivo unido a factor intrnseco de origen porcino. La correccin de una excrecin previamente reducida sugiere que la ausencia de factor intrnseco es el mecanismo fisiopatolgico responsable de los valores bajos de vitamina B12 radiomarcada. Finalmente, la incapacidad para corregir la excrecin indica un mecanismo de malabsorcin gastrointestinal (ej. esprue). 3.3. Otras pruebas Homocistena (Hy) plasmtica La homocistena es un aminocido sulfurado presente en el plasma. Un 70% se encuentra formando parte de protenas y el resto, libre. La homocistena es requerida para la sntesis de DNA; folato y vitamina B12, actan como cofactores, para la conversin de homocistena en metionina. Aproximadamente el 96% de los casos de dficit de vitamina B12 y el 91% de los casos de dficit de folatos cursan con hiperhomocisteinemia y homocistinuria. Sin embargo, la especificidad de la determinacin es baja. La homocisteina adems puede aumentar en deterioro de la funcin renal,
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algunas neoplasias, en ciertos tratamientos con drogas, al igual que en tiroideopatas. La muestra de sangre para la determinacin de homocistena plasmtica debe ser tomada en ayunas, puesto que sus niveles pueden ser influenciados por los alimentos, especialmente protenas y vitaminas. La muestra debe ser enviada de inmediato al laboratorio, ya que los glbulos rojos siguen liberando homocisteina in vitro, por lo que debe separarse rpidamente el plasma, el cual puede congelarse a -20C hasta la realizacin del ensayo. Para la determinacin de la homocistena se ha usado suero o plasma, utilizando la forma libre o la unida a protenas, en general las metodologas para la medicin de homocistena pueden agruparse en aquellas que: (a) generan Hy libre reduciendo los puentes disulfuro con agentes reductores, (b) separan la Hy de otros compuestos que poseen grupos tioles mediante cromatografa (cromatografa lquida de alta resolucin o por cromatografa gaseosa capilar), (c) utilizan una deteccin electroqumica para su cuantificacin (espectrofotometra de masa o la fluorimetra), y determinan Hy mediante el uso de anticuerpos monoclonales (ELISA). cido metilmalnico La deficiencia tisular de vitamina B12 ocasiona aciduria metilmalnica y pr opinica (cetoacidosis metablica); en consecuencia este ensayo permite confirmar su dficit en el suero. Es una prueba muy sensible y especfica; pesquisa precozmente los cambios en los niveles de vitamina B12. Este anlisis permite realizar el diagnstico en caso de sospechar valores falsos negativos, sobre todo en los ancianos, de los que el 5-10% tienen valores sricos de B12 normales a pesar de los indicios de deficiencia tisular. Un valor normal de cido metilmalnico, con una cifra elevada de homocistena es diagnstico de dficit de folato. La vitamina B12 y la enzima metilmalnico CoA mutasa son necesarias para la conversin de metilmalonil CoA a succinil CoA. Si existe dficit de vitamina B 12 , el cido metilmalnico comienza a acumularse rpidamente en suero y orina. Los niveles se miden por una tcnica espectrofotomtrica. Complejo de transcobalamina II-vitamina B12 Se trata de un anlisis poco habitual; consiste en
identificar un equilibrio negativo de vitamina B12 cuando el complejo transcobalamina II-vitamina B12 es menor de 40 pg/ml (<30 pmol/l). Test de supresin de deoxiuridina Se trata de una prueba altamente sensible, que detecta dficit subclnicos, en el cual se utilizan clulas de mdula sea. La mayor desventaja de esta prueba es que requiere de aspirado medular. Determina la deficiencia de N5,N10metilenFH4. En condiciones normales, la deoxiuridina que se incorpora al dUMP impide la incorporacin de timidina marcada al dTMP y posteriormente al DNA, lo cual no ocurre en caso de deficiencias de folato o vitamina B12. Las deficiencias se detectan al existir correccin, luego de agregar al cultivo, folato y/o vitamina B12. LECTURAS SUGERIDAS Anemias hipocromas Center for Disease Control. CDC criteria for anemia in children and childbearing-age women. M.M.W.R. 38:400-404, 1989. Dallman, P.R. Laboratory diagnosis of iron deficiency in infants and children. Annales Nestl. 53:8-14, 1995. Ferguson, B.J., Skikne, B.S., Simpson, K.M., Baynes, R.D., Cook, J.D. Serum transferrin receptor distinguishes the anemia of chronic disease from iron deficiency anemia. J. Lab. Clin. Med. 19:385-90, 1992. Olivares, M., Walter, T., Cook, J.D., Hertrampf, E., Pizarro, F. Usefulness of serum transferrin receptor and serum ferritin in diagnosis of iron deficiency in infancy. Am. J. Clin. Nutr . 72:1191-1195, 2000. Yip, R., Johnson, C., Dallman, P.R. Age-related changes in laboratory values used in the diagnosis of anemia and iron deficiency. Am. J. Clin. Nutr. 39:427-436, 1984. Anemias megaloblsticas Chui, C.H., Lau, F.Y., Wong, R., Soo O.Y., Lam, C.K., Lee, P.W., Leung, H.K., So, C.K., Tsoi, W.C., Tang, N., Lam, W.K., Cheng, G. Vitamin B12 deficiencyneed for a new guideline. Nutrition 17(11-12):917-20, 2001.
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HEMATOLOGA
Captulo
29
ESTUDIO DE LABORATORIO DE LAS ANEMIAS HEMOLTICAS

Ivn Palomo G., Marcela Vsquez R., Marcelo Alarcn A., Mnica Maldonado R. y Leonor Armanet B.
1. Introduccin 2. Anemias hemolticas intracorpusculares 2.1. Membranopatas 2.1.1. Esferocitosis Hereditaria 2.1.2. Hemoglobinuria paroxstica nocturna 2.2. Enzimopatas 2.2.1. Dficit de Glucosa fosfato deshidrogenasa (G6PD) 2.2.2. Dficit de Piruvato kinasa (PK) 2.3. Globinopatas 3. Anemias hemolticas extracorpusculares 3.1. Anemias hemolticas inmunes 3.1.1. Anemias hemolticas aloinmunes 3.1.2. Anemias hemolticas autoinmunes 3.2. Anemias hemolticas no inmunes
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RESUMEN
Las anemias hemolticas representan un grupo diverso de anemias regenerativas. En general son normocticas-normocromas y desde el punto de vista fisiopatolgico se les clasifica en intra y extracorpusculares. En este captulo se describen los aspectos fundamentales de las pruebas de laboratorio utilizadas en el diagnstico de las anemias hemolticas ms frecuentes de cada grupo. A modo de ejemplo, entre las anemias hemolticas intracorpusculares se mencionan las pruebas que permiten realizar diagnstico de Esferocitosis hereditaria y entre las anemias hemolticas extracorpusculares se describen las pruebas para establecer el diagnstico de anemias hemolticas inmunes.
1. INTRODUCCIN Las anemias hemolticas son un grupo heterogneo de anemias, que se caracterizan por ser regenerativas. Desde el punto de vista fisiopatolgico se les agrupa en anemias hemolticas intracorposculares y extracorpusculares (ver captulo 8). Las anemias regenerativas, se caracterizan por presentar un ndice reticulocitario aumentado (>3) (ver captulo 27). Si bien pueden incluirse las anemias hemolticas y secundarias a hemorragias no crnicas, este captulo solo se referir a las primeras. El volumen corpuscular medio (VCM) es generalmente normal, pero si la reticulocitosis es muy marcada puede haber leve macrocitosis. Igualmente si la hiperactividad medular consume y agota las reservas de cido flico se producir macrocitosis. En casos de talasemia y anemia con presencia de esferocitos puede haber microcitosis. Ante una anemia cuyo mecanismo presuntamente es de un tipo hemoltico, se deben contestar dos preguntas: (a) Existe hemlisis? y (b) Cul es la causa de la hemlisis?. Respecto a lo primero, los siguientes son signos de hemlisis: Reticulocitosis, disminucin de la haptoglobina libre en sangre, aumento de la
LDH en la sangre, hemoglobinuria sin hemates en el sedimento, clulas con hemosiderina en el sedimento urinario e ictericia (con bilirrubina indir ecta predominante). Respecto a lo segundo, se requiere realizar pruebas de laboratorio especficas, las que se describiran brevemente en los puntos 2 y 3 de este captulo, segn se trata de pruebas utilizadas en el diagnstico de anemias hemolticas intra y extracorpuscular, respectivamente. En algunos casos de anemias hemolticas los glbulos rojos presentan ciertas caractersticas (poiquilocitosis) que pueden orientar al diagnstico. 2. ANEMIAS HEMOLTICAS INTRACORPUSCULARES Las anemias hemolticas intracorpusculares se clasifican en membranopatas, enzimopatas y hemoglobinopatas (ver captulo 8). A continuacin se describen brevemente las pruebas diagnsticas para las patologas ms frecuentes de cada tipo. 2.1. Membranopatas 2.1.1. Esferocitosis hereditaria El frotis de sangre perifrica de los pacientes portadores de Esferocitosis hereditaria (EH) se caracteriza por la presencia de esferocitos en el contexto de una anemia regenerativa.
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Los esferocitos generalmente tambin estn presentes en las anemias hemolticas inmunes, es por ello que se debe realizar un diagnstico diferencial con la Prueba de antiglobulina humana (Prueba de Coombs; ver punto 3.1), la que se presenta negativa en el caso de EH. Fragilidad osmtica. La prueba ms utilizada para el diagnstico de la EH es la Fragilidad osmtica de los glbulos rojos, la cual mide la capacidad de los glbulos rojos de aumentar su volumen cuando son sometidos a soluciones hipotnicas de NaCl. Debido a que los esferocitos tienen una relacin superficie/ volumen disminuida, tienen una menor capacidad para aumentar su volumen y se lisan a una concentracin de sales ms elevada que las clulas normales. La sensibilidad de esta prueba puede incrementarse con la preincubacin de las clulas a 37C. Autohemlisis y Prueba de glicerol. Se han sealado otras modificaciones de la prueba de fragilidad osmtica; entre stas est la autohemlisis, la cual determina la hemlisis de los glbulos rojos incubados sin glucosa en condiciones estriles y la prueba del glicerol, pero ninguna de ellas parece ser ms sensible que la fragilidad osmtica incubada. Ectacitometra osmtica. La introduccin de la ectacitometra, que cuantifica la deformabilidad de los eritrocitos por la medicin de la fuerza que induce la elongacin de la clula, permiti el desarrollo de la ectacitometra osmtica, la cual parece ser la prueba ms sensible en la actualidad. Sin embargo, esta tcnica solo est disponible en laboratorios especializados. Electroforesis en gel de poliacrilamida. El anlisis de las protenas de la membrana eritrocitaria en electroforesis de poliacrilamida con SDS (PAGE-SDS) se utiliza para determinar la presencia o ausencia de las protenas. Biologa molecular. El estudio molecular ha permitido identificar un nmero importante de mutaciones en distintas protenas de la membrana eritrocitaria. Para un diagnstico adecuado de la EH es importante realizar un estudio familiar. 2.1.2. Hemoglobinuria paroxstica nocturna La Hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN) es una forma de membranopata adquirida, a
diferencia de la EH que es hereditaria. La HPN se explica por la disminucin o ausencia de pr otenas reguladoras del sistema del complemento como por ejemplo CD55, CD59 (ver captulo 8). El diagnstico se basa en diferentes pruebas: a) Pruebas serolgicas El diagnstico de la HPN se basa en pruebas ser olgicas especiales que detectan la sensibilidad de los glbulos rojos a la lisis mediada por el sistema del complemento, activado por la va alterna. Test de Ham: El fundamento de esta prueba lo constituye la susceptibilidad de los eritrocitos HPN a la lisis por complemento en suero humano acidificado. Su eficacia es limitada, porque puede dar resultados falsos negativos por el efecto de transfusiones previas, y falsos positivos en la anemia diseritropoytica congnita tipo II o HEMPAS. Prueba de la sucrosa: La base de esta prueba es la fijacin del complemento mediante la disminucin de la potencia inica del medio, lo que provoca la hemlisis exagerada de los eritrocitos HPN. Este examen es sensible, pero poco especfico. b) Identificacin de los defectos proteicos de la membrana celular La demostracin de glbulos r ojos y/o granulocitos carentes de pr otenas de membrana ligadas a glicerol fosfatidil inositol (GPI) mediante el uso de anticuerpos monoclonales (anti-CD55 y anti-CD59) utilizando citometra de flujo, es la mejor forma de diagnosticar la HPN. Este mtodo es sensible y especfico, puede informar sobre la proporcin de poblaciones celulares anormales. 2.2. Enzimopatas 2.2.1. Dficit de Glucosa deshidrogenasa (G6PD) fosfato
La enzimopata ms frecuente es una deficiencia congnita en la actividad de la G6PD. La G6PD cataliza la primera reaccin de la va de las pentosas-fosfato y su rol en el eritrocito es metablico por su potencial reductivo. Reduce la nicotinamida adenina dinucletidico (NADP) generando NADPH y oxidando la glucosa 6 fosfato (G6P), manteniendo as los
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grupos sulfidrilos y ayuda a detoxificar radicales libres y perxidos. Para diagnosticar el dficit de G6PD existen pruebas de laboratorio, tanto rutinarias como especficas. a) Hematolgicas. Se observan concentraciones de hemoglobina entre 3 a 4 g/dl, excentrocitos (presentan un desplazamiento de la hemoglobina hacia uno de los extremos). Cuerpos de Heinz. La oxidacin de la hemoglobina da lugar a la formacin de cuerpos de Heinz, que se descubren en la tincin supravital, como la del violeta de genciana. b) Qumicas: Se observa un aumento de hemoglobina, bilirrubina plasmtica y urobilingeno urinario y fecal, disminucin de haptoglobina, hemoglobinuria y hemosidenuria. c) Cuantificacin de la actividad enzimtica. Para el diagnstico definitivo existen tcnicas como: ensayo enzimtico cuantitativo que es la medida de la actividad enzimtica en el hemolizado en UI por gramo de hemoglobina (rango normal: 4.6 - 13.5 UI/gHb), prueba de fluorescencia, prueba de reduccin de metahemoglobina, prueba de ascorbato-cianide y electroforesis. d) Biologa molecular. Las mutaciones pueden ser estudiadas por mtodos de biologa molecular. 2.2.2. Dficit de Piruvato kinasa (PK) La PK es la enzima que cataliza una de las etapas ms importantes de la gluclisis transformando el fosofenolpiruvato (PEP) a piruvato, proceso en que se produce una molcula de ATP. Para diagnosticar que existe un dficit de PK hay distintas pruebas de laboratorio, tanto rutinarias como especficas. Entre las pruebas rutinarias estn: a) Hematolgicas. Se puede encontrar concentracin de hemoglobina entre 6 a 12 g/ dL, reticulocitocis, moderada macrocitosis (VCM: 98-105 fL), disminucin de la vida media eritr ocitaria, considerable nmero de equinocitos, ausencia de esferocitos circulantes y fragilidad osmtica normal. b) Qumicas. Se observa un aumento moderado de bilirrubina no conjugada, 2,3 DPG y PEP, y disminucin de haptoglobinemia, de ATP, de
lactato y de piruvato. c) Cuantificacin de la actividad enzimtica. Para el diagnstico definitivo existen tcnicas como: ensayo enzimtico cuantitativo que es la medida de la actividad enzimtica en el hemolizado en UI por gramo de hemoglobina (rango normal: 11.1-18.9 UI/gHb) test de fluorescencia y autohemlisis. d) Biologa molecular. La determinacin de las distintas mutaciones de PK se realiza a travs de tcnicas moleculares. 2.3. Globinopatas Electroforesis de la hemoglobina. Este mtodo es muy til en el estudio de las hemoglobinopatas. Permite pesquisar Hb A, HbA2, Hb F, Hb S, Hb C, etc. As por ejemplo para el diagnstico de la anemia drepanoctica, se realiza la electroforesis de hemoglobina usando hemolizado de sangre perifrica. La corrida electrofortica se realiza en acetato de celulosa (pH 8,6 a 9,2) por 30 minutos de 250 a 300 voltios. Despus de revelar y decolorar la tira se observa las diferencias de movilizaciones de las hemoglobinas de la sangre. Cuando la hemoglobinopata no se acompaa de cambios en la carga elctrica, no presentan alteracin electrofortica; a modo de ejemplo ello ocurre en algunas hemoglobinas inestables. Test de falsifor macin. Se basa en la desoxigenacin de la sangre in vitro cuando se pone en contacto con un agente reductor (metabisulfito de sodio) y por lo tanto los glbulos rojos adquieren la forma falciforme. Es un mtodo poco sensible que se ha usado en estudios poblacionales como screening. Hb F (Elucin cida Kleihauer). Usando este mtodo que somete los glbulos rojos a pH cido, la Hb A es eluida de los hemates, en cambio la Hb F se mantiene en el interior de los mismos. Es til en el estudio de Talasemia y Persistencia hereditaria de Hb F. Cuerpos de Heinz espontneos. Se pueden pesquisar al incubar los hemates con azul de cresil brillante o violeta de metilo. Es til en el diagnstico de Hemoglobinas inestables. Prueba de la termoestabilidad hemoglobnica Consiste en incubar a 50C una solucin de Hb tamponada durante 2 horas. Es til en el diagnstico de Hemoglobinas inestables.
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Prueba de estabilidad al isopropanol. Se utiliza en el diagnstico de Hemoglobinas inestables. Cromatografa lquida de alta presin. Se utiliza para detectar algunas hemoglobinas anor males que no son pesquisadas por electroforesis de Hb. Biologa molecular. Los estudios moleculares para el diagnstico de hemoglobinopatas son poco utilizados. Entre otros mtodos, en investigacin se utilizan RT-PCR, secuenciacin, PCR-RFLP (PCR seguida de uso de enzima de restriccin). Estos estudios pueden realizarse con una nica muestra de sangre. El diagnstico prenatal se determina a partir del muestreo de la vellosidad corinica o de la amniocentesis. 3. ANEMIAS HEMOLTICAS EXTRACORPUSCULARES 3.1. Anemias hemolticas inmunes Estas anemias se caracterizan por el acortamiento de la sobrevida normal de los hemates, la acumulacin de los productos del catabolismo de la hemoglobina, un aumento de la eritropoyesis en la mdula sea, en un intento de compensar la prdida de hemates, que se manifiesta clnicamente por aumento del ndice de for macin de reticulocitos. Cuando los reticulocitos estn elevados una prueba clave a realizar es la antiglobulina humana directa (PAD), para determinar el papel desempeado por las Igs en la hemlisis, y en el diagnstico de procesos hemolticos mediados por anticuerpos. Si la PAD es positiva, aun cuando no es sinnimo de hemlisis inmune, podra indicar una posible AHI. En este caso, se deben hacer estudios complementarios para confirmar el mecanismo hemoltico y determinar su causa, tales como la cuantificacin de haptoglobina libre, que se encuentra disminuida en las anemias hemolticas intracorpusculares y la LDH y bilirrubina indirecta, que se encuentran aumentadas
dependiendo del grado de hemlisis. Tambin se deben hacer estudios inmunohematolgicos para determinar su especificidad antignica. Si la PAD fuera negativa se debe investigar otras causas tales como hemorragia aguda o anemia hemoltica no inmune. 3.1.1. Anemias hemolticas aloinmunes En las anemias hemolticas aloinmunes hay una destruccin de los hemates debido a una reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac). La causa es la combinacin in vivo de un anticuerpo con hemates que poseen el antgeno correspondiente sobre la superficie del glbulo rojo, aun cuando no son los anticuerpos los que destruyen los hemates (ver captulo 8). Los cuadros clnicos que se asocian a este tipo de anemia son: la reaccin transfusional hemoltica y la enfermedad hemoltica del recin nacido. a) Reaccin transfusional hemoltica Segn el tiempo de aparicin, las Reacciones transfusionales hemolticas (RTH) se clasifican en reaccin inmediata o aguda, y retardada. Segn el sitio de produccin de la hemlisis, en intravascular y extravascular. Una reaccin hemoltica aguda intravascular constituye una emergencia mdica. La reaccin ocurre en minutos tras la transfusin y se debe a anticuerpos que ya estaban presentes al iniciarla. Usualmente se debe a la transfusin de sangre incompatible para el sistema ABO, producida la mayora de las veces, por una incorrecta identificacin del paciente o de sus muestras de sangre. La forma retardada se debe a una exacerbacin de la respuesta anamnstica secundaria a la transfusin. Es sangre incompatible no detectada en las pruebas cruzadas que genera una elevacin del ttulo de anticuerpos IgG y que se unen a las clulas transfundidas, pr ovocando la hemlisis extravascular y la falta de rendimiento transfusional. Sus diferencias principales se resumen en la tabla 29 - 1
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Tabla 29-1: Caractersticas diferenciales de las reacciones transfusionales agudas y retardadas Aguda o Inmediata Instauracin Lugar de hemlisis Mecanismo Sistema sanguneo ms frecuente Clnica Hallazgos de laboratorio Inmediata (0 120 min) Intravascular; raro extravascular (por Rh) Citolisis mediada por complemento Anticuerpos IgM ABO Kell Rh (raro) Fiebre, escalofros, disnea hipotensin, shock, dolor lumbar Hemoglobinemia, elevada Hemoglobinuria, disminucin de la haptoglobina libre, PAD positivo CID IRA Lenta (1 7 das) Extravascular; raro intravascular (por Kidd) FcgR en monocitos y macrfagos Anticuerpos IgG Rh Kidd Duffy Fiebre, ictericia, anemia, esplenomegalia (raro) Disminucin de la hemoglobina, Disminucin del hematocrito, hiperbilirrubinemia, PAD positivo, PAI positivo, aumento de reticulocitos, esferocitos en frotis sanguneo, urobilinuria Retardada
Complicaciones
FcR, Receptor de Fc de IgG; CID, Coagulacin intravascular diseminada; IRA, Insuficiencia renal aguda; PAD, Prueba antiglobulina directa; PAI, Prueba antiglobulina indirecta.
La actitud frente a una reaccin hemoltica aguda intravascular debe ser: detener la transfusin inmediatamente; forzar diuresis con sueroterapia y furosemida; mantener tensin arterial y va area adecuada; revisar hojas de trabajo en el circuito de transfusin; observar si hay hemoglobinemia y hemoglobinuria; realizar una PAD y eluir el anticuerpo de los hemates; vigilar funcin renal, coagulacin y parmetros de hemlisis. Si el paciente se mantiene hemodinmicamente estable, sin cambios en la funcin renal y en la coagulacin despus de 24 horas de la transfusin de sangre incompatible para ABO, el suceso puede considerarse pasado y son muy raras las
secuelas. En la reaccin hemoltica aguda extravascular, la hemoglobinuria y hemoglobinemia generalmente no est presente, el paciente suele estar clnicamente estable y es raro el deterioro de la funcin renal y presencia de coagulopata de consumo. A menudo no requieren tratamiento. La reaccin hemoltica retardada, generalmente es inevitable y se debe la presencia de aloanticuerpos dirigidos contra antgenos eritrocitarios, que no fueron detectados en las pruebas pretransfusionales. La investigacin serolgica a seguir cuando se sospecha una RTH retardada se muestra en la figura 29-1.
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Figura 29-1: Estudio serolgico de Reaccin transfusional hemoltica retardada.
b) Enfermedad hemoltica del recin nacido En la EHRN los hemates fetales se encuentran recubiertos por aloanticuerpos IgG de origen mater no, dirigidos contra antgenos eritrocitarios de origen pater no. Dichos hemates se destruyen de forma acelerada antes y despus del nacimiento. La gravedad clnica es muy variable, oscilando desde la muerte in tero , a formas benignas slo detectables mediante pruebas serolgicas al nacimiento (ver captulo 8). La EHRN puede diagnosticarse antes o despus del nacimiento (prenatal y postnatal). Diagnstico prenatal Es importante que el diagnstico prenatal se realice lo ms pronto posible. Se debe: (a) Obtener los antecedentes, tanto obsttricos (historia de partos previos con recin nacidos hidrpicos, ictericia en las primeras 24 horas despus del parto, as como abortos en el primer trimestre del embarazo), as como tambin su historia transfusional (si la embarazada ha sido transfundida, si ha presentado reaccin a la transfusin, si conoce su condicin de Rh negativo, etc.). A toda mujer embarazada, en la primera visita prenatal, se le debe investigar el grupo sanguneo y los anticuerpos irregulares; inicialmente a travs de pruebas de pesquisa como PAI, y no slo a las embarazadas Rh negativas, ya que existen otros sistemas de inters clnico. Atendiendo a los resultados, si
la PAI es negativa y existe compatibilidad ABO y Rh con el padre, no es necesario realizar ms estudios. Si existe incompatibilidad ABO y compatibilidad Rh, es conveniente la bsqueda de anti-A y/o anti-B de clase IgG. El mtodo ms sensible y satisfactorio para su estudio es tratar el suero de la madre con sustancias reductoras como el ditiotreitol (DTT) y el 2mercaptoetanol (2-ME), que inactivan los anticuerpos IgM y luego se determina el ttulo de IgG anti-A, anti-B mediante la PAI con el reactivo Antiglobulina Humana monoespecfico anti-IgG. El mecanismo hemoltico en este tipo de enfermedad es de lisis citotxica inducida por clulas fagocticas, especialmente macrfagos esplnicos. El complemento no es activado por los anticuerpos IgG anti-A o antiB en la EHRN por ABO. Si el padre es Rh positivo y la madre Rh negativa con PAI negativa, se debe monitorear mediante PAI al 4, 7, 9 mes de embarazo. Cuando el resultado de la PAI resulta positivo, se debe investigar la especificidad y el ttulo del anticuerpo. Este ttulo se realiza todos los meses y cada semana en el ltimo mes de gestacin. La titulacin del anticuerpo es vlida e importante slo en la primera gestacin donde aparece el anticuerpo, puesto que indica las conductas a seguir en la prevencin y tratamiento de la enfermedad hemoltica. Pueden existir diferencias en cuanto al valor crtico del ttulo, por lo que cada laboratorio deber determinarlo y utilizar los controles necesarios para garantizar que sus resultados son vlidos y reproducibles. Un ttulo alto o en alza representa aloinmunizacin
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importante de la madre y por tanto requiere estudios y evaluacin del feto. En las pacientes previamente inmunizadas, los ttulos seriados de anticuerpos no son un mtodo confiable para evaluar el estado del feto ya que este puede aumentar ms an, disminuir o permanecer inalterado. En estos casos debe evaluarse al feto por los mtodos descritos anteriormente (ver captulo 8). Un examen de valor diagnstico es aquel que con una extraccin percutnea de sangre de cordn, se evala directamente variables hematolgicas y bioqumicas del feto, lo que permite establecer un diagnstico de seguridad y gravedad. Un inconveniente que muchas veces se presenta, es la contaminacin con sangre mater na o fluido amnitico, para diferenciarlas se utilizan marcadores tales como el tamao de los eritrocitos y la presencia de Hb fetal. Otras pruebas diagnsticas reservadas para mujeres con pareja heterocigota para el antgeno problema, mar cadamente inmunizadas, con antecedentes de EHRN grave y muerte intrauterina son la toma de muestras de vellosidades corinicas que al romper las vellosidades se obtienen glbulos rojos fetales y se puede efectuar la tipificacin antignica y la utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para determinar el Rh fetal. Diagnstico postnatal El diagnstico postnatal de EHRN se puede efectuar en base a la clnica y al laboratorio: (a) clnicamente a partir del aspecto fsico del recin nacido, el que presenta palidez, taquicardia y taquipnea debido a la anemia, hepatoesplenomegalia debido a la hemlisis extravascular y a la hematopoyesis extramedular, y adems pueden constatarse signos neurolgicos de la encefalopata bilirrubnica (letargo, hipotona), y (b) inmunohematolgico que confir ma el diagnstico, evala la gravedad y ayuda a establecer la conducta a seguir. En relacin con las pruebas de confirmacin para la madre y el recin nacido pueden ser: en la madre: (a) fenotipificacin ABO y Rh, que incluye prueba de determinacin de variantes dbiles del antgeno D, (b) PAI para determinar aloanticuerpos maternos y su especificidad, (c) prueba de rosetas, para determinar si hubo o no paso de hemates fetales a la circulacin materna, (d) prueba de Kleihauer-Betke, para cuantificar la cantidad de sangre fetal en la circulacin materna y (e) citometra de flujo para
precisar si ocurri o no hemorragia fetomaterna y cuantificarla. En el nio: (a) fenotipificacin ABO y Rh, (b) PAD para demostrar anticuerpos unidos al eritrocito, (c) Hb y hematocrito de cordn, (d) bilirrubina indirecta de cordn, (e) recuento de reticulocitos, que en la EHRN puede ser superior al 6%, (f) gases en sangre arterial, que puede mostrar acidosis metablica, y (g) elucin de anticuerpos de los hemates del recin nacido que presentan una PAD positiva. Son bien conocidos los resultados discrepantes de la PAD como diagnstico de EHRN por ABO, ya que sta puede ser positiva, dbil o moderada y an negativa. Este fenmeno es debido a que existen pocas molculas de IgG anti-A o anti-B sensibilizando los eritrocitos del recin nacido (menos de 220 molculas de IgG por hemate). Usando para la PAD mtodos ms sensibles que el tubo, como por ejemplo el autoanalizador, esta sera positiva en todos los casos de incompatibilidad ABO, pues esta metodologa emplea potenciadores de baja fuerza inica que pueden detectar niveles menores de molculas de IgG en la membrana eritrocitaria. La elucin de anticuerpos de las clulas rojas del recin nacido para enfrentarlas a clulas A B es otra tcnica que se aplica, cuando la PAD es negativa. Las pruebas para la valoracin de la gravedad son principalmente la deter minacin de albmina srica y la relacin albmina/bilirrubina y la determinacin de carboxihemoglobina (COHb). Los niveles de COHb estn aumentados en neonatos con hemlisis. c) Biologa molecular en el diagnstico de anemias hemolticas aloinmunes La identificacin y secuenciacin de los genes que codifican para los diferentes sistemas sanguneos, ha permitido realizar ciertos procedimientos de biologa molecular aplicados a dos situaciones relacionadas con las anemias hemolticas aloinmunes: Genotipificacin de antgenos eritrocitarios La genotipificacin de antgenos eritrocitarios por mtodos de biologa molecular es til cuando las pruebas de hemaglutinacin, usadas habitualmente, no se pueden emplear. Esto puede ocurrir en el caso de pacientes politransfundidos, quienes se han inmunizado con al menos un aloanticuerpo. La identificacin del fenotipo permite conocer la posible especificidad del anticuerpo, sin embargo, la presencia de glbulos rojos transfundidos
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impide realizar este procedimiento. Pacientes cuyos glbulos rojos estn fuertemente sensibilizados con anticuerpos IgG o fracciones del complemento que dificultan la adecuada fenotipificacin. El anlisis molecular de variantes gnticas puede ayudar tambin a complementar las investigaciones serolgicas. En todas estas situaciones se requiere de estudios para evitar probables reacciones hemolticas post-transfusionales. Los mayores avances en materias de genotipificacin eritrocitaria se han realizado en el sistema RH dado el gran polimorfismo de ste. Su genotipificacin requiere del empleo de diversos partidores (primers) para lograr la deter minacin corr ecta de variantes antignicas del antgeno D, alelos D dbiles, hbrido RHD-CE-D y el recientemente descrito gen RHD (pseudogn con una insercin de una secuencia nucleotdica de 37pb en el lmite ente el intrn 3 y exn 4, mltiples mutaciones de sentido alterado en el exon 5 y una mutacin sin sentido en el exon 6), todos los cuales se manifiestan como un fenotipo D negativo. Respeto al sistema ABO se sabe que en los dos ltimos exones (exones 6 y 7) est la regin que codifica el dominio cataltico de las glicosiltranferasas ABO; basado en las diferencias a este nivel existen ms de 100 alelos ABO distintos. Para realizar estudios moleculares en estos casos, es necesario obtener DNA a partir de la fraccin de clulas mononucleares de una muestra de sangre anticoagulada con EDTA. La amplificacin por PCR se realiza mediante el empleo de partidores para los genes de los distintos antgenos eritrocitarios de importancia clnica, que han sido descritos en detalle por St-Louis y colaboradores en 2003. Identificacin de fetos en riesgo de enfermedad hemoltica del recin nacido La determinacin prenatal del grupo sanguneo es actualmente posible en mujeres embarazadas aloinmunizadas contra un antgeno de importancia clnica. Esta determinacin se realiza por PCR usando
material derivado del feto obtenido del lquido amnitico, de las vellosidades corinicas, o ms recientemente, a partir de una muestra de sangre materna ya que el DNA fetal circula libre en el plasma o suero materno en relativamente alta cantidad (3,4% y 6,2% del DNA plasmtico total, al inicio y final del embarazo, respectivamente). El DNA fetal est presente en el plasma materno a partir de las 10 a 12 semanas de gestacin y hasta 10 a 100 horas despus del nacimiento. Este descubrimiento ha abierto grandes posibilidades para realizar genotipificacin sin recurrir a mtodos invasivos para la obtencin de la muestra. La mayora de las tcnicas para la genotipificacin RH usan a lo menos 2 pares de partidores. Un par es especfico para un fragmento de 186 pb del exn 10 del gen RHD y otro para amplificar un fragmento de 136 pb del exn 7 del gen RhD o RhCE . La gran diversidad entre los fenotipos Rh (D) negativos descritos en la actualidad, ha producido una evolucin gradual de las tcnicas basadas en PCR, as las tcnicas de tercera generacin son capaces de detectar alelos negativos para D, deleciones del gen RHD y el gen RHD. Estas tcnicas incluyen, adems de los partidores para los exones 7 y 10, partidores para amplificar segmentos gnicos de los exones 4, 5 y 6 que permiten distinguir variantes genotpicas que induciran a una falsa tipificacin de los fetos como D positivos. La amplificacin del DNA se puede realizar tcnicas de PCR clsico o por el PCR en tiempo real (PCR real time). Amplificacin de DNA por PCR clsico. Se deben seleccionar los partidores adecuados, alguno de los cuales se indican en la tabla 292, adems se debe incorporar la amplificacin de una secuencia gnica de alta frecuencia como control positivo. Las condiciones del PCR tienen algunas variaciones segn los distintos fragmentos a amplificar. La visualizacin de los productos del PCR se realiza por electroforesis en gel de azarosa; as los fragmentos son separados por tamao.
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Tabla 29 -2: Secuencia de los oligonucletidos seleccionados para PCR del sistema Rh Nombre del partidor EX4F EX4R EX4P EX5F EX5R EX5P EX6F EX6R EX6P Secuencia del oligonuceltido (5' -3') CTGCCA AAG CCT CTA CAG G (Sense) ATG GCA GAC AAC TGG GTG TC TTG CTG TCT GAT CTT TAT CCT CCG TTC CCT CGC CCT CTT CTT GTG GAT G GAA CAC GGC ATT CTT CTT TTC TCT GGC CAA GTT TCA ACT CTG CTC GCT ACA CGC TAT TTC TTT GCA GAC TTC T AGG TAC TTG GCT CCC CCA AC AGA TAG CCC AGC CAC AAG ACC CAG Reconoce Exn 4 gen RhD
Exn 5 gen RhD
Exn 6 gen RhD
PCR, reaccin de polimerasa en cadena.
PCR en tiempo real. Esta tcnica usa, adems de los partidores, una sonda marcada con un fluorforo. En el sistema se aprovecha la actividad 5' exonucleasa de las Taq polimerasas para producir un aumento de la intensidad de fluorescencia de una sonda que hibrida con un fragmento de 20 a 30 nucletidos ubicados dentro del fragmento amplificado. Esta sonda posee un fluorforo en su extremo 5' y un quenche en el extremo 3' (procedimiento que evita la prdida de fluorescencia), de esta forma, si el fragmento se est amplificando, la actividad exonuclesica de la Taq escinde al fluorforo, separndolo del quenche y de esta manera el aumento de la fluorescencia ser proporcional a la cantidad de DNA presente en la muestra inicialmente. Este sistema detecta la amplificacin que se lleva a cabo durante cada ciclo de la PCR y se visualiza sin tener que realizar una electroforesis en gel de agarosa. Con esta tcnica se debe calcular un valor umbral de ciclo (Ct), que es en el cual la fluorescencia sobrepasa la lnea base; este valor debe ser determinado para crear una curva estndar de referencia en la que se puede estimar la cantidad de DNA en el plasma materno. Es necesario incorporar controles tales como la deteccin del DNA del receptor de quimioquina 5 (CCR5) fetal y materno, con el objetivo de detectar la eficiencia del procedimiento de extraccin de DNA y estimar la cantidad total de DNA (tanto materno como fetal) presente en el plasma materno y la deteccin de cromosoma Y asociado al gen SRY en fetos masculinos con el objetivo de confirmar la presencia de DNA fetal en el plasma y estimar su cantidad en aquellas
mujeres cuyos fetos eran de sexo masculino. 3.1.2. Anemias hemolticas autoinmunes Las anemias hemolticas autoinmunes (AHAI) son procesos patolgicos que cursan con disminucin de la vida media eritrocitaria (ver captulo 8, tabla 8-9). El diagnstico suele ser un hallazgo en el Banco de Sangre al recibir una solicitud de transfusin por anemia y al realizar las pruebas de compatibilidad pretransfusional se detecta una prueba antiglobulina directa (PAD) positiva y el autoanticuerpo libre en suero. Suponen un problema para la terapia transfusional, debido a que los autoanticuerpos suelen ir dirigidos contra antgenos presentes en los hemates de casi todos los individuos, lo que hace prcticamente imposible la posibilidad de encontrar sangre completamente compatible. A su vez, el autoanticuerpo puede enmascarar la existencia de aloanticuerpos de importancia transfusional. Los hallazgos de laboratorio reflejan tanto la intensidad del proceso hemoltico (aumento de LDH, hiperbilirrubinemia, descenso de haptoglobina libr e) como la respuesta regenerativa de la mdula sea (reticulocitosis). El frotis muestra policromatofilia, esferocitos, algunos esquistocitos e, incluso, eritroblastos en los casos ms intensos. La mdula sea muestra hiperplasia eritroide; si el cuadro hemoltico es crnico muestra rasgos megaloblsticos por el hiperconsumo de cido flico. La ausencia de reticulocitosis no excluye el diagnstico de AHAI, pero sugiere mayor
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gravedad, presumiblemente por la accin del autoanticuerpo sobre los eritroblastos. Las pruebas de fragilidad osmtica, de autohemlisis y los estudios de sobrevida de los hemates son innecesarios. Una prueba importante en el diagnstico diferencial entre la AHAI y otras formas de anemia hemoltica, es la PAD. Esta prueba detecta el hecho central de las AHAI: la pr esencia de IgG y/o componentes del complemento unido a la superficie eritrocitaria. Cuando la PAD es positiva, deben realizarse pruebas especficas para IgG y para C3d para saber la protena adherida. Una PAD positiva, confirmada con un especfico IgG puede observarse aproximadamente en uno de cada 10.000 donantes de sangre. Tambin una PAD positiva por C3d puede verse ocasionalmente en sujetos sanos, aunque este resultado casi siempre apunta la presencia de un autoanticuerpo fro o caliente, por lo que se debe destacar que la existencia de una PAD positiva no implica necesariamente una anemia hemoltica autoinmune. Por otra parte, aunque son raras (5%), existen anemias hemolticas autoinmunes con PAD negativa. Estas AHAI que cursan con una PAD negativa se han atribuido a autoanticuerpos IgA, autoanticuerpos IgG de baja afinidad u otr os mecanismos de autoinmunidad no mediada por anticuerpos. En aproximadamente el 70 % de los casos de AHAI los autoanticuerpos estn tambin presentes en el suero y son detectados con la prueba antiglobulina indirecta (PAI) positiva. Como toda prueba de laboratorio, la prueba antiglobulina requiere ser interpretada. Como ya se mencion, se ha visto que individuos
sanos pueden presentar una PAD positiva y que pacientes con AHAI pueden tener una PAD negativa. Adems una PAD positiva no siempre significa que los hemates estn recubiertos de IgG y/o complemento. En ocasiones se presentan pruebas falsas positivas en pacientes hospitalizados y se debe a muestras coaguladas, tubos que contienen gel de silicona, muestras de vas que contienen soluciones de baja fuerza inica e hipergammaglobulinemia. Los autoantgenos son en la mayora de los casos desconocidos, e incluso en los casos en que la especificidad de grupo sanguneo se sabe, las estructuras relevantes no han sido descritas. Estos autoantgenos estn presentes sobre todos los eritrocitos normales y as, en la prctica, todos los hemates son incompatibles en las pruebas pretransfusionales. La actitud a seguir con este tipo de anemias es realizar un estudio inmunohematolgico adecuado: prueba antiglobulina, eluidos, titulaciones, paneles de identificacin, estudio para descartar aloanticuerpos, etc. segn el comportamiento trmico de los autoanticuerpos, criterio que clasifica las AHAI (ver captulo 8). a) AHAI por anticuerpos calientes Los estudios apuntan a detectar si adems del autoanticuerpo, hay presencia de aloanticuerpos en los pacientes que han presentado una PAD positiva. Si no existen antecedentes de transfusin o embarazo, es improbable que haya un aloanticuerpo en el suero. Dependiendo de si el paciente ha sido transfundido recientemente (en los ltimos tres meses) o no, es el algoritmo que se sigue para el estudio (figura 29-2).
Figura 29-2: Estudio inmunohematlogico en AHAI por anticuerpos calientes
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En un paciente no transfundido recientemente, se realiza una autoabsorcin (figura 29 3), con el propsito de detectar aloanticuerpos enmascarados, si los hay, deben ser identificados. En caso contrario no son necesarias pruebas adicionales y el suero autoabsorbido puede emplearse para las
pruebas de compatibilidad. A su vez, se debe realizar una elucin a los hemates para eliminar la IgG. Luego se comprueba que la PAD es negativa y se realiza fenotipificacin de las clulas. El eluado puede usarse para identificacin del autoanticuerpo.
Figura 29-3: Autoabsorcin en caliente para estudio de AHAI por anticuerpos.
Si el paciente ha recibido transfusiones en los ltimos tres meses, se debe realizar una absorcin diferencial (figura 29- 4), teniendo cuidado en la interpretacin de los resultados
de la absorcin. Aloanticuerpos dirigidos contra antgenos de alta incidencia pueden ser eliminados. Se debe realizar una elucin para luego estudiar el eluado (figura 29 2).
Figura 29-4: Absorcin diferencial para estudio de aloanticuerpos en presencia de autoanticuerpos calientes.
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b) AHAI por anticuerpos fros Los estudios inmunohematolgicos en AHAI por anticuerpos fros apuntan a determinar la amplitud trmica, el ttulo y la especificidad del autoanticuerpo. Esta ltima carece de importancia en el manejo clnico o para la terapia transfusional del paciente. Se debe adems estudiar la posible coexistencia con aloanticuerpos de importancia clnica, ya que stos adquieren relevancia en una eventual transfusin.
El estudio se realiza a partir de muestras de sangre obtenidas con y sin anticoagulante, y mantenidas a temperatura de 37C. Utilizando el suero o plasma se har el estudio segn algoritmo que se muestra en figura 29-5 para determinar el rango trmico, especificidad y ttulo del autoanticuerpo. Para estudiar la coexistencia de un aloanticuerpo, se realiza autoabsorcin usando los hemates de la muestra anticoagulada (figura 296).
Figura 29-5: Estudio inmunohematolgico en pacientes con AHAI por anticuerpos fros.
Figura 29-6: Autoabsorcin en fro para estudio de AHAI por anticuerpos fros.
Hemoglobinuria paroxstica a frigore La Hemoglobinuria paroxstica a frigore (HPF) es la ms infrecuente de las AHAI. Es causada por un anticuerpo clase IgG dirigido con
especificidad para el complejo antignico P del hemate; este tipo de anticuerpo fija el complemento slo a bajas temperaturas (4C) y al aumentar sta a 37C se activa el sistema del complemento provocando la lisis de los
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hemates (ver captulo 8). A esta hemolisina se denomina anticuerpo de Donath-Landsteiner. Su peculiar comportamiento hace que los estudios inmunohematolgicos habituales sean casi siempre negativos, pues slo durante la crisis hemoltica o poco despus la PAD puede
resultar positiva para el componente C3 del sistema del complemento. No obstante, la hemolisina bifsica es fcilmente detectable fuera de los episodios hemolticos mediante la prueba de Donath-Landsteiner, que reproduce in vitro las condiciones fisiopatolgicas de la enfermedad (figura 297 ).
Figura 29-7: Prueba de Donath Landsteiner. Se utiliza en el estudio de Hemoglobinuria paroxstica a frigore
AHAI inducida por drogas Los mecanismos mediante los cuales las drogas pueden inducir a una AHAI han sido descritos previamente: adsorcin de la droga, complejo inmune y autoanticuerpos (ver captulo 8). El
diagnstico diferencial entre cada uno de ellos, se basa en el cuadro clnico y los hallazgos ser olgicos. La tabla 29-3 muestra los mecanismos causantes de la PAD positiva, segn clasificacin.
Tabla 29-3. Mecanismos causantes de PAD positivas inducidas por drogas Clasificacin
In vitro
In vivo
Aproximadamente el 3% de los pacientes desarr olla una PAD positiva si estn recibiendo dosis altas de la droga. Menos del 5% desarrolla anemia hemoltica. La hemlisis es extravascular. Hemlisis intravascular aguda. Insuficiencia renal
Adsorcin de La PAD es fuertemente positiva debido a la droga IgG, y a veces tambin con C3d. El suero y el eluado preparado a partir de los hemates del paciente reaccionan slo con hemates recubiertos con la droga. En el suero se detecta un anticuerpo IgG potente. Complejo Los hemates generalmente estn cubiertos inmune slo con complemento, en excepciones con IgG. El anticuerpo puede ser IgM o IgG. La droga debe incubarse con el suero y los hemates para la prueba. El eluado es negativo. Autoanticuerpos La PAD es positiva debido a IgG, negativa por complemento, pero despus de 3 a 6 meses con el medicamento. Los anticuerpos en el suero y el eluado provienen de los hemates del paciente.
PAD, prueba de antiglobulina directa.
La PAD positiva ocurre en un 15% de los pacientes y es dosis dependiente. Menos del 1% de los pacientes desarrollan anemia hemoltica.
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3.2. Anemias hemolticas no inmunes Las anemias hemolticas extracorpusculares no inmunes, generalmente se diagnostican asociadas a la enfermedad de base o por conocimiento del agente causal. Algunos ejemplos: anemias hemolticas de origen heptico, anemias hemolticas de causa mecnica, hemlisis del ejercicio, hemlisis de origen cardiaco, anemias hemolticas por txicos (infecciones, agentes fsicos y qumicos y venenos de serpientes o araas). LECTURAS SUGERIDAS Enfermedad hemoltica del recin nacido. Disponible en: http://www.aeped.es/ protocolos/neonatologa/hemoltica-rn.pdf Finning, K., Martin, P., Soothill, P., Avent, N. Prediction of fetal D status from maternal plasma: introduction of a new noninvasive fetal RHD genotyping service. Transfusion; 42:10791085,2002. Gamma Biologicals, Inc. Houston.Tx. Inmunohematology Methods. Appendix 2: 1112, 15-16, 20-21. 1998. Harmening, D. Modern Blood Banking and Transfusion Practices, 4edicin. Chapter 20 and 21, 1999. Lindenbaum, J. Estudio de las anemias En Tratado de medicina interna, Wyngaarden, J. B., Smith L.H., Bennet, J.C., ed. Cecil. 19edicin. Filadelfia, W.B. Saunders Company, 1992, pp. 955-965. Lo, Y., Corbetta, N., Chamberlain, P., Rai, V., Sargent, I., Redman, S., Wainscoat, J. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet; 350:485-487, 1997. Lynn, K., Hoffstadter, P.J., De Christopher, J, Perkins, T., Berte, L.M. Transfusion-Medicine, Primera edicin. ASCP press. 1992, pp. 110-24.
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HEMATOLOGA
Captulo
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ESTUDIO DE LABORATORIO DE ENFERMEDADES ONCOHEMATOLGICAS

Mara Eugenia Legues S., Concepcin Risueo A., Juan Luis Castillo N., Elba Leiva M. e Ivn Palomo G.
1. Introduccin 2. Citoqumica 2.1. Antecedentes generales 2.2. Seleccin de mtodos citoqumicos 2.2.1. Peroxidasas 2.2.2. Estearasas 2.2.3. Fosfatasas cidas 2.2.4. Fosfatasas alcalinas de los neutrfilos 2.2.5. Tincin de Perls para hierro 2.3. Aspectos especiales 3. Estudio citogentico 3.1. Citogentica clsica 3.1.1. Antecedentes generales 3.1.2. Anlisis citogentico a) Fotografa y cariotipo b) Leucemia aguda c) Sndromes mielodisplsicos d) Anemia aplstica e) Leucemia mieloide crnica y otros sndromes mieloproliferativos f) Sndromes linfoproliferativos 3.1.3. Aspectos prcticos 3.2. Hibridacin in situ con fluorescencia 3.2.1. Antecedentes generales 3.2.2. Aspectos metodolgicos 3.2.3. FISH interfsico 3.2.4. FISH en el seguimiento de una enfermedad 3.2.5. Avances relacionados con FISH 4. Biologa molecular 4.1. PCR y modificaciones
4.1.1. PCR 4.1.2. RT-PCR 4.1.3. Q-PCR 4.2. Aplicaciones de las PCR en oncohematologa 4.2.1. Leucemias Agudas 4.2.2. Leucemia mieloide crnica 4.2.3. Linfomas no Hodgkin 4.3. Consideraciones 5. Citometra de flujo 5.1. Generalidades 5.2. Aplicaciones en el estudio de Leucemias, linfomas y gammapatas monoclonales 5.2.1. Indicaciones mdicas 5.2.2. Toma de muestras para estudios inmunofenotpicos 5.2.3. Almacenamiento y transporte de muestras para estudios inmunofenotpicos 5.2.4. Preparacin de la muestra para un estudio inmunofenotpico 5.2.5. Anlisis segn cuadro clnico 5.2.6. Informe de resultados 6. Inmunoqumica aplicada a Gammapatas monoclonales 6.1. Pesquisa y estudio de la protena monoclonal 6.2. Viscocidad srica 6.3. Beta 2 microglobulinemia 6.4. Inhibidor 1 del activador de Plasmingeno (PAI-1), Fibringeno, Protena C reactiva (PCR) e Interleuquina 6 (IL-6). 6.5. Nuevos marcadores
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RESUMEN
En este captulo se describe los fundamentos de varias metodologas que son utilizadas en el diagnstico y control de evolucin de enfermedades oncohematolgicas: histoqumica, estudio citogentico, biologa molecular, citometra de flujo, e inmunoqumica aplicada a gammapatas monoclonales. En cuanto a histoqumica se describen varios mtodos citoqumicos: peroxidasas, estearasas, fosfatasas cidas, fosfatasas alcalinas de los neutrfilos y tincin de Perls para hierro. Respecto al estudio citogentico, se menciona los aspectos metodolgicos fundamentales y las aplicaciones de la citogentica clsica y de la hibridacin in situ con fluorescencia (FISH). Sobre la biologa molecular se describe el fundamento y las aplicaciones en leucemias agudas, leucemia mieloide crnica y linfomas no Hodgkin de la reaccin de polimerasa en cadena (PCR) y sus modificaciones (RT-PCR y Q-PCR) De citometra de flujo se indica sus fundamentos metodolgicos y sus aplicaciones en el estudio de leucemias, linfomas y gammapatas monoclonales En cuanto a inmunoqumica, solo se describe la que se aplica en el estudio de gammapatas monoclonales, destacando los mtodos de pesquisa y estudio de la protenas monoclonales.
1. INTRODUCCIN Tradicionalmente, adems de los aspectos clnicos (signos y sntomas), el diagnstico de patologas oncohematolgicas como las leucemias, los linfomas y las gammapatas malignas (ej. mieloma mltiple), radicaba fundamentalmente en el estudio citolgico de sangre perifrica y de mdula sea (hemograma y mielograma, respectivamente) y/o biopsia de mdula sea y/ o ganglios linfticos, segn la enfermedad. Actualmente, debido al avance en el conocimiento fisiopatolgico de estas patologas, como tambin por los nuevos esquemas teraputicos, se requiere, sin dejar de lado la citologa y el estudio anatomopatolgico, de varias otras metodologas como son: histoqumica, el estudio citogentico, la biologa molecular, la citometra de flujo, y el el estudio inmunoqumico aplicado a las gammapatas monoclonales. Este captulo trata sobre los fundamentos y aplicaciones de dichas metodologas, en el contexto de las enfermedades oncohematolgicas. 2. CITOQUMICA 2.1. Antecedentes generales En el campo de la hematologa, el diagnstico citolgico de las leucemias y otras neoplasias
se ha basado en la aplicacin de tcnicas de tincin de tipo Romanowsky, que utilizan eosina y azul de metileno en solucin para resaltar las estructuras celulares. Una de ellas es la tincin May Grnwald Giemsa (MGG), desarrollada por Ehrlich en 1891. A pesar de los avances en otras tcnicas para precisar el diagnstico de las neoplasias hematolgicas como la citogentica, citometra de flujo y biologa molecular, el examen microscpico detallado del frotis de sangre perifrica y mdula sea teidos con el mtodo habitual de MGG siguen siendo fundamentales. La microscopa sola puede dar un diagnstico definitivo de leucemia mieloide aguda (LMA) o de los sndromes mielodisplsticos (SMD) y un diagnstico provisorio de leucemia linftica aguda (LLA) que requiere confir macin inmunofenotpica. La microscopa tambin es crucial en el diagnstico de la leucemia mieloide crnica y es necesaria en el diagnstico de otros sndromes mieloproliferativos (SMP). Tambin es importante en los sndromes linfoproliferativos (SLP) pero puede ser insuficiente si no se complementa con el inmunofenotipo. La primera tcnica citoqumico enzimtica fue la reaccin de peroxidasas basada en bencidina, introducida por Fischel en 1910. l
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observ que al analizar una poblacin de blastos leucmicos, al menos una minora de mieloblastos daba reaccin positiva a las peroxidasas, en contraste con los linfoblastos. Actualmente existe un amplio nmero de tests citoqumico enzimticos e histoqumicos aplicados a la hematologa y esto impide, a veces, comparar resultados obtenidos en diferentes laboratorios. El empleo de varios mtodos citoqumicos en la caracterizacin de las neoplasias hematolgicas es laborioso y en ocasiones no resulta til. Por esta razn el Comit de Estandarizacin en Hematologa recomienda un nmero limitado de procedimientos esenciales. Las tcnicas recomendadas incluyen la reaccin de peroxidasas, fosfatasas alcalinas, fosfatasas cidas, estearasas no especficas y cloroacetato estearasas, adems de la tincin de Perls para estudiar las reservas de hierro. En los laboratorios que disponen de citometra de flujo para el estudio inmunofenotpico, la citoqumica se emplea como complemento ocasional en los casos difciles de clasificar. 2.2. Seleccin de mtodos citoqumicos A continuacin se indican las caractersticas ms importantes de cada uno de los mtodos citoqumicos, especialmente su potencial uso clnico. 2.2.1. Peroxidasas La reaccin de peroxidasas en la mdula sea es fuertemente positiva en clulas de la serie granuloctica. La demostracin de actividad peroxidsica, en al menos 3% de blastos leucmicos, establece el diagnstico de LMA. En los subtipos M2, M3 y M4 de la clasificacin Franco Americano Britnica (FAB), habitualmente la mayora de los blastos son peroxidasa positivos. En monocitos la reaccin es dbilmente positiva. Los linfocitos y precursores eritroides son peroxidasa negativos. Se ha r eportado que los anticuerpos monoclonales anti-mieloperoxidasa son ms sensibles que la reaccin citoqumica. 2.2.2. Estearasas Las tinciones de estearasas son tiles para
diferenciar clulas de la serie neutrfila y monoctica. La Naftol AS-D cloroacetato estearasa est presente en clulas de la lnea neutrfila y es dbil o negativa en monocitos y sus precursores. El patrn de reaccin va en paralelo al resultado de la peroxidasa pero es menos sensible porque la cloroacetato esterasa es dbil en muchos blastos leucmicos. La reaccin es ms fuerte en clulas diferenciadas y es til para demostrar la diferenciacin promieloctica. Las estearasas no especficas, como lo indica su nombre, son enzimas ubicuas presentes en varios tipos celulares, incluyendo monocitos, clulas T y megacariocitos. Las tcnicas para su demostracin pueden usar varios sustratos, incluyendo alfa Naftil acetato estearasa, Naftol AS-D acetato estearasa y alfa Naftil Butirato estearasa. El patrn de tincin que se obtiene puede ayudar a distinguir los tipos celulares. Los monocitos tienen reactividad fuerte y difusa a travs del citoplasma. En las clulas T (incluyendo linfoblastos T) y megacariocitos, el patrn es ms focal (grnulos densos). Aproximadamente un 25% de las leucemias agudas promielocticas son positivas para las estearasas no especficas. Sin embargo, los eritroblastos en la leucemia tipo M5 tambin tienen positividad intensa difusa, que necesita diferenciarse de la que presentan los monocitos. En el procedimiento se agrega un paso de inhibicin con fluoruro para hacerlas ms especficas. La actividad de la enzima en clulas de la lnea monoctica se inhibe con el fluoruro, en cambio, en la mayora de las otras clulas, persiste. 2.2.3. Fosfatasas cidas La actividad de fosfatasas cidas puede demostrarse hasta cierto grado en todas las lneas celulares. La utilidad de esta tincin en la evaluacin diagnstica de la leucemia aguda est limitada a los pacientes con LLA. La reaccin positiva de tipo focal, paranuclear en los linfoblastos, es evidencia presuntiva de fenotipo T. Este examen est ampliamente superado por el estudio inmunofenotpico. En la mayora de los casos de leucemia de clulas velludas y en algunos de su forma variante, se observa una reaccin positiva de fosfatasas cidas que es resistente al tartrato.
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Sin embargo, tambin se observan reacciones positivas resistentes en una minora de casos de leucemia prolinfoctica B y en linfoma esplnico con linfocitos velludos. 2.2.4. Fosfatasas alcalinas de los neutrfilos La obtencin de un porcentaje bajo de positividad de fosfatasas alcalinas en los granulocitos neutrfilos es compatible con el diagnstico de leucemia mieloide crnica (LMC), pero el examen es innecesario si se dispone del estudio citogentico o molecular para detectar el cromosoma Philadelphia. En aproximadamente 5% de los casos de LMC en fase crnica el resultado de la reaccin es normal. Esto puede llevar a una interpretacin diagnstica errnea. El valor tambin puede resultar bajo en la hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN) y en el 30 a 50 % de casos de SMD. 2.2.5. Tincin de Perls para hierro La tincin de azul de Prusia (Perls, 1867) es uno de los mtodos histoqumicos ms antiguos y se realiza hasta hoy prcticamente sin cambios desde su descripcin original. Este es uno de los mejores mtodos para conocer las reservas de hierro en la mdula sea, lo cual es fundamental para el diagnstico de una variedad de condiciones asociadas a la anemia. Est indicada en todos los casos de sospecha de SMD para confir mar el diagnstico y para la caracterizacin posterior de los casos de anemia refractaria o anemia refractaria con sideroblastos en anillo. 2.3. Aspectos especiales Para no llegar a una interpretacin errnea de las diferentes tinciones citoqumicas es necesario realizarlas en el contexto de las caractersticas clnicas, hematolgicas y citolgicas del caso particular. Antes de proceder a una tincin especfica es importante haber designado el caso como perteneciente a uno de los siguientes grupos generales: leucemia aguda, SMD, SMP o SLP. Algunos casos de LMA subtipo M1 pueden identificarse rpidamente con la citologa bsica, sobre todo si los blastos presentan bastones de Auer en su citoplasma, pero para identificar los restantes, es til la reaccin citoqumica de peroxidasas.
Las estearasas no especficas per miten identificar la mayora de LMA subtipo M5, pero en una minora de casos subtipo M5a las reacciones de peroxidasas y estearasas no especficas son negativas y el diagnstico se basa en la citologa, combinada con el inmunofenotipo. La LMA subtipo M0 que presenta signos de diferenciacin mieloide, no se puede detectar con la tincin de peroxidasas pues resulta negativa. La citoqumica no es til en el diagnstico de LMA subtipo M7. 3. ESTUDIO CITOGENTICO 3.1. Citogentica clsica 3.1.1. Antecedentes generales El descubrimiento del cromosoma Philadelphia (Ph) en clulas de pacientes con LMC en el ao 1960 seal el principio de una nueva era en la gentica del cncer. El hallazgo de que se trataba de una translocacin entre los cromosomas 9 y 22 marc el inicio de un perodo de intenso estudio del cariotipo de las clulas leucmicas revelando muchas anormalidades cromosmicas recurrentes. Estas alteraciones comenzar on a tener importancia creciente como ayuda diagnstica y como ndice de pronstico. Hoy da ningn estudio de leucemias a gran escala se considerara completo sin la informacin cariotpica. Las neoplasias hematolgicas y tumores slidos pueden tener una variedad de alteraciones cromosmicas visibles a nivel citogentico convencional, que incluyen cambios numricos (aneuploidas) y estructurales (deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones). Se ha demostrado que existe relacin entre los sitios de algunas alteraciones y la posicin de oncogenes celulares. A nivel gentico, los eventos que se producen pueden desregular un gen intacto por interrupcin o cambio de sus elementos adyacentes de control o crear un gen nuevo de fusin. La citogentica del cncer es una disciplina que evoluciona rpidamente como tantas en la biologa actual y est viviendo cambios dinmicos en su tecnologa y aplicaciones. En la dcada de los 80 se desarrollaron las tcnicas
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de hibridacin in situ con fluorescencia (FISH) que han permitido estudiar lugares especficos del genoma (ver punto 3.2).. El estudio molecular de los genes adyacentes a los puntos de ruptura de translocaciones especficas y de la funcin de sus productos, han ayudado a clarificar las complejas interacciones que promueven la oncognesis y perpetan el fenotipo neoplsico (ver punto 4). En los prrafos siguientes se explicarn los pasos esenciales del anlisis citogentico y el rol que tiene actualmente en el estudio de laboratorio de las neoplasias hematolgicas. 3.1.2. Anlisis citogentico El anlisis citogentico de las neoplasias hematolgicas se realiza en una muestra de mdula sea, nico lugar donde se encuentran las clulas malignas en cantidad suficiente, conservando su naturaleza de divisin rpida y pueden ser acumuladas en metafase mediante un procedimiento directo o cultivo corto en medio lquido. En caso de dificultad en la obtencin de mdula se usa sangre perifrica como sustituto. El uso de colchicina permite cosechar un nmero suficiente de clulas metafsicas. Estas se tien con bandeo G, mtodo basado en la accin de enzimas proteolticas como la tripsina sobre los cromosomas y luego tincin con solucin Giemsa con lo que se obtiene zonas claras y oscuras en las estructuras cromosmicas en un patrn que es especfico para cada par cromosmico. La labor ms extensa en la citogentica es el anlisis cromosmico al microscopio de campo claro. Aunque se haya puesto el mayor cuidado en los procedimientos, el ndice mittico obtenido en algunos casos es bajo y se necesita observar muchas preparaciones buscando metafases. Estas deben analizarse al azar, sin seleccionar las de mejor morfologa que generalmente son normales. a) Fotografa y cariotipo El cariotipo define las caractersticas de los cromosomas de una clula observados al microscopio, fotografiados y ordenados segn el ideograma estndar establecido en el International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN ). Una muestra puede tener un cariotipo similar en todas sus clulas
o presentar dos o ms lneas celulares diferentes (figura 30-1).
Figura 30-1. La imagen corresponde a un cariotipo 46,XX,t(9;22)(q34;q11.2) o cromosoma Philadelphia, en una clula de un paciente con Leucemia mieloide crnica.
La cantidad mnima adecuada de clulas analizadas, segn normas internacionales, es 20 metafases bandeadas. De ese total, se fotografa y arma el cariotipo de un nmero variable de clulas en cada estudio, segn la calidad de las metafases y la complejidad de las anormalidades cromosmicas encontradas. La descripcin del cariotipo y sus alteraciones deben seguir las normas del ISCN. Este sistema contiene representaciones esquemticas de los cromosomas con numeracin de las bandas a lo largo de cada brazo cromosmico desde el centrmero hacia fuera. El brazo corto se designa p y el brazo largo q. En el ncleo de una clula humana existen 46 cromosomas, 22 pares de autosomas y dos cromosomas sexuales, X e Y. El cariotipo de una clula normal femenina es 46,XX y el de una normal masculina 46,XY. Con entrenamiento se puede reconocer cada par cromosmico por su tamao, ubicacin del centrmero, forma y patrn de bandeo. El citogenetista identifica cada par cromosmico y compara ambos homlogos para detectar diferencia en tamao y bandas. Tales diferencias pueden indicar prdida, ganancia o intercambio de material cromosmico, en definitiva de DNA. b) Leucemia aguda El estudio citogentico realizado en la mdula sea de un paciente con leucemia aguda en el
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momento del diagnstico, permite clasificarlo en alguno de los grupos pronsticos: favorable, intermedio o desfavorable (tablas 30-1 y 30-2). Sin embargo las alteraciones cromosmicas dan cuenta slo parcialmente de lo variado del comportamiento clnico de las neoplasias. Pueden existir alteraciones genticas no visibles a nivel cr omosmco que empeoran el pronstico, o que alteran la respuesta esperada al tratamiento. Una anormalidad cromosmica es un marcador clonal totalmente especfico, utilizable para monitorizar la enfermedad en su remisin (enfermedad residual mnima) con mtodos moleculares sensibles, por ejemplo la t(9;22), cuyo gen de fusin es BCR/ABL, puede detectarse por FISH y por PCR (particularmente PCR semi cuantitativo). El estudio citogentico tambin es til cuando el diagnstico de LMA est en duda, pues el tipo de alteracin observada podra aclararlo. El hallazgo de la t(15;17)(q22;q11-12) en LMA subtipo M3 es relevante con respecto al tratamiento, por el rol especfico que juega el cido trans-retinoico (ATRA) que induce diferenciacin de los promielocitos. Los pocos casos que presentan las variantes t(11;17)(q23;q11-12) o t(5;17)(q35;q11-12) no responden al tratamiento con ATRA. En LLA, los casos Ph positivos o con t(4;11)(q21;q23) son de mal pronstico y necesitan protocolos de tratamiento ms intensivos o trasplante de mdula sea. A diferencia de ellos, los casos que presentan hiper diploida >50 cr omosomas, o t(12;21)(p13;q22) requieren de tratamientos menos agresivos. En LLA tipo Burkitt es importante la confirmacin citogentica de la translocacin caracterstica t(8;14)(q24;q32) o sus variantes t(2;8)(p11.2;q24) y t(8;22)(q24;q11) dada la buena evolucin que presentan con quimioterapias alternativas intensivas. En la leucemia del recin nacido es importante la deteccin de la t(4;11)(q21;q23) que indica un pronstico muy adverso. El estudio citogentico no es recomendable para pacientes con leucemia aguda en remisin, ya que no es suficientemente sensible.
c) Sndromes mielodisplsticos Cuando se sospecha SMD la demostracin de una anormalidad citogentica clonal confirma el diagnstico, aunque se debe tener en mente que un resultado normal no lo excluye. Si la anormalidad encontrada es una de las que se considera de mal pronstico en LMA, es predictivo de transformacin rpida a leucemia o muerte por complicaciones debidas a las citopenias. d) Anemia aplstica En la anemia aplstica no est indicado el estudio citogentico si el paciente no dispone de muchos recursos econmicos, porque generalmente no se obtienen clulas en divisin y es raro que se detecte una alteracin cromosmica. Sin embargo, el hallazgo de una alteracin indica la existencia de un clon neoplsico, importante para el diagnstico y eleccin del tratamiento. La aparicin de caracteres displsticos en una anemia aplstica es sugerente de un clon neoplsico y por lo tanto es indicacin de anlisis citogentico. e) Leucemia mieloide crnica y otros sndromes mieloproliferativos En LMC es importante identificar el cromosoma Ph incluyendo sus variantes. Aunque hay poca evidencia de que difieran en cuanto al pronstico de la clsica t(9;22)(q34;q11.2), su deteccin provee una base importante para seguir el curso de la enfer medad con tratamientos como interfern, imatinib o trasplante de mdula sea. Los mtodos moleculares para detectar el gen quimrico BCR/ABL son ms sensibles y sirven adems en las LMC Ph negativas con cariotipo normal, complementando a la citogentica. El hallazgo de anormalidades cromosmicas adicionales al Ph en el momento del diagnstico o su desarrollo en el curso de la enfermedad son indicadores de evolucin clonal y pueden ser precursores de una fase acelerada o transformacin blstica. En sndromes mieloproliferativos con caracteres atpicos como basofilia marcada o blastos en sangre perifrica, y en trombocitemia esencial, es importante detectar si son Ph positivos o si presentan otra alteracin.
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Tabla 30-1 Clasificacin de LMA y SMD en grupos pronsticos segn la citogentica Citogentica Citogentica favorable LMA t(8;21)(q22;q22) inv(16)(p13q22) t(16;16)(p13;q22) t(15;17)(q21;q11) Variantes: t(11;17)(q23;q11) t(5;17)(q32;q11) t(11;17)(q13;q11) SMD Normal del(5q) slo del(20q) slo Citogentica intermedia LMA +8 Cariotipo normal Otras: -Y,+6 Otros cariotipos no considerados favorables o desfavorables SMD +8 Citogentica desfavorable LMA Anormalidades de 11q23 Variantes comunes: t(4;11)(q21;q23) (Peditricos) t(9;11)(p22;q23) t(11;19)(q23;p13.1) t(11;19)(q23;p13.3 t(6;9)(p23;q34) t(3;3)(q21;q26) -5/del(5q) -7/del(7q) Otras: 20q, 21q, del(9q), t(9;22), Anorm. 17p, cariotipo complejo SMD -5 -7/del(7q) inv(3)(q21q26) t(6;9)(p23:q34) Cariotipo complejo
a
Genes de fusin
Otros factores modificantes
AML1/ETO CBFb/MYH11 PML/RARa PLZF-RARa NPM-RARa NuMA-RARa
FLT3 ITDa (9%) + del(9q), + alt. Complejas FLT3 ITD (7%) FLT3 ITD (37%)
FLT3 ITD (28%) FLT3 ITD (34%) MLL ITD (10%) FLT3 ITD (20-30%)
MLL MLL/AF4 MLL/AF9 MLL/ELL MLL/ENL DEK/CAN Riboforina/EVI1
FLT3 ITD (0%)
inv(3)(q21q26) FLT3 ITD (17%) Resistencia a drogas Resistencia a drogas FLT3 ITD (7%)
DEK/CAN
internal tandem duplication
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Tabla 30-2. Clasificacin de LLA en grupos pronsticos segn la citogentica Citogentica Citogentica favorable Hiperdiploida >50 cromosomas t(12;21)(p13;q22)a Citogentica desfavorable LLA t(9;22)(q34;q11.2) t(4;11)(q21;q23) Hipodiploida
a
Gen de fusin
TEL/AML1
BCR/ABL MLL/AF4
translocacin crptica por citogentica, detectable por estudio molecular
f) Sndromes linfoproliferativos En los SLP el estudio citogentico puede confir mar un diagnstico provisorio: por ejemplo, el hallazgo de t(14;18)(q32;q11) confirma la sospecha de linfoma folicular, t(11;14)(q13;q32) lo hace respecto del linfoma del manto y una t(2;5)(p23;q35) la sospecha de linfoma de clulas grandes anaplstico de lnea T. Sin embargo, muchas translocaciones no son totalmente especficas de una categora histolgica, de modo que el cariotipo debe interpretarse en el contexto de los hallazgos citolgicos y clnicos. Por ejemplo, la t(11;14)(q13;q32) no slo se detecta en el linfoma del manto, sino tambin en una proporcin significativa de pacientes con linfoma esplnico con linfocitos vellosos, en algunos pacientes con leucemia prolinfoctica B y en mieloma mltiple. En los SLP las alteraciones citogenticas tienen importancia pr onstica slo cuando se consideran en conjunto el diagnstico preciso y el cariotipo. En los pacientes con leucemia linftica crnica tipo B (LLC-B), el pronstico y el curso clnico son muy variables. Algunos permanecen estables y otros desarrollan una progresin de la enfermedad, requiriendo tratamiento. Estudios de citogentica convencional han detectado algunas anormalidades cromosmicas en 40 50% de los pacientes. Estudios FISH han revelado anormalidades no detectadas por la citogentica. Por citometra de flujo se ha analizando la expresin de CD38 encontrando positividad asociada a algn desbalance cromosmico y los estudios de mutaciones en
los genes de inmunoglobulinas han mostrado que el grupo de pacientes que tiene enfer medad estable o lenta progresin, presenta mutaciones somticas, a diferencia del grupo que no las presenta. Sin embargo, se necesita ms investigacin para aclarar si alguna de las alteraciones encontradas tiene un rol en el cambio de curso de la enfermedad. 3.1.3. Aspectos prcticos Para lograr resultados ptimos al tomar una muestra para anlisis citogentico y evitar prdida de tiempo y recursos valiosos, sta debe transportarse de inmediato al laboratorio, acompaada de los detalles clnicos ms relevantes y el diagnstico probable. Debe consultarse los resultados del inmunofenotipo y del examen citolgico de mdula sea, hasta completar la informacin necesaria. Por ejemplo, en un sndrome linfoproliferativo slo es relevante seguir adelante con el estudio citogentico si se confirma la infiltracin de la mdula sea por clulas neoplsicas. 3. 2. Hibridacin in situ con fluorescencia 3.2.1. Antecedentes generales A finales de la dcada de 1980 se desarrollaron varias tcnicas basadas en FISH, las cuales han significado un gran avance en la citogentica. Estas tcnicas utilizan secuencias de cidos nucleicos como sondas para blancos especficos en el DNA. Virtualmente cualquier segmento del DNA genmico se puede usar como sonda para investigar una regin problema cuyo fragmento est identificado previamente. Puede estudiarse tanto en cromosomas metafsicos como en clulas interfsicas y tambin analizarse varias
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regiones simultneamente usando diferentes fluorocromos para marcar las sondas. Las aplicaciones de las tcnicas de FISH son numerosas (tabla 30-3). Aunque algunas de sus aplicaciones permanecern solamente como herramientas de investigacin, esta tecnologa y las sondas comer ciales para muchas anormalidades cromosmicas de relevancia diagnstica, estn hoy al alcance de la mayora de los laboratorios clnicos. Es importante contar con esta metodologa en la identificacin de translocaciones recurrentes en las leucemias, en los casos en que los estudios citogenticos no resultan informativos ya sea por bajo ndice mittico, mala morfologa de los cr omosomas o en casos de reordenamientos muy complejos. En los ltimos aos se ha desarrollado ms an, comenzando una nueva era para la citogentica molecular, con el FISH Mltiple, cariotipo multicolor o Spectral karyotyping (SKY), hibridacin del genoma comparativo (CGH) y tcnicas de microarrays, que per miten identificar alteraciones no detectables por la citogentica convencional. 3.2.2. Aspectos metodolgicos El mtodo se basa en la unin, en forma complementaria, de una secuencia de nucletidos denominada sonda, a una secuencia blanco especfica de DNA o RNA en la clula.
La sonda est marcada con un fluorocromo y los sitios donde se une, se visualizan en la observacin al microscopio de fluorescencia. Se utilizan clulas fijadas, que han tenido un procedimiento de cosecha como para un estudio citogentico convencional y son goteadas sobre un portaobjetos. Se someten a denaturacin del DNA con formamida y luego se dejan en contacto con la sonda especfica (hibridacin). Despus de unas horas se observa las seales de fluorescencia esperadas. Sondas de DNA. Existen distintos tipos de sondas que se pueden adquirir comercialmente. Las ms usadas en Hematologa son: a) Centr omricas especficas para cada cromosoma. Detectan secuencias repetitivas tipo alfa o beta satlite, ubicadas en el centrmero del cromosoma; se usan para detectar anor malidades cr omosmicas numricas. b) Sondas que pintan todo el cromosoma. Son mezclas complejas de secuencias que cubren un cromosoma completo. Existen para cada uno de los cromosomas. Su utilidad se restringe al anlisis metafsico. Se usan para aclarar mejor las alteraciones complejas encontradas con el estudio citogentico convencional. c) Sondas locus especficas. Detectan alteraciones estructurales como translocaciones, inversiones y deleciones especficas.
Tabla 30-3. Aplicaciones de FISH en Hematologa Identificacin de anormalidades numricas y estructurales Caracterizacin de cromosomas marcadores Deteccin de enfermedad residual mnima Quimerismo de clulas despus de trasplante de mdula sea Identificacin de regiones de delecin o amplificacin
3.2.3. FISH interfsico El FISH interfsico ha facilitado grandes avances en el anlisis citogentico por la habilidad de usar como blanco clulas que no estn en divisin. Esto permite la observacin de gran nmero de clulas, lo cual es una ventaja en
algunas neoplasias hematolgicas en que la actividad proliferativa es baja, o cuando las clulas que se dividen in vitro no son las del clon neoplsico, como sucede en la LLC, linfoma de Hodgkin y mieloma mltiple. En estos casos, el FISH interfsico con sondas regin especficas ha mostrado una alta frecuencia de deleciones
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monoallicas de los genes RB1 (cromosoma 13), p53 (cromosoma 17) y en la regin crtica 11q 22-23, ayudando al diagnstico y/o al seguimiento de la progresin de la neoplasia. 3.2.4. FISH en el seguimiento de una enfermedad En los pacientes con translocaciones especficas como la t(9;22) o Ph en LMC, es importante detectar la presencia de clulas residuales Ph positivas despus del trasplante alogeneico de mdula sea o tratamiento con interfern o imatinib. El mtodo ms sensible es el RT-PCR pero detecta mRNA (lo que se est expresando), en cambio FISH se refiere a porcentaje de clulas. FISH ofrece la posibilidad de analizar muestras de mdula sea o sangre perifrica de los pacientes para una cuantificacin rpida de clulas Ph positivas. En cada laboratorio debe establecerse el lmite mximo de clulas positivas con fusin aparente en muestras normales, lo que se denomina cut-off level o valor de corte. 3.2.5. Avances relacionados con FISH En un perodo relativamente corto, el mtodo FISH ha tenido un gran impacto en el anlisis citogentico, debido a la rapidez de ejecucin, sensibilidad y flexibilidad de sus aplicaciones. El FISH convencional slo puede dar respuestas a preguntas precisas a investigar y generalmente requiere algn conocimiento previo del cariotipo. Con el advenimiento reciente del FISH multicolor que permite visualizar los 23 pares cromosmicos en diferentes colores, la citogentica alcanza una mejor definicin del cariotipo. El beneficio mayor de este desarrollo ser la identificacin de nuevas alteraciones y su correlacin con la clnica. Muchas de las innovaciones recientes estn relacionadas a la automatizacin. Los equipos de microscopio con cmaras y programas para captura y manipulacin de imgenes harn disminuir los aspectos ms laboriosos del anlisis citogentico. 4. BIOLOGA MOLECULAR La deteccin de cambios en el cdigo DNA o RNA en una clula enferma frecuentemente provee informacin patolgica til para el
diagnstico, pronstico y manejo de la enfermedad. Los anlisis relacionados con el DNA son el punto principal de la investigacin en patologa molecular. Los mtodos para detectar estas alteraciones han evolucionado de la investigacin al laboratorio de diagnstico. Una de las tcnicas ms poderosas en esta nueva rama de la patologa ha sido la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La utilizacin de la PCR en patologa no slo provee nuevas posibilidades diagnsticas, sino que tambin requiere adquirir experiencia en su manejo e interpretacin para conseguir resultados confiables. La base biolgica de estas tcnicas es que los tumores representan neoplasias clonales que derivan de una o pocas clulas progenitoras, que imparten esa relacin clonal a todas las clulas hijas. Aparte de los anlisis de clonalidad como marcadores de crecimiento neoplsico, la presencia o ausencia de ciertas anormalidades cromosmicas primarias y el nmero y tipo de anomalas genticas secundarias se hacen cada vez ms importantes para establecer el grado biolgico de agresividad. Las leucemias y los linfomas son neoplasias monoclonales y los avances recientes sobre alteraciones como las translocaciones cromosmicas han permitido un mejoramiento en su clasificacin. La tcnica de PCR es til para establecer diagnsticos, por ejemplo, la t(9;22) es considerada una caracterstica definitiva de la LMC y la t (2;5) define un subtipo de linfomas anaplsticos de clulas grandes con caractersticas clnicas y biolgicas nicas. Permite determinar la presencia de factores pronsticos en las leucemias, relacionado con la presencia o ausencia de determinadas alteraciones, as la deteccin de FLT3-ITD (duplicacin interna en tandem del gen FLT3) en las leucemias mieloides agudas le confieren peor pronstico. Adems, permite evaluar la rapidez de la respuesta al tratamiento en el seguimiento de la enfermedad (estudio de enfermedad mnima residual, ERM). Entre sus ventajas figuran su rapidez, bajo costo y gran sensibilidad. Entre sus limitaciones hay que nombrar que son tcnicas aplicables en el laboratorio clnico rutinario slo para la deteccin de deter minadas alteraciones cromosmicas como los reordenamientos de genes y las translocaciones y el riesgo de falsos positivos por contaminacin.
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4.1. PCR y modificaciones 4.1.1. PCR La PCR es una tcnica in vitro, inventada por Kary Mullis en 1985, que produce mltiples copias de una secuencia de DNA seleccionada, si est presente en la muestra a estudiar. Su sensibilidad se debe a la posibilidad de amplificar millones de veces esa secuencia seleccionada (templado). Una propiedad importante de esta tcnica desde el punto de vista diagnstico es la habilidad de amplificar fragmentos de DNA de tejido fresco o congelado, pero tambin DNA degradado como el que se encuentra en las muestras embebidas en parafina. 4.1.2. RT-PCR El anlisis de la fusin de genes por PCR se basa en el diseo de partidores oligonucletidos para los lados opuestos de la regin de los puntos de ruptura fusionados, de tal forma que el producto de PCR contenga las secuencias especficas de la fusin presentes en el tumor. En la mayora de las aberraciones cromosmicas con fusin de genes los puntos de ruptura en diferentes pacientes estn repartidos en una zona de 10 kb o ms, distancias difciles de cubrir por PCR de DNA en forma rutinaria. Esto implicara que la recombinacin precisa de los puntos de fusin a nivel de DNA, para los diferentes genes de fusin, tendran que ser determinadas para cada paciente en forma individual para poder realizar los anlisis por PCR sensibles. Sin embargo, en muchas leucemias agudas la fusin de genes es transcrita en RNA mensajero (mRNA) de fusin, que pueden servir como blancos de PCR despus de hacer una transcripcin reversa (RT) que los convierte en DNA complementario (cDNA). La RT-PCR puede detectar transcritos de fusin gnica con gran sensibilidad. Este mtodo es til para detectar ERM despus de la quimioterapia o trasplante de mdula sea. 4.1.3. Q-PCR Para hacer anlisis cuantitativos se dispone de la tcnica de PCR cuantitativo (Q-PCR). En el PCR clsico pequeas variaciones en la eficiencia de la reaccin pueden producir grandes cambios despus de 30-35 ciclos de amplificacin. La Q-PCR en cambio permite cuantificar durante la fase exponencial de la amplificacin por PCR. En los anlisis por PCR cuantitativo se genera un grfico de amplificacin y el ciclo en el cual
la seal de fluorescencia excede un cierto nivel de fluorescencia basal, es directamente proporcional a la cantidad de DNA o cDNA presente en la muestra. El nmero de copias de un transcrito en una muestra de mdula sea puede ser calculado por comparacin con una curva de dilucin de cantidades conocidas de plasmidios conteniendo el mismo transcrito. 4.2. Aplicaciones de las PCR en oncohematologa 4.2.1. Leucemias agudas Los genes involucrados en las aberraciones genticas en las leucemias agudas (LA) juegan un papel en el desarrollo y funcin de las clulas linfoides y mieloides. Frecuentemente codifican para factores de transcripcin pero tambin para reguladores del ciclo celular, transduccin de seales, r eceptores y molculas de inmunoglobulina Ig o receptores de clulas T (TCR). El diagnstico de las LA es multidisciplinario, con citologa, inmunofenotipo y citogentica como las metodologas ms utilizadas. La PCR es una tcnica complementaria que puede ayudar a confirmar o descartar un diagnstico por la presencia o ausencia de deter minadas alteraciones moleculares. El inmunofenotipo y la citologa no son en general tcnicas pronsticas, mientras que la evaluacin gentica ha servido para definir el pronstico de los pacientes. Los estudios clnicos han demostrado que las aberraciones cromosmicas en las leucemias linftica aguda (LLA) y mieloide aguda (LMA) pueden ser utilizadas como clasificacin de grupos de riesgo (tablas 30-1 y 30-2). As la presencia de t(9;22) y t(4;11) en LLA estn asociadas con mal pronstico, mientras que la t(12;21) en las LLA as como la t(8;21), t(15;17) e inv(16 ) en las LMA estn asociadas a buen pronstico. Adicionalmente a esta clasificacin molecular de LA al diagnstico, las aberraciones cromosmicas con genes de fusin especficos de leucemia pueden ser utilizados como blancos de PCR para la deteccin de ERM durante el seguimiento, con sensibilidades de 10-3 a 10-6. El estudio de los pacientes con leucemias agudas durante y despus del tratamiento para descubrir la presencia de clulas leucmicas remanentes (enfermedad residual mnima ERM) ha mostrado ser importante para evaluar la efectividad del tratamiento. Particularmente la
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medicin semicuantitativa por Q-PCR de la disminucin de las clulas leucmicas durante las primeras fases del tratamiento tiene un alto valor pronstico. Leucemia linfoblstica aguda El diagnstico de las LLA se hace esencialmente por estudios morfolgicos e inmunofenotpicos. Los blastos de las LLA contienen mutaciones somticas adquiridas que proporcionan datos sobre la patogenia y que influyen fuertemente en el pronstico. Aproximadamente un tercio de las LLA presentan translocaciones cromosmicas, que pueden ser detectadas por RT-PCR, citogentica o FISH, y que constituyen factores pronsticos. La definicin clsica de remisin en LLA, basada
en la citomorfologa de la mdula sea (MO), todava permita la presencia de hasta 5% de linfoblastos, por lo que es no es capaz de discriminar entre los pacientes con alta posibilidad de recada y los pacientes con excelente pronstico (tabla 30-4, figura 30-2). Diversos estudios han demostrado que el seguimiento de la ERM en pacientes con LLA tiene un valor pronstico significativo. La respuesta inicial a la terapia de induccin de remisin es un de los factores pronsticos ms importantes en la LLA que puede ser utilizado para mejorar la estratificacin teraputica. Los pacientes que responden lentamente tienen un alto riesgo de recada, mientras que aquellos que fracasan en lograr una remisin completa (RC) a las 4-6 semanas de tratamiento tienen un particular mal pronstico.
Tabla 30-4. Porcentajes de respuesta completa hematolgica y molecular despus del tratamiento de inducin en pacientes adultos con LLAa. RC hematolgicab < 10-2 82% 88% 87% 83% 77% 78% 82% 18% 41% 63% 4% RC molecularc <10-4 RC moleculard <10-4 y negativo
Sensibilidad Promedio Riesgo estndar Lnea B Lnea T Riesgo alto Ph/BCR-ABL
RC, Remisin completa a, Resultados de GMALL (Estudios multicntricos alemanes para adultos con LLA). b, Observacin morfolgica. c, Niveles de ERM inferiores a <10-4 , positivo o negativo (sensibilidad mnima 10-4). d, ERM no detectable a sensibilidades inferiores a 10-4 .
Figura 30-2. Grfico hipottico que muestra la disminucin de las clulas leucmicas y la recada en pacientes con distintas LLA, durante y despus del tratamiento. (A) Lmite de deteccin por citomorfologa. (B) Rango de deteccin lmite por citometra de flujo. (C) Rango de deteccin por tcnicas de PCR.
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Actualmente, por su alta sensibilidad no alcanzada por las tcnicas de citogentica y FISH, se utilizan tres tcnicas para el estudio de ERM en pacientes con LLA: (a) RT-PCR para detectar translocaciones o expresiones aberrantes de genes, (b) PCR para detectar reordenamientos especficos de genes de inmunoglobulina (Ig) y de TCR, y (c) Citometra de flujo, para detectar inmunofenotipos aberrantes asociados a leucemia. Las caractersticas de estos mtodos, con sus ventajas y desventajas, se resumen en la tabla 30-5. A continuacin se describen los aspectos ms relevantes de a y b. Aspectos sobre Citometra de flujo se describen en el punto 5.
a) Anlisis por RT-PCR de aberraciones cromosmicas. Las aberraciones cr omosmicas estructurales como las translocaciones y las inversiones son blancos especficos de leucemias, ideales para ser estudiados por R T-PCR. Estos blancos permanecen estables durante el curso de la enfermedad y pueden ser detectados con sensibilidades de 10-4 a 10-6. En las LLA estos blancos de PCR son mayoritariamente transcritos de fusin de genes o transcritos especficos expresados en forma aberrante, que pueden ser detectados mediante RT-PCR (tabla 30-5).
Tabla 30-5. Caractersticas de las tcnicas actualmente empleadas para la deteccin de ERM en LLA Citometra de flujo Inmunofenotipo Sensibilidad Aplicabilidad LLA prec B LLA-T Ventajas 10-3-10-4 60-98% 90-95% . Mayora de pacientes . Costo mediano . Rpido:1-2 das RT-PCR Transcritos de genes de fusin 10-4-10-6 40-45%* 15-35%** . Fcil y bajo costo . Sensible y especfico . Alteracin estable . Rpido:2-3 das . Sirve para seguimiento de grupos uniformes de pacientes p.e. Ph+ . til en pocos pacientes . Falsos positivos por contaminacin PCR de genes Ig/TCR Regin de unin especfica 10-4-10-5 90-95% 90-95% . Casi todos los pacientes . Sensible . Paciente especfico . Rpido en seguimiento : 2-3 das
Desventajas
. Sensibilidad limitada . Preferible 2 fenotipos aberrantes por paciente
. Lento al diagnstico . Identificacin de regiones de unin y test de sensibilidad . Costoso . Preferible 2 blancos de PCR por paciente por posibilidad de evolucin clonal
*Se refiere particularmente en LLA de nios a t(12;21)(TEL-AML1) y en adultos a t(p;22)(BCR_ABL). **Se refiere mayormente a del(1) con fusin SIL-TAL y t(5;14) con expresin aberrante de HOX11L2, que ocurren en conjunto en el 25-35% de las LLA de nios y en el 15-20% de las LLA de adultos.
Dos grandes desventajas limitan la aplicacin de este tipo de PCR para el seguimiento de ERM: su aplicabilidad a una minora de pacientes con
LLA y la posibilidad de falsos positivos por contaminacin (tabla 30-6).
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Tabla 30-6. Aberraciones cromosmicas en LLA como blancos de RT-PCR para ERM Aberracin Precursor LLA-B t(9;22)(q34;q11) t(1;19)(q23;p13) t(4;11)(q21;q23) 11 q23 aberraciones t(12;21)(p13;q22) TOTAL LLA-T tAL1 delecin t(8;14)(q24;q11) t(11;14)(p15;q11) t(11;14)(p13;q11) t(11;14)(p34;q11) t(10;14)(q24;q11) TOTAL SIL-TAL1 (DNA/mRNA) c-MYC-TCRA/D (DNA) LMO1-TCRD (DNA) LMO2-TCRD (DNA) TAL1-TCRD (AND) HOX11-TCRD (AND) Blanco (DNA o mRNA)a Frecuencia % b Nios Adultos 5-8 5-8 3-5c 5-6c 30 40-45 10-25 5-10 5-10 5-10 5-10 5-10 25-30 30-35 3-4 3-4 <5 1-3 40-45 5-10 5-10 5-10 5-10 5-10 5-10 10-15
BCR-ABL (ARMm) E2A-PBX1 (mRNA) MLL-AF4 (mRNA) MLL aberante (mRNA) TEL-AML1 (mRNA)
a, El lmite de deteccin por PCR de aberraciones cromosmicas es 10-4 a 10-6. b, Los porcentajes indicados representan frecuencias de los grupos de precursores de LLA-B y LLA-T. c, En las LLA infantiles la frecuencia de t(4;11) puede ser hasta del 50% y las aberraciones relacionadas a 11q23 hasta del 70%.
b) Anlisis por PCR de reordenamientos de genes de Ig y TCR. Las regiones de unin de los genes reordenados Ig y TCR son secuencias tipo huellas dactilares, que difieren en la longitud y composicin en cada linfocito o clon linfocitario y en consecuencia tambin en cada enfermedad linfoide maligna, como las LLA. Estos blancos especficos pueden ser detectados por PCR en la mayora de los precursores de LLA tipo B y de las LLA tipo T, con una sensibilidad cercana a 10 -4-10 -5. La mayor desventaja de este estudio en el seguimiento de ERM es que siguen ocurriendo continuos reordenamientos durante el curso de la enfermedad, que pueden resultar en falsos negativos. Leucemias mieloides agudas El diagnstico de las LMA se hace tambin por morfologa e inmunofenotipo y al igual que en las LLA los factores pr onsticos ms importantes son la presencia o ausencia de anormalidades cariotpicas especfias. Las tcnicas de RT-PCR, citogentica o FISH pueden
ser utilizadas para detectar la presencia de las translocaciones que confieren un pronstico favorable (tabla 30-1). La deteccin de ERM post-terapia para identificar a los pacientes con mayor riesgo de recada se realiza por PCR y citometra de flujo. El anlisis de inmunofenotipo puede ser informativo en el 80-85% de los casos, mientras que el anlisis molecular por PCR es til en menos del 30% de los pacientes con LMA, pues slo la minora expresan mar cadores moleculares que se pueden estudiar (AML1/ ETO, PML/RAR, inv(16), y posiblemente mutaciones en FLT3). Los pacientes que logran RC despus del primer ciclo de quimioterapia tienen mejor pronstico que los que la alcanzan despus del segundo ciclo, pero el significado de resultados positivos en ERM no siempre es claro y diferentes niveles de enfermedad residual parecen tener un significado distinto para diferentes tipos de LMA. En los pacientes con PML/RAR la remisin molecular est asociada con larga sobrevida libre de enfermedad, mientras que en los pacientes con
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AML1/ETO la positividad molecular en remisin clnica no necesariamente implica recada de la enfermedad. 4.2.2. Leucemia mieloide crnica La LMC es un desorden hematopoytico caracterizado por la expansin de clulas progenitoras de la mdula sea. Su marca es la presencia de la translocacin cromosmica t(9;22), conocida como cromosoma Philadelphia. El diagnstico se hace por estudios morfolgicos y las tcnicas de citogentica. La FISH o la PCR permiten confirmar el diagnstico y distinguirla de otr os sndr omes mieloproliferativos crnicos. El seguimiento de los pacientes tratados con drogas como Imatinib se hace por FISH, RT-PCR
o Q-PCR. Los pacientes en fase crnica que alcanzan RC molecular (RT-PCR negativo) tienen un riesgo significativamente menor de progresin de la enfermedad en los siguientes 24 meses, que los que no lograron alcanzarla. 4.2.3. Linfomas no Hodgkin Las tcnicas moleculares tienen una importancia prctica creciente en el anlisis de los Linfomas no Hodgkin (LNH), tanto para el diagnstico como para el pr onstico (tabla 30-7). Adicionalmente las anormalidades clonales proveen marcadores para la deteccin de ERM. Se necesita ms investigacin para evaluar la contribucin de las tcnicas de biologa molecular respecto de las tcnicas clsicas de morfologa, inmunologa y cariotipo.
Tabla 30-7. Anormalidades cromosmicas en LNH comunes Subtipo de linfoma Alteracin cromosmica Linfoma linfoplasmactico Linfoma folicular Linfoma del manto Linfoma MALT Linfoma difuso de clulas grandes Linfoma de Burkitt t(9;14)(p13;q32) t(14;18)(q32;q21) t(11;14)(q13;q32) t(11;18)(q21;q21) t(11;14)(p22;q32) der(3)(q27) t(8;14)(q24;q32) t(2;8)(P11;Q24) t(8;22)(q24;q11) % Genes involucrados PAX5/IgH BCL2/IgH Genes Ig Anlisis diagnstico pronstico FISH FISH, PCR FISH, PCR FISH, PCR FISH, PCR FISH FISH de c-MYC FISH de c-MYC FISH de c-MYC FISH, PCR
50 90 70
R, M R, M, O
Cyclina D1/IgH R, U R, M, O R, M, O R, M R, M R, M R, M
50 AP12/MLT1 raro BCL10/IgH 35 80 15 5 60 BCL6 c-MYC/IgH c-MYC/IgK c-MYC/IgL NPM/ALK
Linfoma anaplstico t(2;5)(p23;q35) de clulas T grandes
R, reordenado; M, mutado; U, no mutado; O, en proceso de mutacin
La gran mayora de los LNH han tenido reordenamiento clonal de las Ig o de los TCR. La identificacin de estos reordenamientos por PCR (clonalidad linfoide) es ampliamente utilizada en el diagnstico y en el seguimiento, y r epresenta pr obablemente el anlisis molecular ms realizado en los LNH.
La deteccin de los reordenamientos Ig/TCR V(D)J se basa en que son clon especficos y altamente variable respecto a la longitud y el contenido de nuecletidos, al igual que en el estudio de las LLA. IgH representa el blanco gentico ms til para la deteccin de clonalidad B y TCR representa el marcador molecular ms
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til para clonalidad de clulas T. El anlisis de la clonalidad linfoide es frecuentemente til en la distincin entre linfoadenopatas malignas versus reactivas en los casos en que los anlisis mor folgicos e inmunolgicos no sean concluyentes; pero hay que tener en cuenta que clonalidad no es sinnimo de malignidad y que los resultados deben ser analizados en conjunto con aspectos clnicos, inmunolgicos y citogenticos. En trminos moleculares las anormalidades cromosmicas son de dos tipos en general: aquellas en las que el punto de ruptura tiene lugar en los genes involucrados, dando lugar a transcritos de fusin de RNA y a protenas quimricas, y los que representan errores de reordenamiento en los genes Ig/TCR. Para propsitos diagnsticos es importante la deteccin de algunas anormalidades por PCR. Por ejemplo la translocacin t(14;18) en los linfomas foliculares es detectada en el 75% de los casos solamente debido a la variacin en los puntos de ruptura. La translocacin t(11;14) est presente en el 40% de los linfomas del manto, pero puede tener lugar en otros desrdenes linfoproliferativos de tipo B con diferentes pronsticos y requerimientos teraputicos, incluyendo linfomas del manto, mieloma mltiple, leucemia de clulas velludas, leucemia prolinfoctica y linfoma esplnico con linfocitos velludos. Finalmente la translocacin t(2;5) se detecta en la casi totalidad de los linfomas anaplsticos de clulas grandes. Sin embargo la tcnica ms til para detectar estas alteraciones al diagnstico es FISH. El seguimiento de la enfermedad se puede realizar por PCR slo si result positiva al diagnstico por esta tcnica. 4.3. Consideraciones PCR y TR-PCR tienen una sensibilidad de 10-2 a 10 -3 despus del primer pr oceso de amplificacin de 35 ciclos, por lo tanto las muestras al diagnstico deben resultar positivas si tienen la alteracin que se est estudiando. PCR y TR-PCR tienen una sensibilidad de 10-4 a 10 -6 despus del segundo proceso de amplificacin (reamplificacin) de 30-35 ciclos. Las muestras para estudio de enfermedad residual (ej. pacientes durante y despus del
tratamiento quimioterpico y antes y despus de un trasplante de mdula sea) deben ser reamplificadas para alcanzar este nivel de sensibilidad, slo si han resultado negativas en la primera fase de amplificacin. Se denomina PCR anidado (nested PCR) cuando se utilizan partidores exter nos en el primer PCR y partidores internos en el segundo PCR. Q-PCR y TR-Q-PCR tienen una sensibilidad de 10-4 a 10-5 en amplificacin de 35-45 ciclos. Pueden utilizarse tanto para la etapa de diagnstico como para estudio de enfermedad residual. Se considera recada molecular cuando hay dos resultados positivos seguidos por PCR o RT-PCR, separados por al menos un mes. Las muestras y los reactivos de TR y PCR deben ser manejados en un laboratorio separado del lugar donde estn los termocicladores y de la zona donde se visualizan las muestras amplificadas. Cuando se hace el estudio de una muestra hay que incluir controles positivos y negativos. 5. CITOMETRA DE FLUJO Sin lugar a dudas, una de las herramientas tcnicas de gran valor en el estudio de neoplasias hematolgicas, lo constituye la citometra de flujo. Esta tcnica permite analizar individualmente miles de clulas en un perodo muy corto de tiempo (segundos). El avance tecnolgico en reas tan diversas como la informtica, electrnica, ptica y biotecnologa (en especial la produccin de anticuerpos monoclonales), han permitido el desarrollo de la citometra de flujo como una herramienta clnica de gran importancia. Es as como las aplicaciones clnicas de la citometra de flujo son cada vez ms numerosas (tabla 30-8) y en especial en el estudio de leucemias y linfomas. A continuacin se revisarn los aspectos fundamentales de la citometra de flujo, la forma de presentar los datos obtenidos y los criterios de anlisis de los mismos. Finalmente se abor darn algunos de los patrones inmunofenotpicos caractersticos de diversas leucemias, as como los diversos tipos de especmenes clnicos que se pueden analizar.
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Tabla 30-8. Aplicaciones clnicas de la citometra de flujo Inmunofenotipificacin Leucemias y linfomas Deteccin de enfermedad mnima residual Subpoblaciones linfoides CD3, CD4, CD8, CD19 y NK (inmunodeficiencias primarias y secundarias) Razn linfocitos T CD4/CD8 (infeccin VIH-SIDA) Poblaciones linfoides T y B (clonalidad en mucosas y ganglios, linfomas) Macrfagos (enfermedad inflamatoria) Contenido de DNA (Ploida de DNA) Fases del ciclo celular Protenas del ciclo celular (ciclinas, kinasas, etc.) Oncogenes (p53, PCNA, ki-67, etc.) Clulas progenitoras (CD34, CD117) Cross match Citocinas intracelulares Fagocitosis Estallido respiratorio pH intracelular Calcio intracelular Potencial de membrana
Cncer
Trasplantes Estudios funcionales
Plaquetas
Glicoprotenas (Ej. tromboastenia de Glanzmann) Fisiologa plaquetaria Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas Fenotipo MDR: glicoprotena p, bombas de eflujo. Recuento absoluto de clulas CD38 en linfocitos TCD8 (infeccin VIH-SIDA) CD64 en granulocitos (infeccin) Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas (Prpuras trombocitopnicos inmunes)
Estudios de resistencia a drogas Cuantificacin de molculas
Deteccin de citoquinas solubles
En base a partculas cubiertas con anticuerpos anti-citoquinas
5.1. Generalidades Fundamentos bsicos. La citometra de flujo es una tecnologa que permite medir caractersticas fsicas y qumicas de clulas en suspensin. Entrega informacin sobre el tamao celular, la granularidad o complejidad interna, as como tambin de la intensidad de fluorescencia relativa que posean las clulas en estudio. El principio bsico de la citometra de flujo (y de muchos contadores hematolgicos), es la interaccin de una fuente de luz, especficamente un rayo lser, con clulas en suspensin, las cuales son canalizadas e interrogadas individualmente por el lser, recogindose la informacin obtenida
de dicha interaccin. Existen equipos que cuentan con uno, dos o ms rayos lser, siendo lo usual, la presencia de un lser que emita a 488 nm (lser de argn). La interaccin de una clula con la luz del lser (ligth scatering), puede producir la desviacin de esta ltima, en un ngulo menor a 10 grados, lo que se conoce como dispersin frontal o FSC (forward scatter) y su vez la desviacin de la luz en ms de 10 grados, pero en menos de 90, se conoce como dispersin lateral o SSC (side scatter). Es as como FSC y SSC son parmetros intrnsecos a la clula. Si a la suspensin celular se agrega un fluorocromo que tenga afinidad por algn componente
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celular y que adems este fluorocromo sea excitable con el rayo lser en uso, se podr detectar un cambio en la longitud de onda de emisin del fluorocromo; lo anterior se traducir en for macin de rangos o canales de fluorescencia, la cual es posterior mente detectada. Por ejemplo, la fluorescena, fluorocromo ampliamente usado tanto en microscopa de fluorescencia como en citometra de flujo, tiene un espectro de excitacin mxima de 494 nm, siendo su espectro de emisin de 518 nm. En los citmetros de flujo actuales, con aplicacin en clnica, es posible detectar simultneamente desde 1 hasta 4 rangos o canales de fluorescencia, lgicamente usando fluorocromos que emitan en diferente longitud de onda. Anticuerpos conjugados con fluorocromos. Dado que ciertos fluorocromos se pueden unir a protenas, es posible disponer anticuerpos conjugados con diversos fluorocromos. Si a esto se le suma el explosivo desarrollo de la produccin y comercializacin de anticuerpos monoclonales, conjugados con diversos fluorocromos, las potencialidades son enormes. Es as como hoy se dispone de anticuerpos contra una infinidad de molculas biolgicas, lo que se ha traducido en un gran desarrollo de los estudios de caracterizacin inmunofenotpica de diversos tipos celulares, muchos de ellos con
una aplicacin clnica concreta, como es el caso del estudio inmunofenotpico de enfermedades oncohematolgicas (leucemias, linfomas, mieloma mltiple y otras). Presentacin de datos y anlisis. Los citmetros de flujos, a pesar de tener un sistema de fluidos, un sistema ptico y un sistema electrnico, es un equipo controlado informticamente, existiendo para ello, diversas plataformas (pc y macintosh principalmente), las cuales, mediante los programas adecuados permiten tanto la adquisicin como el anlisis de los datos obtenidos. La accin de evaluar una suspensin de clulas en un citmetro de flujo, se llama adquisin (se adquiere la informacin de un determinado nmero de clulas en un tiempo determinado). Una vez adquirida la informacin sobre una suspensin celular, esta se almacena como un archivo, y ste es posible visualizarlo de diversas formas, dependiendo del programa de anlisis que se use. Es as como los datos se pueden visualizar como grficos de puntos, contorno, densidad, histogramas, tridimensional, etc., obtenindose, en cada caso infor macin numrica como por ejemplo: coeficiente de variacin, media de intensidad de fluorescencia, mediana, media geomtrica, etc. (figura 30-3).
Figura 30-3. Distintas formas de presentar los datos en citometra de flujo: SSC (granularidad) y CD45 (antgeno leucocitario comn). (A) grfico de puntos; (B) grfico de densidad; (C) grfico tridimensional; (D) grfico de contorno y (E) histograma (representa slo SSC).
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Un concepto fundamental al efectuar un anlisis es la correcta seleccin de la regin de inters a estudiar, la que se conoce como gate o ventana de anlisis. Por ejemplo, si se han analizado leucocitos, se tiene informacin de las diversas poblaciones leucocitarias presentes, pero es posible acotar an ms el anlisis, al seleccionar, por ejemplo, la poblacin de linfocitos, para lo cual se dibuja una gate. Posteriormente, se puede obtener informacin especfica slo de la regin de linfocitos, como por ejemplo la expresin o ausencia de diversas molculas y presencia de clulas normales y anormales (figura 30-4). Es posible combinar varias regiones al momento de hacer un anlisis, lo que se traduce en una gran capacidad y versatilidad en el manejo de la informacin. 5.2. Aplicaciones en el estudio de Leucemias, linfomas y gammapatas monoclonales 5.2.1. Indicaciones mdicas La inmunofenotipificacin de leucemias, es til clnicamente en el diagnstico, clasificacin, pronstico y monitoreo de estas patologas (ver captulo 12). Si bien el inmunofenotipo no puede establecer un diagnstico de leucemia aguda, s es esencial para determinar si las clulas neoplsicas son de lnea linfoide o mieloide. A su vez la subclasificacin inmunolgica de leucemias linfoblsticas agudas y la identificacin de fenotipos mieloides con translocacin t(15;17) son de valor pr onstico. Adems el inmunofenotipo es til en el monitoreo de leucemias linfoblsticas y mieloblsticas agudas. En el caso de los sndromes linfoproliferativos crnicos, el inmunofenotipo es la modalidad diagnstica primaria, teniendo un uso clnico en la subclasificacin, evaluacin pronstica y seguimiento de estas patologas. De igual forma, el inmunofenotipo de gammapatas monoclonales, tiene valor diagnstico, siendo til en identificar clulas plasmticas clonales residuales. En los sndr omes mielodisplsicos y mieloproliferativos, el inmunofenotipo es til en la subclasificacin y en la evaluacin del seguimiento de estos sndromes. 5.2.2. Toma de muestras para estudios inmunofenotpicos En el caso de mdula sea, se requiere un
mnimo de 1 mL (idealmente 3 mL), de mdula usando EDTA como anticoagulante. No es infrecuente que la mdula tienda a coagular, lo que no impide su estudio. En caso de sangre perifrica, esta se debe obtener mediante puncin venosa limpia, tambin usando EDTA como anticoagulante, requirindose un mnimo de 3 mL. El uso de EDTA permite una buena conservacin de la morfologa celular, pero impide la realizacin de estudios funcionales (pH intracelular, estallido respiratorio, produccin de citoquinas, etc.), en cuyo caso se debe usar heparina como anticoagulante. 5.2.3. Almacenamiento y transporte de muestras para estudios inmunofenotpicos La muestra obtenida, ya sea mdula sea o sangr e perifrica, se debe mantener a temperatura ambiente, no se debe refrigerar ni tampoco exponer al calor. En condiciones ideales la muestra debe ser procesada lo antes posible, con un tiempo mximo de 24 a 48 horas. 5.2.4. Preparacin de las muestras para estudio inmunofenotpico Si bien se puede utilizar la centrifugacin en gradiente de densidad para aislar clulas mononucleares, se recomienda el uso de muestras totales (sangre, mdula sea) con la adicin de un agente lisante de eritrocitos despus de la marcacin. En caso de mdula sea, es conveniente lavar la muestra con una solucin salina isotnica (para eliminar inmunoglobulinas solubles) y luego filtrar (50 m) a fin de eliminar restos estromales, grasas, etc. Para detectar antgenos de superficie, las clulas se deben marcar; con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos luego se procede a lisar eritrocitos y posteriormente se fijan las clulas. Para detectar antgenos citoplamticos, las clulas se deben fijar, permeabilizar y luego marcar. Si se desea detectar simultneamente antgenos de membrana y citoplasmticos, se procede a marcar el antgeno de membrana, luego se lisan los eritrocitos, luego las clulas se fijan y permeabilizan, para luego marcar el antgeno citoplasmtico. Para detectar cadenas livianas o pesadas de inmunoglobulinas, se debe eliminar la inmunoglobulina citoflica, incubando 15 a 30 minutos a 37C con una solucin que contenga, por ejemplo suero fetal bovino.
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5.2.5. Anlisis segn cuadro clnico El nmero de anticuerpos y fluorocromos que se pueden combinar, estar limitado por la capacidad de cada instrumento, siendo usual combinar dos a tres tubos (en ocasiones cuatro). Con respecto a qu anticuerpos usar, se debe considerar que los dos objetivos principales del inmunofenotipo son establecer el linaje y la madurez de las clulas oncohematolgicas. En el caso de leucemias agudas, para definir
linaje, es recomendable evaluar antgenos de lneas linfoide B, linfoide T y mieloide. Para evaluar maduracin son tiles los antgenos CD34, TdT (deoxinucleotidil transferasa terninal), CD10 (CALLA) y HLA-DR (tabla 30-9). El inmunofenotipo puede ser de gran ayuda en el diagnstico de una leucemia mieloide aguda, en especial del tipo M6 o eritroleucemia (glicoforina A), M7 o megacarioblstica (CD41, CD61) y para diferenciar M3 de M4, en especial M3 hipogranular (HLA-DR negativo).
Tabla 30-9. Anticuerpos para definir linaje y grado de madurez en leucemias agudas Propsito Definir linaje LLA-B CD19 CD20 CD79 CD22 CD34 CD117 TdT CD10 (CALLA) Ig cit. Ig sup. LLA-T CD3c CD3m CD7 CD5 CD2 CD34 CD117 TdT CD10 (CALLA) CD1a LMA CD13 CD33 MPOc
Definir grado de madurez
CD34 HLA-DR CD15
LLA-B, leucemia linfoblstica aguda de clulas B; LLA-T, leucemia linfoblstica aguda de clulas T; LMA, leucemia mieloide aguda; CD3c, CD3 citoplasmtico; CD3m, CD3 membrana; MPOc, mieloperoxidasa citoplasmtica; TdT, deoxinucleotidil transferasa terninal; Ig cit, inmunoglobulina citoplasmtica; Ig sup, inmunoglobulina de superficie.
En los sndr omes linfopr oliferativos, lo primordial es definir el linaje, y en base a esto,
completar el estudio clasificatorio (tabla 30-10).
Tabla 30-10. Anticuerpos para definir linaje y clasificar sndromes linfoproliferativos Propsito Definir linaje SLP-B CD19 CD20 kappa lambda CD5 CD22 CD23 CD11c CD19 CD25 CD103 FMC7 SLP-T CD3 SLP-NK CD3 CD16 CD56
Clasificacin
CD4 CD8 Razn CD4/CD8 TCR TCR
CD2 CD5 CD8
SLP-B, sindrome linfoproliferativo de clulas B; SLP-T, sindrome linfoproliferativo de clulas T; SLP-NK, sindrome linfoproliferativo de clulas NK.
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Frente a una gammapata monoclonal, el mayor objetivo del inmunofenotipo es lograr la discriminacin de clulas normales de aquellas clulas plasmticas neoplsicas, siendo de gran valor en el diagnstico diferencial de mieloma mltiple y gammapatas monoclonales de significado indeterminado. Como panel mnimo se recomienda el uso de CD38, CD19 y CD56, ya que las clulas plasmticas neoplsicas muestran una dbil expresin de CD38 (a diferencia de las clulas plasmticas normales). A su vez, la presencia de CD19, es caracterstica de clulas plasmticas normales y la expresin de CD56 se encuentra en clulas plasmticas neoplsicas.
5.2.6. Informe de resultados El informe de un inmunofenotipo debe incluir la definicin de la presencia o ausencia (positivo o negativo), de un antgeno determinado, en algunos casos su intensidad de expresin (bright o dim). Es importante describir la expresin de varios antgenos por parte de las clulas neoplsicas, ya que en ocasiones puede ser clave para clasificar una leucemia (por ejemplo, la coexpresin de CD19 con CD10, en leucemia linfoblstica aguda de lnea B. (figura 30-4).
Figura 30-4. Concepto de gate o ventana de anlisis en una muestra patolgica de mdula sea. En (A) se identifican dos poblaciones celulares, correspondiendo la regin 1 (R1) a blastos. R1 se representa en grficos (C), (D) y (E). En grfico (C), en cuadrante superior derecho, se puede observar la coexpresin de CD19 (linfocitos B) con CD10 (linfoide inmaduro). En (D) se destaca la expresin de CD34 (clulas progenitoras). En (E) destaca la expresin de TdT (linfoide inmaduro) con ausencia de mieloperoxidasa. Diagnstico: Leucemia linfoblstica aguda de lnea B.
6. INMUNOQUMICA APLICADA A GAMMAPATAS MONOCLONALES Las gammapatas monoclonales incluyen las enfermedades que se originan a partir del linfocito B, caracterizadas por la produccin de molculas o fragmentos de inmunoglobulinas
absolutamente idnticos entre s y que se identifican en suero u orina en forma de una banda pr oteica llamada componente monoclonal. Se las conoce tambin como discrasias de clulas plasmticas, inmunoglobulinopatas, paraproteinemias, disproteinemias y disglobulinemias. Las
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inmunoglobulinas monoclonales producidas por las clulas patolgicas suelen migrar en la fraccin gamma () cuando son sometidas a electroforesis de suero, motivo por el cual se denominan tambin como gammapatas monoclonales. Entre las patologas que cursan con gammapatas monoclonales se encuentra el Mieloma Mltiple, la Macroglobulinemia de Wldenstrom, Amiloidosis y otras (ver captulo 14) En trminos generales, las inmunoglobulinas monoclonales - al igual que las inmunoglobulinas normales - son glicoprotenas que migran en la regin gamma en una electroforesis de suero y poseen actividad de anticuerpo, pero son producto de una o ms mutaciones en los genes que codifican para la
sntesis de las inmunoglobulinas. Las protenas monoclonales tienen por lo tanto una secuencia aminoacdica y una estructura anormal ya que la estructura tridimensional es anormal. Su alta concentracin, se debe simplemente al hecho del gran nmero de clulas clonales que las origina. El isotipo de Inmunoglobulina vara de paciente en paciente, siendo el ms comn IgG y el ms raro IgE. Cada isotipo est asociado a un patrn levemente diferente de la enfer medad; por ejemplo IgA est ms comnmente relacionado con enfermedad fuera del hueso, mientras que mieloma IgD est ms comnmente asociado con leucemia de clulas plasmticas y dao renal. En la tabla 30-11 se muestran los porcentajes de los diferentes tipos de protena monoclonal
Tabla 30-11. Tipos de protena monoclonal % parcial Suero IgG IgA IgD IgE Orina (Bence Jones o cadenas livianas solamente), tipo y 11 % Dos o ms paraprotenas monoclonales Cadenas pesadas solamente Paraprotena no monoclonal IgM (Mieloma mltiple raro, tpicamente asociada con Macroglobulinemia de Waldenstroms) La estructura y funcin de las inmunoglobulinas anor males tiene un gran nmer o de consecuencias patolgicas, tales como: Acumulacin de las inmunoglobulinas debido a una falla en la regulacin de la sntesis. Las molculas anormales pueden adherirse unas a otras y/o con otros tejidos tales como clulas sanguneas, pared de los vasos sanguneos y otros compuestos de la sangre. Esto reduce el flujo sanguneo y la circulacin, causando el sndrome de hiperviscocidad. Aproximadamente el 30 % de las veces, se producen ms cadenas livianas que las <1% <1% <1% 2% 52 21 2 < 0.01 75 % % total
12 % necesarias para combinarse con las cadenas pesadas para formar una molcula entera de inmunoglobulina. Este exceso de cadenas livianas constituye la llamada Protena de Bence- Jones. Esta protena tiene un peso molecular de 22. KDa, lo que le permite atravesar la barrera glomerular y aparecer en la orina, resultando en la acumulacin de protena de 24 horas en la forma de un peak monoclonal de BenceJones. La protena libre de Bence-Jones puede tambin adherirse unas a otras y/o con otros tejidos, de igual forma como lo puede hacer la inmunoglobulina entera, lo que puede llevar a Amiloidosis y Enfermedad de cadenas livianas.
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Las protenas monoclonales anormales, pueden tener tambin un amplio rango de otras propiedades incluyendo: a) unin a factores de coagulacin sangunea lo que resulta en una tendencia al sangramiento y /o flebitis y b) unin a hormonas circulantes, lo que se traduce en una gran variedad de trastor nos endocrinos o desrdenes metablicos.
Adems de la informacin que proporciona el hemograma, velocidad de sedimentacin, mielograma y pruebas bioqumicas tales como calcemia, creatininemia y otras al diagnstico y control de la evolucin de enfermedades caracterizadas por gammapatas monoclonales, el aporte que los Laboratorios Clnicos pueden hacer al diagnstico de estas patologas tiene por objetivo en primer lugar, pesquisar la protena monoclonal, tanto en suero como en orina, identificarla y luego cuantificarla. Actualmente existen adems otros marcadores moleculares que pueden aportar al diagnstico y a establecer un valor pronstico, tal es el caso de la medicin de: -2 microglobulina, protena C-reactiva, interleuquina-6 (IL-6), factor de crecimiento heptico, excrecin urinaria de retinol y anor malidades genmicas asociadas a gammapatas monoclonales. A continuacin se har una breve descripcin de cada uno de ellos 6.1 Pesquisa y estudio de la protena monoclonal a) Electroforesis de protenas. La electroforesis de protenas es el mtodo de eleccin para la pesquisa de una fraccin proteica de carcter monoclonal. Consiste en hacer migrar una alcuota de suero de un paciente en un campo elctrico sobre diferentes soportes tales como, agarosa, acetato de celulosa y mezclas de acrilamida-bisacrilamida. Las ms usadas son la agarosa y acetato de celulosa. Tal como se observa en la figura 30-5 inferior, la imagen consiste en una fraccin proteica concentrada, de mayor o menor intensidad dependiendo de su concentracin, con lmites muy claros y migracin desde las globulinas 2 hasta las globulinas. El estudio densitomtrico de la electroforesis, entrega un trazado en el que se aprecia la presencia de una banda homognea, aguzada, elevada y de base estrecha. El componente monoclonal o componente M se produce por la expansin maligna de un clon de clulas plasmticas pr oductora de inmunoglobulinas idnticas, que se identifican en el electroforetograma por tener la misma carga elctrica.
Figura 30-5. Electroforetograma de una gammapata monoclonal (a) y de una gammapata policlonal (b). En ambos casos, trazado electrofortico y densitograma.
Mediante la electroforesis es posible distinguir los componentes monoclonales de los policlonales, correspondiendo estos ltimos a una respuesta inmune fisiolgica a estmulos antignicos importantes como es el caso de infecciones de diversos orgenes. Es caracterstico de las gammapatas policlonales un trazado electrofortico en el que se observa en la r egin gamma una banda ancha aumentada, de densidad difusa y altura mediana que refleja el producto de diversos clones de clulas plasmticas, cada una de los cuales sintetiza un tipo distinto de inmunoglobulinas (figura 30-6). La presencia de un componente monoclonal en la electr oforesis asociado a hipogammaglobulinemia, es un signo importante y caracterstico de una gammapata monoclonal maligna. Es posible que ocurra el fenmeno contrario, es decir que existiendo una neoplasia monoclonal de clulas plasmticas, no aparezca el componente monoclonal en la electroforesis de protenas sricas; esto puede observarse en la enfermedad de cadenas livianas, mieloma IgD, enfermedad de cadenas pesadas y en el mieloma no secretor. Este ltimo se caracteriza por presentar un componente monoclonal indetectable en sangre y orina y solo es posible detectarlo en el
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interior de las clulas plasmticas de mdula sea por tcnicas como la inmunofluorescencia directa. Existen algunos factores de error que es importante tener en consideracin al momento de informar una electroforesis, ya que suele suceder que se considera como componente monoclonal a ciertos artefactos tales como: (a) fibrina que puede quedar en sueros mal centrifugados o mal separados y que puede aparecer como una fraccin concentrada entre las y globulinas; (b) complejos de hemoglobina-haptoglobina caracterstico de un suero hemolisado, que migran en la regin de la 2 globulinas; y (c) muestra en exceso que quede en el punto de aplicacin de la misma. b) Identificacin y cuantificacin de la protena monoclonal. Si se detecta un componente monoclonal en una electroforesis de protenas convencional, se debe proceder a la identificacin y cuantificacin mediante las tcnicas de inmunoelectroforesis o inmunofijacin, e inmunodifusin radial o nefelometra respectivamente. Su medicin permite establecer un ndice pronstico, mantener un control evolutivo del tratamiento y detectar precozmente el inicio de una inmunodeficiencia Inmunoelectroforesis : Esta tcnica fue introducida en el ao 1953 por Grabar y Williams y es muy til para la identificacin de una protena monoclonal Es un procedimiento que combina la electroforesis con la inmunodifusin. En una primera etapa, el antgeno es sometido a la electroforesis en un medio de agar o acetato de celulosa. En la segunda etapa, (inmunodifusin), la tira electrofortica se cambia de cmara; se hacen unas incisiones en el agar en lneas paralelas al eje de la electroforesis original, y se inserta el antisuero. Se produce entonces la difusin del antisuero en direccin perpendicular a la depresin lineal hacia la zona de la electroforesis para reaccionar con el antgeno correspondiente. Cuando se ha alcanzado una concentracin apropiada de anticuerpo y antgeno, aparece un arco de precipitacin en la forma de una banda ancha con un fondo claro transparente de agar. Si se utiliza antisuero polivalente y suero fresco como antgeno, pueden verse alrededor de 20 zonas de precipitado Inmunofijacin La inmunofijacin se utiliza principalmente para identificar y monitorear proteinas monoclonales (como las IgG, IgM, IgA, cadena ligera lambda y cadena ligera kappa)
como las que se presentan en el mieloma mltiple y en la macroglobulinemia de Waldenstrom. Esta tcnica tambin ha sido empleada para estudiar el polimorfismo proteico (por ejemplo, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa) y en la tipificacin gentica de alfa-1 antitripsina. La muestra a investigar debe colocarse en 6 pocillos diferentes en placas de agarosa para que sea sometida al proceso de electroforesis y las protenas queden separadas de acuerdo a su carga neta. En una segunda etapa se aplican los anticuerpos monoespecficos en 5 de los 6 trazados electroforticos para que la fijacin ocurra. La inmunofijacin puede realizarse en suero, orina, lquido cefalorraqudeo etc. y posee una mayor sensibilidad y poder de resolucin que la inmunoelectroforesis. Inmunodifusin radial. En esta tcnica se prepara un gel de agarosa conteniendo anticuerpos anti-IgG (-M o A); en un pocillo realizado en el gel se agrega la muestra en estudio, generalmente suero. Si ste contiene el isotipo de inmunoglobulina para el cual tiene especificidad el anticuerpo incorporado en el gel, se forma un anillo de precipitacin cuyo dimetr o ser pr opor cional a la concentracin de la inmunoglobulina existente en la muestra. Nefelometra Es una tcnica de laboratorio que se utiliza para obtener una medicin de la cantidad de inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA de manera precisa y rpida. Esta prueba utiliza un instrumento especializado para medir el movimiento de partculas en una solucin (turbiedad), causada por la interaccin de inmunoglobulinas del suer o con inmunoglobulinas anti IgG ( -M, -A) que ha sido agregada al suero. 6.2. Viscosidad srica La hiperglobulinemia que experimentan los pacientes con Mieloma y ms an con macroglobulinemia los conduce a un estado de hiperviscocidad que puede complicarse con una hiper coagulabilidad sangunea. La viscosidad relativa del plasma, con respecto a la del agua (1.0) es de 1.8 en condiciones normales. Los pacientes con Mieloma Mltiple pueden alcanzar valores de 5 a 6 veces superiores a lo normal. 6.3. Beta 2 microglobulinemia Esta protena forma parte de la estructura de las molculas clase I del Sistema Principal de
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Histocompatibilidad (cadena liviana del heterodmero) y se encuentra en la superficie de todas las clulas nucleadas. Puede medirse tanto en suero como en orina y constituye un valor pronstico en los sndr omes linfoproliferativos, especialmente en el mieloma mltiple. Las cifras elevadas se asocian con activacin y destruccin de linfocitos. Los valores normales son 1.15 - 2.03 mg/l. Valores alterados pueden darse tambin en casos de insuficiencia renal debido a que se excreta por los riones. 6.4. Inhibidor 1 del Activador de Plasmingeno (PAI-1), Fibringeno, Protena C Reactiva (PCR) e Interleuquina 6 (IL-6) La hiper coagulabilidad plasmtica que predispone a eventos tromboemblicos es frecuente en pacientes con Mieloma Mltiple. Las causas de este fenmeno pueden agravarse frente a una gran variedad de agentes quimioterpicos en combinacin con talidomida y dexametasona, utilizadas en el tratamiento del Mieloma mltiple, donde los eventos trombticos venosos pueden alcanzar el 28% de frecuencia en los pacientes. Por otro lado, las caractersticas clnicas del Mieloma Mltiple predisponen a trombosis; dentro de ellas destaca la inmovilizacin, hiperviscocidad e hiper calcemia, amiloidosis, efectos protrombticos derivados de un aumento en IL-6, niveles altos de fibringeno, aumento en la expresin del Factor Tisular, del factor VIII, del Factor von Willebrand, reduccin de los niveles de Antitrombina y protena S. Se ha demostrado que la capacidad fibrinoltica est disminuida en pacientes con Mieloma Mltiple, encontrndose una PAI-1, a la par con el aumento en los valores sricos de IL-6 y PCR. En resumen, fenmenos derivados de las caractersticas clnicas del Mieloma Mltiple, del incremento de IL-6, y de una disminucin de la capacidad fibrinoltica, producen un cuadro de hiper coagulabilidad, cuya deteccin y evaluacin sera til para el tratamiento y pronstico de pacientes con Mieloma Mltiple. En este sentido, los niveles sricos de PAI-1, fibringeno, PCR e IL-6 son de gran utilidad. a) Interleuquina 6. Esta citoquina es el principal factor de crecimiento de la clula plasmtica tumoral. Un aumento en los niveles sricos de ella se asocia como factor pronstico en Mieloma Mltiple, ya que es el principal factor de cr ecimiento celular in vitro en esta enfermedad. Se produce en exceso en pacientes que estn desarrollando Mieloma Mltiple. Su
produccin puede ser potenciada por otras interleuquinas entre ellas, la interleuquina-1 beta, que acta sobre las clulas del estroma y clulas seas del medio ambiente tumoral, estimulando la produccin de IL-6 (produccin paracrina).Tambin se ha demostrado que la clula de mieloma es capaz de producir su propia IL-6 (produccin autocrina) bajo la influencia de IFN y TNF in vitro, adems de otras citoquinas. Cantidades elevadas en suero de IL-6 se asocian a mal pronstico. La medicin srica del llamado receptor soluble de IL-6 (sIL6R), el cual favorece la accin de la IL-6, tendra similar valor pronstico. b) PCR. Esta protena srica de fase aguda aumenta sus niveles asocindose a un aumento en la produccin de IL-6 y otras citoquinas en pacientes con Mieloma Mltiple. La produccin de PCR por parte de los hepatocitos se estimula frente a un aumento de IL-6, IL-1, TNF . No es un marcador especfico pero s bastante sensible. Su aumento srico est asociado a mal pronstico en Mieloma Mltiple. 6.5. Nuevos marcadores a) Factor de crecimiento heptico (FCH). Es una citoquina que originalmente se identific que promova el crecimiento de la clula heptica. Tambin es conocido como un factor mitognico involucrado en la formacin de vasos sanguneos y como un promotor de proliferacin celular e invasin que causa destruccin de uniones celulares. Es por esta razn que este factor se le conoce tambin como factor dispersador. Adems de su capacidad de promover la angiognesis, FCH estimula la for macin de osteoclastos de clulas pr ecursoras hematopoyticas y atrae osteoclastos al sitio de resorcin sea, los cuales en colaboracin con osteoblastos, aumenta la tasa de resorcin sea . El receptor de FCH es una protena transmembrana con actividad tirosinaquinasa codificado por el protooncogene c-met y se encuentra expresado tanto en lneas celulares de mieloma como en clulas frescas adems de clulas de mdula sea. El FCH es liberado por clulas inflamatorias y producido por fibroblastos en respuesta a citoquinas inflamatorias tales como IL-6 y TNF. Clulas de mieloma pueden producir FCH y expresar el receptor para FCH. Se ha asociado a FCH como una citoquina destructora de hueso en mieloma y en diversos estudios se la ha asociado fuertemente con IL-6 y TNF- los cuales son producidos localmente en el microentorno de la mdula sea. Algo similar
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ocurre con 2 micr oglobulinemia. La metodologa utilizada para medir FCH es un ELISA en fase slida. b) Marcadores de metabolismo seo. Debido a que las gammapatas monoclonales, entre las que se destaca al mieloma mltiple se ha asociado con varios manifestaciones clnicas tales como, osteolisis, anemia, hipercalcemia y disfuncin renal asociadas a la produccin de citoquinas producidas por clulas anormales, es importante medir los niveles en orina de ciertas molculas que dan cuenta del metabolismo seo, tales como Osteocalcina (OC), un telopptido aminoterminal de colgeno tipo I (NTx) por tcnicas de Enzimoinmunoensayo. c) Estudio de anormalidades genticas asociadas a gammapatas monoclonales. Recientemente, una serie de translocaciones cr omosomales han sido relacionadas estrechamente a discracias de clulas plasmticas. De hecho, translocaciones que afectan al gen responsable de la sntesis de cadenas pesadas de inmunoglobulinas IgH, y que favorecen la transformacin de protooncogenes en oncogenes efectivos, se han identificado no slo en Mieloma Mltiple, sino tambin en estadios ms tempranos (premalignos) de esta enfermedad como son Gammapta Monoclonal de Significado Indeterminado y Mieloma Indolente. El gen de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas o IgH, est ubicado en la banda 32 del brazo q del cromosoma 14 y las anor malidades cromosmicas que lo afectan estn asociadas con la aparicin de oncogenes tales como ciclynD1/myeov(11q13), c-maf(16q23), FGFR3/ MMSET(4p16.3) y MUM-1 (6p25) entre otros, siendo en su mayora, genes promotores de la proliferacin celular en clulas plasmticas. A travs de la tcnica de fluorescencia con hibridacin in situ conocida como FISH , se ha deter minado una prevalencia para las translocaciones de IgH, cercana al 60% en pacientes con mieloma mltiple. La translocacin ms frecuentemente asociada tanto a mieloma mltiple como a gammapata monoclonal de significado incierto es t(11;14)(q13,q32), existiendo otras, entre el cromosoma 14 y el 4, y entre el 14 y el 16. Tambin hay evidencias que la monosoma 13 (13) est presente desde estadios muy tempranos del mieloma mltiple y de la gammapata monoclonal de significado incierto, asocindose luego a t(4;14)(p16.3;q32) 3. Adems, en otras gammapatas monoclonales similares, como en Amiloidosis de Cadenas
Livianas se ha reportado la presencia de la translocacin t(11;14)(q13,q32)4. Todos estos datos podran servir en un futuro cercano para el diagnstico y pronstico en pacientes con discracias plasmticas y vislumbrar algn tipo de terapia gnica con el estudio de estas mutaciones cromosmicas y la aparicin de oncogenes. LECTURAS SUGERIDAS Citoqumica y Estudio citogentico Dohner, H., Stilgenbauer, S., Benner, A., et al Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 343: 1910-6, 2000. Harris, N.L., Jaffe, E.S., Diebold, J., et al The World Health Organization Classification of Neoplasms of the Hematopoietic and Lymphoid Tissues: Report of the Clinical Advisory Committee Meeting-Airlie House, Virginia, November 1997. The Hematology Journal 1:53-66, 2000. Kearney, L. The impact of the new FISH technologies on the Cytogenetics of Haematological malignancies, British Journal of Haematology 104 : 648-658, 1999. Members of General Haematology Task Force of the BCSH. The r ole of cytology, cytochemistry, immunophenotyping and cytogenetic analysis in the diagnosis of haematological neoplasms, Clin Lab Haem 18: 231-236, 1996. Shibata, A., Bennett, J.M., Castoldi, G.L., et al Recommended methods for cytological procedures in haematology. International Committee for Standarization in Haematology (ICSH). Clin Lab Haematol 7:55-74, 1985. Biologa molecular en oncohematologa Braziel, R.M., Shipp, M.A., Feldman, A.L., Espina, V., Winters, M., Jaffe, E.S., Petricoin, E.F., Molecular Diagnostic. Liotta LA. American Society of Hematology Educational Book, 2003, pp. 279-293 Finbarr, E. (ed.) Methods in Molecular Medecine: Molecular Diagnosis of Cancer. Cotter, University of London, UK. Humana Press, Tootwa, New Jersey. 1996.
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HEMATOLOGA
Captulo
31
ESTUDIO DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES HEMORRAGPARAS

Ivn Palomo G., Blanca Muoz V., Eduardo Retamales C., Patricia Hidalgo P., Olga Panes B., Carmen Gloria Artigas A. y Jaime Pereira G.
1. Introduccin 2. Estudio de alteraciones de la coagulacin 2.1. Pruebas de coagulacin 2.1.1. Pruebas de screening 2.1.2. Dosificacin de factores 2.2. Coagulmetros 2.2.1. Tecnologas de coagulmetros 2.3. Control de calidad interno en coagulacin 2.3.1. Fase pre-analtica 2.3.2. Fase analtica 2.3.3. Fase post-analtica 2.4. Control de calidad externo 3. Estudio de la enfermedad de von Willebrand 3.1. Factor von Willebrand 3.2. Estudio de laboratorio de la EvW 3.2.1. Exmenes bsicos de hemostasia 3.2.2. Exmenes para identificar el tipo de EvW 3.2.3. Exmenes para identificar el subtipo de EvW 3.2.4. Exmenes adicionales
4. Estudio de laboratorio de las trombocitopenias inmunes 4.1. Mtodos generales 4.2. Mtodos de pesquisa de Anticuerpos antiplaquetarios 4.2.1. Mtodos de fase I 4.2.2. Mtodos de fase II 4.2.3. Mtodos de fase III 4.2.4. Mtodos para estudiar las trombocitopenias inducidas por drogas 4.3. Biologa Molecular aplicada a la trombocitopenias inmunes 5. Estudio de la funcin plaquetaria 5.1. Principales disfunciones plaquetarias 5.1.1. Desrdenes adquiridos 5.1.2. Desrdenes hereditarios 5.2. Estudios de laboratorio 5.2.1. Pruebas de screening 5.2.2. Estudios para determinar la causa de la alteracin 5.2.3. Estudio de agregacin plaquetaria 5.2.4. Estudio de secrecin plaquetaria 5.2.5. Estudio de glicoprotenas plaquetarias especficas
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RESUMEN
El diagnstico definitivo de las enfermedades hemorragparas requiere de pruebas de laboratorio. En este captulo se describen los aspectos fundamentales de las pruebas que se utilizan para estudiar las alteraciones de la coagulacin, tanto a nivel global (pruebas de screening) como de aquellas utilizadas para la cuantificacin de defectos especficos. En este contexto se describen las caractersticas de los coagulmetros y aspectos generales del control de calidad interno en coagulacin. Tambin se aborda el diagnstico de laboratorio de la enfermedad de von Willebrand (EvW) y de las trombocitopenias inmunes (pesquisa de anticuerpos antiplaquetarios y pruebas de biologa molecular). Finalmente, se describen las pruebas que permiten estudiar la funcin plaquetaria (agregacin y secrecin plaquetaria) y estudio de glicoprotenas plaquetarias.
1. INTRODUCCIN La sangre cir cula a travs de los vasos sanguneos sin que se produzca activacin plaquetaria o de la coagulacin, ni hemorragia apreciable. El sistema hemosttico puede presentar dos tipos de alteraciones: hemorragia y trombosis; en ambos casos se pueden alterar los elementos plasmticos y celulares. La ruptura de un vaso sanguneo desencadena el proceso hemosttico, comenzando por la adhesin de las plaquetas al endotelio daado o a estructuras subendoteliales expuestas (ver captulo 19). Simultneamente, factores de la coagulacin (plasma) son activados por distintos mecanismos y se produce la coagulacin (ver captulo 20), cuyo fin es detener la extravasacin de la sangre. 2. ESTUDIO DE ALTERACIONES DE LA COAGULACIN Las pruebas generales (screening) de hemostasia incluyen: recuento de plaquetas, tiempo de sangra, tiempo de protrombina (TP), tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), y en algunos casos tiempo de trombina (TT).
El estudio de laboratorio de la hemostasia secundaria (ver captulo 20) comprende las pruebas de screening TP y TTPA, y segn corresponda, el TT. Si una o ms de estas pruebas de coagulacin estn prolongadas, se debe estudiar si la causa es debida a dficit de factor(es) o inhibidores de la coagulacin. 2.1. Pruebas de coagulacin 2.1.1. Pruebas de screening a) Tiempo de Protrombina Esta prueba evala la eficiencia del sistema extrnseco de la coagulacin, midiendo la formacin del cogulo plasmtico, en presencia de un exceso de extractos tisulares. Es ms sensible a los defectos de factores VII, X y V, que a la deficiencia de Factor II (Protrombina). No detecta disminuciones moderadas de fibringeno, pero si este ltimo es muy bajo o existe un potente inhibidor de la reaccin tr ombina-fibringeno, se obtiene un TP prolongado. La sensibilidad de la prueba es influenciada por el reactivo y tcnica usada. El reactivo utilizado, tromboplastina, contiene factor tisular y fosfolpidos. Es importante interpretar la prueba con un rango de referencia establecido por el propio laboratorio.
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todos los factores de la coagulacin en igual forma, mientras que los anticoagulantes orales tienen un mayor efecto sobre algunos factores de la coagulacin. Un laboratorio de coagulacin debe aplicar medidas de control de calidad internas y seguir nor mas de estandarizacin para realizar adecuadamente el control anticoagulante de los pacientes. La escala universal para expresar el resultado de los TP que corresponden a tratamiento anticoagulante oral se denomina INR (International Normalized Ratio). La OMS implement la estandarizacin del control de la anticoagulacin oral mediante el uso de tromboplastinas de referencia, que permiten calibrar la actividad biolgica de las preparaciones comerciales utilizadas para el control de los pacientes. Este proceso de calibracin debe ser realizado por los fabricantes de cada tromboplastina, con un mnimo de 20 plasmas de dadores normales y 60 plasmas de pacientes bajo tratamiento anticoagulante oral estabilizado. Se grafican en escala doble logartmica los TP de los plasmas normales y cumarinizados, expresados en segundos para ambas tromboplastinas (de referencia y a calibrar) y se estima la recta de ajuste por el mtodo de regresin ortogonal. La pendiente de esa recta de calibracin, expresa la sensibilidad de la tromboplastina a calibrar, en relacin a la de referencia usada y se denomina ISI (ndice de Sensibilidad Internacional). Cada envase de reactivo debe tener registrado el ISI. El ISI caracteriza la sensibilidad de la tromboplastina que se est calibrando; mientras ms cer ca de 1, ms sensible es la tr omboplastina. Con valores sobre 2 se considera muy poco sensible y no se recomienda su uso. El INR es la nica forma correcta de expresar resultados de TP cuando stos corresponden a control de tratamiento anticoagulante oral. En primer lugar se obtiene la razn (ratio) TP paciente/TP pool normal, obtenida con la tr omboplastina comercial usada en el laboratorio. El INR corresponde a la razn ISI. El INR refleja el resultado que habra sido obtenido si la tromboplastina de referencia hubiese sido utilizada para realizar la prueba. Ejemplo: 25 seg/11 segundos = 2.27; la tromboplastina
Figura 31-1. Vas intrnseca y extrnseca del sistema de la coagulacin. Las vas intrnseca y extrnseca incluyen factores de la coagulacin que son evaluados por el TTPA y TP, respectivamente.
El TP consiste en comparar los tiempos de coagulacin del plasma en estudio con un pool de plasmas normales, en presencia de Tromboplastina clcica. Los tiempos de coagulacin expresados en las muestras en estudio se interpolan en una curva de calibracin realizada con diluciones seriadas de un pool de plasmas normales y se informa en segundos, porcentaje de actividad de protrombina o en forma de razn (cuociente entre el TP del paciente y el TP del plasma normal). Su sensibilidad para detectar defectos va a depender de la fuente y tipo de tromboplastina tisular. Es una prueba relativamente simple pero sujeto a variables (toma de la muestra, hemlisis, etc.) que afectan los resultados. Control de tratamiento anticoagulante oral El TP es el mtodo ms utilizado para el monitoreo del tratamiento anticoagulante oral. Debido a la gran variabilidad en la sensibilidad de las diferentes tromboplastinas, es necesario estandarizar el contr ol del tratamiento anticoagulante oral. El uso del porcentaje no se recomienda principalmente debido a que el cambio de actividad obtenido por dilucin no refleja el que se produce cuando se administran anticoagulante orales, ya que la dilucin altera
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utilizada tiene un ISI de 1.2; 2.271.2 por tanto el INR = 2.67 b) Tiempo de tromboplastina parcial activado El TTPA se basa en la medicin del tiempo de coagulacin del plasma, en presencia de una tromboplastina parcial (cefalina) que no contiene factor tisular, de un activador de factores de contacto (ej. kaoln, cido elgico) y calcio. El TTPA refleja la integridad global del sistema intrnseco de la coagulacin (figura 31-1), siendo especialmente importante su sensibilidad a los defectos de los factores VIII, IX y XI, ya que stos estn asociados con sangrado clnico. Tambin se encuentra prolongado en dficit de factor XII, Kiningeno de alto peso molecular, precalicreina, en deficiencias que involucran factores de la va comn (Factor V, X, II y fibringeno) y en presencia de inhibidores (Ej. anticoagulante lpico). Es la prueba ms ampliamente usada para el control de la terapia anticoagulante con Heparina no fraccionada. El TTPA se puede ver afectado por las siguientes variables: el tipo de activador, tiempo de incubacin con el plasma, la presencia de buffers y el tipo de fosfolpidos utilizados. Un reactivo de TTPA confiable debe ser capaz de detectar deficiencias de factores de 30% o menos y concentraciones bajas de heparina. c) Tiempo de Trombina El TT mide el tiempo que demora el fibringeno, presente en el plasma, en transformarse en fibrina por la adicin de una cantidad estandarizada de trombina. El TT se encuentra prolongado cuando el nivel de fibringeno es muy bajo, en presencia de anticoagulante tipo antitrombina, especialmente heparina y pr oductos de degradacin fibringeno/fibrina (PDF) y en presencia de fibringeno anormal, congnito o adquirido (disfibrinogenemia). El TT se considera prolongado, cuando es 5 segundos superior al tiempo del pool control resulta mayor a 5 seg.
d) Estudio de mezclas La realizacin de los estudios de mezclas es la 1 etapa en la evaluacin de un TP, TTPA y TT prolongado una vez que la contaminacin con heparina ha sido descartada realizando un Tiempo de Trombina. La mezcla de un volumen de plasma del paciente con un volumen de plasma normal constituye una forma rpida para diferenciar entre un dficit de factor(es) y un inhibidor de la coagulacin. El plasma normal agregado a un plasma deficiente en uno o ms factores de la coagulacin, corrige la prueba. Si la prolongacin de la prueba se debe a un inhibidor, el plasma normal no corregir el valor.
Figura 31-2. Etapa final de sistema de la coagulacin. Esta etapa es evaluada por el tiempo de trombina.
e) Diagramas de flujo de las pruebas bsicas de coagulacin A continuacin se muestran cuatro diagramas de flujo, segn resultados que se presenten en las pruebas bsicas de coagulacin: solo TP alargado, solo TTPA alargado, TP y TTPA alargado y solo TT alargado (figuras 31-3 a 31-6).
Figura 31-3. Diagrama de flujo en caso de prolongacin del tiempo de protrombina (TP).
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mtodos funcionales (coagulomtricos). Para cuantificar los factores II, V, VII y X se utiliza el mtodo en una etapa basado en el TP, y para cuantificar los factores VIII, IX, XI y XII se realiza el mtodo en una etapa basado en el TTPA. El mtodo en una etapa mide la actividad coagulante en un sistema que aporta todos los factores del mecanismo extrnseco o intrnseco (dependiendo del factor a cuantificar), excepto el factor que se desea medir. El tiempo de coagulacin es inversamente proporcional a la actividad coagulante del factor en estudio, en el plasma del paciente. El plasma de referencia usado en la prueba puede ser un pool de plasmas preparado por el propio laboratorio o un plasma comercial, en ambos casos debe ser calibrado con un estndar internacional. 2.2. Coagulmetros 2.2.1. Tecnologas de los coagulmetros Cada vez ms el mtodo manual del tubo inclinado en bao termorregulado ha dado paso a los coagulmetros. stos son instrumentos que miden la formacin de fibrina a travs de diferentes metodologas. Las diferentes metodologas ofrecidas por el mer cado presentan distinta tecnologa para la deteccin del cogulo de punto final. A continuacin se indican, brevemente, sus caractersticas fundamentales: Tecnologa ptica. Se basa en la emisin de un haz de luz blanca que detecta el inicio de la formacin de la malla de fibrina al impedir el paso de la luz en la cubeta.
Figura 31-6. Diagrama de flujo en caso de prolongacin solo del tiempo de trombina (TT).
Figura 31-4. Diagrama de flujo en caso de prolongacin del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA).
Figura 31-5. Diagrama de flujo en caso de prolongacin, tanto del tiempo de protrombina (TP) como del tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA).
Tecnologa mecnica. Usa un brazo con dos varillas que al formarse el cogulo detiene su desplazamiento. Tecnologa optomecnica. Combina la tecnologa ptica con la mecnica, una lmpara de tungsteno est ajustada para entregar un voltaje constante desde los fotodiodos; al exceder el cambio de voltaje los lmites determinados, la coagulacin es registrada. Tecnologa electromagntica. Consiste en una barra que se desplaza en un campo electromagntico y se detiene al formarse la malla de fibrina. Tecnologa nefelomtrica. Mide la luz dispersa al formarse la malla de fibrina. En todos los casos
2.1.2. Dosificacin de factores La dosificacin de factores est indicada cuando en un estudio de coagulacin, habiendo realizado las pruebas bsicas (TP, TTPA y TT), y despus de realizar el estudio de mezclas con plasma nor mal, segn se indica en los diagramas de flujo (punto anterior) se concluye que la prolongacin del tiempo se debe a dficit de uno o ms factores de la coagulacin. Las pruebas permiten la cuantificacin de los factores de la coagulacin de forma individual. Para su medicin se utilizan, principalmente,
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los equipos disponen de sensores para detectar la aparicin de la malla de fibrina y aplica un algoritmo computacional para entregar los resultados. Algunos ejemplos de instrumentos, segn la tecnologa que utilizan son: ptico: ACL futura, Behnk Elektronic, MLA Electra 750 800, MLA Electra Automtico, IL MCL-2, RAL Clot-1, Sysmex CA 1000 Automtico-6000, BioMerieux Option 2 Plus 4 Plus, Human Humalyzer Coag-2000, Teco Coatron, BCS (Dade Behring). Mecnico: Amelung CS 190, AMAX, AMGA, Amelung KC-1, KC-4, KC-10, KC-40, BBL Fibrmetro. Optomecnico: Behring Fibrintimer II-10-New, Behring Fibrintimer A BCT, Trombotimer I Behnk Elecktronic. Electromagntico: Stago ST2-ST4-Start-4, Stago STA compact, compact-CT. Nefelomtrico: ACL modelo 100 a 9000. 2.3. Control de calidad interno en coagulacin El laboratorio de coagulacin cumple un rol fundamental en el diagnstico y manejo de pacientes con enfermedades hemorrgicas o trombticas, adquiridas o hereditaria. As, por ejemplo, errores en la cuantificacin de factor VIII o IX (ver punto 2.1.2.) o determinacin del INR (ver punto 2.1., 1.a y captulo 25) puede tener graves consecuencias clnicas debido a que se puede asociar a un error en el tratamiento de un paciente hemoflico o en el control de tratamiento anticoagulante, respectivamente. Es necesario implementar una serie de medidas para garantizar que los procedimientos realizados en el laboratorio de coagulacin permitan entregar resultados confiables y reproducibles. Las caractersticas del control de calidad en el laboratorio de coagulacin son las siguientes: (a) proceso dinmico que debe ir mejorando continuamente, (b) debe ser organizado, (c) con normas de funcionamiento escritas y claras, (d) vigilar el cumplimiento sistemtico de las normas implementadas, (e) llevar registro de las acciones realizadas, (f) dar a conocer las medidas implementadas y (g) la gestin de
calidad para que sea efectiva, debe contar con la colaboracin y el trabajo en equipo de todos los integrantes del laboratorio. Los aspectos fundamentales a tener en consideracin sobre control de calidad en coagulacin sern descritos, aunque sin detalles, separados en tres fases: pre-analtica, analtica y post-analtica. 2.3.1. Fase pre-analtica La toma de muestra es parte de la etapa preanaltica y considera la obtencin, procesamiento y almacenamiento de las muestras. Para evitar errores en la etapa de identificacin del paciente, se debe disponer de un formato, en el que adems del nombre y apellidos, se identifique cada paciente mediante su nmero de historia clnica, as como al mdico solicitante. En los laboratorios ms complejos se utilizan fichas, en que la identificacin del paciente se realiza mediante cdigo de barras, lo cual elimina el error humano de la etapa preanaltica. La apropiada obtencin de la muestra y la manipulacin de la misma son relevantes; la probabilidad de error en esta etapa, en general, es mayor que el error que pueda ocurrir durante las deter minaciones de laboratorio. Las variaciones intraindividuales incluyen el uso de medicamentos o drogas, la actividad fsica, el estrs emocional, la postura del paciente y variaciones diurnas. La actividad fsica es una causa conocida de variabilidad, que se debe tener en cuenta cuando se va a determinar la actividad del factor VIII y del factor von Willebrand (FVW). La principal causa de variacin son los ritmos circadianos, que modifican los niveles de un parmetro a lo largo del da. Durante la flebotoma, el torniquete debe aplicarse temporalmente (no ms de un minuto), slo utilizarlo para la puncin venosa, pero no durante la extraccin de la muestra. La mayora de los laboratorios rechazan las muestras de sangre si se detecta algn signo de hemlisis. Existen evidencias de que la hemlisis no afecta al TP, siempre que la hemlisis no sea el resultado de una extraccin traumtica. Los tubos para las pruebas de coagulacin deben obtenerse despus de los destinados a otros exmenes. Esta prctica es aceptable en
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el caso que corresponda a una nica prueba, con excepcin del TTPA de pacientes tratados con heparina, ya que en estos casos entrega resultados un 20 % ms corto con el primer tubo. El citrato trisdico (Na 3 C 6 H 5 O) es el , anticoagulante de eleccin para las investigaciones de la hemostasia en concentraciones de 105 mMol/L (3,2 g/dL dihidratada), en una proporcin de una parte de anticoagulante para nueve partes de sangre.
Si la cantidad de sangre en el tubo es menor que la requerida para mantener la proporcin de 9:1 sangre / anticoagulante, el exceso de anticoagulante podra alterar la exactitud del resultado. Si el hematocrito es <20% o >55% tambin se pierde la relacin del anticoagulante respecto a la cantidad de plasma (mayor cantidad en caso de anemia y menor cantidad si se trata de policitemia); para calcular la cantidad de citrato de sodio 3.2% a agregar se aplica la siguiente frmula:
(100 x hematocrito) Volumen anticoagulante = x Volumen de sangre a anticoagular (595 x hematocrito)
Respecto del transporte y conservacin, en general, el TP es una prueba ms estable que el TTPA y, las altas temperaturas conducen a acelerar la r educcin (en porcentaje) o pr olongacin (en segundos) de ambas reacciones. La muestra puede ser mantenida a temperatura ambiente (18 - 24 C) hasta por dos horas. Ese tiempo podra extenderse para las muestras de tamizaje hasta 4 horas a 4 - 8 C. El tubo debe mantenerse tapado para evitar los cambios en el pH y liberacin de CO (cidos 2 voltiles). Para separar el plasma la muestra debe ser centrifugada a 2500 g por 15 a 20 minutos. Si la muestra no es procesada dentro de un tiempo determinado, se recomienda que sea alicuotada y congelada a -20C para ser procesada dentro de 2 semanas. Si desea almacenar la muestra hasta por 1 ao debera ser congelada a -70 C. 2.3.2. Fase analtica Plasma control interno. Los controles internos de pool de plasma congelado o liofilizado, de produccin del propio laboratorio de hemostasia y comerciales, respectivamente, permiten evaluar la precisin y reproducibilidad de los equipos. Deben ser ensayados previo al inicio de la rutina diaria de trabajo y ser graficados en cartas controles de Levey Jennings, para identificar errores sistemticos y al azar. Para la preparacin del pool de plasmas se deben seleccionar 20 o ms voluntarios de ambos sexos, sanos, y sin medicamentos, incluidos estrgenos ni embarazo. Las muestras deben ser obtenidas y el plasma separado segn
se estableci en el punto 2.3.1. Para seleccionar los plasmas a incluir en el pool, se deben realizar un TP y TTPA a cada uno de los plasmas; sern utilizados slo los que tengan resultados dentro de los rangos de referencia. Los plasmas seleccionados son mezclados y se agrega HEPES al 0,6%. Luego se preparan alcuotas que se congelan -20 0C, el material es estable en estas condiciones durante 5 meses. Se debe efectuar una determinacin en cada corrida o cada 20 muestras de pacientes y, si los resultados estn dentro de las 2 desviaciones estndares se puede iniciar la rutina. Revisar la tendencia de la grfica de Levey-Jenning y aplicar las reglas de Westgard. Carta control. El objetivo del control de calidad interno es evaluar y verificar los diversas etapas analticas que se realizan durante una prueba. Consisten en mantener una mejora continua basada en la vigilancia de los procesos para decidir si son confiables sus resultados. El proceso debe buscar y detectar errores sistemticos y por lo tanto, la precisin del anlisis. Cuando el mtodo analtico est fuera de control se deben determinar los tipos de errores: sistemtico, al azar o ambos; basados en la transgresin de las reglas de control. Cuando no se cumple y presenta 1 punto fuera de 3 desviaciones estndar (DE) o R4 DE es ms probable que se trate de un error al azar que sistemtico. Si el error sistemtico est presente es ms probable detectarlo por no cumplimiento de las reglas de 2 puntos de 2 DE, 4 de 1 DE, o 10 x. La revisin de los datos
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de un nico control ayudar a detectar los errores de un rango de concentracin particular (normal o prolongado). Las recomendaciones que se deben aplicar de acuerdo a las reglas de Shewhart son. Se acepta la corrida cuando un control est dentro de la x 2 DE. Se descarta la corrida cuando un control excede la x 3 DE. No se informan los resultados de pacientes. Se descarta la corrida cuando ambos controles (alto y bajo), exceden la misma desviacin: x + 2 DE o x 2 D Se descarta cuando en una carta control, uno de los controles exceden x + 2 DE y el otro excede a x 2 DE en la observacin. Se descarta cuando a lo menos 4 controles consecutivos exceden en la x +1 DE o x 1 DE el mismo control. Se descarta cuando a lo menos 10 controles consecutivos caen hacia un mismo lado de la media. Los factores que deben verificarse en el control de los equipos y reactivos son: fecha de vencimiento de los reactivos, estabilidad elctrica, permeabilidad de los drenajes, indemnidad de las tuberas y mantener niveles aceptables de reactivos y desechos. En este contexto, deben haber procedimientos claros de mantencin de equipos estipulando la regularidad, fecha de visitas, tipo de intervencin (mantencin, correccin o reparacin), reemplazo de repuestos y estado actual del equipo. Valores de referencia. Se recomienda deter minar los valores de refer encia estableciendo rangos para cada tcnica. El procedimiento requiere reclutar un mnimo de 20 individuos sanos, de ambos sexos que no estn recibiendo ningn medicamento. Se les debe medir el TP y TTPA, luego calcular la media y DE. Con estos datos calcular el rango de las 3 desviaciones estndar para eliminar los valores extremos. Se recalcula la media y DE y se obtiene el rango de referencia considerando el rango de las 2 DE tanto el valor de +2 DE y - 2DE. Este rango corresponde al 95% de la poblacin muestreada. Esta es la media que debe ser utilizada como valor normal para calcular el INR, para el control de tratamiento con anticoagulantes orales. 2.3.3. Fase post-analtica En esta etapa, tan importante como las
anteriores se debe evitar de cometer los siguientes errores: (a) de trascripcin, (b) en los clculos o en las unidades, (c) interpretacin incorrecta. Respecto a esto ltimo el laboratorio debe proporcionar los valores de referencia de cada mtodo. Adicionalmente el laboratorio debe tener una adecuada forma de registro de los resultados de los pacientes, de manera que puedan ser recuperados circunstancialmente. En las distintas etapas del procesamiento de las muestras: preanaltica, analtica y post-analtica deben validarse los resultados antes de emitir un informe. Interrelacionar la condicin clnica del paciente, contrastar con exmenes histricos, relacionar con otros exmenes solicitados en el mismo laboratorio y trazabilidad del control de calidad. 2.4. Control de calidad externo Diferentes estudios de evaluacin externa internacional como la Agencia Francesa y el CAP (Colegio de Patlogos Americanos) muestran coeficientes de variacin para TP normales (en segundos) que varan desde 2,1 a 5,1 %, en el caso de plasmas prolongados la variacin va desde 10,3 a 17,8 %. En el caso de los TTPA, en muestras normales el intervalo se encuentra entre 3,8 a 7,8 % y en plasmas prolongados entre 6,8 a 17,6 %. En la experiencia del Instituto de Salud Pblica de Chile, los datos de TP varan para los normales desde 3,4 a 7,7 % y de 9,0 a 18,7 % para los plasmas prolongados, de la misma manera para TTPA varan en los plasmas normales desde 4,3 a 16,9 % y de 6,2 a 23,9% para los prolongados. Se sabe que la composicin de los fosfolpidos de los diferentes reactivos de tromboplastinas utilizadas para el TP varan considerablemente, e influyen de for ma significativa en la sensibilidad del procedimiento. El tipo de activador utilizado en el caso de TTPA, es as mismo importante, y lo mismo ocurre con los diferentes tipos de coagulmetros, ya que ambos afectan el resultado obtenido. Esto se traduce en que los resultados obtenidos entre diferentes laboratorios no sean siempre comparables. Adems de los mtodos antes citados, existe el cromognico. Se ha observado que con este procedimiento se obtienen niveles ms elevados que con los coagulativos.
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3. ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND 3.1. Factor von Willebrand El FVW se considera la glicoprotena adhesiva, multimrica, de mayor peso molecular presente en el plasma normal (500 a 10.000 kDa). El FVW est constituido por subunidades bsicas (260 kDa) que se ensamblan para formar multmeros de diferentes tamaos. Una disminucin o ausencia de multmeros de alto peso molecular producen alteraciones en la funcionalidad del FVW, traducindose en hemorragias mucocutneas (ver captulo 22). 3.2. Estudio de laboratorio de la EvW 3.2.1. Exmenes bsicos de hemostasia a) Recuento de plaquetas. Es generalmente nor mal, pero puede presentarse una trombocitopenia leve en la EvW tipo 2B. Un recuento disminuido de plaquetas puede orientar a una falla general de plaquetas relacionadas o no con la EvW, por lo que puede sugerir una falla cualitativa del FVW con aumento de la afinidad del FVW por la GPIb de las plaquetas.
b) Tiempo de sangra (TS). A pesar de no ser un examen que presenta una alta exactitud y reproducibilidad, contina siendo de ayuda en el estudio de la funcin plaquetaria in vivo. El TS suele presentarse prolongado en los casos severos de la EvW y en los casos moderados o leves puede estar normal, como ocurre en la EvW tipo 1. ltimamente la utilidad del TS ha sido cuestionada. c) Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA). A diferencia del Tiempo de Protrombina (TP) que siempre se presenta normal en la EvW, el TTPA puede presentarse normal o con diferentes grados de prolongacin dependiendo del nivel del FVIII:C. El TTPA comienza a prolongarse con una actividad del FVIII:C inferior al 25-30 UI/dL. 3.2.2. Exmenes para identificar el tipo de EvW En la tabla 31-1 se presentan los principales exmenes de laboratorio que exploran la EvW y la forma de presentacin en cada variante de la enfer medad. La figura 31-7 indica el flujograma para el diagnstico de la EvW.
Tabla 31-1. Laboratorio en los distintos tipos de la Enfermedad de von Willebrand EvW Tipo 1 2A 2B 2M 2N 3 TS (seg) N/P P P P N P FVIII:C (UI/dL) N/D N/D N/D N D D/A FVW:Ag (UI/dL) N/D N/D N/D N / D* N D/A FVW:Co R (UI/dL) N/D D D D N D/A RIPA (mg/mL) N D I D N D Multmeros de alto peso molecular N A A N N D
N: normal; P: prolongado; D: disminuido; A: ausente; I: incrementado * Variante Vicenza
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31-7. Flujograma para el diagnstico de la EvW. Si en el laboratorio se encuentran niveles de FVW:Ag extremadamente bajos o indetectables, orienta al diagnstico de Tipo 3. Cuando la razn FVW:Ag est presente, se debe diferenciar entre tipo 1 y tipo 2 con el FVW:CoR y la razn FVW:CoR/Ag. Si la razn es >0.7, se orienta al tipo 1 que se confirma con niveles de FVIII:C iguales o superiores al FVW:Ag o tambin con el contenido de FVW plaquetario. Si es <0.7 orienta al tipo 2. La caracterizacin del subtipo 2, se realiza con los valores de la RIPA. Si est aumentado, orienta al subtipo 2B. Si est disminuido, puede tratarse del tipo 2A o 2M, donde la ausencia o presencia de los multmeros de alto peso molecular darn el diagnstico. El tipo 2N se caracteriza cuando los niveles de FVIII:C son menores que los del FVW:Ag y se confirma con el estudio de la afinidad FVW por el FVIII. (Adaptado de Federici et al, 2002)
a) Factor von Willebrand antignico (FVW:Ag) Puede ser medido en el plasma, mediante electroinmunoensayo, radioinmunoensayo o por ELISA. Se utiliza anticuerpo mono o policlonal anti FVW y plasma del paciente. En la EvW tipo 3 el FVW:Ag es indetectable, en el tipo 1 y en el tipo 2 puede estar bajo o normal. b) Factor von Willebrand cofactor ristocetina (FVW:CoR) Estudia la interaccin del FVW con la GPIba de las plaquetas. Es un mtodo para medir la actividad funcional del FVW, que es propiedad fundamental de los multmeros de alto peso molecular. Se basa en la propiedad de la ristocetina (antibitico), para inducir la aglutinacin de las plaquetas normales fijadas
en formalina en presencia del FVW. En la EvW tipo 1, donde la estructura del FVW es normal, los valores de FVW:CoR son similares a los valores de FVW:Ag (FVW:CoR/Ag >0.7). Niveles de FVW:CoR ms bajos que FVW:Ag son caractersticos de la EvW tipo 2 (radio FVW:CoR/ Ag <0.7). c) Factor VIII coagulante (FVIII:C) Mide la actividad coagulante del FVIII. Habitualmente se realiza mediante el mtodo clsico en una etapa, usando sustrato comercial deficiente en FVIII:C. La actividad puede estar disminuida en grado variable o normal en la EvW tipo 1 y tipo 2, sin embargo en el tipo 3, los valores estn francamente disminuidos (<15%), similares a los que se presentan en la Hemofilia A. El clculo de la razn FVIII/FVW:Ag
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es til para distinguir entre EvW tipo1 y tipo 2. En el tipo 1 generalmente es proporcional (1), a diferencia de la EvW tipo 2N donde se observan valores discrepantes entre FVIII y FVW:Ag (<1). 3.3.3. Exmenes para identificar el subtipo de EvW a) Aglutinacin plaquetaria inducida por ristocetina (RIPA) Mide la aglutinacin plaquetaria producida en plasma rico en plaquetas (PRP) a diferentes concentraciones de ristocetina en un agregmetro. Los resultados expresan la concentracin de ristocetina (mg/dL) capaz de inducir un 30% de agregacin. Este examen tiene valor diagnstico cuando el FVW est muy disminuido o presenta una funcin deteriorada, sin embargo tiene una baja sensibilidad en los casos de las formas moderadas de EvW. Es til para distinguir los subtipos de la EvW tipo 2. El tipo 2A y 2M se caracterizan por una hiporrespuesta a la ristocetina, presentndose valores >1.2 mg/dL. Excepcionalmente en el tipo 2B, existe una alta respuesta a la ristocetina, debido a una afinidad mayor que la normal del FVW plasmtico por la GPIba plaquetaria, observndose valores de ristocetina capaces de inducir aglutinacin plaquetaria <0.8 mg/dL. b) Anlisis de la composicin multimrica del FVW Los multmeros del FVW se separan en geles de agar osa segn su peso molecular, visualizndose por autorradiografa luego de una incubacin con anticuerpo policlonal anti FVW inmunopurificado y marcado con 125I. Se pueden distinguir los multmeros del FVW de alto, mediano y bajo peso molecular. Esta tcnica es til para distinguir entre la EvW tipo 1 y 2. En la EvW tipo 1 est presente todo el pattern de multmeros. En la EvW tipo 2, los multmeros pueden estar presentes en el tipo 2M y 2N, y los multmeros de alto y mediano peso molecular pueden estar ausentes en el tipo 2A y 2B. c) FVW plaquetario El FVW plaquetario juega un importante rol en la hemostasia primaria, ya que al ser liberado desde los grnulos alfa acta directamente en el sitio de la injuria vascular. Los mtodos han sido ideados para estudiar la relacin del FVW plaquetario desde el punto de vista cuantitativo
(ELISA) y cualitativo (anlisis multimrico). til para determinar la severidad de la EvW tipo 1; los pacientes que tienen disminuido el FVW plaquetario presentan un tiempo de sangra ms pr olongado y tienen manifestaciones hemorrgicas ms severas. Sobre la base de esta medicin, la EvW tipo 1 puede ser clasificada en 3 subtipos: (a) tipo 1 con FVW plaquetario normal, (b) tipo 1 con FVW con plaquetario disminuido, y (c) tipo 1 con FVW plaquetario discordante. d) Capacidad de unin al FVIII (FVW:FVIIIB) Mide la afinidad del FVW por el FVIII. Esta tcnica se realiza cuando la razn FVIII/FVW es <0,5 para distinguir la EvW tipo 2N de una Hemofilia A moderada. La determinacin se realiza por ELISA segn diversos mtodos. Se utiliza anticuerpo policlonal anti FVW, plasma en estudio y FVIII recombinante (rFVIII). 3.3.4. Exmenes adicionales Capacidad del FVW de unin al Colgeno (FVW:CBA) Se ha planteado como un examen alternativo a la medicin de la actividad del FVW:CoR; sin embargo es capaz de detectar en mejor forma que el FVW:CoR, la ausencia de multmeros de alto y mediano peso molecular. 4. ESTUDIO DE LABORATORIO DE LAS TROMBOCITOPENIAS INMUNES Las plaquetas son elementos celulares anucleados que se originan por fragmentacin del citoplasma de los megacariocitos en la mdula sea, desde donde pasan a circulacin permaneciendo en ella durante 8 a 10 das antes de ser removidas por el sistema fagoctico mononuclear. Tienen entre 1,5 a 3 m de dimetro y en reposo presentan forma discoide (ver captulo19). Las trombocitopenias se pueden presentar por uno de los siguientes mecanismos: (a) produccin deficiente, (b) distribucin anormal y, (c) destruccin acelerada (ver captulo 21). Respecto a este ltimo mecanismo se conoce, la participacin de auto y alo anticuerpos (tr ombocitopenias inmunes) y se han desarrollado mtodos para su pesquisa. En el diagnstico de laboratorio de las trombocitopenias inmunes, se utilizan pruebas comunes a toda trombocitopenia y mtodos
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para estudiar el carcter inmune de su patogenia. 4.1. Mtodos generales En general, al iniciar el estudio de las trombocitopenias se utilizan las siguientes pruebas: Recuento de plaquetas. Se realiza para establecer si el sndrome hemorragparo; particularmente la presencia de petequias, equmosis y hematomas, se debe a la disminucin en el nmero de plaquetas. Mielograma. Permite establecer si se est frente a una trombocitopenia megacarioctica o amegacarioctica. Estudio de sobrevida plaquetaria: Este mtodo consiste en transfundir plaquetas marcadas con 59Cr o 111In a un paciente. Con 111 In, adems de observar el acortamiento de la sobrevida plaquetaria, se puede determinar, por medio de radioactividad externa, el lugar del secuestro. Este mtodo no se utiliza en clnica.
4.2.2. Mtodos de fase II Los mtodos de fase II o mtodos para estudio serolgico inicial son los ms usados, permiten medir la IgG asociada a plaquetas (PAIgG) y los anticuerpos antiplaquetarios circulantes (AcAPc). Pueden cuantificar en algunos casos, el nmero de molculas de IgG unida a las plaquetas, sin considerar su especificidad. PAIgG. Se puede medir la PAIgG total y la PAIgG de superficie. En el primer uso se mide la cantidad de IgG en un lisado plaquetario, por lo que la IgG cuantificada corresponde a la IgG de superficie y a la liberada por las plaquetas. Esta ltima fraccin representa la mayor parte de la IgG plaquetaria. La medicin directa de la PAIgG (de superficie) es la ms utilizada. En su pesquisa se utiliza anticuerpos anti-IgG humana marcados con radioistopos, enzimas o fluorocromos (figura 31-8): Anticuerpo monoclonal marcado con 125I. Este mtodo utiliza un anticuerpo monoclonal anti-lgG humana radiomarcado, el cual se une a la IgG antiplaquetaria fijada en la membrana en pr opor cin 1:1, permitiendo as la cuantificacin de las molculas de IgG. La forma indirecta de este mtodo, es decir la cuantificacin de molculas de IgG sobre plaquetas previamente sensibilizadas por un suero en estudio, es til en la pesquisa de AcAPc. Microscopa de Inmunofluorescencia. El uso de anticuerpos anti-IgG conjugado con isotiocianato de fluorescena (FITC) es otra for ma de evidenciar la presencia de anticuerpos antiplaquetarios, sean estos unidos directamente a la membrana plaquetaria (inmunofluorescencia directa, para pesquisa de PAIgG) o se encuentren en circulacin. En este ltimo caso se hace necesaria la incubacion previa del plasma o suero con plaquetas normales sobre la cual se fije la IgG (inmunofluorescencia indirecta). La principal desventaja de este mtodo es lo subjetivo de su interpretacin. Citometra de flujo. La citometra de flujo permite cuantificar la cantidad de anticuerpo monoclonal fluorescente unido a cada clula en for ma individual, facilitando la identificacin y tipificacin de subpoblaciones celulares con alta sensibilidad, especificidad y rapidez. Brevemente algunos aspectos de tipo metodolgico. La muestra de sangre puede
4.2. Mtodos de pesquisa de Anticuerpos antiplaquetarios Los mtodos de pesquisa de anticuerpos antiplaquetarios se han clasificado en fase I, II y III. A continuacin se describen las caractersticas ms importantes de estos mtodos. 4.2.1. Mtodos de fase I Los mtodos de fase I o de punto final, mezclan suero o plasma del paciente con plaquetas nor males y miden algunas reacciones dependientes de plaquetas. Entre otros mtodos se puede mencionar agregacin plaquetaria, disminucin del contenido granular, exposicin a sustancias procoagulantes o inhibicin de la migracin de plaquetas. Los mtodos de fase I presentan baja sensibilidad y especificidad, razn por la cual ya no se utilizan. La baja sensibilidad se explica porque no todos los anticuerpos son capaces de activar o alterar las plaquetas, y la baja especificidad se debe a que factores inmunolgicos y no inmunolgicos, pueden activar las plaquetas y producir falsos positivos.
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ser anticoagulada con EDTA (cido etilendiaminotetra-actico) o citrato de sodio. Las plaquetas pueden ser estudiadas en sangre total, plasma rico en plaquetas (PRP) y plaquetas lavadas en tampn fosfato salino (PBS) ms algn antiagregante plaquetario (EDTA, Prostaglandina PGE1). Las plaquetas pueden ser fijadas (con paraformaldehido o formaldehido), antes o despus de marcarlas con el anticuerpo monoclonal conjugado con el fluorocromo. Si bien las plaquetas generalmente pueden ser identificadas usando la informacin que proporcionan el SSC (Side Scatter Colection) y el FSC (Forward Scatter Colection), para asegurar su reconocimiento y as no confundirlas con los restos celulares (debris) se aconseja marcar las clulas con un anticuerpo dirigido contra una glicoprotena de membrana plaquetaria (ej. GPIIIa=CD61). El fluorocromo conjugado con este anticuerpo debe ser diferente al que se usa en el estudio propiamente tal. Los resultados se expresan en igual forma que en otras clulas: (i) intensidad media de fluorescencia, (ii) porcentaje de clulas marcadas (que emiten fluorescencia) y (iii) nmero de molculas en estudio por cada plaqueta. Esta ltima es de uso infrecuente. El tratamiento de las plaquetas para estudio por microscopa de inmunofluorescencia y por citometra de flujo, en lo fundamental, es el mismo, la diferencia est en la lectura (microcospio citmetro de flujo). Este ltimo determina la subpoblacin, de plaquetas que presentan fluorescencia, respecto al control de isotipo, y la intensidad de dicha fluorescencia. Se puede determinar tanto PAIgG como AcAPc.
reaccionar con membranas plaquetarias inmovilizadas en placas de microtitulacin. La IgG antiplaquetaria unida, se revela con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con una enzima, generalmente fosfatasa alcalina. El color desarrollado luego de agregar el sustrato de la enzima (para fosfatasa alcalina: pnitrofenilfosfato), es proporcional a la cantidad de IgG antiplaquetaria existente del suero en estudio (figura 31-9). Se considera que una muestra es positiva para la pesquisa de anticuerpos cuando su densidad ptica (DO) es mayor a la absorbancia promedio de tres sueros normales ms tres DE.
Figura 31-9. Pesquisa de anticuerpos antiplaquetarios por ELISA.
4.2.3. Mtodos de fase III Los mtodos de fase III son para determinar la especificidad antignica de los anticuerpos antiplaquetarios. Miden la IgG unida a glicoprotenas (GP) plaquetarias especficas superando los problemas de la unin no especfica de la IgG a la superficie plaquetaria. Los mtodos de fase III son capaces de identificar la glicoprotena especfica a la cual el anticuerpo antiplaquetario se une, mas no miden la cantidad de IgG unida. Se han descrito varios mtodos de esta fase: Westernblot o Inmunoblot, ELISA con antgeno capturado (EAC), ELISA con antgeno capturado modificado (EACM), Inmovilizacin de antgeno plaquetario por anticuerpos monoclonales especficos (MAIPA). ELISA con antgeno capturado (EAC). El lisado plaquetario es inmovilizado sobre placas de microtitulacin cubiertas con anticuerpo monoclonal (Ac Mo) dirigido contra las GP mayores de membrana plaquetaria (IIb-IIIa, IaIIa, Ib-IX). Sobre este lisado se hace reaccionar el plasma o eluido plaquetario del paciente. La IgG humana capturada en la placa es revelada, posterior mente, por incubacin con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina.
Figura 31-8. Esquema de mtodos para estudiar Inmunoglobulina G asociada a plaquetas (PAIgG) .
ELISA de membranas plaquetarias. Para pesquisar AcAPc, el suero en estudio se hace
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Este mtodo prcticamente ya no es utilizado pues se ha establecido que el lisar previamente las plaquetas altera algunos eptopos de GP plaquetarios. ELISA con antgeno capturado modificado (MACE). En este ELISA las plaquetas son lisadas despus de reaccionar con el suero en estudio. Esto da una mayor sensibilidad al ensayo, ya que pueden ser pesquisados anticuerpos que dependan de la conformacin de eptopos de GP plaquetarias. Luego de la lisis plaquetaria, los complejos inmunes son incubados en una placa de microtitulacin cubierta con Ac Mo, anti GP y revelados por incubacin con Ac antiIgG humana conjugado con fosfatasa alcalina (figura 31-10).
4.2.4. Mtodos para estudiar las trombocitopenias inducidas por drogas Cualquiera de los mtodos, antes mencionados y que se utilizan en la pesquisa de anticuerpos antiplaquetarios, pueden ser tiles para el estudio de anticuerpos cuyo mecanismo de accin en las trombocitopenias es dependiente de algn frmaco. Los ensayos que se utilicen deben incluir la incorporacin de la droga en todo el procedimiento de deteccin para permitir la accin del anticuerpo. Se entiende que el paciente presenta un anticuerpo antiplaquetario dependiente de un frmaco determinado, cuando hay reaccin positiva con la muestra en presencia de droga, pero no en ausencia de la misma. Un suero normal debe ser negativo para la pesquisa, ya sea en ausencia o presencia de droga. La trombocitopenia inducida por frmacos ms caracterstica es la Trombocitopenia inducida por Heparina (TIH). Trombocitopenia inducida por Heparina La TIH es una importante complicacin de la terapia con heparina, presentndose en el 510% de los pacientes en tratamiento con este anticoagulante. Esta patologa est asociada a heparina no fraccionada, pero tambin se observa, con menos frecuencia, en pacientes tratados con heparina de bajo peso molecular. Clnicamente se presenta como trombocitopenia (<100x103 plaquetas/l) o reduccin del recuento plaquetario en 30-50% respecto al valor base, complicacin que se presenta entre 5 a 15 das despus de iniciado el tratamiento; en pacientes expuestos previamente a heparina, sta se desarrolla dentro de horas a pocos das. El 20-50% de los casos de TIH se asocia a trombosis venosa y algunas veces a trombosis arterial (Trombocitopenia-Trombosis Inducida por Heparina, TTIH). La TIH est relacionada a la presencia de AcIH, que se desarrolla en un grupo de pacientes tratados con heparina. stos presentan especificidad por el complejo PF4-H. La presencia de AcIH no necesariamente se asocia a TIH, existiendo por tanto individuos asintomticos. El diagnstico de TIH se apoya en dos tipos de pruebas de laboratorio: funcionales e inmunolgicas. Ninguno de los dos tipos de pruebas permite hacer diagnstico de TIH en el 100% de los casos, observndose resultados discrepantes en el 10-20% de los pacientes.
Figura 31-10. Esquema de ELISA con antgeno capturado modificado (MACE).
Inmovilizacin de antgenos plaquetarios por anticuerpos monoclonales especficos (MAIPA). En este mtodo el complejo Ac Mo anti-GP plaquetaria especfica - GP - Ac APc es capturado por Ac anti-IgG de ratn fijados en la microplaca. El revelado de la reaccin se realiza igual que en el MACE, es decir con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina y el respectivo sustrato (figura 31-11).
Figura 31-11. Esquema de ELISA Inmovilizacin de antgenos plaquetarios por anticuerpos monoclonales especficos (MAIPA).
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Pruebas funcionales Los ensayos de este tipo ms usados, son los que estudian la capacidad de los AcIH IgG para activar plaquetas. Tanto en la prueba de Liberacin de 14C-serotonina (figura 31-12) como en el ensayo de Agregacin plaquetaria, plaquetas nor males de un donante son incubadas con plasma en estudio (y plasma normal como control). En el primer caso, una prueba altamente sensible (<90%), 14 Cserotonina que se incorpora a los grnulos densos de las plaquetas desde donde es liberada cuando stas son activadas. Ambos ensayos se pueden optimizar usando plaquetas lavadas y una adecuada concentracin de heparina (0.1-1 UI/ml); esto considerando que en ausencia de heparina y en presencia de alta concentracin de sta (100 UI/mL) no se presenta reactividad. Se debe incubar un suero control positivo y controles negativos (suero normal y reacciones sin heparina y con alta concentracin de la misma 100 UI/mL). En estas condiciones la especificidad es superior al 90%. Otras pruebas funcionales son la activacin plaquetaria inducida por heparina, ensayos luminiscentes que evalan la activacin plaquetaria por liberacin de ADP o ATP, y generacin de micropartculas utilizando citometra de flujo. Pruebas inmunolgicas La identificacin de PF4 como el principal antgeno para los AcIH, en presencia de heparina, ha permitido el desarrollo de ELISA anti-PF4-H. Esta prueba requiere un equipo de uso ms frecuente en los laboratorios, respecto a lo requerido para las pruebas funcionales. ste es un ELISA de fase slida en que PF4 (10 g/ ml) junto con heparina convencional (0.5 UI/ ml) se unen a pocillos de placa de microtitulacin. Posteriormente se agrega el suero en estudio que podra presentar AcIH; luego se adiciona un segundo anticuerpo antiIgG conjugado con enzima (generalmente fosfatasa alcalina) y finalmente se revela con el sustrato apropiado. Como en todo ELISA debe incluirse blancos, contr oles negativos y positivos. Presenta una sensibilidad de 80-90%. IgG es el isotipo ms frecuente encontrado en pacientes con TIH (80%). El ELISA PF4-H puede detectar anticuerpos dbiles que no son evidenciados por pruebas funcionales (Ej. IgM e IgA, por ello ahora no son estudiados). Por su parte, estas ltimas
pueden pesquisar especificidades diferentes a PF4 (Ej. anti-IL-8). Dada la alta sensibilidad de ambos tipos de pruebas, y no habindose resuelto an la superioridad de una sobre la otra, se puede utilizar cualquiera de ellas para la pesquisa rutinaria. Se puede incluir una segunda prueba (ELISA PF4-H o Liberacin de 14Cserotonina, segn la que use habitualmente el laboratorio), para aquellos casos en que el cuadro clnico sea compatible con TIH, y los AcIH no fueron pesquisados por la prueba utilizada inicialmente. Debido a que existen pacientes que desarrollan AcIH y no presentan complicaciones no se recomienda realizar como screening alguna de las pruebas para pesquisar AcIH en todos los pacientes que son tratados con heparina.
Figura 31-12. Secrecin de serotonina- 14C
4.3. Biologa molecular aplicada al estudio de las trombocitopenias inmunes Tres condiciones clnicas pueden resultar de una aloinmunizacin contra antgenos plaquetarios especficos: Prpura aloinmune neonatal (PAN), Prpura post-transfusional (PPT) y refractariedad a la transfusin de plaquetas (RTP). En estas situaciones se requiere de una rpida y precisa tipificacin de los sistemas antignicos plaquetarios (HPA: Human platelets antigens) de los pacientes y donantes. Adems en el caso del PAN, los padres pueden ser aconsejados acerca de futuros embarazos. La serotipificacin utilizando los mtodos de fase III antes descritos pueden presentar dos pr oblemas: trombocitopenia marcada y ausencia de sueros controles positivos para ciertas especificidades antignicas, lo que hace que los procedimientos de serotipificacin sean limitados.
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En contraste, la genotipificacin HPA puede ser realizada con DNA genmico de material celular conveniente y usando reactivos comercialmente disponibles. Las bases moleculares estn descritas para la gran parte de los antgenos especficos de plaquetas y la diferencia entre dos alelos se basa en un nucletido lo que origina como resultado el cambio de un aminocido. Una variedad de tcnicas basadas en PCR han sido utilizadas para la genotipificacin HPA, pero la ms utilizada es la PCR alelo especfica. Este mtodo utiliza un partidor nico de consenso para el extremo 5 y un partidor especfico para el extremo 3 de cada alelo. La amplificacin del templado y la deteccin del alelo en estudio, estar condicionada de acuerdo a la especificidad de la secuencia del extremo 3 del partidor usado (figura 31-13). Para validar la reaccin de amplificacin, se realiza una amplificacin paralela de un gen independiente del sistema antignico estudiado, por ejemplo el gen de la Hormona de crecimiento. Los productos amplificados son analizados electroforticamente en gel de agarosa, teido con br omuro de etidio y visualizados posteriormente con luz UV.
Existen numerosas patologas (adquiridas y hereditarias) asociadas a disfunciones plaquetarias, que comprometen las distintas fases en que stas participan. Estas patologas se expresan, generalmente, como sangrados que varan ampliamente en su gravedad. La funcin plaquetaria se ve afectada por defectos producidos por: falta de receptores esenciales para la adhesin y agregacin, daos en la sealizacin interna, que provocan alteraciones en la secrecin plaquetaria y/o defecto en la exposicin de fosfolpidos cargados negativamente en la membrana. En el laboratorio clnico el estudio de la funcin plaquetaria comprende, esencialmente, el estudio de agregacin plaquetaria y secrecin plaquetaria. En este capitulo se describe, la forma habitual en que se realiza el estudio de funcin plaquetaria en el laboratorio clnico. 5.1. Principales disfunciones plaquetarias 5.1.1. Desrdenes adquiridos Las alteraciones adquiridas de la funcin plaquetaria son complejas; se han asociado a mltiples patologas y no infrecuentemente al uso de frmacos que interfieren con la funcin de las plaquetas. Entre las dr ogas antiplaquetarias ms comunes se encuentra el cido acetil saliclico (aspirina) que inhibe la enzima cicloxigenasa que convierte cido araquidnico en tromboxano A2, potente agonista plaquetario y mediador de la liberacin del contenido granular; este efecto es irreversible por lo que se necesita un recambio total de las plaquetas para que su efecto desaparezca. Otras drogas que afectan la funcin plaquetaria son los antiinflamatorios no esteroidales; afectan la funcin plaquetaria por inhibicin de la formacin de prostaglandinas y debido a su reversibilidad el efecto dura mientras est presente el frmaco. 5.1.2. Desrdenes hereditarios Las formas heredadas incluyen un heterogneo grupo de deficiencias; existen alteraciones tanto en la adhesin por deficiencia de los receptores involucrados o en la secrecin por defecto en las vas de sealizacin interna, que tienen como resultado la expulsin del contenido granular. Los defectos de adhesin pueden ser dados por
Figura 31-13. Esquema de la PCR alelo especfica.
5. ESTUDIO DE LA FUNCIN PLAQUETARIA La participacin de las plaquetas en el proceso de la hemostasis es fundamental. Las reacciones en las que participan son: adhesin a la zona lesionada, extensin de las plaquetas sobre la superficie expuesta, secrecin de sus grnulos y aceleracin del proceso de coagulacin por exposicin de superficie adecuada para la activacin de los factores de coagulacin. El resultado es la formacin de una malla de fibrina, que refuerza el tapn plaquetario (ver captulo 19).
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defecto en los receptores de colgeno (GPVI, Ia/IIa), fibringeno (GPIIb/IIIa) o FVW (GPIb) y los de secrecin por falta de contenido granular o movilizacin de su contenido. Los sndromes ms caracterizados incluyen sndrome de Bernard Soullier, en que falta el receptor para FVW y la Trombastenia de Glanzmann, que se caracteriza por ausencia del receptor para fibringeno. En cuanto a defectos de la secrecin plaquetaria el ms caracterizado es el sndrome de Storage Pool Diesae en el cual se observa la ausencia de grnulos densos en las plaquetas. 5.2. Estudios de laboratorio Cuando se sospecha algn sndrome hemorragparo es necesario realizar diferentes pruebas de laboratorio. El estudio de la funcin plaquetaria se inicia por una etapa de screening (Tiempo de sangra o PFA-100) y se contina con otr os estudios ms especializados (Agregacin y secrecin plaquetaria). 5.2.1. Pruebas de screening Tiempo de sangra El tiempo de sangra mide la integridad vascular, nmero de plaquetas y su funcin (hemostasia primaria). Adquiere real importancia diagnstica cuando se ha descartado trombocitopenia. El tiempo de sangra consiste en provocar una pequea incisin al paciente y tomar el tiempo requerido para que forme el tapn plaquetario y cese el flujo de sangre. Se debe minimizar la variabilidad dependiente del operador, para lo cual el mtodo de Ivy utiliza una lanceta estandarizada, en cuanto a longitud del corte y profundidad. El lugar de la incisin debe ser el antebrazo y se debe fijar una presin de 40 mm Hg. La duracin del sangrado, debe estar dentro de un rango normal establecido, por el laboratorio; generalmente es hasta 7 u 8 minutos. El tiempo de sangra se ve alterado, por disminucin en el recuento plaquetario, alteraciones en la funcin plaquetaria y EvW como causas ms frecuentes y tambin por el uso de frmacos como el cido acetilsaliclico. PFA-100 Una medicin alternativa al tiempo de sangra
es la utilizacin de nuevo equipo llamado PFA 100 (PFA = Platelet Function Analyser) el cual permite evaluar la hemostasia primaria in vitro en que estn involucradas tanto las plaquetas como el FVW. La medicin consiste en hacer pasar sangre completa, anticoagulada con citrato de sodio, por un capilar que contiene una membrana recubierta con agonistas (colgeno/ADP o colgeno/epinefrina) a una velocidad de flujo estndar para emular las condiciones de flujo en circulacin normal. Las plaquetas normales al pasar por la membrana son activadas por los agonistas antes nombrados y tapan el paso de sangre cerrando el capilar, lo que se conoce como tiempo de oclusin. Un tiempo de oclusin prolongado indica que se encuentra frente a alteraciones, ya sea de las plaquetas o de FVW. Este mtodo de medicin permite determinar las alteraciones mencionadas de una forma menos invasiva, ms rpida y ms reproducible. Sin embargo, su utilidad diagnstica an est en proceso de ensayo. 5.2.2. Estudios para determinar la causa de la alteracin Una vez establecida la alteracin en la hemostasia primaria por una de las pruebas de screening, el siguiente paso es determinar la causa de esta alteracin. Para ello se debe proseguir estudiando, en primera instancia, las enfermedades que lo alteran en forma ms frecuente como son EvW (ver punto 3) y las disfunciones plaquetarias (trombocitopatas). Para determinar alteraciones de la funcin plaquetaria se realiza el estudio de agregacin y secrecin plaquetaria. 5.2.3. Estudio de agregacin plaquetaria Este estudio consiste en enfrentar a las plaquetas a diferentes agonistas que dan cuenta del funcionamiento de receptor es o de estructuras internas. Los agonistas utilizados ms frecuentemente son araquidonato de sodio, ADP, epinefrina, colgeno y ristocetina, utilizndose para este ensayo un equipo llamado agregmetro. En trminos simples el funcionamiento de este equipo consiste en hacer incidir un haz de luz de una longitud de onda fija, a travs de una celda que contiene un plasma rico en plaquetas
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(PRP), el que es sometido a la accin de alguno de los agonistas mencionados, al producirse la agregacin de plaquetas, stas permiten un mayor paso de luz a travs de la solucin. Este
aumento de paso de luz es detectado por un sistema detector y expresada como un aumento de transmitancia de la solucin que luego es graficado (figura 31-14).
Figura 31-14. Esquema funcional de un agregmetro.
En la figura 31-15 se muestran algunos registros de agregacin plaquetaria caractersticos.
Figura 31-15. Registro obtenido en agregmetro de la agregacin plaquetaria con tres agonistas (ADP, colgeno y ristocetina).
El empleo de un conjunto de agonistas permite tener una visin amplia del funcionamiento de los receptores ms importantes, as como del funcionamiento interno de las plaquetas, establecindose las posibles causas de disfuncin plaquetaria. El araquidonato de sodio permite determinar si existe alguna alteracin en las vas de sealizacin interna de la plaqueta, que termina
con la expresin de receptores para fibringeno y la expulsin del contenido granular. Esta va se ve fuertemente inhibida por el cido acetilsaliclico, el cual acta sobre la ciclooxigenasa, enzima encargada de transfor mar el cido araquidnico en tromboxano A2, potente agregante plaquetario que difunde por la membrana y acta sobre su receptor produciendo un efecto reverberante
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en la activacin plaquetaria. La inhibicin de la ciclooxigenasa provoca una incapacidad de la plaqueta de secretar su contenido granular y por lo tanto, inhibe el reclutamiento de nuevas plaquetas al agregado plaquetario. El ADP es un agonista dbil plaquetario que posee 3 tipos diferentes de receptores en las plaquetas (P2Y1, P2Y12, P2X1). Participa en conjunto con otros receptores como epinefrina. Su actividad est asociada a la fase de consolidacin del tampn plaquetario y a un efecto de retroalimentacin. La activacin de la plaqueta provoca una liberacin de ADP de los depsitos internos lo que provoca una mayor activacin plaquetaria. El colgeno acta sobre las plaquetas por unin a FVW que se une a su receptor plaquetario, la GPIb-IX, lo que provocara el fenmeno de adhesin plaquetaria. Adems el colgeno posee otros receptores como GPIa-IIa, y GPVI, las cuales lo unen directamente provocando la activacin plaquetaria. La ristocetina se utiliza en el laboratorio para evaluar la funcin de FVW, actuando como un cofactor. La ristocetina permite que el FVW sea capaz de unirse a su receptor y produzca uniones entre plaquetas haciendo de puente entre una y otra, lo que se conoce como aglutinacin plaquetaria. 5.2.4. Estudio de secrecin plaquetaria Este estudio consiste en cargar plaquetas con serotonina marcada con carbono ( 14C). La serotonina es incorporada en la plaqueta por medio de difusin facilitada a travs de transportadores y almacenada en los grnulos densos. Una vez que la plaqueta es cargada con la serotonina, las plaquetas son estimuladas con diferentes agonistas y se registra la agregacin plaquetaria en un agregmetro, segn se describi en el punto 5.2.3. Posteriormente la alcuota de PRP se fija, se separan los agregados plaquetarios del plasma por centrifugacin y se determina la cantidad de serotonina -14C liberada al medio, mediante la medicin de la radioactividad de 14C con un contador de centelleo.
El estudio de secrecin plaquetaria puede verse alterado por la ingesta de frmacos que inhiben la recaptacin de serotonina como ocurre con algunos antidepresivos. 5.2.5. Estudio de glicoprotenas plaquetarias especficas Como se indic antes (punto 5.1.2.) un tipo de trombocitopatas hereditarias se explica por ausencia o disminucin de glicoprotenas especficas plaquetarias: GPIIb-IIIa (Enfermedad de Glanzmann) y GPIb-IX (Enfermedad de Bernard Soulier). Si bien stas se expresan en alteraciones en los patrones de los registros de agregacin plaquetaria, la deteccin de la ausencia o disminucin de la glicoprotena de membrana se realiza preferentemente por citometra de flujo, utilizando anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos (ver punto 4.2.1.b). LECTURAS SUGERIDAS Estudio de alteraciones de la coagulacin Bakhshi, S., Arya, L.S. Diagnosis and treatment of disseminated intravascular coagulation. Indian Pediatr.; 40(8):721-30, 2003. Barthels, M. Diagnostic of blood coagulation. Hamostaseologie; 24(2):123-34, 2004. Eckman, M.H., Erban, J.K., Singh, S.K., Kao, G.S. Scr eening for the risk for bleeding or thrombosis. Ann Intern Med.;138(3):W15-24, 2003. Horstkotte, D., Piper, C. Improvement of oral anticoagulation therapy by INR selfmanagement. J Heart Valve Dis.;13(3):335-8, 2004. Mwanda, O.W. Lupus anticoagulants: pathophysiology, clinical and laboratory associations: a review. East Afr Med J .; 80(11):564-8, 2003. Rick, M.E., Walsh, C.E., Key, N.S. Congenital bleeding disorders. Hematology 559-74, 2003. Stepanian, A., Biron-Andreani, C. Primary hemostasis exploration. Ann Biol Clin (Paris); 59(6):725-35, 2001.
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HEMATOLOGA
Captulo
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ESTUDIO DE LABORATORIO DE LAS TROMBOFILIAS

Ivn Palomo G., Ricardo Forastiero V., Silvia Pierangeli y Jaime Pereira G.
1. Introduccin 2. Trombofilias hereditarias 2.1. Principios de la metodologa aplicada al estudio de trombofilias 2.1.1. Ensayos funcionales 2.1.2. Ensayos inmunolgicos 2.1.3. Ensayos genticos por PCR 2.2. Trombofilias hereditarias 2.2.1. Antitrombina III 2.2.2. Protena C 2.2.3. Protena S 2.2.4. Resistencia a la PC activada 2.2.5. Factor V Leiden 2.2.6. Polimorfismo G20210A del gen de la protrombina 2.2.7. Homocistena plasmtica 3. Anticuerpos antifosfolpidos 3.1. Anticuerpos anticardiolipina 3.2. Anticoagulante lpico 3.3. Otras pruebas de laboratorio
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RESUMEN
Las trombosis, incluidas las enfermedades cardiovasculares (ECV), son una de las primeras causas de morbilidad y mortalidad. Varios factores de riesgo de trombosis venosas (TV), o arteriales (TA) son conocidos; algunos son modificables, entre ellos los factores de riesgo clsicos asociados a TA como hipertensin arterial, diabetes, hipercolesterolemia, obesidad, tabaquismo y sedentarismo. Tambin entre los factores de riesgo clsicos se encuentran los preferentemente asociados a TV (anticonceptivos orales, inmovilizacin y cncer), y la edad que se asocia a ambos tipos de trombosis. Otro grupo de factores de riesgo de ECV son las tromboflias, tanto hereditarias (Ej. Deficiencia del Sistema de la Protena C, Deficiencia de Antitrombina III, Factor V Leiden y Mutacin de la Protrombina G20210A) como adquiridas (Ej. Anticuerpos antifosfolpidos). Este captulo revisa los principios fundamentales de los mtodos de laboratorio, que permiten estudiar las trombofilias ms importantes, tanto hereditarias como adquiridas.
1. INTRODUCCIN La trombosis venosa o arterial es un fenmeno relativamente frecuente de observar, tanto en sujetos aparentemente sanos, como en otros que presentan factores de riesgo conocido. Un porcentaje importante de eventos trombticos no son explicados por los factores de riesgo clsicos, a modo de ejemplo, para trombosis arterial: dislipidemias, hipertensin arterial, diabetes, tabaquismo; para trombosis venosa: postoperatorio, traumatismo, cncer, embarazo, sndrome nefrtico; para ambos tipos de trombosis: edad, anticonceptivos orales, obesidad. Se denomina trombofilias al estado de mayor propensin a trombosis, sin factores de riesgo conocido. Se conocen trombofilias hereditarias y adquiridas. Entre las primeras se han descrito varias pero slo algunas estn suficientemente reconocidas: Factor V Leiden, Mutacin G20210A de la protrombina, Dficit de Antitrombina III, Dficit de Protenas C y S, Hiperhomocisteinemia (ver captulo 24). Entre las trombofilias adquiridas estn los Anticuerpos antifosfolpidos que actan por mecanismos inmuno mediados. En este captulo se describirn brevemente los mtodos ms usados para estudiar, tanto las trombofilias hereditarias como las adquiridas.
2. TROMBOFILIAS HEREDITARIAS 2.1. Principios de la metodologa aplicada al estudio de trombofilias 2.1.1. Ensayos funcionales Los mtodos funcionales permiten evaluar la actividad de la protena en estudio y estn diseados en base al mecanismo fisiolgico de la hemostasia en la cual intervienen. Por este motivo son ensayos de primera lnea en hemostasia. Coagulantes: son tcnicas en donde se determina la actividad de las protenas que intervienen en las diferentes etapas de la hemostasia, usando la formacin del cogulo de fibrina como punto final de la reaccin. Cromognicos: estn basados en la actividad enzimtica de las protenas al actuar sobre sustratos cromognicos que son pptidos de 2 a 4 aminocidos combinados con un cromforo. Las pr oteasas (pr otenas con actividad enzimtica) causan la escisin del pptido y liberan el cromforo (generalmente paranitr oanilina), generando cambios en la absorbancia a 405nm. Los cambios en la densidad ptica pueden ser evaluados durante los primeros minutos de la reaccin (tcnica cintica) o al trmino de un tiempo prefijado
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(tcnica de punto final). Los mtodos pueden ser directos o indirectos. Los directos miden la actividad de la protena en estudio al transformarla, por accin de activadores, en enzima que actuar directamente sobre el sustrato cromognico y la concentracin de para-nitroanilina liberada es proporcional a la cantidad de enzima o de protena en estudio. Los indirectos se usan para los inhibidores fisiolgicos y el fundamento base es incubar, por un determinado tiempo, al inhibidor en estudio con un exceso de la enzima que inhibe. Luego de la formacin del complejo enzima-inhibidor se evala la cantidad de enzima residual y de esta manera la concentracin de paranitroanilina es inversamente proporcional a la concentracin del inhibidor o protena en estudio. 2.1.2. Ensayos inmunolgicos Son ampliamente usados para identificar y cuantificar las protenas plasmticas relacionadas al sistema hemosttico. En el estudio de trombofilia son considerados de segunda lnea y son recomendados utilizar solamente cuando la actividad funcional de la protena est disminuida y se quiere discer nir entr e disminucin de sntesis o sntesis de una protena disfuncional. Estas tcnicas evalan la interaccin entre antgeno (protena en estudio) y el anticuerpo que reconoce especficamente un determinante antignico sobre la protena. La formacin de los complejos antgeno-anticuerpo se manifiesta, visiblemente, en la reaccin como precipitacin, floculacin o aglutinacin, o a travs de marcadores que cuantifican al antgeno o al anticuerpo del complejo mediante enzimas, radioistopos o compuestos luminiscentes. Entre los mtodos ms utilizados actualmente en los estudios de trombofilias se encuentran: Inmunoturbidimtrico. Est basado en la utilizacin de micropartculas de ltex sobre las cuales se fijan, por uniones no covalentes, anticuerpos monoclonales especficos contra la protena en estudio. Estas soluciones de micropartculas no absorben luz por tener un dimetro menor que la longitud de onda incidente (590nm). Al formarse los complejos entre el antgeno y los anticuerpos fijados a las partculas, aumenta la absorbancia de luz, la cual es proporcional a la cantidad de antgeno pr esente en la muestra en estudio. La concentracin antignica puede calcularse por
anlisis de punto final, a partir de una curva de calibracin o por mtodos cinticos. Electroinmunodifusin (Laurell). El antgeno contenido en la muestra en estudio es colocado en pequeos crculos u orificios y se lo hace migrar por electroforesis en un medio de soporte (agar o acetato de celulosa) que contiene el antisuero o anticuerpo policlonal especfico en exceso. En el punto de equivalencia (concentracin ptima de antgeno-anticuerpo) se produce un pico de pr ecipitacin (r ocket), cuya altura es proporcional a la cantidad de antgeno presente en la muestra. La concentracin se obtiene por comparacin de las alturas de los picos obtenidos con una curva de referencia que debe colocarse en ambos extremos del soporte. Enzimoinmunoanlisis (EIA). Utiliza una enzima como marcador de la interaccin primaria entre el antgeno y el anticuerpo. Las enzimas ms usadas son la fosfatasa alcalina (sustrato cromognico: para-nitro-fenilfosfato a 405nm) y la per oxidasa (sustratos cromognicos: orto-fenilendiamina a 492 nm o tetrametilbenzidina a 450nm). En los EIA competitivos se cuantifica el antgeno y el reactivo contiene el mismo antgeno, pero acoplado qumicamente a la enzima marcadora. Se fija el anticuerpo sobre una fase slida (placa de poliestireno) y se agregan simultneamente la muestra y el reactivo para que compitan por unirse al anticuerpo de la placa. Luego de lavar las placas para eliminar los antgenos no unidos, la intensidad del color desarrollado ser inversamente proporcional a la concentracin de antgeno en la muestra. Entre los EIA no competitivos, el ELISA es el ms usado en hemostasia. Se utilizan microplacas recubiertas con antgeno (para medir anticuerpos) o con anticuerpos (para medir antgenos). Luego de incubar las muestras a dosar, se lavan las protenas no unidas a la placa y se detectan los complejos con antisueros especficos unidos a la enzima (segundo anticuerpo). La intensidad del color desarrollado ser directamente proporcional a la concentracin de antgeno o de anticuerpo en la muestra analizada. 2.1.3. Ensayos genticos por PCR La PCR o reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica que permite generar, in vitro, millones de copias de material gentico a partir de una secuencia especfica de DNA. La tcnica se basa en la repeticin secuencial de los siguientes pasos: 1) desnaturalizacin o
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separacin de las dos hebras de DNA por accin del calor (a 91-96C durante 1-2 min), 2) hibridizacin de los partidores (primers) especficos a la zona molde de inters (a 3768C durante 1-2 min) y 3) elongacin de los partidores por accin de la enzima Taq polimerasa (a 72C durante 1-2 min). Los partidores forman parte de las nuevas hebras de DNA y la Taq polimerasa sintetiza la hebra complementaria dando como producto final de la reaccin la generacin de DNA de doble cadena conteniendo la secuencia de inters. Repitiendo el proceso por varios ciclos (25-40) se generarn mltiples copias de la secuencia gentica que interesa estudiar. Es un mtodo simple, sensible y especfico, pero se necesita conocer la secuencia que interesa amplificar al seleccionar los primers y las condiciones del ensayo. Luego de la amplificacin de la secuencia gentica se utilizan diferentes mtodos para evaluar las mutaciones o polimor fismos genticos, pero aqu slo mencionaremos los dos ms usados: Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin. Est basado en usar enzimas aisladas de bacterias que reconocen una determinada secuencia de 4 a 8 nucletidos y producen un corte en la doble cadena de DNA. Si existe una mutacin (cambio de una sola base nucleotdica) que genera o destruye un sitio especfico para una enzima de restriccin, podemos estudiar la presencia de estas mutaciones por la longitud de los fragmentos obtenidos al digerir el DNA generado por la PCR con las enzimas de restriccin. PCR-alelo especfica. Se basa en la utilizacin de partidores especficos para el alelo normal y para el alelo mutado, apr ovechando la incapacidad de la taq polimerasa para amplificar el DNA cuando existe no complementariedad a nivel del extremo 3. Se realiza una reaccin de PCR con los partidores normales y otra con los mutados y se determina el estado normal, heterocigoto u homocigoto mutado en base a la amplificacin obtenida. 2.2. Trombofilias hereditarias 2.2.1. Antitrombina III (ATIII) Mtodos funcionales. El ms utilizado es un ensayo cromognico indirecto en presencia de heparina (cofactor de la actividad de ATIII). Se basa en la capacidad de la ATIII de inhibir las
enzimas trombina o factor Xa en presencia de heparina en el medio de reaccin. Luego se cuantifica la cantidad de trombina o factor Xa residual mediante el sustrato cromognico especfico para trombina o factor Xa. La tcnica ms recomendada es aquella que evala la inhibicin de factor Xa, porque ofrece la ventaja de ser ms especfica para ATIII. El ensayo con trombina tiene la desventaja que puede sobreestimar los resultados como consecuencia de la presencia en el plasma del cofactor II de heparina, que tambin inhibe trombina. Mtodos inmunolgicos. Se utilizan el de Laurell y el inmunoturbidimtrico. La ventaja de este ltimo es su rapidez (menos de 60 minutos) y reproducibilidad cuando se utilizan equipos comerciales. El rango de referencia es de 80-120%, tanto para su actividad funcional como concentracin antignica. Los niveles disminuidos de ATIII se pueden hallar en deficiencias congnitas del inhibidor, pero tambin en hepatopatas, coagulacin intravascular diseminada, sndrome nefrtico, pacientes quemados, tratamiento con heparina no fraccionada, tratamientos hormonales y tratamiento con L-asparaginasa. Siempre se realiza la deter minacin por mtodos funcionales y la concentracin antignica se evala solamente en casos de valores funcionales disminuidos para categorizar la deficiencia como del tipo I o II. 2.2.2. Protena C (PC) Mtodos funcionales. El ensayo cromognico directo utiliza un activador especfico de la PC derivado del veneno de la vbora Agkistrodon contortrix y la cantidad de enzima producida se determina por su accin sobre el sustrato cromognico especfico para PC activada. El ensayo coagulante se basa en la prolongacin del TTPA causado por la inactivacin de los factores V y VIII activados por accin de la PC presente en el plasma en estudio y que es activada previamente por accin de venenos de vbora especficos. Por su mayor reproducibilidad el mtodo de preferencia es el cromognico. Mtodos inmunolgicos. Se utilizan el de Laurell y el ELISA. La ventaja de este ltimo es su mayor rapidez y reproducibilidad cuando se utilizan equipos comerciales. El rango de referencia en adultos es de 65130%, tanto para su actividad funcional como
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concentracin antignica y es independiente del sexo y la edad. Los neonatos tienen valores disminuidos de PC (<30%) por la inmadurez heptica, llegando a los valores del adulto alrededor de los 10 aos de edad. Los niveles disminuidos de PC se presentan en deficiencias congnitas de la protena y ms frecuentemente por causas adquiridas. Entre ellas estn las alteraciones hepticas, coagulacin intravascular diseminada, tratamiento con anticoagulantes orales y dficit nutricional de vitamina K. La deter minacin de eleccin es mediante mtodos funcionales y la concentracin antignica solamente en casos de valores funcionales disminuidos para categorizar la deficiencia como del tipo I o II. 2.2.3. Protena S Mtodos funcionales. El ensayo coagulante se basa en la determinacin de la actividad de la protena (PS), actuando como cofactor de la PC activada, en la inhibicin del factor Va. En un medio en exceso de PC activada y factor Va, la inhibicin de ste y por lo tanto la prolongacin del TTPA, depender de la cantidad de PS libre, presente en el plasma en estudio. Este ensayo es insensible a niveles de heparina en sangre inferiores a 1 U/ml, pero concentraciones mayores pueden producir sobreestimacin de la tasa de PS. Mtodos inmunolgicos. Los ms usados son Laurell, inmunoturbidimetra y ELISA. En el caso del ensayo de Laurell y de inmunoturbidimetra se debe hacer un tratamiento previo de las muestras con polietilenglicol con el objetivo de separar la fraccin libre de PS de aquella unida al C4bBP. Luego se realiza el ensayo elegido con la muestra sin tratar para dosar PS total y con la muestra tratada para cuantificar PS libre. Existen actualmente equipos comerciales para PS libre que utilizan las tcnicas de ELISA o de inmunoturbidimetra en muestras de plasmas sin tratar. En estos mtodos nuevos se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra eptopos especficos de la PS libre. La ventaja de estos ltimos es su mayor rapidez y reproducibilidad y adems que eliminan los pasos de pretratamiento de las muestras que son difciles de estandarizar. El rango de referencia en adultos del sexo masculino es de 60-130% y en mujeres de 50120%. La actividad funcional y la concentracin antignica es, por lo tanto, dependiente del sexo y aumenta con la edad en mujeres. Desde el nacimiento hasta los 10 aos, los niveles de PS
se encuentran disminuidos en un 30-50% respecto a los valores del adulto. Los niveles disminuidos de PS se presentan en deficiencias congnitas de la protena y tambin por causas adquiridas. Entre ellas estn las enfermedades hepticas, coagulacin intravascular diseminada, tratamiento con anticoagulantes orales, dficit nutricional de vitamina K, tratamientos hor monales, embarazo y la presencia de anticuerpos antifosfolpidos. Los mtodos de eleccin son el funcional coagulante y/o los inmunolgicos, que miden directamente la concentracin de PS libre. 2.2.4. Resistencia a la PC activada Tcnica original. El ensayo funcional coagulante para pesquisar la resistencia en la PC activada (APCR) se basa en la determinacin del TTPA en el plasma problema en presencia o ausencia de PC activada. El principio de la tcnica es la prolongacin del TTPA en el ensayo realizado en presencia de PC activada como resultado de la degradacin de los factores V y VIII activados. Los resultados se expresan en forma de razn entre los tiempos en segundos del TTPA con PC activada respecto al TTPA basal sin PC activada. Tcnicas modificadas. Existen varios mtodos que surgieron luego del original. El ms usado es aquel que utiliza el mismo principio del ensayo original per o las muestras son prediluidas en un plasma deficiente en factor V. De esta manera el ensayo se hace ms especfico para la evaluacin del fenotipo del FVL. Los resultados se expresan como se mencion en la tcnica original. Otra de las tcnicas modificadas es aquella que utiliza la respuesta al aadido de PC activada, pero se mide el grado de prolongacin del tiempo de coagulacin inducido por el veneno de la vbora Russell en vez de la cefalina del TTPA. En otro mtodo se evala la respuesta a la PC activada pero activando el plasma con reactivo diluido de tromboplastina (reactivo base del tiempo de protrombina). Existe adems un mtodo cr omognico que evala el grado de inactivacin del factor VIII promovido por la PC activada. El mtodo ms nuevo es uno que evala el grado de inactivacin del factor Va en muestras de plasmas prediluidas en plasma deficiente en factor V y usando como activador de la PC al veneno de la vbora Agkistrodon contortrix. Se considera APCR anormal cuando las razones de tiempos del TTPA con el ensayo original o el
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modificado son menores de 2. Sin embargo cada laboratorio debe establecer su propio punto de corte, ya que el mismo depende del reactivo y del instrumento de deteccin (coagulmetro) utilizado. En el caso de usar el mtodo modificado con activador de PC (vbora Agkistrodon contortrix) se considera anormal cuando el resultado del test de coagulacin es menor de 120 segundos. El ensayo original da resultados alterados en pacientes con FVL pero tambin ante muchas causas adquiridas. Entre ellas estn los anticuerpos antifosfolpidos, niveles disminuidos de PS, niveles aumentados de factor VIII, embarazo, ingesta de anticonceptivos orales, tratamiento con anticoagulantes orales o heparina y presencia de inhibidores especficos de factores de la coagulacin. Con el mtodo de TTPA modificado o con el que usa al activador de PC (vbora Agkistr odon contortrix) se elimina la interferencia de la mayora de las causas de una APCR adquirida. De esta manera estos dos ltimos ensayos son ms sensibles y especficos para la deteccin de pacientes portadores del FVL. Sin embargo, los pacientes con anticuerpos antifosfolpidos pueden presentar una APCR alterada an usando estos mtodos modificados. 2.2.5. Factor V Leiden El Factor V Leiden (FVL) se origina como consecuencia de una mutacin puntual en el exn 10 del gen del factor V donde se sustituye una guanina (G) en la posicin 1691 por una adenina (A). Como resultado de la sustitucin nucleotdica la protena del factor V presenta una glutamina en la posicin 506, donde normalmente existe el aminocido arginina. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin. El mtodo por PCR realiza la amplificacin de un fragmento genmico de 267 pares de bases (pb) que incluye el nucletido 1691. Luego se realiza la digestin del DNA amplificado con la enzima de restriccin Mnl I y se evalan los fragmentos generados por electroforesis en gel de agarosa. La figura 32-1 muestra el patrn de bandas obtenido con el mtodo de PCR seguido de digestin con enzima de restriccin. El individuo normal que no tiene FVL presenta 3 bandas (163pb-67pb-37pb), el heterocigoto de la mutacin 4 bandas (200pb-163pb-67pb-37pb) y el homocigoto para el FVL dos bandas (200pb67pb).
Figura 32-1. Esquema de las bandas observadas en el mtodo con enzima de restriccin para FVLeiden.
2.2.6. Polimorfismo G20210A del gen de la protrombina El gen completo de la protrombina presenta 14 exones, 13 intrones, una regin 5 no traducida y una regin 3 no traducida. El polimorfismo G20210A del gen de la protrombina (PTG20210A) se asocia con niveles aumentados de protrombina y resulta de una variante gentica en la regin 3 no traducida donde una G es sustituida por una A en la posicin 20210 del gen. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin. En este mtodo se realiza la amplificacin de un fragmento genmico de 345pb que incluye al nucletido 20210. Luego se realiza la digestin del DNA amplificado con la enzima de restriccin Hind III y se evalan los fragmentos generados por electroforesis en gel de agarosa. PCR alelo especfica. Se realizan dos PCR para cada muestra. En la PCR-1 uno de los partidores presenta en el final de su cadena el alelo A y en la PCR-2 uno de los partidores lleva el alelo G al final de la secuencia. La figura 32-2 muestra el patrn de bandas obtenido con los dos mtodos de PCR ms utilizados. En el ensayo con enzima de restriccin, el individuo normal PT-20210GG pr esenta 1 nica banda de 345pb, el heterocigoto PT-20210GA muestra 2 bandas (345pb-322pb) y el homocigoto PT-20210AA 1 sola banda de 322pb. En el mtodo alelo especfico el patrn de bandas es el siguiente: homocigota normal PT-20210GG (1 fragmento de 270pb en la PCR-1 y 2 fragmentos de 270pb y 148pb en la PCR-2), heterocigota PT-20210GA (2 fragmentos de 270pb y 148pb en ambas PCR-
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1 y PCR-2) y homocigota alterado PT-20210AA (2 fragmentos de 270pb y 148pb en la PCR-1 y 1 fragmento de 270pb en la PCR-2).
proporcional al color desarrollado. Existe tambin un inmunoensayo de fluorescencia polarizada (FPIA) que tiene el mismo principio que el EIA. Los niveles normales de Hcy deben definirse en poblaciones sanas y con nivel vitamnico ptimo. El rango normal ms aceptado es de 5-15 M. Se debe tener en cuenta que los niveles de Hcy aumentan con la edad y es mayor en hombres que en mujeres (antes de la menopausia). La concentracin de Hcy es influenciada por diversos factores adquiridos y congnitos. Las causas adquiridas de aumento de Hcy en plasma pueden ser deficiencias de folatos y de vitaminas B 12 y B 6; consumo excesivo de alcohol, caf y cigarrillo; falla renal, hipotir oidismo, psoriasis, neoplasias, enfermedades gastrointestinales y tratamientos con metotrexate, fenitona, teofilina, niacina e isoniazida. Las causas genticas se relacionan a polimorfismos moleculares en las enzimas involucradas en el metabolismo de la Hcy (metilentetrahidrofolato reductasa y cistationina -sintetasa). 3. ANTICUERPOS ANTIFOSFOLPIDOS
Figura 32-2. Esquema de las bandas observadas en el estudio del gen de la protrombina por el mtodo de PCR con enzima de restriccin (arriba) o con el ensayo de PCR alelo-especfico (abajo).
2.2.7. Homocistena plasmtica Se han desarrollado varios mtodos para el anlisis cuantitativo de la homocistena plasmtica Hcy presente en plasma, suero u orina. Entre ellos se encuentran ensayos radioenzimticos, cromatografa gaseosa con deteccin por espectrometra de masa, cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) con deteccin por fluorescencia, ultravioleta o electroqumica y los inmunoensayos. Con la excepcin de este ltimo grupo de tcnicas (inmunoensayos), todos los dems son mtodos que se caracterizan por ser procesos muy laboriosos y por requerir instrumentos de muy alto costo. Por este motivo se mencionarn aqu solamente los inmunoensayos que poseen alta precisin, excelente correlacin con el mtodo de referencia de HPLC y un uso ms difundido en los laboratorios de hemostasia. Inmunoensayos. La primera etapa en estas tcnicas consiste en reducir la Hcy total de la muestra y convertirla enzimticamente a Sadenosil-homocistena (SAH). Posteriormente se realiza un ensayo de EIA competitivo entre la SAH de la muestra y la SAH unida a la placa de poliestireno en presencia de un anticuerpo monoclonal anti-SAH. La concentracin de Hcy en la muestra en estudio es inversamente Los anticuerpos antifosfolpidos (aFLs) son un grupo heterogneo de anticuerpos que se presentan en el Sndrome Antifosfolpido (SAF) primario y secundario; en este ltimo caso principalmente asociados a enfermedades del tejido conectivo, como Lupus eritematoso sistmico. Tambin se han descrito en infecciones y asociados al uso de ciertos frmacos (ver captulo 24). El diagnstico de SAF se establece cuando el paciente presenta junto a alguna de las manifestaciones clnicas propias del sndrome (tr ombosis venosa o arterial, abortos espontneos a repeticin, o trombocitopenia), anticuerpos anticardiolipina (aCL) en ttulo de moderado a alto y/o una prueba positiva para Anticoagulante lpico (AL), al menos en dos ocasiones separadas por alrededor de un mes y medio a dos meses. Los aFLs clnicamente ms importantes son los aCL y AL. Ms recientemente se ha incorporado el estudio de ensayos ms especficos como el ELISA para anti-2GPI y anti-protrombina (aPT). Los aCL, anti-2GPI y aPT pueden ser de clase IgG, IgM e IgA, teniendo mayor significacin clnica los dos primeros. La pesquisa de aCL, anti-2GPI y aPT se realiza por ELISA y el AL
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por pruebas de coagulacin. A continuacin se describirn los principales mtodos para pesquisar los aFLs. Los aFLs se pueden detectar mediante ensayos de fase slida (aCL) o por medio de pruebas de coagulacin que detectan la prolongacin de reacciones de la coagulacin en las que los fosfolpidos aninicos actan como catalizadores, y que no pueden ser corregidas con plasma normal (AL). 3.1. Anticuerpos anticardiolipina Los aCL fueron identificados por primera vez en la dcada de los ochenta. En 1990 tres grupos independientes describieron que la unin de los aCL a su antgeno depende de un cofactor plasmtico, que fue identificado como la 2-glicoprotena (2GPI). La dependencia 2GPI permite distinguir dos subpoblaciones de aCL: los dependientes del cofactor, que se asocian a manifestaciones clnicas del SAF y los no dependientes de 2GPI, que se asocian a infecciones. Se ha establecido que los anticuerpos dependientes del 2 GPI no reconocen la molcula cardiolipina, sino que estn dirigidos contra un neoeptopo que aparece en la molcula 2GPI cuando sta se une a la cardolipina. Aproximadamente 20-30% de los pacientes que presentan aCL sufren trombosis; si el anlisis se limita a los pacientes portadores de Lupus eritematoso sistmico (LES) que presentan aCL, el porcentaje aumenta aproximadamente a un 40% En clnica hay dos formas de pesquisar los aFLs: ELISA para aCL y actividad AL, existiendo una concordancia parcial entre ambos mtodos. Inicialmente la deteccin de aCL se realiz por radioinmunoensayo (RIA). Actualmente se deter mina por una tcnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) fase slida. El antgeno que se emplea para la deteccin es la cardiolipina, la que se fija a los pocillos de las microplacas. Es necesario que la 2GPI est presente en el medio mientras se realiza el ensayo. sta se aporta mediante la adicin de suero bovino adulto o fetal. Sin describir los procesos de lavado del ELISA aCL, bsicamente tiene las siguientes etapas: Unin de CL a la microplaca (etapa no requerida en los kits), bloqueo con solucin que contenga suero bovino, incubacin con suero en estudio (adems de calibradores), incubacin con segundo anticuerpo (anti-IgG, -IgM, -IgA humana) conjugado con enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa), incubacin con el sustrato
que corresponda y lectura de la absorbancia en un lector de microplacas (figura 32-3). La concentracin se expresa en unidades internacionales: GPL (IgG), MPL (IgM) e APL (IgA).
Figura 32-3. Estructura bsica de ELISAs para pesquisa de anticuerpos antifosfolpidos.
Los aCL tambin pueden determinarse por citometra de flujo. En este ensayo se emplean partculas de poliestireno recubiertas de fosfolpidos. Estas partculas se incuban con el suero en estudio y los anticuerpos se revelan con un anticuerpo anti-Ig humana marcado con un fluorocromo, que luego es ledo en un citmetro de flujo. Como se indic antes, los anticuerpos aCL constituyen un criterio de laboratorio para el diagnstico del sndrome. Se requiere que el ttulo de los anticuerpos (preferentemente IgG e IgM) sea medio (>40-80 GPL o MPL, segn se trate de IgG o IgM, respectivamente) o alto (>80 GPL o MPL) y que las determinaciones se encuentran positivas en dos ocasiones con una separacin entre ellas de, por lo menos, seis semanas. 3.2. Anticoagulante lpico Inicialmente se observ prolongacin de las pruebas de la coagulacin que no se corregan con la adicin de plasma normal. A comienzo de la dcada de los setenta se introdujo el trmino Anticoagulante lpico (AL) debido a la frecuente asociacin de estos anticoagulantes circulantes con el Lupus eritematoso sistmico. El principio general de las pruebas que permiten pesquisar actividad AL, es la prolongacin del tiempo de coagulacin en pruebas dependientes de fosfolpidos. Los anticuerpos con actividad AL constituyen un grupo heterogneo de anticuerpos (IgG e IgM) cuya accin depende, fundamentalmente, de la
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inhibicin del llamado complejo protrombinasa, constituido por el factor X activado, el factor V activado y los fosfolpidos aninicos en presencia de calcio. A travs de la interferencia con el complejo protrombinasa, el AL inhibe la conversin de la protrombina en trombina, por la accin de dicho complejo, por lo que se prolongan las pruebas de coagulacin. Al igual que los aCL, para el diagnstico de SAF, se requiere la identificacin de AL en, por lo menos, 2 ocasiones con una separacin entre ellas de, al menos, 6 semanas. El AL se identifica mediante pruebas de coagulacin. Para su identificacin de requiere: (a) evidenciar la prolongacin de al menos una prueba de coagulacin dependiente de fosfolpidos, (b) que la prolongacin observada en (a) no se corriga por la adicin de plasma normal y (c) que se confirme la naturaleza dependiente de fosfolpidos del inhibidor con una prueba especfica. a) Prolongacin de prueba de coagulacin dependiente de fosfolpidos. En esta etapa se pueden emplear diversas pruebas como Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (TTPA), Tiempo de Protrombina diluida (TPd), Tiempo de coagulacin con Caoln (KCT), test de Veneno de Vbora de Rusell diluido (dRVVT), tiempo de textarin y tiempo de veneno de Taipan. Se recomienda usar dos pruebas de distinta fase (Ej. va intrnseca: KCT y va extrnseca: TPd ). b) Identificacin del inhibidor. Si alguna de las pruebas descritas en el punto anterior est prolongada, se debe proceder a realizar las pruebas de mezclas. Para ello se repite la misma prueba que daba resultados prolongados y se mezcla el plasma del paciente con plasma normal. Si la adicin del plasma normal no corrige el resultado, indica la presencia de un inhibidor plasmtico. c) Confirmacin. La ausencia de correccin del tiempo de coagulacin en la etapa anterior puede deberse a la presencia de un inhibidor especfico de un factor de la coagulacin o a AL. Para confirmar la presencia de AL el plasma en estudio se mezcla con fosfolpidos procedentes de lisado plaquetario o sintticos, en exceso. Luego se repite la prueba de coagulacin que se present prolongada. La adicin de fosfolpidos debe corregir la
alteracin de la prueba de coagulacin, si el plasma tiene AL. Varios estudios han mostrado que el AL es ms especfico para SAF que los aCL. 3.3. Otras pruebas de laboratorio a) Anticuerpos anti-2GPI La 2GPI es la principal protena blanco de los aFLs clnicamente importantes. Es una glicoprotena de aproximadamente 50 kDa, que presenta 5 dominios. Estudios que han utilizado 2GPI como antgeno, particularmente cuando est unidas a placas de poliestireno oxidadas, han demostrado que el ensayo es ms especfico que aCL para la deteccin de anticuerpos presentes en pacientes con SAF. Brevemente; el suero en estudio y controles se incuban en las placas irradiadas cubiertas con 2GPI. Despus de lavar la placa se agrega e incuba el segundo anticuerpo anti-IgG (-IgM, -IgA) conjugado con una enzima, generalmente fosfatasa alcalina. Finalmente, despus de lavar la microplaca se incuba con el sustrato adecuado, en el caso de la enzima mencionada se utiliza paranitrofenilfosfato de sodio (PNPP) (figura 32-3). Luego, en un lector de microplacas, se lee la absorbancia que es pr opor cional a la concentracin de anticuerpos anti- 2 GPI. Actualmente la concentracin se expresa en unidades SGU (IgG) y SMU (IgM). b) Anticuerpos anti-Protrombina Otra de las protenas blanco descritas para los aFLs es la protrombina. Su importancia clnica no est tan estudiada como ocurre con los ELISA aCL y anti- 2 GPI. Esto se debe, fundamentalmente, al hecho que el mtodo no esta suficientemente estandarizado. Bsicamente, el ELISA tiene la estructura del mtodo descrito para anti-2GPI, pero utilizando protrombina como protena que se une a la microplaca en lugar de 2GPI (figura 32-3). No est suficientemente claro si la positividad de las diferentes pruebas de laboratorio se relaciona con la ocurr encia de eventos trombticos. Sin embargo, se han propuesto como factores de riesgo de trombosis los siguientes hallazgos: (a) pesquisar AL, (b) detectar aCL IgG de ttulo alto y dependiente
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de 2GPI, (c) la coexistencia de aCL y AL y (d) que los aFLs se mantengan en el tiempo. LECTURAS SUGERIDAS Trombofilias hereditarias Amiral, J., Grosley, M., Boyer-Neumann, C., Marfaing-Koka, A., Peynaud-Debayle, E., Wolf, M., Meyer, D. New direct assay of free protein S antigen using distinct monoclonal antibodies specific for the free for m. Blood Coag Fibrinolysis; 5: 179-186, 1994. Bertina, R.M., Koeleman, B.P.C., Koster, T., Rosendaal, F.R., Dirven, R.J., de Ronde, H., van der Velden, P.A., Reitsma, P.H. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature; 369: 64-67,1994. De Stefano, V., Rossi, E., Paciaroni, K., Leone, G. Screening for inherited thrombophila: indications and therapeutic implications. Haematologica; 87: 1095-1108, 2002. Iglesias Varela, M.L., Adamczuk, Y.P., Forastiero, R.R., Martinuzzo, M.E., Cerrato, G.S., Pombo, P., Carreras, L.O. Major and potential prothrombotic genotypes in a cohort of patients with venous thromboembolism. Thromb Res; 104: 317-324, 2001. Kordich, L., Blanco, A., Cerrato, G., Quintana, I., Vazquez, A., Vizcargnaga, M.I. (eds.), Fundamentos para el manejo prctico en el laboratorio de hemostasia. Editorial Grupo CAHT, Argentina 2003. Poort, S.W., Rosendaal, F.R., Reitsma, P.H., Bertina, R.M. A common genetic variation in the 3-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood; 88: 3698-3703, 1996. Quintana, I., Freeman, D., Galarza, C., Mura, A., Spence, J.D., Kordich, L. Validation of an enzyme immunoassay for the determination of total homocysteine in plasma. Blood Coag Fibrinolysis; 11: 235-238, 2000. Ueland, P.M., Refsum, H., Stabler, S., Malinow, M.R., Andersson, A., Allen, R.H. Total homocysteine in plasma or serum: Methods and clinical applications. Clin Chem; 39: 17641779, 1993.
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777
778
NDICE ALFABTICO DE MATERIAS A

Acenocumarol 637 cido flico 170 gammacarboxiglutmico 498 tranexmico 571 Aclorhidria 167 Actividad cofactor ristocetina (FvW CoRis) 754 Adenopata 336, 339 Aglutinacin de las plaquetas inducidas por ristocetina (APIR) 755 Agregacin plaquetaria 761 Alfa talasemias 201 Alotrasplante 407 Alteraciones citogenticas 720 de la quimiotaxis 289 Amiloidosis 382 Anemia aplstica (AA) 115 de Blackfan Diamond 129 de enfermedad crnica 151 de Fanconi 126 ferropriva 141 hemoltica 175 extra corpuscular 213 autoinmune 221 por aglutininas fras 223 intra corpuscular 181 - Enzimopatas 188 - Globinopatas 194 - Membranopatas 181 megaloblstica 161 Clasificacin 111 - hipocromas 111 - normocticas 111 - macrocticas 111 Anillos de Cabot 163 Anticoagulante lpico 774 Anticoagulantes orales 635 Antifibrinolticos 571 Aplasia medular 115 Aspirina 628 Antitrombina-III 507 Autotrasplante 407
B
Betatalasemia 197 Binet e International 336 Biopsia de mdula sea 655
C
Clulas de Langerhans 445 de Reed Sternberg 340 troncales 9, 406, 418 Citometra de flujo 732 Citoqumica 718 Coagulacin intravascular diseminada 586 Crioprecipitado 569, 577 Crisis blstica 324 Cuerpos de Heinz 193 de Howell-Jolly 163
D
Deficiencia de ATIII 603 de G6PD 191 de protena C 604 de vitamina B12 165 de piruvatoquinasa 189 de factor VIII 565 Dmero D 591 Disgranulopoyesis 393 Dismegacariocitopoyesis 393 Displasia eritroctica 393
E
Enfermedad de Hodgkin 340 de injerto contra husped (EICH) 410 de von Willebrand 571 de Waldenstrm 382 granulomatosa crnica 290 residual mnima 726 Eritropoyetina 60
779
Eritropoyesis ineficaz 163 Esferocitosis hereditaria 182 Esplenectoma 524
F
Factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) 54 estimulador de colonias de granulocitos (GM-CSF) 54 intrnseco (FI) 163 tisular (FT) 501 von Willebrand (FVW) 502, 753 VIII coagulante 565, 754 IX 565 Fagocitosis 260 Ferremia 143 Ferritina srica 143, 696 Fibringeno 504 Fibrinopptidos A y B 504 Folato srico 698 Fosfatasas alcalinas de los granulocitos (FAG) 326
Hemorragia 238 Hemostasia 460 Heparina 632 Hiperhomocistinemia 620, 773 Histiocitosis 443
I
Inhibidores naturales de la coagulacin 507 Inmunodeficiencia 294 INR International Normalizad Radio 643
J K
Kalicrena 498 Kiningeno de Alto Peso Molecular 498
L
Leucemia aguda (LA) 299 linftica o linfoblstica (LLA) 300 Mieloblstica (LMA) 310 linftica crnica (LLC) 334 mieloide crnica (LMC) 323 Leucocitos defectos cuantitativos 276 deficiencias cualitativas 288 Linfocitosis reactiva 285 Linfoma de Hodgkin 340 no Hodgkin 348, 366
G
Gammapata monoclonal 372 Gen PML promielocytic leukemia 312 Glicoprotena IIb-IIIa 463 Ib-IX 465 Glbulo rojo 82 Granulocitos 258 basfilos 258 eosinfilos 264 neutrfilos 258 Granulopoyesis 58 Grnulos primarios 259 Grnulos secundarios
M
Macrocitosis 163, 667 Macroglobulinemia de Waldenstrm 382 Mdula sea 6, 689 Megaloblastosis 163 Mielograma 655, 680 Mieloma mltiple 376 Mieloperoxidasas 719 Mononucleosis infecciosa 287
H
Haptoglobina 178 Hemartrosis 568 Hematomas 566 Hemofilia A 565 B 565 Hemoglobina 88 Hemoglobinopatas 194 Hemoglobinuria paroxstica nocturna 186 Hemograma 664 Hemlisis extravascular 177 intravascular 178
N
NADPH oxidasa 264 Neutrfilos hiper o polisegmentados 697
780
Neutropenia aloinmune 280 autoinmune 280 cclica 281
O P
PAIgG 756 PCR (reaccin de polimerasa en cadena) 727 Plaquetas 462 Plasma fresco congelado 569 Plasmafresis 382 Plasmina 512 Policitemia vera 325 Productos de degradacin de fibringeno y fibrina (PDF) 512, 590 Protenas de Bence Jones 382 Protoporfirina libre eritrocitaria 143, 693 Prueba de antiglobulina humana directa 218, 710 de Schilling 698 Prpura trombocitopnico autoinmune 521, 522 trombtico (PTT) 528
de protrombina (TP) 746 de sangra 761 de trombinea (TT) 748 Tincin de esterasas 719 de mieloperoxidasa 719 Tinciones citoqumicas 718 Translocacin 9;22 323 15;17 312 Trasplante de progenitores hematopoyticos 405, 417 Trombocitopata 531 Trombocitopenia 516 Trombofilia 601
U
Unidades formadoras de colonias (CFUs) 54
V
Valores normales 659 Vasopresina (DDAVP) 571 Vitamina B12 (VB12) 163 K 499 Volumen corpuscular medio 665
Q
Quimioterapia 306, 318 Quimiotaxis 260
W
Waldenstrm 382 Warfarina 637, 638
R
Remisin 306, 318
X Y Z
Z, protena 510
S
Sideroblastos en anillo 152 Sndrome antifosfolpido 610 hemoltico 176 urmico 588 mielodisplsticos (SMD) 389
T
Tiempo de tromboplastina parcial activa (TTPA) 748
781
Este libro se termin de imprimir en Impresora Gutenberg Talca, en una tirada de 500 ejemplares en Abril de 2005.
782

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HEMATOLOGA

EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA COLECCIN E-BOOK Serie de libros electrnicos

HEMATOLOGA Fisiopatologa y Diagnstico

Ivn Palomo G., Jaime Pereira G., Julia Palma B.

HEMATOLOGA: Fisiopatologa y Diagnstico

EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA Talca - CHILE, 2005

TM. Lic. Marianela Agurto O.

A nuestras queridas familias y a nuestros estimados alumnos

180 181 181

238 238 238

300 300 300 301 301

303 303 304 305 306

310 310 310 311 311 311

340 340 340 341 342 343

345 348 348 348 350 353

366 366 366 366 367

368 369 370 370

372 372 373

396 399 400

406 407 407

434 434 434

443 443 443 443 444 445 445

460 461 462

Captulo 22 HEMOFILIAS, ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND Y OTRAS ALTERACIONES HEREDITARIAS DE LA COAGULACIN

655 656 659

NDICE ALFABTICO DE MATERIAS

Ivn Palomo G. Jaime Pereira G. Julia Palma B.

Figura 1-7. Estadios madurativos de la granulomonopoyesis.

Figura 1-8. Estadios madurativos de la eritropoyesis

Figura 1-11. Etapas en la maduracin de los linfocitos B.

CLULAS TRONCALES EN LA MDULA SEA

que puede formar

seo, cartlago, adiposo, msculo, nervioso, pulmn, estroma hematopoytico,renal

uso de MSC alogeneicas, con fines inmunomodulador es en pacientes no compatibles.

*: revisiones generales sobre el tema: Prockop, 1997, Minguell, 2001

GLBULOS ROJOS Y HEMOGLOBINA

* Corresponde a la deteccin de protenas altamente glicosiladas teidas con PAS.

Tabla 3-2. Molculas de adhesin expresadas por los eritrocitos circulantes

Figura 3-9. Curva de disociacin de oxgeno de Hb y mioglobina a 37C y pH 7,4.

ANEMIA Y SNDROME ANMICO

Tabla 4-4. Clasificacin fisiopatolgica de las anemias

Anemias regenerativas Anemias Hemolticas A. hemolticas intracorpusculares

Membranopatas Hemoglobinopatas Enzimopatas

Autoanticuerpos Aloanticuerpos Traumatismos constantes Microcirculacin alterada Grandes hematomas

Fsicas Qumicas Toxi-infecciosas Parasitarias Anemias por hemorragia aguda

Figura 5-2. Dao a precursores hematopoyticos por toxicidad directa.

Severidad de la AM severa no severa severa severa severa severa severa

Sobrevida (1 ao) 0.64/0.70 0.93/0.91 0.82/0.71 0.71/0.73 (2 a) 0.55/0.80 (2 a) no informada 0.82/0.81 (2 a)

Referencia (ao) 1992 1999 1999 1983 1991 1991 1999

Figura 5-5. Interaccin de protena BRCA en la Anemia de Fanconi.

ALTERACIONES DEL METABOLISMO DEL HIERRO Y DE LA SNTESIS DEL GRUPO HEM

11,0 11,5 12,0 12,0 11,0 13,0

ALA, Orina coproporfirina PBG,ALA Uroporfirina I Orina Orina

Indeterminada Ferroquelatasa Protoporfirina

Figura 7-1. Estructura de la vitamina B12

Requerimientos diarios Depsitos corporales Agotamiento depsitos Absorcin Patologa

Figura 7-2. Metabolismo de la vitamina B12

1 Aumenta en Leucemia mieloide crnica

Figura 7-3. Estructura del cido flico

Figura 7-4. Metabolismo del cido flico

Figura 8-1. Esquema representativo de la hemlisis extravascular.

Figura 8-2. Esquema representativo de la hemlisis intravascular.

III III III III II