ESPECIALIDAD LABORATORIO CLNICO Y ANATOMA PATOLGICA ASIGNATURA Histoqumica Bsica DOCENTE Lic. T.M. Walter Lpez Lpez ALUMNAS Zary Charmely Ziga Armendriz Erika Lorena Quito Velarde SEMESTRE III CUSCO PER 2011 COLORACIONES ESPECIALES COLORACIONES ESPECIALES PRESENTACION El presente trabajo de investigacin contiene los principales mtodos de Coloraciones Especiales para fibras reticulares, elsticas y colgenas. Todos estos componentes tienen estructuras que solo se podrn diferenciar con INTRODUCCION El colgeno es una protena y es el componente principal del tejido conectivo fibroso (tendones), tambin se encuentra en la piel, cartlago y ligamentos; es inelstico pero tiene gran resistencia a la traccin. Las fibras elsticas son ms delgadas que las colgenas y carecen de estriaciones. El componente principal de las fibras elsticas es una protena amorfa llamada elastina, rodeada de micro filamentos de una glicoprotena llamada fibrilina. Las fibras reticulares estn constituidas fundamentalmente por COLORACIONES ESPECIALES Colorean los componentes del tejido colectivamente a travs del uso de colorantes y por reacciones qumicas semiespecficas (hongos, bacterias, bandas musculares, colgeno, detalles intra e intercelulares). Las ms usadas son: W Teido directo: El tejido es empapado y penetrado por el colorante y no cambia la estructura del tejido. W Teido indirecto: La reaccin es indirecta y depende del uso de intermediario de un mordiente, usualmente un metal pesado. W Teido fsico: El colorante se sita fsicamente (solubiliza) en los elementos de la clula. W Teido qumico: El colorante se combina con la sustancia celular afn y forma una substancia nueva y la reaccin es generalmente irreversible. W Mordientes: Substancia que ayuda a ligar los colorantes al tejido para asegurar una accin o reaccin especifica. FIBRAS COLAGENAS El colgeno es una molcula proteica que forma fibras, secretadas por las clulas del tejido conjuntivo como los fibroblastos, son flexibles, pero ofrecen gran resistencia a la traccin. En el tejido seo adulto y en la crnea se disponen en lminas delgadas y superpuestas, paralelas entre s, mientras las fibras forman ngulo recto con las de las capas adyacentes. Las clulas interactan con la matriz extracelular tanto mecnica como qumicamente, lo que produce notables efectos sobre la arquitectura tisular. El tipo ms comn se denomina colgeno tipo I, estas forman haces de fibras de 0,5 a 20 m de Coloracin Tricrmico de Masson Tincin especial que permite visualizar las fibras de colgeno tipo I que forman fibras gruesas o haces. Fundamento: Se tien las secciones con un tinte cido tal como escarlata de Biebrich. Todos los elementos del tejido tales como citoplasma, msculo y colgeno se unirn a los tintes cidos, entonces se tratan con cido fosfotngstico y/o fosfomolbdico permiten que la escarlata de Biebrich difunda del colgeno pero no del citoplasma. Estos cidos tienen numerosos grupos cidos que probablemente acten como medio de unin entre el colgeno y el azul de la anilina (probablemente el pH de la solucin fosfotngstico/fosfomolbdico tambin aumente la coloracin y ayude al colgeno en la difusin o el retiro de los colorantes). Reactivos Solucin de hematoxilina frrica de Weigert. Solucin de escarlata de Biebrich - fucsina cida: - 90,0 ml de escarlata de Biebrich al 1% en agua destilada. - 9,0 ml de fucsina cida al 1% en solucin acuosa. - 1,0 ml de cido actico glacial. Solucin acuosa de cido fosfomolbdico (utilizar cido fosfotngstico en la misma proporcin, si se va a teir con verde luz): - 5,0 g de cido fosfomolbdico. - 200,0 ml de agua destilada. Solucin de azul de anilina: - 2,5 g de azul de anilina. - 2,0 ml de cido actico glacial. - 98,0 ml de agua destilada. Solucin de verde luz al 2% (alternativa al azul): - 2,0 g de verde luz SF amarillento. - 99,0 ml de agua destilada. - 1,0 ml de cido actico glacial. Solucin diferenciadora: solucin acuosa de cido actico glacial al 1%. Procedimiento Desparafinar e hidratar. En material fijado en soluciones de formaldehdo o alcohlicas se recomienda hacer un mordentaje previo con lquido de Bouin durante 1 hora a 56-60 C o toda la noche a temperatura ambiente. Enfriar y lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo. Teir con hematoxilina frrica por 10 minutos. Lavar en agua corriente por 10 minutos. Lavar en agua destilada. Teir con la solucin de escarlata-fucsina cida por 2-5 minutos. Lavar en agua destilada. Tratar con la solucin de cido fosfomolbdico-fosfotngstico por 10-15 minutos si se va a colorear con la solucin de azul de anilina, o en la solucin acuosa de cido fosfotngstico al 5% por 15 minutos si se desea teir con verde luz. Teir con solucin de azul de anilina 15 minutos o con solucin de verde luz por 5 minutos. Lavar en agua destilada. Anlisis de resultados W Fibras de colgeno Azul. W Estructuras oxidadas + citoplasma Rojo. Se teirn de rojo la queratina, los glbulos rojos y el tejido muscular. W Ncleo celular Negro, marrn. Tricrmico de Gomori en un paso Mtodo idneo para teir fibrina, tejido muscular y citoplasmas. Sin embargo, por su pH cido (2.5 y 2.7) se presenta como una tincin incompleta y difusa del componente fibrilar ms fino (membrana basal y finas fibras reticulares). Fundamento: Esta tcnica combina un colorante plasmtico y un colorante de fibras conectivas (verde luz/azul de anilina) en una solucin de cido fosfotngstico y cido actico glacial. El tratamiento previo de las secciones con solucin de Bouin caliente intensifica la tincin. El cido fosfotngstico favorece la coloracin roja de msculo y citoplasmas, las Reactivos Solucin de Bouin: tras la fijacin, se debe lavar la muestra en abundante alcohol de 70 hasta la decoloracin de la misma para asegurar la total eliminacin del cido pcrico. Solucin tricrmica: - 0,6 g de cromotropo 2R. - 0,3 g de verde luz - 1,0 ml de cido actico glacial. - 100,0 ml de agua destilada. - 0,8 g de cido fosfotngstico. Solucin verde luz (el verde luz puede ser sustituido por el azul de anilina): - 5,0 g de verde luz. actico al 0,5%. Solucin diaria de hematoxilina frrica de Weigert: Solucin matriz A: - 1,0 g de hematoxilina de Weigert en - -100 ,0 ml de etanol al 95%. Solucin matriz B: - 4,0 g de cloruro frrico al 29%. - 95 ml de agua destilada. - 1,0 ml de cido clorhdrico concentrado. Se deben utilizar a partes iguales cada una de las soluciones matrices. La solucin diaria de la hematoxilina de Weigert puede reutilizarse Procedimiento Desparafinar e hidratar. Realizar mordentaje en lquido de Bouin durante 1 hora a 56 C o 24 horas a T ambiente. Lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo. Teir con hematoxilina de Weigert por 10-13 minutos. Realizar un lavado prolongado con agua corriente. Teir con la solucin tricrmica por 15 minutos. Diferenciar en la solucin de cido actico al 0,5% por 15 segundos (se puede utilizar tambin cido actico al 1%) Si las secciones son muy rojas, se diferenciar con una solucin de cido actico al 1%, a la cual se le agregarn 0,7 gr de cido fosfotngstico. Lavar en agua destilada. Teir con la solucin de verde luz por 20 o 30 segundos. Deshidratar con alcoholes, aclarar con xileno y montar. Anlisis de resultados W Fibras musculares, fibrina y citoplasma Rojo. W Colgeno, cartlago, mucinas y membranas basales Verde. W Ncleos Azul negruzco. FIBRAS RETICULARES Estn constituidas fundamentalmente por colgeno de tipo III. Son ms delgadas 0,1 a 1,5 m, ms glicosiladas. No se colorean en los cortes de H-E. Se tien al MO con tcnicas argnticas en donde aparecen en color negro, mientras que las colgenas se tien de marrn. Son sintetizada por las clulas del msculo liso, fibroblastos, gla y su funcin es la de sostn de los rganos expandibles. Forman el armazn Mtodo de Manuel Solucin de nitrato de uranio al 1%. - 1,0 g de nitrato de uranilo. - 100 ml de agua destilada. Solucin de plata amoniacal. - 100,0 g de nitrato de plata. - 1000,0 ml de agua destilada. Separar 70 ml de la solucin de nitrato de plata y a los 930 ml agregar 60,0 ml de hidrxido de amonio al 28%; luego agregar lentamente los 70 ml restantes hasta que la solucin aparezca ligeramente turbia (puede ser conservada en refrigerador por varios meses). 40%. - 99 ml de agua destilada. Solucin de tiohiposulfato de sodio al 5%. - 5,0 g de tiohiposulfato de sodio. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin de rojo ncleo resistente (Kernechtrot). - 0,1 g de rojo ncleo resistente. - 100,0 ml de solucin de sulfato de aluminio al 5%. Llevar a hervor lento, enfriar, Procedimiento Desparafinar e hidratar. Sensibilizar con la solucin de nitrato de uranio por 2 minutos. Sumergir rpidamente en agua corriente. Impregnar con la solucin de plata amoniacal por 1 minuto. Lavar con agua corriente, sumergir 2 3 veces rpidamente hasta que el precipitado blanco desaparezca del agua. Revelar con la solucin de formalina por 1 minuto. Lavar con agua corriente. Matizar con la solucin de cloruro de oro por 1 minuto. Lavar con agua corriente. Reducir en la solucin de tiohiposulfato de sodio por 1 minuto. Lavar con agua corriente. Contrastar con la solucin de rojo ncleo resistente por 5 minutos. Enjuagar con agua destilada (3 veces). Deshidratar y aclarar con de alcohol etlico al 95%, alcohol etlico absoluto y xileno (2 cambios cada uno por 2 minutos cada uno). Anlisis de resultados WFibras reticulares Negro. WNcleos y fondo Rojo. Mtodo de Snook Solucin de permanganato de potasio al 0.25%. - 0,25 g de permanganato de potasio. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin de acido oxlico al 5%. - 5,0 g de acido oxlico. -100,0 ml de agua destilada. Solucin de nitrato de uranio al 1%. - 1,0 g de nitrato de uranilo. - 100 ml de agua destilada. Solucin de nitrato de plata al 5%. - 5,0 g de nitrato de plata. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin de hidrxido de sodio al 10%. - 10,0 g de hidrxido de sodio. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin de plata amoniacal de Snook. amonio concentrado, gota a gota hasta que la solucin se aclare y se vean unos pocos grnulos en el fondo, filtrar y usar inmediatamente. Solucin de formalina al 1%. - 1,0 ml de formaldehido al 40%. - 99 ml de agua destilada. Solucin de cloruro de oro al 1% (solucin matriz). - 1 ampolla de 1,0 ml de cloruro de oro. - 99,0 ml de agua destilada. Solucin de tiohiposulfato de sodio al 5%. - 5,0 g de tiohiposulfato de sodio. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin de rojo ncleo resistente (Kernechtrot). - 0,1 g de rojo ncleo Procedimiento Desparafinar e hidratar. Oxidar con la solucin de permanganato de potasio por 5 minutos. Lavar con agua corriente. Colocar en la solucin de acido oxlico hasta que las secciones se aclaren. Lavar con agua corriente y luego colocar en agua destilada. Colocar en la solucin mordiente de nitrato de uranio por 5 minutos. Lavar con agua corriente. Colocar en la solucin de plata amoniacal por 1 minuto. Sumergir en agua corriente. Colocar en la solucin de formalina al 1% por 1 minuto. Lavar con agua corriente. Colocar en la solucin con cloruro de oro por 1 minuto, hasta que las secciones aparezcan de un color negro grisceo. Lavar con agua corriente. Colocar en la solucin de tiohiposulfato de sodio por 30 segundos a 1 minuto. Lavar con agua corriente. Contrastar con la solucin de rojo ncleo resistente por 54 minutos. Enjuagar con agua destilada. Deshidratar y aclarar con alcohol etlico al 95%, alcohol etlico absoluto y xileno (2 cambios cada uno por 2 minutos cada uno). Anlisis de resultados WFibras reticulares Gris a negro. WFondo Rosado. Mtodo de Wilder Solucin de acido fosfomolibdico al 10%. Solucin de nitrato de uranio al 1%. - 1,0 g de nitrato de uranilo. - 100 ml de agua destilada. Solucin de nitrato de plata al 10.2%. - 10.2 g de nitrato de plata. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin de hidrxido de sodio al 3.1%. - 3.1 g de hidrxido de sodio. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin de plata amoniacal. - 5,0 ml de solucin de nitrato de plata. Solucin reductora. - 50,0 ml de agua destilada. - 0,5 ml de formalina neutra al 40%. - 1,5 ml de nitrato de uranio al 1%. Solucin de cloruro de oro al 2%. - 20,0 ml de solucin matriz de cloruro de oro al 1%. - 80,0 ml de agua destilada. Solucin de tiohiposulfato de sodio al 5%. - 5,0 g de tiohiposulfato de sodio. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin de rojo ncleo resistente (Kernechtrot). - 0,1 g de rojo ncleo resistente. - 100,0 ml de solucin de sulfato de aluminio al 5%. Procedimiento Desparafinar e hidratar. Oxidar con la solucin de acido fosfomolibdico por 1 minuto. Enjuagar con agua corriente hasta que todos los trazos de la solucin amarilla desaparezca completamente. Colocar en la solucin de nitrato de uranio por 1 minuto. Enjuagar con agua destilada de 10 a 20 minutos. Colocar en la solucin de plata amoniacal por 1 minuto. Sumergir rpidamente en alcohol al 95%. Colocar en la solucin reductora por 1 minuto. Lavar con agua destilada. Matizar con la solucin de cloruro de oro por 1 minuto. Lavar con agua destilada. Colocar en la solucin de tiohiposulfato de sodio por 1 minuto. Lavar con agua corriente. Contrastar con la solucin de rojo ncleo resistente por 5 minutos. Enjuagar bien con agua destilada. Deshidratar y aclarar con alcohol etlico al 95%, alcohol etlico absoluto y xileno (2 cambios cada uno por 2 minutos cada uno). Montar con un medio resinoso. Anlisis de resultados WFibras reticulares Negro. WColgeno Rosa. WOtros elementos Rojo. FIBRAS ELSTICAS Las fibras elsticas se estiran fcilmente y recuperan su longitud original cuando la fuerza deformante ha desaparecido. El principal componente de las fibras elsticas es la elastina, material proteico muy insoluble, las microfibrillas tienen como principal componente una glicoprotena llamada fibrilina, rica en aminocidos hidroflicos y que contiene residuos de cistina los cuales pueden formar puente Disulfuro (estabilizando la estructura de las microfibrillas). En las fibras elsticas juegan un rol estructural, formando una especie de vaina alrededor de la elastina, permitiendo as la formacin de estructuras fibrilares elsticas. Coloracin de Verhoeff Solucin de hematoxilina alcohlica al 10%. - 10,0 g de hematoxilina. - 100,0 ml de alcohol absoluto. Solucin de cloruro frrico al 10%. - 10,0 g de cloruro frrico. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin de yodo de Verhoeff. - 2,0 g de yodo. - 4,0 g de yoduro de potasio. - 100,0 ml de agua destilada. Solucin colorante diaria de fibras elsticas de Verhoeff. - 25,0 ml de hematoxilina 10%. Mezclar bien y luego agregar 25,0 ml de solucin de yodo de Verhoeff. Solucin diferenciante de cloruro frrico al 2%. - 20,0 ml de cloruro frrico al 10%. - 80,0 ml de agua destilada. Solucin de Van Gieson. - 5,0 ml de solucin de fucsina acida al 1%. - 95,0 ml de solucin saturada de cido pcrico. Solucin de tiohiposulfato de sodio al 5%. - 5,0 g de tiohiposulfato de sodio. Procedimiento Desparafinar e hidratar. Teir con la solucin colorante diaria de fibras elsticas por 15 minutos. Lavar con agua tibia corriente por 20 minutos. Colocar en agua destilada. Diferenciar con la solucin de cloruro frrico al 2%, observar microscpicamente (las fibras elsticas aparecen bien definidas de color negro y el fondo es gris). Colocar en la solucin de tiohiposulfato de sodio por 1 minuto. Lavar con agua durante 5 minutos. Colocar en agua destilada. Contrastar con la solucin de Van Gieson por 1 minuto. Deshidratar y aclarar con alcohol etlico al 95%, alcohol etlico absoluto y xileno (2 veces cada uno). Montar con un medio resinoso. Anlisis de resultados W Fibras elsticas Negro. W Ncleos Negro. W Colgeno Rojo. W Otras estructuras Amarillo. PATOLOGIAS La patologa de las fibras elsticas tiene caractersticas nicas en la piel. A veces es parte de un proceso complejo que afecta otras estructuras celulares y extracelulares. W Elastosis solar: Masas amorfas, fibras enruladas, engrosadas, hiperplasia, relacin inversa con el colgeno, fibrocitos activados. La acumulacin de fibras elsticas anormales en la elastosis solar se debe ms a una disminucin en la degradacin que a un Engrosamiento cutneo. Aspecto creo. Arrugas. WMilium coloide: Ppulas traslcidas amarillentas, mltiples. 1-3 mm. Manos-cuello-cara. WLiquen Esclero Atrfico: Fundamentalmente raza blanca. Incidencia familiar. Ppulas y placas blanquecinas. Epitelio como papel de celofn, atrofia. Erosiones y prpura. Liquenificacin, hiperqueratosis y escamas. 20% lesiones extra genitales (tronco y brazos). Inflamatoria. Ppula o placa blanquecina. Atrofia. Hiperqueratosis folicular. La enfermedad vascular del colgeno ocurre cuando los problemas con el sistema inmunitario afectan el colgeno. W Espondilitis anquilosante: Es una enfermedad crnica que causa inflamacin de las articulaciones entre las vrtebras de la columna y las articulaciones entre la columna y la pelvis. Esta enfermedad finalmente hace que las vrtebras afectadas se fusionen. W Esclerodermia: Es una enfermedad generalizada del tejido conjuntivo que involucra cambios en la piel, los vasos W Dermatomiositis: Es un tipo de miopata inflamatoria, una enfermedad muscular caracterizada por inflamacin y erupcin en la piel. W Escorbuto: Avitaminosis causada por un dficit de vitamina C (cido ascrbico) en la dieta que causa una disminucin en la sntesis de hidroxiprolina y sta proporciona tomos adicionales capaces de formar puentes de hidrgeno que estabilizan la triple hlice de colgeno. CONCLUSIONES En el Laboratorio de Anatoma Patolgica todos los pasos a seguir son fundamentales para un buen diagnstico del espcimen y una parte importante es la coloracin. Debemos tener en cuenta que tipo de muestra tenemos y que coloracin seria la mas adecuada. En el momento de la coloracin debemos tener cautela con los tiempos y control de BIBLIOGRAFA Diccionario Medico Teide Segunda Edicin, 1992, Barcelona. Manual de Mtodos Histotecnolgicos, 1992, Estados Unidos. Wikipedia.com Medline Plus.com
Caracterización Macroscópica y Microscópica de Fibras de Cabello de La Región de La Cabeza en Individuos de La Zona Del Pacífico y Del Atlántico de Nicaragua