Facultad de Ciencias Bioqumicas y Farmacuticas.

Universidad Nacional de Rosario

::.Departamento de Ciencias Fisiolgicas::.

::.fisiologa::. farmacia :.:.::

.::guas de laboratorio:: 2010::.

.::..:.Autores Dra. C Carnovale Dr. F Crocenzi Dr. C Favre Dra. C Larocca Dr. J Monti Dr. M Roma Dr. E Snchez Pozzi Dr. L Veggi

Generalidades para el desarrollo de los trabajos de Laboratorio: Manejo de animales de experimentacin Introduccin El objetivo es poner en contacto al alumno con el animal de experimentacin que se utilizar durante el curso. La rata Ciclo de vida Pesos Peso de nacimiento: 5-6 g Peso de macho adulto: 300-400 g Peso de hembra adulta: 250-300 g Actividad Sexual Pubertad en la hembra: 41 das (35-46) (80 g) Edad de cruzamiento, hembra: 100 das (200 g) Edad de cruzamiento, machos: 100 das (300 g) Ciclo sexual: 5 das Perodo de gestacin: 20-22 das Condiciones Ambientales Temperatura: 22-27C Humedad: 45-55% Horas de Luz: 12 horas Frecuencia Cardaca Adulto: 328/min (261-600) Recin nacido: 161/min (81-241) Frecuencia Respiratoria Adulto: 94/min (75-115) Identificacin Se basa en la ejecucin de orificios y cortes en cuas en la zona anterior, exterior y posterior de las orejas. Manipulacin de la rata Es difcil fijar normas sobre cmo manipular una rata por cuanto el procedimiento cambiar de acuerdo a lo que se realice con el animal (pesarlo, inyectarlo, identificarlo, etc.) El alumno, sin embargo, al tomar la rata deber cuidar que el animal no pueda morderlo y hacerle tomar una posicin que facilite el trabajo. Administracin de sustancias en animales no anestesiados La administracin de sustancias en solucin es uno de los sistemas mas usados, tanto en la investigacin de fenmenos fisiolgicos como en el tratamiento de enfermedades. En animales anestesiados, la va ms frecuente de administracin de sustancias es la intravenosa. Las siguientes vas son las ms utilizadas: 1

a) Inyeccin subcutnea Se realiza preferentemente bajo la piel del abdomen o del dorso con aguja de dimetro fino. Inyectada la sustancia, retire la aguja y masajee suavemente el sitio de la inyeccin, para prevenir el escape del fluido inyectado. b) Inyeccin intramuscular Se realiza con agujas de caractersticas similares a la anterior, de preferencia en las masas musculares de las extremidades superiores o inferiores. c) Inyeccin intraperitoneal Se realiza usando una aguja de dimetro fino y corta. El sitio de predileccin para introducir la aguja es el cuadrante inferior izquierdo, con la aguja levemente inclinada, la misma se sentir flotar libremente en la cavidad peritoneal, de no ser as, no inyecte lquido, porque este caer en el interior de una vscera o en un msculo de la pared abdominal. Despus de la va intravenosa, esta es la va ms rpida, por la gran superficie de absorcin del lecho peritoneal. d) Administracin oral La administracin de lquidos por va oral se realiza con una sonda, conectada a una jeringa. Es necesario entibiar el lquido antes de inyectarlo. Con el fin de facilitar el paso de la sonda por la faringe y la probable mordedura de ella es necesario abrir la boca con una pinza de algodn. En caso de que ella entre forzada, o solo 2 o 4 cm, es probable que se halla introducido en la laringe, por ello no inyecte la sustancia y retire la sonda para ensayar de nuevo. Anestesia El tipo de anestesia se elegir de acuerdo a la duracin del experimento. Anestesia de corta duracin Eter etlico: En una campana de vidrio se coloca un algodn empapado con ter, para saturar el aire con este anestsico. Se introduce la rata y se cubre la campana. Cuando la rata cae, se retira y se mantiene la anestesia con un algodn mojado en ter, colocado cerca de los orificios nasales. La anestesia por ter puede variar en su profundidad. Con una anestesia superficial, la respiracin es predominantemente torcica y rpida, cuando se profundiza, la respiracin es ms pausada y abdominal y lleva al paro respiratorio. En esta ltima circunstancia, retire el algodn con ter y proceda a realizar de inmediato respiracin artificial, insuflando aire con una pipeta por la boca, comprimiendo al mismo tiempo el abdomen con una mano. Una vez inflados los

pulmones cese de insuflar, dejando escapar el aire alveolar, puede ayudar la compresin del trax con la mano. Anestesia de larga duracin Pentobarbital: La dosis utilizada es de 50 mg por kg. de peso, por va intraperitoneal. Esta anestesia da mejores valores de presin arterial, es menos txica, por lo que se puede recuperar el animal. De buen nivel anestsico, se mantiene solo de 1 1/2 a 2 horas, por lo que frecuentemente es necesario administrar dosis de mantenimiento. Tiopental: La dosis utilizada es de 75 mg por kg. de peso, por va intraperitoneal. Ketamina + xilasina: La dosis utilizada es de 100 mg ketamina-3 mg xilasina por kg de peso, por va intraperitoneal. Obtencin de sangre de la rata Es posible obtener pequeas muestras de sangre de rata no anestesiada, cortando la punta de la cola. Esto tambin puede hacerse en ratas anestesiadas, siendo el ter la anestesia mas indicada para estos casos, por cuanto produce vasodilatacin caudal. Para muestras de sangre de 0,5 o mas ml, es necesario canular un vaso, de preferencia una arteria, heparinizando la rata a travs de la cnula ( 1 mg de heparina por 100 g de peso corporal, por va i.v.). Con este sistema se pueden obtener 2 o mas muestras de sangre. Si se trata de una muestra nica de gran volumen, 2 ml o mas, se puede obtener por puncin de arteria aorta abdominal con una aguja de gran calibre (G21 a G18), aspirando rpidamente. Para evitar la coagulacin, se humedece la jeringa con heparina. Cmo matar a una rata? Por decapitacin. Si se est realizando un experimento en ratas anestesiadas, el animal se puede matar producindole un neumotrax bilateral, o bien inyectndole por va intravenosa 1 cc de una solucin de cloruro de potasio al 20 %. Procedimientos Quirrgicos Diseccin del paquete vasculo-nervioso de las extremidades posteriores y canulacin de la vena femoral. Este procedimiento est indicado cuando debe administrarse alguna sustancia por va sangunea. Procedimiento Al animal anestesiado, depilarlo en la regin inguinal. Con una pinza de diente de ratn, levante la piel de esta regin y con una tijera haga un corte en ojal que permita ver totalmente el paquete vasculo-nervioso formado por el nervio citico, la arteria femoral y la vena femoral. Con ayuda de una pinza de algodn pase dos hilos por debajo de la vena. Con uno de ellos ligar lo ms distal posible, con el fin de detener la circulacin.

Apoyndose en la sonda acanalada, introducir una aguja de cono verde en la vena, retirarla y colocar un catter P-40 heparinizado, unido a una jeringa con solucin fisiolgica. Mantener el catter lleno con solucin fisiolgica, para que la sangre no lo obture.

1. Obtencin de muestras para todos los Trabajos Prcticos Objetivo El objetivo del presente prctico es obtener, para conservar hasta su uso, todas las muestras (orina y plasma) necesarias para la realizacin de los TP propuestos a continuacin. Material y Mtodos Ratas Wistar. Material de diseccin. Balanza para animales. Balanza analtica. Centrfugas. Lmparas de calentamiento. Jeringas: 20 ml, 10 ml (vidrio para puncin cardaca), 5 ml, 1 ml. Micropipetas automticas. Algodn, hilo de ciruga. Tubos de centrfuga, Eppendorf, capilares, tubos de hemlisis. Drogas: Anestsicos Ketamina 50 mg/ml, Xilasina 2 % Glucosa 0.3 g/ml en solucin fisiolgica Insulina 0.5 U/ml en solucin fisiolgica Azul de Evans 5 g/l en solucin fisiolgica Heparina Solucin Fisiolgica (Cloruro de sodio 9 g/l)

Protocolo Experimental Las ratas previamente colocadas en las jaulas metablicas desde el da anterior, sern pesadas para determinar las cantidades de anestsico (ketamina + xilasina, 100 mg + 3 mg/Kg de peso corporal) y dems drogas administradas segn el peso corporal. En este momento se recoger tambin la orina del contenedor para medir el volumen de orina recolectado y se congelar una alcuota de la misma en tubo eppendorf. Tambin se determinar el volumen de agua ingerido. Una vez anestesiados (administracin intraperitoneal de la dosis de anestsico correspondiente), los animales sern inmovilizados en tablas de ciruga y se realizar incisin en la cola para obtener sangre venosa. La muestra de sangre (200-400 ul) ser recogida en tubo eppendorf heparinizado. Con una gota de la misma se proceder a cargar capilares para determinacin de hematocrito. Los capilares sern centrifugados a 3000 rpm 5 minutos. El resto de la sangre ser centrifugada a la misma velocidad para separar el plasma y congelarlo (muestra basal). Luego de la obtencin de muestra basal los animales recibirn, segn los casos, una solucin intraperitoneal de glucosa (1,5 g/Kg peso rata), luego de 5

lo cual (tiempo 0), se obtendrn muestras de sangre venosa de la cola (150250 ul) a los 10, 30, 45 y 60 minutos. Las mismas sern colocadas en tubos eppendorf heparinizados que sern luego centrifugados para separar y congelar el plasma. Algunos grupos de animales recibirn insulina (0,5-1 U/Kg peso rata) en inyeccin i.p. a los 10 minutos de haber sido administrada la glucosa. Luego se efectuar una incisin a nivel inguinal a fin de localizar la vena femoral. Se pasar por debajo de la misma una sonda acanalada que servir como superficie de apoyo para efectuar la inyeccin. Se aislar el vaso y se inyectarn 0,2 ml de la solucin de Azul de Evans de concentracin de 5 g/l. efectundose compresin sobre el orificio para evitar la prdida de sangre. Luego de 5-10 minutos despus de la inyeccin se extraer sangre (5-8 ml) por puncin cardiaca con aguja y jeringa heparinizadas. La sangre ser recolectada en tubos de centrifugacin y centrifugada para la separacin y congelado del plasma.

2. Determinacin del volumen de lquidos corporales - Medicin del Volumen Sanguneo Introduccin: La medicin del volumen sanguneo es un complemento importante del recuento globular. Hay casos en que un recuento normal puede ser resultado de la prdida de lquido en un paciente anmico o tambin que el recuento de eritrocitos sea bajo por una retencin de agua. En estos casos la medicin del volumen total de sangre permitir comprobar la verdadera condicin del animal. La distribucin del agua en los distintos compartimientos ha sido fundamentalmente calculada por tcnicas de dilucin. Dichas tcnicas se efectan mediante la inyeccin de sustancias que se suponen estn distribuidas uniformemente en el compartimiento cuyo volumen se desea calcular. Una vez alcanzado el equilibrio en su espacio de distribucin conociendo la cantidad total inyectada y determinando la concentracin de la sustancia en dicho espacio, podremos calcular el volumen aparente de distribucin. La sustancia a ser administrada en el organismo deber reunir los siguientes requisitos: 1. 2. 3. 4. No ser txica Debe distribuirse uniformemente en el compartimiento a ser medido. Debe poder ser determinado fcilmente por mtodos qumicos. No debe ser metabolizada ni sintetizada por el organismo.

Objetivo El objetivo del presente prctico es la medicin del volumen sanguneo y la osmolaridad en animales normales y sometidos a una hidratacin aguda. Determinacin del volumen sanguneo Se define como volumen sanguneo o volemia a la suma del volumen globular y el volumen plasmtico. (Vs= Vg + Vp) El volumen globular se estimar utilizando el valor del hematocrito. Para la determinacin del volumen plasmtico se utilizar Azul de Evans (colorante que se une a la albmina), midindose su concentracin en plasma por espectrofotometra. En el rango apropiado de concentraciones la determinacin cumple con la ley de Beer y la recta pasa por el origen. Material y Mtodos Ratas Wistar. Material de diseccin. Balanza para animales. Balanza analtica. Espectrofotmetro. Osmmetro. Centrfugas. 7

Lmparas de calentamiento. Jeringas: 20 ml, 10 ml (vidrio para puncin cardaca) 5 ml, 1 ml. Micropipetas automticas. Algodn, hilo de ciruga. Tubos de centrfuga, Eppendorf, capilares, tubos de hemlisis. Drogas: Anestsico. Azul de Evans (T 1824): Colorante a inyectar: concentracin 5 g/l en cloruro de sodio 9 g/l. Concentracin de la solucin testigo 250 mg/l. Heparina. Solucin Fisiolgica (Cloruro de sodio 0,9 g/l). Determinacin de la concentracin de AE y clculos Se toman 0,2 ml de plasma y se llevan a 5 ml con agua destilada. De la solucin testigo (250 mg/l) se toman 0,1 ml y se lleva a igual volumen final que la muestra con agua destilada. La absorbancia de la muestra y el testigo se lee a 620 nm contra blanco de agua destilada, con estos datos se calcula el volumen plasmtico aplicando la frmula: Vp= Q/[AE]p. La volemia para el animal entero se calcula aplicando la frmula: Volemia= Vp/1-Hto (Hto: expresado en nmero decimal)

El resultado final se expresa cada 100 g de peso corporal.

Discusin de los resultados obtenidos.

3. Fisiologa Renal Introduccin La funcin renal se cumple por medio de la filtracin glomerular de todos los componentes plasmticos a excepcin de las protenas. Los tbulos renales reabsorben selectivamente distintos componentes del filtrado glomerular como la glucosa, aminocidos, etc. Un parmetro para evaluar la funcin renal es medir la velocidad de filtracin glomerular (VFG). La velocidad de filtracin glomerular (VFG) puede estimarse a travs del clculo de la depuracin plasmtica de una sustancia que slo sea filtrada libremente, que no difunda pasivamente, ni sea secretada ni reabsorbida por los tbulos renales. La sustancia exgena que rene estas condiciones es la inulina. Tambin puede utilizarse para conocer la VFG una sustancia endgena que es la creatinina, la cual proviene de la metabolizacin de la glicina, arginina y metionina. La creatinina se encuentra especialmente en el tejido muscular donde la creatina-fosfato cumple un importante rol fisiolgico. La creatina pierde una molcula de agua y se transforma en la creatinina de estructura cclica. El clearance osmolar (Closm) representa el volumen de plasma depurado de todos los solutos de la orina por el rion en un minuto de actividad. La comparacin del Closm con el Vo' es una medida til para estimar el funcionamiento de los segmentos del nefrn involucados en los mecanismos de concentracin/dilucin de la orina. Objetivo El objetivo del presente prctico es estimar la velocidad de filtracin glomerular (VFG) y el clearance osmolar (Closm) en la rata. Material y Mtodos Ratas Wistar. Tijeras. Balanza para animales. Balanza analtica. Espectrofotmetro. Centrfugas. Lmparas de calentamiento. Micropipetas automticas. Bao a 37. Tubos Eppendorf. Jaula metablica. Heparina. Kit comercial de determinacin de creatinina (utilizar el mtodo enzimtico)

Determinacin de creatinina Se determinar la concentracin de creatinina en plasma y en una alcuota de la orina de 24 hs diluda 1/50. Despus de separar el suero de las respectivas 9

muestras por centrifugacin, se determinar la concentracin de creatinina utilizando el mtodo enzimtico de un reactivo comercial Depuracin plasmtica de creatinina = [creatinina]o . Vo/[creatinina]s Determinacin de Closm Se determinarn las osmolaridades del plasma y de la orina recogidos utilizando el osmmetro. Closm= [Osm]o . Vo'/[Osm]p Discusin de los resultados obtenidos.

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4. Regulacin de la glicemia Introduccin Los hidratos de carbono de la dieta son digeridos y absorbidos en el intestino para luego ser transportados al hgado que acta como reservorio para su distribucin. De esta forma, son mantenidos los niveles de glicemia, tanto luego de la ingesta como en ayuno, dependiendo de los requerimientos energticos de los tejidos. La regulacin hormonal de este proceso involucra, fundamentalmente, la secrecin de insulina y glucagon pancreticos. En ayuno la relacin I/G es baja; en contraposicin, con la ingesta la relacin aumenta por un incremento en la secrecin de insulina (producida y almacenada en las clulas beta del pncreas), que tiene como principales rganos blanco el hgado, msculo esqueltico y tejido adiposo En estos tejidos insulina aumenta el metabolismo de glucosa (gluclisis, sntesis de glucgeno, etc.), por lo que disminuyen los niveles de glicemia.

Objetivo El objetivo del presente prctico es evaluar los niveles de glucosa en sangre en respuesta a la administracin de glucosa y/o insulina exgena.

Material y Mtodos Ratas Wistar. Balanza para animales. Instrumental quirrgico. Jeringa 1 ml. Espectrofotmetro. Centrfugas. Lmparas de calentamiento. Micropipetas automticas. Tubos Ependorff. Kit comercial de glicemia. Drogas: Insulina. Glucosa Determinacin de glicemia Se incuban 10 l de muestra (suero) o de solucin standard de glucosa 1mg/ml (5 l) con 1 ml de reactivo durante 5 min a 37 y se realiza la lectura de la absorbancia a 505 nm. Clculo y presentacin de los resultados Se representar en un grfico la concentracin de glucosa plasmtica (mg/dl) vs. tiempo. Discusin de los resultados obtenidos. 11