KOLESTEROL TAYN N BYOSENSR HAZIRLANMASI

Sinan Mithat MUHAMMET

DOKTORA TEZ KMYA

GAZ NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS

OCAK 2008 ANKARA

SNAN MTHAT MUHAMMET tarafndan hazrlanan KOLESTROL TAYN N BYOSENSR HAZIRLANMASI adl bu tezin Doktora tezi olarak uygun olduunu onaylarm. Prof. Dr. Ahmet YAAR Tez Danman, Kimya Anabilim Dal .

Bu alma, jrimiz tarafndan oy birlii ile Kimya Anabilim Dalnda Doktora tezi olarak kabul edilmitir. Prof. Dr. Melike KABASAKALOLU Kimya Anabilim Dal, Gazi niversitesi Prof. Dr. Ahmet YAAR Kimya Anabilim Dal, Gazi niversitesi Prof. Dr. Esma KILI Kimya Anabilim Dal, Ankara niversitesi Prof. Dr. ule PEKYARDIMCI Kimya Anabilim Dal, Ankara niversitesi Prof. Dr. Selma ATE Kimya Anabilim Dal, Gazi niversitesi Tarih:01/ 02 /2008 Bu tez ile G.. Fen Bilimleri Enstits Ynetim Kurulu Doktora derecesini onamtr. . . . . .

Prof. Dr. Nermin ERTAN Fen Bilimleri Enstits Mdr

TEZ BLDRM Tez iindeki btn bilgilerin etik davran ve akademik kurallar erevesinde elde edilerek sunulduunu, ayrca tez yazm kurallarna uygun olarak hazrlanan bu almada bana ait olmayan her trl ifade ve bilginin kaynana eksiksiz atf yapldn bildiririm.

Sinan Mithat MUHAMMET

iv

KOLESTEROL TAYN N BYOSENSR HAZIRLANMASI (Doktora Tezi) Sinan Mithat MUHAMMET GAZ NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS Ocak, 2008 ZET Bu almada, kolesterol tayini iin yeni bir amperometrik biyosensr gelitirildi. Bu amala slfrik asit ortamnda piroln elektrot ve anilinin elektropolimerlemesiyle platin/polianilin-polipirol hazrland.

Kolesterol oksidaz enzimi hazrlanan platin/polianilin-polipirol elektrot zerine immobilize edildi. Kolesterol tayini, enzim elektrodun yzeyindeki enzimatik tepkime sonucu oluan hidrojen peroksidin +0,70 Vda ykseltgenmesine dayanarak yapld. Kolesterol biyosensrnn cevabna pHnn ve scakln etkisi incelendi. Biyosensrn kolesterol iin dorusal alma aral (1,8.10-5 5.10-5 M) olarak tespit edildi. mmobilize enzimin KM, Vmaks deerleri hesapland. Biyosensrn tekrar kullanlabilirlii ve raf mr tayin edildi. Hazrlanan biyosensrle biyolojik svda (kan) kolesterol tayini yapld.

Bilim Kodu : 201.1.020 Anahtar Kelimeler :Kolesterol, Kolesterol Oksidaz, Biyosensr, Polianilin, Biyolojik Sv, mmobilize Enzim Sayfa Adedi : 73 Tez Yneticisi : Prof.Dr. Ahmet YAAR

Polipirol,

PREPARATION OF AMPEROMETRIC BIOSENSOR FOR CHOLESTEROL DETERMINATION (Ph D. Thesis) Sinan Mithat MUHAMMET GAZI UNIVERSITY INSTUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY January 2008 ABSTRACT In this study, a new amperometric biosensor for determination of cholesterol oxidase was developed. For this purpose platinum/polypyrrole-polyaniline electrode was prepared by electropolimerization pyrrole and aniline in sulphuric acid media containing pyrrole. Cholesterol oxidase has been immobilized on the surface of platinum / polypyrrole-polyaniline electrode. Determination of cholesterol was performed by means of oxidation of hydrogen peroxide liberated during the enzymatic reaction on the surface of the enzyme electrode at +0,70V (Ag/AgCl). The effects of pH and temperature on the response of the cholesterol biosensor were investigated. The linear working range of biosensor was 1,8.10-5 5.10-5 M of cholesterol concentration. Value of KM and Vmax of immobilized enzyme were estimated respectively. Reuse number and storage stability were determined of the biosensor. Determination of cholesterol was carried out in biological fluid (in blood) by biosensor.

Science Code : 201.1.020 Key Words : Cholesterol, Cholesterol Oxidase, Biosensor, Polypyrrole, Polyaniline, Biological Fluid, mmobilized Enzyme Page Number : 73 Adviser : Prof. Dr. Ahmet YAAR

vi

TEEKKR

almalarm boyunca deerli bilgi ve katklaryla beni ynlendiren hocam Prof. Dr. Ahmet YAARa, Prof. Dr. Esma KILI ve Prof.Dr. Melike KABASAKALOLU na, Dr.Servet ETE ve Dr. Fatma ARSLAN a ve manevi destekleriyle beni yalnz brakmayan aileme ok teekkr ederim.

vii

NDEKLER Sayfa ZET...........................................................................................................................iv ABSTRACT................................................................................................................ v TEEKKR................................................................................................................vi NDEKLER...vii ZELGELERN LSTES.........................................................................................xi EKLLERN LSTES..............................................................................................xii 1. GR........................................................................................................................1 2. GENEL BLGLER..................................................................................................3 2.1. Enzimler ............................3 2.1.1. Enzimlerde seicilik 4 2.1.2. Enzim aktivitesi........................................................................................5 2.2. Kolesterol Oksidaz Enzimi ..6 2.2.1. Kolesterol oksidazn kaynaklar ...7 2.2.2. Tepkime mekanizmas....9 2.2.3. Kolesterol oksidazn uygulama alanlar............................................10 2.2.4. Analitik uygulamalar ..11 2.3. Kolesterol............12 2.4. Biyosensrler...13 2.4.1. Biyosensrlerin uygulama alanlar....15 2.4.2. Biyobileenler....17 2.5. letken Polimerlerle Dntrc Hazrlanmas..17

viii

Sayfa 2.5.1. letken polimerler......................17 2.5.2.. Elektrokimyasal polimerleme mekanizmas..17 2.5.3. letken polimerlerle enzim immobilizasyonu...20 2.6. Biyobileen mmobilizasyonu.....21 2.6.1. Kovalent balama.....21 2.6.2. Tutuklama.................22 2.6.3. apraz balama.........22 2.6.4. Adsorbsiyon......24 2.7. Enzim Sensrleri..24 2.7.1. Genel alma ilkesi..................25 2.7.2. Enzim sensrlerinin snflandrlmas.....26 2.8. Performans Faktrleri..28 2.8.1. Kararllk.......28 2.8.2. Tayin aral ve tayin snr.......29 2.8.3. Seimlilik..................31 2.8.4. Cevap sresi.33 2.8.5. Tekrarlanabilirlik...34 2.8.6. Dier performans faktrleri.34 3. DENEYSEL KISIM..............................................................................................36 3.1. Cihazlar ve Malzemeler...................................................................................36 3.1.1. Elektrokimyasal analiz cihaz................................................................36 3.1.2. Hcre ve elektrotlar................................................................................36 3.1.3. pH metre.................................................................................................37

ix

Sayfa 3.1.4. Su banyosu .......................................................................................37 3.1.5. Mikro pipet.............................................................................................37 3.1.6. Azot gaz................................................................................................37 3.1.7. Saf su......................................................................................................37 3.1.8. SEM analizi............................................................................................37 3.2. Kullanlan Reaktifler ve zellikleri................................................................38 3.2.1. Kullanlan zeltiler...............................................................................38 3.3.Platin Yzeye Slfrik Asit ortamnda Polipirol-Polianilin Kaplanmas....39 3.3.1. Elektrotlarn Hidrojen Perokside Duyarll40 3.4. alma potansiyelinin belirlenmesi .....42 3.5. Film kalnlna evrim saysnn etkisi 42 3.6. Kolesterol Biyosensrnn Hazrlanmas......43 3.7. Kolesterol Biyosensrnn alma artlarnn Belirlenmesi.........43 3.7.1. pH nn etkisi..................43 3.7.2. Scakln etki.................43 3.7.3. Substrat deriiminin etkisi..................44 3.7.4. Biyosensrn tekrar kullanlabilirliinin belirlenmesi...............44 3.7.5. Biyosensrn raf mrnn belirlenmesi.........................44 3.7.6. Biyosensrn cevap sresinin belirlenmesi45 3.7.7. Biyolojik svda (kan ) kolesterol tayini......45 4. SONULAR VE TARTIMA...47 4.1. alma Potansiyelinin belirlenmesi...49 4.2. evrim saysnn belirlenmesi.50

Sayfa 4.3. Pt/Polianilin-Polipirol Filminin SEM Fotoraf.53 4.3.1. Pt/Polipirol-Polianilin filminin SEM fotoraf54 4.4. Kolesterol Biyosensrnn alma artlar le lgili Sonular.....55 4.4.1.Farkl elektrotlara enzim immobilizasyonu ile aktivite deiiminin incelenmesi..55 4.4.2. Pt/Polipirol- polianilin-enzim-glutaraldehit-albumin filminin fotoraf..58 4.4.3. pH nn etkisi..59 4.4.4. Scakln etkisi..60 4.4.5. Substrat deriiminin etkisi..61 4.4.6. Biyosensrn tekrar kullanlabilirlii.....63 4.4.7. Biyosensrn raf mr...64 4.4.8. Cevap sresi65 4.4.9. Biyolojik svda (kanda) kolesterol tayini..66 4.4.10. Farkl yntemlerle bulunan kolesteroln ( Kanda) karlatrlmas.....................................................................66 KAYNAKLAR..........................................................................................................69 ZGEM................................................................................................................73

xi

ZELGELERN LSTES izelge Sayfa

izelge 2.1. eitli kaynaklardan elde edilen enzimlerin zelliklerinin karlatrlmas9 izelge 2.2. Biyosensrler iin uygulama olanaklar.....16 izelge 2.3. Enzim sensrlerinin snflandrlmas.....27 izelge 3.1. almada kullanlan kimyasal maddelerin adlar, saflk dereceleri ve temin edildikleri firmalar..38 izelge 4.1. Kan numunelerinde hesaplanan kolesterol ierii..66

xii

EKLLERN LSTES ekil Sayfa

ekil 2.1. Kolesterol oksidaz enziminin boyutlu yaps.7 ekil 2.2. Kolesterol oksidaz enziminin reaksiyon mekanizmas.10 ekil 2.3.a) Piroln elektrokimyasal ykseltgenme ile polimerleme Mekanizmas..19 b) Anilinin kimyasal polimerlemesine ait nerilen mekanizma..20 ekil 2.4. Baz bifonksiyonel reaktiflerin kimyasal formlleri.22 ekil 2.5. Direkt balama ile enzim immobilizasyonu..23 ekil 2.6. Biyosensr teknolojisinde kullanlan biyoaktif materyal sralamasnda enzimlerin yeri.25 ekil 2.7. Bir enzim sensrnn genel gsterimi (A: Analizlenecek madde, B: .26 ekil 3.1. Kaplama ve lme yapmada kullanlan hcre sistemi..............................36 ekil 4.1. Kolesteroln kolestenona ykseltgenmesi srasnda elektrot yzeyinde gerekleen elektron aktarm..48 ekil 4.2. Polipirol-Polianilin kapl film elektrodun farkl alma potansiyellerinde duyarllnn belirlenmesi.49 ekil 4.3. Sabit hidrojen peroksit deriimde polipirol elektrodun evrim saysna kar duyarll...50 ekil 4.4. Sabit hidrojen peroksit deriimde polianilin elektrodun evrim saysna kar duyarll...51 ekil 4.5. 16-16 evrimde Pt/PPy-Pani elektrodun hidrojen peroksit deriimine kar duyarll...52 ekil 4.6. 16-16 evrimde Pt/ Pani- PPy elektrodun hidrojen peroksit deriimine kar duyarll...52 ekil 4.7. Sabit evrimde polipirol-polianilin film elektrotun farkl deriimlere kar duyarll...53 ekil 4.8. Pt/Polianilin-Polipirol filminin SEM fotoraf...54

xiii

ekil

Sayfa

ekil 4.9. Pt/Polipirol-Polianilin filminin SEM fotoraf..55 ekil 4.10. Polipirol film elektroda enzim immobilizasyonuyla aktivitenin incelenmesi56 ekil 4.11. Polianilin film elektroda enzim immobilizasyonuyla aktivitenin incelenmesi.56 ekil 4.12. Polianilin-Polipirol film elektroda enzim immobilizasyonuyla aktivitenin incelenmesi57 ekil 4.13. Polipirol-Polianilin film elektroda enzim immobilizasyonuyla aktivitenin incelenmesi58 ekil 4.14. Pt/Polipirol-Polianilin-Enzim-Glutaraldehit-Albumin filminin SEM fotoraf..59 ekil 4.15. Biyosensrn aktivitesine pH nn etkisi59 ekil 4.16. Biyosensrn aktivitesine scakln etkisi.60 ekil 4.17. Biyosensrn aktivitesi zerine kolesterol deriiminin etkisi (Michealis-Menten grafii)..61 ekil 4.18. Biyosensrn aktivitesi zerine kolesterol deriiminin etkisini gsteren Lineweaver-Burke grafii.62 ekil 4.19. Kolesterol biyosensr iin kalibrasyon grafii...62 ekil 4.20. Biyosensrn tekrar kullanlabilirliinin incelenmesi..63 ekil 4.21. Biyosensrn raf mrnn belirlenmesi...64 ekil 4.22. Biyosensrn cevap sresi65

1. GR

Enzimlerin kullanm ok eski alara dayanr. lk alarda insanlar bilinsiz olarak ekmek hamuru, peynir, kmz, yourt gibi gdalarn hazrlanmasnda enzimlerin ilevlerinden yararlanmlardr. Enzimlerin yaps ve tepkime mekanizmalarnn aydnlatlmasyla enzimler gda, ila, kozmetik, tekstil, temizlik maddeleri gibi eitli endstriyel maddelerin retiminde, retime ynelik eitli tepkimelerin katalizlenmesinde ve fizyolojik rahatszlklarn tedavisinden tpta tan almalarna kadar uzanan yeni birok alanda kullanlmaya balanmtr [1]. Enzimoloji konusundaki gelimeler 1897de Bchnerin canl maya hcrelerinden ilk aktif enzimi ekstre etmesiyle balamtr. Bchner bu almasyla enzimlerin katalitik aktivitelerini iinde bulunduklar hcrelerin yaamsallna bal olmakszn farkl ortamlarda da devam ettirdiini gstermitir. 1926da Sumner enzimlerin protein yapsnda olduunu ortaya koymu ve ilk enzim saflatrmasn gerekletirmitir [2]. Enzimler canl hcrelerden elde edilmi protein yapsndaki byk bileiklerdir. Deiik avantajlarndan dolay enzimler eitli kimyasal tepkimelerde katalizr olarak kullanlmaktadr. Bitki , hayvan dokular ve mikroorganizmalardan elde edilen ok saydaki enzim yaplarna ve kontrol ettikleri tepkime mekanizmalarna gre karakterize edilmilerdir. Karakterize edilen bu enzimlerin ticari ve saf ekillerinin bulunmas endstriyel uygulamalarda kullanlmalarn salamaktadr. Enzimlerin spesifik olmalar ve tepkimeleri katalizleme kabiliyetleri onlarn biyokimyasal, endstriyel ve analitik alanlarda uygulamalarn cazip hale getirmektedir [3]. Doal enzimler yksek molekl ktlesine sahip protein yapsnda olup suda znrler. Ancak zelti halinde kararllklarnn snrl olmas, ortamdan ayrlmasnn ok zor olmas, tepkime denetimlerini gletirmelerini ve enzimlerin tekrar kullanmlarnn mmkn olmamas immobilize enzim dncesini ortaya karmtr. Sonuta immobilizasyon ile enzimlerin scaklk, mekanik ve kimyasal kararllklarnn arttrlmas ile tekrar kullanlabilmeleri mmkn klnmtr [4].

Bu almada, kolesterol tayini iin yeni bir amperometrik biyosensr gelitirildi. Bu amala slfrik asit ortamnda piroln ve anilinin elektropolimerlemesiyle platin/polianilinpolipirol elektrot hazrland. Bu elektrot kullanlarak serbest kolesterol oksidaz enziminin aktivitesi incelendi. Daha sonra, kolesterol oksidaz enzimi hazrlanan platin/polianilinpolipirol elektrot zerine immobilize edildi. Kolesterol tayini, enzim elektrodun yzeyindeki enzimatik tepkime sonucu oluan hidrojen peroksidin +0,70 Vda ykseltgenmesine dayanarak yapld.

2. GENEL BLGLER 2.1.Enzimler Enzimler canl hcrede meydana gelen kimyasal tepkimeleri katalizleyen veya dzenleyen biyokatalizrlerdir. Organizmadaki organik molekllerin yapm, ykm, kas hareketleri ve solunum gibi fizyolojik olaylar enzimler yardmyla yrtlmektedir. Bu sebeple hayat enzimatik tepkimelerin tmdr denilebilir. Enzimler drt temel adan ok gl katalizrlerdir: 1. Enzimler son derece etkilidirler. Sradan kimyasal katalizrlere gre tepkimeleri 1081011 kez daha hzl gerekletirebilmektedirler. Enzimler gsterdikleri bu hza ularken pH, scaklk, basn asndan olduka lml koullarda alabilmeyi mmkn klarlar. Enzimlerle katalizlenen reaksiyonlar fazla enerji gerektirmezler. Ayrca en kolay bulunan, en ucuz, en emniyetli zc olan su ierisinde almak enzimler iin mmkn olmaktadr. Mesela amonyak elde etmek iin kullanlan Haber prosesinde azot balamak iin 200-1000 atm basn ve 500C scaklk gereklidir. Ama azot balayan bir bakterinin bu ilemi yaparken yksek basn ve scakla ihtiyac yoktur. 2. Enzimler kimyasal katalizrlere gre ok daha deiik kimyasal reaksiyonlar katalizleyebilirler. 3. Enzimler reaksiyonun tipine ve substrata son derece spesifiktirler. Bylece yksek verim ve ok az sayda yan rn meydana gelir. 4. Enzimlerin ok eitli doal kontrol mekanizmalar vardr. Enzimlerin aktivitesi, iinde bulunduklar artlara gre dzenlenebilir. Ayrca kontrol edici kk molekller de enzimatik aktiviteyi azaltabilir ya da arttrabilir [5]. Enzimler tepkimenin balamas iin gerekli olan aktivasyon enerjisini drrler. Bir enzim daima bir eit tepkimeyi kontrol eder. Biyosensr yzeyi arttka enzim aktivitesi de artar.

Hcre iinde retilmelerine ramen hcre dnda da etki gsterebilirler. Enzimlerin kontrol ettii tepkimelerin ou ift ynldr. Genellikle protein yapl olmalarndan dolay proteinlerin etkilendii faktrlerden etkilenirler [6]. Enzimlerde proteini oluturan amino asitlerin says, dizili sras ve molekllerin yaps belirli bir dzen iindedir. Bu dzen enzimin substrata seiciliini salar. Baz enzimler yalnzca proteinden oluurken bazlar protein yannda protein olmayan bir ksm ierirler. Bu tip enzimlerde enzimin protein ksmna Apoenzim, denir. Koenzim ya da kofaktr enzime kovalent balysa Prostetik grup ad verilir. Koenzimler genellikle vitamin trevleri, ve organik molekllerden oluur. Apoenzim ve koenzim birlikte Holoenzim diye adlandrlr. Holoenzimin byk bir ksmn apoenzim oluturur. Apoenzim tek bana katalitik aktivite gstermez. Enzimin gerek aktivitesi sadece koenzim ve apoenzim bir arada olduunda gzlenir [7]. Enzim moleklnn belirli bir blgesinde belirli amino asitlerin oluturduu bir ksm bulunur. Protein zincirinin bu blgesi enzimin katalitik etkisinden sorumlu olup Aktif blge olarak tanmlanr. Substrat ve eer varsa koenzim, bu merkeze hidrojen balar, hidrofobik etkileimler, iyonik balar veya kovalent balar ile balanr. Substratn dnmne katlan ve katalitik prosesi yrten amino asit yan zincirleri de aktif merkezi olutururlar [6]. 2.1.1. Enzimlerde seicilik Enzimler yksek seicilie sahip katalizrlerdir. Bu seicilii be ksmda incelemek mmkndr [7]. Mutlak Seicilik : Bu durumda enzim belirli bir substrat katalizleyerek belirli bir rne dntrr. rnein reaz, reyi hidrolizlerken ve maltaz, maltozu monosakkaritlerine paralarken bu trden seicilik gsterirler. Grup Seicilii : Grup seicilii gsteren enzimler yapsnda belirli bir grup bulunduran tm substratlar katalizler. Proteini paralayan proteolitik enzimlerin ou grup seicilii gsterir.

Tepkime ya da Ba Seicilii : Bu gruptaki enzimler belirli bir tepkime trn katalizler ve substrat yapsnda bulunan belirli bir baa seicidir. Organik esterlerin hidrolizini katalizleyen lipazlar bu tr seicilie rnek olutururlar. Sterokimyasal Seicilik : Bu gruptaki enzimler substratn belirli bir sterokimyasal eklini katalizler. Dier sterokimyasal ekillere kar etkisizdir. Laktik dehidrojenaz, laktik asidin ykseltgenmesinde L-Laktik asidi ykseltgerken, D-Laktik aside kar katalitik aktivite gstermez. Btn bu seiciliklerden farkl olarak dier bir seicilik tr ayn enzimin farkl kaynaklardan elde edilmi analoglarnn ayn substrata farkl etkiler gstermesi eklindedir. rnein polipeptit balarnn hidrolizini katalizleyen kimotripsin ve tripsin enziminin aktif blgesindeki amino asit yan zincirlerindeki nedeniyle, peptit balarn farkl yerlerden krarlar [8]. 2.1.2. Enzim aktivitesi Enzim aktivite birimi (nite) yaygn olarak standart koullarda 1 dakikada 1mol substrat rne dntren enzim miktar olarak tanmlanmaktadr. Bu tanm Uluslararas Biyokimya Birlii tarafndan 1965 ylnda kabul edilmitir [8]. Ancak gda endstrisinde kullanlan enzimlerin bir ou iin bu tanm farkl ekillerdedir, nk bu enzimler hammaddedir ve enzimatik olarak aktif protein miktarn lmek olanakszdr. Bu nedenle deriik ham enzim preparatlar iin aktiflik mL enzim bana enzim birimi (nite) (nite/mL enzim zeltisi) olarak veya preparatn ierdii protein miktar tayin edilmise mg toplam protein bana nite (nite / mg protein) olarak da tanmlanabilir [7]. 1 saniyede 1 mol substrat rne dntren enzim aktivitesine 1 katal denir. Enzim aktivitesini etkileyen faktrler, enzimler tarafndan katalizlenen tepkimelerin aktivitesini dolaysyla hzn etkileyen faktrler; enzim deriimi, substrat deriimi, scaklk, pH, iyonik aktivite, inhibitr veya aktivatrlerin deriimi, tepkime rnlerinin deriimi ve zellikleri, sistemdeki akkan kuvvetler, k ve dier fiziksel faktrler olarak sralanabilir. Bu faktrlerin enzim tepkimeleri zerine olan etkilerini farkllk

saptamak iin etkisi llmek istenen faktr dndaki koullar sabit tutularak sadece bu faktrn farkl deerlerindeki enzimli tepkime hzlar llr [1]. 2.2. Kolesterol Oksidaz Enzimi Kolesterol oksidaz eitli mikroorganizmalardan saflatrlan iki ilevli bir enzimdir. Bu enzim merkezde iki tepkimeyi katalizler. lk tepkimede kolesteroln, ykseltgenmesini, ikinci tepkimede ise oluan ykseltgenme rnnn kolesterol-4en-3-ona dnmn salar ve bu srada aada da verildii gibi H2O2 aa kar [9-13].

1975ten beri kolorimetrik tayin ile serum iindeki serbest kolesteroln hesaplanmasnda bu enzim kullanlmaktadr [9,14,15]. Serum iindeki toplam kolesteroln hesaplanmas klinik tehisler iin gereklidir. Kolesteroln yksek deeri baz damarlarn eperlerinde birikerek damarlarn tkanmasna, tiroit bezinin az almasndan kaynaklanan tiroit bozukluuna, bbrek tubuluslarnn dejenerasyonun yol at bir hastala, ve eker hastalna ve sarla sebep olur. Dk deeri ise boynun nnde bulunan tiroit bezinin fazla almasndan ileri gelen bir bozuklua ve kanszla sebep olur [16,17]. Kolesterol oksidaz steroitlerin izomerizasyonunu ve oksidasyonunu salayan koenzim olarak FAD tayan bir enzimdir [9,11]. Enzimin protein yapsnda 492 tane amino asit kalnts vardr. Aktif merkezdeki amino asitler His447, Glu361dir.En nemli amino asit kalnts Glu361dir. Glu361 mekanizmadaki izomerizasyon basamanda bir proton alcs gibi grev yapar. ekil.2.1.de Glu361 kk sar

toplar olarak gsterilmitir. Proteine bal FAD, enzimin mavi renkte gsterilen sarmal ile evrelenmitir [16].

ekil 2.1. Kolesterol oksidaz enziminin boyutlu yaps

2.2.1. Kolesterol oksidazn kaynaklar Kolesterol oksidaz farkl ortamlarda bulunan mikroorganizmalardan elde edilmitir. Bunlarn snflandrlmas yllar boyunca gelitirilmitir. lk defa Turfitt, Nocardia erythropolis mikroorganizmasndan enzimi saflatrm ve kolesteroln ykseltgenmesi zerine etkilerini incelemitir. Stadtman ve arkadalar ekstrakte edilen serbest enzimin inkbasyonundan 4-kolest-3-on u elde etmilerdir. Bu gelimelerden sonra birok mikroorganizmada bu enzim bulunmutur. Kolesterol oksidazn elde edildii mikroorganizmalar aada verilmitir [18,19]. Corynebactericum Arthrobacter Nocardia erythropolis ve Rhodococcus eryhcopolis

Nocardia rhdochrous ve Rhodococcus rhdochrous Mycbacterium Pseudomonas Schizopyllum commune Brevibacterium cholesterolicum Streptoverticillium cholesterolicum Streptomyces violascens Rhodococcus Streptomyces bakterisinden elde edilen kolesterol oksidazn zellikleri [17]: Sistematik ad : E.C.1.3.3.6 kolesterol oksijen oksidoredktaz Grnm Molekl ktlesi zoelektrik noktas nhibitrleri En iyi pH En iyi scaklk pH kararll Termal kararll Kararll : Donmu toz hali sardr. : Yaklak 59 kDa ( jel filtrasyonu ile ) : 5,1 0,1 ve 5,4 0,1 : yonik deterjanlar , Hg ++ , Ag ++ : 6,5 7,5 : 37 C : 4,0 9,0 : 70 C nin altnda : 37 C de en az bir ay

Farkl kaynaklardan elde edilen enzimin zelliklerinde farkllklar grlr (izelge 2.1) [18].

izelge 2.1. eitli kaynaklardan elde edilen enzimlerin zelliklerinin karlatrlmas Bakteri ad Nocardia Rhodococcus Brevibacterium Sterolicum Streptomyces 7 37 C 4,56,7.104M 59 kDa yonik deterjanlar, Hg++, Ag++ Pseudomonas 7 37 C 56 kDa Fe++, Zn++, Hg++ Optimum pH 7 7 Optimum scaklk 32 C 37 C 55-45-69 0,3 mM 80-40 kDa 55k Da Km Ma nhibitrleri

2.2.2. Tepkime mekanizmas Kolesterol oksidaz enziminin katalizledii tepkime mekanizmas [ekil 2.2]de gsterildii gibidir. Katalizleme iki safhada gerekleir. lk tepkime kolesteroln kolest-5-en-3-ona ykseltgenmesi, ikinci tepkime ise kolest-5-en-3-on un kolest-4en-3-on a dnm tepkimesidir [19].

10

ekil 2.2. Kolesterol oksidaz enziminin tepkime mekanizmas [19] 2.2.3. Kolesterol oksidazn uygulama alanlar Gda analizlerinde kolesterol tayini amacyla kullanlr. Kolesterol Oksidaz Kolesterol + O2 katalaz H2O2 + metanol Formaldehit + NH4+ + 2-asetilaseton formaldehit + 2 H2O Lutidin Boyar maddesi+ 3 H2O kolestenon + H2O2

Katk maddesi olarak yumurta sars ieren gdalarda kolesterol tayini amac ile kullanlr [6].

11

Klinik analizlerde kolesteroln belirlenmesi amacyla kullanlr. Kolesterol esteraz, kolesterol oksidaz ve peroksidaza bal enzimatik kolorimetrik metot kolay duyarl ve zeldir. Bu yzden de rutin analizler iin uygundur. Bu da aadaki kimyasal reaksiyonlara dayandrlmaktadr. Kolesterol esteraz Kolesterol esteri + H2O Kolesterol oksidaz Kolesterol + O2 Kolest -4-en-3-on + H2O2 Peroksidaz H2O2 + 4-aminofenazon + fenol Kinonimin boyas Kolesterol + Ya asidi

Bu rnekteki ilk tepkimede kolesterol esterleri kolesterol esteraz tarafndan kolesterol ve ya asitlerine hidrolizlenir. kinci tepkimede kolesterol, kolesterol oksidaz tarafndan kolest-4-en-3-on ve H2O2 ye ykseltgenir. H2O2, peroksidaz katalizrlnde 4-aminofenazon ve fenol varlnda renkli 4-[p-benzokinonmonoimino]fenazon oluumunu salar. ndikatr ve stokiyometrik olarak elemi tepkimeler yardmyla kolesterol deriimine ulalr [21]. Etkin enzim gl bir bcek ldrcdr [22]. 2.2.4. Analitik uygulamalar Analitik inceleme olarak kolesterol oksidazn kullanm iin birok yeni uygulamalar vardr. a) Farkl rnek trlerinde kolesteroln saptanmas iin kullanlr. Bu rnekler Serumda toplam ve esterlemi kolesterol tayini Yksek ve dk younluklu [HDL-LDL] lipoprotein llmesi b) Hcrelerdeki kolesterol tayini ve enzimlerin yol at hcre zarlarnn paralanmasnn tespit edilmesi c) nsan safras ve safra talarndaki toplam kolesterol tayini

12

d) Kemilminesans ve floresans yntemleriyle kolesterol tayini e) Biyosensr yapm ve enzimin polimer matrikse immobilizasyonu Genelde kolesterol tayini yntemlerin ou H2O2 lmne dayanr. Bu sebeple bu yntem dolayl bir yntemdir. Bunun sebepleri eitlidir. Birinci olarak H2O2 in renk oluturan bileenlerle elemesi sonucunda yksek seviyede renk verici maddeler oluur. Bu da daha hassas kolesterol lmesini salar. kinci olarak, H2O2 nin redoks tepkimesi ak bir ekilde saptanr. Bu da kolay voltametrik ve amperometrik lme yaplmasn salar [18]. 2.3. Kolesterol Kolesterol 3-hidroksi-5-dehidro kolestan olup, hayvansal organizmalarda en ok bulunan bir steroldr. Ak forml aada verimektedir.

Kolesterol nsan vcudunda bulunan kolesteroln bir ksm besinler ile dardan alnrken byk bir ksm da ya asitleriyle esterlemi haldedir. Kolesterol, kan plazmasnda steroit bileiklerinin sentezinde k maddesi olarak kullanlr [14,15]. Kolesterol yaam iin gerekli olan mum kvamnda yams bir maddedir. Beyin, sinirler, kalp, barsaklar, kaslar, karacier bata olmak zere tm vcutta yaygn olarak bulunur. Vcut kolesterol kullanarak hormon, D vitamini ve yalar sindiren safra asitlerini retir. Bu ilemler iin kanda ok az miktarda kolesterol bulunmas yeterlidir. Kanda fazla miktarda kolesterol bulunmas kolesteroln kan damarlarnda birikmesine, damarlarn daralmasna, sertlemesine yol aar. Kolesterol hangi organn damarlarnda birikirse o organa ait hastalklar ortaya kar. rnein kalbi

13

besleyen atar damarlarda kolesterol birikimi olursa, gs ars, kalp krizi gibi sorunlar oluur. Bbrek damarlarndaki birikim ise yksek tansiyon ve bbrek yetmezliine yol aabilir [20]. Kolesterol normal koullarda kanda znmez. Kanda znmesi iin karacierde bir proteinle birlemesi gerekir. Bu kolesterol ve protein birleimine lipoprotein ad verilir. ok eitli lipoprotein trleri vardr bunlarn en nemlileri aada verilmitir. 5 e ayrlr. Dk younluklu lipoproteinler (LDL): Kan kolesterolnn yaklak %70ini tamaktadrlar. Kan damarlar duvarlarna girebilmek iin yeterince kktrler ve damarlara zarar verirler. Kt bir kolesterol olarak adlandrlrlar. Yksek younluklu lipoproteinler (HDL): Vcudun kullanmad kolesterol karacierden safraya boaltmak zere tar. Kolesteroln bir cins ters naklini yapt iin iyi tr kolesterol olarak adlandrlrlar. ilomikronlar ok dk younluklu lipoproteinler Ara younluktaki lipoproteinler

Kanda toplam kolesterol ve LDL kolesteroln yksek olmas yksek risk oluturmaktadr. Ayrca HDL kolesteroln dk olmas da bir risktir. Normal artlarda insan kan plazmasnda 130-260mg/100 mL kolesterol bulunur. Bunun zerindeki deerler yksek kolesterol seviyesi olarak bilinir [20]. 2.4. Biyosensrler Btn canllar yaadklar ortamdaki deiimleri derhal alglayp yaamlarn srdrebilmek iin deiimlere uymaya alrlar. te bu alglama mekanizmas biyosensrlerin hcre d [in vitro] kullanm iin temel oluturmutur [25].

14

Biyosensr, biyolojik olaylardaki biyokimyasal deiimleri alglayarak, biyolojik olayn tehisine imkan tanyan bir lme sistemi olarak tanmlanabilir [25]. Biyosensrlerin tarihi 1950li yllarn ortalarnda L.C. Clarkn kandaki glukoz seviyesini lmesiyle balad. Clark ve Lyonsun gelitirdii birinci nesil biyosensrlerde [25].
GOD Glukoz + O2 Glukonik asit+ H2O2

elektron

alc

olarak

oksijen

kullanlrken,

ikinci

nesil

biyosensrlerde elektron alc olarak redoks medyatrleri kullanlmaya balanmtr

GOD= Glukoz oksidaz

nc nesil biyosensrlerde enzimin indirgenme ykseltgenme merkezi ile elektrot yzeyi arasnda dorudan elektriksel iletiim salanm ve indirgenme ykseltgenme medyatrlerine gereksinim kalmamtr [25]. Biyosensrlerde biyobileen olarak enzimler yannda doku kltrleri,

mikroorganizmalar, organeller, antikorlar ve nkleik asitler de kullanlabilmekte ve lme tekniine gre amperometrik, potansiyometrik, termal, piezoelektrik, akustik veya optik sensrler olarak adlandrlmaktadrlar [25]. Biyosensrlerin yksek spesifiklii yannda; renkli ve bulank zeltilerde geni bir deriim aralnda dorudan lmeye olanak salamak gibi stnlkleri vardr. Fakat reseptr olarak adlandrlan biyobileenlerin pH, scaklk, iyon iddeti gibi ortam koullarndan etkilenmesi biyosensrn kullanm mrn ksaltmaktadr [25].

15

Medyatrler

ve

zellikleri:

Medyatrler

oksidoredktazlarn

koenzimlerinin

yenilenmesinde nemli rol oynarlar. Enzim znm ekilde deilse koenzimin hareketi azalr ve elektronlarn elektrot ve koenzim arasnda tanmas iin bir medyatre gereksinim duyulur. Medyatrn tatmin edici bir fonksiyon gsterebilmesi iin aadaki zellikleri de salamas gerekir [25]. - Kolay indirgenip ykseltgenebilmesi, - Ykseltgenmi ve indirgenmi eklinin kararl olmas, - zeltideki oksijen ile tepkime vermemesi, - Hcre ii uygulamalar iin zararl olmamas. Ferrosen yukarda belirtilen btn artlar salayan bir maddedir. Medyatrler inert veya elektroaktif bir polimer ile immobilize edilir. yon deitirici polimerler (nafyon gibi) ve iletken polimerler (polipiroller, polianilinler, poliindoller gibi) bu amala kullanlr . Son zamanlardaki yaplan almalarda biyosensrlerde enzimin indirgenme ykseltgenme merkezi ile elektrot yzeyi arasnda dorudan elektriksel iletiim salam olduundan redoks medyatrlerine gereksinim kalmamtr [25]. 2.4.1. Biyosensrlerin uygulama alanlar Biyosensrler tp, tarm, gda, eczaclk, evre kirlilii, savunma sanayi ve birok endstriyel alanda zellikle otomasyon ve kalite kontrolnde ok nemli rol oynarlar. Bugne kadar 180den fazla farkl madde iin biyosensr hazrlanm olup, bunlardan ancak 25 kadar ticari olarak retilmektedir. Biyosensrlerin uygulama alanlarnn bazlar izelge 2.2de verilmitir [25]. Biyosensrler; gda maddeleri, metabolitler, vitaminler, antibiyotikler, ilalar gibi organik maddeler ile baz anorganik bileikler yannda enzimler, virsler ve mikroorganizmalarn tayininde kullanlrlar [25]. Hi kukusuz biyomedikal sektr biyosensrler iin en iyi pazardr. Bu alanda uygulama olana bulunan ilk biyosensrler enzim sensrleridir. Ticari olarak

16

retilen ilk biyosensr ise eker hastal tehisi iin kan ve idrarda glukoz tayininde kullanlan glukoz oksidaz elektrodudur [25]. izelge 2.2. Biyosensrler iin uygulama olanaklar Klinik tehis, biyomedikal sektr Proses kontrol Biyoreaktr kontrol Gda retim ve analizi Tarm ve veterinerlik Bakteri ve virs tehisi la analizi Endstriyel atk su kontrol evre koruma ve kirlilik kontrol Maden iletmelerinde zehirli gaz analizleri Askeri uygulamalar

Son yllarda tbbi analizrlere enzim elektrodlar taklarak youn bakm nitelerinde kullanlmaya balanmtr. Biyoteknoloji ve gda endstrisinde bata glukoz olmak zere birok monosakkarit, aminoasitler, organik asitler (laktik asit) re ve alkol tayinlerinde enzim sensrleri kullanlmaktadr. Ayrca, gdalardaki yabanc maddeler (pestisitler, toksinler ve hormonlar vb.) yannda aroma ve tazelik gibi kompleks deikenlerin tayininde de biyosensrler kullanlabilir. Toprak, hava ve su kirliliinin kontrolnde mikrobiyal sensrler ve enzim sensrleri kullanlmaktadr. lalarn kt amala kullanm ve uyuturucu ile mcadelede biyosensrler kullanlabilir. Bylece uyuturucu madde arayan kpeklerin yerini biyosensrler alabilir ve bylece gmrklerde, karakollarda daha ksa srede sonu alnabilir [25].

17

2.4.2. Biyobileenler Enzimler, mikoorganizmalar, organeller, doku kesitleri, antikorlar , nkleik asitler ve biyolojik zarlar iine yerlemi kimyasal reseptrler, sensrlerde biyobileen olarak kullanlrlar. Biyoreseptrler analizlenecek maddeyi dnme uratr ve bu dnme elik eden deiimler dntrc tarafndan alglanr. Yksek spesifikliklerinden dolay enzimler en yaygn kullanlan biyomateryallerdir. Uygun bir enzimin bulunamamas veya enzimin kararsz olmas ve birden ok sayda maddenin tayini durumlarnda hcre sistemleri ve tercihen mikroorganizmalar kullanlr [25]. 2.5. letken Polimerlerle Dntrc Hazrlanmas 2.5.1. letken polimerler letken polimerler konusundaki almalar 1950lerde balamtr. letkenlikleri oda scaklnda 10-5 S/cm olan yar iletken polimerler 1950-1960 yllar arasnda retilmitir. Gnmzdeki anlaya uygun iletken polimerler 1970lerin sonunda ortaya kmaya balamtr. Shirakawa yntemiyle retilen poliasetilenin ykseltgen ile dop edilmesi sonucunda iletkenliinin 108 kat arttrld grlmtr [26]. letkenlik konusunda en nemli adm 1979da Diazn pirol elektrokimyasal

yntemle ykseltgeyerek polipirol retmesiyle atlmtr. Polipirol anot zerinde retilebilmi ve gl bir film olarak yzeyden karldnda iletkenlii 100 S/cmye ulaabilmitir. Benzer ekilde, elektroykseltgenme yntemiyle iletken politiyofen anot zerinde retilebilmitir [26]. 2.5.2. Elektrokimyasal polimerleme mekanizmas Polipiroln elektrokimyasal oluma mekanizmas ekil 2.3de verilmektedir. Reaksiyon sulu veya susuz zeltilerde ve oksijensiz ortamlarda anodik ykseltgenme ile balar ve devam eder. Polipirol kimyasal olarak da retilebilir.

18

ekil 2.3de grld gibi radikal katyonlar dimerleip tekrar ykseltgenme veya baka monomere katlp sonra ykseltgenmektedir. Oluan dikatyon iki proton kaybedip ntrletikten sonra ykseltgenme ile balayan basamaa tekrar dnmekte ve bu mekanizma polimerleme duruncaya kadar tekrarlanmaktadr. Elde edilen polimerin yaps, mol ktlesi, iletkenlii ve fiziksel dayankll deney koullarna gre deikenlik gsterir. zc olarak genellikle dielektrik sabiti yksek olan ancak nkleofilik karakter gstermeyen organik zcler tercih edilir. Anot olarak platin levha, cams karbon veya indiyum kalay oksit (ITO) cam kullanlr. Elektrolitlerin yksek potansiyellerde bozunmamas istenir ve tetra alkillerin BF4veya CIO4- tuzlar tercih edilir. Bu anyonlar ayn zamanda polimerler iin en uygun dopantlardr. Anot potansiyelinin de ar ykseltgenmeye neden olmayacak ekilde dk tutulmas gerekir. Ar ykseltgenen polimerin ana zincirindeki konjuge ift balar krlr ise konjugasyon kesintiye urar ve iletkenlik der. rnein polipirol sulu zeltide Ag/AgCl referans elektroduna gre +0,8 volttan daha yksek potansiyellerde ar oksitlenerek iletkenliini kaybedebilir [26].

19

1.
N H N+ H

e-

H H

2a.

2
N+ H

N+ N+ H H H

H H +N N H H

2b.
N+ H

-e

+ N H H

H N+

H H H N+ +N H H H N H

H N

3.

+ 2H

4.
N

n
H

ekil 2.3.a) Piroln elektrokimyasal ykseltgenme ile polimerleme mekanizmas b) Anilinin kimyasal polimerlemesine ait nerilen mekanizma [26,27]

20

ekil 2.3.(Devam) a) Piroln elektrokimyasal ykseltgenme ile polimerleme mekanizmas b) Anilinin kimyasal polimerlemesine ait nerilen mekanizma [26,27] 2.5.3. letken polimerlerle enzim immobilizasyonu letken polimer elektrotlarn elektroanalitik uygulamalarnda, enzim

immobilizasyonuna sklkla rastlanlmaktadr. izelge 2.2de grld gibi enzim kullanlan biyosensrlerin geni bir uygulama alan bulunmaktadr [26]. Aizawa ve Foulds tarafndan yaplan almalarn ardndan enzimler eitli iletken polimerlerle immobilize edilmitir . Enzim moleklne monomer kimyasal olarak balanabilmekte ve ardndan iletken polimer elektrolizle retilebilmektedir. Bu yntem ile kovalent bal enzim elektrot elde edilmektedir [26].

21

Birden fazla enzimin iletken polimerlere immobilize edilmesiyle de biyosensrler hazrlanabilmektedir. Laktat dehidrojenaz ve laktat oksidaz enzimlerinin poli (fenilendiamin) polimerine immobilize edilmesiyle ok hassas biyosensrler hazrlanmtr [26]. 2.6. Biyobileen mmobilizasyonu Biyosensrler farkl zellikteki iki elemann [dntrc ve biyobileen] kombinasyonu ile oluurlar. Uygun biyoreseptr ve dntrc seildikten sonra bunlarn birbirine balanmas almas gereken en nemli sorundur. Bu balama ilemi biyoreseptr immobilizasyonu olarak tanmlanr. Balama ileminde ok deiik yntemler kullanlabilir. Hangi yntemin kullanlaca seilen dntrc ve biyoreseptre gre belirlenir. mmobilizasyon biyoreseptrn kararll ve tekrar kullanm asndan byk avantaj salar. Biyosensr immobilizasyonunda balca drt yntem kullanlmaktadr [28]. 2.6.1. Kovalent balama Enzimler dorudan dntrc veya nceden uygun bir film veya tabaka ile kaplanm dntrcye kovalent olarak balanabilirler. Enzimler aktifletirilmi dntrc yzeylerine balanabilecei gibi nceden uygun bir materyale kovalent balanarak immobilize edilen enzim preparatnn dntrc yzeyinde bir film veya tabaka oluturmasyla da biyosensrler hazrlanabilir [28]. Enzimlerin kovalent balanmasnda dikkat edilecek nemli nokta, balanmann enzim aktivitesi iin aktif merkezdeki amino asitler zerinden gereklememesi ve bu gruplarn sterik olarak rahatsz edilmemesidir. Kovalent balanma enzim molekl zerindeki fonksiyonel gruplar zerinden gerekleir [28].

22

2.6.2. Tutuklama Biyoreseptrn bir membran veya tabaka ierisinde hapsedilmesidir. Enzimler

makromolekler yapl proteinler olup polimer jel tabakalarda ve daha basit olarak diyaliz membranlarnda tutuklanabilirler. Bu yntem enzimler yannda organeller, hcreler ve antikorlar iin de uygulanabilir. Elektrokimyasal polimerleme dier bir tutuklama yntemidir [28]. 2.6.3. apraz balama Bu yntem biyosensr hazrlanmasnda daha ok tutuklama ve kovalent balama yntemlerinin kombinasyonu eklinde uygulanr. apraz balayc reaktif olarak gluteraldehit, heksametilen diizosiyanat, diflorodinitrobenzen, bismaleimidoheksan, disksinilsuberat sk kullanlr. ki fonksiyonlu reaktifler enzimler yannda organeller, hcreler ve antijenlerin immobilizasyonunda da uygulanr. Baz apraz balayclarn formlleri ekil 2.4 de verilmitir [28].

O H2C H2C H2C C H Glutaraldehit Hekzametilendiizosiyanat C H O N (H2C)6 N C O C O

NCO

NO2

NCS

CH3

NO2

F 2-Izosiyanato-4-izotiyosiyanato-toluen 1,5-difloro-2,4-dinitrobenzen

ekil 2.4. Baz bifonksiyonel reaktiflerin kimyasal formlleri

23

apraz balamada iki yntem kullanlr: Daldrma yntemi Elektrot nce enzim ve apraz balaycnn bulunduu karma veya enzim, albumin, jelatin gibi, suda znen protein ve apraz balaycnn bulunduu karma daldrlr, sonra kendi ekseni etrafnda homojen bir enzim tabakas elde edilecek ekilde dndrlr. Bundan sonra elektrot glisin zeltisine daldrlarak ntrletirilir ve apraz balaycnn fazlas ve dier reaksiyona girmeyen maddeler ykanarak uzaklatrlr. Yntem ok kolay ve zellikle kk dntrcler iin ok uygundur [28].

Dorudan balama yntemi Bu yntemde yaklak 10 L enzim zeltisi bir klcal boru yardmyla dntrc yzeyine ince bir tabaka oluturacak ekilde damlatlr (ekil 2.5 (a)). Daha sonra apraz balayc reaktif ilave edilir (ekil 2.5 (b)). Bu yntemde daldrma yntemine gre daha az biyobileen ile allabilmektedir [28].

ekil 2.5. Direkt balama ile enzim immobilizasyonu(a) Enzim zeltisi b) apraz balayc reaktif ilave edilmesi [28]

24

2.6.4. Adsorpsiyon Bu yntemde biyobileenin film veya tabakaya adsorbe olmas salanr. Biyobileenlerin kimyasal yaps ve fiziksel durumuna gre immobilizasyon yntemi belirlenir. Enzimler iin uygulanan tm immobilizasyon yntemleri protein yapsndaki dier biyoreseptrler iin de uygulanabilir. rnein; hayvan ve bitki dokular zar yapsnda olduklarndan farkl immobilizasyon yntemleri uygulamak gerekir [28]. mmobilizasyon yntemine gre biyosensrlerin ortalama mrleri aada verilmitir. Adsorpsiyon: 1 gn, Membranda tutuklama: 1 hafta Fiziksel tutuklama: 3-4 hafta Kovalent balama: 4-14 ay 2.7. Enzim Sensrleri Biyosensr teknolojisindeki ilk rnekler zellikle amperometrik ve potansiyometrik temelli enzim elektrotlar eklinde ortaya kmlardr. Bu durumun en nemli nedeni o tarihteki bilgi ve teknolojik birikimin, sz konusu almalar iin yeterli dzeye ulam olmasdr. Biyosensr teknolojisinde kullanlan biyoaktif materyal sralamasnda enzimlerin yeri ekil 2.6 da verilmitir [29].

25

Organ (rnein; koku alma organ) Doku Tm hcre Hcre organeli (rnein; mitokondri) Biyomembran (rnein; reseptr) Lipozom Enzim Antikor yonofor ekil 2.6. Biyosensr teknolojisinde kullanlan biyoaktif materyal sralamasnda enzimlerin yeri 2.7.1. Genel alma ilkesi Enzim sensrleri, biyobileen olarak enzimin kullanld iletici ve lme sisteminden oluur. Dier biyosensrlerde olduu gibi enzim sensrlerinde de biyoaktif tabakann i ve d yzeylerinde zarlar, sinyali ykselticiler, mikro ilemciler, kaydedici veya bilgisayar sistemleri amaca ynelik olarak kullanlabilir. Bir enzim sensrnn genel gsterimi ekil 2.7da verilmitir [29].

26

ekil 2.7. Bir enzim sensrnn genel gsterimi (A: Analizlenecek madde, B: mmobilize enzim tabakas, C: letici eleman, D: lme sistemi) Bir enzim elektrodunda enzimi ieren biyoaktif tabaka, enzimin katalizledii tepkime uygun bir iletim ve lm sisteminin uzants olan bir iletici ile birletirilmektedir. letim sistemi biyoaktif tabakada gerekleen enzimatik tepkime rnn miktarndaki sonucu oluan art tespit edebilecek ekilde seilmelidir. Biyoaktif

tabakadaki ve biyoaktif tabaka iletici ara yzeyindeki deriimlerin hzl bir ekilde dengeye ulaabilmesi iin difzyon engelini en aza indirmek amacyla biyoaktif tabaka kalnlnn mmkn olduunca ince olmas gerekmektedir. Bunun yan sra biyoaktif tabakada sabit bir substrat deriimi salayabilmek iin lme zeltisinin yeterli bir ekilde kartrlmas gerekmektedir. letici sistemin lme sistemine gnderdii sinyal biyoaktif tabaka ile iletici ara yzeyindeki deriimlerdeki deiiklie baldr. Ancak sz konusu deriimler denge halinde lme zeltisindeki deriimlerle orantl olduu iin ou zaman kalibrasyon grafii izilerek sonuca varlr [29]. 2.7.2. Enzim sensrlerinin snflandrlmas Enzim sensrlerinin snflandrlmas en yaygn ekilde, enzimatik tepkime sonucu oluan sinyalin belirlenme ilkesine gre yaplmaktadr (izelge 2.3).

27

izelge 2.3. Enzim sensrlerinin snflandrlmas[29] 1. Elektrokimyasal Esasl Enzim Sensrleri a. Amperometrik esasl enzim sensrleri Birinci nesil amperometrik enzim elektrotlar kinci nesil amperometrik enzim elektrotlar nc nesil amperometrik enzim elektrotlar b. Potansiyometrik esasl enzim sensrleri Protona duyarl potansiyometrik enzim elektrotlar Amonyuma duyarl potansiyometrik enzim elektrotlar Karbondioksite duyarl potansiyometrik enzim elektrotlar Dier iyonlara duyarl potamsiyometrik enzim elektrotlar c. Yar iletkenleri esas alan enzim sensrler, Enzim alan etki transistrleri (ENFET) 2. Optik esasl enzim sensrleri; Absorpsiyon esasl optik enzim sensrleri. Floresans esasl optik enzim sensrleri. Biyoluminesans esasl optik enzim sensrleri. 3. Kalorimetrik esasl enzim sensrleri 4. Piezoelektrik esasl enzim sensrleri

Elektrokimyasal esasl enzim sensrleri Elektrokimyasal esasl enzim sensrleri, enzim sensrleri ierisinde en yaygn kullanm alan bulmu tr oluturur. Bu durumda, enzim sensrlerinin dolaysyla biyosensrlerin ilk ortaya kan rnekleri elektrokimyasal enzim sensrleridir [29].

28

Amperometrik esasl enzim sensrleri Amperometri genel anlamda belli bir potansiyeldeki akm iddetinin lm esas alr. Sz konusu akm younluu alma elektrodunda ykseltgenen ya da indirgenen elektroaktif trlerin deriimlerinin bir fonksiyonu olarak tanmlanr. kinci elektrot referans elektrot olarak i grr. Kalibrasyondan sonra, akm younluklarndan ilgili trlerin deriimlerinin belirlenmesinde yararlanlr [29]. letici sistem olarak bir amperometrik sensrn kullanlmas durumunda

potansiyometrik sensrlerden en byk fark oluan rnlerden sinyal oluturan trn elektrot yzeyinde tketilmesidir [29]. 2.8. Performans Faktrleri Hazrlanan biyosensrn hedeflenen amalar erevesinde kullanlabilir olup olmadna ancak performans faktrlerinin ayrntl bir ekilde belirlenmesinden sonra karar verilebilir [29]. 2.8.1. Kararllk Bir enzim elektrodunun kararll dier faktrlerde yeterli koullar salandktan sonra onun pratik kullanlabilirliinin en nemli belirtelerinden biridir. Kararllk biyosensr mrnn uzunluu hakknda fikir verir. Uzun mr ayn materyalle ok sayda analizin yaplabileceini gsterir. Bu durum da i gc ve maliyet asndan nemli avantajlar salar [29]. Doann temel ilkeleri erevesinde bata organik molekller olmak zere tm maddeler kanlmaz bir ykma urarlar. Dolaysyla biyosensrlerin de bir mr vardr. Sz konusu mr onlarn depolama ve alma koullar asndan balca iki durumda incelenir. Doal olarak kullanlmadan ideal koullarda depolandndaki mr ile srekli alma koullarndaki mr farkl olacaktr [29].

29

Biyolojik materyal asndan enzim sensrnn kararll incelendiinde enzimin saflk dzeyi, kayna ve immobilizasyon yntemi gibi deikenlerin nem tad grlr. Genelde fiziksel immobilizasyon yntemlerinin kullanlmas durumunda biyosensr mr kimyasal yntemlere gre daha ksadr. Enzimin saflk dzeyi ykseldike doal ortamndaki bileenlerinden uzaklat iin kararllkta azalma sz konusu olabilir [29]. 2.8.2. Tayin aral ve tayin snr Kalibrasyon grafiinde substrat deriimiyle sensr cevab arasndaki ilikisinin dorusal olduu deriim aralna dorusal aralk denir. Bu dorusal grafiin en alt snr tayin snr olarak tanmlanr. Bu deer bir kesinlik ve doruluk ifade eder. Tayin snr kalibrasyon grafiinin, dorusal ksmnn uzatlarak x eksenini kestii nokta olarak tanmlanr [29].

Potansiyometrik

enzim

sensrlerinde ile elde

kalibrasyon arasnda

grafii substrat (yada izilir. Buna karlk

rn])deriiminin logaritmas arasnda dk dorusal grafikler

potansiyel edilir.

amperometrik esasl enzim sensrlerinde substrat (veya rn) deriimiyle akm Ancak btn grafikler MichaelisAmperometrik esasl enzim Menten eitliinin kapsam iindedirler . Genelde tayin snrnn 10-5Mdan daha bir deer olmasnn nemi vurgulanr. sensrlerinde dierlerine nazaran olduka yksek duyarllklara eriebilmek

mmkndr [29]. Doal olarak dorusal tayin aralnn ve tayin snrnn alma iin uygunluu, hedeflenen analizde analizlenecek maddenin analiz ortamndaki dzeyi ve giriim yapabilecek dier maddelerle birlikteliinden nemli lde etkilenmektedir [29]. Bunun yan sra biyosensr cevabn etkileyen deikenlerin dorudan sensr kalibrasyonunu etkileyecei gzden uzak tutulmamaldr. rnek olarak enzim sensrleri incelendiinde balca pH scaklk ve giriim yapan maddeler sensr cevabn etkileyerek tayin araln deitirebilirler. alma pHsndan

30

uzaklalmasyla biyoaktif tabakadaki toplam enzim aktivitesinde deimeler olabilir. kincisi ise enzimatik tepkime uyarnca tketilen yada retilen ve sinyal oluumuna yol aan trlerin pH deiimiyle beraber disosiasyon deerlerinin deimesidir. Bu durum tayin edilecek maddenin aktif trn deriiminde deiiklie neden olarak sensr cevabnda deimeye yol aabilir. Bylece pH farklanmasyla kalibrasyon erisinde deiimler ortaya kar [29]. Scaklk, enzim sensrnn cevabn optimum scaklktan uzaklalmas durumunda olumsuz ynde etkiler. Bu, zellikle termal kararl dk enzimlerde geri dnmsz bir denaturasyonla da sonulanabilir. Buna karlk eitli kimyasal trlerin difzyon hzlarnn scaklkla artmas enzim sensr cevabnda bir arta neden olur [29]. Herhangi bir giriim yapan madde enzim sensr cevabn balca ekilde etkileyebilir. Bu etkileimlerden birincisi, giriim yapan maddenin etkisinin temel sensr zerinde, ikincisi biyoaktif tabakadaki enzim zerinde, ncs ise; enzimatik tepkimedeki bileikler zerinde gstermesiyle gerekleir. Sz konusu durumlara rnek olarak srasyla katyon seici temel sensrlerin ortamdaki dier katyonlardan etkilenmesi, inhibitr veya aktivatrlerin veya mutlak zgl olmayan enzimler iin benzer substratlarn biyoaktif tabakadaki enzim aktivitesini etkilemesi ve ortamda bulunabilecek baz indirgen veya ykseltgen maddelerin enzimatik reaksiyonun substrat veya rnleriyle etkilemesi verilebilir. Sonuta enzim sensr cevabndaki deiim kalibrasyon grafiinde deimeye ve ou zaman tayin aralnda ve tayin snrnda deimeye yol aar. Bu gibi problemleri ortadan kaldrmak veya en aza indirmek iin, temel sensr seilirken analiz ortamnda onu etkileyecek unsurlarn varl dikkate alnmaldr. Enzim aktivitesi asndan aktivatrlerin maksimum dzeyde ilavesine buna karlk inhibitrlerin uzaklatrlmasna nem verilmelidir. Aktivatr ve inhibitr etkisi biyaoaktif tabakadaki enzim aktivitesinin arttrlmasyla byk lde engellenebilir. Enzimatik tepkimenin substrat ve rnleriyle giriim yapan maddelerin varl nemli bir problemdir. Bu problem giriim yapan maddenin bir n ilemle uzaklatrlmas ya

31

da tepkime bileenlerinden giriim yapan maddenin etkilemedii bir tanesine duyar bir temel sensr kullanlmasyla zme kavuturulabilir [29]. 2.8.3. Seimlilik Seimlilik dier analiz sistemleriyle kyaslandnda biyosensrlerin varlk nedenlerinin en n sralarnda gelmektedir. Kullanlan biyomateryal asndan bakldnda enzimler genel anlamda seimlilik sralamasnda antikor ve nkleik asitlerden sonra gelirler. Ancak bu genel yaklam mutlak zgl enzimler sz konusu olduunda geersizdir. Dolaysyla mutlak spesifik bir enzim sz konusu olduunda seimlilik de en st seviyelere ykselir. Buna karlk zgll dk enzimler, grup zgl enzimler, ksmi saflatrlm enzim preparatlar, dokular ve mikroorganizmalar seimlilik asndan bir takm olumsuzluklara sahiptirler [29]. Bir biyosensrn seimlilii zerinde balca, sensrle giriimler, biyokatalizrle giriimler ve pH etkili olmaktadr. Sensrde meydana gelebilecek giriimleri engellemenin en iyi yolu rnekteki dier maddelere cevap vermeyen ve yalnzca ilgilenilen biyokatalitik tepkimeyi izleyebilecek bir sensr kullanmaktr. rnein; kanda re tayinine ynelik bir biyosensrde temel sensr olarak NH4+a duyarl bir iyon seimli elektrodun kullanlmas ortamda bulunan Na+ ve K+ iyonlarnn giriimine neden olur. Buna karlk temel sensr olarak NH3 a duyarl bir sensr kullanlmas bu istenmeyen durumu ortadan kaldrr [29]. Amperometrik sensrler potansiyometrik olanlara nazaran bir lde daha zgldrler. Seilmi sabit bir potansiyelde i grmelerine ramen, sz konusu koullarda elektroaktif maddelerin varl giriime neden olabilir [29]. Seimlilii etkileyen dier nemli deiken biri olan biyokatalizatrle giriim, enzimler sz konusu olduunda, iki balk altnda incelenebilir. Bunlar yarmal substratlar ve enzimi aktive veya inhibe eden maddelerdir. Eer enzim reaz

32

[substrat :re], rikaz [substrat: rik asit], aspartaz [substrat: aspartik asit] gibi yanlzca bir substratla tepkime verme zelliine sahipse yarmal bir baka substrat giriimi sz konusu deildir. Ancak alkol oksidaz gibi grup zgllne sahip enzimler (substrat: dk molekl ktleli primer alkoller) veya amino asit oksidazlar (substrat: amino asitler) sz konusuysa esas tayin edilecek trn yannda dierlerinin de varolmas giriim etkisine yolaar. Bu durumda baz n ilemlerin yaplmas gereksinimi doar. Bir enzim sensrnde enzim aktivitesi lme ortamndan gelen inhibitr ve aktivatrlerden de etkilenir. En nemli inhibitrler Ag+, Hg2++ ve Cu2+ gibi metal iyonlar, organofosfatlar ve tiyol bileikleridir. Bata oksidazlar olmak zere pek ok enzimin aktif merkezinde yeralan serbest tiyol gruplarn bloke ederler. Ortamda bulunabilecek enzim aktivatr veya inhibitrleri, enzim aktivitesini deitirecei iin hatal sonulara ulalmasna neden olurlar. Bu nedenle analizlenecek rnek ieriinin iyi yorumlanmas byk nem tar [29]. Ortamn pHs da seimlilii etkileyen nemli deikenlerden biridir. pH etkisi hem enzime hem de sensre deiik ekillerde etkir. Bilindii gibi her enzim en yksek dzeyde aktivite gsterdii bir optimum pHya sahiptir. mmobilizasyon sonucu baz durumlarda taycnn yapsna bal olarak optimum pHda kaymalar olabilir. Bunun yansra ilgili enzimatik tepkimede ykl substratlarn szkonusu olmas durumunda pHye bal olarak bu subtratlarn yk durumlarndaki deiimler de seimlilik zerine etki edebilir. Ayrca temel sensrn de, zellikle baz tr elektrodlarda optimum cevap iin belirli pH gereksinimleri vardr. leriki faktr arasndaki uyum, teorik olarak pH zorlamalarnn yerine, en pratik bir ekilde, hazrlanan biyosersrn en hzl, en kararl ve en duyarl cevap verdii optimum pH deerinin deneysel olarak belirlenmesiyle elde edilir [29]. Gerekte tayin aralnn da seimlilik zerinde bir etkisi vardr. rnein; bir lme yaplacak ortamda analizlenecek hedef maddenin yannda giriim yapabilecek bir baka maddenin varolmas durumunda, hedef maddeye ilikin tayin aral byk nem tar. Olduka dk tepkimelere inebilen bir tayin aralnda, rnekteki hedef maddenin nemli lde seyreltilerek tayinine olanak varsa, giriim yapacak

33

maddenin konsantrasyonunu bu ilemler sonucunda tayin snrlar dna karlmas mmkn olabilmektedir. Bu durum sonuta seimlilie nemli bir katk salar [29]. 2.8.4. Cevap sresi Biyosensrlerin byk bir hzla yaygnlamasnn en nemli nedenlerinden biri, ideal bir biyosensrn de temel niteliklerinden olan pratik bir ilemle ksa srede sonu verebilmesidir. ok sayda rnein sz konusu olduu rutin analizlerde mmkn olan en az n ilemle en ksa srede elde edilen sonu byk nem tamaktadr. Cevap sresi ile kastedilen, biyosensrn, analizlenecek maddenin bulunduu ortama temas ettii andan itibaren lme dzeneinden sonucun okunduu ana kadar geen sredir [29]. Bir biyosensrn cevap sresi 3 ana aamada meydana gelen olaylar tarafndan etkilenir. Bunlar; 1. Substratn analiz ortamndan zar yzeyine ne kadar hzl, difzlendii, 2.Substratn zar iine ne kadar hzl difzlendii ve biyokatalizrn aktif merkezi ile ne kadar abuk tepkime verdii, 3.Oluan rnn lld yer olan sensr yzeyine ne kadar hzl difzlendii. Bu olay etkileyen balca unsurlar da zeltinin kartrma hz, substrat deriimi, enzim deriimi , optimum pH, scaklk ve sensr yzeyinde veya biyoaktif tabaka yzeyinde herhangi bir zarn kullanlp kullanlmad ve kullanlyorsa niteliidir. Bu unsurlardan kartrma hznn art cevap sresini ksaltrken, substrat deriimindeki art uzamasna yol aar. Enzim miktarnn art ve optimum pHya yaknlama cevap sresini ksaltr. Ancak enzim miktar art biyoaktif tabaka kalnlamasna yol aaca iin difzyon problemini arttrabilir ve cevap sresi uzar. Bu sorun spesifik aktivitesi yksek enzim preparatlarnn kullanmyla giderilebilir. Scaklk difzyonu olumlu ynde etkileyerek cevap sresinin ksalmasna yol aar.

34

Ancak enzimin optimum scaklndan uzaklamasnn enzim aktivitesinde bir dmeye neden olaca gzden uzak tutulmamaldr [29]. Biyosensrler iin cevap sresi genel olarak birka saniye ile birka dakika arasnda deiir. 5 dakikaya kadar olan deerler kabul edilebilir. Ancak 10 dakika gibi bir sre olduka uzun kabul edilir. Doal olarak bir biyosensrn en az srede en ok sayda analize imkan vermesi sadece cevap sresiyle snrl bir durum deildir. Yeni bir lme hazr hale gelebilmesi iin gereken polarizasyon, denge veya yenilenme gibi ilemlerin ald sre ou zaman cevap sresinden ok daha fazla bir sre alr [29]. 2.8.5. Tekrarlanabilirlik Hazrlanan bir biyosensr ile tekrarlanabilirlik denemelerinin en basiti ayn bir rnekle ardarda lme yaplmas ve elde edilen deerlerden standart sapma ve korelasyon katsaysnn hesaplanmasdr. Her zaman standart kalibrasyon grafii izme gereinden kanlmas durumunda, standart ilave yntemlerinden yararlanlr. Bu amala analizlenecek rnek llr, ardndan gerek deeri bilinmeyen bu rnein lme sonularna gre yaklak iki kat deriimde bilinen bir standart eklenir ve lme ilemi gerekletirilir. Bu yntem sensr cevabnn rnek deriimiyle dorusal deitiinin bilindii durumlarda aadaki bant yardmyla hesaplanr [29]. ruCs (r (u + s ) ru )

Cu=

Bantda

Cu:

Bilinmeyen

rnein

deriimini,

Cs:

Eklenen

standardn

konsantrasyonunu, ru: bilinmeyen rnein sensr cevabn, r[u+s]: bilinmeyen rnek ve eklenen standardn sensr cevaplar toplamn ifade eder [29].

35

2.8.6. Dier performans faktrleri Bir biyosensrn performansn etkileyen dier nemli faktrlerden biri de maliyettir. Maliyet genelde biyosensrn hazrlanmas giderleri ile sz konusu biyosensrle yaplan bir analizin giderlerinin toplamdr. Hazrlanma giderlerinin az olmas durumunda genelde bu fasldan analiz bana gelecek gider katks azalacaktr. Doal olarak biyosensrn kullanlma kararll bu faktr byk lde etkileyecektir [29]. zellikle evre ve savunma gibi alanlarda kullanlacak bir biyosensr iin tanabilir olmas byk nem tar. Tanabilirlik beraberinde kullanm kolayln ifade edecek ekilde basit olma niteliini de ieriyorsa daha yaygn kullanm olana ortaya kacaktr. Ancak pratik kullanm iin basitletirilmi sistemlerin, ou zaman kark sistemlere nazaran hatal olabilecei gzden uzak tutulmamaldr. Genelde bu gibi sistemlerden acil durumlarda bir fikir edinmek amacyla ya da dier trden bir analizin mmkn olmad koullarda yararlanlmaldr [29].

36

3. DENEYSEL KISIM 3.1. Cihazlar ve Malzemeler 3.1.1. Elektrokimyasal analiz cihaz Amperometrik lme ilemlerinde BAS Epsilon-EC-Ver 1.40.67NT elektrokimyasal analiz cihaz kullanld. 3.1.2. Hcre ve elektrotlar Amperometrik lme ilemlerinde, ekil 3.1 de verilen elektrotlu hcre sistemi kullanld. Referans elektrot olarak BAS RE-5B no lu Ag/AgCI, kart elektrot olarak MW-1032 no lu platin tel ve alma elektrodu olarak 0,5 cm2 yzey alanl ve polianilin-polipirol ile kaplanm Pt levha elektrotlar kullanld.

ekil 3.1. Kaplama ve lme yapmada kullanlan hcre sistemi

37

3.1.3. pH metre Tampon zeltilerinin pH larnn lmesinde ORION Model 720A pH-iyonmetre cihaz kullanld. 3.1.4. Su banyosu Sabit scaklk almalarnda Grant W14 Marka termostatl dolaml su banyosu kullanld. 3.1.5. Mikro pipet 5 L - 500 L zelti ilaveleri iin Volac marka 0,05 L hassasiyeti olan mikro pipetler kullanld. 3.1.6. Azot gaz zeltide znm oksijeni uzaklatrmak iin, inert gaz olarak Kargaz firmasndan temin edilen yksek saflktaki [ % 99,999] azot gaz kullanld. 3.1.7. Saf su zeltilerin hazrlanmasnda kullanlan saf su GFL Marka saf su cihazndan temin edildi. 3.1.8. SEM analizi Hazrlanan elektrotlarn yzey fotoraflar ekme ilemlerinde Gazi niversitesi Fen Edebiyat Fakltesi Biyoloji blmndeki Jeol-JSM-6060 LV marka cihaz kullanld.

38

3.2. Kullanlan Reaktifler ve zellikleri almada kullanlan kimyasal maddelerin adlar, saflk dereceleri ve temin edildikleri firmalar izelge 3.1de verildi.

izelge 3.1. almada kullanlan kimyasal maddelerin adlar, saflk dereceleri ve temin edildikleri firmalar Kimyasal Madde Pirol (C4H5N) Anilin Glutaraldehit (C5H8O2) Sodyum hidroksit (NaOH) Hidroklorik asit (HCI) Sodyum (Na2HPO4) Sodyum Dihidrojen fosfat (NaH2PO4) Slfrik asit (H2SO4) Hidrojen Peroksit (H2O2) Sr Serum Albumin (BSA) Triton X-100 Kolesterol Propan 2-ol %98 %35 Merck Merck Merck Merck Merck Merck Merck Merck Monohidrojen Saflk Dereceleri %97,0 %99.5 %25d=0,78 %36.5 fosfat Temin Firma Fluka Aldrich Aldrich Fluka Merck Merck Edildii

3.2.1. Kullanlan zeltiler Slfrik asit zeltisi: Deriik slfrik asitten belli bir miktar alnp uygun ekilde seyreltilerek deriimi 0,1 M olan zelti hazrland.

39

Fosfat tamponu: Monosodyum fosfat monohidrat ve disodyum fosfat heptahidrat belli bir miktar tartlarak saf suda zld, hazrlanan zeltinin pH s 0,1 M NaOH ile 7,2 e ayarland ve zeltideki analitik deriimi 0,1M olacak ekilde seyreltildi. Farkl pH ve deriimlerdeki tampon zeltileri hazrlamak iin ayn yol izlendi. Tampon zelti ll balonda buzdolabnda sakland. Enzim zeltisi: Toplam aktivitesi 100 U ve miktar 5,0 mg olan kolesterol oksidaz enzimi alnd ve saf suda zldkten sonra hacim ll balonda 10 mLye tamamland [10 nite/mL]. Deney srasnda kullanlacak olan dondurucuda sakland. Glutaraldehit zeltisi: % 25 lik glutaraldehit zeltisinin seyreltilmesiyle %5 lik glutaraldehit zeltisi hazrland. Kolesterol zeltisi: 0,0193 g kolesterol, 2,56 mL propan 2-ol ierisinde zld. zerine 0,4 mL Triton X-100 ilave edildi. Hazrlanan zeltinin homojenliini salamak amacyla zelti iyice kartrld. Daha sonra fosfat tamponu [pH = 7, 0,1 M] ile hacmi 25 mL ye tamamland ve +4C da sakland. Sodyum hidroksit zeltisi: Kat sodyum hidroksitten belli bir miktar tartlp suda zlerek 0,1 M, 250 mL zeltisi hazrland. Hidrojen peroksit zeltisi: %30luk hidrojen peroksit zeltisinden belli bir miktar alnarak 1,0 Mlk stok zelti hazrland. Bu stok zeltiden belli miktarlarda alnp seyreltilerek 1.10-3, 1.10-4, 1.10-5 Mlk hidrojen peroksit zeltileri hazrland. Hidroklorik asit zeltisi: Deriik HCI den belli bir miktar alnp uygun bir ekilde seyrelterek 0,1 M 250 mL zeltisi hazrland. enzim zeltisi buzdolabnda bekletildi, ancak uzun sre kullanlmad durumlarda zelti derin

40

3.3. Platin Yzeye Slfrik Asit ortamnda Polipirol-Polianilin Kaplanmas Elektrot yzeyinin hazrlanmas: Kaplama ileminden nce platin levhann yzeyi mekanik, kimyasal ve elektrokimyasal olarak temizlendi. nce yzey sfr numara zmpara ile parlatld, sonra aleve tutuldu. 5 dakika sre ile srasyla aseton, etil alkol, deriik HCl ve deriik nitrik asit zeltisi ierisinde bekletildi. Elektrot yzeyi bol saf su ile ykandktan sonra 5 M H2SO4 iinde -2,0 V - +2,0 V arasnda tarama yaplarak elektrokimyasal olarak temizlendi. Tekrar saf su ile ykand ve kurutuldu. Her kaplama ileminden nce yzey, bu ekilde temizlendi [30]. Temizlenmi Pt levha elektrodunun yzeyi bir iletken polimer olan polipirol ve polianilin ile kapland. Polipirol ve polianilin elektrot yzeyine piroln ve anilinin elektropolimerlemesi ile biriktirildi. Elektropolimerlemede l elektrot sistemi kullanld (ekil 3.1). alma elektrodu olarak platin levha (0,5 cm2), kart elektrot olarak platin tel ve referans elektrot olarak da Ag/AgCI elektrot kullanld. Enzim elektrot yapmnda kullanlmak zere polianilin-polipirol elektrot hazrland. Bu amala 0,00-0,7 V arasnda 50 mV/s tarama hznda evrim alnarak (dnml voltametri ile) anilinin ve piroln platin yzeyde elektropolimerlemesi gerekletirildi. Kaplama ileminden sonra elektrot yzeyi tampon zeltisi ile ykandktan sonra kullanlmak zere tampon iinde bekletildi ve bylece platin/ polianilin/polipirol elektrot hazrland. Hazrlanan platin/polianilin-polipirol elektrodun yzeyinin taramal elektron mikroskobu (SEM) ile fotoraf ekildi.

3.3.1. Elektrotlarn hidrojen perokside duyarll. Blm 3.3 de belirtildii ekilde hazrlanan polianilin-polipirol kaplanm platin elektrotlar kolesterol biyosensr yapmnda kullanlacandan ve enzimatik reaksiyon sonucunda elektroaktif tr olarak hidrojen peroksit olutuundan, bu elektrotlarn ve platin elektrodun hidrojen peroksite duyarll ve dorusal alma aral belirlendi. Bu elektrot iin yaplan ilemler aada ksaca akland.

41

Platin [Pt] elektrodunun hidrojen perokside duyarll Yzey alan 0,5 cm2 olan ve Blm 3.3de belirtildii ekilde temizlenen ve alma elektrodu olarak kullanlan platin levha elektrodun, hidrojen perokside duyarlln belirlemek amacyla Blm 3.3de kullanlan elektrot sistemli elektrokimyasal hcre kullanld. Elektrokimyasal hcreye pH s 7,0 olan 10 mL, 0,1 M fosfat tamponu ilave edildi. Suda znm olan oksijeni uzaklatrmak amacyla 10 dakika azot gaz geirildi. Kararl akm elde etmek iin alma potansiyeli olarak seilen +0,70 V sabit potansiyelde platin elektrot dengeye getirildi. Elektrodun dengeye gelmesi iin yaklak bir saat beklendi ve kararl akm kaydedildi. Blm 3.2.1de belirtildii ekilde hazrlanan 1,0x10-3 M stok zeltisinden mikro pipet yardmyla elektrokimyasal hcreye hidrojen peroksit ilave edildi ve bir dakika sreyle N2 gaz geirildi. + 0,70 V sabit potansiyel uygulanarak her 5 dakika sonundaki akmlar kaydedildi. Hidrojen peroksit deriimine kar akm deerleri grafie geirildi [kalibrasyon erisi] ve platin elektrodun hidrojen perokside dorusal cevap verdii aralk belirlendi. Platin / Polipirol (Pt/PPy) elektrodunun hidrojen perokside duyarll Blm 3.3 de anlatld gibi hazrlanan Pt/PPy elektrot alma elektrodu olarak kullanld ve hidrojen peroksite duyarll Platin (Pt) elektrodunun hidrojen perokside duyarllde anlatld ekilde belirlendi. Platin / Polianilin(Pt/Pani) elektrodunun hidrojen perokside duyarll Blm 3.3 de anlatld gibi hazrlanan Pt/Pani elektrot alma elektrodu olarak kullanld ve hidrojen peroksite duyarll Platin (Pt) elektrodunun hidrojen peroksidede anlatld ekilde belirlendi.

42

Platin / PolipirolPolianilin(Pt/PPy-Pani) elektrodunun hidrojen perokside duyarll Blm 3.3 de anlatld gibi hazrlanan Pt/PPy-Pani elektrot alma elektrodu olarak kullanld ve hidrojen peroksite duyarll Platin (Pt) elektrodunun hidrojen peroksidede anlatld ekilde belirlendi. Platin / Polianilin-polipirol (Pt/Pani-PPy) elektrodunun hidrojen perokside duyarll Blm 3.3 de anlatld gibi hazrlanan Pt/ Pani-PPy elektrot alma elektrodu olarak kullanld ve hidrojen peroksite duyarll Platin (Pt) elektrodunun hidrojen peroksidede anlatld ekilde belirlendi. 3.4. alma Potansiyelinin Belirlenmesi Blm 3.3 de hazrlanan polianilin-polipirol elektrodunun hidrojen perokside duyarll aratrlrken, hidrojen peroksidin ykseltgenebilmesi iin uygun potansiyelin belirlenmesi amacyla, eitli alma potansiyellerinde kalibrasyon erileri izildi. Bu potansiyeller yledir: +0,70; +0,60; +0,50; +0,40; +0,30 V; +0,20 V. Her bir potansiyelde izilen kalibrasyon erilerinden en iyi alma potansiyeli belirlendi. 3.5. Film Kalnlna evrim Saysnn Etkisi Literatrde film kalnlnn evrim saysyla ve devreden geen yk ile ilikili olduu belirtilmektedir, ancak kullanlan cihazda dorudan yk saymak mmkn olmadndan film kalnlnn elektrodun hidrojen perokside duyarllna etkisi kaplamadaki evrim says deitirilerek incelendi. Bu amala Blm 3.3de anlatld ekilde hazrlanan elektrotlar iin sras ile polipirol iin 5, 10, 15, 20, 25, ve 60 evrim alnarak denendi. Polianilin iin ise 5, 15, 30, 45, 55, 65, 70 evrim saylar denendi. Sonra uygun evrim saysnda platin-polipirol elektrodun hazrlanmas iin elektrot yzeyi polipirol ve polianilinin farkl evrim saylarnda kapland.

43

3.6. Kolesterol Biyosensrnn Hazrlanmas Bir tp ierisinde 100 L kolesterol oksidaz, 100 L fosfat tamponu, 50 L glutaraldehit ve 3 mg sr serum albumin [BSA] dan oluan zelti hazrland. Blm 3.3e gre hazrlanan platin/ polianilin/polipirol elektrodun her bir yzeyine bu karmdan 50 L damlatld ve zcnn uzaklamas iin beklendi. Biyosensr kullanlmad zamanlarda buzdolabnda +4C da fosfat tamponunda bekletildi. Hazrlanan biyosensrn yukarda anlatlan her aamas iin elektrot yzeyinin taramal elektron mikroskobu [SEM] ile fotoraf ekildi. 3.7. Kolesterol Biyosensrnn alma artlarnn Belirlenmesi 3.7.1. pH nn etkisi Blm 3.6a gre hazrlanan biyosensrn amperometrik cevap akm zerine pH nn etkisini incelemek iin nce biyosensr, deriimi 100 mM pH s 5 olan 10 mL fosfat tamponunda oda scaklnda +0,7 Vda dengeye getirildi. Sonra stok kolesterol zeltisinden, hcredeki deriimi 5.10-5 M olacak ekilde ilave edildi. Daha sonra +0,7 V sabit potansiyelde amperometrik cevap akm lld. Ayn ilemler deriimi 100 mM ve pH s 5,0; 5,5,6,0; 6,5;7,0; 7,5; 8,0; 8,5; olan fosfat tamponlar ve 5.10-5 M kolesterol zeltileri iin de tekrarland. Farkl pH lardaki her bir zelti iin + 0,70 V sabit potansiyelde llen amperometrik cevap akmlar pH ya kar grafie geirildi ve grafikten biyosensrn optimum alma pH s [7,0] belirlendi. 3.7.2. Scakln etkisi Blm 3.6e gre hazrlanan biyosensrn amperometrik cevap akm zerine scakln etkisini incelemek iin nce biyosensr, deriimi 100 mM pH s 7,0 olan 10 mL fosfat tamponunda 20C da +0,7 Vda dengeye getirildi. Sonra deriimi 100 mM pH s 7,0 olan fosfat tamponunda hazrlanm stok kolesterol zeltisinden

44

hcredeki deriimi 5.10-5 M olacak ekilde ilave edildi. Daha sonra +0,7 V sabit potansiyelde amperometrik cevap akm lld. Ayn ilemler 20, 30, 35, 37, 40, 50, 60, 65C scaklklar iin de tekrarland. Farkl scaklklardaki her bir zelti iin + 0,70 V sabit potansiyelde llen amperometrik cevap akmlar scakla kar grafie geirildi ve grafikten biyosensrn optimum alma scakl [60C] belirlendi. alma artlarnn kolay olmasndan dolay bundan sonraki deneylerde alma scakl olarak 25C seildi. 3.7.3. Substrat deriiminin etkisi Blm 3.6.e gre hazrlanan biyosensrn amperometrik cevap akm zerine substrat deriiminin optimum artlarda etkisini incelemek iin nce biyosensr, +0,7 Vda dengeye getirildi. Sonra biyosensrn kolesterole cevabnn ve alma aralnn belirlenmesi iin 1.10-6-3.10-4 M kolesterol deriimi aralnda amperometrik cevap akmlar lld ve bulunan deerler kolesterol deriimlerine kar grafie geirildi [Michaelis-Menten erisi]. Bu grafikten yararlanarak biyosensrn alma aral belirlendi. Enzim sabitleri olan Km ve Vmaks belirleyebilmek iin Lineweaver-Burk grafiini izildi. 3.7.4. Biyosensrn tekrar kullanlabilirliinin belirlenmesi Blm 3.6a gre hazrlanan ve dengeye getirilen biyosensrn optimum artlarda tekrar kullanlabilirliini belirlemek iin 5.10-5 M kolesterol deriiminde arka arkaya yaplan lmeler sonucu elde edilen amperometrik cevap akmlarna kar lme says grafie geirildi ve bu grafikten llen akm deiimleri kullanlarak aktivitedeki azalma deeri hesapland. 3.7.5. Biyosensrn raf mrnn belirlenmesi Blm 3.6a gre hazrlanan ve dengeye getirilen biyosensrn optimum artlarda raf mrn belirlemek iin biyosensr 25 gn boyunca 4 C da buzdolabnda bekletildi. gnde bir defa olmak zere 5.10-5 M kolesterol deriiminde

45

biyosensrn amperometrik cevap akm lld. Bekletme sresine kar cevap akmlar grafie geirildi ve bu grafikten llen akm deiimleri kullanlarak aktivitedeki azalma deeri hesapland. 3.7.6. Biyosensrn cevap sresinin belirlenmesi Blm 3.3.e gre hazrlanan ve dengeye getirilen biyosensrn optimum artlarda cevap sresini belirlemek iin 5.10-5 M kolesterol deriiminde +0,7 Vda eitli zaman aralklarnda devreden geen akm deerleri kaydedildi. Zamana kar llen amperometrik cevap akmlar grafie geirilerek akm deiiminin sabit kald sre biyosensrn cevap sresi [ 300 s ] olarak belirlendi. 3.7.7. Biyolojik svda [kanda ] kolesterol tayini Biyolojik svda ki kolesterol tayini iin 5 kiiden kan rnei alnd. rnek alma ilemleri salkl bireylerden yapld. Bu rnekler steril kaplara alnd ve muhafaza edildi. Kan rneklerinden ayn anda 2 parelel numune alnd. rneklerden biri karlatrma yapmak amacyla Salk Kltr Spor Daire Bakanl biyokimya laboratuvarnda analiz iin brakld. Dier kan rnekleri ise tarafmzdan analiz edilmek zere getirildi ve hemen buzdolabna konularak muhafaza edildi. Kan rneklerinin analizi iin n ilemler uyguland. Kan analizleri genellikle kan serumunda yapld iin ncelikle kan rneklerinden bir miktar alnd ve 3000 rpm de 5 dakika santrifj edildi. Santrifj sonrasnda stte kalan [kan serumu] ksm alnd. Daha sonra analiz srasnda giriim yapabileceini dndmz proteinleri bulunduklar kan serumu ortamndan ayrmak iin %10luk triklorasetik asit kullanld ve ken proteinler sonucu oluan kelek szlerek ortamdan uzaklatrld. Proteinleri ktrlm kan serumu analiz yaplncaya kadar buzdolabnda muhafaza edildi.

46

Kan serumunda kolesterol tayini iin seyreltme ilemleri yapld. Bu ilem kan serumundaki kolesterol deriiminin biyosensrn dorusal alma aralna getirilmesi iin yapld. Kan serumundan belli hacimlerde alnd ve 20 defa seyreltme olacak ekilde biyosensrn bulunduu hcre ortamna ilave edildi. llen akm deerlerinden kalibrasyon grafii kullanlarak kolesterol deriimi tayin edildi. Her numune iin 3 parelel deney yapld ve standart sapma deerleri hesapland.

47

4. SONULAR VE TARTIMA Bu almada platin yzey zerine iletken bir polimer olan polipirol ve polanilin kapland. Ayrca bu film elektrot zerine kolesterol oksidaz enzimi bir protein olan albumin ve apraz balayc olarak glutaraldehitin varlnda immobilize edildi. Hazrlanan biyosensrn analitik ve biyokimyasal zellikleri incelendi. Bilindii gibi enzimatik reaksiyonlarn bir ksmnda tepkime rn olarak H2O2 aa kar. Hazrlanan enzim elektrotlarn ou, uygulanan sabit potansiyelde alma elektrodunun yzeyinde enzimatik tepkime sonunda oluan H2O2 in ykseltgenmesi esasna dayanmaktadr [31- 33]. H2O2 aadaki tepkimeye gre olumaktadr.

Oluan hidrojen peroksit platin elektrot yzeyinde sabit bir potansiyelde aadaki tepkimeye gre ykseltgenmektedir [31]. H2O2 O2 + 2H+ + 2eYkseltgenmenin meydana gelecei bir potansiyelde alldnda devreden geen anodik akm oluan hidrojen peroksitin deriimi, dolaysyla kolesterol deriimi ile orantldr. Bu almann prensibi de yukardaki prensiple ayn olmakla beraber daha nce polipirol-polianilin kolesterol oksidaz enziminin serbest ve immobilize edilmi ekli ile ilgili bir almaya rastlanmamtr. Bu yzden yaplan bu alma orjinal bir almadr.

48

Bu almada Pt/Pani-PPy elektrodu ile enzimatik reaksiyon sonucunda oluan hidrojen peroksidin dolaysyla kolesteroln llmesinde zeltide ve elektrot yzeyinde gerekleen olaylar ematik olarak ekil 4.1. de gsterilmektedir.

ekil 4.1. Kolesteroln kolestenona ykseltgenmesi srasnda elektrot yzeyinde gerekleen elektron aktarm ekil 4.1e gre kolesterol elektronlarn enzime vererek kolestenona ykseltgenir. Elektronlar alan Enzim-FAD kompleksi indirgenir. Yeni bir substrat molekl ile tepkimeye girebilmesi iin enzimin yeniden ykseltgenmesi gerekir, bu nedenle enzim elektronlar oksijene elektron vererek yeniden ykseltgenmi hale geer. Sonra hidrojen peroksit +0,70 Vda elektrot yzeyinde ykseltgenir. Bu elektrodun uzun sre kullanlabilmesi iin enzimin srekli ykseltgenmi gerekir. Bu almada Pt/polipirol-polianilin film elektrotla kolesterol oksidaz enziminin immobilize ekline ait analitik ve biyokimyasal zellikler incelenmi olup bunlarla ilgili sonular ve yorumlar aada sunulmutur. halde bulunmas

49

4.1. alma Potansiyelinin Belirlenmesi

ekil 4.2. Polianilin-Polipirol kapl film elektrodun farkl alma potansiyellerinde duyarllnn belirlenmesi ekil 4.2 da ise Pt/Pani-PPy elektroda ait potansiyel almas grlmektedir. 0,20,7 V arasnda sabit hidrojen peroksit deriiminde 6 farkl potansiyelde akm iddetleri llm ve potansiyele kar akm iddeti grafie geirilmitir. Grafik incelendiinde dk potansiyellerde akm iddetinin dk olduu ve potansiyel arttka len akm iddeti deerlerinin art grlmektedir. En yksek akm deerinin lld 0,7 V bundan sonraki almalarda en iyi alma potansiyeli olarak belirlendi.

50

4.2. evrim saysnn belirlenmesi

ekil 4.3. 1.10-7 M sabit hidrojen peroksit deriimde polipirol elektrodun evrim saysna kar duyarll ekil 4.3de polipirol film elektrodun 0,7 V ve 1.10-7 M sabit hidrojen peroksit deriimde evrim saysyla akm iddetindeki deiim incelenmektedir. ekilden grld gibi dk evrim saylarnda akmlarn yksek olduu ve evrim says arttka akm iddetinin dt grlmektedir. En yksek akm iddetinin lld 5 evrim optimum evrim says olarak belirlendi.

51

ekil 4.4. 1.10-4 M Sabit hidrojen peroksit deriimde polianilin elektrodun evrim saysna kar duyarll ekil 4.4de polianilin film elektrodun 0,7 V ve 1.10-4 M sabit hidrojen peroksit deriimde evrim saysyla akm iddetindeki deiim incelenmektedir. ekilden grld gibi dk evrim saylarnda akmlarn yksek olduu ve evrim says arttka akm iddetinin dt grlmektedir. En yksek akm iddetinin lld 10 evrim optimum evrim says olarak belirlendi.

52

ekil 4.5. 16-16 evrimde Pt/PPy-Pani elektrodun hidrojen peroksit deriimine kar duyarll

ekil 4.6. 16-16 evrimde Pt/ Pani- PPy elektrodun hidrojen peroksit deriimine kar duyarll

53

ppy

pani

ekil 4.7. 16-16 Sabit evrimde polipirol-polianilin film elektrotun farkl hidrojen peroksit deriimlere kar duyarll ekil 4.6 ve ekil 4.7 incelendiinde ayn evrim saysnda kaplanm olan Pt/ PaniPPy elektrodunun Pt/PPy-Pani elektroduna gre ayn hidrojen peroksit deriiminde daha yksek akm iddetine sahip olduu grlmektedir. Bu yzden bundan sonraki almalarda evrim says olarak 16 polipirol ve 16 polianilinin kullanld ve polipiroln stte olduu elektrodun kullanlmasna karar verildi. Bunun sebebi olarak polianilinin kaplama potansiyelinin 1,0 V dan daha yksek olmas ve dolaysyla bizim kaplama potansiyelimizde [0,7 V] filmin bozulmasdr.

4.3. Pt/Polianilin-Polipirol filminin SEM fotoraf Blm 3.3 e gre hazrlanan Pt/Polianilin-Polipirol filminin ekil 4.8 de verilen SEM fotorafnda, karnabahar yaplar grlmektedir. Bu yap yzeyin polipirolle kaplandn gstermektedir.

54

ekil 4.8. Pt/Polianilin-Polipirol filminin SEM fotoraf 4.3.1. Pt/Polipirol-Polianilin Filminin SEM Fotoraf Blm 3.3 a gre hazrlanan Pt/Polipirol-polianilin filminin SEM fotoraf ekil 4.9. de grlmektedir. ekil 4.8 de Pt/ Polianilin-Polipirol filmi incelendiinde karnabahar yaplar grlmektedir. ekil 4.9 incelendiinde ise karnabahar yaplarrnn belli bir dzeyde bozulduu ve bunun ise polianilinden kaynakland sylenebilir. Litaratrde de bu yapy destekleyen almalar mevcutur [34].

55

ekil 4.9. Pt/Polipirol-Polianilin filminin SEM fotoraf

4.4. Kolesterol Biyosensrnn alma artlar ile lgili Sonular 4.4.1.Farkl elektrotlara enzim immobilizasyonu ile aktivite deiiminin incelenmesi Bu almada filmin yapsn oluturan polimerler tek tek ve birlikte elektrot yzeyine kaplanarak enzim immobilizasyonu gerekletirildi. Bunun iin polipirol zerine enzim, polianilin zerine enzim, polipirol-polianilin film zerine ve polianilin-polipirol zerine enzim immobilize edilerek akmdaki incelendi. deiimler

56

ekil 4.10. Polipirol film elektroda enzim immobilizasyonuyla aktivitenin incelenmesi lk olarak polipirol ile kaplanm film zerine enzim immobilizasyonu

gerekletirildi ve akm deiimleri incelendi. Deriim arttka akm deerlerinin artt grld ( ekil 4.10).

ekil

4.11.Polianilin film elektroda incelenmesi

enzim immobilizasyonuyla

aktivitenin

57

kinci olarak polianilin ile kaplanm filme enzim immobilizasyonu gerekletirildi ve akm deiimleri incelendi (ekil 4.11.). Deriim arttka akm deerlerinin artt grld. Ancak bir nceki polipirol film zerine yaplan immobilizasyonla karlatrldnda polipirolle kapl filme ait akm deerlerinin daha yksek olduu grld.

ekil 4.12. Polianilin-Polipirol film elektroda enzim immobilizasyonuyla aktivitenin incelenmesi Daha sonra polianilin-polipirol ile kaplanm filme enzim immobilizasyonu gerekletirildi ve akm deiimleri incelendi. Deriim arttka akm deerlerinin yine artt grld (ekil 4.12).

58

ekil 4.13. Polipirol-Polianilin film elektroda enzim immobilizasyonuyla aktivitenin incelenmesi Son olarak polipirol-polianilin ile kaplanm filme enzim immobilizasyonu gerekletirildi ve akm deiimleri incelendi. Deriim arttka tek bana polipirol veya polianilin varlndaki kadar bir art grld (ekil 4.13). Polipirol-polianilin film ile Polianilin-polipirol film karlatrldnda Polianilin-polipirol filme enzim immobilize edildiinde daha yksek akm deerlerinin gzlendii ve dolaysyla bu filme ait aktivite deerlerinin daha yksek olduu grld. Bu nedenle bundan sonraki almalarda film olarak Polianilin-Polipirol film elektrot seildi. 4.4.2. Pt/Polipirol- polianilin-enzim-glutaraldehit-albumin filminin fotoraf Blm 3.6 a hazrlanan Pt/Polipirol- Polianilin-enzim- filminin SEM fotoraf ekil 4.14de grlmektedir. Bu fotoraf bir nceki Pt/Polipirol-Polianilin kaynakland sylenebilir. Bu yap literatrlerle uyum halindedir [34]. filmi ile karlatrldnda polianilin yapsnn deitii ve bunun kolesterol oksidazdan

59

ekil 4.14. Pt/Polipirol-Polianilin-Enzim-Glutaraldehit-Albumin filminin SEM fotoraf

4.4.3. pH nn etkisi

ekil 4.15. Biyosensrn aktivitesine pH nn etkisi

60

Blm 3.6a gre hazrlanan biyosensr ile yaplan deneyler sonunda (0,7 V) elde edilen amperometrik cevap akmlar pH ya kar grafie geirilerek ekil 4.15 de verildi. ekil incelendiinde dk pH deerlerinde llen amperometrik cevap akmnn kk olduu, pH deerleri bydke amperometrik cevap akmnn byd grlmektedir. Cevap akmndaki bu art optimum pH deerine yaklatka beklenen bir durumdur. Grafik incelendiinde maksimum cevap akm pH 7,0de gzlenmitir. Literatrler de ise deiik destek materyallere immobilize edilmi kolesterol oksidaz iin pH deerleri 7,4; 7,0; 6,5; 7,25 olarak bulunmutur (34-36). Bulunan bu deer literatr verileri ile uyumaktadr. 7,0den sonraki pH deerlerinde cevap akm tekrar azalmaya balamtr. Enzim ve substrat molekllerinde asidik ve bazik gruplar olduundan (E-S) aktiflemi kompleksinin en kolay bir ekilde olumas, yani hznn maksimum olmas iin bu gruplarn belirli bir iyonlama durumunda olmas gereklidir. Bunun dndaki iyonlamalarda (E-S) kompleksinin oluumu zorlaacak ve tepkime hz deceinden akmlardaki azalma beklenen bir durumdur [37].

4.4.4. Scakln etkisi

ekil 4.16. Biyosensrn aktivitesine scakln etki

61

Blm 3.6a gre hazrlanan biyosensr ile yaplan deneyler sonunda elde edilen amperometrik cevap akmlar (0,7 V ve pH=7) scakla kar grafie geirilerek ekil 4.16 da verildi. ekil 4.16. incelendiinde dk scaklk deerlerinde enzimin dk aktivite gsterdii ve amperometrik cevap akmlarnn scaklk arttka artt grlmektedir. Maksimum cevap akmnn 60 C da olduu gzlenmitir. 60 Cdan sonra enzimin aktivitesinin dt grlmektedir. Aktivitede ki bu dlerin enzimin protein yapsnn ve yksek scaklklarda denatre olmas ve bundan aktif merkezin ve enzim aktif merkezindeki koenzimin etkilenmesinden ileri geldii sylenebilir. Ancak maksimum cevap akmnn gzlendii 60 C olduka yksek bir scaklktr. Literatrlerde de deiik destek materyallere immobilize edilmi kolesterol oksidaz iin 49; 40; 40; C gibi scaklklar bulunmutur (34,35,36). alma koullarnn kolay olmasn salamak, rutin analizlerde daha kolay uygulanabilir olmas ve uzun inkbasyon srelerinde yksek scaklklarda enzim aktivitesinin azalmasndan dolay bundan sonraki almalarda oda scakl olan 25C seildi. 4.4.5. Substrat deriiminin etkisi

ekil 4.17. Biyosensrn aktivitesi zerine kolesterol deriiminin etkisi [MichealisMenten grafii, pH=7 ve 25C]

62

ekil 4.18. Biyosensrn aktivitesi zerine kolesterol deriiminin etkisini gsteren Lineweaver-Burke grafii

ekil 4.19. Kolesterol biyosensr iin kalibrasyon grafii

63

Blm 3.6 a gre yaplan deneyler sonunda elde edilen sonulardan, kolesterol deriimine kar amperometrik cevap akmlar [pH=7 ve 25C] grafie geirilerek ekil 4.17. de verildi. ekil 4.17. incelendiinde akmlarn belli bir deriime kadar dorusal olarak artt ve bu deriimden sonra dorusallktan sapt sylenebilir. 1.10-6-5.10-5 M aralnda dorusal blge olduu, bu blgenin dorusallnn iyi olduu [R2=0,996] ve kolesteroln kantitatif tayini iin kullanlabilecei sylenebilir [ekil 4.19 pH=7 ve 25C]. Daha sonra 1/[S] deerlerine kar 1/V deerleri grafie geirilerek Lineweaver-Burk grafii izildi. Kolesterol oksidaz enzimi iin spesifik olan Km ve Vmaks deerlerini bulmak iin Blm 3.6. a gre yaplan deneyler sonunda izilen grafiklerden ekil 4.18. [pH=7 ve 25C] kullanlarak gzlenen Km deeri 3,3 mM Vmaks ise 5,26 mM/dakika olarak hesap edildi. Literatrlerde deiik destek materyallere immobilize edilmi farkl kaynaklardan saflatrlm kolesterol oksidaz enzimi iin Km deerleri 0,41; 2,72; 9,8; mM [38,39,35] Vmaks ise 0,908; 1,495 mM/dakika [40,41] olarak bulunmutur.

4.4.6. Biyosensrn tekrar kullanlabilirlii

ekil 4.20. Biyosensrn tekrar kullanlabilirliinin incelenmesi Blm 3.6 a gre yaplan deneyler sonunda elde edilen amperometrik cevap akmlar lme saysna kar grafie geirilerek ekil 4.20. da(pH=7 ve 25C)

64

verildi. ekil 4.20 incelendiinde lme says arttka akmlarda azalma olduu grlmektedir. Akmlardaki bu dmelerin zamanla enzim aktivitesindeki deimeden kaynakland sylenebilir. Biyosensrn 30 lme sonunda balang aktivitesinin yaklak % 82sini koruduu grlmektedir. Biyosensrn zamanla aktivitesinin ok fazla deimemesi kullanlan immobilizasyon tekniinin iyi olduunu gstermektedir. Tekrarlanabilirlik biyosensr iin ok nemli olup hazrlanan biyosensrle arka arkaya fazla sayda analiz yapabileceimizi gstermektedir. Rutin analizlerde tek lmede kullanlan kitler maliyet asndan pahal olduu iin bu ekilde hazrlanan bir biyosensr daha avantajldr. Bulunan sonu literatr deerleri ile karlatrldnda hazrlanan biyosensrn tekrar kullanlabilirliinin olduka iyi olduu sylenebilir [40,42].

4.4.7. Biyosensrn raf mr

ekil 4.21. Biyosensrn raf mrnn belirlenmesi Blm 3.6 ya gre yaplan deneyler sonunda elde edilen amperometrik cevap akmlar gne kar grafie geirilerek ekil 4.21 de (pH=7 ve 25C) verildi. ekil incelendiinde ilk onbir gn boyunca alnan 5 lm sonunda ayn cevap akm gzlenirken 11.gnden sonra akmn biraz dt akmn biraz dt, 11.gnden

65

15.gne kadar alnan 3 lm iin ayn akm deerinin lld ve 20.gnden sonra 23.gne kadar alnan tek lmde yine akmn bir miktar dt grld. Bu ise biyosensrn 23 gn sonunda balang aktivitesinin yaklak % 60 n koruduunu gstermektedir. Ancak 11. gne kadar akmlardaki azalmann ok fazla olmad ve balang aktivitesini koruduu grlmektedir. Ayrca enzimin aktif merkezinde scakln, havann ve baz kimyasal maddelerin etkisi ile deiiklikler meydana gelmesi ya da aktif merkezdeki gruplarn evresindeki dier gruplarla etkilemesi sonucu biyosensrn aktivitesinde zamanla meydana gelen azalma beklenen bir sonutur. Biyosensrn raf mrnn uzun olmas kullanlan immobilizasyon ynteminin iyi olduunu gstermektedir. Bulunan sonucun literatr deerleri ile karlatrldnda olduka iyi olduu sylenebilir [43,44]. 4.4.8. Cevap sresi

ekil 4.22. Biyosensrn cevap sresi Blm 3.6 ya gre yaplan deneyler sonunda elde edilen amperometrik cevap akmlar zamana kar grafie geirilerek ekil 4.22 de verildi. llen amperometrik cevap akmlarna kar izilen zaman grafiinden (ekil 4.22.) akm deiimlerinin sabit kald 300 s lik sre cevap sresi olarak belirlendi. Genelde

66

biyosensrler iin cevap sresinin 5 dakikay gememesi istenir [29]. Bulunan sonu bu deere yakn bir deerdir. 4.4.9. Biyolojik svda (kanda) kolesterol tayini Biyolojik svlarda yaplan kolesterol analizi sonunda llen amperometrik cevap akmlarna kar gelen deriim deerleri kalibrasyon grafii kullanlarak hesapland ve izelge 4.1 verildi. Bulunan sonular, enzimatik kit kullanlarak spektrofotometrik olarak llen hastane sonular ile kyaslandnda yaklak olarak % 30 a yakn nemli bir fark olduu gzlendi. Biyokimyasal lmelerde %20 ye kadar olan farkllklar normal kabul edilebilir. Ancak burada farkn % 30 kmasnn nedeni deneysel hatalar olabilecei gibi hastanede bulunan sonulardan da kaynaklanabilecei dnlebilir. nk hastanede kullanlan cihazn kalibrasyonunun tam yaplamam olmas byle bir sonucu dourabilir. izelge 4.1. Kan numunelerinde hesaplanan kolesterol ierii Kan numunesi Sonu [mg/100mL] Enzimatik kit kullanlarak spektrofotometrik olarak llen hastane sonucu [mg/100mL] 218 157 153 119 112

1 2 3 4 5

160 110 105 78 76

4 3 2 2 1

4.4.10. Farkl yntemlerle bulunan kolesteroln( Kanda) karlatrlmas Hazrlanan biyosensrle ekil 4.19. daki kalibrasyon grafii kullanlarak bulunan kolesterol deerleri, kit kullanlarak spektrofotometrik yntemle bulunan kolesterol deerlerine karlk grafie geirilerek ekil 4.23 de verilmitir. ekil 4.23 incelendiinde dorunun eiminin bire yakn olmas kolesterol biyosensr ile elde

67

edilen sonularn kit kullanlarak spektrofotometrik yntemle elde edilen sonularla uyumlu olduunu gstermektedir. Bu ise hazrlanan biyosensrle kan serumunun bozucu etkisi olmakszn serumda kolesterol tayini yaplabileceini gstermektedir.

ekil 4.23. Kanda kolesterol tayininde yntemlerin uyumluluu Sonu olarak; bu almada hazrladmz kolesterol biyosensrnn; - Dorusal alma aral olduka genitir [1.10-6 M-5.10-5M]. - Tekrar kullanlabilirlii yksektir [30 lme sonunda biyosensrn aktivitesini %82 orannda koruduu grlmtr]. - Raf mr uzundur [ 23 gn ve 9 lm sonunda balang amperometrik cevabnn yaklak % 60 n korumaktadr]. - Hazrlanan biyosensr iin cevap sresi 300 s olarak bulunmutur. Bu sre literatrde verilen deerlerle karlatrldnda normal bir sredir. - Polipirol-polianilin filmle yaplan biyosensrdeki immobilize enzime ait gzlenen Km deeri 3,3 mM ve Vmaks deeri ise 5,26 mM/dakika bulunmutur. - Hazrlanan biyosensr ile biyolojik svda [kanda] birden fazla numunede kolesterol tayini yaplabilmekte ve bu da rutin analizlerde kullanlan ve fazla maliyet getiren tek kullanmlk kitlerin yerine hazrlanan biyosensrn kullanlabileceini gstermektedir.

68

- Literatrlerde kolesterol oksidaz enziminin deiik filmlere immobilizasyonu ile hazrlanm biyosensrler mevcuttur. Yine polipirol film zerine kolesterol oksidaz enziminin immobilizasyonu ile hazrlanm biyosensrler mevcuttur. Ancak polianilin-polipirol film zerine kolesterol oksidazn immobilizasyonu ile ilgili bir almaya rastlanmamtr. Bu yzden almada kullanlan film orijinal olduu iin hazrlanan biyosensr orjinaldir.

69

KAYNAKLAR 1. Bailey, J., E. and Ollis, F., D., Biochemical Engineering Fundementals 2nd ed., McGraw Hill International Editions, 984 (1986). 2. Geminos, G. and Greenfield, P.F., An enzymatic technique for the detection of dextran in cane juice and prediction of viscosity ncreases, International Sugar Journal, 80:227-231 (1978). 3. Zaborsky. O., Immobilized Enzyme, CRC Pres, Ohio, 1-3 (1973). 4. Kutay, F., Enzimler, nsan Biyokimyas, Onat T., Emerk K., Szmen E.Y., Palme Yaynclk, Ankara, 197-202 (2002). 5. Wiseman, A., Handbook of Enzyme Biotechnology, 2nd ed., John Wiley&Sons Chicester, ngiltere, 12 (1986). 6. Telefoncu A., mmobilize Enzimler ve mmobilizasyon Yntemleri,Temel ve Uygulamal Enzimoloji Biyokimya Lisans st Yaz Okulu, zmir, 1-16, 193-249, (1986). 7. Fennema, O.R., Food Chemistry,2nd ed., Macel Dekker Inc., New York, 994 (1985). 8. Lehninger, A., L., Biochemistry, 2nd ed., Worth Publishers, New York, 1103 (1979). 9. Fujishiro, K., Uchida, H., Shimokawa, K., Nakano, M., Sano, F., Ohta, T., Kayahara, N., Aisaka, K., Uwajima, T., Purification and propperties on a new brevibacterium sterolicum cholesterol oxidase produce by e.coli mm294/pnh10, FEMS Microbiology Letters, 215:243-248 (2002). 10. Yin, Y., Liu, P., Anderson, G.W.R. and Sompson, S., N., Construction of a catalytical inactive cholesterol oxidase mutant:inversigation of the interplay between active side-residues glutamate 361 and histidine 447, Archives of Biochemistry and Biophysics, 402:235-242 (2002). 11. Akgl, S., Bayramolu, G., Kacar, Y., Denizli, A., Arca, M.Y., Poly(hdyroxyethyl methacrylate-co-glycidly methacylate) reactive membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation, Polymer International, 51:13161322 (2002). 12. Nishiya, Y., Hirayama, N., Alteration of substrate affinity of streptomyces cholesterol oxidase application to the rate assay of cholesterol serum, Clinica Chimica Acta, 287:111-122 (1999).

70

13. Lario, I.P., Sampson, N. and Verielink, A., Sub-atomic resolution crystal structure of cholesterol oxidase:what atomic resolution crytallography reveals about enzyme mechanism and the role of the fad cofactor in redoks activity, Journal Molecular Bio., 326:1635-1650 (2003). 14. Singh, S., Chaubey, A., Malhotra, B.D., Amperometric cholesterol biosensor based on immobilized cholesterol esterase and cholesterol oxidase on conduction polypyrrole films, Analytica Chimica Acta, 502:229-234 (2004). 15. Isobe, K., Shoji, K., Nakansh, Y., Yokoe, M. and Wakao, N., purification and some properties of cholesterol oxidase stable in detergents frod -probacterium Y134, Journal of Biosicience and Bioengineering, 95 (3): 257-263 (2003). 16. Coulombe, R., Yue, K., Q., Ghisla, S. and Vrielink, A., Oxygen access to the active side of cholesterol oxidase through a narrow channel s gated by an arg-glu pair, The Journal Of Biological Chemistry, 276 (32): 30435-30441 (2001). 17. Suman, Pundir, C.S., Co-immobilization of cholesterol esterase, cholesterol oxidase and peroxidase onto alcylamine glass beads for measurement of total cholesterol in serum, Current Applied Physics, 3:129-133 (2003). 18. MacLachlan, J., Wotherspoon, A.T.L., Ansell, R.O., Brooks, C.J.W., Cholesterol oxidase:sources, physical properties and analytical applications, Journal of Steroid Biochemistry&Molecular Biology, 72:69-195 (2000). 19. Bokoch, M.P., Devadoss, A., Palencsar, M.S., Burgess, J.D., Steady-state oxidation of cholesterol catalyzed by cholesterol oxidase in lipid bilayer membranes on platinum electrodes, Analytice Chimica Acta, 519:47-55 (2004). 20. Wang, H., Mu, S., Bioelectrochemical characteristics of cholesterol immobilized in a polyaniline film, Sensor and Actuators B, 56:22-30 (1999). 21. Raghavan, V., Ramanathan, K., Sundaram, P.V., Danielsson, B., An enzyme thermistor-based assay for total and free cholesterol, Clinica Chimica Acta, 289:145-158 (1999). 22. Shen, Z., Corbin, D.R., Greenplate, T.J., Grebenok, R.J., Galbraith, D.W. and Purcell, J.P., Studies on the mode of action of cholesterol oxidase on nsect midgut membranes, Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 34:429-442 (1997). 23. Bongiovanni, C., Feri, T., Poscia, A., Varalli, M., Santucci, R., Desideri, A., An electrochemical multienzymatic biosensor for determination of cholesterol, Bioelectrochemistry, 54:17-22 (2001). 24. Tahran, L. and Uslan, A., Characterization and operational stability of immobilised catalase, Process Biochemistry,14:345-373 (1990).

71

25. Telefoncu A., Biyosensrlere genel bak , Biyosensrler, Biyokimya Lisans st Yazokulu, Kuadas, 1-9 (1999). 26. Akbulut U., letken polimerlerle transduser hazrlanmas , Biyosensrler, Telefoncu A, Biyokimya Lisans st Yazokulu, , Kuadas, 10-16 (1999). 27. Bejan, D., Duca, A., Voltammetry of Aniline with Different Electrodes and Electrolytes Croatica Chemica Acta, 71 (3) 745756 (1998) 28. Telefoncu A., Biyoreseptr immobilizasyonu , Biyosensrler, Biyokimya Lisans st Yazokulu, Kuadas, 42-61 (1999). 29. Dinkaya, E., Enzim sensrleri , Biyosensrler, Telefoncu A, Biyokimya Lisans st Yazokulu, Kuadas, 81-139 (1999). 30. Qiong C., Tuzhi P., Liju., Silk fibroin/cellulose asetate membrane electrodes incorporating xanthine oxidase for the determination or fish freshness ,Analytica Chimica Acta., 369: 245-251(1998). 31. Hoshi, T., Saiki, H. and Anzai, J., Amperometric uric acid sensors based on polyelectrolyte multilater films , Talanta., 61: 363-368 (2003). 32. Kuwabata, S., Nakaminami, T., Ito, S. and Yoneyama, H., Preparation and properties of amperometric uric acid sensors, Sensors and Actuators., B52: 72-77 (1998). 33. Suzuki M., Takayanagi T., Yashiro T., Use of the o-Phenilendiamine fluorescence system in the enzymatic assay of serum uric acid, Chem.Pharm.Bull. 39: 2745-2747 (1991). 34. Chetna D., S.P. Singh., Sunil K. Arya., Monika Datta.,B.D. Malhotra., Cholesterol biosensor based on electrophoretically deposited conducting polymer film derived from nano-structured polyaniline colloidal suspension Analytica chimica acta 6 0 2 :244251( 2 0 0 7 ) 35. Singh, S., Chaubey, A., Malhotra, B.D.Amperometric cholesterol biosensor based on immobilized cholesterolesterase and cholesterol oxidase on Conducting polypyrrole films Analytica Chimica Acta 502:229234 (2004). 36. Brahim, S., Narinesingh D., Guiseppi-E.A., Amperometric determination of cholesterol in serum using a biosensor of cholesterol oxidase contained within a polypyrrolehydrogel membraneAnalytica Chimica Acta, 448: 27-36 (2001). 37. Tzn, C., Enzimler ve enzim kinetii , Biyokimya, Palme Yaynclk, Ankara, 124-150 (1992).

72

38. Xuecai Tan, Minjian Li, Peixiang Cai, Lijun Luo and Xiaoyong Zou An amperometric cholesterol biosensor based on multiwalled carbon nanotubes and organically modified sol-gel/chitosan hybrid composite film Analytical Biochemistry, 337: 111-120 (2005). 39. Wang, H., Mu, S., Bioelectrochemical characteristics of cholesterol oxidase immobilized in a polyaniline filmSensors and Actuators B: Chemical, 56:22-30 (1999). 40. Vidal J.C., Garcia ., Castillo J.R. Development of a platinized and ferrocenemediated cholesterol amperometric biosensor based on electropolymerization of polypyrrole in a flow system Analytical Sciences, 18:537-542 (2002). 41. Wang, H., Mu, S., Bioelectrochemical characteristics of cholesterol immobilized in a polyaniline film, Sensor and Actuators B, 56:22-30 (1999). 42. Vidal J.C. , Garcia E., Espulas C., Aremandia T., Castillo J.R. Comparison of biosensors based on entrapment of cholesterol oxidase and cholesterol esterase in electropolymerized films of polypyrrole and diaminonaphthalene derivatives for amperometric determination of cholesterol Analytical and Bioanalyticalchemistry,377:273-280 (2003). 43. Singh, S., Chaubey, A., Malhotra, B.D., Amperometric cholesterol biosensor based on immobilized cholesterol esterase and cholesterol oxidase on conduction polypyrrole films, Analytica Chimica Acta, 502:229-234 (2004). 44. Kumar, H., Kumar, A., Kumari, P., Jyotimai, S., Tulsani, N., B., Immobilization of cholesterol oxidase on formar using organic solvents, Biotechnology Application Biochemistry, 30:231-233 (1999).

73

ZGEM Kiisel Bilgiler Soyad, ad Uyruu Doum tarihi ve yeri Medeni hali Telefon Faks e-mail Eitim Derece Yksek lisans Lisans Lise Deneyimi Yl 1994-2006 2006 Yabanc Dil 1.ngilizce 2. Arapa Yaynlar 1. Muhammet S, Hasdemir E, Tuzen M, et al., Lead levels in plant and soil samples collected from the vicinity of Ankara-Istanbul , Volume: 12 highway, Turkey , fresenius environmental bulletin 731 Published: 2003 Hobiler Tenis, Bilgisayar teknolojileri Issue: 7 Pages: 728-

: MUHAMMET, Sinan Mithat : T.C. : 06.12.1965 Erbil : Evli : 0 (312) 2126768 : 0 (312) 2126768 : mithat@gazi.edu.tr

Eitim Birimi Gazi niversitesi /Kimya Blm Alnidal Lisesi

Mezuniyet tarihi 2000 1988 1984

Selahattin niversitesi/ Kimya Blm

Yer Gazi niversitesi Gazi niversitesi

Grev Aratrma Grevlisi retim Grevlisi