PRCTICA N 15

ACTIVIDAD ENZIMATICA EN TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES I. OBJETIVO(S): Estudiar el efecto de una enzima presente en tejidos animales y vegetales. Comparar la accin de la peroxidasa (catalizador presente en tejidos orgnicos) y del MnO2 (catalizador inorgnico) sobre un mismo sustrato (agua oxigenada) Estudiar el efecto de la temperatura en la intensidad de la reaccin Medir la actividad cataltica por medio del desprendimiento de burbujas y la produccin de calor.

I. MARCO TERICO: Las enzimas son protenas especficas que actan como catalizadores de las reacciones bioqumicas de todos los seres vivos. La actividad enzimtica puede comprobarse experimentalmente mediante la identificacin y cuantificacin de los productos formados de la reaccin que ellas regulan. La actividad celular depende completamente de que en la clula ocurran una serie de reacciones qumicas de naturaleza compleja. Las molculas de los compuestos no reaccionan unas con otras a menos que sean activadas de alguna manera. Una forma de activar las molculas es aplicando calor. El cambio en temperatura hace que unas molculas aumenten su movilidad, choquen con otras y reaccionen entre s. La energa que se requiere para provocar esa activacin se conoce como energa de activacin (Ea). En los sistemas biolgicos, es imposible calentar a temperaturas muy altas, por lo que dichos sistemas dependen de las enzimas. Las enzimas son generalmente protenas cuya funcin es reducir la energa de activacin en los sistemas biolgicos, por lo que se dice que son catalizadores orgnicos. Para que ocurra una reaccin enzimtica, es necesario que estn presentes la enzima y el sustrato, que es la sustancia que reacciona con la enzima para formar productos finales. Bajo condiciones especficas, las enzimas acomodan el sustrato, formando un complejo enzima-sustrato. La reaccin entre la enzima y el sustrato ocurre en un lugar especfico de la enzima, que se conoce como el sitio activo. Cuando el sustrato es el adecuado para la enzima se dice que hay afinidad entre la enzima y el sustrato. Las enzimas de por s no resultan afectadas por mucho tiempo durante la reaccin. Intervienen por el tiempo necesario, luego del cual el complejo enzima-sustrato se disocia, generndose los productos y la enzima nuevamente. La enzima est entonces lista para ser reutilizada en otra reaccin.

Las enzimas funcionan generalmente bajo condiciones especficas y controladas. Tanto el pH, como la temperatura deben mantenerse en condiciones ptimas para que la enzima pueda funcionar adecuadamente. Los cambios extremos en cualquiera de esos dos parmetros pueden resultar en la desnaturalizacin de la enzima. El proceso de desnaturalizacin puede resultar en cambios reversibles o irreversibles en la estructura qumica de la enzima. Esos cambios alteran la estructura del sitio activo y se dice que la enzima est inactiva. Otros factores que pueden afectar la actividad de una enzima son la concentracin de sustrato, la concentracin de producto y la presencia de inhibidores. En esta prctica se disean experimentos utilizando un catalizador inorgnico (MnO2) y otro orgnico (peroxidasa); esta ltima, se encuentra tanto en tejidos animales como vegetales y acta sobre el perxido de hidrogeno o agua oxigenada (H2O2). El perxido es un producto de la actividad celular y el acumularse en exceso intoxica la clula por lo cual debe ser degradado por una enzima especfica. La reaccin en la cual interviene la peroxidasa se presenta de la siguiente manera:

2 H2O2 2 H2O + O2
Esta reaccin puede visualizarse por la formacin de burbujas, las cuales se producen debido al desprendimiento de oxgeno. La cantidad de burbujas en una medida cualitativa proporcional a la intensidad de reaccin y puede utilizarse para evaluar la dinmica de la reaccin. II. MATERIA PRIMA, EQUIPOS Y REACTIVOS: I. Hgado de res Papa blanca Agua destilada Agua oxigenada de 30 volmenes Dixido de manganeso Balanza analtica ( 0,0001 g) Pipetas de 2 cc Tubos de ensayo Gradilla Licuadora Tabla de picar y cuchillo Placas petri Esptula Bao de agua caliente Balanza analtica Cronometro Soporte universal Termmetro

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Accin de un catalizador inorgnico sobre el H2O2: Marque cuatro tubos de ensayo con los nmeros 1, 2,3, 4 agregue a cada tubo lo que pueda tomar con la punta de una esptula dixido de manganeso (procure que las cantidades sean constantes para todos los tubos) y proceda de la siguiente manera:

 tubo 1+ MnO2 +2 ml H2O2. Observar la reaccin Como podemos observar al agregar agua oxigenada hubo un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxgeno.

tubo 2+ MnO2 bao mara x 10 mn. + 2 ml H2O2. Observar la reaccin como podemos observar aqu la temperatura no influye tanto en el desprendimiento de oxgeno.

 tubo 3+ MnO2 bao en hielo x 10 mn. + 2 ml H2O2. Observar la reaccin una vez al ser sometida al hielo y al agregarle agua oxigenada la reaccin resulta ser la misma q la anterior en cual podemos decir que todo catalizador inorgnico ,la variacin de temperatura no afecta la actividad enzimtica en la cual el agua oxigenada se transformara en agua y oxgeno.

tubo 4+ MnO2 + 4 ml H2O2. Observar la reaccin Aqu la reaccin es ms intensa debido a que se agreg ms agua oxigenada.

 Accin de un catalizador de origen vegetal sobre el H2O2: Marque cuatro tubos de ensayo con los nmeros 1, 2, 3, 4 agregue a los tubos 1, 2,3 un pedazo de papa (procure que las cantidades sean constantes para todos los tubos); Para el tubo 4, realice un licuado de papa y agregue al tubo una cantidad similar al de los tubos anteriores, luego proceda de la siguiente manera:

tubo 1+ trozos de papa +2 ml H2O2. Observar la reaccin tubo 2+ trozos de papa mara x 10 mn. + 2 ml H2O2. Observar la reaccin tubo 3+ trozos de papa en hielo x 10 mn. + 2 ml H2O2. Observar la reaccin tubo 4+ licuado de papa + 2 ml H2O2. Observar la reaccin En este experimento como podemos observar aqu si influye de manera considerable la variacin de temperatura , en la cual en el tubo 1 y 4 si hubo reaccin con el agua oxigenada en la cual hubo un

burbujeo intenso debido al desprendimiento de oxgeno. Ms aun en el tubo 4 ya que fue licuado hubo ms reaccin. En cambio en el tubo 2 y 3 al disminuir y aumentar su temperatura afecto considerablemente la reaccin por poseer un catalizador organico al inactivar la actividad enzimtica.

Medicin de la accin de una enzima en trminos de la produccin de calor: Haga el montaje de tal manera que pueda proceder como se indica a continuacin: Coloque un tubo de ensayo en una gradilla y adicione una cantidad constante de muestra homogenizada (papa e hgado, un tubo para cada muestra), inserte en cada tubo un termmetro con la escala de tal forma que pueda leer los valores (el termmetro debe dejarse descansar libremente). Tome la temperatura inicial. Posteriormente Muestra con papa proceda de la siguiente Tiempo en seg. Temperatura manera: C 0 20 30 22 60 24 90 25

Aqu en esta experimentacin podemos observar q la accin de un enzima aumenta con la temperatura.

I. DISCUSIN DE RESULTADOS Segn nuestras observaciones la muestra que reaccion ms rpido en el sentido de la liberacin de espuma y calor que se obtena por entrar en contacto con el H2O2 descomponindola a la vez en H2O y O2 fue la muestra del dixido de manganeso , por poseer un catalizador organico ,seguidos por las muestras de papa en la cual hubo resultado en los q no fueron sometidos a variacin de temperatura. Este catalizador llamado enzima es una protena. La enzima catalasa que se encuentra en los tejidos de las clulas animales y vegetales, acelera la reaccin de descomposicin del H2O2. Los Perxidos de Hidrgeno son los productos de oxidacin de muchas de las reacciones que ocurren en nuestro cuerpo y dems seres vivos, estos son txicos. Por lo tanto, deben ser eliminados rpidamente, y es ah donde acta la enzima catalasa, donde pudimos observar claramente en las distintas muestras. Debido a la accin de la enzima catalasa, el agua oxigenada o perxido de hidrgeno agregado se transformar en agua y oxgeno. El desprendimiento de oxgeno se pone de manifiesto como un intenso burbujeo.

I. CONCLUSIONES Al plantear una hiptesis y ponerla a prueba por medio de la experimentacin, hemos podido concluir que todas las clulas vivas, ya sean clulas que conformen tejidos animales o vegetales, cuentan con catalizadores especficos, denominados enzimas, los cuales sirven para ayudar a acelerar la velocidad de los procesos metablicos, como los son la obtencin de energa y la obtencin de los componentes necesarios para la supervivencia de estas clulas. Todos estos procesos se llevan a cabo a travs de un gran nmero de reacciones qumicas que transcurren de forma constante y ordenada. Adems, como cualquier catalizador las enzimas recuperan su estado inicial despus de cada ciclo cataltico. Tambin podemos concluir que las reacciones de las enzimas pueden ser afectadas en su funcin, tanto por factores de temperatura denominado el proceso de desnaturalizacin y cuando las clulas han dejado de ser orgnicas, es decir, que forman parte de la materia muerta o se les considera clulas muertas, en las cuales todas sus reacciones qumicas y metablicas ya no responden a ninguna reaccin ni proceso. Esto se pudo comprobar haciendo experimentos adicionales que nos aclararon las dudas, adems de la informacin recopilada que pudo hacer valer nuestra hiptesis.

I. CUESTIONARIO: 1. Cul es la funcin de un catalizador sobre la velocidad de reaccin? El catalizador funciona proporcionando un camino de reaccin alternativo al producto de reaccin. La velocidad de la reaccin aumenta a medida que esta ruta alternativa tiene una menor energa de activacin que la ruta de reaccin no mediada por el catalizador. La dismutacin del perxido de hidrgeno para dar agua y oxgeno es una reaccin que est fuertemente afectada por los catalizadores: 2 H2O2 2 H2O + O2 Esta reaccin est favorecida, en el sentido de que los productos de reaccin son ms estables que el material de partida, sin embargo, la reaccin no catalizada es lenta. La descomposicin del perxido de hidrgeno es de hecho tan lenta que las soluciones de perxido de hidrgeno estn disponibles comercialmente. Tras la adicin de una pequea cantidad de dixido de manganeso, el perxido de hidrgeno reacciona rpidamente de acuerdo a la ecuacin anterior. Este efecto se ve fcilmente por la efervescencia del oxgeno.4 El dixido de manganeso puede ser recuperado sin cambios, y volver a utilizarse de forma indefinida, y por lo tanto no se consume en la reaccin. En consecuencia, el dixido de manganeso cataliza esta reaccin. 2. Diagrame el mecanismo de accin enzima-sustrato soportado sobre las nuevas teoras existentes? En la elucidacin de los mecanismos de reaccin de las enzimas, y principalmente aquellas que involucran un ion-metlico o metaloenzimas, se requiere conocer: 1) La afinidad de los reactantes, las coenzimas y los cofactores; 2) Las constantes de velocidad para cada paso; 3) Las relaciones geomtricas tridimensionales entre los reactantes, las coenzimas en relacin a los sitios catalticamente importantes de la enzima; y 4) el mecanismo de cada paso, es decir los arreglos atmicos y electrnicos. El mecanismo qumico est determinado por el tipo de rompimiento y formacin de enlaces que lleva a cabo la enzima. Se ha propuesto que las enzimas contienen en sus "centros activos" cidos (AH) o bases (B) de manera que se puede calcular su fuerza cida o bsica. As la pepsina, enzima que cataliza la hidrlisis de ciertos enlaces ppticos en el estmago, tiene un valor de

fuerza cida (pK) de 2.2. El nico grupo orgnico que puede dar este valor es el COOH-. Tambin hay enzimas con caracter bsico como la quimotripsina y la colinesterosa con un pK=7.2. El hecho de que puedan existir esos dos tipos de grupos cidos y bsicos al mismo tiempo es posiblemente la explicacin qumica del efecto tan selectivo observado en la catlisis por enzimas, ya que el ataque simultneo por las dos especies cida y bsica debe traducirse en una mejora muy notable de la velocidad y la selectividad, con un mecanismo que podra llamarse de "estira y afloja". El equivalente en catlisis heterognea podra ser un mecanismo bifuncional (que comprende dos funciones con dos tipos de sitios diferentes), con la salvedad de que en la enzima los dos activos pueden actuar sobre la misma molcula al mismo tiempo y en la heterognea esto no es posible. La complejidad de la estructura de las enzimas se puede comprender al observar la estructura bsica de la carboxipeptidosa A, que es una molcula relativamente simple con un peso molecular de 36 400 (existen enzimas de peso molecular de 600 000), su estructura obtenida por microscopa electrnica se muestra en la figura 4. La enzima es ligeramente elipsoidal de dimensiones 50 X 42 X 38 Angstroms. En esta estructura se pueden ver un enlace azufre-azufre en el extremo derecho, y un tomo de zinc (Zn2+) en el centro, alrededor del cual se sita el "sitio activo". El ion Zn2+es absolutamente esencial para la actividad enzimtica de la carboxipeptidosa A. Sin embargo se puede cambiar ese ion por otros iones metlicos como Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, etc., cambindose tanto la actividad como la selectividad de la enzima. Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas son en general proporcionales a la primera potencia de la concentracin de la enzima (son de primer orden respecto a la enzima). Sin embargo, es frecuente encontrar una dependencia de la concentracin del sustrato (sobre el que acta la enzima), como se muestra en la figura 5. La velocidad vara linealmente con la concentracin de sustrato a concentraciones bajas (primer orden respecto al sustrato) y se hace independiente de la concentracin de ste (orden cero) a concentraciones elevadas. Este tipo de comportamiento fue explicado por Michaelis y Menten en funcin del mecanismo siguiente: 1. Interaccin de la enzima con el substrato (reactivo), para formar un complejo intermediario k1 E+S ES k-1

2. Descomposicin del complejo intermediario para dar los productos y regenerar la enzima k2

ES E+P E es la enzima, S el sustrato, ES un complejo y P es el producto. Aplicando el tratamiento cintico denominado del estado estacionario, en el que se asume que la concentracin del complejo intermediario es constante obtenemos K1[E] S - k_1 [ES] I K2[ES] = 0 Si la concentracin total de la enzima [E]o es igual a la suma de la concentracin en enzima libre [E], ms la concentracin de enzima que forma el complejo [ES]: I [E]o = [E] + [ES] I Introduciendo [E] de la ecuacin II en la ecuacin I, tenemos: K1 ([E]o - [ES]) [S] - (K_1 + K2)[ES] = 0 de donde podemos obtener la concentracin de enzima que est formando el complejo:

Se asume que la etapa determinante de la reaccin es la descomposicin del complejo, entonces la velocidad de la reaccin es v=k2[ES] en donde se substituye [ES]

que rearreglando nos da:

III

donde km =

se denomina constante de Michaelis.

De la ecuacin III se deduce que cuando [S] es suficientemente pequea,

lo que indica primer orden respecto a la concentracin de sustrato. Por el contrario, cuando [S] es mucho mayor que Km, v = k2 [Eo] y la cintica es orden cero respecto al sustrato. En ambos casos el orden es 1 para la concentracin de enzima. La ecuacin III da cuenta entonces del comportamiento observado en la figura 1.

Figura 1. Dependencia tpica de la velocidad de una reaccin enzimtica como funcin del sustrato S Muchas reacciones obedecen la ley de Michaelis (ecuacin III), sin embargo, el mecanismo queda an en la duda ya que a travs de otro mecanismo complejo es posible llegar a la misma ecuacin cintica. El efecto del cambio de pH en las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas se puede observar en la figura 6. Se tiene un mximo y la primera explicacin de este hecho fue dada por Michaelis. La idea bsica es que el centro activo de la enzima puede existir en tres estados de ionizacin dependiendo de la fuerza cida, Kb EH2 E Las constantes de disociacin se representan por kb y ka. Cada una de las tres formas de la enzima puede interaccionar con el sustrato, Kb EH2 ka EHS ka EH

ES Si se postula que slo EHS puede dar productos, el esquema de reaccin queda entonces

EH2

EH

EH 2S

EH S K2 EH +P

E S

As, en solucin cida, la enzima estar en la forma EH2 y formar con el reactivo el complejo EH2; este complejo se descompone para dar otro complejo EHS, el cual a su vez se descompone para dar los productos y luego entonces la velocidad ser pequea (lado izquierdo de la figura 6). Si la solucin es bsica predominan las formas E y ES y la velocidad ser tambin pequea. A cierto pH intermedio, llamado pH ptimo, se observar la concentracin mxima de EHS y ser por lo tanto el mximo de la velocidad. Los estudios sobre velocidades de reacciones catalizadas por enzimas a diversos valores de concentraciones y pH han permitido obtener los valores de las constantes de disociacin ka, kb, k'a y k'b.

Las dos primeras corresponden a informacin sobre la naturaleza del centro activo. Por ejemplo, la pepsina, enzima que cataliza la hidrlisis de ciertos enlaces peptdicos en el estmago tiene un pK = 2.2, siendo el nico grupo orgnico conocido que puede dar este valor el grupo carboxilo (-COOH), concluyndose que esta enzima trabaja en condiciones muy cidas equivalentes a las de un cido actico (principal constituyente del vinagre).

Figura 2. Variacin de la velocidad en funcin del pH, para una reaccin enzimtica Los valores de k'a y k'b proporcionan informacin respecto de la forma en que los grupos ionizantes del centro activo tienen interaccin con el sustrato. La influencia de la temperatura en la velocidad ha suministrado informacin valiosa acerca de los mecanismos enzimticos. Sin embargo, una complicacin surge del hecho de que las enzimas por s mismas experimentan un proceso de desactivacin que tiene una energa de desactivacin muy alta, por lo que a 35C o ms (dependiendo de la enzima) se puede observar una desactivacin muy rpida. Por ello es frecuente encontrar que las velocidades catalizadas por enzimas pasan por un mximo al ir subiendo la temperatura. A 60C por ejemplo, muchas propiedades de la enzima se alteran, algunas de ellas irreversiblemente. Estos cambios se conocen con el nombre de desnaturalizacin y son los responsables del decrecimiento de la actividad de la enzima.TABLA 1. Efecto cataltico de algunas enzimas para diferentes reacciones

En la tabla 1 se dan los valores de las constantes de velocidad, energas de activacin y factores preexponenciales de tres reacciones catalizadas por enzimas y se incluyen a ttulo de comparacin los valores de otros catalizadores.