7.

DERS
PROTEİNLERDEKİ
AMİNO ASİT
BİLEŞİMİNİN
BELİRLENMESİ
 1. AŞAMA: İLERİ DERCEDE
SAFLAŞTIRMA
2. AŞAMA:
MONOMERİK OLİGOMERİK
PROTEİNLER İÇİN: PROTEİNLER İÇİN:

DENATÜRASYON ve
ASİT HİDROLİZ ILIMLI HİDROLİZ ile alt
birimlerin ayrılması ve
SAFLAŞTIRILMASI
3. AŞAMA:
 ASİT HİDROLİZ
24 saat, 110 oC’da 6 N HCl ile işleme sokulur.
Böylece peptit bağları kopar ve amino asitler
serbest kalır.

DİKKAT: Bu işlem 3 amino asidi olumsuz

etkiler:
Triptofan
Glutamin Glutamik asit + NH3
Asparagin Aspartik asit + NH3
Triptofan parçalanır

Hidrolizattaki NH3 miktarından bu

iki amino asidin toplamı bulunur.

Triptofanı belirlemek için ayrı bir örnek NaOH

ile hidrolezlenir (BAZİK HİDROLİZ). Bu işlem
triptofan dışında kalan amino asitleri etkiler.
 3. (4.) AŞAMA
KROMATOGRAFİ
(KATYON DEĞİŞİMİ KROMATOGRAFİSİ:
AMİNO ASİT ANALİZÖRÜ)
İyon değiştirici reçine (-) yüklüdür.
Amino asitler asit ortamda (+) oldukları
için önce bu kolona bağlanırlar. Sonra
yavaş yavaş pH artırılır. Amino asitler
önce -COOH gruplarından bir H iyonu
kaybederek nötr, sonra da(-) yüklü hale
geçerek kolonu terkederler.
AMİNO ASİT ANALİZÖRÜ
 SON AŞAMA:
KANTİTATİF ANALİZ
Amino asit + Ninhidrin reaktifi Mor renkli bileşikler
(Prolin amino asidi
ile sarı renkli bileşik)

Bu maddelerin absorpladığı ışık

miktarı spektral yöntemle ölçülür.

Bilgisayar
aracılığıyla Pikler bir kaydedicide
kantitatif
analiz yapılır sürekli olarak kaydedilir.
Her pik bir amino aside karşılık
gelir.
Mor renkli
bileşik
 Kolonu belli bir sıraya göre terkeden amino asitler
elüsyon hacmi denilen (kolondan ayrılmaları için
gereken tampon hacmi) bir parametreye göre
farklandırılırlar.

Önce standart amino asit karışımı kolondan

geçirilir ve bir elüsyon profili çıkartılır.

Sonra hidrolizat kolondan geçirilir ve elüsyon

profili hazırlanır. Bu profil standart karışımın
elüsyon profili ile karşılaştırılır.
ELÜSYON PROFİLLERİNİN
KARŞILAŞTIRILMASI
 Not: Proteinlerdeki amino asit
sayısının hesap yoluyla bulunması
• Proteinin molekül ağırlığı biliniyor ya da
bulunabiliyorsa:
Proteinin Ma
A.A. Sayısı =

110

Doğada bulunan amino asitlerin ortalama molekül ağırlığı 138.

Peptit bağı oluşumu ile 1 mol su ayrıldığından amino asit
kalıntısının ağırlığı 138-18=120; Proteinlerde düşük molekül
ağırlıklı amino asitler ağırlıkta olduğu için bu değer (1 amino
asit kalıntısının ort. Ağırlığı) 110 olarak kabul edilir.
ROTEİNLERDEKİ AMİNO ASİT
SIRASININ BELİRLENMESİ

N-terminal kalıntıların belirlenmesi

SANGER YÖNTEMİ
DABSİL KLORÜR KULLANIMI
EDMAN YÖNTEMİ
 SANGER YÖNTEMİ
• N-terminal amino
asidin serbest -
amino grubu “2,4-
dinitrofluorobenzen”
(fluorodinitrobenzen,
FDNB) ile reaksiyona
girer.
 DABSİL KLORÜR KULLANIMI
• Sanger yöntemindeki FDNB yerine bu
madde kullanılır. Daha koyu renkli türevler
ortaya koyar, dolayısıyla duyarlılık artar.
 EDMAN YÖNTEMİ
• N-terminal amino asit fenilizotiyosiyanat
ile işleme sokulur. Böylece bu amino
asidin bir feniltiohidantion türevi oluşur.
• Bu yöntemde N-terminal kalıntı ayrıldıktan
sonra peptit zinciri sağlam kalır. Bu zincir
de işleme sokulur. Böylece 2. amino asit
belirlenir. İşlem devam ettirilerek amino
asit dizisi ortaya konulmuş olur.
 ROTEİNLERDEKİ AMİNO ASİT
SIRASININ BELİRLENMESİ

C-terminal kalıntıların belirlenmesi

• Serbest karboksil grubunun hidroksile
redüklenmesi R Bu maddenin
kromatografik
-Amino alkol H C OH
analizi
NH2 gerçekleştirilir.
Spesifik enzimlerin kullanımı
NH2     COOH
ENZİMATİK KESİM (ör. Karboksipeptidazlarla)
 POLİPEPTİDİN KISA
PARÇALARA AYRILMASI
• Birçok polipeptit 100’den fazla amino asit
içerir. Bu durumda amino asit dizisini bir
uçtan başlayarak saptamak mümkün değildir.
• Dolayısıyla polipeptit önce kısa peptit
parçalarına ayrılır.
 Bu işlem 2 yolla yapılabilir:
ENZİMLER ARACILIĞIYLA
KİMYASAL YOLLA SELEKTİF KESİM
SİYANOJEN BROMÜR TRİPSİN ENZİMİ
Polipeptit zincirini metionin Pankreatik bir enzim olan
kalıntısının karbonil tripsin, lizin ve arjinin
tarafından keser. kalıntılarının karbonil
tarafındaki peptit bağlarının
NH2 COOH hidrolizini katalizler.
Met
NH2 COOH
Lys Arg


TRİPTİK PEPTİTLER
 KİMOTRİPSİN

• Kimotripsin,
fenilalanin, tirozin ve
triptofan kalıntılarının
karbonil tarafındaki
peptit bağlarının
hidrolizini katalizler.
 SONRA:
• Kısa peptit parçaları Edman yöntemiyle
analiz edilir.
• Farklı kesim yöntemleriyle oluşan
fragmentlerin dizi analizleri yapıldıktan
sonra OVERLAP eden (ÇAKIŞAN)
parçalar aracılığıyla kesin sıra saptanır.
İlk kesimde oluşan fragmentler:
T-U D-E-F L-M-N PQRS
A-B-C O G-H-I-J-K L-M-N
İkinci kesimde oluşan fragmentler:
E-F-G U H-I N-O-P-Q
A-B-C-D R-S-T J-K-L-M

OVERLAP EDİLEREK OLUŞTURULAN DİZİ:

A-B-C-D-E-F-G-H-I-J-K-L-M-N-O-P-Q-R-S-T-U
Günümüzde üç boyutlu yapıların
aydınlatılmasında bilgisayar
kullanımı çok yaygındır.