ENZİM AKTİVİTESİNİN

ÖLÇÜLMESİ
ve
HESAPLANMASI

Enzimlerin doku ve hücrelerdeki konsantrasyonu son derece

düşük olduğundan miktarlarını ölçmek çok güçtür. En iyi
ölçme yöntemi enzimin katalitik aktivitesini ölçmektir.

UV-VIS ABSORPSİYON FLUORESANS RADYOAKTİF

SPEKTROFOTOMETRİSİ SPEKTROFOTOMETRİSİ YÖNTEMLER
SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLERLE
ENZİM AKTİVİTESİNİ ÖLÇMEK:
Belli bir zaman aralığında enzimin kataliz
etkinliği sonucu oluşan
DEĞİŞİMİ
saptamaktır.

ÜRÜN SUBSTRAT
OLUŞUMU EKSİLMESİ
Enzim miktarı, genelde, enzim
konsantrasyonu ile doğru orantılı
olarak meydana gelen ürün miktarı
ölçülerek saptanır.
Başlangıç Hızı "Initial rate":
vo
• Aktivite ölçümü, henüz reaksiyon hızında
bir düşmenin olmadığı kısa zaman
aralığında yapılır.
Bu dönemde güvenilir bir ölçüm
için:
• Enzim ve substrat derişimi reaksiyonun
optimum hızda gerçekleşmesine yetecek
şekilde ayarlanmalı,
• Sıcaklık kontrol altında tutulmalı,
• Ölçüm yapılan karışımın homojen olması
sağlanmalı,
• Çok sağlıklı kör ve kontrol ölçümleri
yapılmalıdır.
 KÖR (BLANK)
Çalışılan dalga boyundaki ışını
absorplayacak maddeyi
içermeyen reaksiyon ortamı

KONTROL(LER)
Reaksiyon ortamındaki etkinliği
şüpheli olan bileşenler (ör.
Koenzimler)
 İŞLEMLER
• Spektrofotometre ölçümden 10-15 dak önce
çalıştırılır; çalışma ortamının sıcaklığı
ayarlanır; doğru ve temiz küvetler seçilir.
• Reaksiyonu başlatacak bileşen hariç diğer tüm
bileşenler küvete (çift ışınlı aletlerde her iki
küvete) konulur. Alet sıfırlanır ("Auto-Zero").
• Reaksiyonu başlatacak bileşen eklenir ve etkin
bir şekilde karışması sağlanarak ölçüm yapılır.
 TEKNİK OLARAK DİKKAT
EDİLECEK NOKTALAR
• Yüksek Km değeri söz konusu ise aktivite ölçümünde substrat
konsantrasyonu yüksek tutulmalıdır.
• Olanaklar el verdiği ölçüde saf enzimle çalışmakta yarar vardır.
• Çözelti şeklinde saklanan enzimlerde zamanla aktivite kaybı olacağı
unutulmamalıdır. Liyofilize halde saklamak daha elverişlidir.
• Ölçümlerde kullanılan kimyasalların saf olması şarttır. Kalite ne
kadar yüksek olursa, hata payı o kadar azalır.
• Cam eşyaların temiz olması, deterjan artığı bulunmaması, saf suyun
yüksek kalitede olmasına özen gösterilmelidir.
• Reaksiyon karışımına katılacak maddelerin pH'ları elverişli olmalıdır.
ENZİM AKTİVİTESİNİN HESAPLANMASI:
Birimler ve Spesifik Aktivite
Absorpsiyon (Ekstinksiyon) Katsayısı

Spektrofotometrik ölçümün dayandığı Beer-

Lambert yasasına göre Absorbans (A; ya da
Optik Dansite, O.D.), absorpsiyon yapan
maddenin derişimi (c) ve ışının katettiği yol (d) ile
doğru orantılıdır: A=cd
Buna göre: A A
c = c =
d 
1 cm old.
 A=cd
1M 1 cm

Derişimi 1 M olan bir kromoforun

ışık yolu 1 cm olan bir
spektrofotometrede ortaya koyduğu
absorbans Molar Absorpsiyon
(Ekstinksiyon) Katsayısı () olarak
tanımlanır.
Birimi M-1cm-1 'dir.
(lmol-1cm-1 veya mmol-1cm2 'ye eşdeğerdir)
cm2mol-1 (M-1cm-1'in 1000 katı) olarak da ifade edilir
Bu durumda hesaplanan derişimin
(c'nin) birimi M (mol/l)'dır.
Enzim Aktivitesinin Tanımlanması
Bir enzimin aktivitesini çeşitli biçimlerde ifade etmek
mümkündür:
Örneğin,
Birim zamanda enzim tarafından meydana getirilen
absorbans değişimi: (dA/dt)
ÜNİTE (U;
Ancak daha standart bir birim olan
"International Unit", IU) daha geniş
kullanım alanı bulur.
Buna göre 1 Ünite Enzim, 1 dakikada 1 mol ürünün
oluşumunu (veya 1 mol substratın dönüşümünü)
katalizleyen enzim miktarıdır (U= mol /dak)
Deneysel Ölçümlerin Üniteye Dönüştürülmesi

Örnekteki Enzim V x dA/dt x 1000 x sulandırma faktörü

t
Ünitesi =
 vs x d

Vt = Reaksiyon karışımının toplam hacmi (ml)

dA/dt = dakikada Absorbans değişimi (dak-1)

 = Absorpsiyon katsayısı (cm2mol-1)

Vs = Reaksiyon ortamına katılan örnek (enzim) hacmi
(ml)
D = küvetteki ışık yolu (genellikle 1 cm)
1000 çarpanı enzimi mole çevirmek içindir.
 SPESİFİK AKTİVİTE = U/mg protein

Saf bir enzimin spesifik aktivitesi

sabittir ve o enzime özgü bir değerdir.
Bu aktivite birimi, enzimin saflığını
tanımlayan bir ölçüttür.

Ham özütlerde protein derişimi yüksektir

Dolayısıyla ilgilenilen enzimin spesifik
aktivitesi DÜŞÜK çıkar. Enzimi
SAFLAŞTIRDIKÇA spesifik aktivitesi
YÜKSELİR.