BİYOTEKNOLOJİ I

2005-2006

Prof. Dr. Şule ARI

 Fermentasyon terimi,
• Oksijensiz ortamda bir ATP üretim süreci
• Fermentasyon Pasteur tarafından bulunmuştur
• Glukozdan piruvat oluşumu reksiyonları dizisi
tüm hücreler için benzer (GLİKOLİZ)
GLİKOLİZ
GLİKOLİZ
Piruvattan metabolik enerji oluşumu üç
yol

1. Maya ve diğer birçok mikrooganizmada olduğu gibi alkolik

fermentasyonla etanol oluşumu:
Piruvat + H+ Aset aldehit + CO2
piruvat dekarboksilaz
Asetaldehit+NADH+H+ EtOH+NAD+
alkol dehidrogenaz
2. Çeşitli mikroorganizmalar ve yüksek organizmalarda oksijenini
azaldığı durumlarda kaslarda meydana gelen laktik asit
fermentasyonu
Piruvat+NADH+H+ Laktat+ NAD+
laktat dehidrogenaz
3. Aerobik solunum yoluyla piruvatın mitokondrilerdeki sitrik asit
siklusu ve elektron transport zincirine girmesiyle
gerçekleşen oksidatif yol
 Fermentasyon Teknolojisi
• Endüstriyel boyutta kültürlemenin yapıldığı mikrobiyal proseslerin ilk
örnekleri (anaerobik koşullarda gereçekleştirilir)
– biracılık
– aseton-butanol üretimi

• büyük ölçekte üretim “fermentasyon” olarak tanımlanmış, bu

teknolojiye de “fermentasyon teknolojisi” denmiştir.
• Ancak endüstriyel fermentasyon hem anaerobik hem de aerobik
mikrobiyal prosesleri kapsar
• Hatta endüstriyel boyuttaki mikrobiyal proseslerin çoğu aerobiktir
• Endüstriyel fermentasyon tanımı: “tek çeşit mikroorganizmayla
ve belirli optimum koşullarda gerçekleştirilen biyolojik
transformasyonlar -biyodönüşümler-”
 Biyoteknolojik olarak üretilen
ürünler
Yakıt/kimyasal Ethanol, methanol, acetone, butanol, acetic acid, citric acid
Miktar artışı (kg)

Amino Asit Glutamik asit (MSG), Fenilalanin, Aspartik acidt

(aspartame)
Gum Ksanhan gum
Enzim Proteaz, renin

Antibiyotik Penisilin, Sefalosporinler, Tetrasiklinler, Eritromisin

Aşı Tetanoz, grip
Rekombinant insan insulini, interferon, eritropoietin (EPO), büyüme

Fiyat artışı ($)

insan proteinleri hormonu, koloni sitimulasyon factorleri (GCSF & GMCSF)

Monoklonal Remicade (Crones) ReoPro (PCI anti clot), Avonex (MS

antikorlar (MAb’s): tedavisi) Herceptin (adv. stagemetastatic meme kanseri)
Laboratuvardan üretime
 Bir fermentasyon süreci ile
üretimin aşamaları
1. Konu ile ilgili literatür incelemesi
2. Üretilmesi istenen maddeyi en yüksek verimle üreten
Üst mikroorganizmanın seçilmesi, geliştirilmesi
akım 3. İstenen maddenin seçilen mikroorganizma tarafından en
işleml yüksek düzeyde üretimini sağlayacak besiyeri bileşiminin
belirlenmesi
eri
4. Mikroorganizmanın üremesine ve ürün oluşturmasına en uygun
çevresel koşulların (pH, sıcaklık, karıştırma vb.) belirlenmesi
5. En ekonomik üretimi sağlayacak süreç biçiminin seçilerek
fermentör tasarımının yapılması
Alt 6. Oluşan ürünün fermentasyon ortamından en ekonomik yöntemle
akım geri kazanılması.
7. İşletme, pazarlama, kalite kontrol vb. faaliyetler
işlemle
ri
Bu aşamalar temelde 3 büyük grup
altında toplanır:
• Üst akım işlemleri (Upstream process),
biyoreaksiyon, alt akım işlemleri
(downstream process) ve ürün eldesi
• Bu üç aşamanın her biri ayrı operasyonlar
olarak adlandırılan farklı aşamaları içerir.
Üst akım işlemlerinin operasyonları
• Öğütme
• Karıştırma
• Besiyeri hazırlama
• Sterilizasyon
• Soğutma
• Isıtma
Biyoreaktör ile ilgili operasyonlar

• Karıştırma
• Mikroorganizma, bitki ya da hayvan
hücrelerinin hazırlanması
• Hücrelerin inokülasyonu
• Isıtma ve soğutma
 Alt akım işlemleri ve ürün geri
kazanımı ile ilgili operasyonlar
• Filtrasyon
• Santrifügasyon
• Diyaliz
• Kristalizasyon
• Membran ayrımı
• Kromatografi
• Solvent ekstraksiyonu
• Evoporasyon
• Çöktürme
 Fermentasyon ile üretim sürecinde 2.
ve 3. aşamalar birbiriyle iç içedir
Çünkü: süreç için en uygun olan
mikroorganizma bir yandan mutasyon,
seleksiyon vb. yollarla geliştirilirken bir
yandan da substrat optimizasyonu ile ürün
verimi yükseltilmeye çalışılır.
• Endüstriyel fermentasyonda üretim giderleri
arasında çok büyük bir pay substrat giderleridir
– Maliyetin yaklaşık yarısını substrat giderleri tutar
– Bu nedenle endüstriyel fermentasyonda kullanılacak
substratların olabildiğince ucuz ve içerik bakımından
zengin olması istenir
Endüstriyel fermentasyon

500 ml

Pilot fermentör
(2-100 l)

Pilot fermentör
(100-2000 l) Üretim fermentörü
50.000-400.000 l
 ENDÜSTRİYEL
FERMENTASYON
• Mikroorganizmaların hücre kitleleri ya da
ürettikleri metabolitleri ticari olarak
kullanabilmek için fazla miktarda (10-50.000
litre) üretilmeleri gereklidir

• Bu ölçekteki üretim = geniş ölçekte üretim

(large-scale) =endüstriyel fermentasyon
 ENDÜSTRİYEL
FERMENTASYON
Mikroorganizmaların üreme gereksinimleri
BİLEŞEN FONKSİYON
Su Kültür ortamının Esas Bileşeni
H Hücresel su ve organik hücre materyalinin bileşeni
O2 Hücresel su ve organik hücre materyalinin bileşeni
Major Maddeler
C Organik hücre materyalinin bileşeni
N Protein, nükleik asit, koenzimlerin bileşen
S Bazı aminoasitlerin ve koenzimlerin bileşeni
P Nük. as.ler, fosfolipidler, koenzimlerin bileşeni
Makro bileşenler
(Tuzlar halinde)
K Temel inorganik katyon, enzim kofaktörü
Mg Katyon, enzim kofaktörü, ATP sentezi
Enzimin substrat bağlayıcısı, Klorofil bileşeni
Ca Katyon, bazı enzimlerin kofaktörü
Fe Sitokrom ve bazı proteinlerin bileşeni, bazı enzimlerin kofaktörü
Mikro bileşenler
(az miktarda ilave)
Mn Bazı enzimlerin kofaktörü, bazen Mg yerine kullanılır
Co B12 vit. Bileşeni ve B12 den türevlenen koenzimlerin bileşeni
Cu, Zn, Mo Belli enzimlerin inorganik bileşeni
 Yapay besiyerleri
• Saf kimyasal maddelerin sistematik olarak
formüle uygun biçimde bir araya
getirilmesiyle oluşturulur
• Daha çok mikroorganizmaların özgül
gereksinimlerini belirlemek için kullanılır
• Üretimde kullanılmaları ekonomik değildir

ENDÜSTRİYEL FERMENTASYONDA;
çoğunlukla çeşitli atıkların ve yan ürünlerin
bulunduğu doğal kaynaklı karışık ortamlar
tercih edilirler
– Ekonomiklerdir
 ENDÜSTRİYEL FERMENTASYONDA
KULLANILAN BESİYERLERİNİ OLUŞTURAN
TEMEL BİLEŞENLER

 KARBON kaynakları
 AZOT kaynakları
 İNORGANİK BİLEŞİKLER
 VİTAMİNLER
 1. Karbon Kaynakları:

• Basit şekerler
– Glukoz
– Sukroz
• Polimerler (nişasta, dekstrin, selüloz gibi)
• Melas Şeker kamışı ve şeker pancarı ekstraksiyon prosesinin
(şeker endüstrisinin) bir yan ürünü
• Maltoz Bira endüstrisinde kullanılan arpadan elde edilen malt
özütü
• Sülfit atık likörü
 2. Azot Kaynakları
Doğal kökenli karışık azot kaynakları
Maserasyon sıvısı
• Mısır nişastası ekstraksiyon prosesinin bir yan ürünü
Soya Fasulyesi İrmiği
• Çeşitli antibiyotiklerin üretiminde ve bazı steroidlerin
transformasyonlarında kullanılır
Diğer Azot kaynakları:
– Maya ve özütleri (ekstreleri),
– Farklı kaynaklardan elde edilen hidrolize proteinler
– Balık unları
– Et, kemik ve kandan elde edilen unlar
 3. İnorganik Bileşenler

• Kuru ağırlık temeline göre biyokütlenin

% 5’ini kül oluşturur.
• İnorganik bileşenlere ihtiyaç çok az
• Kullanılan doğal besiyeri bileşenleri ile
sağlanırlar
• Ancak bazı örneklerde ör: antibiyotik
üretiminde ortama ilaveleri gerekebilir
 4. Vitaminler

• Genellikle kullanılan azot ve karbon

kaynakları ile sağlanırlar
• Eksiklikleri halinde ortama eklenirler
 Mikrobiyal kinetik
• Belirli bir besiyerinde ve belirli koşullarda
mikroorganizmaların zamanla çoğalması olayları bu
olaylarla ilgili matematiksel bağıntıların türetilmesi
• Fermentasyon süreçleri
– Kesikli (batch): Tüm süreç belli bir zaman aralığında gerçekleşir.
Besiyeri eklemesi yapılmaz.

– Yarı-kesikli Reaktanların zaman içinde yavaş yavaş reaktöre eklenir

– Sürekli (kontinü): Aralıksız günlerce, haftalarca devam eder

Mikroorganizmaların üreme kinetiğinin incelenebileceği
en iyi sistem kesikli üremedir.
 Kesikli fermentasyon ve mikrobiyal
üreme kinetiği
 Lag faz:
faz Mikroorganizmaların yeni besiyerine aktarıldıklarında,
ortama adapte olup çoğalmaya başlayana kadar geçen süre
 Logaritmik (log) faz: Lag fazın sonunda ortama adapte
olmuş hücrelerin bölündüğü evre, (matematiksel ifadelerin
türetildiği evre)
 Durağan (stationary) faz: Hücre sayısı sabit kalır, ancak
metabolizma yavaşlar. Sekonder metabolitlerin üretimi
üretimi bu evrede gerçekleşir.
 Ölüm fazı: Substrat tükenmesi nedeniyle metabolik
aktivite durur. Hücreler ölmeye başlar.
Mikrobiyal üreme eğrisi
Kesikli fermentasyon ve mikrobiyal
üreme kinetiği
Log (logaritmik, üssel faz)
• Ancak üreme oranı log faz boyunca sabit kalır. Üreme
oranı (growth rate) substrat ortamda bulunduğu sürece
substrat konsantrasyonundan bağımsızdır. Hücre sayısı
ya da hücre kitlesindeki artış oranı; spesifik üreme oranı
(µ ) genellikle üç parametrenin bir fonksiyonudur.
• Substrat konsantrasyonu (S)
• Maksimum üreme oranı (µ m)
• Substrata özel sabite (Ks)
S
µ =µ m Monod Eşitliğ
Ks+S
 Bazı mikroorganizmaların farklı
substratlarda Ks değerleri
Mikroorganizma substrat Ks (mg/ml)
E. coli glukoz 4
Mannitol 2
Laktoz 20
Fosfat iyonu 1.6
Aspergillus Triptofan 1.4 x 107
Glukoz 5
Candida Arginin 5.0 x 10-1
Gliserin 4,5
Saccharomyces O2 4.5 x 10-1
Pseudomonas Glukoz 2.5
Metanol 0.7
Klebsiella Metan 0.4
CO2 0.4
Mg++ 5.6 x 10-1
 Bazı mikroorganizmaların
glukozdaki µ m değerleri
ToC µ m (h-1 ) İkilenme süresi (h)
Aspergillus niger 30 0.20 3.46
Aspergillus nidulans 20 0.090 7.72
25 0.148 4.68
30 0.215 3.23
37 0.360 1.96
Penicillum chrysognum 25 0.123 5.65
Mucor hiemalis 25 0.17 4.1
Fusarium avanaceum 25 0.18 3.8
Fusarium graminearum 30 0.28 2.48
Verticillum agaricinium 25 0.24 2.9
Geotrichum candidum 25 0.41 1.7
Neurospora sitophila 30 0.4 1.73
Escherichia coli 30 0.35
Pseudomonas putida 30 0.75
 Normal kültür koşullarında bazı
organizmaların ikilenme zamanları

Organizma İkilenme zamanı (dak)

E. coli 20
Bakteriler 45
Mayalar 90
Küfler 160
Hayvan hücreleri 630-1260
Bitki hücreleri 3600-6600
Üreme kinetiği üzerinde etkili diğer
parametreler
• İnhibitörler
• Aktivatörler
• O2
 Birden fazla organizma türü içeren
karışık kültürlerin kinetiği

• Atık su arıtımı, bazı besin endüstrisi dallarında

ve bazı fermentasyonlarda (aspartik asit üretimi)
birden fazla mikroorganizmanın kinetiği
bilinmelidir
• İki ya da daha fazla mikroorganizmanın
kullanıldığı kültürlemelerde bu
mikroorganizmalar için aynı kinetik bağıntılar
geçerlidir.
 Fermentasyon uygulamalarının
sınıflandırılması
– HAVA KULANIMI ESASINA GÖRE
• AEROBİK FERMENTASYONLAR
– Derin (Submerged) fermentasyonlar
» Karıştırıcılı tipler
» Karıştırıcısızı tipler
– Tavalı fermentörler
• ANAEROBİK FREMENTASYONLAR
– Sulu besiyeri uygulamalı tank tipi fermentörler (bira,
şarap yapımı)
– Kuru uygulamalar için yer altı depoları tipindekiler
(Biyogaz)
– İŞLEMİN SÜREKLİ /KESİKLİ OLUŞU ESASINA GÖRE
• Kesikli (Batch) fermentasyonlar
• Sürekli fermentasyonlar
Anaerob fermmentasyonlarda sürekli kültür kullanımı yaygındır.
 FERMENTÖRLER

• Kimyasal reaksiyonların meydana geldiği kaplara genel olarak

reaktör denir, biyolojik reaksiyonların meydana geldiği
kaplara biyoreaktör ya da fermentör denir. Biyoreaktörler
süreç tipine göre;
 Kesikli (süreksiz, batch)
 Yarı sürekli (semi-batch)
 Sürekli
 Tapa akışlı (Reaksiyona giren maddeler önce karıştırılır ve
kolon biçimindeki reaktöre pompalanır. Kolonun diğer
ucundan ürünler toplanır. Atık su arıtımında, immobilize enzim
uygulamalarında (sabit yataklı, akışkan yataklı) kullanılır.
Beslemeli sistem
Lab.tipi fermentör

(1L-10L)

Faz 2 ve Faz 3 klinik çalışmalar

Etkinlik, güvnlik, doz belirleme çalışmaları
Endüstriyel tip
Tek kullanımlık biyoreaktör
Tek kullanımlık biyorektör
kullanımı
 Katatilitik reaktör
Membran reaktör (nano-palladium, nano-
silver)
• prebiyotik vb. testler için insan barsak
simülatörü
• Atık su arıtımı
Aşı üretimi için reaktörü
Bitkisel sekonder metabolit üretimi
için saçak kök kültür reaktörleri
Alglerden biyodizel üretim
reaktörleri
Alglerden biyodizel üretim
reaktörleri
Atık su arıtımı reaktörü
TAVALI FERMENTASYON REAKTÖRLERİ
 FERMENTÖRLER
Farklı büyüklüklerine karşın fermentörler şu
özellikleri taşırlar:
• Steril çalışmaya uygun gövde ve kısımlara sahip
olmalıdırlar.
• Uygun karıştırma (O2 ve ısı transferi)
sağlamalıdır.
• Steril katkılara elverişli girişler ve katkı sistemleri
içermelidirler.
• Kontrol sistemleri ile ilişkili olmalıdırlar.
Derin karıştırmalı fermentör ve
kesikli kültürleme
• Mekanik karıştırıcısız derin fermentörler: Oksijen
gereksinimi az olan fermentasyonlar için uygundur
Ör: tek hücre proteini üretimi, ekmek mayası
üretimi
• Tavalı fermentasyon: Küflerin (miselli
organizmaların) ürünlerinin elde edilmesinde
kullanılır. Ör: sitrik asit fermentasyonu.
• Anaerob süreçlerde kullanılan fermentörler:
Havalandırma gerektirmediğinden daha büyük
fermentörlerin kullanılır (3000-4000 l)
 FERMENTASYONDA
STERİLİZASYON
• Fermentasyon ortamında
– substratların (besiyerlerinin)
– ortama verilecek havanın STERİL olması (edilmesi) gerekir.
– İnokulasyon hazırlanması için için steril oda kullanımı
– Fermentör sisteminin temizliği ve sterilizasyonu
• Kontaminasyon kaynakları;
– besiyeri bileşeni olarak kullanılan hammaddeler,
– sisteme giren hava,
– çeşitli kademelerdeki işlemler (ekim işlemleri, pH ölçümü vb.),
– ekipman arızalarından doğan riskler ve çevresel koşullar
(ortam temizliği, depolama koşulları) dır.
dır
Endüstriyel Besiyeri Sterilizasyonu:

• Besiyerlerinin çoğu 121oC’de steril edilir Kesikli sterilizasyon:

Sterilizasyon bir kez yapıldıktan sonra işlem boyunca tekrar
sterilizasyon yapılmayan durumdur
• Kontinü sterilizasyon: kısa süre yüksek sıcaklık (140oC)
prensibi
Endüstriyel Fermentasyonda Hava Sterilizasyonu
• Endüstriyel fermentasyonlarda en büyük sorunlardan biri
– Filtrasyon
– Isı
Endüstriyel Fermentasyonda Hava Sterilizasyonu
KİRLİ – YAĞLI – SULU HAVA GİRİŞİ

COALESCING FILTER
Yağ, su, yağ buharı, (YAĞ VE SU TUTAR)
su buharı partikül,
bakteri

KURUTUCU
Yağ, su, yağ (SU BUHARINI TUTAR)
buharı partikül,
bakteri

KARBON FİLTRE
Yağ buharı, (YAĞ BUHARINI TUTAR)
partikül, bakteri

ÖN FİLTRE
Partikül, bakteri (PARTİKÜLLERİ TUTAR)

STERİL FİLTRE
Bakteri (BAKTERİLERİ TUTAR)

KURU – YAĞSIZ VE STERİL HAVA

 ENDÜSTRİYEL
FERMENTASYONDA KONTROL
• Havalandırma: Bir fermentasyonda O2 gereksinimi ve transferi,
fermentöre giren havanın miktarı ve hızı kontrol edilmelidir
• Sıcaklık: Mikroorganizmanın canlılığı ve metabolik faaliyetlerini
sürdürebilmek için belli bir sıcaklık değeri gereklidir.
• pH: Biyosentezin devam edip, etmediği fermentasyonun
sonlandığı pH değişimleri ile anlaşılır.
• Köpüklenme: Hava ile sıvı yüzey gerilimi nedeniyle gaz kabarcıklarının
sıvı içinde süspansiyon halinde dağılması ile köpüklenme olur.
• Basınç
• Karıştırıcı gücü
• Türbidite (bulanıklık)
• Vizkozite (akışkanlık)
• Çıkış gazı (Egzoz) kompozisyonu