BİYOTEKNOLOJİ I

2005-2006

Prof. Dr. Şule ARI

Mikroorganizmaların ürettikleri
düşük molekül ağırlıklı
maddeler
 Biyodönüşüm
(Biyotransformasyon) Yoluyla
Üretilen Metabolitler
• Mikroorganizmalar çok çeşitli organik bileşikleri
kimyasal olarak değişikliğe uğratma
(biyodönüşümler veya biyotransformasyonlar)
biyotransformasyonlar
yeteneğine sahiplerdir.
• Biyodönüşüm: mikroorganizmaların bir bileşiği
yapısal olarak ilişkili ürünlere dönüştürmeleri
• Bu enzimatik reaksiyonlarda bir taraftan
mikroorganizmanın üremesi için gerekli substrat
metabolize edilirken diğer taraftan da
biyodönüşüme uğratılacak substrat metabolize
edilir=kometabolizma
 Biyodönüşüm
• Biyodönüşümde bir veya az sayıda enzimatik
reaksiyon kullanılır
• Genellikle tampon solüsyonlarda gerçekleştirilir
• Oysa fermentasyonla üretimde çok sayıda
enzimatik reaksiyon sonucu ürün oluşur
• Yüzlerce farklı biyodönüşüm reaksiyonunun
belirlenmesine karşın fermentasyon çok pahalı
ya da zor olduğu durumlarda biyodönüşüm
reaksiyonları ticari olarak kullanılır
 Biyodönüşüm
Biyodönüşüm prosesinin kullanılması için önemli gerekçeler
:
1. Substrat spesifisitesi: sadece bir spesifik reaksiyon
aşaması bir enzim tarafından katalizlenir.
2. Bölge spesifisitesi: molekülde birden fazla fonksiyonel
grup varlığında sadece spesifik bir pozisyona sahip
olan etkilenir
3. Stereospesifite: rasemik karışımlarda sadece bir form
dönüşüme uğrar
4. Reaksiyon koşulları: enzimatik reaksiyonlar daha
yumuşak koşullarda gerçekleştiğinden daha az
çevresel zarara neden olma.
Üretimde biyodönüşümün avantajları

 Reaksiyon sayısı azaltılıp, maliyet

düşürülebilir
Ör: Steroid biyotransformasyonlarından
kortizol sentezi örneğinde orijinal
kimyasal sentez 37 aşamalı ve 1g kortizol
maliyeti 200$.
Mikrobiyal biyodönüşümle aşama sayısı
11’e gram başına maliyet ise 6$’a
düşürülmüştür.
Üretimde biyodönüşümün avantajları
• Verim artışı
 İmmobilizasyon uygulaması için ideal (hücre ya da enzim
kullanımı)
 İmmobilize hücre ya da enzim kullanımının avantajları ise;
 canlı hücrelerin bölünmesini inhibe edebilecek yüksek
konsantrasyonlarda substratın (ör. 10g/l) kullanılabilmesi,
 hücre üremesi için kullanılan kontaminant maddelerin gerekli
olmayışı,
 ürünün geri kazanılmasının kolay olması,
 verimin yüksek (%85-100) olması,
 pH ve temparatür gibi koşulların tüm hücre için gereken
değerlerden bağımsız seçilebilmesi
Üretimde biyodönüşümün avantajları

• Enzim aracılığıyla yapılan dönüşümler

olduklarından ve sadece birkaç
parametreyi ilgilendirdiğinden kolaylıkla
büyük ölçekli üretime uygulanabilirlik
Üretimde biyodönüşümün avantajları
 Rekombinant DNA teknolojisinin uygulanması için ideal
adaydırlar
 Mevcut prosesin enzim düzeyi artırılabilir
 Ekonomik olmayan prosesler ekonomik hale getirilebilir
 Enzim geninin klonlanması ile enzim düzeyinin
artırılması
 Klonlanma sonrası “side directed mutagenesis-bölgeye
özgü mutagenez” uygulamasıyla enzimin termostabiltesi
veya substrat spesifisitesinin değiştirilmesi
 Sentetik sentez yolları oluşturulabilir.
Ör: C vitamini üretimi
Klasik yol: Reichstein-Grüssner sentezi

Kimyasal Acetobacter suboxydans

D-glukoz D-sorbitol L-sorboz

kimyasal

diaseton-2-keto-L-gulonik asit
Kimyasal
Kimyasal

Askorbik asit 2-keto-L- guloik asit

 Rekombinant DNA teknolojisi ile,
Oysa Corynebacterium’un 2,5-diketo-D- glukonik asit redüktaz geni
Erwinia’ya aktarılarak proses basite indirgenmiştir.

Erwinia
D-glukoz 2,5-diketo-D-glukonik asit

Corynebacterium

2-keto-L- guloik asit

Kimyasal

Askorbik asit
 Biyodönüşüm verimlerine ait
örnekler
Mikroorganizma Substrat Ürün Verim (%)

Gluconobacter suboxydans sorbitol Sorboz 98

Gluconobacter suboxydans gliserin dihidroksiaseton 90
Gluconobacter suboxydans glukoz 5-ketoglukonik asit 90

Gluconobacter suboxydans mannitol fruktoz 95

Aspergillus niger glukoz glukonik asit 100
Aspergillus oryzae L-triroksin L-dopa 100
Pseudomonas fragi glukoz L-ketoglukonik asit 92
Rhizopus nigricans progesteron 11-a-hidroksiprogesteron 90
Alcaligenes faecalis maleik asit fumarik asit 98
Bacillus fructosus sorbitol fruktoz 90
 Biyodönüşüm prosedürü
• Mikrobiyal dönüşümü için,
– Sporlar
– bölünen hücreler
– dinlenme halindeki hücreler
– Enzimler
– immobilize hücreler
– immobilize enzim ve enzim sistemleri
kullanılabilir
 Biyodönüşüm prosedürü
Bölünmekte olan hücrelerin kültürleri kullanımında,
kullanımında
1. uygun besiyerinde kültürleme
2. Üremenin uygun bir evresinde (6.-24. saatler) biyodönüşümü
istenen substratın konsantre biçimde kültüre ilavesi
YA DA
1. Çok fazla miktarda inokulüm
2. üreme periyoduna giriş beklenmeden konsantre edilmiş
substrat ilavesi

SORUN: Konsantre substratın çözünmemesi

• Az çözünen maddelerin çözünürlüğünü artırmak için
emülsifiye edici madde (deterjan, etanol, aseton, dimetil
formamid, dimetil sülfoksit gibi düşük toksisiteli suyla
karışabilir çözücüler) ilavesi
 Biyodönüşüm prosedürü
Dinlenme halindeki hücrelerin kullanımı
• ilave edilen substrat ile enzim indüksiyonu gerekli
olmadığı durumlarda
• substrat tarafından üreme inhibisyonunu ortadan
kaldırdığı için önemli bir avantaj
İmmobilize hücre kullanımı
• proses sürekliliği
• tekrar tekrar hücre kullanımı
• bir ya da birden fazla reaksiyon aşamasını
katalizleyebilme
Ör: Alanin, maleik asit, aspartik asit immobilize bakteri
hücreleri ile üretilmektedir.
 Biyodönüşüm prosedürü
Hücresiz enzim ekstrelerinin kullanımı
• immobilize enzimlerle yapılan proseslerde
• istenmeyen reaksiyonların gerçekleşmemesi için
veya reaksiyon ürünlerinin daha ileri yıkımlara
uğramamasının istendiği durumlarda veya
substratın hücre membranı yoluyla transport
edilerek kaybedildiği durumlar için
İmmobilize enzim kullanımı
• sürekli prosesler için
Ör: penisilin açilaz, glukoamilaz, glukoz izomeraz
biyotransformasyonları
 Biyodönüşüm prosedürü
1. Hücrelerin ortamdan ayrılması (transformasyon
reaksiyonlarında son ürünler genellikle ekstraselülerdir
veya çözünmüş hale ya da süspanse olmuş formda
bulunurlar. Bakteri ve mayalar genellikle ayrılmazken
fungus miselleri filtrasyonla ortamdan uzaklaştırılarlar)
2. Hücrelerin tekrar tekrar yıkanması (önemli miktarda
reaksiyon ürünü hücrelere absorbe olmuş haldedir)
3. Ürünün çözünürlüğüne bağlı olarak geri kazanma
işlemi (kalsiyum tuzları halinde çöktürme, iyon
değiştiricilerle adsorbsiyon, uygun çözücülerle
ekstraksiyon, buharlaşan maddeler için doğrudan
besiyerinden distilasyon )
 Biyodönüşüm uygulamaları
• Biyodönüşüm reaksiyonları çok çeşitli
• Ticari olarak kullanılanları fazla değildir
• ÇÜNKÜ: biyodönüşüm yoluyla üretilecek ürünün
pazarının olmaması ya da üretimin pahalıya mal
olmasıdır
• Ancak , immobilize hücre/enzim kullanımı ve
prosese spesifik genetik modifikasyonlar
yapılmış mikroorganizmaların geliştirilmesiyle
ticari ölçeğe uygun biyodönüşüm
reaksiyonlarının sayısı artmakta
 Ekonomik açıdan önemli
biyodönüşüm reaksiyonları

(1) steroid ve sterollerin biyodönüşümü,

(2) steroid olmayan bileşiklerin
biyodönüşümü (C vitamini)
(3) pestisitlerin biyodönüşümü
(4) antibiyotiklerin biyodönüşümü
 Steroid ve sterollerin
biyodönüşümü

• Mikroorganizmaların steroid ve sterol

substratlarını okside ve redükte etmeleri
selektif ve spesifik biyotransformasyonlara
örnek oluşturur
 Steroid ve steroller
• Glukokortikoidler, mineralokortikoitler, androjen, östrojen,
progesteron gibi steroidler hormon özelliğinde olan doğal
maddelerdir
• Tüm steroidlerin ortak özellikleri bir
siklopetanoperhidrofenantren yapısında olmaları
• Hormon özelliğinde olan steroidler tedavi amacıyla
yaygın şekilde kullanılır
• Antitümör ve antienflamatuar özellikte steroidler var
• Kortizon antienflamatuar olarak romatoid artrit ve çeşitli
deri hastalıklarının tedavisinde kullanılmaktadır.
 Steroid çeşitleri
• Kortikosteroidler: Adrenal korteks tarafından
üretilen hormonlar
Karbohidrat ve protein metabolizmasında,elektrolit, su dengesi,
kardiyovaskular sistem iskelet kasları, böbrek ve diğer
organların fonksiyonlarında etkin

• Östrojenler ve Progesteron: Dişi cinsiyet

hormonları
Sekonder cinsiyet karakterlerinden, üreme fonksiyonlarından
sorumlu, doğum kontrolünde kullanılmakta

• Androjenler: Erkek cinsiyet hormonu

Erkek sekonder cinsiyet karakterlerinden, üreme fonksiyonlarından
sorumlu.  Ayrıca meme kanseri tedavisinde, androjen eksikliğinde,
gelişimi kas büyümesini ve kırmızı kan hücrelerinin yapımını
teşvik eder
 C D
A B 3 tane primer 18 tane sekonder
karbon atomu

18 karbon atomunun her biri 

ya da  formu şeklinde hidrolize
olabilir

Bu formların her biri farklı bir

mikrobiyal hidroksilaz ile
oluşturulur.

Hidroksilasyona ek olarak bazı

mikrobiyal enzimler A halkasını
aromatize ederler. Böylece
alternatif steroid türevi oluşumu
artar.
Steroid hidroksilasyon örnekleri
 Examples of Steroid-based Drugs in Use Today

O
Male Sex Female Sex
CH3 OH CH3
Hormone Hormone CH3
CH3 CH3

O O
O

Anti-inflammatory O O
Agent CH2OH
CH3 CH3
HO OH
CH3 CH3

OH
O HO Congested Heart
H
Symptoms
 Steroid ve sterollerin biyotransformasyonu,
• steroid hormon maliyetini çok azaltır
• Orijinal kimyasal prosesle
– 1 gram kortizon asetat 31 ayrı reaksiyonla 615 gram deoksikolik
asitten meydana gelir, sentetik hormonun maliyeti 200$
– Deoksikolik asit öküz safrasından elde edilir ve birçok proses
için substrat
– Mikrobiyal hidroksilasyon ile pogesteronun 11. karbon atomunun
 formunda hidroksile olması ürün fiyatını 1$’a düşürmüştür
– Kortizonun ucuza mal edilmesindeki bir diğer etken de substrat
olarak deoksikolik asit yerine soya yağı üretiminde ortaya çıkan
yan ürünlerden sitosterol ve stigmasterol gibi ucuz substratların
kullanımıdır
 Steroid olmayan maddelerin
biyodönüşümü

Alkanların, aromatik, heterosiklik bileşiklerin,

terpenlerin, alkoloidlerin
mikroorganizmalarca transformasyonu
 Steroid olmayan maddelerin
biyodönüşümü
ÖNEMLİ TİCARİ ÖRNEK ASKORBİK ASİT ÜRETİMİ
(L- askorbik asit C vitamini üretiminde ve gıda endüstrisinde
antioksidan olarak kullanılır)
Yıllık üretimi 40.000 ton
Askorbik üretimi için iki yol vardır
1. Klasik yol (Reichstein-Grüssner sentezi): Reichstein-Grüssner
sentezinde Acetobacter suboxydans’ın 30-35oC’deki oksijenli ve
kuvvetli karıştırmalı üretimiyle D-sorbitol, L-sorboza dönüştürülür.
Tüm prosesin tamamlanmasıyla 2kg glukozdan 1kg L-askorbik asit
üretilir
2. Rekombinant DNA teknolojinin uygulandığı modern yol:
Rekombinant DNA teknolojisi ile Corynebacterium’un 2,5-diketo-D-
glukonik asit redüktaz geni Erwinia’ya aktarılarak proses basite
indirgenmiş
 Steroid olmayan maddelerin
biyodönüşümü
GLİSEROLDEN DİHİDROKSİASETON ÜRETİMİ
Dihidroksiaseton güneş kremi ve diğer kozmetik ürünlerde
yer alır
Çeşitli asetik asit bakterileri uygun besiyerinde 28oC’da ve
6’nın altındaki pH’larda gliserolün %10’unu 72-96 saatte
dihidroksiasetona dönüştürürler.
Gluconabacter melanogenus IFO 3293’ün oksijence zengin
ortamda üretilmesiyle süre 33 saate düşmüş ve ürün
miktarı 12.2g/g biyomastan, 35.8g/g biyomasa
çıkarılmıştır.
Acetobacter suboxydans (%97)
Gliserol dihidroksi aseton
Acetobacter xylinum (%100)
 Antibiyotik transformasyonu

Biyotrasformasyonlar mevcut antibiyotiklerden;

• yeni antibiyotik üretimi
• spektrumun genişletilmesi
• antibiyotik etkinliğinin artırılması
• toksisitenin azaltılması
• oral emilimin artırılması
• direnç gelişiminin ve alerjik etkinin azaltılması
gibi özelliklerinin geliştirilmesi/kazandırılması için kullanılır.

• Ancak biyodönüşüm için kullanılacak antibiyotiğin total ya da kısmi

inaktivasyonu tehlikesine karşı antibiyotik seçimi önemlidir.

• Antibiyotik biyotransformasyonuna ait çok sayıda olası reaksiyon

vardır.
 Dolaylı transformasyon
• İnhibitör veya modifiye prekürsörlerin ilavesi ile
değişik antibiyotiklerin sentezi
Ör: cis-4-metil prolin varlığında Streptomyces
parvulus iki yeni antibiyotik oluşturur. Bu yeni
antibiyotiklerden antinomisinde prolin yerine
prolin analoğu olan cis-4-metil prolin geçmiştir.
• Antibiyotik sentezinde bazı özel yolların bloke
edilmesiyle yeni ürünlerin üretilmesi
Ör: Neomisin üreticisi Streptomyces fradiae’de
böyle böyle bir mutantta neomisin biyosentezinin
ara ürünlerinden ribostamisin antibiyotiği birikimi
olur.
 Doğrudan transformasyon
Mevcut antibiyotiklerin
• asetilasyonu (Ac),
• fosforilasyonu (P), ve
• adenilasyonu (Ad) ile yeni antibiyotiklerin
elde edilmesi
 Doğrudan transformasyon
Asetilasyon reaksiyonları: çeşitli antibiyotikler için
belirlenmiş

• Biyolojik olarak aktif olmayan deasetile ürünlerin

semisentetik ürünlerin oluşumu için kullanılması

• Farklı fosfotransferazlarla fosforilasyon

• Adenil transferazlarla adenilasyon aminoglikozid cinsi
antibiyotiklerin biyodönüşümü için kullanılan reaksiyon
tipleri

• Adenilasyon, fosforilasyon ve deadenilasyon

gentamisinde değişikliklere yol açar ve aminoglikozidlere
karşı bakteriyal direncin gelişmesinde rol oynar.
  laktam antibiyotik hidrolizi,
Önemli,
Hidrolizle penisilinlerde lakton halkasının kopması
ile antibiyotik inaktivasyonu
-laktamazlar penisilinlerin ve sefalosporinlerin
lakton halkalarını hidrolizle parçalarlar (-laktam
antibiyotiklere bakteriyal direnç)
Penisilin açilaz ile penisilinin 6-APA’ya dönüşüm
reaksiyonu ekonomik açıdan çok önemli
Çünkü 6-APA yeni semi sentetik penisilin
türevlerinin yapımında kullanılır
 penisilin açilaz
penisilin açilaz
6-APA+D-fenil glisin metil ester Ampisilin
(yarı sentetik penisilin)

-laktamazlar

6-APA
 Yarı sentetik penisilinlerin;
sentetik olanlara göre asit stabilitesi, plazmit
veya kromozomal olarak kodlanan -
laktamazlara dirençlilik, geniş mikrobiyal
etkinlik gibi nitelikleri geliştirilerek elde
edilen semi sentetik penisilinler tedavi için
artan şekilde kullanılmakta