PCR, MUTASYON ANALİZ

YÖNTEMLERİ VE DNA
PARMAK İZİ

ARŞ.GÖR. ÖZGÜR VATAN

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
(PCR = PZR)
 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU, SPESİFİK
BİR DNA PARÇASININ KOPYALARININ
PRİMERLER TARAFINDAN YÖNLENDİRİLEREK,
ENZİMATİK OLARAK SENTEZLENMESİ
(AMPLİFİKASYONU)ŞEKLİNDE TANIMLANAN
İN VİTRO BİR YÖNTEMDİR.

PCR GENLERİN YA DA DNA DİZİLERİNİN

REPLİKASYONUNU HIZLANDIRILMIŞ BİR
ŞEKİLDE GERÇEKLEŞTİREN VE DNA
MOLEKÜLÜNÜN MİLYONLARCA HATTA
MİLYARLARCA KOPYASINI KISA ZAMANDA
OLUŞTURABİLEN BİR TEKNİKTİR.
 Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Oluşum
Mekanizması
Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli bir DNA
molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin
bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Primerler,
kalıp DNA molekülü yüksek sıcaklık derecelerinde
denatüre edildikten sonra, tek iplikli DNA molekülleri
üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle
melezlenirler.
DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve dört çeşit
deoksiribonükleozid trifosfat (dNTP: dATP, dTTP,
dGTP, dCTP) varlığında primerin 3' hidroksil ucundan
uzamasını sağlar. Böylece kalıp DNA ipliğine
tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü sentezlenmiş
olur.
Bir PCR döngüsü denatürasyon, primerin
bağlanması ("annealing") ve uzama
("extension") olarak adlandırılan temel olarak
tekrarlayan üç aşamadan oluşur:
1- Denatürasyon: Amplifiye edilecek DNA’nın birkaç
sn. 94-96ºC ısı ile tek iplikli DNA’ya
ayrılmasıdır.
2- Bağlanma (annealing): Birkaç dak. 50-65º
tutularak primerin tek sarmal DNA’daki hedef
bölgelere hibridizasyonu sağlar.
3- Uzama (Extension): Polimeraz enzimi yardımıyla
DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5´ → 3´
yönde uzatılmasıdır. 72ºC

Ardarda tekrarlanan denatürasyon,

primerin bağlanması, ve primerin uzaması
evreleriyle DNA fragmentleri üssel olarak artar.
Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu
sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer
primer için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her
PCR döngüsü DNA molekülü üzerinde istenilen
bölgenin iki katına çıkması ile sonuçlanır.
 PCR mixi:
- dH2O ...............................14.4µl
- 10xPCR buffer ................2.5µl
- MgCl2 ...............................0.2µl
- dNTP ................................1.25µl
- Primer1 (F) .......................1.25µl
- Primer2 (R) .......................1.25µl
-Taq Polimeraz ...................0.1µl
(Thermus aquaticus)
-Kalıp DNA .........................4-5µl
dH2O : Reaksiyon ortamı
- 10xPCR buffer : Tampon
- MgCl2 dNTP ile çözünebilir kompleks
oluşturur, polimeraz aktivitesini stimüle
eder, DNA nın Tm değerini arttırır, Primer
kalıp etkileşimini sağlar, düşük olunca
üründe azalma, yüksek olunca spesifik
olmayan ürün.
- dNTP : deoksinükleozidtrifosfatlar ( A, T, G, C)
- Primer1 (F): serbest 3 OH
- Primer2 (R)
-Taq Polimeraz : enzim
(Thermus aquaticus)
-Kalıp DNA
PCR REAKSİYONU

94ºC................2dk Ön Denaturasyon

94ºC................30sn Denaturasyon
50-60ºC.......….45sn Annealing 35 döngü
72ºC................30sn Uzama

72ºC................5dk Son Uzama

 
PCR,genetik ve moleküler biyolojide en fazla kullanılan teknik
lerden biridir.
– Klonlamada kullanılmaktadır
– DNA tekrar dizilerindeki ve restriksiyon kesim
bölgelerindeki farklılıkların kısa sürede tanımlanmasında
kullanılır.
– Genetik bozukluklardaki mutasyonların yerinin ve
mutasyonun tipinin hızlı olarak belirlenmesinde kullanılır.
– Özellikle tek bir hücrenin, tükürük bulaşmış posta pulunun,
fosillerin ya da suç bölgesindeki bir saç telinin DNA kaynağı
olarak kullanıldığı örneklerle yapılan çalışmalarda, DNA'nın
gelişigüzel primerler kullanılarak, özgül olmayan
amplifikasyonu çok yararlıdır.
Kısaca, PCR, çok geniş kullanım alanı olan ve modern genetikte
çok yönlü kullanılabilen tekniklerden biridir.
 PCR'ın Sınırları

PCR çok gelişmiş bir teknik olmasına rağmen, bazı

sınırları vardır. Hedef DNA'nın nükleotit dizisi
hakkında bazı bilgilerin gerekli olması ve nispeten
kısa bir ürün elde edilmesi, bunlardan bazılarıdır.
Diğer DNA kaynaklarından çok küçük miktarda bir
bulaşma bile sorunlara neden olabilir. Laboratuar
çalışanlarından dökülebilecek deri parçaları, bir
fosilden ya da suç mahallinden alınan DNA örneğine
bulaşabilir ve doğru sonuç alınmasını engelleyebilir.
PCR reaksiyonu çok dikkatli ve kontrollü yapılmalıdır.
 MUTASYON ANALİZ
YÖNTEMLERİ
SSCP, HDA, RFLP, LOH ve
MSI ANALİZLERİ VE
KULLANIM ALANLARI
 SSCP
(SINGLE STRAND CONFORMATIONAL
POLYMORPHISM = TEK İPLİKLİ
KONFORMASYONEL POLİMORFİZM)
 PCR kullanılarak mutasyon saptama yöntemlerinden
biri de, tek zincir konformasyon polimorfizmidir (single
strand conformational polymorphism: SSCP).
 Bir baz değişiminin neden olduğu mutasyonlar bu
yöntemle taranır.
 Tek zincirli DNA parçacığı bazı koşullarda nükleotid
dizisine bağlı olarak belirli bir konformasyon alır. Farklı
konformasyondaki parçacıklar elektroforezde farklı
hareket eder.
 Bir baz değişimi DNA'nın konformasyonunu,
dolayısıyla elektroforezdeki hareketini değiştirir.
 Yöntem hızlı ve basittir. DNA dizi analizi yapmadan
önce potansiyel baz değişikliği saptanabilir.
SSCP (Single Strand Conformational
Polymorphism)
 SSCP ile mutasyon saptaması yapmak için,
DNA önce PCR ile çoğaltılır.
 Çoğaltılan çift zincirli DNA denatüre edilerek,
tek zincirli hale getirilir buz içerisine alındıktan
sonra elektroforez jeline yüklenir.
 Elektroforez sonrası, baz dizisi farklı olan DNA
normal DNA'ya göre bant kayması (shift)
gösterir.
 Yöntemden iyi sonuç alınması için, kullanılan
DNA parçacığının 200 bç'i geçmemesi gerekir.
Bu durumda genin tümünü taramak için geni
200 bç uzunlukta parçalara ayırmak uygun
olur.
SSCP
SSCP
 HDA (Heterodubleks Analizi)
 Heterodubleks analizi mutasyon saptama
yöntemlerinden biridir. Yöntemin temeli; jel matriksinde
heterodubleks DNA moleküllerinin homodubleks
yapıdaki DNA moleküllerinden daha farklı göç etmesine
dayanmaktadır. Yöntem DNA örneklerinin yüksek
sıcaklıkta denatüre edildikten hemen sonra renatüre
edilmesi ile gerçekleştirilmektedir.
 Renatürasyon esnasında mutant DNA ipliği ile yabani
DNA ipliklerinin hibridize olması ile mutasyon noktasında
yanlış eşleşme yapmış bir baz çifti bulunur, bu da
heterodubleks DNA’ların oluşması anlamına gelir.
HDA’nın, 300 baz çiftlik veya daha küçük bir DNA
fragmanında %90-95 oranında güvenilirliği mevcuttur.
 HDA
DENEYİN YAPILIŞI:

 PCR ÜRÜNLERİNDEN 7µL YENİ PCR TÜPLERİNE

ALINIR. ÜZERLERİNE 3µL STOP SOLÜSYONU
KONULUR VE 95ºC’DE 5DK BEKLETİLİR. BU
BASAMAKTA DNA’LAR DENATÜRE OLUR VE İKİ
İPLİKÇİK BİRBİRİNDEN AYRILIR. SÜRE
SONUNDA DNA LAR RENATURASYON
SICAKLIĞINA ALINIR (50 ºC ) VE
RENATURASYON SAĞLANIR. EĞER MUTASYON
VARSA HETERODUBLEX YAPMIŞ DNA LAR
OLUŞACAKTIR.
 HDA
Deneyin Yapılışı:

 Daha önceden hazırlanan poliakrilamid jele yüklenir,

yürütülür. Yürütme işleminden sonra gümüş boyama
yapılarak bantların görünür hale gelmesi sağlanır ve
mutasyonun olup olmadığına bakılır.
 Eğer ipliklerden birinde mutasyondan kaynaklanan bir
baz değişimi varsa; bu iplik farklı konfigürasyonda
olacağından jelde de farklı yürür.
 Mutasyon yoksa konfigürasyonları aynı olduğundan,
jeldeki hareketlerinde farklılık olmaksızın aynı seviyede
yürüyerek, tek bant şeklinde görünürler.
HDA
HDA
 MSI (MICROSATELLIT INSTABILITY)
 MİKROSATELLİTLER DNA ÜZERİNDEKİ TEKRAR
BÖLGELERİNİN BİR ÇEŞİTİDİR.
 TEKRARLARDAN OLUŞTUKLARI İÇİN
REPLİKASYON HATALARINA DAHA YATKINDIRLAR
 TAMİR GENLERİ GİBİ BAZI GENLERDEKİ
MUTASYONLAR MİKROSATELLİT BÖLGELERİNİN
ARTMASINA YADA AZALMASINA NEDEN OLMAKTADIR
 BÖYLECE İLGİLİ MİKROSATELLİT BÖLGESİ PCR
İLE ÇOĞALTILARAK JEL ELKTROFOREZİNE TABİİ
TUTULURSA . NORMAL GENLE, MUTASYONLU OLANIN
MİKROSATELLİTLERİNDEKİ UZUNLUK FARKINA
BAKILARAK MUTASYON KARARI VERİLEBİLMEKTEDİR
 RFLP
(RESTRICTION FRAGMENT
LENGTH POLYMORPHISMS =
RESTRİKSİYON PARÇA
UZUNLUK POLİMORFİZMİ)

BAKTERİLERDEN İZOLE EDİLEN VE

BAKTERİDE İKEN BAKTERİ DNA SINI
METİLLEYEREK KORUMA GÖREVİNDEKİ
ENZİMLER KULLANILARAK
GERÇEKLEŞTİRİLEBİLİNEN BİR MUTASYON
ANALİZ YÖNTEMİDİR.
 BU ENZİMLER İZOLE EDİLDİKLERİ
BAKTERİLERE GÖRE İSİMLENDİRİLİRLER.
ÖRNEĞİN E.coli’den ECORI.
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN EN
ÖNEMLİ ÖZELLİĞİ ENDONÜKLEAZ
AKTİVİTESİNE SAHİP OLMALARIDIR. YANİ
BU ENZİMLER DNA MOLEKÜLÜNÜN İKİ
İPLİĞİNİ BİRDEN KESEBİLMEKTEDİRLER.
DNA ÜZERİNDE GENELLİKLE
PALİNDROMİK ( HER İKİ YÖNDEN
OKUNUŞLARI AYNI OLAN) DİZİLERİ
TANIYARAK KESERLER
HER ENZİMİN KENDİNE ÖZGÜ TAYIP
KESTİĞİ 4-10 NÜKLEOTİDLİK DİZİLER
VARDIR.
 RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

 İnsan genomu boyunca (özellikle kodlayıcı olmayan bölgelerde), her

200 nükleotitte 1 dizi farklılığı görülür. Bu özel bölgelerdeki nükleotit
değişiklikleri, tek bir nükleotit çiftinde değişiklik veya bir ya da birden
fazla nükleotit çiftinin çıkarılması (delesyonu) veya araya sokulması
(insersiyonu) şeklinde görülür ve bir restriksiyon enziminin kesim
noktasını ortadan kaldırabilir ya da yeni bir kesim noktası yaratabilir. Bu
şekilde yaratılan bir restriksiyon bölgesi, bir kromozomda bulunur fakat
diğer homolog kromozomda bulunmazsa, bu iki kromozom, restriksiyon
parçalarının membrana aktarılan (blotla­nan) profillerinin analizi ile
birbirlerinden ayırt edilebilir. Şekilde, kromozom A'nın bir bölgesi üç
tane BamHI kesim bölgesi içermektedir. Homolog kromozom B'de ise,
aynı bölgede BamHI'e ait iki kesim bölgesi bulunmaktadır. Kromozom
A, BamHI ile kesilince 3-kb ve 7-kb büyüklüğünde parçalar oluşurken,
kromo­zom B aynı enzimle kesildiğinde, sadece 10-kb büyüklü­ğünde bir
parça oluşur. Bu kromozomal bölgeye ait bir prob kullanılarak, bu
parçaların büyüklükleri Southem blot ile görüntülenebilir.
 LOH
(LOSS OF HETEROZIGOTY = HETEROZİGOTİ KAYBI)
 ÖZELLİKLE TÜMÖR HÜCRELERİNDE BAZI
GENLER SADECE TEK ALLELDEN OLUŞUR , 2.
ALLEL NONDİSJUNCTİON İLE KAYBOLABİLİR.
BÖYLECE BİR HETEROZİGOTİ KAYBI OLUŞUR.
 BU ALLEL KAYBININ BELİRLENEBİLMESİ
İÇİNDE PCR DA ÇOĞLATILAN DNA LAR
RESTRİKSİYON ENZİMLERİ İLE KESİLİR VE
ELEKTROFOREZE TABİİ TUTULURLAR
 GÖRÜNTÜLEME İÇİN RADYO AKTİF İŞARETLİ
PROBLARIN KULLANILDIĞI SOUTHERN BLOT
YÖNTEMİ KULLANILIR. ALLEL KAYBI VAR İSE
BELİRLENİR.
 DNA FINGER PRINT
(DNA PARMAK İZİ = DNA EL İZİ)
 VNTR
 Tipik olarak, her bir tekrardaki nükleotit sayısı
14'ten 100 nükleotite kadar değişebilir ve her
bölgedeki tekrar sayısı ise 2 ila l00'den fazla
sayıda olabilir.
 Bu bölgeler, değişken sayıdaki ardışık tekrarlar
(variable-number of tandem repeats, VNTR
olarak bilinir.
 Belirli bir bölgedeki tekrar sayıları değişiktir ve
her farklı tekrar sayısı bir VNTR allelini oluşturur.
Her bir bölge için düzinelerce farklı allelin
varlığına bağlı olarak, heterozigotluk oranı çok
yüksek olmaktadır.
 VNTR
 VNTR dizileri restriksiyon enzimleri ile kesilip,
Southern blot ile görüntülendiği zaman, ortaya
bir bant profili çıkar. Bu profil, DNA
parmakizi olarak bilinen profile bir örnektir.

 Bu profiller gerçek bir parmakizidir, çünkü, DNA

kaynağı olarak hangi doku kullanılırsa
kullanılsın, bant profili belirli bir birey için
her zaman aynı, fakat bireyden bireye
farklıdır.

 Gerçekte, bireyden bireye bant profillerinde o

kadar çok değişiklik vardır ki, teorik olarak her
bireyin bant profili sadece ona özgüldür ve
bireyler bu profillerin bir kısmını annesinden bir
kısmını ise babasından alır.
 VNTR
 DNA parmakizi analizi, çok az miktardaki
örneklerden [60 mikrolitre kan örneği] ya
da oldukça eski örneklerden bile elde
edilebilir (2400 yıldan daha yaşlı Mısır
mumyalarında VNTR analizi
gerçekleştirilmiştir) ve bu durum, tekniğin
kullanılabilirliğini ve önemini artırmaktadır.