KROMOZOM

BANTLAMA
TEKNİKLERİ ve
FISH
  İnsan kromozomlarındaki karyotipleme
çalışmaları sırasında benzer büyüklükteki ve
benzer konumlu sentromere sahip kromozomların
ayırt edilebilmesini sağlamak amacı ile
kromozomların uzun eksenleri boyunca farklı
boyanmaları bantlama olarak isim alır.
Günümüzde farklı bantlama yöntemleri
bulunmaktadır.
 Q BANTLAMA
Floresans boyalar
kullanılır ve böylece
kromozomlar
üzerinde farklı
bölgeler farklı renkte
boyanmış olur.
 C BANTLAMA
Kromozom preparatları ısı
ile denatüre edilip sonra
giemsa ile boyanır
böylece heterokromatin
bölgeleri boyanırken
diğer bölgeler boyanmaz.
NOR Bantlama
(Nukleolar organizer
bölgeler)
En sık kullanılan bantlama yöntemidir. Preparatlar
bir proteaz olan tripsin ile muamele edilir.
Ardından giemsa ile boyama yapılır.böylece A-T
açısından zengin olan bölgeler daha koyu boyanır.
Bu bantlar kromozomlara özgüdür ve
kromozomların kesin tanısında kullanılır. Ayrıca
bu bantlar sayesinde translokasyon, inversiyon,
delesyon gibi kromozomal hasarlar belirlenebilir.
Giemsa boyamanın ardından preperatların
sıcak tuz solüsyonu ile muamele edilerek G
bantlamadaki bant profilinin tam tersi elde
edilir. Yani burada A-T açısından zengin
bölgeler açık renk boyanırlar.
G BANTLAMA R BANTLAMA
FLOURESCENCE IN SITU
HYBRIDIZATION
(FISH)
YÖNTEMİ
Çeşitli dokulardan alınan hücrelerin (kültüre almadan)
DNA larını floresan işaretli problarla hibridize
ederek,bu floresan işaretler sayesinde söz konusu
DNA bölgesinin hücre içerisindeki durumunu
görmemizi sağlayan bir yöntemdir.
 Moleküler sito-genetikteki hızlı ilerlemeler,
bantlama ve boyama tekniklerinin hızlı
gelişimiyle sağlanmıştır.

 Standart bantlama teknikleri yalnızca bir

denemede bir hücre için tüm genomu
sorgulamada yetersiz kalmaktayken,
 Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH), genleri
ve kromozomları boyamada fluoresan
moleküllerin kullanıldığı bir yöntem olarak
bantlama teknikleriyle birlikte iyi bir
değerlendirme aracıdır.
 Bu yöntem gen haritalanmasında ve kromozom
aberasyonlarının tanımlanmasında kullanılır.
 Kromozomların çalışılmasında kullanılan birçok
teknik, aktif olarak bölünen hücreleri gerektirirken
(metafaz kromozomları),
 FISH aynı zamanda bölünmeyen hücrelere de
uygulanabilir (interfaz nukleusu).
 Metafaz delesyonları belirlemede kullanılır
 Interfaz genelde kromozomların yeniden
düzenlenmesinin ve kromozom sayılarının
belirlenmesinde kullanılır.
 Preperatların hazırlanması
 Materyalin preperat üzerine sabitlenmesi
 Ön yıkama
 Prob ve hedef DNA nın denaturasyonu
 Hibridizasyon
 Yıkama
 Görüntüleme
 Mikroskobi
 Fish yönteminde kullanılan probların işaretlenmesi
önemli bir aşamadır. Bu işaretleme doğrudan
floresan işaret taşıyan probun hedef DNA ile
hibridizasyonu ile olabildiği gibi indirekt işaretleme
ile yani floresan sinyal güçlendirilerekte yapılabilir.
Genellikle indirekt yöntem tercih edilir.
 İndirekt işaretlemede Biotin gibi moleküller önce
prob DNA içerisine yerleştirilir sonra biotinle çok
sıkı bağ yapan avidin gibi moleküller ortama konur
avidin molekülleri ayrıca floresan madde
taşırlar(Florescein izotiyosiyanat FITC=yeşil renk).
Daha sonra ortama anti avidin antikorları konur, bu
antikor hem probdaki avidin hemde ortamdaki
avidinlere bağlanır böylece sinyal güçlenir.
  Tekrarlayan bölge probları
 Lokusa özgü prob

 Tüm kromozomu boyayan prob

 Banda özgü prob
• Lokusa özgü olan problar bir kromozomun
belirli bölgeleriyle hibridizasyona girer. Bu tip
problar ilgilenilen belirli bir genin hangi kromozom
üzerinde yerleşmiş olduğunu belirlemede kullanılır.
•Alfoid veya sentromerik tekrarlı problar,
kromozomların sentromerlerinde bulunan
tekrarlayan dizilerden elde edilir. Kromozomlar
farklı renklerde boyanabildiği için, bu prob herhangi
bir bireyin doğru sayıda kromozoma sahip olup
olmadığının belirlenmesinde kullanılır.
 “Whole chromosome” probları, herbiri tüm bir

kromozom boyunca farklı dizilerle hibridizasyona
girebilen küçük probların kolleksiyonudur. Bu
şekildeki bir prob kitaplığı taranarak tüm bir kromozom
spektral bir karyotip oluşturmak üzere boyanabilir. Bu
teknik kromozomal translokasyonların tanımlanmasında
imakan sağlar.

 FISH ile sitogenetik çalışmalara yardımcı olan ve iyi

tanımlanmış uygulamalar geliştirilmiş olmasına rağmen,
amaca uygun prob ve filtre seçimi doğru yapılmaz ise
hatalı ve zaman alıcı denemeler ortaya çıkmaktadır.
 Prosedür
 Metafaz kromozomları veya interfaz nukleusu
kullanılarak preparatların hazırlanması
 Etanol içinde dehidrasyon
 DNA’yı 70oC’de denatüre etme
 Etiketli probun denatürasyonu
 Hibridizasyon için 37oC’de, 4-16 saat
inkübasyon
 TANISAL AMAÇ:
* Klinik sitogenetik
* Prenatal tanı (trizomi, monozomi, mozaizm,
translokasyon, delesyon)
* İnterfaz sitogenetiği (mayoz, mitoz,.)
* Mikrodelesyon sendromlarının tanısı
* Dokuda enfeksyon ajanlarının tanısı
* Kanser genetiği
* Dokuda mRNA düzeyinde onkogenlerin
değerlendirilmesi
ARAŞTIRMA AMACI:
* Gen haritalaması
* Tümör biyolojisi
* Viroloji
* Gen expresyon analizi
* Mayoz/mitoz analizleri
* Hücre tanımlaması
 Di George Sendromu (22q11.2)
 Prader Willi Angelman (15q11-13)
 Williams Beuren Sendromu (7q11.23)
 Smith-Magenis Sendromu (7p11.2)
 Wolf Hirschhorn Sendromu (4p16.3)
 Miller-Dieker Sendromu (17p13.3)
 Cri-du-Chat Sendromu (5p15.2/5p15.3)
Di George: metafaz görünümü Di George: İnterfaz hücresinde
Prader Willi / D115Z1 / SNRP / PML loküs bölgeleri
 Sayısal kromozom anomalileri (-7,+8, +12)
 Partial kromozom yada gen delesyonları

 Gen amplifikasyonları

 Translokasyonlar

 CGH ile tüm hücre genomunu tarama

Trisomy 7
11q23 MLL gen bölgesi
Trizomi 11q23 (ALL)
Trisomy 11(ALL)
 17p13.1 ( p53 )
p
17p11.1 - q11.1 (CEP 17)

q
P53 delesyonu
p
8p11.1 – q11.1 (CEP 8)

8q24.2 – q24.3 (c-myc)

t(9;22)(q34;q11.2) metafaz ve interfaz görüntüleri
t(9;22) (bcr/abl)
Monozomi 9, t(bcr;abl)
Monozomi 22
PML ve RARA lokusleri t(15q22;17q12-22.1)
t(15q22;17q12-22.1) şematik
t(15q22;17q11-12),(PML/RARA)
metafaz ve interfaz görünümü
t(2;5)(p23;q35) - Anaplastik büyük hücre lenfoması
t(8;14) - Burkitt's lenfoma (c-myc)
t(9;22)(q34;q11) - Philadelphia kromozom, Kronik
miyoljenik lösemi (KML), Akut lenfoblastik lösemi (ALL)
t(11;14) - Kabuklu hücre lenfoması (Bcl-1)
t(11;22)(q24;q11.2-12) - Ewing's sarkoma
t(14;18)(q32;q21) - Foliküler lenfoma (Bcl-2)
t(17;22) - Dermatofibrosarkomik protuberans
t(15;17) - Akut promyelötik lösemi
t(1;12)(q21;p13) - Akut miyelötik lösemi
t(9;12)(p24;p13) - Kronik miyelötil lösemi (CML), Akut
lenfoblastik lösemi (ALL) (TEL-JAK2)
t(X;18)(p11.2;q11.2) - Eklem sarkoması
t(1;11)(q42.1;q14.3)- Şizofreni
İnversyon 16 Şematik
İnversyon 16 probu ile FISH
  Sitogenetik kültür sorunları
 İnterfaz nükleusunda çalışılabilir
 Kantitatif ölçüm sağlar
 Tedavi sonrası izleme de ideal
 Lösemilerde p190 ve 210 aynı anda bakılabilir,
 Kırılmanoktaları değişebilen translokasyonlarda efektifdir

Örn: t(9;22), t(15;17), 11q23, inv 16

 Hızlı sonuç istendiğinde
 Klonal anomalilere sitogenetik yetersiz kalır
 Lökosit sayısı az olduğunda (<10.000) PCR yapılamazsa
 Yapılan çalışmalar normal bireylerde de bu tip translokasyonların
olduğunu gösterdi.
 Probun uygun olması ve doğru probun eldesi için
nelere bakılması gerektiğinin iyi bilinmesi

 Hibridizasyon için birleşme sinyali

 Nuklear organizasyonda beklenmedik

varyasyonlar