Professional Documents
Culture Documents
1)Hücrelerin Parçalanması
2) DNA – Protein Kompleksinin Çözünmesi
3)DNA’nın ortamdaki Diğer moleküllerden
Uzaklaştırılması.
1) HÜCRELERİN PARÇALANMASI
• EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetikasit) lı tüpe alınmış
kandan 400 µl alınır.
• 1000 µl TE (Tris EDTA) eklenir.
• 12000 rpm de 1 dk santrifüj
• Süpernatant atılır. Dipteki hücrelerle aynı işlem üç
sefer tekrarlanır.
• Son yıkamadan sonra Hücrelerin Üzerine 320 µl TE,
90 µl NaCl, 80 µl SDS (Sodyum Dodesil Sülfat), 10 µl
Proteinaz K eklenir.
• 56 C de 1,5 saat veya 37 C de tam gece bekletilir.
• EDTA ; Antikoaglükan maddedir.
• TE; Özellikle eritrositlerin parçalanmasında
kullanılan bir çözeltidir.
• SDS; bir deterjan türevidir ve özellikle hücre
zarındaki lipitleri uzaklaştırır.
• NaCl; tuz çözeltisi
• Poreteinaz K ; Proteolitik bir enzimdir.
2) DNA PROTEİN KOMPLEKSİNİN
ÇÖZÜNMESİ
• Lizatın üzerine 250 µl Fenol 250 µl Kloroform
eklenir, karıştırılır.
• 2500 rpm de 2 dk. Santrifüj edilir.
• Üst faz başka tüpe alınır alt faz atılır.
• Üst faz ile aynı işlem iki sefer daha tekrarlanır.
• Fenol proteinleri degrede ederken, kloroform
gradient farkı yaratarak DNA nın fenol ve
parçalanmış etıklarla beraber dibe çökmesini
engeller.
3) DNA nın DİĞER MOLEKÜLLERDEN
UZAKLAŞTIRILMASI
• Son fenol muamelesinden sonra farklı tüpe alınan
DNA içeren üst faz’a soğuk % 99 luk etanol eklenir
ve DNA çöktürülür.
• Soğuk etanolde DNA tüm diğer moleküllerden
(degrede olmuş veya olmamış RNA, protein
parçaları, fenol kalıntısı gibi) daha hızlı çökelir.
İZOLE DNA ‘ nın ANALİZİ
• SPEKTROFOTOMETRİK
• ELEKTROFORETİK
SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZ
• Nükleik Asitler 260 nm de maksimum
absorbsiyon gösterirler.