P. 1
YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ

YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ

|Views: 5,049|Likes:
Yayınlayan: kimyauzerine

More info:

Published by: kimyauzerine on Apr 13, 2011
Telif Hakkı:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

03/04/2013

pdf

text

original

GENEL GİRİŞ Gİ YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ KROMATOGRAFİ ( HPLC

)
HAZIRLAYAN Ömer ERCAN

• Klasik LC’’de numune ve hareketli faz kolonun LC
üzerinden ilave edilir.Hareketli fazın kolondan fazı sürüklenmesiyle bileşenlerin bantlar halinde bileş ayrılmaları sağlanır.Ayrılmayı iyileştirmek için; ayrı lmaları sağ lanı r.Ayrı lmayı iyileş iç daha uzun kolonlar (daha fazla süre) sü kullanılabilir veya dolgu maddesi kullanı inceltilebilir.Araştırmalar sonucunda; kolonun inceltilebilir.Araş uygun büyüklükte dolgu maddesiyle bü klü doldurulduğu ve kolonun üstünden yüksek doldurulduğ stü yü basınç uygulandığı HPLC elde edilmiştir. bası uygulandığı edilmiş

HPLC 4 bölümde incelenir. bö
• Yüksek performanslı sıvı performanslı
kromatografisinde,

• Hareketli faz: Sıvı Sı • Durgun faz: Çok küçük katı parçacıklardan küçük katı parçacı
oluşur. oluş • Uygun akış hızları elde edebilmek akış zları için,sıvıya birkaç yüz psi’lik veya daha in,sı birkaç psi’ yüksek bir basınç uygulanması gerekir. bası uygulanması

• 1)Dağılma kromatografisi (sıvı-sıvı krom.) 1)Dağılma (sı • 2)Adsorpsiyon kromatografisi (sıvı-katı (sı katı
krom.)

• 3)İyon değiştirici kromatografi 3)İ değ • 4)Jel kromatografisi (jel geçirgenlik ve jel geç
süzme kromatografisi) • Bu sıvı kromatografi teknikleri aslında sı aslı uygulamalarda birbirini tamamlayan tekniklerdir. (Şekil 1 ) (Ş

HPLC’nin Önemi HPLC’
• HPLC, bütün analitik ayırma metotları bü ayı metotları
arasında en çok kullanılanılanıdır.Bunun arası kullanılanılanı nedenleri: • Hassas olması olması • Sıcaklığa hassas olan maddelere bile caklığa uygulanabilmesi • Doğruluk dereceleri ve kesinlikleri yüksek Doğ yü sonuçlar vermesi sonuç

• Şekil 1 Sıvı kromatografinin uygulamaları Sı uygulamaları

1

Metodun uygulanabildiği başlıca uygulanabildiğ baş alanlar şunlardır: unlardı
• • • • • • • • • •
Nükleik asitler Terpenoitler Pestisitler Antibiyotikler Steroitler Proteinler Amino asitler Hidrokarbonlar Karbonhidratlar Organometalik bileşikler ve bazı inorganik bileş bazı maddeler

HPLC’de Ekstra Bant Genişlemesi HPLC’ Geniş
• HPLC’de bazen kolon dolgu maddesinin HPLC’
haricinde önemli bir bant genişlemesi geniş olur.Bant genişlemesi genel olarak; geniş enjeksiyondan,dedektörden veya boru enjeksiyondan,dedektö birleştirme kısımlarından kaynaklandığı halde birleş kı mları kaynaklandığı ekstra bant genişlemesi, sıvının kolon geniş sı duvarlarına yakın bölgelerindeki ve orta duvarları yakı bö kısımlardaki akış hızlarının farklılığından akış zları farklı ığından kaynaklanır. GC’ de bu genişleme difüzyonla kaynaklanı GC’ geniş difü bertaraf edilebilirken LC’de bu pek mümkün LC’ mü mkü değildir. değ

HPLC CİHAZI Cİ ve Başlıca Kısımları Baş Kı mları
• Çözücü Haznesi ve Çözücü Çöz Çöz • Yüksek Basınç Pompası (Pompa Sistemleri) Bası Pompası • Akış Kontrolü ve Programlama Sistemleri Akış Kontrolü • Numune Enjeksiyonu • Kolonlar ve Kolon Termostatları Termostatları • Kolon Dolgu Maddesi Tipleri • Dedektörler Dedektö
• Şekil 2 HPLC cihazının şematik görünümü cihazı gö

Çözücü Haznesi ve Çözücü Çöz Çöz
• Her cihazda en az bir tane 500 mL’lik bir mL’
çözücü haznesi bulunur.Çözücü sıvılarda çöz bulunur.Çöz bulunabilecek tozları ve çözünmüş gazları tozları çöz nmü gazları uzaklaştırmak için önlemler alınır.(pik uzaklaş iç alı genişlemesi ve girişime sebep olurlar) geniş giriş • HPLC metodunda izokratik elüsyon, çözücü elü çöz bileşiminin sabit tutulduğu bir tekniktir. bileş tutulduğ • HPLC’de gradiyent elüsyon çözücü HPLC’ elü çöz bileşiminin sürekli veya basamaklı bileş sü basamaklı değiştirildiği bir tekniktir. değ tirildiğ

2

Pompa Sistemleri
• LC’de kullanılan pompaların özellikleri: LC’ kullanı pompaları • 6000 psi’ye kadar basınç oluşturabilmeli psi’ bası oluş • Pulssuz sıvı çıkışı bulunmalı sı bulunmalı • Akış hızı 0,1-10 mL/dakikaya Akış 0,1ayarlanabilmeli

• İki tip mekanik pompa vardır: vardı • 1)Vidalı şırınga:Akış hızı kolay kontrol 1)Vidalı şır nga:Akış
edilebilen,pulsuz akış sağlar.Kapasiteleri akış sağ sınırlıdır. rlı

• 2)Reciprocating pompa:Daha yaygın yaygı
kullanılır.İç hacminin küçüklüğü,yüksek kullanı r.İ küçüklü ,yü çıkış basıncı,gradiyent elüsyon tekniğine basıncı elü tekniğ kolay uyarlanabilme ve sabit akış hızı akış üstünlükleri vardır. stü nlü vardı

• Akış hızı tekrarlanabilirliği >%5 olmalı Akış tekrarlanabilirliğ olmalı • Çok sayıda çözücünün korozyon etkisine sayı çöz
karşı dayanıklı olmalı karşı dayanıklı olmalı

Numune Enjeksiyon Sistemi
• Elastomerik bir septum içerisinden şırınga ile iç şır
enjeksiyon yaygındır ama tekrarlanabilirliği yaygı ndı tekrarlanabilirliğ düşüktür. ktü

• Akış-durdurma enjeksiyon sistemlerinde çözücü Akışçöz
akışı ani olarak durdurulur,kolondaki bağlantı akışı bağ lantı çıkarılarak şırınga ile dolgulu kolona enjekte karı şır edilir.Bu numune uygulama lupları ile yapılır.5lupları yapı r.5500 µl enjeksiyona uygun luplar vardır.Bu sistem vardı enjeksiyonun tekrarlanabilir ve uygun basınçta bası yapılmasını sağlar. yapı lması sağ

• Şekil 3 HPLC’’de kullanılan reciprocating pompa HPLC kullanı

Kolon Sistemleri
• Kolon çapları ve uzunlukları yapılacak işlere apları uzunlukları yapı iş
bağlıdır.Kolonların uzunluğu 130 cm ve iç çapı 4bağ r.Kolonları uzunluğ iç apı 10 mm civarındadır.Dolgu parçacık boyutu 5-10 civarı ndadı parç acı 5µm kadardır.Bu kolonların 1 metresinde 40.000kadardı kolonları 40.00060.000 tabaka bulunur.Son yıllarda uzunluğu 3yı uzunluğ 37,5 cm iç çapı 1-4,6 mm olan mikro kolonlarda iç apı üretilmeye başlamıştır.Tabaka sayısı 100.000’e başlamışt sayı 100.000’ kadar çıkmaktadır. kmaktadı LC’de kullanılan en yaygın dolgu maddeleri LC’ kullanı yaygı silisyum dioksittir.Parçacıkların yüzeyi fiziksel dioksittir.Parç acı kları yü veya kimyasal bağlarla ince organik bir filmle bağ kaplanır. kaplanı Alümina, polimerler ve iyon değiştirici reçinelerde Alü değ reç dolgu maddesi olarak kullanılmaktadır. kullanı lmaktadı

• Şekil 4 Numune
uygulama lupu.

3

Dedektörler Dedektö
• HPLC’de genel ve özel amaçlı olmak üzere HPLC’ amaç
iki tip dedektör kullanılır.Genel amaçlı dedektö kullanı amaç dedektörler, hareketli fazın kırma indisini, dedektö fazı kı dielektrik sabitini, yoğunluğunu ölçen yoğ unluğ dedektörlerdir.Bu özellikler çözünenin dedektö çöz konsantrasyonuna ve türüne bağlı olarak tü bağ değişir. Buna karşılık özel amaçlı değ karşıl amaç dedektörler, bir maddenin UV dedektö absorpsiyonunu, floresansını, difüzlenme floresansı difü akımını ölçer. akı

• Ultraviolet / Visible detector (UV/VIS)
• • • • • • •

Photodiode Array detector (PDA) Fluorescence detector (RF) Conductivity detector (CDD) Refractive Index detector (RID) Electrochemical detector (ECD) Mass detector (MS) Evaporative Light Scattering detector (ELSD) (ELSD)

UV-VIS. Absorbans Dedektörleri UVDedektö UV DEDEKTÖR DEDEKTÖ
• En çok kullanılan dedektörlerdir.Piyasada kullanı dedektö
kolonlara takılarak kullanılabilecek şekilde takı kullanı özel tasarlanmış fotometre ve tasarlanmış spektrofotometrelerde vardır.Bir çok vardı organik madde UV bölgede absorpsiyon bö gösteren fonksiyonlu gruplar bulundurduğu için fotometrelerde 245 nm bulundurduğ iç ve 280 nm d.boyunda ışın veren civa ışın lambaları kullanılır. lambaları kullanı

• Absorbans ölçümü çüm C : concentration Cell
Ein
b

Eout
Lambert-Beer yasası

AbC= - log (Eout / Ein)
(A : absorbance)

UV DEDEKTÖR
Çalışma prensibi

UV DEDEKTÖR DEDEKTÖ
• UV dedektörün olanakları dedektö olanakları
– İki ayrı dalga boyunda çalışabilmek ayrı alışabilmek – Oran kromotogramı alabilmek kromotogramı – Dalga boyunu zamana karşı karşı programlayabilmek – Spektrum taraması yapabilmek taraması – D2 / W lamba seçeneği seç eneğ – Değişik çalışma türleri için hücre Değ alışma tü iç hü seçenekleri seç
23

4

Floresans Dedektörleri Dedektö
• En basit floresans dedektörlerinde,uyarıcı kaynak dedektö rlerinde,uyarı
olarak civa lambası,ışınları süzmek için de lambası ışınları iç filtreler kullanılır.Daha iyi cihazlarda uyarıcı kullanı uyarı ksenon ark lambası ve monokromator lambası kullanılır.Floresans metodunun avantajı, her kullanı avantajı hangi bir absorbans metodundan en az10 defa daha hassas olmasıdır.Bu avantaj LC’de daha da olması LC’ iyidir, çünkü LC ile ayrılan maddeler,farmasotik çünkü ayrı maddeler, kriminal maddeler, klinik maddeler, petrol ürü nleridir ki bunların çoğu şiddetli bunları floresandır. floresandı

FLORESANS DEDEKTÖR DEDEKTÖ
• Floresans oluşumu oluş
Excitation Wavelength

+ hn1

*
hn2+
Emission Wavelength

*
A*
hn1 hn2

A

Fluorescence A

FLORESANS DEDEKTÖR DEDEKTÖ

Çalışma prensibi alışma

Kırma İndisi Dedektörleri Dedektö
• Güvenilir cihazlardır.Akış hızından cihazlardır.Akış
etkilenmezler ve her madde için iç kullanılabilirler.İndis ölçmeleri sıcaklığa çok kullanılabilirler.İ sıcaklığa bağımlıdır.Diğer dedektörler kadar hassas bağımlı r.Diğ dedektö değildirler.(Duyarlılığı düşüktür) değ ildirler.(Duyarlı ktü

REFRACTİVE INDEX DETECTOR REFRACTİ

Çalışma prensibi alışma

Işın Dağıtıcı Dedektörler (ELSD) şın Dağıt Dedektö
• ELSD, HPLC için son zamanlarda geliştirilen iç geliş
genel amaçlı dedektörlerdendir.Böylece amaç dedektörlerdendir.Bö dedektörlerde kolondan gelen çözelti,bir dedektö çözelti,bir nebülizöre aktarılır.Çözelti orada azot veya hava nebü lizö aktarı r.Çözelti akımıyla ince bir sis haline getirilir.Bu sis sıcaklığı akı sı caklığı kontrol edilen bir tüpten geçirilir.Burada çözücü tü geç çöz buharlaştırılır.Geriye analizi yapılan maddenin buharlaş yapı mikrokürecikleri kalır.Bu parçacıklar bir lazer mikrokü kalı parç acı demetinden geçirilir.Etrafa yayılan ışınlardan geç yayı ışınlardan parçacık akımına dik olan yöndeki ışın demeti parç acı akı yö ışın fotodiyotla ölçülür.Bunun avantajı uçucu çül avantajı olmayan bütün maddelere uygulanabilmesi ve bü tekrarlanabilirliğinin yüksek olmasıdır. tekrarlanabilirliğ yü olması

Sıcaklık kontrolü

5

Kütle Spektrometrisi Dedektörleri Dedektö HPLC-MS HPLC• HPLC, bütün analitik ayırma metotları arasında bü ayı metotları arası • •
en çok kullanılanılanıdır.Bir çok bileşiği çok iyi kullanı lanı lanı bileş ayırabilmektedir.Fakat bunları tanıyamaz. ayı rabilmektedir.Fakat bunları tanı MS, pek çok bileşiğin tam olarak tanınması gibi bileş tanı nması detaylı yapısal bilgi verebilir.Fakat bunları detaylı yapı verebilir.Fakat bunları kolayca ayıramaz. ayı Hem HPLC hem de MS yöntemleri kullanım yö kullanı alanlarını genişletmek ve aynı zamanda daha alanları geniş aynı güçlü bir analitik teknik oluşturmak üzere üçl oluş birleştirilmektedir. birleş

MASS DETECTOR
• Çalışma prensibi alışma
Vacuum

+ ++ + ++ + + ++

+ + ++ + + + +

+ ++ ++ +

+

+

+

Mass analyser Skimmer lens

Rotary pump

TMP1

TMP2

MASS DETECTOR
• Diquat’’ın mass spektrumu Diquat

Dağılma Kromatografi Dağılma
• Bütün sıvı kromatografi teknikleri içinde en sı iç
fazla kullanılanı dağılma kromatografisidir. kullanılanı dağılma Sıvı-sıvı kromatografi ve sıvı-bağlı faz bağ kromatografi olmak üzere iki alt sınıfta sı incelenir.

Normal-Faz ve Ters-Faz Dağılım NormalTersDağıl
• Sıvı-sıvı dağılma kromatografide durgun dağılma
faz, katı dolgu parçacıkları yü zeyine katı parçacı kları adsorpsiyonla tutturulmuş bir çözücüdür. tutturulmuş çöz

• Durgun faz ile hareketli fazın bağıl fazı bağıl
polaritelerine göre iki tip dağılma krom. gö dağılma vardır. vardı • Normal-faz dağılma kromatografide, Normaldağılma durgun faz polar; hareketli faz ise apolardır. apolardı • Ters-faz dağılma kromatografide ise Tersdağılma durgun faz apolar; hareketli faz polardır. polardı

• Sıvı bağlı faz kromatografide durgun faz, bağ
katı dolgu parçacıkları yüzeyine kimyasal katı parç acıkları bağlarla tutturulmuş organik bağ tutturulmuş maddelerdir.Daha sık kullanılır. sı kullanı

6

• Normal-faz kromatografide polarlığı en az Normalpolarlığı
olan bileşen kolondan en önce bileş çıkar,hareketli fazın polarlığı arttıkça fazı polarlığı arttı elüsyon zamanı azalır. elü zamanı azalı

Uygulamalar

• Şekillerde ve tabloda bağlı-faz dağılma bağ dağılma
kromatografi ile yapılan tipik çalışmalar yapı alışmalar belirtilmiştir. belirtilmiş

• Ters-faz tekniğinde ise, polarlığı en çok Terstekniğ polarlığı
olan bileşen kolondan ilk önce çıkar ve bileş hareketli fazın polarlığı arttıkça elüsyon fazı polarlığı arttı elü zamanı artar. zamanı

• Bir alkolsüz içecek alkolsü iç
katkı maddesinin sıvı katkı sı bağlı faz bağ kromatogramı. kromatogramı

• Bir organik fosfat
böcek ilacının sıvı ilacı sı bağlanmış faz bağ lanmış kromatogramı. kromatogramı

Yüksek Performanslı Dağılma Performanslı Dağılma Kromatografinin Uygulamaları Uygulamaları

Adsorpsiyon Kromatografisi
• Adsorpsiyon kromatografisinde analit,polar
bir dolgu maddesinin yüzeyine adsorplanır. yü adsorplanı

• Adsorpsiyon kromatografisinde, hareketli
faz genellikle bir organik çözücü veya org. çöz çözücülerin karışımıdır.Durgun faz ise, çok çöz karışım ince bir şekilde öğütülmüş silis veya lmü alümina tozudur. alü

7

İyon kromatografisi
• Adsorpsiyon kromatografisi, daha çok mol
kütleleri 5000’den daha az,nispeten apolar 5000’ ve suda çözünmeyen organik maddelerin çöz ayrılmasında kullanılır.Diğer tekniklerde ayrılması kullanı r.Diğ bulunmayan en önemli özelliği, meta ve zelliğ para sübstitüe benzen türevleri gibi sü bstitü tü izomerik karışımları ayırabilmesidir. karışımları ayı

• İyon kromatografisi, analitin sulu bir
hareketli faz içerisinde iyonlaşarak iç iyonlaş çözündüğü bir HPLC tekniğidir.Durgun faz çöz ndü tekniğ ise çok ince olarak öğütülmüş bir iyon lmü değiştirici reçinedir. değ reç

Boyut Ayırıcı Kromatografi Ayı
• Boyut ayırıcı iyon kromatografisinde ayı
ayırma, molekül boyutlarına dayanır. ayı molekü boyutları dayanı • Jel süzme tekniği, polar türlerin sü tekniğ tü ayrılmasında kullanılan,dolgu maddelerinin ayrılması kullanı hidrofilik olduğu bir çeşit boyut ayırıcı olduğ ayı kromatografidir. • Jel geçirgenlik tekniği, apolar türlerin geç tekniğ tü ayrılmasında kullanılan, dolgu ayrılması kullanı maddelerinin hidrofobik olduğu bir çeşit olduğ boyut ayırıcı kromatografidir. ayı

Kaynaklar
• İnstrümental Analiz-Prof.Dr.Turgut Gündüz nstrü AnalizGü ndü • Enstrümental Analiz İlkeleri-Skoog,West Enstrü lkeleri• Analitik Kimya Temelleri 2

www.kimyauzerine.com

8

You're Reading a Free Preview

İndirme
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->