Schlanser C. Rev.brm.hemtol.

hemotm, 2000,22 (Suplemento2):248-252

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Artigo

Uso de potenciadores en banco de sangre

Gloria Schlanser Es descripto las tecnicas potenciadoras e substancias que se emplean

en imunohematologia e banco de sangre para promover modzficacion
en el medios de prueba. Son considerados potenciadores de la
aglutinacion la albumina bovina, soluciones de baja fuerza ionica y
o po2ietilenglicol.
Reu.bras.hematol.hemoter., 2000(22) (Suplemento 2): 248-252

Palavras-chave: Imunohematologia, potenciadores

La interacción antigeno eritrocitário- Factores que afectan la aglutinación

anticuerpo puede ser detectada por diversas
técnicas serológicas, entre ellas, la precipitación
la aglutinación, la inhibición y la hemólisis. Los
métodos utilizados con mayor frecuencla en el
laboratorio de Inmunohematologla tienen como
punto final la hemólisis o la aglutinación. El
fenómeno de la aglutinación proporciona la
manera más fácil de estudlar la reacción entre los
antigenos eritrocitarios y sus anticuerpos
correspondientes. La prueba puede llevarse a cabo
en un portaobjetos o cualquier otra superficie
5 plana, en tubos, en capilares, etc. El resultado de
la prueba es simple de interpretar, la presencia
de aglutinación indica que ha ocurrido una
reacción antígeno-anticuerpo, mientras que su
ausencla indica lo contrario.
La aglutinación sucede en dos etapas, durante
la primera etapa el anticuerpo se une al antigeno
correspondiente en la membrana eritrocitaria. La
fijación ocurre entre la región varlable de la
inmunoglobulina (Fab) y los determinantes
antigénicos correspondientes. El proceso se
conoce con el nombre de sensibilización y a este
punto la reacción no es visible.
La segunda etapa es el resultado de colisiones
entre hematfes sensibilizados que dan lugar a la
formación d e "puentes" entre ellos y la
subsiguiente visualización de la aglutinación.
La aglutinación de hematíes es una reacción
físico-quimica con parámetros definidos. Entre
ellos se incluyen la temperatura de incubación,
el período de incubación, la fúerza iónica, el
pH, la concentración del anticuerpo, la clase
de inmunoglobulina presente y la concentracion
del antigeno. El uso de potenciadores se basa
en el principio de que los factores que afectan
la reaccion antígeno-anticuerpo pueden
manipularse de tal manera que antieuerpos que
reaccionan débilmente puedan dar reacciones
fuertes. Diferentes factores afectan las diferentes
etapas de la aglutinación.
Primera etapa
La asociación del antígeno con el anticuerpo
es reversible y es afectada por la concentración
del antigeno y el anticuerpo y por factores fisicos
como el pH, la fuerza iónica y la temperatura.
Concentración de antigeno y anticuerpo
Es más probable q u e se produzca la
sensibilización cuando el anticuerpo se balla en
concentración elevada. Esto puede lograrse
aumentando la proporción del suero en relación
con los hematies.

r;
Reference and Education Immucor, Inc

Temperatura
La mayoría de los anticuerpos de grupo
sanguíneo presentan un rango térmico específico.
Generalmente, los anticuerpos IgM reaccionan
mejor a temperaturas bajas, mientras que los IgG
se detectan mejor a 37°C y e n la fase d e
antiglobulina. En medicina transfusional es de
importancia detectar solo los anticuerpos que se
consideran clinicamente significativos.
Generalmente, estos anticuerpos reaccionan mejor
a 37°C y en la fase de antiglobulina.
Período de incubación
El período de incubación necesario pra que
la reacción antigeno-anticuerpoalcance el equilibrio
varla para los anticuerpos de los diferentes grupos
sanguíneos. Esta variación es principalmente debido
a la clase de inmunoglobulina y a la interacción
específica entre la región Fab del anticuerpo y la
configuración antigénica. La adición de sustancias
que afectan la captación de anticuerpo puede
disminuir el tiempo de incubación.
Fuerza iónica
Los iones de ~ a ' y~ 1 presentes
- en la
solución salina normal se agrupan alrededor
d e las moléculas d e antígeno y anticuerpo y
neutralizan parclalmente sus cargas opuestas,
lo cual dificulta la unión entre ellos. El efecto
p u e d e reducirse disminuyendo la fuerza
iónica del medio. -
PH
Aunque no se ha determinado el pH óptimo
para la mayorla d e anticuerpos d e grupo
sanguíneo de importancia clínica, se supone que
s e aproxima al pH fisiológico. Sin embargo,
algunos anticuerpos, como por ejemplo anti-M,
reaccionan mejor a pH bajo.
Segunda etapa
Después que el anticuerpo se ha fijado al
antígeno e n la superficie eritrocitaria, los
hematies sensibilizados deben unirse pra asi dar
lugar a la aglutinación. El tamaño y las
p r o p i e d a d e s fisicas d e l a n t i c u e r p o , la
concentración de los sitios antigénicos en cada
hematie, y la distancia entre las células afectan
la segunda etapa de la aglutinación.
L,
DZstancia entre las células
Los hematies tienen una carga neta negativa
en la superficie y la interacción con los iones del
medio en que están suspendidos altera esta carga,
dando como resultado una carga neta líamada
potencial zeta. La reducción de la carga que
separa a los hematies permite que estos se
aproximen y se produzca la aglutinación.
El agua de hidratación es otra propiedad
fisica que mantiene la distancia entre los hematies
suspendidos en solución salina. Se piensa que
las moléculas de agua fuertemente unidas a la
membrana celular actúan como alslantes y evitan
el acercamiento entre los hematies.
Tamaño del anticuerpo
Las reacciones que incluyen las moléculas
de IgM suceden con facilidad ya que debido a
su tamafio, estas moléculas pueden cubrir la
distancia necesarla para formar puentes con otros
hematies. Este no es el caso con las moléculas
de IgG, las cuales debido a su tamaño no pueden
cubrir esas distancias y solo producen la
sensibilización.
Potenciadores de la Aglutinación
Se define como potenciadores a aquelías
sustancias que se emplean para modificar el m
-
medio de prueba como una manera de promover
la aglutinación de hematies antigeno-positivos
por los anticuerpos IgG correspondientes. Con
este fin se han desarrollado un número de
potenciadores para la detección de anticuerpos
irregulares en pruebas de rutina (l), entre los
más comúnmente usados se incluyen, la albúmina
bovina, las soluciones de baja fherza iónica y en
años recientes el polietilen glicol.
Albúmina bovina
El uso de la albúmina bovina se introdujo en
1945 cuando se descubrió que algunos anti-D
aglutinaban los hematies con el antígeno
correspondiente solo cuando estos estaban
suspendidos en albúmina (3). En 1965, Pollack y
colaboradores investigaron el mecanismo de acción
de la albúmina y concluyeron que reducla el .
potencial zeta de la mezcla asi permitiendo que
los hematies se aproximen los unos a los otros (4).
 Las soluciones de albúmina bovina están
disponibles en concentraciones del 22% y el 30%.
La calidad del reactivo y por lo tanto su capacidad
de potenciar la aglutinación depende de vazios
factores q u e incluyen la concentración d e
proteína, el grado de polimerización, el pH y la
fúerza iónica del diiuyente. Debido al grado de
viscosidad de algunos reactivos aí 30% y la
dificultad q u e p u e d e n presentar e n la
resuspensión de los hematies, muchas personas
prefleren trabajar con la albúmina al 22%. Sin
embargo, la solución aí 30% da una mayor
probabilidad de alcanzar la potenciacón deseada
del anticuerpo. En una publicación en la revista
Transfusion, Jones indicó que solo es posible
alcanzar la potenciacón adecuada con albúmina
si la concentración final de albúmina en la mezcla
de suero y hematies es de alrededor del 15%.
En los años 60, Stroup (6) y colaboradores
informaron que muchos anticuerpos potenclaban
su reactividad si se afladla albúmina a la prueba.
Algunos de estos anticuerpos reaccionaban en
la fase de antigiobulina después de un período
de incubación más corto que sin la adición de
albúmina. Estudios posteriores demostraron que
el efecto de la albúmina en la primera fase de la
agiutinación es mínimo y los resultados que se
observaron en los estudios de Stroup pueden
haber sido debidos a la flinción de la fuerza iónica
del diluyente de la albúmina.
La albúmina no es un potenciador de la
aglutinación directa cuando se emplea a la
concentración d e l 22% c o n hematies
suspendidos en salina. Por ejemplo:
2 gotas de suero(6%) = 2x6 =12
1 gota de hematies (0%) = O
2 gotas de albúmina (22%) = 22x2 =44
- alta que la deseada y esta varlación afecta la
56
Divida por el número de gotas(5) =11.2%
Cuando se emplea d e esta manera la
concentraciónfinaldeproteinaenlamezcla
está por debajo del óptimo mencionado por
1 Jones (5). Su acción como solución potenciadora
es dudosa, al menos cuando la prueba se incuba
solo durante 15 minutos.
Soluciones de baja fuerza iónica
El uso de soluciones de baja flierza lónica
para incrementar la captación de anticuerpo en
la prueba d e antiglobulina indirecta fue
iniclalmente descrito en 1964 por Hughes-Jones
y colaboradore y Elliot y colaboradores (7). Sin
embargo, en ese entonces habla cierta aversión
a usar este método en la rutina debido a las
reacciones positivas-falsas que podlan ocurrir.
En 1974, L6w y Messeter (7) describieron
el uso en las pruebas rutinarlas de detección de
anticuerpos y de compatibilidad de una solución
LISS de 0.03M que prácticamente no daba
resultados positivos-falsos. En un articulo
publicado en la revista Transfusion, describieron
el uso de in medio de baja fiuerza iónica para
la suspensión d e hematies que permitía la
reducción del período de incubación.
La técnica consistla en iniclalmente lavar
los hematies a emplear con soiución salina y a
continuación resuspenderlos en una solución
LISS a 0.03. Puesto que los hematies muestran
tendencla a hemolizar al ser suspendidos en
salina a una fuerza iónica tan baja, la presión
osmótica de la solución se reestablece a nivel
fisiológico medlante la adición d e alguna
sustancla no-iónica,; la sustancla más usada es
la glicina. Para la prueba, se mezclaban
volúmenes iguales de suero y de hematies
suspendidos en LISS a una concentración del
5%. La mezcla se incuba durante 5 minutos a
37"C, se centrífuga, se iee se lava 4 veces y se
aflade el reactivo de Coombs.
La prueba se centrifuga nuevamente y se
lee. La fuerza iónica óptima s e obtiene
mezclando volúmenes iguales d e suero y
hematies. Cualquier aumento en la relación
suer0:hematíe.s resulta en una fuerza iónica más
sensibilidad de la prueba. Este método tiene la
desventaja que la suspensión de hematies debe
prepararse el dla de uso.
En años posteriores, se desarrollaron
soluciones aditivas d e baja fuerza iónica que
p o d l a n s e r afladidas directamente a la
prueba sin antes tener q u e resuspender los
hematies en ellas. Existen eu el mercado
d o s clases d e soluciones d e baja fuerza
iónica; lo que se podrla líamar el LISS simple
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Reu.hras.hematoI.hemot~~.,
o tradicional y LISS al que se han afladido
macromoléculas para potenciar la aglutinación
directa por ciertos anticuerpos, particularmente
los del sistema Rh.
Las soluciones de baja fuerza iónica aumentan
la velocidad de asoclación entre los anticuerpos
d e g r u p o sanguíneo y los antigenos
correspondientes,asi permitiendo acoitar el tiempo
de incubación de la prueba sin sacrificar su
sensibilidad.
Polletilen Glicol
El uso de polletilen glicol como potenciador
de la reacción antigeno-anticuerpo lhe descrito
iniclalmente en 1985 por Nance y Garratty (8, 9).
PEG es un polimero linear de etilen glicol que
afecta la primera fase de la aglutinación. Cuando
se afladen los polímeros a la prueba, ocurre la
exclusión estérica de las moléculas de agua, lo
cual causa que las moléculas de anticuerpos y los
hematies estén e n mayor proximidad asi
incrementando la velocidad y la cantidad de
captación de anticuerpo (9, 10, 11, 12). En sus
estudios, Nance y Garraty observarom que la
potenciacón de reacciones débiles era óptima
cuando se empleaba PEO, de peso molecular de
4000, al 20% en tampón fosfato. El procedimiento
empleado consistla en mezclar dos gotas de suerc
una gota de hematies aí 4% y cuatro gotas de
PEG con incubación a 37°C durante 15 minutos.
Después de la incubación, la prueba se lava cuatro
veces y se afkade anti-IgG.
Estudios posteriores demostraron que el uso
de polietilen glicol incrementa la sensibilidad de
las pruebas de detección de anticuerpos irregulares
clinicamente importantes medlante la prueba de
antigiobulina indirecta y la facilidad de su uso en
las pruebas de rutina (11, 12, 13, 14).
En los años 90 se desarroilaron soluciones
aditivas de polletilen glicol que incorporan el uso
de un entorno d e baja fuerza iónica. Esta
modificación permite emplear solo dos gotas del
reactivo para alcanzar la sensibilidad deseada en
la detección de anticuerpos IgG (15).
Enzimas
En 1946, I'ickles (16) describió por
primera vez el uso d e las enzimas e n la
Schlar~rerG.
e
serologla d e grupos sanguíneos. Algunas
enzimas proteolíticas, como por ejemplo la
ficina, la papaína y la bromelina, son d e
utiiidad en la potenciacón d e reacciones
serológicas, particularmente las d e los
anticuerpos de los sistemas Rh y Kidd.
Las enzimas pueden emplearse de dos
maneras, la enzima p u e d e ser a.fladida
directamente a la mezcla de suero y hematies en
lo que se conoce como la técnica a un paso, o
los hematies pueden ser tratados con la enzima
antes de usarmos para la prueba, en la técnica a
dos pasos. Sin embargo, el uso de las enzimas
e n la rutina del laboratorio tiene varlas
desventajas. Primero, los antigenos M, N, ~ y " ,
b
Fy , algunos 5 y s son destruidos por el
tratamiento con enzimas; por lo tanto, si el
anticuerpo correspondiente está presente en la
muestra, no puede ser detectado. En segundo
lugar, las enzimas potenclan anticuerpos frios,
resultando en la demora eu proporcionar la
sangre aí paciente y trabajo adicional debido a
anticuerpos sin importancia clínica.
El uso d e enzimas es una herramienta
importante en la identificación de anticuerpos,
pero su uso es limitado en las pruebas pre-
transfisionales de rutina.
Conclusión
Es importante recordar que no existe un
reactivo perfecto para la potenciación de todos
los anticuerpos de importancia clínica. Cada uno
de ellos tiene sus aplicaciones asi como sus
limitaciones. La selección del medio d e
potenciacón depende de la experiencla del
personal, la necesidad, basándose en la clase de
pacientes, y la preferencia.
The use of potentiators in blood banks
GlorZa Scblanser
Abstract
The tecbniquesfor Potentiators o f reactions used
in immunohematology and tbe blood bank to
make clear a n eytbrocyta y antigen reaction
are described in this repofl.Bovine albumin, low- %
..
ionic strengtb salt solution and polyetbylene
glycol are included witbin tbe potentiators.
 R e v . hras.hematol.hemoter.,2000(22)
(Suplemento 2): 248-252
Key words: Immunohematolo~y,potentiators
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