Cromatografia de inalta performanta

HPLC

Metode cromatografice
Dintre toate metodele de separare, cromatografia are o pozitie unica,
putand fi aplicata tuturor problemelor din toate domeniile stiintei, avand o
raspandire de-a dreptul exploziva in ultimii 40 de ani.
Cromatografia prezinta anumite trasaturi commune tuturor metodelor
cromatografice care vor fi prezentate in continuare.

Istoric
Primele experimentări cromatografice au fost realizate la inceputul
secolului in mod independent de catre David Day, inginer geolog si de Mihail
Tvet, botanist si fizician-chimist.
Urmatorul pas a fost realizat de Martin si Synge (1941) reusind
separarea aminoacizilor pe o coloana umpluta cu silicagel saturat cu apa, iar
ca faza mobila au utilizat cloroform si alcool n-butilic.
Consden, Gordon si Martin (1944) prin inlocuirea suportului de
silicagel cu benzi de hartie pun bazele cromatografiei pe hartie.
Cromatografia pe stat subtire este descrisa pentru prima data de
Izmailov si Shraiber (1938) si a fost standardizata si perfectionata de catre
Sthall in Europa si Kirchner in America. Astazi aceasta tehnica are o
raspandire universala datorita vitezei mari de eluare si a unei bune rezolutii.

Clasificarea metodelor cromatografice

Cromatografia poate fi impartita in urmatoarele domenii generale:
1. Cromatografia de adsorbtie;
2. Cromatografia de repartitie;
3. Cromatografia de excludere;
4. Cromatografia de schimb ionic.
5.
Acestea nu trebuie confundate cu operatiile de laborator. De exemplu
repartitia poate fi facuta pe hartie (cromatografie pe hartie), intr-o coloana
(repartitia pe coloana, faza inversa si cromatografia de gaze), sau in strat
subtire (cromatografia in straturi subtiri). Principiul fundamental al repartitiei
este acelasi in toate aceste cazuri. Diferenta consta in maniera in care este
executat experimental efectul de repartitie.

3
 In continuare trebuie sa se tina seama de tipul fazelor prezente. Toate
procedeele cromatografice implica o faza mobila care trece peste o faza
stationara. Asadar solutul este distribuit intre cele doua faze, motivul
particular pentru modul in care are loc distributia reprezentand
cheia sistemului cromatografic.

Echipamentul HPLC

Detaliile pot sa difere, dar odata ce ai stapanit operatia unui sistem

HPLC, sa inveti sa le folosesti pe celelalte este de obicei usor.
LC poate fi (si a fost) indeplinita folosind un tub de sticla ales cu grija
cu pudra prin care unui solvent ii este permis caderea libera. Deci de ce avem
nevoie de toate acele echipamente complicate de inalta performanta? Sunt
foarte multe aspecte pentru a raspunde:

Viteza. O singura analiza a “clasicului” LC poate dura oricat intre 2 si

12 ore pentru a fi indeplinit. HPLC permite o analiza echivalenta care poate fi
facuta intre 2 si 12 minute.
Reproductibilitate. O coloana clasica trebuie sa fie impachetata
proaspat pentru fiecare analiza, crescand sansa erorilor. O singura coloana
HPLC poate fi folosita pentru sute de probe.
Cantitate. Clasicul LC a fost (si inca mai este) o tehnica excelenta
pentru prepararea de probe sau purificarea lor, dar necesita colectari aditionale
si pasi de analiza pentru a fi folositor ca o unealta pentru analiza cantitativa.
HPLC foloseste detectori care dau informatii cantitative in timpul separarii.
Sensibilitatea. Clasicul LC folosea coloane relativ mari si volume
corespunzatoare mari de solventi de faza mobila. Diluarea rezultata limita
sensibilitatea tehnicii. HPLC foloseste coloane miniaturizate pentru a pastra
diluarea probei la minim.

4
 Puncul de inceput este coloana. Scazand media impachetarii marimii
particulei coloanei minimalizeaza largirea benzii. O scadere corespunzatoare
in marimea coloanei minimalizeaza consumul de solvent si diluarea probei.

Rezervoarele solventului HPLC

Rezervorul care contine faza mobila este des nu mai mult de o sticla.
De obicei, sticla de reactiv care contine solventul HPLC poate fi folosita ca
rezervor. Solventul este transportat din rezervor la pompa prin mijloace de
tuburi de teflon – numite “linia de
intrare” in pompa. Unele sisteme
HPLC ca Agilent 1100 aratate in
stanga au compartimente speciale
pentru a tine una sau mai multe
rezervoare de faze mobile.
Rezervoarele din aceste sisteme
pot avea adaugari de caracteristici
care permit ca faza mobila sa fie
degazata si izolata de la contactul cu
aerul.

Necesitatile unui rezervor de solvent sunt simple:

 rezervorul si atasamentele la pompa ar trebui sa fie facute din
materiale care nu vor contamina faza mobila: teflon, sticla, sau otel
inoxidabil.
 recipientul ar trebui sa aiba un fel de capac pentru a preveni
contaminarea fazei mobile de catre materia sub forma de particula. Unele
sisteme LC prevad asta ca parte din proiectul rezervorului. Daca folosesti o
sticla de solvent ca rezervor, varful sticlei poate fi infasurat in folie de
aluminiu pentru a pastra praful afara sau capacul sticlei poate fi gaurit pentru
a permite inserarea liniei de intrare prin capac.

5
  nu inchide sticla prea strans sau inlaturarea fazei mobile de la
pompa va creea un gol. Aceasta previne faza mobila de la scurgerea pe
pompa, creand o “incuietoare de vapori” in pompa.

Exemple de lanturi de rezervoare de faza

mobila din sticlaria de laborator standard cum ar
fi pahare gradate sau bidoane acoperite cu folie
de aluminiu prin recipiente mai mari ca sticle
medii, cani cu solvent, sau baloane de sticla,
pentru sticlarie facuta la comanda care include
provizii incorporate pentru agitare si degazare.

Capacitatea de agitare nu este in mod absolut necesara, dar poate ajuta

la pastrarea omogenitatii fazei mobile ca solvent este pierduta la evaporare.
Degazarea – indepartarea aerului dizolvat din faza mobila – nu este
intotdeauna necesara, dar este, in general, recomandata pentru operatii sigure.
Este important ca materia sub forma de particule sa fie tinuta in afara
fazei mobile pentru ca particulele pot cauza stricaciuni pompei si injectorului,
de asemeni si dopului coloanei. Fazele mobile sunt deseori filtrate inainte sa le
introducem in rezervor. In plus, o frita de 10 microni sau filtrele de intrare
trebuie sa fie conectate la sfarsitul liniei de intrare care este scufundata in
rezervor. Aceasta frita de intrare serveste in mai multe scopuri. In afara
asigurarii unei extra protectii impotriva intrarii particulelor in pompa, filtrele
de intrare servesc la pastrarea liniei de intrare la fundul rezervorului.
Rigiditatea liniei de intrare tinde sa permita tevariei de teflon sa se
strecoare afara din rezervor, prevenind folosirea tuturor fazelor mobile numai
daca un filtru de intrare este folosit pentru a ingreuna capatul tevariei. Pentru
acest motiv, filtrele de intrare sunt des numite “scufundatoare”.

Frita scufundatoare nu este un

inlocuitor pentru filtrarea fazei mobile.
Marimea porilor tipica folosita intr-o frita
scufundatoare este de ordinul 5 - 10 microni;
fritele cu marimi mai mici a porilor sunt
foarte posibile sa se astupe. In general, faza

6
mobila ar trebui sa fie filtrata printr-o frita de 0.3 – 0.5 microni dupa ce
solventul si tamponul sunt amestecate pentru a indeparta materia sub forma de
particula. Frita scufundatoare protejeaza impotriva particulelor de prf mai
mari ocazionale intalnite dupa ce faza mobila a fost filtrata.

In ciuda marimii relativ mari a porului, frita scufundatoare poate de

asemeni sa se astupe peste timp. Aceasta este in special posibil sa se intample
cu tampoane apoase ca rezultat la cresterea bacteriala. Este o idee buna sa
verificam periodic frita de intrare pentru a fi siguri ca faza mobila pluteste in
liberate. “Testul sifon” este o cale buna pentru a indeplini aceasta:
1. Fii sigur ca sistemul de pompare este de prima calitate ( adica sa
nu aiba aer pe linia de intrare).
2. Deconecteaza linia de intrare unde ea intra in pompa.
3. Aseaza linia de intrare deconectata deasupra unui pahar gradat
sau a altui vas de colectare.
4. Ridca rezervorul solventului aproximativ 50 cm si obserba ce se
intampla. Daca faza mobila sifoneaza libera, atunci frita de intrare este
probabil buna. Daca faza mobila picura incet, atunci ori linia este rasucita, ori
frita de intrare este partial tamponata.
Este adesea necesar sa indepartam aerul dizolvat din faza mobila inainte
ca faza mobila sa fie introdusa in pompa. Aceasta procedura este numita
dagazarea fazei mobile. Motivul degazarii fazei mobile este acela ca aerul
dizolvat tinde sa fie eliberat in interiorul sistemului HPLC. Aceasta face ca
operatiile multor pompe HPLC sa fie nesigure, conducand la fluctuatii in
calitatea plutirii. Bulele pot fi de asemeni prinse in celula de scurgere a
detectorului, cauzand probleme cu acest modul.

Obtinerea separarii
In aceasta parte, vom vorbi despre o forma a HPLC numita
“cromatografie de faza inversata”. Aceasta este tipul de saparare HPLC cel
mai comun folosita.
Metodele HPLC de faza inversata folosesc un tip special de coloana si o
faza mobila compusa dintr-o amestecare de apa (sau un tampon apos) si un
solvent organic cum ar fi acetonitril sau metanol. Mai exista si alte tehnici LC
cum ar fi: cromatografie de pereche de ioni, cromatografie de faza normala,
cromatografie de schimb de ioni, si cromatografie ce face excludere de
marimi.
Sa incepem prin examinarea fazei stationare (impachetarea coloanei)
folosita pentru separarile de faza inversate. Aceasta impachetare a coloanei
consta in particule foarte mici care sunt inghesuite impreuna foarte strans in

7
coloana. Daca materialul pentru impachetarea coloanei este marit astfel incat
sa putem sa vedem efectiv particulele individuale, ele sunt de obicei sferice si
arata ca niste mingi de tenis foarte mici. Cu ochiul liber, totusi, impachetarea
coloanei arata mai mult sau mai putin ca pudra pentru copii; particulele
individuale sunt mult prea mici pentru a fi vazute clar.

Sa ne imaginam ca putem sa taiem in doua o particula de

faza stationara (ca si cum am taia un mar) si sa privim
la sectiunea de traversare rezultata. Am putea sa
vedem atunci ceva ca in diagrama din stanga.
Partile solide negre reprezinta materialul din care
este facuta particula, in timp ce partile albe
reprezinta gauri sau pori care traverseaza particula in
zig-zag in toate directiile. Cea mai mare parte din
particula este compusa din silicat – o sticla –
ca si materialele care dau structura de baza.

Suprafata silicatului (amandoua partile din exterior si

din pori) este acoperita cu un strat de molecule organice;
aceste molecule sunt legate chimic la suprafata silicatului
astfel incat sa formeze o imbracaminte stransa, rezistenta chimic. Acest strat
organic se mai numeste si “faza legata”.

Acum sa marim o parte dintr-un perete de por mai departe, asa cum
este aratat in dreapta. Putem sa vedem mai clar structura suprafatei acestui
strat organic de legatura (“faza legata”). Stratul organic este compus din fire
sau lanturi alchilice atasate la suprafata silicatului. Moleculele de proba se
lipesc de aceste lanturi alchilice si sunt deci, retinute in particula impachetata,
deci cauzand retragerea probei.
Asa cum moleculele de proba sunt trecute prin coloana de faza mobila
plutitoare, ele intra si ies prin pori. Compusii care se “lipesc” de faza legata
vor fi incetiniti si vor parasi coloana mai tarziu decat componentele care nu se
lipesc. Compusii de proba diferite (analitice) se vor lega de faza stationara mai
mult sau mai putin strans, depinzand de natura chimica a compusului.
Retinerea probei depinde de interactiunea dintre analitic cu faza mobila
pe de o parte si cu faza stationara (impachetarea coloanei) pe cealalta parte. In
general, compusii care sunt mai similari cu faza mobila vor interactiona cu ea
mai puternic si de aceea vor fi spalati din coloana repede. Compusii care
seamana mai mult cu faza legata vor tinde sa stea pe particula impachetata si
deci spalati din coloana mai greu.

8
 Pentru cromatografia de faza inversa, impachetarile sunt grupate in
concordanta cu chimia lanturilor de faza legata. Impachetarea obisnuita
include urmatoarele:
 C18, numit si octadecil sau ODS;
 C8, numit si octil
 Trimetilsilil, numit si TMS sau FENILMETIL
Mai sunt si alte impachetari de coloana care sunt folosite pentru LC-
urile de faza inversa mai putin (ciano, difenil, etc.).
In timp ce este important sa numim tipul impachetarii coloanei cum este
descris mai sus, aceasta nu este o descriere suficienta pentru a ne asigura ca o
coloana va funtiona la proba. Datorita diferentelor in chimia manufacturii, o
coloana C18 de la Waters nu este la fel ca o coloana C18 de la Agilent sau de
la Supelco sau de la oricare alt furnizor. In multe cazuri, un furnizor va avea
multiple (diferite) coloane care se incadreaza la descrierea generala. De
exemplu, Waters vinde coloane C18 numite Microbondpak, Novapak, si
Symmetry, si nu sunt la fel. Agilent vinde coloane C8 sau C18 sub nume
diferite ca Zorbax, Zorbax Rx, Zorbax Stablebond, sau Zorbax Eclipse, fiecare
dintre ele fiind facute pentru folosire diferita.
Marimea particulei impachetarii coloanei este foarte importanta, si
aceasta ar trebui intotdeauna specifica. Majoritatea coloanelor vin cu particule
de 5-microni (mm), desi ambele particule si mici si mari sunt folosite.
Lungimea coloanei si largimea ar trebui de asemeni specificate.
Am vazut ca o separare buna necesita
varfuri inguste in cromatograma.
Cromatograma este o schita sau
inregistrare a separarii chimice produsa in
HPLC. Totusi este greu sa descrii o coloana
in termeni de largimea varfului deoarece
varfurile de la inceput sunt mai inguste
decat cele mai tarzii (presupunand conditii
constante). “Numarul plat” al coloanei (N)
este o cale de a evita acesta problema,
deoarece numarul plat este constant in mod
egal pentru toate varfurile dintr-o
cromatograma particulara. Numarul plat
poate fi masurat din latime si timpul de retinere aratat aici:

Valoarea lui N pentru o coloana variaza cu multi factori: lungimea

coloanei, marimea particulei, rata plutirii fazei mobile, cat de bine a fost

9
facuta coloana, si cat timp a fost folosita coloana. Coloanele uzuale de lungimi
de 10- sau 15-cm impachetate cu particule de 3- sau 5-microni au valori ale lui
N de aproximativ 10,000 plate cand sunt noi si cand opereaza in conditii
ideale. Numerele plate ale coloanei pentru separarea probelor “reale” sunt in
general intre 2,000 si 5,000.
Este important sa verificam numarul plat a unei coloane cand este
primita si instalata pe sistemul LC. Fabricantul va furniza o cromatograma de
test cu coloana aratand separarea unei probe particulare (de obicei un amestec
de componenti) cu un set particular de conditii (rata de scurgere, faza mobila,
temperatura, etc.) specificate. Ar trebui sa fii capabil sa obtii aceeasi separare
raportata in cromatograma de test, si numarul plat pentru varfuri diferite ar
trebui sa fie intre 10 si 20% din valorile raportate. Cromatograma de test ar
trebui pastrata, pentru ca este folositoare in verificarea anumitor probleme
care pot sa apara pe parcurs.
Acum ca am acoperit subiectul legat de numarul plat, sa discuta despre
asimetria varfului. Varfurile LC-urilor bune ar trebui sa fie perfect simetrice,
dar exista des o anumita urma, asa cum se vede in figura.

Acest varf de fapt lasa o urma mai degraba slaba. Urma varfului sau
asimetria este slaba din mai multe motive; este greu sa se masoare marimea
varfului, si este o simptoma a altor probleme a coloanei.
Putem masura asimetria varfului in unu sau doua moduri asa cum este
aratat aici. Factorul de Urma, masurat la 5% din inaltimea varfului, este folosit
in mare parte in industria farmaceutica. Factorul de Asimetrie masurat la 10%
din inaltimea varfului este mai des folosit in analizele nonfarmaceutice. In
cele mai multe cazuri, Factorul de Asimetrie si Factorul de Urma vor fi sumar
aceiasi (desi rar exista egali). Valorile ar trebui normal sa cada intre 1.0 si 1.5
pentru o coloana noua si conditiile cromatogramei de test. Varfurile mai putin
simetrice sunt des observate in conditiile actuale din probele “reale”, dar orice

10
crestere in urma varfului este o simptoma a unei probleme care ar trebui
fixata.
O separere buna necesita de asemeni valori
rezonabile ale retinerii. In timp ce timpul de retinere
este o masurare directa a retinerii, are dezavantajul de
a fi afectat de rata de scurgere a fazei mobile la fel ca
si chimia de sistem (cresterea ratei de scurgere
cauzeazaa o scadere proportionala a timpului de
retinere). O masurare mai folositoare este
factorul de capacitate, sau k’. Acesta este calculat
din timpul de retinere a varfului si timpul mort al
coloanei, asa cum este aratat in figura. Asta are ca avantaj faptul ca si timpul
mort si timpul de retinere sunt afectati la fel de schimbarile din rata de
scurgere sau dimensiunile coloanei; aceste efecte se anuleaza astfel incat
factorul de capacitate nu afectat de rata de scurgere sau dimensiunile coloanei;
este controlat in totalitate de temperatura si de caracteristicile chimice ale
fazei mobile si fazei stationare. Timpul mort al sistemului nu este afectat de
scimbarile din compozitia fazei mobile sau de chimia coloanei.
Daca o proba are doua sau mai multe varfuri, putem calcula de asemeni
si o rata de retinere (a) pentru orice pereche de varfuri. Aceasta este simplu
proportia factorilor de capacitate (k’-ul celui de al doilea varf impartit de k’-ul
primului varf). El ne da informatii despre selectivitatea sistemului
cromatogafic. Ca factorii de capacitate care in cuprind, proportia retinerii nu
este afectata de rata de scurgere sau dimensiunile coloanei; este controlat in

totalitate de temperatura si de cacracteristicile chimice ale fazei stationara si a

fazei mobile.

11
 Detectoarele HPLC

Detectorul masoara concentratia benzelor proba cand parasesc coloana

si trec prin celula plutitoare a detectorului. Cand nici o banda nu trece prin
detector, un semnal constant este inregistrat – numit Baselina cromatografului
sau detectorului. Cand o banda de proba ajunge la detector,
acesta raspunde diferentei din proprietatile fazei mobile
cauzate de prezenta compusului probei, dand nastere la o
schimbare in semnalul detectorului, vazuta ca un varf.
Cum functioneaza un detector? In cele mai multe cazuri folosim un detector
fotometric, numit uzual detector UV. In forma lui simpla, aceasta constand
dintr-o sursa de lumina, o celula de scurgere (sau “celula de proba”), si un
senzor de lumina asa cum este aratat in figura.

Cand nici o proba nu trece prin detector, lumina trece prin celula de
scurgere si genereaza un semnal maxim la senzorul de lumina. Daca o banda
de proba intra in detector, proba reduce cantitatea de lumina care ajunge la
senzor si cauzeaza o scimbare in semnalul detectorului. Acest semnal este
electronic inversat de datele sistemului care rezulta la aparitia unui varf
pozitiv in cromatograma. Semnalul aratat creste in proportie cu concentratia
probei in celula de scurgere. Detectorul va raspunde de asemeni si la alte
schimbari in continutul celulei de scurgere. De exemplu, daca particule sau
“murdarie” sunt prinse in interiorul celulei de scurgere, acestea vor intrerupe
lumina care trece prin celula de scurgere si cauzeaza o schimbare in baselina.
Sau o bula de aer poate fi prinsa in celula de scurgere, cauzand o schimbare
foarte mare in cantitatea de lumina care trece. In acest caz, semnalul s-ar putea
duce complet sub scala, dupa aceea se va intoarce la baselina originala daca
bula terce prin celula.

Doua tipuri de detectoare UV sunt folosite astazi:

12
  Cu lungime de unda variabila (uneori numite detectoare
“spectrofotometrice”)
 Aranjare Fotodiodica (uneori numite detectoare “aranjatoare de
diode”).
Detectoarele cu lungime de unda variabila sunt mai putin scumpe; ele
sunt tipul detectoarelor standard pentru analizele cantitative si a
aranjamentelor de rutina. Detectoarele ce aranjare fotodiodica sunt mai
versatile, pentru ca ele permit achizitionari simultane de informatii
cromatografice si spectrale; ele sunt frecvent folosite in dezvoltarea metodei.
Lungimea de unda a detectorului este o caracteristica importanta a unei
separari HPLC. Ca o regula generala, lungimea de unda este setata la
absorbanta maxima a analitului. Folosind lungimea de unda gresita poate
rezulta in scaderea marimii varfului, sau chiar fara nici un varf!
Deoarece compusi diferiti pot sa aiba spectre de absorbanta diferite, o
comparatie cantitativa directa de varfuri diferite in aceeasi cromatograma
poate fi prost inteleasa. A cantitate mica a unui compus care absoarbe puternic
la lungimea de unda a detectorului poate da un varf mai mare decat o cantitate
mare a unui absorbant slab. Pentru o cantitate de baza, o calibrare trebuie sa
fie indeplinita cu o cantitate cunoscuta a compusului exact pentru a fi analizat.
Sunt un numar de alte setari sau controale pentru detector; acestea pot fi
construite chiar in detector, sau pot fi parti din datele sistemului:
Marimea tuturor varfurilor din cromatograf poate fi schimbata folosind
atenuatorul sau setarile reglate. Scala de atenuare indica de obicei marimea
unui varf care va aparea ca un varf de marime intreaga pe ecran. Aceasta scala
este masurata in unitati de absorbanta (care sunt proportionale cu concentratia
de proba); este de obicei exprimata ca “Scala Intreaga a Unitatilor de
Absorbanta” (AUFS).

Figura ilustreaza efectul unei schimbari in atenuare. Cum setarea

atenuarii este crescuta (AUFS este scazut), detectorul devine mai
senzitiv, si toate varfurile cresc in marime. In mai multe
sisteme, rangul de atenuare poate fi setat ori pe un detector
ori pe un sistem de date.daca atenuarea sau rangul este setat
pe sistemul de date, afecteaza de obicei numai expunerea.
Nu schimba felul in care cantitatea este indeplinita pentru ca nu
schimba informatia prezentata in sistemul de date. Daca
atenuarea sau rangul este setat chiar la detector totusi, este

13
posibil ca marimea varfurilor mari sa poata depasi capacitatile sistemului de
date.
O alta setare a detectorului este Baseline Zero (uneori numita “Setarea
Zero” ). Miscand setarea (aratata in figura) schimba in mod simplu toata
cromatograma sus sau jos pe ecran. Cu setarea atenuarii, daca zero este setat
la sistemul de date el afecteaza numai expunerea: cantitatea ramane
neschimbata. Daca baseline zero este modificata la detector, integritatea poate
fi compromisa daca baseline este setata suficient de jos pentru a trimite un
semnal de voltaj negativ la sistemul de date (cele mai multe sisteme de date
pot functiona numai cu semnale de voltaj pozitiv).

Alte tipuri de detectoare sunt mai putin intalnite in HPLC:

 Detectoarele de Index Refractiv

(RI) monitorizeaza indexul refractiei in
efluentul coloanei (faza mobila parasind
coloana). Fiecare lichid are un index
caracteristic de refractie, si aceste index se
schimba cand un solut (analitul) este dizolvat in
lichid. Schimbarea in indexul de refractie indica
deci elutia analitului din coloana. Pentru ca
detectoarele RI sunt bazate pe o proprietate a
fazei mobile, sunt universale.din cauza aceasta,
ele difera de detectoarele UV care sunt
specifice probei. RI este folosit cu prioritate
pentru analiti care nu se absorb in UV. Este
sensibil la schimbari mici in scurgerea fazei
mobile sau compozitia acesteia si poate fi foarte
sensibil la schimbarile mici ale temperaturi
ambiante (un bun control al temperaturii este
necesar pentru a face cu succes operarea pe
detectoarele RI).

 Detectoarele fluorescente, precum detectoarele UV sunt specifice

probei: ele depind pe o caracteristica particulara a analitului. Pentru ca nu toti
compusii sunt fluorescenti, detectorul fluorescent este mult mai selectiv decat
detectorul UV. Acesta selectivitate este sporita pentru ca doua lungimi de
unda sunt folosite: lungimea de unda de excitare si lungimea de unda de
emisie. In multe cazuri, aceste lungimi de unda pot fi potrivite ca sa permita

14
discriminari intre analiti similari chiar structural. Pentru ca detectarea
fluorescenta masoara lumina emisa (mai degraba decat transmiterea luminii),
poate fi mult mai sensibila decat detectarea UV (este mai usor sa masori o
cantitate absoluta decat o mica diferenta dintre doua valori mai mari).

 Detectoarele electrochimice, precum detectoarele fluorescente si

UV, sunt specifice probei: ele se bazeaza pe oxidarea si reducerea analitului la
o suprafata a electodului. Ele sunt folosite in principal pantru analiti usor
oxidati/redusi cum ar fi zaharidele. Detectoarele electrochimice pot fi si mai
sensibile si selective decat detectoarele fluorescente dar necesita o atentie
scrupuloasa la puritatea solventului pentru succesul operatiei.
Unele “detectoare” HPLC sunt de fapt instrumete complet analitice in
scopul lor. Exemple de aceste detectoare include LC-MS (spectrometrie de
masa) si LC-FTIR (transformarea Fourier spectroscopie infrarosie). In multe
astfel de sisteme, “detectorul” este mai complex si mai puternic decat in
sistemul LC. LC-urile pot fi des considerate ca o proba a sistemului curat/de
intrare pentru MS sau FTIR.

Chimia fazei stationare in HPLC

Acum sa privim mai indeaproape la variatele erori ale coloanei si
posibile reparari ale acestora.

Cel mai mare mod de eroare al coloanei este o

deteriorare in forma varfului asa cum este aratat in
stanga. La largirea varfurilor si/sau la dezvoltarea unei
urme severe sau schimbarea in forma. In acelasi timp
presiunea colanei creste deseori marcabil. Aceste
simptome se pot forma din cauze diferite, si este o idee
buna sa verificam cromatograma
de test originala in acesta situatie. Asta inseamna, sa se
faca o cromatograma in aceleasi conditii si sa vedem
daca aceeasi problema este prezenta. Daca se dovedeste
sa fie cazul acesta (benzi cu urma saucu forma gresita
in proba de test), aunci problema este ori blocarea fritei
de intrare cu particule, ori crearea unui vid la intrarea in
coloana.
Cea mai buna cale este sa procedam dupa cum urmeaza:
In primul rand detasati coloana din sistemul LC, intoarceti-o, si
reconesctati-o la injector (inca nu o reconectati la detector). Iesirea originala a
coloanei nu ar trebui sa fie intrare. In continuare pompati faza mobila prin

15
coloana la o rata de scurgere mare (2 la 4 ml pe minut) pentru aproximativ o
jumatate de ora. Acum intoarceti coloana la directia originala de scurgere,
reconectati-o la injector si la detector, si intoarceti-va la conditiile originale de
operare pe care le-a dat problema si vedeti daca cromatograma s-a imbunatatit
si/ sau presiunea a scazut (nu reintoarceti coloana la pozitia ei originala).
Deseori acesta simpla procedura de scurgere intoarsa sau jet de apa intors va
spala particule din frita de intrare originala si va restabili performanta coloanei
la nivelul bun original. Unii fabricatori de coloane nu recomanda sa intoarceti
scurgerea la coloanele lor. Totusi, coloanele bine impachetate nu ar trebui sa
sufere acesta procedura.

Daca coloana inca da varfuri slabe dupa inversarea scurgerii, urmatorul

pas este sa inlocuim frita de intrare originala a coloanei. Detasati coloana din
sistem, si foarte atenti indepartati garnitura de intrare, aratand frita la capatul
de sus al coloanei ( un mm sau mai mult) sau daca o gaura este aparenta
(suprafata imbracamintii coloanei nu este perfect neteda), ne referim la
aceasta ca vid. In general coloana ar trebui sa fie data jos daca exista un vid,
desi unele laboratoare prefera sa repare vidurile cu garnituri de noi
impachetari. Daca nici un vid nu este aparent, inlocuiti frita originala cu una
noua, si reatasati garnitura de sfarsit a coloanei. Fiti atenti sa strangeti
garnitura precis ca recomandat: strangeti la ¾ la puterea mainii. Acum
reinstalati coloana pe sistemul LC si vedeti daca rezulta in cromatograma vreo
imbunatatire. Daca problema originala persista, dati coloana jos si instalati
una noua.
O alta problema comuna coloanelor este observata ca o scadere
graduala in timpul de retinere a probei si corespunzand in pierderea numarului
plat. Des aceasta este datorata acumularii de compusi puternic retinuti pe
imbracamintea coloanei. Aceste impuitati sunt prezente in probe care provin
din surse de plante sau animale, probe de mediu, sau alte surse.cea mai buna
cale sa evitam acesta problema este prin curatarea probei cum trebuie inaintea
injectarii si sa folosim coloane de garda. O data ce problema s-a dezvoltat,

16
poate des fi rezolvata prin spalarea coloanei cu o serie de solventi care pot
indeparta aceste materiale absorbite.

O alta cauza a esecului coloanei este pierderea

fazei legate datorata atacului chimic al fazei
mobile – sau ocazional al probei. Aceasta
problema nu poate fi reparata o data ce s-a produs,
asa ca preventia este unica solutie. Folosirea precoloaneisi
evitarea ph-ului mare sau ph-ului mic al fazei mobile si proba
sunt cele mai bune moduri de rezolvare.

Folosirea cromatogramei pentru obtinerea rezultatelor

Aceasta sectiune incepe cu cromatograma pe care o obtinem dupa ce
am folosit o proba. La acest moment avem unul sau mai multe varfuri care ne
spune ceva despre cati compusi sunt prezenti in proba.

In exempulul afisat, vedem trei varfuri, fiecare

corespunzator unui compus diferit. Deci, exista cel putin
trei compusi prezenti in aceasta proba. Dar ceea ce vrem
de obicei sa aflam este ce compusi sunt prezenti in proba
si cat din fiecare compus este prezent. Tehnica “analizei
calitative” inseamna gasirea identitatii diferitilor
compusi in proba. “Analiza cantitativa” se refera la
masurarea concentratiei sau cantitatii fiecarui compus in
proba.

De obicei vrem sa facem analize cantitative pe proba, dar asta inseamna

de asemeni si identificarea compusilor a caror concentratie o masuram. In LC
folosim timpul de retinere pentru a stabili identitatea varfului si marimea
benzii (inaltimea varfului sau aria acestuia) ca sa masuram concentratia.

Analize calitative pe HPLC

Din fericire, de obicei stim la ce compusi sa ne asteptam intr-o anumita
proba.
De exemplu, daca analizam tablete de aspirina,
presupunem ca aspirina va fi prezenta in fiecare
tableta. Sau daca incercam sa masuram puritatea unor
compusi “X” determinand concentratia lor in proba
presupunem ca acel compus este prezent. Cand vrem

17
sa masuram concentratia unui compus sau compusi
dintr-o proba prin mijloace de HPLC, intai
determinam timpul de retinere a compusului pur ca
proba. Daca vrem sa masuram compusul A, injectam
A pur in sistemul nostru LC, folosind aceleasi conditii
pe care le-am folosit sa masuram A in probe diferite.
In acest caz am putea obtine cromatograma
urmatoare:

Vedem ca acel compus A are un timp de retinere de 4.25 minute.

Acum daca vrem sa aflam daca unele amestecuri sau probe
contin acest compus, injectam proba si obtinem
cromatograma din figura. In acest caz vedem ca primul
varf are de asemeni un timp de retinere de 4.25 minute,
si de aceea presupunem ca varful #1 in proba este compusul
A. am putea dori de asemeni sa masuram compusul B si C in proba, asa ca ii
injectam si pe ei: prin potrivirea timpurilor variate de retinere, vedem ca
varful #2 in proba noastra este compusul B (timpul de retinere de 4.64 minute)
si varful #3 este compusul C (timpul de retinere de 5.1 minute).
Daca timpul nostru de retinere nu se potriveste indeaproape pentru compusul
pur si pentru proba atunci probabil am facut o greseala - compusul nu este
prezent in proba.

Cand folosim probe diferite continand

compusii A, B si C ca mai sus, descoperim
in general ca marimea a unor varfuri diferite
se schimba de la determinare la determinare.
Aceasta inseamna ca sunt cantitati diferite
de A, B si C prezente. Totusi cat timp A, B
si C sunt continute de proba, timpul lor de
retinere nu ar trebui sa se schimbe. Asta
inseamna, ca timpul de retinere al unui
compus nu este in mod normal afectat de
marimea varfului sau cantitatea unui compus
prezent in proba. Daca compusul A (timpul
de retinere este egal cu 4.25 minute) este
absent dintr-o proba data, atunci nici un varf
nu va fi gasit la 4.25 minute – putem atunci
decide ca A are concentratia zero in proba.

18
 In alte cazuri, putem gasi mai multe varfuri in
cromatograma in afara de acelea provenite din
compusii pe care ii anlaizam. Asta inseamna ca sunt
si alti compusi in proba, compusi la care nu ne
asteptam sa fie prezenti. Prezenta unor benzi
neasteptate in cromatograma ar trebui aratata
persoanei pentru care analiza LC este facuta –
uneori aceasta afecteaza folosirea care va fi facuta
pe analiza probei.

Deseori descoperim ca timpii de retinere pentru compusi diferiti raman

constanti de la zi la zi. Asta inseamna, compusul A da acelasi timp de retinere
(4.25 minute) la fiecare determinare LC. In alte cazuri putem vedea mici
variatii in timpul de retinere de o zi la alta: Aceasta poate fi un lucru normal,
si de obicei este cand schimbarile in timpul de retinere sunt numai de cateva
sute de minute – si cand retinerea se schimba in aceeasi directie pentru toate
benzile. Pentru schimbari mai mari in timpul de retinere, asa cum este aratat in
figura, compusii puri ar trebui reinjectati pentru a confirma ca benzile probei
sunt aceleasi pentru compusii pe care ii analizam. In orice caz, compusiii puri
ar trebui injectati cel putin o data pe zi pentru a confirma benzile probei.
Niciodata nu te baza pe injectarea de ieri a unui compus pur pentru a identifica
varful probei de azi. De asemeni tine minte ca schimbarile in timpul de
retinere pot fi o simptoma a unei probleme cu procedura de analiza. Aceasta
este in special adevarata cand numai o singura banda arata o schimbare in
timpul de retinere, in timp ce alte benzi nu se schimba dupa cum se vede aici.

Aici varful #1 (compusul A) arata schimbari in

timpul de retinere de 4.1
minute in determinarea a
doua. Aceasta ar putea fi rezultatul a unor compusi
care se intrepatrund care suprapun partial varful #1,
care ar putea cauza erori
mari in valoarea raportata a
compusului A. in acest caz
compusul pur A ar trebui injectat pentru a confirma
timpul lui de retinere. Daca
descoperim ca ceva nu este in regula cu acesta

19
 determinare concentratia compuslui A in aceasta
proba nu ar trebui raportata.

Este de asemeni posibil sa vedeam

schimbari in forma varfului din
cromatograma. Aici varful #2 a dezvoltat o
urma si nu mai este un varf simetric.
Aceasta sugereaza ca unii compusi
intrepatrunsi suprapun partial varful #2 in
cromatograma, si din nou, concentratia
compusului B in proba nu ar trebui rapotata.

HPLC – metoda utilizata in studiul coloranţilor din băuturi

nealcoolice şi alcoolice

Calitatea alimentelor este o entitate deosebit de complexă deoarece,

spre deosebire de cea a altor produse industriale, ea are un cuprins mult mai
larg şi efecte mult mai profunde.Trebuie evidenţiat faptul că alimentul, prin
calitatea sa, are implicaţii deosebite asupra vieţii deoarece alimentele
reprezintă un factor esenţial al proceselor metabolice şi al echilibrului
organismului. Introducerea în produsele alimentare a unor cantităţi sporite de
conservanţi, poate avea ca efect, pe de o parte substituirea unui component de
valoare superioară şi, deci, fraudă de ordin economic şi calitativ pentru
consumatori, iar pe de alta parte, în cazul în care limitele normelor oficiale
sunt depăşite, obţinerea de produse care devin periculoase pentru sănătatea
consumatorului. În toate cazurile de suspiciune, trebuie să se apeleze la
analizele fizico-chimice de laborator. Din cauza toxicităţii posibile a unor
aditivi legislaţia sanitară naţională şi internaţională,precum şi standardele
prevăd denumirea aditivilor şi dozele maxim permise. Aditivii trebuie să
îndeplinească pe lângă condiţiile de calitate şi proprietăţi specifice şi o serie
de cerinţe de puritate în ceea ce priveşte conţinutul în metale grele şi
metaloizi.

20
 Culoarea este o însuşire a calităţii senzoriale a unui produs alimentar
care, alături de formă, mărime, structură şi aspectul general al acestuia,
contribuie la percepţia vizuală a consumatorului. Este bine-cunoscut faptul că
aspectul unui produs alimentar sau al unei băuturi depinde în mare măsură de
faptul că acesta este sau nu colorat.

Culoarea unei băuturi este un parametru greu de evidenţiat în

profunzime, dar foarte important în clasificarea şi stabilirea calităţii acesteia.
Pentru a satisface preferinţa consumatorului pentru băuturi colorate, se
recurge adesea la adaosuri de coloranţi sintetici şi/sau naturali, care pot fi
interzişi sau nu de lege. Posibilitatea de detectare a coloranţilor utilizaţi la
prepararea băuturilor nealcoolice (concentrate, răcoritoare, energizante) şi
alcoolice (lichioruri, whisky, băuturi preparate din vin – vermut, coniac etc.)
este foarte importantă pentru controlul calităţii acestor produse.

Coloranţii alimentari incluşi în lista E-urilor (E 100 – E 182) sunt

intens folosiţi în industria producerii băuturilor. Caracterizarea culorii
băuturilor face subiectul a numeroase cercetări în domeniu. Apariţia pe piaţă a
unei game variate de băuturi colorate artificial, ridică însă problema colorării
artificiale şi impune un control riguros al calităţii şi cantităţii coloranţilor
folosiţi. Ca urmare, cercetări specifice de actualitate pentru determinarea
coloranţilor prezenţi în băuturi sunt absolut necesare.

Autenticitatea băuturilor şi securitatea chimică a acestora sunt

parametri deosebit de importanţi care pot fi confirmaţi prin rezultatele
analizelor efectuate şi care fac posibilă delimitarea băuturilor originale de cele
falsificate. În stadiul actual, problema autenticităţii, a calităţii şi a siguranţei
chimice a băuturilor de pe piaţa românească este stringentă deoarece sistemul
de control existent se manifestă doar în cazul apariţiei unor sesizări ale
consumatorului, este subdimensionat şi rezolvă doar o paletă restrânsă din
problemele ridicate de consumator. Numărul laboratoarelor de control al
calităţii produselor alimentare este mic şi nu posedă metode moderne de lucru
standardizate. Importanţa comercială considerabilă a băuturilor, împreună cu
regulile stricte de control al calităţii necesită dezvoltarea unor metode
adecvate şi sigure pentru determinarea coloranţilor alimentari continuţi.

Metodele de analiză fizico-chimică a coloranţilor alimentari din

băuturi au menirea de a interveni în mecanismul de control al conformităţii
etichetă-compoziţie, contribuind astfel la diminuarea abuzurilor
producătorilor. Pentru că în produsele alimentare coloranţii sintetici se

21
folosesc în cantităţi extrem de mici, care nu determină un gust sesizabil, iar
preţul de cost este deosebit de avantajos pentru producătorii, tentaţia utilizării
lor pentru a imita produsele naturale poate fi foarte mare. Identificarea
utilizării coloranţilor alimentari în scopul ilustrat mai sus reprezintă un alt
obiectiv care justifică elaborarea metodelor de analiză fizicochimică a
coloranţilor alimentari din băuturi.

Există o gamă largă de metode de analiză, destructive şi nedestructive

utilizate pentru analiza băuturilor: metode spectrofoto-metrice: UV-Vis,
spectroscopie IR (FTIR, NIR), metode cromatografice: GC, GCMS,HPLC,
HPTLC, TLC, HPLC-MS, metode electrochimice, electroforeza capilară,
spectrometrie de masă etc.

Metodele de analiză a coloranţilor alimentari fie că sunt metode

electrochimice, fie că sunt metode spectrofotometrice sau metode
cromatografice, ele trebuie să întrunească anumite criterii de performanţă,
criterii care se referă la limita de detecţie şi de determinare; la interferenţă şi
nu în ultimul rând la siguranţa rezultatului dat şi a costurilor legate de analiză.
În baza datelor din literatură, se observă ca tehnicile cromatografice de analiză
sunt foarte permisive din punct de vedere al varietăţii compuşilor care pot fi
analizaţi. Astfel datorită performanţelor obţinute, tehnicile cromatografice s-
au consacrat ca tehnici uzuale de analiză a coloranţilor alimentari.

Au fost efectuate cercetări de laborator preliminare privind

determinarea unor coloranţi sintetici (tartrazine, sunset yellow, carmoisine,
quinoline yellow, carmine, Ponceau 4R,Burnt Sugar, Caramel Brown, Dark
Chocolate, Brilliant Black, brilliant Blue) şi a coloranţilor naturali (antociani,
b-caroten, Enocolor - extract natural din coajă de strugure), utilizând metode
spectroscopice (FTIR, UV-Vis), metode cromatografice (HPLC - High
Performance Liquid Chromatography şi TLC - Thin Layer Chromatography).

Rezultatele obţinute arată că spectroscopia optică poate fi utilizată cu

succes pentru identificarea componentelor produselor comercializate ca şi
coloranţi dar, având în vedere sensibilitatea la adaosurile prezente în unii
produşi, rezultatele obţinute prin această metodă de analiză trebuie corelate cu
cele obţinute prin alte metode de investigare. Menţionăm că spectrele UV-Vis
sunt utile pentru stabilirea lungimii de undă optimă pentru detecţia HPLC.

Analiza prin HPLC este o metodă de analiză performantă şi rapidă.

Datorită rezoluţiei, sensibilităţii şi preciziei aceasta a devenit în ultimii ani

22
metoda preferată de mulţi analişti, în special atunci când este necesară analiza
compuşilor nevolatili.

Au fost realizate cercetări preliminare, obţinându-se o bună separare

prin HPLC a şase coloranţi de sinteză: tartrazină, sunset yellow, carmoizină,
ponceau 4R, brilliant blue şi brilliant black. Pentru studiul coloranţilor
naturali, au analizate HPLC extracte naturale din coajă de struguri roşii
(antociani) şi sfeclă roşie (betaina) în comparaţie cu colorantul comercial
Enocolor.

A fost adaptată o metodă HPLC pentru determinarea a patru coloranţi

alimentari sintetici: tartrazină, ponceau 4R, allura red şi galben de chinolină si
o metodă HPLC de determinare simultană a unor coloranţi naturali din
extracte de morcov, pătrunjel, ardei roşu, pastă de roşii. Metodele HPLC
prezentate sunt potrivite pentru studiul coloranţilor naturali şi sintetici din
diferite probe de băuturi nealcoolice şi alcoolice.

BIBLIOGRAFIE

1. Armstrong, D.W. Analytical Chemistry, 1987, Vol. 59, pp. 84-91.

2. Beckman Model 330 HPLC Manuel, Beckman Instruments,

Fullerton, CA.

3. Bidlingmeyer, B.A. and Warren, F.V. Jr. Analytical Chemistry, 1984,

Vol. 56, pp. 1583-96.

4. Bright, F.V. Analytical Chemistry, 1988, Vol. 60, pp. 1031-1039.

5. Brown, P.R. Analytical Chemistry, 1990, Vol. 62, pp. 995-1008.

6. DiCesare, J.L.; Dong, M.W.; Vandermark, F.L.; Am. Lab., 1981, No.
13, p. 52.

7. Dorschel, C.A.; Ekmanis, J.L.; Oberholtzer, J.E.; Warren, F.V. Jr.;

Bidlingmeyer, B.A. Analytical Chemistry, 1989, Vol. 61, pp. 951-968.

8. Ewing, A.G.; Wallingford, R.A.; Olefirowicz, T.M.; Analytical

Chemistry, 1989, Vol. 61, pp. 292-303.

23
 9. Glajch, J.L. and Kirkland, J.J.; Analytical Chemistry, 1983, Vol. 55,
pp. 319-32.

10. Green, R.B. Analytical Chemistry, 1983, Vol. 55, pp. 20-31.

11. Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research

Chemicals; Molecular Probes Inc.; Eugene, OR, 1985.

12. Jones, D.G. Analytical Chemistry, 1985, Vol. 57, pp. 1057-1073.

13. Knox, J.H. and Kauer, B.; High Performance Liquid

Chromatography; Brown. P.R. and Hartwick, R.A. Eds.; Wiley Interscience:
New York, 1989, Chapter 4.

14. Mant, C.T. and Hodges R.S. eds. High-Performance Liquid

Chromatography of Peptides and Proteins: Separations, Analysis, and
Conformation, CRC Press: Boston, 1991.

15. McClure, W.F. Analytical Chemistry, 1994, Vol. 66, pp. 43-54.

16. Novotny, M. Analytical Chemistry, 1989, Vol. 60, pp. 500-10.

17. Regnier, F.E. Analytical Chemistry, 1983, Vol. 55, pp. 1298-1306.

18. Schoeff, M.S. and Williams, R.H. Principles of Laboratory

Instruments, Mosby: St. Louis, 1993.

19. Simpson, R.C. and Brown, P.R.; J. Chromatogr., 1987, Vol. 400, p.
297.

20. Synder, L.R.; Stadalius, M.A.; Quarry, M.A. Analytical Chemistry,

1983, Vol. 55, pp. 1412-30.

21. Thomas, E.V. Analytical Chemistry, 1994, Vol. 66, pp. 795-804.

22. Thorne, A.P. Analytical Chemistry, 1991, Vol. 63, pp. 57-65.

23. Wellinder, B.S.; Kornfelt, T.; Sorensen, H.H.; Analytical

Chemistry, 1995, Vol. 67, pp. 39-43.

24
 24. Willard, H.; Merritt, L.; Dean, J.A.; Settle Jr., F.A. Instrumental
Methods of Analysis , 7th ed., Wadsworth Publishing Co., 1988.

25. S.Gocan, Cromatografia de înalta performanta, I. Cromatografia de

gaze, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, 1998.

26. S.Gocan, Cromatografia de înalta performanta, II Cromatografia de

lichide pe coloana, Ed.Risoprint, Cluj-Napoca, 2002.

25