İRAN’DA YAYILIŞ GÖSTEREN KÜÇÜK BALARISI (APIS FLOREA FABRICIUS)

TOPLUMLARINDA GENETİK VARYASYONUN RAPD YÖNTEMİYLE

ARAŞTIRILMASI

Burçin TERZİ

Zonguldak Karaelmas Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyoloji Anabilim Dalında
Yüksek Lisans Tezi
Olarak Hazırlanmıştır

ZONGULDAK

Haziran 2008

i
 ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

İRAN’DA YAYILIŞ GÖSTEREN KÜÇÜK BALARISI (APIS FLOREA FABRICIUS)

TOPLUMLARINDA GENETİK VARYASYONUN RAPD YÖNTEMİYLE
ARAŞTIRILMASI

Burçin TERZİ

Zonguldak Karaelmas Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyoloji Anabilim Dalı

Tez Danışmanları:
Prof. Dr. Mustafa SÖZEN
Doç. Dr. İrfan KANDEMİR
Haziran 2008, 39 sayfa

Bu çalışmada İran’da 3 eyalette yayılış gösteren küçük balarısı (Apis florea Fabricius)
populasyonlarında genetik varyasyonu RAPD PCR yöntemiyle incelenmiştir. Küçük balarısı
örnekleri farklı yıllarda (2005, 2007) İran İslam Cumhuriyeti’nde yer alan Bushehr,
Khuzestan ve Ilam eyaletlerinden toplanmıştır. 3 eyaletten toplam 9 lokasyonda 158 doğal
koloniden toplanan Apis florea örnekleri ile çalışma gerçekleştirilmiştir. 155 küçük balarısı
örneğinin toraksı alınarak DNA’ları izole edilmiş ve izole edilen DNA’lar RAPD PCR
yöntemiyle çalışılmıştır. PCR’ı yapılan örnekler agaroz jelde yürütülerek EtBr ile
boyanmıştır. Boyanan bantlar UV altında değerlendirilmiştir. Bu verilerin analizleri için
POPGEN32 ve POPULATION 1.0 bilgisayar programları kullanılmıştır.

iii
 ÖZET (devam ediyor)

Bu analizlerin sonucunda populasyonyonlardaki genetik varyasyonlar, populasyonlar arası

genetik uzaklık ve genetik benzerlik sonuçları elde edilmiştir. Nei (1972)’ye göre hesaplanan
genetik mesafe değerlerinde genetik olarak birbirine en yakın populasyonlar Sarollah ve
Mosain iken en uzak populasyonlar ise Soush ve Dezful’dur. Genetik ilişkilerini gösteren
dendograma göre de 3 gruba ayrılmıştır. Genetik farklılaşma değeri en yüksek Khuzestan
eyaletindeki populasyonda iken Bushehr ve Ilam eyalet populasyonlarında genetik farklılaşma
değerleri eşittir. Populasyon içi farklılaşma değerleri Bushehr eyalet populasyonunda en fazla,
Khuzestan eyalet populasyonunda ise en azdır. Populasyonlar arası genetik ilişki ağacına göre
3 eyalet populasyonları da birbirine yaklaşık olarak eşit uzaklıkta bulunmaktadır.

Anahtar Sözcükler: Küçük balarısı, Apis florea, RAPD, İran

Bilim Kodu: 401.02.00

iv
 ABSTRACT

M.Sc. Thesis

DETERMINATION OF GENETIC VARIATION BASED ON RAPD METHOD IN

DWARF HONEYBEE (APIS FLOREA FABRICIUS) POPULATIONS DISTRIBUTED
IN IRAN

Burçin TERZİ

Zonguldak Karaelmas University

Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Biology

Thesis Advisor:
Prof. Mustafa SÖZEN
Assoc. Prof. İrfan KANDEMİR
June 2008, 39 pages

In this study, dwarf honeybee (Apis florea Fabricius) populations distributed in three states of
Iran were studied by RAPD PCR method to determine the presence of genetic variation. The
dwarf honeybees samples were collected in different years (2005-2007) from Bushehr,
Khuzestan and Ilam states. A total of 158 Apis florea colonies from nine locations belonging
to above mentioned three states. DNA was isolated from 155 dwarf honeybee thorax and they
were subjected to RAPD-PCR method utilizing 10 primers. PCR products were resolved by
agaroz jel electrophoresis and stained with Ethidium Bromide. Screened bands were evaluated
over Ultraviolet Light. POPGEN32 and POPULATION 1.0 computer programs were used to
analyze samples.

v
 ABSTRACT (continued)

After analysing the genetic variations in these populations, several population genetic
parameters such as genetic distances between populations and genetic similarities were
calculated. According genetic distances based on Nei (1972), the nearest populations were
found to be Sarollah and Musain, and the farthest populations were Soush and Dezful. The
studied populations were divided into three groups according to the dendrogram constructed
based on the genetic similarities. Khuzestan state was the most differentiated than other states.
Bushehr and Ilam were more similer to each other. With respect to within genetic variation in
each state, Bushehr has the higest, on the other hand Khuzestan has the lowest. Based on the
dendrogram construted with respect to genetic variation present in each state, three states
were approximately equal distances to each other.

Key Words: Dwarf honey bee, Apis florea, RAPD, Iran

Science Code: 401.02.00

vi
 TEŞEKKÜR

Bu tezi tamamlamam için yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Prof. Dr. Mustafa
SÖZEN’e (ZKÜ) teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans çalışmalarım sırasında çalıştığım için
beni anlayışla karşılayıp tez çalışma programını bana göre düzenleyen, değerli bilgileriyle
beni yönlendiren, her konuda beni destekleyen ve ufkumu genişleten, kendisinin öğrencisi
olmaktan onur duyduğum saygı değer hocam Doç. Dr. İrfan KANDEMİR’e (Ankara Ü.)
sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Tez çalışmam için örnekleri sağlayan İran Zanjan Üniversitesi’nden Yrd. Doç. Dr.
Mohammed G. Moradi’ye (Zenjan Ü.) çok teşekkür ederim.

Laboratuar çalışmalarımda ve tez yazımındaki yardımlarından dolayı Doktora Öğrencisi Ayça

ÖZKAN’a çok teşekkür ederim.

Tezimin her aşamasında beni destekleyen eşim İlkay TERZİ’ye ve benimle beraber
çalışmalara katılan oğlum Canberk TERZİ’ye çok teşekkür ederim. Her zaman yanımda olan
ve beni destekleyen aileme sonsuz teşekkür ederim.

vii
viii
 İÇİNDEKİLER

Sayfa
KABUL .................................................................................................................................. ii
ÖZET...................................................................................................................................... iii
ABSTRACT ........................................................................................................................... v
TEŞEKKÜR ........................................................................................................................... vii
İÇİNDEKİLER....................................................................................................................... ix
ŞEKİLLER DİZİNİ................................................................................................................ xiii
ÇİZELGELER DİZİNİ .......................................................................................................... xv
KISALTMALAR DİZİNİ ..................................................................................................... xvii

BÖLÜM 1 GİRİŞ ................................................................................................................... 1

1.1 APIS FLOREA’NIN GENEL ÖZELLİKLERİ VE BİYOLOJİSİ............................... 4

1.1.1 Morfolojik Özellikleri........................................................................................... 4
1.1.2 Balarılarının Hayat Devresi .................................................................................. 5
1.1.3 Yayılış Alanı ......................................................................................................... 6
1.2 MOLEKÜLER TEKNİKLER ..................................................................................... 8
1.2.1 RAPD Tekniği ...................................................................................................... 9
1.3 ARAŞTIRMANIN AMACI ........................................................................................ 10

BÖLÜM 2 MATERYAL METOT ........................................................................................ 11

2.1 ÖRNEKLERİN TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI ........................................... 11

2.2 DNA İZOLASYONU.................................................................................................. 12
2.2.1 CTAB Metodu ...................................................................................................... 12
2.2.2 İzolasyonda Kullanılan Stok Çözeltiler ................................................................ 13
2.3 RAPD PCR METODU................................................................................................ 14
2.3.1 PCR ve Bileşenleri................................................................................................ 14
2.3.2 RAPD Primerleri .................................................................................................. 15

ix
 İÇİNDEKİLER (devam ediyor)
Sayfa
2.3.3 Tek Bir Örnek İçin Hazırlanan RAPD-PCR Karışımı.......................................... 15
2.3.4 RAPD-PCR Koşulları ........................................................................................... 17
2.4 AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ............................................................................ 17
2.5 JELDEKİ BANDLARIN YORUMLANMASI VE ANALİZİ ................................... 17

BÖLÜM 3 SONUÇLAR........................................................................................................ 21

BÖLÜM 4 TARTIŞMA ......................................................................................................... 29

KAYNAKLAR....................................................................................................................... 33
ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................................... 39

x
 ŞEKİLLER DİZİNİ
No Sayfa

1.1 Dört Apis türünün yuva özellikleri, habitatları, vücut ağırlıkları ve yerçekimine
göre yaptığı davranışlarına göre sınıflandırılması ............................................................ 3
1.2 Apis florea’nın dünya üzerindeki yayılış alanları ............................................................. 7
2.1 İran İslam Cumhuriyeti’nde örneklerin toplandığı eyaletler (1: Dehloran, 2: Sarollah,
3: Mosain, 4: Dasht Abas, 5: Ogahha, 6: Dezful, 7: Soush, 8: Ahvaz, 9: Bushehr) .........12
2.2 POPGENE32 programına RAPD verilerinin veri giriş dosyası........................................19
2.3 POPULATION programına RAPD verilerinin veri giriş dosyası.....................................19
3.1 Çalışmada kullanılan örneklerin primer 4 ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü......................................................................22
3.2 Çalışmada kullanılan örneklerin primer 5 ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü......................................................................22
3.3 Çalışmada kullanılan örneklerin OPB 17 primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü......................................................................22
3.4 Çalışmada kullanılan örneklerin OPD 02 primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü......................................................................23
3.5 Çalışmada kullanılan örneklerin OPB 07 primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü......................................................................23
3.6 Dokuz Apis florea populasyonları arasındaki genetik ilişkileri gösteren, Nei (1972)’nin
standart genetik mesafe değerlerine göre gösteren dendogram.........................................25
3.7 Dokuz Apis florea populasyonları arasındaki genetik ilişkileri gösteren diğer bir
dendogram.........................................................................................................................26
3.8 Üç eyalet populasyonları ve alt populasyonları arasındaki genetik ilişkileri gösteren,
dendogram.........................................................................................................................27

xi
xii
 ÇİZELGELER DİZİNİ

No Sayfa

1.1 Hayvanlar aleminin böcekler sınıfında yer alan balarısının taksonomisi ......................... 3
1.2 Balarılarında biyolojik hayat evreleri................................................................................ 6
1.3 RFLP ve RAPD-PCR yöntemlerinin karşılaştırılması ......................................................10
2.1 İran İslam Cumhuriyeti’nden örnek toplanan eyaletler, lokasyon ve koordinatlar...........11
2.2 RAPD PCR analizinde kullanılan primerler ve baz dizileri..............................................16
2.3 Her bir primer için kullanılan PCR koşulları ....................................................................17
3.1 Her bir primerden elde edilen toplam bant sayısı .............................................................21
3.2 Tüm lokuslar için 9 lokasyondaki populasyonlarda genetik varyasyon analizi sonucu ...24
3.3 Genetik mesafe (alt diagonal) ve genetik benzerlik (üst diagonal) hesaplamaları ...........25
3.4 Tüm lokuslar için 3 eyalet populasyonların genetik varyasyon analizi sonucu................26
3.5 Üç eyalet populasyonları için genetik farklılaşma analizi sonucu ...................................27

xiii
xiv
 KISALTMALAR DİZİNİ

AFLP : Amplifiye edilen parça uzunluk polimorfizmi

mtDNA : Mitokondriyal DNA
PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu
RAPD : Rastgele amplifiye edilen polimorfik DNA
RFLP : Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi
SSR : Basit dizi tekrarları

xv
xvi
 BÖLÜM 1

GİRİŞ

Arıcılığın tarihçesi insanların mağara hayatı yaşadığı on binlerce yıl öncesine kadar
gitmektedir. M.Ö. 7000 yıllarına ait mağaralara çizilen resimler, çok eski tarihlere ait arı
fosilleri ve benzeri tarihi buluntular bu görüşü doğrulamaktadır. İlk insanlar doğal olarak ağaç
kovukları ve kaya oyuklarına yuvalanan oğulları öldürerek ballarından yararlanmışlardır.
Tarihi gelişim içinde taş devrinden itibaren; önce mantar ve ağaç kütükleri
sonra da toprak ve kilden yapılmış kaplar kovan olarak kullanılmış ve
zamanla bugün kullanılan kovanlar geliştirilmiştir. Gerçek arıcılık, insanların ağaç kovukları
içinde yuvalanan arıları öldürmeden bir miktar bal almaları ve bir miktar balı da arılara
bırakmaları ile başlamıştır. Arıların gen merkezlerinin Orta-Doğu ülkeleri olduğundan
arıcılığın ortaya çıkması bu ülkelerde olmuştur. Bununla birlikte M.Ö. 1300 yıllarına ait
olduğu sanılan ve Hititler devrinden kalma Boğazköy'deki taş yazıtlarda arılardan
bahsedilmesi arıcılığın Anadolu'da da çok eski tarihlere dayandığını göstermektedir.

Günümüz arıcılığına gelinmesinde; 1787 yılında ana arının havada çiftleştiğinin tespiti, 1845
yılında arı üreme biyolojisinin izahı, 1851 yılında çerçeveli fenni kovanın keşfi, 1857 yılında
temel petek kalıplarının bulunuşu, 1865 yılında bal süzme makinesinin icadı, 1882 yılında
larva transfer yöntemiyle ana arı yetiştirme tekniğinin keşfi ve 1926 yılında ana arılarda yapay
döllemenin bulunuşu gibi icatlar katkıda bulunmuştur.

Bugün dünyada 56 milyon dolayında arı kovanı bulunmakta ve bunlardan 1.2 milyon ton
dolayında bal üretilmektedir. Üretilen balın yaklaşık 1/4'ü ticarete konu olmakta ve dış
satımın %90'ı 20 dolayındaki bal üreticisi ülkeden yapılmaktadır. Dünyanın en çok kovan
varlığına (65 milyon) sahip ve bal üreten (211 bin ton) ülkesi Çin'dir. Bal yanında; propolis,
arı sütü, polen ve balmumu gibi arı ürünleri de dünya ticaretinde yer almaktadır. Bununla
birlikte arıcılık, doğa ve çevreye zarar vermeden yapılabilen ender tarımsal faaliyetlerden
birisidir. Bu yönüyle de arıcılık geleceğin en önemli sürdürülebilir tarım faaliyetlerinden birisi
olacaktır (URL-1 2008).

1
Dünyada bilinen 900,000 farklı böcek türü vardır. Bu da gösteriyorki yaklaşık olarak
dünyadaki türlerin %80’i böcektir. Bu bilgi eski ve yeni çalışmalara dayanıyor. Birçok yazar
tanımlanan böcek sayısından daha fazla isimlendirilmemiş böcek olduğunu düşünüyor (Erwin
1983).

Aynı morfolojik özellikleri gösteren bal arılarının içinde bulundugu Apidae günümüzden 70
milyon yıl önce ortaya çıkmıstır. Bu familya içinde bulunan Apis yaklasık 30 milyon yıl önce
ortaya çıktıgı tahmin edilmektedir. İlk tespit edilen Apis örnegi Almanya’da, alt Miosen’e ait
olarak bulunmustur (22–25 milyon yıl önce). Bu örnek Cockerell (1907) tarafından Synapsis
henshawi olarak adlandırılmıs, sonra Zeuner et al. (1976) tarafından Apis içerisinde
sınıflandırması yapılmıştır (Ruttner 1988).

Küçük balarısı (Apis florea)’nın da içinde yer aldığı balarıları Hymenoptera, Apidae içindeki
Apis’te yer alır (Çizelge 1.1). Bu tür ilk defa Fabricius (1787) tarafından tanımlanmıştır.
Yapılan farklı araştırmalar sonucu bu cins içerisinde tanımlanan diğer türler Apis dorsata,
Apis cerana, Apis mellifera, Apis nuluensis, Apis laboriosa, Apis koshevnikovi, Apis
nigrocincta ve Apis andreniformis’tir (Otis 1996). Son iki yüz yılda Apis florea’ nın çeşitli alt
türleri, varyasyonları ve nationesları tanımlandı ve Apis andreniformis türleri Apis florea gibi
isimlendirilmişti (Maa 1953). 1990’dan önceki literatürlerde işçi arıların morfolojik olarak
benzer olduğundan ve türlerin de kısmen simpatrik olduğundan çoğu kez değerlendirmek zor
olduysa da küçük balarılarının (Apis florea ve A. andreniformis) sınıflandırmasının doğruluğu
ortaya çıkarıldı (Otis 1996).

Tropikler alanlarda yayılış gösteren, Apis florea ve Apis dorsata doğal “eski” türlerdir. Bu
türlerin kolonileri ağaç dallarında açık alanlarda bulunur ve tek bir koloni kurarak yaşarlar.
Bir diğer tropikal tür, Apis cerana doğal olarak ağaç oyuklarında yaşar, Apis mellifera’nın da
doğal alandaki yuvaları kapalı alanlarda bulunur. Bununla beraber Apis cerana’da Apis
mellifera gibi Uzak Doğu’da insanlar tarafından bal üretimi ve tozlaşmada kullanılmaktadır
(Ruttner 1988). Şekil 1.1’de görüldüğü gibi bu dört alttürden en küçüğü Apis florea’dır.
Haberleşme açısından bakıldığında en ilkel türün Apis florea olduğu Ruttner (1988)
tarafından belirtilmektedir. Ayrıca Apis florea’nın dans ederken yerçekimi ve akustik
sinyalleri kullanmadığı Sen Sarma et al. (2007) tarafından belirtilmiştir.

2
 Çizelge 1.1 Hayvanlar aleminin böcekler sınıfında yer alan balarısının taksonomisi.

Alem (Kingdom) Hayvanlar (Animalia)

Şube (Phylum) Eklembacaklılar (Arthropoda)
Alt Şube (Subphylum) Antenliler (Antennata)
Sınıf (Class) Böcekler (Insecta)
Takım (Order) Zar Kanatlılar (Hymenoptera)
Familya (Family) Arılar (Apidae)
Cins (Genus) Bal Arıları (Apis)
Tür (Species) Apis florea
Apis dorsata
Apis cerana
Apis mellifera
Apis nuluensis
Apis laboriosa
Apis koshevnikovi
Apis nigrocincta
Apis andreniformis

Şekil 1.1 Dört Apis türünün yuva özellikleri, habitatları, vücut ağırlıkları ve yerçekimine göre
yaptığı davranışlarına göre sınıflandırılması (Sen Sarma et al. 2007).

3
1.1 APIS FLOREA’NIN GENEL ÖZELLİKLERİ VE BİYOLOJİSİ

1.1.1 Morfolojik Özellikleri

Apis mellifera ve Apis cerana büyük koloniler halinde ve paralel petekler üzerinde yaşayan
gelişmiş arı türleridir. Apis florea ise daha ilkel balarıları olup kolonileri tek petek üzerinde
yaşamaktadır (Ruttner 1988). Koloni gelişimi oğul verme yöntemine bağlıdır ve Apis florea
aktivitesi ilkbaharda başlar sonbaharın sonunda biter (Moradi and Kandemir 2004). Apis
florea’nın en sık rastlanan yuva yapma yeri bir çalının ince bir dalı ya da bir küçük ağaçtır.
Dar bir desteğe peteği bağlar. Böylece Apis florea peteği dalı tamamen kuşatmış olur. Altıgen
hücre örnekleri ile inşaa başlatılır ve hücreler dalın tüm çevresine yüzeyden hemen
yerleştirilir. Bu esasa göre hücreler az ya da çok yatay olarak iki tarafa doğru büyür.
Yanlamasına çok derin bir hale gelir (20–30 mm). Tepedeki hücreler derinliği azaltır; böylece
az ya da çok yassı yüzey yaratılır. Dalın üstündeki ve altındaki karşılıklı hücreler ortak bir dip
şekillendirirler, hücreleri ayırırlar ve peteğin temelini oluştururlar. Dalın etrafındaki silindirik
hücre yapısı başarılı bir şekilde balla dolar ve tarlacı arıları ile iletişim kurmak için düzleşmiş
tepede dans odasının oluşumunu sağlar. Dalın altındaki peteğin ansızın çapı daralır (16 mm).
Çok düzenli, küçük hücreli peteğin bu bölümü yavru petektir. Bal kabının ya da tepesinin bal
depolama kapasitesi 500-1000 g arasıdır. Sadece olgun petekler kıyaslandığında bile Apis
florea peteklerinin büyüklüğü oldukça çeşitlilik gösterir. Güney İran’da 130 x 130 mm ve 270
x 360 mm (= 265-1527 cm²) arasında çeşitlilik gösterir. Daha büyük erkek hücreler (4,2–4,8
mm) peteğin alçak bölümlerinde bulunur. Kraliçe hücreler dipte bulunur. Kuzeyden güneye
doğru vücut büyüklüğü düşüşüne bağlı olarak işçi yavru hücrelerin çapı coğrafik çeşitlilik
sergiler. Apis florea açık alanlarda yuva yapmasına rağmen geniş ağızlı küçük mağaralarda,
binaların barınak alanlarında ya da bahçe yüzeyinden uzak kuyularda da yuva yapabilir. Bu
alanlarda petek desteği her hangi bir duvar, saçak, kutu vs. olabilir. Apis florea Umman’daki
ağaçsız bölgelerde uçurum kayalarını yuva yeri olarak kullanabilir. Bu gibi yerlerde peteğin
desteğe bağlanma durumu daldakine göre farklılık gösterir, değişmeden aynen kalır. Her
durumda altıgen hücre örneği destekte petek yapımına başlatılır. Eğer destek dikey duvar ise
petek yatay olarak ona bağlanır. Tepe kısım böylece tek yanlı hale gelir. Eğer destek yatay
tavan ise dikey petek zıt yönde yavaş yavaş bitişik hücre ekseni değişikliğine neden olur. Bu
durumda bal kabı hemen tavana bağlanan yavru petek tarafına yerleşir.

4
Doğada elverişsiz koşullar altındaki yaşam mücadelesi yeteneği onun karakteristik özelliğidir.
Günlük uçuş aktivitesini bitirdikten sonraki sıcaklık toleransı Apis mellifera’ya göre
yüksektir. Günlük uçuş örneğinde anlamlı bir fark vardır. Gündüz Apis florea tarlacı arıları
uçuşa 2 saat sonra başlar ama 40 ºC’den yüksek sıcaklıklarda bile saatlerce çalışmaya devam
eder. Aynı sıcaklıkta Apis mellifera tüm uçuş aktivitelerini çoktan durdurmuştur (Ruttner
1988).

İşçi ve diğer arılar arasındaki büyüklük farkının dikkat çekici olması Apis florea’nın önemli
bir karakteristik özelliğidir. Bu farklılık diğer türlerde daha azdır. Vücut büyüklüğündeki
farklar aynı zamanda yavru hücrelerinin büyüklüğüne de yansımıştır. İşçi sınıfının küçük
ebatlı olması bulundukları biyotopun özelliğinden dolayıdır. Yoğun çalılık yerlerde ve
tropiklerde küçük ağaçlarda bulunurlar. Yuva yapma ve yiyecek arama için kazandıkları
adaptasyonlardan dolayı küçük ebatlıdırlar.

1.1.2 Balarılarının Hayat Devresi

Bal arıları yaşama bir yumurta olarak başlarlar. Ana arının petek gözlerine yumurtladığı
döllenmiş yumurtalardan işçi arılarla ana arılar, dölsüz yumurtalardan ise erkek arılar
meydana gelmektedir. Bir arının yaşamında yumurta, larva, pupa ve ergin olmak üzere 4
farklı gelişme dönemi vardır. Petek gözü içerisinde geçen dönem (kuluçka süresi) ana arıda
16, işçi arılarda 21, erkek arılarda da 24 gün sürmektedir.

Kraliçe arının birden fazla erkek arı ile çiftleşmesi özelliği Apis için ayırt edici özelliktir. Cins
içinde kraliçe arılarda çiftleşme frekansı yüksektir. Bazı Apis kraliçelerinde kraliçenin 44 ve
fazlası erkek ile çiftleştiği belirtilmiştir. Apis florea’nın çiftleşme frekansı diğer türlere göre
düşük olsa da oldukça yüksek bir değerdedir (Palmer and Oldroyd 2001). Yumurtasının
boyutu Apis cerana indica ile aynıdır (0,46 x 1,675 mm, resp. 0,403 x 1,750 mm) ama Apis
dorsata’dan küçüktür. Apis florea’nın doğal kolonilerinde işçi arıların görevi sıvı ve polen
aramak, iğnesini batırarak ve titrek bir şekilde sallanarak abdomenini korumaktır (Oldroyd et
al. 1994 ).

5
 Çizelge 1.2 Balarılarında biyolojik hayat evreleri.

Devreler(gün) Ana Arı İşçi Arı Erkek Arı

Yumurta devresi 0-3 0-3 0-3
Yumurtadan çıkış 3.gün 3.gün 3.gün
Larva devresi 3-8 3-8 3-10
Gözün kapatılması 8.gün 8.gün 10.gün
Pupa devresi 8-16 8-21 10-24
Ergin hale geliş 16.gün 21.gün -

1.1.3 Yayılış Alanı

Apis florea sıcak iklimli alçak ovalarda, ağaç dallarında açık alanda koloni kurarak yaşar.
Yayılış alanları batıda Oman’ın ılık bölgeleri, İran ve Pakistan, Hindistan kıtasında ve Sri
Lanka’dır.

Apis florea Güney Asya ovalarının balarısıdır. Asya’da yayılış gösteren diğer türlere göre
Uzakdoğu’nun daha batı kısımlarında bulunmaktadır. Apis florea çok büyük bir yayılış
alanına sahiptir, özellikle kentsel alanlarda bulunmaktadır (Hepburn and Hepburn 2005). Apis
florea kendi alanlarının büyük bölümünde Apis dorsata ve Apis cerana ile simpatrik yaşar.
Apis mellifera ile ise yalnızca kuzey doğu Umman’da simpartik yaşar. Türün yayılış alanı için
Whitcombe (1984) İran, Umman, muhtemelen Irak, Abu Dhabi olduğunu belirtmiştir. Türün
asıl habitatı Pakistan, Hindistan, Sri Lanka, Tayland, Hindiçini, Malezya, Endonezya’nın bazı
bölümleri (Sumatra, Java, Borneo) ve Palawan’nın 500 m yüksekliği, Sudan ve Suudi
Arabistan, Kuveyt (Maa 1953, Free 1981, Ruttner 1988, Moradi and Kandemir 2004,
Hepburn and Hepburn 2005). Bu türün dünya üzerindeki yayılış alanı Şekil 1.2’de
görülmektedir. Hepburn ve Hepburn (2005) Asya’daki bu geniş yayılış alanı dışında
Afrika’nın iklimsel koşullarınında bu türün yayılışı için uygun olduğunu belirtmektedir.

Apis florea’nın İran’daki Bushehr’in güney sahilleri, Hormuzgan, Sistan va Baluchestan, Fars,
Khuzestan, Kerman, Ilam, Boyarahmad va Kohgiluye ve Lorestan ile sınırlıdır (Mossadegh
1993). Hashemi (2004) Batı’daki yayılış alanının Kürdistan’daki Qhasr-e- Shirin’den
başladığını belirtmiştir. Sehristani (1997) İran’ın Kirman-Jiroft bölgesinde de bu türün var
olduğunu belirtmiştir.

6
7
Şekil 1.2 Apis florea’nın dünya üzerindeki yayılış alanları (Hepburn et al. 2005).
1.2 MOLEKÜLER TEKNİKLER

Son yıllarda tür tanımlanması, türler arası ve tür içi polimorfizmi belirlemek için moleküler
teknikler kullanılmaya başlanmıştır.

Bal arısı alt türlerinin DNA’ları da moleküler düzeyde çalışılmaya başlanmıştır. Bu

çalışmalarda restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP), mikrosatellitler (SSR-basit dizi
tekrarları), mtDNA ve mtDNA’nın belirli bölgelerinin dizi analizi, rastgele amplifiye edilen
polimorfik DNA (RAPD), amplifiye edilen parça uzunluk polimorfizmi (AFLP) ve DNA
parmak izi gibi teknikler kullanılarak bal arılarında genetik varyasyon tespit edilmeye ve
bulunan farklılıklardan balarılarının evrimi ortaya çıkarılmaya çalısılmıştır (Sheppard and
Smith 2000).

RFLP ilk defa Hamilton Smith (Nobel Prize 1995) tarafından keşdedilen tek baz
değişikliklerini veya farklı büyüklükte minisatellitleri belirleyebilen bir tekniktir. En önemli
özelliği hem nüklear DNA’ daki hemde mtDNA’daki genetik varyasyonları ayırt
edebilmesidir. Apis mellifera alttürleri populasyonlarında nRFLP çalışmalarının yanında
mtDNA ile RFLP çalışmaları da yapılmıştır (Clarke et al. 2001, Crozier et al. 1991, Franck et
al. 2000, Garnery et al. 1992, 1993, 1995, Hall and Muralidharan 1989, Hall and Smith, 1991,
Meixner et al. 1993, Moritz et al. 1986, 1994, Nielson et al. 2000, Sheppard et al. 1996, Smith
1988, Smith and Brown 1988, 1990, Smith et al. 1989, 1991).

Mikrosatellitler genom içerisinde mono, di, tri ya da tetra nükleotid permütasyonların her
hangi biri şeklinde nadir olarak tekrarlanan (tandem repeated) kısa DNA sekanslarıdır
(Ellegren 1993). Balarıları alttürlerinde mikrosatellit çalışmaları Estoup et al. (1995), Franck
et al. (1998), Franck et al. (2000), Franck et al. (2001) ve Garnery et al. (1998) tarafından
yapılmıştır

PCR tekniği ilk kez 1985 yılında Kary B. Mullis tarafından polimeraz zincir reaksiyonunu
tanımlayan araştırmasını yayınlamasıyla bilindi. DNA molekülleri topluluğunda, özgül hedef
DNA dizilerinin dizilimi belli olan iki primer ile çoğaltılmasına dayanır. PCR yöntemi teşhis
ve moleküler kopyalama da değerli bir araç olmakla birlikte aynı zamanda da DNA
örneklerinin katlanarak milyonlarca çoğaltılmasını sağlar. Hedef DNA dizilerine birleşen
oligonükleotidler polimeraz reaksiyonlarında primer olarak kullanılmıştır (Arslan 2004).

8
1.2.1 RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) Tekniği

Bireyler arasındaki DNA dizi farklılığının belirlemek için kullanılan bir tekniktir. Genomik
DNA’nın tesadüfi primerlerle DNA polimeraz enzimi aracılığıyla milyonlarca kez
çoğaltılması esasına dayanır (Welsh ve McClelland 1990). Burada amaç türler arası
filogenetik akrabalıkları, tür içi polimorfizmi, DNA’daki yer değiştirmeler, ters dönmeler,
parça eksilmeleri ve parça yerleşmeleri ile meydana gelir ve genleri, onların düzenlenmelerini,
biyokimyayı, gelişmeyi, morfolojiyi, davranışı etkileyeceğinden evrim sürecinde fenotipik
varyasyonun da kaynağıdır ve genetik varyasyonları analiz etmektir. William et al. (1990) ve
Welsh and McClelland (1990), rastgele primerler kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu ile
rastgele DNA dizilerinin çoğaltılmasında yeni bir teknik bulmuşlardır.

RAPD’in diğer moleküler yöntemlere göre avantajı ise reaksiyonlarda nanogram (ng)
düzeyinde DNA’ya ihtiyaç duyulması, primerlerin tesadüfi olarak seçilmesi, yüksek
polimorfizm göstermesim ve bu seçimde belli bir sekans bilgisine gereksinim duyulmamasını,
basit, hızlı ve polimeraz zincir reaksiyonu ürünlerinin (PCR) agaroz jel üzerinde ayrıştırılarak
ethidium bromide ile boyandıktan sonra ultraviyole (UV) ışık kaynağı altında görüntülenmesi,
sonuçların daha kısa sürede alınması ve maliyetinin ucuz olmasını sayabiliriz (Çizelge 1.3).
Bu tekniğin en önemli dezavantajı ise sonuçların tekrarlanmasında karşılaşılan güçlüklerden
dolayı güvenirliliğinin az olmasıdır (Gübbük ve Pekmezci 2001, Çizelge 1.3).

Reaksiyonun ürünleri, oligonükleotidlerin dizisine, uzunluğuna ve reaksiyon şartlarına

bağlıdır. RAPD yönteminin en büyük üstünlüğü çok sayıda marker sağlamasıdır. Fragman
sayısı (veya lokusu), RAPD primerleri ile büyümesi, genomun boyutu ve içeriği birde
reaksiyonun şartları gibi faktörlere bağlıdır (Williams et al. 1990).

Suazo et al. (1998) farklı balarısı alttürleri (A. m. ligustica, A. m. carnica, A. m. mellifera, A.
m. iberica ve Amerika’daki Avrupa ve Afrika kökenli arılar) ile yaptıkları çalışmalarda bu
tekniği kullanmışlardır.

9
 Çizelge 1.3 RFLP ve RAPD-PCR yöntemlerinin karşılaştırılması.

RFLP RAPD

Kalıtım Basit, Mendel, Kalıcı, Kodominant Basit, Mendel, Dominant

Polimorfizm Derecesi Yüksek Yüksek

Allelik Varyant Tespiti Evet Hayır

Saptanan Lokus Sayısı 1-3 1-10

Teknik Zorluk Orta Yüksek

Güvenirlik Yüksek Orta/yüksek

Gereken DNA Miktarı 2-10 μg. 10-50 μg.

Radyoizotop Evet Hayır

1.3 ARAŞTIRMANIN AMACI

Balarıları ekonomik anlamda en yararlı böceklerin başında gelmektedir. Tozlaşma ile tarıma
yaptıkları katkı son derece önemlidir. Apis florea’da sıcak bölgelere adapte olmuş ve yayılış
gösterdiğinden bu bölgelerdeki bitki tozlaşmasına önemli katkılar yapmaktadır. Uzak
doğudan İran’a kadar yayılış gösteren bu tür üzerine yeteri kadar çalışma yapılmamıştır. Tür
içi varyasyonu belirlemek yapılan çalışmalar morfometrik yöntemlerin kullanılması ile sınırlı
kalmıştır. Bu çalışmada İran İslam Cumhuriyeti’nde dağılım gösteren Apis florea’ya ait 3
eyaletten toplanan 158 doğal koloniden toplanan örnekler ile RAPD PCR tekniği ile genetik
varyasyonun tespitini amaç edinilmiştir.

10
 BÖLÜM 2

MATERYAL VE METOT

2.1 ÖRNEKLERİN TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI

İran İslam Cumhuriyeti’nden küçük balarısı örnekleri farklı yıllarda (2005, 2007)
toplanmıştır. 3 eyaletten toplam 9 lokasyonda 158 doğal koloniden toplanan Apis florea
örnekleri ile çalışma gerçekleştirilmiştir. Örnekleme yapılırken Apis florea’ nın dağılım
gösterdiği eyaletlerden mümkün olduğu kadar çok doğal koloni örneklenmeye çalışılmıştır.
Örneklerin toplandığı lokasyonlara ait detaylı bilgiler Çizelge 2.1 ve Şekil 2.1’de verilmiştir.

İşçi arı örnekleri doğal yuvalarından toplanmıştır. Toplanan örnekler küçük cam ve plastik
şişelere konulmuştur. Travmatik deformasyonları ve ekto-endo parazitleri önlemek için
örnekler % 70’lik Etil alkol içerisinde laboratuar ortamına getirilmiştir (Aytekin 2007). Bu
şekilde laboratuar koşullarına getirildikten sonra DNA’lar elde etmek için torakslar alıp -20
°C’de saklanmıştır. Daha sonra uygun DNA izolasyon yöntemi uygulanarak DNA izolasyonu
gerçekleştirilmiştir. RAPD-PCR yöntemi ile amplifiye edilen DNA’lar agaroz jel
elektroforezinde yürütülmüştür. Elde edilen bandlar yorumlanarak istatistiksel analizler
yapılmıştır.

Çizelge 2.1 İran İslam Cumhuriyeti’nden örnek toplanan eyaletler, lokasyon ve koordinatlar.

Eyalet Lokasyon Koordinatlar

Ilam 1. Dehloran 32.41N 47.15E
2. Sarollah 32.35N 47.22E
3. Mosain 32.32N 47.22E
4. Dasht Abas 32.29N 47.47E
5. Ogahha 32.10N 47.41E

Khuzestan 6. Dezful 32.23N 48.23E

7. Soush 32.11N 48.14E
8. Ahvaz 31.17N 48.43E

Bushehr 9. Bushehr 28.59N 50.50E

11
Şekil 2.1 İran İslam Cumhuriyeti’nde örneklerin toplandığı eyaletler (1: Dehloran, 2: Sarollah,
3: Mosain, 4: Dasht Abas, 5: Ogahha, 6: Dezful, 7: Soush, 8: Ahvaz, 9: Bushehr).

2.2 DNA İZOLASYONU

Apis florea örneklerinden DNA izolasyonu için Doyle and Doyle (1987)’un CTAB metodu
kullanılarak DNA izolasyonu gerçekleştirildi.

2.2.1 CTAB Metodu

Ependorf tüpüne konulan balarısı toraksı üzerine 300 μl CTAB solüsyonu eklendi. Bir pestle
ile olabildiğince ezilen toraks üzerine 300 μl daha CTAB ve 50 μl βME (ß-Merkaptoetanol)
eklendi ve nazikçe karıştırıldıktan sonra 65 oC de 1 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonucu tüp
üzerine 500 μl kloroform: izoamil alkol (24:1), eklenip, yavaşça karıştırıldı. 4 oC’de 13000
rpm’de 15 dakika santrifüj edildikten sonra sulu faz alınıp üzerine 500 μl soğuk izopropanol

12
eklendi ve -80 oC’de 30 dakika inkübe edildi. 4 oC’de 13000 rpm’de 10 dakika santrifüj
edildikten sonra süpernatant atılıp çökelti iki kere %70’lik etil alkol ile yıkandı. Steril kabinde
1 saat süre ile kurutulan çökeltiler daha sonra 50 μl TE tamponu içerisinde çözüldü ve elde
edilen DNA örnekleri çalışılmak üzere -20 oC saklandı.

2.2.2 İzolasyonda Kullanılan Stok Çözeltiler

CTAB çözeltisi
Sorbitol (L-sorbase) 2,5 g
N-Lauroylsarcosine (Sodium Salt) 1,0 g
CTAB (Hexadectrimethyl ammonium bromide) 0,8 g
NaCl 4,7 g
EDTA 0,8 g
PVPP (Sigma 6755) 1,0 g
100 ml’ye distile su ile tamamlanır.

βME stoğu
MW 78.13 g in 1000 ml
250 ml=19,5 g
1,14 g in 1ml
19,5 g in 17,5 ml
17,5ml βME + 232,5ml dH2O =250 ml.
1M Tris = 12,11g in 100 ml pH: 8,0 (otoklav)
5M KAc= 24,5g in 50 ml (otoklav)
0,3M NaOAc= 4,083g in 100 ml (otoklav)
0,5M EDTA= 3,722g in 200 ml pH: 8,0 (otoklav)
5M NaCl= 29,22g in 100 ml (otoklav)

TE buffer
1 ml 1M Tris + 20 μl 0,5M EDTA + 99 ml dH2O pH: 8,0 (otoklav)

13
2.3 RAPD PCR METODU

Arbitrary primed PCR (AP-PCR) olarak da adlandırılan Random Amplified Polymorphic

DNA-PCR (RAPD-PCR), genomik DNA’nın rastgele seçilmiş bir veya daha fazla primer ile
çoğaltılması prensibine dayanmaktadır. Kullanılan primerler genellikle 9-10 bazlık kısa
primerler olup G-C bakımından zengindir (En az %40 mol G+C içermelidir) (Ütük vd. 2005).
Kısa primer, analizi yapılacak DNA kalıbının her iki zincirininde farklı yerlerine yapışabilir.
Reaksiyon sonucunda, bu farklı yapışmalardan dolayı farklı uzunluklarda ürünler ortaya çıkar.
Analizi yapılan genomik kalıplar arasında farklılıklar varsa primerlerin yapışma yerleri
değişeceğinden agaroz jel üzerinde farklı büyüklükte bantlar görülecektir (Ütük vd. 2005).

RAPD yönteminin başlıca avantajları, spesifik PCR ve RFLP yöntemlerindeki gibi her
hayvan için türe spesifik primerin kullanılmasına ve her hayvan türü için ayrı bir PCR
işlemine gerek duyulmamasıdır. Ayrıca türlerin DNA dizilişlerinin bilinmesine de gerek
yoktur. Dezavantajları olarak, farklı primerler ile farklı sonuçlar alınması ve aynı tür
içerisinde, tekrarlar arasında küçük varyasyonlar çıkabilmesi dolayısı ile kullanılan hedef
DNA miktarının ve RAPD yönteminin tam olarak standardize edilmesi gerektiği
vurgulanabilir. Aksi takdirde, laboratuarlar arasında alınan sonuçlar tartışılabilir (İlhak ve
Arslan 2007).

2.3.1 PCR ve Bileşenleri

PCR üç aşamadan oluşmaktadır. Birinci aşama ayrılma (denatürasyon) DNA dizilerinin

birbirinden ayrılmasıdır, ikinci aşama olan bağlanma (annealing) de primer kopyalanmak
istenilen bölgenin karşılığı olan yere bağlanır. En son aşama uzama (extension) da ise Taq
polimeraz enzimi ortamda bulunan nükleotidleri karşılıklarına uygun olarak birbirine ekler.
Böylece iki diziden dört dizi oluşmuş olur. Bu döngü 30-45 arasında tekrar edilir ve 2n sayıda
DNA dizisi çoğaltılmış olur.

1.Primer, Çoğaltılacak bölgeyi sınırlayan, çoğaltılması istenen bölgenin ucundaki DNA

dizisini özgül olarak tanıyıp bağlanacak olan sentetik DNA parçasıdır. Primer 15-30 nükleotid
uzunluğunda olup, mikroorganizma genomunun spesifik bölgesine yapışmaya uygun olarak
hazırlanır. Ürün spesifikliği büyük ölçüde uygun seçilen primerlere bağlıdır (Sambrook and
Russel 2001). Primerler liyofilize halde geldi ise DNAz ve RNAz free distile suda 10 veya 50

14
pmol/ul olacak şekilde sulandırılır. Daha sonra küçük hacimlere (10-20 örneklik) bölünerek
–20 oC’de saklanır (Saniç vd. 2005 ).

2.dNTP karışımı, Amplifikasyon esnasında denatüre edilen zincirlerin tamamlanmasında

kullanılacak olan deoksi nükleotit trifosfatlar (dNTP’ler: eşit oranda dATP, dGTP, dCTP,
dTTP)’lardan oluşur (Saniç vd. 2005 ).

3.DNA polimeraz, PCR çalışmalarının büyük çoğunluğunda Thermus aquaticus

bakterilerinden elde edilen termostabil Taq DNA polimeraz enzimi kullanılmıştır. Taq DNA
polimeraz optimal sıcaklıkta (70-80 °C) saniyede 35-100 nükleotidin polimerizasyonu ve 5’-
3’ ekzonükleaz aktivitesini gerçekleştirme yeteneğine sahiptir (Sambrook and Russel 2001).
Taq polimeraz genellikle 5 ünite/ul konsantrasyonda gelir ve –20 °C’de saklanır (Saniç vd.
2005).

4.MgCl2, Taq DNA polimeraz MgCl2 varlığında etkindir. MgCl2’ün PCR’ın özgüllüğü ve
ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır Genellikle optimum MgCl2 konsantrasyonu
olarak 1.5 mM tercih edilir. Düşük Mg+2 iyon konsantrasyonu zayıf ürün oluşumuna, yüksek
Mg+2 iyon konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün oluşumuna sebep olmaktadır (Saniç vd.
2005).

2.3.2 RAPD Primerleri

Çalışmamızda kullanılan RAPD primerleri, rastgele seçilmiş 10 bazlık primerlerdir.

Çalışmada toplam 27 primer çalışılmıştır. Primerler G+C içeriği %60–70 olacak şekilde
seçilmiştir. Çalışmadaki 158 örnek Çizelge 2.2’de verilen bu primerler tarafından taranmış ve
10 tanesi Apis florea’da çalışmıştır.

2.3.3 Tek Bir Örnek İçin Hazırlanan RAPD-PCR Karışımı

Bir ependorf tüpüne örnek sayısına göre karışım hazırlanıp, PCR tüplerine 24’er µl dağıtıldı.
PCR karışımının hacmi 25 µl tutuldu. Son olarak her bir örnekten 1 µl DNA eklenerek
programı ayarlanmış olan PCR cihazı yerleştirildi. Tüm primerler için aynı mikterda karışım
kullanılmıştır.

15
Tek bir örnek için hazırlanan karışım,
Distile su 15 µl
Nükleotidler 4 µl
Buffer 2,5 µl
MgCl2 1,5 µl
Primer 1 µl
Taq polimeraz 0,25 µl

Çizelge 2.2 RAPD PCR analizinde kullanılan primerler ve baz dizileri.

Primerler Dizileri
Primer 1 5-CTTACGTCAC-3
Primer 2 5-CGGTTAGACG-3
Primer 3 5-GGTTTGGAGG-3
Primer 4 5-AAACCAGGCG-3
Primer 5 5-CCCAACACAC-3
Primer 119 5-GTGCTCTAGA-3
Primer 139 5-AGCGTCGACT-3
Primer 142 5-CTT TCC TTCC-3
Primer 149 5-GCGCGGCACT-3
Primer 151 5-TTGCGCCCGG-3
Primer 154 5-AGACGCCGAC-3
Primer 162 5-GGGTGTGGTT-3
Primer 189 5-CGGCGTTACG-3
Primer 190 5-GGCCGATGAT-3
OPA 07 5'-GAAACGGGTG-3'
OPA 09 5'-GGGTAACGCC-3'
OPA 10 5'-GTGATCGCAG-3'
OPB 06 5'-TGCTCTGCCC-3'
OPB 07 5'-GGTGACGCAG-3'
OPB 08 5'-GTCCACACGG-3'
OPB 09 5'-TGGGGGACTC-3'
OPB 17 5'-AGGGAACGAG-3'
OPB 20 5'-GGACCCTTAC-3'
OPD 02 5'-GGACCCAACC-3'
OPD 03 5'-GTCGCCGTCA-3'
OPD 13 5'-GGGGTGACGA-3'
OPD 15 5'-CATCCGTGCT-3'

16
2.3.4 RAPD-PCR Koşulları

Bu çalışmadaki primerler için kullanılan PCR koşulları Çizelge 2.3’te verilmiştir. Bu koşullar
27 primer için sabit tutulmuştur.

Çizelge 2.3 Her bir primer için kullanılan PCR koşulları.

Basamak Sıcaklık ve Süre Siklus

Ön Denatürasyon 95 °C 1 dakika 1 siklus
Denatürasyon 94 °C 1 dakika
45 siklus
Bağlanma 36 °C 2 dakika
Uzama 72 °C 2 dakika
Son Uzaman 72 °C 15 dakika 1 siklus

2.4 AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ

Elde edilen PCR ürünleri (23,5 μl) yükleme boyası (μl) 1.5 ile (%40’lık sükroz, xylene cyanol
FF ve Bromophenol Blue) karıştırılarak %1,7’lik agaroz jelde yürütülmüştür. %1,7’lik agoroz
jel hazırlandı. Agaroz jel için ise 2,89 g agaroz 170 ml 1X’lik TAE (Tris-Asetat-EDTA)
içinde mikrodalga fırında homojen şekilde eritildi. Daha sonra içerisine tarak yerleşmiş olan
jel tablosuna döküldü. Jel tamamen donana kadar en az yarım saat beklenildi. Jel katılaştıktan
sonra tarak çıkarılarak jel elektroforez tankına yerleştirilerek jelin üzeri tamamen TAE
tampon solüsyonu ile kapanacak şekilde elektroforez tankına yerleştirildi. Jele yükleme işlemi
sırasında Marker φX174 RF DNA /Hae III (DNA parçalarının büyüklüklerinin tahmininde
kullanılan DNA referansı) kullanıldı. Örnekler 70 Volt’ta 2 saat elektroforez koşullarında
yürütüldükten sonra jel çıkartılıp EtBr (Etidyum Bromür) ile yarım saat boyanması sağlandı.
Boyanan DNA bantları UV ışığı altında görünür hale getirilerek resim çekildi. Her bir primer
için elde edilen verilerin analizler için dosyaları hazırlandı.

2.5 JELDEKİ BANDLARIN YORUMLANMASI VE ANALİZİ

RAPD PCR yöntemi ile amplifiye edilen ürünler görsel olarak gözlenmiştir ve gözlenen
bantlar değerlendirilmiştir. Jeller yorumlanırken DNA bantlarının varlığı (1) ve yokluğuna

17
göre (0) olacak şekilde her bir primer için bir matris oluşturulmuştur. Bu veriler birleştirilerek
analizler için kullanılmıştır.

Bu çalışmada analizler için POPGENE32 (Yeh et al. 1999) ve POPULATION 1.0 (Langella
2000) programları kullanılmıştır. Bu programlara veri girişi ile ilgili dosyalar Şekil 2.2 ve
Şekil 2.3’te verilmiştir.

Bu programlar kullanılarak her örnek için gözlenen allel sayısı (Na), etkili allel sayısı (Ne),
Nei’nin genetik çeşitliliği (1972) (H) ve Shanon information indeksi (I) hesaplandı. Ek olarak
populasyondaki bir bireyin beklenen heterozigotluğu (HS) ve tüm populasyonda bir bireyin
beklenen heterozigotluğu (HT) Hardy-Weinberg beklentilerine göre hesaplandı. Alt
populasyonlar arasındaki genetik farklılaşmanın nisbi büyüklüğü (GST) Nei (1987)’ye göre
hesaplandı. Nm= 0.5(1- GST )/( GST) formülü kullanılarak her lokus için nesil başına göçlerin
ortalama sayısını ve lokuslar arasındaki ortalama değeri hesaplamak için GST tahminleri
kullanıldı. Populasyonlar arası ilişkileri görmek için POPGENE32 programı ile dendogram
oluşturuldu. POPULATION 1.0 programları ile analizleri yapıldı. Bu programlar ile yapılan
analizler sonucu hesaplanan değerler şunlardır:

Na : Her örnek için gözlenen allel sayısı

Ne : Etkili allel sayısı
Nm : Gen akışı
H : Nei’nin genetik çeşitliliği (1987)
I : Shanon information indeksi
HS : Populasyondaki gen çeşitliliği
HT : Toplam gen çeşitliliği
GST : Alt populasyonlar arasındaki genetik farklılaşmanın nisbi büyüklüğü
P : Polimorfik lokus
%P : Yüzde polimorfik lokus

18
Şekil 2.2 POPGENE32 programına RAPD verilerinin veri giriş dosyası.

Şekil 2.3 POPULATION programına RAPD verilerinin veri giriş dosyası.

19
20
 BÖLÜM 3

SONUÇLAR

İran İslam Cumhuriyeti’nden 3 eyaletten toplam 9 lokasyondan 158 doğal koloniden toplanan
Apis florea örnekleri RAPD-PCR yöntemi ile çalışılmıştır. Bu çalışma sonucu kullanılan 25
primerden 10 tanesinden bant elde edilmiştir. Primer 2’de 11 bant; Primer 3’te 12 bant; Primer
4’te 13 bant Primer 5’te 10 bant; OPA 07’de 12; OPB 07’de 12; OPB 17’de 13 OPB 20’de 10
OPD 02’de 9 ve OPD 13’te 13 bant görülmüştür. Her bir primerden elde edilen bant sayısı
Çizelge 3.1’de gösterilmiştir.

Çizelge 3.1 Her bir primerden elde edilen toplam bant sayısı.

Primerler Dizileri Toplam Bant Sayısı

Primer 2 5-CGGTTAGACG-3 11
Primer 3 5-GGTTTGGAGG-3 12
Primer 4 5-AAACCAGGCG-3 13
Primer 5
5-CCCAACACAC-3 10

OPA 07 5'-GAAACGGGTG-3' 12

OPB 07 5'-GGTGACGCAG-3' 12

OPB 17 5'-AGGGAACGAG-3' 13

OPB 20 5'-GGACCCTTAC-3' 10

OPD 02 5'-GGACCCAACC-3' 9

OPD 13 5'-GGGGTGACGA-3' 13

Çalışmada kullanılan beş primerden (primer 4, primer 5, OPB 17, OPB 07 ve OPD 02) elde
edilen jel resimleri sırası ile Şekil 3.1, Şekil 3.2, Şekil 3.3, Şekil 3.4, Şekil 3.5’te verilmiştir.

21
Şekil 3.1 Çalışmada kullanılan örneklerin primer 4 ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü.

Şekil 3.2 Çalışmada kullanılan örneklerin primer 5 ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü.

Şekil 3.3 Çalışmada kullanılan örneklerin OPB 17 primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü.

22
Şekil 3.4 Çalışmada kullanılan örneklerin OPD 02 primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü.

Şekil 3.5 Çalışmada kullanılan örneklerin OPB 07 primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon
ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü.

POPGENE32 programı ile Nei (1987) ve Nei (1972)’ye göre tüm lokuslar için 9 lokasyondaki
populasyonlarda genetik varyasyon; populasyonlar arasındaki genetik uzaklar ile genetik
benzerlikler sırası ile Çizelge 3.2 ve Çizelge 3.3’te verilmiştir.

Apis florea populasyonları için hesaplanan ortalama genetik farklılaşma değeri 0,21’dir. Bu
değer, Dezful populasyonunda en düşük H= 0,03 (%P, polimorfik lokus yüzdesi = 6,09)
değerdedir. Bushehr populasyonunda ise bu değer en yüksek seviyededir H= 0,17 (%P=52,17)
(Çizelge 3.2). Bu populasyonlar için ortalama polimorfik lokus yüzdesi 75, 65’dir.

23
Nei (1972)’ye göre hesaplanan genetik mesafe değerlerine göre genetik olarak birbirine en
yakın populasyonlar 0,059 genetik mesafe değeri ile Sarollah ve Mosain populasyonlarıdır.
Birbirine en uzak populasyonlar ise 0,463 genetik mesafe değeri ile Soush ve Dezful’dur
(Çizelge 3.3). Genetik benzerlik değerleri ve genetik mesafe değerleri birbirleri ile tutarlı
sonuçlar vermiştir. Bu sonuçlara göre Soush ve Dezful populasyonları en az benzerlik
gösteren populasyonlarken (0,629), Sarollah ve Mosain populasyonları ise genetik benzerlik
değerleri bakımından birbirine en yakın populasyonlardır (0,942) (Çizelge 3.3).

Çizelge 3.2 Tüm lokuslar için 9 lokasyondaki populasyonlarda genetik varyasyon analizi
sonucu (Nei 1987).

#Polimorfik %Polimorfik
Lokasyon Na Ne H I
Lokus Lokus
1,52 1,29 0,17 0,26 60
Bushehr 52,17
(0,50) (0,36) (0,19) (0,28)
1,44 1,22 0,14 0,21
Dast Abas 51 44,35
(0,50) (0,32) (0,18) (0,26)
1,33 1,19 0,11 0,17
Dehloran 38 33,04
(0,47) (0,31) (0,17) (0,26)
1,31 1,19 0,11 0,17
Mosain 36 31,30
(0,47) (0,34) (0,18) (0,26)
1,35 1,24 0,14 0,20
Ogahha 37 32,17
(0,48) (0,37) (0,20) (0,28)
1,31 1,19 0,11 0,16
Sarollah 36 31,30
(0,47) (0,32) (0,18) (0,26)
1,50 1,24 0,15 0,23
Ahvaz 51 44,35
(0,50) (0,31) (0,18) (0,26)
1,08 1,05 0,03 0,04
Dezful 7 6,09
(0,27) (0,16) (0,10) (0,15)
1,28 1,20 0,11 0,17
Soush (0,45) (0,35) (0,19) (0,27) 29 25,22

1,76 0,34 0,21 0,32

Ortalama (0,43) (0,35) (0,19) (0,26) 87 75,65

Dokuz Apis florea populasyonu arasındaki genetik ilişkileri gösteren dendograma

bakıldığında 33’lük bootstrap değerine göre 3 grup oluşmuştur. Birinci gruptaki Ahvaz ve
Dezful populasyonları 77’lik bootstrap değerine göre bağlanmıştır. Buna ek olarak Dehloran,
Bushehr, Dasht Abas, Soush aynı grup içerisinde yer almıştır ve sırası ile 49, 25, 22, 27’lik
bootstrap değerleri ile Ahvaz ve Dezful populasyonlarına bağlanmıştır. Birinci grup 33’lük
değeri ile ikinci ve üçüncü gruptan ayrılmıştır. İkinci grupta Mosain ve Ogahha
populasyonları 52’lik bootstrap değeri ile birbirinden ayrılmıştır. Üçüncü grup olarakta sadece
Sarollah populasyonundan oluşmaktadır (Şekil 3.6). Şekil 3.7’te bu populasyonların
gruplaşmasını farklı bir şekilde göstermektedir.

24
Apis florea populasyonlarında üç eyaletteki genetik farklılaşma değeri en yüksek Khuzestan
eyaletindedir (H=0,18). Bu değer Bushehr ve Ilam populasyonlarında eşittir (H=0,17). Bu
eyaletlerdeki populasyonların yüzde polimorfik lokus değerleri sırası ile ve 60,87 (Ilam),
60,00 (Khuzestan), 52,17 (Bushehr) (Çizelge 3.4).

Çizelge 3.3 Genetik mesafe (alt diagonal) ve genetik benzerlik (üst diagonal) hesaplamaları
(Nei 1972).

Lokasyon Bushehr Dasht Abas Dehloran Mosain Ogahha Sarollah Ahvaz Dezful Soush
Bushehr - 0.928 0,916 0,910 0,871 0,910 0,867 0,760 0,870

Dasht Abbas 0,074 - 0,911 0,902 0857 0,941 0,816 0,761 0,875

Dehloran 0,087 0,094 - 0,919 0,881 0,904 0,861 0,815 0,837

Mosain 0,094 0,104 0,084 - 0,904 0,942 0,810 0,725 0,873

Ogahha 0,138 0,154 0,127 0,101 - 0,908 0,774 0,680 0,831

Sarollah 0,094 0,061 0,101 0,059 0,097 - 0,801 0,725 0,875

Ahvaz 0,142 0,203 0,150 0,211 0,256 0,221 - 0,869 0,725

Dezful 0,274 0,273 0,204 0,322 0,385 0,321 0,140 - 0,629

Soush 0,139 0,134 0,178 0,135 0,185 0,133 0,321 0,463 -

Şekil 3.6 Dokuz Apis florea populasyonları arasındaki genetik ilişkileri gösteren, Nei
(1972)’nin standart genetik mesafe değerlerine göre gösteren dendogram.

25
Şekil 3.7 Dokuz Apis florea populasyonları arasındaki genetik ilişkileri gösteren diğer bir
dendogram.

Çizelge 3.4 Tüm lokuslar için 3 eyalet populasyonların genetik varyasyon analizi sonucu
(Nei 1987).

#Polimorfik %Polimorfik
Eyalet Lokasyon Na Ne H I
Lokus Lokus
1,52 1,29 0,17 0,26
Bushehr Bushehr 60 52,17
(0,50) (0,36) (0,19) (0,28)
DastAbas-
Dehloran
1,61 0,28 0,17 0,26
Ilam Mosain- 70 60,87
(0,49) (0,35) (0,19) (0,27)
Ogahha-
Sarollah
Ahvaz-Dezful- 1,60 0,28 0,18 0,28
Khuzestan 69 60,00
Soush (0,49) (0,31) (0,18) (0,26)

26
 Çizelge 3.5 Üç eyalet populasyonları için genetik farklılaşma analizi sonucu (Nei 1987).

Eyalet Lokasyon Ht Hs Gst Nm

0,17 0,17 0,00
Bushehr Bushehr -
(0,04) (0,04)
DastAbas-Dehloran Mosain- 0,17 0,12
Ilam 0,30 1,16
Ogahha-Sarollah (0,04) (0,02)
0,17 0,10
Khuzestan Ahvaz-Dezful-Soush (0,01) 0,40 0,75
(0,03)

Her bir eyaletin kendi içindeki populasyonların farklılaşmasını gösteren Hs değerine göre
Bushehr’de populasyon içi farklılaşma daha fazlayken Khuzestan’daki populasyon içi
farklılaşma daha azdır (Çizelge 3.5). İran’daki 3 eyaletlerdeki Apis florea alt populasyonları
için genetik farklılaşma değerlerine baktığımızda, tek bir populasyondan oluştuğu için
Bushehr populasyonunun genetik farklılaşma değeri yoktur (Gst= 0,00). Khuzestan ve
Ilam’daki alt populasyonların genetik farklılaşma değerleri sırası ile Gst= 0,40 ve
Gst= 0,30’dir. Buna göre Khuzestan’daki populasyonlarda genetik farklılaşma daha fazladır
(Çizelge 3.5).

Şekil 3.8’de üç eyalet populasyonları ve alt populasyonları arasındaki genetik ilişkileri

gösteren ağaç görülmektedir. Bu ağaca göre her üç eyalette birbirine yaklaşık olarak aynı
uzaklıktadır. Khuzetan eyaletinde Ahvaz ve Dezful populasyonları birbirine daha yakınken
Soush populasyonu daha uzaktadır. Ilam eyaletinde ise populasyonlar biribirine farklı
uzaklıkta bulunmaktadır.

27
Şekil 3.8 Üç eyalet populasyonları ve alt populasyonları arasındaki genetik ilişkileri gösteren,
dendogram.

28
 BÖLÜM 4

TARTIŞMA

Bu çalışmada da RAPD PCR metodu ilk defa Apis florea populasyonları arasındaki genetik
farklılaşmayı ortaya koymak için kullanılmıştır. Farklı primerler ile çalışma gerçekleştirilmiş,
PCR ürünü veren bu primerlerden 10 tanesi ile yapılan analizler ve oluşturulan ağaçlara göre
populasyonlardaki genetik farklılaşmalar ve ilişkiler çıkarılmıştır. Bu çalışma İran’da dağılım
gösteren Apis florea populasyonlarının genetik ilişkilerini gösteren ilk çalışma olduğu için
önemlidir.

Daha önce birçok canlıda RAPD tekniği kullanılarak genetik varyasyon çalışmaları
yapılmıştır (Gübbük ve Pekmezci 2001, İlhak ve Arslan 2007). Arılarda ise Suazo et. al.
(1998) farklı balarısı alttürleri (A. m. ligustica, A. m. carnica, A. m. mellifera, A. m. iberica ve
Amerika’daki Avrupa ve Afrika kökenli arılar) ile yaptıkları çalışmalarda bu tekniği
kullanmışlardır. Bu çalışmada da kullanılan primerlerden bazıları (Primer 1-5) Afrika ve
Avrupa balarılarının birbirinden ayrılmasında kullanılmıştır. Ancak çalışmada onlarca primer
kullanılmasına rağmen sadece 5 tanesi farklı kökenlere sahip arıların birbirileri arasındaki
farklılığın tespitinde kullanılabilmiştir.

Bu çalışmada da 27 primer denenmiş ancak 9 primer ile çoğaltma işlemi gerçekleşmiş ve

veriler toplanmıştır. Bu primerler ile elde edilen bant sayısı 9 ile 13 arasında değişmekte olup
daha önceki çalışmalarda elde edilenler ile benzerlik göstermektedir. Lokasyonlar ele
alındığında en düşük polimorfik lokus sayısı 7 olarak Dezful’da tespit edilmiş en yüksek ise
60 ile Bushehr de hesaplanmıştır. Yüzde polimorfik lokuslar ele alındığında sonuç
değişmemektedir. Aşağı yukarı benzer sonuçlar üm lokasyonlar için geçerlidir.

Eyaletler göz önüne alınarak yapılan değerlendirmede geografik olarak yakınlık gösteren
eyaletler genetik olarak birbirine yakın bulunmuştur. Bushehr sonuçlara göre Bhuzestan’a
İlam’dan daha yakın hesaplanmıştır. Bu durum lokasyonlar ele alındığında tam olarak ortaya
koyulamamıştır (Şekil 3.6 ve Şekil 3.7). Eyaletler arasındaki farklılık çok az ve birbirlerine

29
çok yakındır (Şekil 3.8). Genetik parametreler açısından en az alel çeşitliliğine sahip eyalet
Bushehr, en fazla ise Ilam’da bulunmuştur. Aynı şekilde Polimorfik lokus sayısı ve
polimorfik lokus yüzdelerine bakıldığında durum aynıdır. Bunun en büyük sebeplerinden
birisi eyaletler arasındaki örnek sayısı farklılıından kaynaklanmış olabilir. FST değerinden
hesaplanan Nm değerlei bu eyaletler arasında herhangi bir gen alış verişinin olmadığını
bildirmektedir. Bushehr de Nm hesaplanamamasının sebebi ise bu eyalette tek bir
lokasyondan örneklemenin yapılmasından kaynaklanmaktadır. Yinede ikinci grubu oluşturan
İlam eyaletindeki populasyonlar için Nm değeri 1,16’dir; Üçüncü grubu oluşturan Khuzestan
populasyonları için Nm değeri de 0,75’dir. Wright (1969)’a göre Nm değerinin 1’den küçük
çıkması populasyonun genetik sürüklenme yüzünden farklılaşmaya başladığını ifade eder.
Çalışmamızda Khuzestan grubu için bu değer 1’in altında olduğu için bu eyaletteki
populasyonlarda farklılaşma olduğu söylenebilir.

Bu çalışma sırasında bu ve diğer yaın eyaletlerden daha çok örnekle yapılmış ve ileride bu
örneklerinde aynı primerler kullanılarak RAPD çalışmaları gerçekleştirilecek bu ön çalışmaya
eklenerek bir makale hazırlanacaktır.

Bu çalışmada elde edilen veriler ile daha önce yapılan İran’daki Apis florea
populasyonlarındaki klasik ve geometrik morfometri verilerine dayalı istatistiksel analizlerde
(yayınlanmamış) üç eyaletteki populasyonların birbirine çok yakın olduğunu göstermekte ve
RAPD çalışmasını destekleyici bulgular ortaya koymaktadır. Klasik morfometrik çalışmalarda
kullanılan karakterler aynı RAPD de olduğu gibi lokasyonlar bazında ayırt edici olmaktan
uzak ancak eyalet olarak analize tabi tutulduğunda bulunan sonuçlar benzer çıkmaktadır. Apis
florea ile ilgili daha önce herhangi bir molekuler çalışma olmadığından elde edilen bulgular
ile karşılaştırılacak herhangi bir çalışma da yer almamaktadır.

Daha önce deneme niteliğinde yayınlanmamış birkaç moleküler çalışma yapılmış ve bu

çalışmalardan bazı önemli souçlar bulunmuştur. Sınırlı örnek sayısıyla yapılan çalışmada
COI-COII bölgesi çalışılmış (Kandemir vd. yayınlanmamış) ve balarılarında (Apis mellifera)
rastlanan intergenik bölge farklılığı ortaya konulmuştur. Ayrıca bu bölgede yapılan tüm
örneklerde PC sonucunda elde edilen DNA parçası farklılığa rastlanmamıştır. Ayrıca
balarıları için kullanılan bazı mikrosatelit lokusları Apis florea için kullanılmış ancak detaylı
bir çalışma yapılmamıştır.

30
Tahmasebi et al. (2002) Apis florea ile yaptıkları çalışmalarda benzer şekilde coğrafik olarak
bu bölgedeki populasyonların bir kümede toplandığını tespit etmiş ve belirtmişlerdir. Aynı
durum çok daha geniş bir çalışma ile Hepburn et al. (2005) tarafından tüm yayılış
gösterdikleri coğrafya da yapılmış ve çok farklılık olmadığı vurgulanmıştır. Bu çalışma da
kullanılan RAPD belirteçleri ile İran da yayılış gösteren Apis florea’nın 3 eyaletteki
populasyonları örneklenmiş ve 9 primer ile yapılan araştırmada üç eyaletteki populasyonların
genetik olarak biribirine çok yakın olduğunu göstermektedir.

Daha detaylı çalışmalar için gerek mtDNA gerekse nükleer genomda farklı belirteçlerin
bulunması ve bu yeni gen bölgelerinin çalışılması yanında mcrosatelit ya da SNP gibi diğer
moleküler belirteçlerin kullanılarak Apis florea’daki genetik varyasyon çok daha detaylı ve
doğru bir şekilde ortaya konulabilecektir.

31
32
 KAYNAKLAR

Arslan E (2004) RAPD-PCR yöntemiyle Türkiye’deki Hyacinthella Schur (Liliaceae) türleri

arasındaki polimorfizm ve filogenetik ilişkilerin belirlenmesi. S.Ü. Fen Ed. Fak. Fen
Derg., 23: 27-32.

Aytekin A M, Terzo M, Rasmont P and Çağatay N (2007) Landmark based geometric

morphometric analysis of wing shape in Sibiricobombus Wogt (Hymenoptera:
Apidae: Bombus Latreille). Ann. Soc. Entomol. Fr. (n.s.), 43(1): 95–102.

Catherine M H, Somutria G and John A T (1992) Microsatellites for Linkage Analysis of

Genetic Traits. 8 (8) England.

Clarke K E, Oldroyd B E, Javier J, Quezada-Euán G and Rinderer T (2001) Origin of

honeybees (Apis mellifera L.) from the Yucatan peninsula inferred from
mitochondrial DNA analysis. Molecular Ecology, 10: 1347–1355.

Crozier Y C, Koulianos S and Crozier R H (1991) An improvement test for Africanized

honey bee mitochondrial DNA. Experientia, 47: 968–969.

Doyle, J J and Doyle, J L (1991) Isolation of plant DNA from fresh tissiue. Focus, 12(1): 13-15.

Ellegran H (1993) Genome analysis with microsatellite markers. Department of animal

breeding and genetics, Swedish University of Agricultural Science, Uppsala .

Erwin T L (1983) Tropical forest canopies: the last biotic frontier. Bulletin of the
Entomological Society of America, Volume 29: 14-19.

Estoup A, Garnery L, Solignac M and Cornuet J M (1995) Microsatellite variation in

honey bee (Apis mellifera L.) populations: hierarchical genetic structure and test of
the infinite allele and stepwise mutation models. Genetics, 140: 679–695.

Franck P, Garnery L, Solignac M and Cornuet J M (1998) The origin of west European
subspecies of honeybees (Apis mellifera): New insights from microsatellite and
mitochondrial data. Evolution, 52: 1119–1134.

Franck P, Garnery L, Loiseau A, Solignac M and Cornuet J M (2000) Molecular

confirmation of a fourth lineage in honeybees from Middle-East. Apidologie, 31:
167–180.

Franck P, Garnery L, Loiseau A, Oldroyd B P, Hepburn H R, Solignac M and Cornuet

J M (2001) Genetic deversity of the honeybee in Africa: microsatellite and
mitochondrial data. Heredity, 86: 420–430.

33
 KAYNAKLAR (devam ediyor)

Free J B (1981) Biology and behaviour of the honeybee Apis florea and its possibilities for
beekeeping. Bee World, 62: 46–59.

Garnery L, Cornuet J M and Solignac M (1992) Evolutionary history of the honeybee

(Apis mellifera L.) inferred from mitochondrial DNA analysis. Moleculer Ecology, 3:
145–154.

Garnery L, Solignac M, Celebran G and Cornuet J M (1993) A simple test using

restricted PCR-amplified mitochondrial DNA to study the genetic structure of Apis
mellifera L. Experientia, 49: 1016–1021.

Garnery L, Mosshine E H, Oldrody B P and Cornuet J M (1995) Mitochondrial DNA

variation in Moroccan and Spanish honey bee populations. Mol. Ecol., 4: 465–471.

Garnery L, Franck P, Baudry E and Vautrin D (1998) Genetic biodiversity of the West
European honeybee (Apis mellifera mellifera and Apis mellifera iberica), I.
Mitochondrial DNA. Génét. Sél. Evol., 30: 31–47.

Gübbük H ve Pekmezci M (2001) Değişik muz klonları arasındaki genetik varyasyonların

RAPD markörleri ile belirlenmesi. Bahçe, 30(1-2): 71-79.

Hall H G and Muralidharan K (1989) Evidence from mitochondrial DNA that African
honey bees spread as continuous maternal lineages. Nature (Lond.), 339: 213–215.

Hall H G (1986) DNA differences found between Africanized and European honeybees.
Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 4874-4877

Hall H G (1988) Characterization of the African honey bee genotype by DNA restriction
fragments, pp. 287-293, In G. R. Needham, R. E. Page, M. Delfinado-Baker and C.
E. Bowman [eds.], Africanized honey bees and bee mites, Ellis Horwood, Chishester,
England.

Hall H G and Smith D R (1991) Distinguishing African and European honey bee matrilines
using amplified mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 4548–4552.

Hall H G (1992a) DNA studies reveal processes involved in the spread of New World
African honeybees, Fla. Entomo. 75: 51-59

Hall H G (1992b).Further characterization of nuclear DNA RFLP markers that distinguish

Africanand European honeybees, Arch. Insect Biochem. Physiol., 19: 163-175.

Hall H G (1992c) Suspected African honeybee colonies in Florida tested for identifying DNA
markers, Flo. Entomol. 75: 257-266

Hashemi M (2004) The complete guide to bee keeping. 2nd Edition, 730 p.

34
 KAYNAKLAR (devam ediyor)

Hepburn H R and Hepburn C (2005) Bibliography of Apis florea. Apidologie, 36: 377–378.

Hepburn H R, Radloff S E, Otis G W, Fuchs S, Verma L R, Ken T, Chaiyawong T,

Tahmasebi G, Ebadi R and Wongsiri S (2005) Apis florea: morphometrics,
classification and biogeography. Apidologie, 36: 359–376.

İlhak O İ ve Arslan A (2007) Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA yöntemiyle kanatlı

etlerinde tür tayini. F.U. Sağ. Bil. Derg., 21(4): 167-171.

Langella O (2000) POPULATIONS: Population Genetic Software (Individuals or

populations distances, phylogenetic trees). CNRS, France. http://pge.cnrs-gif.fr/bio-
info/populations.

Maa T C (1953) An inquiry into the systematics of the Tribus Apidini or honeybees
(Hymenoptera). Treubia, 21: 525–640.

McMichael M and Hall H G (1996) DNA RFLPs at a highly polymorphic locus distinguish
European and African subspecies of the honey bee Apis mellifera L. And suggest
geographical origins of New World honey bees. Mol. Ecol. 5: 403-416.

Meixner M D, Sheppard W S and Poklukar J (1993) Asymetrical distribution of a

mitochondrial DNA poltmorphism between two introgressive heney bee races.
Apidologie, 24: 147–153.

Moradi M and Kandemir I (2004) Observations on Apis florea "the Dwarf Honey Bee" in
Iran. Am. Bee J., 144 (9): 699–703.

Moritz R F A, Hawkins C F, Crozier R H and Mackinley A G (1986) A mitochondrial

DNA polymorphism in honeybees (Apis mellifera L.). Experientia, 42: 322-324.

Moritz R F A, Cornuet J M, Kryger P, Garnery L and Hepburn H R (1994)

Mitochondrial DNA variability in South African honeybees (Apis mellifera L.).
Apidologie, 25: 169-178.

Mossadegh M S (1993) New geographical distribution line of Apis florea in Iran. Asian
Apiculture, pp. 64–66.

Muralidharan K and Hall H G (1990).Prevalence of African DNA RFLP alleles in

neotropical African honeybees, Arch. Insect Bichem. Physiol., 15: 229-236

Nei M (1972) Genetic Distance Between Populations. American Naturalist. 106: 283-292.

Nei M (1987). Molecular Evolutionary Genetics. Columbia Uni. Press, New York.

35
 KAYNAKLAR (devam ediyor)

Nielson D I, Ebert P R, Page R E Jr, Hunt G J and Guzmán Novoa E (2000) Improved
Polymerase Chain Reaction–Based Mitochondrial Genotype Assay for Identification
of the Africanized Honey Bee (Hymenoptera: Apidae). Ann. Entomol. Soc. Am., 93
(1): 1–6.

Oldroyd B P, Sylvester A, Wongsiri S and Rindeder E (1994) Task specialization in a wild

bee, Apis florea (Hymenoptera: Apidae), revealed by RFLP banding. Behavioral
Ecology and Sociobiology, 34: 25-30.

Otis G W (1996) Distribution of recently recognized species of honeybees (Hymenoptera:

Apidae: Apis) in Asia. J. of Kansas Entomol. Soc., 69: 311-333.

Palmer K A and Oldroyd B P (2001) Mating frequency in Apis florea revisited

(Hymenoptera, Apidae). Insectes soc., 48: 40–43.

Ruttner F (1988) Biogeography and Taxonomy of Honeybees, Springer-Verlag, Berlin,

Heildelberg 284 p.

Saniç A, Eroğlu C ve Kızırgil A (2005) PCR ve RFLP yöntemleri ile Mycobacterium

türlerinin identifikasyonu. 21. Yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu ve II. Tüberküloz
Laboratuvar Tanı Yöntemleri Kursu, Samsun.

Sehristani N (1997) Honey bees and beekeeping, Sipehr Pres, Tehran, Iran, 455p.

Sen Sarma M, Whitfield C W and Robinson G E (2007) Species differences in brain gene
expression profiles associated with adult behavioral maturation in honey bees.
Genomics, 8: 202.

Sheppard W S, Rinderer T E, Meixner M D, Yoo H R, Stelzer J A, Schiff N M, Kamel S

M and Krell R (1996) HinF1 variation in mitochondrial DNA of Old World honey bee
races. J. Hered., 87: 35–40.

Sheppard W S and Smith D R (2000) Identification of African-Derived Bees in the

Americas: A Survey of Methods, Ann. Entomol. Am. 93 (2): 159-176.

Smith D R (1988) Mitochondrial DNA polymorphism in five Old World subspecies of honey
bees and in New World hybrids, pp. 303–312, In G.R. Needham, R.E. Page,
M.Delfinado-Baker and C.E. Bowman [eds.], Africanized honey bees and mites, Ellis
Horwood, Chichester, England.

Smith D R, Brown W M and Taylor Jr (1989) Neotropical Africanized bees have African
mitochondrial DNA. Nature, 339: 213–215.

Smith D R and Brown W M (1990) Restriction endonuclease cleavage sites and lenght
polymorphism in mtDNA of A. mellifera mellifera and A. mellifera carnica
(Hymenoptera: Apidea), Entom. Soc. Am., 83 (1): 81–88.

36
 KAYNAKLAR (devam ediyor)

Smith D R, Palopodi M F, Taylor B R, Garnery L, Cornuet J M, Solignac M and Brown

W M (1991) Geographical overlap of two mitochondrial genomes in Spanish
honeybees (Apis mellifera iberica). J. Hered., 82: 96–100.

Smith H (1995) Nobel Prize winner in medicine or physiology, Mayo Clin Proc. 1995
Jun;70(6):540. No abstract available, PMID: 7776712 [PubMed - indexed for
MEDLINE

Suazo A, McTiernan R and Hall H G (1998) Differences between African and European
honey bees (Apis mellifera) in random amplified polymorphic DNA (RAPD), J.
Hered. 89: 32-36.

Tares S, Cornuet J M and Abad P (1993) Characterization of an unusually conserved AluI

highly reiterated DNA sequence family from the honeybee, Apis mellifera.
Genetics,134: 1195-1204.

Tahmasebi G, Ebadi R, Tajabadi N, Akhondi N and Faraji S (2002) The effect of

geographical and climatological conditions on the morphometrical variation and
separation of Iranian small honeybee (Apis florea F.) populations. Journal of Science
and Technology of Agriculture and Natural Resources, 6(2): 176-185.

Ütük A E, Şimşek S ve Köroğlu E (2005) Echinococcus cinsinin moleküler genetik

karakterizasyonu. Türkiye Parazitoloji Dergisi, 29(3): 171-176.

Whitcombe R P (1984) Apis florea, Thesis Univ Durham.

Williams J V, Kubelik A R, Livak K, Rafalski, J A and Tingey S (1990) DNA

polymorphism amplified by arbitrary primers are usefull as genetic markers. Nucleic
Acid Research, 18(22): 6531-6535.

Welsh J and McClelland M (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrarly
primers. Nucleic Acid Research, 18: 7213-7218.

Wright S (1969) Evolution and Genetics of Populations: The Theory of Gene Frequencies.
Chicago. Univ. Chicago Pres.

Yeh C F, Yang R and Boyle T (1999) POPGENE32 version 1.31. Windows based software
forpopulation genetics analysis

URL-1 http://www.bilgipasaji.com/forum/b-454/69457-ariciligin-tarihcesi.html, Arıcılığın

Tarihçesi, 12.06.2008

37
38
 ÖZGEÇMİŞ

Burçin TERZİ 1984 yılında Zonguldak ilinde doğdu. İlk ve orta öğrenimini aynı şehirde
tamamladı. Lise öğrenimini Zonguldak Atatürk Anadolu Lisesi’nde tamamladı. Yüksek
öğrenimini 2002-2006 yılları arasında Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi
Biyoloji Bölümü’nde tamamladı. 2006 yılında Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda yüksek lisansa başladı.

ADRES BİLGİLERİ

Adres: Kapuz Caddesi Tersane Üstü Sokak No:9/B

67030 ZONGULDAK
Tel: (372) 256 33 02
(544) 2614037
E- posta: burcinterzi67@hotmail.com

Burçin TERZİ

39