HPLC ( YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI

KROMATOGRAFİSİ )
AHMET ORAL SARIOĞLU
ÜLKÜ ÇAKIR
GAYE ULUÇ
 HPLC
 Sıvı kromatografisi yönteminin özel bir uygulaması olan yüksek
performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yönteminde, sabit faz
olarak kullanılan parçacık boyutlarının önemli ölçüde
küçültülmesi sonucu hareketli faz ile etkileşen sabit faz yüzey
alanı büyür ve böylece kolonun etkinliği arttırılmış olur. Çok sıkı
olarak doldurulmuş kolondan hareketli fazın belirli bir hızla
geçebilmesi için bir basınç uygulanması gerekir. Bu yüksek
verimdeki kolonların ve oldukça yüksek basınçların kullanıldığı
HPLC, element türlendirilmesinde en yaygın biçimde uygulanan
kromatografi türüdür.
 HPLC
 HPLC günümüzde kimya, biyokimya, biyoteknoloji,
farmakoloji, tıp kimyası, bitki kimyası, tarım ve kimya
mühendisliğini içeren alanlarda ayırma ve analiz için
vazgeçilmez bir araç olarak kabul edilmektedir.
Bilhassa diğer kromatografik tekniklere uygun olmayan
bileşiklerin ayrılması ve analizi için uygundur. Çevre
sıcaklığında termal olarak kararsız bileşikleri ve yüksek
polarlıktaki bileşikleri herhangi bir türevlendirme
olmaksızın ayırabilir ve analiz edebilir.
HPLC’nin sıvı kromatografisinin diğer
türlerinden üstünlükleri şunlardır;
 HPLC kolonu, rejenerasyon olmaksızın pek çok kez
kullanılabilir.
 Böyle kolonlarda gerçekleştirilen ayırma, eski
yöntemlerle elde edilenden çok daha çeşitlidir.
 Bu teknik kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve
tekrarlanabilirlik daha yüksektir.
 Nicel analiz amaçları için de kullanılabilir.
 Analiz süresi çok kısadır.
 Duyarlılık çok yüksektir, 10 mg’lık bir örnek bile,
floresans veya elektron yakalama dedektörleri
kullanılarak tayin edilebilir.
HPLC cihazı başlıca üç bölümden
oluşur:

 Çözücü dağıtma bölümü

 Ayırma kolonu
 Dedektör ve kaydedici sistem
 HPLC Çalışma prensibi
Poröz bir materyal içeren kolona örnek çözeltisi
pompalanır ve bir mobil faz yardımıyla kolon boyunca
yürür. Maddeler, kolondan geçerken farklı dağılma
davranışlarına bağlı olarak farklı göç oranlarına sahip
olduklarından farklı tutunma zamanlarına sahip
olacaklardır ve bu süreye bağlı olarak kolondan yine
farklı sürelerde çıkacaklardır.
HPLC CİHAZININ TEMEL BİLEŞENLERİ
HPLC CİHAZI
 1. Çözücü Dağıtma Sistemi

 HPLC cihazı, diğer sıvı kromatografisi cihazlarından, daha

önce de belirtildiği gibi, kolon giriş ve çıkışı arasında
oluşturulması gereken yüksek basınç nedeni ile farklılık
gösterir. Bu basınç farkı, kolon girişine bir pompa yoluyla
uygulanan basınç ile sağlanır. Çözücü pompalama sistemi 
belki de HPLC sisteminin en önemli kısmıdır. Pompanın
performansı, analitik sonuçlardaki tekrarlanabilirliği, nicel
değeri, gözlenebilme sınırı vb. değerleri büyük ölçüde etkiler.
 Ticari olarak mevcut pompalama
sistemlerinin farklı tipleri şunlardır:

Doğrudan gaz basınç pompaları

Pnömatik hızlandırıcı pompalar
Pistonlu pompalar
Şırınga tipi pompalar
a) Doğrudan gaz basınç pompaları

 Doğrudan gaz basınç pompalarında, yüksek basınçta sıvı

akışının sağlanması, genellikle azot veya helyum gazinin
kullanılmasıyla olur. Gaz basıncı, hareketli fazın yüzeyine
doğrudan veya bir diyafram yoluyla uygulanır. Bu sistem
sinirli bir hacme sahiptir, bu yüzden durdurularak tekrar
çözücü ile doldurulmalıdır. Avantajı, ucuz ve tek hareketli
faz kullanıldığında güvenilir olmasıdır.
b) Pnömatik hızlandırıcı pompalar

 Pnömatik (havalı) pompalar da gaz basıncıyla çalışır. Gaz

basıncı küçük alanlı bir pistonu iten büyük alanlı bir pistona
etki eder. Gaz basıncı böylece pistonların yüzey alanları
oranında kuvvetlenir. Sabit basınçtaki sıvı sisteme dağıtılır.
Sıvının pompayı terk etme hızı, çözücünün viskozitesine,
pompa çıkısındaki akışın direncine ve kolon dolgu maddesiyle
olan etkileşimine bağlıdır.
Pistonlu pompa
 c) Pistonlu pompalar
 Pistonlu (sabit akış ) pompaları iki modeldir. Birinde piston,
pompalanan hareketli sıvı faz ile doğrudan temas halindedir.
Diyafram pompaları olarak adlandırılan diğerinde ise, piston
hareketi hidrolik sistem yoluyla esnek paslanmaz çelik membrana
iletilir. Bu pompaların piston hareketi nedeniyle çözücü,  sabit
akış hızında, havalı pompalardan daha seri pulslarla dağıtılır.
Çözücünün pulslu akışı ile dakikada 25 -100 piston hareketi
(strok) üretilir. Pompalardaki sıvı akışı genellikle 10 mL.dak-1’e
kadardır.
 d) Şırınga tipi pompalar
 Şırınga tipinde pompalarda,  elektriksel olarak
hareket eden kursun vida, verilen çözücü hacmini
yeterli basınçta tutan bir pistonu hareket ettirir. Bu
pompaların başlıca avantajı, yüksek basınçta (7500
psi’a kadar) serbest pulslu akış sağlama
yetenekleridir ve akis hızı, çalışılan basınçtan
bağımsızdır.
Çözücü programlamalı sistem
Çözücü programlamalı sistem
 Çözücüler, ayırma kolonuna girmeden önce karıştırılırlar.
Bu sistem gerekli ayırmayı sağlamakta kullanılan iki
hareketli faz için, iki yüksek basınç pompasına sahiptir. Bu
amaçla kullanılacak iki hareketli fazın tamamen karışabilir
olması gerekir. Pompalar yoluyla çözücüler,  ya difüzyon ya
da mekanik olarak çalışan küçük hacimdeki karıştırma
odalarında karıştırılırlar.
Numune Enjeksiyon Sistemleri

 A.  Hareketli faz akışı olurken; Septum yoluyla  kolon başına

mikroşırınga ile enjeksiyon,
 Hareketli faz akışının durdurulmasıyla septum yoluyla
enjeksiyon,
 Kolonun hemen başında hareket eden faza septum yoluyla
enjeksiyon.
 B.  Dış ilmek subabı (valfi)yoluyla enjeksiyon.
 Septum enjeksiyonları
 Şırınga enjeksiyonları, iç hacmi mümkün olduğunca küçük
olması gereken bir septum enjektörü vasıtasıyla yapılabilir.
Bu basit alet, dolgu maddesine yapılan (kolon üzeri
enjeksiyon)  ve akışı durdurarak yapılan enjeksiyonlar
(stop-flow) için iyi sonuçlar verir. Kolon üstü septum
enjeksiyonu yapılırken alınması gereken önlem, iğnenin
kolon dolgu maddesine temas etmemesidir.
 Septum enjeksiyonları

 Örnek, hareketli faz kolona girmeden önce de enjekte edilir.

Bu yöntem kolon dolgu maddesinin herhangi bir zarar
görmesinin önüne geçer. Fakat bu yöntemde, pompa,
basıncın atmosferik basınca düşmesi için kapatılır, sonra
örnek enjekte edilir ve pompa tekrar çalıştırılır. Bu yüzden
alıkonma zamanında belirsizlik yaratabilir. Septum
enjeksiyon teknikleri, küçük hacimli örnekler
kullanıldığında uygulanır.
 Valf enjeksiyonları
 Bölme kullanılmaksızın, 5000 psi dan yüksek basınçta
çalışacak şekilde dizayn edilmiş, ince borulu ilmek(loop)lerdir.
Bunlar, hareketli faz,  by-pass yoluyla kolona pompalanırken,
örnek ilmeğinin doldurulması yoluyla çalışırlar. Örnek ilmeği,
10-500 ml ‘lik bir hacim aralığında, ya dıştan ve
değiştirilebilir, ya da içten ve sabit hacim ilmeği olabilir.
Nicel analiz için valf enjeksiyon aletleri, septum
enjektörlere göre bazı avantajlara sahiptir:

 Yüksek tekrarlanabilirlikle, geniş bir aralıktaki örnek

hacimlerini enjekte etme yeteneği,
 Çözücü akışını durdurmaksızın yüksek basınçta (5000 psi)
enjeksiyon olanağı,
 Kolon tıkanmasına neden olan septumun bulunmaması,
 Örnekleme sistemi için otomasyon.
 Oto-enjektörler

 2 tip oto-enjektör mevcuttur. Bunlar XY tipi ve carousel

tipidir. XY tipinde enjektör hareketli olup belirtilen
koordinatlara giderek örneği şişesinden çekmekte ve loop
vasıtasıyla mobil faza enjekte etmektedir. Bunun için seçilen
örneklere ait bilgilerin, gerekli yazılım kullanılarak, önceden
bilgi işlemciye girilmesi gerekmektedir. Carousel tipinde ise
örnekler dönen, dairesel şekilli bir taşıyıcı vasıtasıyla sabit bir
enjektörün altına taşınmaktadır.
 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Kolonları
 Modern HPLC donanımının temel yapı taşından birisi olan kolon,
karmaşık örneklerde bileşenlerin birbirinden iyi çözünürlükle
ayırımından sorumlu sabit fazdır. Kolon imalatında yapı materyali
olarak 316 paslanmaz çelik, teflon, cam veya peek en sık tercih
edilenlerdir. Kullanılan bu tür kaplama malzemeleri çok çeşitli
olup, kullanılacak mobil fazın ve uygulanacak HPLC metodunun
özelliklerine ve analizi yapılacak örneğin bilinen kimyasal ve
fiziksel özelliklerine göre seçilmelidir. Seçilecek kolonun HPLC
uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak
basınca dayanıklı olmasına dikkat edilmelidir.
 KOLON DOLGU MADDELERİ
 İyi bir kolon dolgu maddesi kararli olmalıdır ve hem hareketli
faz çözücülerine hem de örnek çözeltilere karşı inert olmalıdır.
Geniş yüzey alanına, düzgün olarak dağılmış ve hareketli faza
kolay erişebilir açık yapısal yüzeye sahip olmalıdır.Yüksek
basınç ve yüksek akış hızlarından etkilenmemelidir.
 Dolgu maddesinin seçiminde tanecik biçimi, büyüklüğü, tanecik
büyüklüğünün dağılımı, gözenek hacmi ve yüzey alanı gibi
özellikler rol oynar.
KOLON DOLGU MADDELERİ TİPLERİ
 Yüzey alanı: Örneğin alıkonma hacmi ve tutulma kapasitesi
dolgu maddesinin yüzey alanı ile orantılıdır. Dolgu maddesinin
yüzey alanı 15 - 600 m2/g arasında değişir. Küçük tanecikler
nisbi olarak büyük yüzey alanına sahiptir.
 KOLON DOLGU MADDELERİ TİPLERİ
 Gözenek hacmi: Gözenekli bir dolgu maddesinde örnek moleküllerinin
tanecik merkezine ulaşması ve sonra geriye dönmesi için (25 µm + 25 µm =
50 µm) ideal diffüzyon uzaklığı olmalıdır. Pelliküler dolgu maddelerinde
diffüzyon uzaklığı (2 µm + 2 µm = 4 µm) dir. Bu nedenle kolon verimi
yüksek olmaktadır. Kısa diffüzyon mesafesi (N) i arttırmakta ve nisbi
alıkonma süresini kısaltmaktadır. Kolon dolgu maddeleri genellikle silika ve
alümina esaslıdır. Kolon dolgu maddeleri tip olarak gözenekli (poröz), küresel
(spherical), düzensiz (irregular), pelliküler (pellicular) ve mikro tiplerinde
olmaktadırlar.
 KOLON DOLGU MADDELERİ TİPLERİ
 HPLC sistemi bir çözücüde çözülebilen bütün maddelere uygundur. Maddeler
kolon içinden geçirilirken maddelerin kolon dolgu maddesi ile farklı
etkileşimlerinden dolayı kolon içersinde alı konma zamanları farklı olur ve
detektöre farklı zamanlarda gelirler.
 Kromatografide kullanılan gözenekli partiküller, çapları 3 - 10 m arasında
olan gözenekli partiküllerdir. partikül boyutu aralığını en aza indirmek için,
her türlü gayret sarfedilmektedir. Partiküller silis, alumina, polistirendivinil
benzen sentetik reçinesi veya bir iyon değiştirici reçineden meydana gelmiştir
 Küresel tipte, gözeneksiz, çapları 30 - 40 µm olan cam veya polimer
tanelerinden oluşur. Bu tanelerin yüzeyine, silis, alumina, polistirendivinil
benzen sentetik reçinesi veya bir iyon değiştirici reçineden oluşan ince bir
gözenekli film kaplanmıştır.
 KOLON DOLGU MADDELERİ TİPLERİ
 Silis, sıvı kromatografide en yaygın kullanılan dolgu maddesidir.
Tanecik büyüklüğü 5 - 30 µm, yüzey alanı 350 - 600 m2/g gözenek
büyüklüğü 50-100 °A dur. Mikrondan daha küçük boyutlardaki
silisyumdioksit parçacıklarının aglomerasyonuyla daha büyük ve
yaklaşık aynı boyutlarda parçacıklar elde edilir.
 Silis (Silika,SiO2), yüzeyindeki (-OH) gruplarındaki aktif
hidrojenden ötürü biraz asidiktir (pH = 4). Su ile yıkanarak asitlik
giderilir. Silikatın üç farklı tipi bulunmaktadır. Tamamen poröz
silika, pelliküler silika ve mikro silikadır. Mikro silika ile poröz ve
pelliküler silikaya nazaran daha keskin pikler elde edilmektedir
 Alümina parçacıkları, gözenekli polimer parçacıkları ve iyon
değiştirici reçineler de dolgu maddesi olarak kullanılabilmektedir.
 Kolonun ayırım gücü ve performansı yapıldığı materyalden çok, iç yüzeyine
yapılan kaplamada kullanılan malzemenin kimyasal ve fiziksel özelliklerinden
etkilenmektedir. Kullanılan bu tür kaplama malzemeleri çok çeşitli olup,
kullanılacak mobil fazın ve uygulanacak HPLC metodunun özelliklerine ve
analizi yapılacak örneğin bilinen kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre
seçilmelidir.
 Kolon çıkışına ve dedektör sistemine bağlanmış boruların en iyisi, hareketli
fazla önemsiz ölçüde seyrelmeye izin veren minimum ölü hacme sahip olanıdır.
Bu örnek seyrelmesini engelleyen, 0.025-0.05 cm iç çapa sahip (çelik ve teflon)
bağlantı borularının kullanılmasıyla başarılır.
 HPLC çalışmalarında sabit faz olarak genellikle silikajel kullanılır. İçerdiği
SiOH grupları nedeniyle zayıf asidik özellik gösteren silikajel, bazik özellik
gösteren bileşikleri bazlık kuvvetlerine göre tutar
 Elementel türlendirme amacı ile kullanılan dolgu maddesi ise
genellikle anyon veya katyonları tutan iyon değiştirici reçinelerdir.
Bu reçinelerin kullanılması durumunda örnekte iyon halinde
bulunan türlerin birbirinden ayrılması sağlanabilir. Kullanılan iyon
değiştirici reçineler doğrudan kolona doldurulabilen kati reçineler
olabileceği gibi, bir kati yüzeyine kaplanmış sıvı reçineler de
olabilir.
 İyonların bu reçinelere olan ilgilerine etki eden birçok faktör vardır.
Bunlar; iyonların yükü ve büyüklüğü, pH, iyon şiddeti, kullanılan
reçinenin gözenekliliği, çözücü cinsi, çözücü derişimi ve sıcaklıktır.
 İYON DEĞİŞTİRME
 İyon değiştirme, iyonik türlerden birinin diğeriyle yer değiştirmesini içerir.
Sabit faz, iyon değiştirici R+ vermek için, net pozitif yük taşıyan kati bir
matriksten oluşur. Eğer anyon içeren hareketli faz kullanılırsa, R+(iyon
değiştirici taraf) negatif karşı iyonu kendine doğru çeker, böylece örnek
anyonları (X-), karşı iyonlarla (Y-) yer değiştirir.
R+Y- + X- = R+X- + Y-

 Bu yöntem anyon değişimini içerdiğinden, anyon değiştirme olarak bilinir.

 Yüzey, iyon değiştirici R- vermek için, net negatif yük taşıdığı zaman  katyon
değiştirme olayi meydana gelir. Karşı iyonlar ( Y+) ve örnek iyonlarının
(X+)  ikisi de katyondur ve iyon değiştirme şu şekilde olur

R-Y+ + X- =R-X+ + Y+
Anyon ve katyon değiştirme reçinesindeki ayırma
mekanizması
HPLC destek maddeleri hem silika temelindeki maddeleri hem de
türevlendirilmiş hidrofilik veya hidrofobik polimerleri kapsar.
 A)Polimer temelli iyon  değiştiriciler: Polimer temelindeki iyon
değiştirici reçinelerin polimerik iskeleti polistirene çapraz
bağlanmış divinilbenzenden sentezlenir.Bu iskelet genellikle bir
stirendivinilbenzen (DVB) polimeri, polimetakrilat polimeri,
metakrilik asit divinilbenzen (MA-DVB) polimeri veya akrilik
asit divinilbenzen (A-DVB) polimeridir. Bunlardan
stirendivinilbenzen polimerinin oluşturulması aşağıdaki sekilde
gerçekleştirilir:
 Bu   destek  maddelerinin   avantajı,
pH 2 - pH 12 arasındaki pH aralığında kararlı olmalarıdır.
 Katyon değiştiriciler, polimere asidik fonksiyonel gruplar
eklenerek, anyon değiştiriciler ise bazik fonksiyonel gruplar
eklenerek elde edilirler. En çok kullanılan fonksiyonel gruplar
katyon  değiştiriciler  için  -SO3-(sülfonat), anyon değiştiriciler
için  kuarter  amin (-N+(CH3)3  trimetilamonyum; -N+
(CH3)2C2H4 OH  dimetil hidroksietil amonyum) formundaki 
iyon değiştiricilerdir. Örneğin bir stirendivinilbenzen polimeri
sülfürik asitle tepkimeye girdiğinde -SO3H bağlı katyon
değiştirici oluşturur
 B) Silika temelinde iyon değiştiriciler: Silika temelinde iyon
değiştiren matriksler hidrofiliktir ve polimerik tabaka oluşması
için kullanılan çapraz bağlayıcılar yüzünden düşük hidrofobik
tutunma gösterirler. Küçük parçacık büyüklükleri ve sık
dağılımları yüksek kaliteli bir ayırma sağlar.
 Kimyasal ve mekanik olarak kararlı olan silika matriksleri,
yüksek akış hızı  gerektiren yüksek basınca karşı iyi direnç
gösterirler. 2.5-7 pH aralığındaki sulu tamponlar ve pek çok
organik çözücüler, matrikste şişme veya büzülme olmaksızın
kullanılabilirler.
 Günümüzde belki de en çok kullanılan kolon, 25 cm uzunluğunda,
4,6 mm iç çapında ve 5 m tanecik büyüklüğüne sahip dolgu
maddesi doldurulmuş kolondur. Bu tip kolonlar 40000 - 60000
tabaka/metre içerirler. Bu gibi kolonların iç çapı 1 - 4,6 mm ve 3 -
5 µm tanecik büyüklüğündeki dolgu maddesi ile doldurulmuş
olabilir. Çoğu zaman boyu 3 - 7,5 cm kadar kısadır.
 Şekilde, bu tipteki bir kolonda gerçekleşebilecek bir ayırmanın
hızını ortaya koymaktadır.Burada farklı tipteki 8 tane madde,
yaklaşık 15 s içinde birbirinden ayrılabilmektedir. Kolon 4 cm
uzunluğunda ve iç çapı 4 mm’ dir ve 3 µm tanecik boyutundaki
dolgu maddesi ile doldurulmuştur.
 Hareketli faz: n-hekzanda %4,1 etil asetat.
Bileşikler:
p-ksilen (6) dibütil ftalat
anisol (7) dipropil ftalat
benzil asetat (8) dietil ftalat
dioktil ftalat
dipentil ftalat

Yüksek hızlı izokratik ayırma

 Emniyet (Klavuz) Kolonları
 Klavuz kolonlar, analit kolonun giriş kısmına takılarak çözücü
gelebilecek toz ve kirlilikleri tutmak suretiyle kolonun ömrünü
uzatırlar. Klavuz kolonun dolgusunun bileşimi ile analitik
kolonunki benzer olmalıdır. Ancak basınç düşmelerini azaltmak
için, klavuz kolonun dolgu maddesinin parçacık boyutu analitik
kolonunkinden genellikle daha büyüktür
 Kolon Termostatları
 Birçok uygulama için kolon sıcaklığının yakından kontrolu
gerekli değildir ve kolonlar oda sıcaklığında kullanılırlar. Ancak,
çoğu zaman, kolon sıcaklığı, derecenin onda birkaçı hata ile sabit
tutulduğu zaman daha iyi kromatogramlar elde edilmektedir.
 Kolon kullanımı için önlemler
 I.Kolon seçimi: Örneğin molekül kütlesi, solvent sisteminin
çözünürlüğü, ayırma modu gibi bilgiler performanslı bir
ayırmadan önce kolon seçimine yardim eder. Üreticiler kolon
dolgu maddelerini, ayırdıkları bileşikler, örnek kapasiteleri vb.
şekilde sınıflandıran bir literatür sağlamışlardır.
 Ön-kolon kullanımı: Hareketli faz, pompa çıkısından sonra,
ayırmayı sağlayan kolon ile ayni sabit fazı içeren bir ön-kolondan
geçirilir. Bu uygulamanın amacı, hareketli fazdaki safsızlıkları
toplamak ve hareketli fazı sabit faz ile doygunluğa getirmektir.
Ön-kolon kullanmanın bir diğer avantajı ise fiyatları bir hayli
yüksek olan ayırıcı kolonların ömrünü uzatmasıdır.
 Kolon kullanımı için önlemler
 Kolon tabakasının bozulması: HPLC sistemi çalıştırılmaya başlanınca akış hızı
yavaş yavaş arttırılmalıdır. Aynı uygulama sistem kapatılırken de izlenmelidir.
Böylece kolon tabakasının bozulmaksızın kolon basıncının artması sağlanır.
 Kolonun korunması: Kolonlar rutubetli ve çok yüksek veya çok düsük
sıcaklıkların olduğu yerlerde saklanmamalıdır.  Kolonların özel bir çözücü ile
saklanması, kirlenmeyi azaltır ve kolon ömrünü artırır. Bazı tamponlar (özellikle
halojen tuzlarını içeren tamponlar) kolonun paslanmaz çelik duvarını aşındırır. Bu
nedenle kolon saklanmadan önce uygun bir çözücüyle temizlenmelidir.
 Kolonun rejenerasyonu (yenilenmesi):  Kolon performansı azaldığında en iyisi
kolonu rejenere etmektir. Normal faz kolonları kullanıldığında, kolon önce çok az
polarlıkta bir çözücü geçirilerek yenilenebilir ve sonra tekrar hareketli fazla
dengeye getirilir. Ters faz kolonları metanol, THF, CH2Cl2 gibi çözücülerle 
yenilenebilir.
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Dedektörleri

 Dedektör yüksek basınçlı sıvı kromatografisinde,

aletin en önemli kısımlarından birini oluşturur.
Kolondan çıkan maddelerin derişimi kolon çıkışına
yerleştirilen uygun bir dedektör ile ölçülür. Dedektör
seçimi doğru ve hassas bir analiz yapabilmek için son
derece önemlidir. Genellikle tek dedektör sistemi
kullanılmakla beraber, birden fazla dedektör
sisteminin yer aldığı cihazlar da mevcuttur.
 Dedektörler

Bir dedektörde bulunması gerekli önemli karakteristikler;

 Duyarlılık
 Doğrusallık
 Üniversal ve seçici cevap
 Doğru cevap, koşulların değişiminden etkilenmeme
 Numuneyi tahrip etmeme
 Ucuzluk ve kolay kullanım
 Dedektörler

HPLC dedektörlerinin iki tipine rastlamak mümkündür.

 1. Genel dedektörler
 2. Seçici dedektörler
 Genel ve Seçici Dedektörler
 Genel dedektörler, hareketli faz ve örnek çözeltisinin
özelliklerindeki değişimi ölçer.
 Seçici dedektörler ise yalnız örnek çözeltisi için duyarlılık ve
seçicilik gösterir.
 Genel özellikli dedektörlere örnek olarak kırılma indisi ölçen
dedektörler ve kütle spektrofotometreleri verilebilir.
 Seçici dedektörlere örnek olarak da UV, FT-IR, floresans,
elektrokimyasal, radyokimyasal, iletkenlik dedektörleri
verilebilir.
 Seçici dedektörler, genel dedektörlerine göre yaklaşık 1000 kat
daha duyarlıdır. Dedektörler, örnek bileşenlerini tayin ederken
ölçtükleri fiziksel özelliklere göre farklılandırılabilir.
UV dedektörü
Ultraviyole-görünür bölge dedektörü
(UV dedektörü)
 Değişken dalga boylu UV-VIS detektör en çok kullanılan
detektördür.
 Döteryum veya tungsten lambadan çıkan ışık demeti dalga
boyu seçici tarafından dalga boylarına ayrılır.
 Akış hücresinin önünde bulunan aralık sadece seçilen dalga
boyunun hücre boyunca geçişine izin verir.
 Geçen dalga boyundaki ışığın yoğunluğu bir diot aracılığıyla
ölçülür.
 Avantajları:
Hassasiyet:
o Değişken dalga boylu UV-VIS detektörler 190-800 nm
aralığındaki dalga boylarında kullanılabilirler.
o Pek çok bileşiğin bu aralıkta absorpsiyonu vardır.
o Bu aralıkta absorpsiyonu olan bileşikler için UV detektörün
hassasiyeti yüksektir
o ppm seviyesinden daha düşük konsantrasyonlarda bile
ölçüm yapılabilir.
 Seçimlilik:
o Piklerin çakışması durumunda UV dedektörün seçimlilik
özelliğinden yararlanılabilir.
o Analiz edilen madde için optimum dalga boyu seçilerek
girişim yapmış olan diğer maddelerin etkisi en aza indirilir.
 Sabit Dalgaboylu UV-VIS Dedektör

 Bir cıva lambadan gelen ve filtreden geçirilen ışık, örnek

hücresi boyunca geçerek diyota ulaşır.
 Işık yoğunluğu bir referans diyot aracılığıyla doğrudan ölçülür.
(Hg lambası 254 nm de çalışır)
 Avantajları:

 Maliyetinin düşük olması.

 Cıva lambanın ışık yoğunluğunun yüksek olması nedeniyle
hassasiyetin yüksek olması.

 Dezavantajları:

 Sınırlı dalga boyu seçimine sahiptir.

 Optimum dalga boyuna yakın dalga boyu içermeyebilir.
Foto Diode Array Dedektörü
Foto Diode Array (PDA) Dedektör
 Fotodiyot dizisi dedektör UV-VIS bölgede cevap veren bir
dedektördür.
 Lambadan gelen UV ışık demeti dalga boylarına ayrılmadan
önce ışık hücresinden geçer.
 Grating mekanizmasından sonra yerleştirilen yüzlerce fotodiyot
dizisi ile her dalga boyunun yoğunluğu ölçülür.
 Böylece maddeye ait spektrum ile istenilen dalga boyunda
kromatogram elde edilir.
 Her bir fotodiot başka bir dalga boyunda ışık şiddeti
ölçebilmektedir ve monokromatör, ışık kaynağı ile örnek
arasında değil, örnek ile detektör arasına yerleştirilir.

 Bu tür bir optik yerleştirmede ışık kaynağından gelen

ışınların tümü birden örneğe gönderilerek duyarlılık artırılmış
olur.

 Bu dedektörle elde edilen gözlenebilme sınırı 10-10 g/mL’dir.

 Avantajları:
 Fotodiyot dizisi detektör, seçimlilik ve hassasiyet açısından
değişken dalga boylu UV-VIS detektör ile aynı avantaja
sahiptir.
 Ek olarak elde edilen spektrum kullanılarak madde tanınması
gerçekleştirilir.
 Elde edilen piklerin saflığı hakkında da bilgi verir
 Dezavantajları:
 Değişken dalga boylu UV-VIS dedektörlerden daha pahalıdır.

 Zaman içerisinde baselinedaki değişim fazladır.

Refraktif İndeks Dedektörü
(Kırılma İndisi Dedektörü)
 Refraktif İndeks Dedektörü
(Kırılma İndisi Dedektörü)
 Her bir bileşenin miktarını ölçebilen, yani seçimli olmayan bir
detektör türüdür.
 Örnek hücre ile referans hücre arasındaki kırılma indisi farkı
ölçülür.
 Referans hücre daima hareketli faz içerir.
 Maddeyi taşıyan hareketli faz örnek hücresine geçtiğinde ışık
demeti kırılır.
 Kırılan ışık demeti fotodiyota ulaşarak elektriksel sinyal üretir.
 Avantajları:

 Refraktif indeks dedektörü üniversal bir dedektördür bu nedenle

bütün bileşiklere cevap verir.
 Doymuş hidrokarbonlar, alkoller ve eterler gibi UV absorpsiyonu
olmayan bileşikler için tercih nedenidir.
 Dezavantajları:
 Gradient çalışmalar için kullanılamaz çünkü hareketli fazın
kırılma indisi değişimine cevap verir.
 Sıcaklığa karşı hassas olduğundan oda sıcaklığındaki küçük
değişiklikler bile baseline kayması veya gürültüye neden
olabilir.
 Ayrıca örnek bileşenleri hareketli fazdan büyük yada küçük
kırılma indisine sahip olabilirler. Bu da hem negatif hem de
pozitif piklerin oluşmasına neden olur ki bu yüzden
integrasyon hataları ortaya çıkabilir.
FLORESAN DEDEKTÖR
 FLORESAN DEDEKTÖR
 Maddenin yaydığı floresansı ölçer.
 UV ışığı istenen eksitasyon dalga boyunu seçmek için filtreden
geçirilir.
 Floresans özellik taşıyan bir madde hücreden geçtiğinde UV ışığı
absorplar ve daha büyük dalga boyunda ışık yayar (Emisyon).
 Yayınlanan ışık istenen dalga boyunu seçmek için filtreden
geçirilir.
 Daha gelişmiş floresans dedektörlerde filtreler yerine
monokromatörler kullanılır ve spektroflorimetre olarak
adlandırılırlar.
 Avantajları:
 Hassasiyet

 Floresans dedektörün en önemli avantajı hassasiyetidir.

 1 ppb den daha düşük konsantrasyondaki maddelere cevap
verebilmektedir (10-11 M)

 Spektrum Alabilme

 Bazı spektroflorimetreler bir bileşen hücrede tutulurken hem

eksitasyon hemde emisyon dalga boyu tarayacak yetenektedir.
Sonuçta elde edilen spektrum pik tayininde kullanılabilir.
 Hem eksitasyon hem de emisyon dalga boyunu dikkatli bir
şekilde seçerek özel bir bileşiğin cevabını optimize etmek
mümkündür.
 Floresans detektörün seçimlilik özelliği pek çok çakışan pike
sahip kompleks ürünler için oldukça kullanışlıdır.

 Dezavantajları

 Floresans özelliğe sahip olmayan maddeleri tayin etmek

mümkün değildir. (Ancak uygun olanlar türevlendirerek
floresans verici hale getirebilir.)
 Türevlendirme maddelerinin seçimi ve türevlendirme
işlemi her zaman istenilen cevabı vermeyebilir.
 ELEKTROKİMYASAL DEDEKTÖR
 Son derece hassas bir detektördür.
 Elektroaktif bileşiklerin tespitinde kullanılır.
 Maddelere spesifik akım uygulanır, bu nedenle seçicidir.
 Maddelerin indirgenmesi veya yükseltgenmesi sonucu oluşan
sinyalleri ölçer.
 Hareketli faza taşıyıcı elektrolit katmak gerekir.
 Avantajları:
 Çok düşük derişimlerde analize olanak sağlar.
 Yabancı maddelerin girişim yapması çok güçtür.
 Dezavantajları:
 Dengelenmesi uzun zaman alır.
 Sınırlı sayıda maddeye uygulanabilir.
 AMPEROMETRİK DEDEKTÖR
 Elektroaktif bileşiklerin tespitinde kullanılan çok hassas bir
dedektördür.
 Elektroliz sonucu oluşan akımın ölçülmesi ile yani organik
bileşiklerin ölçümü gerçekleştirilebilir.
 Fenoller, aminler, merkaptanlar, peroksitler, purinler ve
heterosiklik bileşikler elektrokimyasal olarak okside olabilirler.
Aldehitler, ketonlar ve nitro bileşikleri ise elektrokimyasal olarak
indirgenebilirler.
 İletken bir hareketli faz gerektirdiğinden ayırmalar tampon içeren
hareketli faz ile ters faz kolonlarında gerçekleştirilir.
 ELEKTRİK İLETKEN DEDEKTÖR
 İyonik bileşikler elektrik iletken dedektör ile ölçülebilirler.
 Kolondan çıkan sıvı iki metal levha elektrot arasından geçirilir
ve dedektör hücresinde iki elektrot arasına küçük bir gerilim
uygulanır.
 Hareketli faz düşük iletkenliğe sahip olmalıdır.
 Elektrotlar arasında geçen akım hareketli faz iletkenliğine,
hareketli fazın iletkenliği de çözelti iyonlarının
konsantrasyonuna karşılık gelir.
 KÜTLE SPEKTROMETRİSİ
DEDEKTÖRÜ
 Kütle spektrometrisi dedektörü sıvı kromatografi piklerinin
on-line kalitatif analizi için en iyi araçtır.
 Ayırım sonrasında molekül, iyon kaynağı tarafından iyonize edilir.
 İyonizasyon sonrasında moleküldeki zayıf bağlar kırılır ve bir seri
iyonize olmuş fragman oluşur.
 Bu fragmanlar kütle spektrometresi tarafından spektrum üretmek
üzere ayrılır.
 İyonlar dört yol boyunca hızlandırılır ve yollara hem ters hem de
doğru akım uygulanır. Uygulanan gerilimler fragmanların yönünü
değiştirir.
 Bu yollar bir kütle filtresi gibi hareket eder.
 Devamında ölçülen her bir kütlenin yoğunluğundan kütle
spektrumu çizilir.
 Avantajları:

 Kütle spektrometresi kalitatif analiz için en iyi araçtır.

 Son derece hassastır ve seçimlidir.

 Son yıllarda daha da geliştirilen (LC-MS/MS) detektörleri

de kullanılmaktadır.
 Dezavantajları
 Yüksek maliyetlidir
 Yüksek molekül ağırlı bileşikler detektörün kütle aralığının
ötesinde fragmanlar oluşturabilirler. Düşük molekül ağırlıklı
bileşikler ara yüzeyde kaybolabilirler.
 Spektrumun yorumu deneyimli eleman
 BUNLARIN DIŞINDA
 Sıvı kromatografisi sistemine;

 Bir FT-IR spektrometresi eklenerek de maddelerin teşhisi

gerçekleştirilebilir (LC-FT/IR).
 Ayrıca daha az kullanılmakla birlikte iyon seçimli
elektrotlarla yapılan potansiyometrik ve fotoakustik, ICP ve
atomik absorpsiyon ölçümlerine dayanan detektörler de
vardır.
 YÜKSEK PERFORMANSLI DAĞILMA
KROMATOGRAFİSİ
 Dağılma kromatografisi sıvı - sıvı kromatografi ve sıvı bağlı
faz kromatografi olmak üzere iki alt sınıfa ayrılabilir. İki
teknik arasındaki fark katı parçacıklar yüzeyine durgun fazın
tutturulmasındaki metod farkından kaynaklanır. Sıvı-sıvı
tekniğinde durgun faz katı yüzeyine fiziksel adsorpsiyonla;
bağlı faz tekniğinde ise kovalent bağlarla tutturulur.
 1)Bağlı-Faz Dolgu Maddeleri
 Bağlı faz dolgu maddelerinin çoğu bir organoklorosilanın, sıcak seyreltik
hidroklorik asit çözeltisinde hidrolizlenerek yüzeyine –OH grubu bağlanmış
silisyumdioksit ile reaksiyona sokulmasıyla hazırlanır. Bu reaksiyon
sonucunda oluşan ürün bir organosiloksandır.

 Bağlı faz dolgu maddeleri, fiziksel olarak yüzeye tutturulmuş dolgulara göre
daha kararlı olma gibi bir üstünlüğe sahiptir.
 Dağılma kromatografi, hareketli ve durgun fazlarının bağıl polarlığına bağlı
olarak iki kısma ayrılabilir:
 Normal-faz kromatografi
 Ters-faz kromatografi
 Normal Faz Kromatografisi
 Normal-faz kromatografide en düşük polaritedeki bileşenler
hareketli fazda nispeten çok çözündükleri için en önde elue
edilirler, hareketli fazın polaritesindeki artış, elüsyon zamanının
azalması ile sonuçlanır.
 Normal Faz kromotografisi denir. Kolon olarak aşağıdaki kolon
sistemleri kullanılır;
 Silika
 Siyano ( CN)
 Amino ( NH2 )
 Diol ( OH )
 Nitro ( NO2 )
 Normal Faz Kromatografisi
 Bu kullanılan teknikde mobil faz olarak diklorametan yada hekzan gibi
apolar çözücüler kullanılır. Bu kromotografi sisteminde örneklerin
kolonla etkileşimi hidrojen bağ (hidrofilik) ile oluşur.

Normal Faz Kolon da Örnek Kolon Seçimi

 Ters-faz kromatografi
 Bu sistemde kolon apolar ve çoğu zaman bir hidrokarbondur ,
mobil faz ise metanol, asetonitril ve su gibi polar çözücüler
kullanılır. Bu sistem en çok kullanılan kromotografi tekniğidir.
Kullanılan kolon çeşitleri aşağıdadır;
 C18 ( ODS )
 NH2 (RP )
 C8
 C4
 C2
 Phenyl
 CN ( RP )
 NH2 (RP )
 Ters-faz kromatografi
 Ters-faz kromatografide durgun faz apolardır ve çoğu zaman bir
hidrokarbondur. Ters-faz kromatografide en polar bileşenler, en önde yürür
ve hareketli fazın polaritesindeki artış, elüsyon zamanını artırır
•Bu sistemde ise dallanma ve karbon zincirinin uzunluğu hidrofobik
etkiyi artırır bu yüzden B maddesi kolonda daha fazla tutulurken OH,
COOH,NH2 ve NO2 gibi gruplar hidrofobik etkiyi azaltığı için A
maddesi kolonda fazla tutulmadan dedektöre daha çabuk gelir.

Ters Faz kromatgrafideki etkileşim

 Ters faz iyon çifti kromatografisi
 iyonik türlerin ayrılması için kullanılan bir tür ters faz dağılma
kromatografisidir. Hareketli faz, metanol ve asetonitril gibi bir
organik çözgen içeren sulu bir tampon ve tayin edilecek analit
ile zıt yüklü “karşıt iyon” içeren bir iyonik bileşikten meydana
gelmiştir. Karşıt iyon, analit ile birleşerek ters faz dolgu
maddesi ile alıkonulabilen nötral iyon çifti oluşturan bir
iyondur.
 Çevre analizlerinde özellikle deniz suyunda poliaromatik
hidrokarbonlar (PAH)’ ın analizinde EPA metoduna göre analizi
ters faz kromotografi sistemi ile yapılmaktadır.
EPA Metoduna göre HPLC PAH Analizi
Normal-faz ve ters-faz kromatografide polarlık ile elüsyon
süreleri arasındaki ilişki
 Dağılma Kromatografide Yöntem Geliştirme
 Dağılma Kromatografi Ayırmalarında Kolon Seçimi
 Farklı analit fonksiyonlu grupların polariteleri artan sıraya göre
şöyledir: hidrokarbonlar  eterler  esterler  ketonlar 
aldehitler  amidler  aminler  alkoller. Su, bu sayılan
fonksiyonlu grupları içeren bileşiklerden daha polardır.
 İyi bir dağılma kromatografik ayırmanın makul sürelerde
gerçekleştirilmesi isteniyorsa,
 çözünen madde
 hareketli faz
 durgun fazın polariteleri dikkatlice seçilmelidir.
Dağılma Kromatografide Hareketli-Faz Seçimi
 Bir kromatografik kolondaki ayırmayı iyileştirmek için
yöntemlerin her biri değişkenlerden (N, k ve ) değişmesi
temeline dayanmaktadır.
Alıkonma Faktörlerine Çözücü Gücünün Etkisi
 Polarite indisi, farklı çözücülerin bağıl polaritelerinin sayısal bir ölçüsüdür.

Çizelge:Yaygın kromotografik haraketli fazların özellikleri

 Bu sınırlar arasında arzu edilen herhangi bir polarite indisi uygun iki
çözücünün karıştırılmasıyla elde edilebilir. Böylece A ve B
çözücülerinden meydana gelen bir karışımın polarite indisi PAB
aşağıdaki eşitlikte verilir:

P’A ve P’B: iki çözücünün polarite indisi

A ve B: çözücülerin her birinin hacim kesri
Altı tane steroidin karışımından meydana gelen bir numunenin Şekil de verilen
kromtogramlarında görülmektedir.
KROMATOGRAFİNİN UYGULAMALARI

 Kromatografi, birbirine yakın özellikteki kimyasal türlerin

ayrılmasında başlıca yöntem olmuştur.
 kalitatif
 kantitatif tayinde kullanılabilir.
 Kalitatif Analiz
 Bir kromatogram, bir numunedeki her bir tür hakkında sadece biraz kalitatif
bilgi sağlar:
 bir türün alıkonma süresi
 belli bir elüsyon süresinden sonra durgun fazdaki konumu
 Şüphesiz değişik hareketli ve durgun fazlar ve farklı elüsyon sıcaklıkları
içeren kromatogramlardan daha fazla bilgi elde edilebilir.
 Kromatografiden elde edilebilecek bilgi miktarı tek bir IR, NMR ya da kütle
spektrumunun sağlayabileceği miktarla kıyaslandığında azdır.
 Ayrıca spektral dalga boyu veya frekans bilgileri kendilerinin kromatografik
eşleniklerene (tR) oranla daha yüksek kesinlikte tayin edilebilir.
 Bu yöntem ne oldukları bilinen sınırlı sayıdaki olası maddeleri içeren
karışımların bileşenlerinin var olup olmadığını belirtmede sıklıkla kullanılan
bir araçtır.
 Kalitatif Analiz
 Örnek: bir protein hidrolizatındaki 30 ya da daha fazla amino
asit, kromatogram sayesinde bağıl olarak daha yüksek bir
kesinlikte tayin edilebilir.
 Bunların varlığının doğrulanması ayrılmış olan bileşenlerin
spekral ya da kimyasal incelenmesini gerektirir.
 Karmaşık bir numune için ön kromatografik ayırma olmadan
spektroskopik tanıma imkansızdır.
 Kalitatif Analiz
 Kromatografi genellikle kalitatif spektroskopik analizler için çok
önemli bir ön işlemdir.
 Kromatogramların numunede bulunan türlerin pozitif
tanınmasını sağlayamamasına karşılık, bazı bileşiklerin mevcut
olmadığına kesin kanıt sağlar.
 Aynı koşullarda çalışılmış standart ve numune aynı alıkonma
süresinde pik oluşturmuyorsa, söz konusu bileşiğin olmadığı
(veya yöntemin gözlenebilme sınırının altında bir derişimde var
olduğu) varsayılabilir.
 Kantitatif Analiz
 Kromotgrafi son 40-50 yıldaki hızlı büyümesini
 kısmen hızına,
 basitliğine,
 nisbeten ucuz giderlerine ve
 ayırma aracı olarak geniş uygulanabilirliğe
 sahip olmasına borçludur.
 Ayrılmış türler için faydalı kantitatif bilgi sağlayabildiği gerçeği olmasaydı, bu kadar
yaygınlaşıp yaygınlaşmayacağı şüphe götürürdü.
 Kantitatif kolon kromatografi: analitin
 pik yüksekliği
 pik alanı
 standardınki ile kıyaslanır.
 Düzlemsel kromatografide ayrılmış maddelerin kapladığı alan analitik parametre
olarak işlev görür.
 Koşullar düzgün bir şekilde kontrol edilebilirse, bu parametreler derişimle doğrusal
olarak değişir.
 Pik Yüksekliğine Dayalı Analizler
 Bir kromatografi pikinin yüksekliği, pikin her iki tarafındaki taban çizgilerinin düz bir
çizgi ile birleştirilmesi ve bu çizgiden pik tepesine dikey mesafenin ölçülmesi ile elde
edilir.
 Bu ölçüm genelde yüksek kesinlikle yapılabilmektedir.
 Pik yüksekliklerinin pik genişlikleriyle ters orantılı olduğuna dikkat etmek
gerekir.
 Pik yükseklikleri kullanılarak doğru sonuçlar ancak kolon koşullarındaki
değişikliklerin numunenin ve standartların kromatogramlarını elde etmek için
gerekli olan sürede pik genişliklerini değiştirmediği durumda elde edilir.
 Yakından kontrol edilmesi gereken değişkenler:
 kolon sıcaklığı,
 eluent akış hızı
 numune enjeksiyon hızı
 Kolonun aşırı yüklenmemesine dikkat edilmelidir.
 Numune enjeksiyon hızı özellikle kromatogramın ilk pikleri için önemlidir.
 Bu sebepten dolayı şırınga ile yapılan enjeksiyonlarda, %5 -%10 bağıl hata normaldir.
 Pik Alanına Dayanan Analizler
 Pik alanları bant genişleme etkilerinden bağımsızdır. Alanlar
pik yüksekliklerine göre daha tatmin edici bir analitik
değişkendir.
 Pik yükseklikleri daha kolay ölçülür ve dar pikler için daha
doğru şekilde tayin edilebilir.
 Uygun genişlikleri olan simetrik pikler için iyi sonuç veren basit
bir yöntem pik yüksekliğini, pik yüksekliğinin yarısındaki pik
genişliği ile çarpmaktır.
 Diğer yöntemler
 planimetre kullanılması
 piki kesip bunun ağırlığını kullanılan kağıdın bilinen alanının
ağırlığına kıyaslanması
 Elle yapılan integral hesabı teknikleri %2 ile % 5 düzeyinde
tekrarlanabilen alanlar sağlar,
 Dijital integral hesaplayıcılar en az bir ondalık mertebesi daha
kesindir.
 Kalibrasyon ve Standartlar
 Kantitatif kromatografik analizler için en dolaysız yöntem,
bilinmeyenin bileşimine benzeyen bir seri standart çözelti
hazırlanmasını içerir. Bundan sonra standartların kromatogramları
alınır ve pik yükseklikleri veya alanları derişimin bir fonksiyonu
olarak grafiğe geçirilir. Verilerin grafiği, orijinden geçen düz bir
doğru vermelidir. Analizler bu grafiğe dayandırılır.
 En yüksek doğruluk için sık sık yeniden kalibrasyon yapılması
gereklidir.
 En önemli hata kaynağı: numune hacmindeki belirsizlik (yüzde
birkaç bağıl hata)
 Numunenin ısıtılmış numune bölgesine enjekte edilmesinin
gerekli olduğu gaz-sıvı kromatografide daha fazladır.
 İç Standart Yöntemi
 Kantitatif kromatografi için en yüksek kesinlik iç standartlar
kullanılarak elde edilir, çünkü numune enjeksiyonundan kaynaklanan
belirsizlikler önlenmiştir. Bu yöntemde iç standart maddesinden dikkatle
ölçülmüş miktarlar her bir standarda ve numuneye konur ve analit
pikinin iç standart pik alanlarına (ya da yüksekliklerine) oranı analitik
parametre görevi görür.
 Bu yöntemin başarılı olması için
 iç standart pikinin numunenin diğer bileşenlerinin piklerinden iyi ayrılmalı (RS
> 1,25)
 standart piki analit pikine yakın olmalı
 Uygun bir iç standartla genellikle % 1’den daha iyi bir kesinlik elde
edilebilir.
 Dış standart yöntemi
 Miktar tayini yapılacak maddelere ait belirli bir miktar enjekte edilerek kromotogram
alınır ve pik artar,pik artmasıyla bilinmeyen maddenin pik alanı veya pik yüksekliği
kıyaslanarak hesaplama yapılır.

STANDART EKLEME YÖNTEMİ

 Genellikle bir veya birden çok maddelerin analizinde kullanılır.örnekler optimum

miktarda enjekte edilir.kalibrasyon grafiği ile bilinmeyen madde tayin edilir.
 Alan Normalizasyon Yöntemi
 Numune enjeksiyonundan kaynaklanan belirsizlikleri ortadan
kaldıracak bir başka yaklaşım, alan normalizasyon yöntemidir.
Numunenin tüm bileşenlerinin tam olarak elüe edilmesi gereklidir.
Normalizasyon yönteminde elüe olmuş tüm piklerin alanları
hesaplanır; farklı bileşik türlerine karşı detektör cevabındaki
farklılaşmalara göre, bu alanlar düzeltildikten sonra analit derişimi,
analit pik alanının tüm piklerin toplam alanına oranından bulunur.
 Ancak bir karışımın tüm bileşenlerinin kolondan uygun bir sürede
elüe olacağı şekilde koşulları ayarlamak, genellikle pratik değildir.
Bu nedenle, alan normalizasyon yönteminin uygulamaları kısıtlıdır.
HPLC Kullanırken Alınması Gereken Önlemler
 A) Hareketli faz çözücüleri için  C)Kolon kullanımı için önlemler
önlemler
 Farklı dolgulu kolonlar için  Kolon seçimi
çözücü sınırlaması  Ön-kolon kullanımı
 Çözücünün saflığı  Kolon tabakasının bozulması
 Çözücünün degaze edilmesi  Kolonun korunması
 Çözücünün süzülmesi
 Çözücülerin değişimi  Kolonun rejenerasyonu
 B)Örnek hazırlanması (yenilenmesi)
 Katı örnekler
 Sıvı örnekler
 Örneklerin süzülmesi
 HPLC İLE İLGİLİ UYGULAMALAR
HPLC sistemi ile hangi analiz yapılacak ise öncelikle o
analiz icin gerekli şartlar sağlanır:
•Uygun ekstraksiyon yöntemi bulunur
•Analiz için uygun kolon, haraketli faz ve akış
hızının şeçilir.
•Analiz edilecek maddenin bilinen bir derişimdeki
standartı sisteme enjeksiyon edilir.
•Standartın kolondan çıkış süresi (alıkonma süresi)
HPLC için uygulama grafiği tespit edilir
•Derişimi bilinen standartın verdiği pikin altında
kalan alan veya pik yüksekliği ( h) hesaplanır.
•Örnek kromotogramındaki yeri tespit edilen
bilinmeyen bileşenin pikinin altında kalan alan veya
yükseklik hesaplanır.
•Sonuçta orantı hesaplaması ile analiz edilen
bileşenin derişimi hesaplanır.
HPLC ile yapılan bazi analiz örneklerinden elde edilen
pik alanları
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi İle Eritrositlerde Toplam
ve İndirgenmiş Glutatyon Miktarının Tayini
 Bu çalışma, eritrosit toplam (indirgenmiş+oksitlenmiş glutatyon) ve
indirgenmiş glutatyonun Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ile analizi
için en uygun koşulların saptanması amacıyla gerçekleştirilmiştir.
 Biyolojik sıvılarda glutatyon analizi için tanımlanmış birçok yöntem
bulunmaktadır. Bu yöntemler enzimatik, fluo­rometrik ve kolorimetrik olmak
üzere üç ana grupta top­lanmaktadır.
 HPLC temelli yöntemlerin birçoğu; glutatyonun, 5,5’-di­tiyobis- (2-
nitrobenzoic) asit veya 2,4 dinitrofluorobenzen ile türevlendirilerek elde edilen
UV-absorbansının, UV-dedektör ile değerlen­dirilmesine dayanmaktadır. UV-
dedektörlerin yanısıra fluoresans dedektörler yardımıyla da glutatyonun tiyol
gruplarının; monobromobiman,orto-fitaldehit(OPA) , 1-dimetilaminofitalen-5-
sülfonilklorür (dansil klorür) gibi fluorojenik reaktiflerle türevlendirilmesinden
sonra oluşan fluoresansın değer­lendirilmesi de yaygın olarak kullanılmaktadır.
OPA, glutatyonun hem sülfidril hem de primer amino grubu ile şiddetli
fluoresans veren türevler oluşturduğu için tercih edilen bir türevlendirme
maddesidir.
 GEREÇ ve YÖNTEM
 Kimyasal Maddeler ve Su
 Glutatyon
 OPA(orto-fitaldehit)
 Metafosforik asit(MPA)
 Tris (hidroksimetil) aminometan
 Hidroklorik asit
 Disodyumhidrojenfosfat
 Sodyumhidrojenfosfat
 Sodyumtetraborat(NaB4 O7)
 Sodyumhidroksit
 Metanol
 Ditiyotireitol
 Sodyumasetat
 Asetonitril
 Asetik asit
 Standart Çözeltiler
 0.0156, 0.0312, 0.0625, 0.125, 0.250, 0.500, 1.00, 2.00
mmol/L derişimlerinde glutatyon standart çözeltileri hazırlanır.
 Tüm standartlara, örneklere uygulanan işlemlerin aynısı
uygulanarak standart kalibrasyon eğrisi oluşturul­ur.
 Kullanılan yöntemde, indirgenmiş glutatyon, türevlendir­me
işleminden sonra doğrudan ölçülmektedir.
 Türevlendirme Reaktifi
 Türevlendirme reaktifi olan OPA, 5 mg/mL derişimin­de ve 0.1 M
Sodyum tetraborat, pH 9.9 tamponu içinde hazırlanır.
Paket Eritrosit Örneklerinin Hazırlanması
 Glutatyon için paket eritrosit örnekleri 1:1,5 (h/h) oranında 0.1
M Tris-HCl, pH 8.5 tamponu ile seyreltilir. Bu karışım 1:8 (h/h)
oranında taze hazırlanmış % 6’lık MPA ile dep­roteinize edilerek
9168 x g +4 ºC’de 7 dakika santrifüj edilir.Supernatant 1:4 (h/h)
oranında 50 mM sodyum fosfat, pH 7.0 tamponu ile
nötralleştirilir ve nötr super­natant 1:1 (h/h) oranında OPA
reaktifi ile karıştırılır. Bu karışım oda sıcaklığında 5 dakika
bekletildikten sonra hacim 1:4 (h/h) oranında 50 mM sodyum
fosfat tampo­nu, pH 7.0 ile seyreltilir. ve analiz için 5 μl HPLC
ciha­zına enjekte edilir.
 Kromotografik Koşullar
 Analizler Shimadzu-VP serisi HPLC sistemi ile yapılmıştır.
Sistem, pompa (LC-10ADVP), fluoresans dedektör (RF-
10AXL), oto enjektör (SIL-10ADVP), kolon fırını (CTO-
10ASVP) ve kontrol ünitesinden (SCL 10AVP) oluş­maktadır.
Çalışmada; 5 μm tanecik çapında, 25 cm/4.6 cm boyutlarında
C18 kolonu (ACE/121–254) ve 50 mM asetonitril+50 mM
asetat tampon (pH 6.2) karışımından oluşan hareketli faz
kullanılmıştır. Enjeksiyon hacmi 5 μL, kolon fırını sıcaklığı
30°C, fluoresans dedektör eksitas­yon ve emisyon dalga boyları
sırasıyla, 340 nm ve 420 nm olarak ayarlanmıştır.
 BULGULAR
 Hareketli Faz Bileşimi ve Akış Hızının Kromatografik Parametrelere Etkisinin
İncelenmesi
 Uygun Hareketli Faz Bileşiminin Saptanması

•Glutatyonun ideal elüsyon/alıkonma zamanını belirle­mek için en uygun

asetonitril/asetat tampon karışımı­nı saptamak amacıyla, asetonitril oranları % 10,
% 20, % 30, % 40 ve % 50 arasında değişen beş farklı hareketli faz
hazırlanmıştır.Glutatyon standartı (0.5 mM), OPA ile türev­lendirildikten sonra 5’er
μL’lik hacimlerle kolona enjek­te edilmiştir. Her enjeksiyon sonrası kolonun
temizlenmesi ve dengelenmesi için hareketli faz akışına 15 dakika de­vam
edilmiştir. Glutatyon pikinin alıkonma zamanı, 1 mL/dakika akış hızında elde
edilen kromatogramlarda, 3–5 dakika arasında belirlenmiştir. Farklı hareketli faz
bileşim­lerinde elde edilen kromatografik parametre değerleri Tablo 1de
gösterilmektedir.
Tablo 1. Sabit akış hızında (1 ml/dak) farklı hareketli faz bileşimleri ile
elde edilen kromatografik parametre değerleri

Denemeler sonucunda elde edilen ayırıcılık değerleri formülden hesaplanır.

R = 2 (t2–t1) / (W1+W2)
 Uygun Hareketli Faz Akış Hızının Belirlenmesi
 Uygun asetonitril+asetat tampon oranı saptandıktan sonra en uygun hareketli faz akış
hızını belirlemek için, hareketli faz akış hızı 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, ve 0.9 ml/daki­ka
değerlerinde uygulanmıştır.

Tablo 2. Sabit hareketli faz bileşiminde (% 30 asetonitril+% 70 sodyum asetat) farklı akış
hızları ile elde edilen kromatografik parametre değerleri
Şekil 1. Sabit hareketli faz bileşiminde (% 30 asetonitril+ % 70 sodyum
asetat) 0.7 ml/dakika akış hızı ile alınan kromatogram
Şekil 2. Paket eritrosit için optimum kromatografik
koşullarda kayıt edilmiş kromatogram
 Standart Kalibrasyon Eğrisinin Hazırlanması
 Standart kalibrasyon eğ­risi için elde edilen korelasyon katsayısı (r) 0.996 olarak
bulunmuştur. Yapılan çalışmada 0.0156 mmol/L-2.00 mmol/L glutatyon derişimleri
arasında yöntemin lineer olduğu gö­rülmüştür.

Şekil 3. Glutatyon standartı ile alınan kromatogram

Şekil 4. Glutatyon standartı ile alınan kalibrasyon eğrisi
 Tekrarlanabilirlik Çalışması
 Gün-içi % Bağıl Standart Sapma (BSS), oksitlenmiş glutatyon(GSSG) için 11.78-18.34
arasında, indirgenmiş glutatyon(GSH) için 1.82-5.99 arasında bulundu.Günler-arası %
BSS oksitlenmiş için 21.68, indirgenmiş için ise % 4.80 olarak elde edilmiştir.

Tablo 3. Paket eritrosit havuzu ile gerçekleştirilen gün-içi/günler-arası çalışma sonuçları

HPLC’NİN YAYGIN UYGULAMALARI
 Fizyolojik örneklerdeki bazı aminoasit, nükleik asit ve protein miktarlarının tayini
 İlaç aktif maddelerinin, sentetik biyoürünlerin yada farmasötik ilaçlardaki bozunma
ürünlerinin tayini
 Pestisit ve insektisit ve diğer çevresel örneklerin tayini
 Karışımlardaki bileşenlerin ayrılması
 Kalite kontrolü
 Bir karışımdaki polimerlerin moleküler ağırlık dağılımının belirlenmesidir.
 HPLC tekniği ne kadar gelişmiş ve yaygın bir teknik olsada bazı sınırlamaları vardır:
 Bileşenlerin tanımlanması, bazı durumlarda kütle spektrometresi ile kombine
edilmemiş olan HPLC kullanıldığında yeterli olmayabilmektedir.
 Karmaşık örneklerde iyi çözünürlük sağlamak zor olabilmektedir.
 Aynı anda sadece bir örnek analizlenebilmektedir.
 SONUÇ
 HPLC bir çözücüde çözünebilen bütün maddelere uygundur. Bu
kromatografi türü, verilen bir numunedeki bileşenlerin hızla
ayrımına, ayrıca uçucu olmayan veya sıcaklıkla bozunan ve bu
nedenlerle gaz kromatografik tayinleri zorlukla gerçekleştirilen
maddelerin ayrımına da imkan tanır ve duyarlılığı yüksek, doğru
kantitatif tayinlere kolaylıkla uyarlanabilir olması sebebiyle
sanayinin, birçok bilim dalının ve halkın çok yakından ilgilendiği
maddelere geniş ölçüde uygulanabilir. Bundan dolayı HPLC
cihazlarının kullanılması, bir çok yöntemin cihazına göre daha
uygundur.HPLC cihazları uçucu olmayan türlere ve sıcaklıkla
kolayca bozunabilen türlerin ayrılmasında kullanılabilir
olduğundan dolayı pahalıdır; pahalı olmasına karşılık yılda bir
milyar dolar satışa sahip cihazlardır.
TEŞEKKÜRLER……