You are on page 1of 146

T.C.

MARMARA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BAL ÖRNEKLERİNDE ASETAMİPRİD KALINTISININ


ve BOZUNMA ÜRÜNÜNÜN TAYİNİ İÇİN YÖNTEM
GELİŞTİRİLMESİ

Oya TANÇ YETER


(Kimya Mühendisi, M.Sc.)

DOKTORA TEZİ
KİMYA ANABİLİM DALI
ANALİTİK KİMYA PROGRAMI

DANIŞMAN
Prof.Dr. Adnan AYDIN

İSTANBUL 2007
T.C.
MARMARA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BAL ÖRNEKLERİNDE ASETAMİPRİD KALINTISININ ve


BOZUNMA ÜRÜNÜNÜN TAYİNİ İÇİN YÖNTEM
GELİŞTİRİLMESİ

Oya TANÇ YETER


(Kimya Mühendisi, MSc.)
141200120020013

DOKTORA TEZİ
KİMYA ANABİLİM DALI
ANALİTİK KİMYA PROGRAMI

DANIŞMAN
Prof. Dr. Adnan AYDIN

İSTANBUL 2007
ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR)

Çalışmalarımdaki yardım ve desteği için danışman hocam Prof. Dr. Adnan AYDIN’a,
Adli Tıp Kurumu Başkanı Uz. Dr. Keramettin KURT’a,
Adli Tıp Kurumu Kimya Dairesi Başkanı Uz. Kimya Y.Müh. Faruk BİÇER’e,
Kimya Dairesi Araştırma ve Enstrümental Analiz Laboratuarı Şefi Uz. Kimya Y. Müh.
Zafer GÜRPINARLI’ya, çalışma arkadaşlarım Şenol, Mehmet ve Ayşegül’e,
Marmara Üniversitesi Kimya Bölümü araştırma görevlisi arkadaşlarım Soner ve İlhan’a,
Beni her zaman destekleyip cesaret veren aileme ve eşim Kürşat’a ,
teşekkür ederim.

Oya YETER

I
İÇİNDEKİLER

SAYFA
ÖNSÖZ ....................................................................................................... I
İÇİNDEKİLER .......................................................................................... II
ÖZET ......................................................................................................... V
ABSTRACT................................................................................................ VI
YENİLİK BEYANI ................................................................................... VII
SEMBOL LİSTESİ .................................................................................... VIII

KISALTMALAR........................................................................................ X
ŞEKİL LİSTESİ ......................................................................................... XII
TABLO LİSTESİ ....................................................................................... XXI
GRAFİK
LİSTESİ…..……………………………………………………XXIII
BÖLÜM I. GİRİŞ VE AMAÇ ................................................................... 1

BÖLÜM II. GENEL BÖLÜM ................................................................... 5


II.1. PESTİSİTLER………………………………………………………… 5
II.1.1. Pestisitlerin Kullanım alanlarına göre sınıflandırılması…… 5
II.1.2. Pestisitlerin Zararları…………………………………………… 7
II.1.2.1. Hedef Olmayan Organizmalar Üzerine Etkisi………… 7
II.1.2.2. İnsanlar Üzerine Etkileri ………………………………. 8
II.1.2.3. Çevre Üzerine Etkileri…………………………………… 9
II.1.2.4. Gıdaların Kontaminasyonu……………………………… 9

II
II.2. NEONİKOTİNOİD İNSEKTİSİTLER…………………………… 10
II.2.1. Asetamiprid………………………………………………………10
II.2.1.1. Toksikolojik Bulgular…………………………………... 12
II.2.1.2. Ekolojik Etkileri ve Çevredeki Durumu………………....12
II.2.1.3. Asetamipridin Bazı Önemli Bozunma Ürünleri…………15
II.3. BAL…………………………………………………………………16
II.4. KROMATOGRAFİ………………………………………………..18
II.4.1. Kromatografik Yöntemlerin Sınıflandırılması………….. 18
II.4.2 Kromatgrafide Kullanılan Uygulama Karakteristikleri… 20
II.4.3. Gaz Kromatografisi Cihazı……………………………… 25
II.4.4. Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi……………… 27
II.4.5. Kütle Spektrometride Numunenin İyonizasyonu……… 28
II.4.6. Kütle Analizörleri ………………………………………… 30

BÖLÜM III. TEZ ÇALIŞMALARI .......................................................... .32

III.1. ARAŞTIRMA ARAÇLARI ……………………………………… 32


III.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler……………………………… 32
III.1.2. Kullanılan Malzemeler ve Aparatlar……………………… 33
III.1.3. Kullanılan Cihazlar………………………………………… 33
III.1.4. Standart Çözeltilerin Hazırlanması………………………… 34
III.1.4.1. HPLC İçin Standart Asetamiprid Çözeltilerinin
Hazırlanması………………………………………… 34
III.1.4.2. GC-MS İçin Standart Asetamiprid Çözeltilerinin
Hazırlanması………………………………………… 36
III.1.5. Tampon Çözeltilerin Hazırlanması……………………….. 37

III.2. YAPILAN DENEYLER………………………………………… 37


III.2.1. HPLC Metodu Geliştirilmesi……………………………… 37
III.2.2. GC Metodu Geliştirilmesi…………………………………… 52
III.2.3. Ekstrakiyon Metodu Geliştirilmesi………………………… 57
III.2.3.1. Sıvı-Sıvı Ekstraksiyon (LLE)………………………….. 58
III.2.3.2. Katı Faz Ekstraksiyonu(SPE)…………………............. 61
III.2.4. Asetamiprid Kararlılığının İncelenmesi…………………… 64
III.2.4.1. Sulu Ortamda Asetamiprid Kararlılığının İncelenmesi…. 64
III.2.4.2. Balda Asetamiprid Kararlılığının İncelenmesi…………. 65

III
III.2.5. Bozunma Ürünleri Yapı Tayini……………………………… 65
III.2.6. Validasyon……………………………………………………. 66

III.2.6.1. Doğrusallık……………………………………………… 66
III.2.6.2. Geri Kazanım ..………………………………………… 67
III.2.6.3. Doğruluk ……………………………………………… 67
III.2.6.4. Kesinlik…..……………………………………………. 67
III.2.6.5. Tanıma ve Tayin Sınırları ……………………………. 68
III.2.6.6. Seçicilik……………………………………………….. 68
BÖLÜM IV. SONUÇLAR ......................................................................... 69
IV.1. EKSTRAKSİYON SONUÇLARI……………………………… 69
IV.2. SULU ORTAM SONUÇLARI………………………………… 70
IV.2.1. HPLC-DAD Sonuçları……………………………………. 70
IV.2.2. GC-EI-MS Sonuçları……………………………………… 78
IV.3. BAL ORTAMI SONUÇLARI………………………………… . 80
IV.3.1. HPLC-DAD Sonuçları…………………………………… . 81
IV.3.2. GC-EI-MS Sonuçları……………………………………... . 87
IV.4. BOZUNMA ÜRÜNLERİ YAPI TAYİNİ……………………….. 91
IV.4.1. IM-1-2 için GC-EI-MS Sonuçları…………………………. 91
IV.4.2. IM-1-2 için GC-CI-MS Sonuçları…………………………… 92
IV.4.3. IM-1-2 için NMR Sonuçları………………………………… 94
IV.4.5. IM-1-4 için GC-EI-MS Sonuçları…………………………. 95
IV.4.6. IM-1-4 için GC-CI-MS Sonuçları………………………… 97
IV.2.7. IM-1-4 için NMR Sonuçları……………………………… 98

BÖLÜM V. TARTIŞMA VE DEĞERLENDİRMELER ......................... 100


KAYNAKLAR............................................................................................ 114
EKLER ....................................................................................................... 102
EK.1. pH:2-9 tamponlarındaki asetamipridin 1. ve 60. gün HPLC
sonuçlarına ait kromatogramlar…………………………… 102
EK.2. pH:2-9 tamponlarındaki asetamipridin 1. ve 60. gün GC-MS
sonuçlarına ait kromatogramlar……………………………. 108
ÖZGEÇMİŞ................................................................................................ 122

IV
ÖZET

BAL ÖRNEKLERİNDE ASETAMİPRİD KALINTISININ ve


BOZUNMA ÜRÜNÜNÜN TAYİNİ İÇİN YÖNTEM
GELİŞTİRİLMESİ

Bal örneklerinde asetamiprid ((E)-N1-[(6-kloro-3-piridil)metil-N2-siyano-


N1-metil asetamidin) kalıntısı ve ana bozunma ürünü IM-1-2 ((E)-N2-karbamoil-Nı-
[(6-klloro-3-pridil)metil]-NI-metilasetamidin))’in tayini için analitik metot
geliştirildi. Asetamiprid içeren bal örnekleri diklormetan ile ekstrakte edildikten
sonra, asetamipridin ve onun ana bozunma ürününün tayini HPLC-DAD ile yapıldı.
Geliştirilen metodun tespit sınırı 0.07mgkg–1 ve tayin sınırı ise 0.10mgkg-1’dir.
Ortalama geri kazanım oranı % 96.95±2.59 (1.00 mgkg-1) ve %120±7.05 (0.10
mgkg-1) olarak hesaplandı.
Asetamipridin sulu ortamdaki kararlılığı pH:1.30-10.00 arasındaki tampon
çözeltilerde incelendi. Tampon çözeltilerdeki asetamiprid ve IM-1-2 miktarlarındaki
değişim 6 ay boyunca HPLC ile izlendi. Ayrıca örneklerdeki değişim GC-MS ile
kalitatif olarak da izlendi. 6 ay sonunda pH:1.30, 2.00, 9.00, 10.00’da asetamiprid
kademeli olarak bozundu. En yüksek bozunma oranı pH:10.00’da gözlendi. Oluşan
bozunma ürünleri GC-EI-MS, GC-PCI-MS ve NMR teknikleri ile IM-1-4 (N-metil-
(6-kloro-3-piridil)metilamin) ve IM-1-2 olarak tanımlandı.
Ayrıca asetamipridin değişik türdeki bal ortamlarındaki kararlılığı çalışıldı. ATP
ile kirletilen bal örnekleri 20, 30 ve 40oC’de tutularak, asetamiprid ve IM-1-2
miktarlarındaki değişim 6 ay boyunca HPLC-DAD ile izlendi. Örneklerdeki değişim
kalitatif olarak ayrıca GC-MS ile izlendi. Tampon çözeltilerdeki bozunma
ürünlerinin balda da meydana geldiği, bozunma ürünlerinin ve bozunma hızlarının
bal türüne bağlı olmadığı gözlendi.
Haziran 2007 Oya YETER

V
ABSTRACT

DEVELOPMENT OF THE ANALYSIS METHOD FOR


ACETAMIPRID RESIDUE AND ITS DEGRADATION PRODUCT
IN HONEY SAMPLES

Analytical method was developed to determine the residues of acetamiprid ((E)-


N -[(6-chloro-3-pridyl) methyl-N2-siyano-N1-methylacetamidin) and main
1

degradation product IM-1-2 ((E)-N2-carbamoyl-Nı-[(6-chloro-3-pridyl)methyl]-NI-


methyl acetamidin) in honey samples. Honey samples are extracted by dichlormetane
and then, the determination of ATP and IM-1-2 are performed by HPLC-DAD. Limit
of detection and quantification for the method are 0.07mgkg–1, 0.10mgkg-1
respectively. The average recovery was calculated as % 96.95±2.59 (1.00 mgkg-1)
and %120±7.05 (0.10 mgkg-1).
The stability of the ATP was investigated in buffer solutions with a pH range
between 1.30 and 10.00, with HPLC-DAD quantitative and GC-MS qualitatively, for
a period of 6 months. The degradation of the ATP was observed in the solutions with
pH’s 1.30, 2.00, 9.00 and 10.00. The highest degradation rate was observed in the
solution with a pH of 10.00. The degradation products were identified as IM-1-4 (N-
methyl-(6-chloro-3-prydil)methylamine) and IM-1-2 by GC-EI-MS, GC-PCI-MS
and NMR.
The stability of the ATP in the different type honey samples was also
investigated. It was observed that the degradation product of the ATP did not change
with the type of honey.

June 2007 Oya YETER

VI
YENİLİK BEYANI

BAL ÖRNEKLERİNDE ASETAMİPRİD KALINTISININ ve


BOZUNMA ÜRÜNÜNÜN TAYİNİ İÇİN YÖNTEM
GELİŞTİRİLMESİ

Bu çalışmada, balda asetamiprid kalıntısı ve ana bozunma ürününün (IM-1-2)


tayini için doğru, güvenilir, hızlı ve yeni bir metot geliştirildi. Balda asetamiprid
kalıntısı tayini ile ilgili literatürde iki çalışma olmasına rağmen, balda asetamiprid ve
ana bozunma ürününün birlikte analizi ile ilgili bir çalışmaya rastlanmadı.
Çalışmanın ikinci aşaması ise balda asetamipridin kararlılığının belirlenmesi idi.
Bu amaçla öncelikle asetamipridin sulu ortamdaki kararlılığı incelendi. Zamana bağlı
olarak farklı pH tamponlarında asetamipridin değişimi incelendiğinde, pH: 1.30,
2.00, 9.00 ve 10.00 da bozunma meydana geldiği görüldü. 6 aylık izleme sonunda,
asetamiprid miktarının pH:2.00’de % 8.00, pH:9.00’da % 17.00, pH:1.30’de %
66.00, pH:10.00’da %99.50 oranında azaldığı tespit edildi. pH: 3.00, 4.00, 5.00,
6.00, 7.00 ve 8.00’de anlamlı bir değişim görülmedi. Asetamiprid miktarındaki en
hızlı ve en fazla değişim pH:10’da gerçekleşti. Bozunma gözlenen çözeltilerde IM-1-
4 (N-metil-(6-kloro-3-piridil)metilamin) ve IM-1-2 ((E)-N2-karbamoil-Nı-[(6-klloro-
3-pridil)metil]-NI-metilasetamidin))kod numaralı bozunma ürünlerinin meydana
geldiği tespit edildi. Bu ürünlerden IM-1-2, asetamiprid ile birlikte kantitatif olarak
tayin edildi.
Bal ortamında asetamipridin kararlılığının incelenmesi için bala asetamiprid
ilave edilerek 20, 30 ve 40oC’de bekletildi. Tüm sıcaklıklarda 6 ayın sonunda
asetamiprid miktarı yaklaşık olarak % 47 oranında azaldı. Bal örneklerinde IM-1-2
ve IM-1-4 kod numaralı bozunma ürünleri oluştuğu tespit edildi.
Haziran 2007 Prof. Dr. Adnan AYDIN Oya YETER

VII
SEMBOL LİSTESİ

o
C : Santigrat derece.
pKa : Asitlik sabitinin negatif logaritması.
mm Hg : Basınç birimi.
mg : miligram.
L : Litre
pH : Hidrojen iyonun konsantrasyonunun negatif logaritması.

CS : Çözünenin durgun fazdaki analitik konsantrasyonu

CM : Çözünenin hareketli fazdaki analitik konsantrasyonu

tR : Kromatografide çözünenin alıkonma zamanı.


tM : Kromatografide durgun fazda hiç tutulmayan bir türün alıkonma zamanı.
kı : kapasite faktörü.
α : Seçicilik faktörü.

H: Plaka yüksekliği.

L: Kolon uzunluğu.

N : Teorik plaka sayısı.

W1/2 : Kromatografik pikin yarı yüksekliğindeki genişliği.

A, B, C : Bant genişlemesine etki eden faktörler.

u : Hareketli fazın ortalama hızı.

R : Çözünürlük (Resolution)

µl : Mikrolitre

Torr : Basınç birimi.

eV : Elektron Volt.

VIII
ml : Mililitre

g : gram.

λ: Dalga boyu

ppm : Milyonda bir kısım.

ppb: Milyarda bir kısım.

mg : Miligram.

r2 : Tayin faktörü

δ : Kimyasal kayma.

r : Regresyon katsayısı

IX
KISALTMALAR

CAS : Chemical Abstracts Service


EPA : Çevre Koruma İdaresi
SPME : Katı faz mikro ekstraksiyon.
GC-ECD : Gaz kromatografisi elektron yakalama dedektörü.
LLE : Sıvı-sıvı ekstraksiyon.
SPE : Katı faz ekstraksiyonu.
HPLC : Yüksek performanslı sıvı kromatografisi.

TCD : Termal iletkenlik dedektörü.

FID : Alev iyonizasyon dedektörü.


ECD : Elektron yakalama dedektörü.
NPD : Azot-fosfor dedektörü.
GC-MS : Gaz kromatografisi kütle spektrometrisi
EI-MS :Elektron çarpma kütle spektrometrisi
CI-MS : Kimyasal iyonizasyon kütle spektrometrisi.
V: Alternatif akım voltajı.
ms : Milisaniye
DAD : Diyod serili dedektör.
UV-VIS : Ultra viyole görünür bölge spektrofotometri.
NMR : Nükleer manyetik rezonans.
ACN : Asetonitril.
HAc: Asetik asit.
SD: Standart sapma.
RSD: Bağıl standart sapma.
RSDr : Tekrarlanabilirlik için bağıl standart sapma.
RSDR : Yenidenüretilebilirlik için bağıl standart sapma.

X
LOD : Tespit sınırı.
LOQ : Tayin sınırı.
ATP : Asetamiprid.
IM-1-4 : N-metil-(6-kloro-3-piridil)metil]-metilamin.
IM-1-2 : (E)-N2-karbamoil-Nı-[(6-kloro-3-piridil)metil]-Nı-metilasetamidin
PCI : Pozitif kimyasal iyonizasyon

XI
ŞEKİL LİSTESİ

SAYFA NO

Şekil II.1. Asetamipridin kimyasal yapısı………………………………….......... 11

Şekil II.2. Asetamipridin bazı bozunma ürünlerinin kimyasal yapısı……………. 15

Şekil II.3. tR ,tM terimlerinin gösterildiği kromatogram………………………….. 20

Şekil II.4. Kromatografik kolon ve var olduğu kabul edilen teorik plakalar......... 21

Şekil II.5. Van Deemter Grafiği……………………………………………......... 23

Şekil II.6. Çeşitli taşıyıcı gazlar ile elde edilen HETP değerleri………………… 23

Şekil II.7. Sıvı kromatografide hareketli fazın hızının plaka yüksekliğine etkisi.. . 24

Şekil II.8. Gaz kromatografisi cihazı……………………………………………. 26

Şekil II.9. Bir Kütle Spektrometrenin Bileşenleri…………………………… ….. 28

Şekil II.10. Elektron-impakt kaynağının yapısı………………………………….. 29

Şekil II.11. Kuadrupol kütle analizörü……………………………………………. 31

Şekil III.1. Akış Hızı: 1ml/dakika, kolon: LiRP8-5-3931 (250mmx4.6mm,5mikron,


HiChrom), enjeksiyon hacmi:10µl, sıcaklık: 50oC, λ: 245, 254, 268nm,
270nm koşullarında elde edilen kromatogram…..…………………… 39
Şekil III.2. Mobil Faz: Metanol:KH2PO4 (0.05M) (60:40,v/v), kolon: LiRP8-5-3931
(250mmx 4.6mm, 5mikron, HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon
hacmi: 10µl, sıcaklık: 50oC, λ: 245, 254, 268 ve 270nm koşullarında elde
edilen kromatogram………………………………………………….. 40

Şekil III.3. Mobil faz: Metanol:KH2PO4 (0.05M),(70:30,v/v), akış hızı: 1ml/dakika,


kolon: LiRP8-5-3931(250mmx4.6mm, 5mikron, HiChrom), enjeksiyon
hacmi:10µl, sıcaklık : 50oC, λ: 245, 254, 268, 270nm koşullarında elde
edilen kromatogram……………………………………..……………. 40

XII
Şekil III.4. Mobil Faz:Su, akış hızı: 1ml/dakika, kolon: LiRP8-5-31 (250mmx
4.6mm,5mikron, HiChrom), enjeksiyon hacmi: 50µl, sıcaklık:25oC,
λ:248 nm koşullarında elde edilen kromatogram.…………………. 41
Şekil III.5. Mobil Faz:Su-Metanol(75:25), akış hızı:1ml/dakika, kolon:LiRP8-5-
3931(250mmx4.6mm,5mikron, HiChrom), enjeksiyon hacmi:50µl,
sıcaklık:25oC, λ:248 nm koşullarında elde edilen kromatogram... .. 41

Şekil III.6. Mobil Faz:Su-Metanol(50:50), akış hızı:1ml/dakika, kolon:LiRP8-5-


3931(250mmx4.6mm,5mikron,HiChrom), enjeksiyon hacmi:50µl,
sıcaklık: 25oC, λ: 248 nm koşullarında elde edilen kromatogram…. 42

Şekil III.7. Mobil Faz :Su-Metanol (25:75) ,akış hızı : 1ml/dakika, kolon: LiRP8-5
-3931(250mmx4.6mm, 5mikron, HiChrom) , enjeksiyon hacmi:50µl,
sıcaklık: 25oC, λ: 248 nm koşullarında elde edilen kromatogram…… 42

Şekil III.8. Mobil Faz :Metanol , akış hızı : 1ml/dakika, kolon: LiRP8-5-3931
(250mmx4.6mm,5mikron,HiChrom), enjeksiyon hacmi:50µl sıcaklık:
25oC, λ: 248 nm koşullarında elde edilen kromatogram…………… 43

Şekil III.9. Mobil Faz:Metanol:Su (50:50), akış hızı : 1ml/dakika, kolon: LiRP18-5-
4623(250mmx4.6mm,5mikron,HiChrom), enjeksiyon hacmi:10µl, sıcaklık:
40oC, λ: 245, 254, 268nm koşullarında elde edilen kromatogram…….. 43
Şekil III.10. Mobil Faz : Metanol:Su(50:50), kolon:LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm,
5mikron,HiChrom),akış hızı:1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:20µl, sıcaklık:
40oC, λ: 245, 254, 268nm koşullarında elde edilen kromatogram…… 44
Şekil III.11. Mobil Faz:Metanol:Su(50:50), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm,
5mikron,HiChrom) , akış hızı: 1ml/dakika , Enjeksiyon Hacmi : 50µl,
sıcaklık: 40oC, dalga boyları: 245, 254, 268nm koşullarında elde edilen
kromatogram………………………………………….………………. 44

Şekil III.12.Mobil Faz :Metanol:Su (50:50), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm,


5mikron,HiChrom), akış hızı:1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:50µl, sıcaklık:
50oC, λ: 245, 254, 268nm koşullarında elde edilen kromatogram…….... 45

Şekil III.13. Mobil Faz: Metanol(%0.01 HAc):SU(%0.01HAc), (50:50,v/v), kolon:


LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm,5mikron,HiChrom),akış hızı:1ml/dakika
enjeksiyon hacmi: 10µl, sıcaklık: 40oC, λ: 245, 254,268nm koşullarında
elde edilen kromatogram………………………………………………. 45

XIII
Şekil III.14. Mobil Faz: Metanol (%0.01 HAc) : SU (%0.01HAc), (50:50,v/v),
kolon:LiRP18-5-4623 (250mmx4.6mm, 5mikron, HiChrom), akış
hızı:1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:50µl, sıcaklık: 40oC, λ:245,248,
254nm koşullarında elde edilen kromatogram………………….. 46

Şekil III.15. Mobil Faz: Metanol(%0.01 HAc):SU(%0.01HAc), (70:30,v/v), kolon:


LiRP18-5-4623 (250mmx4.6mm, 5mikron, HiChrom), akış hızı:1ml/dak.
enjeksiyon hacmi:50µl, sıcaklık: 40oC, λ: 245, 254,268nm koşullarında
elde edilen kromatogram…………………………………………….. 46
Şekil III.16. Mobil Faz: Metanol(%0.01 HAc):SU(%0.01HAc), (80:20,v/v),
kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm, 5mikron, HiChrom),
akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:50µl, sıcaklık: 40oC,
λ:245, 254, 268nm koşullarında elde edilen kromatogram……..… 47
Şekil III.17. Mobil Faz:ACN:SU (60:40,v/v),kolon: LiRP18-5-4623 (250mmx
4.6mm,5mikron,HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:
10µl, sıcaklık :50oC, λ: 245, 248, 254nm koşullarında elde edilen
kromatogram…………………………………………………….….. 47
Şekil III.18. Mobil Faz: ACN:SU (50:50,v/v, kolon: LiRP18-5-623(250mmx4.6mm,
5mikron, HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:10µl,
sıcaklık : 50oC, λ: 245, 248, 254nm koşullarında elde edilen
kromatogram....................................................................................... 48
Şekil III.19. Mobil Faz:ACN:SU(40:60,v/v), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm,
5mikron,HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:10µl,
sıcaklık : 50oC, λ: 245, 248, 254nm koşullarında elde edilen
kromatogram………………………………………………………... 48
Şekil III.20.Mobil Faz:ACN:SU (30:70,v/v), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm,
5mikron,HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi: 10µl,
sıcaklık : 50oC, λ: 245, 248, 254nm koşullarında elde edilen koşullarında
elde edilen kromatogram ……………………………………………. 49
Şekil III.21. Mobil Faz: ACN (%0.02HAc) : SU (%0.02HAc), (50:50,v/v,
kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm, 5mikron, HiChrom),
akış hızı:1ml/dakika, enjeksiyon hacmi: 50µl, sıcaklık: 40oC,
λ: 245, 248, 254nm koşullarında elde edilen kromatogram………… 49

XIV
Şekil III.22. Mobil Faz: ACN (%0.04HAc): SU (%0.04HAc), (50:50,v/v),
kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm,5mikron,HiChrom), akış
hızı:1ml/dakika, enjeksiyon hacmi: 50µl, sıcaklık : 40oC, λ: 245, 254,
268nm koşullarında elde edilen kromatogram……………………. 50
Şekil III.23. Mobil Faz:ACN:SU(50:50,v/v), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4.6mm,
5mikron,HiChrom) , akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi: 50µl,
sıcaklık : 65oC, λ: 245nm, 248nm, 254nm koşullarında elde edilen
kromatogram…………………………………...…………………… 50
Şekil III.24. Mobil Faz:ACN:SU (50:50,v/v), kolon: Sinergy 44 MAX-RP 80A
(250mmx4.6mm,4mikron, Phenomenex ), akış hızı: 1ml/dakika,
enjeksiyon hacmi: 50µl, sıcaklık : 40oC, λ: 245, 248, 254nm……… 51
Şekil III.25. Kolon: HP-5-MS (30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:
300oC, Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dk.),20 oC /dk. hız ile
300 oC (2 dk.), Akış Hızı: 1ml/dakika, Enjeksiyon Hacmi: 1µl,
splitless, Dedektör: NPD koşullarında elde edilen kromatogram….. 52
Şekil III.26. Kolon: HP-5-MS (30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dk.),20 oC /dk. hız ile 300 oC
(2 dk.), Basınç programı:110kPa (2dk.), 10kPa/dk. Hızla 200kPa
(2 dk.), Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless, Dedektör: NPD, koşullarında
elde edilen kromatogram...................................................................... 53
Şekil III.27. Kolon: HP-5-MS (30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:
300oC, Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dk.),20 oC /dk. hız ile
300 oC (2 dk.), Akış Hızı: 2ml/dk. Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless,
Dedektör: NPD, koşullarında elde edilen kromatogram....................... 53
Şekil III.28. Kolon: HP-5-MS (30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:
300oC, Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dk.), 20 oC /dk. hız ile
300 oC (2 dk.), Akış Hızı: 2ml/dk. Enjeksiyon Hacmi: 2µl, splitless,
Dedektör: NPD, koşullarında elde edilen kromatogram....................... 54
Şekil III.29. Kolon: HP-5-MS (30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı:100 oC (2 dk.), 20 oC /dk. hızla 300 oC (2 dk.),
Akış Hızı: 2ml/dk., Enjeksiyon Hacmi: 4µl, splitless, Dedektör: NPD,
koşullarında elde edilen kromatogram................................................... 54

XV
Şekil III.30. Kolon: DB1701(30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı: 300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı:100oC (2 dk.),20 oC /dk. hız ile 300 oC (2dk.),
Akış Hızı: 1ml/dk., Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless, Dedektör: ECD.
koşullarında elde edilen kromatogram.................................................. 55
Şekil III.31. Kolon: HP-5-MS (30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı: 300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dk.),20 oC /dk. hız ile 300 oC
(2dk.), Akış Hızı: 1ml/dk. Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless, Dedektör:
MSD, Arayüz Sıcaklığı: 300 oC, İyonizasyon Enerjisi: 70 eV, Kütle
Analizörü: EI, Scan, koşullarında elde edilen total iyon kromatogramı ve
kütle spektrumu....................................................................................... 55
Şekil III.32.Kolon: HP-5-MS (30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı: 300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 70 oC (3.5dk.),50 oC /dk. hız ile 300 oC (7dk),
Akış Hızı: 1ml/dk. Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless, Arayüz Sıcaklığı:
300 oC, İyonizasyon Enerjisi: 70 eV, Kütle Analizörü: EI, Scan,
koşullarında elde edilen kromatogram ve kütle spektrumu.................. 56
Şekil III.33.Kolon: HP-5-MS (30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı: 280oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 70 oC (3.5 dk.),50 oC /dk. hız ile 300 oC (7dk)
Akış Hızı: 1ml/dk. Enjeksiyon Hacmi: 2µl, pulsed splitless, Arayüz
Sıcaklığı: 300 oC, İyonizasyon Enerjisi:70 eV, Kütle Analizörü: EI, Scan
koşullarında elde edilen kromatogram................................................... 56
Şekil III.34. Kolon: HP-5-MS (30mx0.25mmx0.25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı:100 oC (2 dk.), 20 oC /dk. hızla
300 oC (2dk), Akış Hızı: 1ml/dk. Enjeksiyon Hacmi: 1µl, pulsed
splitless, Arayüz Sıcaklığı: 300 oC, İyonizasyon Enerjisi: 70 eV, Kütle
Analizörü: EI, SIM(m/z; 152,126 ), koşullarında elde edilen
kromatogram ve kütle spektrum............................................................ 57
Şekil III.35. Sudan diklormetan ile eksrakte edilen asetamipridin(1ppm) HPLC
kromatogramı........................................................................................ 58
Şekil III.36. Sudan heksan ile eksrakte edilen asetamipridin (1ppm) HPLC
kromatogramı........................................................................................ 58
Şekil III.37. Sudan etil asetat ile eksrakte edilen asetamipridin (1ppm) HPLC
kromatogramı......................................................................................... 59

XVI
Şekil III.38. Sudan diklormetan:heptan(50:50) çözeltisi ile ekstrakte edilen
asetamipridin (1ppm) HPLC kromatogramı........................................ 59
Şekil III.39. Baldan heksan ile ekstrakte edilen asetamipridin (1ppm) HPLC
kromatogramı......................................................................................... 69
Şekil III.40. Baldan etilasetat ile eksrakte edilen asetamipridin (1ppm) HPLC
kromatogramı......................................................................................... 60
Şekil III.41. Baldan diklormetan ile ekstrakte edilen asetamipridin(1ppm) HPLC
kromatogramı........................................................................................ 60
Şekil III.42. Baldan diklormetan ile eksrakte edilen asetamipridin(100ppb) HPLC
kromatogramı........................................................................................ 60
Şekil III.43. Baldan diklormetan:heptan karışımı ile eksrakte edilen asetamipridin
(1ppm) HPLC kromatogramı.................................................................. 61
Şekil III.44. ODS-C18 kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamiprid (1ppm)
(%60’lık metanol, geri kazanım %85.30) HPLC kromatogramı............. 62
Şekil III.45. ODS-C18 kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin(1ppm)
(%80 ile metanol, geri kazanım %91.23) HPLC kromatogramı........... 62
Şekil III.46. Oasis HLB kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin (1ppm)
(%60’lık metanol, geri kazanım %76.35) HPLC kromatogramı......... 62
Şekil III.47. Oasis HLB kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin (1ppm)
(%80’lik , geri kazanım %95.98), HPLC kromatogramı........................ 63
Şekil III.48. Strata C18-E kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin(1ppm)
(%60’lık metanol, geri kazanım %76.45), HPLC kromatogramı........ 63
Şekil III.49. Strata C18-E kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin (1ppm)
(%80’lik metanol, geri kazanım %95.60), HPLC kromatogramı........... 63
Şekil III.50. Asetamiprid içermeyen diklormetan ile ekstrakte edilmiş bal örneğinin
HPLC kromatogramı............................................................................... 68
Şekil IV.1. Asetamiprid UV spektrumu (ACN-SU; 50:50)...................................... 71
Şekil IV.2. pH:1 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün sonundaki
HPLC sonucu...................................................................................... 76
Şekil IV.3. pH:10 tampon çözeltideki asetamipridin 1.gün sonundaki
HPLC sonucu....................................................................................... 76
Şekil IV.4. pH:1 tampon çözeltideki asetamipridin 60 gün sonundaki
HPLC sonucu...................................................................................... 77

XVII
Şekil IV.5. pH:10 tampon çözeltideki asetamipridin 60 gün sonundaki
HPLC sonucu........................................................................................ 77
Şekil IV.6. pH:1.3, 2, 8, 9 ve 10 tampon çözeltilerinde 60.gün Rt:3.49’daki pikin
UV-spektrumu.................................................................................... 78
Şekil IV.7. pH:1.3 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün sonundaki
GC-MS kromatogramı........................................................................ 78
Şekil IV.8. pH:10 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün sonundaki GC-MS
kromatogramı........................................................................................ 79
Şekil IV.9. pH:1.3 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün sonundaki GC-MS
kromatogramı......................................................................................... 79
Şekil IV.10. pH:10 tampon çözeltideki asetamipridin 360. gün sonundaki
GC-MS kromatogramı.......................................................................... 79
Şekil IV.11. pH:10 tampondaki asetamiprid çözeltisinde 60. güne ait GC-MS
kromatogramında 7.82. dakikada gözlenen maddenin kütle spektrumu. 80
Şekil IV.12. pH:10 tampondaki asetamiprid çözeltisinde 60. güne ait GC-MS
kromatogramında 6.73. dakikada gözlenen maddenin kütle spektrumu. 80
Şekil IV.13. 20oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün HPLC
kromatogramı........................................................................................ 84
Şekil IV.14. 30oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün HPLC
kromatogramı....................................................................................... 84

Şekil IV.15. 40oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün HPLC
kromatogramı..................................................................................... 85
o
Şekil IV.16. 20 C’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 150. gün HPLC
kromatogramı………………………………………………………… 85
Şekil IV.17. 30oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 150. gün
HPLC kromatogramı………………………………………………… 86
Şekil IV.18. 40oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 150. gün
HPLC kromatogramı………………………………………………….. 86
Şekil IV.19. 20oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR :9.54) kütle spektrumu.................... 87
Şekil IV.20. 30oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR:9.50)kütle spektrumu……………. 87

XVIII
Şekil IV.21. 40oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR:9.50) kütle spektrumu…………… 88
o
Şekil IV.22. 20 C de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin son. gün
GC-MS kromatogramı ve asetamipridin (tR:9.53) kütle spektrumu……. 88
Şekil IV.23. 20oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin sonun. gün GC-MS
(seçilmiş iyon (198,155,141)) kromatogramı ve tR:7.82’de gözlenen
bozunma ürününün kütle spektrumu………………………………… 88
o
Şekil IV.24. 20 C de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün
GC-MS (seçilmiş iyon (114,126 ve 155)) kromatogramı ve tR:6.74’de
gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu..……………………… 89
Şekil IV.25. 30oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin son gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR:9.53) kütle spektrumu…………… 89
Şekil IV.26. 30oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin son gün GC-MS
(seçilmiş iyon (198,155,141)) kromatogramı ve tR:7.82’de ki bozunma
ürününün kütle spektrumu……………………………………………. 89
Şekil IV.27. 30oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin son gün GC-MS
(seçilmiş iyon (114,126 ve 155)) kromatogramı ve tR:6.74’de gözlenen
bozunma ürününün kütle spektrumu……………………………….. 90
Şekil IV.28. 40oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin son gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR:9.53) kütle spektrumu…………… 90
Şekil IV.29. 40oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin son gün GC-MS
(seçilmiş iyon (198,155,141) kromatogramı ve (tR:7.82)’de gözlenen
bozunma ürününün kütle spektrumu………………………………… 90
o
Şekil IV.30. 40 C de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin son gün GC-MS
(seçilmiş iyon (114,126 ve 155)) kromatogramı ve (tR:6.74)’de gözlenen
bozunma ürününün kütle spektrumu……………………………… 92
Şekil IV.31. pH:10 tampondaki asetamipridin 360 gün GC-EI-MS kromatogramı ve
(tR:7.82)’de gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu…………. 92
Şekil IV.32.pH:10 tampondaki asetamipridin 360.gün GC-PCI-MS kromatogramı ve
(tR:7.82)’de gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (70eV)… 93
Şekil IV.33.pH:10 tampondaki asetamipridin 360.gün GC-PCI-MS kromatogramı ve
(tR:7.82)’de gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (50eV)… 93
Şekil IV.34.pH:10 tampondaki asetamipridin 360.gün GC-PCI-MS kromatogramı ve
(tR:7.82)’de gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (30eV)… 94

XIX
Şekil IV.35. IM-1-2’nin parçalanması…………………………………………… 94
Şekil IV.36. IM-1-2 nolu bozunma ürününün 1H-NMR spektrumu.…………… 95
Şekil IV.37. Asetamipridden sentezlenen IM-1-4 bileşiğinin GC-EI-MS
kromatogramı ve kütle spektrumu………………………………… 96
Şekil IV.38. IM-1-4’ün parçalanması…………………………………………… 96
Şekil IV.39. pH:10 tamponda(360.gün) GC-EI-MS kromatogramında (tR:6.73)’de
gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu……………………… 97
Şekil IV.40. pH:10 tamponda(360.gün) GC-EI-MS kromatogramında (tR:6.73)’de
gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (70eV)………………. 97
Şekil IV.41. pH:10 tamponda(360.gün) GC-EI-MS kromatogramında (tR:6.73)’de
gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (50eV)………………. 98
Şekil IV.42. pH:10 tamponda(360.gün) GC-EI-MS kromatogramında (tR:6.73)’de
gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (30eV)………………. 98
Şekil IV.43. IM-1-2 nolu bozunma ürününün 1H-NMR spektrumu…………… 99

XX
TABLO LİSTESİ

SAYFA NO
Tablo II.1. Avrupa Birliği ülkelerinde bazı gıda maddelerinde
izin verilen maksimum asetamiprid kalıntısı düzeyleri……………...14
Tablo II.2. Kolon kromatografisi metotlarının sınıflandırılması…………………18
Tablo III.1. Şekil III.1 için kromatografik bulgular…………………………….. 39
Tablo III.2. Şekil III.2 için kromatografik bulgular…………………………….. 40
Tablo III.3. Şekil III.3 için kromatografik bulgular……………………………… 40
Tablo III.4. Şekil III.4. için kromatografik bulgular……………………………. 41
Tablo III.5. Şekil III.5. için kromatografik bulgular…………………………….. 41
Tablo III.6. Şekil III.6. için kromatografik bulgular……………………………. 42
Tablo III.7. Şekil III.7 için kromatografik bulgular……………………………. 42
Tablo III.8. Şekil III.8. için kromatografik bulgular…………………………… 43
Tablo III.9. Şekil III.9. için kromatografik bulgular…………………………… 43
Tablo III.10. Şekil III.10. için kromatografik bulgular…………………………. 44
Tablo III.11. Şekil III.11. için kromatografik bulgular…………………………. 44
Tablo III.12. Şekil III.12. için kromatografik bulgular…………………………. 45
Tablo III.13. Şekil III.13. için kromatografik bulgular………………………….. 45
Tablo III.14. Şekil III.14. için kromatografik bulgular…………………………. 46
Tablo III.15. Şekil III.15. için kromatografik bulgular………………………… 46
Tablo III.16. Şekil III.16. için kromatografik bulgular………………………… 47
Tablo III.17. Şekil III.17. için kromatografik bulgular………………………… 47
Tablo III.18. Şekil III.18. için kromatografik bulgular………………………… 48
Tablo III.19. Şekil III.19. için kromatografik bulgular………………………… 48
Tablo III.20. Şekil III.20. için kromatografik bulgular………………………… 49
Tablo III.21. Şekil III.21. için kromatografik bulgular………………………… 49
Tablo III.22. Şekil III.22. için kromatografik bulgular………………………… 50
Tablo III.23. Şekil III.23. için kromatografik bulgular…………………………50
Tablo III.24. Şekil III.24. için kromatografik bulgular…………………………51
Tablo III.25. Şekil III.25. için kromatografik bulgular…………………………52
Tablo III.26. Şekil III.26. için kromatografik bulgular…………………………53

XXI
Tablo III.27. Şekil III.27. için kromatografik bulgular…………………………53
Tablo III.28. Şekil III.28. için kromatografik bulgular…………………………54
Tablo III.29. Şekil III.29. için kromatografik bulgular…………………………54
Tablo III.30. Şekil III.30. için kromatografik bulgular…………………………55
Tablo III.31. Şekil III.31. için kromatografik bulgular…………………………55
Tablo III.32. Şekil III.32. için kromatografik bulgular…………………………56
Tablo III.33. Şekil III.33. için kromatografik bulgular…………………………56
Tablo III.34. Şekil III.34. için kromatografik bulgular…………………………57
Tablo III.35. Ekstraksiyon yöntemlerinin geri kazanımlarının karşılaştırılması…64
Tablo III.36. 0.1 ve 1.0 mgkg-1 düzeyinde kirletilen bal örneklerinin geri kazanım
(%), tekrarlanabilirlik (RSDr), yenidenüretilebilirlik (RDSR) ve
doğruluk değerleri (n=6)…………………………………….......... 68
Tablo IV.1. Çalışılan ekstraksiyon yöntemlerinin geri kazanımları sonuçları…..69
Tablo IV.2. pH:1.3-10 arasındaki tampon çözeltilerde asetamiprid miktarındaki
değişim……………………………………………………………… 70
Tablo IV.3. pH:1.3-10 arasındaki tampon çözeltilerde bozunma ürünü IM-1-2
(µg/ml) miktarındaki değişim……………………………………… 71
Tablo IV.4. 100mgkg-1 düzeyinde asetamiprid ile kirletilen bal örnekleri sonuçları,
standart sapma ve bağıl standart sapma değerleri…………………… 81
Tablo IV.5. 20,30 ve 40oC de bekletilen bal örneklerindeki asetamiprid
miktarındaki değişim……………………………………………… 81
Tablo IV.6. 20,30 ve 40oC de bekletilen çiçek balı örneğindeki asetamiprid
miktarındaki değişim…………………………………………………82
Tablo IV.7. 20,30 ve 40oC de bekletilen çam balı örneğindeki asetamiprid
miktarındaki değişim……………………………………………….. 83
Tablo IV.8. 20,30 ve 40oC de bekletilen kestane balı örneğindeki asetamiprid
miktarındaki değişim…………………………………………………. 83
Tablo IV.9. 20, 30 ve 40oC de bekletilen ayçiçeği balı örneğindeki asetamiprid
miktarındaki değişim………………………………………………. 84
Tablo IV.10. 20, 30 ve 40oC de bekletilen ayçiçeği balı örneğindeki asetamiprid
miktarındaki değişim.

XXII
GRAFİK LİSTESİ

SAYFA NO
Grafik III.1. Asetamiprid için 1-1000ng/ml arasında doğrusal aralık.……........ 66
Grafik IV.1. pH:9 tampon çözeltide zamana bağlı olarak bozunmöa ürünü IM-1-2
miktarındaki değişim………………………………………………... 72
Grafik IV.2. pH:10 tampon çözeltide zamana bağlı olarak bozunmöa ürünü IM-1-2
miktarındaki değişim……………………………………………… 72
Grafik IV.3. pH:1.3 tampon çözeltide 14.günden itibaren görülmeye başlayan 3,45.
dakikada gözlenen bozunma ürünü (IM-1-2) alanı ile asetamiprid alan
oranlarının 60 gün süreyle zamana bağlı değişimi……………………. 73
Grafik IV.4. pH:8 tampon çözeltide 7.günden itibaren görülmeye başlayan
3.45. dakikada görülen bozunma ürünü (IM-1-2) alanı ile asetamiprid alan
oranlarının 60 gün süreyle zamana bağlı değişimi…………………… 73
Grafik IV.5. pH:9 tampon çözeltide 4.günden itibaren görülmeye başlayan 3.45.
dakikada görülen bozunma ürünü (IM-1-2) alanı ile asetamiprid alan
oranlarının 60 gün süreyle zamana bağlı değişimi……………………. 74
Grafik IV.6. pH:10 tampon çözeltide 3.günden itibaren görülmeye başlayan
3.45. dakikada görülen bozunma ürünü (IM-1-2) alanı ile asetamiprid alan
oranlarının 60 gün süreyle zamana bağlı değişimi…………………… 74
Grafik IV.7. pH:1.3-10 arasındaki tampon çözeltilerde asetamipridin miktarındaki
değişim……………………………………………………………… 75
Grafik IV.8. pH: 9 ve 10 tampon çözeltilerinde zamana bağlı olarak asetamipridin
miktarındaki değişim……………………………………………… 75
Grafik IV.9. 20oC’de bekletilen farklı tür balların asetamiprid miktarındaki
değişim……………………………………………………………… 84
Grafik IV.10.: 30oC’de bekletilen farklı tür balların asetamiprid miktarındaki
değişim…………………………………………………………….. 84
Grafik IV11.: 40oC’de bekletilen farklı tür balların asetamiprid miktarındaki
değişim……………………………………………………………. 84

XXIII
BÖLÜM I

GİRİŞ ve AMAÇ

Ürünü hastalıkların, böceklerin, yabancı otların ve diğer zararlıların etkilerinden


ekonomik ölçüler içinde koruyarak kayıpları en aza indirmek, kaliteyi yükseltmek
tarımsal mücadelenin ana amacıdır. Tarımsal mücadele her ne kadar değişik
yöntemler içermekteyse de, çoğunlukla pestisit genel adıyla bilinen tarım ilaçlarının
uygulandığı kimyasal yöntemlerdir. Bu nedenle tarımsal mücadele denildiğinde akla
kimyasal mücadele ve buna bağlı olarak da bitki koruma ilaçları yani pestisitler
gelmektedir [1].
Pestisitler daima hastalıkları kontrol altına almak ve ekonomik kayıpları
önlemek amacıyla geliştirirler. Ancak sıklıkla canlı organizmalar ve çevre üzerinde
zararlı etkileri vardır [2].
İnsan popülasyonu her geçen gün çoğalmakta ve buna paralel olarak da yiyecek
üretimindeki baskılar aynı oranda artmaktadır. Bu talepleri karşılamak, ürün
rekoltesini artırmak ve ürünleri yetiştirilme veya depolanma sırasında ortaya çıkan
zararlılardan korumak için tarımsal yiyecek üretimi modern teknolojiyi ve bu
teknolojinin bir parçası olan pestisitleri kullanmak durumundadır. Pestisitlerin
kullanımı yiyeceklerin tarımsal üretiminin artmasına paralel olarak II. Dünya
Savaşından sonra hızla artmıştır [2].
Kullanılan pestisitler su, hava ve toprak gibi yollarla ya da bitki ve hayvanlarda
yer değiştirerek besin zinciri yolu ile çevrede sürekli taşınmaktadırlar. Pestisit
kalıntılarının ömrü ve biyolojik sistemlerdeki durumu tam olarak bilinememektedir.
Yapılan araştırmalar bitki ve hayvanların bulunduğu her yerde pestisit kalıntılarının
bulunabileceğini göstermiştir. Pestisit kalıntıları belli ölçülerde akut ve kronik
toksisiteye sahiptir. Yoğun ve bilinçsiz pestisit kullanımı sonucunda gıdalarda ya

1
kullanılan pestisitin kendisi ya da parçalanma ürünleri kalabilmektedir. Bu
maddelerden bazıları toksikolojik açıdan önemli ölçüde zararlı olabilmektedir.
Pestisit kalıntısının izlenmesi, yiyecekler içindeki pestisitlere insanların
maruziyetinin doğru olarak değerlendirilmesi açısından can alıcıdır. Çeşitli devlet
otoriteleri ve Avrupa Birliği Komisyonu tarafından tüketici güvenliğini garanti altına
almak, uluslar arası ticareti düzenlemek için gıda maddelerindeki maksimum pestisit
kalıntı düzeyleri belirlenmektedir.
Bu gibi nedenlerle gıda maddelerinde kalıntı düzeylerinin belirlenmesi ve
kullanılan analitik metodolojilerin çok düşük düzeyde kalıntı ölçümü yapabilmesi
önem kazanmaktadır.
Pestisitler içerdikleri farklı tür organik bileşikler ve kullanımda hedeflenen
türlerin çeşidine bağlı olarak sınıflandırılırlar. Pestisitler insektleri (insektisit), yabani
otları (herbisit), mantarları (fungisit), akarları (akarisit), bakterileri ve diğer bazı
organizmaları öldürmek veya etkilemek amacıyla kullanılırlar [3,4].
DDT yi de kapsayan organoklorlu insektisitler sıtma hastalığını kontrol altına
almadaki etkinliği nedeniyle yaygın olarak ve sıklıkla kullanılmıştır. Bununla birlikte
kimyasal kararlılıkları ve yağ çözünürlükleri çevreye zararlı olduklarını, insan ve
hayvanlarda birikme yeteneğine sahip olduklarını göstermiş ve bundan dolayı DDT
ve diğer kimyasal olarak kararlı klorlu pestisitler birçok ülkede kullanımdan
kaldırılmıştır [5].
1970’li yıllardan itibaren 3 farklı kimyasal tür –organofosfatlar, karbamatlar ve
piretroidler- insektisit marketinde egemen olmaya başlamıştır. Ancak son yıllarda
insektler bu kimyasal türlere karşı direnç geliştirmiştir ve bunun sonucunda
zararlıların kontrol edilmesinde verim azalmıştır. Bu gibi nedenlerle son on yıldır
neonikotinoidler dahil, yeni kimyaları ile yeni insektisit türleri market piyasasına
girmiştir [6].
Neonikotiniller, kloronikotinler ya da kloronikotiniller olarak da adlandırılan
neonikotinoidler, farklı bir etki mekanizmasına sahip yeni bir insektisit sınıfıdır.
Farklı etki mekanizmaları nedeniyle neonikotinoidler, diğer çoğu insektisite karşı
direnç geliştiren birçok önemli zararlının kontrol edilmesinde etkilidir. Acetamiprid,
imidocloprid, thiacloprid ve thiamethoxam bu sınıfta yer alan türlerdir.
Neonikotinoidler, piretroidlerin marketlere girişinden beri en hızlı giriş yapan
insektisit sınıfıdır. Sadece imidocloprid yıllık 600 milyon Avro pazar payına sahiptir
[7,8].

2
İdeal olarak insektisitler tamamen uygulandığı türe ya da en azından sadece
omurgasızlara spesifik olmalıdır. Ancak bu durum her zaman böyle olmamaktadır.
Bazı insektisitler, insektlere karşı yaşayan diğer türlerden daha fazla öldürücüdür
ama yine de yaşayan diğer türlere en azından belli oranda zararlıdırlar[9].
İnsektlerin direnç geliştirmemesi ve toksik seçiciliğinin yüksek olması nedeniyle
asetamipridin dünya çapında kullanılan bazı organofosfatlı pestisitlerin yerine
kullanılması tavsiye edilmektedir.
Bu gerçek, geçerli analitik metodolojilerle gıda maddelerinde asetamiprid
analizini daha da önemli kılmaktadır.
Geleneksel olarak özellikle çocuk, hasta ve yaşlı insanlar tarafından tüketilen bal
gibi doğal ürünlerde insektisitlerin değerlendirilmesi önem kazanmaktadır. Ancak
ülkemizde ve Avrupa Birliğinde sadece üç akarisit için maksimum kalıntı düzeyi
(MRL) belirlenmiştir [10,11]. Maksimum kalıntı limitinin belirlenmemiş olması o
ürünün tüketiciler için güvenli olup olmadığının araştırılmasını zorlaştırmaktadır.
Maalesef bal arıları tarımsal alanda kullanılan pestisitlerden etkilenmektedir. Bu
nedenle bazı pestisitler arı ürünlerinde bulunabilir. Böylece doğal bir gıda maddesi
olan balın karakteristiklerinin belirlenmesinde pestisit kalıntı düzeyleri önemli
olmaktadır. Dahası arı ürünlerindeki pestisit içeriği, pestisit kirliliği açısından da iyi
bir belirteçtir. Bu ürünler karmaşık yapıları ve içerdikleri karbonhidratlar, pigmentler
ve parafin nedeni ile bazı önemli analitik sorunlara neden olmaktadır. Balda şimdiye
kadar akarisitler, organofosforlu, karbamatlı ve organoklorinli insektisitler gibi çeşitli
türdeki pestisitler için birçok çalışma yapılmıştır[12-15, 30-33].
Literatüre bakıldığında, her ne kadar sebze, meyvelerde ve diğer bazı gıda
maddelerinde asetamiprid kalıntısı tayini için birçok çalışmalar bildirilmiş olsa da
balda asetamiprid kalıntısı tayini için yapılan sadece bir çalışma bildirilmiştir[16, 17,
18, 19, 20, 21].
Bu çalışmada ülkemizde ve dünyada çok geniş tarım alanlarında uygulanmaya
başlanan ve tüketici sağlığı ve güvenliği açısından ciddi riskler yaratabilecek
neonikotinoid insektisitlerden asetamipridin baldaki düzeyini belirlemek için hızlı,
hassas ve doğru bir yöntem geliştirilmesi ve asetamipridin bal ortamındaki
kararlılığının incelenmesi amaçlanmıştır.
Çalışmanın birinci basamağı olarak HPLC-DAD ile balda asetamiprid kalıntısı
ve bozunma ürünlerinin tayini için hassas, doğru ve hızlı bir yöntem geliştirilmesi
amaçlanmıştır.

3
Kullanılan pestisitin bal gibi doğal ortamlardaki kararlılığının bilinmesi ve
muhtemel bozunma ürünlerinin belirlenmesi o maddenin toksikolojik durumunun
değerlendirilmesinde çok önemlidir. Asetamiprid kullanılan alanlarda yapılan bal
üretiminde, balda asetamiprid kalıntısı ve saklama koşullarında oluşabilecek
bozunma ürünlerinin olması muhtemeldir. Sulu ortamlardaki bozunma ürünlerinin
bilinmesi ise bal gibi doğal ortamlardaki çalışmalara önemli yardım
sağlamaktadır[22,23].
Bu nedenle çalışmanın ikinci basamağı olarak asetamipridin öncelikle sulu
ortamda ve baldaki kararlılığının incelenmesi, bozunma koşullarının belirlenmesi ve
bozunma ürünlerinin tayini amaçlanmıştır.
Sonuç olarak bal ortamında mevcut acetamiprid ve bozunma ürünlerinin
belirlenmesi, gıda maddelerindeki pestisit kalıntı analizi ile ilgili olarak bir katkı
sağlayacak, ayrıca bozunma şartlarının belirlenmesi balların sağlıklı depolama
koşullarının belirlenmesi alanında bir eksikliği tamamlayacaktır.

4
BÖLÜM II

GENEL BİLGİLER

II.1. PESTİSİTLER

Pestisitler, pestlerin yani zararlıların kontrolü, yok edilmesi, engellenmesi,


itilmesi veya yayılmasının durdurulması amacıyla kullanılan maddelerdir. Pestisitler
kullanım alanlarına göre aşağıdaki sınıflara ayrılırlar[2,3,4].

II.1.1. Pestisitlerin Kullanım alanlarına göre sınıflandırılması


Algisitler: Yüzme havuzu, göl, kanal, su tankları ve diğer alanlardaki alglerin
kontrolü için kullanılan pestisitlerdir..
Çürüme Önleyiciler: Bot, sandal dipleri gibi su altındaki yüzeylerdeki
organizmaları kontrol etmek için kullanılan pestisitlerdir.
Antimikrobiyaller: Bakteri ve virüs gibi mikroorganizmaların kontrolü için
kullanılan pestisitlerdir.
Tuzaklar: Böcek, fare gibi zararlıların bir tuzak ile kontrolü için kullanılırlar.
Yiyecekler dikkat çekmek için kullanılsalar da pestisit olarak değerlendirilmezler.
Biopestisitler: Hayvan, bitki, bakteri ve bazı minerallerden türetilmiş pestisitlerdir.
Biositler: Mikroorganizmaları öldürmek için kullanılan pestisitlerdir..
Dezenfektanlar ve Koruyucular: Nesneler üzerindeki hastalık üreten
mikroorganizmalaları etkisiz hale getirmek veya öldürmek için kullanılan
pestisitlerdir.
Fungisitler: Küf, pas ve mantarları öldürmek için kullanılan pestisitlerdir..
Fumigantlar:Toprak veya binalardaki zararlıları gaz ya da buharla kontrol altına
almak için kullanılan pestisitlerdir.

5
Herbisitler: Yabani otları ve diğer istenmeyen yerlerde gelişen bitkileri öldürmek
için kullanılan pestisitlerdir.
Akarisitler: Bitki ve hayvanlar üzerinde beslenen kene, uyuz gibi akarları öldürmek
amacıyla kullanılan pestisitlerdir.
Mikrobiyal Pestisitler: Böcekleri ve diğer mikroorganizmaları kontrol altına almak
için kullanılan pestisitlerdir.
Mollusisitler: Salyangoz gibi yumuşakçaların kontrolünde kullanılan pestisitlerdir..
Nematisitler: Mikroskobik veya solucan gibi bitki kökleri üzerinde beslenen
organizmaları öldürür.
Ovisitler: Akarların ya da böceklerin yumurtalarını öldürmek amacıyla kullanılan
pestisitlerdir.
İticiler: Sivrisinek gibi böcekleri ve bazı kuşları geri püskürtmek için kullanılırlar.
Rodentisitler: Fare gibi kemirgenlerin kontrolünde kullanılan pestisitlerdir.
İnsektisitler: Böcekleri öldürmek için kullanılan pestisitlerdir.

İnsektisitler farklı kimyasal grup içinde sınıflandırılabilirler.

Organofosforlu İnsektisitler: Kimyasal olarak kararsız olan organofosfatlı


insektisitler dayanıklı organoklorlu insektisitlerin ev ve bahçelerdeki kullanımındaki
yerini almıştır. Organofosforlu ismi yapısında fosfor bulunduran insektisitleri kapsar.
Bunlar fosforik asitten elde edilirler ve omurgalı hayvanlara karşı en çok toksisite
gösteren pestisitlerdir. Organofosforlu pestisitler insanlara ve omurgalı hayvanlara
karşı akut toksik etki gösterirler ve dayanıklı değildirler.

Karbamatlı İnsektisitler: Karbamatlar karbonik asit(HO-CO-NH2) türevleridir.

Organoklorlu İnsektisitler: Geçmişte yaygın olarak kullanılan ancak ,sağlık ve


çevre üzerindeki etkileri ve dayanıklılıkları nedeniyle birçoğu kullanımdan
kaldırılmış olan insektisitlerdir.

Piretroidler: Doğal insektisit olan piretrumun kullanımı, fiyatından ve güneş


ışığındaki kararsızlığından dolayı oldukça azdır. Sentetik piretroidler olarak
isimlendirilen, modifikasyonlarla çevredeki kararlılıkları artırılmış piretrin benzeri
sentetik maddelerdir.

6
Nikotinoidler: Nikotinoidler farklı etki mekanizmaları ile göreceli olarak yeni sınıf
insektisitlerdir. İnsektlerin merkezi sinir sistemindeki postsinaptik nikotinik
reseptörlere bağlanarak antagonist olarak etki ederler. Bu da asetilkolin birikimine
neden olarak paralize ve sonuçta insektin ölümüne neden olur. Neonikotinoidler,
mükemmel sistemik özellikleri nedeniyle tarım ürünlerinin korunmasında yoğun
olarak kullanılmaktadır.

II.1.2. Pestisitlerin Zararları

Modern tarımsal savaşımda, pestisitlerin çevreye zarar vermeyecek düzeyde ve


gerçekten gerekli olduğunda kullanılması benimsenmiştir. Bunun bir sonucu olarak,
başta ABD olmak üzere, gelişmiş ülkelerde “düşük risk” yada “doğa dostu”
pestisitler adı altında toplanmışlardır. Örneğin ABD Çevre Koruma Örgütü (EPA),
böyle pestisitlerin hem ruhsatlandırılmasını kolaylaştırmış ve hem de
kullanılmalarını teşvik etmeye başlamıştır[1].

Bununla beraber, yoğun ve bilinçsiz pestisit kullanımının sonucunda gıdalarda,


toprak, su ve havada kullanılan pestisitin kendisi ya da dönüşüm ürünleri
kalabilmektedir. Hedef olmayan diğer organizmalar ve insanlar üzerinde olumsuz
etkileri görülmektedir. Pestisit kalıntılarının önemi ilk kez 1948 ve 1951 yıllarında
insan vücudunda organik klorlu pestisitlerin kalıntılarının bulunmasıyla anlaşılmıştır.
Pestisitlerin bazıları toksikolojik açıdan bir zarar oluşturmazken, bazılarının
kanserojen, sinir sistemini etkileyici ve hatta mutasyon oluşturucu etkiler
saptanmıştır. Pestisit kalıntılarının en önemli kaynağı gıdalardır. Bu nedenle 1960
yılında FAO ve WHO “Pestisit Kalıntıları Kodeks Komitesi”ni kurmuşlar ve bu
komitenin çalışmaları sonucu konu ile ilgili tanımlamalar yapılmış, bilimsel
araştırma verilerine dayanılarak gıdalarda bulunmasına izin verilen maksimum
kalıntı değerleri saptanmıştır. Ülkemizde de tarımsal ürünlerde kullanılan
pestisitlerin gıdalarda bulunması müsaade edilebilir maksimum miktarları ürün ve
ilaç bazında belirlenmiştir[11].

II.1.2.1 Hedef Olmayan Organizmalar Üzerine Etkisi

Hemen bütün insektisitler spesifik olmadıkları için sadece hedef organizmaları


öldürmez, omurgalı ve omurgasız diğer organizmaları da etkilerler. Zararlı etkilerin

7
şiddeti, insektisitin ve formülasyonun tipine, uygulama şekline ve tarımsal arazinin
tipine bağlı olarak değişmektedir. En genel yan etkiler şunlardır:

Arılar, kuşlar ve balıklar, mikroorganizmalar ve omurgasızlar gibi hedef olmayan


organizmalarda ölümler,

Kuş, balık ve diğer organizmalarda üreme potansiyelinin azalması,

Hedef olmayan organizmalarda dayanıklılık oluşması sonucu insanlara hastalık

taşıyan böcek ve parazitlerin kontrolden çıkması,

Ekosistemin yapısının ve türlerinin sayılarının değişmesi gibi uzun dönemli


etkiler.

II.1.2.2. İnsanlar Üzerine Etkileri


İnsanların pestisitlere maruz kalması mesleki zehirlenmeler veya kaza ile
meydana gelebilmektedir[9].

Mesleki zehirlenmeler, üretim, formülasyon hazırlama, taşıma, yükleme ve


uygulama sırasında deri ve solunum yoluyla maruz kalma (akut zehirlenme) olarak
tanımlanabilir. Bunlar vücutta kolin esteraz enzimini inhibe ederek asetil kolin
birikimine yol açarlar. Kaza ile meydana gelen zehirlenmelerde pestisitlerin yaprak
ve topraktaki kalıntıları veya onların toksik dönüşüm ürünleriyle temas sonucu
hastalıklar meydana gelebilmektedir. Son yıllarda ilaçların besin maddelerindeki
kalıntılarının insanlar için kronik toksisitesi iki şekilde ele alınmaktadır:

Kabul edilebilir günlük alım (Acceptable Daily Intake-ADI): Bir kişinin bir
günde alabileceği kabul edilebilir günlük ilaç miktarını mg/kg olarak ifade
eden değerdir.

Maksimum kalıntı limitleri (Maximum Residue Limits-MRL): Gıda


maddelerinde bulunmasına izin verilen en fazla ilaç miktarını (ppm) ifade
eden değerdir.

“Codex Alimentarius”, USEPA (United States Environmental Protection


Agency) gibi kuruluşların bu değerleri içeren listeleri mevcuttur. Bu miktarlar
tarımsal ürünlerin dış pazarlaması bakımından da önemlidir. Tolerans miktarını aşan
değerlerde pestisit kalıntısı tespit edilen tarımsal ürünler alıcı ülkeler tarafından geri
çevrilmektedir.

8
Pestisitlerin kalıntı yoluyla kronik toksisiteleri yanında bazılarının insanlarda
mutajenik, teratojenik ve kanserojen etkilerinin de olduğu son yıllarda yapılan
çalışmalarla saptanmıştır.

II.1.2.3. Çevre Üzerine Etkileri

Tarımsal alanlara, orman veya bahçelere uygulanan pestisitler havaya, su ve


toprağa, oradan da bu ortamlarda yaşayan diğer canlılara geçmekte ve dönüşüme
uğramaktadır. Bir pestisitin çevredeki hareketlerini onun kimyasal yapısı, fiziksel
özellikleri, formülasyon tipi, uygulama şekli, iklim ve tarımsal koşullar gibi faktörler
etkilemektedir.

Pestisitlerin püskürtülerek uygulanması sırasında bir kısmı evaporasyon ve


dağılma nedeniyle kaybolurken, diğer kısmı bitki üzerinde ve toprak yüzeyinde
kalmaktadır. Havaya karışan pestisit rüzgarlarla taşınabilir; yağmur, sis veya kar
yağışıyla tekrar yeryüzüne dönebilir. Bu yolla hedef olmayan diğer organizma ve
bitkilere ulaşan pestisit, bunlarda kalıntı ve toksisiteye neden olabilir.

Toprak ve bitki uygulamalarından sonra toprak yüzeyinde kalan pestisitler,


yağmur suları ile yüzey akışı şeklinde veya toprak içerisinde aşağıya doğru yıkanmak
suretiyle taban suyu ve diğer su kaynaklarına ulaşabilirler. Eğim, bitki örtüsü,
formülasyon, toprak tipi ve yağış miktarına bağlı olarak taşınan pestisitler, bu sularda
balık ve diğer omurgasız su organizmalarının ölmesine; bu organizmalardaki pestisit
kalıntısının insanların gıda zincirine girmesi ve kontamine olmuş suların içilmesiyle
kronik toksisitenin oluşmasına neden olurlar.

Toprağa geçen pestisitler güneş ışınlarının etkisiyle fotokimyasal degradasyona,


bitki, toprak mikroorganizmaları ve diğer organizmaların etkisiyle biyolojik
degradasyona uğramakta; toprak katı maddeleri (kil ve organik madde) tarafından
adsorlanıp desorplanmakta veya kimyasal degradasyona uğramaktadırlar. Toprak
içine geçmiş pestisitler kapiller su vasıtasıyla toprak yüzeyine taşınmakta ve buradan
havaya karışabilmektedir. Toprağın yapısı, kil tipi ve miktarı, organik madde içeriği,
demir ve alüminyum oksit içeriği, pH’sı ve toprakta var olan baskın mikroorganizma
türleri tüm bu olayları etkileyen faktörlerdir. Toprakta pestisitin tutulmasıyla hareketi
ve biyolojik alımı engellenmekte ve çeşitli şekillerde degradasyonu ile ya toksik
özelliğini kaybetmekte ya da daha toksik metabolitlerine dönüşebilmektedir.
Pestisitin kendisinin ya da toksik dönüşüm ürünlerinin hedef olmayan yerleri veya

9
organizmaları kontamine etmesi istenmediğinden tüm bu olayların bilinmesi ve
incelenmesi önem taşımaktadır.

II.1.2.4. Gıdaların Kontaminasyonu


Bitkinin direkt yolla veya toprakta kalan pestisiti kendi bünyesine alması ve bu
bitkilerin insan gıdası veya hayvan yemi olarak kullanılması sonucunda pestisitler
insanların gıda zincirine girmektedirler[1].

II.2. NEONİKOTİNOİD İNSEKTİSİTLER

Tarım ürünlerine zarar veren ve insektisitlere direnç gösteren birçok zararlı son
yıllarda ciddi sorun oluşturmaktadır. Ayrıca zararlı kontrol stratejisinde çevre
güvenliği çok önemlidir. Bu durumda konvansiyonel insektisitlere karşı direnç
gösteren, kontrolü zor böceklere karşı etkili ve çevreye zararlı olmayan bir insektisit
geliştirilmesi ihtiyacı doğmuştur[7, 8].

Son 30 yılda insektisit piyasasına giriş yapmış tek büyük kimyasal insektisit
sınıfı olan neonikotinoidlerin girişinden sonra bitki koruma ve veteriner pest kontrolü
büyük bir değişim geçirmiştir. Dünya genelinde neonikotinidlerin kullanımı hızla
artmaktadır. İmidokloprid, nitenpiram, tiakloprid, asetamiprid, tiametoksam bu
grupta yer alan türlerdir. Neonikotinoid insektisitler ticari olarak kullanıma sunulmuş
ve marketlerde yerini alarak yıllık milyar dolar civarında pazar payına sahip
olmuştur. Neonikotinoid insektisitlerin piretroidler, metil karbamatlar ve
organofosfatlardan sonra dördüncü büyük insektisit grubu olması
beklenmektedir[24]. Neonikotinoidler, nikotinik asetil kolin reseptörü agonisti
(nAChR) olarak insektlerin sinir sistemine seçici olarak etki ederler. Onlar hem bu
reseptörlere yüksek bir affinite gösterirler hem de sudaki orta dereceli çözünürlükleri
ve iyonize olmamaları gibi uygun fizikokimyasal özelliklere sahiptirler. Bu durum
onlara insekt nikotinik asetilkolin reseptörlerindeki farklılıkları algılama ve yapılarını
keşfetme yeteneği de sağlar. Neonikotinoid insektisitler insekt ve omurgalılar
arasında seçici toksisite mekanizmasının mükemmel bir örneğidir[24, 25].

II.2.1. Asetamiprid
Asetamiprid ((E)-N1-[(6-kloro-3-piridil)metil-N2-siyano-N1-metil asetamidin),
Nippon Soda Co. Ltd. tarafından geliştirilmiş bir insektisittir. Asetamiprid,

10
hedeflenmeyen bölgelere zararlı etkisi olmaksızın bitler, beyazsinekler gibi emici
zararlılara karşı etkilidir ve yüksek toksik seçiciliğe sahiptir.

Asetamiprid diğer neonikotinoid insektisitler gibi Hemiptera ve Thysanoptera ve


Lepidoptera’ya karşı mükemmel aktivite gösterir. Çay ağacı, meyve ağaçları,
sebzelerdeki zararlıların kontrolünde kullanılır. Merkezi sinir sistemine etki ederek
postsinaptik nikotinerjik asetilkolin reseptörlerini geri dönüşümsüz olarak bloke eder.

Asetamiprid bir siyanoamidin ve bir 6-kloro-3-piridilmetil kısmından ibarettir.


Bileşik 1995 yılında Japonya da kaydedilmiştir. Mospilan ticari adı ile Japonya’ da
satışa sunulmuştur[7,8].

Kimyasal yapısı ve fiziksel özellikleri aşağıda gösterilmiştir[26].

Adı (IUPAC): (E)-N1-[(6-kloro-3-piridil)methil]-N2-siyano-N1-metil


asetamidine

Kimyasal Yapı:

CH3

CI CH2N
CH3
N C

N
CN
Şekil II.1. Asetamipridin kimyasal yapısı.

Molekül Formülü: C10H11ClN4

Molekül Ağırlığı: 222.68 g/mol

Genel Adı: Asetamiprid

CAS (Chemical Abstracts Service) Numarası: 135410–20–7

Pestisit Tipi: İnsektisit

Kimyasal Sınıf: Neonikotinoid insektisit

Kullanım Alanları: Yapraklı sebzelerde, meyveli sebzelerde, lahana türlerinde,


turunçgillerde, taneli meyvelerde, üzümlerde, pamukta ve süs bitkileri ve
çiçeklerindeki emici-tip insektlerin kontrolünde kullanılır.

Fiziksel Görünüm: Beyaz kristal

11
Koku : Kokusuz

Erime Noktası: 98,9oC

Buhar Basıncı: 1x10-8 mm Hg (25oC)

Dağılım Katsayısı (Log Pow) : 0,8 (20oC)

pKa : 0,7 (25oC)

Çözünürlük: Distile suda 4250mg/L (25oC)

pH:5 3480mg/L (25oC)

pH:7 2950mg/L (25oC)

pH:9 3960mg/L (25oC)

Aseton, metanol, etanol, diklormetan, kloroform, asetonitril, tetrahidrofuran içinde


çözünür.

Hidrolitik Kararlılık: pH:9’da ve 45oC’de kademeli olarak bozunur.

Fotokararlılık : Güneş ışığında kararlı.

II.2.1.1. Toksikolojik Bulgular


Asetamipridin memelilere karşı göreceli olarak düşük toksisiteye sahip olduğu
bildirilmiştir. Erkek sıçanlar ve fareler üzerindeki akut toksisitesi yaklaşık olarak
200mg/kg’dır[ 7, 8, 26].

Asetamiprid, deri ve gözde irritasyon ve hassasiyet, mutajenite testleri için


değerlendirilmiş ve negatif bulunmuştur.

Çevre Koruma İdaresi (EPA) tarafından kanserojen etkisi muhtemel olmayan


pestisit olarak sınıflandırılmıştır. Memelilerde belli bir hedef organa spesifik toksisite
göstermemiştir. Asetamipridin kanserojen, mutasyon ve nörotoksik etkisi olduğuna
dair herhangi bir kanıt bulunamamıştır.

Yiyecekler ve su için EPA’nın akut ve kronik maruziyet düzeyini aşmadığı


yönünde değerlendirilmiştir.

Asetamipridin toksisite değerleri; LD50 : 213mg/kg (vücut ağırlığı, sıçan)


LD50 : 213mg/kg (vücut ağırlığı, kuş)
LD50 : 14,53µg/arı olarak bildirilmiştir.

12
II.2.1.2. Ekolojik Etkileri ve Çevredeki Durumu
Asetamiprid oksijenli toprak metabolizması ile hızla bozunur. İçme sularındaki
kalıntı miktarı düşük olarak tahmin edilmektedir. Balıklarda biyobirikime neden
olmadığı ve çevre için diğer çoğu insektisitlerden göreceli olarak düşük toksisiteye
sahip olduğu bildirilmiştir.

Asetamiprid kullanımı balıklar ve yabani yaşam için minimum risklidir.


İnsektlere karşı seçici toksiktir, fakat hedef olmayan, suda yaşayan omurgasızlar için
riskli olabilir. Arılara karşı orta derecede toksiktir. Tehdit altındaki türler için düşük
risklidir. Hedef olmayan bitkiler için minimum bir risk vardır.

Asetamiprid çoğu toprak içinde hızla biyobozunmaya uğrar. Başlıca bozunma


yolu aerobik (oksijenli) toprak metabolizmasıdır. Çevre temperatüründe hidrolize
dayanıklıdır ve su içinde göreceli olarak fotobozunmaya uğrar. Oksijenli su
ortamında orta hızda, oksijensiz su ortamında yavaşça metabolize olur. EPA
raporuna göre asetamipridin çevrede uzun süre kalmayacağı beklenmektedir.

Yapılan çalışmalara göre EPA’nın değerlendirmeleri aşağıda belirtilmiştir[26].


Hidroliz: pH: 5 ve 7’de (22, 35 ve 45oC ) anlamlı bir değişiklik yok; pH: 9’da
(22oC ) kararlıdır.
Suda Fotoliz: 34 günlük yarılanma ömründe pH:7’de (25oC) anlamlı bir süreç
değildir.
Toprakta Fotoliz : Yarılanma ömrünü belirlemek için güvenilir bilgi yok. Ancak
tüm işaretler topraktaki fotobozunmanın önemli bir süreç değildir.
Oksijenli Toprak Metabolizması: Çeşitli Avrupa ve Amerika topraklarında
yapılmış tüm çalışmalarda 1’den az ve 8,2 gün arasında değişen kısa yarılanma ömrü
ile önemli bir bozunma sürecidir. Amerika’da balçık-kumlu toprakta 25oC’de 8.2 gün
yarılanma ömrü risk değerlendirmesinde kullanılmıştır. Başlıca bozunma ürünü –
metil(6-kloro-3-piridil)metilamin’in asetamipridin kendisinden daha dayanıklı
olduğu tespit edilmiş ve 121 gün sonra uygulanan materyalin %73.3’ü kaldığı tespit
edilmiştir. Bu nedenle bozunma risk değerlendirmesinde ifade edilmiş ancak düşük
anlamlı bulunmuştur.
Oksijensiz Su Metabolizması: Başlıca bozunma ürünü olan –metil(6-kloro-3-
piridil)metil amin, 6 ay sonunda, 45 günlük tahmini yarılanma ömrü ile uygulanan
materyalin maksimum %62,3’üne ulaşmış ve 10 ayın sonunda %32,5’e azalmıştır.

13
Diğer iki bozunma ürünü, maksimum %21( 1 ayda) ve %17.7 (6 ay) düzeyine
ulaşmış ve daha sonra da bozunma devam etmiştir.
Asetamipridin Doğadaki Hareketliliği : Orta ve yüksek hareketlilik.
Asetamipiridin Bozunma Hareketliliği : Orta ve yüksek hareketlilik.
Karasal Alan Kalıcılığı: 7 çalışmada 18 günden az yarılanma ömrü ile kalıcı
olmadığı, yeraltı sularına geçme potansiyelinin düşük olduğunu, düşük derinliklere
süzülümünün anlamlı olmadığı sonuçlarına ulaşılmıştır. Bozunma ürünlerinin yeraltı
sularına geçme potansiyeli asetamipridden daha fazladır. Asetamipridin oksijenli
toprak metabolizması yolu ile oluşan ana bozunma ürününün çevredeki dayanıklılığı
ve hareketliliği yeraltı sularının kirlenmesine neden olabilir ancak tüm kanıtlar bu tür
bir kirlenmenin toksikolojik açıdan anlamlı olmadığını göstermektedir.
Asetamiprid için Avrupa Birliği ülkelerinde bazı gıda maddelerinde izin verilen
maksimum kalıntı düzeyleri belirlenmiştir (tablo II.1.). Ancak bu gıda maddeleri
arasında bal ve diğer arı ürünleri yoktur.
Tablo II.1: Avrupa Birliği ülkelerinde bazı gıda maddelerinde izin verilen
maksimum asetamiprid kalıntısı düzeyleri.

YİYECEK MADDESİ MAKSİMUM KALINTI LİMİTLERİ


(ppm)
Turunçgiller 0,05
Kabuklu kuruyemiş 0,05
Elma 1
Muşmula 0,10
Armut 1
Ayva 0,1
Kayısı 0,1
Kiraz 0,2
Şeftali 0,1
Erik 1
Köklü sebzeler (havuç vb.) 0,05
Soğanlı sebzeler(soğan, sarımsak vb.) 0,05
Domates 0,3
Biber 1

14
Tablo II.1: Devam
Kırmızı Biber 0,05
Salatalık 0,3
Kavun 0,2
Marul 3
Semizotu 0,05
Baklagiller 0,05
Mantar 0,05
Patates 0,5
Tahıl 0,05
Çay 0,05
Hayvansal Gıdalar (et vb.) 0,01

Asetamipridin toprakta ve bitkilerdeki metabolizması incelenmiş ve bazı


bozunma ürünleri tanımlanmıştır[21, 27,28].

IM-1-2 ((E)-N2-karbamoil-Nı-[(6-klloro-3-pridil)metil]-NI-metilasetamidin))

CH3

CI CH 2N CH 3
N
N
CNH2
O

M.A.: 240g/mol

IM-1-4 (N-metil-(6-kloro-3-piridil)metilamin)

CH3

CI CH2NH
N

M.A. 156 g/mol

15
IC-O ( 6-kloronikotinik asit)

CI COOH
N

M.A.: 157g/mol

IM-O ( 6-kloro-3-piridilmetanol)

CI CH2OH
N
M.A.:143g/mol

IM-2-1 ( (E)-N'-[(6-kloro-3-piridil)-metil]-N2-siyanoasetamidin )

CI CH2NH
CH3
N C M.A.:208g/mol

N
CN

Sekil II.2. Asetamipridin bazi bozunma ürünlerinin kimyasal yapisi.

II.3. BAL
Türk Gıda Kodeksine göre bal, bitki nektarlarının, bitkilerin canlı kısımlarının
salgılarının veya bitkilerin canlı kısımları üzerinde yaşayan bitki emici böceklerin
salgılarının bal arısı Apis mellifera tarafından toplandıktan sonra kendine özgü
maddelerle birleştirerek değişikliğe uğrattığı, su içeriğini düşürdüğü ve petekte
depolayarak olgunlaştırdığı doğal bir üründür[29].

Kaynağına göre balın sınıflandırılması;

Çiçek veya nektar balı: Bitki nektarından elde edilen bal.

16
Salgı balı: Bitkilerin canlı kısımlarının salgılarından veya bitkilerin canlı
kısımları üzerinde yaşayan bitki emici böceklerin -Hemiptera- salgılarından elde
edilen bal.

Üretim ve/veya pazara sunuluş şekline göre balın sınıflandırılması;

Petekli bal: Kuluçka amaçlı kullanılmamış olan saf balmumundan hazırlanmış


temel peteklerin veya arılar tarafından yapılmış peteklerin gözlerinde depolanmış ve
tamamı veya büyük bölümü sırlanmış olarak satışa sunulan bal.

Süzme bal: Sırları alınan yavrusuz peteklerden santrifuj yolu ile elde edilen bal.

Petekli süzme bal: Süzme bal içerisinde petekli bal parçaları ile hazırlanmış bal.

Sızma bal: Süzme bal elde edilirken alınan sırlardan ve balı alınmış peteklerden
sızdırılarak toplanan bal.

Pres balı: Yavrusuz peteklerin doğrudan veya 45°C’yi aşmamak üzere ısıtılarak
preslenmesi ile elde edilen bal.

Filtre edilmiş bal: Yabancı organik ve/veya inorganik maddelerin filtrasyon yolu
ile uzaklaştırılması sırasında polen içeriği önemli ölçüde azalmış bal.

Bal için ülkemizde ve Avrupa Birliği Komisyonu tarafından sadece üç adet


akarisit için maksimum kalıntı limiti belirlenmiştir. Balda asetamiprid kalıntı düzeyi
için bir limit değeri belirlenmemiştir.

Balda pestisit kalıntısı analizleri ile ilgili çalışmalara bakıldığında, dünyada son
yıllarda çok sayıda çalışma yapılmış olmasına karşın ülkemizde, ballarda pestisit
kalıntı analizleri ile ilgili sınırlı sayıda çalışma mevcuttur[30].

Bu alandaki çalışmalarda örnek hazırlama basamağında farklı tekniklerin


kullanıldığı görülmektedir [30-36]. Örneğin Jimenez ve arkadaşları SPME (solid
phase microextraction) metodunu kullanarak GC-ECD (gas chromatography-electron
capture detector) ile balda çeşitli pestisitleri tayin etmişlerdir[31]. Yine Pico ve ark.
örnek hazırlama basamağında sıvı-sıvı ekstraksiyonu (LLE) ile katı faz ekstraksiyonu
(SPE) kıyaslayarak çalışmışlardır[32].

17
II.4. KROMATOGRAFİ
Kromatografi, karışımlardaki bileşimlerin hareketli ve durgun fazlar arasında
etkileşerek ayrılması, tanınması ve tayini için kullanılan analitik bir yöntemdir.
Ekstraksiyon, distilasyon, kristalizasyon gibi klasik ayırma metodlarından daha
yüksek ve daha hassas ayırma yeteneğine sahiptir[37, 38].

Karışımdaki maddeler gaz, sıvı veya bir süperkritik akışkan olan hareketli fazla
birlikte, poröz bir katı madde ya da katı maddeye emdirilmiş bir sıvı olan durgun faz
üzerinden geçirilerek göç hızlarına bağlı olarak ayrılırlar. Göç hızlarının farklılığı
sonucu, numune bileşenleri birbirlerinden kalitatif ve / veya kantitatif olarak
analizlenebilen farklı bantlar veya bölgeler şeklinde ayrılırlar.

II.4.1. Kromatografik Yöntemlerin Sınıflandırılması


Kromatografik yöntemler durgun fazın tutulduğu yüzeye göre ikiye ayrılabilir.

Kolon Kromatografi : Durgun faz ince bir kolonda tutulur. Hareketli faz basınç
altında bu kolondan geçirilir.

Düzlemsel Kromatografi : Durgun faz düzlemsel bir plaka veya kağıdın


gözenekleri arasına tutturulur ve hareketli faz kapiler etkisi ya da yerçekimi etkisiyle
durgun faz arasından hareket eder.

Kromatografik yöntemler ayrıca hareketli ve durgun faz tipleri ile fazlar arasında
madde aktarımını sağlayan denge türlerine göre de sınıflandırılabilir. Buna göre
kolon kromatografisi türleri aşağıdaki tabloda verilmiştir[38].

Tablo II.2. Kolon kromatografisi metotlarının sınıflandırılması

Genel Sınıflandırma Özel Metot Durgun Faz Denge Tipi

Sıvı Kromatografisi(LC) Sıvı-sıvı ve partisyon Bir kalıntı üzerine Karışmayan


(hareketli faz:sıvı) adsorblanmış sıvı sıvılar arası partisyon

Bağlı-sıvı faz Katı bir yüzeye Sıvı ve bağlı yüzey


bağlı organik türler arasında partisyon

Sıvı-katı veya adsorbsiyon Katı Adsorbsiyon


İyon değişimi İyon değiştirici reçine İyon değişim

18
Tablo II.2. Devam
Boyut elemesi Polimer bir katı Partisyon/eleme
yüzeylerindeki sıvı

Gaz Kromatografisi(GC) Gaz-sıvı Bir katı üzerine Gaz-sıvı


Hareketli faz:gaz adsorblanmış sıvı arası partisyon

Bağlı-gaz fazı Katı bir yüzeye Sıvı-bağlı yüzey


bağlı organik türler arasında partisyon

Gaz-katı Katı Adsorbsiyon

Süperkritik akışkanlı Katı bir yüzeye Süperkritikakışkan


Kromatografi(SFC) bağlı organik türler ve bağlı yüzey
arasında partisyon

Gaz kromatografisi genellikle uçucu, küçük ve nonpolar ve türevlendirilmiş


küçük polar bileşikler için kullanılır. Gaz kromatografisinde kapiler kolon kullanımı
analitin çok iyi ayrılmasını sağlar.

Sıvı kromatografide sıvı hareketli faz kullanımı küçük-polar ve büyük


bileşiklerin ayrılmasını sağlar. Birçok makrobiyomolekülün ayrılması ise ancak
elektroforez ile yapılır.

Kromatografik sistemler analitlerin ayrılmasını kolon aracılığı ile


gerçekleştirdiklerinden kolonlar kromatografik sistemlerin kalbidir. Uygun durgun
faz ile kolon seçimi karışımdaki bileşenlerin ayrılmasının sağlanmasında çok
önemlidir. Kapiler kolon teknolojileri kromatografik metotlarda devrim
niteliğindedir. Çünkü çok uzun bir kolon ile akış hızını fazla sınırlamaksızın istenen
ayrım sağlanabilir.

Ancak HPLC’de kullanılan kolonların uzunlukları sınırlıdır. Diğer taraftan


analitlere farklı affinitedeki çok çeşitli sayıdaki sıvılar HPLC’de hareketli faz olarak
kullanılabilir. Böylece, sınırlı sayıdaki durgun faz ve yeterli uzunluktaki kolonlar ile
dikkatlice seçilmiş hareketli faz kullanılarak analitlerin ayrımı gerçekleştirilebilir.

Seçilmiş bir kolon ile GC ve HPLC’de ayrımın optimizasyonu için kullanılan


yaklaşımlar farklıdır. Hareketli fazın gaz olduğu durumlarda kolon sıcaklığı çok
çeşitli olabilir. HPLC’de ise farklı polaritedeki çözücüler ya da karışımları
değiştirilebilir. GC’de kolon sıcaklığının artırılması taşıyıcı gazı viskozitesin artırır

19
ve akış oranını düşürür. HPLC’de gradient elusyon değişimleri hareketli fazın
viskozitesini değişitir, sabit bir akış hızında yüksek basınçları gerektirebilir.

II.4.2 Kromatgrafide Kullanılan Uygulama Karakteristikleri


Analitlerin fazlar arasındaki dağılımı analitin fazlar arasında dengede olduğu
durumda açıklanır[39].

Bu reaksiyonun denge sabiti K’ya partisyon oranı ya da partisyon katsayısı


denir.

K=CS/CM

CS: çözünenin durgun fazdaki analitik konsantrasyonu

CM: çözünenin hareketli fazdaki analitik konsantrasyonu

Gaz ve sıvı kromatografisi ile kalitatif ve kantitatif analiz yapılabilir. Bir


maddenin enjeksiyonunun yapıldıktan sonra dedektörde sinyalinin görünmesine
kadar geçen süreye o maddenin alıkonma zamanı (tR), bu süreçte tüketilen hareketli
faz hacmine ise alıkonma hacmi denir. Ayrıca durgun fazda hiç tutulmayan bir türün
alıkonma zamanı ise tM ile gösterilir. Belirli şartlarda bir maddenin alıkonma zamanı
sabittir. Bu özellikten yararlanılarak kalitatif analiz yapılır. Kantitasyon ise, dedektör
tarafından algılanarak elektrik sinyaline çevrilen pikin büyüklüğü ile dedektörden
geçen madde miktarıyla orantılı olduğundan, pik büyüklüğünün (alan ya da
yükseklik) ölçülmesi ile yapılır.

Şekil II.3. tR ,tM terimlerinin gösterildiği kromatogram.

20
Alıkonma faktörü, kı (kapasite faktörü), analitin kolondaki hareket hızını
tanımlar. A analiti için kapasite faktörü,

k'A = t R - tM / tM

olarak ifade edilir. Alıkonma faktörü ideal olarak 1-5 arasında olmalıdır.

Seçicilik faktörü, α , iki analitin (A ve B) kolondaki ayrımını ifade eder.


α = k 'B / k 'A

A analiti, B’den önce elüe olur ve seçicilik faktörü her zaman 1’den büyüktür.

Bant Genişlemesi ve Kolon Verimliliği


Optimum ayrışma elde etmek için ince, simetrik pikler elde edilmelidir. Bu bant
genişlemesinin sınırlanması gerektiği anlamına gelir. Bununla birlikte kolonun
verimliliğini de ölçmek gerekmektedir.
Teorik Plaka Modeli

Plaka modeline göre, kromatografik kolon yapısında teorik plaka olarak


adlandırılan birçok plaka bulundurur. Analitin sabit ve hareketli fazlarda
dengelenmesi bu plakalarda olur. Analitin kolon boyunca taşınması; dengedeki
hareketli fazın bir plakadan diğerine hareketi ile gerçekleşir. Şekil II.4’de
kromatografik kolon ve var olduğu kabul edilen teorik plakalar gösterilmiştir.

Şekil II.4. Kromatografik kolon ve var olduğu kabul edilen teorik plakalar.

Plakalar gerçekte bulunmamalarına rağmen, kolon işleminin anlaşılmasını ve


kolondaki teorik plaka sayısını (N) belirterek kolonun verimliliğinin ölçülebilmesini
sağlar. Teorik plaka sayısının büyük olması kolonun verimliliğini artırır. Kolon
uzunluğu L ise;

H=L / N ’dir.

H: Plaka yüksekliği

21
Kolondaki plaka sayısı, elüsyondan sonra kromatografik pikin değerlendirilmesi
ile tespit edilebilir.

W1/2 : pikin yarı yüksekliğindeki genişliğidir.

Kromatografide Hız Teorisi

Kolonda gerçekleşen olaya daha gerçekçi yaklaşım analitin durgun fazla


hareketli faz arasında dengeye gelinceye kadar geçen süre ile ilgilidir. Kromatografik
pikin bant şekli bu nedenle elüsyon hızından etkilenir. Ayrıca analitin durgun fazın
parçacıkları arasında ilerlerken izleyebileceği farklı yolların olması pikin şeklini
etkiler.

Bant genişlemesini etkileyen farklı mekanizmalar incelendiğinde plaka


yüksekliğini veren Van Deemter eşitliğine ulaşılır.

H= A + B/u +C.u

Bu eşitlikte u ; hareketli faz ortalama hızı ve A, B, C ise bant genişlemesine


katkıda bulunan faktörlerdir.

A : Eddy Difüzyon Terimi: Türlerin ortamda daha derişik bölgeden daha seyreltik
oldukları bir bölgeye göçlerine difüzyon denir. Hareketli faz kolonun durgun fazı
boyunca ilerler. Çözünen maddeler durgun faz boyunca ilerlerken tamamen rastgele
yollar izlerler. Farklı yollar farklı uzunluklara sahip olduğundan bu durum bant
genişlemesine neden olur.

B : Uzunlamasına Difüzyon Terimi : Analitin konsantrasyonu bant kenarlarında


merkezindekinden daha azdır. Analit merkezden kenarlara doğru yayılır. Bu da bant
genişlemesine neden olur. Hareketli fazın hızı yüksek ise analit kolonda daha az süre
harcar ve uzunlamasına difüzyonun etkisi azalır.

C : Kütle Transferine Direnç : Analitin hareketli ve durgun faz arasında dengeye


gelmesi belli bir zaman alır. Hareketli fazın hızı yüksek ise ve sabit faz kuvvetli bir
çekim uyguluyorsa hareketli fazdaki analit daha hızlı hareket eder ve analit bandı
yayılır.

22
Van Deemter Eğrisi

Şekil II.5. Van Deemter Grafiği

A, B ve C sabittir. Böylece optimal kolon etkinliğine optimal gaz hızı ile ulaşılır.
Farklı taşıyıcı gaz türleri ve teorik plaka yüksekliği arasındaki ilişki aşağıda şekil
II.6.’da gösterilmiştir.

Şekil II.6. Çeşitli taşıyıcı gazlar ile elde edilen HETP değerleri(Van Deemter eğrisi) .

23
Sıvı hareketli fazlı kromatografide kütle aktarımı, yukarıdaki grafikteki H’nin
karşılığıdır. Ancak optimal bir değere ulaşamaz. Her ne kadar akış hızının sürekli
olarak azaltılması ayırma etkinliğini sürekli olarak geliştirse de, akış hızı sınırsız
olarak azaltılamaz. Çünkü bu kabul edilemez uzun sürelerdeki alıkonma zamanlarına
neden olacaktır[40].

Şekil II.7. Sıvı kromatografide hareketli fazın hızının plaka yüksekliğine etkisi.

Çözünürlük

Seçicilik faktörü, α, bant merkezlerinin ayrımını tanımlasa da pik genişliğini


ifade etmez. Analitlerin birbirlerinden ne kadar ayrıldığını çözünürlük tanımlar. A ve
B analitlerinin çözünürlüğü;

R=1.5 değeri yeterli ayrılmanın olduğunu gösterir. Çözünürlük, kolon plaka sayısı ile
ilişkilendirilirse;

Yüksek çözünürlük bu üç terim artırılarak elde edilebilir. Kolon boyunu


uzatarak, teorik plaka sayısını artırmak, alıkonma zamanında artmaya neden olur ve

24
bu da bant genişlemesini artırır. Plaka sayısını artırmak yerine durgun faz partikül
büyüklüğünü küçülterek plaka yüksekliğini düşürmek mümkün olur.

Genel olarak kapasite faktörünü, kı, kontrol ederek ayrıştırma oldukça


iyileştirilebilir. Bu, gaz kromatografide kolon sıcaklığı, sıvı kromatografide hareketli
faz kompozisyonunu değiştirerek olur.

Kromatografik metodolojiler, örnek içindeki analitlerin ayrılmasını sağlarlar,


fakat modern konfirmasyon testlerinin gerekliliği olan tam bir tanımlamayı
sağlayamazlar. Bu nedenle birçok analitik metodoloji, daha kesin bilgi sağlayabilmek
için, dedeksiyon limitini artıran, daha spesifik veya kesin tanımlama sağlayabilecek
dedektörlerle birlikte kullanılır.

Kromatografik metodların modern kullanımı şu şekilde tanımlanmıştır.

1- Geleneksel kolon sıvı kromatografi metodları şimdi katı faz ekstraksiyonunda


olduğu gibi örnek hazırlama tekniği olarak kullanılmaktadır.

2- HPLC ve kapiler GC yarı - kesin veya tarama teknikleri olarak kullanılır.

3- Kromatografik metodlar, analit dedeksiyonunu artıran, kesin bir tanımlama ve


maddenin yapısı hakkında kesin bilgi sağlayan diğer analitik metodolojiler ile
kombinasyonları halinde kullanılırlar.

II.4.3 Gaz Kromtagrafisi Cihazı


Gaz-sıvı kromatografisinde genellikle sıvı haldeki numune bir enjeksiyon
bloğundan sisteme enjekte edilir. Enjeksiyon bloğunda yüksek sıcaklıklara tabi
tutularak gaz haline geçmesi ve inert bir taşıyıcı gaz ile kolona sürüklenmesi
sağlanır. Kolonun yapısında inert, katı bir destek maddesi üzerinde belli bir
kalınlıktaki sıvı faz bulunur. Sıvı sabit faz üzerinden taşıyıcı gazla birlikte geçen
numune bileşenleri dedektöre gelir ve burada dedektörün türüne göre
algılanırlar[38,39].

Bir gaz kromatografisi cihazı genel olarak aşağıdaki kısımlardan meydana gelir.

1- Taşıyıcı gaz kaynağı

3- Numune enjeksiyon sistemi

4- Kolon ve kolon fırını

5- Dedektör

25
GAZ FİLİTRELERİ

Regülatörler ELEKTROMETRE
ENJEKSİYON
AKIŞ BLOĞU DEDEKTÖR
KONTROLLERİ

BİLGİSAYAR
KOLON

Taşıyıcı
gaz
Dedektör Gazları
FIRIN

Şekil II.8. Gaz kromatografisi cihazı.

1- Taşıyıcı gaz kaynağı: Taşıyıcı gaz olarak genellikle helyum, argon, hidrojen,
karbondioksit, azot gibi inert gazlar kullanılır. Günümüzde çok küçük çaplı
kolonların kullanılması nedeni ile taşıyıcı gaz olarak genellikle helyum kullanılır.
Gaz kromatografisinin güvenilirligi taşıyıcı gazın akışının ve basıncının
ayarlanmasına bağlıdır. Taşıyıcı gazın basıncını ve akışını ayarlayan basınç
ayarlayıcılar, göstergeler ve akış ölçerler de gaz kaynağına bağlı diğer öğelerdir.
Taşıyıcı gazın içinde bulunan yabancı maddeler ve nem gazın yoluna konulan
moleküler elekler yardımı ile tutulur.

2- Numune enjeksiyon sistemi: Gaz kromatografi cihazına numune enjekte edilmesi


çok önemli ve dikkat edilmesi gereken bir işlemdir. Sıvı numuneler ya da inert bir
çözücüde çözülerek sıvı hale getirilmiş numuneler mikro enjektörler yardımıyla
buharlaştırma odasına verilir. Burada sıvı buharlaşır ve taşıyıcı gaz yardımıyla
kolona sürüklenir. Enjeksiyon gaz kromatografisinde çok önemlidir. Deneylerdeki
tekrarlanabilirlik büyük ölçüde buna bağlıdır. Bu nedenle bu işlem son zamanlarda
gaz kromatografi cihazına monte edilen bir otoenjektör ile yapılır. Enjekte edilen
örnek hacmi 1–10 µl arasında değişebilir.

3- Kolon ve kolon fırını: Kromatografide en önemli parametrelerden birisi kolon


seçimidir. Genel olarak kolonlar dolgulu ve kapiler olarak iki grupta toplanır. Ancak

26
günümüzde kapiler kolonlar kullanılmaktadır. Kapiler kolonlar kullanılarak çok
üstün bir ayırma sağlanmaktadır. Gaz kromatografisinde içindeki dolgu maddesi ve
uzunluğu farklı olan birçok ayırma kolonu kullanılır.

Hassas ve tekrarlanabilir çalışmalar için kolon sıcaklığı hassas bir şekilde


kontrol edilmelidir. Düşük sıcaklıklar iyi çözünürlük vermekle birlikte elüsyon
süresini arttırır. Eğer numune geniş kaynama noktası aralığına sahipse, sıcaklık
programı uygulanabilir. Burada kolon fırını sıcaklığı sürekli veya kademeli olarak
artırılarak ayrıştırma optimize edilebilir.

5- Dedektör: Bir GC detektörü taşıyıcı gazdan farklı bir malzemenin varlığını


algılayan ve bu bilgiyi elektrik sinyaline dönüştüren bir araçtır. Gaz
kromatografisinde farklı seçiciliklere sahip birçok farklı dedektör kullanılabilir. Bir
dedektörün, duyarlılığı yüksek ve geniş bir konsantrasyon aralığında lineer olmalıdır.
Ayrıca gaz akış hızı ve sıcaklık değişimlerinden etkilenmemeli ve uzun süre
dayanmalıdır.

Günümüzde kullanılan dedektörler şöyledir.

Termal iletkenlik dedektörü (TCD) : Filament sıcaklığı analitin taşıyıcı gaz içinde
bulunması durumunda yükselir, böylece filament rezistansı artar.

Alev iyonizasyon dedektörü (FID) : Alev içinde yanan maddenin ürettiği iyonlar
akım değişikliğine neden olur.

Elektron yakalama dedektörü (ECD) : Elektro negatif madde dedektörden geçerken


düşük enerjili termal iyonları yakalar, hücre içinde akım düşmesine neden olurlar.

Azot-fosfor dedektörü (NPD) : Azot ve fosforlu maddeler alkali metal tuzu buharı ile
zenginleştirilmiş alevde akımın yükselmesine neden olurlar.

II.4.4. Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi


Analitik kimya açısından kütle spektrometrinin gelişimi ve kullanılması son
derece önemlidir. Yüksek kesinlik ve doğrulukta analitik sonuçlar sağlayan kütle
spektrometrinin oldukça geniş bir kullanım alanı vardır.

Gaz kromatografisinde yukarıda sözkonusu edilen dedektörlere ek olarak kütle


spektrometresi (MS) dedektörü de kullanılır.

27
Bir GC-MS spektrometri prosesinde temel olarak numunenin girişi ve
iyonlaştırılması, sonra ayrılması ve kaydedilmesi gerekir (Şekil.II.9). Bu adımların
her birinin çeşitli alternatifleri vardır.

Şekil II.9. Bir Kütle Spektrometrenin Bileşenleri

II.4.5. Kütle Spektrometride Örneğin İyonlaştırılması


Aşağıda çalışmada kütle spektrometride kullanılan iyonlaştırma teknikleri kısaca
açıklanmıştır.

Elektronla Çarpma Kütle Spektrometrisi : Yeterli miktarda elektron enerjisi


numune molekülü ile çarpıştırılarak molekülden elektron koparılır. Bu durum şöyle
gösterilir.

M : + e- M :+ + 2e-

Eski olmasına rağmen populer bir tekniktir. Alternatif teknikler geliştirilse de


bunlar elektron impakt tekniğinin yerini tam olarak tutamamaktadır.

Elektronla çarpma ile iyonizasyon ancak gaz halindeki numune moleküllerine


uygulanabilir. Bu nedenle numunenin iyonizasyon odasına gelmeden önce gaz haline
geçmesini sağlayacak bir sistem kullanılmalıdır. İyonizasyon odasının basıncı çok
düşük (10-5 - 10-7 Torr) olmalıdır. Bunun için cihaza stratejik olarak yerleştirilmiş
çeşitli vakum pompaları kullanılır.

İyonizasyonun gerçekleşmesi için gelen elektron ışınının en azından numune


molekülünün iyonizasyon potansiyeline eşit olmalıdır. Genelde 70 eV luk bir
elektron ışını kullanılır. Çoğu organik moleküllerin iyonizasyon potansiyeli 7-13 eV
arasındadır. Bu değer (70eV) bunu kolaylıkla karşılar. Aslında bu durum, moleküle

28
basit bir iyonizasyon için gerekli olandan daha fazla enerji verir. Bu fazla enerji,
bağların kırılmasına neden olur ve değişken fakat tekrarlanabilir oranlarda kompleks
iyon karışımı oluşur.

Şekil II.10. da iyon kaynağının bir versiyonu görülmektedir. Gaz halindeki molekül
iyonizasyon odasına gelir ve ısıtılmış tungsten veya renyum telden yayılan elektron
ışınıyla bombardıman edilir.

Elektron Iyonizasyonu N

Filament Ekstraksiyon
lensleri

Numune
girişi + +
+
+ +
+ + + +
+ + + +
+ +
+

Kollector

Kaynak
magnet S

Şekil II.10. Elektronla çarpma iyon kaynağının yapısı.

Kimyasal İyonlaştırma Kütle Spektrometrisi : Kimyasal iyonizasyonda kaynağa


öncelikle reaktif bir gaz (metan, isobütan, amonyak vb.) girer ve yüksek enerjili
elektronlarla bombardıman edilir. Sonuçta gaz iyonize olur ve reaktif gaz iyonlarını
üretir. Gaz halindeki numune, çok miktarda reaktif gaz iyonları ile çarpıştırılır.İyon
kaynağındaki reaktif gaz miktarı numune miktarından fazla olmalıdır. Bu durum
numunenin direk iyonizasyonunu minimize eder.

Bu amaçla genellikle pozitif iyonlar kullanılır, ancak analitlerde


elektronegativitesi yüksek atomlar varsa, negatif iyonlarla kimyasal iyonlaştırma da
kullanılır.

29
En çok kullanılan reaktif gaz metandır. Metan molekülleri yüksek enerjili
elektronlarla etkileşerek CH4+, +
CH3 , CH2+ gibi bazı iyonlar meydana getirirler. Bu
iyonlar hızla diğer metan molekülleriyle reaksiyona girerler:

2CH4 + 2e- CH4+ + CH3+ + H . + 4e-

CH4+ + CH4 CH5+ + . CH3

CH3+ + CH4 C2H5+ + H2

Numune molekülü MH ile CH5+ veya C2H5+ arasında çarpışmalarda proton veya
hidrür aktarımı olur. Örneğin;

CH5+ + MH MH2+ + CH4 proton aktarımı

C2H5+ + MH MH2+ + C2H4 proton aktarımı

C2H5+ + MH M+ + C2H6 hidrür aktarımı

Proton aktarım reaksiyonları (M+1) + iyonu, hidrür aktarım reaksiyonları ise


(M-1) + iyonu veririler.
Kimyasal iyonizasyonda yük transferi reaksiyonunun enerjisi az olduğundan
numune moleküllerinde parçalanma az olur ya da hiç olmaz. Spektrumda moleküler
iyon piki kolaylıkla gözlenir.

II.4.6. Kütle Analizörleri


Kütle analizörleri farklı kütle/yük oranlarındaki iyonları ayırabilen cihazlardır.
Kütle analizörleri küçük kütle farklarını ayırt edebilecek duyarlılıkta olmalıdır.
Ayrıca analizörler kolayca ölçülebilir iyon akımları elde etmek için yeterli sayıda
iyon geçişi sağlayabilmelidir.

Magnetik Sektör Analizörleri: Kalıcı mıknatıslar ya da elektromıknatıslar


kullanılır. Bu mıknatıslar iyon kaynağından gelen demete 180, 90 veya 60 derecelik
açılarla dairesel hareket

yaptırırlar. Sistemde iyonların serbest hareket edebilmeleri için iç basınç 10-7 Torr
civarındadır. İyona etkiyen magnetik kuvvet, merkezkaç kuvvetle dengelenir.
Magnetik alan şiddeti doğrusal olarak değiştirildiğinde iyonlar kütle/yük oranlarına
göre sırayla dedektör üzerine düşerler. Magnetik alanın değişimi elektromagnetten
geçen akım değiştirilerek yapılır.

30
Kuadrupol Kütle Analizörleri : Kuadrupol kütle analizörlerinde elektrot olarak
kullanılan dört adet paralel silindirik çubuk kullanılır. (Şekil 12) Karşılıklı çubuklar
elektriksel olarak birbirine bağlıdır. Bir çift, doğru akım kaynağının pozitif tarafına,
diğer çift ise negatif tarafına bağlıdır. Ayrıca her çubuk çiftine değişebilir radyo-
frekanslı (180 derece faz dışı) alternatif akım potansiyeli uygulanır. Çubuklar
arasındaki boşluğa 5-10 V’luk bir potansiyel uygulanarak, iyonlar hızlandırılır. Bu
arada çubuklara uygulanan doğru akım ve alternatif akım potansiyelleri, oranları
sabit tutularak aynı anda arttırılır.

Kuadrupol cihazlar yüksek tarama hızına sahiptir. (< 100 ms) Ayrıca çok küçük
kütle farklarını bile ayırabilecek duyarlılıktadır.

+ + +

+
Şekil II.11. Kuadrupol kütle analizörü.

31
BÖLÜM III

TEZ ÇALIŞMALARI

III.1. ARAŞTIRMA ARAÇLARI

III.1.1. Kimyasal Maddeler


Sertifikalı asetamiprid standardı (Riedel-de-Haen) kullanıldı.

HPLC analizine uygun saflıkta su, asetonitril (Sigma Aldrich), diklormetan


(Riedel de Haen), metanol (Sigma Aldrich), heksan(Riedel de Haen), etilasetat
(Riedel de Haen), aseton (Sigma Aldrich), heptan (Sigma Aldrich) kullanıldı.

Na2SO4, HCI, H3PO4, NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4.7H2O, CH3COONa,


CH3COOH, NaHCO3, Na2CO3, NaOH (Merck) kullanıldı.

III.1.2 Malzemeler ve Aparatlar


Cam tüpler (10ml)

Balon jojeler (25, 50, 100, 500 ve 1000ml)

Erlenler (100, 250ml)

Cam Şişeler (20ml)

ITK plakaları (silika 254 , Merck)

Buzdolabı Arçelik

Pipetler : (1ml, 5ml, Eppendorf )

32
Dipenser : (0,2-2ml ve 1-5ml, Brand)

pH metre: Optik Ivymen System

pH elektrodu: Jenway

Terazi: Mettler Toledo, (maksimum:4100g; 0,1g hassasiyet ile)

Terazi: Mettler Toledo, (maksimum:41g; 0,01mg hassasiyet ile)

maksimum:210g; 0,1mg hassasiyet ile)

Girdaplı karıştırıcı : IKA MS2 Minishaker (maksimum 2500devir/dakika)

Santrifüj : Selecta Centronic BL (maksimum 4400 r.p.m.)

Ultrasonik banyo : Selecta Ultrasons

SPE kartuşları : ODS-C18, (C18 sorbent, 500mg,3ml Agilent),

StrataC18-E, (C18sorbent,500mg,6ml,Phenomenex),
Strata-X, (polimerik sorbent,30mg,1ml, Phenomenex)

Oasis HLB (C18+polimerik sorbent,100mg,3ml,Waters

Katı faz ekstraksiyon sistemi: Varian (Vac Elute SPE 24)

Vakum pompası: Edwards

Evaporatör : Zymark TurboVap LV Evaporator

HPLC analitik kolonları:

Sinergy 44 MAX-RP 80A (250mmx4,6mm, 4mikronmetre, Phenomenex )

LiRP18-5-4623 (250mmx4,6mm, 5mikronmetre, HiChrom)

LiRP8-5-3931 (250mmx4,6mm, 5mikronmetre, HiChrom)

GC analitik kolonları:

HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm, %5 fenil metil siloksan, JW)

DB-1701 (30mx0,25mmx0,25µm, %14 siyanopropil fenil)

metilpolisiloksan, JW)

33
III.1.3. Kullanılan Analitik Cihazlar

Cihaz Marka Model Yazılım Programı

HPLC-DAD Agilent 1100 Chemstation

GC Agilent 6890 Chemstation

MS Agilent 5973 Chemstation

GC Agilent 6890

NPD Agilent Chemstation

ECD Agilent Chemstation

UV-VIS Spektrofotometre Shimadzu

NMR Varian Mercury Vx 400 MHz.

III.1.4 Standart Çözeltilerin Hazırlanması


Standart asetamiprid çözeltileri HPLC ve GC-MS metotlarının kalibrasyonu ve
bal örneklerinin kirletilmesi amacıyla hazırlandı.

III.1.4.1 HPLC için standart asetamiprid çözeltilerinin hazırlanması


Balda asetamiprid kalıntısı tayini için ve 100 ppm seviyesinde asetamiprid ile
kirletilen baldaki asetamiprid seviyesinin izlenmesi için iki farklı kalibrasyon eğrisi
hazırlandı.

Kalıntı tayini için hazırlanan kalibrasyon çözeltileri

Kalıntı analizi için 1,0, 0,50, 0,20, 0,10, 0,050, 0,020, 0,010, 0,0010 µg/ml
konsantrasyonlarındaki standart asetamiprid çözeltileri mobil faz (asetonitril/su,
50/50, v/v) içinde hazırlandı.

Ana çözelti(100 µg/ml) hazırlanması: 10,00 mg standart asetamiprid, 100ml mobil


faz içinde çözüldü,

Ara çözeltilerin hazırlanması:

1,0 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 1,0 ml alınıp aseton ile 100ml ye
tamamlandı.

34
1,0 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 1,0 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile 100ml
ye tamamlandı.

0,50 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 0,50 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
100ml’ye tamamlandı.

0,20 µg/ml standart çözelti: Ana stok çözeltiden 0,20 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
100ml’ye tamamlandı.

0,10 µg/ml standart çözelti: 1,0 µg/ml’lık ara çözeltiden 1,0 ml alınıp mobil faz
çözeltisi ile 10ml’ye tamamlandı.

0,050 µg/ml standart çözelti: 1,0 µg/ml’lık ara çözeltiden 1,0 ml alınıp mobil faz
çözeltisi ile 20ml’ye tamamlandı.

0,020 µg/ml standart çözelti: 1,0 µg/ml’lık ara çözeltiden 0,40 ml alınıp mobil faz
çözeltisi ile 20ml’ye tamamlandı.

0,010 µg/ml standart çözelti: 0,10µg/ml’lık ara çözeltiden 2,0 ml alınıp mobil faz
çözeltisi ile 20ml’ye tamamlandı.

0,0010 µg/ml standart çözelti: 0,10µg/ml’lık ara çözeltiden 0,2 ml alınıp mobil faz
çözeltisi ile 20ml’ye tamamlandı.

Kararlılık çalışmaları için kirletilen bal örneklerindeki asetamiprid seviyesi tayini


için, 100,0, 50,0, 25,0, 10,0 5,0 ve 1,0µg/ml konsantrasyonlarında standart
asetamiprid çözeltileri mobil faz (asetonitril/su, 50/50, v/v) içinde hazırlandı.

Yüksek konsantrasyonda asetamiprid çözeltilerinin hazırlanması

50,0µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 10,0 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
20ml’ye tamamlandı.

25,0µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 5,0 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
20ml’ye tamamlandı.

10,0µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 2,0 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
20ml’ye tamamlandı.

5,0µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 1,0ml alınıp mobil faz çözeltisi ile 20ml’ye
tamamlandı.

1,0 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 1,0ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
100ml’ye tamamlandı.

35
III.1.4.2. GC-MS için standart asetamiprid çözeltilerinin hazırlanması

Asetamiprid kalıntısı tayini için ve 100 ppm seviyesinde asetamiprid ile


kirletilen baldaki asetamiprid seviyesinin izlenmesi için iki farklı kalibrasyon eğrisi
hazırlandı.

Kalıntı tayini için hazırlanan kalibrasyon çözeltileri

5,0, 1,0, 0,50, 0,20, 0,10 µg/ml konsantrasyonlarındaki standart asetamiprid


çözeltileri aseton içinde hazırlandı.

Ana çözelti(100 µg/ml) hazırlanması: 10,00 mg standart asetamiprid, 100 ml aseton


içinde çözüldü.

Ara çözeltilerin hazırlanması:

1,0 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 1,0 ml alınıp aseton ile 100ml’ye

tamamlandı.

0,50 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 0,5 ml alınıp aseton ile 100ml’ye
tamamlandı.

0,20 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 0,2 ml alınıp aseton ile 100ml’ye
tamamlandı.

0,10 µg/ml standart çözelti: 1,0 µg/ml’lık ara çözeltiden 1 ml alınıp aseton ile
10ml’ye tamamlandı.

Yüksek konsantrasyonda asetamiprid çözeltilerinin hazırlanması

Kirletilen bal örneklerindeki asetamiprid seviyesi tayini için, 100,0, 50,0, 25,0,
10,0, 5,0 µg/ml konsantrasyonlarında standart asetamiprid çözeltileri aseton içinde
hazırlandı.

50,0 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 10,0 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
20ml’ye tamamlandı.

25,0 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 5,0 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
20ml’ye tamamlandı.

10,0 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 2,0 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
20ml’ye tamamlandı.

36
5,0 µg/ml standart çözelti: Ana çözeltiden 1,0 ml alınıp mobil faz çözeltisi ile
20ml’ye tamamlandı.

III.1.5 Tampon Çözeltilerin Hazırlanması


Hazırlanan çözeltiler aşağıda verilen oranlarda karıştırılarak hazırlandı.
Tampon çözeltilerin pH ayarları pHmetre ile kontrol edildi. 1 gün sonra tekrar pH
kontrolü yapıldı. Çözeltilerin pH değerlerinde değişim görülmedi.
pH:1,30; 0,05 M HCI
pH:2,00; 0,05 M H3PO4 - 0,05 M NaH2PO4,2H2O
pH:3,00; 0,05 M H3PO4 - NaH2PO4,2H2O
pH:4,00; 0,1M CH3COONa - 0,1M CH3COOH
pH:5,00; 0,1M CH3COONa - 0,1M CH3COOH
pH:6,00; 0,1M NaH2PO4,2H2O - 0,1M Na2HPO4,7H2O
pH:7,00; 0,1M NaH2PO4,2H2O - 0,1M Na2HPO4,7H2O
pH:8,00; 0,1M NaH2PO4,2H2O - 0,1M Na2HPO4,7H2O
pH:9,00; 0,1M NaHCO3 - 0,1M Na2CO3
pH:10,00; 0,1M NaHCO3 - 0,1M Na2CO3

III.2. YAPILAN DENEYLER


Balda asetamipridin kalıntı analizi için uygun yöntemin belirlenebilmesi
amacıyla HPLC ve GC-MS cihazları ile denemeler yapıldı. Kabul edilebilir
kromatografik karakteristiklerle, düşük tayin sınırına sahip, doğru, hızlı ve
uygulaması kolay bir metot geliştirilmeye çalışıldı.

III.2.1. HPLC Metodu Geliştirilmesi


HPLC ile asetamiprid kalıntısı tayini metodu geliştirilmesi amacıyla farklı mobil
faz bileşimleri, kolonlar, enjeksiyon hacimleri ve sıcaklıklarda çalışıldı.
Asetamiprid tayini için optimum kromatografik koşulları elde edebilmek
amacıyla, farklı polaritelerdeki mobil fazlar izokratik ve gradient olarak, farklı
partikül boyutlarındaki C18 ve C8 dolgulu kolonlarda, farklı sıcaklıklarda, farklı
enjeksiyon hacimlerinde çalışıldı.
Deneme sonuçları aşağıdaki şekillerde gösterildi. Açıklamalarda ise değiştirilen
parametre italik olarak yazıldı.

37
Denenen Kolonlar

C8 ve farklı partikül boyutundaki C18 kolonları kullanıldı. Bu kolonların özellikleri


ve ticari isimleri aşağıda verilmiştir.

Sinergy 44 MAX-RP 80A (250mmx4,6mm, 4mikronmetre, Phenomenex )

LiRP18-5-4623 (250mmx4,6mm, 5mikronmetre, HiChrom)

LiRP8-5-3931 (250mmx4,6mm, 5mikronmetre, HiChrom)

Denenen Mobil Faz Bileşimleri

- Su (%100)

- Metanol: KH2PO4; (60:40), (70:30), (gradient)

- Metanol:Su, (60:40), (50:50)

- Metanol (%0,01, asetik asit,v/v): Su (%0,01, asetik asit,v/v);

(50:50),(60:40),(70:50),(80:20)

- Asetonitril:Su (30:70),(40:60), (50:50), (60:40)

Denenen Sıcaklık

- 20 oC,

- 40 oC

- 60oC

Denenen Enjeksiyon Hacimleri

- 10 µl

- 20 µl

- 50 µl

Uygun analiz süresinde, en düşük tayin sınırını sağlayan, kromatografik olarak


kabul edilebilir pik karakteristiklerine ulaşılana kadar optimizasyon çalışmalarına
devam edildi. Aşağıda, optimizasyon denemelerine ait kromatogramlar, analiz
koşulları ve kromatografik parametreleri ile birlikte verildi.

Mobil Faz: A. Metanol B. KH2PO4 (0,05M)

Dakika %A

38
0-3 5
3-10 5-40
10-15 40
15-20 40-100
20-25 100
25-30 100-5
30-35 5
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP3.D)

24.757

25.502
mAU

25.233
23.341
23.767
23.961
16.166
40

21.535
5.750
20

0
0 5 10 15 20 25 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP3.D)

24.757

25.503
23.051
5.751

mAU

16.162

23.961
23.757

25.231
21.537
20

10

0
0 5 10 15 20 25 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP3.D)

25.504
mAU
5.752

24.757
23.766

25.232
23.059
30

16.159

21.541
20
10
0
0 5 10 15 20 25 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP3.D)

25.504
mAU
5.751

24.757
40

23.765

25.232
23.062
30
16.158

21.541
20
10
0
0 5 10 15 20 25 min

Şekil III.1. Akış Hızı: 1ml/dakika, kolon: LiRP8-5-3931 (250mmx4,6mm, 5µm,


HiChrom), enjeksiyon hacmi: 10µl, sıcaklık:50oC, λ: 245,254,268,
270nm, koşullarında elde edilen kromatogram.(gradient bileşimi
yukarıda verilmiştir).

Tablo III.1. Şekil III.1 için kromatografik bulgular.

tR Alan Boy w1/2 Simetri


16,15 957 21 0,559 0,286

Bu denemede asetamiprid kabul edilebilir pik karakteristiklerinde elde


edilemedi. Pik simetrisi 1’den çok küçük ve kuyruklanma var. Ayrıca pikin başlangıç
ve bitiş zamanı, istenen şekilde ince bir pik sağlayamayacak kadar uzun sürede
olduğundan daha iyi sonuç için bir sonraki denemede asetamipridin elue olduğu 16.
dakika civarındaki mobil faz kompozisyonu izokratik olarak çalışıldı.

39
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP2.D)

24.658
25.345
mAU

25.098
23.885
23.690
23.323
40 ASETAMIPRID

21.516

31.350
16.464
30

5.759
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP2.D)

24.658
25.345
23.878
22.984
mAU

22.450
5.758

16.192

21.517

31.344
20

10

0
0 5 10 15 20 25 30 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP2.D)

25.347
mAU

24.658
25.100
23.685
22.992
30

5.757

31.326
21.518
20

16.188
10
0
0 5 10 15 20 25 30 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP2.D)

25.347
mAU

24.658
25.099
23.683
22.994
30
5.757

31.324
21.517
16.187
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 min

Şekil III.2. Mobil Faz: Metanol:KH2PO4 (0,05M) (60:40,v/v),kolon: LiRP8-5-3931


(250mmx 4.6mm, 5µm, HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon
hacmi: 10µl, sıcaklık: 50oC, λ: 245, 254, 268 ve 270nm, koşullarında
elde edilen kromatogram.

Tablo III.2. Şekil III.2 için kromatografik bulgular.

tR Alan Boy W1/2 Simetri


16,18 168 4 0,542 0,314

Bu denemede de elde edilen sonuçlar bir önceki denemeye göre iyileşme


sağlanamadı ve kabul edilebilir bulunmadı.
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP5.D)
4.039
4.474

mAU
400
300
3.306

200
3.700
2.718

100
0
0 5 10 15 20 25 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP5.D)
4.039

mAU
600
4.472

400
3.305
3.688
2.717

200

0
0 5 10 15 20 25 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP5.D)
4.040

mAU

600
4.463

400
3.304
3.675
2.716

200
0
0 5 10 15 20 25 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP5.D)
4.040

mAU

600
4.461

400
3.304
3.682
2.716

200
0
0 5 10 15 20 25 min

Şekil III.3. Mobil faz: Metanol:KH2PO4 (0,05M),(70:30,v/v), akış hızı: 1ml/dakika,


kolon: LiRP8-5-3931(250mmx4,6mm, 5µm, HiChrom), enjeksiyon
hacmi:10µl, sıcaklık : 50oC, λ: 245, 254, 268, 270nm, koşullarında elde
edilen kromatogram.

Tablo III.3. Şekil III.3 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
4,04 1206 72 0,181 0,37

40
Şekil III.4. Mobil Faz:Su, akış hızı:1ml/dakika,kolon: LiRP8-5-31,250mmx4,6mm,
5µm, HiChrom), enjeksiyon hacmi: 50µl, sıcaklık:25oC, λ: 248 nm,
koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.4. Şekil III.4. için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
65,823 3511 325 0,142 1,64

Bu denemede pik karakteristikleri daha iyileşmiş olsa da elusyon süresi çok uzun
olduğundan alıkonma zamanını azaltmak için mobil faz polaritesi, miktarı kademeli
olarak artırılan metanol ile optimize edilmeye çalışıdı.

Şekil III.5. Mobil Faz:Su-Metanol(75:25), akış hızı:1ml/dakika, kolon:LiRP8-5-


3931 (250mmx4.6mm,5µm, HiChrom), enjeksiyon hacmi:50µl,
sıcaklık: 25oC, λ: 248 nm, koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.5. Şekil III.5. için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
14,314 3957 56 1,033 0,61

41
DAD1 A, Sig=248,4 Ref =360,100 (HPLCREC\ATP4.D)
mAU

6 .774
10

1 .697
6

0 2 4 6 8 10 12 min
Şekil III.6. Mobil Faz:Su-Metanol(50:50), akış hızı:1ml/dakika, kolon:LiRP8-5-
3931(250mmx4,6mm,5µm,HiChrom), enjeksiyon hacmi:50µl,
sıcaklık: 25oC, λ: 248 nm, koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.6. Şekil III.6. için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
6,774 405 11,6 0,491 0,584

DAD1 A, Sig=248,4 Ref =360,100 (HPLCREC\ATP5.D)


5 .1 96

mAU

35

30

25
5.902

20

15

10
1.776

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
Şekil III.7. Mobil Faz :Su-Metanol (25:75) ,akış hızı : 1ml/dakika, kolon: LiRP8-5
-3931(250mmx4,6mm, 5µm, HiChrom) , enjeksiyon hacmi:50µl,
sıcaklık: 25oC, λ: 248 nm, koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.7. Şekil III.7 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
5,19 1122 37 1,25 0,249

42
DAD1 A, Sig=248,4 Ref =360,100 (HPLCREC\ATP8.D)

4 .820
mAU

22

20

18

16

14

12

0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 min

Şekil III.8. Mobil Faz :Metanol , akış hızı : 1ml/dakika, kolon: LiRP8-5-3931
(250mmx4,6mm,5µm,HiChrom), enjeksiyon hacmi:50µl sıcaklık:
25oC, λ: 248 nm, koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.8. Şekil III.8. için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
4,82 393 11 0,437 1,96

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP8.D)


3.762

mAU

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 m in
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP8.D)
3.762

mAU
7
6
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 m in
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP8.D)
3.764

mAU

3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 m in

Şekil III.9. Mobil Faz:Metanol:Su (50:50), akış hızı : 1ml/dakika, kolon: LiRP18-5-
4623(250mmx4,6mm,5µm,HiChrom), enjeksiyon hacmi:10µl,sıcaklık:
40oC, λ: 245, 254, 268nm, koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.9. Şekil III.9 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
3,762 473 8,5 0,705 0,137

Metanol-Su (50:50) karışımı ile elde edilen bulgular önceki çalışmalara göre
daha iyi ancak hala istenen düzyde olmadığından bu mobil faz kompozisyonu ile
sıcaklık, enjeksiyon hacmi, pH gibi parametrelerle iyileştirilmeye çalışıldı (Şekil
III.9-16).

43
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP9.D)

3.754
mAU

12
10
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP9.D)

3.753
mAU

10
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP9.D)

3.755
mAU
6
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 min

Şekil III.10. Mobil Faz : Metanol:Su(50:50), kolon:LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm,


5µm, HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi :20µl,
sıcaklık:40oC, λ:245, 254, 268nm, koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.10. Şekil III.10 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
3,754 526 13,5 0,532 0,235
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP10.D)
3.772

mAU

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP10.D)
3.772

mAU
35
30
25
20
15
10
5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP10.D)
3.772

mAU
17.5
15
12.5
10
7.5
5
2.5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 min

Şekil III.11. Mobil Faz:Metanol:Su(50:50), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm,


5µm,HiChrom) , akış hızı: 1ml/dakika , Enjeksiyon Hacmi : 50µl,
sıcaklık:40oC, λ: 245, 254, 268nm, koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.11. Şekil III.11. için kromatografik bulgular


tR Alan Boy W1/2 Simetri
3,772 2596 44 0,772 0,154

44
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP12.D)

3.726
mAU

12
10
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP12.D)

3.726
mAU
12
10
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP12.D)

3.728
mAU
6
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 min

Şekil III.12.Mobil Faz :Metanol:Su (50:50), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm,


5µm,HiChrom), akış hızı:1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:50µl,
sıcaklık: 50oC, λ: 245, 254, 268nm, koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.12. Şekil III.12. için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
3,726 315 15 0,308 0,429

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP13.D)


3.779

mAU

14
12
10
8
6
4
2
0
0 2 4 6 8 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP13.D)
3.780

mAU
14
12
10
8
6
4
2
0
0 2 4 6 8 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP13.D)
3.780

mAU
7
6
5
4
3
2
1
0
0 2 4 6 8 min

Şekil III.13. Mobil Faz: Metanol(%0,01 HAc):SU(%0,01HAc), (50:50,v/v), kolon:


LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm,5µm,HiChrom),akış hızı:1ml/dakika,
enjeksiyon hacmi: 10µl, sıcaklık: 40oC, λ: 245, 254, 268nm, koşullarında
elde edilen kromatogram.

Tablo III.13. Şekil III.13. için kromatografik bulgular


tR Alan Boy W1/2 Simetri
3,779 339 17 0,277 0,334

45
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP14.D)

3.817
mAU
70
60
50
40
30
20

1.760
10
0
0 2 4 6 8 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP14.D)

3.817
mAU

60
50
40
30
20

1.761
10
0
0 2 4 6 8 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP14.D)

3.817
mAU

30
25
20
15
10
1.760

5
0
0 2 4 6 8 min

Şekil III.14.Mobil Faz: Metanol (%0,01 HAc) : SU (%0,01HAc), (50:50,v/v), kolon:


LiRP18-5-4623 (250mmx4,6mm, 5µm, HiChrom), akış hızı:1ml/
dakika, enjeksiyon hacmi:50µl, sıcaklık:40oC, λ:245,248, 254nm,
koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.14. Şekil III.14 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
3,817 1826 80 0,317 0,337
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP15.D)
3.591

mAU

80

60

40

20

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP15.D)
3.591

mAU
80

60

40

20

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP15.D)
3.591

mAU

40

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 min

Şekil III.15. Mobil Faz: Metanol(%0,01 HAc):SU(%0,01HAc), (70:30,v/v), kolon:


LiRP18-5-4623 (250mmx4,6mm, 5µm, HiChrom), akış hızı:1ml/
dakika, enjeksiyon hacmi:50µl, sıcaklık: 40oC, λ: 245, 254, 268nm,
koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.15. Şekil III.15 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
3,591 2054 99 0,280 0,298

46
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP17.D)

3.449
m AU

40

30

20

10

0 1 2 3 4 5 6 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP17.D)

3.449
m AU

40

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5 6 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLC OP~1\ATP17.D)

3.450
m AU

20

15

10

0
0 1 2 3 4 5 6 min

Şekil III.16. Mobil Faz: Metanol(%0,01 HAc):SU(%0,01HAc), (80:20,v/v), kolon:


LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm, 5µm, HiChrom), akış hızı:
1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:50µl, sıcaklık:40oC, λ:245,254,268nm,
koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.16. Şekil III.16 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
3,449 1895 56 0,434 0,201

Metanol-su karışımı ile farklı parametreler kullanılarak iyileştirilmeye çalışıldı


ancak sonuçlar hala kabul edilebilir bulunmadı. Bu nedenle metanol yerine
literatürde de neonikotinoid insektisitlerin likit kromatografik analizlerinde
kullanılıdığı bildirilen asetonitril ile deneme yapılmaya karar verildi[50].
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP20.D)
3.579

mAU
50
40
30
20
1.352

10
0

0 2 4 6 8 min
DAD1 B, Sig=254,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP20.D)
3.578

mAU

40

30

20
1.353

10

0 2 4 6 8 min
DAD1 C, Sig=268,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP20.D)
3.578

mAU

20
15
10
1.354

5
0
-5
0 2 4 6 8 min

Şekil III.17. Mobil Faz:ACN:SU (60:40,v/v),kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm,


5µm,HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi: 10µl,
sıcaklık :50oC, λ: 245nm, 248nm, 254nm, koşullarında elde edilen
kromatogram.
Tablo III.17. Şekil III.17 için kromatografik bulgular.

tR Alan Boy W1/2 Simetri


3,579 1732 64 0,387 0,455

47
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP231.D)

3.860
mAU

100
80
60
40

1.197
20
0
0 1 2 3 4 5 6 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP231.D)

3.860
mAU

100
80
60
40

1.197
20
0
0 1 2 3 4 5 6 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP231.D)

3.860
mAU
100

80

60

40
1.196

20
0
0 1 2 3 4 5 6 min

Şekil III.18. Mobil Faz: ACN:SU (50:50,v/v, kolon: LiRP18-5-623(250mmx4,6mm,


5µm, HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:10µl,
sıcaklık : 50oC, λ: 245nm, 248nm, 254nm, koşullarında elde edilen
kromatogram.

Tablo III.18. Şekil III.18. için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
3,86 2721 128 0,295 0,31
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP25.D)
4.526

mAU
20

15

10

0 2 4 6 8 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP25.D)
4.526

mAU
20

15

10

0 2 4 6 8 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP25.D)
4.527

mAU
17.5
15
12.5
10
7.5
5
2.5
0

0 2 4 6 8 min

Şekil III.19. Mobil Faz:ACN:SU(40:60,v/v), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm,


5µm,HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi:10µl,
sıcaklık:50oC, λ:245, 248, 254nm, koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.19. Şekil III.19 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
4,526 966 23 0,582 0,273

48
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP26.D)

5.728
mAU
40

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP26.D)

5.728
mAU
40

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP26.D)

5.728
mAU
35
30
25
20
15
10
5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min

Şekil III.20.Mobil Faz:ACN:SU (30:70,v/v), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm,


5µm,HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi: 10µl,
sıcaklık:50oC, λ: 245, 248, 254nm, koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.20. Şekil III.20 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2 Simetri
5,728 2572 44 0,764 0,202
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP272.D)
3.839

mAU

100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP272.D)
3.839

mAU

100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP272.D)
3.839

mAU
100

80

60

40

20

0
0 1 2 3 4 5 6 7 min

Şekil III.21. Mobil Faz:ACN(%0,02HAc):SU(%0,02HAc,(50:50,v/v, kolon: LiRP18-


5-4623(250mmx4,6mm,5µm, HiChrom), akış hızı: 1ml/dakika,
enjeksiyon hacmi: 50µl, sıcaklık:40oC, λ: 245, 248,254nm, koşullarında
elde edilen kromatogram

Tablo III.21. Şekil III.22 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy w1/2 Simetri
3,847 1047 47 0,305 0,278

49
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP291.D)

3.845
mAU

100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP291.D)

3.845
mAU

100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP291.D)

3.845
mAU

100

80
60

40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min

Şekil III.22. Mobil Faz: ACN (%0,04HAc): SU (%0,04HAc), (50:50,v/v), kolon:


LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm,5µm,HiChrom), akış hızı:1ml/
dakika, enjeksiyon hacmi: 50µl, sıcaklık : 40oC, λ: 245, 254, 268nm,
koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.22. Şekil III.22 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy w1/2 Simetri
3,845 2711 130 0,283 0,276
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP30.D)

3.669
mAU

100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP30.D)
3.669

mAU

100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP30.D)
3.669

mAU
100

80

60

40

20

0
0 1 2 3 4 5 min

Şekil III.23. Mobil Faz:ACN:SU(50:50,v/v), kolon: LiRP18-5-4623(250mmx4,6mm,


5µm,HiChrom) , akış hızı: 1ml/dakika, enjeksiyon hacmi: 50µl,
sıcaklık:65oC, λ: 245, 248, 254nm, koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.23. Şekil III.23 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy w1/2 Simetri
3,669 2847 126 0,306 0,252

50
Asetonitril, metanolde daha iyi sonuçlar verdi. Ancak iyileştirme için uygulanan
değişiklikler (enjeksiyon hacmi, mobil faz bileşimi, mobil fazın pH’ı vb.) yeterli
iyileştirmeyi sağlayamadı. Bu nedenle partikül çapı 4mikron olan yine C18 durgun
fazı ile çalışıldı.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP32.D)

3.993
mAU

400

300

200

100

2.834
0
0 1 2 3 4 5 6 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP32.D)

3.993
mAU

400

300

200

100

2.832
0
0 1 2 3 4 5 6 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (HPLCOP~1\ATP32.D)

3.993
mAU
400

300

200

100
2.832

0
0 1 2 3 4 5 6 min

Şekil III.24. Mobil Faz:ACN:SU (50:50,v/v), kolon: Sinergy 44 MAX-RP 80A


(250mmx4,6mm,4µm , Phenomenex ), akış hızı: 1ml/dakika,
enjeksiyon hacmi: 50µl, sıcaklık : 40oC, λ: 245, 248, 254nm,
koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.24. Şekil III.24 için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy w1/2 Simetri
3,993 2314 494 0,07 0,986

Sonuç olarak asetamiprid için, Sinergy 44 MAX-RP 80A (250mmx4,6mm,4µm,


Phenomenex ) kolon ile, 1ml/dakika akış hızında ACN:SU (50:50,v/v) mobil fazı ile
40oC’de ve 50 µl enjeksiyon hacminde en yüksek absorbans 248nm’de elde edildi.

Balda asetamiprid kalıntısı tayini için geliştirilen HPLC metodu parametreleri


aşağıdaki şekilde belirlendi.
Mobil faz: Asetonitril:Su(50:50,v/v)

Analitik kolon: Sinergy 44 MAX-RP 80A (250mmx4,6mm, 4µm, Phenomenex )

Dalga boyu: 248nm


Sıcaklık:40 oC
Enjeksiyon hacmi: 50µl

51
III.2.2. GC Metodu Geliştirilmesi
Gaz kromatografisi ile asetamiprid kalıntısı tayini metodu geliştirilmesi amacıyla
farklı dedektörler, kolonlar, sıcaklık programları, enjeksiyon hacimleri ile çalışılarak
doğru, hızlı ve güvenilir bir metot geliştirilmesi amaçlandı.
Asetamiprid kalıntısı tayini için optimum kromatografik koşulları elde
edebilmek amacıyla, farklı GC dedektörleri (NPD, ECD, MSD), farklı polaritelerdeki
kolonlar ile sıcaklık programlarını, taşıyıcı gazın akış hızını ve enjeksiyon
hacimlerini değiştirerek çalışıldı.
Deneme sonuçları aşağıdaki şekillerde gösterildi. Açıklamalarda ise değiştirilen
parametre italik olarak yazıldı.

HPLC çalışmalarında olduğu gibi uygun analiz süresinde, en düşük tayin sınırını
sağlayan, kromatografik olarak kabul edilebilir pik karakteristiklerine ulaşılana kadar
optimizasyon çalışmalarına devam edildi. Aşağıda, optimizasyon denemelerine ait
kromatogramlar, analiz koşulları ve kromatografik parametreleri ile birlikte verildi.

Şekil III.25. Kolon: HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:


300oC, Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dakika),20 oC /dakika hız ile
300 oC (2 dakika), Akış Hızı: 1ml/dk, Enjeksiyon Hacmi: 1µl,
splitless, Dedektör: NPD koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.25. Şekil III.25 için kromatografik bulgular.


tR Alan W1/2
12,18 2973601 0,03

52
Şekil III.26. Kolon: HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dakika),20 oC /dakika hız ile 300 oC
(2 dakika), Basınç programı:110kPa (2dakika), 10kPa/dakika Hızla 200kPa
(2 dakika), Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless, Dedektör: NPD, koşullarında
elde edilen kromatogram.

Tablo III.26. Şekil III.26 için kromatografik bulgular.


tR Alan w1/2
12,01 3558640 0,04

Şekil III.27. Kolon: HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:


300oC, Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dakika),20 oC /dakika hız ile
300 oC (2 dakika), Akış Hızı: 2ml/dakika Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless,
Dedektör: NPD, koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.27. Şekil III.27 için kromatografik bulgular.


tR Alan w1/2
11,91 16974823 0,032

53
Şekil III.28. Kolon: HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:
300oC, Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dakika), 20 oC /dakika hız ile
300 oC (2 dakika), Akış Hızı: 2ml/dakika Enjeksiyon Hacmi: 2µl, splitless,
Dedektör: NPD, koşullarında elde edilen kromatogram

Tablo III.28. Şekil III.28 için kromatografik bulgular.


tR Alan w1/2
11,91 31012515 0,03

Şekil III.29. Kolon: HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:300oC,


Kolon Başlangıç Sıcaklığı:100 oC (2 dakika), 20 oC /dakika hızla 300 oC
(2 dakika), Akış Hızı: 2ml/dakika, Enjeksiyon Hacmi: 4µl, splitless,
Dedektör: NPD, koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.29. Şekil III.29 için kromatografik bulgular.


tR Alan w1/2
11,91 38547990 0,027

54
Şekil III.30. Kolon: DB1701(30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı: 300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı:100oC(2dakika),20oC/dakika hız ile300 oC (2dakika),
Akış Hızı: 1ml/dakika, Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless, Dedektör: ECD.
koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.30. Şekil III.30 için kromatografik bulgular.


tR Alan w1/2
10,04 1231391517 0,03

Şekil III.31. Kolon: HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı: 300oC,


Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 100 oC (2 dakika),20 oC /dakika hız ile 300 oC
(2dakika), Akış Hızı: 1ml/dakika Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless, Dedektör:
MSD, Arayüz Sıcaklığı: 300 oC, İyonizasyon Enerjisi: 70 eV,
İyonizasyon: EI, Scan, koşullarında elde edilen total iyon kromatogramı
ve kütle spektrumu.

Tablo III.31. Şekil III.31 için kromatografik bulgular.


tR Alan w1/2
11,23 718299 0,09

55
Şekil III.32.Kolon: HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı: 300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 70 oC (3,5dakika),50 oC /dakika hız ile 300 oC (7dk),
Akış Hızı: 1ml/dakika Enjeksiyon Hacmi: 1µl, splitless, Arayüz Sıcaklığı:
300 oC, İyonizasyon Enerjisi: 70 eV, İyonizasyon: EI, Scan,
koşullarında elde edilen kromatogram ve kütle spektrumu.
Tablo III.32. Şekil III.32 için kromatografik bulgular.
tR Alan w1/2
9,62 2021844 0,03

Şekil III.33.Kolon: HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı: 280oC,


Kolon Başlangıç Sıcaklığı: 70 oC (3,5 dakika),50 oC /dakika hız ile 300 oC (7dk)
Akış Hızı: 1ml/dakika Enjeksiyon Hacmi: 2µl, pulsed splitless, Arayüz
Sıcaklığı: 300 oC, İyonizasyon Enerjisi:70 eV, İyonizasyon: EI, Scan
koşullarında elde edilen kromatogram.

Tablo III.33. Şekil III.33. için kromatografik bulgular.


tR Alan Boy W1/2
9,55 12838126 12838126 0,018

56
Şekil III.34. Kolon: HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm), Enjeksiyon Sıcaklığı:300oC,
Kolon Başlangıç Sıcaklığı:100 oC (2 dakika), 20 oC /dakika hızla 300 oC (2dk),
Akış Hızı: 1ml/dakika Enjeksiyon Hacmi: 1µl, pulsed splitless, Arayüz
Sıcaklığı: 300 oC, İyonizasyon Enerjisi: 70 eV, İyonizasyon: EI, SIM
(m/z; 152,126 ), koşullarında elde edilen kromatogram ve kütle spektrum

Tablo III.34. Şekil III.34 için kromatografik bulgular. (100ng/ml asetamiprid)


tR Alan w1/2
9,11 134262 0,03

III.2.3. Ekstrakiyon Metodu Geliştirilmesi


10ml’lik cam tüp içindeki 1g bal 2ml su ile karıştırıldıktan sonra (su için 1ml
örnek) üzerine 3ml diklormetan ilave edildi ve 3 dakika girdaplı karıştırıcıda
2500devir/dakika hızda karıştırıldı. Fazların ayrılması için 4400 r.p.m. de 5 dakika
santrifüj edildi. Alttaki organik faz temiz bir tüpe aktarıldı. Sulu faza tekrar 3 ml
diklormetan ilave edilerek işlem tekrarlandı. Organik fazlar birleştirildi ve
evaporatörde azot buharında çözücüsü uçuruldu. Kalıntı 1ml mobil faz içinde
çözülerek HPLC ile analiz edildi.

Balda asetamipridin kararlılığı için yapılan analizlerde yukarıdaki işlem


uygulandıktan sonra kalan sulu fazın pH’ı 0,1N NaOH ile 13’e ayarlandıktan sonra
tekrar 2x3ml diklormetan eklenerek karıştırıldı ve tüm organik fazlar birleştirilerek

57
azot atmosferinde kuruluğa kadar uçuruldu[27]. Kalıntı HPLC analizleri için 1ml
mobil fazda, GC-MS analizleri için 1ml aseton içinde yeniden çözüldü.

III.2.3.1. Sıvı-Sıvı Ekstraksiyon (LLE)

Baldan ve sulu ortamdan asetamiprid ekstraksiyonu amacıyla heksan, etil asetat


ve diklormetan ve heptan çözücüleri kullanılarak en yüksek geri kazanım oranını ve
en az karışık kromatogramı sağlayan çözücü belirlendi. 1,0000g bal örneği üzerine 2
ml su eklendi. Karıştırıldıktan sonra üzerine 3ml çözücü eklenerek girdaplı
karıştırıcıda 3 dakika boyunca karıştırıldı. Fazların ayrılması için 5 dakika 4400
r.p.m. ’de santrifüj edildi. Organik faz temiz bir cam tüpe aktarıldı. Sulu faza tekrar 3
ml çözücü eklenerek aynı işlem bir kez daha tekrarlandı. Organik fazlar birleştirildi
ve evaporatörde azot buharında çözücüsü uçuruldu. Kalıntı 1ml mobil faz içinde
çözülerek HPLC ile analiz edildi.

Bu çözücüler ile elde edilen sonuçlar aşağıda gösterildi.


DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCREC\DKMSU.D)
3.776

Norm.

25

20

15

10

3 4 5 6 7 8 9 10 11 min

Şekil III.35. Sudan diklormetan ile eksrakte edilen asetamipridin(1ppm) HPLC


kromatogramı.
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\HEKSANSU.D)
5.394

Norm.
2.5

2
1.918

1.5

0.5

-0.5
3.138

-1

-1.5

0 2 4 6 8 10 12 min

Şekil III.36. Sudan heksan ile eksrakte edilen asetamipridin (1ppm) HPLC
kromatogramı.

58
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\EASU1.D)

3.755
Norm.

25

20

15

10

1.979
5
1.920

2.723
2.275
0

0 2 4 6 8 10 12 14 min

Şekil III.37. Sudan etil asetat ile eksrakte edilen asetamipridin (1ppm) HPLC
kromatogramı.

DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCREC\DKMHESU1.D)


3.758

Norm.

30

25

20

15

10

3 4 5 6 7 8 9 10 min

Şekil III.38. Sudan diklormetan:heptan(50:50) çözeltisi ile ekstrakte edilen


asetamipridin (1ppm) HPLC kromatogramı.

DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\HEK1.D)


mAU
2.857
2.730

-2
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min

Şekil III.39. Baldan heksan ile ekstrakte edilen asetamipridin (1ppm) HPLC
kromatogramı.

59
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\ETAC1.D)

2.030
mAU

400

2.805
300

200

2.496
100

3.944
0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min

Şekil III.40. Baldan etilasetat ile eksrakte edilen asetamipridin (1ppm) HPLC
kromatogramı.

DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\DKM1.D)


2.898

mAU
300

250

200

150

100
3.925
2.376

3.289
2.602
2.022

50
4.497

0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min

Şekil III.41. Baldan diklormetan ile ekstrakte edilen asetamipridin(1ppm) HPLC


kromatogramı.
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (HPLCREC\D1.D)
2.782

mAU

50
3.259

40
3.111

30
2.902
2.524

20
3.900
2.039

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 min

Şekil III.42. Baldan diklormetan ile eksrakte edilen asetamipridin(100ppb) HPLC


kromatogramı.

60
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCREC\DKMHESU1.D)

3.758
Norm.

30

25

20

1.063
15

10

1.928
5

4.832
2.955

8.315
3.317
0

0 2 4 6 8 10 min

Şekil III.43. Baldan diklormetan:heptan karışımı ile eksrakte edilen asetamipridin


(1ppm) HPLC kromatogramı.

III.2.3. Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)


Baldan ve sulu ortamdan asetamiprid ekstraksiyonu amacıyla ODS-C18
(500mg,3ml Agilent), Strata C18-E (500mg, 6ml, Phenomenex), Strata-X
(30mg,1ml, Phenomenex), Oasis HLB (100mg, 3ml, Waters) kartuşları kullanılarak
en yüksek geri kazanım oranını sağlayan kartuş belirlendi.

Katı Faz Ekstraksiyon Yöntemi

-2ml metanol

-2ml su

-Örnek

-2ml %5’lik metanol

-2ml %60’lık metanol, %80’lik metanol, %100 metanol ve diklormetan ile elusyon
yapıldı. Eluatlar azot atmosferine tutularak çözücüleri uçuruldu. Kalıntı 1ml mobil
faz içinde çözüldü. 0,2µm naylon filtreden süzülerek 50µl’si HPLC’ye enjekte edildi.

1ppm düzeyinde kirletilen bal örnekleri ile yapılan katı faz ekstraksiyonlarında %60-
95 arasında geri kazanım oranları elde edildi. Ancak 0,1ppm düzeyinde aynı geri
kazanım oranları elde edilemedi. 0,1ppm düzeyindeki bal örneklerinde %120’nin
üzerinde geri kazanım elde edildi. Elusyon çözeltisi olarak kullanılan su-metanol
karışımlarında metanol oranı yükseldikçe geri kazanım oranı arttı. Ancak %80’nin
üzerindeki metanol oranında asetamiprid ile birlikte elue olan bozucu pikler
gözlendi.

61
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\BAL43.D)

3.964
mAU

40

30

20

1.722

2.081
10

3.364
0

0 2 4 6 8 10 min

Şekil III.44. ODS-C18 kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamiprid (1ppm)
(%60’lık metanol, geri kazanım %85,30) HPLC kromatogramı.

DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\BAL31.D)

3.954
mAU

40

30

20
1.718

2.051

10
3.352

0 2 4 6 8 min

Şekil III.45. ODS-C18 kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin(1ppm)


(%80 ile metanol, geri kazanım %91,23) HPLC kromatogramı.

DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\BAL1TR1. D)


3.992

mAU
40

35

30

25

20
2.948
2.082
1.752

15
3.023
2.630

10
2.286
2.428

3.388
2.831

0 2 4 6 8 10 min

Şekil III.46. Oasis HLB kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin (1ppm)
(%60’lık metanol, geri kazanım %76,35) HPLC kromatogramı.

62
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\OASIS1.D)

2.082
Norm.

2.534
300

250

2.359
200

2.797
150

9.105
2.992
2.910

3.287
100

3.965

4.547
3.579
50

5.793
0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min

Şekil III.47. Oasis HLB kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin (1ppm)
(%80’lik , geri kazanım %95,98), HPLC kromatogramı.

DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\BAL1T1.D)

3.945
mAU

40

30

20
1.811

2.120

2.915
2.994

10
2.344

3.348
2.529

0 2 4 6 8 min

Şekil III.48. Strata C18-E kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin(1ppm)
(%60’lık metanol, geri kazanım %76,45), HPLC kromatogramı.

DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLCOP~1\BAL21.D)


3.947

mAU
50

40

30

20
1.798

2.097

2.917
2.995

10
2.510

3.345
2.790

0 2 4 6 8 min

Şekil III.49. Strata C18-E kartuş ile baldan ekstrakte edilen asetamipridin (1ppm)
(%80’lik metanol, geri kazanım %95,60), HPLC kromatogramı.

63
Tablo III.35. Ekstraksiyon yöntemlerinin geri kazanımlarının karşılaştırılması.

Metod Geri kazanım Geri kazanım Geri kazanım


(%) (%) (%)
Su-1ppm Bal-1ppm Bal-0.1ppm
C18 (SPE) 89,42 91,23 138,36

Strata C18-E 98,38 95,60 177,35

Strata-x (SPE) 86,34 89,21 131,10

Oasis HLB (SPE) 99,01 95,98 128,40

Heksan (LLE) ‹10,00 ‹10,00 -

Diklormetan (LLE) 94,72 96,95 120,00

Etilasetat (LLE) 68,00 86,65 -

Diklormetan:heptan(50:50) 73,74 69,20 132,00


(LLE)

Ekstraksiyon metoduna karar verilirken her iki seviyede de kabul edilebilri geri
kazanım oranını vermesi, karmaşık olmayan bir kromatogram sağlamasına dikkat
edildi. Bu nedenle baldan asetamiprid ekstraksiyonu için diklormetan ile sıvı-sıvı
ekstraksiyon metodu yeterli bulundu.

III.2.4. Asetamipridin Kararlılığının İncelenmesi


Asetamipridin kararlılığı sulu ortamda ve bal ortamında incelendi. Zamana bağlı
olarak sulu ortamda farklı pH’lardaki kararlılığı ve bal ortamında ise farklı
sıcaklıklardaki kararlılığı araştırıldı.

III.2.4.1 Tampon Ortamlarda Asetamiprid Çözeltilerinin Kararlılığı


pH: 1,30 ve pH:10,00 arasında hazırlanan 10 adet tampon çözeltinin her biri
100µg/ml düzeyinde asetamiprid ile kirletildi. Bu şekilde hazırlanan çözeltiler
20±2oC sıcaklıkta bekletildi.
İlk gün izlemeleri UV-VIS spektrofotometre ile yapıldı. İlk saat 2’şer dakika ara
ile, 2. saat 10’ar dakika ara ile ve daha sonra saat başı yapılan ölçümlerle ilk 6 saat
asetamiprid miktarında ve spektrumunda değişim olmadığı gözlendi. 200-400nm
arasında tarama yapılarak maksimum absorbans veren dalga boylarındaki absorbans
değerlerinde değişim görülmedi. Her bir tampon çözelti ilk ölçümde elde edilen

64
absorbans değeri ve standart asetamipridin absorbans değeri ile karşılaştırılarak
değerlendirildi. Tüm tampon çözeltilerde maksimum absorbans 245nm’de okundu.
Daha sonraki izlemeler önceden belirlenmiş periyotlarda yapıldı. Tampon
çözeltideki asetamiprid diklormetan ile ekstrakte edildi. Bu amaçla, 10ml’lik cam tüp
içindeki 1ml asetamiprid içeren tampon çözelti üzerine 2ml diklormetan ilave edildi.
3 dakika boyunca 2500 devir/dakika hızda girdaplı karıştırıcıda karıştırıldı. Fazların
ayrılması için santrifüj (5 dakika 4400r.p.m.) yapıldı. Organik faz temiz bir tüpe
alındı. Bu işlem 3 defa tekrarlandı ve organik fazlar birleştirildi. Birleştirilen organik
fazlar azot atmosferi altında uçuruldu. Kalıntı 1.00ml mobil faz (acn:su,50:50) içinde
çözülerek 50µl’si HPLC’ye enjekte edildi. Ayrıca GC-MS analizi için azot altında
kurutulan asetamiprid içeren mobil faz 1ml diklormetan ile çözülerek 1µl’si enjekte
edildi.
Ölçümlere 60 gün boyunca devam edildi. Son olarak 6. ay ölçümleri yapıldı.

III.2.4.2. Asetamipridin Baldaki Kararlılığının İncelenmesi


Bal örnekleri 100mg/kg düzeyinde asetamiprid ile kirletildi. 600.0g bal örneği
tartıldı ve üzerine 60,00mg asetamiprid eklendi. Mekanik olarak karıştırıldı.
Homojen olması için önce küçük miktarda bal örneği kirletildi. İyice karıştırıldıktan
sonra kademeli olarak eklenen bal ile 600,0 g’a tamamlandı. Bu şekilde elde edilen
balın homojenizasyonunun kontrolü için aynı anda 10 farklı yerinden 1,0000’er gram
bal örneği alındı ve asetamiprid miktarı tayini için HPLC’de analiz edildi. Bulunan
sonuçlar arasındaki bağıl standart sapma %5’den az bulundu(tablo IV.4.).
Daha sonra bal örnekleri 20, 30 ve 40oC deki kum banyosuna bırakıldı. Bal
örneklerindeki asetamiprid miktarındaki değişim belirli aralıklarla izlenenerek
aşağıda tablo IV.2’de görülen sonuçlar bulundu. İzlemeye 6 ay boyunca devam
edildi.
Ayrıca kestane balı, çiçek balı, ayçiçeği balı ve çam balı örnekleri de asetamiprid
ile kirletilerek çalışıldı.

III.2.5. Bozunma Ürünleri Yapı Tayini


pH:1,30, 2,00, 9,00, 10,00 tampon çözeltileri ve bal örneklerinde görülen
bozunma ürünlerinin yapılarının belirlenmesi amacıyla GC-EI-MS ve GC-PCI-MS
ve NMR teknikleri kullanıldı. En fazla bozunma pH:10.00 tampon çözeltisinde

65
gözlendiği için sözkonusu bozunma ürünleri bu çözeltiden ekstrakte edilerek
çalışıldı. Ayrıca preperatif olarak ince tabaka kromatografisi yöntemi ile ayrıldıktan
sonra 254nm’de UV lamba altında gözlenen spotlar kazınarak kloroform içinde
çözüldü, süzüldü ve bu şekilde hazırlanan örnekler GC-MS, HPLC-DAD ve NMR
teknikleri ile çalışıldı. UV, EI-MS, CI-MS ve NMR spektrumları yorumlanarak
bozunma ürünlerinin yapısı belirlendi.

III.2.6. Metot Validasyonu


Metodun validasyonu doğrusal aralık, geri kazanım, doğruluk, kesinlik, tepsi,
tayin sınırları ve seçicilik çalışmaları ile yapıldı. Hesaplamalar Eurachem’in analitik
metodların validasyonu rehberinden alındı[41].

III.2.6.1. Doğrusallık
Metodun doğrusal aralığı için (ng/ml) olarak enjekte edilen analit çözeltisine
karşılık gelen pik alanı arasında grafik çizildi. Eğri 7 farklı konsantrasyon düzeyinde
3 tekrar ölçüm yapılarak elde edilen toplam 21 noktayı içermektedir. Lineer
regresyon katsayısı r2=0.999 Kalibrasyon eğrisi orijinden geçmektedir. Kalibrasyon
eğrisi ve regresyon denklemi aşağıda grafik ’de görülmektedir.
y = 0,2676x
2
R = 0,9994
atp lineer aralık
300

250

200
alan

150

100

50

0
0 200 400 600 800 1000 1200
hazırlanan kons.(ng/ml)

Grafik III.1. Asetamiprid için 1-1000ng/ml arasında doğrusal aralık.

66
III.2.6.2. Geri Kazanım
Geri kazanım çalışması için bal örnekleri asetamiprid ile 0,1 ve 1,0 mgkg-1
düzeyinde kirletildi. Her konsantrasyonda 6 kez çalışıldı. Sonuçlar Tablo III.36’da
gösterilmiştir.
bulunan miktar
Geri Kazanım (%) = X100
eklenen miktar

Geri kazanım oranı konsantrasyon düzeyinden etkilenmektedir. Tayin sınırı


yakınlarında geri kazanım matriksden gelen bazı interferanslar nedeniyle pozitif bir
hata ile elde edilmektedir.

III.2.6.3. Doğruluk
Metodun doğruluğu geri kazanım çalışması verilerinden bağıl hata olarak
hesaplandı. İki farklı konsantrasyonda 0,1 ve 1,0 mgkg-1 hazırlanan bal
örneklerindeki asetamiprid miktarı ölçüldü. Her bir konsantrasyonda 6 tekrar ölçüm
yapıldı. Her bir tekrar birbirinden bağımsız olarak hazırlandı. Elde edilen sonuçlar
tablo III.34’de gösterilmiştir.
Ortalama bulunan miktar-Eklenen miktar
Bağıl Hata (%) = X100
Eklenen miktar

III.2.6.4. Kesinlik
Metodun kesinliği tekrarlanabilirlik ve yeniden üretilebilirlik çalışmaları ile
yapıldı ve bağıl standart sapma değerleri ile ifade edildi. Tekrarlanabilirlik (RSDr)
(gün içindeki kesinlik) aynı gün içinde çalışılan birbirinden bağımsız olarak
kirletilmiş bal örneklerinin geri kazanım oranları yüzdelerinin standart sapma
değerlerinin karşılaştırılması ile ölçüldü. Yeniden üretilebilirlik (RSDR) (farklı
günlerdeki kesinlik) farklı günlerde birbirinden bağımsız olarak kirletilmiş bal
örneklerinin 5 farklı günde çalışılması ile yapıldı. Her konsantrasyon (0,1 ve 1,0
mgkg-1 ) düzeyi için 6 kez tekrarlanarak RSD değerleri hesaplandı.

67
Tablo III.36. 0,1 ve 1,0 mgkg-1 düzeyinde kirletilen bal örneklerinin geri kazanım
(%), tekrarlanabilirlik (RSDr), yenidenüretilebilirlik (RDSR) ve
doğruluk değerleri (n=6).

0.1mgkg-1 1.0mgkg-1
Geri RSDr RSDR Bağıl Hata Geri RSDr RDSR Bağıl
kazanım(%) (%) (%) (%) kazanım(%) (%) (%) Hata (%)

120,00±7,05 7,05 13,59 +20,00 96,95±2,59 2,59 5,69 -3,05

III.2.6.5. Tespit ve Tayin Sınırları


Tanıma ve tayin sınırlarının hesaplanması için asetamiprid içermeyen bal
örnekleri ile çalışıldı (n=10). 1g bal örneği ekstrakte edildikten sonra 1ml mobil faz
içinde çözüldü.
Tespit sınırı (LOD)=ortalama+3sd
Tayin sınırı (LOQ)=ortalama+6sd
Ortalama: asetamiprid içermeyen bal örneklerine ait ortalama
sd: asetamiprid içermeyen bal örneklerinin standart sapması.
Tespit sınırı; 0,07 mgkg-1 ve tayin sınırı; 0,10 mgkg-1 olarak hesaplandı.
III.2.6.6. Seçicilik
Örnekten gelebilecek potansiyel interferanslar, asetamiprid içermeyen temiz bal
örneklerinin çalışılması ile kontrol edildi.
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (HPLC1\BLNKBAL2.D)
Norm.

40

30

20
2.141
1.818

2.994
2.916

10
2.530

3.349

4.164

0
0 2 4 6 8

Şekil III.50. Asetamiprid içermeyen diklormetan ile ekstrakte edilmiş bal örneğinin
HPLC kromatogramı.

68
BÖLÜM IV

SONUÇLAR

IV.1. EKSTRAKSİYON ÇALIŞMALARI SONUÇLARI

Farklı kartuşlarla katı faz ekstraksiyonu ve farklı çözücülerle sıvı-sıvı


ekstraksiyonu çalışmaları yapıldı. Sonuçlar geri kazanım değerleri ile kıyaslandı
(tablo IV.1). Balda ve suda asetamipridin diklormetan ile ekstraksiyonu yeterli geri
kazanımı oranı ve karmaşık olmayan bir kromatogram sağladığından uygun bulundu.

Tablo IV.1. Çalışılan ekstraksiyon yöntemlerinin geri kazanımları sonuçları.

Metod Geri kazanım Geri kazanım Geri kazanım


(%) (%) (%)
Su-1ppm Bal-1ppm Bal-0,1ppm

C18 (SPE) 89,42 91,23 138,36

Strata C18-E 98,38 95,60 177,35

Strata-x (SPE) 86,34 89,21 131,10

Oasis HLB (SPE) 99,01 95,98 128,40

Heksan (LLE) ‹10,00 ‹10,00 -

Diklormetan (LLE) 94,72 96,95 120,00

Etilasetat (LLE) 68,00 86,65 -

Diklormetan:heptan(50:50) 73,74 69,20 132,00


(LLE)

69
IV.2. SULU ORTAM SONUÇLARI
pH:1,30-10,00 arasındaki tampon çözeltiler 100µg/ml düzeyinde asetamiprid ile
kirletildi. Tampon çözeltilerin izlenmesi UV-VIS, HPLC-DAD ve GC-MS ile
yapıldı. Tampon çözeltilerdeki asetamiprid ve ana bozunma ürünü IM-1-2 miktarı
HPLC-DAD ile ölçüldü. Oluşan yeni maddelerin tespiti için aynı ekstraktlar ayrıca
GC-MS ile analiz edildi.

IV.2.1 HPLC-DAD ile Elde Edilen Sonuçlar


pH: 1,30, 2,00, 3,00, 4,00, 5,00, 6,00, 7,00, 8,00, 9,00 ve 10,00 çözeltileri
100µg/ml asetamiprid düzeyinde kirletilerek 20±2oC’de bekletildi. İlk 6 saatlik
ölçümler UV-VIS spektrofotometre ile yapıldı. Değişiklik gözlenmedi.
Daha sonraki ölçümler HPLC ve GC-MS ile yapıldı. Sonuçlar aşağıda tablo’de
gösterildi.
Tablo IV.2. pH:1,30-10,00 arasındaki tampon çözeltilerde asetamiprid(µg/ml)
miktarındaki değişim.

pH:1,30 pH:2,00 pH:3,00 pH:4,00 pH:5,00 pH:6,00 pH:7,00 pH:8,00 pH:9,00 pH:10,00
(ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm)
Gün
2 98,95 96,27 97,98 96,55 101,07 98,32 96,78 98,25 98,88 98,21
3 96,65 97,92 100,74 98,62 98,74 99,33 96,24 98,25 98,21 95,79
4 98,65 97,56 98,69 99,43 95,73 97,93 92,96 96,04 95,85 94,89
5 95,73 96,71 95,68 100,65 97,33 98,69 99,25 95,48 95,57 86,84
7 94,63 93,54 96,81 97,25 95,89 94,75 93,34 95,59 94,10 93,04
10 94,13 94,97 93,88 93,26 93,60 93,65 90,39 91,74 90,58 86,06
14 91,96 92,37 91,64 93,51 94,06 92,65 90,99 92,03 93,52 76,04
21 95,39 86,00 88,99 90,04 90,31 92,17 93,15 96,06 88,85 62,27
30 87,7 90,05 93,77 95,24 93,31 94,58 93,99 92,65 85,77 36,27
60 78,15 92,34 91,58 93,54 95,4 93,98 89,37 94,63 86,67 8,00
180 33,77 91,69 97,49 99,78 101,86 103,27 101,76 98,7 82,75 0,47

180 günün sonunda elde edilen sonuçlara göre, başlangıçtaki miktarı 100µg/ml
olan asetamiprid,

70
pH:1,30 de % 66,00
pH:2,00 de % 8,00
pH:9,00 da % 17,00
pH:10,00 de % 99,50 oranında azalmıştır.
pH : 3,00, 4,00, 5,00, 6,00, 7,00 ve 8,00 da anlamlı bir değişim görülmedi.

*DAD1, 3.953 (176 mAU, - ) Ref =3.906 & 4.000 of B1-1T.D


mAU

160

140

120

100

80

60

40

20

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 nm

Şekil IV.1. Asetamiprid UV spektrumu (ACN-SU; 50:50)

Tablo IV.3. pH:1,30-10,00 arasındaki tampon çözeltilerde bozunma ürünü IM-1-2


(µg/ml) miktarındaki değişim.

gün pH:1,30 pH:2,00 pH:3,00 pH:4,00 pH:5,00 pH:6,00 pH:7,00 pH:8,00 pH:9,00 pH:10,00
1 0 0 0 0 0 0 0 0 2,48 2,41
2 0 0 0 0 0 0 0 1,56 3,35 3,55
3 0 0 0 0 0 0 0 2,29 4,61 8,57
4 1,25 0 0 0 0 0 0 3,21 10,68 13,46
7 1,19 0 0 1,79 0 0 0 3,17 6,48 21,31
10 0 0 2,5 2,97 0 0 0,46 2,79 8,26 32,67
14 0,18 0,16 0,01 0 0 1,36 3,47 3,53 8,91 41,32
21 0,59 0 0 1,74 0,94 0,51 3,81 4,31 18,77 50,38
30 0,7 2,01 1,84 1,49 2,18 1,32 3,06 3,17 17,21 61,13
60 1,44 0,45 4,81 3,69 3,59 2,69 4,56 9,01 29,71 82,91
180 0 0 0 0 0 0,72 0,77 4,47 23,09 65,77

71
pH:9

35

IM-1-2 kons.(ug/ml)
30
25
20
15
10
5
0
0 50 100 150 200
zaman (gün)

Grafik IV.1. pH:9,00 tampon çözeltide zamana bağlı olarak bozunma ürünü IM-1-2
miktarındaki değişim

pH:10

100
IM-1-2 kons.(ug/ml)

80

60

40

20

0
0 50 100 150 200
zaman (gün)

Grafik IV.2. pH:10,00 tampon çözeltide zamana bağlı olarak bozunma ürünü
IM-1-2 miktarındaki değişim

72
pH:1.3

0,005

alan oranı (Rt:3,45/3,9)


0,004

0,003
pH:1
0,002

0,001

0
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman(gün)

Grafik IV.3. pH:1,30 tampon çözeltide 14.günden itibaren görülmeye başlayan 3,45.
dakikada gözlenen bozunma ürünü (IM-1-2) alanı ile asetamiprid alan
oranlarının 60 gün süreyle zamana bağlı değişimi.

pH:8

0,012
alan oranı(Rt:3,45/3,9)

0,01
0,008
0,006 pH:8
0,004
0,002
0
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman(gün)

Grafik IV.4. pH:8,00 tampon çözeltide 7.günden itibaren görülmeye başlayan


3.45. dakikada görülen bozunma ürünü (IM-1-2) alanı ile asetamiprid alan
oranlarının 60 gün süreyle zamana bağlı değişimi.

73
pH:9

0,05

Alan Oranı (Rt:3,45/3,9)


0,04

0,03
pH:9
0,02

0,01

0
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman(gün)

Grafik IV.5. pH:9,00 tampon çözeltide 4.günden itibaren görülmeye başlayan 3.45.
dakikada görülen bozunma ürünü (IM-1-2) alanı ile asetamiprid alan
oranlarının 60 gün süreyle zamana bağlı değişimi.

pH:10

3
Alan Oranı(Rt:3,45/3,9)

2,5
2
1,5 pH:10
1
0,5
0
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman(gün)

Grafik IV.6. pH:10,00 tampon çözeltide 3.günden itibaren görülmeye başlayan


3.45. dakikada görülen bozunma ürünü (IM-1-2) alanı ile asetamiprid alan
oranlarının 60 gün süreyle zamana bağlı değişimi.

74
ATP nin FARKLI pH lardaki STABİLİTESİ

130,00

110,00

90,00
pH1
KONSANTRASYON (ug/ml)

pH2
pH3
70,00 pH4
pH5
pH6
50,00 pH7
pH8
pH9
pH10
30,00

10,00

1 2 3 4 7 10 14 30 45 60
-10,00
ZAMAN (gün)

Grafik IV.7. pH:1,30-10,00 arasındaki tampon çözeltilerde asetamipridin


miktarındaki değişim.

ATP nin pH:9 ve 10'da STABİLİTESİ

120,00

100,00

80,00
konsantrasyon (ug/ml)

pH9
60,00
pH10

40,00

20,00

-
1 2 3 4 7 10 14 30 45 60 360
zaman (gün)

Grafik IV.8. pH:9,00 ve 10,00 tampon çözeltilerinde zamana bağlı olarak


asetamipridin miktarındaki değişim.

75
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH1-1. D)

3.934
mAU
2000
1500
1000

3.343
2.071
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH1-1. D)

3.934
mAU
2000
1500
1000

3.343
2.172
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\PH1-1.D)

3.934
mAU
2000
1500
1000

3.343
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH1-1.D) 3.933
mAU
1500

1000
3.344

500

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

Şekil IV.2.pH:1,30 tampon çözeltideki asetamipridin 1.gün sonundaki HPLC sonucu


DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH10-1.D)
3.927

mAU
2000
1500
1000
3.330
2.147

2.976

3.494

500
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH10-1.D)
3.929

mAU
2000
1500
1000
3.330
2.146

2.976

3.495

500
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\PH10-1.D)
3.928

mAU
2000
1500
1000
3.330
2.976

3.498

500
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH10-1.D)
3.915

mAU

1500
1000
3.330
3.499

500
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min

Şekil IV.3.pH:10,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1.gün sonundaki HPLC


sonucu

76
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (PH\PH1-60.D)

3.898
mAU
2000
1500
1000

18.914
2.063

2.537

3.329
3.491

6.288
2.193

2.745
3.020
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (PH\PH1-60.D)

3.898
mAU
2000
1500
1000

18.914
2.063

3.329
3.491

6.289
2.193
2.538

3.020
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (PH\PH1-60.D)

3.898
mAU
2000
1500
1000

18.906
3.329
3.492

6.289
2.063

2.545
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (PH\PH1-60.D)3.897
mAU

1000

18.914
500
3.330
2.063

3.492
2.548

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

Şekil IV.4.pH:1,30 tampon çözeltideki asetamipridin 60gün sonundaki HPLC


sonucu.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (PH\PH10-60.D)


3.913

mAU

300
3.491

200

19.219
3.329
3.129

4.946
2.122

4.189

4.759

6.347
6.541

100
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (PH\PH10-60.D)
3.913

mAU

300
3.491

200

19.222
3.329
3.127
2.122

4.189

4.761
4.946

6.347
6.542

100
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (PH\PH10-60.D)
3.913

mAU
3.491

300
200

19.225
3.329
3.119

4.188

4.763
4.946

6.347
2.121

6.537

100
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (PH\PH10-60.D)
3.491

mAU
3.913

300
200
19.221
10.471
3.330
3.051

4.185
4.363
4.761
4.946

6.514
2.124

100
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min

Şekil IV.5. pH:10,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60 gün sonundaki HPLC


sonucu.

77
*DAD1, 3.494 (1060 mAU,Apx) Ref =3.448 & 3.534 of PH10-60.D
mAU
1000

800

600

400

200

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 nm

Şekil IV. 6. pH:1,30, 2,00, 8,00, 9,00 ve 10,00 tampon çözeltilerinde 60.gün IM-1-2
kod nolu bozunma ürününün (tR:3,49) UV-spektrumu

pH: 1,30, 8,00, 9,00 ve 10,00 tampon çözeltilerinde asetamiprid alanı 3,45’de
oluşmaya başlayan bozunma (IM-1-2) ürünü pikinin zamana bağlı olarak arttığı
görüldü. 3,45’de görülen pikin alanının asetamiprid pik alanına oranı, zamana bağlı
olarak aşağıda grafiklerde gösterildi.

4.2.1 GC-MS ile Elde Edilen Sonuçlar


Asetamiprid ile kirletilen tampon çözeltiler HPLC yöntemine paralel olarak GC-
MS yöntemiyle de izlendi. Elde edilen sonuçlar aşağıda ve ekler bölümünde
gösterildi. pH:1,30, 2,00, 9,00 ve 10,00 tamponlarında meydana gelen bozunma
ürünleri GC-MS’de 6,73 ve 7,82 alıkonma zamanlarında tespit edildi. Bu piklerin
kütle spektrumları aşağıda şekil IV.12 ve IV.13’de gösterildi.

Şekil IV.7. pH:1,30 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün sonundaki GC-MS


kromatogramı.

78
Şekil IV.8. pH:10,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün sonundaki GC-MS
kromatogramı.

Şekil IV.9. pH:1,30 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün sonundaki GC-MS
kromatogramı.

Şekil IV.10. pH:10,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60.gün sonundaki GC-MS


kromatogramı.

79
Şekil IV.11. pH:10,00 tampondaki asetamiprid çözeltisinde 60. güne ait GC-MS
kromatogramında 7,82. dakikada gözlenen bozunma ürününün maddenin
kütle spektrumu.

Şekil IV.12. pH:10,00 tampondaki asetamiprid çözeltisinde 60. güne ait GC-MS
kromatogramında 6,73. dakikada gözlenen bozunma ürünün kütle spektrumu.

IV.3. BAL ORTAMI SONUÇLARI

Bal örnekleri 100,00mgkg-1 düzeyinde asetamiprid ile kirletildi. 600,00g bal


örneği tartıldı ve üzerine 60,00mg asetamiprid eklendi. Homojen bir karışım elde
edebilmek için asetamiprid önce küçük bir miktar bal örneğinde karıştırıldı ve
üzerine kademeli olarak bal eklenerek 600,0g’a tamamlandı. Homojenizasyon
kontrolü için balın 10 farklı yerinden aynı anda 1,0000’er gram örnek alındı ve
asetamiprid miktarı tayini için HPLC’de analiz edildi. Bulunan sonuçlar arasındaki
bağıl standart sapma %5’den az bulundu. Homojenizasyon sonuçları aşağıda tablo
IV.3’de gösterilmiştir.

80
IV.3.1. HPLC-DAD Sonuçları

TabloIV.4. 100,00mgkg-1 düzeyinde asetamiprid ile kirletilen bal örnekleri


sonuçları, standart sapma ve bağıl standart sapma değerleri (asetamipridin
balda homojen dağılımı).

Analiz Sayısı Asetamiprid (ppm)


1 93,23
2 94,34
3 96,64
4 92,83
5 96,46
6 95,14
7 88,23
8 85,65
9 94,35
10 91,00
Ortalama 92,79
Standart Sapma 3,55
Bağıl Standart 3,83
Sapma

Daha sonra bal örnekleri 20, 30 ve 40oC deki kum banyosuna bırakıldı. Bal
örneklerindeki asetamiprid miktarındaki değişim belirli aralıklarla izlenenerek
aşağıda tablo IV.4’ de görülen sonuçlar bulundu. İzlemeye 6 ay boyunca devam
edildi.

Tablo IV.5. 20,30 ve 40oC de bekletilen bal örneklerindeki asetamiprid


miktarındaki değişim.
Gün 20oC (ppm) 30oC(ppm) 40oC(ppm)
0 93,23 94,34 96,64
1 92,83 96,46 95,14

81
Tablo IV.5. Devam
2 93,26 96,58 89,77
3 90,95 87,2 90,768
6 84,5 87,82 79,26
8 87,42 84,06 83,55
10 81,58 88,92 88,24
13 84,95 93,23 88,85
15 79,58 93,53 86,21
20 81,97 87,66 91,71
30 79,86 89,65 83,1
40 85,19 82,62 71,18
50 81,94 83,88 69,38
65 80,42 81,21 71,22
70 73,04 84,19 70,47
80 75,29 81,58 72,19
90 73,50 71,36 74,49
100 72,55 75,47 73,91
150 66,86 71,36 69,81
160 62,04 64,52 61,17
180 53,80 53,45 51,87

Tablo IV.6. 20, 30 ve 40oC de bekletilen bal örneklerindeki IM-1-2 miktarları.


Gün 20oC (ppm) 30oC(ppm) 40oC(ppm)
50 10,45 8,32 10,35
65 8,96 9,43 22,50
70 12,63 14,44 17,65
80 6,05 12,99 18,54
100 10,43 16,87 25,76
150 9,08 14,98 22,23
180 13,54 18,90 20,28

Kestane balı, çiçek balı, ayçiçeği balı ve çam balı örnekleri de 2 ay süreyle
izlendi. Sonuçlar aşağıdaki tablolarda gösterildi.

82
Tablo IV.7. 20,30 ve 40oC de bekletilen çiçek balı örneğindeki asetamiprid
miktarındaki değişim.
Gün 20oC (ppm) 30oC(ppm) 40oC(ppm)
1 98,58 102,07 97,65
10 98,09 100,94 102,50
20 90,40 94,12 89,39
30 82,34 85,67 79,09
60 81,23 80,34 77,27

Tablo IV.8. 20,30 ve 40oC de bekletilen çam balı örneğindeki asetamiprid


miktarındaki değişim.
Gün 20oC (ppm) 30oC(ppm) 40oC(ppm)
1 92,23 97,24 93,04
10 90,79 82,94 86,62
20 85,98 83,54 83,21
30 82,87 79,21 84,06
60 78,40 76,09 75,23

Tablo IV.9. 20,30 ve 40oC de bekletilen kestane balı örneğindeki asetamiprid


miktarındaki değişim.
Gün 20oC (ppm) 30oC(ppm) 40oC(ppm)
1 88,70 93,22 89,57
10 87,55 92,90 92,72
20 83,07 88,32 85,65
30 78,35 80,56 83,70
60 79,30 78,54 80,06

Tablo IV.10. 20, 30 ve 40oC de bekletilen ayçiçeği balı örneğindeki asetamiprid


miktarındaki değişim.
Gün 20oC (ppm) 30oC(ppm) 40oC(ppm)
1 92,55 94,40 101,53
10 80,66 97,59 102,72
20 81,34 87,72 94,43
30 80,89 83,87 90,10
60 78,35 80,56 83,70

83
o
Bal türleri 20 C

120
100

atp kons. (ppm)


çiçek balı
80
çam balı
60
kestane balı
40
ayçiçek balı
20
0
0 20 40 60 80
zaman (gün)

Grafik IV.9.: 20oC’de bekletilen farklı tür balların asetamiprid miktarındaki


değişim.

o
Bal türleri 30 C

120
100
atp kons. (ppm)

80 çiçek balı
çam balı
60
kestane balı
40
ayçiçek balı
20
0
0 20 40 60 80
zaman (gün)

Grafik IV.10.: 30oC’de bekletilen farklı tür balların asetamiprid miktarındaki


değişim.

o
Bal türleri 40 C

120
100
atp kons. (ppm)

çiçek balı
80
çam balı
60
kestane balı
40
ayçiçek balı
20
0
0 20 40 60 80
zaman (gün)

Grafik IV11.: 40oC’de bekletilen farklı tür balların asetamiprid miktarındaki


değişim.

84
DAD1 A, Sig=245,16 Ref=360,100 (ATP1106S\BAL20-1.D)
mAU

4.003
2.944
22 .. 68 42 26
3.330
22 .. 23 12 29

3.692

4.595
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref=360,100 (ATP1106S\BAL20-1.D)
mAU

4.004
22 . . 89 24 54
3.337
2.214

3.712

4.637
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref=360,100 (ATP1106S\BAL20-1.D)
mAU
22. .892424

4.003
3.347
3.725
2.217

4.594
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref=360,100 (ATP1106S\BAL20-1.D)
mAU
2.943

4.003
4.582
3.329
2.666

3.738

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
Şekil IV.13. 20oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün HPLC
kromatogramı.
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (ATP1106S\BAL30-1.D)
mAU
4.011
22..892435
3.334

4.592

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (ATP1106S\BAL30-1.D)
mAU
4.011
22..892425
3.342
3.675

4.593

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (ATP1106S\BAL30-1.D)
mAU
22. .892435

4.011
3.350
3.686

4.593

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref=360,100 (ATP1106S\BAL30-1.D)
mAU
2.945

4.011
4.590
3.333
3.743

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
Şekil IV.14. 30oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün HPLC
kromatogramı.

85
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (ATP1106S\BAL40-1.D)
mAU

22. .892421

4.000
3.324
22 .. 32 43 52
2.636

4.579
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (ATP1106S\BAL40-1.D)

22. .892401

3.999
mAU

3.332
22 .. 32 43 63

3.698
2.637

4.580
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (ATP1106S\BAL40-1.D)

22. .891471

4.000
mAU

3.343
22 .. 12 53 15

3.719

4.581
2.641
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref=360,100 (ATP1106S\BAL40-1.D)
mAU 2.941

4.000
44 .. 45 27 97
33 .. 43 32 75
2.153
2.668

0 3.735
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
Şekil IV.15. 40oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün HPLC
kromatogramı.
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\BAL20-14.D)
3.953

mAU

1500
1000
2.906

12.152

20.454
3.314
2.338
2.395
2.544

3.518
3.684

4.528

500
0
0 5 10 15 20 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\BAL20-14.D)
3.953

mAU

1500
1000
2.907

12.147

20.454
3.313
2.338
2.392
2.546

3.521
3.687

4.530

500
0
0 5 10 15 20 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\BAL20-14.D)
3.953

mAU
1500

1000
2.908

12.141

20.454
3.314

4.530
2.337
2.389

3.523
3.692

500

0
0 5 10 15 20 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\BAL20-14.D)
2.909

3.953

mAU
1000
750
500
12.143

20.453
4.525
3.710
3.289
3.374
3.522
2.331

250
0
0 5 10 15 20 min

Şekil IV.16. 20oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün HPLC
kromatogramı.
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\BAL30-14.D)
3.954

mAU
2000
1500
2.908

1000
20.458
12.217
3.311
3.520

4.527
2.417
2.521

3.675

4.389
1.835
2.334

500
0
0 2. 5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\BAL30-14.D)
3.954

mAU
2000
1500
2.909

1000
20.458
12.207
3.310
3.522

4.529
2.414
2.523

3.679

4.381
1.834
2.333

500
0
0 2. 5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\BAL30-14.D)
3.954

mAU
2000
2.909

1500
1000
20.459
12.189
3.311
3.523

4.530
2.410

3.684

500
0
0 2. 5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\BAL30-14.D)
2.909

mAU
3.953

1500
1000
20.456
12.198
4.526
3.522
3.286
3.689
2.410
2.536
2.663

500
0
0 2. 5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min

Şekil IV.17. 30oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün
HPLC kromatogramı.

86
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\BAL40-14.D)

3.953
mAU

2.909
2000
1500
1000

20.464
3.304
3.522
1.964
2.416
2.539

4.529
2.344

3.668

4.388
500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\BAL40-14.D)

3.953
mAU

2.909
2000
1500
1000

20.464
3.523
2.413

3.306

4.531
1.964
2.343
2.543

3.674

4.372
500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\BAL40-14.D)

2.910

3.953
mAU

1500
1000

20.464
12.191
3.523

4.531
2.409

3.307
1.965
2.339
2.549

3.682
500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\BAL40-14.D)
2.910

mAU
2000
3.953

1500
1000

20.464
13.922
2.662

3.523

4.525
3.275
3.689
4.176
2.409
1.967
2.332
2.554

500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min

Şekil IV.18. 40oC’de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün
HPLC kromatogramı.

IV.3.2. GC-EI-MS Sonuçları

Şekil IV.19. 20oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR:9,54) kütle spektrumu.

87
Şekil IV.20. 30oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR:9,50)kütle spektrumu.

Şekil IV.21. 40oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 1. gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR:9.50) kütle spektrumu.

Şekil IV.22. 20oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin180. gün


GC-MS kromatogramı ve asetamipridin (tR:9,53) kütle spektrumu.

88
Şekil IV.23. 20oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün GC-MS
(seçilmiş iyon (198,155,141)) kromatogramı ve tR:7,82’de gözlenen bozunma
ürününün kütle spektrumu.

Şekil IV.24. 20oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün
GC-MS (seçilmiş iyon (114,126 ve 155)) kromatogramı ve tR:6,74’de
gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu.

Şekil IV.25. 30oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR:9,53) kütle spektrumu.

89
Şekil IV.26. 30oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün GC-MS
(seçilmiş iyon (198,155,141)) kromatogramı ve tR:7,82’de ki bozunma
ürününün kütle spektrumu.

Şekil IV.27. 30oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün GC-MS
(seçilmiş iyon (114,126 ve 155)) kromatogramı ve tR:6,74’de gözlenen
bozunma ürününün kütle spektrumu.

Şekil IV.28. 40oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün GC-MS
kromatogramı ve asetamipridin (tR:9,53) kütle spektrumu.

90
Şekil IV.29. 40oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün GC-MS
(seçilmiş iyon (198,155,141) kromatogramı ve (tR:7,82)’de gözlenen
bozunma ürününün kütle spektrumu.

Şekil IV.30. 40oC de bekletilen asetamiprid içeren bal örneğinin 180. gün GC-MS
(seçilmiş iyon (114,126 ve 155)) kromatogramı ve (tR:6,74)’de gözlenen
bozunma ürününün kütle spektrumu.

IV.4. BOZUNMA ÜRÜNLERİ YAPI TAYİNİ

pH: 9,00, 10,00 tampon çözeltileri ve bal örneklerinde görülen bozunma


ürünlerinin yapılarının belirlenmesi amacıyla GC-EI-MS ve GC-PCI-MS ve NMR
teknikleri kullanıldı. En fazla bozunma pH:10 tampon çözeltisinde gözlendiği için
sözkonusu bozunma ürünleri bu çözeltiden ekstrakte edilerek çalışıldı. Ayrıca
preperatif olarak ince tabaka kromatografisi yöntemi ile ayrıldıktan sonra 254nm’de
UV lamba altında gözlenen spotlar kazınarak kloroform içinde çözüldü, süzüldü ve
bu şekilde hazırlanan örnekler GC-MS, HPLC-DAD, FT-IR ve NMR teknikleri ile
çalışıldı. UV, EI-MS, CI-MS, IR ve NMR spektrumları yorumlanarak bozunma
ürünlerinin yapısı belirlendi.

91
IV.4.1. IM-1-2 için GC-EI-MS Sonuçları

GC-EI-MS’de yapılan çalışmada HP-5-MS (30mx0,25mmx0,25µm) analitik


kolonunda, 10µl’lik enjektörle 1µl, 300oC enjeksiyon sıcaklığında ve splitless olarak
enjeksiyon yapıldı. Kolon sıcaklık programı;70 oC’de 3,5 dakika bekletildi, dakikada
50 oC ‘lik artış ile 300 oC’ya ulaşılarak bu sıcaklıkta da 7 dakika bekletildi. Taşıyıcı
gazın (helyum) akış hızı: 1ml/dk, arayüz sıcaklığı:300 oC, iyonizasyon enerjisi:70 eV
ile tarama (scan) modunda çalışıldı.

Şekil IV.31. pH:10,00 tampondaki asetamipridin 360 gün GC-EI-MS kromatogramı


ve (tR:7,82)’de gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu.

92
IV.4.2. IM-1-2 içinGC-CI-MS Sonuçları

GC-PCI-MS’de yapılan çalışmada GC-EI-MS ile aynı koşullarda, iyonizasyon


enerjisi:70, 50 ve 30eV, reaktif gaz metan ile tarama (scan) modunda çalışıldı.
Bu maddenin 70eV, 50eV ve 30 eV’da alınan PCI kütle spektrumlarında
moleküler iyon, EI kütle spektrumuna göre daha şiddetli gözlenmiştir.
C:\Xcalibur\data\CI\pH10atp02 5/16/2007 2:25:12 AM pH10atp

RT : 0.00 - 14.98
7.97 NL:
100 1.27E7
90 TIC F:
MS
80
pH10atp02
Relative Abundance

70
60 5.46
50

40
30
20
4.23 5.83 6.70 7.61 8.44
10 9.13 9.78 10.40 11.84 13.11 13.75
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
T ime (min)

pH10atp02 #214 RT : 7.99 AV: 1 NL: 2.03E6


T: + c Ful l ms [ 50.00-600.00]
199.1
100

80
Relative Abundance

60

40
201.1

20 85.2 163.2 227.1


71.2 86.2 179.2 239.2
126.1 255.2 295.3 341.3 373.1 395.4 452.5 467.0 489.3 514.3 556.3 595.1
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m /z

Şekil IV.32.pH:10,00 tampondaki asetamipridin 360.gün GC-PCI-MS kromatogramı


ve (tR:7,82)’de gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (70eV).
C:\Xcali bur\data\CI\pH10atp03 5/16/2007 3:22:02 AM pH10atp

RT : 0.00 - 14.99
7.97 NL:
100 1.14E7
90 T IC F:
MS
80
pH10atp03
Relative Abundance

70
5.46
60
50

40
30
20
4.09 5.97 6.75 7.61 8.19 8.47
9.28 10.19 11.65 12.35 12.83 13.39 14.22
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
T im e (mi n)

pH10atp03 #214 RT : 7.99 AV: 1 NL: 1.76E6


T : + c Ful l m s [ 50.00-600.00]
198.1
100

80
Relative Abundance

60

40
200.2
84.2
162.2
20 226.1
70.2 197.1
96.2 228.2
125.1 248.2 314.5 360.4 385.8 403.4 458.4 471.5 511.9 541.3 571.5
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z

Şekil IV.33.pH:10,00 tampondaki asetamipridin 360.gün GC-PCI-MS kromatogramı


ve (tR:7,82)’de gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (50eV)

93
C:\Xcalibur\data\CI\pH10atp04 5/16/2007 3:41:53 AM pH10atp

RT : 0.00 - 14.99
7.97 NL:
100 7.71E6
90 TIC F:
MS
80
pH10atp04

Relative Abundance
70
60
5.46
50
40
30
20
4.08 4.41 5.87 6.49 7.61 8.25 8.74 10.48 11.15 11.99 13.21 13.79 14.89
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
T ime (min)

pH10atp04 #214 RT : 7.99 AV: 1 NL: 9.25E5


T: + c Ful l ms [ 50.00-600.00]
198.1
100

80
Relative Abundance

60

40
84.2 200.2

20 162.2 226.2
70.2
96.1 98.3 161.1 178.2 228.2
270.4 292.7 330.3 359.6 400.9 414.6 431.6 527.6
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m /z

Şekil IV.34.pH:10,00 tampondaki asetamipridin 360.gün GC-PCI-MS kromatogramı


ve (tR:7,82)’de gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (30eV).

GC-MS ile elde edilen kütle spektrumlarında, asetamipridin IM-1-2 nolu


bozunma ürününün 240 m/e’ye karşılık olan moleküler iyon piki gözlenmektedir.
Maddenin parçalanması ile elde edilen iyonlar şekil IV.36’de gösterildi.

Şekil IV.35. IM-1-2’nin parçalanması.

IV.4.3. IM-1-2 için NMR Sonuçları


Preparatif ince tabaka kromatografisi ile ayrılan maddelerin, CDCI3 içinde 400
MHz.’de 1H-NMR spektrumları alındı.

94
Şekil IV.36. IM-1-2 nolu bozunma ürününün 1H-NMR spektrumu.

IM-1-2 nolu bozunma ürünü: 1H-NMR (CDCI3), (δ) (ppm): 1,2 (NH2,2H),
2,1 (CH3-N,3H), 2,9 (CH3-C,3H), 4,5 (CH2,2H), 7,2-7,6 (aromatik CH,1H),
8,2 (NH2,2H).

IV.4.5. IM-1-4 için GC-EI-MS Sonuçları


Kromatogramda 6,73. dakikada gözlenen diğer bir bozunma ürünü ise, daha
önce sentezi yapılmış olan iki bozunma ürününden biri ile GC-MS’de aynı alıkonma
zamanı ve spektruma sahip olduğundan bu bozunma ürünü IM-1-4 (N-metil-(6-
kloro-3-piridil) metilamin) olarak teşhis edildi [21].
Ayrıca maddenin EI-MS, PCI-MS ve NMR spektrumları alınarak bu teşhis
doğrulandı. EI-Kütle spektrumunda moleküler iyon olan 156 ve M-1 (155) iyonu
gözlendi.

95
Şekil IV.37. Asetamipridden sentezlenen IM-1-4 bileşiğinin GC-EI-MS kromato-
gramı ve kütle spektrumu.

Şekil IV.38. IM-1-4’ün parçalanması.

96
Şekil IV.39.pH:10,00 tamponda(360.gün) GC-EI-MS kromatogramında (tR:6,73)’de
gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu.

IV.4.6. IM-1-4 içinGC-PCI-MS Sonuçları

Bu maddenin PCI spektrumu da alınarak, değerlendirildi. Kimyasal iyonizasyon


kütle spektrumunda moleküler iyon piki temel pik olarak gözlendi.

C:\Xcal ibur\data\CI\pH10atp02 5/16/2007 2:25:12 AM pH10atp

RT : 0.00 - 14.98
7.97 NL:
100 1.27E7
90 T IC F:
MS
80
pH10atp02
Relative Abundance

70
60 5.46
50
40
30
20
4.23 5.83 6.70 7.61 8.44
10 9.13 9.78 10.40 11.84 13.11 13.75
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Ti me (mi n)

pH10atp02 #80 RT : 5.48 AV: 1 NL: 2.40E6


T : + c Ful l ms [ 50.00-600.00]
157.1
100

80
Relative Abundance

60

40
159.1

20 121.1 185.1
85.2
57.2 114.1 155.9 197.1
207.2 277.1 297.3 331.4 347.1 409.5 449.5 469.4 496.1 585.9
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z

Şekil IV.40. pH:10,00 tamponda(360.gün) GC-EI-MS kromatogramında (tR:6,73)’de


gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (70eV).

97
C:\Xcalibur\data\CI\pH10atp03 5/16/2007 3:22:02 AM pH10atp

RT : 0.00 - 14.99
7.97 NL:
100 1.14E7
90 TIC F:
MS
80
pH10atp03

Relative Abundance
70
5.46
60
50
40
30
20
4.09 5.97 6.75 7.61 8.19 8.47 9.28 10.19 11.65 12.35 12.83 13.39 14.22
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
T ime (min)

pH10atp03 #81 RT : 5.50 AV: 1 NL: 2.06E6


T: + c Ful l ms [ 50.00-600.00]
156.1
100

80
Relative Abundance

60

40
158.1

84.2 120.1
20 184.2
70.2 129.1 196.1
113.1
206.0 276.2 318.5 381.1 394.3 413.4 444.6 474.1 500.5 543.8 572.1
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m /z

Şekil IV.41. pH:10,00 tamponda(360.gün) GC-EI-MS kromatogramında (tR:6,73)’de


gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (50eV).

C:\Xcalibur\data\CI\pH10atp04 5/16/2007 3:41:53 AM pH10atp

RT : 0.00 - 14.99
7.97 NL:
100 7.71E6
90 T IC F:
MS
80
pH10atp04
Relative Abundance

70
60
5.46
50
40
30
20
4.08 4.41 5.87 6.49 7.61 8.25 8.74 10.48 11.15 11.99 13.21 13.79 14.89
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
T ime (min)

pH10atp04 #81 RT : 5.50 AV: 1 NL: 1.26E6


T : + c Full ms [ 50.00-600.00]
156.1
100

80
Relative Abundance

60

40
158.2

84.2 120.1 184.2


20
70.1 155.1
96.2 186.2
206.3 276.3 298.5 345.4 364.3 394.5 411.4 472.1 497.7 548.9
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z

Şekil IV.42. pH:10,00 tamponda(360.gün) GC-EI-MS kromatogramında


(tR:6,73)’de gözlenen bozunma ürününün kütle spektrumu (30eV).

98
IV.2.7. IM-1-4 için NMR Sonuçları

Şekil IV.43. IM-1-4 nolu bozunma ürününün 1H-NMR spektrumu.

IM-1-4 nolu bozunma ürünü: 1H-NMR (CDCI3), (δ) (ppm): 1,4 (NH,1H), 2,4
(CH3,3H), 3,7 (CH2,2H), 7,2-7,6 (aromatik CH,1H).

99
BÖLÜM V

TARTIŞMA VE DEĞERLENDİRME

Bal Örneklerinde Asetamiprid Kalıntısı ve Ana Bozunma Ürününün Tayini İçin


Yöntem Geliştirilmesi

Bu çalışmada, balda asetamiprid kalıntısı ve ana bozunma ürününün tayini için


doğru, güvenilir ve hızlı bir metot geliştirildi. Geliştirilen metotda 1,0000g bal örneği
2,00ml su ile karıştırıldıktan sonra 2x3,00ml diklormetan ile ekstrakte edilip
diklormetan fazı ayrılır. Sulu fazın pH’ı 0,1N NaOH ile 13’e ayarlanıp tekrar 3ml
diklormetan ile ekstrakte edildi. Birleştirilen organik fazlar evaporatörde azot
buharında kuruluğa kadar buharlaştırıldıktan sonra kalıntı 1,00 ml mobil fazda
çözülerek HPLC-DAD ile analiz edildi. HPLC metodu parametreleri aşağıda verildi.

Mobil faz: Asetonitril:Su(50:50,v/v)

Analitik kolon: Sinergy 44 MAX-RP 80A (250mmx4.6mm, 4µm, Phenomenex )

Dalga boyu: 248nm


Sıcaklık:40 oC
Enjeksiyon hacmi: 50µl
tR (ATP) : 3,95
tR(IM-1-2): 3,45
Balda asetamiprid kalıntısı tayini ile ilgili literatürde iki çalışma olmasına
rağmen, balda asetamiprid ve ana bozunma ürününün birlikte analizi ile ilgili bir
çalışmaya rastlanmadı[16,45]. Fidente ve ark. [16] balda asetamiprid kalıntısı tayini
için, solid matriks dağılımı ile hazırladıkları bal örneklerini LC-MS ile analiz

100
etmişlerdir. Bu çalışmada ortalama olarak asetamiprid için, % 83,9 (0,1ppm), %89,6
(1,0ppm) geri kazanım oranı ile 0,03mgkg-1 tespit ve 0,1mgkg-1 tayin sınırları elde
edildiği ve bu tayin sınırlarına ulaşmak için 5g bal örneği ile çalışılması gerektiği
bildirilmiştir.
Diğer çalışmada ise farklı kartuşlarla yapılan katı faz ekstraksiyonu ile
hazırlanan bal örnekleri karşılaştırılarak en iyi geri kazanım oranının Strata C18 E ile
elde edildiği bildirilmiştir.
Bizim çalışmamızda sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi ile hazırlanan bal örnekleri,
HPLC-DAD ile analiz edildi. Geri kazanım oranı % 120 (0,1mgkg-1) ve % 96,95
(1,0mgkg-1) olarak belirlendi. Tespit ve tayin sınırları ise 1g bal örneği
kullanıldığında 0,07 ve 0,1mgkg-1’dir. Diklormetan çözücüsü baldan asetamipridin
ekstraksiyonu için uygundur. Uygulanan analitik prosedür, uygulanması kolay, hızlı
ve balda asetamiprid kalıntısının izlenmesi amacıyla kullanılabilir bir yöntemdir.
Bu çalışmada, daha basit ve kısa süreli örnek hazırlama işlemi ile aynı tayin
sınırı daha ucuz bir yöntemle elde edilmiştir.
Asetamipridin Sulu Ortamdaki Kararlılığı
Çalışmanın ikinci aşaması ise balda asetamipridin kararlılığının belirlenmesi idi.
Bu amaçla öncelikle asetamipridin sulu ortamdaki kararlılığı incelendi. pH:1,30,
2,00, 3,00, 4,00, 5,00, 6,00, 7,00, 8,00, 9,00 ve 10,00 tampon çözeltilerine 100µg/ml
düzeyinde asetamiprid ilave edilerek 6 ay boyunca HPLC-DAD ve GC-MS ile
izlendi. Zamana bağlı olarak farklı pH tamponlarında asetamipridin değişimi
incelendiğinde, pH: 1,30, 2,00, 9,00 ve 10,00 da bozunma meydana geldiği görüldü.
6 aylık izleme sonunda, pH: 1,30’deki asetamiprid miktarı % 66, pH:2,00’deki
asetamiprid miktarı % 8, pH:9,00’daki asetamiprid miktarı % 17, pH:10,00’daki
asetamiprid miktarı % 99,5 oranında azaldığı tespit edildi. pH: 3,00, 4,00, 5,00, 6,00,
7,00 ve 8,00’de anlamlı bir değişim görülmedi. Asetamiprid miktarındaki en hızlı ve
en fazla değişim pH:10,00’da gerçekleşti.
Tampon çözeltilerde IM-1-4 ve IM-1-2 kod numaralı bozunma ürünlerinin
meydana geldiği tespit edildi. Toprak ve bitkide meydana geldiği bildirilen IC-O( 6-
kloronikotinik asit), IM-O (6-kloro-3-piridil metanol), IM-2-1 ((E)-Nı-[(6-kloro-3-
pridil)-metil]-N2-siyanoasetamidin)) bozunma ürünleri tampon çözeltilerde
gözlenmedi [24]. Bu ürünlerden IM-1-2, asetamiprid ile birlikte kantitatif olarak
tayin edildi. 6 ayın sonunda pH:10,00’da meydana gelen IM-1-2 miktarı 65,77µg/ml
olarak bulundu. Ancak 60. günde IM-1-2 miktarı 82,90 olarak bulundu. Bozunmanın

101
belirgin olduğu diğer bir tampon pH:9,00’da benzer durum gözlendi. 60. günde 29,71
µg/ml bulunan IM-1-2 miktarı 6. ayda 23,09 µg/ml’a azaldığı görüldü. pH: 9,00 ve
10,00 tampon çözeltilerinin 6. ayda bulunan IM-1-2 miktarları 60. gün sonuçlarına
göre, sırasıyla %22,82 ve % 20,66 oranında azaldı. Benzer durum diğer tampon
çözeltilerde de gözlendi (Tablo IV.3).
Asetamipridin Baldaki Kararlılığı
Bal ortamında asetamipridin kararlılığının incelenmesi için bala asetamiprid
ilave edilerek 20, 30 ve 40oC’de bekletildi. Bal örnekleri 6 ay süreyle izlendi. Tüm
sıcaklıklarda asetamiprid miktarı yaklaşık olarak % 47 oranında azaldı. Bal
örneklerinde IM-1-2 ve IM-1-4 kod numaralı bozunma ürünleri oluştuğu tespit
edildi. Bozunma 40oC’de bekletilen bal örneğinde diğerlerine göre göreceli olarak
daha hızlı gerçekleşti.
Sulu ortamda pH: 4,00’de değişim olmamasına rağmen, pH değeri 4,00-4,50
arasında olan bal örneklerinde bozunma meydana geldi.
Farklı türdeki bal örnekleri (kestane balı, çiçek balı, ayçiçeği balı ve çam balı)
ile yapılan kararlılık çalışmasında da paralel sonuçlar elde edildi. Farklı tür ballarda
60 gün sonundaki asetamiprid miktarı 75,23-83,70 µg/g arasında değişti.
Asetamipridin oksijenli toprak ortamındaki ana bozunma ürünü IM-1-4 olarak
bildirilmiş olmasına karşın tampon çözeltilerde ve bal ortamında ana bozunma ürünü
IM-1-2’dir. Toprak ve bitkide meydana geldiği bildirilen IC-O( 6-kloronikotinik
asit), IM-O (6-kloro-3-piridil metanol), IM-2-1 ((E)-Nı-[(6-kloro-3-pridil)-metil]-N2-
siyanoasetamidin)) bozunma ürünleri balda gözlenmedi.
pH: 1,30, 2,00, 9,00 ve 10,00’da ve 20, 30 ve 40oC’de bekletilen bal
örneklerinde meydana gelen bozunma ürünlerinin yapı tayini amacıyla EI-MS, PCI-
MS ve NMR spektrumları yorumlandı.
Asetamiprid memelilere ve arılara karşı düşük toksisiteye sahip siyano gruplu bir
neonikotinoid insektisittir. Asetamipridin, nitro gruplu (imidokloprid gibi) diğer
neonikotinoidlerden daha düşük tosisiteye sahip olduğu bildirilmiştir[46]. Ayrıca
aynı çalışmada asetamipridin IM-2-1, IM-O ve IC-O kod numaralı metabolitleri,
arılara 50 µg/arı dozunda topikal olarak uygulandığında mortailite görülmediği
bildirilmiştir. Ancak literatürde, balda meydana geldiğini tespit ettiğimiz IM-1-2 ve
IM-1-4 kod numaralı bozunma ürünlerinin toksisitesi hakkında bir bilgi
bulunamamıştır.

102
Son zamanlarda arıların koloniler halinde kaybolmasının(colony collapse
disorder) ardında aranan sebepler arasında neonikotinoid insektisitlerin arıların
kafalarını karıştırdığı ve oryantasyonlarını bozduğu iddiaları da yeralmaktadır [47].
Toksisitesi düşük bulunsa da asetamipridin arıları ne şekilde etkilediği açıklığa
kavuşmamıştır.
Bu nedenle çalışmamız, asetamiprid ve metabolitlerinin baldaki ve dolayısıyla
arıdaki ve arı ürünlerini tüketen insanlardaki durumunun değerlendirilmesi açısından
önemli bilgi sağlayacaktır.

103
KAYNAKLAR

[1] www.zmo.org.tr/etkinlikler/6tk05/030nafizdelen.pdf (Erişim Tarihi:Nisan 2007)


[2] C. Tomlin, The Pesticide Manual, The British Crop Protection Council, Surrey,
UK, 12th edition (2000)
[3] Isolation and Identification of the Drugs, 202-225
[4] http://www.epa.gov/pesticides/about/types.htm (Erişim Tarihi:Nisan 2007)
[5] http:\www.chem.ox.ac.uk (Erişim Tarihi: Nisan 2007)
[6] Pesticides, Council of Europe Press, 7th edition (1992)
[7] Ambrose, M. Lee: ‘‘Characterization of the insecticidal properties of
acetamiprid under field and laboratory conditions’’, Master Thesis, Graduate
Faculty of North Carolina State University, Department of Entomology,Raleigh,
2003,9.
[8] Yamamoto, I; Casida J.E. ‘‘Nicotinoid Insecticides and the Nicotinic Acetyl-
choline Receptor’’, Springer Verlag, Tokyo, Japonya,(1999),(149-176).
[9] www.dogainsanisbirligidernegi.org.tr/makaleler/pestisitler.doc (Erişim
Tarihi: Nisan 2007)
[10] Council Directive 2001/110/EC of December 2001 relating honey.
[11] T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü
Hayvansal Kökenli Gıdalarda Veteriner İlaçları Maksimum Kalıntı
Limitleri Tebliği. Yayımlandığı R.Gazete: 28.04.2002-24739 Tebliğ No:
2002/30
[12] Blascob, C., Linoa, C.M, Pico Y., Penaa, A., Fontb, G., Silveiraa M.I.N.,
‘‘Determination of organochlorine pesticide residues in honey from the
central zone of Portugal and the Valencian community of Spain’’ J.
Chromatography A, 1049, (2004), 155.

104
[13] Jimenz, J.J., Bernal, J. L., Toribio, L., del Nozal, M. J., Martin, M. T.,
‘‘Capillary gas chromatographywith mass spectrometric and atomic emission
detection for characterization and monitoring chlordimeform degradation in
honey’’, Journal of Chromatography A , 946 (2002) 247.
[14] Tahboub, Y. R., Zaater, M. F., Barri, T. A.: ‘‘Simultaneous identification and
quantitation of selected organochlorine pesticide residues in honey by full-scan
gas chromatography–mass spectrometry’’, Analytica Chimica Acta, 558,
(2006), 62.
[15] Herrera, A., Pe´ rez-Arquillue, C., Conchello, P., Bayarri, S., La´ zaro, R.,
Yagu, C.,Arin, A.: ‘‘Determination of pesticides and PCBs in honey by solid-
phase extraction cleanup followed by gas chromatography with electron-
capture and nitrogen–phosphorus detection’’, Anal Bioanal Chem 381,
(2005) 695.
[16] Fidente, P., Seccia, S., Vanni, F., Morrica, P.: ‘‘Analysis of Nicotinoid
Insecticides Residues in Honey by Solid Matrix Partition Clean-up and Liquid
Chromatography-Electrospray Mass Spectrometry’’, J. Chromatography A,
1094, (2005), 175.
[17] Di Muccio, A., Fidente, P., Barbini, D., A., Dommarcoa, R., Seccia,S.,
Morrica, P.: ‘‘ Application of solid-phase extraction and liquid
chromatography–mass spectrometry to the determination of neonicotinoid
pesticide residues in fruit and vegetables’’, Journal of Chromatography A, 1108,
(2006),1.
[18] Seccia, S., Fidente, P., Barbini, D., A., Morrica, P.: ‘‘Multiresidue
determination of nicotinoid insecticide residues in drinking water by liquid
chromatography with electrospray ionization mass spectrometry’’, Analytica
Chimica Acta, 553, (2005), 21.
[19] Sanchez M, Arrebola FJ, Martinez JL.: ‘‘Analysis of acetamiprid in
vegetables using gas chromatography – tandem mass spectrometry’’,
Analytical Sciences ,19,(2003),701.
[20] Obana, H., Okihashi, M., Akutsu, K.,Kitagawa, Y., Hori, S.: ‘‘Determination
of Acetamiprid, Imıdocloprid and Nitenpyram Residues in Vegetables and
Fruits by High-Performance Liquid Chromatography with diyote-Array
Detection’’, J. Agriculture and Food Chemistry, 50,(2002), 4464.

105
[21] Tokieda, M., Ozawa, M., Kobayashi, S., Gomyo, T.: ‘‘ Method to
Determination of Total Residues of the Insecticide Acetamiprid and Its
Metabolites in Crops by Gas Chromatography’’, J. Pesticide Science.,
22 (1997), 77.

[22] E. Corta, Bakkali, A., Berrueta, L.A., Gallo, B., Vicente, F,:‘‘Kinetics and

mechanism of amitraz hydrolysis in aqueous media by HPLC and GC-MS’’,


Talanta 48 (1999) 189.

[23] E. Corta, Bakkali, Berrueta, L.A Gallo, B., Vicente, F, Bogdanov, S.: ‘‘Study
of the degradation products of bromopropylate, chlordimeform, coumaphos,
cymiazole, flumethrin and tau-fluvalinate in aqueous media’’, Talanta, 52
(2000) 169.
[24] Kagabu, S.: ‘‘Chloronicotinyl insecticides-discovery, application and future
perspective’’, Reviews in Toxicology 1, 75,(1997), 129.
[25] Tomizawa M., Yamamoto, I,:‘‘ Binding of nicotinoids and the related
compounds to the insect nicotinic acetylcholine receptor’’, J. Pesticide Sci., 17,
(1992), 231.
[26] www.epa.gov.acetamiprid (Erişim Tarihi:Ocak 2006)
[27] Tokieda, M., ,Tanaka, T., Ozawa, M., Gomyo, T.: ‘‘High Performance Liquid
Chromatograpic Determination of Acetamiprid and Its Degradation Products
in Soil’’, J. Pesticide Sci., 23,(1998), 296.
[28] Tokieda, M., Ozawa, M., Gomyo, T.: ‘‘Methods of Determination of
Acetamiprid and Its Degradation Products in Soil by Gas Chromatography’’,
J. Pesticide Sci., 24,(1999), 181.
[29] T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü
Türk Gıda Kodeksi Bal Tebliği (Tebliğ No: 2005/49)
[30] Özdoğrul,Ö.: ‘‘Levels of selected pesticides in honey samples from
Kahramanmaraş, Turkey’’, Food Control,18,7 (2007), 866.
[30] Jiménez, J.J, Bernal, J. L., del Nozal, M. J, Novo, M., Higes, M., Llorente, J.:
‘‘Determination of rotenone residues in raw honey by solid-phase extraction an
and high-performance liquid chromatography’’,J. Chromatogr. A, 871
(2000),67.

106
[32] Blasco, C., Fernández, M., Picó, Y.: ‘‘Comparison of solid-phase micro-
extraction and stir bar sorptive extraction for determining six organo-
phosphorus insecticides in honey by liquid chromatography–mass
spectrometry’’, J Chromatography A, 1030, (2004),77.
[33] Jimenez, J.J., Bernal, J.L., Del Lozal, M.J., Toribio, L., Mart´ın, M.T.: ‘‘Gas
chromatography with electron-capture and nitrogen–phosphorus detection in
the analysis of pesticides in honey after elution from a Florisil column ,
Influence of the honey matrix on the quantitative results’’,J. Chromatogr. A,
823 (1998) 381.
[34] Albero B, Sanchez-Brunete C, Tadeo JL.,:‘‘Analysis of pesticides in honey
by solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry’’,
J Agric Food Chem.(19), (2004),5828,
[35] Jimenez, J. J., Bernal, J. L., del Nozal, M. J., Martin, M.,T., Mayorga, A. L.:
‘‘Solid-phase microextraction applied to the analysis of pesticide residues in
honey using gas chromatography with electron-capture detection.’’
J. Chromatogr. A 829, (1998),269.
[36] R. Rial-Otero, R., Gaspar, E.M., Moura, I., Capelo, J.L., ‘‘Chromatographic-
based methods for pesticide determination in honey:An overview’’,
Talanta,71, 2, (2007), 503.
[37] Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A., (çeviri editörleri: Kılıç, E.,
Köseoğlu, F., Yılmaz, H.): ‘‘Enstrumental Analiz İlkeleri’’, Bilim Yayıncılık,
Ankara, Türkiye, (1997)
[38] Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A., (çeviri editörleri: Kılıç, E.,
Köseoğlu, F.): ‘‘Analitik Kimya Temelleri’’, Bilim Yayıncılık,
Ankara, Türkiye, (1999).
[39] http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/chrom1.htm (Erişim
Tarihi: Mayıs, 2007)
[40] http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/ (Erişim Tarihi: Mart, 2007)
[41] Eurachem Guide, The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A
Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics (1998).

107
[42] Marin, A., Martinez Vidal, J. L., Egea Gonzalez, F.J., Garrido Frenich, A.,
Glass, C.R., Sykes, M., ‘‘Assesment of potential (inhalation and dermal ) and
actual exposure to acetamiprid by greenhouse applicators using liquid
chromatography-tandem mass spectrometry’’, Journal of Chromatography B,
804(2004) 269.
[43] Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R.M., ‘‘Mechanism for the
differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis
mellifera’’, Crop Protection 23 (2004) 371.
[44] http://www.epa.gov/oppbead1/methods/ecm12b.htm (Erişim
Tarihi:Mayıs, 2006)
[45] Guzsvany, V. J.: ‘‘Comparison of solid-phase extraction procedures for
determining neonicotinoid insecticides in honey by liquid chromatography’’.
1st European Chemistry Congress, 27-31 August 2006, Budapest, Hungary.
[46] Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M., ‘‘Mechanism for the
differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis
mellifera’’, Crop Protection,23 (2004) 371.
[47] http://www.sare.org/index.htm (Erişim Taihi: Haziran 2007)

108
EKLER

EK.1. pH:2,00-9,00 tamponlarındaki asetamipridin 1. ve 60. gün HPLC sonuçlarına


ait kromatogramlar.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH2-1. D)


3.902

mAU
2000
1500
1000
3.333

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 m in
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH2-1. D)
3.905

mAU
2000
1500
1000
3.333

6.275

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 m in
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\PH2-1.D)
3.899

mAU
2000
1500
1000
3.333

6.276

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 m in
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH2-1.D)
3.899

mAU

1500
1000
3.333

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 m in

EK 1.1. pH:2,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün HPLC sonucu.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH3-1. D)


3.910

mAU

2000
1500
1000
3.333

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 m in
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH3-1. D)
3.908

mAU
2000
1500
1000
3.333

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 m in
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\PH3-1.D)
3.905

mAU
2000
1500
1000
3.333

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 m in
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH3-1.D)
3.901

mAU

1500
1000
3.333

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 m in

EK 1.2. pH:3,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün HPLC sonucu.

109
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH4-1. D)

3.891
mAU
2000
1500
1000

3.328
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH4-1. D)

3.892
mAU
2000
1500
1000

3.328
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 R ef =360,100 (BAL2\PH4-1.D )

3.892
mAU
2000
1500
1000

3.328
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH4-1.D)
mAU 3.892

1500
1000
3.328

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.3. pH:4,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün HPLC sonucu.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH5-1. D)


3.905

mAU
2000
1500
1000
3.331
2.826
2.975

500
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH5-1. D)
3.904

mAU
2000
1500
1000
3.331
2.976

500
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\PH5-1.D)
3.920

mAU
2000
1500
1000
3.331
2.976

500
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH5-1.D)
3.906

mAU
2000
1500
1000
3.331

500
0
0 2.5 5 7. 5 10 12.5 15 17.5 min

EK 1.4. pH:5,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün HPLC sonucu.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH6-1.D)


3.897

mAU
2000
1500
1000
3.333
2.801
3.002
3.136

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH6-1.D)
3.897

mAU
2000
1500
1000
3.333
3.001
3.135

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\PH6-1.D)
3.911

mAU
2000
1500
1000
3.333
3.000

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH6-1.D)
3.901

mAU

1500
1000
3.333

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.5. pH:6,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün HPLC sonucu.

110
D AD 1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH7-1.D)

3.909
mAU
2000
1500
1000

3.334
2.807
3.013
3.134
500
0
0 2. 5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
D AD 1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH7-1.D)

3.908
mAU
2000
1500
1000

3.334
3.017
3.135
500
0
0 2. 5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
D AD 1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\PH7-1.D )

3.911
mAU
2000
1500
1000

3.334
3.022
3.136
500
0
0 2. 5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
D AD 1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH 7-1.D)

3.905
mAU

1500
1000
3.334

500
0
0 2. 5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min

EK 1.6. pH:7,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün HPLC sonucu.

D AD 1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH8-1.D)


3.915

mAU
2000
1500
1000
3.338
2.977
3.142

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
D AD 1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH8-1.D)
3.913

mAU
2000
1500
1000
3.338
2.977
3.142

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
D AD 1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\PH8-1.D )
3.913

mAU
2000
1500
1000
3.338
2.975
3.141

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
D AD 1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH 8-1.D)
3.917

mAU

1500
1000
3.338

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.7. pH:8,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün HPLC sonucu.

D AD 1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (BAL2\PH9-1.D)


3.914

mAU
2000
1500
1000
3.334
2.154

3.001
3.136

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
D AD 1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (BAL2\PH9-1.D)
3.914

mAU
2000
1500
1000
3.334
2.154

3.001
3.136

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
D AD 1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (BAL2\PH9-1.D )
3.917

mAU
2000
1500
1000
3.334
3.002
3.136

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
D AD 1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (BAL2\PH 9-1.D)
3.916

mAU

1500
1000
3.334

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.8. pH:9,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün HPLC sonucu.

111
D AD 1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (PH\PH2-60.D )

3.896
mAU
1500

1000

18.724
2.055
2.179

2.678
3.019
3.333
3.493
3.703

6.270
6.489
500

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
D AD 1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (PH\PH2-60.D )

3.896
mAU
1500

1000

18.723
3.333
2.055
2.179

2.772
3.016

3.493
3.704

6.270
6.488
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
D AD 1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (PH\PH2-60.D)

3.896
mAU
1500

1000

18.724
3.333
2.055
2.179

3.019

3.495

6.270
6.489
500

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
D AD 1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (PH \PH2-60.D)

3.896
mAU
800
600
400

18.723
3.333
2.055

3.494
2.675

3.705
200
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.9. pH:2,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün HPLC sonucu.


3.897

mAU

2000
1500
1000

18.850
3.330
2.047
2.165

2.677
3.017
3.134
3.492
3.674

6.288
6.507

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
3.898

mAU

2000
1500
1000

18.848
3.330
2.048
2.164

2.682
3.017
3.133
3.492
3.674

6.288
6.506

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
3.901

mAU
2000
1500
1000

18.848
3.331
2.047
2.164

3.018
3.132
3.493
3.678

4.769

6.287

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
3.900

mAU

1500

1000
10.266

18.853
3.331
3.494
2.047

3.044

3.672

500

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.10. pH:3,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün HPLC sonucu.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (PH\PH4-60.D)


3.897

mAU
2000
1500
1000
18.850
2.047
2.165

2.677
3.017
3.134
3.330
3.492
3.674

6.288
6.507

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (PH\PH4-60.D)
3.898

mAU
2000
1500
1000
18.848
3.330
2.048
2.164

2.682
3.017
3.133
3.492
3.674

6.288
6.506

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (PH\PH4-60.D)
3.901

mAU
2000
1500
1000
18.848
3.331
3.493
2.047
2.164

3.018
3.132

3.678

4.769

6.287

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (PH\PH4-60.D)
3.900

mAU

1500
1000
10.266

18.853
3.331
3.494
2.047

3.044

3.672

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.11. pH:4,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün HPLC sonucu.

112
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (PH\PH5-60.D)

3.901
mAU
2000
1500
1000

18.790
2.052
2.160

2.804
2.994
3.333
3.498
3.689

4.802

6.274
6.496
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (PH\PH5-60.D)

3.901
mAU
2000
1500
1000

18.789
2.052
2.159

3.333
3.498
3.690

4.803

6.275
2.994

6.497
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (PH\PH5-60.D)

3.897
mAU
2000
1500
1000

18.789
3.333
3.500
3.694

4.805

6.275
2.052
2.159

2.993

6.495
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (PH\PH5-60.D)

3.901
mAU

1500
1000

10.141

18.791
3.334
3.500
2.052
2.162

3.689

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.12. pH:5,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün HPLC sonucu.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (PH\PH6-60.D)


3.909

mAU
2000
1500
1000

18.961
2.053
2.156

2.755
3.027
3.137
3.333
3.494
3.692

6.314
6.532

500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (PH\PH6-60.D)
3.907

mAU
2000
1500
1000

18.961
2.053
2.156

3.028
3.333
3.494
3.692

6.314
3.136

6.532

500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (PH\PH6-60.D)
3.906

mAU
2000
1500
1000

18.961
3.333
3.029

3.495
3.694

4.841

6.314
2.052
2.157

3.133

500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (PH\PH6-60.D)
3.906

mAU

1500
1000
10.164

18.961
3.333
3.496
2.052
2.159

3.033

3.692

500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min

EK 1.13. pH:6,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün HPLC sonucu.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (PH\PH7-60.D)


3.900

mAU
2000
1500
1000
18.903
2.048
2.152

2.750
3.028
3.129
3.331
3.491
3.694

6.295
6.518

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (PH\PH7-60.D)
3.897

mAU
2000
1500
1000
18.910
2.048
2.152

2.754
3.028
3.129
3.332
3.492
3.694

6.295
6.517

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (PH\PH7-60.D)
3.904

mAU

1500
1000
18.912
3.332
2.049
2.152

3.028
3.127
3.492
3.695

6.296

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (PH\PH7-60.D)
3.900

mAU

1500
1000
10.304

18.917
3.332
3.493
2.049
2.156

3.040

3.694

500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.14. pH:7,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün HPLC sonucu.

113
DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (PH\PH8-60.D)

3.911
mAU
2000
1500
1000

19.085
2.040
2.145

3.033
3.135
3.332
3.495
3.672

5.575

6.327
6.537
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (PH\PH8-60.D)

3.909
mAU
2000
1500
1000

19.082
3.332
3.495
2.040
2.145

3.032
3.134

3.673

5.577

6.327
6.538
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (PH\PH8-60.D)

3.912
mAU
2000
1500
1000

19.084
3.495
3.332
2.040
2.145

3.033
3.133

3.677

5.578

6.327
6.537
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (PH\PH8-60.D)

3.910
mAU

1500
1000

10.380

19.088
3.495
3.333
2.040

3.129

3.670

6.510
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

EK 1.15. pH:8,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün HPLC sonucu.

DAD1 A, Sig=245,16 Ref =360,100 (PH\PH9-60.D)


3.918

mAU
2000
1500
1000

19.179
3.495
2.110

3.039
3.132
3.332
3.647

4.663
4.945

5.594

6.344
6.550

500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 B, Sig=248,16 Ref =360,100 (PH\PH9-60.D)
3.918

mAU
2000
1500
1000

19.179
3.495
3.332
2.110

3.039
3.131

3.647

4.763
4.944

5.592

6.343
6.550

500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 C, Sig=254,8 Ref =360,100 (PH\PH9-60.D)
3.916

mAU
2000
1500
1000

19.179
3.495
3.332
3.129

6.343
2.109

4.767
4.943

5.590

6.546

500
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
DAD1 D, Sig=270,16 Ref =360,100 (PH\PH9-60.D)
3.915

mAU

1500
1000
10.464

19.181
3.496
3.332
3.121
2.112

6.515

500

0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min

EK 1.16. pH:9,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün HPLC sonucu.

114
EK.2. pH:2,00-9,00 tamponlarındaki asetamipridin 1. ve 60. gün GC-MS
sonuçlarına ait kromatogramlar.

EK 2.1. pH:2,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün GC-MS sonucu.

EK 2.2. pH:3,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün GC-MS sonucu.

EK 2.3. pH:4,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün GC-MS sonucu.

115
EK 2.4. pH:5,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün GC-MS sonucu.

EK 2.5. pH:6,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün GC-MS sonucu.

EK 2.6. pH:7,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün GC-MS sonucu.

116
EK 2.7. pH:8,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün GC-MS sonucu.

EK 2.8. pH:9,00 tampon çözeltideki asetamipridin 1. gün GC-MS sonucu.

EK 2.9. pH:2,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün GC-MS sonucu.

117
EK 2.10. pH:3,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün GC-MS sonucu.

EK 2.11. pH:4,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün GC-MS sonucu.

EK 2.12. pH:5,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün GC-MS sonucu.

118
EK 2.13. pH:6,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün GC-MS sonucu.

EK 2.14. pH:7,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün GC-MS sonucu.

EK 2.15. pH:8,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün GC-MS sonucu.

119
EK 2.15. pH:9,00 tampon çözeltideki asetamipridin 60. gün GC-MS sonucu.

120
ÖZGEÇMİŞ

1975 yılında Ordu’da doğdum. İlk, orta ve lise öğrenimimi Ordu’da tamamladım. 1996
yılında İstanbul Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümünden
mezun olduktan sonra 2001 yılında İ.Ü. Adli Tıp Enstitüsü’nde adli bilimler alanında
yüksek lisans eğitimimi tamamladım. 1998 yılından beri Adalet Bakanlığı Adli Tıp
Kurumu’nda adli bilimler uzmanı olarak çalışmaktayım.

Oya TANÇ YETER

You might also like