PROTEİNLERİN

EKSTRAKSİYONU
KONSANTRASYONU
SAFLAŞTIRILMASI
 PLANLAMA VE STRATEJİ

• Protein ne için gereklidir?

• Onun eldesi için en uygun kaynak ne
olabilir?
• Protein hakkında ne bilinmektedir?
• Protein nasıl analiz edilecektir?
 Protein ne için gereklidir?
Proteinlerin
• Aminoasit kompozisyonunu ve dizilişini,
• Molekül ağırlığını ve
• Fiziksel özelliklerini öğrenmek için
• Proteinin aktivitesi,
• işlev ilişkileri incelemek üzerine olabilir.
 Protein ne için gereklidir?
• Bu çalışmaların gereksinimleri, ne kadar
saflaştırılmış protein gerektiği, aktive
kaybının tolere edilebilirliği, nasıl bir
saflıkta olabilirliği ve de proteinin
saflaştırma zamanı ve maliyeti üzerinde
belirleyici olurlar.
HANGİ KAYNAK KULLANILMALIDIR?

• İlgilenilen proteini en stabil ve en bol

miktarda içeren kaynak seçilmelidir.
• Ayrıca kaynağın elde edilebilirliği ve
miktarı da göz önüne alınmalıdır.
BİYOLOJİK MATERYALLER
MİKROORGANİZMALAR
HAYVANSAL ÖRNEKLER
HAYVAN DOKU VE HÜCRE
KÜLTÜRLERİ
BİTKİLER VE BİTKİ DOKU
KÜLTÜRLERİ
PROTEİN HAKKINDA NE BİLİNMEKTEDİR?

• Proteinin en azından fiziksel ve kimyasal özelliklerinden

bazılarının bilinmesi ve onun hücre içinde bulunduğu yer
ekstraksiyon ve saflaştırma basamaklarının tasarımında
yardımcı olacaktır.

• Eğer protein daha önce başka bir kaynakta izole

edilmişse ona ait bilgilerin çoğu yeni bir kaynaktan
proteinin izolasyonunda kullanılabilir.

• Proteinin hücre içi ya da dışı olması, çözünür, çözünmez

yada membrana bağlı olması, hücre altı organellerde
bulunması seçilen ekstraksiyon yöntemi ve kullanılan
tampon çözelti bileşenlerini etkiler.
• Molekülleri doğrudan hücre içindeki
durumlarıyla izlemeye yönelik bazı yöntemler
de bulunmakla birlikte,
• moleküler biyolojideki araştırmalar büyük
ölçüde saflaştırılmış moleküllerle yapılan
çalışmalara dayanmaktadır.

• Bu amaçla gerçekleştirilen işlemlere

özütleme (ekstraksiyon) adı verilir.
• Özütleme sırasında ardışık iki temel uygulama
aşaması (parçalama ve ayırma-saflaştırma) vardır.
• Bunun için öncelikle proteinin ekstre edileceği kültür,
doku yada organın hazırlanır.
• Hayvan dokusu ile çalışılacaksa doku, kan ve diğer
hücre dışı materyal kalıntılarını uzaklaştırmak için
fizyolojik su veya tamponlanmış tuz çözeltisi ile
yıkanır.
• Bitkisel materyal söz konusu ise, ilgili bitki kısmı
toprak vb. kalıntılardan temizlendikten sonra küçük
parçalara ayrılarak dondurulur veya kurutularak
kullanılır.
• Mikroorganizmalardan ekstrakte edilecekse, hücreler
santrifüjlendikten sonra tamponda süspanse edilirler.
• Daha sonra materyale uygun ekstraksiyon tamponu
ile parçalama yöntemi seçilerek lizis edilir.
 Protein denatürasyonundan ve
inaktivasyondan korunmak için
çalışmanın her aşamasında
pH ve SICAKLIK kontrol altında
tutulmalıdır!
Sıcaklığın olumsuz etkisi, işlemlerin SOĞUKTA
(genelde 4oC’da) gerçekleştirilmesiyle önlenir.

pH ise bu moleküllerin fizikokimyasal gereksinimleri

doğrultusunda hazırlanmış tampon çözeltilerin kullanımı
ile istenen değerde tutulur.
 Ortam pH’sının 7 ve 7’ye yakın
değerlerde olduğu koşulda en geniş
çapta kullanılan tamponlar tris ve
fosfat tamponlarıdır.
 TAMPON SEÇİMİNDE DİKKAT
EDİLMESİ GEREKENLER:
• Çalışma pH’sı,
• Tamponun anyonik veya katyonik karakterde olması,
• İyonik kuvvet ve sıcaklık etkisiyle pH değişimi,
• Kimyasal etkinlik,
• Biyolojik etkinlik,
• Diğer bileşenlerle etkileşim,
• Biyolojik membranların geçirgenliği,
• Toksisite,
• Maliyet,
• Çözünürlük
 Parçalama (Homojenizasyon)
• Bu aşamada, çalışılacak molekül grubunu (nükleik
asit yada protein) içeren doku veya hücrelerin
çeper ve zar yapıları parçalanıp yok edilir.
• Elde edilen yapıya homojenat denir.
• Hücre yapısı ortadan kalkmış olan homojenatta,
serbest yada organeller içerisindeki, hücre
bileşenleri parçalamanın yapıldığı ortamda
dağılmış bir süspansiyon halinde bulunurlar.
• Hangi yöntemin uygulanacağına kullanılan
organizmanın doku ve hücre tipine veya
amaçlanan çalışmaya göre karar verilir.
 HOMOJENİZASYON:
Çalışılacak molekül grubunu içeren
doku veya hücrelerin çeper ve zar
yapılarını parçalama işlemi

Fiziksel işlemler Kimyasal işlemler

•Mekanik işlemler •Çözücülerin kullanılması
•Ultrasonikasyon •Enzimlerin kullanılması
•Ozmotik şok
•Dondurma-çözme
 Mekanik İşlemler:
ALETLİ HOMOJENİZASYON
Mekanik İşlemler:
OZMOTİK ŞOK
 Mekanik İşlemler:
DONDURMA-ÇÖZME

Soğuk-Sıcak-Soğuk-Sıcak.....
 Kimyasal İşlemler:
Çözücülerin Kullanılması

Organik çözücüler
Deterjanlar,
Bazik çözeltilerle...
 BİYOLOJİK MOLEKÜLLERİN
İZOLASYONU (EKSTRAKSİYON) :
MASERASYON
 Kimyasal İşlemler:
Enzimlerin Kullanılması

Lizozim,
Tripsin,
Proteinaz K,
Zimoliyaz gibi enzimlerle...
 Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı
parçalama yöntemleri
Teknik Materyal tipi
Nazik
Ozmotik şok Eritrositler
Enzim uygulaması Bakteriler, mayalar
Deterjan uygulaması Doku kültürü hücreleri
Havan veya pistonlu
homojenizatör Karaciğer vb yumuşak dokular
Diğer aletlerle parçalama Kas vb. Dokular

Orta şiddette
Milli homojenizatörle par. Hayvansal ve bitkisel dokular
Kum, alumina vb. ile ezme Bitkisel dokular, bakteriler

Sert
Fransız basınç hücresi Bitkisel dokular, bakteriler
Ultrasonikasyon Hücre süspansiyonları
Balistik parçalama Hücre süspansiyonları
Parçalama (homojenizasyon)
yöntemleri uygulanarak doku
veya hücrelerin çeper ve zar
yapıları yok edilir.

Ele geçen ve çalışılacak

molekül grubunu içeren
karışıma HOMOJENAT denir.
 Ayırma (seperasyon) ve Saflaştırma
(Pürifikasyon)
• Parçalamaya ardışık olarak, üzerinde çalışılacak molekül grubunu homojenattaki
diğer moleküllerden ayırıp saf şekilde elde etmeye yönelik bir seri işlem
uygulanır.

• Bu işlemler homojenattaki molekül gruplarının genellikle çözünme özelliklerine ya

da kitle, yoğunluk, elektriksel yük gibi fiziksel özelliklerine göre birbirlerinden
ayrılmalarını sağlayan yöntemleri kapsarlar.

• Bir makromolekülün izolasyon ve saflaştırılmasında genellikle çeşitli teknikler

ardışık olarak kullanılmaktadır.

• Bu yöntemlerin başlıcaları şunlardır:

• Süzme (filtrasyon)
• Çöktürme
• Enzim uygulaması
• Santrifüjleme
• Kromotografi
• Elektroforez
SÜZME (FİLTRASYON)
 Moleküler biyolojide en çok
kullanılan filtre edici materyaller:

• Müslin (tülbent veya gazlı bez)

• Filtre kağıdı (bkz. MBKY kitabı Ek 15, s. 324)
• Sinterli cam huni
• Membran filtreler (bkz. MBKY kitabı Ek 16, s.
324)
Membran filtreler veya ”membranlar” özgül por
çaplarına sahip polimer filmlerden oluşur.
Porlardan geçemeyecek büyüklükteki partiküller ve
mikroorganizmalar için fiziksel bir bariyer oluşturur ve
bunları zarın yüzeyinde tutarlar.
 ULTRAFİLTRASYON

Moleküllerin boyut, biçim

ve/veya yüklerine göre
ayrılmasını sağlar.
Centricon tipi
ultrafiltrasyon
tüpü Kapan hücresi
(vakumdan (basınçtan
yararlanılır) yararlanılır)
 SANTRİFÜJLEME

Santrifüjler yardımıyla yüksek hızda döndürülerek

merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin
davranışına göre ayırım sağlayan teknik
Santrifüjleme sonunda
Üst faz (sıvı
faz)
“süpernatant”

Alt faz (çökelti)

“pellet”
Homojenattaki zar (membran)
parçalarını, parçalanmamış
doku ve hücreleri
uzaklaştırmak amacıyla
uygulanan ÖN AYIRMA
işlemlerinden sonra ele geçen
sıvıya HAM ÖZÜT
adı verilir.
• Laboratuvarda protein ekstraksiyonu
aşamasından sonra santrifüjleme ve
elektroforez yönteminden
yararlanacağız.
 Protein Konsantrasyonunun
Belirlenmesi
Konsantrasyonun belirlenmesi için kullanılan 4 metot vardır;
• A280/A260 (Warburg-Christian yöntemi)
• Biuret yöntemi
• Boya-bağlama (Bradford) yöntemi
• Lowry yöntemi
Bu yöntemler protein çözeltisinin UV absorbsiyonunun
ölçülmesi veya bir belirteç ile reaksiyonu sonucu
oluşan renkli bir bileşiğin görünür alanda spektral
olarak belirlenmesine dayanır.
a) Biüret Yöntemi

Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği

nedeniyle geniş çapta kullanılan bir yöntemdir.

Reaksiyonun temeli belirteçteki bakır iyonlarının (Cu+2) peptid

azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide 540-560 nm’de
maksimum absorbsiyon gösteren renkli bir kompleksin
oluşumuna dayanır.

Cu+2 iyonlarının ana zincire bağlanması nedeniyle amino asit

çeşitlerinin ölçümler üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.
 Proteinler amid grupları içerirler. Bir
amino grubu ile bir karboksil grup
peptit bağı ile birbirine bağlandığında,
amino grupları bir amid grubu
oluştururlar. Bu yüzden, uygun pH’ta
proteinler bakır iyonlarıyla bir kompleks
oluştururlar.

Buna biüret reaksiyonları denir. Bu

reaksiyon protein konsantrasyonu
ölçümlerinde kullanıldığında biüret
protein tahlili adı verilir.
• Biüret Yönteminin Amacı

• Konsantrasyonu bilinmeyen maddelerin

standart eğriden tayin edilmesi
 Lowry yöntemi

Lowry yöntemi alkali koşullarda meydana gelen iki farklı

reaksiyona dayalıdır.

Hassasiyet aralığı 5 - 100 μg/ml’dir.

Bunlardan birincisi amid bağları ile bakır iyonları arasında

meydana gelir ve indirgenmiş bakır oluşumu ile sonuçlanan
Biüret reaksiyonudur.

İkincisi ise Folin-Ciocalteu ayıracının (fosfomolibden ve

fosfotungsten) tirozin ve triptofan amino asitleri ile
tepkimeye girerek indirgenmesidir.

İndirgenmiş ayıraç mavi renktedir

 Warburg-Christian Yöntemi

*Warburg-Christain yönteminde, çalışılan

çözeltinin UV absorbsiyonu doğrudan ölçülür
ve protein derişimi hesap yoluyla bulunur.
*Diğer yöntemlerde ise belirteçlerle işlem
sonucu oluşan renkli bileşiğin absorbsiyonu
belirlenir ve derişimleri bilinen satandart protein
çözeltilerinin ortaya koyduğu verilerle
karılaştırılır.
 Warburg-Christian Yöntemi

Tirozindeki fenolik gruplar ve triptofandaki indolik

gruplar nedeniyle birçok proteinin 280 nm’de maksimum
absorbsiyon gösterme özelliğinden yararlanılarak
örnekteki protein miktarının yaklaşık olarak bulunması için
kullanılan hızlı bir yöntemdir.
 Çok duyarlı değildir.
 Kolaydır ve hızlı sonuç verir.
 Warburg-Christian Yöntemi

 260 nm’de maksimum absorbiyon gösteren

nükleik asitlerin 280 nm’de de absorbsiyon
yetenekleri olduğundan nükleik asit artıkları ile
kontamine durumdaki ilk kaba ekstreler ile
çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir.Bunun
önüne geçmek için Warburg ve Christian tarafından
geliştirilmiş bir seri hata düzeltme faktörü kullanılır.
 Protein çözeltisinin saflık derecesi yükseldikçe
hatalar da en aza indirgendiğinden,bu yöntem daha
çok yarı saf ve saf protein çözeltilerine uygulanır.
 Warburg-Christian Yöntemi

 İşlem şu şekilde yapılır :

 Protein çözeltisinin 280 nm ve 260 nm’deki absorbansı
ölçülür.
 A280 / A260 oranı hesaplanır.
 Tablodaki değerlerden hata düzeltme faktörü
bulunur.Faktör,formülde yerine konularak protein derişimi
hesaplanır.
 Protein konsantrasyonu ( mg/ml ) = Faktör x A280
A280/A260 oranı Nükleik Asit(%) Faktör

1.75 0.00 1.116

1.63 0.25 1.081
1.52 0.50 1.054
1.40 0.75 1.023
1.36 1.00 0.994
1.30 1.25 0.970
1.25 1.50 0.944
1.16 2.00 0.899
1.09 2.50 0.852
1.03 3.00 0.814
0.979 3.50 0.776
0.939 4.00 0.743
0.874 5.00 0.682
0.846 5.50 0.656
0.822 6.00 0.632
0.804 6.50 0.607
0.784 7.00 0.585
0.767 7.50 0.565
0.753 8.00 0.545
0.730 9.00 0.508
0.705 10.00 0.478
0.671 12.00 0.422
0.644 14.00 0.377
 Warburg-Christian Yöntemi

 Schleif ve Wensink, sadece 280 nm ve 260 nm’de ölçülen

absorbanslardan giderek yaklaşık protein miktarının
hesaplanabileceği bir formül geliştirmişlerdir:

 Protein konsantrasyonu ( mg/ml ) = 1.5 x A280 - 0.75 x A260

 Boya Bağlama (Bradford)
Yöntemi:
• Bu yöntem, Coomassie Brilliant Blue G-250
boyasının farklı
• konsantarsyonlardaki protein çözeltilerinde
değişik şiddette
• mavi renk ortaya koymasından yararlanılarak
geliştirilmiştir.
• Boyanın özellikle arginin gibi bazik amino
asitler ve
• Bazı aromatik amino asitlere bağlanma
eğiliminde olduğu gösterimiştir.
• Dolayısıyla bu yöntemde proteinin primer yapısının önemi
• vardır.
• Duyarlılık sınırları, total reaksiyon karışımında (5.1 ml)
• 20-140 μg olan bu yöntemde (örnek konsantrasyonunun
• 0.2-1.4 mg/ml arasında olması demektir) asidik boya
• proteine bağlanır ve 495-595 nm arasında maksimum
• absorbsiyon değerleri elde edilir.
• Bu deneyde standart protein olarak miktarı belirlenecek
• proteinin kendisi kullanılırsa en doğru sonuç alınır.
• Standart olarak çoğunlukla kullanılmakta olan sığır serum
• albumininden (bovine serum albumin, BSA) yararlanılabilir,
• ancak BSA, boya bağlama kapasitesinin fazla olması
• nedeniyle, Bradford deneyinde diğer yöntemlere göre daha
• yüksek değerler ortaya koyar.
• Bu da protein miktarının gerçeğinden daha düşük çıkmasına
• yol açar.
• Bu nedenle standart protein olarak sığır γ-globulin ya da
• yumurta albumini tercih edilir.
 Araç ve Gereçler

• 1 mg/ml standart bovine serum albumin (% 0.9 NaCl içinde),

• % 0.9 NaCl
• Distile Su
• Bradford çözeltisi;
• 25 mg Coomasie brillant blue G-250, 12.5 ml %95 etanolde
çözündürülüp, 25 ml %85
• fosforik asit (H3PO4) eklenir. Bu boya çözeltisi 250 ml’ye tamamlanır.
Kullanılacağı
• zaman 5 kere sulandırılır. Whatman no.1filtreden geçirilir ve bir cam
şişede, oda
• sıcaklığında saklanır. Kullanılmadan kalan Bradford stok çözeltisi
ortalama 1 yıl 4oC’de
• saklanabilir.
• Test Tüpü
• Pipet (1 ve 5 ml. lik pipet)
• Kolorimetre tüpler
İzlenecek Yol
 İzlenecek Yol
• 1) Kör tüpü (1 no.lu tüp) ve Örnek tüpleri (7 ve 8 no.lu tüpler) hariç bütün
tüplere tabloda verilen miktarlarda (µl) BSA (Standart Serum Albumin)
ilave edin.
• 2) 7 ve 8 no.lu tüplere, farklı konsantrasyonlarda ancak bizim derişimlerini
bilmediğiniz protein örneğinden 20-100 µl arası ekleyin. Eğer 100 µl’den
az örnek kullandıysanız son hacmi su ile 100µl’ye tamamlayın.
• 3) Bütün tüplere tabloda verilen miktarlarda d-H2O (distile su) ekleyin
• 4) Bütün tüplere 5.9 ml NaCl ekleyerek hacimleri 6 ml’ye tamamlayın
• 5) Bütün tüplere 1’er ml Bradford çözeltisi ilave edin.
• 6) Oluşan rengin sabitlenmesi için 10 dakika bekleyin.
• 7) 595 nm ye ayarlı spektrofotometrede 1 numaralı kör tüpüne karşı
2,3,4,5,6, 7. ve 8. tüplerin absorbanslarını okuyun ve kaydedin.
• 8) 2,3,4,5 ve 6. Tüpler için okuduğunuz absorbans değerlerini ordinatta (y
ekseni),bu tüplerdeki BSA derişimlerini absiste (x eksenine) göstererek
Standart grafiği çizin.
• 9) Bu standart grafiği kullanarak derişimini bilmediğiniz 7 ve 8 no.lu
tüpteki örneklerinizin protein derişimini bulun ve kaydedin.
Protein miktarlarına göre renk göstergesi (en
sağdaki tüp kör tüpüdür)
 ELEKTROFOREZ
SDS-PAGE
• Yüklü moleküllerin elektriksel alanda ayrılmaları
temeline dayanan elektroforez tekniği proteinlerin
analizinde ve ayrılmasında da geniş çapta kullanılır.
• Temelde protein tanımlama (molekül ağırlığını,
oligomerik mi, monomerik mi olduğunu, miktarını,
saflığını belirlemek vb) ve saflaştırma amacıyla
kullanılan bu yöntem doğal veya rekombinant bir
proteinin sentezlenip sentezlenmediği;
sentezleniyorsa işlevsel olup olmadığı hakkında da
bilgi verir.
Elektroforez Cihazının Parçaları
 SDS-PAGE
Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Gel Elektroforezi

• Proteinlerin elektroforetik ayrımında nişasta,

agaroz ve selüloz asetat gibi çeşitli jeller
kullanılmakla birlikte, genelde en iyi ayrışımın
sağlandığı poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)
tekniği uygulanır.
• PAGE'de destek matrisi olan poliakrilamid,
akrilamid monomerlerinin çapraz bağlayıcı
("cross-linker") moleküller (N,N'-metilen-bis-
akrilamid, kısaca bis) yardımıyla kovalent olarak
bağlanmasından oluşan bir polimerdir.
POLYACRYLAMIDE MATRIX
SDS-PAGE
 Jelin Boyanması
• Elektroforetik ayırım bittikten sonra jel
Coomassie blue ile en az 30 dakika
boyanır.
• Boyama işlemi tamamlandıktan sonra jel,
yıkama tamponu ile yaklaşık 2 saat
boyunca yıkanır ve fazla boya
uzaklaştırılır. Bu işlem protein bantları
belirmeye başlayana kadar yapılır.
 Protein Jelin Analizi
• Polipeptidin molekül ağırlığının 10 tabanına göre
logoritması ile jeldeki göç hızının bir ifadesi olan Rf
değeri arasında doğru orantı vardır.
• Rf değeri, jelin üst kısmından bandın bulunduğu yere
kadar olan mesafenin, jelin üst kısmından işaret
boyasının olduğu yere kadar olan mesafeye
bölünmesi ile elde edilen sabit bir sayıdır.
• Bu değer yardımıyla standart eğri hazırlanır. Standart
eğri, standart polipeptidlerin Rf değerleri ile molekül
ağdıklarının log10 değerlerini gösterir.
• Molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin Rf değeri
standart eğride bulunarak molekül ağırlığının
logoritmik değeri belirlenir. Bu değerin antilogoritması
molekül ağırlığını verir.