Cromatografia

Cromatografia este metoda de separare a doi sau mai mulţi componenţi pe baza
diferenţei de afinitate între o fază staţionară şi una mobilă. Considerând un amestec de doi
componenţi x şi y în soluţie, y având o afinitate mai mare pentru faza staţionară şi o
solubilitate mai mica în solvent, faţă de x, cei doi componenţi se separă.

Metode de separare
- metode de extracţie selectivă – se bazează pe dizolvarea selectivă a componentelor
din amestecul analizat prin alegerea convenabilă a unor solvenţi potriviţi sau a unor condiţii
de pH adecvate
- metode cromatografice – se bazează pe partiţia diferenţiată a componentelor probei
analizate între două medii nemiscibile (faza “staţionară”-FS şi “faza mobilă”-FM), fenomen
care determină mobilităţi diferite ale componentelor în faza staţionară
- metode electrice – se bazează pe mobilitatea diferenţiată a componentelor chimice
posedând sarcină electrică (ioni) în condiţii adecvate de câmp electric, aplicat ca atare sau în
combinaţie cu pH potrivit (sau cu un gradient de pH)

PRINCIPIUL METODEI CROMATOGRAFICE

• Separarea unei probe în doi componenţi decurge datorită faptului că unul din
componenţi rămâne mai multă vreme pe faza staţionară a coloanei.
• Suprafaţa de contact a fazei staţionare are proprietatea de a reţine componenţii probei
pentru scurt timp. Prin adsorbţii şi desorbţii succesive, fiecare component se transferă
din nou în faza mobilă. Acest proces se repetă mereu.
• Timpul de retenţie al unei substanţe depinde de competiţia între afinitatea pentru faza
staţionară şi solubilitatea în solvent (faza mobilă). Timpul necesar pentru ca substanţa
să ajungă la capătul coloanei (din momentul injectării) se numeşte timp de retenţie, tR.

Mobilitatea diferită a componentelor se manifestă prin deplasare cu viteze diferite de-alungul

“suportului cromatografic” (sau de-alungul fazei staţionare).
Suport cromatografic:
- hârtie poroasă (cromatografie pe hârtie)
- strat subţire depus pe un suport plan (TLC/CSS)
- coloană umplută cu faza staţionară
- tub capilar cu suprafaţa internă acoperită cu faza staţionară

Clasificarea metodelor cromatografice

Criterii de clasificare:
1) după starea de agregare a fazei mobile (FM) şi a fazei staţionare (FS)
2) după polaritatea fazelor (FM şi FS)
3) după mecanismul de interacţiune a componentelor probei cu FM şi FS

1) După starea de agregare a fazelor

1.1 Faza mobilă gazoasă (gaz cromatografie, GC)
1.1.1 Faza staţionară solidă (solid - gaz)
1.1.2 Faza staţionară lichidă (lichid - gaz)

1.2 Faza mobilă lichidă

1.2.1 Faza staţionară solidă (solid - lichid)
1.2.2 Faza staţionară lichidă (lichid - lichid)

1
 2) După polaritatea fazelor
2.1 Cromatografie cu faza normală (FS polară, FM nepolară)
2.2 Cromatografie cu faza inversă (FS nepolară, FM polară)

Exemple:
FS polare : silicagel, oxid de aluminiu, celuloză, “Florisil”
FS nepolare : diferite tipuri de silicagel silanizat
FM polare : metanol, acetonitril, etanol, apă, tetrahidrofuran
FM nepolare : diclormetan, cloroform, hexan, benzen, toluen

3) După mecanismul de interacţiune a componentelor cu FM şi FS

3.1 Cromatografie de adsorbţie (adsorbţia componentelor pe FS solidă, polară)
3.2 Cromatografie de partiţie (partiţia componentelor între FS şi FM, ambele lichide
dar nemiscibile)
3.3 Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni (interacţiuni ionice între componente
şi FS – răşină solidă)
3.4 Cromatografie de gel-permeaţie (gel-filtrare) (potrivire sau nepotrivire sterică a
moleculelor componentelor în cavităţile unui gel - FS - inert; separare după criteriul
volumelor moleculare) (cromatografie de gel-permeaţie / de gel-filtrare / cromatografie de
excludere sterică)
3.5 Cromatografie de afinitate (interacţiuni specifice, de natură biochimică, între
componente şi FS: interacţiuni de tipul antigen-anticorp, enzimă-substrat, enzimă-coenzimă,
enzimă-inhibitor)

Caracterizarea mobilităţii cromatografice a componentelor

- prin distanţa parcursă de component într-un interval de timp dat (comun pentru toate
componente) - în special la cromatografia în strat subţire
- prin timpul necesar pentru parcurgerea lungimii L a sistemului cromatografic - în
special la cromatografia în coloană

Legea distribuţiei Nernst

• La extracţia unui component între două faze nemiscibile, specia dizolvată se distribuie
între cele două faze nemiscibile.
• Legea distribuţiei Nernst: raportul concentraţiei speciei în cele două faze este constant,
la temperatură constantă.
• K = C1/C2 T = ct.
K=D coef.de distribuţie lichid-lichid la cromatografia de distribuţie lichid-lichid
• Coeficientul de distribuţie Nernst Kms depinde de :
• - natura componentei repartizate între FS şi FM
• - natura fazelor FM şi FS
• - temperatura de lucru
• - mecanismul de interacţiune cu FS şi cu FM
Cu cât coeficienţii de distribuţie Nernst ai substanţelor sunt mai mari şi mai diferiţi între
ei, cu atât separarea pe coloană mai bună.

2
 • Separarea probei în componenţi individuali decurge la suprafaţa particulelor poroase,
strâns împachetate. Avantajul particulelor poroase este raportul mare între suprafaţa şi
volumul lor.
• 500 m2 (pentru pori de 6 nm) şi
• 10 m2 (pentru pori de 400 nm), per gram de material de umplutură.

Faza mobilă curge printre spaţiile libere dintre particulele umpluturii coloanei.
Componenţii fazei mobile staţionează în porii particulelor şi se separă pe baza diferenţei
dintre timpii lor de retenţie.
Silicagelul reprezintă un important material hidrofil. Caracteristica majoră a silicagelului este
prezenţa grupelor hidroxil polare, legate de atomii de siliciu de la suprafaţă. Grupele hidroxil,
care formează interfaţa fazei staţionare, sunt polare reţinând pentru scurt timp substanţele,
prin adsorbţie pe grupele polare.
Adsorbţia este cu atât mai puternică cu cât este este mai polară molecula. Astfel molecula de
fenol polară este adsorbită mai puternic decât n-octanul nepolar care se eluează mai repede.
Solventul componenţilor este unul slab sau mediu polar.

Silicagel faza normala Separarea pe silicagel faza normala

a doi component cu polaritati diferite

• Silicagelul fază inversă se obţine din silicagel polar prin modificări chimice ale
suprafeţei.
• Grupele polare hidroxil sunt înlocuite cu grupe funcţionale nepolare ca: n-octadecil, n-
octil, metil, fenil. Caracterul hidrofob creşte cu creşterea lungimii lanţului legat.

3
 Silicagel faza inversa
Factorul de retenţie (întârziere)
Gradul de migrare se exprimă prin valoarea Rf (retardation factor) factor de retenţie
sau de întârziere, calculat cu relaţia:
dis tan ta . parcursa .de .component
Rf =
dis tan ta . parcursa .de .solvent
timpul .de .trecere . prin .coloana .a.solventulu i
Rf =
timpul .de .trecere . prin .coloana .a.componentu lui
Distanţa parcursă de component se măsoară de la punctul de start până la mijlocul
zonei solutului, iar distanţa parcursă de solvent de la locul de aplicare al spotului până la
frontul solventului
Factorul de retenţie sau de întârziere este o mărime adimensională şi are valori între 0 şi 1-

• Rezultatul analizei cromatografice este înregistrat ca o cromatogramă. De ex. pentru o

probă conţinând doi componenţi, plasată într-o coloană cromatografică, se obţine o
curbă cu profilul curbei Gauss pentru fiecare component separat. Această curbă este
denumită peak.
• Momentul t = 0 corespunde injectării probei.
• Înălţimea peak-ului H, este o măsură a concentraţiei componentului eluat.

Timpul de retenţie net: tR’ = tR - tm

tm intervalul de timp de la injectarea probei pâna la eluarea componentului nereţinut

Metoda tangentelor
• WB = lăţimea la bază a peak-ului
• WH = lăţimea la jumătate din inălţimea peak-ului

Lăţimea la bază se determină grafic trasând tangentele şi măsurând distanţa dintre punctele de
intersecţie cu linia de bază.

4
 • A= aria peak-ului este proporţională cu concentraţia substanţei şi se foloseşte în
analiza cantitativă A = H x WH

Izoterma de distribuţie
• 1.Curba de eluare este simetrică şi gaussiană când distribuţia componentului între cele
două faze se face corespunzător constantei de echilibru:
• Coeficientul de distribuţie Nernst: Km/s=Cm/Cs
• Izoterma de distribuţie liniară
• Cm=Km/s*Cs
• Izoterme de distribuţie neliniară
• Cs=K*Cαm
• 2. α<1
• 3. α>1

Conceptul talerelor teoretice

• Numărul de talere teoretice este o măsură a capacităţii de separare a coloanei: cu cât
este mai mare numărul de talere teoretice, cu atât este mai mare capacitatea de
separare a coloanei şi mai mică lăţimea la bază a peak-ului.
• H=(2...5)xdiam.particulelor
• H=2x5μm=10μm
• H= 5x5μm=25μm
L 100 mm
N= = = 10 .000
H 10 x10 −3 mm

L 100 mm
N= = = 4.000
H 25 x10 −3 mm

• Măsura cantitativă a eficienţei coloanei de separare este numărul de talere teoretice N.

• Când o coloană de separare eficientă dă peak-uri înguste la bază sau la jumătate din
înălţime, rezultă o valoare relativ mare a N, la timpi de retenţie egali, prin comparaţie
cu o coloană neeficientă.

Rezoluţia cromatografică este o măsură a gradului de separare a două peak-uri vecine.

5
 t R 2 − t R1 2∆t
R= =
WB1 +WB 2 WB1 +WB 2
2
FRXpag .1.049
t −t
R = 1,18 x R 2 R1
b0,5 a + b0, 5b

Rezoluţia cromatografică
t R 2 − t R1 2∆t
R= =
WB1 + WB 2 WB1 + WB 2
2

Coeficientul de selectivitate
• Coeficientul de selectivitate α sau selectivitatea exprimă capacitatea coloanei de a
separa două substanţe.
• Selectivitatea coloanei de separare este raportul timpilor relativi de retenţie
• Sau raportul factorilor de capacitate
• Sau raportul coeficienţilor de distribuţie Nernst-datorită relaţiei de proporţionalitate
dintre factorul de capacitate k’ şi coeficientul de distribuţie Nernst K
t R 2 − t m t ' R 2 k '2 K 2 t 'R t R − tm
α= = = = k'= =
t R1 − t m t ' R1 k '1 K1 tm tm

Cromatografie cu faza mobilă lichidă

FS - solidă (mai rar) sau lichidă (mai frecvent)

FM - lichidă (solvent unic sau amestec de solvenţi)
În cromatografia lichidă se realizează:
- separarea (analitică sau preparativă) a componentelor unei probe
- identificarea calitativă a componentelor pe baza mobilităţii cromatografice (timp de
retenţie)
- analiza cantitativă a componentelor din probă
Variante :
- FS în forma de strat subţire, întins pe un support plan (TLC)
- coloană cu umplutură (scop analitic sau preparativ)
Regim de lucru :
- cu compoziţie constantă în timp a FM ( regim "izocratic" )
- cu compoziţia variabilă în timp a FM ( regim cu "gradient" )

Cromatografie în strat subţire-CSS

6
 este tehnica citată frecvent în Farmacopeea Română şi în cele ale altor ţări (inclusiv
Farmacopeea Europeană).
Avantaje :
- rezoluţie bună (mai ales cu variantele actuale, performante)
- posibilitatea analizării mai multor probe în condiţii strict identice
- posibilitatea separării "bidimensionale" a componentelor din probă
- se realizează prin operaţii simple (nu necesită specializare deosebită)
- literatura de specialitate conţine multe informaţii privind condiţiile de lucru
- dotarea cu tehnica TLC nu presupune efort financiar deosebit
Stratul subţire (FS):
- silicagel
- oxid de aluminiu (Al2O3) cu umiditate controlată
- celuloză
- acetat de celuloză

Identificarea / vizualizarea componentelor pe placa cromatografică :

- prin mărimile RF şi RM
- prin răzuirea spotului, urmată de extracţia componentei şi identificarea prin metode
fizico-chimice (ex. IR)
- prin pulverizarea plăcii cu reactivi de culoare specifici componentelor
- prin modificarea fluorescenţei stratului subţire

Analiza aminoacizilor prin derivatizare cu ninhidrină

FS-strat subţire silicagel
• FM-soluţie de fenol
• Revelator-soluţie ninhidrină 0,1% în etanol
• Aminoacizii ciclici (ca alfa-prolina) nu pot fi identificaţi cu ninhidrină
• Aminoacizii reacţionează cu ninhidrina, conform reacţiilor:
• Produsul de condensare dintre un mol de ninhidrină redusă şi un mol de ninhidrină, în
mediu amoniacal, este colorat şi indică prezenţa aminoacizilor în probă.

Analiza aminoacizilor prin derivatizare cu 9-fluorenilmetil cloroformiat (FMOC-

Cl)
• Derivatizarea cu FMOC-Cl se poate aplica aminoacizilor primari şi secundari.

7
• Nu este susceptibilă interferenţelor majore cu alte substraturi.
• Derivaţii rezultaţi sunt foarte stabili şi puternic fluorescenţi, coborând limita de
detecţie la nivelul fmol (femtomolar).
• λ ex = 270 nm
• λ em = 316 nm
• 1.Elimină necesitatea extracţiei simplificând procedura şi dovedind acurateţea analizei
cantitative a aminoacizilor hidrofobi.
• 2.Se formează un singur produs, stabil, ceea ce permite analiza cantitativă a tuturor
aminoacizilor, inclusiv histidina şi tirosina.
• 3.Se elimină interferenţa cu alţi reactivi sau alţi solvenţi.
• 4.Detecţia în UV la 270nm
sau emisie fluorescentă la 316nm.

Determinarea aminelor prin derivatizare cu fluorescamină

• Un alt agent de derivatizare care prin condensare cu gruparea amino exaltă
fluorescenţa produsului este fluorescamina
• Detecţia:
• λ ex = 360nm
• λ em = 440nm

O O

Determinarea HPLC a aflatoxinelor

Micotoxine-derivaţi cumarinici aflatoxine
Detector de fluorescenţă
λ ex = 360nm
λ em = 420nm

8
• Produsele vegetale cu poliholozide mixte la umiditate crescută devin medii de cultură
pentru microorganisme (bacterii, mucegaiuri, ciuperci)
• degradarea principiilor active şi biosinteza diferitelor substanţe toxice numite
micotoxine.

Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Răşinile schimbătoare de ioni se clasifică :

- după natura speciilor ionice schimbate
- cationiţi (schimbă cationi; grupele ionizabile, legate chimic de
răşină, au sarcina electrică negativă)
- anioniţi (schimbă anioni; grupele ionizabile, legate chimic de
răşină, au sarcina electrică pozitivă)
- după tăria acidă (bazică) a grupărilor ionice legate de răşină
- cationit / anionit tare
- cationit / anionit slab
• Un cationit este în " forma H " dacă ionul reţinut pe suprafaţa lui (prin inter-acţiuni
electrostatice cu grupările legate chimic de răşină) este protonul, H+. Dacă acest ion
este dislocat din vecinătatea grupelor legate de răşină cu alţi ioni, de exemplu cu Na+,
atunci cationitul este în " forma Na ".
• Un anionit este în " forma OH " dacă ionul reţinut pe suprafaţa lui (prin in-teracţiuni
electrostatice cu grupările legate chimic de răşină) este ionul OH-. Dacă acest ion este
dislocat din vecinătatea grupelor legate de răşină cu alţi ioni, de exemplu cu Cl-, atunci
anionitul este în " forma Cl ".
• Ionii Na+, prezenţi în soluţie, dislocă protonul din gruparea sulfonică a răşinii şi sunt
fixaţi, prin forţe electrostatice, în sfera de solvatare a anionului sulfo-nat. Protonul
trece în soluţie în forma disociată (electrolit tare).
• Procesul este reversibil.
• Echilibrul nu este deplasat pre-dominant într-un anume sens.
• Dacă în urma dislocării proto-nului, acesta trece în soluţie în forma de electrolit slab
(con-centraţia de H+ mică), atunci echilibrul este deplasat spre " forma Na " a răşinii.
Răşină insolubilă SO3 H + ( Na +Cl )
+ -

" forma H " electrolit tare

-
Răşină insolubilă SO3 Na+ + ( H++Cl- )

" forma Na " electrolit tare

Răşină insolubilă SO3 H

-
+ ( Na++OH )
" forma H " electrolit tare

9
-
Răşină insolubilă SO3 Na+ + H2O

" forma Na " electrolit slab

 Un anionit este capabil să schimbe anionul reţinut în sfera de solva-tare a grupei active
(un cation cu sarcina electrică pozitivă) cu un alt anion, aflat la concentraţie suficient
de mare în mediul cu care răşina este în contact.
Anioniţii au gruparea ac-tivă cu caracter bazic (în funcţie de tăria bazică a grupei
active, anionitul poate fi tare sau slab).
Răşinile schimbătoare de ioni reţin ionii

Răşină insolubilă
+
NR3 Cl
- + ( Na++OH- )

" forma Cl " electrolit tare

Răşină insolubilă
+
NR3OH
- + ( Na++Cl- )

" forma OH " electrolit tare

Valorile optime ale parametrilor cromatografici

Nr.crt. Parametrul Relaţia de calcul Valorile optime
1 Legea Lambert-Beer
Exprimă proprietatea A = axbxC 0,1-0,8 AU
speciei de a absorbi
radiaţia
2 Legea distribuţiei Nernst
Arată de câte ori este mai K = C1 /C2 K>>1
solubil componentul, în T = ct.
solventul 1 decât în
solventul2
3 Timpul de retenţie net tR’ = tR - tm 1-15 min.
4 Aria peak-ului A = H x WH -
Proporţională cu
concentraţia
5 Factorul de asimetrie B10% H Valori cât mai apropiate de 1
Reflectă simetria peak- AS =
ului A10% H
6 Factorul de coadă W0 , 05 Valori cât mai apropiate de 1
Reflectă simetria peak- T =
2f
ului
A5% H + B5% H
T=
2 A5% H
7 Numărul de talere 2 N=4.000-10.000
 t 
teoretice N = 5,54  R  pentru o coloană cu lungimea
Eficienţa de separare a  WH  de 100 mm şi dim. particulelor
coloanei 2 5 μm
t 
N = 16  R  N=6.000-15.000
 WB  pentru o coloană cu lungimea
2
 t  de 150 mm şi dim. particulelor
N = 25  R 
 5 μm
 W4 , 4 
8 Numărul de talere/metru n=N/L n=40.000-100.000
9 Înălţimea talerului H=L/N H=10-25 μm
teoretic pentru particule de 5 μm

10
 Cu cât este mai mică H, 2
L  WH 
cu atât este mai îngust H= *  H=(2…5)xdiam.particulelor
peak-ul 5,54  t R 
10 Factorul de capacitate t 'R t R − tm
Abilitatea coloanei de a k’ = = 1-15
reţine componentul tm tm
11 Selectivitatea t R 2 − t m t ' R 2 k '2 K 2
Reflectă capacitatea α= = = = α.> 1
coloanei de a separa doi t R1 − t m t ' R1 k '1 K1
componenţi
12 Rezoluţia cromatografică t R 2 − t R1 2∆t R>1
Arată cât de bine sunt R= =
separate peak-urile WB1 + WB 2 WB1 + WB 2 Pt. R = 1,5
2 Separare netă
α −1 k' N
R= * *
α k '+1 4
13 Ecuaţia Van-Deemter H(u) = A + B / u + C u H(u) are valoare minimă
Înălţimea talerului pentru:
teoretic în funcţie de Difuzia Eddy...............................A u= 2-3 mm/s
viteza liniară a fazei Difuzia longitudinală...................B / u pentru particule de 5 μm
mobile Factorul de transfer de masă….C u

Factorul de asimetrie
B B10% H
AS =
=
A A10% H
A = distanţa de la axa verticală a peak-ului pentru maximul de concentraţie, până la frontul
peak-ului, măsurată la 10% din înălţimea peak-ului;
B = distanţa de la capătul peak-ului până la axa verticală a peak-ului pentru maximul
concentraţiei, măsurată la 10% din înălţimea peak-ului.

Factorul de coadă
W0 , 05 A5% H + B5% H
T = ;T=
2f 2 A5% H
f = distanţa dintre axa corespunzătoare maximului peak-ului şi frontul peak-ului;
W0,05 = distanţa dintre axa corespunzătoare maximului peak-ului şi capătul cozii, măsurată la
5% din înălţimea peak-ului (faţă de linia de bază).

11
 Peak
2
Peak
1

H
Peak
nere
ţi-
nut

W0,05
0,05
H

A B f

Reprezentarea grafică a două peak-uri şi a parametrilor care intră în calculul asimetriei peak-
ului şi a factorului de coadă

12