A Simplified Method for the Analysis of Hydroxyproline in Biological Tissues.

Um estudo crítico dos diferentes passos envolvidos no procedimento anterior para a dosagem
de hidroxiprolina permite a medição direta da quantidade de colágeno em homogeneizados de
tecido sem perder as vantagens do método. O procedimento é baseado na hidrólise alcalina do
homogeneizado de tecido e posterior determinação da hidroxiprolina livre em hidrolisados.
Cloramina-T foi utilizado para oxidar a hidroxiprolina livre para a produção de pirrol. A adição
de reagente de Ehrlich, resultou na formação de um chromotore o pode ser medida em
550nm. condições ótimas de ensaio foram determinadas usando homogeneizado de tecido
colágeno e ácido solúvel purificado, juntamente com hidroxiprolina padrão. Os parâmetros
críticos, tais como a quantidade de cloramina-T, hidróxido de sódio, dimetilaminobenzaldeído-
p, pH do tampão de reação e comprimento de tempo foi oxidação examinados para a
obtenção de resultados satisfatórios. O método foi aplicado à amostras de homogeneizado de
tecido colágeno e ácido purificado solúvel, com recuperação de hidroxiprolina acrescentado de
101 6.5 e 104 6.0 (SD) por cento, respectivamente. O método é altamente sensível e
reprodutível quando utilizada para medir o ácido imino em homogeneizados de tecido. O
ensaio modificado de hidroxiprolina apresentado na presente comunicação serão aseful para a
medição de rotina do conteúdo de colágeno em extratos de amostras de tecidos diferentes.
Em adição, o método modificado pode ser usado para processamento em lote de frações da
coluna para monitorar a concentração de colágeno, durante a purificação.

DISCURSÃO DE RESULTADOS

O colágeno é a proteína mais abundante do tecido conjuntivo dos vertebrados, o que

representa aproximadamente um terço da proteína corporal. O metabolismo do colagénio e
do seu regulamento são de interesse vital em uma série de doenças clinicamente importantes,
que se caracteriza por um acúmulo ou perda de colágeno. A produção excessiva de colágeno
tem sido documentada em proliferar doenças como cirrose hepática, fibrose pulmonar,
sceleroderma e crescimento do tumor. Perda de tecido colágeno tem sido observada em
certas doenças do tecido conjuntivo incluindo artrite reumatóide uma ferida / úlcera tecidos
danificados. Em outras situações clínicas, tais como a reparação dos tecidos e a cicatrização de
feridas, a superprodução e deposição de colágeno são necessários para curar os tecidos
danificados. Para entender o papel fundamental do colágeno em várias condições
fisiopatológicas, diversas metodologias foram desenvolvidas para a determinação da Hyp em
vários tecidos e fluidos fisiológicos, como plasma e urina. Todos os casos, estes métodos têm
duas etapas como: (a) hidrólise da amostra com um ácido forte ou alcalinos para libertar Hyp e
(b) a detecção de ácido imino gratuitamente por qualquer colorimetria, fluorimetria, ou de alta
performance líquido métodos cromatográficos. O método descrito aqui é essencialmente
baseado na hidrólise alcalina do homogeneizado de tecido e posterior quantificação da Hyp
livre na hidrolisados. Theentire procedimento compreende três etapas: (a) de hidrólise,
oxidação (b) e (c) desenvolvimento de cromóforo. O método é preciso, o anúncio simples,
específica para Hyp. Neste método, nós não apenas condições otimizadas para a curva padrão,
mas também para os homogeneizados de tecidos, bem como colágeno purificado. Os
resultados demonstram claramente que o desenvolvimento de cromóforos com Hyp em
homogeneizado de tecido colágeno e purificada foi semelhante ao da Hyp padrão, sugerindo
que outras proteínas que não interferem no processo de reação. A interferência da prolina
durante a reação pode ser excluído com base em relatórios anteriores (6) que o choromogen
podem ser formadas com o reagente de Ehrlich se prolineis oxidado com periodato de sódio
(6).

Although the procedure presented here is somewhat similar to that of the earlier method (11),
several modifications were incorporated after optimizing the conditions for the measurement
of tissue Hyp. Such modifications include the omission of drying the sample before hydrolysis
and treatment of the sample with citric acid for neutralization after hydrolysis. Examination of
the effect of various citric acid concentrations on the absorbance values revealed that the
deletion of citric acid from the reaction medium did not affect the accuracy or sensitivity of the
assay ( results not shown). Moreover, the concentrations of reagents used in the current
protocol differ sligthly from the earlier method (11). THE TOTAL VOLUME OF THE SAMPLE,
INCLUDING all reagents necessary for the reaction medium, was condensed to 1ml with no loss
of sensitivity and simplicity. With the retention for all advantages of the earlier procedure (11),
the modified method described in this communication is highly applicable from the point of
the view of analysis of collagen content in various tissues during pathophysiological conditions.
Also, the procedure described here for the Hyp assay can be extend for the detection of
collangen fragments in column fractions from various chromatographic techniques employed
for the purification collagen.

In conclusion, a convenient and reliable method for the determination of Hyp in biological
tissue samples has been established, which may provide a useful tool in clinical and biomedical
research areas.