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QBQ 0214
Departamento de Bioquímica
Instituto de Química
2009
Docentes:
Prof Dr. Alexander Henning Ulrich (Coordenador) Bloco 8 Sup.
Sala 854
Profa Dra. Deborah Schechtman Bloco 10 Inf. Sala
1013/1018
Monitores:
Cecília Midori Ikegami (cikegami@usp.br)
Mariana Lemos Duarte (mlduarte@gmail.com)
Programa
Bibliografia
- Bioquímica Básica: A. Marzzoco & B.B. Torres – Ed. Guanabara Koogan - 2a ed.; 1999.
- Princípios de Bioquímica: A.L. Lehninger, D.L. Nelson & M.M. Cox – 3a ed. Sarvier; 2002.
- Bioquímica: L. Stryer – Ed. Guanabara Koogan – 4a ed.; 1996.
- Fundamentos de Bioquímica – D. Voet, J. G. Voet & C. W. Pratt – Artmed Editora; 2000.
- Biochemistry: D. Voet & J.G. Voet – John Wiley & Sons – 3ttded; 2004.
- Biochemistry: J. M. Berg, J.L. Tymoczko & L. Stryer -.Freeman and Company – 5thed.; 2002.
- Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations: T.M. Devlin – John Wiley & Sons, Inc.,
5th ed New York; 2001.
- Biochemistry: C. K. Mathews & K.E. van Holde – The Benjamin/Cummings Publishing
Company; 1996.
- Principles of Biochemistry: H.R. Horton, L.A. Moran, R.S. Ochs, J.D. Rawn & K.G.
Scrimgeour Prentice Hall; 1993.
- Principles of Biochemistry: G.L. Zubay, W.W. Parson & D.E. Vance – WCB Publishers; 1995.
- Nutritional Biochemistry: T. Brody – Academic Press; 1994.
- Biochemistry – A Foundation: P. Ritter – Brooks/Cole Publishing Company; 1996.
Critério de Avaliação
O aluno será avaliado por três avaliações, testes e ainda um seminário que serão realizados ao
longo do semestre. A nota das avaliações será obtida pela média aritmética das notas da
Avaliação 1 (peso 1), Avaliação 2 (peso 2) e Avaliação 3 (peso 4). A média dos testes somará
1,5, os relatórios de aulas práticas valerão 1,0 e os seminários valerão 0,5. O cálculo da nota final
deverá ser feito através da seguinte equação:
2
Cronograma de Aulas
3
AULA 1: ENZIMAS
4. Definir constante de Michaelis-Menten (Km) e mostrar a relação entre seu valor e a afinidade
da enzima pelo seu substrato
6. Mantendo o sabor doce do milho. O sabor doce de um milho recém-colhido é devido ao alto
nível de açúcar nas sementes. Milho armazenado (vários dias depois da coleta) não é tão doce
porque cerca de 50% do açúcar livre é convertido em amido dentro de um dia após a coleta. Para
preservar a doçura do milho fresco, as espigas podem ser imersas em água fervendo por alguns
minutos (“escaldada”), depois esfriadas em água fria. O milho processado dessa maneira e
armazenado em congelador mantém sua doçura. Qual é a base bioquímica para esse
procedimento.
7. Para produzir um medicamento que atuasse sobre uma enzima bacteriana, qual seria o tipo de
inibidor escolhido, competitivo ou não competitivo?
4
Aula 2: Introdução ao Catabolismo e Anabolismo
MAPA I
Esquemageral dadegradaçãodenutrientes
ALIMENTOS
CO 2
NAD + NADH
FAD FADH 2
ADP+P i
O2
H2O
ATP
CASO 2
R.T.P., 27 anos, masculino, analisador de sistemas, fumante. O paciente chegou no dia anterior a
La Paz, vindo de Salvador. Relata que logo ao sair do aeroporto, precisou subir um lance de
escada e sentiu-se muito cansado. Embora tenha feito refeições corretas, o cansado persistiu e
agravava-se com atividades físicas que até a véspera fazia sem problemas. No final do terceiro
dia, tendo tido necessidade de um esforço intenso, desmaiou, sendo conduzido ao Pronto
Atendimento. Depois dos exames preliminares, foi posto sob respiração em balão de oxigênio e
rapidamente sentiu-se melhor. Foi dispensado do hospital, com a recomendação de que ingerisse
chá ou outra bebida estimulante.
CASO 3
5
J.P.F., 42 anos, masculino, executivo, fumante. O paciente iniciou há seis meses um quadro de
dor no peito, em aperto, com duração de cinco a dez minutos, no máximo, sempre que fazia
algum esforço físico, como subir uma ladeira caminhando, ou ao sentir emoções. A dor
melhorava com o repouso. Fazendo exames de avaliação cardíaca, foi constatada obstrução
parcial de uma das artérias coronárias. Desde então vinha fazendo uso de remédios que
promovem dilatação das coronárias.
Logo ao sair para o trabalho, relata o filho que o estava acompanhando, o paciente sentiu forte
dor no peito, de inicio abrupto. Conta que o seu pai ficou pálido, começou a suar frio e dentro de
poucos minutos perdeu a consciência e caiu. Com esse quadro foi trazido ao pronto socorro e
embora fossem tentadas todas as manobras e medicações para a reanimação cardíaca, o paciente
foi a óbito.
6
3. Animais de laboratório foram submetidos a dietas compostas exclusivamente de carboidratos,
ou lipídios ou proteínas. Estes três tipos de compostos são essenciais para a sobrevivência. Não
havendo outras restrições na dieta, prever que grupo de animais sobreviveria, verificando se é
possível sintetizar:
4. Alguns tecidos (nervoso) e células (hemácias) obtêm ATP exclusivamente a partir de glicose.
Como é possível garantir sua sobrevivência quando as reservas de glicogênio tornam-se
insuficientes para manter a glicemia?
MAPAII
POLISSACARÍDIOS PROTEÍNAS LIPÍDIOS
CO 2
Acetil-CoA(2)
CO 2
CO 2
CO 2
Fumarato (4) α Cetoglutarato (5)
CO 2
Succinato (4)
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AULA 3: GLICÓLISE
HOCH 2
O
HO
OH
OH
GLICÓLISE Glicose
OH
ATP ATP
ADP ADP
P -OCH 2
O
OH Glicose 6-fosfato
HO OH
OH
P -O-CH 2 O CH 2OH
HO Frutose 6-fosfato
OH
HO
ATP
ATP
ADP
ADP
P -O-CH 2 O CH 2O- P
HO OH
Frutose 1,6 bisfosfato
HO
H2C-O- P HC=O
ADP ADP
ATP ATP
O=C-O -
HC-OH 3-Fosfoglicerato
H2C-O- P
COO -
HC-O- P
2-Fosfoglicerato
H2C-OH
H2O
COO -
C-O- P
Fosfoenolpiruvato
CH 2
ADP
ADP
ATP
ATP
COO - COO -
HC-OH C=O
Lactato Piruvato
CH 3 NAD + NADH CH 3
NAD + NADH
8
170 B (tiro de 30s)
B A (caminhada)
160
Freqüência Cardíaca (bat/min)
150
140
Figura 1: freqüência cardíaca durante caminhada
130
de 15 min (A) e tiro de 30 s (B)
120
110 A
100
90
80
00 2 4 30s 6 8 10 14 15 min
16
tempo
8
B
7
B (tiro de 30s)
Lactatemia (mmol/L)
6 A (caminhada)
5
2
A
1
0
00 2 4 30s 6 8 10 14 15min
16
tempo
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12. Os Casos clínicos 2 e 3 (p. 10) indicavam que o oxigênio é necessário para a
produção de energia pelo organismo. No entanto, a glicólise é anaeróbia e
produz ATP. Explicar este aparente paradoxo, consultando o Mapa I.
13. Verificar quais são os efetuadores alostéricos da fosfofrutoquinase.
AULA 4: GLICONEOGÊNESE
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11
AULA 5: OXIDAÇÃO DE TRIACILGLICERÓIS
Caso clínico
Identificação: A. C., 35 anos, casada.
Queixa e Duração: Aumento de peso após as gestações
História Pregressa da Moléstia Atual: A paciente relata, na admissão a um centro de
emagrecimento, que casou há cinco anos pesando 60 kg. Após dois anos de casamento,
nasceu o primeiro filho. Nessa gestação a paciente engordou cerca de 20 kg e perdeu muito
pouco após o parto. Quando o primeiro filho completava um ano e meio ano, a paciente
engravidou novamente, e após esse segundo parto, seu peso chegou a 105 kg. Por esse motivo
deu entrada em um spa. Não apresenta problemas de saúde e não se queixa de nenhum mal
estar.
Exame Físico: Peso na admissão 105,4 kg. Altura de 1,67 m. Apresenta boa função cardíaca e
pulmonar. Encontra-se com leve edema dos membros inferiores.
Exames Laboratoriais:
Glicemia = 95mg% (Valor de Referência = 70 – 105 mg%)
Colesterol = 357 mg/dL (Valor de Referência = 120-220 mg/dL)
Soro lipêmico
Triacilgliceróis = 680mg/dL (Valor de Referência = 40 – 150 mg/dL)
Evolução: A partir da admissão a paciente foi submetida a uma dieta de 600 kcalorias,
distribuída em cinco refeições. Após passar por avaliação médica e de capacidade física,
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iniciou um treinamento adequado à sua capacidade e com cerca de quatro horas diárias de
exercícios, feitos de maneira fracionada e diversificada, dando ênfase às caminhadas. Por
volta do 4o dia de estadia, a paciente sentiu-se com sonolência, sensação de enjôo e gosto
amargo na boca, tendo sido orientada quanto ao caráter reversível desses sintomas. No 10o
dia da estadia a paciente pesava 94,8 kg, portanto com perda de cerca de 10% do peso inicial.
Foi aconselhada a aumentar o ritmo dos exercícios físicos para 6 horas/dia, dispensando mais
tempo para as caminhadas (duas vezes ao dia, com cerca de uma hora de cada vez), dança
(cerca de uma hora por dia) e atividades na piscina, como jogos, hidroginástica e natação (no
mínimo uma hora por dia). Após completar 30 dias de estadia a paciente retornou para casa
pesando 85,7 kg, totalizando uma perda total de 19,7 kg (18,7%).
Manutenção: Regime alimentar, com uma dieta de aproximadamente 900 kcalorias, e
manutenção de prática de exercícios físicos, com caminhadas de uma hora por dia e natação
com aulas de 50 minutos, três vezes na semana. Após oito meses de tratamento, encontra-se
com 71,1 kg e prepara-se para submeter-se a uma cirurgia plástica.
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Para responder às questões de 1 a 4 usar apenas os Mapas I (p. 5 ) e II (p. 7).
7. Explicar por que dietas ricas em carboidratos e/ou proteínas levam a um acúmulo de
citrato.
1. Quais são os grupos responsáveis pelo transporte de elétrons em cada um dos compostos
que fazem parte da cadeia de transporte de elétrons?
2. A quantidade de oxigênio consumido pela cadeia de transporte de elétrons tem relação
estequiométrica com a quantidade de NADH oxidado?
3. Uma suspensão de mitocôndrias incubada com malato e rotenona não apresentou consumo
de oxigênio. Quando incubação semelhante foi feita substituindo o malato por succinato,
ocorreu consumo de oxigênio. Explicar este resultado. Que resultado haveria, nos dois casos,
se a rotenona fosse substituída por cianeto ou por antimicina A?
-Protocolo Experimental
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a) Fracionamento celular
b) Verificação da atividade de succinato desidrogenase
NADH/NAD+ -0.32
15
Succinato/Fumarato -0.3
FADH2/FAD 0.00
H2O / ½ O2 0.82
16
p-fenilendiamino (p-FDA) Incolor Violeta 0.5
- Seguir o protocolo 3.
PROTOCOLO 1
TUBO 1 2 3 4 5
Fração Celular 0.1 (I) 0.1 (II) 0.1 (I) 0.1 (II) -
PROTOCOLO 2
TUBO 1 2 3 4 5 6 7
PROTOCOLO 3
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TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Volume (ml)
Tampão A 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
Sacarose 0,7M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Água Destilada 1.3 1.2 1.0 1.0 0.9 0.9 0.9 0.8 0.8
Nujol (cm) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
2. Por que o número de moléculas de ATP sintetizadas para cada succinato oxidado a
fumarato é diferente da quantidade de moléculas sintetizadas para cada malato oxidado a
oxaloacetato?
3. É possível a oxidação contínua de NADH na ausência de ADP? Qual é o mecanismo de
controle fisiológico da velocidade da cadeia de transporte de elétrons?
4. Na presença de dinitrofenol a oxidação de NADH é mais lenta do que na ausência daquele
composto. Correto?
5. Hemácia e tecido nervoso fazem fosforilação oxidativa?
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6. Qual seria o estado de oxidação (oxidado/reduzido) dos componentes da cadeia de
transporte de elétrons em presença de malato e de antimicina A?
7. A intensidade da fosforilação oxidativa tem relação direta com a quantidade de NADH
oxidado?
8. Por que o número de moléculas de ATP sintetizadas para cada succinato oxidado a
fumarato é diferente da quantidade de moléculas sintetizadas para cada malato oxidado a
oxaloacetato?
9. É possível promover a síntese de ATP por uma suspensão de mitocôndrias sem
fornecimento de substrato oxidável?
10. O tratamento de uma suspensão de mitocôndrias com cianeto ou com oligomicina
inibe tanto o consumo de oxigênio quanto a síntese de ATP. A adição de dinitrofenol
restaura o consumo de oxigênio apenas em um dos casos mas não tem efeito sobre a
inibição da síntese de ATP. Explicar estes resultados.
11. É possível a oxidação contínua de NADH na ausência de ADP? Como é possível a
grande utilização no citossol do ATP produzido na mitocôndria?
12. Hemácia e tecido nervoso fazem fosforilação oxidativa?
13. Como o NADH produzido na via glicolítica pode ser oxidado na cadeia respiratória
(lançadeiras do malato e do glicerol-fosfato)?
3. Ordenar a atuação das enzimas listadas abaixo para que seja obtida a degradação do
glicogênio. Apontar as que utilizam ATP e as que utilizam HPO42--.
a) glicogênio fosforilase
b) proteína quinase
c) glicogênio fosforilase quinase
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8. Descrever a ação da insulina sobre o metabolismo de carboidratos quanto à:
a) permeabilidade da célula à glicose
b) síntese de glicogênio
c) síntese de glicoquinase (fígado)
1. Citar as enzimas da glicólise e gliconeogênese que têm sua concentração alterada por
ação hormonal, indicando o hormônio que atua em cada caso.
2. Citar os hormônios que estimulam a degradação do glicogênio no fígado e no músculo e
mostrar seu modo de ação.
3. Mostrar a relação entre AMP cíclico e a síntese de glicogênio.
4. Descrever a ação da insulina sobre o metabolismo de carboidratos quanto à:
a. permeabilidade da célula à glicose;
b. síntese de glicogênio;
c. síntese de glicoquinase (fígado).
5. Descrever as ações de glucagon, adrenalina e insulina no metabolismo de triacilgliceróis.
6. Descrever o efeito do glucagon sobre a atividade da fosfofrutoquinase 2 e mostrar a
conseqüência deste efeito sobre a atividade da via glicolítica.
7. Que transformações permitem a utilização de glicose 1-fosfato pela via glicolítica e para
a exportação do hepatócito?
8. O glucagon estimula a gliconeogênese? Como?
9. Como são desfosforiladas as enzimas, quando cessa o efeito do glucagon? Se a célula
contém proteína fosfatase, como é possível manter proteínas fosforiladas?
10. Há gasto de ATP para a síntese de glicogênio a partir de glicose?
11. Como a insulina leva a ativação da proteína quinase B?
12. Descrever a ação da insulina sobre o metabolismo de carboidratos quanto à:
a. permeabilidade da célula à glicose
b. síntese de glicogênio
c. síntese de glicoquinase (fígado)
Baixo KM
GLUT4 Adipócito,coração,músculo esquelético,
Dependente de insulina
Transporte ativo
GLUT5 Intestino, rim
Co-transporte com Na+
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1. Um adulto normal, com uma dieta desprovida de proteínas, elimina uréia. Por que?
2. Um adulto normal, com uma dieta rica em carboidratos e lipídios, tem necessidade de
ingestão proteica. Por que?
3. Esquematizar as reações catalisadas pelas seguintes enzimas: aspartato aminotransferase
(glutâmico-oxaloacético transaminase - GOT) e alanina aminotransferase (glutâmico-
pirúvico transaminase - GTP). Citar a coenzima que participa das reações e a vitamina
presente na sua estrutura.
4. Esquematizar a reação catalisada pela glutamato desidrogenase.
5. Verificar o destino dos esqueletos de carbono dos aminoácidos em seu catabolismo e
indicar aqueles que podem originar glicose.
6. O nitrogênio presente em todos os compostos biológicos provém de aminoácidos.
Exemplos destes compostos e seus precursores:
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4. A insulina aumenta a permeabilidade celular a aminoácidos e estimula a síntese de
proteínas.
5. Alistar os fatores que tornam obrigatória a ingestão de aminoácidos (proteínas).
6. Comparar a qualidade nutricional de proteínas de origem animal com a qualidade de
proteínas de origem vegetal.
7. Indicar o valor recomendado de ingestão proteica para indivíduos adultos de países em
desenvolvimento.
8. Justificar a necessidade de ingerir uma quantidade mínima de carboidratos.
9. Caracterizar as síndromes de desnutrição mais comuns.
A B C
II
III
0 5 10 15 20 25
Horas
12. Um indivíduo adulto recebeu, durante várias semanas, uma dieta com quantidades de
carboidratos, lipídios e proteínas adequadas para seu peso, sexo, faixa etária e atividade
física. Apesar da dieta conter também o suprimento correto de vitaminas e sais minerais, o
indivíduo apresentou perda lenta e contínua de peso.
AULAS 18 : DIABETES
DIABETES MELITTUS
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Diabetes melittus é uma doença que ocorre devido a anomalias no metabolismo e
pode comprometer o funcionamento de rins, olhos, nervos e vasos sanguíneos. É uma doença
que pode ser definida como um estado de tolerância diminuída à glicose, usualmente devido à
deficiência ou resistência à insulina. Há dois tipos mais comuns de diabetes melittus (DM):
1) A tipo I, também chamada de DM insulina dependente (DMID), 2) A tipo II, ou DM não
dependente de insulina (DMNDI). Antes de verificar as diferenças e semelhanças nas
manifestações dessas duas diabetes, vamos lembrar os efeitos da insulina:
- Esse hormônio, por ação direta:
25
Presente em 80 a 90 % dos diabéticos, com alto fator genético (100% dos irmãos
gêmeos idênticos de um diabético tipo II desenvolverão a doença). Os pacientes apresentam
normalmente níveis normais ou elevados de insulina, sugerindo que não há a utilização
correta do hormônio pelo organismo, provavelmente por defeito nos receptores de insulina
nas células. DMNDI geralmente é diagnosticada após os 40 anos de idade em pessoas com
obesidade e que tenham parentes diabéticos. Não há relação necessária entre diabetes tipo I e
obesidade. O que há no diabetes tipo II é uma relativa resistência ao desenvolvimento de
cetose, baseado numa relativa mas não absoluta deficiência de glicose. Assim, pacientes com
DMNDI podem manifestar hiperglicemia não acompanhada de um correspondente grau de
cetose. Nos diabéticos tipo II, a cetose pode aparecer em certas condições de estresse
metabólico, como sepsis. Atualmente, considera-se que não existem apenas duas situações
extremas: cetoacidose diabética ou hiperglicemia não cetônica, ocorrendo, na verdade, toda
uma gama de variação das intensidades dos dois sintomas.
Diagnóstico
Para diagnosticar diabetes tipo I em estado agudo basta demonstrar que as
observações clínicas como perda de peso, poliúria (aumento na quantidade de urina) e
polipsia (sede) são acompanhadas por testes laboratoriais positivos para hiperglicemia,
cetoacidose e glicosúria. Diabetes tipo II é mais certamente diagnosticada por uma
demonstração da tolerância diminuída à glicose. O indivíduo ingere uma solução contendo
75g de glicose e o diabetes tipo II é diagnosticado quando uma dessas situações ocorre: O
nível plasmático de glicose em jejum é maior que 140 mg/dL ou glicose em jejum é normal,
atingindo 200mg/dL após 2h de ingestão da solução de glicose. No período inicial da doença
observa-se glicemia de jejum normal e após 2h valores entre 140 e 200 mg/dL.
A tabela na página a seguir apresenta um resumo das diferenças entre os dois tipos de
diabetes.
Tratamento
Depende do tipo de diabetes.Tipo I é, ou tornar-se-á, dependente de insulina por toda
a vida. Deve haver reposição adequada de Na+ e água. Na tipo II, perda de peso já pode
influenciar na capacidade do corpo de controlar o nível de glicose. Agentes hipoglicemiantes
orais (geralmente aumentam secreção de insulina pelas células β ) pode ajudar obesos ou
não. Alguns pacientes podem necessitar de injeções de insulina. Nesses pacientes dieta e
exercícios físicos são um bom meio de alcançar o controle da glicemia.
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Predisposição genética Moderada Muito forte
Coma diabético
A glicose sanguínea em concentrações maiores que o limite de reabsorção renal
provoca uma rápida diurese osmótica, que leva a perda de água e eletrólitos. Há tendência a
hipovolemia e deslocamentos de água intracelular para o espaço extracelular. Tanto a
hiperglicemia como a hipernatremia afetam muito o cérebro. Aumentando a osmolaridade
plasmática, a água move-se para fora das células cerebrais, causando desidratação celular.
Quando a osmolaridade alcança 340 a 350 mosmol/kg, a conseqüência mais provável é o
coma.
Exame Físico: Regular estado geral, palidez cutâneo-mucosa. Sinais clínicos de desidratação,
ritmo cardíaco regular, levemente taquicárdico. Respiração tendendo a ofegante, pulsos finos,
hálito cetônico bastante evidente.
Exames Laboratoriais: Glicemia (não é de jejum) = 457 mg/dL (referência = 70 a 100 mg/dL)
Cetonúria = +++/++++ (O normal é negativo).
Dados de gasometria revelam acidose.
Tratamento: O paciente foi submetido a hidratação intensa e administração de insulina, por
via muscular, de hora em hora. Após três horas de cuidados a glicemia já havia baixado para
185 mg/dL, mas a cetonúria ainda se mantinha em + / +++.
CASO 2
Identificação: J.L.P., 35 anos, feminina, branca, executiva do ramo de cosméticos.
Queixa e Duração: Sensação de fraqueza há doze horas. Dor de cabeça intermitente, há oito
horas. Hálito amargo há um dia.
História Pregressa da Moléstia Atual: A paciente deu entrada no centro endocrinológico de
emagrecimento em um spa há três dias. Está submetida a uma dieta de 300 kcalorias/dia.
Relata que no primeiro dia nada sentiu, porém, a partir do segundo dia, notou gosto ruim na
boca e o apetite diminuiu. Hoje, no terceiro dia de estadia, o gosto ruim na boca é muito
intenso e acompanhado de um hálito próximo ao cheiro de acetona; a paciente passou a sentir
também fortes dores de cabeça, aliadas à fraqueza. Procurou o ambulatório médico para
esclarecimentos.
Exame Fïsico: Bom estado geral, hálito cetônico, ritmos cardíaco e respiratório normal,
pressão arterial = 100 x 60 torr.
Exames Laboratoriais: Glicemia = 65 mg/dL (Referência = 70 a 100 mg/dL)
Cetonúria = +++ / ++++
Tratamento: A paciente foi informada que esses sintomas são provenientes da diminuição de
ingestão calórica e que a cetonúria indica que o organismo está respondendo à dieta. Foi-lhe
dito que, para resolver seus sintomas, bastaria uma refeição calórica que, porém, não é lhe
indicada já que está sob regime de emagrecimento. Indicou-se que aguardasse por mais
alguns dias até que os sintomas regredissem.
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2. Um transcrito para um gene contem a seqüência de bases abaixo:
5´ AACUGCACGAGGUAACACAAGAUGGCU 3´
Preveja o efeito de uma mutação que altere o G sublinhado para um A nas três diferentes
fases.
3. Aponte três mutações que não modificam a sequência da proteína.
4. Compare a precisão de (a) replicação do DNA (b) síntese de RNA e (C) síntese de
proteínas. Quais mecanismos são usados para garantir a fidelidade de cada um destes
processos.
5. Suponha que você tenha um sistema de síntese de proteínas que está produzindo uma
proteína chamada A. Além disso, você sabe que a proteína A tem quatro pontos sensíveis
à tripsina igualmente espaçados na proteína que na digestão produzem os peptídeos A1,
A2, A3, A4 e A5. O peptídeo A1. é o amino- terminal e A5 é o carbpxi-terminal.
Finalmente, você sabe que seu sistema precisa de 4 minutos para produzir uma molécula
de proteína A completa. Em t=0, você adiciona todos os 20 amino-ácidos, cada um
levando uma marcação com 14C .
(A) Em t=1 minuto, você isola a proteína A intacta do sistema, corta-a com tripsina e isola
os cinco peptídeos. Qual peptídeo é mais intensamente marcado?
(B) Em t=3 minutos, qual será a ordem de marcação dos peptídeos do mais para o menos
marcado?
(C) O eu esta experiência lhe diz sobre o sentido da síntese de proteínas?
6. As aminoacil-tRNA sintetases são os únicos componentes da expressão gênica que
decodificam o código genético. Explique.
7. Quais são as funções do mRNA. tRNA e rRNA?
1. Células de E. coli são crescidas no meio com glicose como única fonte de carbono.
Tryptofano é adicionado. As células continuam a crescer e dividem a cada 30 minutos.
Descreva qualitativamente como a atividade da triptofano sintase varia nas seguintes
condições:
a) O trp mRNA é estável (degrada lentamente após algumas horas)
b) O trp mRNA é degradado rapidamente, porém a enzima triptofano sintase é estável.
c) Tanto o trp mRNA e a enzima triptofano sintase são degradadas mais rapidamente
que o normal.
2. Descreva os prováveis efeitos na expressão do gene operon lac quando sofre mutações
em:
a) o gene lacI que inativa o repressor
b) o promotor é eliminado na região próxima a posição -10
3. Células de E. coli são crescidas no meio contendo lactose, porém não glicose. Indique
em cada uma das situações abaixo se a expressão do operon lac aumenta, reduz ou não é
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alterada. Desenhe um modelo descrevendo o que acontece em cada uma destas
situações.
a) Adição de alta concentração de glicose
b) Uma mutação que impede a dissociação do repressor lac na região reguladora.
c) Uma mutação que inativa completamente a β -galactosidase.
d) Uma mutação que inativa completamente a permease galactosidase
e) Uma mutação que previne a ligação de CRP para o sítio de ligação próximo a região
do promotor lac.
4. Como a transcrição do gene operon trp da E. coli pode ser afetada pelas seguintes
manipulações da região promotora do mRNA trp.
a) Aumento da distância (número de pares de base) entre o peptídeo iniciador e a
seqüência 2.
b) Aumento da distância (número de pares de base) entre a seqüência 2 e a 3.
c) Removendo a seqüência 4
d) Trocando os dois códons trp no peptídeo iniciador para códons de His.
e) Eliminando o sítio de ligação para o ribossomo que transcreve o peptídeo iniciador.
5. Uma nova RNA polimerase é descoberta a partir de extratos protéicos obtidos por um
fungo exótico. Esta RNA polimerase inicia somente a transcrição a partir de uma única região
promotora altamente especializada. A atividade desta RNA polimerase é reduzida quando a
enzima é purificada. Sugira uma explicação para esta observação.
31
Definição de transgênicos: Os Transgênicos são organismos que adquiriram características
de outro organismo, pelo uso de técnicas modernas de Engenharia Genética. O termo
geneticamente modificado tem sido utilizado para descrever a aplicação da tecnologia
do DNA recombinante para a alteração genética de animais, plantas e
microorganismos.
Histórico: A Genética é uma ciência característica do século XX, pois, a partir de 1900 as
Leis de Mendel foram redescobertas e começaram a ser aplicadas. Nos primeiros ¾
deste século, a genética mendeliana contribuiu significativamente para a sustentação do
crescimento populacional de nosso planeta, produzindo maiores safras de alimentos de
origem vegetal, aumentando a produtividade de animais e contribuindo para uma maior
longevidade humana. O crescimento acelerado do campo da biotecnologia, entretanto,
ocorreu a partir da década de 70 com o desenvolvimento da Engenharia Genética (ou
Tecnologia do DNA Recombinante). A decifração do código genético e a manipulação
do DNA neste último quarto de século, aceleraram as descobertas científicas e suas
aplicações biotecnológicas, abrindo novas perspectivas econômicas nos campos da
saúde humana, sanidade animal e produção de alimentos. Surgiram técnicas
biotecnológicas como a produção e pesquisa de plantas e animais transgênicos,
clonagem de mamíferos, produção de proteínas humanas em microorganismos, plantas
e animais, mapeamento do genoma humano, técnicas de detecções e diagnósticos por
PCR e Terapia Gênica.
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Após esta última etapa, tem-se uma planta transgênica, porque ela contém, além dos
genes naturais, um gene adicional proveniente de outro organismo, que pode ser uma planta,
uma bactéria ou até um animal.
Genes de Interesse:
O genoma de uma bactéria contém em média 5.000 genes, o de plantas, entre 40.000 e
60.000, enquanto o genoma humano consiste de aproximadamente 30.000 genes. Os genes
são segmentos de um mesmo tipo de molécula: o ácido desoxirribonucléico (DNA) e é esta
característica que permite que genes de um organismo sejam potencialmente funcionais em
outro.
Uma das possibilidades para isolamento de um
gene é a construção de uma “biblioteca genômica”
e, para isso, o DNA do organismo contendo o gene
de interesse é extraído. Em seguida o DNA é
cortado em fragmentos menores utilizando as
enzimas de restrição. Estes fragmentos são, então,
ligados a outros fragmentos de DNA, mas que
podem se replicar em bactérias, onde este material
é inserido e replicado por várias vezes. Depois,
seleciona-se a colônia de bactérias que contém o
fragmento de DNA correspondente ao gene de
interesse. Diversos genes de interesse agronômico
já foram isolados, entre eles temos:
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Transferência dos genes de interesse em plantas:
A transferência dos genes se dá diretamente na célula vegetal (processo mais utilizado
- especialmente para o caso de monocotiledôneas) ou através de agrobactérias. A
transferência é alcançada por um dos métodos seguintes:
A) Eletroporação de protoplastos e células vegetais: Protoplastos são células vegetais,
desprovidas de parede celular. Para a transformação, são incubados em soluções que contêm
os genes a serem transferidos e, em seguida, um choque elétrico de alta voltagem é aplicado
por curtíssimo tempo. O choque causa uma alteração da membrana celular, o que permite a
penetração e eventual integração dos genes no genoma.
B) Biobalística: Baseia-se na utilização de microprojéteis de ouro ou tungstênio
cobertos com os genes de interesse. Os microprojéteis são acelerados com pólvora ou gás em
direção aos alvos (as células vegetais). Os genes entram nas células junto com o projétil de
maneira não-letal, inserindo-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA é
dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular, ocorrendo o processo de
integração do gene exógeno no genoma do organismo a ser modificado.
C) Infecção por Agrobacterium tumefaciens: O plasmídeo é uma molécula de DNA
extracromossomal que pode se replicar independentemente do cromossomo. O plasmídeo
encontrado na bactéria Agrobacterium tumefaciens é um dos vetores mais importantes para a
transformação de plantas. Parte do plasmídeo é um transposon (T DNA) que produz cópias
de si mesmo nos cromossomos da planta infectada. Os transposons são assim denominados
(ou também chamados elementos de transposição) justamente porque são elementos
genéticos móveis capazes de integrar-se ao genoma do hospedeiro e duplicar-se.
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A modificação genética de microrganismos continua sendo uma importante
complementação para as modificações genéticas de plantas e animais, especialmente para a
produção de metabólitos secundários, biofertilizantes e biopesticidas, bioprocessamento,
biorremediação e tratamento de águas. De acordo com uma pesquisa sobre a expectativa de
comercialização de produtos obtidos de organismos geneticamente modificados nos E.U.A., a
agricultura tem um grande potencial de crescimento e uma forte posição nas vendas em
volume.
Já existem sementes manipuladas sendo cultivadas no mundo em uma área de 30
milhões de hectares e seu mercado deverá movimentar cerca de US$ 3 bilhões. No Brasil,
muitos alimentos transgênicos importados já são comercializados e estima-se a importação de
3 milhões de toneladas de milho da Argentina e dos E.U.A, onde as lavouras transgênicas são
permitidas oficialmente.
Na década de 90, os E.U.A aprovaram dezenas de produtos geneticamente
modificados e outra grande quantidade apareceu no mercado europeu. O ritmo atual de
liberação de OGMs indica que na primeira década deste século já teremos uma centena de
produtos geneticamente modificados nas prateleiras dos supermercados, podendo-se chegar
na casa dos milhares em algumas décadas.
Uso de terras marginalizadas: Solos com elevados índices de salinidade e alcalinidade podem
ser utilizados caso se consiga obter um transgênico que tenha resistência a essas condições.
Como exemplo, temos um gene de tolerância em manguezais (Avicennia marina) que foi
clonado e transferido para outras plantas que se mostraram mais tolerantes a altas
concentrações de sal.
Segundo a revista Nature Biotechnology, graças à injeção de um único gene capaz de
absorver um excedente de sal em plantações de tomate, cientistas conseguiram fazer crescer e
desenvolver em água contendo forte teor de sódio, tomates perfeitamente comestíveis. O gene
introduzido atua sobre uma proteína como um filtro capaz de captar e isolar o sódio
excedente.
Benefícios nutricionais: Já foi desenvolvido o arroz transgênico com elevados níveis de ferro,
de forma a combater a anemia. Ele foi produzido usando-se genes envolvidos na produção de
proteínas capazes de ligar o ferro e de uma enzima que facilita a disponibilidade de ferro na
dieta humana (Goto et al, 1999). As plantas transgênicas contêm entre 2 e 4 vezes mais ferro
do que normalmente encontrado no arroz convencional.
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Pesquisadores desenvolveram arroz
com alto teor de beta-caroteno,
precursor da vitamina A, que ajuda a
combater diversas doenças, como a
cegueira noturna, ressecamento da
córnea, diarréias e sarampo. Foram
inseridos genes de bactérias que fazem
a conversão do precursor presente no
arroz em beta-caroteno. O resultado
desse experimento foi a produção de
grãos amarelados de arroz, devido à
presença de beta-caroteno. Cerca de
300 g desse arroz cozido por dia
arroz normal arroz transgênico suprem as necessidades de beta-
caroteno de um indivíduo.
Referências
• Lewin, B. (1994) Genes. 1ed. New Yourk, Oxford University Press.
• Okamuro, J.K. & Goldberg, R.B. (1989) The Biology of Plants. Academic Press Inc.
• Purves, W.K.; Sadava,D.; Orians,G.H. & Heller, H.C. (2001) Life – the science of
Biology. 6th. Ed. Sinauer AssociaTES, Inc & W.H.Freeman and Company.
• Zaha, A. (Coord.) (1996) Biologia Molecular Básica, Porto Alegre, Mercado Aberto.
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Laboratório 2: Transformação de bactérias com DNA plasmidial e eletroforese em gel
de agarose
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Questões
1. Que papel desempenha cada componente do tampão GET (glicose, EDTA e Tris) ?
2. O que é lisozima e para que é usada na preparação de plasmídeos ?
3. Qual a função do NaOH e do SDS presentes na solução de lise ?
4. Se o DNA cromosomal tiver sido muito quebrado durante as manipulações, onde espera
encontrá-lo após precipitação com KAc ? Quais as conseqüências para a preparação de
DNA plasmidial?
5. Como age o isopropanol ? Este álcool poderia ser substituído por etanol, por exemplo ?
6. Por que se dissolve a preparação de DNA em tampão Tris-EDTA ?
7. Quantas bandas do DNA plasmidial são visualizadas no gel corado com EtBr Quantas
bandas você esperaria caso o pBR322 purificado fosse digerido com enzima EcoRI ?
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Procedimento experimental: O ideal é que a experiência seja realizada em ambiente
asséptico (fluxo laminar), para evitar contaminação. Manipule convenientemente o material
estéril fornecido. NÃO ABRA AS PLACAS DE ÁGAR ATÉ O MOMENTO DE USO.
As bactérias competentes para transformação são preparadas a partir de uma cultura
em fase exponencial do crescimento e através de sucessivas lavagens do precipitado de
bactérias com uma solução de CaCl2. As bactérias competentes assim preparadas podem ser
armazenadas a –80°C, para uso posterior.
1. Inocular 5 ml de meio LB líquido com uma colônia de bactérias HB101 (E.coli) e incubar
à 37°C até o dia seguinte sob agitação forte (200-250 rpm).
2. Diluir a pré-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB, incubar à 37°C sob agitação até
OD600nm=0,3 (fase logarítmica de crescimento).
3. Transferir a cultura para o gelo, coletar as bactérias por centrifugação (4000 rpm, 5 min).
Ressuspender o sedimento de bactérias em 5 ml de tampão acetato de sódio (frio) 20mM
pH6,5 contendo CaCl2 0,1 M. Incubar no gelo por 20 minutos.
4. Coletar as bactérias (4000 rpm, 5 min á 4 °C) e ressuspender em 1 ml do mesmo tampão
(frio).
5. Após pelo menos 30 min. No gelo estas BACTÉRIAS COMPETENTES podem ser
transformadas.
6. Para transformar, distribuir 0,1 ml/tubo da suspensão de bactérias competentes para cada
um de 2 tubos. Adicionar o DNA transformante (0,5 µ g DNA de pBR322 em 10µ l de
tampão 10mM Tris pH7,5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. O outro tubo será
usado como controle (bactéria apenas).
7. Incubar em gelo por 15 min. Antes de dar o choque térmico (42°C por exatamente 90
segundos) . Transferir os tubos para o gelo por 2 min.
8. Adicionar 0,9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37°C sem agitação, em banho-maria, por
uma hora.
9. Transferir 25µ l ou 250µ l da suspensão para placas de ágar LB e LB-A (LB contendo
ampicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Espalhar as bactérias
com o auxílio de uma alça de vidro, previamente flambada e em seguida resfriada na
própria tampa da placa de Petri.
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Número de Colônias / Placas
Questões
1. Por que se usa cultura em fase exponencial de crescimento para obter bactérias
competentes?
2. Qual o papel do choque térmico?
3. Por que as bactérias devem ser incubadas por 60 min. a 37°C antes de espalhá-las em
placas de ágar?
4. Que utilidade teria esta técnica do ponto de vista biotecnológico? Dê um exemplo.
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