BİYOMÜHENDİSLİK LABORATUVARI 2

MİKROORGANİZMALARIN BİYOREAKTÖR
KULLANILARAK ÜRETİLMESİ
SUNUM İÇERİĞİ

 Deneyin Amacı
 Teorik Bilgi

 Deneysel Yöntem

◦ Deney Düzeneğinin Şematik Gösterimi ve Yapılışı

◦ Deney Koşulları ve Güvenlik Kaygısı
 Deney Verilerinin Saptanması ve Analizi
 Grafik ve Çizimler

 Deney Sonuçları ve Yorum

DENEYİN AMACI:
 Kapalı sistemde çalışan 5 L hacimli bir
biyoreaktörde Saccharomyces cerevisiae
üretmek ve gelişim sürecinde örnekler alarak
büyüme eğrisi oluşturmaktır.
 TEORİK BİLGİ
 Saccharomyces cerevisiae biracılıkta bir üst
fermantasyon mayası olarak tanımlanır. Üst
Saccharomyces cerevisiae, kalın bağırsak iltihabına
(kolit) neden olan Clostridium difficile bakterisinin
biyolojik kontrolunda bir probiyotik katkı olarak
kullanılır. Çok hasta insanlarda bu uygulamanın
sistemik maya iltihabına yol açabileceği
gözlemlenmiştir.
 Beta-glukan "Saccharomyces cerevisiae" adlı maya
mantarının hücre duvarından ekstrakte edilen,
polisakkarit lif yapısında, enfeksiyöz hastalıklara ve
kansere karşı immun sistemi stimule ederek
güçlendiren organik bir biyolojik yanıt düzenleyicidir.
Saccharomyces cerevisiae hücre duvarının yapısı
FERMENTASYON:
 Mayalanma ya da fermantasyon, bir maddenin
bakteriler, mantarlar ve diğer mikroorganizmalar
aracılığıyla, genellikle ısı vererek ve köpürerek
kimyasal olarak çürümesi olayıdır.
 2 tür fermentasyon çeşidi vardır:
1. Glikozun Fermantasyonu
 
a-Alkol fermantasyonu

b-Laktik asit fermantasyonu

c-Karışık asit fermantasyonu d-
Butirik asit fermantasyonu
e-Solvent fermantasyonu
f-Bütandiol fermantasyonu
g-Propionik asit fermantasyonu

2. Amino asit fermantasyonu (Stickland Fermantasyonu)

 Mikroorganizmalar bitkiler ve hayvanlara göre çok hızlı
şekilde ve 2 'ye bölünerek çoğalır.
 Genel olarak küfler bakteri ve mayalara göre daha geç
çoğalırlar.
 mantarlar sporlanma (sporulasyon) ile eşeysiz
(aseksüel) ve eşeyli (seksüel) olarak üreme yeteneğine
sahiptirler.
 Mayalar üreme yönünden başlıca iki gruba ayrılırlar
(aseksüel ve seksüel üreme).
 Virüsler ise bir canlı grubuna rastlamasıyla kendini
çoğaltmaya başlar. Bir virüsün canlı bir hücre olmaksızın
kendini çoğaltması ise mümkün değildir. Yani virüs ancak
ve ancak canlı bir hücre vasıtasıyla kendini çoğaltabilir.
 Biyoreaktörler, aktif bir
biyoçevre yaratan sistem ya da
cihazların genel adıdır.Temel
olarak küçük hacimli ve büyük
hacimli olarak 2 gruba
ayrılırlar.
 Genel olarak küçük hacimli
reaktörler hacim olarak 3 tona
kadar ulaşabilmektedirler
Biyoreaktörler operasyon tipine göre;

1-Kesikli prosesler: Kesikli proseslerde reaktöre

giren ya da çıkan bir besiyeri söz konusu
değildir.Substratın tamamı reaktöre başlangıçta
konur.
2-Yarı kesikli prosesler: Reaktöre sürekli olarak
besiyeri eklenir ancak ortamdan
uzaklaştırılmaz.Yani reaktörde sıvı miktarı
sürekli artar.
3-Sürekli prosesler:Reaktör sürekli beslenir ve
genellikle aynı hızda da ortamdan uzaklaştırılır.
BİYOREAKTÖRÜOLUŞTURAN
ANA ELEMANLAR !!
1)Reaktör kabı;
2)ceket;
3)izolasyon sağlayıcı;
4)örtü;
5)mikroorganizma girişi;
6)pH için giriş noktası;
7)karıştırıcı ve paletler ;
8)gaz püskürtücü;
9)mekanik conta;
10)indirgeyici dişli kutusu;
11)motor;
12)ürün çıkış ağzı;
13)ceket bağlantıları;
14)buhar bağlantılı örnek kapakçığı;
15)görüş camı;
16)asit,alkali ve köpük kırıcı
kimyasal bağlantısı;
17)hava girişi;
18)çıkarılabilir baş;
19)besiyeri ya da besleyici
girişi;
20)hava çıkışı
21)aygıt girişi(çeşitli);
22)köpük kırıcı;
23)ışıklı görüş camı ve buhar
bağlantısı;
24)bağlantı koparıcı disk
nozül bölümlerinden
oluşur
DENEY DÜZENEĞİNİN ŞEMATİK GÖSTERİMİ
DENEYİN YAPILIŞI

 Saccharomyces cerevisiae’nin saf kültürü katı besiyerine

yayma yöntemiyle ekilip,48 saat 30ºC’de inkübe edilmiştir.
 Katı besiyerinden (yeast pepton dekstroz agar) tek koloni
ekimi ile 10 mL’lik sıvı besiyerinden tek koloni ekimi ile
10mL’lik sıvı besiyerine geçilir(mini prep).48 saat 30ºC’lik
çalkalayıcı inkübatörde bırakılır.
 Ölçek büyütme işleminde kullanılan sıvı besiyeri(agar hariç
yeast pepton dekstros) hacmi büyük ölçeklinin %10 kadarı
olmalıdır.Yani 1Lt için %10 besiyer kullanılır.
 Süre sonunda 10mL’lik kültür 100 ml lik steril besiyerine
aktarılır ve 48 saat 30ºC’lik çalkalayıcı inkübatörede bırakılır.
 Süre sonunda 100 mL’lik besiyerinin tamamı büyük ölçekli
besiyerine(biyoreaktöre)aktarılır.
 Biyoreaktöre ekim yapıldığında(t=0) örnek alınmaya
başlanır ve büyümenin gerçekleşeceği 48 saat içinde
belirli aralıklarla örnek alımına devam edilir.Ancak
zaman süresinin uzunluğundan dolayı biz 330 dk
boyunca ölçüm aktarılır.
 Spektrofotometrede ölçüm alınır.Blank olarak steril
besiyeri kullanıldık.Blank cihaza yerleştirilir.Auto
zero yapıldıktan sonra örnek küvete ekledik ve 600
nm.de absorbansı ölçtük.
 30 dk ararlıklarla örnekler alınıp absorbansları ölçüldü
örnekler alındığında O2 girişini kapattık, bulanıklığın
oluşumundan mayaların üremesi gözlemlendi ve
değerlerin artışı yeterince azalıncaya kadar bu işleme
devam edildi.
 Deney Koşulları: Deney normal laboratuvar koşullarında
gerçekleştirilecektir
 Güvenlik Kaygısı

Saccharomyces cerevisiae biracılıkta bir üst

fermantasyon mayası olarak tanımlanır. Üst
Saccharomyces cerevisiae, kalın bağırsak iltihabına
(kolit) neden olan Clostridium difficile bakterisinin
biyolojik kontrolunda bir probiyotik katkı olarak
kullanılır. Çok hasta insanlarda bu uygulamanın sistemik
maya iltihabına yol açabileceği gözlemlenmiştir. İnsan
sağlığı üzerinde ciddi etkileri çok olmayan bir maya olsa
da el temizliğine ve eldiven kullanmadan
mikroorganizmayla direkt temastan kaçınmaya özen
gösterilmelidir.
Biyoreaktörden numune alınırken dikkatli
olunmalı,numunenin alındığı ince hortum serbest
bırakılmamalı böylece tazyikten dolayı madde çıkışını
engelleyebiliriz.
DENEY VERİLERİNİN SAPTANMASI VE ANALİZİ

 5 litrelik biyoreaktöre dalgalanma,köpük oluşumu ve

çok az da olsa mikroorganizmaların sayısının artışından
dolayı 2.5 Lt kültür besiyer karışımını koyduk.Cihaz
elektronik olduğundan kendi beslemelerini otomatik bir
şekilde yapmaktadır.
 Ölçek büyütme işlemi;

 2.5 lt lik taze YPDA besiyerine hacmin %10’u kadar

doygun Saccharomyces cerevisiae kültürü aşılanır.
 2.5x0.10=250 mL Saccharomyces cerevisiae kültürü

 Deneye ilk başlanıldığında pH değeri 7.0 iken bu

değerin zamanla düştüğü gözlemlendi.

0-30 dk lar arası
lag fazı

30-330.dk lar
arası log faz

330.dk dan sonra

durağan faza geçiş
gözlendi.
GRAFİK VE ÇİZİMLER

2
Absorbans(600nm.de)

1.5

0.5
0 100 200 300 400
t

zaman (dk)
DENEY SONUÇLARI VE YORUMLAR
 Spektrofotometrede 100-200 dk lar arasındaki
değerlerin artışı çok küçük değerlerde
görülmüştür.Bunun spektrofotometreden
kaynaklandığı sanılmaktadır.0-15. dk lar arsında
mikroorganizma üremesi olmamasından dolayı
absorbans değerinde herhangi bir değişiklik
olmadığından bu süre ‘lag fazı’dır.
 30.dk dan itibaren mikroorganizma sayısı
artmaya başlamıştır.90.dk da ani bir artış
gözlemlememizin nedeni üremenin hızlı bir
şekilde gözlendiği ‘log fazına’ geçiştir.
 330.dk daki değerimizde artış miktarı çok
azaldığından(≈%4.9) durağan faza geçiş gözlemlendi.
 Yeterince uzun süre boyunca numune almamız mümkün
olmadığından ölüm fazını gözlemleyemedik.Fakat maya
hücreleri bir süre sonra tüm enerji kaynaklarını
tüketeceklerinden dolayı metabolik aktiviteler
duracaktır,bu faza geçildiğinde işlem durdurulur.
 Sonuç olarak Saccharomyces cerevisiae üremesini
absorbans değerlerindeki değişmelerle üreme safhalarını
belirleyerek gözledik.Absorbans değerlerindeki artış ile
log fazında maya hücrelerinin sayısının arttığını
logaritmik olarak orantılı arttığını
gözlemledik.Biyoreaktörün çalışma şeklini,kontrol
modüllerini ve diğer kısımları hakkında bilgilendik.


TEŞEKKÜRLER…