INTRODUCCIÓN

En su mayor parte los microorganismos son demasiado

pequeños para observarse a simple vista: protozoos, algas,
hongos, bacterias y virus.
Estos microorganismos difieren en características tales como
forma de nutrición, estructura, tamaño, composición entre
otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio
microscópico el facilita notablemente la observación;
principalmente en las bacterias se facilita al tratarlas con
colorantes o tintes los cuales facilitan también la observación
de ciertas estructuras celulares.
En este informe vamos a distinguir la estructura intracelular
de algunos microorganismos.
La coloración celular y tejidos son una combinación
de fenómenos físicos y químicos de absorción: los
fenómenos físicos de absorción, capilaridad y ósmosis
participan en cierto grado. La afinidad de colorantes
básicos por los tejidos ácidos y viceversa indican que
hay reacción química.

Son compuestos, orgánicos que contienen radicales

cromóforos esto es que producen color y grupo de
anxocromos que forman sales los grupos nitrito (-NO2) y azo (-
N = N) son cromóforos. Los radicales hidroxilo (-OH) y amino (-
NH2) son grupos anxocromos. Los cromóforos imparten la
propiedad cromógena al colorante y los anxocromos permiten
que el colorante se una con la fibra o tejido.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen
alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos
colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos
son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se
combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente,
tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la
fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la
localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de
colorante liposoluble es el negro Sudán.
 Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya
sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí
mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual
es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular
y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la
microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El
azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las
células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso
que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar
la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor
parte del material no celular no se tiñe.
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las
células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las
rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia
utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las
células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de
carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua).
La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste
de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en
revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.
 Preparación de Frotis Bacteriano
para Coloración:
Entes de la tinción las bacterias suelen encontrarse en
agua o en otro líquido en un porta objeto limpio y son
extendido en una película uniforme y delgada. Se deja
que la película seque en el aire y los microorganismos
son fijados por sustancias químicas o por el calor
moderado.

Tinciones:
Es un método utilizado para estudiar microorganismos.
(no vivos); en estas tinciones se observa morfología,
estructura y agrupamientos de microorganismos.
Los métodos de tinción son de gran utilidad,
pero deben usarse siempre con precaución, ya
que pueden conducir a errores.

Las moléculas de colorante forman en

ocasiones precipitados o agregados que
parecen estructuras celulares auténticas, pero
que son formaciones completamente
artificiales inducidas por el mismo colorante.

Tales estructuras se denominan artefactos, y

deben tomarse muchas precauciones para
tener la seguridad de que no nos estamos
equivocando al creer que un artefacto es una
estructura realmente existente.
 Tinción Simple: utiliza un solo colorante.
Tinción de Gram:
Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado
con alcohol, Safranina 30 seg)
Tinción Ácido Resistente:
Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con
ácido mineral reducido. En esta tinción las bacterias ácido
resistentes conservan el colorante primario color rosa o rojo,
los demás microorganismos son decolorados por el ácido y
toman el color azul.
Tinción de Giensa:
El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando
se sospeche de protozoos en la sangre para observar materias
núcleos de la células.
Tinción de Esporas:
Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.
 Tinción de Cápsula:
Colorante nigrosuna, aquí se observa microorganismos
encapsulados creando resistencias.
Tinción de Flagelos:
Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del
microorganismo.
Endósporas:
Son unos cuerpos resistentes que se producen en el
interior de la célula los cuales contienen los componentes
necesarios para conservar la vida.
Las esporas pueden situarse en el centro de la célula o en
situaciones excéntricas cerca de un extremo de la misma.
Levaduras:
Son esféricas, elípticas y cilíndricos, su tamaño varía
notablemente. Son hongos cuya forma corriente y
dominante de crecimiento es unicelular
 Las Cápsulas:
Son estructuras grueso viscosas gelatinosas que rodean las
células de algunas especies.
Sarcina:
Son anaerobios obligados y son extremadamente ácido –
tolerantes que pueden fermentar azúcares y crecer a pH
inferior a 2.
Este género comprende 2 especies de bacterias que se dividen
en tres planos perpendiculares para producir paquetes de 8 en
una célula.
Bacillus Cereus:
La mayoría se encuentra en el suelo o en partículas de polvo
en suspensión y son uno de los organismos del género Bacillus
que pueden ser aislados fácilmente.
Puesto que los formadores de esporas pueden aislarse
selectivamente a partir del suelo, alimentos o de otro material
dejando las muestras a 80 ºC durante 10 minutos.
Los bácillus suelen crecer en medios sistemáticos que
contengan azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes, etc, como
única fuente de carbono y amoníaco como única fuente de
nitrógeno.
La tinción de Gram, diseñada en 1884 por el bacteriólogo
danés Christian Gram clasifica a las bacterias en dos
grandes grupos: Gram Positivas y Gram Negativas. Esta
tinción diferencial depende de la estructura de la pared
celular de las bacterias.
 

La tinción de Gram se utiliza para identificar bacterias

tratándolas con un tinte azul y observando cómo
responden a esta coloración. La forma en que se
colorean los distintos tipos de células depende de las
variaciones de estructura de la pared celular. Las
bacterias Gram positivas, como Lactobacillus
acidophilus, retienen el tinte y se colorean de azul.
 En la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM

Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una

coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color
rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la
coloración de contraste las células gramnegativas son rojas,
mientras que las grampositivas permanecen azules.
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas
tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus p
aredes celulares
. La pared de la célula bacteriana sirve para dar
su tamaño y forma al organismo así como para
prevenir la lisis osmótica. El material de la pared
celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la célula gram-
positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectandas de peptidoglicano así como
algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90%
de la pared de la célula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la célula gram-
negativa, por otro lado, contiene una capa mucho
más delgada, únicamente de peptidoglicano y
está rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y
lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la
célula gram-negativa es peptidoglicano.
Las bacterias Gram negativas tienen una membrana externa
de la que carecen las bacterias Gram positivas.
Neisseria meningitidis

                                                                           

Labacteria Neisseria meningitidis que muestra esta

imagen, produce meningitis bacteriana así como otras
enfermedades. Su carácter Gram negativo se debe a su
incapacidad para captar un tipo específico de colorante
bacteriano denominado tinción de Gram.
En las tinciones simples se usa un único colorante de
carácter básico. Todas las células de la preparación
quedan teñidas y se observan del mismo color. Se
realiza la fijación, por calor, de la muestra al
portaobjetos. Se añade el colorante y se deja actuar el
tiempo necesario para que se absorba. Posteriormente
se retira el exceso de colorante y la preparación está
lista para ser observada.
-Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras
celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno
de Loeffler, Azul de lactofenol).
-El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver
elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los
componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no
actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
-La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes
capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos
capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un
halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de
Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces
para observar la presencia de leucocitos.
En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta
china.
Las tinciones diferenciales se utilizan para distiguir
entre tipos de microorganismos. Se basan en el uso de
dos colorantes. Se realiza una tinción primaria, con la
misma técnica de la tinción simple y posteriormente
una tinción de contraste para teñir las células que no se
hayan teñido previamente. La tinciones diferenciales
más importantes son la tinción de Gram y la tinción de
Ácido-Alcohol Resistencia
 Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se
usan para diferenciar de manera mas explicita los
microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes
diferenciales, que se componen de mas de una sustancia
tintórea. En algunas técnicas de coloración, las tinciones
diferenciales más importantes que se emplean en
bacteriología son las de Gram y la tinción ácido-resistente.
Ambas tinciones se utilizan para obtener informacion
acerca de la composición de las capas de la pared celular
de las células bacterianas.
La tinción de Wirtz-Conklin permite diferenciar las
esporas de las células vegetativas. La tinción primaria
se realiza con Verde de Malaquita en caliente que tiñe
las células de verde. El calor es necesario para que las
endosporas se tiñan. Si la preparación se lava con agua,
sólo las células vegetativas se decoloran mientras que
las esporas retienen el color.
La tinción de contraste se realiza con rosa safranina
que tiñe las células vegetativas de color rosa, mientras
que las esporas permanecen verdes.
Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium
y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia
denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones
ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes,
temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.)
formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el
proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la
espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora
germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de
germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias
productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo
que su estudio y observación son de enorme interés.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas
vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante
en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que
quedarán teñidas con el segundo colorante.
 Esporas de Microsporidium Glugea anomala

Espora de Nosema
tractabile, con el
filamento polar
expulsado
 transformado en un
tubo.  El esporoplasma
diplocariota se
encuentra de forma
visible afuera del tubo

Encephalitozoon spp. Detectados con  un reactivo

de inmunofluorescencia. (A) Sedimentos urinarios;
(B) control positivo de esporas