Microbiologa Aplicada: Practica I 2016

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE PENJAMO

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
DOCENTE:
MARIA GUADALUPE MORENO CONTRERAS.
ALUMNOS
JUREZ SERRANO SABINO ISMAEL
HERNANDEZ PICENO CHRISTOFER ROMAN
PARTIDA RAMIREZ JOSE
5 A

MICROBIOLOGIA APLICADA

PRACTICA I: "Conservacin de cepas microbianas.

PNJAMO GTO. MARZO 12 DEL 2016.

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CONTENIDO

INDICE DE FIGURAS ........................................................................................................................... 3

INDICE DE TABLAS ............................................................................................................................. 3
RESUMEN ............................................................................................................................................ 3
ABSTRACT ........................................................................................................................................... 3
INTRODUCCIN ................................................................................................................................ 4
OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................................... 4
OBJETIVOS ESPECFICOS .................................................................................................................... 4
JUSTIFICACIN ................................................................................................................................... 4
MARCO TEORICO............................................................................................................................... 5
MATERIAL ....................................................................................................................................... 6
REACTIVOS ..................................................................................................................................... 6
PROCEDIMIENTO ............................................................................................................................... 7
PROCEDIMIENTO: PREPARACION DE MEDIO Y MATERIAL ....................................................... 8
PROCEDIMIENTO: CONSERVACION DE CEPAS ............................................................................ 9
RESULTADOS .................................................................................................................................... 10
DISCUCIONES ................................................................................................................................... 10
CONCLUSIN ................................................................................................................................... 11
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................... 11
ANEXOS............................................................................................................................................. 12

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INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1:.8
FIGURA 2:..9

INDICE DE TABLAS

TABLA 110

RESUMEN

La conservacin de cepas tiene tres objetivos principales que hay que alcanzar para
conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiologa. Para
ello aplicamos la tcnica de transferencia peridica y de congelacin, que es una tcnica

confiable metiendo variables de agente crio protector como agua y glicerol para comparar
las tcnicas, obteniendo una mayor efectividad en el proceso donde se emplea el glicerol
como agente crio protector.
ABSTRACT

Conservation strains have three main objectives to be achieved to properly maintain the

microbial strains in microbiology laboratories. To apply this periodic transfer technique

and freezing, which is a reliable technique tucking variables protective agent such as
water and glycerol to compare techniques, achieving greater effectiveness in the process
where the glycerol as protective agent is employed?

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INTRODUCCIN

Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas
microbianas en los laboratorios de microbiologa son: que el cultivo a conservar sea puro,
evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservacin; que

durante el tiempo de conservacin sobrevivan al menos el 70-80% de las clulas, y por

ltimo, que estas clulas permanezcan genticamente estables. Los dos primeros objetivos
no son muy difciles de conseguir cuando se conoce bien la tcnica microbiolgica, pero

el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios
mtodos de conservacin para los microorganismos, y ninguno de ellos es de utilizacin
general. Vamos a resumir estos mtodos agrupndolos en tres apartados, que son:
Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo, mtodos alternativos y mtodos
restringidos. (Lopez, 2010)

OBJETIVO GENERAL
Implementar tcnicas de conservacin de cepas, teniendo en cuenta las variables
implicadas en el mtodo.
OBJETIVOS ESPECFICOS

Conocer los mtodos necesarios.

Comparar ambos mtodos para conocer el mejor.
JUSTIFICACIN

La prctica aportara conocimientos prcticos de la conservacin de cepas y reforzara la

informacin terica aprendida en clase. Dando una mejor perspectiva sobre este tema de
suma importancia microbiolgica.

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MARCO TEORICO
Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo.
Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las clulas microbianas, pero
stas no han muerto. As se garantiza al mximo la estabilidad gentica, por evitarse la
aparicin de generaciones sucesivas. An as no se puede descartar algn cambio
originado por el mtodo preparatorio en si mismo. Los mtodos de conservacin
pertenecientes a este grupo son dos: Congelacin y liofilizacin.
Conservacin por congelacin.
Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente crioprotector y se
guardan a temperaturas inferiores a cero grados centgrados, con lo que el agua se

congela. De esta forma, al no disponer las clulas de agua en forma lquida, no hay
crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las clulas as conservadas, se recuperan

subiendo la temperatura. Este es el mejor mtodo de conservacin desde todos los puntos
de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y adems existe el
peligro de que algn fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura
durante el almacenamiento. Tambin resulta ser el mtodo ms molesto para realizar el
envo de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las
clulas conservadas por este mtodo son los siguientes: (Lopez, 2010)
1.-

Edad de las clulas: Donde conviene utilizar clulas maduras del inicio de

2.-

Velocidad en la congelacin y descongelacin (rapida).

la fase estacionaria de la curva de crecimiento.

3.-

Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo ms baja posible (195C o

140C.)
4.-

Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del dao que

se pueda producir en las clulas microbianas en el momento de la congelacin.

(Lopez, 2010)

B.- Mtodos alternativos.

Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de eleccin, bien por
carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los
tratamientos de la conservacin por estos mtodos. (Lopez, 2010)

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a).- Conservacin por transferencia peridica.

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que

ha crecido. Sin embargo, estas clulas no pueden permanecer indefinidamente en el
mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos txicos del metabolismo que se
acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo que es necesario

transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco para retardar el envejecimiento y
alargar los periodos entre dos resiembras. (Lopez, 2010)
MATERIAL
6 Cajas Petri
4 Tubos de 5 ml
Puntas azules

Asa bacteriolgica
Mechero

Refrigerador
4 Micro tubos
REACTIVOS
Caldo Sabouraud
Caldo Nutritivo
Agar Dextrosa Papa
Agar Eusina Azul de Metileno

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PROCEDIMIENTO

RESIEMBRA DA 1:
PREPARAR MATERIAL:
3 CAJAS (30 ml) Y 2 TUBOS con 10 ml de medio de cultivo por cada microorganismo
5 ml de agua potable estril (solucin isotnica)
5 ml de solucin de glicerol estril
4 microtubos estriles
Puntas azules
INOCULAR MEDIO DE CULTIVO LQUIDO (1 TUBO) POR CADA
MICROORGANISMO
RESIEMBRA DA 2
INOCULACIN DE MEDIO SLIDO (1 caja)
A partir del tubo de cultivo del Da 1, sembrar por estra cruzada para obtener
colonias aisladas
INCUBACIN
INOCULACIN DE MEDIO LQUIDO DA 3
Inoculacin de tubo con medio de cultivo a partir de la caja del da 2 (Cultivo joven)
para cada microorganismo
CONSERVACIN DE CEPAS DIA 4 (El proceso se tiene que hacer para cada cepa)
CONGELACIN
Tomar 1.5 ml de la suspensin del microorganismo (Cultivo DIA 3) y centrifugar por
5 min.

Eliminar el sobrenadante (caldo)

Agregar 1 ml de solucin isotnica (agua potable estril) y lavar la pastilla (vortex).

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Centrifugar 5 min y eliminar sobrenadante
Adicionar 0.5 ml de solucin isotnica estril, conservar a -70C
Repetir el proceso anterior pero al final adicionar 0.5 ml de Glicerol al 15%
TRANSFERENCIA PERIDICA
A partir del tubo de cultivo del DIA 3, sembrar por estra cruzada 2 cajas (para cada
microorganismo). Incubar 24-48 hrs hasta tener crecimiento.
Almacenar una caja a 4C y otra a temperatura ambiente
PROCEDIMIENTO: PREPARACION DE MEDIO Y MATERIAL
INICIO

Preparacin de material

Inocular los medios con

cada microorganismo en

FIN

medio lquido.
Dejar incubar
un da.
Inocular los medios con
cada microorganismo en
medio slido.
o

Inocular el medio lquido

(Muestra joven).

Dejar incubar
uno o dos das.

Figura 1: Diagrama de flujo de Practica, Material1.

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PROCEDIMIENTO: CONSERVACION DE CEPAS
INICIO

Tomar 1.5 ml de la
suspensin del
microorganismo

Centrifugar y eliminar sobre

nadante

Agregar 1 ml de solucin
isotnica

Centrifugar y eliminar sobre

nadante

Adicionar 0.5 ml de
solucin isotnica estril,

FIN

conservar a -70C
Sembrar por estra
Repetir y al final adicionar
0.5 ml de Glicerol al 15%

cruzada 2 cajas. Incubar

24-48 hrs. Almacenar a

4C y otra a temperatura
ambiente

Figura 2: Diagrama de flujo de Practica II

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RESULTADOS
Absorbancia
Microorganismo

Bacteria Hongo
Blanco

Temperatura

-0.044

0.031

Refrigeracin

0.129

0.061

0.405

0.715

0.341

0.406

Ambiente
(4C)

Refrigeracin
(Glicerol)
Refrigeracin
(Agua)

Tabla 1: Tabla de resultados de absorbancia para cada Microorganismo.

DISCUCIONES

La prctica fue muy importante para todos nosotros, ms que nada en la comprobacin de
la teora, con respecto a la conservacin de cepas microbianas.
Con respecto a las variaciones en la absorbancia que nos encontramos, fue el de
absorbancias negativa que indica que no tuvimos crecimiento en la cepa bacteriana a
temperatura ambiente indicndonos que es un mal mtodo de conservacin.
El mtodo de congelado con el crio protector fue el mejor mtodo de conservacin ya que
protegi las membranas celulares de las clulas, de igual manera los hongos tuvieron una
mayor resistencia por las esporas que producen.
El crecimiento en biomasa es relativamente proporcional a la absorbancia del medio y
esto nos dio una perspectiva del crecimiento de las cepas.

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CONCLUSIN

Se concluy, que el mejor mtodo de conservacin es la congelacin con un crio

protector, que conserva las cepas por mucho ms tiempo y cumple con los 3 puntos

esenciales de la conservacin, adems encontramos una relacin entre el mejor mtodo,

donde se obtendrn ms crecimiento y este crecimiento dar una mayor turbidez en el

medio, aumentando la absorbancia, es as como obtenemos resultados relacionados al

mtodo de conservacin
BIBLIOGRAFIA

Leal, L. C. (2005). Evaluacin de la congelacin para conservacin de especies autctonas

bacterianas. Unicolmayor, 21 - 29.
Lopez, M. D. (2010). La concervacion de cepas microbianas. Coleccion Espaola de

Cultivos Tipo (CECT).

Nacedo, D. (2009). SciELO. Obtenido de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025028X2009000100004

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ANEXOS

Tubo de hongo conservado, sacado para su

anlisis

Menor absorbancia, obtenida de la

conservacin de resiembra a temperatura
ambiente.

Mayor absorbancia, obtenida de la

conservacin de conservacin con crio
protector (Hongo).

Absorbancia de cero, calibracin con blanco.

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