PEWARNAAN /

PENGECATAN
BAKTERI
Asih Rahayu,drh.,M.Kes.
LAB. MIKROBIOLGI
FK UWKS

IDENTIFIKASI BAKTERI

Identifikasi bakteri penyebab penyakit infeksi

dilakukan di laboratorium Mikrobiologi dengan
mengirimkan spesimen /sampel / bahan
pemeriksaan penderita (mengenai sampel dibahas
lebih lanjut pada Bab Pengambilan Spesimen &
interpretasi Hasil Pemeriksaan Laboratorium
Mikrobiologi)
Sampel yang diterima oleh lab akan dikerjakan
sesuai permintaan dokter pengirimnya

PEMERIKSAAN RUTIN LAB

MIKROBIOLOGI UNTUK BAKTERI

1.

2.

3.

Setiap sampel untuk pemeriksaan bakteri yang

diterima oleh lab Mikrobiologi akan dilakukan
pemeriksaan sbb:
Pemeriksaan mikroskopis untuk mengetahui
morfologi & sifat afinitas bakteri terhadap zat
warna
Kultur (perbenihan) untuk mengetahui sifat
fisiologis & kimiawi bakteri
Hewan coba (bila perlu) ; saat ini sudah sangat
jarang dilakukan

1.PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS

Untuk memeriksa bakteri secara mikroskopis perlu

dilakukan pewarnaan /pengecatan
Jenis pewarnaan yang dipergunakan disesuaikan
dengan kebutuhan / permintaan masing masing
spesimen yang dikirimkan
Umumnya dilakukan pewarnaan rutin lab
Mikrobiologi yaitu Pewarnaan Gram, kecuali
terdapat indikasi lain misalnya untuk spesimen
penderita yang diduga TBC atau lepra , tidak
dilakukan pewarnaan Gram melainkan pewarnaan
Tahan Asam / Acid Fast / Ziehl Nelsen
Terdapat banyak jenis pewarnaan, pada kuliah ini
hanya dipelajari beberapa yang dasar & sangat
penting diketahui oleh seorang calon praktisi /
dokter umum

PEWARNAAN
berdasarkan ikatan zat
warna dengan sitoplasma bakteri

POSITIF
-Zat warna dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri

NEGATIF
-zat warna tidak dapat
berikatan dengan sitoplasma bakteri

Pewarnaan yang bersifat positif

Karena mempergunakan zat warna yang dapat berikatan

dengan sitoplasma bakteri, maka di bawah mikroskop
bakteri akan tampak berwarna sesuai dengan warna zat
yang dipakai
Zat warna yang dipakai harus bersifat basa ( basic dyes)
untuk dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri yang
cenderung bersifat asam
Contoh zat warna yang bersifat basa:
Crystal violet berwarna ungu
Safranin berwarna merah
Methylene Blue berwarna biru
Carbol fuchsin berwarna merah
Malachite Green berwarna hijau ; larut dalam air
Neisser AB & Neisser C larut dalam air

Macam Pewarnaan yang bersifat positif

Sederhana / simple staining :

mempergunakan 1 macam zat warna basa

tujuannya hanya untuk mengetahui bentuk/morfologi &

susunan bakteri secara cepat
Differential :

dapat membedakan sifat sifat bakteri berdasarkan

afinitas terhadap zat warna

mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna basa

selain untuk mengetahui bentuk & susunan bakteri juga

untuk mengetahui sifat bakteri berdasarkan afinitas
terhadap zat warna misalnya sifat Gram,sifat Acid fast
Khusus:

mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna basa;

untuk mengetahui bagian bagian khusus yang dimiliki

oleh bakteri misalnya Granula metachromatic,
endospora / spora, capsule dll

PEWARNAAN YANG BERSIFAT NEGATIF

Karena menggunakan zat warna yang tidak dapat

berikatan dengan sitoplasma bakteri, maka di
bawah mikroskop bakteri akan tampak bening /
tidak terwarnai / transparan & hanya latar
belakang / daerah di sekitar bakteri yang akan
terwarnai
Zat warna yang dipakai harus bersifat asam /
acidic dyes sehingga tidak dapat berikatan dengan
sitoplasma bakteri yang cenderung bersifat asam
Contoh zat warna yang bersifat asam : tinta bak,
chinese ink, indian ink, nigrosin

MACAM PEWARNAAN YANG BERSIFAT NEGATIF

Burrie / negative stain :

mempergunakan 1 macam zat warna asam
untuk mengetahui morfologi & susunan bakteri
umumnya dipakai untuk mewarnai bakteri
bakteri yang sulit diwarnai ( sulit menyerap zat
warna basa )
dapat juga dipakai untuk mewarnai bakteri
bercapsule

Membuat preparat / sediaan bakteri untuk pewarnaan

1.
2.
3.
4.

5.

6.
7.

Secara detail langkah langkahnya lihat

Buku Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi
Yang perlu diingat adalah :
Pakai object glass bersih & bebas lemak (baru)
Siapkan ose yang lingkarannya menyatu
Siapkan nyala api bunsen
Bila bakteri diambil dari biakan cair tidak
perlu PZ steril
Bila bakteri diambil dari biakan padat perlu
PZ steril
Selalu bekerja secara ASEPTIS
Preparat harus difixasi setelah benar benar
kering

PEWARNAAN SEDERHANA

= SIMPLE STAINING
Mempergunakan 1 macam zat warna basa ; zat warna yang
dianjurkan : safranin atau methylene blue
Di bawah mikroskop bakteri akan tampak berwarna merah
bila menggunakan safranin & bila menggunakan methylene
blue, bakteri akan tampak berwarna biru
Secara detail langkah-langkahnya lihat Buku Petunjuk
Praktikum I Mikrobiologi
Informasi yang didapat dari pewarnaan ini hanyalah
morfologi & susunan bakteri
Morfologi : coccus ; batang = bacill panjang, pendek,
sangat pendek, kurus , gemuk, kecil, besar, mempunyai spora
(spora tampak sebagai daerah tak berwarna karena spora
tidak dapat ditembus zat warna) dll
Notes: bentuk batang yang sangat pendek sehingga mirip
coccus disebut sebagai cocoid atau coccobacill
Susunan : bergerombol, membentuk rantai, seperti huruf
cina, berdua, berempat berdelapan, sendiri sendiri dll

PEWARNAAN GRAM

Merupakan pewarnaan differential untuk

membedakan antara bakteri Gram positif dengan
bakteri Gram negatif berdasarkan afinitas
dinding sel bakteri terhadap zat warna Gram
Gram merupakan nama penemu pewarnaan
ini tulis huruf awal dengan huruf capital
Secara detail langkah langkahnya lihat di Buku
Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi

Mempergunakan 2 macam zat warna basa yaitu :

Crystal violet ( berwarna ungu ) sebagai zat warna
utama = main stain & safranin (berwarna merah)
sebagai zat warna pembanding = counter stain
Mempergunakan zat kimia pelarut organik :
Alkohol absolut = alkohol 95 96 % sebagai
decolorizing agent = peluntur
Mempergunakan zat kimia : lugol (KI3 3%)
sebagai mordant = pemantek = zat yang
membantu pengikatan zat warna Crystal violet
dengan sitoplasma bakteri (Iodine-dye complex)

Bakteri yang mempunyai struktur dinding

sel peptidoglikan yang tebal
mempertahankan zat warna crystal violet
pada saat pelunturan warna tetap ungu
Gram POSITIF
Bakteri yang mempunyai struktur dinding
sel peptidoglikan yang tipis tidak dapat
mempertahankan zat warna crystal violet
pada saat pelunturan akan mengikat zat
warna pembanding ( safranin) warna
merah Gram NEGATIF

PEWARNAAN ACID FAST

= Pewarnaan Tahan Asam = Pewarnaan ZiehlNeelsen

Ada beberapa metode , diantaranya Ziehl-Neelsen ,
Tan Thiam Hok dari nama orang penemunya
Langkah langkah secara detail lihat Buku
Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi metode
Ziehl Neelsen
Merupakan pewarnaan diffrential untuk
membedakan antara bakteri yang tahan asam
(Acid Fast) dengan bakteri yang tidak Tahan Asam
( Non Acid Fast)
Contoh bakteri Acid Fast adalah : Mycobacterium
leprae & Mycobacterium tuberculosis

Mempergunakan 2 macam zat wana basa yaitu: Carbol

Fuchsin ( wana merah ) sebagai main stain dengan
Methylene Blue ( warna biru) sebagai counter stain
Mempergunakan zat kimia pelarut organik yang kuat yaitu
Alkohol asam (larutan Alkohol + HCl) sebagai decolorizing
agent
Mempergunakan tehnik pemanasan preparat untuk
merenggangkan pori dinding sel / lapisan mycolic acid
bakteri yang bersifat tahan asam , sehingga diharapkan zat
warma Carbol Fuchsin dapat masuk & berikatan dengan
sitoplasma bakteri
Bakteri yang mempunyai struktur dinding sel mycolic acid
akan mempertahakan zat warna Carbol Fuchsin pada saat
pelunturan Bakteri Acid Fast / bakteri tahan Asam /BTA
berwarna merah
Bakteri yang tidak mempunyai struktur dinding sel mycolic
acid tidak dapat mempertahankan zat warna Carbol Fuchsin
akan mengikat zat warna pembanding Methylene Blue
bakteri tidak Tahan Asam / Non Acid Fast berwarna biru

PEWARNAAN SPORA

= Pewarnaan Schaeffer-Foulton nama penemu

pewarnaan ini
Merupakan pewarnaan khusus untuk melihat spora
(endospora) bakteri
Bakteri yang dapat membentuk spora (suatu bentuk
pertahanan diri/tidak aktif dari bakteri) misalnya Bacillus
sp & Clostridium sp
Letak & diameter spora adalah karakteristik
Letak : central, sub terminal, terminal
Diameter : lebih kecil atau lebih besar dari diameter bagian
vegetatif bakteri
Bentuk spora : bulat atau oval

Mempergunakan 2 macam zat warna basa yaitu :

Malachite Green (warna hijau) sebagai main stain
& safranin (warna merah) sebagai counter stain
Mempergunakan tehnik pemanasan untuk
merenggangkan dinding spora yang tebal &
impermiable sehingga diharapkan zat warna
Malachite Green dapat menembus dinding spora
warna spora hijau
Karena Malachite Green larut dalam air maka
bagian vegetative bakteri akan melepas warna
malachite green & mengikat warna safranin
bagian vegetative berwarna merah

PEWARNAAN NEISSER

Merupakan pewarnaan khusus : untuk melihat granula

metachromatic bakteri
Contoh bakteri patogen yang mempunyai granula
metachromatic adalah Corynebacterium diphteriae
Menggunakan 2 macam zat warna basa Neisser AB &
Neisser C (keduanya larut dalam air) oleh karena itu
selama pewarnaan tidak boleh ada proses pencucian
Secara detail dapat dilihat pada Buku Praktikum I
Mikrobiologi
Granula metachromatik tampak berwarna biru gelap &
sitoplasma bakteri akan tampak kuning kecoklatan

PEWARNAAN NEGATIF

= negative stain = Burrie nama penemunya

Menggunakan zat warna asam,umumnya tinta
bak dengan kualitas yang baik
Metode Pembuatan preparat bakteri untuk
pewarnaan negatif berbeda dengan metode
pembuatan preparat bakteri untuk pewarnaan
positif (simple, Gram, Acid Fast, Spora,Neisser)
yaitu dengan tehnik ulas secara detail di Buku
P
Bakteri tampak tidak berwarna (transparant)
dengan latar belakang hitam /gelap

Catatan:

Pewarnaan yang menggunakan metode

pemanasan preparat : Acid Fast & Spora
Pewarnaan yang menggunakan metode
pelunturan: Gram (alkohol 95-96%) & Acid Fast
(alkohol asam)
Pada pewarnaan dengan metode pemanasan :
selama pemanasan preparat tidak boleh kering &
tidak boleh mendidih
Semua jenis pewarnaan terdapat tahap pencucian
dengan air (pergunakan air kran) , kecuali pada
pewarnaan Neisser

Staphylococcus sp Gram positif, coccus, umumnya

bergerombol seperti buah anggur
Streptococcus sp Gram positif, coccus , umumnya
berjajar membentuk rantai
Escherechia coli Gram negatif, batang / bacill kecil,
umumnya sendiri sendiri
Bacillus subtilis Gram positif , mempunyai spora
( tampak transparant pada pewarnaan Gram), batang
besar, umumnya berjajar membentuk rantai
Mycbacterium tuberculosis Batang panjang kurus, Acid
Fast / Tahan Asam, umumnya bergerombol atau sendiri sendiri
Mycobacterium leprae Batang panjang kurus, Acid Fast /
Tahan Asam, umumnya bergerombol membentuk formasi
melingkar seperti potongan melintang cerutu (globi /
globus) atau sendiri sendiri
Preparat yang ditemukan bakteri bentuk batang Tahan
Asam disimpulkan sebagai BTA positif