You are on page 1of 20

Katedra za analitiku lekova

Procena robusnosti
primenom
eksperimentalnog
dizajna

Katedra za analitiku lekova

Robusnost neke analitike metode mera je njene


sposobnosti da se odupre malim i namernim
promenama u parametrima metode, a ujedno je i
mera pouzdanosti metode tokom rutinske primene.

Robusnost se moe smatrati delom validacije metode koji se


izvodi na kraju razvoja metode ili na poetku validacije.
Tana pozicija ima relativno malo uticaja na nain izvoenja.

Katedra za analitiku lekova

Ciljevi procene robusnosti

procena
kvantitativnosti
metode

sadraj

odreivanje limita za
procenu pogodnosti
sistema

faktor rezolucije, faktor


simetrije, retencioni
faktor

Katedra za analitiku lekova

Koraci u proceni robusnosti


1) izbor faktora koji e se testirani,
2) definisanje nivoa faktora,
3) izbor eksperimentalnog dizajna,
4) definisanje eksperimentalnog protokola,
5) definisanje odgovora koji e se pratiti,
6) izvoenje eksperimenta i odreivanje odgovora metode,
7) izraunavanje efekata,
8) statistika i/ili grafika analiza efekata i
9) izvoenje zakljuaka iz statistike analize

Standardna operativna procedura

Odabir faktora

Definisanje nivoa faktora

Katedra za analitiku lekova

Definisanje odgovora

Izbor eksperimentalnog dizajna

Izvoenje dodatnih
eksperimenata npr.
na nominalnom nivou

Plan eksperimenta

Izvoenje eksperimenata

Odreivanje odgovora

Praenje kvantitativnosti
metode

Procena pogodnosti
sistema

Izraunavanje efekata

Statistika/grafika
interpretacija efekata

Izvoenje zakljuaka
+
Preporuke

Definisanje "uslova sa
najgorim odgovorom"

Odreivanje SST limita

Katedra za analitiku lekova

Izbor faktora i
definisanje nivoa
faktora

Katedra za analitiku lekova

Faktori koji se ispituju u testu robustnosti mogu biti vezani za


proceduru (operacioni faktori) i za uslove sredine (faktori sredine).
Odabrani faktori mogu biti:
kvantitativni (pH rastvora, temperatura, koncetracija rastvora),
 kvalitativni (serija reagensa, proizvoa hromatografske kolone) ili
faktori smee (koncentracija organskog rastvaraa u mobilnoj fazi) .

Katedra za analitiku lekova

Faktori koji se biraju u hromatografiji


Metoda

Faktori
pH mobilne faze
Koliina organskog rastvaraa

Tena hromatografija pod


visokim pritiskom

Koncentracija pufera, koncentracija


soli ili jonska jaina
Koncentracija aditiva
Protok mobilne faze
Temperatura kolone
Za gradijentno eluiranje (poetni
sastav mobilne faze, krajnji sastav
mobilne faze, nagib gradijenta)
Faktori kolone (tip stacionarne faze,
proizvoa, starost kolone)
Faktori detektora
Faktori integracije
...

Katedra za analitiku lekova


Metoda

Faktori
Temperatura injektovanja
Temperatura kolone
Temperatura detekcije

Gasna hromatografija

Za temperaturni gradijent
(poetna temperatura, krajnja
temperatura, nagib gradijenta)
Brzina protoka gasa
Za program gradijenta protoka
(poetni protok, krajnji protoka,
nagib gradijenta)
Faktori kolone (tip stacionarne
faze, proizvoa, starost kolone)

Katedra za analitiku lekova


Metoda

Faktori
Sastav eluenta
pH mobilne faze
Temperatura

Tankoslojna
hromatografija

Duina razdvajanja
hromatograma
Oblik mrlje
Veliina mrlje
Uslovi suenja (temperatura,
vreme)
Zapremina uzorka
Serijski broj ploa
Uslovi detekcije (prskanje ploe
reagensom, UV detekcija,
uranjanje u reagens)

Katedra za analitiku lekova

Odabrani faktori moraju biti oni koji e se najverovatnije


menjati kada se metoda prenosi iz jedne laboratorije u drugu,
sa jednog instrumenta ili analitiara na drugi, a da
potencijalno mogu uticati na odgovore metode.

Katedra za analitiku lekova

ta sa faktorima koji se odnose na smeu?


U smei p komponenti samo p-1 se moe nezavisno menjati.
A - acetonitril
B metanol
C voda
A + B + C = 100
Ako menjamo bilo koja dva faktora, trei mora uvek imati vrednost do 100.
Ukoliko se pokae da jedna komponenta smee ima znaajan
uticaj na robusnost metode, to znai da je sastav smee u celini
znaajan s obzirom da nije mogue kontrolisati samo jednu
komponentu smee ve se mora striktno kontrolisati sastav
smee u celini.

Katedra za analitiku lekova

Kvantitativni faktori

Na primer sastav pufera moe se izraziti


kao koncentracija kisele komponente ili
koncentracija bazne komponente.

Paljivo birati
ta e se
ispitivati

Pre e se
na ovaj
nain
testirati

Mogu se testirati:
a) kao dva razliita faktora ili
b) u kombinaciji koja se izraava kao pH
pufera i/ili jonske jaine ()

Ako se pufer priprema rastvaranjem odreenje koliine soli a


zatim podeavanjem pH, onda e se pH uvek testirati!!!

Katedra za analitiku lekova

Kvalitativni faktori
Na primer kolone (proizvoa kolone, serija kolone, ispitivanje
kolona iste serije itd.)

Izbegavati nemogue kombinacije!!!

"proizvoa materijala od koga je kolona napravljena" i


"serija materijala"
Zato je ovo nemogue?
Odabir dva nivoa za proizvoaa materijala dao proizvoae I i J,
dok odabir dva nivoa za seriju materijala nije mogu s obzirom da se
ne moe definisati serija zajednika za oba proizvodjaa I i J

Katedra za analitiku lekova

Kako sada biramo nivoe faktora?


Ako su kvantitativni ili faktori smee...
Nivoi faktora se obino odreuju simetrino oko nominalnog nivoa
propisanog u operativnoj proceduri.
Interval izmeu nivoa treba da bude odabran tako da predstavlja
granice ire od varijacija faktora koje se oekuje kada se vri
transfer metode.
U najveem broju studija nivoi se definiu od strane analitiara na
osnovu linog stava. Odabir nivoa moe se vriti i na osnovu
preciznosti ili nepouzdanosti sa kojom faktor moe biti podeen i
primenjen.

Katedra za analitiku lekova

Nepouzdanost faktora "pH rastvora"


nepouzdanosti merenja pHmetra

nepouzdanosti kalibracije
pH-metra

pH varira u intervalu pH 0,02 sa


intervalom pouzdanosti od 95%.

pH varira za 0,02 pH jedinice oko


nominalnog nivoa
ekstremni nivoi
se biraju
mnoenjem nepouzdanosti sa koeficijentom k tako da e ekstremni nivoi
biti pH k*0,02. Uobiajena vrednost k je 5, ali se mogu koristi i druge
vrednosti ukoliko analitiar smatra sa su za neke faktore mogui vei ili
manji intervali.

Katedra za analitiku lekova


Za svako merenje moe se definisati apsolutna nepouzdanost:
 Za masu na primer 0,1 mg za analitiko merenje
 Za zapreminu na primer 0,08 ml za sud od 100 ml (odreeno
proizvoaem)
 pH vrednost uzima se greka na poslednjoj decimali
Primer:
Metanol

Voda

Metanol+voda

Zapremina (V)

300 ml

700 ml

1000 ml

Apsoultna
nepouzdanost

1,88 ml

5 ml

6,88 ml

Relativna
nepouzdanost

6,27 10-3

7,14 10-3

6,88 10-3

Odnos apsolutne nepouzdanosti i


zapremine (u ovom sluaju)

Katedra za analitiku lekova

Ako su kvalitativni...
Za kvalitativne faktore, dobijeni rezultati nisu reprezentativni za celu
populaciju faktora kome pripadaju izabrani nivoi, ve samo omoguavaju
trenutno poreenje izmeu dva odabrana nivoa.
Ako je kao faktor ispitivana "hromatografska kolona" i ako su samo dve
kolone ukljuene u ispitivanje robusnosti (kao dva nivoa u 2n
eksperimentalnom dizajnu), nikako se ne moe izvesti globalni zakljuak o
uticaju kolona, jer odabrane kolone ne mogu dokazano biti ekstremni nivoi
za celu populaciju hromatografskih kolona.

Zakljuak o uticaju ovog faktora na robusnost metode odnosie se


samo na ispitivane kolone. Nikakvo uoptavanje, koje bi ukljuilo sve
kolone slinih karakteristika, ne sme da se vri.

Katedra za analitiku lekova

Izbor eksperimentalnog
dizajna

Katedra za analitiku lekova

Za robusnost su bitni samo glavni faktori!!!

Biramo screening design!

Frakcioni faktorski dizajn

Plackett-Burman-ov dizajn

Katedra za analitiku lekova

Plackett-Burman-ov dizajn
 Prvi put se pojavljuje 1946. godine
 R. L. Plackett
 J. P. Burman
 Dizajn koji u svojoj osnovi ima matricu
 Razvijen u ciju unapreenja kontrole kvaliteta procesa

Katedra za analitiku lekova

Kako je postignuto
unapreenje kontrole
kvaliteta procesa?

 Defini
Definie gornji i donji nivo promenljivih
 Pronalazi faktore koji imaju veliki uticaj
 Poma
Pomae efikasnoj proceni procesa
 Poma
Pomae pobolj
poboljanju kvaliteta proizvoda

Katedra za analitiku lekova


Kako je pomae
poboljanju kvaliteta
procesa?
Na vie naina:

1. Rezultati se mogu proveriti bez promene samog procesa jer se


mogu proveriti matematikim putem
2. Na minimum se svodi gubitak novca i vremena
3. Dizajn eksperimenta je zasnovan na statistikim principima
4. Minimalan broj eksperimenata
5. Dobijeni podaci se mogu koristiti za optimizaciju procesa
6. Daje podatke o tome na koje promenljive je proces najosetljiviji
7. Daje matematiki model koji opisuje proces
8. Sa modelom se mogu predvideti sve promene procesa

Katedra za analitiku lekova

Osnovne osobine Plackett-Burman-ovog dizajna:


 Frakcioni faktorski dizajn na dva nivoa
 Omoguava efikasnu procenu glavnih efekata
 Ne uzima u obzir interakcije izmeu faktora
 Primenjuje se u obliku matrice (ema eksperimenta)

Katedra za analitiku lekova

Broj eksperimenata koji se izvodi:

Broj
eksperimenata

Broj faktora

Broj kolona

od 2 do 3

od 4 do 7

12

od 8 do 11

11

20

od 12 do 19

19

24

od 20 do 23

23

Katedra za analitiku lekova

Za definisanje PlackettBurmanovog dizajna


potrebno je voditi rauna o sledeem:

 Izabrati broj faktora (n) koji e biti ispitivani (npr. n=3)


 Za tri faktora broj kolona je 4, tada se jedna kolona oznaava kao
"vetaki" faktor npr. vreme ili dan
 Definisati prvi red koji mora da sadri podjednak broj "" i "+"
oznaka, npr. "+ +" pri emu je etvrti faktor vetaki.
 Ostali deo matrice eksperimenta nastaje ciklinim permutacijama
prve kolone dok se ne dobije broj eksperimenata definisan u tabeli (u
ovom sluaju 4).

Katedra za analitiku lekova

Definisanje plana izvoenja eksperimenata

Katedra za analitiku lekova

Generatori za Plackett-Burman-ov dizajn

Faktori

Generator

++++

11

++++++

15

++++++++

19

++++++++++

23

++++++++++++

Katedra za analitiku lekova

Plackett-Burman-ov dizajn za testiranje 11 faktora izvoenjem


12 eksperimenata
Faktori
A

Odgovor
G

y1

y2

y3

y4

y5

y6

y7

y8

y9

10

y10

11

y11

12

y12

Katedra za analitiku lekova


Odreeni broj faktora je pravi a preostali do N-1 su dummy vetaki faktori.

ta znai vetaki
faktor???

Imaginarni faktor za koga promena sa jednog na drugi nivo nema


fizikog znaaja.

Katedra za analitiku lekova

ta ako je broj faktora


veliki?

Podatke emo podeliti u dve grupe i izvesti dva nezavisna


dizajna.

Katedra za analitiku lekova

Izvoenje robusnosti

Katedra za analitiku lekova

Izvoenje eksperimenata

Tokom ispitivanja u svim eksperimentima koristi se isti rastvor


uzorka ili smee standarda.
Poeljnije je da se eksperimenti definisani dizajnom izvode
nasumino (randomizirano).
Eksperimenti mogu biti podeljeni u blokove na osnovu jednog ili vie
faktora.

Katedra za analitiku lekova

Minimiziranje uticaja nekontrolisanih faktora


Metode koje se primenjuju u farmaceutskoj analizi mogu biti izloene
uticaju nekontrolisanih faktora. Na primer, sve HPLC kolone zastarevaju i
kao rezultat neki odgovori se menjaju u funkciji vremena.
Procena robusnosti kod ovih metoda je uvek korisna s obzirom da e
tano pokazati koji faktori i koliko utiu na odgovor.
Izraunate vrednosti faktorskih efekata mogu biti pogrene ako se ne uzme
u obzir:
 korekcija za nekontrolisane faktore replikacijama eksperimenta na
nominalnom nivou (0) ili
 zamena efekata nekontrolisanih faktora sa efektima dummy
promenljivih

Katedra za analitiku lekova

1) Upotreba ponovljenih eksperimenata replikacija

 Replikacije se obino izvode na nominalnom novou.


 Replikacije se izvode u odreenim vremenskim razmacima (ne
jedne za drugim).
 Na ovaj nain:
(i) proveravaju se karakteristike metode na poetku, tokom i na kraju
eksperimenta,
(ii) procenjuje se uticaj nekontrolisanih faktora,
(iii) eksperimentalno dobijeni rezultati se koriguju zbog uticaja
nekontrolisanih faktora i
(iv) normalizuju se efekti.

Katedra za analitiku lekova

2) Upotreba dummy promenljivih


U PlackettBurman-ovom dizajnu uticaj nekontrolisanih faktora na
faktorske efekte svodi se na minimum odgovarajuim izborom matrice
eksperimenata sa dummy promenljivim.
To se izvodi na sledei nain:
1. Konstruie se plan eksperimenta i procenjuje koja kolona je pod
najveim uticajem nekontrolisanih faktora. To se postie tako to se
svakoj koloni (faktoru) dodeljuje uz predznak koji ima (+ ili -) i
odgovarajui broj ekpserimenta. Dobijene vrednosti se sabiraju:

Katedra za analitiku lekova


Faktori
A

+1

-2

+3

-4

-5

-6

+7

+8

+9

10

-10

11

+11

12

-12

zbir

-10

-8

-18

-28

-16

-4

-2

10

Postaju dummy
to je vea apsolutna vrednost to je vei uticaj nekontrolisanih
faktora.

Katedra za analitiku lekova

Izbor odgovora

Katedra za analitiku lekova

Hromatografija

Kvantitativni

Kvalitativni

odgovori

odgovori

sadraj aktivne supstance


i degradacionih proizvoda

faktor rezolucije, faktor


simetrije, retencioni
faktor...

odreivanje limita za
procenu pogodnosti
sistema

Katedra za analitiku lekova

Rezultati korigovanog odgovora


Izraunava se kada je izvrena procena nekontrolisanih faktora.

yi,korigovano =

( p + 1 i)* ynom,before + i* ynom, after


yi, measured + ynom,begin
p +1

gde i = 1, 2, ...,
p - broj eksperimenata u dizajnu izmeu dva uzastopna nominalna
eksperimenta;
yi korigovani - korigovani odgovor,
yi - eksperimentalno dobijeni odgovor,
ynom - odgovor prvog eksperimenta na nominalnom nivou
ynom,pre i ynom,posle - odgovori izvedeni na nominalnom nivou a koji su
izvedeni pre i posle eksperimenta iji se odgovor koriguje.