Prueba de la catalasa I PRINCIPIO Comprobar la ‘presencia de la enzima catalasa Ul. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 32 a 34.) A) Utilizada originariamente para diferen- Gar entre los géneros. 1, Streptococcus (—) del Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). 2. Bacillus (+) cel Clostridium (—), 3. Listeria monocytogenes (+) ylo Coryne bacterium (+) del Exysipelothrix (-) Excepciones: a) Connebacterium pyoge- nes (—); b) Corynebacterium haemolyt- cum (= B) Ayudar a la diferenciacién de especies: Moraxella bovis (¥) y Moraxella kingié (—) de otras especies de Moraxella (+). III. BASES BIOQUIMICAS La enzima catalasa se encuentra en la mayoria de las bacterias aerobias y anacrobias facultativas que contienen citocromo;*"" la excepcién principal es el Sireptecoccus. Por lo general, los organismos que no poseen el sistema citocromo carecen también de la enzima catalasa y por lo tanto no pueden descomponer el perdxido de hidrégeno.* La mayoria de las bacterias anaerobias (por ejemplo, especies de Clostridium) poseen ta enzima peroxidasa en lugar de la catalasa. Sin embargo, Doelle ? afirma que la prueba de la catalasa no es especifica y puede interferir en la accion de las enzimas peroxidasas. ‘Tanto las catalasas como las peroxidasas entran en la clasificaci6n enzimatica general de “hidroperoxidasas”.' La catalasa ¢s una hemoproteina; el grupo prostético esta for mado por cuatro atomos de hierto trivalente (Fe***-férrico) por molécula* que retiene su. estado oxidado durante la actividad enzimatica.? Burrows y Moulder* sostienen que hay pruebas de que algunas bacterias pueden poseer una catalasa que no contiene hierro. Los estudios efecttrados por Dacre y Sharpe * demuestran una actividad de la_catalasa fuerte y débil entre los lactobacilos. Whitten- bury ™ observé la presencia de dos tipos de catalasa entre las bacterias que producen dcido lictico: 1) la clisica catalasa que descompone el perdxiclo de hidrogeno y que no es sensible a las condiciones acidas, y 2) una seudocatalasa que carece del grupo prostético hem y es sensible a un pH acido, Whittembury ® sugiere que las bacterias que producen Acido lictico poseerian un sistema respiratorio rudimentario por el cual, si se les suministra, una fuente de ferroporfirinas, algunos organismos producirfan una hemo- proteina. Johnston y Delwich demostraron también la presencia de ambos tipos de catalasa entre los organismos Licticos. El perdxido de hidrogeno se forma como un producto terminal oxidativo de la descompo- sicién aerdbica de los azicares. La flavopro- teina reducida reacciona directamente con el oxigeno gaseoso por medio de la reduccién40. Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias de electrones, para formar perdxido de hidrdgeno,'"" y no por accibn directa entre el hidrégeno y el oxigeno molecular." FPH, + Op = FP + HO, Flavoproteina reducidat nt a Flavoproteina oxidada Fl perdxido de hidrogeno, si se_deja acumular, es t6xico para. las baeterias provoca su muerte. La catalasa descompone el peroxide de hidrégeno uw oxida los sustratos secundarios; + sin embargo, no tiene accidn contra otros perdxidos.” La descomposicidn del peroxido de hidré- geno se produce a través de la accién de dos envimas: 1) catalasa (oxidorreductasa del perdxido de hidrégeno), y 2) una peroxidasa, nicotinamida adenindinuclestico (NAD) re- ducido, nicotinamida adenindinuclestico fos fato (NADP) reducido, citocromo ¢, 0 gluta tidn,? En la descomposicién del peréxido de hidrégeno. una moléula actiia como. el sustrato y la otra como un dador; el sustrato reducido por los dtomos de hidrogeno cedidos por el dador, da como resultado un sustrato reducido y un dador oxidado.t H A #0, + H lg cals Sustrato Dador 2 moléculas de peroxide de hidigeno [ecieos > 2H:,0 + O, de agua Otros compuestos, aparte del perxido de hidrégeno, que pueden ser sustratos utiliza- dos por la catalasa, son: varios alcoholes (por ejemplo, etanol), formaldehido hidratado (H.C(OH),), acido nitroso (NOH), y acido formico (HCOOH) ambién pueden usarse sustratos inespecificos como las aminas aromaticas, fenoles y acidos aromaticos." La enzima catalasa puede emplear ¢} peroxido de hidrégeno para oxidar los alcoholes metilico (CH,OH) y etilice (C3H;OH), cedien- do sus correspondientes aldehidos."* El pH Sptimo para la actividad de la catalasa es 7." IV. REACTIVOS A) Perdxido de hidrdgeno, 30 % (Superoxal). 1. Conservar en frasco_ color caramelo. Evitar la innecesaria exposicion a Ta luz. 2. Mantener continuamente refrigerado, cuando no se usa. B) Buffer fosfato (M/15), pH:7. 1. Ingredientes. a) Fosfato. monopotisico (KH.PO) anhidro 2... 1361 g by Fosfato disédico (NasHPO,) anhidro . ©) Agua destilada 2. Método de preparacién. a) Agregar las sales a un pequetio volumen de agua destilada (hery da y enfriada antes de su uso) en un frasco volumétrico de un litro. b) Disolver por agitacion y agregar agua destilada hervida es.p. 1.000 nil Tween 80, 10% 1. Se obtiene el producto en el comercio: BBL-Tween 80 (polisorbato 80)? 2. Método de preparacié a) Agregar Iml de Tween 80 con- centrado a un pequeno yolumen de agua destilada en un frasco volu- métrico de 10 ml b) Disolver por agitacién y agregar agua destilada cs.p. 10 ml El ‘Tween 80 es un_polioxietileno derivado del monooleato de sorbitan, compuesto de actividad en superficie? Control de calidad: E} peroxido de hidré geno debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su uso general. El Staphylococcus aureus y cualquier espe- cie de Streptococcus son buenos controles, ya que se obtienen ficilmente y su conser- vaciénven cultivos madre no crea proble- mas. S. aureus: prueba fuertemente posi- tiva; especies de Streptococcus, prueba negativa, Si sobre una placa de agar sangre se coloca una gota de peréxido de hidré- geno se observa una enérgica produccién, de burbujas y espuma, debida a la presencia de catalasa en los eritrocitos. Puede utilizarse una placa de agar choco- latado como control negativo, ya que en ella se han destruido los globulos san- guineos.” El peréxido de hidrégeno (Superoxal) es muy inestable y debe pasar por un 1,420 g 1.000 ml Cc)Prueba del citrato 1. PRINCIPIO Determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como tinica fuente de carbono para el metabolismo, provocando alealinidad. WI. OBJETIVO (Véase también la Seccién IIT, Capitulos 32 a 34) A) Ayudar a la diferenciacién entre los géneros. 1. Edwardsiella (=) de Salmonella (por to feneral +), 2. Serratia liquefaciens (+) de Yersinia pseudotuberculosis {por lo general ~) y Y. enterocolitica (~). 3. Klebsiella (+) de Actinobacillus equui ©. 4. Grupos Klebsiella general +) de nterobacter (por lo Excherichia coli (—). B) Ayudar a la diferenciacién de las especies. 1. Aeromonas hydrophilia (por lo general +) de la Aeromonas salmonicida (=), 2 Bordetella pertussis (—) de otvas especies de Bordetella (+). Moraxella osloensis (+) y Moraxella phenylpyronvica (©) de otras especies de Moraxella (—). 4. Proteus rettgeri (+) del Protens morganii (-). 5. Psendomonas cepacia (+) de la Psendo- monas maltophitia (—) III. BASES BIOQUIMICAS Algunas bacterias pueden suministrar ener- gia en ausencia de fermentacion 0 produc- ci6n de acido Lietico "™ empleando el citrato como tinica fuente de carbono. Normalmen- te, el metabolismo del citrato comprende una condensacién de acetilo con la coenzima Ay oxalacetato " para entrar en el ciclo de Krebs. EI metabolismo del citrato por la mayoria de las bacterias es ripido a través del ciclo del icido tricarboxilico o el ciclo de fermentacién del citrato.” En las bacterias, el desdobla- miento del citrato comprende un. sistema enzimitico sin la intervenci6n de la coenzima A, Esta enzima se denomina citritasa (citrato oxalacetato-liasa) ™ 0 citrato desmolasa." La enzima requiere un catién bivalente para su actividad, que es suministrado por el mag- nesio 0 el manganeso.” Originariamente se pensé que la descom- pos ial del citrato daba oxalacetato (la sal del acid oxalacético) y acetato (la sal del dcido acético)." Sin embargo, se considera actualmente que el oxalacetato y el acetato son intermediarios en cl metabolismo del ato." piruvato + COs Los productos obtenidos del metabolisme del citrato dependen del pH del medio." " $i el pH aumenta (alcalino), se producen mis acetato y formato, con una disminucién de ka produccién de lactato y COz."* Por encima de pH 7 no hay produccién de lactato y los productos son: 546 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias Gitrato + CO. + acide finmiien + 2 tcido accion Con un pH acido, el acetilmetilcarbinol (acetoina) y el lactato son los. principales productos ‘de utilizacién del. citrato,! Independientemente de los productos ter- minales producides, el primer paso dela fermentacion del citrato da por resultado ke produccin de piruvato. La degradacion del piruvato depende, entonces, del pH del medio." Cinaio > oxilacerate + acetate, Osalacetato — pinwate + CO, pit alvatine Piruyato — acetate + formate, PH sicido 2 Pinuvate — acetate + CO, + lactate 2 Piraata > acotwinta + 2.CO, El medio utilizado para a fermentacion del citrato contiene también sales de amonio inorganicas, Un organismo que es capaz de utilizar citrato como su tinica fuente de carbono utiliza también las sales de amonio como sur inica fuemte de nitrégeno, Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NHs) con la consiguiente alcalinidad. Deffner v Franke * * han postulado que la utilizacion “de citrato_ por. el Enterobacter acrogenes (Aerobacter) originaba los siguientes productos: 1 Citrate + 7 acetate + 5 CO, + formate + succinate La_utilizacion de acidos orginicos y sus sales como fuente de carbono produce carbonatosy bicarbonatos alcalinos en la nueva degradacion.” IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Medio de citrato de Simmons, pH 6on%m 1, Ingrediemtes. a) Sulfato de magnesio (MgSO,) 02 g b) Monofosfato de amonio o fosfato de amonio dihi- drogenado (NH)H.PO, 1g ©) Fosfato dipotasico (KyHPO,) ees 4) Citrato de sodio (2.77 g de citrato de sodio, 5 1/2 de HO) 28 ©) Clorure de sodio 5 og Agar aw ¢ g) Azul de bromotimol (solucion alcoholica al 15%) 0.08 g hy Agua destilada 1000 mt Indicador del pH: azul de bromo- timol a) Acido: color amarillo (no se obser- va). pH: 6. b) Alealino: color azul de intenso. pH: 7.6. ©) Medio no inoculado: 1) pH: 6.9: 2) color verde Prusia Existen productos comerciales a) Difco. b) BBL, Método de preparacion a) Pesar exactamente la cantidad de acuerdo con las indicaciones del prospect. b) Rehidratar con. desmineralizada. ©) Calentar swavemente hasta su diso- lucion. ) Colocar aproximadamente 4a 5 ml en cada tubo (pico de flanta largo, con poca profundidad). gua cestilada 0 Método de esterilizacion. a) Autoclave, b) 121° C, 15 libras, 15 min, Dejar que el medio solidifique en posicién inclinada. Enfriar antes de su empleo y refr gerar para su conservacion (4-10° C Tnoculacion, a) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h (cultivo en AHK u otro medio adecuado) b) Inéculo fiviano.» ©) Unicamente en cola de pescado sobre un medio en pico de flauta, Incubacién. a) 35°C, b) 24.48 h, A veces es necesari unaincubacién mas prolongada (hasta 4 dias)." El medio de citrato de Simmons es una modificacién del medio original de Koser con el agregado de 1.5 % de agar, y un indicador del pH, azul de bromotimoi."* Puede incorporarse en el medio como fuente de carbono citrato de sodio 0 citrato de potasio."* B) Medio de citrato sulfuro de Christensen, pH: 67.552 1. Ingredientes. a) Citrato de sodio g b) Glucosa g ©) Extracto de levadura g ) Monoclorhidrato de cisteina ol og ©) Citrato férrico de monio o4 g f) Fosfato monopotisico 1 g ) Cloruro de socio 5g h) Tiosulfato de sodio 0,08 g i) Rojo de fenol O01 g g p Agar 15 ) Agua destilada 1000 ml 2. El medio de citrato sulfuro de Chris- tensen permite poner a prueba la utilizacion del citrato en presencia de nitrégeno orginico, monodorhi- drato de cisteina."" Sino se quiere determinar la produccién de sulfuro de hidrdgeno se_podra climinar del medio el citrato férrico de amonio y el tiosulfato de sodio, ya que ellos no imerfieren en la utilizacion del ci- trato.® " Indicador del pH: rojo de fenol. a) Acido: color amarillo, pH: 6.8. b) Alcalino: color rojo rosado, pH 8.4. ©) Medio no inoculado: 1) pH 2) color crema a cobrizo (ante) 4. Existen productos comerciales. a) Difco. b) BBL. Proceder de la misma manera que cuando se emplea medio de citrato de nmons en cuanto a la preparacién, esterilizaci6n, almacenamiento, inocu- laci6n e incubacién Citrato 47 V. RESULTADOS Los resultados pueden verse en las fotogrofias en colores de la figura 6-1 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACIONES A) Medio de citrato de Simmons. 1. Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico de fauta 2. Prueba negativa: no se observa creci- miento ni cambio de color (verde) B) Medio de citrato de Christensen. 1, Prueba positiva el pico de Mauta 2 Prueba negativa: no se observa cam- bio de color (ante) color rojo rosado en VII. PRUEBAS RAPIDAS A) Prueba de la sangre citratada.” 1, Método de Cordaro y Sellers.* 2. Principio: demostrar la fxcultad de un organismo de utilizar el citrato que se encuentra en la sangre citratada para formar un coagulo, 3. Medios. a) Diluyente del indculo. 1. Ingredientes a) Caldo de infusién de cere- bro deshidratado (CIC), 12.5 gilitro. b) Cloruro de calcio (ClCa), > 100 mg. 6) Clorure de sodio (CINa), ae 2. Preparacién. » a) Distribuir en frascos con tapa a rosca (volumen 120 ml) 85 ml caldo/frasco. b) Poner en autoclave a 121° C, 15 libras, 15 min. 3. Refrigerar pai cién (4-108 ©). su conserva b) Medio de prueba.48 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias 1. A un frasco de CIC agregar ) Seguir las indicaciones del fabri- asépticamente 15 ml desangre de ante. baneo citratada vencida. b) Es esencial un inéculo. espeso.%® 2. Merclar y empleando técnicas asépticas distribuir con una pie 4. Correlacion con los métodos de pru peta I mlen pequenos tubos de ba standard. nsayo estériles. Preparar sola mente el mimero de tubos nece- a) 96,8 %? sarios para un lote de pruebas. b) Escasa correlacién con la prueba 3. EL resto de la mezcla caldo- del citrato de sangre se mantendri refrige- reproductibi vada 1 a 2 meses. ©) Falsos_ positives y_ falsos_nega- tivos."* 4, Inéculo. d) Falsos positives con el Proteus morganii.® a) Crecimiento de un cultivo puro de e) Es dificil interpretar una tira débil- 18 h, en AHTA. b) Indculo espeso, la cantidad que alcanza a recoger el asa de inocu- lacién, 5. Incubacién. 35° C. 1 a 3,5 h. a) Puede ser necesaria una incuba- cién més prolongada, hasta 6,5 h. b) Examinar los tubos cada hora. 6. Interpretacién. a) Prueba positiva: presencia de un coagulo firme. b) Prueba negativa: no hay forma- cion de coagulo; el. medio se mantiene homogéneo. La presencia de codgulo en la prueba de la sangre citratada es indice de utilizacién del citrato.* Segiin Cordaro y Sellers,’ es esencial un medio de inéculo nutritivo, pero no usar solucién fisioldgica ni uno que contenga glucosa (que retarda el tiempo de coagu- facion). Se incorpora al medio una pequeia cantidad de cloruro de sodio (2,5 g) para impedir la lisis de los eritrocitos." Se prefiere la sangre entera y no el plasma porque tiene un tiempo de coagulacién mas ripido y ofrece la ventaja de que no necesita centri- fugacién. B) Tiras para la prueba del citrato impreg- nadas con reactivo (Pathotec). 1. Fabricante: General Diagnostics Divi- sion, Warner-Lambert Company. 2. La identificacién rapida de las Entero- bacteriaceae se obtiene en el término de 4h. 3. Método, A) D) mente positiva por el color produ- cido por una reaccién negativa.™ VIII. PRECAUCIONES Puede haber variaciones en la inten: del color producido en una prueba de citrato positiva, debido a las diferencias en los lotes de indicadores del pH que se encuentran en el comercio. Si se usa un inéculo grande para estriar el cultivo en pico de flauta, puede obtenerse en éste un color amarillo claro a cobrizo, sin afectar el medio de mas abajo." Sin embargo, este color no indica una reaccién positiva. También un inécu- lo demasiado espeso puede dar un faiso resultado positivo.* Cuando se inocula una baterfa de sustan- cias bioquimicas con el mismo cultivo, pasar por la llama la aguja o el asa de joculacién antes. de estriar el_medio citratado, 0 inocularlo primero. El tras- paso de glucosa u otro nutriente al medio de citrato puede producir una falsa reacci6n positiva. Vaughn y col! demos- traron que si se introduce en el pico de flauta de citrato una sustancia facilmente metabolizada como la peptona, glucosa 0 acetato, el citrato resultara metabolizado. Matsen y Sherris ® y Branson * recomien- dan diluir el indculo en solucién fisiolé- gica antes de inocular el citrato para evitar el traspaso de otras fuentes de carbono. Después de 24 h de incubacién, un organismo citrato positive puede mostrar una ligera alcalinidad, apenas visible en cl pico de flauta. Si se tienen dudas en cuanto a la interpretacion, compararlo con un tubo de citrato no inoculado. Algunos organismos citrato positivos ne- cesitan la incubacion durante 48 h o mas para que se produzca un cambio en el pH.FE) Weaver y col recomiendan que cuando se utiliza la tra de citrato impregnada con reactivo, para dar validez a los resultados habra que tener en cuenta lo siguiente: 1) usar un inéculo espeso; 2) tomarlo de un cultivo en pico de flauta de Citrato 49 agar hierro triple azucarado (AHTA) en vez de agar con tripticasa de soja (ATS), que muestra tendencia a dar resultados débilmente positivos o falsos negativos, y 3) aumentar el tiempo de incubacion de 4a 6 bh si las reacciones son dudosas. BIBLIOGRAFIA BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, 5th ed., Cockeysville, Md.: Division of BioQuest, Division of Becton, Dickinson and Company, 1968, p. 99) Borchardt, K. A. (1968) Scheme for screening and identifying enteric and other gram negative bacteria using re- agent-impregnated strips. Am. J. Clin. Pathol., 50, 129. Branson, D. 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PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar el indol de la molécula wipts- fano. I. OBJETIVO (Véase también la Seccién I, Capitulos 33 y 34.) A) Ayudar a la diferenciacién entre los, generos, 1. Edwardsiella (+) de Salmonella (-). 2. Escherichia coli (por lo general +) de Klebsiella-Enterobacter (por lo gene- ral =). B) Ayudar ala diferenciacién de las especies, 1. Bacillus alvei (+) de otras especies de Bacillus (-). 2. Haemophilus haemoglobinophilus (+) y Haemophilus influenzae (+) de otras especies de Haemophilus (generaimen- tex). 3. Pasteurella multocida (+) y Pasteurella feumotropica (+) de la Pasteurella haemolytica (—) y Pasteurella ureae (—). 4. Proteus mirabilis (—) de otras especies de Prottus (+). IIL. BASES BIOQUIMICAS El tript6fano es un aminodcido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indélicos principales: indol escatol (metilindol) e indolacético (IAA- indolacetato).*"*"* Diversas enzimas intrace- lulares que intervienen en este proceso reciben el nombre colectivo de “triptofanasa”, Jo que indica un sistema completo de enzimas vinculadas con la produccién del indol."* NH ct -G—coon Cort w L-Triptéfano 1 ° A I) i -CH:—-C—COOH C — ro——._ { Aye Desaminadon QA i i Indolpiravieo Indot 1 yy cHcH Cryer i Indolacetaldehido t ~y—-cH.cooH CJ e i Acido indolacético Gndolacerato), incubacidn de conto término L Decarboxilacién Cla Escatol (metilindot) incubacién de largo términoSAY? __am Triptofanasa HO Lariptéfano —Desaminacién EI principal intermediario en ta degrada- cidn del wipt6fano es el acido indolpirwvico, del cual puede formarse indol por desamina~ cion, y escatol por decarboxilacién del acido indolacético.* En la pagina anterior se ilustra la degradacién del tript6fano. in vitro. PRINCIPALES METABOLITOS INDOLICOS PRODUCIDOS Reproducido en forma abreviada de Yoko- yama, M. T. y Carlson, J. R., 1974. Appl. Microbiol, 27: 540, con’ autorizacién de la American Society for Microbiology. La enzima viptofanasa caualiza la reaccion de desaminacion," atacando la molécula Uiptfano solamente en su cadena lateral y dejando intacto el anillo aronxitico en la forma de indol.” Véase formula arriba. La desaminacion y la hidrdlisis tienen lugar con el agregaco de una molécula de agua en presencia de la enzima wriptofanasa y el piridoxal {ostato como coenzima. En I dlesaminacion, es extraida la porcion amina (NH) del aminoacido con la liberacion de una molécula de amoniaco. Existen dos tipos de desaminacién: oxidativa y recuctiva, La desaminacion oxidativa extrae el grupo NHz de un aminosiciclo v se agrega un doble enlace al producto desaminado (an compuesto no saturado} junto con la formacion de NH ¥ energia.” Véase formula al pie de la pagina La desaminacion por ef triptofano es del tipo reductor, por lo cual es extraido el NHz y liberado como NHy y energia, que es utilizada por la bacteria, La degradacion del triptofano libera indol dicido pintivico, amontaco y energia, El ticido pirtvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucolitico, 0 entrar en el ciclo de Krebs para liberar COz, HzO y una gran produccién de energia. EI NH, puede ser utilizado para sintetizar nuevos aminoi- cidos empleando la energia que se encuentra para la reaccién anabilica EL indol, desdoblido de kx molécula tripto: Desaminacién oxidativa R—C—COOH i TRO NH, Aminosicido Indol Indo! 105 ° os 4 -CH:-CH—COOH 7 I Core [CJ + c—t-coon + ws ~ i Acido pirdivieo Amonineo fano, puede ser detectado por un reactive que posea una combinacién quimica que produzca un color definido, La presencia 0 ausencia de formacién de indol se emplea para la identificacion bacteriana. IV, MEDIOS EMPLEADOS A) Caldo de wiptétano 0 de peptona 1. Ingredientes. a) Medio basico, 1, Peptona: una fraccién proteica 2. Cloruro de sodio. b) Tript6t porarse en el caldo de concentracién del 1% ‘ano: variable, puede incor- peptona en 2.” Existen productos comerciales. a) BBL: Caldo con peptona y wipti- casa (caldo de wiptofano). b) Difco: Caldo de triptona, 3. Método de preparacién. a) Pesar exactamente las cantidades segtin las indicaciones del prospec- to. Los diferentes productos pue- den variar ligeramente. b) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. c) Calentar suavemente hasta su diso- lucion Distribuir en wos, aproximada- mente 4 ml por tubo. d) 4. Método de esterilizacién. a) Autoclave, by 121°C, 15 libras, 15 min. Dejar enfriar antes de su empleo y Tefrigerar para su conservacién (4-10°C). *R—G—COOH + NE + Enetgia I ° Acido ceténico106 Pruebas bioquimicas pars la identificacién de bacterias 6. Inoculaci6n. a) Inéculo liviano."* b) Crecimiento de un cultivo puro de 18.a 24h en AHK. 7. Incubacién, a) 35°C. b) 24a 48h 8. Agregar reactivo de Kovacs o de Ehr- lich directamente al tubo incubado, antes de intentar una interpretacién. B) Medio de caseina. 1. Sino se consigue un producto comer- Gal, puede prepararse un digesto pancredtico de solucién de caseina. a) Ingredientes. 1. Digesto pancreatico de caseina 2g 2. Cloruro de sodio 05g 3. Aguadestilada 100ml b) Método de preparacién. 1. Disolver_ por medio de un calentamiento moderado. 2. Distribuir en tubos en canti- dades de 4 ml. ¢) Método de esterilizacién. 1. Autoclave. 2. 121° C, 15 libras, 15 min d) Proceder de la misma manera que cuando se emplea el medio co- mer 2. La easeina contiene 12 g de triptéfa- no por cada 100 g."* V. REACTIVOS EMPLEADOS A) Reaccidn del indol de Ehrlich? 1. Ingredientes. a) p-dimetilamino- benzaldehido, 2g b) Alcohol etilico (absolut) 190 ml ©) HCl (concentrado) 40 mi 2. Método de utilizaci6n. a) Agregar I ml de éter a un tubo de caldo’ incubado de 24 a 48 h. b) Esperar a que el éter suba hasta la superficie del medio, c) Agregar suavemente 0,5 ml de reactivo de Ehrlich al tubo, incli- nandolo para que el reac deslice por la pared del tubo. B) Reaccién del indol de Kovacs Ingredientes. a) Alcohol amilico o isoamilico (puc- de sustituirse por alcohol buti- lico) 150 ml b) p-dimetilamino- benzaldehido log ) HCI (concentrado) 50 ml 2. Método de preparacién. a) Disolver el aldehido en el alcohol. b) Agregar lentamente cl acido a la mezcla aldehido-alcohol. 3. Método de utilizaci a) Agregar 5 gotas de reactive de Kovacs directamente a un tubo incubado 24 a 48 h. b) Agitar suavemente el tubo. ©) Gualquiera que sea cl reactive empleado, si se hace la prueba de produccién de ndol en un tubo incubado 24h, se recomienda retirar asépticamente para la prueba una porcion de 2 ml 1. La reaccién positiva después de 24h indica una prueba completa. 2. Siel cultivo de 24 h es negativo, debe- ra ineubarse otras 24 hy repetirse la prueba. D) Control de calidad: Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos antes de su empleo general. La E. coli y las especies de Klebsiella resultan controles convenien- tes para control porque se obtienen facilmente y no ofrece problemas su acién en cultivos madre. E. cali reaccién del indol positiva; especies de Klebsiella: reaccion del indol negativa E) Conservacion: Guardar ambos reactivos en el refrigerador (4° C) mientras no seesen_ Su estabilidad es variable, por lo tan- to se hara todas las semanas un control de calidad, desechandolos si muestran una reaccién debil o negativa con un organis- mo positive conocido. F) Quimica de la reactividad: Cuando existe indol, éste se combina con el aldehido que se encuentra tanto en el reactivo de Kovacs como en el de Ehrlich, para dar a q NCH, p-Dimetilamino- Indol henzaldehido un color rojo en la capa de alcohol."® Esta reaccién se produce por un proceso de condensacién formado por un desdobla- miento acido de la proteina."* La reaccién de color se basa en la presencia de la estructura pirrélica en el indol. + Estructura pirrélica La estructura pirrélica puede reaccionar en sus formas tautoméricas (cuando se encuen- ta en solucién, algunas de las moléculas alteran su disposicién ce manera que se encuentran dos formas):* Los grupos CH: en cualquiera de las formas pirtdlicas permiten la condensacién con el aldehido en un método en dos etapas. Véase figura en pagina siguiente. Una quinona o una estructura de tipo quinoide es un importante compuesto que produce color. o={)=0 auinon Las etapas I y 2 de la reaccién se producen inmediatamente cuando se emplea el reactivo p-dimetilamino-benzaldehido en HCl con- centrado. Indol 107 Los derivados del pirrol_muestran_ las mismas reacciones de condensacién siempre que tengan un grupo CH intacto en posicién a 0 Ben relacidn con el grupo ciclico NH."* La capa alcohélica extrae y concentra el complejo de color rojo. Este complejo es soluble en éter etilico, alcohol etilico, alcohol isoamilico, alcohol amilico 0 alcohol butilico. Hcl —alcohol__, Color rojo violiceo Condensacién oo nfo viol por ealentamiento VI RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en lo Figura 14-1 (Apéndice 1). VII. INTERPRETACION: CUALQUIERA DE LOS REACTIVOS A) Prueba positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohdlica. B) Prueba negativa: no se produce color en. la capa alcohdlica; toma el color del reac tivo de Kovacs 0 de Ehrlich (amarillo). ©) Variable (+): un color anaranjado en la superficie del medio debido a desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser un precursor de la formacién de indol.” VIII. PRUEBAS RAPIDAS A) Prueba de la mancha del indol. 1, Método de Vracko y Sherris.” 2. Reactivos; existen varios (véase el Apéndice V). a) Kovacs: p-dimetilamino-benzalde- hido (DMABA). 1, Fabricante: Eastman Organic Chemicals. 2. Solucién al 5% en alcohol amilico acidificado (8 ml de alcohol amilico en 1 ml de HCI concentrado)108 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bocterias cHO HC. =H.0 HC- Nica) Estructura pirrélica —_ g-dimetilamino- del indo Conrado b) -p-dimetilamino-benzaldehido. 1. Sohucién al 1% en HCI con- centrado al 10 % (viv). 2. Prepararlo fresco cada cuatro meses. 3. Detecta de 6 a 12 yg de in- dol/ml.” 4. Esel reactivo mas estable y mais econdmico, ©) p- dimetilamino - cinamaldehido (DMACA). 1. Analogo vinilico del DMABA.2” 2. Fabricante: Aldrich Chemical Company, Ine 3. Solucién al 1% en HCl con- centrado al 1 % (v/v). 4. Preparar fresco cada 2. meses. 5. Detecta 3 ug de indol/ml 6. Es el reactivo mas sensible 3. Inéculo. a) Cultivo pwo de 18 a 24 b, en agar sangre de carnero (ASC). b) Es preferible, cuando ello es posi- ble: agar sangre con tripticasa de soja, 5 % de sangre de carnero.'"* 4. Método. a) Papel de filtro Whatmann N° 1 (9 cm). 1, Colocar en la tapa de una cipsula de Petri. 2. Humedecer con | a 1.5 ml de reactivo de Kovacs (oalguno de Jos mencionados anteriormen- te). N CH: NCH) 1, = -cu-{ ani LTO tT {* € \-xena @ 2 Compuesto quinoidico rojo viokiceo b) Extender el indculo en el papel de filtro humedecido. Pueden reali- zarse muchas pruebas en un solo papel de filtro, 5. Interpretacién, a) Indol positiv.”* 1. Kovacs: Castafio > purpura rojizo— color rojo. 1a 3 min, DMABA: Color rosado a rojo. 1a3 min. 3. DMACA: Color azul o verde, a los pocos seg. ra b) Indol_negativo: color blanco a amarillo. B) Microtécnica del indol. 1. Método de Arnold y Weaver. 2. Medios: dos opciones. a) Caldo 1 1. Triptona, 1% 2. Extracto de carne, 0,3 %. b) Caldo 2. 1. Triptfano, 0,03 % 2. Peptona, 0,1 %. 3. Fosfato de potasio (KsHPO,). 0.5%. ©) pH, 6ptimo para la produccién de indol: 7.47.8. ) Distribuir alicuotas de Iml de 108 Lubes de ensayo aldo en pequ (LO x 75 mm),1 No es necesaria una este absoluta." 2. Noes necesario taparlos 3. Reactivo: Kovacs. o ©) Ti a) Debe ser fresco. b) Solvente preferido: alcohol isoam lico, Método. a) Calentar previamente los tubos de caldo; requisito absolute. 1. Bano de agua 37° C. 2. Abrevia el tiempo necesario para la produccién del indol.! b) Indculo denso." i & Preferido: de agar o caldo de uiptona. Alternativa: cualquier_medio de triptéfano 0 medio sintético que contenga triptofano. ©) Agregar 4 gotas de reactive de Kovacs fresco, Incubacién, a) Preferida: bao de agua a 37° C. b) 6m a 2h. Interpretacion a) Indol positive: color rosado a rojo en la capa de alcohol, b) Indol negativo: no hay cambio de color; ef medio se mantic ne amari- Ho claro. a impregnada con reactive para la prueba del indol (Patho Tee) 1 Fabricante: General Diagnostic Divi- sion, Warner Lambert Company Resultados: dentro de las 4 h de ineu- bacién, Método: seguir las indicaciones del fabricante, : Correlaci6n con las pruebas estandar, a) 99,9 % 99% y 99 G2 b) Falsos negativos con especies de Proteus indolpositivas.® 1 Buena correlacién si el inéculo ha sido tomado de un caldo2® Indol 109 2. Algunos falsos negativos cuan- do proviene de un medio sé do, especialmente AHTA.” ©) Ocasionales Falsos positivos27 Los estudios realizaclos por Weaver y col.” indican que se producen resultados falsa- mente negativos cuando se toma el indculo de picos de flauta de agar hierro wiazucarado (AHTA); recomiendan agar con tripticasa de soja (ATS) que muestra una excelente corre- lacién. IX. PRECAUCIONES A) Cuando se emplea un caldo de peptona en lugar de triptfano para la prueba del indol, debe controlarse el medio con un organismo_productor de indol_ posi conocido. Esto permite determinar peptona ¢s adecuada para la produccién del indol y, asimismo, el periodo de incu- bacion éptimo necesario.” Se encuentran en el comercio diferentes lotes y varie- dades de medios de peptona, algunos de los cuales resultaron inconvenientes para la produccién del indol por la insuficien- fe concentracién de triptéfano que con- tienen No debe emplearse para la deteccién del indol un medio de peptona que contenga glucosa, La formacién det indol se produ- ce solamente con aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono. Los organismos que utilizan hidratos de carbono por wn proceso oxidativo son incapaces de producir in- dol." La elevada acidez producida por la mentacion de la glucosa puede impe- dir el crecimiento del organismo ‘0 inhi- 1 la enzima." El agregado de triptéfano estimula la produccién de indol mientras que la glucosa la inhibe.! #38 ©) Algunos organismos forman indol pero lo descomponen con la misma rapidez con que es producide; por lo tanto, puede producirse una reaccin falsamente ne- gativa” Esto ocurre sobre todo entre algunas especies de Clostridium. D) EF pH optimo para la actividad de la actividad de la triptofanasa es ligeramen- te alcalino (pH:7.4 a 7,8); la disminucién del pH (hacia la acidez) provoca una reduccion en la produccién de indol™ y una posible reaccién falsamente negati va o débilmente positiva E) Los cultivos que se van a someter a las pruebas de produccién de indol deben ser B110 Pruebas bioquimicas para ia identificacién de bacterias F) incubados_aerdbicamente. El descenso de la tensién del oxigen disminuye la produccion de indo." E] reactivo de Kovacs debe ser frese embargo, puede conservarse varios dias enel refrigerador (4-10° C). Sise deja a la temperatura del ambiente durante un tiempo, cambiar’ el color (amarillo a cas- tafio) y se hari menos sensible.! Los reactivos deben guardarse en frascos de color caramelo con tapa de vidrio. Si el inéculo es de un cultivo mixto de Organismos indol positives y negativos cuando se realiza la prueba de la mancha, pueden producirse reacciones débilmente 6 falsamente positivas. Es fundamental obtener un cultivo puro. Utilizar para la prueba una sola colonia, bien aislada También debe cultivarse el indculo en un medio que favorezca la produccién de indol: un medio de wiptona o tiptofano. No resultan aceptables el agar de Mac Conkey (MAC) 0 con eosina ¥ azul de metileno (EAM), dado que contienen’ indicadores que podrian trasmitir su color al papel de filtro humedecido con ficido. dando. lugar a_ interpretaciones de color falsamente positivas. BIBLIOGRAFIA 1. 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AHK y a) Escherichia (Alkalescens - Dispar) anaerogénicas, sin motilidad b) Enterobacter hafniae c) Serratia d) Salmonella enteritidis bioserotipo pa- ratyphi A ©) Shigella. £) Proteus morganii g) Proteus rettgeri h) Providencia Alealinofacido, gas, SHx: AHK y ©) Citrobacter A) Sabnonelta typhi €) Otras especies de Salmonella (es- pecies tipo: S. enteritidis y S. chole- rae-suis) £) Proteus mirabilis 8) Proteus vulgaris5. Alcalino/alealino_o alealino/sin.cam- bio: AHK y AHTA. a) Alcatigenes faecalis b) Acinetobacter (Tribu Mimae; He- rellea y Mima) ©) Pseudomonas aeruginosa B) Ayudar a la especificacién en_género: Yersinia enterocolitica (AHTA, dcido/aci de Y. pestis AHTA, alcalinoficido) y ¥. pseudotuberculasis (AHTA, alcalino/acido). TI. BASES BIOQUIMICAS El agar hierro de Kligler (AHK) y el agar hierro triplemente azucarado (AHTA) son medios diferenciales en tubo que sirven a un doble fin: 1) determinacién de las fermenta- ciones de los hidratos de carbono, y 2) determinacién de la produccién de’ acide sulfhidrico. Un organismo puede utilizar diversos sustratos incorporados en el medio; los diferentes sustratos metabolizados son utilizados para la diferenciacién entre varios prupos, géneros o especies, sobre todo entre las Enterobacteriaceae. El medio AHK contiene dos hidratos de carbono: lactosa, con concentracién del 1%, y glucosa, en concentracién del 0,1 %. Este medio puede sustituirse por AHTA; la diferencia fundamental es el agregado de un tercer hidrato de carbono, sacarosa, en con- centracién del 1 %. Sin embargo, los funda- mentos bioquimicos son los mismos y por eso s6lo trataremos con detalle el AHK. En el medio AHK, algunos organismos tienen la facultad de fermentar ambos hidra- tos de carbono; otros fermentan solamente la cosa; y otros, atin, no son capaces de fermentar ni la lactosa ni la glucosa. La fermentacién del hidrato de carbono puede producirse con produccién 0 no de gases (CO. + Ha) La fermentacién se produce aerdbicamente (en el pico de flauta) y anaerébicamente (en la capa inferior del cultivo). En el pico de flauta, el monosacirido glucosa es catabolizado inicialmente por medio del ciclo anerdbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar el intermediario clave, acido pirtivico. A su vez, este acido es degradado por medio del ciclo de Krebs, por los aerobios 0 anaerobios facultativos, para dar COs, H,O y energia, Ambos ciclos, el de Embden-Meyerhof y el de Krebs, comprenden etapas en serie que producen muchos intermediarios; en cada Pruebas con agar hierro de Kligler 113 etapa inter La lactosa es un disacirido formado por dos unidades de monosaciridos: glucosa y ga- lactosa. Begalactosidasa Lactosa sglucosa + galactosa Ciclo de Krebs Ghucosao galaetosa <2 C01 + HO +energia En la capa profunda del cultivo en AHK, existen condiciones anaerébicas por la cuales es metabolizada la glucosa a través del ciclo de Embden-Meyerhof, en ATP y el intermedia- rio clave, dcido pinivico, que después es convertido en diversos productos. finales estables; aicido ictico yiu otros acidos orgi- Idehidos, alcoholes, CO,, H, y energia, i ‘cidos orginicos Ghucoca Cit? de Emden Meyernae § ido ong ~~ anaersbico—”- Yaleoholes Con's He energta Las reacciones en AHK se utilizan primaria- ‘mente para la identificacién de miembros de las Enterobacteriaceae (entéricos) que son, por definicidn, bacilos gramnegativos catalasa positivos, todos los cuales fermentan el hidrato de carbono glucosa en Acido. Asimismo, existen muchos bacilos intestinales gramne- gativos no entéricos, a cuya identificacion 0 separacion de las Enterobacteriaceae ayudan las reacciones en AHK. Se han observado tres formas basicas de fermentacién en el medio AHK: 1) fermenta- cidn de la glucosa solamente, 2) fermentacién tanto de la glucosa como de la lactosa, y 3) no fermentacién de la glucosa ni de la lactosa, Para los fines de identificacin es esencial que se interprete la fermentacin de los hidratos de carbono en todas los tubos con AHK, al término de 18 a 24 h de incubacién, Una interpretacién prematura o demorada dara formaside fermentacién no validas que llevaran a errores en el agrupamiento de organismos entre las Enterobacteriaceae 0 en la identificacién del género, 0 del género y la especie. Fermentacién de la glucosa solamente (alcalina/acida) La primera forma de fermentacién en AHK después de 18 a 24h de incubacién es tun pico “de, Mlauta alcalino yuna capa profunda acida (alcalina/acida), Esta reaccion se observa en los organismos capaces de fermentar solamente la glucosa; son no fer- mentadores de la lactosa114 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias EL pico de flauta es alcalino (rojo), lo que indiea que se ha producido la degradacién aerébica de la glucosa. Después de 18 a 24h de incubacién’ la baja concentracién de glucosa (0.1%) ha sido consumida por completo y el organismo comienza a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio para obtener los nutrientes para su cre miento. El catabolismo de la peptona produce la liberacion de amoniaco (NH,) dando un pH alealino con el rojo de fenol, indicador del PH incorporado en el medio. Sin embargo, en la capa profunda del AHK se observa un color amarillo debido a la degradacion anaerdbica de la glucosa. Aqui, la glucosa también es degradada después de 18a 24h de incubacion; sin embargo, se forman_ productos terminales cidos dando un pH dacido (color amarillo). Si se lee mas pronto un organismo fermen- ador de la glucosa en AHK, por ejemplo, 12h o menos, el pico de Mauta serfa dcido, dado que en tan breve tiempo la glucosa ain Eee eran isleceplcameni yee una reaccién falsa. El microbiélogo interpre- tarfa que el organismo es capaz de fermentar ambos carbohidratos, la glucosa y la lactosa. Del mismo modo, si no se lee el tubo con AHK hasta después de una incubacion de 48h o mis, tanto el pico de flauta como la parte profunda del cultivo serfan alcalinos (rojo), lo que indica que no se ha fermen- tado ninguno de los hidratos cde carbono. La acidez que se halla normaimente en la parte Resdiisia del culfende’ dake a la prodonsn de productos dcidos estables; sin embargo, eventualmente, estos productos se oxidan y el organismo se. desvia_utilizando peptonas como elemento nutritive para continuar su reproduccién, y dando un pH alcalino en todo el tubo con AHK (tanto en el pico de flauta como en la capa profunda). Fermentacién de la lactosa y la glucosa (acida/acida) Algunos organismos tienen la facultad de fermentar tanto la lactosa como la glucosa en busca de elementos nutritivos, dando una reaccién en el medio AHK de_un pico de flauta acido y una capa profunda acida (acida/acida), “después de 18 a 24h de Incubacién. La lactosa se encuentra en con- centracién del 1%, es decir, diez veces mas que la glucosa. En un periodo de 18a 24 hla concentracién de lactosa en mayor cantidad atin no se ha consumido y todavia existe una condicién acida, Si se leyera el mismo tubo AHK después de 48 h o mis, el pico de flauta se habria vuelto alcali Tacte 0 por deplecién de la sa y la utilizacion de peptonas. No fermentacién de Ia lactosa ni de la glucosa (alcalina/alcalina; alcalina/sin cambio) Algunas bacterias, sobre todo los bacilos no. entéricos. gramnegativos, son incapaces de fermentar la glucosa ola lactosa. Estas bacterias se encuentran en el tracto intestinal junto con miembros de las Enterobacteri ceae y es necesario identificarlas definida- mente como no entéricas. Como ellas som incapaces de obtener sus nutrientes de los hidratos de carbono, acuden a la peptona que Contiene el medio. Estos no entéricos pueden utilizar la peptona aerdbica 0 anaerdbica- mente dando dos posibles reacciones en AHK. Un organismo que da un pico de flauta alcalino y una capa profunda alcalina (alea- linajalcalina) en un medio AHR, degrada la peptona tanto aerdbica como anaerdbica- mente. Una reaccion de pico de flauta alcalino y sin cambio en la capa profunda (alealina/sin cambio) es el resultado de un organismo que solamente puede catabolizar la peptona en condiciones aersbicas: de alli que solamente el pico de flauta muestra el cambio de color (rojo). Cuando las peptonas son degradadas se ‘produce un pH. alcalino por la liberacién de amoniaco (NH), que Imparte al medio un color rojo intenso, acrébicamente FeO accibiamentd amoniaco (NH) Por lo tanto, puede interpretarse una reaccién en AHK de cuatro maneras, segin la bacteria en estudio: 1. Alcalina/acida: solamente es atacada la glucosa. Acidasacida: son atacadas la glucosa y la lactosa, Alcalina/alcalina: no es atacada la gluco- sa ni la lactosa; se utilizan las peptonas. Alcalina/sin cambio: no son atacadas ni la glucosa ni la lactosa; se utilizan las peptonas. observa el tubo de AHK. para determi- nar sila bacteria presente tiene capacidad para fermentar la lactosa y/o glucosa y también para ver si se produce gas como. producto terminal del metabolismo de los hidratos de carbono. Los gases producidos son anhidrido carbonico e “hidrégeno. La bacteria que produce gas se denomina aerogénica, lo que se manifiesta por el desdoblamiento del medio, una sola burbuja de gas, el desplazamiento 2 3. 4.total del medio del fondo del tubo dejando un area clara, o una ligera muesca del medio en el costado del tubo. La no produccién de gas se denomina anacrogénica. Otro sistema de diferenciaci6n es la presen- cia de indicadores del aicido sulfhidrico en el medio: una sal, el citrato férrico de amonio. y una sustancia quimica, el tiosulfato de sodio. ‘Ambos indicadores deben estar present puesto que el resultado final es un método en dos etapas. 1" etapa Bacteria (medio sivido) + tiosulfato de sedio > SH, gas t icido sulthidrico es un gas incolore; por lo tanto, es necesario un segundo indicador para detectar en forma visible su produccion 2° etapa SH, + iones férricos > sulfuro ferroso | (precipitado rhegro insoluble) Para tener una explicacién mais detallada de la bioquimica de la produccién del SH, véase el capitulo 13. EI precipitado negro del sulfur ferroso que indica la produccién de SH, puede ocular la condicién acida producida en la capa superior cel medio AHK: por lo tanto, st roduce SH» €s que existe una condicion acida, aun cuando no se la observe. Tittsler * asegura que existe un paralclo entre la capacidad de un organismo de producir gas SH» y los gases CO; y Hp por la fermentacién de los hidratos de carbono. No todos los monosacaridos son degra- dados por todas las especies bacterianas; sus formas de fermentacién y de produccion de SHe difieren, permitiendo la identificacion del grupo, género o especie. La fermentacion es un proceso anaerdbico y la mayoria de los fermentadores bacterianos son, por lo gene- ral, anaerobios facultativos.” Cuando se lee un AHK después de 18 a 24 h de incubaci6n, observar: 1) la fermen- tacién de la lactosa y/o la ghucosa; 2) la produccién de gases CO; y Hs por el metabolismo de los hidratos de carbono, y 3) la produccién de SH. IV, MEDIOS EMPLEADOS A) Agar hicrro wiplemente azucarado, véase el capitulo 13. sobre acido_ sulfhidrico, B) Agar hierro de Kligler, pH:7.4 1 Pruebas con agor hierro de Kligler 115 Dos variedades comerciales. a) Ingredientes, BB, 1. Polipeptona wg 2. Lactosa wg 3. Dextrosa (ghucosa) log 4. Cloruro de sodio (CINa) 5 og Citrato férrico de amonio (mezela 0) 05 ¢ a) Gitrato férrico (FeC«HsO;) b) Citrato de amonio: L(NH):CsH;02) 6 05 ¢ 7. Rojo de fenol 0,025 8. Agar bg 9 Agua destilada 1.000 ml b) Ingredientes, Difco.” 1. Extracto de carne 8 og 2. Extracto de levadura Bg 3. Peptona 1b g 4. Proteosapeptona 5g 5. Lactosa Wg 6. Dextrosa (glucosa) 1g 7. Sulfato ferroso (FeSO,) O2 ¢ 8. Cloruro de sodio (CINa) 5g 9. Tiosulfato de sodio (NazS:O;) 03 10. Rojo de fenol 0,024 g 11. Agar 2 og 12. Agua destilada 1.000 mi Hidratos de carbono. a) b) Lactosa, 1%. Glucosa, 0.1% Indicador del pH: rojo de fenol. a) b) ° Alcalino: rojo. Acido; amarillo, Medio no inoculado: 1) pH:7.4; 2) anaranjado rojizo. Indicadores del SH3. a) BBL.116 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bocterias 1. Tiosulfato de sodio. 2. Citrato férrico de amonio. b) Difco. 1, Tiosulfato de sodio. 2. Sulfato ferroso. Inhibidor: ninguno. oo Método de preparacién. a) Pesar exactamente las cantidades de acuerdo con las indicaciones del prospecto. Los diferentes pro- ductos pueden variar ligeramente. b) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. ©) Calentar suavemente hasta su diso- luci6n 4) Distribuir en tubos, aproximad mente 5 ml por tubo. 7. Método de esterilizacién. a) Autoclave. b) 121°C, 15 libras, 15 min. 8. Dejar enfriar en posicién inclinada (pico de flauta) con una capa basal profunda. 3 9. Método de inocul: a) Cultivo puro, colonia tinica. b) Recoger el centro de la colonia con una aguja de inoculacién. ©) Tubo en pico de flauta: J) inocu- lacién en “cola de pescado"; 2) picadura de la capa profunda. Puede invertirse el orden, de acuerdo con las preferencias. 10, Incubacién. a) 35°C. b) 18 a 24 h, ni antes ni después. v. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en las Figuras 15-1 a 15-7 (Apéndice 1) VI. INTERPRETACIONES A) Utilizacién del hidrato de carbono. 1. Fermentacién de la glucosa solamente. a) En pico de flauta. Reaccién alea- lina. Color rojo. b) Capa profunda. Reaccién dcida. Golor amarillo. 1. Si también se produce gas SH» el precipitado negro puede ocultar la acidez. Existe ‘acidez en la capa pro- funda, que se registra como tal 2 Fermentacién, tanto de la glucosa como de la lactosa. a) Pico de flauta. Reaccién dcida. Color amarillo. b) Capa profunda. Reaccién Acida. Color amarillo. 1. El Gitrobacter freundii produce también SH, ademas de fer- mentar ambos hidratos de car- bono. 2. Sin embargo, existe una condi- cién dcida en Ja capa profunda, que se registra como tal aun- que no se observe No fermentacién de la glucosa ni de Ia lactosa (no entéricos). a) Pico de flauta, Reaccién alcalina. Color rojo. b) Capa profunda. 1. Organismo aerdbico. No se observa crecimiento. No hay cambio de color. El color es el mismo del tubo no inoculado. Color anaran- jado rojizo. Si no hay segu dad, comparar con el tubo no inoculado. 22 Organismo facultativo. Reac- cién alcalina. Color rojo. No fermenta ni la glucosa nila lactosas bastante comin. a) Pico de fla 1. Crecimiento solamente 2. No hay cambio de color; el mismo del tubo no inoculado (color anaranjado rojizo). b) Capa profunda. 1. Crecimionto solamente.2. No hay cambio de color; el mismo del tubo no inoculado (color anaranjado rojizo). B) Produccidn de gas. 1. Aerogénico. a) Produccion de gases: COz y He. b) Se manifiesta por lo. siguiente: Una sole burbuja de gas. Burbujas en el medio lamiento del medio. zamiento completo del medio del fondo del tubo, dejando un area clara Ligera muesca del medio en el costado del tubo, Ae 2 Anaerog gases. ico: no hay produccién de C) Produccién de acido sulthidrico (SH.) la presencia de un precipitado negro (suil- furo ferroso) se manifiesta por 1. Un color negro distribuido por wda la capa profunda y que enmascara la acidez; puede haber una ligera evidencia en el pico de flauta. 2. Un anillo negro cerca de la parte superior de la capa profunda. Un precipitaco negro distribuido por la capa profunda, pero que no oculta totalmente la acides. Cuando se interpreta un resultado en AHK puede observarse la combinacién de cual- quiera de las reacciones antes mencionadas. Buscar siempre las tres cavacteristicas: 1) fermentaciGn de los hidratos de carbono; 2) produccién de gases (CO; y H,), y 3) produccion de SH», Registrar todas. las VII, PRECAUCIONES A) Es fundamental leer ¢ interpretar un tubo de AHK dentro de un periodo de incubacién de 18 a 24 h, Si se lee antes, por ejemplo, a las 12 in, puede obtenerse un resultado falsamente positive de Acidofacido, 0 el hidrato de carbono fermentado no habri producido atin bastante acido como para cambiar el indicador del pH (rojo de fenol) gue se halla incorporado al medio. Un tubo de B) Pruebas con agar hierro de Kligler 117 AHK leido después de 24 h puede dar un resultado falso de alcalino/alcalino del do a la utilizacién de peptonas por parte del organismo, lo que da un pH alcalino. Un organismo productor de SH; puede dar tal cantidad de precipitado negro de sulfuro ferroso que oculte completa- mente la acidez producida en la capa profunda. Sin embargo, si se forma SH, €s que existe en la capa profunda una condicién Acida, aun cuando no se observe, y debe ser registrada como tal. Los resultados del AHK se escriben siempre siguiendo un patrén. Primero la reaccién del pico de flauta seguida por la reaccién de la capa profunda, separada por una barra (reacciin pico de flautal reaccién capa profunda). La reaccion del pico de flauta se refiere a la presencia © no de acidez (fermentaci6n del hidrato de carbono). Cuando se interpreta la reaccién de la capa profunda observar: 1) la ausencia 0 presencia de acidez (fermentacién del hidrato de carbono) 0 utilizacion de las peptonas; 2) la presencia de gases CO: y Hs, y 3) la presencia de un precipitado negro que indica que se ha _producido el” gas SH. El acido sulfhidrico es un gas, pero como es incoloro, cs necesario el segundo indi- cador del mismo para detectar su pre- sencia. El citrato férrico. de amonio reacciona con el gas SH, dando el precipitado negro de sulfuro ferroso observado en la capa profunda. Por lo tanto, cuando se registre la produccién de SH, no utilizar la palabra gas, sino el simbolo SHz, que indica su. produccién. Las diferentes reacciones del medio AHK que se observen, pueden ser es- critas en forma completa o por medio de abreviaturas comunes en todos los laboratorios de bacteriologia, La acidez se indica con la letra A; la alcalinidad ‘abreviatura Alc o el simbolo K. Los gases CO; y Hz pueden indicarse con la palabra gas, el simbolo G 0 rodeando con _un circulo la reaccion. de la capa profunda, El Acido sulthidrico se indi tinicamente con el simbolo SH». A continuacién damos las diferentes formas de registrar las reacciones AHK; recordar que siempre se registra primero la reaccién det pico de flauta, seguida por la reaccion de la capa profunda. 1. Acidofacido: A/A. 2. Acido/acido, gas.118 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias b) ay AJA, b) AVAL. 0 V®, 3. Alealino/acido. a) Ale/A. b) KIA, 4. Alealino/acido, gas, FE) a) Ale/A, gas. b) Ales, G. ©) Alei@. dd) K/AL gas. ©) WAG, 1 K® Alcalinoficido. gas, SH a) Alc/A, gas, SH. b) Ale/A, G, SH 6. Alcalinoficido, SH, a) Alc/A, SH. b) K/A, SHe. Alcalino/alcalino. a) Ale/ale. b) KK Fi © Alcalino/sin cambio, a) Ale/SC. b) KISC. in cambio/sin cambio: SC EI simbolo K que indica alcalinidad, aunque se acepta, no es de uso frecuente en los laboratorios ni en libros de referencia. Por lo tanto, antes de adop- tarlo, asegurarse de que es aceptado () generalmente, El agar hiervo de Kligler no contiene Inhibidor, por lo tanto cualquier orga- nismo puede crecer en este medio, EL medio diferencial AHK en tubos se usa para la identificacién de todos los miem- bros de las Enterobacteriaceae (entéricos) 4) y los bacilos intestinales gramnegativos no entéricos, De alli que antes de inoculat un tubo de AHK con un organismo desconocido, asegurarse de que sea_un bacilo. gramnegativo, catalasa_ positivo. Si se inoculan otros organismos en el medio AHK se podra observar una variedad de reacciones, algunas que no se adaptan al patron del agrupamiento entérico: por ejemplo, sicida/alealina, aci- da/sin cambio, ete. Después de registrar los resultados del tubo de AHK, conservarlo (refrigerar) para inocular sustancias bioquimicas para la identificacién 6 confirmacién det gé nero, o del género y la especie, Colocar el tubo en una gradilla junto con las pruebas bioquimicas que ‘se van a_ino- cular, El tubo de AHK se incuba junto con las pruebas bioquimicas para man- tener la continuidad del espécimen, ya que el tubo de AHK debera haber sido rotulado convenientemente para identi- arlo. Por lo general no se rotulan las sustancias bioquimicas que se inoculan a partir del tubo de AHK y por eso éste se coloca en el primer lugar de la gradilla, y se sigue un orden preestablecido con las pruebas. Esto permite asimismo man- tener la continuidad cuando se inoculan los diferentes tubos. Sin embargo, des- pués, de la incubacidn de todos los tubos de la gradilla, no intentar interpretar nuevamente el tubo de AHK, lo que ya se ha hecho y anotado. Si hay algtin cambio en la reaccién, no tiene impor- tancia. Elagar hierro de Kligler permite detectar dos tipos de gases: DCO. y Hs, que son los productos terminales del metabolismo de los hidratos de carbono, y 2) SH.. El gas acido sulfhidrico es incoloro y_ su presencia est indicada por un precipi- tado negro cuando el gas entra en contacto con la sal citrato férrico de amonio.o sulfato ferroso. Por lo unto, solamente los gases COs y Hz se anotan utilizando la palabra gas; y para indicar el gas acido sulfhidrico se emplea ¢l simbolo SH,. No usar la palabra gas para la producciin de SH. Si un opganismo es capas, de producir gas SHz su deteccion depende de la presencia de ambos indicadores del mis- mo: tiosulfato de sodio y citrato férrico de amonio 0 sulfato ferroso. Si uno de ellos esta ausente, no podré ser detectado el SH, ‘A menudo, un organismo que produce los gases COs y Ha no da muestras de estos gases en la capa profunda del AHK:J K) Ly M) burbujas, descomposicién del medio, una ligera muesca del medio sobre el costado del tubo, o desplazamiento del medio del fondo, dejando un espacio libre. Si no se observan gases con un organismo que normalmente los produce, no preocupar- se. Si se forma gas ello sera detectado cuando se realicen diversas pruebas con hidratos de carbono (principalmente glu- cosa) utilizando un tubo invertido de Durham 0 un medio semisélido. La Salmonella typhi produce por lo general un anillo de SH, cerca de la superficie de la capa profunda. Sin embargo, esta caracteristica no es suficiente para los fines de su identificacién. Deben realizarse pruebas bioguimicas y_de_tipificacion seroldgica para la identificacién y confir- macién, A veces, otros organismos que producen SHz dan un falso aspecto de anillo por la pequefa cantidad de SH: formado durante el periodo de incuba- cion de 18 a 24 h. No confiar en la presencia de un anillo de SH, para la definida identificacion de S. typhi No utilizar el asa de inoculacién para inocular un tubo de AHK. Si se hace la puncién de la capa profunda, se produce la desintegracién mecénica del medio dando una falsa apariencia de produccién de gases (COs y H2). BBL ! recomienda preparar los tubos de AHK el mismo dia que se van a usar para mayor precision de los resultados. Si esto no es posible, derretir el medio y volver a solidificarlo antes de su empleo. No dejar de hacer la puncién de la capa profunda del AHK durante el proceso de inoculacién, porque de no hacerlo se invalidardn los resultados. El orden de inoculacién del tubo de AHK: pico de flauta en cola de pescado, puncién de la capa profunda; 0 puncién de la capa profunda, pico de flauta en cola de pescado, no tiene importancia en tanto se haga la inoculacién completa. El orden depende de las preferencias del micro- bidlogo. fundamental usar un. cultivo puro cuando se inocula un tubo de AHK. Recoger siempre el centro de una colonia bien aislada en un medio sélido utili- zando una aguja de inoculacién. Si se inocula el AHK con un cultivo mixto, después de la incubacidn las observacio- nes seran_irregulares; después de las pruebas bioquimicas son comunes las Teacciones mixtas que hacen imposible ubicar con precisién un organismo den- oO) P) Q Pruebas con agar hierro de Kligler 119 tro de_un_patrén determinado para la identificacion del grupo, el género o la especie. Los indicadores del SHz en el medio AHK no son tan sensibles como las tiras de acetato de plomo para detectar la produccién. de. dcido sulfhidrico. La determinaci6n del acido sulfhidrico utili- zando el medio AHK debera limitarse alos miembros de las Enterobacteriaceae; ‘otros organismos requieren el método de la tira de acetato de plomo, mds sensible para detectar la formacién de SH,. Algunos organismos, especialmente los grupos Klebsiella-Enterobacter, producen tanta abundancia de gases (CO. y Hs) que el medio puede ser totalmente desplazado por los mismos, Tegando hasta la tapa del tubo. Si esto ocurre, manipularlo con mucho cuidado si se hace un subcultivo para evitar la contami- nacién del cultivo o la autocontamina- cidn. La cantidad de SHz que producen al- gunos organismos es variable. Algunos producen gas en cantidades tan grandes que toda la capa profunda ‘aparece ennegrecida por el precipitado de sulfuro ferroso; otros producen una cantidad moderada que ennegrece la capa pro- funda pero deja visible la acidez produ- cida, mientras que otros s6lo producen pequeiiisimas cantidades en_un periodo de incubacién de 18 a 24 h. Sin embargo, cualquier vestigio de ennegrecimiento de la capa profunda indica la produccién de SHz y debe registrarse como tal. A veces, el Proteus retigeri 0 el Proteus morganii muestran ennegrecimiento de la capa profunda del AHK, pero esto no debe Interpretarse como produccién de SHz. AA veces se observa después de la incu- bacién un AHK sin cambio/sin cambio. No apresurarse a desechar el tubo. Controlarlo con cuidado para ver si hay crecimiento. Si no hay crecimiento, es proba- ble que el microbidlogo haya olvidado inocular el tubo; controlar si se ve la linea de puncién o las estrias en el pico de flauta, Algunas bacterias se desarrollan en AHK pero no muestran accién sobre los hidratos de carbono, dentro de las 24 h; tampoco se observa cambio en el indi- cador del pH hacia la alcalinidad. Si hay crecimiento, registrar la reaccion SC/SC continuar la inoculacién de sustancias bioquimicas para la identficacién. des pués de realizar una coloracién de Gram120 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias R) para confirmar la presencia de un bacilo gramnegativo. A veces un tubo de AHK muestra una Teaccion dcida en el pico de flauta, y sin cambio en la capa profunda. Esto podr' ser consecuencia de: 1) se ha usado para la inoculacién un organismo gramposi- tivo capaz de utilizar la lactosa sdlo aerdbicamente, 0 2) el microbidlogo olvidé hacer ‘la puncién de la capa profunda. Controlar entonces ésta para observar la marca de la puncién, con- trolar la morfologia de la colonia en la placa utilizada para la inoculacion del AHK, y hacer una coloracién de Gram y una prueba de la catalasa del creci- miento que se encuentra en el pico de flauta, Los grupos Klebsiella-Enterobacter provo- can por lo general una rapida reversion del pico de flauta, dentro de un periodo de incubacién de 18 a 24 h, Normal- mente estos grupos muestran tina reac- cion A/A, gas, en el AHK. Hacer el informe de la reaccién exactamente como se observa; por ejemplo, con reversin alcalina/acida, gas. Si hay sospecha de reversion debido a la morfologia de la colonia, se escribir reversién entre pa- réntesis después de la reaccién del AHK: alcalinafacida, gas (reversion). Cuando se produce la reversidn, ella comienza por lo general en la parte superior del pico de flauta, con reversién hacia la alcalinidad. Sin embargo, esto no debe crear problemas si se controla la morfo- logia de la colonia en medios sdlidos y el pico de flauta de AHK. Por lo general, estos organismos son de apariencia suma- mente mucode tanto en los medios en placa como en el pico de flauta AHK y por lo comtin producen abundantes gases haciendo desplazar el medio hasta la tapa del tubo. Siempre se haran las pruebas bioquimicas para la identifica- cin de los grupos, género, o género y especie. VIII. AGAR HIERRO TRIPLEMENTE AZUCARADO (MEDIO ALTERNATIVO) El AHK puede sustituirse por un agar hierro triplemente azucarado (AHTA). ‘La diferencia fundamental es el agregado de un tercer hidrato de carbono sacarosa. Sin embargo, el principio, los objetivos y las bases bioquimicas ‘son esencialmente las. mismas que para el AHK. Véase el capitulo 13, sobre Acido sulfhidrico, donde se encontrard el metodo de preparacin y utilizacién, obser- vando las precauciones, El agrupamiento de las Enterobacteriaceae por las reacciones con AHTA varia ligera- mente del que se realiza con el AHK, dado que algunos no fermentadores de la lactosa pueden fermentar la sacarosa dando como resultado una reaccién del pico de flauta diferente. Por ejemplo, el Proteus vulgaris es alcalinajécida en AHK, pero dcida/acida en AHTA, BIBLIOGRAFIA 1. BBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5th od., Cockeysville, Mary- Innd: Division of BioQuest, Division of Becton, Dickinson and Company, 1968, p. 16. 2. Difco Manual, 9th ed., Detroit: Difco Lab- oratories, 1953, pp. 165 and 181. 3. Hugh, R., and Leifson, B. (1953) The taxo- nomic significance of fermentative ver- sus oxidative metabolism of carboby- drates by various gram negative bacte- ria. J. Bacteriol., 65, 24. Tittaler. R. P. (1931) The effect of temper- ature upon the production of hydrogen sulphide by Salmonella pullorum. J. Bac- toriol., 21, 111.Prueba de la leche con tornasol I. PRINCIPIO Diferenciar organismos sobre la base de sus multiples reacciones metabélicas en un medio lacteo IL OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 32 y 33.) A) Ayudar a la diferenciacién de las especies sobre todo para el género Clostridium: Clostridium cochlearium (sin crecimiento), C. difficile (sin crecimiento), C. putrefaciens (sin crecimiento), y C. tetanomorphum (sin crecimiento), de otras especies de Clostri- dium (crecimiento). B) Streptococcus bouis (crecimiento) de S. equinus (sin crecimiento), Ill. BASES BIOQUiMICAS La leche tornasolada es un medio dife- rencial que se emplea para determinar varias, funciones metabolicas de un organismo: 1) fermentacién de la lactosa, 2) casedlisis y 3) coagulaci6n de la caseina.® EI tornasol incorporado a la leche es un indicador del pH y un indicador Ep (oxida- cion-reduccién) que hace que el medio pueda indicar diversas funciones metabélicas. La leche sola contiene el hidrato de carbono lactosa junto con tres importantes proteinas: caseina, lactalbumina y lactoglobulina.* Por lo tanto, un organismo puede mostrar una 0 varias propiedades metabélicas en la leche tornasolada, cada una de ellas propia de una especie determinada, ayudando asi a la identificacién bacteriana: 1) fermentacién de la Tactosa; 2) reduccién del tornasol; 3) formacién de codgulo; 4) peptonizacién (digestion); 5) formacién de gas. Fermentacién de Ia lactosa El tornasol como indicador del pH es rojo en solucién dcida (pH: 4,5) y azul en condiciones alcalinas (pH: 8,3). La leche tornasolada presenta un color azul purpireo (pH: 6,8) cuando no esta inoculada,* pero si un organismo es capaz de fermentar la lactosa, produciendo principalmente acido lac- tico, se produce una condicién acida indicada por el cambio de color del medio, que se vuelve rojo rosado. A veces el acido butirico es el producto final de la fermentacién de la lactosa.* Ciertas bacterias que forman alcalis no fermentan, lactosa, pero actian sobre las sustancias nitrogenadas que se encuentran en. la leche liberando amoniaco, y dando en consecuencia un pH alcalino que se mani- fiesta por un color purpura azulado. Lactosa —+ glucosa + galactosa Acido lactico Reduccién del tornasol EI tornasol es un indicador del pH y un indicador de oxidacién-reduccion (Ej). Algu-Prueba del rojo de metilo 1. PRINCIPIO A) Comprobar la capacidad de un orga- nismo de producir y mantener estables los productos terminales acidos de la fermentacin de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora del sistema, B) Es una prueba cualitativa de la produc- cion de acido (determinacién del pH); algunos organismos producen mas acidos que otros. I. OBJETIVO (Véase también Ja Seccién 111, Capitulos 33 y 34.) A) Ayudar a la diferenciacién entre los géneros. 1. Escherichia coli (+) del Enterobacter aerogenes (—), Enterobacter cloacae (=) y Klebsiella (por lo general —) 2. Especies de Yersinia (+) de otros bacilos no entéricos_gramnegativos 1a B) Ayudar a la identificacién de la Listeria monocytogenes (+). Ill. BASES BIOQUIMICAS La prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador del pH, rojo de metilo, para determinar la concentracién de iones hidrégeno (pH) presente cuando un organismo fermenta la glucosa."* La concen- tracion de hidrogeniones depende de la relacidn gaseosa (CO; y Hz), que a su vez es un indice de los diferentes ciclos del meta- bolismo de la glucosa que muestran diversos organismos. Las diferentes formas de fer- mentacién se deben a variaciones en las enzimas vinculadas con el metabolismo del Acido pirivico que se encuentran en cl organismo! Todos los miembros de las Enterobacte- riaceae son, por definicion, fermentadores de la glucosa. En el caldo RM/Voges-Proskauer (VP), después de 18 a 24h de incubacién, la fermentacién resultante da productos secun- darios metabélicos acidos; por lo tanto, inicialmente todos los entéricos darén una reacci6n positiva con el rojo de metilo.t: + Sin embargo, después de mas tiempo de incubacién como lo exige la realizacién de la prueba (de 2 a 5 dias), aquellos organismos que son rojo de metilo positives continian produciendo mis acidos, y dan como resul- tado un bajo pH terminal, venciendo al sistema amortiguador de fosfato, y mante- niendo un medio acido (pH: 4,2 0 menos). Los organismos rojo de metilo negatives continéan metabolizando los products ini- ciales de la fermentacién por decarboxi- lacién, produciendo acetilietilcarbino (ace- toina) neutro, lo que da un elevado pH terminal que disminuye la acidez del medio, elevando el pH hacia la neutralidad (pH: 6 © mas).!"4 La E. coli y otros organismos RM positivos producen un alto volumen de dcidos: lictico,Prueba del rojo de metilo 135 2 Glucosa + H,O — 2 dcido ldctico +4cido aeético+ aleohol etic + 2 CO: + 2 He (Acido formico > He + CO.) succinico, acético y formico; la descompo- sicién del acido férmico es la Have para la produccién de hidrégeno y anhidrido carbé- nico." La E. coli produce cantidades iguales (relacién 1:1) de Hy y CO, a partir del metabolismo de la glucosa.® La reaccién general del metabolismo de la glucosa por la E. coli es la indicada arriba. Los organismos rojo de metilo positivos producen acidos estables,? manteniendo una alta. concentracién de jones hidrégeno ® hasta alcanzar cierta concentracién y en- tonces cesa toda actividad Los organismos rojo de metilo negativos también producen Acidos (acético, lactico y férmico), pero tienen una menor concen- tracién de iones hidrégeno porque hay una reversién hacia la neutralidad debida a la nueva degradacion de los cidos organicos en carbonatos, y al anhidrido carbénico, y posiblemente a la formacién de compuestos de amonio por las proteinas que se encuen- tran en el medio." Asimismo, por debajo de un pH de 63, el acido acético es convertido en acetoina y 2,3-butanediol,? productos finales neutros; cesa la produccién de Hz mientras que aumenta la acumulacién de COs. Las especies de Klebsiella-Enterobacter (E. cloacae y E. aerogenes) rojo de metilo negativas producen mis alcohol etilico que la E. coli, menos acidos, y el doble de CO, y Hz (relacion gaseosa 2:1). La falta de produccién de hidrégeno se debe a la ausencia de la enzima hidrogeno liasa.? La reaccién general del metabolismo de la glucosa por los grupos Klebsiella-Enterobacter es: * Ghucosa + 1/2 O > 2.5-butanedio! + HO + 2 CO, (Acetoi -butanediol) La validez de la prueba del rojo de metilo depende de un tiempo de incubacién sufi- ciente como para permitir que se produzca la diferencia en el metabolismo de la glucosa."” Los organismos en estudio se incubaran por lo menos 3 dias a 35-87° C* lo que permite que todos los organismos con baja proporcién gaseosa (RM +) muestren su limite en la concentracién de iones hidrégeno (bajo pH terminal), mientras que los que tienen una alta relacién gaseosa (RM —) mostraran una menor concentracién de hidrogeniones (alto pH terminal)? IV. MEDIO EMPLEADO: MEDIO DE, CLARK Y LUBS (CALDO RM/VP), PH: 6,9* A) Ingredientes. 1. Polipeptona o peptona amortiguada * 7¢ 2. Dextrosa (glucosa) 5g 3. Fosfato de potasio (KsHPO,) (buffer) 5g 4, Agua destilada 1000 ml B) Productos comerciales. 1. BBL. 2. Difco. C) Método de preparacién. 1. Pesar exactamente las cantidades, de acuerdo con las indicaciones del pros- pecto. Los diferentes productos pue- den variar ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada o des- mineralizada. 8. Calentar suavemente hasta disolucién. 4. Distribuir en tubos, aproximadamen- te 5 ml por tubo. D) Método de esterilizacién. 1, Autoclave. 2. 121°C, 15 libras, 15 min. E) Enfriar antes de su empleo y refrigerar para su conservacién (4-10° C). F) Inoculacién. 1. Crecimiento de un cultivo puro en AHK, de 18 a 24h. 2. Indéulo poco espeso. G) Incubacion. 1. Minimo absoluto. a) 85°C. b) 48h. 2. Recomendada.* * a) 30°C b) De 3.a5 dias. H) Agregar indicador del pH rojo de metilo136. Pruebos bioquimicas para Ia identificacién de bacterias directamente a una alicuota_incubada antes de intentar la interpretacién. EI medio RM/VP que se encuentra en el comercio ¢s una modificacién del medio de Clark y Lubs. Clark y Lubs utilizaron una concentracidn del I % de peptona y glucosa, ro como wna concentracién menor de no menos del 0,5 % ¢s el minimo satisfactorio, por lo tanto los organismos rojo de metilo hegativos no alcanzan la elevada concentra- cién de iones hidrégeno limitante.” Una concentracién del 0,5 % de peptona da menos color al medio, haciendo mas facil interpretar la reaccién de color. V. REACTIVO EMPLEADO: INDICADOR DEL PH ROJO DE METILO ‘A) Método de preparacién. 1. Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 ml de alcohol etilico de 95°. 2. ‘Agregar 200 ml de agua destilada a la mezela alcohol-indicador. 1. El medio inoculado de Clark y Lubs se emplea también para la reaccién de VP, que se determina después de 24 a 48 h de incubacién. 2. Asépticamente, con pipeta, retirar una alicuota de 2,5 ml para la determi- naci6n del rojo de metilo. 3. Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo a la alicuota. 4, Interpretar el resultado de color inmediatamente. ©) Control de calidad: El reactive debe controlarse con cultivos positivos y nega- tivos conocidos antes de disponer su empleo. E. coli y especies de Klebsiella son buenos controles, porque se obtienen facilmente y no crean problemas cuando se los mantiene como cultivos madre: E. coli: rojo de metilo positivo; especies de Klebsiella: rojo de metilo negativo. Conservacién: Guardar el reactivo en un refrigerador (4° C) mientras no se usa. Quimica de la accién del reactivo: El rojo de metilo es un indicador que ya es acido € indicara los cambios en el grado de acidez por reacciones de color, en una escala de pH 4,4 a 6. Con un pH de 4,4 © menos en el medio, el reactivo se mantiene rojo, mientras que con dismi- nucién de la acidez y con un pH de 6, D) A) B) © A) c) D) el indicador rojo de metilo vira aun color amarillo, que denota asimismo acidez, pero la concentracién de iones hidrogeno es mucho menor. Con un pH de 5 a 5,8 se producen diferentes tonalidades de anaranjado.! VI. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 19-1 (Apéndice 1). VII, INTERPRETACIONES Prueba RM positiva: el cultivo es suficientemente acido como para permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga un definido color rojo (pH: 4,4) en la superficie del medio. Prueba RM negativa: color amarillo (pH: 6) en la superficie del medio. Reaccién retardada: color anaranjado. Continuar la incubacién hasta 4 dias y repetir la prueba. VIII. MICROTECNICA RAPIDA Método de Barry y col.! Detecta organismos rojo de metilo posi- tivos en 18h. Medio: caldo RM/VP.* 1. Guardar en tubos con tapa a rosca (16 x 125 mm). 2. Inmediatamente antes de su empleo, pasar asépticamente con una pipeta alicuotas de 0,5 mi en pequeiios tubos de ensayo (13 X 100 mm). Método. 1. Inéculo. a) Recoger el centro de una sola colonia (cultivo puro). b) Cultivo de un crecimiento de 18 a 24 h en EAM, MAC o ASC. 2. Incubacién. a) 35°C. b) 18a 24h. 3. Después de la incubacién agregar una gota de reactivo RM a cada tubo deensayo ya preparado. 4, Interpretacion, a) RM positive: color rojo brillante. b) RM negativo: color amarillo defi- nido, La _microtécnica de Barry y col! ha permitido disminuir el periodo de incubacién con relacién al método comin (2 a 5 dias), Los estudios' demostraron que utilizando menores voltimenes de caldo para la prueba, os organismos en estudio sufrian una mejor exposicién al oxigeno aumosférico que hacia que los organismos RM negativos revirtieran al pH acido inicial con’ mayor rapidez. IX. PRECAUCIONES A) La peptona que se encuentra en el medio puede afectar los resultados del rojo de metilo. Antes de su empleo, debe hacerse un control de calidad con cada lote utilizando organismos rojo de metilo positivos y negatives conocidos.* B) La reaccién del rojo de metilo no puede acelerarse aumentando la concentracién de glucosa en el medio. # ©) No debe intentarse interpretar un resul- tado con el rojo de metilo después de menos de 48 h de incubacién.® Si se realiza la prueba demasiado pronto, los resultados seran a menudo equivocos 0 falsamente positivos, dado que los orga- D) E) Prueba del rojo de metilo 137 nismos RM negatives no habran tenido tiempo suficiente para metabolizar por completo los productos cidos iniciales acumulados por fermentacién de la glu- cosa.! Después de slo 18 a 24 h de incubacién todos los resultados son RM ositivos. i no se dispone de medio comercial, cualquier medio sera conveniente en tanto contenga no menos del 0,5 % de ucosa y peptona, junto con un buffer fosfato, y se haya realizado un control de calidad. Evitar la prueba con’ una mezcla caldo- inéculo demasiado turbia; el crecimiento bacteriano es inhibido si el inéculo excede la concentracién celular maxima de alre- dedor de 10° células viables por ml.! Con cada disminucién logaritmica del tamatio del inéculo hay un aumento en el tiempo necesario para que los organismos RM positivos acumulen suficientes productos acidos como para superar el sistema amortiguador, Cada laboratorio debe fijar sus patrones en cuanto a las siguientes variables para obtener resultados éptimos y reprodu- cibles: 1) la densidad del indculo; 2) el volumen total de caldo, y 3) el tamario del tubo de ensayo que se emplee. A menudo se produce una reaccién de color anaran- jado cuando se ha utilizado un volumen ‘demasiado grande de caldo, y ello hace que Ja interpretacin sea’ subjetiva y menos reproducible,! IBLIOGRAFIA 1. Bany, A. L., Bemsohn, K. L., Adams, A. P.. and Thrupp, L. D. (1970) Im: proved 18shour methyl red test. Appl Microbiol, 20,, 866. 2. Branson, D. Methods in Clinical Bacteri- ology, Springfield, Ill.: Charles C ‘Thomas, Publisher, 1972, pp. 32-33. 3. Clark, W. M., and Lubs, H. A. (1915) ‘The differentiation of bacteria of the co- Ion-aerogenes family by the use of indi- ators, J. Infect. Dis., 17, 160. 4. Cowan, S. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medica Bacte- ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, p. $2. 5. Doelle, H.’ W. Bacterial Metaboliem, New York: Academie Press, 1969, pp. 284-286 and 291, 6. Edwards, P. R., and Ewing, W. H. Iden- tification’ of Enterobacteriaceas, Minne- apolis: Burgess Publishing Company, 1955, pp. 248-249, 7. Gunsalus, I. 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A., Topley and Wilson's Principles of Bacteriology and Immunity, Vol 1, 5th ed., Balti- more: The Williams & Wilkins Com- any, 1964, pp. 815-816Prueba de la oxidasa PRINCIPIO Determinar Ia presencia de las enzimas oxiclasas. I, OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 32 a 34.) A) La prueba de la oxidasa se utiliz6 origina riamente para identificar todas las espe- Ges de Neiweria, pero mas adelante se la usé para diferenciar las Pseudomona- daceae de los miembros oxidasa negatives de las Enterobacteriaceae.® * ® B) La mayoria de las bacterias grampositivas son oxidasa negativas.” Muchos de los bacilos gramnegativos, te de las Enterobacteriaceae, tienen una actividad oxidasa variable. D) Ayudar a la diferenciacién entre los generos: Moraxella (+) y Neisseria (+) del Acinetobacter (—) E) Ayudar a la diferenciacién en especies. 1. Brucella neotomae (=) y Brucella ovis (~) de otras especies de Brucella (+). 2. Pseudomonas maltophilia (-) de otras especies de Pseudomonas (por lo gene- ral +). F) Ayudar a la identificacion de: 1. Aeromonas (+) 2) Neisseria (+) 3. Pseudomonas (por lo general +) Alealigenes +) Branhamella (+) (Neisseria catarrhalis) Moraxella (+) Enterobacteriaceae (—) Yersinia (=) SIT oe III. BASES BIOQUIMICAS La prueba de la oxidasa esta basada en la produccién bacteriana de una enzima oxi- dasa. Esta reacci6n de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacién del citocromo redu- cdo por cl oxigeno molecular, el que a su vez acttia como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema dle trasferencia de electrones.** ‘Todas las bacterias aerébicas obtienen su energia por la respiracion, proceso respon- sable de la oxidacion de diversos sustratos. El oxigeno molecular oxida un sustrato con la intervencién del sistema de trasporte de electrories.'* El oxigeno es el aceptor de hidrégeno final, produciendo a partir del hidrégeno agua 0 perdxido de hidrégeno, segtin la especie bacteriana y su sistema enzimatico.”” EI sistema citocromo s6lo se encuentra por lo general en.los organismos aerébicos,” lo que los hace capaces de utilizar el oxigeno como un aceptor de hidrégeno final para reducir el oxigeno molecular en perdxido de hidrégeno, el tiltimo enlace de la cadena de la respiracién aerébica.* 7 Steel ™ demostro que todos los organismos oxidasa positivos jue estudid eran aerdbicos, 0 anaerbicos facultativos, excepto el Vibrio fetus, que tieneun requerimiento de oxigeno mucroaero- filico, Gordon y McLeod" aseguran que la reaccién oxidasa positiva esti limitada a aquellos organismos capaces de desarrollarse en presencia de oxigeno y producir, al mismo tiempo, la enzima catalasa, La enaima catalasa degrada el peroxido de hidrogeno,’ dado que str acumulacidn es toxica 2H.0, —Helts_ 5 9 H,0 + 0, Peroxido de hidrogeno Los organismos obligadamente anaerdbi- cos carecen de actividad 6xidasa porque no pueden vivir en presencia del oxigeno atmos- lérico y no poseen el sistema citocromooxi- dasa. 1%" Deibel_y Evans ® mostraron también esta ausencia de actividad enzimética en el Lactobacillus. Poco se sabe acerca de la funcién exacta de los diversos citocromos bacterianos, ya que el sistema citocromooxidasa varia entre las especies bacterianas.”’ Sin embargo, es sabido que su papel en la respiracién aerdbica es importante, En otros tiempos se crefa que existian dos enzimas oxidasas, separadas y diferentes, que eran responsables de una reaccién oxidasa positiva; la produccién de estas enzimas diferia en los diversos géneros. Se creia que las especies de Neisseria producian indofenol oxidasa, mientras que la Gtocromo-oxidasa era producida por especies de Pseudomonas. Los estudios espectrofotométricos han de- mostrado que la citocromo-oxidasa de War- burg y la indofenol-oxidasa son la misma.* Gaby y Hadley ® afirman que la enzima citocromo-oxidasa ha recibido otros nombres: atmungsferment, citocromooxidasa ¢, citocro- mooxidasa ag, y citocromooxidasa a. Castor y Chance * mostraron por medio de métodos fotoquimicos que existen cuatro pigmentos bacterianos que actian como enzimas respi- ratorias citocromooxidasa terminales: cito- cromo ay, citocromo as, ctocromo.a; y un pigmento que liga el monoxido de carbono denominado citocromo 0. La variedad de Gitocromos son pigmentos respiratorios que contienen compuestos de ferroporfirinas.” La distribuci6n de los diferentes cito- cromos varia en cada especie bacteriana; algunos organismos poseen solamente una oxidasa, en tanto que otres pueden producir dos 0 tres3* ‘Todas las especies de Pseudomonas y Neisseria producen una enzima oxidasa que, cuando se encuentra en presencia del oxigeno atmos- férico, citocromo ¢, y un reactive oxidasa, oxidan al réfictivo para formar un compuesto Pruebo de Ia oxidaso 155 coloreado, indofenol.* ™ La mezcla del citocromo a y el citocromo a se denomina citocromo-c-oxidasa.™" Un resultado oxidasa positivo est formado por una serie de reacciones en la cual un componente autooxidable del sistema cito- cromo es el catalizador final.*” Pueden susti- tuirse los aceptores clectrénicos naturales por sustratos arbificiales, en cualquier sitio de la cadena de trasporte de electrones, donde acttian como reductantes del sistema cito- cromo -c-citocromooxidasa." 2 Los diversos colorantes para la prueba de la oxidasa son aceptores de electrones artificiales; el reactivo parafenilendiamina y el indofenol son a la vez aceptores y dadores de clectrones.* Estos sustratos artificiales son incoloros 0 colo- reados segtin el estado en que se encuen- tren; * la reaccién oxidasa final muestra un producto coloreado. IV. REACTIVOS EMPLEADOS A) Reactivos para la oxidasa, varias opciones. 1. Reactive de Kovacs: *! Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 1 %. 2. Reactivo de Gordon y McLeod: ® ® Diclorhidrato de dimetil-p-fenilendia- mina (denominado también N-dimetil- ‘p-fenilendiamina 0 monoclorhidrato de-p-aminodimetilanilina). 3. Reactivo de Nadi: 2 Una mezcla Por partes iguales de a-nafiol al t % en alcohol etilico (etanol) de 95° y aminodimetilanilina al 1% 4, Reactivo de Carpenter, Suhrland y Morrison: 7 Oxalato de p-aminodime- tilanilina al 1% Discos impregnados con oxidasa a) Difco: Discos Bacto-Differentia- tign, de oxidasa.” b) BBL: Discos Taxo N.* o B) Método de preparacion de los reactivos. 1. Disolver 1 g del reactivo deseado en menos de 100 mi de agua destilada {con excepcién del -naftol). a) anaftol (1-naftol) lg b) Alcohol etilico absoluto 100 ml 2. Calentar suavemente hasta su disohu- Gon. 3. Pasar a un frasco volumétrico_ y agregar un diluyente adecuado (agua © alcohol etilico) ¢s.p. 100 ml156 Pruebas bioquimicas para la idemtficacién de bacterias 4. Dejar descansar 15 min antes de su empleo.' Guardar en frasco de vidrio de color caramelo, tapado. Evitar la innecesa- ria exposicidn a la luz" 6. Rotular correctamente. El reactivo de Kovacs, solucién acuosa al 1% de tetrametil-p-fenilendiamina, es menos t6xico y sumamente sensible en comparacion con el compuesto dimetilo, pero es mas costoso.4 + + #4 32 Este reactivo imparte un color lavanda a las colonias oxidasa positivas que gradualmente vira a un pirpura-ne- gruzco intenso, pero también puede impartir Color al medio que las rodea." El reactive de Gordon y McLeod." solucién acuosa al | a 1,5 % de dimetil-p-fenilendia- mina, ¢s mas estable que el compuesto tetrametilo™ Todos los compuestos p-fenilen son relativamente inestables.® EI reactive oxalato de p-aminodimetil- anilina tiene una ventaja sobre los reactivos de Kovacs o de Gordon y McLeod, porque es sumamente estable, tanto en forma de polvo como en solucién; la solucién acuosa se mantiene estable por lo menos 6 meses." Fl p-aminodimetilanilina es un poco menos soluble que los clorhidratos, pero un ligero calentamiento permite su disolucién, Otra ventaja es que la sal oxalato no forma precipitado negro cuando se baiian con el Teactivo las colonias que se desarrollan en agar chocolatado, como ocurre a veces con los clorhidratos."' El empleo de discos impregnados con oxidasa, que se encuentran en el comercio, evita la necesidad de preparar reactivos frescos. Ninguno de estos reactivos inter reaccion de coloracién de Gram. C) Método de utilizacién. mina re la 1. Solucién de reactivo. a) Método en placa directa 1, Agregar directamente 2 0 3 gotas de reactive a algunas Colonias sospechasas que se desa- rrollan en un medio en placa, por ejemplo, agar sangre 0 agar chocolatado. 2. No imundar toda la placa con el reactive 3. No invertir la placa 4. Observar los cambios de color b) a) b) a) Reactivo de Kovacs: reac- Gién de color dentro de los 10 a 15 seg.» b) Reactive de Gordon y Mc Leod: reaccién de color dentro de los 10 a 30 reeelian S Método indirecto de Kovacs sobre papel.2* 1. Colocar un trozo de 6 cm* de papel de filtro de Whatman Ne Len una capsula de Petri 2. Agregar de 2 a 3 gotas de reactivo de Kovacs en el centro del papel Hacer un extendido con el asa de inoculacin de una colonia sospechosa, en el papel im- pregnado con reactivo siguien- do una linea de 3 a 6 cm de longituel 4, La reaccién de color positiva se produce a los 5 a 10 seg. 1s de oxida’ Método directo en placa. 1. Humedecer los discos impreg- nrados con agua destilada et nil 2. Colocar el disco sobre algunas colonias sospechosas de un mectio en placa, por ejemplo, agar sangre 0 agar chocolatado. 3. No invertir la placa 4. Reponer la placa en una incu- badora a 35° C durante 20 a 30 min. La prueba puede ser \cubada a la temperatura del ambiente (25° C) 0 en relrige- rador (4-10° G), pero la reac- ci6n es mus lenta. 5. Observar los cambios de color que se produzcan. Método indirecto.* 1. Dos variantes. a) Humedecer el disco. con agua destilada estérit, colo- car en una capsule de Petri V agregar después la canti- dad’ reeogida con un asa de-una colonia sospechosa cultivada en un medio s6- lo,1D) Control de calidad: FE) b) Humedecer el disco con un. cultivo en caldo del orga- hismo sospechoso. 2. Observar si se producen cam- bios de color: la reaccion post tiva debe ocurrir a los. pocos segundos. Cualquiera de los reactives 0 discos empleados debe ser controlado con cultives positives y nega- tivos conocidos antes de su empleo general. La Escherichia cali, cualquier especie de Neisseria 0 de Pseudomonas aeruginosa constituyen un buen control, dado que se obtienen ficilmente y no ofrecen problemas para su conservacién en culti- vos madre: E.coli, reaccion oxidasa negativa: especies de Neisseria y P. aeru- ginosa, veaccion oidasa positiva. Conservacién: Guardar todos los reacti- vos y discos en un refrigerador (4° C) mietitras no se usen; calentar los reactivos antes de su empleo." Barry y Bernshon ? recomiendan congelar los reactives en voltimenes de 1 at 2 ml para reducir La autooxidacién y prolongar su actividad. Todos los reactivos deben ser recién preparados antes de su empleo, puesto queen solucién se desactivan ripida- mente. Si estin refrigerados pueden man- tenerse estables desde 5 dias a 2 sema- nas.” Los Laboratorios Difco |! ase- veran que el reactivo de oxalato de p- ninodimetilanilina es estable por lo menos durante 6 meses. Sin embargo, HC CH, NH. ecnafiol Diver fenleiin Prueba de la oxidaso 157 como la estabilidad de estos reactivos varia, es aconsejable efectuar todas. las semanas un control de caliclad, desechiin- dolos cuando muestren una reaccién débil o negativa con un organismo posi tivo conocido, La actividad oxidasa di minuye si los discos se han oscurecido por una prolongada conservacién2 Cuan- do los discos de preparacién comercial no reaccionan convenientemente en el con trol de calidad, se devolvera todo el lote al laboratorio productor, para su repo- sicion, F) Quimica de la accién reactiva: Los colo- rantes p-fenilendiaminas son aminas aro- maiticas primarias2* diaminoderivados det benceno."* ee O pfenilendiamina La citocromooxidasa, en presencia del oxigeno atmosférico, oxida el reactivo fenil- endiamina oxidasa para formar un compues- to coloreado, el indotenol.*: * Si el reactivo oxidasa se prepara con a-naftol, se forma azul de indofenol; * sin embargo, el -naftol no es necesario para que tenga lugar la reaccion, El indofenol es w de la quinona en la cual © ambos grupos =O. colorante, un N-analogo N reemplaza a uno i ao Go Aaul de indofenol*158 Pruebas bioquimicas pora la identificacién de bacterias EI reactivo clorhidrato de fenilendiamina forma un grupo diclorimida (CIN=CaHi= NCD; el =NCI es reducido a —NH2, 0 hidrolizado en =O. V, RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en las Figuras 23-1, 23-2 y 23-3 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACION A) Colonias oxidasapositivas: la colonia toma un color rosado, después marrén y Finalmente negro. 1. Colonias rosadas. a) Bacterias viables. b) Periodo para el subcultivo. 2. Colonias negras: bacterias no viables. Cuando se emplea una mezcla de reactive dimetil-p-fenilendiamina-e-naftol, la reaccién oxidasa positiva esta indicada por un color azul! B) Colonias oxid: a negativas. 1. No se produce cambio de color en las colonias, 0 s6lo adquieren un color rosado pilido por el reactivo. 2. Puedg producirse una coloracién ne- gra del medio civcundante Si se emplea cl reactivo de Kovacs, la reaccion oxidasa positiva esta indicada por un color negro purptireo que se desarrolla en el término de 10 seg; la reaccion positiva dentro de los 10 a 60 seg se considera un resultado retardado.* Stee! * asegura que el desarrollo tardio del color, pasado un periodo de 60 seg, indica una prueba oxidasa negativa VII. TIRAS IMPREGNADAS CON REACTIVO PARA LA PRUEBA DE LA OXIDASA A) Tiras para la prueba de la citocromo- oxidasa (PathoTec). 1 Fabricante: General Diagnostic Divi- sion, Warner-Lambert Company Resultados dentro de los 30_ seg. Principio: dimetil-p-fenilendiamina + a-naftol > azul de indofenol (color azul intenso). 4, Método: seguir las indicaciones del fabricante. Correlacién con las pruebas standard: 100 G2 2 30, o B) Método de Barry y Bernsohn? Preparacion de la tira. a) Papel de filtro de Whatman N° 1. 1. Cortar en tiras de 6 a 8 em de diametro, 2. Saturar con una solucién acuo- sa de oxalato de dimetil-p- fenilendiamina al 1%. b) Secar ripidamente. 1. Colgar en cuerdas 0 varillas de vidrio. 2. Evitar el contacto con ganchos © cualquier objeto de metal ©) Guardar en frascos con tapa a rosea que contengan una cantidad abundante de un desecante. 4) Conservar en refrigerador; estable hasta 6 meses. 2. Método. a) Extender una colonia pura sobre una tira seca. b) Puede hacerse la prueba simulti- nea de varias colonias en una misma tira. s Interpretacién. a) Resultados a los 10 seg. b) Positivo: color rojo. VIII. PRECAUCIONES A) La prucba de la oxidasa se usa como rutina para la identificacién del género Neisseria, No obstante, otros géneros: pueden mostrar también una reaccién oxidasa positiva. 1. Moraxella wrethratis (antigua Mima poly- morpha var. oxida).B) c) Alealigenes faecalis." ® Algunas especies de Pseudomonas.* Algunas especies de Haemophilus. Algunas especies de Bordetella. Algunas especies de Pasteurella.” Vibrio comma.* Especies de Aeromonas ‘Algunas especies de Brucella.” Algunas especies de Bacillus. Bees omsen Ellingworth y col." hallaron que el Haemophilus influenzae era oxidasa neg: tivo utilizando dimetil-p-fenilendiamina, pero posit se usaba el reactivo de Kovacs mas sensible, tetrametil-p-fenil- endiamina. Castor y Chance * afirman que la Pseudomonas mattophilia da a menudo una reaccién oxidasa positiva retardada y que no todas las especies de Pseudomonas son ositivas. Recomiendan que no se emplee [ijreassondes WA oxides anne aes cién del género Pseudomonas. Para utilizar la prueba de la oxidasa en la identificacién del géncro Neisseria, debe realizarse una coloracién Gram en todas las colonias oxidasa positivas. Todas las especies de Neisseria son diplococos gram negativos en forma de grano de café mientras que otros organismos que puc- den mostrar una reaccidn oxidasa positiva son bacilos gramnegativos 0 cocobacilos gramnegativos. Sin embargo, la Moraxella urethralis puede tener una_morfologia Gram similar a la Neiseria. Por lo tanto, se deben utilizar pruebas de fermentacion de los hidratos de carbono para la identi- ficacién final de las especies de Neisseria No debe intentarse realizar una prueba de oxidasa de las colonias cultivadas en un medio que contenga glucosa, ya que su fermentacion inhibira la actividad de la enzima oxidasa, y dara posibles resultados falsamente negativos. Lautrop ® indica que pueden producirse resultados falsamente positives con. la Bordetella pertussis si se cultiva en medios que contengan una elevada concentracién de sangre. 1. Bailey, R, W., and Seott, E, G, Diagnos- tic Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. 'Y. Mosby Company, 1966, pp. 329-330. 2. Barry, A. L., and Bernsohn, K. 1. (1969) Methods for storing oxidase test re- agents. Appl. Microbiol., 17, 933. Prueba de la oxidesa 159 D) Se recomienda el empleo de asa o aguja de inoculacién de platino para retirar las colonias para la prueba de la oxidasa. En este sentido Steel * afirma que la presen- cia de un simple vestigio de hierro puede por sé solo catalizar la oxidacién del reactive fenilendiamina, dando una reac- Gon falsamente positiva Pueden producirse resultados falsamente un cultivo mixto contiene los dos géneros Pseudomonas y Neisseria Las especies de Pseudomonas producen ancia inhibidora que impide la produccién de oxidasa en las especies de Neisseria. Una prueba de oxidasa negativa puede dar una coloracién negra en el medio que rodea a las colonias, pero no en éstas. Este color no tiene importancia. Se puede producir un precipitado negro en el medio circundante en un agar chocola- tado cuando se usa como reactivo un clorhidrato viejo." La. sal oxalato no forma este precipitado."* No rotular simplemente como reactivo de Kovacs el de diclorhidrato de tetrametil- p-fenilendiamina, sino reactivo de oxidasa de Kovacs, ya que existe también un reactivo de indol de Kovacs. Los reactivos de oxidasa se autooxidan pidamente y pierden su sensibilidad La autooxidacién es reducida agregando una solucién de acido ascérbico al 0,1 % directamente al reactivo® durante su preparacidn. Los reactivos se desecharan si se forma un precipitado.'' Evitar la innecesaria exposicidn a la luz, El reactivo de tetrametilo de Kovacs debe ser inco- loro y se desechara cuando toma un color azul intenso.” La confiabilidad del reactivo de tetrame- tilo de Kovacs se limita al tiempo en qu puede producirse un resultado positivo (hasta 60. seg)."* No obstante, el reactivo dlimctilo ubile wneceshar entreil0' 30 min para que se produzca una reaccién positiva Los estudios espectrofotométricos han demostrado que la citocromooxidasa. y la indofenol-oxidasa son Ia misma en- zima.”* * E) F) G) H) BIBLIOGRAFIA 3. BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, sth ed., Cockeysville. Maryland: Division of BioQuest, Divi sion of Becton, Dickinson and Com- pany, 1968, pp. 22 and 172-173 4, Blazevic, D. J., Schreckenberger, P. C.,Reaccién de la I, PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar ia urea, formando dos molé- culas de amoniaco por accién de la enzima ureasa, I, OBJETIVO (Véase también la Seccién I, Capitulos 33 y 34.) A) Esta actividad enzimatica es caracteristica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar los organi mos Proteus rapidamente ureasa positivos de otros miembros de las Enterobacte- riaceae: otros géneros pueden ser posi- tivos retardados. psiella (+) de 2. Proteus (+, rapi escherichia (—) (0) de Providencia (~) B) Ayudar a la diferenciacién en especies. 1. Bordetella pertussis (—) de B. paraper- tussis (+) y B. bronchiseptica (+). 2. Moraxella phenylpyrowvica (+) de otras pecies de Moraxella (por lo gene- =) + 2 HOH Cor + He Anhidride earhonico ureasa 3. Pastewrella pnewmatropica (+) y P. ureae (+) de P, multocida (~) y P. haemoly- tiea (=). A. Fersinia pestis (—) de Y. pseudatubercu- lasis (C4) y ¥. enterocolitica (+). ©) Ayudar a la identificacion de: 1. Bacitlus lentus +). 2! Pseudomonas cepacia (P. maultivorans) (+). If, BASES BIOQUIMICAS El sustrato urea es una diamida del aicido carbonico, a la que frecuentemente se men- ciona como carbamida.® " Todas las amidas (RCO—NH,) son ripidamente hidrolizadas."* La hidrolisis de la urea es catalizada por una envima especifica, la ureasa, para dar dos moléculas de amoniaco. En solucion, la urea se hidroliza, dando carhonato de amonio como producto final * (Véase al pie.) La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicién de los compuestos orginicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en constitutivas 0 adaptativas. Una cnzima adaptativa 0 indu- cida es aquella que es producida por una +2 NH, (NCO, Carbonate de amonio Amwnisess184 Pruebas bioquimicas pora la identificacién de bacterios bacteria solamente cuando se encuentra presente su sustrato especifico.’ La ureasa es considerada una enzima_constitutiva dado que es sintetizada por ciertas bacte tener en cuenta la presencia o ausenc sustrato, la urea.* Existen dos grandes divisiones de las ensimas: 1) hidrolasas, que estén vinculadas con la hidrélisis (agregado de agua) de los teres, hidratos de carbono, proteinas y amidas, y 2) las que estin relacionadas co diversas reacciones de oxidacin-reduccién." La, ureasa se clasifica como una amidasa, catalizando la hidrdlisis de las amidas." Op- enheimer " incluy6 en las amidasas a todas hidrolisis, el enlace entre el nitrogeno y el carbono. En el caso de ka ureasa, el nitogeno es disociado en amoniaco (NH)! Lat ureasa (0 urea amidohidrolasa) ™ ® acta sobre los enlaces C=N del compuesto, con excepeién de los que contienen enlaces. peptidicos."” EI pH 6ptimo para la actividad de la ureasa es 7.4 IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Caldo de ure: 1 de Rustigian y Stuart, pH: 68.6% 1. Ingredientes. a) Fosfato. monopotisico (KH2PO,) 91 g b) Fosfato de sodio (NazHPO,) (buffer de Sorensen) 95 ¢ ©) Extracto de levadura 01 g a) ma pureza, 20 €) Rojo de fenol O01 g 1) Agua destilada 1000 ml 2. Indicador del pH: rojo de_ fenol a) Acido: color amarillo, pH: 68. b) Alcalino: color rojo rosado, pH: 84. ©) Medio no inoculado: 1) pH: 68; 2) color amarillo anaranjado. 3. Productos comerciales. a) Difeo: caldo de urea. b) BBL: ealdo para la reaccién de la ureasa, 4. Método de preparacion. a) Pesar las cantidades exactamente de acuerdo con las_indicaciones. b) Rehidratar con agua destilada 0 desmineralizada ©) No calentar para disolver. La urea se descompone con el calenta- miento. 5. Método de esterili dado, ci6n_ recomen- a) Filtracién. 1. Método del filtro de mem- brana Millipore. 2. Membranas: 0,45 « diimetro del poro. b) Asépticamente, distribuir en tubos aproximadamente 3 ml" por tubo estéril ©) Si el medio es preparado ¢ inocu- lado inmediatamente, no es nece- saria la filtracién; pueden obte- nerse resultados confiables.! d) El medio basico puede ser rehidra- tado en 900 mi de agua destilada y esterilizado en autoclave a 121° C, 15 libras, durante 15 min. Mi tras se est enfriando se agregan 100 ml de a solucién de urea estéril (filtrada) al 20%, y- se distribuye en tubos (en volamenes de 3 ml por tubo estérid.” 6. Dejar enfriar antes de su uso y refrigerar para su conservacién (4- 10° ©). 7. Tnoculacién a) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h (AHK u otro cultivo adecuado) b) Inéculo denso: la cantidad reco- gida con el asa de inoculacion (de 2 mm) tres veces.) 21 ©) Agitar suavemente el tubo para lograr la suspensién de bacte- rias.8. Ineubacién a) Incubadora 0 batio de agua a ype cana b) Observar las reaceiones despué de 8, 12, 24 y 48 h de incubacion, ©) Con el cambio de la temperatura se_producen cambios en la velo- cidad de produccién de ureasa El caldo de urea de Rustigian y Stuart es un medio muy amortiguado en el cual la deteccisn de utilizacion de la urea despues de 48 ho menos de incubacién esta limitada a la produccién de ureasa de las especies de Proteus solamente2" Otros organismos, sobre todo especies Enterobacter (Aerobacter), son capaces de atacar ta urea lenta y débilmente, pero con el caldo de urea de Stuart no resulta demostrable su deteccién de ureasa dentro de las 48 h de incubacion 2# EL extracto de levadura incorporado en el medio suministra los factores de crecimiento esenciales que requieren las especies Proteus, Las especies de Proteus son capaces de utilizar el nitrogeno de la urea, pero otros organismos que producen ureasa requieren una fuente adicional de nitrogeno.* EI indicador del ion hidrogeno, rojo de fenol, demuestra la produccién de ureasa por el género Proteus, mostrando. una. dismi- hucion en la concentraci6n del ion hidregeno debido a la formacion de dos moléculis de amoniaco (NH) B) Agar urea de Christensen, pH: 68.17% 1. Ingredientes. a) Peptona Ig b) Cloruro de sodio 5g ©) Fostato_ monopoti (KH:PO,) 2 ¢g d) Glucosa (dextrosa) (OL %) Do Oy ¢) Urea (20 %) 2g 1) Rojo de fenol 0,012 g g) Agar 2000 g h) Agua destilada 1000 ml 2. Indicador del pH: rojo de fenol a) Acido: color amarillo, pH: 6.8 b) Alealino: rojo rosado, pH: 8.4 ©) Medio no inoculado: 1) pH: 6.8: 2) color amarillo a piel de ante Productos que existen en el comercio, a) Difeos agar con urea basico. b) BBL: agar con urea bisico. Reaccién de la ureaso 185 Método de preparacion y esterilizae cin. # a) Urea hiisiea deshidratada. 1. Pesar exactamente 20 g de la base deshidrataca y disolver en 100 ml de agua destilada 0 desmineralizada, 2. No calemar la solucion, La urea se descompone con el calor 3. Esterilizar por filtracién. Mi do del filtro de membrana Millipore. Didmetro del_poro AB a. b) Agar Disolver 15 g de agar en 900 ml de agua destilada 0 desmi- neralizad: 2. Autoclave: 121° ©, 15 15 min. Enfriar hasta 50° . ‘bras, © Agregar los 100 ml de base de urea estéril, por medios ase pticos, al agar ya la mezcla acuosa 4) Distribuir ef medio asépticamente en tubos esténiles, aproximadamen- te 4a 5 ml/tubo (pico de flauta largo, capa profunda reducida). ©) Si se desea, este medio puede ser empleado en forma liquida."” Dejar entriar oblicua. Enfriar antes de su uso y refr para su conservacion (4-10 C), Inoculacién. cl medio en posicién gerar nto de un cultivo puro de a 24h (AHK u otto cultive conveniente) b) Inéculo denso,* * ™ en cola de pescado, en toda la superficie del pico de fauta. ©) No hacer puncion de la capa profunda, porque ella sitve para control del color." Incubacién, a) 35 b) De 6 a 24 hy todos los dias siguientes durante 6 dias.” A veces es necesarie un periodo mas pro- longado.186 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias El agar urea de Christensen se usa para kt deteccion rdpida de la actividad ureasa de todas kas especies de Proteus, Este medio detecta asimismo la actividad ureasa detinida en las expecies de Enterobacter y otros mien bros de las Enterobacteriaceae * que mues- tran una reaccién de fa ureasit retarclada. Es sibido que las especies de Enterobacter. son capaces de utilizar kt urea come si tinier fuente de nitrégeno2! Las especies de Entera- acter pueden perder su capacidad de utilizar el amoniaco (NH) ureico como sul tities fuente de nitrogen, pero ne pueden retener © reeuperar sit capacidad de hidvolizar lt urea? El medio de Christensen elimin necesidad de un organismo de utilizar los productos derivades de li urea Gumoniaco! como su tinica fuente de nitrégeno y muestra también actividad ureasa en organismos cuyo requerimiento de nitrogeno es mis com- plejo. En el medio de urea de Rustigian y Stuart 2 existen tan pocos elementos nutriti- vos que si un organismo no puede utilizar el amoniaco, debe recurrir al exmacto de levadura que se encuentra en eb medio para Gblener de él el nityegeno el carbon. Si los nutrientes suministrados por ct extracto de levadura se han consumido antes de que el organisine miuestre un crecimicnto apre- Gable, no podria determinarse con exactitud sui capacidad de hidroliaar la urea.” Si_un organismo es capa de hidrolizar ka urea pero no de atilizay cl amoniaco como fuente de nitrogeno, no se produce el crecimiento ¥ es posible observar_ un resultado falsamente negative.” Fl medio de Rustigian y Suuart est muy amortiguado y ello puede ocultar tas reacciones positivas de organismos con una actividad ureasa mocerada? El medio de Christensen evita kt necesiclad de que un organismo utilice el amoniaco como su tinica fuente de nitrogeno, asi como permite la deteccion de la hidrolisis de la urea Causada por otros miembros de las Entero- bacteriaceae, cuya actividad ureasa cs muy leve y retardada.? Esto se produce por: 1) el agregado de ghucosa al medio. 2) disminucion de li concentvacion de peptoma y 3) dismi- nucion del sistema buffer. ‘Todos los miem- bros de las Enterobacteriaceae son fermen- tadores de la glucosa por definicién, y la acide resultante contrarrestara Ia alcalinidad producida por la descomposicion dela peptona: por lo tanto, la glucosa suministra una fuente de energia de la que puede disponer, dejando intaeta a la peptona.? El agregado de glucosa evita las posibles reac- Giones falsamente negativas y estimuka la actividad ureasa en aquellos organismos que hidrolizan Jentamente la urea? La energia suministrada por la fermentacion de- kt ghicosa estimula [a envima urease aumen- tando la velocidad del metabolismo vy kt reproduccin celular.” Elagregado de ghost no aumenta de manera apreciable Ta acti- vidad ureasa del género Proteus, lo qu sugiere que su_ureasa es una enzima consti- tutiva Gon el medio de Christensen la velocidad de hidrélisis de ka urea permite dilerenciay entre especies de Protens ¥ otros organismos ureasa positives. Todas las especies de Proteus muestrin una reaceién positiva en ef pico de flauta dentro de un periodo de incubacion de 1a 6h? con el caracteristico color rojo viokiceo (rojo vosude) que se extiende por todo el_medio al término de 6 h de Incubacién. No es rare que un organismo Proteus muestre una reaccion positiva despucs, dle 30 min solamente de incubacion, ya que su actividad ureasia es muy ripida cn el medio de Christensen, El grado y velocidad de penetracién del color en todo cl medio es una medida de la actividad ureasa de an orga- nismo.’ 'Vodas las especies de Proteus dan una reaceion +4 después de 24h de incubacion No hay diferencia en la velocidad de hidvo- lisis cle ka urea entre las especies de Proteus en el medio de Christens Los organismos ureasa positives retardados como especies de Klebsiella 0° Enterobacter varian en cuanto a su velocidad de hidvalisis de la urea, Algunos presentan una reaccion +1 después de 6 h de incubacion que puede raluna reaccion +4 después de 3 a5 dias: incubacion, mientras que otros solamente dan una reacci6n +1 al cabo de 6 dias.? V. RESULTADOS Las folografias en colores de los refultodos pueden verse en lo Figura 28-1 (Apéndice 1) \TERPRETACIONES A) Caldo de urea de Stuart 1. Reaceién positiva a) Color rojo rosado intenso en todo el caldo. b) Solamente especies de Proteus. 2. Reaccion negativa: no se produceB) A) cambio de color (amarillo jado) naran- ristensen. Agar urea de C 1. Reaccién positiva: color rojo resado intenso (rojo viokiceo) en el pico de flauta. El color puede penetrar en el agar i a) Positiva ripida: de 1a 6 h para todas las especies de Proteus, b) Positiva retardada: de 24 h a 6 dias de incubacién o mas. 1. Alguna: de_ Klebsiella 2. Algunas cepas de Enterobacter 3. Algunas cepas de Citrobacter. 4. Otras bacterias que no son Enterobacteriaceae, por ejem- plo, algunas especies de Bor detella ¥ todas las especies de Brucella. cepas 2. Reaccién negativa: cambio de_ color amarillo palido) no se produce (color de ante a VIL, PRUEBAS RAPIDAS Reaccién de la ureasa con tira impreg- nada con reactivo (PathoTec). 1. Fabricante: General Diagnosties Divi- sion, Warner-Lambert Company Resultados dentro de las 2h de incubacién. Método: seguir las indi fabricante 4. Correlacién con el método standard de Christensen. iones del s a) Deteccion positiva. 1 Entre las Enterobacteri ‘eae. a) Solamente especies de Pro- tes.” b) Especies de Proteus, Klebsie- Ua y Enterobacter** ©) Todas las especies de Kleb- siella y algunas de Serratia, Citrobacter y Proteus. 2. Ouras bacterias gramnegativas no fermentadoras. a) Herallea * (actualmeme es- pecies de Acinetobacter). Reaccién de la ureosa 187 b) Pseudomonadaceae.*" b) Correlacién, 1. 100 %,* 97.2 %P 90,2 %2! 90%? complementarias.® 2. Falsos negativos: ** Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. 3. Falsos positivos: Klebsiella.** Borchardt y Weaver y col.® observaron que la reacci6n de la tira era mas sensible que el medio de Christensen; sin embargo Bla- zevic y col2 hallaron que la primera era menos sensible. Matsen y Sherris® reeo- miendan que se utilicen tanto tiras de ureasa y fenilalanina para la identificacién presun- tiva de especies de Proteus (ureasa positivas, fenilalanina positivas) B) Tabletas para la reaceién de la ureasa de Key 1. Fabricante: Key Scientific Products Company. Formula de Christensen. Resultados dentro de las 6 a 12 h de incubacion. Método: seguir fabricante. * »K las indicaciones del C) Discos de urea, Fabricante: Difco Laboratories. Resultados dentro de 1 a 4 h de neubacibn. 3. Método: seguir las indicaciones del fabricante. ta VII. PRECAUCIONES A) Caldo de urea de Stuart. 1. El elevado sistema buffer oculta la actividad ureasa en organismos que son positivos retardados; por lo tanto, se destina este medio tinicamente para la deieccién de la actividad ureasa en todas las especies de Proteus.” 2. El Proteus morganii es un hidrolizador lento de la urea’ y después de 24h de incubacién la reaccién puede mos- trar apenas un color rosado muy piilido. Cuando haya dudas en cuanto al resultado, compararlo con un tbo de medio no inoculado 0 volver a Incubar durante otras 24h. El P. morganié requiere por lo general apro-188 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias Cuadro 28.1 Reacciones pH ” Pevioto de incubacin hs 6: a 9 2-9 1 Todas las especies de Prot. ximadamente 36 h de incubacién 5. Pueden producirse resultados falsa- para que dé una reaccién ureasa mente negativos si la cantidad de Intensamente positiva.* NH formado es tan escasa que no La reaccién de la ureasa intensa- puede cambiar la concentracién del mente positiva para las especies de ton hidrégeno del elevado sistema Proteus se produce cuando el pH llega buffer y no puede alcanzar un pH a 81 o mas Existen_ variaciones alcalino para hacer que el indicador en la reaccién del pH segiin el rojo de fenol indique un cambio de periodo de incubacién y la especie color en el medio. de Proteus en estudio (véase el cuadro 28-1). Agar urea de Christensen. El Proteus vulgaris y el Proteus mirabilis daran una reaccién ureasa 1. Las especies de Proteus vuelyen alea- positiva (pH: 8,1) después de aproxi- 10 (rojo rosado) el medio de Chris- madamente 8 h de incubacin. El tensen poco después de la inoculacién. Proteus retigeri ataca rapidamente a la Para que los resultados sean vilidos urea, dando un resultado. positive para la deteccién de especies de en unas 12 h, El P. morganii requiere Proteus, deben ser leidos dentro del aproximadamente 36 h de incubacion intervalo de las primeras 2 a 6 h de para que se produzca una reaccién incubacién. El Citrobacter freundii y ureasa fuertemente positiva™ la Klebsiella pneumoniae pueden con- 38. Pueden producirse variaciones en el vertir el agar urea de Christensen PH de las reacciones positivas debido dentro de las 24 a 48 h. Este medio a las diferencias en el tamaiio del detecta la actividad ureasa rapida inéculo utilizado, o a diferencias en de las especies de Proteus tinicamente. la velocidad de actividad ureasa de las 2. El medio de urea de Christensen diferentes cepas de Proteus: Aumentando el indculo de una suspension bacteriana en solucién fisiologica de Proteus, de 0,01 a 0,1 ml, disminuye el tiempo necesario para alcanzar un pH de 8,1; sin ‘embargo, un indculomasdenso no pro- voca mayor aceleracién. El inéculo tipo aceptado es de 0,1 ml, lo que dar un resultado positive aproximada- mente 3 h antes que si se usa un indeulo de 0,01 ml? 4. El volumen de sustrato empleado yfo la temperatura de incubacion pueden alterar la velocidad de pro- duccién de ureasa por la especie de Proteus.” Utilizando un inéculo constante, y variando el volumen del medio por tubo, de 15 a3 y de 45 a ml, Stuart y_ col. demostraron que el tiempo necesario para que se produjera una reaccién positiva au- mentaba con el volumen. El minimo aceptable de medio por tubo, para una interpretacién exacta. es de 1,5 mi no se usa para determinar la velo: Gidad absoluta de actividad ureasa, Muchos organismos ureasa_ positives que no son Proteus pueden hidrolizar la urea dentro de las 24 hy seguir después descomponiendo lentamente la urea. Esto se manifiesta por el color alcalino que penetra por todo el medio, tanto en el pico de flauta como en la capa profunda, Esta nue degradacién de’ la urea puede ser debida a la falta de tolerancia de algunos organismos al aumento del pH alcalino, lo que da como resultado consiguiente _disminuc idadt ureasa.?