You are on page 1of 41

Inginerie citotisulara

si organe artificiale
Ingineria tisulara a osului si
cartilajului
CURS 7

esutul osos este unul dintre numeroasele tipuri de esut


conjunctiv ce se gsete n organism, care implic o matrice
extracelular bogat n colagen. Alte exemple de esut conjunctiv
sunt cartilajul, ligamentele, tendoanele, muchii.
esutului osos i se atribuie trei funcii importante n
organismul uman:
(i) ofer sprijin mecanic precum i suport pentru inserarea
muchilor,
(ii) are un rol protector pentru organele interne i mduv,
(iii)furnizeaz ionii necesari pentru funcionarea normal a
organismului

Structur i compoziia esutului osos


esutul osos n sine este compus din mai multe tipuri de celule diferite
fiecare cu funcia lor specific, precum i o matrice extracelular, aa cum se
poate observa din figura 1. Matricea extracelular este compus din 95% de
colagen de tip I i proteoglicani, mpreun cu proteine noncolagenice, 5%.
Proteoglicanii sunt molecule de greutate molecular ridicat derivai din
proteine i polizaharide, care, de obicei, se gsesc n esuturile structurale i
cele conjunctive. Un exemplu de proteoglicani sunt GAG, frecvent ntlnii la
nivelul esutului osos ct i cel cartilaginos.

Structura tesutului osos cortical si spongios

Osul este un esut de legtur, format dintr-o matrice extracelular


mineralizat i celule specializate: osteoblaste - OB, osteocite i osteoclaste
- OC. Principalul component organic al matricei este colagenul de tip I, ce
este n procent de 90%, i restul de 10% este repezentat de o serie de
proteine nestructurale de dimensiuni mici, printre care se gsete
osteocalcina, osteonectina, unele fosfolipide, siloproteine, factori de cretere
i proteine serice.
Faza anorganic este alctuit din cristale minuscule dintr-un
mineral cu caracter alcalin, Hap. Aceste cristale se ncrucieaz cu fibrele
de colagen pentru a forma un material ce ntrunete caracteristicile
adecvate de rigiditate, flexibilitate i rezisten.

OB, celulele formatoare de os, lucreaz n grupuri pentru a segrega i


a mineraliza, pachete din matricea osoas. Microscopic, OB active, sunt
observate precum nite celule cuboidale, cu un reticul endoplasmatic
proeminent, caracteristic celulelor secretoare de proteine, situate la
suprafaa osoas (figura 2). Aceste celule sintetizeaz din abunden
fosfataz alcalin, o enzim care contribuie la mineralizarea matricei
extracelulare.

Schema de formare si
resorbie a esutului
osos n funcie de
sarcinile aplicate

Remodelarea osoas cuprinde cinci faze


distincte:
Faza de repaus: cnd suprafaa esutului osos este acoperit
cu celule inactive. OB sunt fixate n matricea mineralizat.
Faza de activarea: stimulii hormonali sau fizici trimit semnale
ctre monocitele mononucleare i macrofage pentru a migra la
locul unde este necesar remodelarea i pentru a se diferenia
n OC.
Faza de resorbie: OC ncep s elimine componentele
organice i minerale de la nivelul esutului osos precum i
formarea unei caviti caracteristice denumite lacuna lui
Howship, la nivelul esutului osos trabecular ct i la nivelul
esutului cortical.

Faza de inversie: OC dispar, iar celulele macrofage mononucleare


se aglomereaz n zona resorbit de ctre osteoclaste, depozitnd o
substan care va favoriza depunerea noului esut osos; dup care
pre-osteoblstele ncep s apar datorit unor factori de stimulare
precum IGF-2 i TGF-.
Faza de formare: OB se difereniaz i acoper cavitatea format
de OC ducnd la formarea de noi osteoni prin depunerea de colagen
de tip I.

Remodelarea esutului osos

1.Hormonii:
Hormonul paratiroidian (PTH): formarea i activitatea OC;
proliferarea i activitatea OB turnover
PTH intermitent: formarea esutului osos in
vivo
PTH n doze mari: resorbie osoas
pierderea esutului osos.
Vitamina D: formarea i activitatea OC;
proliferarea OB;
diferenierea OB
Necesar pentru mineralizarea matricei osoase:
deficien rahitism.
Calcitonina: formarea i activitatea OC.
Glucocorticoizii:
Necesari pentru dezvoltarea i funcionarea normal a
osului
n exces pierdere de esut osos/ osteoporoz.
Hormoni de cretere:
Necesari pentru creterea normal a scheletului.
Hormonii sexuali (estogeni i androgeni):
formarea i activitatea OC; activitatea OB (posibil)
Deficitul osteoporozii

2. Factori locali:
Factorii de cretere i citochinele:
Efect variabil asupra formrii i activitii OC i OB
Alte molecule:
Prostaglandinele: activitatea OC
Leucotrinele: formarea i activitatea OC
ATP extracelular: formarea i activitatea OC,
activitatea OB
Bradikinina: formarea i activitatea OC
CGRP (Calcitonin-Gene Related Peptide): formarea i
activitatea OC

3.Ageni anorganici (locali i sistemici) :


H+ extracelular (pH < 7,2): activitatea OC, activitatea OB
PO43-: formarea i activitatea OC
Ca2+ : formarea i activitatea OC (efect limitat)
F- : formarea osoas
Hipoxia: formrii OC, funciei OB
Oxidul nitric: formarea i activitatea OC, activitatea OB,
intervine n rspunsul la solicitri mecanice
4.Efecte mecanice:
ncrcturi regulare ciclice: activitatea OB, formarea osoas.
Absena greutilor: formarea i activitatea OC
Schimbri majore ale presiunii hidrostatice: apoptoza OC

Proprietile mecanice ale esutului osos


Tabelul 2. Proprietaile mecanice ale esutul osos uman
esut osos cortical

Rezisten (MPa s.d.)

Modulul de elasticitate
(GPa s.d.)

Compresiune

180 36

18,6 28,8

151 28

7,1 28,2

65 9

esut osos spongios

Rezisten (MPa s.d.)

Modulul de elasticitate
(MPa s.d.)

Compresiune

1,512

40400

Tractiune
Torsiune

Perspective clinice

Os sanatos

Grefele osoase sunt necesare


pentru repararea tesuturilor
lezate ca urmare a:
traume

- boli
defecte congenitale

Restabilirea functiei osoase


protejare organe vitale
medierea activitatilor

dependente de musculoschelet

Os - osteoporoza

Semnificatie clinica

Tesutul osos ocupa locul 2 intre cele mai


transplantate tesuturi:
643,000 proceduri anuale (USA)
cost ~ $600 milioane/an (USA)

Natura transplantului
45% autologe
45% alogenice
10% sintetice

10% dintre grefe esueaza

Grefe osoase autologe


Transplantul de tesut de la acelasi pacient Stimulare Vindecare
Imbunatatiri clinice:

celule, factori de crestere in tesutul grefat

Pot fi remodelate:
nou os format
grefa transplantata resorbita

Limitari:
disponibilitatea de tesut donor (forma si marime)
doua interventii chirurgicale (dureros pentru pacient,

cost ridicat)

Grefe alogenice si sintetice


Inlocuirea functiei tesutului
Avantaje

varietate de forma si marime


interventie chirurgicala unica

Dezavantaje
integrare slaba
rupturi mecanice in material

Strategia in ingineria tisulara a


osului

Producerea de materiale cu caracteristici


similare grefelor osoase autologe

Producerea de materiale cu compozitie similara


grefelor osoase autologe
celule si factori de crestere in matrice colagenice

mineralizata

Strategia in ingineria tisulara a


osului si cartilajului
Suport

Celule
Cultura de celule

Substante
active

Aplicatie
clinica

Suportul
Definit de forma tesutului care trebuie vindecat
Macroporos cu suprafata extinsa pentru a favoriza
adeziunea celulara si dezvoltarea de tesut

Goldstein et al. Tissue Eng 5:421, 1999

Pentru ingineria esutului osos, materialele de


substituie trebuie s prezinte:
Biocompatibilitate: lipsa rspunsului imunogenic.
Biodegradabilitate: este un material ce odat implantat
sufera un fenomen de degradare (enzimatic, acid,
bazic), prin interaciune cu sistemele biologice. Acest
degradare se produce ca rezultat al unui proces de alterare
i transformare al implantului datorit aciunilor celulare,
enzimatice, bacteriane sau virale.

Osteoconductivitate: este o proprietate pasiv a unui


material ce permite acceptarea i conducerea creterii
osoase. Aceasta cretere se realizeaz prin invazia
vascular i celular.
Osteoinductivitate: este capacitatea unui material de
a induce o difereniere celular pn la sinteza matricei
osoase mineralizate.
Osteogenitate: reprezint formarea esutului osos
nou format din osteoblaste.
Proprieti mecanice: materialele de substituie
trebuie s posede proprieti mecanice asemntoare
cu cele ale esuturilor nvecinate pentru a preveni un
dezechilibru mecanic, care poate duce la stres i
resorbie osoas.

Suportul
Caracteristici esentiale
stimuleze functiile celulare: factori bioactivi pe

suprafata materialului, medicament/gene in


material

compliante/degradare

Suportul - os
Dintre diferitele solutii care s-au propus ca materiale de
substitutie a osului sau care sa ajute regenerarea acestuia se pot cita
ceramicile de hidroxiapatita, amestecate sau nu cu colagen.
Materialele cu colagen - foarte bune biocompatibilitati dei
sunt putin osteoconductoare, cele mai utilizate materiale colagenice
fiind atelocolagenul sau fibra de colagen
Un biomaterial implantabil s-a realizat prin formarea treptat de
cristale de hidroxiapatit ntr-o matrice tip burete de colagen
liofilizat.

Rezultate
In timp ce buretele de colagen netratat s-a degradat rapid (ntr-o zi),
implantul ncrcat cu minerale a fost capabil s-i menin integritatea
timp de 2 sptmni. In cultura de celule s-a pus n eviden o degradare
medie a implantului printr-o descretere a coninutului de calciu.
Morfologia colagenul liofilizat i forma sa mineralizat (coninnd fosfat
de calciu) arata ca structura poroas a colagenului liofilizat original a fost
meninut cnd s-a realizat depunerea cristalelor de fosfat de calciu de
form acicular. Aceasta are o semnificatie deosebita atunci cnd se
ateapt ca matricea de colagen s fie utilizata pentru creterea i
proliferarea celular, difuzia celulelor fiind dependenta de marimea
porilor suportului. Buretele colagenic are, n stadiul uscat,
Pstrarea morfologiei celulare, rotunde originale, asociat cu
interactiunea moderat celul-substrat indic n general faptul
ca celula si manifest functia sa diferential.

Fosfat de calciu

Fosfat de calciu
sintetic

1.
2.

Colagen

Polimer

=
=

OS
Compozit Fosfat de
calciu / Polimer

Proprietati care sa simuleze pe cele ale osului natural


Bioactivitate

. Diferite forme de fosfai de calciu, abrevierea lor,


formula chimic i raportul Ca/P
Componentul

Abreviere

Formul chimic

Raport Ca/P

-Fosfat tricalcic
-Fosfat tricalcic
Fosfat monocalcic monohidrat

-TCP
-TCP
MCPM

-Ca3(PO4)2
-Ca3(PO4)2
Ca(H2PO4)2 * H2O

1,5
1,5
0,5

Fosfat monocalcic anhidru

MCPA

Ca(H2PO4)2

0,5

Fosfat dicalcic anhidru, moneit

DCPA

CaHPO4

1,00

Fosfat dicalcic dihidrat, bruit

DCPD

CaHPO4 * 2H2O

1,00

Fosfat tetracalcic
Fosfat octocalcic

TTCP
OCP

Ca4(PO4)2O
Ca8H2(PO4)6 * 5H2O

2,0
1,33

Hidroxiapatit
Hidroxiapatit deficit n calciu

Hap
CDHap

Ca10(PO4)6(OH)2
Ca9(HPO4)(PO4)5OH

1,67
1,5

Procese in sinteza matricilor

Colagen- hidroxiapatitaacid citric


Pentru cresterea capacitatii de
formare a hidroxiapatitei pe
membrane colagenice s-a propus
utilizarea acidului citric ca agent
de complexare, cunoscut fiind
faptul ca mai bine de 70% din
cantitatea de citrat existenta in
organism este localizata la nivelul
sistemului osos.

Reprezentarea schematica a formarii cristalelor


de hidroxiapatita pe membrana de colagen prin
intermediul acidului citric

Acidul citric se leaga de membrana colagenica la functiile -OH, -C=O,


-NH2, prin legaturi de hidrogen, prin intermediul functiilor hidroxilice.
Sarcinile negative ale acidului citric pot chelatiniza simultan cu ioni de
Ca2+ din solutie formnd complex Ca-citrat. Se formeaza agregate prin
adsorbtia ulterioara a fosfatilor si ionilor de calciu, rezultnd structuri
tridimensionale care se pot constitui ca nuclee pentru cristalele de
hidroxiapatita.

Alte materiale:
- colagen + hidroxiapatita + acid hialuronic;
- microsfere de colagen cu hidroxiapatita
- chitosan + hidroxiapatita

Date de microscopie optica a compozitului colagen-hidroxiapatita

Suportul - cartilaj
Cartilajul prezinta o capacitate redusa de autorefacere datorita naturii
sale nevascularizate. Din aceasta cauza, in prezent se practica
reconstructia sa plastica sau chirurgia ortopedica ca tratamente pentru
pacientii cu defecte datorate artritelor, anomaliilor congenitale sau
traumelor diferite.
Terapiile includ:
-transplantul;
-implantul de dispozitive protetice artificiale.
Amndoua tehnici prezinta insa dezavantaje:
-transplantul presupune gasirea de tesuturi donatoare;
-apar dificultati legate de marimea grefei si fixarea acesteia;
-protezele pot produce toxicitate datorita adeziunii la interfata
cu ruptura.

Sistemul model
Condrocitele izolate se insamanteaza pe suporturi de polimer
biodegradabil si se realizeaza culturi in vitro, in capsule petri,
recipient cu elice sau bioreactor, inainte de implantarea in vivo
pentru a forma un neocartilaj sau pentru a repara cartilajul
articular.
Se folosesc ca suporturi biodegradabile:
-colagen;
-acid hialuronic;
-acid poliglicolic
care asigura o structura 3D pentru atasarea celulelor si stabileste
marimea si forma tesutului proiectat. In conditiile specifice ale
culturii in vitro, condrocitele prolifereaza in interiorul suportului
si secreta matricea extracelulara cartilaginoasa formata din
glicozoaminoglicani si colagen. Degradarea suportului in paralel
cu regenerarea tesutului conduce la o biocompatibilitate in timp.

Fig.7 Sistemul model


Suportul poate fi proiectat astfel inct sa corespunda criteriilor specifice ingineriei tisulare.
Astfel, ideal ar fi ca materialul:
a)
sa fie reproductibil intr-o structura poroasa 3D permitnd o distributie spatiala
uniforma si diminuarea constrngerilor difuzionale din timpul culturii in vitro;
b)
stimularea proliferarii celulare si secretia matricii extracelulare fara aparitia
efectelor secundare sau toxice;
c)
biodegradarea intr-un ritm controlabil.

Alte potentiale avantaje:


utilizarea att a condrocitelor autografe ct si alografe;
imunoprotectia oferita de sechestrarea antigenelor
suprafetelor celulelor de catre matricea extracelulara generata in
timpul culturii in vitro;
abilitatea de control a culturii in vitro;
posibilitatea cresterii in vitro a cartilajului in mod
continuuu si astfel complet integrat cu tesutul gazda in care se
implanteaza.

Sistem celula polimer - bioreactor


Celule precursoare:

Bioreactor:
Ex. Vas rotativ

Suport polimeric:
ex. Material fibros
sau burete poros

Produs al ingineriei tisulare

Aplicatia:

Ingineria tisulara a cartilajului

Structura cartilajului produs


Retea de colagen (Scanning Electron Micrograph)
nativa

Riesle et al., J Cell Biochem


71: 313, 1998

Celule
Formeze un tesut de tip os sau cartilaj
Asamblu
Crestere 3 D

Formare Matrice

Diferentiere

Vascularizare

Surse de Celule

Celule
Cerinte esentiale:
Stimulare proliferare fara pierde a

pluripotentei
Diferentiere directa in liniile celulare

dorite.

Agenti farmaceutici
Caracteristici:
Diferiti agenti necesari in diferite stadii

de dezvoltare a celulei spre tesut osos


Suporturi proiectate astfel incat sa

elibereze diferiti factori la anumite


intervale de timp bine precizate

Agenti farmaceutici
Hormoni,

factori de crestere:

Stimulaeaza proliferarea celulara


Diferentiere directa a celulelor

multipotente in tesut specific


Exemple:
dexamethasone
factor de crestere de tip insulina-I (IGF-I)
proteina morfogenetica a osului-2 (BMP-2)