Inginerie tisulara

C2

Biocompatibilitatea -interactiunea biomaterial-organism

- interactiunea cu proteinele;
-interactiunea cu enzimele;
-interactiunea cu celulele.

Fenomene la interfata biomaterial-organism

Interactiunea biomaterial-organism poate fi reprezentata
schematic sub forma:

Interactiunea biomaterialelor cu proteinele

Multitudinea de proteine existente la nivelul corpului uman si varietatea de
structura si proprietati ale acestora, determina manifestarea unor interactiuni
complexe cu biomaterialul, interactiuni care vor afecta si procesele biologice de la
nivelul celulelor sau ale matricii extracelulare.

Relatia biomaterial- component proteic

Se constata prezenta att a proteinelor fibrilare (colagenul, elastina,

laminina), ct si a proteinelor globulare( albumina,
imunoglobulina), deci o varietate de structuri chimice proteice si o
multitudine de tipuri de amestecuri proteice. Pentru a studia , in
aceste conditii, fenomenul de adsorbtie al proteinelor la suprafata
biomaterialelor, trebuie abordate procesele att din punct de vedere
termodinamic ct si din punct de vedere cinetic.

Lund in considerare caracterul adsorbtiei proteinei se poate spune ca

procesul are loc in trei etape :
transportul proteinei la limita energetica a suprafetei;
interactiunea si atasarea la suprafata ( pot aparea perturbatii in structura
proteinei);
relaxarea proteinei adsorbite la o stare stabila din punct de vedere conformational.

Adsorbtia proteinelor
la suprafata
biomaterialelor

Cinetica proceselor de adsorbtie a proteinelor la suprafata biomaterialelor

Analiznd procesul de adsorbtie din punct de vedere cinetic, adica prin
prisma variatiei in timp a cantitatii de proteina adsorbita pe suprafata, s-au propus
trei faze la contactul proteina- biomaterial:

Etapele adsorbtiei proteinelor

Nucleatia
Numarul de puncte disponibile pentru legaturi monomoleculare (puncte
de nucleatie) difera de la suprafata la suprafata, dar in general este de ordinul
109-1010 molecule/cm2. Este foarte dificil de masurat aceste legari initiale ca
urmare a timpului de urmarire f. redus.

Cresterea
Formarea unuia sau a mai multor agregate tridimensionale pe suprafata se
poate realiza daca energia libera de interactiune scade odata cu numarul de
molecule adsorbite. Aceasta energie va fi rezultanta intre intensitatea
interactiunilor intermoleculare proteina-proteina si interactiunile suprafataproteina.
Ecuatii cinetice pentru crestere:
S
t
s
sd des

1
f t 1 t exp

kt
kt

sd - energia libera de activare pentru difuzia moleculelor la suprafata

- densitatea de situri de legare independent
- frecventa de coliziune cu siturile de nucleatie
Legea logistica de crestere limitata ( Smith C )

R f t N

S
S ktdes
g t 1
e
t
S m ax

Smax - numarul maxim de molecule

g(t) - functie de timp si corespunde probabilitatii de interactiune favorabile intre
moleculele legate si cele care difuzeaza spre suprafata

S Rs 1 e t - probabilitatea interactiunilor favorabile intre

Statistica
moleculele adsorbite si cele adsorbabile
Aceste ecuatii presupun o crestere rapida a filmului proteic( variatie
exponentiala), fiind observata si experimental, pentru intervale de timp reduse,
cresterea fiind limitata de diferiti factori externi: transport de masa, geometria
agregatelor in crestere.
Desorbtia
Dependenta de timp a desorbtiei este limitata de geometria agregatelor in
adsorbite, numarul de ciocniri ale macromoleculelor cu agregatele si densitatea
fluctuanta a moleculelor blocate la suprafata.
S
des
S n exp
t
kt

des
S
h S S o e kt ;0 S 0 S
t

h() - viteza de desorbtie, care depinde de frecventa de coliziune si durata de

adsorbtie
S0 - numarul de molecule la care densitatea de suprafata devine constanta

Viteza de adsorbtie, tinnd cont de nucleatie, crestere si desorbtie limitata poate fi

scrisa:

S
R s N max N k t Nf t h S S 0
t
Adsorbtia competitiva a proteinelor
Ecuatiile cinetice permit descrierea procesului de adsorbtie in cazul in
care in sistem se gaseste o singura specie proteica. Intrebarea care apare este: ce
se intmpla in cazul in care in mediu se afla proteine diferite? Cum se poate
aborda problema adsorbtiei in cazul plasmei sanguine, care contine peste 100
proteine diferite, din care cel putin 12 au o concentratie 1mg/ml?
Inca din anii 1960 Leo Vroman, studiind adsorbtia fibrinogenului din plasma la
diferite tipuri de materiale( sticla, tantal anodizat, oxid de siliciu), pentru intervale
reduse de contact, folosind tehnici imunologice (si anume urmarind reactivitatea
fata de ser de antifibrinogen), constata ca in timp are loc o indepartate a acestei
proteine de la suprafata.

Variatia cantitatii de
fibrinogen adsorbita in timp
la suprafata:----sticlei si
poli(metilmetacrilatului)

Variatia cantitatii de
fibrinogen adsorbit din
plasma pe biomaterial in
functie de concentratia in
plasma a acestuia

Deoarece tehnicile utilizate de Vroman nu erau suficient de performante, el nu

reuseste sa deceleze cauzele care determina cresterea activitatii imunologice. El
considera ca fenomenul putea fi datorat modificarilor structurale si orientationale
ca urmare a imobilizarii proteinei pe suprafata solida, inlocuirii fibrinogenului de
catre alte proteine plasmatice, digestiei porteolitice a fibrinogenului adsorbit de
catre enzime sau mascarea fibrinogenului de catre proteinele adsorbite.
Ulterior, utilizdu-setehnici avansate (fibrinogen marcat si tehnici ELISA) s-a
aratat ca fibrinogenul adsorbit este inlocuit la suprafata biomaterialelor de catre
proteine plasmatice cu o afinitate mai mare la suprafata.
Totusi, ca o recunoastere in depistarea fenomenului, acest proces poarta numele de
efect Vroman. Studiile efectuate pe alte tipuri de proteine si suprafete (
polietilena, polistiren), au aratat generalitatea efectului Vroman.

Mecanismul adsorbtiei competitive a proteinelor

Lund in considerare efectul Vroman, s-a incercat elaborarea unui mecanism de
adsorbtie al proteinelor la suprafata biomaterialelor, ct mai realist. Aceasta
presupune stabilirea influentei fortelor de interactiune care se manifesta la
interfata biomaterial proteina si intre proteinele adsorbite si cele in curs de
adsorbtie.
De exemplu, pentru o suprafata hidrofoba si proteina in stare hidrofoba. Att
suprafata ct si proteina vor fi inconjurare de molecule de apa aranjate nefavorabil
dpdv energetic:

Adsorbtia si desorbtia proteinelor la suprafata biomaterialului

Molecula proteica se va deplasa ca urmare a agitatiei termice si se va ciocni cu

suprafata. Acesta ciocnire va avea ca rezultat indepartarea stratului de molecule de
apa dintre proteina si suprafata. Daca energia rezultata in urma acestui proces este
mai mare dect energia termica a moleculei proteice, aceasta va ramne pe
suprafata. In caz contrar se intoarce in solutie.
Contributia interactiunilor electrostatice la mecanismul de adsorbtie, conform
estimarilor cantitative, este secundara iar fortele Van der Waals sunt neglijabile.
Ce se poate spune despre procesul de desorbtie?
Asa cum am amintit , moleculele proteice adsorbite pot fi inlocuite de alte molecule
proteice. O confirmare a acestui fapt o constituie si studiile de circulatie a unor
solutii tampon peste suprafetele cu proteine adsorbite, cnd fenomenul de desorbtie
nu se produce.
Prezenta moleculelor proteice in solutie diminueaza interactiunile dintre molecula
proteica adsorbita si suprafata prin efecte asupra retelelor moleculelor de apa
dispuse in jurul acestora. Acesta va determina modificarea balantei dintre fortele
entropice si cele hidrofobe, producndu-se desorbtia.

In momentul in care o suprafata si un amestec de proteine vin

in contact, initial toate proteinele sunt distribuite uniform in solutie.
La contactul cu suprafata, proteinele se vor adsorbi formnd un strat
proteic pe biomaterial. Formarea mai multor straturi presupune
manifestarea unor interactiuni puternice intre proteine si este posibila
in cazul proteinelor care in solutie se afla sub forma de agregate
(insulina).
Proteinele cu afinitatea de suprafata cea mai mare (cel mai mare k) se
vor adsorbi preferential. Totusi, procesul este limitat de transportul de
masa si prima proteina adsorbita va fi una cu cea mai mare viteza de
transport. Eventual, proteina cu urmatoarea valoare a vitezei de
difuzie isi va creste concentratia la suprafata, dar va putea inlocui
prima proteina adsorbita numai daca afinitatea de suprafata este mai
mare. Procesul continua pna cnd proteina cu afinitatea cea mai
mare acopera suprafata, este adsorbita si mentine echilibrul.

INTERACTIUNEA BIOMATERIALULUI CU FLUIDUL SANGUIN

Notiuni introductive privind functiile sngelui

Sngele este un tesut lichid, eterogen, alcatuit din doua faze, una
propriuzis lichida-plasma, care este o solutie apoasa de proteine si saruri minerale,
tamponata la pH=7.35- si cealalta solida, corpusculara, reprezentata prin
eriltrocite, leucocite si trombocite, suspendate in partea lichida.
Data fiind pozitia sngelui in ansamblul functional al sistemelor lichide
din organism- lichid interstitial, intracelular, intravascular- sngele are de
indeplinit cteva roluri, care, in esenta se pot concentra in doua functii
fundamentale:
functia de transport;
functia reglatoare homeostatica.

Functia de transport
Aceasta consta in vehicularea, in dublu sens, intrare si iesire, a tuturor
substantelor necesare vietii celulare sau a celor rezultate din metabolismul
intermediar. Dintre principalele substante transportate sunt in primul rnd cele
legate de respiratie, oxigenul transportat de la plamn la tesuturi si CO2 in sens
invers. Fiecare eritrocit contine 28milioane molecule de hemoglobina, proteina
transportoare de oxigen. Urmeaza apoi substantele nutritive- aminoacizi, acizi
grasi, vitamine- provenite din tractul digestiv, precum si produsele finale ale
metabolismului intermediar( uree, acid uric) vehiculate pentru eliminare prin
rinichi, plamn, pieele, intestin- precum si hormonii transferati de la glandele
endocrine catre tesuturi tinta. Proteinele plasmatice transportate pot lega
substante cu proprietati hidrofobe, dispunnd de o suprafata functionala de
700000m2.
Prin proteinele transportate si proteinele plasmatice de tipul
imunoglobulinelor si prin leucocitele sale, sngele ia parte la procesul de aparare
specifica organismului. Prin proteinele anticorpi, limfocite, macrofage si
plasmocite, sangele asigura desfasurarea proceselor imune fata de agenti
infectiosi- virusuri sau bacterii- sau proteine straine.
Functia de transport are deci trei componente principale: respiratorie,
nutritiva si de aparare.

Functia reglatoare homeostatica

Se realizeaza cu urmatoarele componente:
izoionie- pastrarea constanta a concentratiilor si raporturilor ionice ( cationi Na+, K+,
Ca2+, Mg2+; anioni Cl-, H2PO4-, HCO3-) si a echilibrului acido-bazic cu mentinerea
concentratiei ionilor de hidrogen la pH=7.35
izotonie- mentinerea la nivel constant a presiunii osmotice a sngelui, proportionala cu
numarul de molecule de compusi nedisociati si cu numarul de ioni ai electrolitilor care
se gasesc in solutie, dintre care ionii de Na+, Cl-, HCO3- raspund de 85% din presiunea
osmotica totala. Orice marire a presiunii osmotice intr-unul dintre sectoarele hidrice (
intramuscular, extracelular, intracelular) trebuie sa fie compensata, in conditii
fiziologice, prin modificari de volum hidric. Izotonia este corelata cu mentinerea
constanta a tebloului sanguin. Datorita continutului sau proteic, in special nivelul de
concentratie al albuminelor serice, sngele exercita o presiunee coloid-osmotica
datorita careia faza lichida este mentinuta in sistemul vasculat;
izotermia- mentinerea constanta a tempereaturii corpului. Se realizeaza datorita fazei
lichide a sngelui. Caldura specifica, foarte ridicata a apei, face posibila distribuirea in
intregul organism a caldurii ce s-ar putea produce prin reactiile exoterme la nivelul
organelor metabolice extrem de active, cum ar fi, de exemplu, ficatul.

Elementele sngelui
Eritrocitele- formate din 60% apa si 40% substanta solida- se compune din:
componente minerale(K+, Na+, Ca2+);
componente organice hemoglobinice;
componente organice nehemoglobinice;
enzime.
Leucocitele- formate din:
granulocite ( neutrofile, eozinofile, bazofile);
monocitul.
Trombocitele ( globulinele)
Plasma: proteine; lipide; compusi anorganici; enzime.

Proteinele plasmatice
Sunt un amestec eterogen de aproape 100 componente cu proprietati
fizico-chimice si functii diferite. Greutatile moleculare variaza intre 60000 si
130000.
Functiile proteinelor plasmatice sunt:
- mentin volumul normal si prresiunea coloid-osmotica a sngelui, precum si
schimburile dintre capilare si tesuturi- albuminele sunt preponderent raspunzatoare
de aceasta functie;
- transporta hormoni, metale, lipide, vitamine, pigmenti, coloranti, medicamente;
participa la procesele de aparare specifica si nespecifica a organismului prin:
imunoglobuline, properdina, transferina si la fenomenele de coagulare si
fibrinoliza;
- participa la mentinerea echilibrului acido-bazic al sngelui, ca sistem tampon,
datorita caracterului lor amfoter;
- influenteaza vscozitatea si microcirculatia, contribuind la realizarea unui mediu
protector pentru eritrocite, favorizndu-le in acelasi timp mobilitatea;
- reprezinta o rezerva proteica importanta in situatiile in care aportul proteic scade.

Relatia biomaterial- fluid sanguin

Relatia biomaterial- fluid sanguin urmareste, in primul rnd, asigurarea
biocompatibilitatii materialului cu functie de proteza sau implant.

Contactul dintre fluidul sanguin si suprafata unui implant declanseaza in primul

rnd adsorbtia superficiala a proteinelor serice, urmata de aderarea, deformarea si
eliberarea plachetelor deci se produce coagularea sngelui.

Fazele si factorii principali ai coagularii

In esenta, fenomenul de coagulare a sngelui consta in transformarea
fibrinogenului in fibrina. Particularitatile specifice procesului sunt:
- numarul mare de activatori si inhibitori care intervin;
- existenta, ca precursori, a majoritatii factorilor coagularii;
- preponderent, factorii coagularii sunt proteaze care rezulta in urma proteolizei
limitate din formele lor inactive;
- transformarea factorilor coagularii din forme inactive in forme active se face prin
autocataliza, determinata de propriile lor produse;
- unii dintre factori, ca de exemplu Ca2+ au actiune multipla, intervenind aproape
in toti timpii coagularii;
- procesul complex se desfasoara in cascada. Faza de latenta este formata de o
avalansa de transformari accelerate ale factorilor coagularii, prin forme inactive si
forme active.

Fibrinogenul este o proteina cu forma moleculara alungita, una dintre cel mai
putin solubila proteina a sistemului sanguine. Are o masa moleculara medie de
330000-340000Da si un pHizoelectric de 5.3. Este alcatuit din 6 lanturi
peptidice, grupate cte doua, perechile diferind intre ele prin aminoacidul Nterminal si anume: o pereche are tirozina ca aminoacid terminal, a doua are
acidul piroglutamic, iar a treia alanina.
Acest factor contine componente glucidice: hexoze, aminozaharuri, acid sialic,
oxidarea glucidelor facndu-l inapt pentru fenomenul coagularii.
Fiziologic, transformarea fibrinogenului in fibrina se petrece in 2-3 secunde sub
actiunea trombinei. Transformarea fibrinogenului in fibrina este un fenomen de
proteoliza limitata, in cursul careia se formeaza doua lanturi polipeptidice
diferite: fibrinopeptidele A si B, conform reactiei:
Fibrinogen--- fibrina + fibrinopeptide A si B

Transformare fibrinogenului in fibrina

Polimerizarea monomerilor de fibrina se face pe doua directii:

- longitudinala- cu formarea fibrelor sau fibrilelor primare;
- transversala- cu producerea fibrelor secundare de fibrina, datorita puntilor
de hidrogen ce se stabilesc intre tirozina si histidina dintre doua fibre
primare.

Mecanismul coagularii
sngelui
Coagularea
sngelui
se
desfasoara pe doua cai care se
deosebesc dupa originea tisulara
sau sanguinea a factorului de
declansare a procesului in
cascada.
Calea extrinsica, scurta, cu
durate de ordinul secundelor, are
doua etape importante: generarea
protrombinazei si producerea
trombinei. Trombina actioneaza
asupra
fibrinogenului
transformndu-l
in
fibrina.
Fibrina formata in aceasta faza
este foarte fragila.

Calea intrinsica- pe aceasta cale, mai lenta, a carei durata este de ordinul
minutelor sunt intlnite patru etape:
- generarea protrombinazei;
- producerea trombinei;
- transformarea fibrinogenului in fibrina si stabilizarea acesteia;
- sinereza si retractia cheagului.
In calea intrinsica sunt implicati numai factori sanguini. Procesul este declansat
prin activare afactorului XII(factorul Hageman), ca urmare a fenomenului
de suprafata de hemosorbtie, pe care-l sufera acest factor de contact la
nivelul leziunilor vasculare sau prin contact cu o suprafata straina. Legarea
factorului Hageman sau a kininogenului de masa moleculara mare la
suprafata unui biomaterial(si in special la suprafete incarcate negativ) face
mai usoara activarea acestuia.
Factorul Hageman si kininogenul de masa moleculara mare contin in catena
macromoleculara zone bogarte in aminoacidul histidina.
In aceste zone secventa de aminoacizi care se repeta este (Gly-His-X) sau (HisGly-X). Acest aminoacid cu pK> 10, la valoarea de pH a fluidului sanguine
este incarcat pozitiv la N.

HN

HN
CH - CH2- C - N

CH - CH2- C - N

+ H+

OC

OC
HC CH

HC CH

N
H

N+
H

Zonele incarcate pozitiv vor fi atrase de catre suprafata.

CO - CH - NH- CO- CH2-NHCH2- C - N

HC CH
+
NH2
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - BI OMATERI AL

Atractia si asocierea aminoacizilor cu grupele negative ale suprafetei determina

modificari conformationale ale factorului XII, respective ale kininogenului. Astfel,
legatura peptidica din dreptul unor aminoacizi devine sensibila la actiunea
hidrolitica a enzimelor. In cazul factorului Hageman, desfacrea legaturii peptidice se
realizeaza la nivelul aminoacizilor Arg 353-Val354.

..
C - CH - NH - C - CH - NH
CH2
NH

NH

CH
CH3 CH3

Serina - O - H

CH2

NH2

..
H- O-

Treonina

Fragmentul proteic rezultat in urma hidrolizei reprezinta factorul Hageman activat,

proteina cu conformatie si incarcare electrica diferita de a compusului
macromolecular de plecare, si, implicit cu posibilitati de interactiune diferite cu
proteinele plasmatice. Urmeaza o serie de pasi care conduc la formarea
polimerului de fibrina, instabil, trecut in forma stabila sub actiunea factorului XIII.
Fibrina devine insolubila prin constituirea unor punti disulfidice intre glicina
terminala a unui monomer si gruparea unui monomer vecin. Urmeaza apoi
sinereza cheagului prin expulzarea apei din ochiurile gelului, cu micsorarea
spatiilor dintre fibrile. Retractia cheagului se produce numai in prezenta
trombocitelor functional normale, care actioneaza prin intermediul factorului I
plachetar. In punctele nodale ale retelei de fibrina plachetele functioneaza ca centri
mecanici.
Sngele contine si factori inhibitori ai coagularii, care reduc viteza acestui
proces. Din grupul antitrombinelor fac parte: fibrina, antitrombina I, heparina
sau antitrombina II si antitrombinele III, IV si VII. Anticoagulantele cu aplicare
terapeutica mai folosite sunt heparina si antagonistii vitaminei K.

Heparina are ca unitate de repetitie cantitati echimoleculare de resturi de Dglucozamina si acid D-glucuronic. Continutul de sulfat variaza intre 5 si 6,5 resturi
de sulfat de tetrazaharida. Are caracter acid, fiind puternic sulfatata.
COOCH2OSO3COOCH2OSO3CH2OSO3OH H
OH
OH H
OH H
OH H
OH H
H
H
H
H
H
H
H
OH H
OH H
OH H
OH H
OH H
OH H
O
OH
O
O
O
O
O
n
H
OSO3H
NH
H HN
H
OH
H
OH
H
NH
-O 3S
SO3SO COO-

Heparina inhiba direct att activitatea factorului X, cat si actiunea enzimatica a

trombinei deja formate. Actiunea sa depinde de gradul de sulfatare.
Fibrinoliza
Fibrinoliza este ultima faza a hemostazei, ce are ca efect eliminarea
fragmentelor de cheag si a depozitelor de fibrina. Se realizeaza prin mecanism
enzimatic fiind catalizata de plasmina sau fibrinolizina. Aceasta scindeaza
fibrina in fragmente polipeptidice mici, solubile, care nu mai pot forma retele
coerente. Plasminogenul poate fi activat in sistem intra si extravascular.
Activatorii se gasesc in snge si in toate fluidele biologice ale organismului.

Schema fibrinolizei

Produsele secundare ale fibrinolizei inhiba formare trombinei si polimerizarea

monomerilor de fibrina. Plasminogenul poate fi inhibat sau activat. Streptokinaza,
proteina streptococcia neenzimatica formeaza cu plasminogenul un complex, prin
interactiuni hidrofobe, care transforma moleculele de plasminogen in plasmina. In
urina se gaseste urokinaza, activator al plasminogenului care provine din snge sau
tesuturi.
Ca inhibitori ai procesului pot fi mentionate proteinele cu o activitate
antiplasmatica, ca 2- macroglobulina sau antitrombina III.