BAB I

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
DNA (asam deoksiribonukleat) adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara
sistematis dan yang membawa informasi genetik dari sel khususnya dan dari mahluk
dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Informasi genetik
tersebut disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa nukleotida dan
menentukan bentuk, struktur, maupun fisiologi suatu jasad (Triwibowo 2005: 51). DNA
memiliki dua fungsi yang sangat penting, yaitu sebagai autokatalis dan
heterokatalis. DNA berfungsi sebagai autokatalis karena DNA mampu mensintesis dirinya
sendiri Sedangkan sebagai heterokatalis karena DNA mampu mensintesis molekul
kimiawi lainnya seperti RNA, protein dan lain-lain (Wolfe 1995: 72).
DNA terdiri dari tiga macam molekul, yaitu gula pentosa, gugus fosfat dan basa
nitrogen. Gula pentosa memiliki 5 atom C dan pada DNA, atom C nomor 2 berikatan
dengan atom H. Gugus fosfat pada DNA berikatan dengan atom C nomor 5 melalui ikatan
fosfoester. Gugus fosfat tersebut yang menyebabkan asam nukleat bermuatan
negatif. Basa nitrogen yang menyusun asam nukleat ada dua macam, yaitu basa purin
yang terdiri dari adenin dan guanin dan basa pirimidin yang terdiri dari timin dan
sitosin. Basa purin atau pirimidin adalah basa nitrogen yang terikat pada atom C nomor 1
suatu molekul gula melalui ikatan N-glukosidik. Ikatan tersebut menghasilkan molekul
yang disebut nukleosida. Nukleosida akan bergabung dengan fosfat dan membentuk
molekul yang disebut nukleotida (Triwibowo 2005:26; Suryo 2005 : 59--62). Nukleotida
adalah Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa,
satu gugus fosfat dan satu pasang basa (Lewis 2003: 176--178).
Struktur DNA pertama kali diungkap oleh James Watson dan Franson Crick pada
tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan
Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data yang diperoleh Watson dan Crick membuat
struktrur DNA yang disebut untai ganda (double helix). Untai ganda DNA tersusun oleh
dua rantai polinukleotida yang terpilin. Kedua rantai tersebut mempunyai orientasi yang
berlawanan, yaitu rantai yang satu mempunyai orientasi 5 ke 3 sedangkan yang lainnya
dari 3 ke 5. Kedua rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa
adenin dengan timin sebanyak dua ikatan dan antara guanin dan sitosin sebanyak tiga

ikatan. Spesifisitas pasangan basa tersebut disebut sebagai komplementaritas (Triwibowo

2005: 51).
Berdasarkan penemuan Watson dan Crick, diambil suatu kesimpulan, yaitu deretan
polinukleotida DNA mempunyai bentuk spiral teratur. Spiral tersebut mempunyai
diameter kira-kira 20 , dan lebar yang tetap. Spiral tersebut juga membuat satu putaran
lengkap setiap 34 dan tiap putaran lengkapnya terdiri dari 10 nukleotida. Spiral tersebut
berbentuk duplex dan mengandung dua deret polinukleotida (Suryo 2005: 67--68).
Struktur DNA yang dikemukan Watson dan Crick adalah struktur DNA yang paling
umum ada di alam dan dapat dikelompokkan pada tipe B. Molekul DNA tipe B
mempunyai lekukan besar dan lekukan kecil. Dibandingkan dengan tipe A, lekukan besar
pada tipe B lebih mudah mengikat protein tertentu karena lekukan besar pada tipe A lebih
dalam. Bentuk Tipe A lebih menyerupai konformasi bagian untai ganda molekul
RNA. Selain tipe A dan B, DNA juga memiliki tipe lain, yaitu tipe Z. Tipe tersebut tidak
lazim pada untai ganda, karena arah rotasinya ke kiri (Fairbanks & Andersen 1999: 33).
Genom adalah komplemen lengkap gen-gen atau materi genetik suatu organisme dan
terorganisasi menjadi kromosom. DNA genom adalah semua gen-gen dan semua sekuens
DNA (urutan polinukleotida) yang fungsional maupun non-fungsional dalam inti suatu
organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen (Campbell dkk. 2002: 221).
DNA terdapat dalam sel prokariot maupun eukariot. Lokasi yang paling banyak
mengandung DNA terdapat pada bagian aktifitas genetik utama sel. Sel prokariot,
aktifitas genetiknya terjadi di seluruh sel sehingga DNA tidak mempunyai tempat yang
spesifik dalam sel. Sebaliknya, karena aktifitas pada sel eukariot terjadi di dalam inti,
maka sebagian besar DNA terdapat dalam inti sel. DNA pada sel prokariot berbentuk
lingkaran dan hanya ada satu unit. Oleh karena itu, prokariot bersifat monoploid karena
hanya ada satu bahan genetik utama. DNA pada sel prokariot juga tidak dikemas dalam
struktur yang jelas karena sel prokariot tidak memiliki inti sel (Triwibowo 2005:
76). DNA pada sel eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Ukuran DNA
eukariot juga lebih besar dibandingkan DNA prokariot dan DNA eukariot lebih bervariasi
(Raven & Johnson 2002: 94).
Sel prokariot memiliki pula bahan genetik tambahan yang disebut DNA
plasmid. Dalam keadaan normal, kehadiran plasmid pada umumnya tidak diperlukan oleh
sel. Jika sel prokariot membawa plasmid, maka genom sel tersebut meliputi satu kesatuan
gen yang ada pada bahan genetik utamanya dan gen yang ada pada plasmid tersebut.
(Triwibowo 2005: 76).

Sel eukariot memiliki DNA di dalam kromosom, yaitu di inti sel dan ada Beberapa sel
eukariot memiliki DNA di luar kromosom, yaitu DNA pada mitokondria
dan kloroplas. DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein
histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular, replikasinya
berlangsung secara independen dan tidak bergantung pada replikasi kromosom, serta tidak
berasosiasi dengan protein histon. Organisasi gen mitokondria lebih mirip organisasi gen
pada bakteri. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya
mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA
nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua (Klug & Cummings 1994:
315316).
DNA dari sel prokariot maupun eukariot dapat diperoleh dengan cara mengisolasi
DNA yang terdapat di dalam sel. Isolasi DNA adalah teknik yang dilakukan untuk
memisahkan DNA dari zat yang lain di dalam sel. Fungsi dari pengisolasian DNA adalah
mendapatkan DNA murni dari dalam sel yang akan digunakan untuk penganalisisan
genotip suatu organisme (Triwibowo 2005 32).
DNA yang diisolasi dari sel manusia disebut DNA genom manusia (Solomon dkk.
1993: 323). DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah adalah modifikasi
jaringan dengan matriks cair yang disebut plasma (Campbell dkk. 2002: 794 & 459).
Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat,
protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah
terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet).
Plasma darah mengisi lebih dari setengah volume darah yang terdiri atas 90 % air dan 10
% garam-garaman, protein, dan substansi substansi lain yang terangkut
darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan
pilihan karena memiliki nukleus. DNA juga dapat diisolasi dari tumbuhan dan
khamir, pada tumbuhan misalnya bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang
(Musa sp.) sedangkan pada khamir misalnya Candida parapsilosis (Campbell dkk. 2002:
459; Duncan dkk. 2004: 1; Kimball 2005: 8).
Isolasi DNA dilakukan dengan beberapa tahap, yaitu:
1.

Isolasi jaringan.

2.

Pelisisan dinding dan membran sel

3.

Ekstraksi DNA dalam larutan

4.

Purifikasi

5.

Presipitasi

(Boyer 1993: 455; Kimball 2005: 4).

Isolasi DNA memiliki dua prinsip, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama
sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara
memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Prinsip presipitasi adalah
pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang terdapat dalam sel (Kimball 2005: 4; Kent
& Carr 2001: 317).
Sentrifugasi merupakan salah satu metode dasar yang Sangat penting dalam studi
biologi sel maupun molekular. Sentrifugasi tidak hanya berguna untuk memisahkan sel atau
organel subselular, melainkan juga digunakan untuk pemisahan molekular. Teknik
sentrifugasi pada pengisolasian DNA berfungsi untuk memisahkan DNA dari zat lain dalam
sel berdasarkan berat molekulnya. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan mengunakan alat
yang berupa rotor yang digerakan oleh motor elektrik yang merupakan tempat berpegangnya
tabung yang akan disentrifugasi. Pergerakan mesin sentrifugasi berhubungan dengan massa,
kerapatan dan usuran dari molekuk yang disentrifugasi, serta massa , kerapatan dan viskositas
dari lingkungan larutan (Triwibowo 2005: 33; Wolfe 1995: 124).
B. Tujuan
Untuk mengetahui lebih rinci tentang isolasi dna dan tahapan tahapan
pada isolasi dna

BAB II
ISI
A. Pengertian Isolasi DNA
Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat
digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. DNa dapat di isolasi dari bergabai sal
yang memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam inti sel. beberapa sumber DNA yang
dapat dipergunakan dalam isolasi DNA adalah urine, darah, biopsi,rambut, gigi kuku dan
lainya.
DNA pertama kali berhasil dimurnikan pada tahun 1868 oleh ilmuan Swiss Freadrich
Meischer di Tubingen, jerman yang menamainya nuclien berdasarkan letaknyayang berada di
dalam inti sel. Tapi penelitian tentang DNa dimulai pada awal abad 20, bersamaan dengan
ditemukannya postulat genetika Mendel. DNA dan protein di anggap dua molekul yang

paling memungkinkan sebagai pembawa sifat genetis.

Asam Deoksiribonukleat, yang lebih dikenaldangan DNA, adalah sejenis asam nukleat yang
tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA
umumnya terletak didalam inti sel.
DNA berperan di dalam sebuah sel ialah sebagai materi genetic artinya, DNA menyimpan
cetakan baru bagi segala aktivitas sek. Dan pengecualian bagi beberapa jenis virus seperti
HIV.(Human Papilioma Virus). DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen
utama, yaitu gugus fosdat, gula deoksiribonukleat, dan basa nitrogen. Sebuah unit monomer
DNA yangterdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehinnga DNA
tergolong sebagai polinukleotida. RAntia DNA memiliki lebar 22-24 , sementara panjang
satu unit nukleotida 3,3 ,. Walaupun unit monomer ini sangat kecil, DNA dapat memiliki
jutaan nukleotida yang terangkai seperti halnya rantai.
DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda. Pada struktur
heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi
nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Masing-masing untai terdiri dari
rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai
DNA satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan
hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang
ditemukan pada DNA adalah adenin (dilambangkan A), sitosin (C, dari cytosine), guanin (G),
dan timin (T). Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan
sitosin.
Basa-basa ini dibagi menjadi dua jenis; adenin dan guanin adalah leburan lima dan enamAnggota heterosiklik senyawa yang disebut purin, sedangkan sitosin dan timin adalah enamAnggota disebut cincin pirimidin. pirimidin kelima dasar, yang disebut urasil (U), biasanya
mengambil tempat timin pada RNA dan berbeda dari timin oleh kekurangan gugus metil pada
cincin. Urasil tidak biasanya ditemukan dalam DNA, terjadi hanya sebagai produk rincian
sitosin. Selain RNA dan DNA, sejumlah besar buatan analog asam nukleat juga telah
dibentuk untuk mempelajari sopan santun asam nukleat, atau untuk digunakan di bidang
bioteknologi.
DNA linear biasanya terjadi sebagai kromosom pada eukariota, dan lingkaran kromosom
pada prokariota. Himpunan kromosom dalam sel membuat sampai dengan genom; pada
genom manusia memiliki sekitar 3 miliar pasangan basa DNA disusun dalam 46 kromosom.
Informasi yang dibawa oleh DNA yang disimpan di dalam urutan dari potongan-potongan
DNA yang disebut gen. Transmisi dari informasi genetik dalam gen ini dicapai melalui

pasangan basa komplementer. Misalnya, dalam transkripsi, ketika sebuah sel menggunakan
informasi dalam gen, urutan DNA akan disalin ke dalam urutan RNA komplementer melalui
tarik-menarik antara DNA dan RNA nukleotida yang benar. Biasanya, copy RNA ini
kemudian digunakan untuk melakukan pencocokan sekuens protein dalam proses yang
disebut terjemahan yang sama tergantung pada interaksi antara nukleotida RNA. Atau, sebuah
sel mungkin hanya menyalin informasi genetik dalam proses yang disebut replikasi DNA.
Rincian fungsi-fungsi ini akan dibahas pada artikel lain, di sini kita fokus pada interaksi
antara DNA dan molekul lain yang menengahi fungsi genom.
Gen dan genom
Genomik DNA terletak di inti sel eukariota, serta jumlah kecil dalam mitokondria dan
kloroplas. Pada prokariota, DNA diadakan dalam sebuah tubuh berbentuk tidak teratur di
dalam sitoplasma disebut nucleoid. informasi genetik dalam genom diadakan dalam gen, dan
satu set lengkap informasi ini pada suatu organisme disebut dengan genotipe. Sebuah gen
adalah unit keturunan dan merupakan daerah DNA yang mempengaruhi karakteristik tertentu
dalam suatu organisme. Mengandung gen membaca terbuka frame yang dapat ditranskripsi,
serta urutan peraturan seperti promotor dan enhancer, yang mengontrol transkripsi membaca
bingkai yang terbuka.
Dalam banyak spesies, hanya sebagian kecil dari total urutan genom mengkodekan protein.
Sebagai contoh, hanya sekitar 1,5% dari genom manusia terdiri dari protein-kode ekson,
dengan lebih dari 50% dari DNA manusia yang terdiri dari non-pengkodean sekuens
berulang. Alasan kehadiran begitu banyak non-coding DNA pada eukariot genom dan
perbedaan yang luar biasa dalam ukuran genom, atau C-nilai, di antara spesies mewakili tekateki lama yang dikenal sebagai "nilai C teka-teki." Namun, sekuens DNA kode yang tidak
menyandi protein mungkin masih fungsional non - coding RNA molekul, yang terlibat dalam
regulasi ekspresi gen. T7 RNA polimerase (biru) menghasilkan mRNA (hijau) dari cetakan
DNA (oranye).
Beberapa non-coding sekuens DNA memainkan peran struktural dalam kromosom.
Telomeres dan sentromer biasanya berisi beberapa gen, tetapi penting untuk fungsi dan
stabilitas kromosom. [70] Sebuah bentuk melimpah non-coding DNA pada manusia adalah
pseudogen, yang merupakan salinan dari gen yang telah dinonaktifkan oleh mutasi. urutan ini
biasanya hanya molekul fosil, meskipun mereka kadang-kadang bisa berfungsi sebagai bahan
genetik baku untuk menciptakan gen baru melalui proses duplikasi gen dan divergensi.
Transkripsi dan terjemahan

Gen adalah urutan DNA yang mengandung informasi genetik dan dapat mempengaruhi
fenotipe dari suatu organisme. Dalam gen, urutan basa untai DNA sepanjang mendefinisikan
sebuah mRNA urutan, yang kemudian mendefinisikan satu atau lebih banyak protein
sekuens. Hubungan antara gen sekuens nukleotida dan asam amino sekuens protein
ditentukan oleh aturan-aturan terjemahan, disebut sebagai kode genetik. Kode genetik terdiri
dari tiga huruf 'kata-kata' disebut kodon terbentuk dari rangkaian tiga nukleotida (misalnya
ACT, CAG, TTT).
Dalam transkripsi, yang kodon gen disalin ke RNA kurir oleh RNA polimerase. Copy RNA
ini kemudian diterjemahkan oleh ribosom yang membaca urutan RNA oleh pasangan basaRNA kurir untuk transfer RNA, yang membawa asam amino. Karena terdapat 4 basis di 3huruf kombinasi, terdapat 64 mungkin kodon (4 3 kombinasi). Menyandikan ini dua puluh
standar asam amino, asam-asam amino yang paling memberikan lebih dari satu mungkin
kodon. Ada juga tiga 'berhenti' atau 'omong kosong' kodon menandakan akhir dari daerah
pengkode; ini adalah TAA, TGA dan TAG kodon
Replikasi DNA. Helix ganda yang terurai oleh helikase dan topoisomerase. Selanjutnya, salah
satu DNA polimerase menghasilkan untai terkemuka salinan. DNA polimerase lain mengikat
ke untai tertinggal. Enzim ini membuat segmen diskontinu (disebut fragmen Okazaki)
sebelum DNA ligase bergabung dengan mereka bersama-sama.
Pembelahan sel sangat penting bagi suatu organisme untuk tumbuh, tetapi ketika membagi
sebuah sel harus meniru DNA dalam genom sehingga kedua sel anak memiliki informasi
genetik yang sama sebagai orangtua mereka. Beruntai ganda struktur DNA menyediakan
mekanisme sederhana untuk replikasi DNA. Di sini, dua untai terpisah dan kemudian masingmasing untai's DNA komplementer urutan diciptakan oleh sebuah enzim yang disebut DNA
polimerase. Enzim ini membuat untai komplementer dengan menemukan dasar yang benar
melalui pasangan basa komplementer, dan ikatan itu ke untai asli. Sebagai DNA polimerase
hanya dapat memperpanjang untai DNA dalam 5 'ke 3' arah, mekanisme yang berbeda
digunakan untuk menyalin antiparalel untaian heliks ganda. [73] Dengan cara ini, pangkalan
di untai lama dasar perintah yang muncul di untai baru, dan akhirnya sel dengan salinan
sempurna DNA-nya.
B. Tahapan Tahapan Pada Isolasi DNA
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran
dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang
bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau
jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan

menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode
freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan
menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi
seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi
destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan
proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007)
serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown,
2010; Surzycki (2000).
Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate
(SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam
melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease
yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer, 1999). Selain digunakan SDS, detergen
yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk
melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007).
Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama,
Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA.
Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah
larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel
yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA
bersifatinsolublepada suhu di bawah 15C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian
yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali
kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu
kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan
mengendap pada suhu 15C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida,
CTAB banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak
polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas,
Agrobacterium, dan Rhizobium (Surzycki, 2000).
Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl,
EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida
sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol
dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol
dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang
kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol perlu
dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat
menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping
itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA
(Porebskiet al., 1997). Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat
mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008).
Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai 12.
Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA
terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di
atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk
menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan
dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA
dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer,
dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen
(Surzycki 2000).

Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediamine
tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat
mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara
mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse
(Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu
dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein
agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan
sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein
kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari
DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan
bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada
lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan
berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan
berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat
pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil
alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga
terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara
pemberian RNAse (Birren, et al., 1997; Clark, 2010).

Gambar 1. Asam nukleat berada pada lapisan air setelah disentrifugasi

pada tahapan ekstraksi (Clark, 2010). klik gambar untuk memperbesar.
Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein
juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik.
Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut
organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang
mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan
perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan
kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang
terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform air.
Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein
mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan
kloroform (Clark, 2010).
Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air.
Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya
dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak
dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan
ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan
kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil
alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran

yang terbatas (20.00050.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk
menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA kemudian
diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Surzycki, 2000).
Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.Pada
umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa
tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal
membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer,
1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk
menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi.
Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan
kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi
molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan
negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air.
Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul
isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga
isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol
akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi;
ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga
memudahkan presipitasi DNA.
Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA
dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak
membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau
isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa
dalam tabung adalah DNA pekat.Proses presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol
sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi
(Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian
kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan
untuk menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat
dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi
bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi
dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003).
Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol
kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk
menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan dengan
cara evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki, 2000). Pada tahap pencucian
biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu
memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat
pada asam nukleat (Sambrook et al., 2001).
Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE ke
dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar
-20C. Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20C
bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu bermingguminggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer
TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah

dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA
sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20C.

Gambar 2. Proses pufrifikasi DNA dengan menggunakan metode silika dan kolom
kromatografi (a) proses pengikatan DNA ke silika dengan bantuan perubahan konsentrasi
garam, (b) DNA dielusi untuk memperoleh DNA (Brown, 2010). Klik gambar untuk
memperbesar.
Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh
beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi
juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan.

BAB
III

A.Kesimpulan
Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat
digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. DNa dapat di isolasi dari bergabai sal
yang memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam inti sel. beberapa sumber DNA yang
dapat dipergunakan dalam isolasi DNA adalah urine, darah, biopsi,rambut, gigi kuku dan
lainya. DNA berperan di dalam sebuah sel ialah sebagai materi genetic artinya, DNA
menyimpan cetakan baru bagi segala aktivitas sek