Professional Documents
Culture Documents
SDS PAGE
Tugas Mata Kuliah Instrumentasi
Oleh:
Adilah Ulfiati
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) merupakan metode analisis
yang digunakan untuk memisahkan komponen campuran protein berdasarkan
ukurannya. Teknik ini berdasarkan prinsip bahwa molekul yang bermuatan
akan bermigrasi pada daerah elektrik ke elektroda yang berlawanan tandanya.
Dengan kata lain teknik ini menggunakan prinsip perbedaan kemampuan
migrasi dari setiap molekul.
Teknik elektroforesis umum tersebut tidak bisa digunakan untuk
menentukan berat molekul dari molekul biologis karena pergerakan zat
bergantung pada tidak hanya ukuran tapi juga muatan. Untuk mengatasi ini,
sampel biologis membutuhkan perlakuan khusus yaitu penyeragaman muatan
yang dapat menyebabkan pergerakan zat bergantung hanya pada ukuran.
Untuk protin-protein yang memiliki ukuran dan bentuk yang berbeda, harus
didenaturasi terlebih dahulu dengan menggunakan bantuan SDS (Sodium
Dodecyl Sulphate).
sementara discontinous
system
menggunakan
dua
jenis
gel
berupa resolving gel dan stacking gel. Stacking gel berfungsi untuk menahan
sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Resolving
gel berfungsi untuk memisahkan molekul-molekul yang ada berdasarkan berat
molekulnya.
Pewarnaan gel pada teknik SDS-PAGE terdiri dari commasie blue
staining dan silver salt staining. Commasie blue straining adalah pewarna
tekstil trifenilmetana, dan lebih sering digunakan di dalam teknik SDS
PAGE. Commasie blue straining banyak beberapa kelebihan yaitu harga yang
relatif murah, mengikat protein secara spesifik, bekerja cepat. Silver salt
staining memiliki
kelebihan
yaitu
hasilnya
lebih
akurat
jika
BAB II
METODE PRAKTIKUM
2.1 Waktu dan Tempat
Praktikum SDS-PAGE ini berlangsung pada tanggal 14 Maret 2014 di
laboratorium biomedik FKUB.
2.2 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini:
2.2.1 Preparasi Gel
1. Alat elektroforesis
2. Baker glass 2 buah
3. Micropipette
4. Comb
5. Aquades
6. Akrilamid
7. Gel buffer 2,5 ml
8. APS dan TEMED
9. ddH2O
Tabel 1. Formulasi gel
12%
ddH2O (ml)
Acrillamida/bis (ml)
Gel Buffer (ml)
10% SDS (ml)
Tris-HCL M
pH Tris-HCL
APS 10% (l)
TEMED (l)
2.2.2 Preparasi Sampel
1. 50 l b-mercaptoetanol
2. Sample Buffer terdiri dari
Separating Gel
3,4
4
2,5
0,1
1,5
8,8
50
5
Stacking Gel
3,4
4
2,5
0,1
0,5
6,8
50
10
Methanol 20 cc
Aquades 100 cc
2. Masukkan gel akrilamid ke dalam 2 buah baker glass. Gelas yang pertama
untuk separating gel dan gelas yang kedua untuk stacking gel.
3. Masukkan gel buffer 2,5 ml.
4. Masukkan APS dan TEMED ketika akan dimasukkan ke dalam gel caster
atau loyang. Masukkan terlebih dahulu pada campuran separating gel.
5. Masukkan campuran separating gel tadi ke dalam loyang dengan bantuan
mikropipet. Beri aquades agar permukaan gel rata. Tunggu hingga
separating gel membentuk gel. Buang sisa aquades.
6. Masukkan APS dan TEMED pada campuran stacking gel ketika akan
dimasukkan ke dalam loyag elektroforesis.
7. Masukkan campuran stacking gel dengan menggunakan micropipete.
8. Pasang comb diatas stacking gel.
9. Setelah gel mengeras, kaca dilepas dari penjepit.
10. Gel pada kaca dipasang pada alat elektroforesis.
11. Tuangkan running buffer.
2.3.2 Preparasi Sampel
1. Sebelum dimasukkan ke dalam well, sampel diberi perlakuan terlebih
dahulu.
2. Tambahkan 50 l b-mercaptoetanol ke dalam 950 l buffer sample
dengan dilusi 1:2
3. Panaskan sampai dengan 950C dalam waktu 4 menit.
4. Sampel didinginkan dalam suhu ruangan
2.3.3 Elektroforesis Gel
1. Sampel dimasukkan ke dalam well-well dengn menggunakan pipet
khusus sebanyak 2 l / well.
2. Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply.
3. Running dengan tegangan listrik sebesar 120 V selama 60-90 menit.
4. Gel dilepas dari kacanya
2.3.4 Pewarnaan
1. Gel direndam dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue.
2. Letakkan dalam shaker selama 20-30 menit.
2.3.5 Destaining
1. Pewarna pada gel dihilangkan dalam rendaman destaining solution 1-2
jam dalam keadaan tetap di shaker.
2. Gel siap discan dan dianalisa hasilnya.
3. Hitung BM protein pada band protein yang tampak pada gel
menggunakan grafik regresi linear.
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil Praktikum
Berikut merupakan hasil SDS PAGE dari sample hasil purifikasi protein
rekombinan Ag36 kDa Mycobacterium tuberculosis menggunakan urea 2 M.
Log BM
Tracking
RF
40
1.602059991
28
0.451613
35
1.544068044
33
0.532258
29
0.467742
Keterangan:
BM
Tracking
RF
x
y
: BeratMolekul
: batas stacking protein berhenti
: tracking/panjanglintasan (rrelative migration distance)
: Beratmolekul protein sampel (10log BM sampel)
: Logaritma BM
= 0,532258 0,451613
= 0,080645
= 1,602059991 1,544068044
= 0,057991947
0,057991947)+1,544068044
( 0,064516
0,080645
X
= 1,5905461602
BM
= 101,5905461602
BM
= 38,94588723kD
Dari perhitungan diatas maka didapatkan hasil running dari SDS PAGE adalah
38,94588723 kD
3.2 Pembahsan
Dalam preparasi gel, konsentrasi gel yang akan dibuat disesuaikan dengan
berat molekulnya semakin berat maka persenan gel yang dibuat semakin kecil.
APS dan TEMED merupakan katalisator dan harus diberikan terakhir dalam
pencampuran pada tahap preparasi gel. Konsentrasi katalis sangat penting.
Anyaman gel yang tidak baik dapat diakibatkan konsentrasi katalis yang tidak
akurat. Pemberian APS dan TEMED dilakukan ketika akan dimasukkan ke dalam
loyang atau gel caster. PAda campuran stacking gel jangan dulu diberikan APS
dan TEMED sebelum separating gel karena akan cepat mengeras atau sudah
terlebih dahulu membentuk gel. Jika demikian, akan sulit untuk memasukkan
campuran stacking gel tersebut ke dalam Loyang. Stacking gel dimasukkan
apabila sisa separating gel pada baker glass sudah mulai membentuk gel. Itu
tandanya campuran separating gel yang dimasukkan ke dalam loyang sudah mulai
mengeras.
Pada tahap preprasi sampel, campuran RSB atau b-mercaptoetanol
digunakan untuk memotong ikatan disulfide agar mudah bermigrasi dan
menunjukkan bentuk migrasi yang linier pada gel. Sedangkan pemanasan
dilakukan dengan tujuan mengoptimalkan pengkatalisnya agar benar-benar linier.
Pewarnaan bisa dilakukan dengan berbagai staining atau pewarnaan.
Pewarna silverstain digunakan jika berat protein kurang dari 4 nanogram. Protein
glikoprotein tidak bisa menggunakan pewarnaan kromasin. Pewarna yang
digunakan untuk protein gikoprotein adalah PAS. Gel yang didalam chamber
disiram dengan larutan biru kemudian diberi destaining. Destaining digunakan
untuk memberikan latar putih agar kromasi yang diserap protein dapat terlihat.
Ketika dialiri listrik, proteinnya luruh.
BAB IV
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
1. Mahasiswa memahami prinsip elektroforesis