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ISBN: 9974-0-0290-7
Microbiologa
20
Lillian Frioni
membrana
ribosomas
pared
membrana
retculo
pared
regin nuclear
ncleo
mitocondrias
Estructuras permanentes
(de afuera hacia adentro de la clula)
Pared celular
Constituye la parte ms importante de la clula procariota
ya que salvo algunos micoplasmas y arqueobacterias, parsitas intracelulares, todas las otras bacterias presentan
esta barrera de proteccin contra el ambiente, sin la cual
las clulas sufriran lisis osmtica en ambientes en general
hipo o hipertnicos (suelos, agua, organismos). En 1884,
Christian Gram desarroll la tincin que lleva su nombre y
desde entonces, las bacterias se clasifican en dos grupos
importantes: Gram negativas y Gram positivas.
La diferencia estructural entre ambos grupos se puso de
manifiesto con el microscopio electrnico de transmisin,
a mediados del siglo pasado. El cuadro 2 resume las
diferencias.
Gram positivas: la pared celular posee gruesa capa de peptidoglicano que retiene el colorante especfico (violeta)
Gram negativas: la pared celular presenta capa fina de peptidoglicano y una membrana externa y no retiene el colorante. Se
Periplasma: espacio entre membrana externa de la pared celular y la membrana citoplasmtica, contiene numerosas protenas
hidrolticas
18
Lillian Frioni
Microbiologa:
bsica, ambiental y agrcola
Lillian Frioni
Lillian Frioni
17
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biologa de los microorganismos, 9. Edicin, 2000 Prentice Hall International
Prescott, Harley, Klein, Microbiologa, 1999 McGraw-Hill
Interamericana
Preguntas de repaso
1) Objeto de estudio de la Microbiologa
2) Disciplinas muy relacionadas a la microbiologa
3) Algunas de las especialidades en que se ha subdividido esta ciencia
4) Concepto del trmino microorganismo y ejemplos de
ellos
5) Por qu se dice que los microorganismos son muy
buenas herramientas en estudios fisiolgicos, genticos, enzimticos?
6) Por qu las bacterias estn tan distribuidas en la naturaleza? Seale ambientes donde se las encuentra.
7) Cual fue el gran descubrimiento que permiti separar
a los microorganismos en dos grandes grupos? Con
qu instrumento se logr este hallazgo?
8) Diferencias entre bacteria, arquebacteria y eucariotas
9) Por qu resulta importante la tincin de los frotis bacterianos antes de su observacin microscpica?
10) Por qu aun no se tiene certeza definitiva sobre la
evolucin del mundo microbiano? Qu herramientas
resultan muy importantes de aplicar?
16
Lillian Frioni
En general los microorganismos son fijados (frotis) y teidos con colorantes cidos o bsicos a los efectos de aumentar su visibilidad y/o conservarlos para otros estudios.
Fijacin: se realiza en general secando suavemente el
inculo sobre el portaobjeto a la llama y luego cortando
varias veces la llama con el preparado. El objetivo es conservar las estructuras lo ms intactas posibles antes de
su tincin. La fijacin puede realizarse con sustancias
qumicas, como el etanol, cido actico, formaldehdo, que
inactivan e insolubilizan molculas como los lpidos y protenas microbianas.
Tabla de contenidos
Prlogo .................................................................................................................. 7
Los microorganismos: estructuras y funciones
1 Introduccin a la Microbiologa .............................................................................. 9
El primero permite visualizar estructuras dentro de la clula, as como caractersticas de la membrana y pared
celular, por la diferencia de densidades al ser atravesadas por un flujo acelerado de electrones. El de barrido
muestra el relieve de superficies celulares ya que los electrones se reflejan luego de chocar con una superficie metlica que recubre los preparados.
Tinciones
Los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un microscopio ptico, prctica corriente en estudios
de morfologa de hongos, algas y protozoos (figura 6).
En el caso de las bacterias, dado su pequeo tamao y la
falta de contraste con el medio, esta tcnica de observacin es menos usada.
Sin embargo, es muy empleada para evidenciar la movilidad bacteriana, con cultivos jvenes en medio lquido, en
el microscopio ptico, ya que los flagelos son difciles de
observar aun con tinciones especiales. Se coloca una
gota de cultivo entre porta y cubre objeto o en portaobjetos especiales excavados, que se observan con baja luminosidad ya que existe poco contraste entre las clulas
y el agua, lo que dificulta la observacin.
Existen otro grupo de tinciones que permiten visualizar estructuras como esporas, flagelos, materiales de reserva, etc.
Lillian Frioni
15
Bacteria
Archaea
Eukarya
Mitocondria
Entamebas
Bacterias verdes
no sulfurosas
Cloroplastos
Flavobacterias
Cianobacterias
Bacterias
grampositivas
Euriarqueotas
Hongos
mucosos
Animales
Hongos
Crenarqueotas
Thermoproteus
Methano- Methanosarcina
bacterium
Methanococcus
Thermococcus
Pyrodictium
Plantas
Halfilos
extremos
Ciliados
Thermoplasma
Flagelados
Korarqueotas
Methanopyrus
Tricomnadas
Thermotoga
Microsporidios
Aquifex
Diplomnadas
(Giardia)
Microscopa
El microscopio marc un hito en los estudios, ya que
hay que considerar que el ojo desnudo aprecia como
independientes a dos puntos separados por 0,1mm (poder separador) y el mejor microscopio ptico presenta
un lmite de resolucin de 0,2 m y un aumento mximo
de 1.500-2000X, que resulta de multiplicar el aumento
del ocular (10-20X) por el del objetivo (5, 10, 20 aumentos, los comunes y x 100, el objetivo de inmersin en
aceite).
Como las bacterias presentan aproximadamente un dimetro de 1 m, con los microscopios pticos slo se pueden apreciar la forma general y las caractersticas morfolgicas principales, pero no se aprecian estructuras subcelulares.
Se emplean tambin microscopios de contraste de fases y los fluorescentes, que permiten distinguir estructuras en base al empleo de colorantes fluorescentes,
como el naranja de acridina, diacetato de fluorescena
etc. Muchos de ellos se consideran colorantes vitales,
ya que fluorescen en luz ultravioleta luego de ser empleados por enzimas celulares.
La estructura interna detallada de los microorganismos
fue visible con el microscopio electrnico, desarrollado a
partir de la dcada del 30 del siglo XX y que presenta un
poder separador aproximadamente 1000 veces superior
al del microscopio ptico y puede distinguir puntos separados por 0,5nm (aumento eficaz 100.000X). Se emplean
los microscopios electrnicos de transmisin y de barrido
(figura 5).
Fe de erratas
Tabla de contenidos: Algunos captulos presentan una numeracin de
pgina que no corresponde.
Captulo
1
2
8
9
10
11
12
13
14
Pgina
11
19
121
143
169
191
211
231
243
Captulo
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Anexo Prctico
Pgina
9
donde dice
Los protistas superiores
13
Protistas inferiores
27
28
42
52
57
105
Pgina
255
291
309
323
341
357
373
393
407
417
debe decir
Los microorganismos
eucariotas
Procariotas
La figura 12 presenta la
morfologa de bacilos
capsulados y esporulados
Morfologa de bacilos
esporulados y capsulados
hetertrofos
compuestos orgnicos
Eliminar subrayado. Es:
Los microorganismos activos
son sobre todo los hongos
El H2 acta como donador y el
CO2 como aceptor de
electrones
Se estila ms referirlos como :
Microorganismos eucariotas
115
141
150
300
315
422
Zygomycetes: micelio
cenoctico o septado bien
desarrollado.
Cuadro 11:
Bacterias
aerobias/desnitrificantes
Bacterias
aerobias/nitrificantes
14
Lillian Frioni
Arqueobacterias
Eucariotas
Eubacterias
Ancestro universal
Origen de la vida
Aunque las eubacterias y las arqueobacterias son procariotas, desde un punto de vista evolutivo no estn ms
estrechamente relacionadas entre si como lo estn con
los eucariotas.
Las arqueobacterias (Archaeae) comprenden un grupo
muy primitivo que incluye organismos halfitos y termfilos extremos. Entre ellas se encuentran las bacterias metanognicas, anaerobias estrictas.
Parecera que los tres grupos bacterianos surgieron temprano en la historia de la tierra a partir de un organismo
primitivo comn, el ancestro universal.
Debido a que las clulas de los animales y de las plantas
son eucariotas, se ha considerado en forma general que
han derivado de algn tipo de microorganismo, en tanto
que los procariotas representan una rama que nunca super la etapa microbiana.
Prlogo
Microbiologa: bsica, ambiental y agrcola surge luego de revisin y ampliacin de Procesos microbianos, editado en
1999 por la Fundacin de la Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina, texto que continu a Ecologa microbiana
del Suelo, editado en 1990 por el Departamento de Publicaciones de la Universidad de la Repblica (Uruguay).
En todos ellos se analizan actividades de los microorganismos que benefician al hombre y mejoran la calidad de los
ecosistemas naturales, cuyo conocimiento permite manejarlas y dirigirlas en beneficio de la poblacin. En efecto,
muchas actividades microbianas permiten incrementar la produccin de alimentos, la salud de los suelos y de los
cauces de agua, evitando o disminuyendo las aplicaciones masivas de fertilizantes y sustancias altamente txicas como
herbicidas, fungicidas, etc.
Debemos, sin embargo sealar las diferencias entre los tres textos: en Ecologa microbiana del suelo, se analizaron las
transformaciones de la materia orgnica y mineral de los suelos, las interacciones de los microorganismos entre si y con
los vegetales, con nfasis en dos importantes asociaciones simbiticas, las fijadoras de nitrgeno y las asociaciones con
hongos micorrcicos.
En Procesos microbianos se agregaron temas vinculados a los procesos de biodegradacin de restos orgnicos, tanto
aerobios como anaerobios que contribuyen a la conversin de materiales de deshecho de la industria lctea, de otras
agroindustrias y de prcticas agrcolas, en productos que se usan como biofertilizantes y obtener efluentes de la industria sin carcter contaminante, contribuyendo a la proteccin ambiental. Otra temtica abordada en este segundo texto
es la promocin del crecimiento vegetal, tanto en forma directa, por procesos microbianos de mineralizacin, oxidoreduccin, solubilizacin, fijacin, como por su contribucin a la eliminacin de microorganismos fitopatgenos por
mecanismos conocidos como Control Biolgico.
Finalmente, en el presente texto Microbiologa: bsica, ambiental y agrcola, adems de revisarse y actualizarse estos
temas, se entendi oportuno incorporar captulos dedicados a aspectos de Microbiologa General o Bsica, en el entendimiento de que muchas veces resulta dificultoso a los estudiantes de Agronoma, de Ciencias del Suelo o de Ciencias
Ambientales, acceder a los excelentes textos que sobre el tema estn publicados.
Se continu una interesante experiencia de coordinacin realizada entre el 2000 y el 2002 por los docentes de Microbiologa de las 7 Facultades de Uruguay que imparten conceptos de Microbiologa en la que se delimitaron los conceptos
bsicos que deberan contener un curso comn de Microbiologa General, a aplicar en cada uno de esos centros, que
est disponible en CD. Sobre esta experiencia se desarrollaron los captulos del 1 al 7 del presente texto.
Otras temticas abordadas en este texto son el de Biorremediacin, o sea el tratamiento microbiolgico de situaciones
de polucin graves, como las que lamentablemente nos tiene acostumbrados la prensa: derrames de petrleo, contaminaciones por solventes, herbicidas, etc. y el de la aplicacin biotecnolgica de muchos microorganismos.
El Anexo prctico contiene como en los textos anteriores, tcnicas bsicas para realizar experiencias sencillas y poner
en evidencia los procesos microbiolgicos tratados en el texto.
Por ltimo, se desea dedicar este texto a los estudiantes de distintas disciplinas: Agrcolas, Biolgicas, de Ciencias
Ambientales, Ciencias del Suelo, Bioqumica y Qumica, que sientan inters en adentrarse en el apasionante mundo de
los microorganismos.
Lillian Frioni
citoplasma
clula
eucariota
ncleo
clula
procariota
13
organelos
Protistas superiores, con estructura eucariota, que comprende a las algas, protozoos y hongos.
A los virus les faltan muchos de los atributos de las clulas entre los cuales el ms importante es que no son sistemas abiertos dinmicos. Una partcula viral es una estructura esttica, incapaz de cambiar o reponer sus partes. Carecen de organizacin celular, de capacidad metablica y de autoduplicacin, no se los considera microorganismos, sino entidades biolgicas y sern tratados en
el captulo de gentica de procariotas, por el rol que ejercen en la transferencia de material gentico.
12
Lillian Frioni
Los organismos cumplen con los 5 principios caractersticos de las clulas vivas:
1. autoalimentacin o nutricin: las clulas toman las
sustancias qumicas del ambiente, las transforman, liberan energa y productos de desecho.
2. autoduplicacin o desarrollo: las clulas son capaces de dirigir su propia sntesis. Al crecer, se dividen dando dos clulas cada una idntica a la original.
Los microorganismos:
estructuras y funciones
organismos y confirmar la existencia de dos tipos de clulas: la eucaritica, unidad estructural de animales, vegetales, protozoos, hongos y algas y la procaritica, caracterstica de los organismos ms simples, las bacterias, incluyendo entre stas a las cianobacterias (figura 2).
A pesar de la extraordinaria diversidad de clulas eucariticas, resultante de la especializacin evolutiva de los distintos grupos, su arquitectura bsica es comn: compartimentalizacin por sistemas membranosos (RE y Golgi), corrientes citoplasmticas, mitocondrias y cloroplastos. El
ncleo de los eucariotes est rodeado por una membrana
10
Lillian Frioni
11
Introduccin a la Microbiologa
La Microbiologa es la ciencia que estudia a los microorganismos que constituyen un importante grupo de organismos primitivos y simples, la mayora unicelulares microscpicos y otros macroscpicos filamentosos o cenocticos,
capaces de realizar innumerables procesos biolgicos, que
han surgido muy temprano en la evolucin, pero que se
han adaptado a las condiciones ambientales actuales.
La Microbiologa estudia:
i) clulas vivas y su funcionamiento
ii) los microorganismos, importante grupo capaz de
existencia independiente
iii) diversidad microbiana y evolucin
iv) funciones en la biosfera, en nuestro organismo, en el
de los vegetales y animales
10
Lillian Frioni
11
Introduccin a la Microbiologa
La Microbiologa es la ciencia que estudia a los microorganismos que constituyen un importante grupo de organismos primitivos y simples, la mayora unicelulares microscpicos y otros macroscpicos filamentosos o cenocticos,
capaces de realizar innumerables procesos biolgicos, que
han surgido muy temprano en la evolucin, pero que se
han adaptado a las condiciones ambientales actuales.
La Microbiologa estudia:
i) clulas vivas y su funcionamiento
ii) los microorganismos, importante grupo capaz de
existencia independiente
iii) diversidad microbiana y evolucin
iv) funciones en la biosfera, en nuestro organismo, en el
de los vegetales y animales
12
Lillian Frioni
Los organismos cumplen con los 5 principios caractersticos de las clulas vivas:
1. autoalimentacin o nutricin: las clulas toman las
sustancias qumicas del ambiente, las transforman, liberan energa y productos de desecho.
2. autoduplicacin o desarrollo: las clulas son capaces de dirigir su propia sntesis. Al crecer, se dividen dando dos clulas cada una idntica a la original.
Los microorganismos:
estructuras y funciones
organismos y confirmar la existencia de dos tipos de clulas: la eucaritica, unidad estructural de animales, vegetales, protozoos, hongos y algas y la procaritica, caracterstica de los organismos ms simples, las bacterias, incluyendo entre stas a las cianobacterias (figura 2).
A pesar de la extraordinaria diversidad de clulas eucariticas, resultante de la especializacin evolutiva de los distintos grupos, su arquitectura bsica es comn: compartimentalizacin por sistemas membranosos (RE y Golgi), corrientes citoplasmticas, mitocondrias y cloroplastos. El
ncleo de los eucariotes est rodeado por una membrana
Lillian Frioni
citoplasma
clula
eucariota
ncleo
clula
procariota
13
organelos
Protistas superiores, con estructura eucariota, que comprende a las algas, protozoos y hongos.
A los virus les faltan muchos de los atributos de las clulas entre los cuales el ms importante es que no son sistemas abiertos dinmicos. Una partcula viral es una estructura esttica, incapaz de cambiar o reponer sus partes. Carecen de organizacin celular, de capacidad metablica y de autoduplicacin, no se los considera microorganismos, sino entidades biolgicas y sern tratados en
el captulo de gentica de procariotas, por el rol que ejercen en la transferencia de material gentico.
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Lillian Frioni
Arqueobacterias
Eucariotas
Eubacterias
Ancestro universal
Origen de la vida
Aunque las eubacterias y las arqueobacterias son procariotas, desde un punto de vista evolutivo no estn ms
estrechamente relacionadas entre si como lo estn con
los eucariotas.
Las arqueobacterias (Archaeae) comprenden un grupo
muy primitivo que incluye organismos halfitos y termfilos extremos. Entre ellas se encuentran las bacterias metanognicas, anaerobias estrictas.
Parecera que los tres grupos bacterianos surgieron temprano en la historia de la tierra a partir de un organismo
primitivo comn, el ancestro universal.
Debido a que las clulas de los animales y de las plantas
son eucariotas, se ha considerado en forma general que
han derivado de algn tipo de microorganismo, en tanto
que los procariotas representan una rama que nunca super la etapa microbiana.
Prlogo
Microbiologa: bsica, ambiental y agrcola surge luego de revisin y ampliacin de Procesos microbianos, editado en
1999 por la Fundacin de la Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina, texto que continu a Ecologa microbiana
del Suelo, editado en 1990 por el Departamento de Publicaciones de la Universidad de la Repblica (Uruguay).
En todos ellos se analizan actividades de los microorganismos que benefician al hombre y mejoran la calidad de los
ecosistemas naturales, cuyo conocimiento permite manejarlas y dirigirlas en beneficio de la poblacin. En efecto,
muchas actividades microbianas permiten incrementar la produccin de alimentos, la salud de los suelos y de los
cauces de agua, evitando o disminuyendo las aplicaciones masivas de fertilizantes y sustancias altamente txicas como
herbicidas, fungicidas, etc.
Debemos, sin embargo sealar las diferencias entre los tres textos: en Ecologa microbiana del suelo, se analizaron las
transformaciones de la materia orgnica y mineral de los suelos, las interacciones de los microorganismos entre si y con
los vegetales, con nfasis en dos importantes asociaciones simbiticas, las fijadoras de nitrgeno y las asociaciones con
hongos micorrcicos.
En Procesos microbianos se agregaron temas vinculados a los procesos de biodegradacin de restos orgnicos, tanto
aerobios como anaerobios que contribuyen a la conversin de materiales de deshecho de la industria lctea, de otras
agroindustrias y de prcticas agrcolas, en productos que se usan como biofertilizantes y obtener efluentes de la industria sin carcter contaminante, contribuyendo a la proteccin ambiental. Otra temtica abordada en este segundo texto
es la promocin del crecimiento vegetal, tanto en forma directa, por procesos microbianos de mineralizacin, oxidoreduccin, solubilizacin, fijacin, como por su contribucin a la eliminacin de microorganismos fitopatgenos por
mecanismos conocidos como Control Biolgico.
Finalmente, en el presente texto Microbiologa: bsica, ambiental y agrcola, adems de revisarse y actualizarse estos
temas, se entendi oportuno incorporar captulos dedicados a aspectos de Microbiologa General o Bsica, en el entendimiento de que muchas veces resulta dificultoso a los estudiantes de Agronoma, de Ciencias del Suelo o de Ciencias
Ambientales, acceder a los excelentes textos que sobre el tema estn publicados.
Se continu una interesante experiencia de coordinacin realizada entre el 2000 y el 2002 por los docentes de Microbiologa de las 7 Facultades de Uruguay que imparten conceptos de Microbiologa en la que se delimitaron los conceptos
bsicos que deberan contener un curso comn de Microbiologa General, a aplicar en cada uno de esos centros, que
est disponible en CD. Sobre esta experiencia se desarrollaron los captulos del 1 al 7 del presente texto.
Otras temticas abordadas en este texto son el de Biorremediacin, o sea el tratamiento microbiolgico de situaciones
de polucin graves, como las que lamentablemente nos tiene acostumbrados la prensa: derrames de petrleo, contaminaciones por solventes, herbicidas, etc. y el de la aplicacin biotecnolgica de muchos microorganismos.
El Anexo prctico contiene como en los textos anteriores, tcnicas bsicas para realizar experiencias sencillas y poner
en evidencia los procesos microbiolgicos tratados en el texto.
Por ltimo, se desea dedicar este texto a los estudiantes de distintas disciplinas: Agrcolas, Biolgicas, de Ciencias
Ambientales, Ciencias del Suelo, Bioqumica y Qumica, que sientan inters en adentrarse en el apasionante mundo de
los microorganismos.
Lillian Frioni
15
Bacteria
Archaea
Eukarya
Mitocondria
Entamebas
Bacterias verdes
no sulfurosas
Cloroplastos
Flavobacterias
Cianobacterias
Bacterias
grampositivas
Euriarqueotas
Hongos
mucosos
Animales
Hongos
Crenarqueotas
Thermoproteus
Methano- Methanosarcina
bacterium
Methanococcus
Thermococcus
Pyrodictium
Plantas
Halfilos
extremos
Ciliados
Thermoplasma
Flagelados
Korarqueotas
Methanopyrus
Tricomnadas
Thermotoga
Microsporidios
Aquifex
Diplomnadas
(Giardia)
Microscopa
El microscopio marc un hito en los estudios, ya que
hay que considerar que el ojo desnudo aprecia como
independientes a dos puntos separados por 0,1mm (poder separador) y el mejor microscopio ptico presenta
un lmite de resolucin de 0,2 m y un aumento mximo
de 1.500-2000X, que resulta de multiplicar el aumento
del ocular (10-20X) por el del objetivo (5, 10, 20 aumentos, los comunes y x 100, el objetivo de inmersin en
aceite).
Como las bacterias presentan aproximadamente un dimetro de 1 m, con los microscopios pticos slo se pueden apreciar la forma general y las caractersticas morfolgicas principales, pero no se aprecian estructuras subcelulares.
Se emplean tambin microscopios de contraste de fases y los fluorescentes, que permiten distinguir estructuras en base al empleo de colorantes fluorescentes,
como el naranja de acridina, diacetato de fluorescena
etc. Muchos de ellos se consideran colorantes vitales,
ya que fluorescen en luz ultravioleta luego de ser empleados por enzimas celulares.
La estructura interna detallada de los microorganismos
fue visible con el microscopio electrnico, desarrollado a
partir de la dcada del 30 del siglo XX y que presenta un
poder separador aproximadamente 1000 veces superior
al del microscopio ptico y puede distinguir puntos separados por 0,5nm (aumento eficaz 100.000X). Se emplean
los microscopios electrnicos de transmisin y de barrido
(figura 5).
16
Lillian Frioni
En general los microorganismos son fijados (frotis) y teidos con colorantes cidos o bsicos a los efectos de aumentar su visibilidad y/o conservarlos para otros estudios.
Fijacin: se realiza en general secando suavemente el
inculo sobre el portaobjeto a la llama y luego cortando
varias veces la llama con el preparado. El objetivo es conservar las estructuras lo ms intactas posibles antes de
su tincin. La fijacin puede realizarse con sustancias
qumicas, como el etanol, cido actico, formaldehdo, que
inactivan e insolubilizan molculas como los lpidos y protenas microbianas.
Tabla de contenidos
Prlogo .................................................................................................................. 7
Los microorganismos: estructuras y funciones
1 Introduccin a la Microbiologa .............................................................................. 9
El primero permite visualizar estructuras dentro de la clula, as como caractersticas de la membrana y pared
celular, por la diferencia de densidades al ser atravesadas por un flujo acelerado de electrones. El de barrido
muestra el relieve de superficies celulares ya que los electrones se reflejan luego de chocar con una superficie metlica que recubre los preparados.
Tinciones
Los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un microscopio ptico, prctica corriente en estudios
de morfologa de hongos, algas y protozoos (figura 6).
En el caso de las bacterias, dado su pequeo tamao y la
falta de contraste con el medio, esta tcnica de observacin es menos usada.
Sin embargo, es muy empleada para evidenciar la movilidad bacteriana, con cultivos jvenes en medio lquido, en
el microscopio ptico, ya que los flagelos son difciles de
observar aun con tinciones especiales. Se coloca una
gota de cultivo entre porta y cubre objeto o en portaobjetos especiales excavados, que se observan con baja luminosidad ya que existe poco contraste entre las clulas
y el agua, lo que dificulta la observacin.
Existen otro grupo de tinciones que permiten visualizar estructuras como esporas, flagelos, materiales de reserva, etc.
Lillian Frioni
17
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biologa de los microorganismos, 9. Edicin, 2000 Prentice Hall International
Prescott, Harley, Klein, Microbiologa, 1999 McGraw-Hill
Interamericana
Preguntas de repaso
1) Objeto de estudio de la Microbiologa
2) Disciplinas muy relacionadas a la microbiologa
3) Algunas de las especialidades en que se ha subdividido esta ciencia
4) Concepto del trmino microorganismo y ejemplos de
ellos
5) Por qu se dice que los microorganismos son muy
buenas herramientas en estudios fisiolgicos, genticos, enzimticos?
6) Por qu las bacterias estn tan distribuidas en la naturaleza? Seale ambientes donde se las encuentra.
7) Cual fue el gran descubrimiento que permiti separar
a los microorganismos en dos grandes grupos? Con
qu instrumento se logr este hallazgo?
8) Diferencias entre bacteria, arquebacteria y eucariotas
9) Por qu resulta importante la tincin de los frotis bacterianos antes de su observacin microscpica?
10) Por qu aun no se tiene certeza definitiva sobre la
evolucin del mundo microbiano? Qu herramientas
resultan muy importantes de aplicar?
18
Lillian Frioni
Microbiologa:
bsica, ambiental y agrcola
Lillian Frioni
Lillian Frioni
19
Membrana citoplasmtica
Citoplasma
Espacio periplasmtico
Nucleoide
Plsmidos
Ribosomas
Fimbrias y pilis
Flagelos
Endosporas
Vacuolas de gas
Inclusiones citoplasmticas
20
Lillian Frioni
membrana
ribosomas
pared
membrana
retculo
pared
regin nuclear
ncleo
mitocondrias
Estructuras permanentes
(de afuera hacia adentro de la clula)
Pared celular
Constituye la parte ms importante de la clula procariota
ya que salvo algunos micoplasmas y arqueobacterias, parsitas intracelulares, todas las otras bacterias presentan
esta barrera de proteccin contra el ambiente, sin la cual
las clulas sufriran lisis osmtica en ambientes en general
hipo o hipertnicos (suelos, agua, organismos). En 1884,
Christian Gram desarroll la tincin que lleva su nombre y
desde entonces, las bacterias se clasifican en dos grupos
importantes: Gram negativas y Gram positivas.
La diferencia estructural entre ambos grupos se puso de
manifiesto con el microscopio electrnico de transmisin,
a mediados del siglo pasado. El cuadro 2 resume las
diferencias.
Gram positivas: la pared celular posee gruesa capa de peptidoglicano que retiene el colorante especfico (violeta)
Gram negativas: la pared celular presenta capa fina de peptidoglicano y una membrana externa y no retiene el colorante. Se
Periplasma: espacio entre membrana externa de la pared celular y la membrana citoplasmtica, contiene numerosas protenas
hidrolticas
40
Lillian Frioni
Carbono (C)
Hidrgeno (H)
Oxgeno (O)
-3
PO4
-G-M-GL-ala
Potasio (K)
KCl, KH2PO4
D-glu
Magnesio (Mg)
MgCl2, MgSO4
glucano
NaCl
Calcio (Ca)
CaCl2
Hierro (Fe)
G-M-G
L-ala
pptidos
DAP
Sodio (Na)
perimembrana
Azufre (S)
membrana
lipopolisacrido y protena
Fsforo (P)
peptidoglicano
membrana
Nitrgeno (N)
Gram-
peptidoglicano
Gram+
Elemento
21
D-ala
puente
cruzado
D-glu-NH2
L-lis
D-ala
DAP
D-ala
D-glu
D-ala
gli
gli
gli
gli
gli
-G-M-G-
% peso seco
clases diferentes
Total de macromolculas
96
24.610.000
2.500
Protenas
55
2.350.000
1.850
Polisacridos
4.300
Lpidos
9,1
22.000.000
ADN
3,4
2,1
ARN
20,5
255.500
660
Total de monmeros
3,5
350
Aminoc.y precursores
0,5
100
Azcares y precursores
50
0,5
200
18
Nucletidos y precursores
Iones inorgnicos
total
100%
a) Escherichia coli
(G- )
D-ala
b) Staphylococcus L-lis
aureus(G+)
D-glu-NH2
L-ala
-G-M-G
(cido D-glutmico, D-alanina y cido meso-diaminopimlico) no estn presentes en las protenas. La cadena peptdica de 4 aminocidos D y L alternados se conecta a un
grupo carboxilo del cido N-acetilmurmico (figura 4).
La penicilina acta inhibiendo la incorporacin de los aminocidos al peptidoglicano. Otros componentes de la pa-
* Cadenas de glicano
- polmeros lineares de N-acetilglucosamina (NAG)
y cido N-acetil murmico (NAM)
- hidrlisis por lisozima
* Entrecruzamiento peptdico
- unin al cido N-acetil murmico
- contiene D y L aminocidos, inhibicin por antibiticos lactmicos (penicilina)
* Funciones
- confiere forma a la clula, previene la lisis osmtica
- su porosidad permite el pasaje de nutrientes
La pared de una clula Gram negativa (figura 2) es ms
compleja, con capa de 2 a 7 nm de grosor formada por
peptidoglicano (5-10% del peso total de la pared) y se
presenta en forma de gel, ms que como una capa compacta. Luego se encuentra la llamada membrana externa
22
Lillian Frioni
de 7-8 nm constituida por lipopolisacridos (LPS) con lipoprotenas en la cara interna. Algunas de stas, llamadas porinas, forman canales de entrada y salida de sustancias de bajo peso molecular.
Membrana externa: capa externa con lipopolisacridos (LPS), interna unida al peptidoglicano por
lipoprotenas
Porinas, protenas que permiten pasaje de pequeas
molculas al periplasma
Protenas de enlace periplsmicas que unen nutrientes, interactan con protenas de transporte en la membrana facilitando ingreso de nutrientes.
Los lipopolisacridos (LPS) son importantes componentes de la pared Gram negativa, estn formados por lpidos e hidratos de carbono: 1) lpido A; 2) polisacrido central y 3) cadena lateral (O). El lpido A contiene derivados
del azcar glucosamina y est unido a cidos grasos y
fosfatos o polifostatos y se encuentra inmerso en la membrana externa. El resto de la molcula de LPS sobresale
de la superficie. El polisacrido central (core) est unido
al lpido A.
39
Constituyentes
Nutricin y metabolismo
bioenergtico en microorganismos
Nutricin microbiana
1- Fuentes de energa
(luz fototrofos)
(reacciones qumicas quimiotrofos)
2. Macronutrientes
C
H
O
95%
N
S
P
K
Mg
Na
Ca
Fe
El cuadro 1 presenta los distintos tipos de nutrientes requeridos para el desarrollo microbiano.
Los 6 primeros macronutrientes integran importantes molculas (hidratos de carbono, lpidos, protenas, cidos
nuclecos), los restantes se encuentran en forma de cationes y pueden actuar como coenzimas de muchas enzimas (K+). El Ca contribuye a la termoresistencia de las
38
Lillian Frioni
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker, Brock, Biologa de los microorganismos, 9 edicin, 2000, Prentice Hall International
23
Material gentico
Preguntas de repaso
1) Describa la estructura y la funcin de una clula bacteriana, indicando cuales de ellas estn presentes en todas
las bacterias y cuales solamente en algunas especies.
2) Cmo puede obtener nutrientes solubles desde el
ambiente? Y las partculas de gran tamao?
3) Compare la estructura y la composicin qumica de
paredes de bacterias Gram positivas y negativas
4) Describa el material gentico presente en una clula
procariota
5) Polmeros acumulados fuera de la clula: composicin
y funcin. Usos que hace el hombre de ellos. Polmeros de reserva internos.
6) Apndices celulares: comparacin con los presentados en eucariotas. Funcin de ellos
7) Qu propiedades adquieren las clulas esporuladas?
Por qu la esporulacin se considera una especie de
ciclo celular?
8) Por qu una bacteria no puede mantener endosimbiontes?
9) Formas de divisin celular de un procariota.
10) Cmo se explica que las bacterias colonicen ambientes tan extremos (aguas termales, materiales en fermentacin, glaciares?
11) Seale dos momentos en la evolucin de la ciencia
que contribuyeron marcadamente al conocimiento del
mundo microbiano.
12)Seale tres diferencias fundamentales entre ambos
tipos celulares y sus consecuencias en su funcionamiento.
13)Cmo pondra en evidencia la presencia de bacterifagos para bacterias entricas (E.coli, Salmonella) en
muestras de aguas?
La gran diferencia entre clulas pro y eucariotas lo constituye la organizacin del material gentico. Las procariotas
carecen de ncleo tpico, rodeado por membrana. La mayor parte del ADN de una bacteria est constituido por una
sola molcula de ADN, de doble cadena, muy enrollada (figura 4) (Prescott et al., 1999). El material claro a los electrones es el ADN.
Membrana plasmtica
Ribosomas
Cuerpo de
inclusin
de PHB
Nucleoide
Mesosoma
Pared celular
24
Lillian Frioni
Fagos
Bacterias
Estructuras accesorias
(del exterior al interior de la clula)
Cpsulas y capas mucosas
Constituyen deposiciones de materiales altamente polimerizados, hidratos de carbono, pptidos, que la clula libera
al medio cuando las fuentes exceden a las necesidades de
la clula. Las clulas encapsuladas son resistentes a la fagocitosis por protozoos o glbulos blancos, en el caso de
los patgenos del hombre. Tambin evita la desecacin de
las clulas y el ataque por bacterifagos y sustancias txicas y colabora en la adhesin de las clulas a superficies
slidas, en el mar o a superficies de tejidos en huspedes
animales o vegetales (figura 5) (Madigan et al., 2000).
sola partcula fgica, todos los derivados de l seran genticamente idnticos. Los eventos ilustran una curva de
crecimiento de un solo paso. Se repica la playa de lisis en
medio de cultivo bacteriano fresco.
Lisogenia
37
Clasificacin de los fagos: no se han desarrollado relaciones filogenticas y se aplican propiedades como el
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Lillian Frioni
virus
25
gancho
adhesin
monotrico
ADN
clula husped
lofotrico
anillo L
inyeccin
ciclo lisognico
ciclo ltico
anillo S
membrana externa
peptidoglicano
anillo P
replicacin
ADN viral
protenas del
virus y unin
con el ADN
anfitrico
membrana citoplasmtica
integracin del
ADN de virus
induccin
anillo M
peritrico
clula lisogenizada
divisin
celular
lisis
induccin lisognica
crecimiento normal
La figura 7 muestra la ultraestructura del flagelo bacteriano, con la parte ms larga, el filamento, el gancho de anclaje a la clula y el cuerpo basal, embebido en la clula.
En bacterias G- se presentan en este cuerpo basal 4 anillos unidos por una varilla central: el L y P se asocian con
el lipopolisacrido de la membrana externa y el peptidoglicano, respectivamente y el anillo interno M se contacta
con la membrana plasmtica y el gancho, que es un segmento curvo y corto que une el filamento al cuerpo basal,
acoplndolo. En bacterias G+ se presentan slo dos anillos, uno interno relacionado a membrana plasmtica y
otro externo, vinculado al peptidoglicano.
La flagelina es una protena flexible cuyo PM vara entre
30 y 60.000. Algunas bacterias poseen una envoltura de
lipopolisacrido por fuera, como Vibrio cholerae. Mutantes de bacterias con flagelos rectos o con regiones del
gancho anormalmente largas, no pueden nadar.
Su presencia y distribucin en la clula tiene carcter taxonmico: monotricos (un flagelo), anfitricos (a ambos lados), lofotricos (grupos de flagelos en uno o ambos extremos), peritricos (alrededor de la clula) (figura 8).
Los mecanismos de accin flagelar son provocados por:
rotacin de los anillos en el cuerpo basal, estara dirigido por gradiente de protones
Inclusiones citoplasmticas
Materiales orgnicos e inorgnicos, visibles a veces al
microscopio de luz se encuentran en la matriz citoplasmtica. La clula almacena polmeros para evitar las consecuencias de altas presiones osmticas que le ocasio-
26
Lillian Frioni
naran lisis celular o cambios bruscos de pH. Algunos inclusiones estn rodeadas por una membrana no unitaria
de una sola capa de unos 2-4 nm de espesor (azufre, algunos de glicgeno, carboxisomas y vesculas de gas).
Se distinguen (figura 10) (Madigan et al., 2000):
PHB
a
b
d
e
Figura 10- Inclusiones citoplasmticas
a) Grnulos de lpidos (cido poli -OH butrico: PHB)
b) y c) Membrana fotosinttica en lminas (bacterias purpreas)
c) Membrana y vesculas individuales (clorobio) en bacterias purpreas
d) Clorosomas unidos a la membrana plasmtica (bacterias verdes)
e) Bacterioclorofila asociada directamente a la membrana plasmtica
(Heliobacterium)
35
capsmeros
ncleo cpside
unidad
estructural
cabeza
Adenovirus
envoltura
cpside helicoidal
eje tubular
Virus del
mosaico del tabaco
vaina
fibras caudales
Endosporas
Cuando las condiciones del ambiente se tornan desfavorables, ciertos gneros de bacterias (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina) son capaces de formar estructuras terminales o
intercalares, llamadas esporas (cuadro 6). Estn formadas
Virus gripal
espinas caudales
Bacterifago
34
Lillian Frioni
Eucariota
Procariota
si
no
varios
1 (?)
Nucleolos
si
no
si
no
Divisin mittica
si
no
ADN en organelos
si
no
Recombinacin por:
i) fusin de gametos
ii) diploides parciales
si
no
no
si
Retculo endoplasmtico
si
no
Aparato de Golgi
si
no
Lisosomas
si
no
Mitocondrias
si
no
Ribosomas
70S
Microtbulos
si
no
no
si
No
si
Estructura citoplasmtica
27
plsmido
Luego de una serie de etapas que en Bacillus megaterium lleva slo unas 10 horas, se aprecia en los cultivos
las esporas libres, refringentes, sin mucho contraste con
el medio.
Las esporas constan de una cubierta externa, el exosporio, la corteza, en el espacio entre las dos membranas,
donde se acumulan el calcio y el cido dipicolnico y el
protoplasto, en estado criptobitico.
La figura 11 (Prescott et al., 1999). presenta un esquema
de la formacin de una endospora en un bacilo y la figura
12 presenta la ultraestructura de una endospora al microscopio electrnico.
Divisin celular
cromosoma
bacterifago
Algunos pueden presentar otra envoltura ms externa, de
carcter lipdica.
VIII
Lisis del
esporangio,
liberacin de la
espora
VI
Finalizacin de la
sntesis de la cubierta,
aumento de la
refractilidad
y la termorresistancia
Pared
Espora libre
Exosporio
Cubierta de la espora
Crtex
Protoplasto
I
Formacin
del
ligamento
axial
Membrana
plasmtica
DNA
II
Formacin
del septo
Exosporio
V
Sntesis de
la cubierta
Crtex
III
Inclusin de
la preespora
Los fagos virulentos slo se propagan por el ciclo ltico y los temperados pueden propagarse por ciclos
lticos o lisognicos.
IV
Formacin del crtex
28
Lillian Frioni
33
cl
cb
Figura 17- Ultraestructura de las cilias. Izquierda: cuerpo basal (cb) y la cilia (cl) con los microtbulos centrales y perifricos
(x100.000). Derecha: corte transversal de cilias con los dos microtbulos centrales rodeados por nueve pares de microtbulos
(x160.000) (Prescott et al., 1999).
La matriz citoplasmtica es una de las partes ms importantes y complejas de la clula ya que constituye el lugar
Los virus
Se aplica el trmino virus a entidades biolgicas submicroscpicas muy simples, desprovistas de actividad metablica
e incapaces de reproducirse fuera del organismo que parasitan. Alternan su ciclo de vida en dos fases: la extracelular,
donde se comportan como partcula inerte, aunque infecciosa, el virin; y la intracelular, en la cual el virus se presenta
como cido nucleico replicable y la clula del husped (animal, vegetal o microbiana) gobernada por este cido nucleico, rplica todos los componentes virales, provocando la infeccin daos celulares e incluso la lisis de las mismas.
32
Lillian Frioni
clear (parte de un cromosoma especfico) dirige la produccin de ARN ribosomal (rARN) que se combina con
protenas ribosomales de la matriz citoplasmtica, para
formar las subunidades ribosomales parcialmente acabadas, las que dejan el ncleo a travs de los poros de la
envoltura y maduran en el citoplasma.
La divisin celular de una clula eucariota se realiza
asexualmente mediante el proceso de mitosis (divisin nuclear y transmisin cromosmica) o mediante la fusin de
ncleos y reduccin cromtica (ciclo sexual). El proceso de
divisin celular ocupa solo una pequea parte de la vida de
un organismo (ciclo celular). El crecimiento celular ocurre
en la interfase, parte del ciclo celular entre dos mitosis.
Las clulas diploides pueden permanecer como tales durante su vida o en algn momento pueden reducir el nmero de cromosomas a la mitad (clulas haploides), las
que pueden actuar como gametos y fusionarse para volver a formar organismos diploides, mediante el proceso
de meiosis (figura 15)(Prescott et al., 1999).
Organismo diploide
Meiosis
La pared celular rgida de clulas eucariotas es ms sencilla en composicin qumica que la procariota (peptidoglicano, cidos teicoicos, lipoproteinas), presenta en general un
polisacrido sencillo con un solo monmero, como la celulosa, pectina. Otras contienen sustancias inorgnicas como
la slice (diatomeas) o carbonato de calcio (algunas algas).
Los hongos presentan celulosa, quitina o glucano.
Cilias y flagelos
Estos apndices citoplasmticos son organelos relacionados con la movilidad celular en eucariotas y se diferencian entre si por su longitud: las cilias miden entre 5 y 20
micras de longitud, mientras que los flagelos pueden alcanzar 100 a 200 micras.
Otra diferencia la constituye la forma de moverse: los flagelos presentan movimiento ondulante, si la onda se mueve desde la base a la punta, la clula es empujada hacia
delante, mientras que las cilias lo hacen con una vibracin con dos fases distintivas: en el golpe efectivo la cilia
acta como un remo, por lo que impulsa al organismo hacia
delante (figura 16). A continuacin la cilia se pliega a lo
largo, mientras es arrastrado hacia delante en el golpe de
recuperacin, para preparar otro golpe efectivo. El organismo ciliado coordina los golpes de modo que algunas
cilias estn en fase de recuperacin mientras que otras
estn en fase efectiva. De este modo se coordina el movimiento en el agua.
2n
Fusin
Clula
haploide
Gametos
Membrana citoplasmtica
adhesin a superficies, secrecin.
Citoplasma
Microfilamentos, microtbulos
Retculo endosplasmtico
Ribosomas
Sntesis proteica
Aparato de Golgi
Mitocondrias
Cloroplastos
Fotosntesis
Ncleo
Nucleolo
Cilias y flagelos
Movimiento celular
donde se realizan muchos procesos bioqumicos. Est formada por un 70 a 85% de agua, que se encuentra como
agua en estado libre, osmticamente activa, o ligada, como
agua de hidratacin de protenas y otras macromolculas. El pH es cercano a la neutralidad, pero puede variar
ampliamente (las vacuolas de los protozoos pueden tener
pH de 3 a 4).
Estructuras externas
Las clulas eucariotas presentan numerosas capas protectoras o de soporte externas a la membrana citoplasmtica. Muchos microorganismos carecen de pared celular, como las amebas. La mayora de las membranas
eucariotas contienen esteroles, como el colesterol que le
confieren resistencia mecnica.
Los microfilamentos constituyen filamentos de protenas con dimetro entre 4 a 7 nm, pueden estar distribuidos por la matriz del citoplasma u organizados en redes y
participan en el movimiento y cambios de formas de las
clulas (movimiento ameboide, de los grnulos y corrientes citoplasmticas). La protena constitutiva es una actina, similar a la protena contrctil del tejido muscular.
1n
29
cilias y flagelos. Ciertas sustancias como la colchicina alteran la estructura de los microtbulos y bloquean la mitosis y el movimiento de la clula.
Las clulas procariotas carecen de este citoesqueleto
organizado y no presentan protenas similares a la actina.
Retculo endoplasmtico (RE) y aparato de Golgi (AG)
RE: Adems del citoesqueleto, el citoplasma est ocupado
por una red de tbulos membranosos ramificados y fusionados de 40 a 70 nm de dimetro y sacos aplanados que
constituyen el RE. Cuando existe activa sntesis de protenas para excretar, el RE aparece cubierto de ribosomas
(retculo granular o rugoso). Las clulas que sintetizan gran
cantidad de lpidos presentan una RE liso o agrunular.
Funciones: transporte de protenas, lpidos y otros materiales a travs de la clula y es tambin un importante
lugar de sntesis de membrana celular.
AG: es un organelo membranoso compuesto de 4 a 8
sacos membranosos aplanados o cisternas, llamado dictiosoma y no presentan ribosomas. En los extremos de
las cisternas se ubica una red compleja de tbulos y vesculas (dimetro de 20 a 100nm). Parece que los materia-
30
Lillian Frioni
Membrana externa
Menbrana interna
Inclusin
Ribosomas
Es de tamao superior al procariota (70S) y es un dmero
formado por subunidades de 60S y 40S, con un dimetro
de aproximadamente de 22nm, coeficiente de sedimentacin de 80S y PM de 4.106. Cuando est unido al RE rugoso lo hace por la subunidad 60S. Su rol es la sntesis
31
ADN
Mitocondrias
En estos importantes organelos (figura 14) tiene lugar la
actividad del ciclo de los cidos tricarboxlicos y la generacin de ATP por transporte de electrones a nivel del sustrato y por fosforilacin oxidativa. Al microscopio electrnico se ven como estructuras cilndricas de 0,3 a 1,0 por 5
a 10 m (tamao similar a las clulas bacterianas). Pueden presentarse mucha cantidad o una sola muy grande
por clula.
Complejos
F1 -F0
Crestas
Matriz
Presentan doble membrana, la interna presenta invaginaciones conocidas como crestas, que aumentan mucho la
superficie. Las crestas pueden aparecer en forma laminar, de disco o de tbulo. La membrana interna engloba a
la matriz mitocondrial, densa que contiene a los ribosomas, ADN y a menudo grnulos de fosfato de calcio.
Los ribososmas mitocondriales son ms pequeos que
los citoplasmticos y se parecen a los bacterianos por el
tamao, las subunidades y el ADN circular. Las enzimas
responsables de la generacin de energa se ubican solamente en la membrana interna, donde muchas pequeas
esferas (partculas F1) estn adheridas por un pednculo
a la superficie interna y sintetizan ATP en la respiracin.
Las enzimas del ciclo ATC y las de la oxidacin de los
cidos grasos, se localizan en la matriz.
Las mitocondrias as como los cloroplastos se reproducen por fisin binaria y como se parecen a las bacterias,
apoyan la hiptesis de la simbiosis de clulas procariotas
para formar una eucariota.
Cloroplastos
La clase ms importante de plastidios (organelos para la
sntesis y almacenamiento de reservas nutritivas) son los
cloroplastos, que presentan clorofila y son el lugar donde
se realiza la fotosntesis (figura 14). Varan en forma y
tamao, pero en general son ovalados (2-4 por 5-10 micras), aunque algunas algas poseen un nico cloroplasto
gigante que llena casi toda la clula. Son organelos de
doble membrana con una matriz llamada estroma, den-
Envoltura
Laminilla del
(doble membrana)
estroma
Matriz
Grana
Tilacoides
Ncleo
Es el organelo ms visible de las clulas eucariotas y fue
descripto desde 1831, almacena la informacin gentica
y es el centro de control celular. Estn limitados por membranas, la externa y la interna de 5-7 micras (membrana
unitaria). La envoltura contina en algunos puntos con el
RE y la membrana externa est recubierta de ribosomas.
La cromatina es la zona que contiene el ADN, que si bien
se encuentra dispersa, se condensa durante la mitosis,
formando los cromosomas. Numerosos poros (dimetro
aproximado de 70 micras) penetran la envoltura y se forman por la fusin de ambas membranas. Los poros son
una ruta de transporte entre el ncleo y el citoplasma.
El nucleolo es un organelo complejo que no est rodeado
de membranas, se observa en clulas en reposo pero
desaparece en la mitosis. Desempea importante papel
en la sntesis de ribosomas. El ADN del organizador nu-
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Membrana externa
Menbrana interna
Inclusin
Ribosomas
Es de tamao superior al procariota (70S) y es un dmero
formado por subunidades de 60S y 40S, con un dimetro
de aproximadamente de 22nm, coeficiente de sedimentacin de 80S y PM de 4.106. Cuando est unido al RE rugoso lo hace por la subunidad 60S. Su rol es la sntesis
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ADN
Mitocondrias
En estos importantes organelos (figura 14) tiene lugar la
actividad del ciclo de los cidos tricarboxlicos y la generacin de ATP por transporte de electrones a nivel del sustrato y por fosforilacin oxidativa. Al microscopio electrnico se ven como estructuras cilndricas de 0,3 a 1,0 por 5
a 10 m (tamao similar a las clulas bacterianas). Pueden presentarse mucha cantidad o una sola muy grande
por clula.
Complejos
F1 -F0
Crestas
Matriz
Presentan doble membrana, la interna presenta invaginaciones conocidas como crestas, que aumentan mucho la
superficie. Las crestas pueden aparecer en forma laminar, de disco o de tbulo. La membrana interna engloba a
la matriz mitocondrial, densa que contiene a los ribosomas, ADN y a menudo grnulos de fosfato de calcio.
Los ribososmas mitocondriales son ms pequeos que
los citoplasmticos y se parecen a los bacterianos por el
tamao, las subunidades y el ADN circular. Las enzimas
responsables de la generacin de energa se ubican solamente en la membrana interna, donde muchas pequeas
esferas (partculas F1) estn adheridas por un pednculo
a la superficie interna y sintetizan ATP en la respiracin.
Las enzimas del ciclo ATC y las de la oxidacin de los
cidos grasos, se localizan en la matriz.
Las mitocondrias as como los cloroplastos se reproducen por fisin binaria y como se parecen a las bacterias,
apoyan la hiptesis de la simbiosis de clulas procariotas
para formar una eucariota.
Cloroplastos
La clase ms importante de plastidios (organelos para la
sntesis y almacenamiento de reservas nutritivas) son los
cloroplastos, que presentan clorofila y son el lugar donde
se realiza la fotosntesis (figura 14). Varan en forma y
tamao, pero en general son ovalados (2-4 por 5-10 micras), aunque algunas algas poseen un nico cloroplasto
gigante que llena casi toda la clula. Son organelos de
doble membrana con una matriz llamada estroma, den-
Envoltura
Laminilla del
(doble membrana)
estroma
Matriz
Grana
Tilacoides
Ncleo
Es el organelo ms visible de las clulas eucariotas y fue
descripto desde 1831, almacena la informacin gentica
y es el centro de control celular. Estn limitados por membranas, la externa y la interna de 5-7 micras (membrana
unitaria). La envoltura contina en algunos puntos con el
RE y la membrana externa est recubierta de ribosomas.
La cromatina es la zona que contiene el ADN, que si bien
se encuentra dispersa, se condensa durante la mitosis,
formando los cromosomas. Numerosos poros (dimetro
aproximado de 70 micras) penetran la envoltura y se forman por la fusin de ambas membranas. Los poros son
una ruta de transporte entre el ncleo y el citoplasma.
El nucleolo es un organelo complejo que no est rodeado
de membranas, se observa en clulas en reposo pero
desaparece en la mitosis. Desempea importante papel
en la sntesis de ribosomas. El ADN del organizador nu-
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clear (parte de un cromosoma especfico) dirige la produccin de ARN ribosomal (rARN) que se combina con
protenas ribosomales de la matriz citoplasmtica, para
formar las subunidades ribosomales parcialmente acabadas, las que dejan el ncleo a travs de los poros de la
envoltura y maduran en el citoplasma.
La divisin celular de una clula eucariota se realiza
asexualmente mediante el proceso de mitosis (divisin nuclear y transmisin cromosmica) o mediante la fusin de
ncleos y reduccin cromtica (ciclo sexual). El proceso de
divisin celular ocupa solo una pequea parte de la vida de
un organismo (ciclo celular). El crecimiento celular ocurre
en la interfase, parte del ciclo celular entre dos mitosis.
Las clulas diploides pueden permanecer como tales durante su vida o en algn momento pueden reducir el nmero de cromosomas a la mitad (clulas haploides), las
que pueden actuar como gametos y fusionarse para volver a formar organismos diploides, mediante el proceso
de meiosis (figura 15)(Prescott et al., 1999).
Organismo diploide
Meiosis
La pared celular rgida de clulas eucariotas es ms sencilla en composicin qumica que la procariota (peptidoglicano, cidos teicoicos, lipoproteinas), presenta en general un
polisacrido sencillo con un solo monmero, como la celulosa, pectina. Otras contienen sustancias inorgnicas como
la slice (diatomeas) o carbonato de calcio (algunas algas).
Los hongos presentan celulosa, quitina o glucano.
Cilias y flagelos
Estos apndices citoplasmticos son organelos relacionados con la movilidad celular en eucariotas y se diferencian entre si por su longitud: las cilias miden entre 5 y 20
micras de longitud, mientras que los flagelos pueden alcanzar 100 a 200 micras.
Otra diferencia la constituye la forma de moverse: los flagelos presentan movimiento ondulante, si la onda se mueve desde la base a la punta, la clula es empujada hacia
delante, mientras que las cilias lo hacen con una vibracin con dos fases distintivas: en el golpe efectivo la cilia
acta como un remo, por lo que impulsa al organismo hacia
delante (figura 16). A continuacin la cilia se pliega a lo
largo, mientras es arrastrado hacia delante en el golpe de
recuperacin, para preparar otro golpe efectivo. El organismo ciliado coordina los golpes de modo que algunas
cilias estn en fase de recuperacin mientras que otras
estn en fase efectiva. De este modo se coordina el movimiento en el agua.
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Fusin
Clula
haploide
Gametos
Membrana citoplasmtica
adhesin a superficies, secrecin.
Citoplasma
Microfilamentos, microtbulos
Retculo endosplasmtico
Ribosomas
Sntesis proteica
Aparato de Golgi
Mitocondrias
Cloroplastos
Fotosntesis
Ncleo
Nucleolo
Cilias y flagelos
Movimiento celular
donde se realizan muchos procesos bioqumicos. Est formada por un 70 a 85% de agua, que se encuentra como
agua en estado libre, osmticamente activa, o ligada, como
agua de hidratacin de protenas y otras macromolculas. El pH es cercano a la neutralidad, pero puede variar
ampliamente (las vacuolas de los protozoos pueden tener
pH de 3 a 4).
Estructuras externas
Las clulas eucariotas presentan numerosas capas protectoras o de soporte externas a la membrana citoplasmtica. Muchos microorganismos carecen de pared celular, como las amebas. La mayora de las membranas
eucariotas contienen esteroles, como el colesterol que le
confieren resistencia mecnica.
Los microfilamentos constituyen filamentos de protenas con dimetro entre 4 a 7 nm, pueden estar distribuidos por la matriz del citoplasma u organizados en redes y
participan en el movimiento y cambios de formas de las
clulas (movimiento ameboide, de los grnulos y corrientes citoplasmticas). La protena constitutiva es una actina, similar a la protena contrctil del tejido muscular.
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cilias y flagelos. Ciertas sustancias como la colchicina alteran la estructura de los microtbulos y bloquean la mitosis y el movimiento de la clula.
Las clulas procariotas carecen de este citoesqueleto
organizado y no presentan protenas similares a la actina.
Retculo endoplasmtico (RE) y aparato de Golgi (AG)
RE: Adems del citoesqueleto, el citoplasma est ocupado
por una red de tbulos membranosos ramificados y fusionados de 40 a 70 nm de dimetro y sacos aplanados que
constituyen el RE. Cuando existe activa sntesis de protenas para excretar, el RE aparece cubierto de ribosomas
(retculo granular o rugoso). Las clulas que sintetizan gran
cantidad de lpidos presentan una RE liso o agrunular.
Funciones: transporte de protenas, lpidos y otros materiales a travs de la clula y es tambin un importante
lugar de sntesis de membrana celular.
AG: es un organelo membranoso compuesto de 4 a 8
sacos membranosos aplanados o cisternas, llamado dictiosoma y no presentan ribosomas. En los extremos de
las cisternas se ubica una red compleja de tbulos y vesculas (dimetro de 20 a 100nm). Parece que los materia-
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cb
Figura 17- Ultraestructura de las cilias. Izquierda: cuerpo basal (cb) y la cilia (cl) con los microtbulos centrales y perifricos
(x100.000). Derecha: corte transversal de cilias con los dos microtbulos centrales rodeados por nueve pares de microtbulos
(x160.000) (Prescott et al., 1999).
La matriz citoplasmtica es una de las partes ms importantes y complejas de la clula ya que constituye el lugar
Los virus
Se aplica el trmino virus a entidades biolgicas submicroscpicas muy simples, desprovistas de actividad metablica
e incapaces de reproducirse fuera del organismo que parasitan. Alternan su ciclo de vida en dos fases: la extracelular,
donde se comportan como partcula inerte, aunque infecciosa, el virin; y la intracelular, en la cual el virus se presenta
como cido nucleico replicable y la clula del husped (animal, vegetal o microbiana) gobernada por este cido nucleico, rplica todos los componentes virales, provocando la infeccin daos celulares e incluso la lisis de las mismas.
34
Lillian Frioni
Eucariota
Procariota
si
no
varios
1 (?)
Nucleolos
si
no
si
no
Divisin mittica
si
no
ADN en organelos
si
no
Recombinacin por:
i) fusin de gametos
ii) diploides parciales
si
no
no
si
Retculo endoplasmtico
si
no
Aparato de Golgi
si
no
Lisosomas
si
no
Mitocondrias
si
no
Ribosomas
70S
Microtbulos
si
no
no
si
No
si
Estructura citoplasmtica
27
plsmido
Luego de una serie de etapas que en Bacillus megaterium lleva slo unas 10 horas, se aprecia en los cultivos
las esporas libres, refringentes, sin mucho contraste con
el medio.
Las esporas constan de una cubierta externa, el exosporio, la corteza, en el espacio entre las dos membranas,
donde se acumulan el calcio y el cido dipicolnico y el
protoplasto, en estado criptobitico.
La figura 11 (Prescott et al., 1999). presenta un esquema
de la formacin de una endospora en un bacilo y la figura
12 presenta la ultraestructura de una endospora al microscopio electrnico.
Divisin celular
cromosoma
bacterifago
Algunos pueden presentar otra envoltura ms externa, de
carcter lipdica.
VIII
Lisis del
esporangio,
liberacin de la
espora
VI
Finalizacin de la
sntesis de la cubierta,
aumento de la
refractilidad
y la termorresistancia
Pared
Espora libre
Exosporio
Cubierta de la espora
Crtex
Protoplasto
I
Formacin
del
ligamento
axial
Membrana
plasmtica
DNA
II
Formacin
del septo
Exosporio
V
Sntesis de
la cubierta
Crtex
III
Inclusin de
la preespora
Los fagos virulentos slo se propagan por el ciclo ltico y los temperados pueden propagarse por ciclos
lticos o lisognicos.
IV
Formacin del crtex
26
Lillian Frioni
naran lisis celular o cambios bruscos de pH. Algunos inclusiones estn rodeadas por una membrana no unitaria
de una sola capa de unos 2-4 nm de espesor (azufre, algunos de glicgeno, carboxisomas y vesculas de gas).
Se distinguen (figura 10) (Madigan et al., 2000):
PHB
a
b
d
e
Figura 10- Inclusiones citoplasmticas
a) Grnulos de lpidos (cido poli -OH butrico: PHB)
b) y c) Membrana fotosinttica en lminas (bacterias purpreas)
c) Membrana y vesculas individuales (clorobio) en bacterias purpreas
d) Clorosomas unidos a la membrana plasmtica (bacterias verdes)
e) Bacterioclorofila asociada directamente a la membrana plasmtica
(Heliobacterium)
35
capsmeros
ncleo cpside
unidad
estructural
cabeza
Adenovirus
envoltura
cpside helicoidal
eje tubular
Virus del
mosaico del tabaco
vaina
fibras caudales
Endosporas
Cuando las condiciones del ambiente se tornan desfavorables, ciertos gneros de bacterias (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina) son capaces de formar estructuras terminales o
intercalares, llamadas esporas (cuadro 6). Estn formadas
Virus gripal
espinas caudales
Bacterifago
36
Lillian Frioni
virus
25
gancho
adhesin
monotrico
ADN
clula husped
lofotrico
anillo L
inyeccin
ciclo lisognico
ciclo ltico
anillo S
membrana externa
peptidoglicano
anillo P
replicacin
ADN viral
protenas del
virus y unin
con el ADN
anfitrico
membrana citoplasmtica
integracin del
ADN de virus
induccin
anillo M
peritrico
clula lisogenizada
divisin
celular
lisis
induccin lisognica
crecimiento normal
La figura 7 muestra la ultraestructura del flagelo bacteriano, con la parte ms larga, el filamento, el gancho de anclaje a la clula y el cuerpo basal, embebido en la clula.
En bacterias G- se presentan en este cuerpo basal 4 anillos unidos por una varilla central: el L y P se asocian con
el lipopolisacrido de la membrana externa y el peptidoglicano, respectivamente y el anillo interno M se contacta
con la membrana plasmtica y el gancho, que es un segmento curvo y corto que une el filamento al cuerpo basal,
acoplndolo. En bacterias G+ se presentan slo dos anillos, uno interno relacionado a membrana plasmtica y
otro externo, vinculado al peptidoglicano.
La flagelina es una protena flexible cuyo PM vara entre
30 y 60.000. Algunas bacterias poseen una envoltura de
lipopolisacrido por fuera, como Vibrio cholerae. Mutantes de bacterias con flagelos rectos o con regiones del
gancho anormalmente largas, no pueden nadar.
Su presencia y distribucin en la clula tiene carcter taxonmico: monotricos (un flagelo), anfitricos (a ambos lados), lofotricos (grupos de flagelos en uno o ambos extremos), peritricos (alrededor de la clula) (figura 8).
Los mecanismos de accin flagelar son provocados por:
rotacin de los anillos en el cuerpo basal, estara dirigido por gradiente de protones
Inclusiones citoplasmticas
Materiales orgnicos e inorgnicos, visibles a veces al
microscopio de luz se encuentran en la matriz citoplasmtica. La clula almacena polmeros para evitar las consecuencias de altas presiones osmticas que le ocasio-
24
Lillian Frioni
Fagos
Bacterias
Estructuras accesorias
(del exterior al interior de la clula)
Cpsulas y capas mucosas
Constituyen deposiciones de materiales altamente polimerizados, hidratos de carbono, pptidos, que la clula libera
al medio cuando las fuentes exceden a las necesidades de
la clula. Las clulas encapsuladas son resistentes a la fagocitosis por protozoos o glbulos blancos, en el caso de
los patgenos del hombre. Tambin evita la desecacin de
las clulas y el ataque por bacterifagos y sustancias txicas y colabora en la adhesin de las clulas a superficies
slidas, en el mar o a superficies de tejidos en huspedes
animales o vegetales (figura 5) (Madigan et al., 2000).
sola partcula fgica, todos los derivados de l seran genticamente idnticos. Los eventos ilustran una curva de
crecimiento de un solo paso. Se repica la playa de lisis en
medio de cultivo bacteriano fresco.
Lisogenia
37
Clasificacin de los fagos: no se han desarrollado relaciones filogenticas y se aplican propiedades como el
38
Lillian Frioni
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker, Brock, Biologa de los microorganismos, 9 edicin, 2000, Prentice Hall International
23
Material gentico
Preguntas de repaso
1) Describa la estructura y la funcin de una clula bacteriana, indicando cuales de ellas estn presentes en todas
las bacterias y cuales solamente en algunas especies.
2) Cmo puede obtener nutrientes solubles desde el
ambiente? Y las partculas de gran tamao?
3) Compare la estructura y la composicin qumica de
paredes de bacterias Gram positivas y negativas
4) Describa el material gentico presente en una clula
procariota
5) Polmeros acumulados fuera de la clula: composicin
y funcin. Usos que hace el hombre de ellos. Polmeros de reserva internos.
6) Apndices celulares: comparacin con los presentados en eucariotas. Funcin de ellos
7) Qu propiedades adquieren las clulas esporuladas?
Por qu la esporulacin se considera una especie de
ciclo celular?
8) Por qu una bacteria no puede mantener endosimbiontes?
9) Formas de divisin celular de un procariota.
10) Cmo se explica que las bacterias colonicen ambientes tan extremos (aguas termales, materiales en fermentacin, glaciares?
11) Seale dos momentos en la evolucin de la ciencia
que contribuyeron marcadamente al conocimiento del
mundo microbiano.
12)Seale tres diferencias fundamentales entre ambos
tipos celulares y sus consecuencias en su funcionamiento.
13)Cmo pondra en evidencia la presencia de bacterifagos para bacterias entricas (E.coli, Salmonella) en
muestras de aguas?
La gran diferencia entre clulas pro y eucariotas lo constituye la organizacin del material gentico. Las procariotas
carecen de ncleo tpico, rodeado por membrana. La mayor parte del ADN de una bacteria est constituido por una
sola molcula de ADN, de doble cadena, muy enrollada (figura 4) (Prescott et al., 1999). El material claro a los electrones es el ADN.
Membrana plasmtica
Ribosomas
Cuerpo de
inclusin
de PHB
Nucleoide
Mesosoma
Pared celular
22
Lillian Frioni
de 7-8 nm constituida por lipopolisacridos (LPS) con lipoprotenas en la cara interna. Algunas de stas, llamadas porinas, forman canales de entrada y salida de sustancias de bajo peso molecular.
Membrana externa: capa externa con lipopolisacridos (LPS), interna unida al peptidoglicano por
lipoprotenas
Porinas, protenas que permiten pasaje de pequeas
molculas al periplasma
Protenas de enlace periplsmicas que unen nutrientes, interactan con protenas de transporte en la membrana facilitando ingreso de nutrientes.
Los lipopolisacridos (LPS) son importantes componentes de la pared Gram negativa, estn formados por lpidos e hidratos de carbono: 1) lpido A; 2) polisacrido central y 3) cadena lateral (O). El lpido A contiene derivados
del azcar glucosamina y est unido a cidos grasos y
fosfatos o polifostatos y se encuentra inmerso en la membrana externa. El resto de la molcula de LPS sobresale
de la superficie. El polisacrido central (core) est unido
al lpido A.
39
Constituyentes
Nutricin y metabolismo
bioenergtico en microorganismos
Nutricin microbiana
1- Fuentes de energa
(luz fototrofos)
(reacciones qumicas quimiotrofos)
2. Macronutrientes
C
H
O
95%
N
S
P
K
Mg
Na
Ca
Fe
El cuadro 1 presenta los distintos tipos de nutrientes requeridos para el desarrollo microbiano.
Los 6 primeros macronutrientes integran importantes molculas (hidratos de carbono, lpidos, protenas, cidos
nuclecos), los restantes se encuentran en forma de cationes y pueden actuar como coenzimas de muchas enzimas (K+). El Ca contribuye a la termoresistencia de las
40
Lillian Frioni
Carbono (C)
Hidrgeno (H)
Oxgeno (O)
-3
PO4
-G-M-GL-ala
Potasio (K)
KCl, KH2PO4
D-glu
Magnesio (Mg)
MgCl2, MgSO4
glucano
NaCl
Calcio (Ca)
CaCl2
Hierro (Fe)
G-M-G
L-ala
pptidos
DAP
Sodio (Na)
perimembrana
Azufre (S)
membrana
lipopolisacrido y protena
Fsforo (P)
peptidoglicano
membrana
Nitrgeno (N)
Gram-
peptidoglicano
Gram+
Elemento
21
D-ala
puente
cruzado
D-glu-NH2
L-lis
D-ala
DAP
D-ala
D-glu
D-ala
gli
gli
gli
gli
gli
-G-M-G-
% peso seco
clases diferentes
Total de macromolculas
96
24.610.000
2.500
Protenas
55
2.350.000
1.850
Polisacridos
4.300
Lpidos
9,1
22.000.000
ADN
3,4
2,1
ARN
20,5
255.500
660
Total de monmeros
3,5
350
Aminoc.y precursores
0,5
100
Azcares y precursores
50
0,5
200
18
Nucletidos y precursores
Iones inorgnicos
total
100%
a) Escherichia coli
(G- )
D-ala
b) Staphylococcus L-lis
aureus(G+)
D-glu-NH2
L-ala
-G-M-G
(cido D-glutmico, D-alanina y cido meso-diaminopimlico) no estn presentes en las protenas. La cadena peptdica de 4 aminocidos D y L alternados se conecta a un
grupo carboxilo del cido N-acetilmurmico (figura 4).
La penicilina acta inhibiendo la incorporacin de los aminocidos al peptidoglicano. Otros componentes de la pa-
* Cadenas de glicano
- polmeros lineares de N-acetilglucosamina (NAG)
y cido N-acetil murmico (NAM)
- hidrlisis por lisozima
* Entrecruzamiento peptdico
- unin al cido N-acetil murmico
- contiene D y L aminocidos, inhibicin por antibiticos lactmicos (penicilina)
* Funciones
- confiere forma a la clula, previene la lisis osmtica
- su porosidad permite el pasaje de nutrientes
La pared de una clula Gram negativa (figura 2) es ms
compleja, con capa de 2 a 7 nm de grosor formada por
peptidoglicano (5-10% del peso total de la pared) y se
presenta en forma de gel, ms que como una capa compacta. Luego se encuentra la llamada membrana externa
60
Lillian Frioni
0,9
Absorbancia
0,8
0,7
clorofila a
carotenoide
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
340 400
0,9
Absorbancia
0,8
500
600
700
800 900
longitud de onda (nm)
bacterioclorofila a
carotenoide
0,7
0,6
tos elementos. Integran normalmente enzimas y cofactores, tienen funcin cataltica y mantienen estructuras proteicas. As, el Mo interviene en la fijacin del N2, en la
nitrato reductasa, el Co integra la vitamina B12, el Na es
requerido por muchas especies marinas.
Requerimientos de carbono: los microorganismos presentan gran versatilidad en el empleo de sustancias carbonadas. Por las fuentes de carbono que emplean se
clasifican en:
hetertrofos: fuentes orgnicas muy variadas: azcares, alcoholes, cidos grasos, hidrocarburos, polmeros
como la celulosa, lignina.
Factores de crecimiento: muchos microorganismos, incluso los auttrofos, requieren una o ms molculas orgnicas para su desarrollo, ya que no pueden sintetizarla a
partir de los nutrientes. Deben tomarlas completas del medio o bien sus precursores, a muy baja concentracin, como
los micronutrientes. Ejemplos de ellos son: vitaminas (parte
o totalidad de cofactores de enzimas), aminocidos esenciales para la sntesis proteca, bases pricas y pirimdicas (para la sntesis de cidos nuclecos) (cuadro 1).
0,3
0,2
0,1
0
340 400
500
600
700
800 900
longitud de onda (nm)
Flia I
Purpreas sulfurosas
Flia II Chromatiaceae
gn. Chromatium
Verdes sulfurosas
Rhodospirillaceae
gn. Rhodospirillum
A modo de resumen el cuadro 26 se analizan los principales gneros de bacterias fotosintticas anoxignicas,
en el 27 se resumen los procesos generales de la fotosntesis y en el 28 se comparan las propiedades de los sistemas fotosintticos encontrados en microorganismos.
Antes de lograr su aislamiento en cultivo puro, Winogradsky puso en evidencia procesos anaerobios fotosin-
41
0,5
0,4
Requerimientos en N, P, S: los microorganismos pueden emplear estos elementos a partir de las mismas fuentes orgnicas de las que derivan el carbono, aunque usan
frecuentemente fuentes inorgnicas, como sales minerales solubles. El N lo usan desde fuentes inorgnicas reducidas como el amonio (NH4+), pasando por el N-orgnico
(R-NH2), N2 (diazotrofos o fijadores de N2), NO3-. La fuente ms sencilla de asimilar la constituyen las sales de amonio, ya que el N se encuentra en el mismo estado de oxidorreduccin que en los aminocidos. La clula emplea
energa creciente al asimilar nitratos y nitrgeno molecular. El S puede ser nutriente como sulfuros (en general
txicos para la mayora de los microorganismos), S-orgnico (puentes sulfuro o disulfuro), S, formas inorgnicas
Muchos microorganismos son empleados para valorar cantidades pequeas de factores de crecimiento, como la vitamina B12, riboflavina. El microorganismo se desarrolla
en forma proporcional a la cantidad de factor de crecimiento agregado al medio de cultivo. Curvas patrones con
estndares puros de la vitamina, permite efectuar las comparaciones. Los bioanlisis microbiolgicos se emplean
muchas veces a pesar de los avances en las determinaciones qumicas (Captulo 20).
Un microorganismo se denomina:
prottrofo cuando emplea los mismos nutrientes que la
mayora de las cepas de su especie que existen en la
naturaleza. Pero esta bacteria puede mutar y requerir tomar del medio el nutriente para su desarrollo, se comporta entonces como
auxtrofo para ese nutriente, como un aminocido, que
se convierte en esencial. Estos microorganismos se usan
mucho en estudios de gentica bacteriana.
En resumen: las potencialidades metablicas de los microorganismos son muy variadas (cuadro 9), desde aquellos prcticamente autosuficientes (fotolitotrofos), hasta los
muy exigentes, que requieren agregados de varios factores de crecimiento, muchas veces contenidos en los extractos de lavadura, de malta, de carne, de suelo, etc.
42
Lillian Frioni
H2S
CO2
ADP
hv
organotrofos
litotrofos
(CH2O)
La figura 14 (Madigan et al., 2000) muestra la composicin y espectro de absorcin de la clorofila a, tpica de los
eucariotas, la bacterioclorofila, de los procariotas. Se observa el mayor espectro de absorcin en las bacterioclorofilas, que absorben adems en la regin azul del espectro, luz de longitud de onda larga, cerca de 1000nm, no
visible al ojo humano (zona oscura, en pantanos, suelos
anegados).
ATP
Estroma
Piridin
nucletido reductasa
ADP + Pi
Fotones
Complejo citocromo bf
8H+
2NADP+
e
QA
QB
e-
4PQH2 e-
e-
P680
Cit f
8H
O2 + 4H+
FeS
Fotosistema II
CF1
2NADPH
Fd FAD
FeS
4PQ
Mn
CGO
2H2O
Cit b6
3H+
2H+ +
-
Feofitina
ADP
hv
ATP
Tilacoide
emplean la luz
reacciones qumicas con sustratos: orgnicos
inorgnicos
CO2
compuestos inorgnicos
oxignica
CO2
ATP
n
Membrana externa
Membrana interna
Estroma
Cloroplasto
H2 O
/2O2
Fotones
(CH2O)
SO4=
hv
energa
Los microorganismos presentan varios sistemas de transporte para una misma sustancia, lo que les brinda gran
ventaja competitiva en el ambiente.
C
anoxignica
El cuadro 5 presenta los tipos nutricionales ms comunes, donde se aprecian organismos que emplean sustancias muy simples, como minerales y CO2 y aquellos, ms
exigentes, con requerimientos de compuestos carbonados variados.
Poder reductor
Clasificacin nutricional
de los microorganismos
Importante es el papel que juegan los siderforos, molculas orgnicas de bajo peso molecular, capaces de formar
complejos organo-metlicos con el ion frrico a los efectos
de transportarlo al interior de las clulas, donde una hierro
reductasa lo reduce a in ferroso, asimilable por el microorganismo. El tema es relevante en el control biolgico de
microorganismos fitopatgenos, quienes compiten por bajos niveles de hierro disponible en los suelos, con los microorganismos antagonistas seleccionados e inoculados en las
semillas en viveros, como Pseudomonas (captulo 17).
Las figura 11 esquematiza el flujo de electrones en ambos tipos de fotosntesis, la 12 (Madigan et al., 2000) y la
13 (Prescott et al.. 1999), muestran las estructuras celulares que albergan a los pigmentos fotosintticos y pigmentos accesorios en clulas procariotas y eucariotas.
59
e-
PC - Cu+
PC - Cu2+
e-
P700
Fotosistema I
Lumen
3H+
ATP
sintetasa
58
Lillian Frioni
procariotas
cinaobacterias
bacterias sulfurosas
verdes y purpreas
bacterias no sulfurosas
verdes
y purpreas
La fotosntesis anoxignica (tipos 2, 3 y 4) es ms primitiva, es conocida como fotosntesis bacteriana, o cclica, los electrones de la clorofila bacteriana, o bacterioclorofila, que absorbe en el infrarojo (700-800nm), vuelven a
ella por lo que genera slo 1 ATP por vuelta de los electrones. Se realiza en anaerobiosis y surgi cuando en la
atmsfera no haba oxgeno. El NADP+ es reducido por
flujo inverso de electrones o directamente por los donadores externos de electrones en reaccin independiente
de la luz (cuadro 24).
El tipo 2) es realizado por las bacterias fotosintticas sulfurosas purpreas y verdes: Chromatiaceae y Chlorobiaceae (gneros ms conocidos: Chromatium y Chlorobium)
distinguibles por sus pigmentos. Usan H2S o H2 como donadores de electrones. El S acumulado en las clulas
puede ser empleado como fuente de energa cuando crecen en quimiotrofia, sin luz. Crecen en barros o aguas en
donde hubo anaerobiosis (produccin de H2S).
El tipo 3) y 4) lo realizan integrantes de una sla familia de
bacterias fotosintticas no sulfurosas: Rhodospirillaceae
(gnero Rhodospirillum). No pueden emplear H2S ni H2
como donadores de electrones, pero si molculas orgnicas simples, como cidos o alcoholes. El tipo 4) no puede
reducir el CO2 (la forma ms oxidada del carbono) con la
energa de la fotosntesis, la que slo le alcanza para reducir molculas de estado de oxidacin intermedio (cidos) hasta carbohidratos.
Son fotoheteroorganotrofas.
La mayora de las bacterias fotosintticas anaerobias se
desarrollan en ambientes anegados, barros, capas subsuperficiales de suelos, sucediendo a las bacterias sulfatorreductoras, que liberan cido sulfhdrico en anaerobiosis. Tambin la mayora es capaz de fijar N2, por lo que
constituyen una importante herramienta de estudio; el flujo electrnico de la fotosntesis es capaz de reducir CO2 y
N2 en anaerobiosis.
FOTOSISTEMA I
P700+
-1.5
Fd
800+
BI
FOTOSISTEMA II
P680+
-1.0
Feofitina
PQ
NADP
NADP NADPH, H
NADPH, H
CIT. b/f
CIT. bc
PC
0.0
H2S, S + NAD+
ac. orgnicos
succinato
CIT. c
800
1.0
ADP + Pi
+
S, SO4 + NADH + H
fumarato
Fuente
de energa
Fuente de
carbono
Donadores
de electrones
Ejemplos
Fotoautolitotrofos
(FAL)
luz
CO2
Agua, sulfuros, H2
Algas, cianobacterias
Bacterias fotosintticas
sulfurosas
Fotoautoorganotrofos
(FAO)
luz
CO2
cidos orgnicos
Bacterias fotosintticas
no sulfurosas
Fotoheteroorganotrofos
(FHO)
luz
Materia orgnica
(cidos)
Materia orgnica
(cidos)
Algunas bacterias
fotosintticas no sulfurosas
Quimioheteroorganotrofos
(QHO)
Reacciones
qumicas
Materia orgnica
Materia orgnica
La mayora de los
microorganismos
Quimioautolitotrofos
(QAL)
Reacciones
qumicas
CO2
Pocas bacterias
tpicas y archeae
Fotoautoorganotrofos Bacterias fotosintticas no sulfu- Para el desarrollo microbiano es necesario tener en cuenrosas (emplean sustancias orgnicas simples como do- ta adems de los nutrientes, las llamadas condiciones
de cultivo: el pH, presin osmtica, temperatura de innadores de electrones en la fotosntesis)
cubacin, nivel de oxgeno, etc. a niveles adecuados,
Quimioautolititrofos Bacterias oxidantes del amonio, del sin las cuales el microorganismo no se desarrollar o lo
nitrito, del azufre, del hierro, del hidrgeno (aerobias), har mal.
desnitrificantes auttrofas (anaerobias). Importantes en los
Condiciones para el crecimiento microbiano
ciclos biogeoqumicos.
Se toman en cuenta:
Quimioheterotrofas La mayora de los microorganismos Los medios de cultivo, que aportan los nutrientes, como
usan materia orgnica como fuente de energa, de carbo- el agua, fuentes de E, C, N, S, P, etc., los micronutrientes,
no y donadores de electrones (la sustancia que se oxida). empleados en baja concentracin (Cu, Cd, Zn, etc. y los
En general la misma sustancia puede cumplir todas estas que actan como factores de crecimiento (vitaminas, amifunciones. Todos los hongos, protozoos y la mayora de nocidos esenciales, bases de cidos nucleicos).
las bacterias pertenecen a esta categora.
Las condiciones de cultivo: temperatura, radiaciones,
luz, aireacin, presin osmtica, que afectan el desarrollo
de los microorganismos.
Medios de cultivo
P700
43
P680
H2O
O2 + H+
Donadores externos
de electrones
Complejo
Mn
Un gran desarrollo en la microbiologa se ha logrado luego del aislamiento y cultivo de los microorganismos en el
laboratorio. Esto se logr a partir de su siembra en los
llamados medios de cultivo: conjunto de nutrientes que
permiten el desarrollo de microorganismos particulares.
Todos contienen agua y fuentes de energa, C, N, S, Fe,
P, etc., micronutrientes, factores de crecimiento y aditivos
como colorantes, antibiticos, sales, etc.
44
Lillian Frioni
Por su naturaleza
lquidos
slidos
semislidos
Hasta la introduccin del agar-agar los medios se solidificaron con una protena, la gelatina, con el inconveniente
de que muchos microorganismos producen proteasas que
la hidrolizan, licuando al medio, inicialmente slido. El agaragar es un polmero de alto peso molecular, aislado de un
alga marina. Funde a los 100C y se mantiene en estado
lquido hasta aproximadamente 45C lo que permite repartirlo en cajas de Petri, antes de su solidificacin.
Se usan solidificantes inorgnicos, como el slico gel, producido por la unin de soluciones de silicato de sodio o de
potasio con cido clorhdrico de densidades adecuadas.
Luego de gelificacin y repetidos lavados para eliminar el
cido restante, se pasan por agua hirviendo y luego se
impregnan con los nutrientes. Es empleado para aislamiento de organismos auttrofos, como los nitrificantes.
Los medios slidos se usan en tubos o cajas de Petri,
para el aislamiento, purificacin y numerosos tipos de estudios. Los semislidos, llevan baja concentracin de solidificante, por ejemplo con 0,2% de agar y son empleados para estudios de microorganismos microaeroflicos
(cuadro 7). Los medios selectivos son muy tiles para el
aislamiento de miroorganismos con exigencias particulares, como los autotrfos (medios sin C-combinado), fijadores de N2 (medio sin N-combinado), otros medios llevan antibiticos, sales biliares, etc. para evitar el desarrollo de organismos no deseados.
57
CH
masa microbiana que lo hace apto para uso como mejorador de suelos.
Cuadro 22- Reduccin de iones frricos
(ferrireduccin)
+++
MO + Fe
CO
++
+ H2O + Fe (soluble)
Complejos organo-metlicos
+++
Siderforos + Fe
el complejo entra a la
++
clula y se reduce en el citoplasma (Fe asimilable)
(reductasa-frrica)
Corrosin anaerobia de metales
=
SFe + 3Fe(OH) (soluble) + OH
4Fe + SO4 + H2O
2
Este proceso es muy aplicado en el tratamiento de residuos de tambos (estircol), restos de cosechas y en la
depuracin de efluentes de fbricas, en anaerobiosis y es
tratado en el captulo 21.
+ 2H2O (auttrofas)
CO + CH
Acetilclstica CH3COOH
2
4
Methanosarcina, Mathanobacillus, Methanococcus
Metilotrfica: usan metilamina, metilsufuros (hetertrofas)
El cuadro 22 resume la intervencin del hierro en procesos redox anaerobios, que lleva a los iones frricos insolubles y no aprovechables por las plantas a formas reducidas ferrosas, solubles (captulo 12).
Fotosntesis
Constituye un proceso redox de conversin de la energa
lumnica en energa qumica (ATP). La energa de la luz
se emplea para reducir CO2 o compuestos orgnicos
menos reducidos a molculas orgnicas (azcares), por
organismos aerobios y anaerobios.
Tipos de fotosntesis en los microorganismos
1) CO2 + 2H2O
2) CO2 + H2S
(anoxignica)
3) CO2 + CH3COOH
(CH2O)n + H2O
4) CH3COOH
(CH2O)n + H2O
56
Lillian Frioni
Flavoprotena
e=
Componentes comunes
Medio 1
K2HPO4, 1g
ADP + P1
ATP
Citocromos
H2 + NO3
NO3-
Cit a1
ADP + P1
Cit a3
1/2O2
ATP
SO4 + N2 (N2O) + H
KH2PO4, 1g
Medio 2
Medio 3
Medio 4
NH4Cl, 1g
NH4Cl, 1g
NH4Cl, 1g
glucosa
glucosa
glucosa
cido nicotnico
100mg
extracto de
levadura, 5g
MgSO4.7H2O, 20mg
Medio 5
FeSO4.7H2O, 10mg
Micronutrientes: Mn,
Mo,Cu,Co,Zn, como sales
(0,02-0,5mg/L de c/u)
N2 (N2O) + H2O
H2O
+0,82V
componentes adicionales
Agua, 1L
NAD
NO2-
tadoras de electrones para la oxidacin del mismo sustrato: una aerobia, que le rinde ms energa y otra anaerobia, ms corta, que rinde entre 2 y 3 ATP por mol de
glucosa.
-0,32V
+
45
Como los nitratos se forman en aerobiosis, una alternancia de perodos de aerobiosis y de anaerobiosis (lluvias y
anegamiento seguidos de aireacin en suelos) estimula
mucho este proceso que resulta muy importante en la
depuracin de aguas altamente contaminadas: el nitrgeno orgnico se mineraliza a nitratos en aerobiosis y se
desnitrifica volatilizndose a la atmsfera como N2 por
respiracin anaerobia.
Aceptor sulfatos (sulfatorreduccin)
Este proceso es realizado por un grupo de bacterias anaerobias estrictas, es decir que slo pueden crecer en anaerobiosis. Los gneros ms conocidos son Desulfotomaculum, Desulfovibrio (cuadro 20).
El proceso perjudica a las plantas que emplean sulfatos,
pero es favorable en la depuracin de cursos de aguas
contaminadas, pues volatiliza formas combinadas de azufre, como gas H2S (captulo 12).
As, la puesta en evidencia de los grupos fisiolgicos conjunto de organismos taxonmicamente a veces no relacionado, pero que presentan la misma aptitud para efectuar reacciones de biodegradacin o de biosntesis, como
los celulolticos, los amonificantes, etc., se realiza por siembra en medios selectivos apropiados.
Siembra y aislamiento
Siembra: es colocar un microorganismo en un medio apropiado para que se desarrolle.
Se realiza con fines variados: aumentar el nmero de microorganismos en medio slido o lquido, para obtener biomasa microbiana para uso industrial, preparar inoculantes biolgicos, obtener metabolitos de inters. La siembra
puede realizarse para obtener cultivos puros, entonces
se habla de aislamiento.
Aislamiento: obtencin de cultivos puros, en general microorganismos derivados de una sola clula (clon).
El aislamiento puede ser:
46
Lillian Frioni
inculo
N2 como fuente de N
cianobacterias
anaerobiosis
H2, c.orgnicos, N2 H2S
donador de e
bacterias purpreas
no sulfurosas
NH4
NO2
H2
=
H2S, S, S2O3
+3
Fe , pH bajo
organismos
inculo
O2
Nitrosomonas
tierra, lodos
O2
Nitrobacter
aguas servidas
O2
bacterias del H2
biodigestores anaerobios
O2
Thiobacillus spp
suelos
O2
T. ferrooxidans
suelos
anaerobia
=
S, S2O3
NO3
T. denitrificans
suelos, lodos
H2
CO2
metanognicas
H2
NO3
Paracoccus denitrificans
aceptor de e
O2
vegetacin en descomposicin
almidn, NH
pasteurizar
Estas respiraciones poseen importantes aplicaciones biotecnolgicas por |os productos formados, cidos glucurnicos, cido actico, etc.
organismos
Pseudomonas fluorescens
(80C) para enriquecer en Bacillus
O2
etanol (4%)+ 1%
O2
Acetobacter, Gluconobacter
extracto de levadura
pH 6, hidrocarburos (ej.aceite mineral),
amonio
O2
Mycobacterium, Nocardia
celulosa, amonio
O2
Cytophaga, Sporocytophaga
azcares, N2
O2
Azotobacter
COOH
3
(preparacin de vinagre)
cido actico
bacterias sulfurosas
purpreas y verdes
aceptor de e
CH
CH3CH2OH + O2
etanol
aerobiosis
aerobiosis
donador de e
55
amonio
nitrito
azufre
hierro
hidrgeno
Ecuacin (ATP)
+
Grupo
Fisiolgico
Nitratantes
=
+++
Fe + O2 = Fe + H2O
H 2 + O2
= H2O
El cuadro 18 resume los potenciales redox en estas respiraciones que indica que varios compuestos inorgnicos
que pueden dar al oxidarse con el O2, energa suficiente
para la sntesis de ATP.
Cuadro 18 - Produccin de energa a partir de la
oxidacin de varios donadores inorgnicos de
electrones
G (kJ/reaccin)
Reaccin
-
HS + H + 0,5O2
S + 0,5O2 + H2O
+
NH4 + 0,5O2
NO2 + 0,5 O2
++
+
Fe + H + 0,25 O2
S + H
0
+
SO + 2H
4
+
NO + 2H + H O
2
2
NO3
+++
Fe + 0,5 O
2
=
-203,2
-589,1
-260,2
- 75,8
- 71,2
++
Su rol puede resultar muy importante en la naturaleza por la liberacin de iones fundamentales para las
plantas: nitratos, sulfatos. La oxidacin del hierro conduce a la formacin de Fe(OH)3 insoluble, indisponible para los cultivos. Esta sustancia produce obstrucciones en las caeras de hierro atacadas por las ferrobacterias.
Nitritantes
ATP se acopla a la oxidacin del donador de electrones y la energa de reduccin se obtiene directamente a
partir del compuesto inorgnico, si tiene potencial redox
suficientemente bajo, o por reacciones de transporte inverso de electrones.
Ferroxidantes
Oxidantes del H2
Respiraciones anaerobias
Constituyen procesos realizados solamente por protistas
inferiores (bacterias) en anaerobiosis. Los distintos tipos
se presentan en la figura 9. El flujo de electrones en las
respiraciones, sus cadenas transportadoras de electrones
(CTE) se aprecia en la figura 4.
Los rendimientos energticos, son muy superiores en las
respiraciones aerobias con sustratos orgnicos.
Las cadenas transportadoras de electrones en las respiraciones anaerobias son ms cortas, entrando los mis-
54
Lillian Frioni
47
Flujo de C
Flujo de eCO3O2
NO3
Fe
Respiracin aerobia
+++
=
4
Respiracin anaerobia
Compuestos inorgnicos
NH4+ , NO2- , S= , Fe++ , H2
Lacobacillus
SO
comp. org.
CO2
Flujo de C
Flujo de eBiosntesis
(Ciclo de Calvin)
O2
Respiracin aerobia
Respiracin anaerobia
Respiraciones aerobias
aceptor e
cido orgnico
KNO3(2%)
extracto de levadura
KNO3(10%)
Bacillus
cidos orgnicos
Na2SO4
Desulfovibrio, Desulfotomaculum
CH3OH
Na2CO3
Methanosarcina barkeri
CH3NH2
KNO3
Hyphomicrobium
glutamato
Clostridium
lodo, sedimentos
histidina
Tetanomorphum
almidn, amonio
Clostridium spp
almidn, N2
C. pasteurianum
anaerobiosis, fermentacin
glucosa,
extracto de
Streptococcus
Leuconostoc
componentes
Esta es una respiracin aerobia completa, ya que el sustrato es oxidado completamente a CO2 y agua, liberando
toda la energa de la molcula. Los sustratos orgnicos
son degradados muy rpidamente por esta va.
Existen casos en los que los organismos carecen de enzimas del ciclo de Krebs y no pueden llevar el sustrato a
CO2, son las respiraciones con sustrato orgnico incompletas:
levadura, pH 5
Preguntas de repaso
1) Conceptos y ejemplos de:
Nutriente
Medio de cultivo
Condiciones de cultivo
2) Seale: ejemplos de microorganismos auto y heterotrficos, asi como aquellos de mayor capacidad biosinttica. Cuales son los ms distribuidos en la naturaleza?
3) Complete el siguiente cuadro indicando la forma
qumica en que los principales elementos se usan
como nutrientes a vegetales, animales y microorganismos
Elemento vegetales
C
N
S
P
Fe
Ca
Mn
Micronutrientes
animales
microorganismos
48
Lillian Frioni
Luz
Reacciones qumicas
Donadores de electrones
B
+
C
+
-
D
+
-
+
H2O
+
orgnico
+
NH4+
+
c. actico
Clasificacin:
Metabolismo bioenergtico
en los microorganismos
El cuadro 9 es un clsico esquema sobre la utilizacin de
los nutrientes con el objeto de obtener energa o con fines
biosintticos. Se abordarn distintos aspectos relacionados a los mecanismos de obtencin de energa por los
microorganismos, que como todo organismo, emplean los
tres tipos de procesos: fermentacin, fotosntesis y respiracin (cuadro 10).
Cuadro 9- Metabolismo bioenergtico y
biosinttico
ADP
energa
utilizable
calor
biopolmeros
Pi
fuentes
de energa
intermediarios
biosintticos
ATP
depsitos
celulares
productos
metablicos
nutrientes
externos
2ADP
2ATP
C6H12O6
2 NAD
2NADH
Fermentaciones
Donadores y aceptores de electrones compuestos orgnicos
Rinde poca energa (E) y nada de poder reductor. Ej:
fermentaciones lctica y alcohlica
Respiraciones
Donadores de e- pueden ser orgnicos o inorgnicos,
los aceptores son en general inorgnicos:
O2 (aerobia)
=
=
+++
CO3 , SO4 , NO3 , Fe (anaerobia)
Fotosntesis
Transformacin de energa lumnica en qumica por fotofosforilacin
Oxignica (la superior), libera O2
Anoxignica (bacterias anaerobias, no liberan O2)
2 CH3COCOOH
(cido pirvico)
deshidrogenasa
lctica
NAD
2 CH3CHOHCOOH
(cido lctico)
Figura 6- Fermentacin homolctica
Se cree que es el metabolismo bioenergtico ms antiguo, cuando no exista el O2. Los microorganismos fermentadores se han adaptado a las nuevas condiciones
de la atmsfera, realizando el mismo proceso que sus
ancestros.
glucosa
glucosa-6P
ATP
ADP
NAD
6P-gluconato
NAD
NADH
CO2
Respiraciones
gliceradldehdo - P
NAD
2 ADP
NADH
2 ATP
cido pirvico
NADH
acetil - P
NADH
NAD
acetaldehdo - P
NADH
Reacciones de biosntesis
ii) poder reductor
* autotrofia: CO2 Corgnico
* transferencia de poder reductor:
+
sustrato oxidado + NADH sust.reducido+ NAD
Son quizs unas de las bacterias ms estudiadas y cultivadas por su importancia econmica ya que participan en
las transformaciones de un alimento tan importante como
la leche y son responsables de aplicaciones biotecnolgicas en derivados de la leche: leches agrias y yogur, quesos. La produccin de cido lctico hace que el producto
se estabilice, evitando el deterioro microbiano. Este proceso se emplea tambin en la conservacin de pasturas y
granos en el proceso conocido como ensilaje, tema que
ser tratado en el captulo 18.
NADH
ribulosa - 5P
i) obtencin de energa
Bacterias acidolcticas
NADH
Ejemplos:
5) Relativa al cuadro 7
i)Clasifique los medios de cultivo (1...5) por su empleo en
el laboratorio
ii) Seale los factores de crecimiento presentes en los
medios y su rol en la clula
ii) Cmo hara diferencial al medio 3?
iv) Cmo trabajara en anaerobiosis con el medio 4?
v) Rol del par fosfato en los medios de cultivo
C-CO2
C-orgnico
A
+
-
Los mecanismos de biosntesis de distintas macromolculas, como hidratos de carbono, lpidos, protenas, cidos nucleicos, no sern analizadas ya que los procesos
no difieren mayormente en la escala biolgica. En efecto,
el equipo enzimtico y los mecanismos bioqumicos suelen ser similares en una bacteria y en organismos superiores, incluido el hombre.
53
NAD
cido lctico
NAD
etanol
CTE
AH2 + B
A + BH2
52
Lillian Frioni
Lactato
CO2
NADH
Acetaldehdo
Piruvato
2
NADH
Piruvato
CO2
levadura
CO2
CoASH
3
Etanol
como
del pan
acetolactato
Oxaloacetato
Acetil -CoA
Pi
CoA
NADH
Acetil
Malato
H2O
P
ADP
ATP
Formato
5
H2
Acetaldehdo
CO2
Acetona
NADH
NAHD
Semi reaccin
+
produccin
Acetoacetil-CoA
CO2
Propionato
Butiril -CoA
Acetona
NADH
NADH
Isupropanol
2H + 2e = H2
+
Oxidacin de compuestos
orgnicos o inorgnicos
luz
S(s) + 2H + 2e = H2S(g)
+
Pi
Coa
CoA
Butiraldehdo Butiril P
ADP
NADH
ATP
Fermentacin alcohlica
La enzima involucrada es la deshidrogenasa alcohlica,
el donador de electrones se encuentra en la va glicoltica (triosa-P) y los productos finales son el etanol y el
CO2. Se realiza en el msculo y entre los microorganismos son sobre todo los hongos y entre ellos las levaduras, como Saccharomyces cereviseae, son muy empleadas en la produccin industrial de etanol, en la vinificacin, en la panificacin (el CO2 es el agente levador, el
etanol se volatiliza en el horno).
El empleo de distintas sustancias qumicas que al humedecerse y con la temperatura liberan CO2 (tartratos, bicarbonatos) empelados en los polvos de hornear, no ha podido sustituir a las levaduras, que dan a la masa un sabor
y textura muy particular.
El cuadro 16 resume las mltiples aplicaciones biotecnolgicas de la fermentacin alcohlica, una de las ms
empleadas, junto a la fermentacin lctica, a nivel industrial. Ya vimos el uso del agua o del extracto de levaduras en los medios de cultivo, como fuentes de aminocidos, de carbono y de factores de crecimiento (vitaminas y otros).
Fermentacin heterolctica
Las bacterias carecen de enzimas de la va glicoltica (aldolasa y triosafosfato isomerasa) y la degradacin de la
glucosa se realiza por la va del fosfogluconato: oxidan
glucosa-6P a 6-fosfogluconato que luego decarboxilan a
pentosa-P. Esta se transforma en triosa-P y acetil-P por la
enzima fosfocetolasa. La triosa da cido lctico con la
formacin de un mol de ATP, mientras que el acetil-P acepta electrones a partir de los NADH generados en la produccin de pentosa-P y se convierte en etanol sin produccin de ATP.
El rendimiento energtico es menor: 1 solo mol de ATP, en
lugar de 2 como en los homofermentadores, que producen
el doble de biomasa por mol de azcar fermentado.
No se acumula poder reductor (figura 7).
La produccin de CO2 es una forma sencilla de distinguir
un grupo de otro. Importantes productos son formados en
estos procesos, que el hombre ha aprovechado desde muy
antiguo, incluso antes de conocerse el rol de los microorganismos en el proceso.
El balance energtico es muy bajo, 2 ATP en las fermentaciones alcholica y lctica y 1 en la heterolctica. No se genera poder reductor, por lo cual el micro-
ENERGIA
(1KCAL=4,184Kjulios)
piruvato + 2H + 2e = lactato
-
polisacridos
lpidos
Fe+3 + e = Fe+2
Etapa 1
O2 + 4H = 2H2O
aminocidos
Etapa 2
NADH
FADH2
ATP
NADH
Piruvato
NADH
Acetil CoA
Etapa 3
Oxaloacetato
-0.22 **
0.36
0.56
0.67
0.74 **
0,76
0.82
monosacridos
NH3
-0.25 **
0.42
-
-0.29
-0.19
-0.32
-0.24
-
SO4-2 + 9H + 8e = HS + 4H2O
Fermentacin lctica
-0.43
-0.41 **
NAD + 2H + 2e = NADH + H
NADH
CO2
Succinato
Eo [v]
produccin
Etanol
Acetato
Fumarato
CO2
49
Citrato
Ciclo de los
cidos
tricarboxlicos
ATP
NADH
FADH2
Isocitrato
CO2
-cetoglutarato
CoQ
CO2
Succinil Co A
Citocromos
Cadena de
tranporte
O2
de electrones
ATP
50
Lillian Frioni
NADH NAD+
+H+
Aldolasa
Gliceraldehdo 3-P
Pi
1,3-bisfofoglicerato
Fosforilacin a
nivel de sustrato
3-fosfoglicerato
2-fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato
Fosforilacin a
nivel de sustrato
Piruvato
1/2O2+2H
H 2O
NAD
Matriz
Lactato
Piruvato
Gliceraldehdo 3-fosfato
Rendimientos energticos
38 ATP/glucosa en la respiracin con O2:
* 10 NADH x 3ATP= 30 ATP
* 2FADH2 x 2 ATP = 4 ATP
* 2ATP + 2 GTP = 4 ATP
2 ATP/ glucosa en las fermentaciones
Menos de 2-6 ATP/glucosa en respiraciones anaerobias: los electrones entran en general pos los citocromos. El NAD+ se regenera por flujo inverso de electrones con gasto de ATP (figura 10).
Caractersticas de las fermentaciones
i) Diferentes organismos liberan distintos productos por
las fermentaciones (cidos, alcoholes, solventes, H2)
que son usados para su identificacin y aprovechados
por el hombre
C6H12O6
C6H12O6
C6H12O6
CO2 + CH3CH2OH
CH3CHOHCOOH
Alcohlica
Homolctica
CO2+ CH3CH2OH + CH3CHOHCOOH
Heterolctica
ii) Mucha energa de los azcares se pierde en las fermentaciones como productos de deshecho, es un proceso ineficiente
Los tipos de fermentaciones sirven tambin para identificar microorganismos (figura 5) (Prescott et al., 1999).
Fermentaciones
NADH+H+
NAD+
NADPH
6-fosfogluconato
Entner-Doudoroff
rinde:
-1 ATP/glucosa
-2 NAD(P)H
Pentosa fosfato
Glucosa -6-P oxidada, produce CO2
Interconversiones entre azcares con 3, 4, 5, 6, 7 C
Importante en la formacin de NADPH para anabolismo, ribosa para cidos nucleicos
Dihidroxiacetona-P
Etapa 3
carbonos
NAD+
NAD+
+
NADH+H+
NADH+H
1,3-bisfosfoglicerato
NADP
Glucosa
Fructosa 1,6-bisfosfato
2H+
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
Fructosa 6-fosfato
4H+
NADH+H+ Piruvato
ADP
Glucosa 6-fosfato
H2O
Glucosa 6-fosfato
2H+
ATP
Etapa de 6
carbonos
Gliceraldehdo-3 - P
Glucosa
51
donador de e
aceptor de e
enzimas
productos finales
alcohlica
triosa-P
acetaldehido
deshidrogenasa
alcohlica
CO2,
etanol
homolctica
triosa-P
cido pirvico
deshidrogenasa
lctica
cido lctico
50
Lillian Frioni
NADH NAD+
+H+
Aldolasa
Gliceraldehdo 3-P
Pi
1,3-bisfofoglicerato
Fosforilacin a
nivel de sustrato
3-fosfoglicerato
2-fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato
Fosforilacin a
nivel de sustrato
Piruvato
1/2O2+2H
H 2O
NAD
Matriz
Lactato
Piruvato
Gliceraldehdo 3-fosfato
Rendimientos energticos
38 ATP/glucosa en la respiracin con O2:
* 10 NADH x 3ATP= 30 ATP
* 2FADH2 x 2 ATP = 4 ATP
* 2ATP + 2 GTP = 4 ATP
2 ATP/ glucosa en las fermentaciones
Menos de 2-6 ATP/glucosa en respiraciones anaerobias: los electrones entran en general pos los citocromos. El NAD+ se regenera por flujo inverso de electrones con gasto de ATP (figura 10).
Caractersticas de las fermentaciones
i) Diferentes organismos liberan distintos productos por
las fermentaciones (cidos, alcoholes, solventes, H2)
que son usados para su identificacin y aprovechados
por el hombre
C6H12O6
C6H12O6
C6H12O6
CO2 + CH3CH2OH
CH3CHOHCOOH
Alcohlica
Homolctica
CO2+ CH3CH2OH + CH3CHOHCOOH
Heterolctica
ii) Mucha energa de los azcares se pierde en las fermentaciones como productos de deshecho, es un proceso ineficiente
Los tipos de fermentaciones sirven tambin para identificar microorganismos (figura 5) (Prescott et al., 1999).
Fermentaciones
NADH+H+
NAD+
NADPH
6-fosfogluconato
Entner-Doudoroff
rinde:
-1 ATP/glucosa
-2 NAD(P)H
Pentosa fosfato
Glucosa -6-P oxidada, produce CO2
Interconversiones entre azcares con 3, 4, 5, 6, 7 C
Importante en la formacin de NADPH para anabolismo, ribosa para cidos nucleicos
Dihidroxiacetona-P
Etapa 3
carbonos
NAD+
NAD+
+
NADH+H+
NADH+H
1,3-bisfosfoglicerato
NADP
Glucosa
Fructosa 1,6-bisfosfato
2H+
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
Fructosa 6-fosfato
4H+
NADH+H+ Piruvato
ADP
Glucosa 6-fosfato
H2O
Glucosa 6-fosfato
2H+
ATP
Etapa de 6
carbonos
Gliceraldehdo-3 - P
Glucosa
51
donador de e
aceptor de e
enzimas
productos finales
alcohlica
triosa-P
acetaldehido
deshidrogenasa
alcohlica
CO2,
etanol
homolctica
triosa-P
cido pirvico
deshidrogenasa
lctica
cido lctico
52
Lillian Frioni
Lactato
CO2
NADH
Acetaldehdo
Piruvato
2
NADH
Piruvato
CO2
levadura
CO2
CoASH
3
Etanol
como
del pan
acetolactato
Oxaloacetato
Acetil -CoA
Pi
CoA
NADH
Acetil
Malato
H2O
P
ADP
ATP
Formato
5
H2
Acetaldehdo
CO2
Acetona
NADH
NAHD
Semi reaccin
+
produccin
Acetoacetil-CoA
CO2
Propionato
Butiril -CoA
Acetona
NADH
NADH
Isupropanol
2H + 2e = H2
+
Oxidacin de compuestos
orgnicos o inorgnicos
luz
S(s) + 2H + 2e = H2S(g)
+
Pi
Coa
CoA
Butiraldehdo Butiril P
ADP
NADH
ATP
Fermentacin alcohlica
La enzima involucrada es la deshidrogenasa alcohlica,
el donador de electrones se encuentra en la va glicoltica (triosa-P) y los productos finales son el etanol y el
CO2. Se realiza en el msculo y entre los microorganismos son sobre todo los hongos y entre ellos las levaduras, como Saccharomyces cereviseae, son muy empleadas en la produccin industrial de etanol, en la vinificacin, en la panificacin (el CO2 es el agente levador, el
etanol se volatiliza en el horno).
El empleo de distintas sustancias qumicas que al humedecerse y con la temperatura liberan CO2 (tartratos, bicarbonatos) empelados en los polvos de hornear, no ha podido sustituir a las levaduras, que dan a la masa un sabor
y textura muy particular.
El cuadro 16 resume las mltiples aplicaciones biotecnolgicas de la fermentacin alcohlica, una de las ms
empleadas, junto a la fermentacin lctica, a nivel industrial. Ya vimos el uso del agua o del extracto de levaduras en los medios de cultivo, como fuentes de aminocidos, de carbono y de factores de crecimiento (vitaminas y otros).
Fermentacin heterolctica
Las bacterias carecen de enzimas de la va glicoltica (aldolasa y triosafosfato isomerasa) y la degradacin de la
glucosa se realiza por la va del fosfogluconato: oxidan
glucosa-6P a 6-fosfogluconato que luego decarboxilan a
pentosa-P. Esta se transforma en triosa-P y acetil-P por la
enzima fosfocetolasa. La triosa da cido lctico con la
formacin de un mol de ATP, mientras que el acetil-P acepta electrones a partir de los NADH generados en la produccin de pentosa-P y se convierte en etanol sin produccin de ATP.
El rendimiento energtico es menor: 1 solo mol de ATP, en
lugar de 2 como en los homofermentadores, que producen
el doble de biomasa por mol de azcar fermentado.
No se acumula poder reductor (figura 7).
La produccin de CO2 es una forma sencilla de distinguir
un grupo de otro. Importantes productos son formados en
estos procesos, que el hombre ha aprovechado desde muy
antiguo, incluso antes de conocerse el rol de los microorganismos en el proceso.
El balance energtico es muy bajo, 2 ATP en las fermentaciones alcholica y lctica y 1 en la heterolctica. No se genera poder reductor, por lo cual el micro-
ENERGIA
(1KCAL=4,184Kjulios)
piruvato + 2H + 2e = lactato
-
polisacridos
lpidos
Fe+3 + e = Fe+2
Etapa 1
O2 + 4H = 2H2O
aminocidos
Etapa 2
NADH
FADH2
ATP
NADH
Piruvato
NADH
Acetil CoA
Etapa 3
Oxaloacetato
-0.22 **
0.36
0.56
0.67
0.74 **
0,76
0.82
monosacridos
NH3
-0.25 **
0.42
-
-0.29
-0.19
-0.32
-0.24
-
SO4-2 + 9H + 8e = HS + 4H2O
Fermentacin lctica
-0.43
-0.41 **
NAD + 2H + 2e = NADH + H
NADH
CO2
Succinato
Eo [v]
produccin
Etanol
Acetato
Fumarato
CO2
49
Citrato
Ciclo de los
cidos
tricarboxlicos
ATP
NADH
FADH2
Isocitrato
CO2
-cetoglutarato
CoQ
CO2
Succinil Co A
Citocromos
Cadena de
tranporte
O2
de electrones
ATP
48
Lillian Frioni
Luz
Reacciones qumicas
Donadores de electrones
B
+
C
+
-
D
+
-
+
H2O
+
orgnico
+
NH4+
+
c. actico
Clasificacin:
Metabolismo bioenergtico
en los microorganismos
El cuadro 9 es un clsico esquema sobre la utilizacin de
los nutrientes con el objeto de obtener energa o con fines
biosintticos. Se abordarn distintos aspectos relacionados a los mecanismos de obtencin de energa por los
microorganismos, que como todo organismo, emplean los
tres tipos de procesos: fermentacin, fotosntesis y respiracin (cuadro 10).
Cuadro 9- Metabolismo bioenergtico y
biosinttico
ADP
energa
utilizable
calor
biopolmeros
Pi
fuentes
de energa
intermediarios
biosintticos
ATP
depsitos
celulares
productos
metablicos
nutrientes
externos
2ADP
2ATP
C6H12O6
2 NAD
2NADH
Fermentaciones
Donadores y aceptores de electrones compuestos orgnicos
Rinde poca energa (E) y nada de poder reductor. Ej:
fermentaciones lctica y alcohlica
Respiraciones
Donadores de e- pueden ser orgnicos o inorgnicos,
los aceptores son en general inorgnicos:
O2 (aerobia)
=
=
+++
CO3 , SO4 , NO3 , Fe (anaerobia)
Fotosntesis
Transformacin de energa lumnica en qumica por fotofosforilacin
Oxignica (la superior), libera O2
Anoxignica (bacterias anaerobias, no liberan O2)
2 CH3COCOOH
(cido pirvico)
deshidrogenasa
lctica
NAD
2 CH3CHOHCOOH
(cido lctico)
Figura 6- Fermentacin homolctica
Se cree que es el metabolismo bioenergtico ms antiguo, cuando no exista el O2. Los microorganismos fermentadores se han adaptado a las nuevas condiciones
de la atmsfera, realizando el mismo proceso que sus
ancestros.
glucosa
glucosa-6P
ATP
ADP
NAD
6P-gluconato
NAD
NADH
CO2
Respiraciones
gliceradldehdo - P
NAD
2 ADP
NADH
2 ATP
cido pirvico
NADH
acetil - P
NADH
NAD
acetaldehdo - P
NADH
Reacciones de biosntesis
ii) poder reductor
* autotrofia: CO2 Corgnico
* transferencia de poder reductor:
+
sustrato oxidado + NADH sust.reducido+ NAD
Son quizs unas de las bacterias ms estudiadas y cultivadas por su importancia econmica ya que participan en
las transformaciones de un alimento tan importante como
la leche y son responsables de aplicaciones biotecnolgicas en derivados de la leche: leches agrias y yogur, quesos. La produccin de cido lctico hace que el producto
se estabilice, evitando el deterioro microbiano. Este proceso se emplea tambin en la conservacin de pasturas y
granos en el proceso conocido como ensilaje, tema que
ser tratado en el captulo 18.
NADH
ribulosa - 5P
i) obtencin de energa
Bacterias acidolcticas
NADH
Ejemplos:
5) Relativa al cuadro 7
i)Clasifique los medios de cultivo (1...5) por su empleo en
el laboratorio
ii) Seale los factores de crecimiento presentes en los
medios y su rol en la clula
ii) Cmo hara diferencial al medio 3?
iv) Cmo trabajara en anaerobiosis con el medio 4?
v) Rol del par fosfato en los medios de cultivo
C-CO2
C-orgnico
A
+
-
Los mecanismos de biosntesis de distintas macromolculas, como hidratos de carbono, lpidos, protenas, cidos nucleicos, no sern analizadas ya que los procesos
no difieren mayormente en la escala biolgica. En efecto,
el equipo enzimtico y los mecanismos bioqumicos suelen ser similares en una bacteria y en organismos superiores, incluido el hombre.
53
NAD
cido lctico
NAD
etanol
CTE
AH2 + B
A + BH2
54
Lillian Frioni
47
Flujo de C
Flujo de eCO3O2
NO3
Fe
Respiracin aerobia
+++
=
4
Respiracin anaerobia
Compuestos inorgnicos
NH4+ , NO2- , S= , Fe++ , H2
Lacobacillus
SO
comp. org.
CO2
Flujo de C
Flujo de eBiosntesis
(Ciclo de Calvin)
O2
Respiracin aerobia
Respiracin anaerobia
Respiraciones aerobias
aceptor e
cido orgnico
KNO3(2%)
extracto de levadura
KNO3(10%)
Bacillus
cidos orgnicos
Na2SO4
Desulfovibrio, Desulfotomaculum
CH3OH
Na2CO3
Methanosarcina barkeri
CH3NH2
KNO3
Hyphomicrobium
glutamato
Clostridium
lodo, sedimentos
histidina
Tetanomorphum
almidn, amonio
Clostridium spp
almidn, N2
C. pasteurianum
anaerobiosis, fermentacin
glucosa,
extracto de
Streptococcus
Leuconostoc
componentes
Esta es una respiracin aerobia completa, ya que el sustrato es oxidado completamente a CO2 y agua, liberando
toda la energa de la molcula. Los sustratos orgnicos
son degradados muy rpidamente por esta va.
Existen casos en los que los organismos carecen de enzimas del ciclo de Krebs y no pueden llevar el sustrato a
CO2, son las respiraciones con sustrato orgnico incompletas:
levadura, pH 5
Preguntas de repaso
1) Conceptos y ejemplos de:
Nutriente
Medio de cultivo
Condiciones de cultivo
2) Seale: ejemplos de microorganismos auto y heterotrficos, asi como aquellos de mayor capacidad biosinttica. Cuales son los ms distribuidos en la naturaleza?
3) Complete el siguiente cuadro indicando la forma
qumica en que los principales elementos se usan
como nutrientes a vegetales, animales y microorganismos
Elemento vegetales
C
N
S
P
Fe
Ca
Mn
Micronutrientes
animales
microorganismos
46
Lillian Frioni
inculo
N2 como fuente de N
cianobacterias
anaerobiosis
H2, c.orgnicos, N2 H2S
donador de e
bacterias purpreas
no sulfurosas
NH4
NO2
H2
=
H2S, S, S2O3
+3
Fe , pH bajo
organismos
inculo
O2
Nitrosomonas
tierra, lodos
O2
Nitrobacter
aguas servidas
O2
bacterias del H2
biodigestores anaerobios
O2
Thiobacillus spp
suelos
O2
T. ferrooxidans
suelos
anaerobia
=
S, S2O3
NO3
T. denitrificans
suelos, lodos
H2
CO2
metanognicas
H2
NO3
Paracoccus denitrificans
aceptor de e
O2
vegetacin en descomposicin
almidn, NH
pasteurizar
Estas respiraciones poseen importantes aplicaciones biotecnolgicas por |os productos formados, cidos glucurnicos, cido actico, etc.
organismos
Pseudomonas fluorescens
(80C) para enriquecer en Bacillus
O2
etanol (4%)+ 1%
O2
Acetobacter, Gluconobacter
extracto de levadura
pH 6, hidrocarburos (ej.aceite mineral),
amonio
O2
Mycobacterium, Nocardia
celulosa, amonio
O2
Cytophaga, Sporocytophaga
azcares, N2
O2
Azotobacter
COOH
3
(preparacin de vinagre)
cido actico
bacterias sulfurosas
purpreas y verdes
aceptor de e
CH
CH3CH2OH + O2
etanol
aerobiosis
aerobiosis
donador de e
55
amonio
nitrito
azufre
hierro
hidrgeno
Ecuacin (ATP)
+
Grupo
Fisiolgico
Nitratantes
=
+++
Fe + O2 = Fe + H2O
H 2 + O2
= H2O
El cuadro 18 resume los potenciales redox en estas respiraciones que indica que varios compuestos inorgnicos
que pueden dar al oxidarse con el O2, energa suficiente
para la sntesis de ATP.
Cuadro 18 - Produccin de energa a partir de la
oxidacin de varios donadores inorgnicos de
electrones
G (kJ/reaccin)
Reaccin
-
HS + H + 0,5O2
S + 0,5O2 + H2O
+
NH4 + 0,5O2
NO2 + 0,5 O2
++
+
Fe + H + 0,25 O2
S + H
0
+
SO + 2H
4
+
NO + 2H + H O
2
2
NO3
+++
Fe + 0,5 O
2
=
-203,2
-589,1
-260,2
- 75,8
- 71,2
++
Su rol puede resultar muy importante en la naturaleza por la liberacin de iones fundamentales para las
plantas: nitratos, sulfatos. La oxidacin del hierro conduce a la formacin de Fe(OH)3 insoluble, indisponible para los cultivos. Esta sustancia produce obstrucciones en las caeras de hierro atacadas por las ferrobacterias.
Nitritantes
ATP se acopla a la oxidacin del donador de electrones y la energa de reduccin se obtiene directamente a
partir del compuesto inorgnico, si tiene potencial redox
suficientemente bajo, o por reacciones de transporte inverso de electrones.
Ferroxidantes
Oxidantes del H2
Respiraciones anaerobias
Constituyen procesos realizados solamente por protistas
inferiores (bacterias) en anaerobiosis. Los distintos tipos
se presentan en la figura 9. El flujo de electrones en las
respiraciones, sus cadenas transportadoras de electrones
(CTE) se aprecia en la figura 4.
Los rendimientos energticos, son muy superiores en las
respiraciones aerobias con sustratos orgnicos.
Las cadenas transportadoras de electrones en las respiraciones anaerobias son ms cortas, entrando los mis-
56
Lillian Frioni
Flavoprotena
e=
Componentes comunes
Medio 1
K2HPO4, 1g
ADP + P1
ATP
Citocromos
H2 + NO3
NO3-
Cit a1
ADP + P1
Cit a3
1/2O2
ATP
SO4 + N2 (N2O) + H
KH2PO4, 1g
Medio 2
Medio 3
Medio 4
NH4Cl, 1g
NH4Cl, 1g
NH4Cl, 1g
glucosa
glucosa
glucosa
cido nicotnico
100mg
extracto de
levadura, 5g
MgSO4.7H2O, 20mg
Medio 5
FeSO4.7H2O, 10mg
Micronutrientes: Mn,
Mo,Cu,Co,Zn, como sales
(0,02-0,5mg/L de c/u)
N2 (N2O) + H2O
H2O
+0,82V
componentes adicionales
Agua, 1L
NAD
NO2-
tadoras de electrones para la oxidacin del mismo sustrato: una aerobia, que le rinde ms energa y otra anaerobia, ms corta, que rinde entre 2 y 3 ATP por mol de
glucosa.
-0,32V
+
45
Como los nitratos se forman en aerobiosis, una alternancia de perodos de aerobiosis y de anaerobiosis (lluvias y
anegamiento seguidos de aireacin en suelos) estimula
mucho este proceso que resulta muy importante en la
depuracin de aguas altamente contaminadas: el nitrgeno orgnico se mineraliza a nitratos en aerobiosis y se
desnitrifica volatilizndose a la atmsfera como N2 por
respiracin anaerobia.
Aceptor sulfatos (sulfatorreduccin)
Este proceso es realizado por un grupo de bacterias anaerobias estrictas, es decir que slo pueden crecer en anaerobiosis. Los gneros ms conocidos son Desulfotomaculum, Desulfovibrio (cuadro 20).
El proceso perjudica a las plantas que emplean sulfatos,
pero es favorable en la depuracin de cursos de aguas
contaminadas, pues volatiliza formas combinadas de azufre, como gas H2S (captulo 12).
As, la puesta en evidencia de los grupos fisiolgicos conjunto de organismos taxonmicamente a veces no relacionado, pero que presentan la misma aptitud para efectuar reacciones de biodegradacin o de biosntesis, como
los celulolticos, los amonificantes, etc., se realiza por siembra en medios selectivos apropiados.
Siembra y aislamiento
Siembra: es colocar un microorganismo en un medio apropiado para que se desarrolle.
Se realiza con fines variados: aumentar el nmero de microorganismos en medio slido o lquido, para obtener biomasa microbiana para uso industrial, preparar inoculantes biolgicos, obtener metabolitos de inters. La siembra
puede realizarse para obtener cultivos puros, entonces
se habla de aislamiento.
Aislamiento: obtencin de cultivos puros, en general microorganismos derivados de una sola clula (clon).
El aislamiento puede ser:
44
Lillian Frioni
Por su naturaleza
lquidos
slidos
semislidos
Hasta la introduccin del agar-agar los medios se solidificaron con una protena, la gelatina, con el inconveniente
de que muchos microorganismos producen proteasas que
la hidrolizan, licuando al medio, inicialmente slido. El agaragar es un polmero de alto peso molecular, aislado de un
alga marina. Funde a los 100C y se mantiene en estado
lquido hasta aproximadamente 45C lo que permite repartirlo en cajas de Petri, antes de su solidificacin.
Se usan solidificantes inorgnicos, como el slico gel, producido por la unin de soluciones de silicato de sodio o de
potasio con cido clorhdrico de densidades adecuadas.
Luego de gelificacin y repetidos lavados para eliminar el
cido restante, se pasan por agua hirviendo y luego se
impregnan con los nutrientes. Es empleado para aislamiento de organismos auttrofos, como los nitrificantes.
Los medios slidos se usan en tubos o cajas de Petri,
para el aislamiento, purificacin y numerosos tipos de estudios. Los semislidos, llevan baja concentracin de solidificante, por ejemplo con 0,2% de agar y son empleados para estudios de microorganismos microaeroflicos
(cuadro 7). Los medios selectivos son muy tiles para el
aislamiento de miroorganismos con exigencias particulares, como los autotrfos (medios sin C-combinado), fijadores de N2 (medio sin N-combinado), otros medios llevan antibiticos, sales biliares, etc. para evitar el desarrollo de organismos no deseados.
57
CH
masa microbiana que lo hace apto para uso como mejorador de suelos.
Cuadro 22- Reduccin de iones frricos
(ferrireduccin)
+++
MO + Fe
CO
++
+ H2O + Fe (soluble)
Complejos organo-metlicos
+++
Siderforos + Fe
el complejo entra a la
++
clula y se reduce en el citoplasma (Fe asimilable)
(reductasa-frrica)
Corrosin anaerobia de metales
=
SFe + 3Fe(OH) (soluble) + OH
4Fe + SO4 + H2O
2
Este proceso es muy aplicado en el tratamiento de residuos de tambos (estircol), restos de cosechas y en la
depuracin de efluentes de fbricas, en anaerobiosis y es
tratado en el captulo 21.
+ 2H2O (auttrofas)
CO + CH
Acetilclstica CH3COOH
2
4
Methanosarcina, Mathanobacillus, Methanococcus
Metilotrfica: usan metilamina, metilsufuros (hetertrofas)
El cuadro 22 resume la intervencin del hierro en procesos redox anaerobios, que lleva a los iones frricos insolubles y no aprovechables por las plantas a formas reducidas ferrosas, solubles (captulo 12).
Fotosntesis
Constituye un proceso redox de conversin de la energa
lumnica en energa qumica (ATP). La energa de la luz
se emplea para reducir CO2 o compuestos orgnicos
menos reducidos a molculas orgnicas (azcares), por
organismos aerobios y anaerobios.
Tipos de fotosntesis en los microorganismos
1) CO2 + 2H2O
2) CO2 + H2S
(anoxignica)
3) CO2 + CH3COOH
(CH2O)n + H2O
4) CH3COOH
(CH2O)n + H2O
58
Lillian Frioni
procariotas
cinaobacterias
bacterias sulfurosas
verdes y purpreas
bacterias no sulfurosas
verdes
y purpreas
La fotosntesis anoxignica (tipos 2, 3 y 4) es ms primitiva, es conocida como fotosntesis bacteriana, o cclica, los electrones de la clorofila bacteriana, o bacterioclorofila, que absorbe en el infrarojo (700-800nm), vuelven a
ella por lo que genera slo 1 ATP por vuelta de los electrones. Se realiza en anaerobiosis y surgi cuando en la
atmsfera no haba oxgeno. El NADP+ es reducido por
flujo inverso de electrones o directamente por los donadores externos de electrones en reaccin independiente
de la luz (cuadro 24).
El tipo 2) es realizado por las bacterias fotosintticas sulfurosas purpreas y verdes: Chromatiaceae y Chlorobiaceae (gneros ms conocidos: Chromatium y Chlorobium)
distinguibles por sus pigmentos. Usan H2S o H2 como donadores de electrones. El S acumulado en las clulas
puede ser empleado como fuente de energa cuando crecen en quimiotrofia, sin luz. Crecen en barros o aguas en
donde hubo anaerobiosis (produccin de H2S).
El tipo 3) y 4) lo realizan integrantes de una sla familia de
bacterias fotosintticas no sulfurosas: Rhodospirillaceae
(gnero Rhodospirillum). No pueden emplear H2S ni H2
como donadores de electrones, pero si molculas orgnicas simples, como cidos o alcoholes. El tipo 4) no puede
reducir el CO2 (la forma ms oxidada del carbono) con la
energa de la fotosntesis, la que slo le alcanza para reducir molculas de estado de oxidacin intermedio (cidos) hasta carbohidratos.
Son fotoheteroorganotrofas.
La mayora de las bacterias fotosintticas anaerobias se
desarrollan en ambientes anegados, barros, capas subsuperficiales de suelos, sucediendo a las bacterias sulfatorreductoras, que liberan cido sulfhdrico en anaerobiosis. Tambin la mayora es capaz de fijar N2, por lo que
constituyen una importante herramienta de estudio; el flujo electrnico de la fotosntesis es capaz de reducir CO2 y
N2 en anaerobiosis.
FOTOSISTEMA I
P700+
-1.5
Fd
800+
BI
FOTOSISTEMA II
P680+
-1.0
Feofitina
PQ
NADP
NADP NADPH, H
NADPH, H
CIT. b/f
CIT. bc
PC
0.0
H2S, S + NAD+
ac. orgnicos
succinato
CIT. c
800
1.0
ADP + Pi
+
S, SO4 + NADH + H
fumarato
Fuente
de energa
Fuente de
carbono
Donadores
de electrones
Ejemplos
Fotoautolitotrofos
(FAL)
luz
CO2
Agua, sulfuros, H2
Algas, cianobacterias
Bacterias fotosintticas
sulfurosas
Fotoautoorganotrofos
(FAO)
luz
CO2
cidos orgnicos
Bacterias fotosintticas
no sulfurosas
Fotoheteroorganotrofos
(FHO)
luz
Materia orgnica
(cidos)
Materia orgnica
(cidos)
Algunas bacterias
fotosintticas no sulfurosas
Quimioheteroorganotrofos
(QHO)
Reacciones
qumicas
Materia orgnica
Materia orgnica
La mayora de los
microorganismos
Quimioautolitotrofos
(QAL)
Reacciones
qumicas
CO2
Pocas bacterias
tpicas y archeae
Fotoautoorganotrofos Bacterias fotosintticas no sulfu- Para el desarrollo microbiano es necesario tener en cuenrosas (emplean sustancias orgnicas simples como do- ta adems de los nutrientes, las llamadas condiciones
de cultivo: el pH, presin osmtica, temperatura de innadores de electrones en la fotosntesis)
cubacin, nivel de oxgeno, etc. a niveles adecuados,
Quimioautolititrofos Bacterias oxidantes del amonio, del sin las cuales el microorganismo no se desarrollar o lo
nitrito, del azufre, del hierro, del hidrgeno (aerobias), har mal.
desnitrificantes auttrofas (anaerobias). Importantes en los
Condiciones para el crecimiento microbiano
ciclos biogeoqumicos.
Se toman en cuenta:
Quimioheterotrofas La mayora de los microorganismos Los medios de cultivo, que aportan los nutrientes, como
usan materia orgnica como fuente de energa, de carbo- el agua, fuentes de E, C, N, S, P, etc., los micronutrientes,
no y donadores de electrones (la sustancia que se oxida). empleados en baja concentracin (Cu, Cd, Zn, etc. y los
En general la misma sustancia puede cumplir todas estas que actan como factores de crecimiento (vitaminas, amifunciones. Todos los hongos, protozoos y la mayora de nocidos esenciales, bases de cidos nucleicos).
las bacterias pertenecen a esta categora.
Las condiciones de cultivo: temperatura, radiaciones,
luz, aireacin, presin osmtica, que afectan el desarrollo
de los microorganismos.
Medios de cultivo
P700
43
P680
H2O
O2 + H+
Donadores externos
de electrones
Complejo
Mn
Un gran desarrollo en la microbiologa se ha logrado luego del aislamiento y cultivo de los microorganismos en el
laboratorio. Esto se logr a partir de su siembra en los
llamados medios de cultivo: conjunto de nutrientes que
permiten el desarrollo de microorganismos particulares.
Todos contienen agua y fuentes de energa, C, N, S, Fe,
P, etc., micronutrientes, factores de crecimiento y aditivos
como colorantes, antibiticos, sales, etc.
42
Lillian Frioni
H2S
CO2
ADP
hv
organotrofos
litotrofos
(CH2O)
La figura 14 (Madigan et al., 2000) muestra la composicin y espectro de absorcin de la clorofila a, tpica de los
eucariotas, la bacterioclorofila, de los procariotas. Se observa el mayor espectro de absorcin en las bacterioclorofilas, que absorben adems en la regin azul del espectro, luz de longitud de onda larga, cerca de 1000nm, no
visible al ojo humano (zona oscura, en pantanos, suelos
anegados).
ATP
Estroma
Piridin
nucletido reductasa
ADP + Pi
Fotones
Complejo citocromo bf
8H+
2NADP+
e
QA
QB
e-
4PQH2 e-
e-
P680
Cit f
8H
O2 + 4H+
FeS
Fotosistema II
CF1
2NADPH
Fd FAD
FeS
4PQ
Mn
CGO
2H2O
Cit b6
3H+
2H+ +
-
Feofitina
ADP
hv
ATP
Tilacoide
emplean la luz
reacciones qumicas con sustratos: orgnicos
inorgnicos
CO2
compuestos inorgnicos
oxignica
CO2
ATP
n
Membrana externa
Membrana interna
Estroma
Cloroplasto
H2 O
/2O2
Fotones
(CH2O)
SO4=
hv
energa
Los microorganismos presentan varios sistemas de transporte para una misma sustancia, lo que les brinda gran
ventaja competitiva en el ambiente.
C
anoxignica
El cuadro 5 presenta los tipos nutricionales ms comunes, donde se aprecian organismos que emplean sustancias muy simples, como minerales y CO2 y aquellos, ms
exigentes, con requerimientos de compuestos carbonados variados.
Poder reductor
Clasificacin nutricional
de los microorganismos
Importante es el papel que juegan los siderforos, molculas orgnicas de bajo peso molecular, capaces de formar
complejos organo-metlicos con el ion frrico a los efectos
de transportarlo al interior de las clulas, donde una hierro
reductasa lo reduce a in ferroso, asimilable por el microorganismo. El tema es relevante en el control biolgico de
microorganismos fitopatgenos, quienes compiten por bajos niveles de hierro disponible en los suelos, con los microorganismos antagonistas seleccionados e inoculados en las
semillas en viveros, como Pseudomonas (captulo 17).
Las figura 11 esquematiza el flujo de electrones en ambos tipos de fotosntesis, la 12 (Madigan et al., 2000) y la
13 (Prescott et al.. 1999), muestran las estructuras celulares que albergan a los pigmentos fotosintticos y pigmentos accesorios en clulas procariotas y eucariotas.
59
e-
PC - Cu+
PC - Cu2+
e-
P700
Fotosistema I
Lumen
3H+
ATP
sintetasa
60
Lillian Frioni
0,9
Absorbancia
0,8
0,7
clorofila a
carotenoide
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
340 400
0,9
Absorbancia
0,8
500
600
700
800 900
longitud de onda (nm)
bacterioclorofila a
carotenoide
0,7
0,6
tos elementos. Integran normalmente enzimas y cofactores, tienen funcin cataltica y mantienen estructuras proteicas. As, el Mo interviene en la fijacin del N2, en la
nitrato reductasa, el Co integra la vitamina B12, el Na es
requerido por muchas especies marinas.
Requerimientos de carbono: los microorganismos presentan gran versatilidad en el empleo de sustancias carbonadas. Por las fuentes de carbono que emplean se
clasifican en:
hetertrofos: fuentes orgnicas muy variadas: azcares, alcoholes, cidos grasos, hidrocarburos, polmeros
como la celulosa, lignina.
Factores de crecimiento: muchos microorganismos, incluso los auttrofos, requieren una o ms molculas orgnicas para su desarrollo, ya que no pueden sintetizarla a
partir de los nutrientes. Deben tomarlas completas del medio o bien sus precursores, a muy baja concentracin, como
los micronutrientes. Ejemplos de ellos son: vitaminas (parte
o totalidad de cofactores de enzimas), aminocidos esenciales para la sntesis proteca, bases pricas y pirimdicas (para la sntesis de cidos nuclecos) (cuadro 1).
0,3
0,2
0,1
0
340 400
500
600
700
800 900
longitud de onda (nm)
Flia I
Purpreas sulfurosas
Flia II Chromatiaceae
gn. Chromatium
Verdes sulfurosas
Rhodospirillaceae
gn. Rhodospirillum
A modo de resumen el cuadro 26 se analizan los principales gneros de bacterias fotosintticas anoxignicas,
en el 27 se resumen los procesos generales de la fotosntesis y en el 28 se comparan las propiedades de los sistemas fotosintticos encontrados en microorganismos.
Antes de lograr su aislamiento en cultivo puro, Winogradsky puso en evidencia procesos anaerobios fotosin-
41
0,5
0,4
Requerimientos en N, P, S: los microorganismos pueden emplear estos elementos a partir de las mismas fuentes orgnicas de las que derivan el carbono, aunque usan
frecuentemente fuentes inorgnicas, como sales minerales solubles. El N lo usan desde fuentes inorgnicas reducidas como el amonio (NH4+), pasando por el N-orgnico
(R-NH2), N2 (diazotrofos o fijadores de N2), NO3-. La fuente ms sencilla de asimilar la constituyen las sales de amonio, ya que el N se encuentra en el mismo estado de oxidorreduccin que en los aminocidos. La clula emplea
energa creciente al asimilar nitratos y nitrgeno molecular. El S puede ser nutriente como sulfuros (en general
txicos para la mayora de los microorganismos), S-orgnico (puentes sulfuro o disulfuro), S, formas inorgnicas
Muchos microorganismos son empleados para valorar cantidades pequeas de factores de crecimiento, como la vitamina B12, riboflavina. El microorganismo se desarrolla
en forma proporcional a la cantidad de factor de crecimiento agregado al medio de cultivo. Curvas patrones con
estndares puros de la vitamina, permite efectuar las comparaciones. Los bioanlisis microbiolgicos se emplean
muchas veces a pesar de los avances en las determinaciones qumicas (Captulo 20).
Un microorganismo se denomina:
prottrofo cuando emplea los mismos nutrientes que la
mayora de las cepas de su especie que existen en la
naturaleza. Pero esta bacteria puede mutar y requerir tomar del medio el nutriente para su desarrollo, se comporta entonces como
auxtrofo para ese nutriente, como un aminocido, que
se convierte en esencial. Estos microorganismos se usan
mucho en estudios de gentica bacteriana.
En resumen: las potencialidades metablicas de los microorganismos son muy variadas (cuadro 9), desde aquellos prcticamente autosuficientes (fotolitotrofos), hasta los
muy exigentes, que requieren agregados de varios factores de crecimiento, muchas veces contenidos en los extractos de lavadura, de malta, de carne, de suelo, etc.
80
Lillian Frioni
to mayor es el dimetro del halo de inhibicin, ms eficiente es el antibitico, en este caso impregnado en los
discos de papel de filtro. Por ejemplo, en este caso se
observa que la vancomicina (V) es efectiva para M.
luteus, pero no para el S. albus.
algas, cianobacterias
anoxignica
CO2 + H2S
Membrana celular
cido nucleico
Acidos nucleicos
Transcripcin
Ribosoma
mRNA
Enzima
Traduccin Protena
Sustrato
Antimetabolitos
Sntesis proteica
Resistencias: si bien la investigacin y desarrollo de nuevos antibiticos, incluidos los semisintticos o los completamente sintticos (antivirales o antiprotozoarios) se ha
incrementado mucho en los ltimos aos, tanto los de
espectro reducido (eficaces frente a una gama estrecha
de patgenos), como los de amplio espectro, como la
ampicilina, rifampicina), existe el problema de la prdida
creciente de eficacia por el desarrollo de resistencias en
los microorganismos originariamente sensibles.
Los mecanismos de resistencia a antibiticos creados por los microorganismos incluyen:
a) desarrollo de una va metablica alternativa a la va
que el antibitico bloquea
b) la produccin de enzimas que inactivan a los antibiticos
c) alteracin del sitio blanco de accin del antibitico evitando su unin
d) bloqueo del transporte del antibitico al interior del microorganismo
Anexo: Esterilizacin
Se define por esterilizacin el proceso por el cual se eliminan todos los microorganismos incluidas las endosporas
bacterianas de cualquier objeto, superficie o medio, por
remocin o muerte de stos. Se emplean mtodos fsicos
y qumicos (cuadro 12).
(CH2O) n + S
(CH
O) n + H2O
fase oscura:
6CO2+ 18 ATP +12NADPH
Propiedad
eucariotas
cianobacterias bacterias
verdes y
purpreas
Pigmento
fotosinttico
clorofila a
clorofila a
bacterioclorofila
Fotosistema II presente
presente
ausente
Donadores
de electrones H2O
H2O
H2, H2S, S,
comp.orgnicos
Produccin
O2
oxignica
anoxignica
(CH2O)n + H2O + O2
Replicacin
oxignica
CO2 + 2H2O
Pared celular
61
C6H12O6 +18ADP + Pi
+12NADP+
oxignica
Productos
primarios de
la conversin
de energa ATP, NADPH ATP, NADPH ATP
Fuente de
carbono
CO2
CO2
Resumen final: el cuadro 29 vincula la clasificacin nutricional de los microorganismos con los posibles mecanismos
de obtencin de energa y cita ejemplos de cada grupo.
62
Lillian Frioni
Carbono: CO2
orgnico
( auttrofos)
(hetertrofo)
Reacciones qumicas
(quimiotrofos)
Donadores de e : inorgnico
orgnico
(litotrofo)
(organotrofo)
Electromagntica: FOTOTROFOS
Fotoautolitotrofos
* Bacterias sulfurosas purpreas y verdes
(Chromatiaceae y Chlorobiaceae)
CO2 + H2S
(CH2O)n + S + H2O
Fotoautoorganotrofo
* Bacterias no sulfurosas purpreas
(Rhodospirillaceae)
(CH2O)n+ H2O
CO2 + CH3COOH
* cianobacterias
(CH O)n + O + H O
CO2 + 2H2O
2
2
2
Fotoheteroorganotrofo
* Bacterias no sulfurosas
CH3COOH (CH2O)n + H2O
No pueden reducir el CO2
Quimioheteroorganotrofo
La mayora de las bacterias, todos los hongos, protozoos
Respiraciones aerobios
C6H12O6 + O2
6CO2 + 6H2O
Respiraciones anaerobias
C6H12O6 +NO3
CO2+ H2O + N2
Aceptores de electrones:
Nitrato: desnitrificantes
Sulfato: sulfatorreduccin
79
C6H12O6+SO4=
CO2/carbonatos: metanognesis
H2 + CO2 CH4 + H2O
Bacterias anaerobias:
=
SH2 + NO3
SO4 + N2
Fermentaciones:
Donadores y aceptores de e : molculas orgnicas
(bacterias, hongos)
Fermentacin lctica
C6H12O6
CH3CHOHCOOH
A los efectos de conocer la concentracin de estas sustancias ya sea en sueros de pacientes, en preparados
comerciales, etc. se emplean los mtodos de:
1) difusin en agar, donde se siembra en superficie patgenos aerobios o un microorganismo aerobio facultativo de crecimiento rpido como el Staphylococcus o
Pseudomonas y se colocan discos de papel impregnados con distintas concentraciones del antibitico. El dimetro del halo de inhibicin formado es proporcional a
la concentracin.
Fue en 1928 cuando el mdico escocs Alexander Fleming redescubri la penicilina (ya detallada en 1896 por
un estudiante en Francia), al dejar durante sus vacaciones una caja de Petri con estafilococos patgenos sobre
los cuales se desarrollaron las esporas del hongo Penicillum notatum, que inhibieron el crecimiento de las colonias bacterianas. Recin en 1940 se publicaron los trabajos de aislamiento y se extendi la aplicacin de esta
sustancia, a la que sigui la estreptomicina por Waksman, en 1944.
+++
La figura 20 es una prueba de sensibilidad de un microorganismo patgeno frente a distintos antibiticos. Cuan
78
Lillian Frioni
cido p-aminobenzoico
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker, Brock, Biologa de los microorganismos, 9 edicin, 2000, Prentice Hall International
Prescott, Harley, Klein Microbiologa, 1999 McGrawHill.Interamericana
Preguntas de repaso
Cuadro 11- Produccin de antibiticos
cido flico
La sulfanilamida que es anloga pero no idntica (figura 16) al cido para amino benzoico (PABA), requerido
en la sntesis del cido flico, vitamina y factor de crecimiento para muchos microorganismos, fue empleada en
medicina antes del descubrimiento de los antibiticos.
El 5 Br uracilo es anlogo del uracilo, pero el correspondiente cido nucleico no puede sintetizarse en su presencia.
Estas sustancias vuelven a emplearse en medicina,
dado el problema de resistencias que estn provocando los antibiticos, que pueden convertir en inefectivos a estos productos poco tiempo despus de su recomendacin.
Antibiticos
Los antibiticos son sustancias qumicas de composicin qumica variada, desde pptidos a molculas heterocclicas, como la penicilina (figura 17), quinonas, como
las tetraciclinas, con accin antimicrobiana, producidas por
un microorganismo contra otro microorganismo. Los ms
conocidos son los secretados por bacterias (incluidos los
actinomicetes) y los hongos (figura 18). Se producen en
la fase estacionaria de crecimiento, cuando las condiciones para el crecimiento son limitantes (telofase) y se consideran metabolitos secundarios.
1) Cite 3 grupos de bacterias fotoauttrofas y 3 quimiauttrofas que habiten el suelo y explique las diferencias entre ambos grupos. Anote y diferencie la forma
por la cual ellas obtienen carbono y energa.
2) Seale los tipos metablicos por los cuales obtienen
energa los siguientes microorganismos: aerobios obligados, anaerobios obligados, anaerobios facultativos
y anaerobios aerotolerantes
63
3) Por qu las respiraciones aerobias con sustrato inorgnico rinden menos energa que las con sustrato orgnico?
4) Seale alguna respiracin aerobia incompleta de gran
valor biotecnolgico
5) Por qu se considera que las fermentaciones son procesos muy antiguos
6) La aparicin de que elemento cambi las formas de
obtencin de energa?
7) Por qu se dice que las bacterias fotosintticas anaerobias pueden crecer en zonas donde aparentemente
no hay luz visible?
8) Qu importancia ecolgica tienen estas bacterias?
9) Compare la estructura y la funcin fotosinttica de: cianobacterias y bacterias sulfurosas purpreas y verdes?
10) Analice la sucesin microbiana en la llamada columna
de Winogradsky. Cmo aislara en cultivo puro a los
diferentes grupos?
64
Lillian Frioni
77
Sustancia
log N
clulas
clulas
bacteriosttico
tiempo
bacteriosttico
recuento de
viables
clulas
bactericida
Usos
Etanol
Desnaturaliza protenas
y solubiliza lpidos
Antisptico
(piel)
Formaldehdo
Desinfectante
Nitrato de plata
Precipita protenas
Antisptico
(ojos)
Detergentes
Altera membranas
Antisptico
Desinfectante
Compuestos
fenlicos
Desnaturaliza protenas
Daa membranas
Antisptico
Desinfectante
tiempo
recuento total
log N
Modo de accin
tiempo
Agentes quimioteraputicos
Los agentes quimioteraputicos se emplean para el control microbiano dentro del husped, deben reconocer estructuras celulares microbianas y no actuar sobre las mismas estructuras del organismo superior (accin selectiva). Son sustancias qumicas utilizadas para matar o inhibir microorganismos dentro del cuerpo humano; poseen
toxicidad selectiva: actan sobre las clulas de algunos
microorganismos y no sobre las clulas del tejido humano, para esto su accin debe estar dirigida a estructuras o
funciones exclusivamente microbianas.
Los ms empleados son las sulfanilamidas o anlogos de
factores de crecimiento y los antibiticos.
76
Lillian Frioni
Factores qumicos
Las sustancias qumicas pueden ejercer distintos efectos
sobre el desarrollo de los microorganismos:
65
no afectarlo
estimularlo, son los nutrientes
inhibirlo, sustancias microbiosttica y microbicida,
con y sin lisis (microltica)
La figura 15 muestra alguno de estos efectos en un cultivo bacteriano creciendo exponencialmente en un medio
lquido. En el momento indicado por la flecha se ha agregado una concentracin inhibitoria de la sustancia en estudio. Se aprecia diferencia en los recuentos de clulas
totales y de viables, consecuencia de la lisis celular.
La ubicacin de una sustancia qumica en alguna de estas categoras es muchas veces arbitraria ya que una misma sustancia puede ser nutriente o bacteriosttico dependiendo de la concentracin, como es el caso de los azcares que al 1% son nutrientes para la mayora de los
microorganismos, pero a altas dosis previenen el crecimiento por plasmolisis (conservacin de alimentos).
Prcticamente cualquier sustancia orgnica de origen
biolgico es utilizada por algn grupo de microorganismo. Aquellas sustancias naturales o artificiales que se
acumulan en los ecosistemas a concentraciones no deseables para las comunidades naturales, se denominan
recalcitrantes (captulo 22).
Por su toxicidad, las sustancias qumicas se clasifican
en:
toxicidad no selectiva, el agente acta sobre todo tipo
de clulas: microbianas, del hospedante. Son conocidos los antispticos, que son efectivos sobre mucosas
(colorantes, sales de mercurio, etc.) y los desinfectantes aplicados sobre superficies inertes (alcoholes, jabones, cresoles). Esta separacin tambin es arbitraria, pues los efectos dependen de la concentracin.
Actan, en general, a altas concentraciones.
toxicidad selectiva, son ms txicos para las clulas
microbianas (incluso para Gram positivas y no para
Gram negativas) y son inocuas para las clulas del
hospedante. Estos son los agentes quimioteraputicos, de gran empleo en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Son efectivas a muy bajas concentraciones.
Los factores que influyen en la accin antimicrobiana son:
Crecimiento microbiano y su
control
1.
nes ptimas por la carencia de nutrientes y por las condiciones ambientales, no siempre favorables ni constantes.
En la naturaleza los microorganismos se encuentran libres en la solucin del suelo y usualmente existen en biofilms: grupos de diferentes microorganismos organizados
en capas e inmovilizados en la superficie de un sustrato,
rodeados en general por una matriz de polmeros orgnicos de origen microbiano. Se desarrollan prcticamente
en todas las superficies inmersas en ambientes acuosos
naturales, biolgicos, como en los vegetales, como abiticos, como plsticos, piedras, partculas del suelo. All, las
interacciones son numerosas tanto sinrgicas como antagnicas (captulo 14).
En el laboratorio, los organismos son estudiados como
cultivos puros, en medios y condiciones de cultivo adecuadas. Analizaremos la cintica del crecimiento en el
laboratorio (in-vitro).
Crecimiento exponencial
2.
3.
4.
Figura 1- Divisin binaria de microorganismos unicelulares
(bacilo)
66
Lillian Frioni
tg=1/vc
n =
Analizaremos el caso hipottico de un organismo unicelular, bacteria, protozoo, alga, que comience a dividirse en
forma exponencial en un medio de cultivo lquido adecuado. Calcularemos el nmero de generaciones, el nmero
final de clulas/mL a medida que transcurre el tiempo
(cuadro 1).
Cuadro 1- Crecimiento exponencial (logartmico)
en una bacteria
N de
clulas/mL
Tiempo
(h)
N
log Ncel/mL
2
generaciones
1
2
4
8
16
32
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
Nf (nmero
n = log Ncl./mL
final)
(tiempo) generaciones
10
0,000
0,301
0,602
0.903
1,204
1,505
2
log N clulas/mL
log Ncel/mL
log Ncel./mL
n=
10
0,301
1
tiempo
Nf= No.2
75
log10 Nf - log10 N0
log10 2 = 0,301
NOTA: i) Para verificar este hecho calcule el peso de clulas bacterianas luego de 24 horas de crecimiento exponencial, partiendo de una clula cuyo peso es un picogramo (10-12g) y cuyo tiempo de generacin es de 1 hora.
ii) Por qu el crecimiento se detiene en la naturaleza y
su representacin sigue una curva sigmoide?
La figura 2 muestra los eventos que pueden darse cuando un microorganismo unicelular se introduce en un medio lquido adecuado a su crecimiento. Se aprecian 4 fases, desde el inicio del cultivo (inoculacin, tiempo cero)
hasta la muerte de la mayora de las clulas (esterilizacin del cultivo).
Las caractersticas de las distintas fases son:
Fase de latencia o fase lag no hay divisin celular, las
clulas se adaptan al medio, aumenta el nivel de coenzimas necesarias para el funcionamiento de enzimas. Esta
fase debe acortarse en el laboratorio y en la industria,
porque implica gasto de energa y tiempo. Esto se logra
repicando el cultivo a un medio de la misma composicin
que el de origen, introduciendo un inculo grande (en general un 10% del volumen final del nuevo medio) y sembrando con cultivos jvenes.
Radiaciones
Tapa
Tornillo de seguridad
Rayos gamma
Abrazadera
Rayos X
Ultravioleta
Junta de
goma
Cmara
del
catalizador
Sobre
generador
de gas
El oxgeno se
elimina de la
cmara, al combinarse con hidrgeno para formar
agua.
Tira indicadora
de anaerobiosis
El azl de
metileno pierde el
color en ausencia
de O2.
10-4
0.01
Ondas de radio
Infrarrojo
100 103
1.0
104
106
Rojo
Naranja
Amarillo
Infrarrojo
Verde
Ultravioleta
200
300
Azul
Violeta
400
500
600
700
108
800
900
74
Lillian Frioni
Ambiente hipertnico
La concentracin de agua
es mayor dentro de la
clula y sta tiende a salir:
plasmolisis
Ambiente hipotnico
La concentracin de agua
es mayor fuera de la
clula, entra agua:
plasmoptisis(irreversible)
Ambiente isotnico
La concentracin de agua
es igual fuera que dentro
de la clula, existe
equilibrio osmtico:
ptimo crecimiento
La edad del inculo es el tiempo transcurrido entre la siembra en el medio de origen y el repique (ejemplo de 6, 12
horas).
Medio fresco
Fase exponencial o logartmica (log), en esta etapa se logra el mayor crecimiento, la velocidad de crecimiento es
mxima y el tiempo de generacin mnimo. Se postula que
en esta etapa cada clula es capaz de dividirse, por lo que
todas las clulas estn viables. En la industria interesa trabajar en esta fase y por ello se realizan cultivos continuos (figura 3) (Prescott et al., 1999) donde la concentracin de una
sustancia limitante del crecimiento, por ejemplo una vitamina, es incorporada al medio de modo de lograr una velocidad
de crecimiento constante y mxima por mucho tiempo.
Anaerobio
facultativo
Anaerobio
aerotolerante
Anaerobio
estricto
Microaerfilo
Suministro
de aire
Filtro
de aire
Recipiente
de cultivo
Colector
Evaluacin de crecimiento
Fase estacionaria por diversos motivos el crecimiento en
la naturaleza se detiene, en general por falta de nutrientes y/o por acumulacin de sustancias inhibidoras o txicas productos del propio metabolismo celular. El caso ms
tpico es la detencin del crecimiento de bacterias lcticas debido a la produccin de cido lctico en la fermentacin, que inhibe a las clulas, que son neutrfilas.
En esta etapa pueden darse dos situaciones:
Que las clulas dejan de dividirse en su conjunto, vc=0,
puede ser el caso de la acumulacin de productos
txicos.
Aerobio
obligado
Vlvula de control
Gases
67
Que la vc=vm, o sea, la velocidad resultante es estadsticamente cero, pero hay clulas que se dividen aun, pero
muere la misma cantidad, en el mismo periodo de tiempo
Fase de muerte, domina la velocidad de muerte (negativa) sobre la de crecimiento. El cultivo puede llegar a esterilizarse, o bien puede esporular y conservarse en estado
cripto bitico.
Recuentos microbianos
Recuento de microorganismos totales en cmaras
Fundamento del mtodo: una muestra de cultivo bacteriano diluido se coloca en una cmara de volumen pequeo y conocido, como por ejemplo la de Petroff-Hause que
encierra 2,5x10-7 mL y se cuentan al microscopio las clulas contenidas en numerosos cuadrados de la cmara
(figura 4) (Prescott et al., 1999).
Se calcula el promedio de clulas contenidas en dicho
volumen y se expresa el N clulas/mL de la muestra. La
desventaja es que no se pueden distinguir clulas viables
de no viables y el error experimental es alto. Pero se pueden efectuar numerosas determinaciones en poco tiempo, con solo lavar la cmara y volverla a cargar.
68
Lillian Frioni
Cubreobjetos
(a)
(b)
Presin osmtica
Figura 9- Efecto de la temperatura sobre el crecimiento
microbiano (vc = velocidad de crecimiento)
(c)
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
73
Muestra de
E. coli
10-1
10-2
10-3
9ml
9ml
9ml
10-4
10-5
10-6
10-6
Tipos
rango de pH
ptimo
acidfilos
neutrfilos
basfilos
0 -7
5 -12
9 -14
5
7
10
En ambientes de pH bajo dominan bacterias fermentativas, como las lcticas, las anaerobias y hongos, que si
bien son neutrfilos como grupo, se favorecen en ambientes cidos por falta de competencia de las bacterias. Los
medios de cultivo se acidifican con cidos orgnicos, lctico, actico, ya que penetran en la clula sin disociarse y
dentro liberan los protones que alteran el pH interno de
las clulas, ms eficientemente que los cidos inorgnicos, disociados.
Por el efecto sobre el pH del ambiente se distinguen micoorganismos:
10-7
pH
log10Ncl/mL
alcalinizantes
(amonificantes)
acidificantes
(bact. lcticas)
0 5 10 15 20
tiempo (h)
a
b
tiempo (h)
pH
a
b
tiempo (h)
72
Lillian Frioni
Segn los rangos de temperatura en que pueden desarrollarse los distintos grupos microbianos, se los clasifica
en sicrfilos, mesfilos y termfilos (cuadro 4).
Cuadro 4- Rangos de temperatura en
microorganismos
Tipos
sicrfilos
mesfilos
termfilos
Rango de temperatura
ptimo
0-20C
15-45C
40-70C
15C
35C
55C
69
Procedimiento: consiste en contar el nmero de colonias formadas en medio de cultivo slido adecuado, luego de sembrar volmenes conocidos de varias suspensiones-diluciones de la muestra (suelo, aguas, alimentos).
La siembra con varias repeticiones permite disminuir el
error experimental, el cual es alto en esta tcnica. El mtodo selecciona las cajas de Petri con entre 30 y 300 colonias (figura 6), ya que ms de 300 colonias por caja implica que muchas pueden originarse por ms de una clula
dada su alta densidad y las de menos de 30 colonias tambin presentan gran error.
Dilucin 104
Ejemplo:
N de colonias en la suspensin dilucin 10-5 = 65, 68, 77;
inculo/caja = 100L
N ufc/mL = 70 X 105 X 10 = 7,0 X 107.
En muchos casos se expresa en logaritmo en base 10:
log10 N ufc/mL = 7, 84
Dilucin 106
1ml
1ml
pH
Si bien el pH interno de las clulas es neutro, los microorganismos poseen mecanismos de control de entrada y
salida de protones y cationes a nivel de la membrana y
pueden desarrollarse en amplios rangos de concentracin
hidrogeninica (cuadro 6).
Recuento en aguas: la figura 7 (Prescott et al., 1999) muestra el procedimiento seguido para el recuento de viables,
por ejemplo coliformes en aguas, las que deben ser filtradas (por ejemplo 100 mL de agua) a los efectos de concentrar la carga microbiana, por filtros bacteriolgicos (0,45 micras), los que luego se depositan en la superficie de medios adecuados. Muchas veces los filtros estn cuadriculados, lo que facilita el recuento de las colonias formadas.
Muestra de
E. coli
10-1
10-2
10-3
9ml
9ml
9ml
1ml
10-1
10-1
1ml
1ml
10-1
10-2
10-2
3
310 en la tabla
10-2
10-3
10-3
10-3
4,5
70
Lillian Frioni
Ejemplo de recuento: se sembraron 0,1 mL. de suspensiones-diluciones de una muestra de leche en medio lquido adecuado (3 tubos/dilucin). Los resultados fueron:
Suspensin/dilucin
Tubos positivos
con crecimiento
10-3
+++
+++
+++
10-4
+++
+++
+++
10-5
+++++
+--
10-6
-------
Otros mtodos
Muy empleado es el mtodo de evaluacin del crecimiento por determinacin de la masa celular en forma indi-
recta, por la turbidez de los cultivos en funcin del tiempo. Se evala la densidad ptica a unos 600nm en espectrofotmetro. La misma es proporcional a la concentracin, dentro de ciertos lmites y esta tcnica es muy
empleada en la rutina del laboratorio. Requiere de una
determinacin previa que relaciona densidad ptica frente a recuentos microbianos, efectuados en medio slido
en placas.
Los otros mtodos de evaluacin del crecimiento emplean
propiedades bioqumicas y metablicas como son las determinaciones de alguna enzima, actividad respiratoria,
contenidos de C, N. etc., muchos de ellos pueden encontrarse en el Apndice prctico.
10-4
+++
+++
+++
10-5
+++
+++
+++
10-6 10-7
++- - - +- - - - --- ---
Preguntas de repaso
1) Una poblacin de bacterias pas de 2.103 a 5.108 clulas /mL en 10 horas. Calcule el nmero de generaciones, la velocidad de crecimiento, y el tiempo de generacin.
2) Determine el nmero total de clulas presentes por
mL en una muestra de levaduras usando la cmara
de Neubauer o similares, cuyo cuadrado grande
est dividido en 25 medianos y cada uno en 16 chicos. Datos de stos ltimos:
A = 0,0025mm2, h = 0,1 mm
Resultados: n de clulas/ cuadrado chico: 18, 32,45,
88,68, 19, 46, 69, 70
3) Concepto de crecimiento exponencial
4) Por qu ste no puede mantenerse indefinidamente
en la naturaleza?
5) Y en el laboratorio puede mantenerse?
6) Diferencias entre mtodos de recuento directo (clulas
totales) e indirectos (clulas viables)
7) Ventajas y limitaciones principales de los mtodos de
recuentos de viables en medio slido
8) Fundamento y aplicacin del recuento de viables en
medio lquido (NMP)
9) Cuando se va a construir la curva de crecimiento de un
microorganismo en un medio adecuado, se usan recuentos de viables o de totales?
10) En qu etapas de la curva puede emplear indistintamente ambos mtodos de recuentos?
71
Animales
Complejidad de la organizacin
Dependencia del ambiente
Se aprecia una relacin inversa entre complejidad de la organizacin de los distintos organismos y su dependencia
con el ambiente. En los microorganismos toda su superficie celular est en contacto con el ambiente y cambios muy
marcados en factores como la temperatura, acidez, presin osmtica, concentracin de sustancias qumicas, pueden detener procesos microbianos. Si los microorganismos
pueden esporular, lo harn en condiciones adversas, otras
veces su nmero decae marcadamente.
70
Lillian Frioni
Ejemplo de recuento: se sembraron 0,1 mL. de suspensiones-diluciones de una muestra de leche en medio lquido adecuado (3 tubos/dilucin). Los resultados fueron:
Suspensin/dilucin
Tubos positivos
con crecimiento
10-3
+++
+++
+++
10-4
+++
+++
+++
10-5
+++++
+--
10-6
-------
Otros mtodos
Muy empleado es el mtodo de evaluacin del crecimiento por determinacin de la masa celular en forma indi-
recta, por la turbidez de los cultivos en funcin del tiempo. Se evala la densidad ptica a unos 600nm en espectrofotmetro. La misma es proporcional a la concentracin, dentro de ciertos lmites y esta tcnica es muy
empleada en la rutina del laboratorio. Requiere de una
determinacin previa que relaciona densidad ptica frente a recuentos microbianos, efectuados en medio slido
en placas.
Los otros mtodos de evaluacin del crecimiento emplean
propiedades bioqumicas y metablicas como son las determinaciones de alguna enzima, actividad respiratoria,
contenidos de C, N. etc., muchos de ellos pueden encontrarse en el Apndice prctico.
10-4
+++
+++
+++
10-5
+++
+++
+++
10-6 10-7
++- - - +- - - - --- ---
Preguntas de repaso
1) Una poblacin de bacterias pas de 2.103 a 5.108 clulas /mL en 10 horas. Calcule el nmero de generaciones, la velocidad de crecimiento, y el tiempo de generacin.
2) Determine el nmero total de clulas presentes por
mL en una muestra de levaduras usando la cmara
de Neubauer o similares, cuyo cuadrado grande
est dividido en 25 medianos y cada uno en 16 chicos. Datos de stos ltimos:
A = 0,0025mm2, h = 0,1 mm
Resultados: n de clulas/ cuadrado chico: 18, 32,45,
88,68, 19, 46, 69, 70
3) Concepto de crecimiento exponencial
4) Por qu ste no puede mantenerse indefinidamente
en la naturaleza?
5) Y en el laboratorio puede mantenerse?
6) Diferencias entre mtodos de recuento directo (clulas
totales) e indirectos (clulas viables)
7) Ventajas y limitaciones principales de los mtodos de
recuentos de viables en medio slido
8) Fundamento y aplicacin del recuento de viables en
medio lquido (NMP)
9) Cuando se va a construir la curva de crecimiento de un
microorganismo en un medio adecuado, se usan recuentos de viables o de totales?
10) En qu etapas de la curva puede emplear indistintamente ambos mtodos de recuentos?
71
Animales
Complejidad de la organizacin
Dependencia del ambiente
Se aprecia una relacin inversa entre complejidad de la organizacin de los distintos organismos y su dependencia
con el ambiente. En los microorganismos toda su superficie celular est en contacto con el ambiente y cambios muy
marcados en factores como la temperatura, acidez, presin osmtica, concentracin de sustancias qumicas, pueden detener procesos microbianos. Si los microorganismos
pueden esporular, lo harn en condiciones adversas, otras
veces su nmero decae marcadamente.
72
Lillian Frioni
Segn los rangos de temperatura en que pueden desarrollarse los distintos grupos microbianos, se los clasifica
en sicrfilos, mesfilos y termfilos (cuadro 4).
Cuadro 4- Rangos de temperatura en
microorganismos
Tipos
sicrfilos
mesfilos
termfilos
Rango de temperatura
ptimo
0-20C
15-45C
40-70C
15C
35C
55C
69
Procedimiento: consiste en contar el nmero de colonias formadas en medio de cultivo slido adecuado, luego de sembrar volmenes conocidos de varias suspensiones-diluciones de la muestra (suelo, aguas, alimentos).
La siembra con varias repeticiones permite disminuir el
error experimental, el cual es alto en esta tcnica. El mtodo selecciona las cajas de Petri con entre 30 y 300 colonias (figura 6), ya que ms de 300 colonias por caja implica que muchas pueden originarse por ms de una clula
dada su alta densidad y las de menos de 30 colonias tambin presentan gran error.
Dilucin 104
Ejemplo:
N de colonias en la suspensin dilucin 10-5 = 65, 68, 77;
inculo/caja = 100L
N ufc/mL = 70 X 105 X 10 = 7,0 X 107.
En muchos casos se expresa en logaritmo en base 10:
log10 N ufc/mL = 7, 84
Dilucin 106
1ml
1ml
pH
Si bien el pH interno de las clulas es neutro, los microorganismos poseen mecanismos de control de entrada y
salida de protones y cationes a nivel de la membrana y
pueden desarrollarse en amplios rangos de concentracin
hidrogeninica (cuadro 6).
Recuento en aguas: la figura 7 (Prescott et al., 1999) muestra el procedimiento seguido para el recuento de viables,
por ejemplo coliformes en aguas, las que deben ser filtradas (por ejemplo 100 mL de agua) a los efectos de concentrar la carga microbiana, por filtros bacteriolgicos (0,45 micras), los que luego se depositan en la superficie de medios adecuados. Muchas veces los filtros estn cuadriculados, lo que facilita el recuento de las colonias formadas.
Muestra de
E. coli
10-1
10-2
10-3
9ml
9ml
9ml
1ml
10-1
10-1
1ml
1ml
10-1
10-2
10-2
3
310 en la tabla
10-2
10-3
10-3
10-3
4,5
68
Lillian Frioni
Cubreobjetos
(a)
(b)
Presin osmtica
Figura 9- Efecto de la temperatura sobre el crecimiento
microbiano (vc = velocidad de crecimiento)
(c)
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
73
Muestra de
E. coli
10-1
10-2
10-3
9ml
9ml
9ml
10-4
10-5
10-6
10-6
Tipos
rango de pH
ptimo
acidfilos
neutrfilos
basfilos
0 -7
5 -12
9 -14
5
7
10
En ambientes de pH bajo dominan bacterias fermentativas, como las lcticas, las anaerobias y hongos, que si
bien son neutrfilos como grupo, se favorecen en ambientes cidos por falta de competencia de las bacterias. Los
medios de cultivo se acidifican con cidos orgnicos, lctico, actico, ya que penetran en la clula sin disociarse y
dentro liberan los protones que alteran el pH interno de
las clulas, ms eficientemente que los cidos inorgnicos, disociados.
Por el efecto sobre el pH del ambiente se distinguen micoorganismos:
10-7
pH
log10Ncl/mL
alcalinizantes
(amonificantes)
acidificantes
(bact. lcticas)
0 5 10 15 20
tiempo (h)
a
b
tiempo (h)
pH
a
b
tiempo (h)
74
Lillian Frioni
Ambiente hipertnico
La concentracin de agua
es mayor dentro de la
clula y sta tiende a salir:
plasmolisis
Ambiente hipotnico
La concentracin de agua
es mayor fuera de la
clula, entra agua:
plasmoptisis(irreversible)
Ambiente isotnico
La concentracin de agua
es igual fuera que dentro
de la clula, existe
equilibrio osmtico:
ptimo crecimiento
La edad del inculo es el tiempo transcurrido entre la siembra en el medio de origen y el repique (ejemplo de 6, 12
horas).
Medio fresco
Fase exponencial o logartmica (log), en esta etapa se logra el mayor crecimiento, la velocidad de crecimiento es
mxima y el tiempo de generacin mnimo. Se postula que
en esta etapa cada clula es capaz de dividirse, por lo que
todas las clulas estn viables. En la industria interesa trabajar en esta fase y por ello se realizan cultivos continuos (figura 3) (Prescott et al., 1999) donde la concentracin de una
sustancia limitante del crecimiento, por ejemplo una vitamina, es incorporada al medio de modo de lograr una velocidad
de crecimiento constante y mxima por mucho tiempo.
Anaerobio
facultativo
Anaerobio
aerotolerante
Anaerobio
estricto
Microaerfilo
Suministro
de aire
Filtro
de aire
Recipiente
de cultivo
Colector
Evaluacin de crecimiento
Fase estacionaria por diversos motivos el crecimiento en
la naturaleza se detiene, en general por falta de nutrientes y/o por acumulacin de sustancias inhibidoras o txicas productos del propio metabolismo celular. El caso ms
tpico es la detencin del crecimiento de bacterias lcticas debido a la produccin de cido lctico en la fermentacin, que inhibe a las clulas, que son neutrfilas.
En esta etapa pueden darse dos situaciones:
Que las clulas dejan de dividirse en su conjunto, vc=0,
puede ser el caso de la acumulacin de productos
txicos.
Aerobio
obligado
Vlvula de control
Gases
67
Que la vc=vm, o sea, la velocidad resultante es estadsticamente cero, pero hay clulas que se dividen aun, pero
muere la misma cantidad, en el mismo periodo de tiempo
Fase de muerte, domina la velocidad de muerte (negativa) sobre la de crecimiento. El cultivo puede llegar a esterilizarse, o bien puede esporular y conservarse en estado
cripto bitico.
Recuentos microbianos
Recuento de microorganismos totales en cmaras
Fundamento del mtodo: una muestra de cultivo bacteriano diluido se coloca en una cmara de volumen pequeo y conocido, como por ejemplo la de Petroff-Hause que
encierra 2,5x10-7 mL y se cuentan al microscopio las clulas contenidas en numerosos cuadrados de la cmara
(figura 4) (Prescott et al., 1999).
Se calcula el promedio de clulas contenidas en dicho
volumen y se expresa el N clulas/mL de la muestra. La
desventaja es que no se pueden distinguir clulas viables
de no viables y el error experimental es alto. Pero se pueden efectuar numerosas determinaciones en poco tiempo, con solo lavar la cmara y volverla a cargar.
66
Lillian Frioni
tg=1/vc
n =
Analizaremos el caso hipottico de un organismo unicelular, bacteria, protozoo, alga, que comience a dividirse en
forma exponencial en un medio de cultivo lquido adecuado. Calcularemos el nmero de generaciones, el nmero
final de clulas/mL a medida que transcurre el tiempo
(cuadro 1).
Cuadro 1- Crecimiento exponencial (logartmico)
en una bacteria
N de
clulas/mL
Tiempo
(h)
N
log Ncel/mL
2
generaciones
1
2
4
8
16
32
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
Nf (nmero
n = log Ncl./mL
final)
(tiempo) generaciones
10
0,000
0,301
0,602
0.903
1,204
1,505
2
log N clulas/mL
log Ncel/mL
log Ncel./mL
n=
10
0,301
1
tiempo
Nf= No.2
75
log10 Nf - log10 N0
log10 2 = 0,301
NOTA: i) Para verificar este hecho calcule el peso de clulas bacterianas luego de 24 horas de crecimiento exponencial, partiendo de una clula cuyo peso es un picogramo (10-12g) y cuyo tiempo de generacin es de 1 hora.
ii) Por qu el crecimiento se detiene en la naturaleza y
su representacin sigue una curva sigmoide?
La figura 2 muestra los eventos que pueden darse cuando un microorganismo unicelular se introduce en un medio lquido adecuado a su crecimiento. Se aprecian 4 fases, desde el inicio del cultivo (inoculacin, tiempo cero)
hasta la muerte de la mayora de las clulas (esterilizacin del cultivo).
Las caractersticas de las distintas fases son:
Fase de latencia o fase lag no hay divisin celular, las
clulas se adaptan al medio, aumenta el nivel de coenzimas necesarias para el funcionamiento de enzimas. Esta
fase debe acortarse en el laboratorio y en la industria,
porque implica gasto de energa y tiempo. Esto se logra
repicando el cultivo a un medio de la misma composicin
que el de origen, introduciendo un inculo grande (en general un 10% del volumen final del nuevo medio) y sembrando con cultivos jvenes.
Radiaciones
Tapa
Tornillo de seguridad
Rayos gamma
Abrazadera
Rayos X
Ultravioleta
Junta de
goma
Cmara
del
catalizador
Sobre
generador
de gas
El oxgeno se
elimina de la
cmara, al combinarse con hidrgeno para formar
agua.
Tira indicadora
de anaerobiosis
El azl de
metileno pierde el
color en ausencia
de O2.
10-4
0.01
Ondas de radio
Infrarrojo
100 103
1.0
104
106
Rojo
Naranja
Amarillo
Infrarrojo
Verde
Ultravioleta
200
300
Azul
Violeta
400
500
600
700
108
800
900
76
Lillian Frioni
Factores qumicos
Las sustancias qumicas pueden ejercer distintos efectos
sobre el desarrollo de los microorganismos:
65
no afectarlo
estimularlo, son los nutrientes
inhibirlo, sustancias microbiosttica y microbicida,
con y sin lisis (microltica)
La figura 15 muestra alguno de estos efectos en un cultivo bacteriano creciendo exponencialmente en un medio
lquido. En el momento indicado por la flecha se ha agregado una concentracin inhibitoria de la sustancia en estudio. Se aprecia diferencia en los recuentos de clulas
totales y de viables, consecuencia de la lisis celular.
La ubicacin de una sustancia qumica en alguna de estas categoras es muchas veces arbitraria ya que una misma sustancia puede ser nutriente o bacteriosttico dependiendo de la concentracin, como es el caso de los azcares que al 1% son nutrientes para la mayora de los
microorganismos, pero a altas dosis previenen el crecimiento por plasmolisis (conservacin de alimentos).
Prcticamente cualquier sustancia orgnica de origen
biolgico es utilizada por algn grupo de microorganismo. Aquellas sustancias naturales o artificiales que se
acumulan en los ecosistemas a concentraciones no deseables para las comunidades naturales, se denominan
recalcitrantes (captulo 22).
Por su toxicidad, las sustancias qumicas se clasifican
en:
toxicidad no selectiva, el agente acta sobre todo tipo
de clulas: microbianas, del hospedante. Son conocidos los antispticos, que son efectivos sobre mucosas
(colorantes, sales de mercurio, etc.) y los desinfectantes aplicados sobre superficies inertes (alcoholes, jabones, cresoles). Esta separacin tambin es arbitraria, pues los efectos dependen de la concentracin.
Actan, en general, a altas concentraciones.
toxicidad selectiva, son ms txicos para las clulas
microbianas (incluso para Gram positivas y no para
Gram negativas) y son inocuas para las clulas del
hospedante. Estos son los agentes quimioteraputicos, de gran empleo en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Son efectivas a muy bajas concentraciones.
Los factores que influyen en la accin antimicrobiana son:
Crecimiento microbiano y su
control
1.
nes ptimas por la carencia de nutrientes y por las condiciones ambientales, no siempre favorables ni constantes.
En la naturaleza los microorganismos se encuentran libres en la solucin del suelo y usualmente existen en biofilms: grupos de diferentes microorganismos organizados
en capas e inmovilizados en la superficie de un sustrato,
rodeados en general por una matriz de polmeros orgnicos de origen microbiano. Se desarrollan prcticamente
en todas las superficies inmersas en ambientes acuosos
naturales, biolgicos, como en los vegetales, como abiticos, como plsticos, piedras, partculas del suelo. All, las
interacciones son numerosas tanto sinrgicas como antagnicas (captulo 14).
En el laboratorio, los organismos son estudiados como
cultivos puros, en medios y condiciones de cultivo adecuadas. Analizaremos la cintica del crecimiento en el
laboratorio (in-vitro).
Crecimiento exponencial
2.
3.
4.
Figura 1- Divisin binaria de microorganismos unicelulares
(bacilo)
64
Lillian Frioni
77
Sustancia
log N
clulas
clulas
bacteriosttico
tiempo
bacteriosttico
recuento de
viables
clulas
bactericida
Usos
Etanol
Desnaturaliza protenas
y solubiliza lpidos
Antisptico
(piel)
Formaldehdo
Desinfectante
Nitrato de plata
Precipita protenas
Antisptico
(ojos)
Detergentes
Altera membranas
Antisptico
Desinfectante
Compuestos
fenlicos
Desnaturaliza protenas
Daa membranas
Antisptico
Desinfectante
tiempo
recuento total
log N
Modo de accin
tiempo
Agentes quimioteraputicos
Los agentes quimioteraputicos se emplean para el control microbiano dentro del husped, deben reconocer estructuras celulares microbianas y no actuar sobre las mismas estructuras del organismo superior (accin selectiva). Son sustancias qumicas utilizadas para matar o inhibir microorganismos dentro del cuerpo humano; poseen
toxicidad selectiva: actan sobre las clulas de algunos
microorganismos y no sobre las clulas del tejido humano, para esto su accin debe estar dirigida a estructuras o
funciones exclusivamente microbianas.
Los ms empleados son las sulfanilamidas o anlogos de
factores de crecimiento y los antibiticos.
78
Lillian Frioni
cido p-aminobenzoico
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker, Brock, Biologa de los microorganismos, 9 edicin, 2000, Prentice Hall International
Prescott, Harley, Klein Microbiologa, 1999 McGrawHill.Interamericana
Preguntas de repaso
Cuadro 11- Produccin de antibiticos
cido flico
La sulfanilamida que es anloga pero no idntica (figura 16) al cido para amino benzoico (PABA), requerido
en la sntesis del cido flico, vitamina y factor de crecimiento para muchos microorganismos, fue empleada en
medicina antes del descubrimiento de los antibiticos.
El 5 Br uracilo es anlogo del uracilo, pero el correspondiente cido nucleico no puede sintetizarse en su presencia.
Estas sustancias vuelven a emplearse en medicina,
dado el problema de resistencias que estn provocando los antibiticos, que pueden convertir en inefectivos a estos productos poco tiempo despus de su recomendacin.
Antibiticos
Los antibiticos son sustancias qumicas de composicin qumica variada, desde pptidos a molculas heterocclicas, como la penicilina (figura 17), quinonas, como
las tetraciclinas, con accin antimicrobiana, producidas por
un microorganismo contra otro microorganismo. Los ms
conocidos son los secretados por bacterias (incluidos los
actinomicetes) y los hongos (figura 18). Se producen en
la fase estacionaria de crecimiento, cuando las condiciones para el crecimiento son limitantes (telofase) y se consideran metabolitos secundarios.
1) Cite 3 grupos de bacterias fotoauttrofas y 3 quimiauttrofas que habiten el suelo y explique las diferencias entre ambos grupos. Anote y diferencie la forma
por la cual ellas obtienen carbono y energa.
2) Seale los tipos metablicos por los cuales obtienen
energa los siguientes microorganismos: aerobios obligados, anaerobios obligados, anaerobios facultativos
y anaerobios aerotolerantes
63
3) Por qu las respiraciones aerobias con sustrato inorgnico rinden menos energa que las con sustrato orgnico?
4) Seale alguna respiracin aerobia incompleta de gran
valor biotecnolgico
5) Por qu se considera que las fermentaciones son procesos muy antiguos
6) La aparicin de que elemento cambi las formas de
obtencin de energa?
7) Por qu se dice que las bacterias fotosintticas anaerobias pueden crecer en zonas donde aparentemente
no hay luz visible?
8) Qu importancia ecolgica tienen estas bacterias?
9) Compare la estructura y la funcin fotosinttica de: cianobacterias y bacterias sulfurosas purpreas y verdes?
10) Analice la sucesin microbiana en la llamada columna
de Winogradsky. Cmo aislara en cultivo puro a los
diferentes grupos?
62
Lillian Frioni
Carbono: CO2
orgnico
( auttrofos)
(hetertrofo)
Reacciones qumicas
(quimiotrofos)
Donadores de e : inorgnico
orgnico
(litotrofo)
(organotrofo)
Electromagntica: FOTOTROFOS
Fotoautolitotrofos
* Bacterias sulfurosas purpreas y verdes
(Chromatiaceae y Chlorobiaceae)
CO2 + H2S
(CH2O)n + S + H2O
Fotoautoorganotrofo
* Bacterias no sulfurosas purpreas
(Rhodospirillaceae)
(CH2O)n+ H2O
CO2 + CH3COOH
* cianobacterias
(CH O)n + O + H O
CO2 + 2H2O
2
2
2
Fotoheteroorganotrofo
* Bacterias no sulfurosas
CH3COOH (CH2O)n + H2O
No pueden reducir el CO2
Quimioheteroorganotrofo
La mayora de las bacterias, todos los hongos, protozoos
Respiraciones aerobios
C6H12O6 + O2
6CO2 + 6H2O
Respiraciones anaerobias
C6H12O6 +NO3
CO2+ H2O + N2
Aceptores de electrones:
Nitrato: desnitrificantes
Sulfato: sulfatorreduccin
79
C6H12O6+SO4=
CO2/carbonatos: metanognesis
H2 + CO2 CH4 + H2O
Bacterias anaerobias:
=
SH2 + NO3
SO4 + N2
Fermentaciones:
Donadores y aceptores de e : molculas orgnicas
(bacterias, hongos)
Fermentacin lctica
C6H12O6
CH3CHOHCOOH
A los efectos de conocer la concentracin de estas sustancias ya sea en sueros de pacientes, en preparados
comerciales, etc. se emplean los mtodos de:
1) difusin en agar, donde se siembra en superficie patgenos aerobios o un microorganismo aerobio facultativo de crecimiento rpido como el Staphylococcus o
Pseudomonas y se colocan discos de papel impregnados con distintas concentraciones del antibitico. El dimetro del halo de inhibicin formado es proporcional a
la concentracin.
Fue en 1928 cuando el mdico escocs Alexander Fleming redescubri la penicilina (ya detallada en 1896 por
un estudiante en Francia), al dejar durante sus vacaciones una caja de Petri con estafilococos patgenos sobre
los cuales se desarrollaron las esporas del hongo Penicillum notatum, que inhibieron el crecimiento de las colonias bacterianas. Recin en 1940 se publicaron los trabajos de aislamiento y se extendi la aplicacin de esta
sustancia, a la que sigui la estreptomicina por Waksman, en 1944.
+++
La figura 20 es una prueba de sensibilidad de un microorganismo patgeno frente a distintos antibiticos. Cuan
80
Lillian Frioni
to mayor es el dimetro del halo de inhibicin, ms eficiente es el antibitico, en este caso impregnado en los
discos de papel de filtro. Por ejemplo, en este caso se
observa que la vancomicina (V) es efectiva para M.
luteus, pero no para el S. albus.
algas, cianobacterias
anoxignica
CO2 + H2S
Membrana celular
cido nucleico
Acidos nucleicos
Transcripcin
Ribosoma
mRNA
Enzima
Traduccin Protena
Sustrato
Antimetabolitos
Sntesis proteica
Resistencias: si bien la investigacin y desarrollo de nuevos antibiticos, incluidos los semisintticos o los completamente sintticos (antivirales o antiprotozoarios) se ha
incrementado mucho en los ltimos aos, tanto los de
espectro reducido (eficaces frente a una gama estrecha
de patgenos), como los de amplio espectro, como la
ampicilina, rifampicina), existe el problema de la prdida
creciente de eficacia por el desarrollo de resistencias en
los microorganismos originariamente sensibles.
Los mecanismos de resistencia a antibiticos creados por los microorganismos incluyen:
a) desarrollo de una va metablica alternativa a la va
que el antibitico bloquea
b) la produccin de enzimas que inactivan a los antibiticos
c) alteracin del sitio blanco de accin del antibitico evitando su unin
d) bloqueo del transporte del antibitico al interior del microorganismo
Anexo: Esterilizacin
Se define por esterilizacin el proceso por el cual se eliminan todos los microorganismos incluidas las endosporas
bacterianas de cualquier objeto, superficie o medio, por
remocin o muerte de stos. Se emplean mtodos fsicos
y qumicos (cuadro 12).
(CH2O) n + S
(CH
O) n + H2O
fase oscura:
6CO2+ 18 ATP +12NADPH
Propiedad
eucariotas
cianobacterias bacterias
verdes y
purpreas
Pigmento
fotosinttico
clorofila a
clorofila a
bacterioclorofila
Fotosistema II presente
presente
ausente
Donadores
de electrones H2O
H2O
H2, H2S, S,
comp.orgnicos
Produccin
O2
oxignica
anoxignica
(CH2O)n + H2O + O2
Replicacin
oxignica
CO2 + 2H2O
Pared celular
61
C6H12O6 +18ADP + Pi
+12NADP+
oxignica
Productos
primarios de
la conversin
de energa ATP, NADPH ATP, NADPH ATP
Fuente de
carbono
CO2
CO2
Resumen final: el cuadro 29 vincula la clasificacin nutricional de los microorganismos con los posibles mecanismos
de obtencin de energa y cita ejemplos de cada grupo.
100
Lillian Frioni
El cuadro 10 resume algunas de las estructuras y/o funciones que se emplean en estudios filogenticos dada su
estabilidad gentica y el cuadro 11 presenta las ventajas
del anlisis de la fraccin 16S del r ARN.
Arboles filogenticos
Efectos del ambiente en la esterilizacin
La figura 2a (Prescott et al., 1999) muestra que el microorganismo A est ms relacionado con C que con D y B,
pero no da datos sobre un ancestro comn ni direcciones
de cambio. En b se muestra un rbol con raz que presenta un nudo que sirve de antecesor comn y muestra el
desarrollo de las cuatro especies desde esta raz.
Tipo de microorganismo: las clulas vegetativas en desarrollo son mucho ms susceptibles que las esporas.
81
82
Lillian Frioni
Bajas temperaturas
Si bien el metabolismo microbiano est inhibido debajo
de 0C, estas temperaturas no matan a los microorganis-
mos, sino que pueden conservarlos durante largos perodos de tiempo. Se usa para conservar microorganismos
indefinidamente. Los cultivos se conservan congelados a
-70C o en recipientes con nitrgeno lquido a -196C. La
mezcla con 30-50% de glicerol, baja el punto de congelamiento de los cultivos y evita mortandad.
B- No ionizantes
Luz ultravioleta: La porcin UV del espectro incluye a
radiaciones desde 15 a 390nm. Las radiaciones con longitudes de onda de 265nm son las de mayor efecto bactericida (200-295nm). Se usan en cmaras de siembra, en
cmaras de flujo laminar y para tratar superficies contaminadas en industrias de alimentos y leche. Posee poca
capacidad para penetrar la materia por lo que slo los
microorganismos que se encuentran en la superficie de
los objetos son susceptibles de ser destruidos.
99
Filogenia bacteriana
La taxonoma bacteriana evoluciona muy rpidamente con
los conocimientos sobre la biologa de las bacterias, la
aplicacin de mtodos moleculares al estudio de las relaciones filogenticas entre grupos bacterianos, ayudados
con importantes aplicaciones de las tcnicas de la informtica. El cuadro 8 resumen estos avances y el cuadro 9
presenta algunos de los segmentos de cidos nucleicos
empleados en estos estudios y la metodologa aplicada.
Se considera que la similitud en molculas implica similitud en los genes. Cuanto ms reciente es el ancestro comn, se encuentra mayor similitud y relaciones entre los
microorganismos segn la similitud en los genes. Se emplean tcnicas de hibridacin ADN-ADN y de comparacin de genes especficos.
Tamao
(nucletidos)
5S
16S
23S
120
1500
2900
Ubicacin
Subunidad mayor del ribosoma
Subunidad menor
Subunidad mayor
Secuencias de 16SrARN
Estructura primaria: mosaico de dominios que varan
en trminos del grado de conservacin de la secuencia
primaria de nucletidos.
- Dominios de conservacin universal
- Dominios de nivel intermedio de conservacin, con cambios de secuencia, pero con conservacin de la estructura secundaria
- Regiones altamente variables
Estructura secundaria:
similar en todos los organismos
acotada por su funcin
sntesis de protenas: funcin ancestral
Metodologa
transcriptasa reversa
PCR
Secuencias de 16SrARN
98
Lillian Frioni
ADN simple
A
b
s.
ADN doble
220
260
Longitud de onda
300
ADN simple
desnaturaliza
A
b
s.
Tm =
ADN doble
80
90
temperatura
100
Algas
Protozoos
Mohos mucosos
Hongos
38-79
20-60
20-40
30-66
Procariotas:
Actinomyces
Bacillus
Escherichia
Pseudomonas
Salmonella
25-80
59-73
32-62
48-52
58-70
50-53
A-Filtros de membrana
Son discos de steres de celulosa con poros pequeos que
evitan el paso de los microorganismos (0,45, 0,22 micras).
Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamao del
poro. Son desechables. Adems de usarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico de
aguas ya que concentran los microorganismos existentes
en grandes volmenes de agua (figura 22).
B- Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) estn compuestos por pliegues de acetato de celulosa que retienen
las partculas (incluidos los microorganismos) del aire que
sale de una cmara de flujo laminar (figura 23).
para los microorganismos de manera que pueda ser fcilmente eliminado del objeto esterilizado luego del tratamiento. Normalmente se usa el xido de etileno, un lquido que hierve a 10,7C y se usa en la industria para esterilizar placas de Petri, jeringas y otros objetos de plstico
que se funden a temperaturas superiores a los 100C.
Debido a su alto poder de penetracin estos objetos se
empaquetan primero y luego se esterilizan. El xido de
etileno acta inactivando enzimas y otras protenas con
grupos sulfhidrilos (R-SH) en reaccin de alquilacin
(R-S-CH2CH2O-H).
2- Glutaraldehdo: una solucin acuosa al 2% presenta
amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y hongos.
Se usa en medicina para esterilizar instrumentos pticos
y otros.
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biologa de los
Microorganismos, 2000. Prentice Hall International.
Prescott, Harley, Klein. Microbiologia, 1999. McGraw-Hill.
Interamericana.
www.fagro.edu.uy/microbiologia, Guia de prcticos, 2005.
Figura 22- Filtros bacteriolgicos descartables
Preguntas de repaso
Para organismos no tan relacionados se emplea la hibridacin del ARN (ribosomal o de transferencia, radiactivo)
con ADN. Se usan los ARN ya que los genes que codifican a estas molculas no han evolucionado tan rpidamente como la mayora de los genes microbianos.
Figura 23- Filtros para aire
Secuenciacin de los cidos nucleicos: las estructuras genmicas se comparan en la actualidad mediante la
secuenciacin del ADN y el ARN. La mayor atencin se
ha focalizado en la secuenciacin de fracciones conservadas del ARN, como la 5S y 16S, aislados de las subunidades 50S y 30S de los ribosomas bacterianos.
83
84
Lillian Frioni
Caractersticas moleculares
Los abordajes ms modernos en la taxonoma se basan
en los anlisis de protenas y cidos nucleicos, que brindan importante informacin sobre relaciones entre microorganismos.
Comparacin de protenas
Las secuencias de aminocidos en las protenas son reflejo de las secuencias de ARNm y por lo tanto estn relacionados con los genes que las codifican. Se determina la secuencia de aminocidos de protenas con la misma funcin
(si stas son similares, es muy probable que los organismos que las poseen estn estrechamente relacionados).
Como estos estudios son largos y caros, se han empleado tcnicas indirectas de comparacin de protenas, como
la movilidad electrofortica de las mismas, o el empleo de
anticuerpos especficos que permiten distinguir protenas
muy similares.
97
G + C x100
G+C+T+A
* gradiente de CsCl
* desnaturalizacin trmica
criterio de exclusin: % GC > 3 dos especies
diferentes
% GC > 10 dos gneros
diferentes
Hibridacin ADN-ADN
- depende de la secuencia
- determinacin por:
* % hibridacin de ADN1 marcado con ADN2
* < T del hbrido y del cultivo puro
m
96
Lillian Frioni
Los perfiles metablicos de poblaciones de inters se pueden evaluar en sistemas comerciales como el Biolog, donde se siembra el aislamiento en una placa con numerosos orificios, cada uno con una fuente de carbono diferente. Luego de la incubacin la placa se lee en un lector
electrnico (aparece color donde hubo crecimiento y utilizacin del sustrato).
85
Gentica de microorganismos
procariotas
Caracteres ecolgicos
Caracteres fisiolgicos y metablicos
Estos constituyen una importante contribucin en la taxonoma ya que estn directamente relacionados con las
enzimas microbianas y las protenas de transporte. Como
las protenas son resultado de sntesis gnica, estos estudios metablicos permiten una comparacin indirecta
de los genomas microbianos. En el cuadro 5 se muestran
algunas de determinaciones ms empleadas.
Son propiedades que afectan la relacin de los microorganismos con el ambiente, como las relaciones simbiticas, la produccin de enfermedades en un husped especfico, las preferencias de habitat, las necesidades de
ciertos rangos de temperatura, pH, O2, concentracin osmtica. Algunas caractersticas de crecimiento se consideran tambin caracteres fisiolgicos.
Caracteres genticos
Cuadro 5- Caracteres fisiolgicos y metablicos
usadas en la clasificacin microbiana
Fuentes de carbono, nitrgeno, azufre, de energa, etc.
Componentes de la pared celular
Tipos de fermentacin y productos finales
Clasificacin nutricional
Efectos de factores del ambiente: temperatura,
pH, gases, solutos, etc. Valores ptimos y rangos
Produccin de luz (luciferasa)
Metabolismos bioenergticos
Pigmentos fotosintticos
Necesidades y tolerancia a la sal
Metabolitos secundarios: antibiticos, toxinas,
pigmentos
Sensibilidad a inhibidores metablicos y antibiticos
Inclusiones citoplasmticas: fosfatos, azufre,
fenoxialcanos
Los estudios llevan en general tiempo ya que el microorganismo en estado puro se cultiva en medios con sustratos especficos. Se evala el empleo de algunos de ellos
(azcares, nitratos, etc.) por la desaparicin del mismo y/
o por la aparicin de productos finales del metabolismo.
Resultan de indudable aplicacin en la taxonoma de eucariotes, donde la especie se define en trminos de reproduccin sexual. En procariotas, el fenmeno es fragmentario, pero de todas formas se realizan grandes avances en el estudio de intercambio de genes mediante la
recombinacin (transformacin, transduccin, conjugacin) (captulo 5). La primera ocurre principalmente entre
especies bacterianas diferentes, pero raramente entre
gneros. Se han realizado estudios de transformacin con
varios gneros: Bacillus, Micrococcus, Rhizobium y otros.
Pero, puede suceder que no ocurra transformacin por
motivos diferentes a la homologa del ADN.
Cromosoma bacteriano
El genoma bacteriano es haploide, est constituido por
una molcula de ADN autorreplicativa (replicn), de 1.000
a 6.000Kb (4.700Kb en E. coli) y alberga la mayor informacin gentica esencial de la clula (figura 1).
monocopia, oligocopia o multicopia. Sus principales funciones no estn relacionadas a metabolismos fundamentales para la viabilidad de la clula, sino que albergan genes que codifican para funciones accesorias como ser
resistencias a antibiticos, fungicidas, metales pesados,
etc. Son empleados como vectores de informacin gentica y la clula al dividirse por fisin binaria asegura previamente la duplicacin de sus plsmidos, ya que stos
contienen un replicn bsico que hace posible que se
dupliquen las copias plasmdicas antes de la divisin celular (figura 3).
Bases
Replicacin
La conjugacin se ha empleado mucho en estudios taxonmicos. As entre las bacterias entricas, Escherichia
puede conjugar con los gneros Salmonella y Shigella,
pero no con Proteus ni Enterobacter, lo que concuerda
con otros datos que muestran que los tres primeros gneros estn ms estrechamente relacionados entre si que
con los otros dos restantes.
El nmero y tipo de plsmido presente en clulas bacterianas tambin se emplea con fines taxonmicos, ya que
Particin
Azcar
Los plsmidos estn formados por ADN circular, de doble hlice, son replicones, su nmero de copias es carcterstico y vara de una clula a otra. El tamao de un
plsmido y su nmero por clula se usan como carcter
taxonmico (figura 2).Una clula puede tener plsmidos
86
Lillian Frioni
repA
ori
tmp
CAGT 3
GTCA 5
95
Cuadro 3- Jerarquas en taxonoma. En este caso simplificado se cita el ejemplo de los miembros del gnero
Shigella y sus rangos taxonmicos superiores.
replicn bsico
(replicacin)
KmR (kanamicina)
Figura 5- Transposones
ApR (ampicilina)
regin tra
(transferencia
conjugativa
RTF
Resistance
Transfer
Factor
R-det
Resistance
determinants
SmR (estreptomicina)
SuR (sulfonamida)
CmR (cloranfenicol)
parA parB
En resumen: las bacterias presentan la informacin gentica esencial en el nucleoide, falso ncleo tambin llamado cromosoma bacteriano y pueden contener informacin gentica adicional, no fundamental, en plsmidos,
profagos y transposones. Estos ltimos, al no ser esenciales, pueden variar mucho en nmero y contenido de
ADN y son responsables de la mayor parte de los cambios genticos en bacterias.
Figura 4- El plsmido R
1
Los bacterifagos
Son virus que atacan a bacterias (captulo 2) y su multiplicacin est asegurada por un ciclo ltico y otro lisognico.
Intervienen por lo tanto en la lisis celular (ciclo ltico) o en
la incorporacin de material gentico a clulas bacterianas (ciclo lisognico).
Caracteres clsicos
Los caracteres morfolgicos, fisiolgicos, bioqumicos,
ecolgicos y genticos han sido empleados en taxonoma
Caracteres morfolgicos
Son muy empleados en taxonoma ya que resultan fciles
de estudiar, son bastante estables por ser la expresin de
numerosos genes, suelen ser estables del punto de vista
gentico y en general, sobretodo en los eucariotas, no
varan mucho con el ambiente. El cuadro 4 presenta algunos de los caracteres morfolgicos empleados.
Grupos microbianos
Muy empleados en todos los grupos microbianos
Todos los grupos principales
Todos los grupos principales
Bacterias, algunos hongos
Todos los grupos principales
Bacterias deslizantes, espiroquetas
Bacterias formadoras de endosporas
Algas, hongos
Todos los grupos principales
Todos los grupos principales
94
Lillian Frioni
87
Transformacin
donador
caracteres morfolgicos
tamao, forma, forma de agruparse de las
clulas en medio lquido
Crecimiento
Serolgicos
Reconocimiento por reacciones antgeno (somticos o flagelares de la bacteria) y anticuerpos especficos producidos contra esas molculas no presentes en animales de sangre caliente: conejos, cobayos, caballo
Ecolgicos, patolgicos y/o simbiticos
Asociaciones con animales, plantas, etc., efecto de
factores del ambiente
Genticos
Anlisis del nmero y tamao de los plsmidos, intercambio de genes mediante los procesos de recombinacin
Moleculares
Estudio de protenas y cidos nucleicos, muy desarrollados en la actualidad, proporciona valiosa informacin sobre relaciones entre microorganismos
receptor
Divisin celular
Transduccin
ADN en virus
caracteres tintoriales
coloraciones simples, diferenciales (Gram),
especficas (esporas, flagelos, etc.)
Fisiolgicos y metablicos
Empleo de fuentes de C, N, S, etc., formas de obtencin de energa, produccin de sustancias biticas (vitaminas) y abiticas (antibiticos)
ADN libre
Un dispositivo muy sencillo permite determinar el mecanismo por el cul se formaron recombinantes cuando dos
cultivos se ponen en contacto: en un tubo doblado en U
se siembran los cultivos, uno en cada rama, separados
por un filtro bacteriolgico, que deja pasar los bacterifagos, pero no a las clulas.
Si los cultivos se tratan previamente con ADNasa,
entonces el proceso no fue por transformacin ya
que el ADN libre est expuesto a la accin de la
enzima. Si igual ocurre recombinacin, debe ser por
alguno de los otros mecanismos de transferencia
horizontal.
Sin ADNasa, la recombinacin debe ocurrir por transduccin o por transformacin, ya que el filtro deja
Conjugacin
transferencia de
cromosoma
transferencia de
plasmidios
Recombinacin
Involucra intercambio fsico de material gentico entre
elementos genticos. Se generan nuevas combinaciones: se une lo que antes estaba separado y se separa
lo que antes estaba unido. Es un evento intracelular.
Se reconocen:
a)Recombinacin homloga o general: el intercambio se
realiza en segmentos extensos de secuencias homlogas o muy parecidas
b)Recombinacin especfica de sitio: el intercambio se
opera en segmentos muy cortos de secuencias especficas (ejemplo integracin del genoma fgico al cromosoma bacteriano).
c)Recombinacin ilegtima: es la transposicin: el intercambio se opera por salto a cualquier secuencia, al azar.
88
Lillian Frioni
Las bacterias son escasamente transformadas por plsmidos, ya que stos deben permanecer con doble hlice
y circulares para replicarse. La figura 8 muestra la transformacin de una bacteria sensible a la ampicilina (Aps)
que se convierte en resistente (ApR) por la adquisicin de
un plsmido con esa resistencia.
Muchos ensayos se han realizado a los efectos de aumentar la competencia de ciertas bacterias de inters para
transformar, como por ejemplo tratarlas con altas concentraciones de iones calcio.
ApR
ApR
Transformacin
Seleccin Ap
Transformacin
El ADN libre (lisis celular) lineal se debe unir a la superficie
de la bacteria mediante una protena de unin, luego de lo
cual entran o bien las dos hebras o previamente una nucleasa degrada una de ellas y la otra entra en la clula. El
trozo de ADN se asocia a una protena especfica que evita
el ataque por nucleasas hasta su integracin con el ADN
con ayuda de una protena llamada RecA, mediante un proceso de recombinacin. En la replicacin de este ADN se
forma una clula igual a la parental y otra recombinante.
Transduccin
El ADN que se transfiere proviene de un virus y el proceso
puede ocurrir en dos formas:
93
La necesidad de agrupar y clasificar a los microorganismos surgi muy temprano en los estudios de la microbiologa. Los criterios empleados para agrupar, sobretodo con
las bacterias incluyeron categoras nutricionales (auttrofas, hetertrofas), caractersticas tintoriales (Gram negativas y Gram positivas), respuestas al oxgeno (aerobias,
anaerobias) rango de temperatura del crecimiento, etc.
La taxonoma (cuadro 1) clasifica a los organismos en
grupos (taxones) en base a similitudes, le asigna nombres a los mismos e identifica organismos desconocidos
(los ubica en algunos de los taxones definidos). La experiencia generada con la clasificacin de otros seres vivos,
como los animales y los vegetales ayud a construir una
aproximacin para el caso de los microorganismos y en
especial para las bacterias. La taxonoma es una ciencia
que requiere la determinacin de numerosos caracteres y
luego una interpretacin rigurosa de los mismos.
Se debe distinguir entre taxonoma e identificacin de
las bacterias. La primera conduce a una caracterizacin
exhaustiva, con aplicacin de la teora y los mtodos de
clasificacin, la formacin de grupos o taxones y su nomenclatura. La identificacin constituye el lado prctico
de la taxonoma, tiende a caracterizar a un aislamiento
por un nmero limitado de anlisis, seleccionados en general para el problema en cuestin, efecta comparacin
con especies conocidas y asigna el aislamiento a una especie conocida o aconseja un estudio taxonmico ms
profundo.
Especie: es la unidad taxonmica bsica y se define como
el grupo de organismos que tiene un alto grado de simili-
En las bacterias se habla ms de taxones que de especies, por la continua evolucin de caracteres morfolgicos y genticos. Las unidades de clasificacin de las bacterias o taxones presentan la siguiente jerarqua:
92
Lillian Frioni
89
ADN deriva del donante y la otra es recientemente sintetizada en la clula receptora durante el proceso de transferencia. El proceso requiere contacto clula-clula para
permitir el pasaje de una hebra del ADN de un plsmido
(se requiere una enzima que corte).
Una molcula complementaria de ADN se sintetiza entonces en la clula receptora. El factor F es un plsmido
conjugativo muy conocido que presenta alta eficiencia
en la transferencia. Las clulas que portan el plsmido F
se denominan F+ y las cepas sin el plsmido F, o sea
recipientes para ste, se denominan F. Cuando una
clula F+ transfiere el plsmido F a una receptora, sta
ltima se convierte en F+, o sea dadora en una conjugacin (figura 10).
F (femenino)
F+(masculino)
tubo de
conjugacin
Clula bacteriana
Clulas conjugando
(transferencia de una
copia del factor F)
Ciclo ltico
Clula transducida
Fago
Fago
Separacin de
clulas F+
Partcula
transductora
Partcula
transductora
Transformacin de
clulas F en F+
Sntesis de ADN
Transduccin
Recombinacin
gentica
La figura 11 (Madigan et al., 2000), muestra una microfotografa electrnica de dos clulas bacterianas unidas por
el pelo sexual o pili, que facilita la transferencia de material gentico por conjugacin.
Conjugacin
Es un proceso de transferencia gentica que involucra
contacto clula a clula. Es un mecanismo codificado por
plsmidos. Un plsmido conjugativo emplea este mecanismo para transferir una copia del mismo a una nueva
clula. La evidencia sugiere que una de las hebras del
Por este mecanismo ocurre la transferencia de resistencia a biocidas, como los antibiticos, ocasionando serios
problemas en la salud humana.
Formacin de cepas Hfr (alta frecuencia de recombinacin y movilizacin del cromosoma) (figura 12).
Lillian Frioni
Mutaciones
El plsmido F de E.coli es conjugativo (es un episoma, o
sea se puede integrar al cromosoma) y tambin puede
movilizar el cromosoma durante el contacto clula-clula.
La conjugacin permitir la transferencia de grandes zonas de cromosoma del donante a la clula receptora. Las
clulas que poseen el plsmido F integrado por recombinacin a su cromosoma se denominan Hfr.
La presencia de un plsmido F altera propiedades de la
clula: capacidad para sintetizar el pili llamado F, facilitando la movilizacin.
E. coli F
(femenino)
E. coli F
(masculino)
cromosomas
bacterianos
F (factor de
fertilidad)
tubo de
conjugacin
clulas de
conjugacin
(copia de factor F)
transferida a clula F
Hfr masculino
F+ masculino
incorporacin
del factor F
factor F
doble hebra
cromosoma
doble hebra
Una mutacin es un cambio gentico heredable en la secuencia de bases de los cidos nucleicos de doble hlice del
genoma de un organismo. El mutante difiere de la clula parental en su genotipo, es decir, en los genes que el organismo posee. Pero adems, puede alterarse su fenotipo.
Una bacteria aislada de la naturaleza se refiere como tipo
salvaje. Una mutante puede obtenerse a partir de estas
cepas o de otras derivadas de ella, es decir de otra mutante. Se nombran por el:
Genotipo: ej: hisC indica uno de los genes de E. coli que
codifican para la sntesis de histidina, mutaciones en este
gen se refieren como hisC1, hisC2, etc.
Fenotipo: E.coli His+, significa que esta cepa puede sintetizar histidina, mientras que E. coli His-, no.
91
Mutantes nutricionales pueden ser detectados por la tcnica de replicacin en placa: se toma una copia de las
colonias creciendo en medio completo con un disco de
terciopelo o de papel de filtro. Esta copia se replica tocando la superficie de cajas con medio mnimo. Las colonias
del tipo parental crecen normalmente, mientras que las
de las mutantes, no lo hacen. Su lugar vaco (en la rplica) es seal de que corresponde a una mutante en el medio
completo. Esta se marca y se busca su homloga en el
medio original, se repica, purifica y se caracteriza.
Se designa como:
Prottrofa: a la cepa tipo salvaje de la cual deriv la
mutante
Auxtrofa: a la mutante nutricional que requiere factores de crecimiento, ejemplo auxtrofa para el triptfano,
vitamina B12, etc.
Las mutaciones pueden ser espontneas o inducidas.
Las espontneas ocurren por errores en la replicacin
del cromosoma, por recombinacin o por transposicin.
Si bien su frecuencia es baja, en cultivos densos, con varios millones de clulas, varias clulas/mL pueden ser mutantes. Las mutaciones pueden implicar cambios de una
o dos bases (mutaciones puntuales) o alteraciones que
incluyan varias pares de bases (deleciones, inserciones,
inversiones).
Mutaciones inducidas: ocurren por la accin de agentes
fsicos o qumicos que daan el ADN, induciendo la aparicin de mutaciones. Se habla de agentes mutagnicos.
Muchos son homlogos de bases, se copian pero luego
surgen errores de copia (bromouracilo, aminopurina). Otras
sustancias reaccionan con el ADN (cido nitroso, hidroxilamina), colorantes (acridinas, bromuro de etidio), radiaciones (UV, ionizantes, etc.).
Existe mutagnesis que ocurre sin el empleo de agentes
fsicos o qumicos, a travs del proceso conocido como
mutagnesis con transposones, donde la insercin de un
elemento transponible ocurre dentro de un gen, determinando en general la prdida de su funcin. La tecnologa
actual del ADN recombinante permite inducir mutaciones
especficas (mutagnesis dirigida a un sitio), en ciertos
genes que pueden ser luego insertados en clulas recipientes apropiadas. Las mutantes son seleccionadas y
empleadas en estudios especficos.
Finalmente, la figura 13 presenta un esquema que muestra las posibilidades de variabilidad gentica entre bacterias lo que explica su inmensa adaptacin a distintos ambientes, condiciones ambientales y situaciones extremas.
Por su alta frecuencia de transferencia horizontal de genes todas las bacterias compartiran un conjunto comn
de genes, que cada bacteria descarta o conserva segn
sus requerimientos. La ausencia de lmites claros de especie o de tiempo en la transferencia sexual permite una
muy rpida adaptacin a cambios ambientales. Esta enorme plasticidad gentica gener la biosfera actual y posibilit la existencia de los eucariotas.
HERENCIA VERTICAL
90
MUTACIN
TRANSFERENCIA
HORIZONTAL
DE GENES
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biologa de los microorganismos, 2000 Prentice Hall International
Prescott, Harley, Klein. Microbiologa, 1999 McGrawHill.Interamericana
www.fagro.edu.uy/microbiologia: Contenidos: Gentica de
procariotas
Preguntas de repaso
1) Concepto de bacterifago
Lillian Frioni
Mutaciones
El plsmido F de E.coli es conjugativo (es un episoma, o
sea se puede integrar al cromosoma) y tambin puede
movilizar el cromosoma durante el contacto clula-clula.
La conjugacin permitir la transferencia de grandes zonas de cromosoma del donante a la clula receptora. Las
clulas que poseen el plsmido F integrado por recombinacin a su cromosoma se denominan Hfr.
La presencia de un plsmido F altera propiedades de la
clula: capacidad para sintetizar el pili llamado F, facilitando la movilizacin.
E. coli F
(femenino)
E. coli F
(masculino)
cromosomas
bacterianos
F (factor de
fertilidad)
tubo de
conjugacin
clulas de
conjugacin
(copia de factor F)
transferida a clula F
Hfr masculino
F+ masculino
incorporacin
del factor F
factor F
doble hebra
cromosoma
doble hebra
Una mutacin es un cambio gentico heredable en la secuencia de bases de los cidos nucleicos de doble hlice del
genoma de un organismo. El mutante difiere de la clula parental en su genotipo, es decir, en los genes que el organismo posee. Pero adems, puede alterarse su fenotipo.
Una bacteria aislada de la naturaleza se refiere como tipo
salvaje. Una mutante puede obtenerse a partir de estas
cepas o de otras derivadas de ella, es decir de otra mutante. Se nombran por el:
Genotipo: ej: hisC indica uno de los genes de E. coli que
codifican para la sntesis de histidina, mutaciones en este
gen se refieren como hisC1, hisC2, etc.
Fenotipo: E.coli His+, significa que esta cepa puede sintetizar histidina, mientras que E. coli His-, no.
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Mutantes nutricionales pueden ser detectados por la tcnica de replicacin en placa: se toma una copia de las
colonias creciendo en medio completo con un disco de
terciopelo o de papel de filtro. Esta copia se replica tocando la superficie de cajas con medio mnimo. Las colonias
del tipo parental crecen normalmente, mientras que las
de las mutantes, no lo hacen. Su lugar vaco (en la rplica) es seal de que corresponde a una mutante en el medio
completo. Esta se marca y se busca su homloga en el
medio original, se repica, purifica y se caracteriza.
Se designa como:
Prottrofa: a la cepa tipo salvaje de la cual deriv la
mutante
Auxtrofa: a la mutante nutricional que requiere factores de crecimiento, ejemplo auxtrofa para el triptfano,
vitamina B12, etc.
Las mutaciones pueden ser espontneas o inducidas.
Las espontneas ocurren por errores en la replicacin
del cromosoma, por recombinacin o por transposicin.
Si bien su frecuencia es baja, en cultivos densos, con varios millones de clulas, varias clulas/mL pueden ser mutantes. Las mutaciones pueden implicar cambios de una
o dos bases (mutaciones puntuales) o alteraciones que
incluyan varias pares de bases (deleciones, inserciones,
inversiones).
Mutaciones inducidas: ocurren por la accin de agentes
fsicos o qumicos que daan el ADN, induciendo la aparicin de mutaciones. Se habla de agentes mutagnicos.
Muchos son homlogos de bases, se copian pero luego
surgen errores de copia (bromouracilo, aminopurina). Otras
sustancias reaccionan con el ADN (cido nitroso, hidroxilamina), colorantes (acridinas, bromuro de etidio), radiaciones (UV, ionizantes, etc.).
Existe mutagnesis que ocurre sin el empleo de agentes
fsicos o qumicos, a travs del proceso conocido como
mutagnesis con transposones, donde la insercin de un
elemento transponible ocurre dentro de un gen, determinando en general la prdida de su funcin. La tecnologa
actual del ADN recombinante permite inducir mutaciones
especficas (mutagnesis dirigida a un sitio), en ciertos
genes que pueden ser luego insertados en clulas recipientes apropiadas. Las mutantes son seleccionadas y
empleadas en estudios especficos.
Finalmente, la figura 13 presenta un esquema que muestra las posibilidades de variabilidad gentica entre bacterias lo que explica su inmensa adaptacin a distintos ambientes, condiciones ambientales y situaciones extremas.
Por su alta frecuencia de transferencia horizontal de genes todas las bacterias compartiran un conjunto comn
de genes, que cada bacteria descarta o conserva segn
sus requerimientos. La ausencia de lmites claros de especie o de tiempo en la transferencia sexual permite una
muy rpida adaptacin a cambios ambientales. Esta enorme plasticidad gentica gener la biosfera actual y posibilit la existencia de los eucariotas.
HERENCIA VERTICAL
90
MUTACIN
TRANSFERENCIA
HORIZONTAL
DE GENES
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biologa de los microorganismos, 2000 Prentice Hall International
Prescott, Harley, Klein. Microbiologa, 1999 McGrawHill.Interamericana
www.fagro.edu.uy/microbiologia: Contenidos: Gentica de
procariotas
Preguntas de repaso
1) Concepto de bacterifago
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Lillian Frioni
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ADN deriva del donante y la otra es recientemente sintetizada en la clula receptora durante el proceso de transferencia. El proceso requiere contacto clula-clula para
permitir el pasaje de una hebra del ADN de un plsmido
(se requiere una enzima que corte).
Una molcula complementaria de ADN se sintetiza entonces en la clula receptora. El factor F es un plsmido
conjugativo muy conocido que presenta alta eficiencia
en la transferencia. Las clulas que portan el plsmido F
se denominan F+ y las cepas sin el plsmido F, o sea
recipientes para ste, se denominan F. Cuando una
clula F+ transfiere el plsmido F a una receptora, sta
ltima se convierte en F+, o sea dadora en una conjugacin (figura 10).
F (femenino)
F+(masculino)
tubo de
conjugacin
Clula bacteriana
Clulas conjugando
(transferencia de una
copia del factor F)
Ciclo ltico
Clula transducida
Fago
Fago
Separacin de
clulas F+
Partcula
transductora
Partcula
transductora
Transformacin de
clulas F en F+
Sntesis de ADN
Transduccin
Recombinacin
gentica
La figura 11 (Madigan et al., 2000), muestra una microfotografa electrnica de dos clulas bacterianas unidas por
el pelo sexual o pili, que facilita la transferencia de material gentico por conjugacin.
Conjugacin
Es un proceso de transferencia gentica que involucra
contacto clula a clula. Es un mecanismo codificado por
plsmidos. Un plsmido conjugativo emplea este mecanismo para transferir una copia del mismo a una nueva
clula. La evidencia sugiere que una de las hebras del
Por este mecanismo ocurre la transferencia de resistencia a biocidas, como los antibiticos, ocasionando serios
problemas en la salud humana.
Formacin de cepas Hfr (alta frecuencia de recombinacin y movilizacin del cromosoma) (figura 12).
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Lillian Frioni
Las bacterias son escasamente transformadas por plsmidos, ya que stos deben permanecer con doble hlice
y circulares para replicarse. La figura 8 muestra la transformacin de una bacteria sensible a la ampicilina (Aps)
que se convierte en resistente (ApR) por la adquisicin de
un plsmido con esa resistencia.
Muchos ensayos se han realizado a los efectos de aumentar la competencia de ciertas bacterias de inters para
transformar, como por ejemplo tratarlas con altas concentraciones de iones calcio.
ApR
ApR
Transformacin
Seleccin Ap
Transformacin
El ADN libre (lisis celular) lineal se debe unir a la superficie
de la bacteria mediante una protena de unin, luego de lo
cual entran o bien las dos hebras o previamente una nucleasa degrada una de ellas y la otra entra en la clula. El
trozo de ADN se asocia a una protena especfica que evita
el ataque por nucleasas hasta su integracin con el ADN
con ayuda de una protena llamada RecA, mediante un proceso de recombinacin. En la replicacin de este ADN se
forma una clula igual a la parental y otra recombinante.
Transduccin
El ADN que se transfiere proviene de un virus y el proceso
puede ocurrir en dos formas:
93
La necesidad de agrupar y clasificar a los microorganismos surgi muy temprano en los estudios de la microbiologa. Los criterios empleados para agrupar, sobretodo con
las bacterias incluyeron categoras nutricionales (auttrofas, hetertrofas), caractersticas tintoriales (Gram negativas y Gram positivas), respuestas al oxgeno (aerobias,
anaerobias) rango de temperatura del crecimiento, etc.
La taxonoma (cuadro 1) clasifica a los organismos en
grupos (taxones) en base a similitudes, le asigna nombres a los mismos e identifica organismos desconocidos
(los ubica en algunos de los taxones definidos). La experiencia generada con la clasificacin de otros seres vivos,
como los animales y los vegetales ayud a construir una
aproximacin para el caso de los microorganismos y en
especial para las bacterias. La taxonoma es una ciencia
que requiere la determinacin de numerosos caracteres y
luego una interpretacin rigurosa de los mismos.
Se debe distinguir entre taxonoma e identificacin de
las bacterias. La primera conduce a una caracterizacin
exhaustiva, con aplicacin de la teora y los mtodos de
clasificacin, la formacin de grupos o taxones y su nomenclatura. La identificacin constituye el lado prctico
de la taxonoma, tiende a caracterizar a un aislamiento
por un nmero limitado de anlisis, seleccionados en general para el problema en cuestin, efecta comparacin
con especies conocidas y asigna el aislamiento a una especie conocida o aconseja un estudio taxonmico ms
profundo.
Especie: es la unidad taxonmica bsica y se define como
el grupo de organismos que tiene un alto grado de simili-
En las bacterias se habla ms de taxones que de especies, por la continua evolucin de caracteres morfolgicos y genticos. Las unidades de clasificacin de las bacterias o taxones presentan la siguiente jerarqua:
94
Lillian Frioni
87
Transformacin
donador
caracteres morfolgicos
tamao, forma, forma de agruparse de las
clulas en medio lquido
Crecimiento
Serolgicos
Reconocimiento por reacciones antgeno (somticos o flagelares de la bacteria) y anticuerpos especficos producidos contra esas molculas no presentes en animales de sangre caliente: conejos, cobayos, caballo
Ecolgicos, patolgicos y/o simbiticos
Asociaciones con animales, plantas, etc., efecto de
factores del ambiente
Genticos
Anlisis del nmero y tamao de los plsmidos, intercambio de genes mediante los procesos de recombinacin
Moleculares
Estudio de protenas y cidos nucleicos, muy desarrollados en la actualidad, proporciona valiosa informacin sobre relaciones entre microorganismos
receptor
Divisin celular
Transduccin
ADN en virus
caracteres tintoriales
coloraciones simples, diferenciales (Gram),
especficas (esporas, flagelos, etc.)
Fisiolgicos y metablicos
Empleo de fuentes de C, N, S, etc., formas de obtencin de energa, produccin de sustancias biticas (vitaminas) y abiticas (antibiticos)
ADN libre
Un dispositivo muy sencillo permite determinar el mecanismo por el cul se formaron recombinantes cuando dos
cultivos se ponen en contacto: en un tubo doblado en U
se siembran los cultivos, uno en cada rama, separados
por un filtro bacteriolgico, que deja pasar los bacterifagos, pero no a las clulas.
Si los cultivos se tratan previamente con ADNasa,
entonces el proceso no fue por transformacin ya
que el ADN libre est expuesto a la accin de la
enzima. Si igual ocurre recombinacin, debe ser por
alguno de los otros mecanismos de transferencia
horizontal.
Sin ADNasa, la recombinacin debe ocurrir por transduccin o por transformacin, ya que el filtro deja
Conjugacin
transferencia de
cromosoma
transferencia de
plasmidios
Recombinacin
Involucra intercambio fsico de material gentico entre
elementos genticos. Se generan nuevas combinaciones: se une lo que antes estaba separado y se separa
lo que antes estaba unido. Es un evento intracelular.
Se reconocen:
a)Recombinacin homloga o general: el intercambio se
realiza en segmentos extensos de secuencias homlogas o muy parecidas
b)Recombinacin especfica de sitio: el intercambio se
opera en segmentos muy cortos de secuencias especficas (ejemplo integracin del genoma fgico al cromosoma bacteriano).
c)Recombinacin ilegtima: es la transposicin: el intercambio se opera por salto a cualquier secuencia, al azar.
86
Lillian Frioni
repA
ori
tmp
CAGT 3
GTCA 5
95
Cuadro 3- Jerarquas en taxonoma. En este caso simplificado se cita el ejemplo de los miembros del gnero
Shigella y sus rangos taxonmicos superiores.
replicn bsico
(replicacin)
KmR (kanamicina)
Figura 5- Transposones
ApR (ampicilina)
regin tra
(transferencia
conjugativa
RTF
Resistance
Transfer
Factor
R-det
Resistance
determinants
SmR (estreptomicina)
SuR (sulfonamida)
CmR (cloranfenicol)
parA parB
En resumen: las bacterias presentan la informacin gentica esencial en el nucleoide, falso ncleo tambin llamado cromosoma bacteriano y pueden contener informacin gentica adicional, no fundamental, en plsmidos,
profagos y transposones. Estos ltimos, al no ser esenciales, pueden variar mucho en nmero y contenido de
ADN y son responsables de la mayor parte de los cambios genticos en bacterias.
Figura 4- El plsmido R
1
Los bacterifagos
Son virus que atacan a bacterias (captulo 2) y su multiplicacin est asegurada por un ciclo ltico y otro lisognico.
Intervienen por lo tanto en la lisis celular (ciclo ltico) o en
la incorporacin de material gentico a clulas bacterianas (ciclo lisognico).
Caracteres clsicos
Los caracteres morfolgicos, fisiolgicos, bioqumicos,
ecolgicos y genticos han sido empleados en taxonoma
Caracteres morfolgicos
Son muy empleados en taxonoma ya que resultan fciles
de estudiar, son bastante estables por ser la expresin de
numerosos genes, suelen ser estables del punto de vista
gentico y en general, sobretodo en los eucariotas, no
varan mucho con el ambiente. El cuadro 4 presenta algunos de los caracteres morfolgicos empleados.
Grupos microbianos
Muy empleados en todos los grupos microbianos
Todos los grupos principales
Todos los grupos principales
Bacterias, algunos hongos
Todos los grupos principales
Bacterias deslizantes, espiroquetas
Bacterias formadoras de endosporas
Algas, hongos
Todos los grupos principales
Todos los grupos principales
96
Lillian Frioni
Los perfiles metablicos de poblaciones de inters se pueden evaluar en sistemas comerciales como el Biolog, donde se siembra el aislamiento en una placa con numerosos orificios, cada uno con una fuente de carbono diferente. Luego de la incubacin la placa se lee en un lector
electrnico (aparece color donde hubo crecimiento y utilizacin del sustrato).
85
Gentica de microorganismos
procariotas
Caracteres ecolgicos
Caracteres fisiolgicos y metablicos
Estos constituyen una importante contribucin en la taxonoma ya que estn directamente relacionados con las
enzimas microbianas y las protenas de transporte. Como
las protenas son resultado de sntesis gnica, estos estudios metablicos permiten una comparacin indirecta
de los genomas microbianos. En el cuadro 5 se muestran
algunas de determinaciones ms empleadas.
Son propiedades que afectan la relacin de los microorganismos con el ambiente, como las relaciones simbiticas, la produccin de enfermedades en un husped especfico, las preferencias de habitat, las necesidades de
ciertos rangos de temperatura, pH, O2, concentracin osmtica. Algunas caractersticas de crecimiento se consideran tambin caracteres fisiolgicos.
Caracteres genticos
Cuadro 5- Caracteres fisiolgicos y metablicos
usadas en la clasificacin microbiana
Fuentes de carbono, nitrgeno, azufre, de energa, etc.
Componentes de la pared celular
Tipos de fermentacin y productos finales
Clasificacin nutricional
Efectos de factores del ambiente: temperatura,
pH, gases, solutos, etc. Valores ptimos y rangos
Produccin de luz (luciferasa)
Metabolismos bioenergticos
Pigmentos fotosintticos
Necesidades y tolerancia a la sal
Metabolitos secundarios: antibiticos, toxinas,
pigmentos
Sensibilidad a inhibidores metablicos y antibiticos
Inclusiones citoplasmticas: fosfatos, azufre,
fenoxialcanos
Los estudios llevan en general tiempo ya que el microorganismo en estado puro se cultiva en medios con sustratos especficos. Se evala el empleo de algunos de ellos
(azcares, nitratos, etc.) por la desaparicin del mismo y/
o por la aparicin de productos finales del metabolismo.
Resultan de indudable aplicacin en la taxonoma de eucariotes, donde la especie se define en trminos de reproduccin sexual. En procariotas, el fenmeno es fragmentario, pero de todas formas se realizan grandes avances en el estudio de intercambio de genes mediante la
recombinacin (transformacin, transduccin, conjugacin) (captulo 5). La primera ocurre principalmente entre
especies bacterianas diferentes, pero raramente entre
gneros. Se han realizado estudios de transformacin con
varios gneros: Bacillus, Micrococcus, Rhizobium y otros.
Pero, puede suceder que no ocurra transformacin por
motivos diferentes a la homologa del ADN.
Cromosoma bacteriano
El genoma bacteriano es haploide, est constituido por
una molcula de ADN autorreplicativa (replicn), de 1.000
a 6.000Kb (4.700Kb en E. coli) y alberga la mayor informacin gentica esencial de la clula (figura 1).
monocopia, oligocopia o multicopia. Sus principales funciones no estn relacionadas a metabolismos fundamentales para la viabilidad de la clula, sino que albergan genes que codifican para funciones accesorias como ser
resistencias a antibiticos, fungicidas, metales pesados,
etc. Son empleados como vectores de informacin gentica y la clula al dividirse por fisin binaria asegura previamente la duplicacin de sus plsmidos, ya que stos
contienen un replicn bsico que hace posible que se
dupliquen las copias plasmdicas antes de la divisin celular (figura 3).
Bases
Replicacin
La conjugacin se ha empleado mucho en estudios taxonmicos. As entre las bacterias entricas, Escherichia
puede conjugar con los gneros Salmonella y Shigella,
pero no con Proteus ni Enterobacter, lo que concuerda
con otros datos que muestran que los tres primeros gneros estn ms estrechamente relacionados entre si que
con los otros dos restantes.
El nmero y tipo de plsmido presente en clulas bacterianas tambin se emplea con fines taxonmicos, ya que
Particin
Azcar
Los plsmidos estn formados por ADN circular, de doble hlice, son replicones, su nmero de copias es carcterstico y vara de una clula a otra. El tamao de un
plsmido y su nmero por clula se usan como carcter
taxonmico (figura 2).Una clula puede tener plsmidos
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Lillian Frioni
Caractersticas moleculares
Los abordajes ms modernos en la taxonoma se basan
en los anlisis de protenas y cidos nucleicos, que brindan importante informacin sobre relaciones entre microorganismos.
Comparacin de protenas
Las secuencias de aminocidos en las protenas son reflejo de las secuencias de ARNm y por lo tanto estn relacionados con los genes que las codifican. Se determina la secuencia de aminocidos de protenas con la misma funcin
(si stas son similares, es muy probable que los organismos que las poseen estn estrechamente relacionados).
Como estos estudios son largos y caros, se han empleado tcnicas indirectas de comparacin de protenas, como
la movilidad electrofortica de las mismas, o el empleo de
anticuerpos especficos que permiten distinguir protenas
muy similares.
97
G + C x100
G+C+T+A
* gradiente de CsCl
* desnaturalizacin trmica
criterio de exclusin: % GC > 3 dos especies
diferentes
% GC > 10 dos gneros
diferentes
Hibridacin ADN-ADN
- depende de la secuencia
- determinacin por:
* % hibridacin de ADN1 marcado con ADN2
* < T del hbrido y del cultivo puro
m
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Lillian Frioni
ADN simple
A
b
s.
ADN doble
220
260
Longitud de onda
300
ADN simple
desnaturaliza
A
b
s.
Tm =
ADN doble
80
90
temperatura
100
Algas
Protozoos
Mohos mucosos
Hongos
38-79
20-60
20-40
30-66
Procariotas:
Actinomyces
Bacillus
Escherichia
Pseudomonas
Salmonella
25-80
59-73
32-62
48-52
58-70
50-53
A-Filtros de membrana
Son discos de steres de celulosa con poros pequeos que
evitan el paso de los microorganismos (0,45, 0,22 micras).
Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamao del
poro. Son desechables. Adems de usarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico de
aguas ya que concentran los microorganismos existentes
en grandes volmenes de agua (figura 22).
B- Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) estn compuestos por pliegues de acetato de celulosa que retienen
las partculas (incluidos los microorganismos) del aire que
sale de una cmara de flujo laminar (figura 23).
para los microorganismos de manera que pueda ser fcilmente eliminado del objeto esterilizado luego del tratamiento. Normalmente se usa el xido de etileno, un lquido que hierve a 10,7C y se usa en la industria para esterilizar placas de Petri, jeringas y otros objetos de plstico
que se funden a temperaturas superiores a los 100C.
Debido a su alto poder de penetracin estos objetos se
empaquetan primero y luego se esterilizan. El xido de
etileno acta inactivando enzimas y otras protenas con
grupos sulfhidrilos (R-SH) en reaccin de alquilacin
(R-S-CH2CH2O-H).
2- Glutaraldehdo: una solucin acuosa al 2% presenta
amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y hongos.
Se usa en medicina para esterilizar instrumentos pticos
y otros.
Bibliografa
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biologa de los
Microorganismos, 2000. Prentice Hall International.
Prescott, Harley, Klein. Microbiologia, 1999. McGraw-Hill.
Interamericana.
www.fagro.edu.uy/microbiologia, Guia de prcticos, 2005.
Figura 22- Filtros bacteriolgicos descartables
Preguntas de repaso
Para organismos no tan relacionados se emplea la hibridacin del ARN (ribosomal o de transferencia, radiactivo)
con ADN. Se usan los ARN ya que los genes que codifican a estas molculas no han evolucionado tan rpidamente como la mayora de los genes microbianos.
Figura 23- Filtros para aire
Secuenciacin de los cidos nucleicos: las estructuras genmicas se comparan en la actualidad mediante la
secuenciacin del ADN y el ARN. La mayor atencin se
ha focalizado en la secuenciacin de fracciones conservadas del ARN, como la 5S y 16S, aislados de las subunidades 50S y 30S de los ribosomas bacterianos.
83
82
Lillian Frioni
Bajas temperaturas
Si bien el metabolismo microbiano est inhibido debajo
de 0C, estas temperaturas no matan a los microorganis-
mos, sino que pueden conservarlos durante largos perodos de tiempo. Se usa para conservar microorganismos
indefinidamente. Los cultivos se conservan congelados a
-70C o en recipientes con nitrgeno lquido a -196C. La
mezcla con 30-50% de glicerol, baja el punto de congelamiento de los cultivos y evita mortandad.
B- No ionizantes
Luz ultravioleta: La porcin UV del espectro incluye a
radiaciones desde 15 a 390nm. Las radiaciones con longitudes de onda de 265nm son las de mayor efecto bactericida (200-295nm). Se usan en cmaras de siembra, en
cmaras de flujo laminar y para tratar superficies contaminadas en industrias de alimentos y leche. Posee poca
capacidad para penetrar la materia por lo que slo los
microorganismos que se encuentran en la superficie de
los objetos son susceptibles de ser destruidos.
99
Filogenia bacteriana
La taxonoma bacteriana evoluciona muy rpidamente con
los conocimientos sobre la biologa de las bacterias, la
aplicacin de mtodos moleculares al estudio de las relaciones filogenticas entre grupos bacterianos, ayudados
con importantes aplicaciones de las tcnicas de la informtica. El cuadro 8 resumen estos avances y el cuadro 9
presenta algunos de los segmentos de cidos nucleicos
empleados en estos estudios y la metodologa aplicada.
Se considera que la similitud en molculas implica similitud en los genes. Cuanto ms reciente es el ancestro comn, se encuentra mayor similitud y relaciones entre los
microorganismos segn la similitud en los genes. Se emplean tcnicas de hibridacin ADN-ADN y de comparacin de genes especficos.
Tamao
(nucletidos)
5S
16S
23S
120
1500
2900
Ubicacin
Subunidad mayor del ribosoma
Subunidad menor
Subunidad mayor
Secuencias de 16SrARN
Estructura primaria: mosaico de dominios que varan
en trminos del grado de conservacin de la secuencia
primaria de nucletidos.
- Dominios de conservacin universal
- Dominios de nivel intermedio de conservacin, con cambios de secuencia, pero con conservacin de la estructura secundaria
- Regiones altamente variables
Estructura secundaria:
similar en todos los organismos
acotada por su funcin
sntesis de protenas: funcin ancestral
Metodologa
transcriptasa reversa
PCR
Secuencias de 16SrARN
100
Lillian Frioni
El cuadro 10 resume algunas de las estructuras y/o funciones que se emplean en estudios filogenticos dada su
estabilidad gentica y el cuadro 11 presenta las ventajas
del anlisis de la fraccin 16S del r ARN.
Arboles filogenticos
Efectos del ambiente en la esterilizacin
La figura 2a (Prescott et al., 1999) muestra que el microorganismo A est ms relacionado con C que con D y B,
pero no da datos sobre un ancestro comn ni direcciones
de cambio. En b se muestra un rbol con raz que presenta un nudo que sirve de antecesor comn y muestra el
desarrollo de las cuatro especies desde esta raz.
Tipo de microorganismo: las clulas vegetativas en desarrollo son mucho ms susceptibles que las esporas.
81
120
Lillian Frioni
101
Bacteria
Archaea
Eucarya
Peptidoglicano
Lpidos de la membrana
Ribososmas +ARN iniciador
Intrones en ARNt
ARN polimerasa
si
Enlaces ster
70S
formilmetionina
no
Una (4 subunidades)
no
Enlaces eter
70S
metionina
si
Varias (8-12 subunidades)
no
Enlaces ster
80S
metionina
si
Tres (12-14 subunidades)
Ribosoma sensible a:
Toxina diftrica
Cloranfenicol
Kanamicina
Estreptomicina
No
Sensible
Sensible
No
Sensible
No
Otra aproximacin ms moderna es la taxonoma polifsica que busca el consenso en la integracin de distintos
tipos de caracteres:
* Fenotpicos:
* Genotpicos:
102
Lillian Frioni
Apndice
La ltima edicin del Manual Bergey
Ha habido un progreso considerable en el dominio de la
taxonoma bacteriana desde 1984, fecha de la publicacin del primer volumen del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. El nmero de especies descriptas se ha
duplicado y hay ms de 170 gneros nuevos, gracias a la
secuenciacin del ARN ribosomal, del ADN y de las protenas.
La segunda edicin del Manual Bergey (2001) es fundamentalmente filogentica en lugar de fnica (figura 3 y
resumen en cuadro 13) (Prescott et al., 1999).
Los microorganismos
en los ciclos biogeoqumicos
8 Ecologa microbiana y mtodos de estudio .................................. 121
9 Ciclo biolgico del carbono ........................................................... 143
10 Ciclo biolgico del nitrgeno ......................................................... 169
11 Fijacin biolgica del nitrgeno (FBN) .......................................... 191
12 Ciclos biolgicos del azufre, fsforo, hierro. ................................. 211
Figura 3- Filogenia en Eubacteria: rbol basado en comparaciones del segmento 16S del ARN ribosomal
119
118
Lillian Frioni
Bibliografa
Dommergues, Y. y F. Mangenot, Ecologie Microbienne
du Sol, 1970, Masson & Cie. Pars.
Frioni, L. Procesos Microbianos, 1999 Fundacin de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina.
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biology of Microorganisms 2000 Prentice Hall International.
Prescott-Harley-Klein, Microbiologa, 1999 Mc Graw-Hill
Interamericana.
www.fagro.edu.uy/microbiologa/protistas superiores
Preguntas de repaso
Figura 7- Clulas de levaduras gemando (seudomicelio)
Rol en el suelo
No es bien conocido: se los considera como organismos
glucoflicos relacionados a la materia orgnica poco transformada, utilizan nitratos y azcares simples u oligosacridos, pero son incapaces de degradar glcidos complejos, tal vez con excepcin de las pectinas. Las levaduras
del gnero Lipomyces parecen una excepcin ya que pueden desarrollarse a dbiles dosis de nitrgeno, con lo que
pueden degradar mucho ms carbono orgnico, y parecen favorecidas por cidos hmicos. En la naturaleza se
las encuentra frecuentemente asociadas a bacterias fijadoras de N2 aerobias, sobre las que ejercen efecto estimulante.
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
Gneros representativos
Fusobacterium.
103
Bibliografa
ASM Methods for General and Molecular Bacteriology, 1994.
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biologa de los
microorganismos, 2000. Prentice Hall International.
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2001.
Prescott, Harley y Klein, Microbiologa, 1999 McGrawHill. Interamericana.
The prokaryotes, 2nd ed. 1992.
Preguntas de repaso
1) Resuma las ventajas de emplear las caractersticas
morfolgicas, fisiolgicas/metablicas, ecolgicas,
genticas y moleculares, en la clasificacin e identificacin.
2) Se le presenta el caso de dilucidar si dos aislamientos
de bacterias aisladas de ndulos de trbol son de la
misma especie. Qu caracteres les determinara?
En qu momento usara estudios de su ADN?
3) Conceptos de: taxonoma y filogenia.
4) Qu se entiende por caracteres morfolgicos?
Resultan ms tiles en estudios taxonmicos de
bacterias o de hongos? Por qu?
104
Lillian Frioni
Levaduras
Si bien el trmino levadura no tiene significado taxonmico, es muy empleado para designar a aquellos hongos de
estructura unicelular y que se reproducen por fisin binaria o gemacin. Los gneros ms encontrados en el suelo
son: Cndida, Hansenula, Lipomyces, Pichia, Pullularia,
Rhodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces, Torula,
Zygosaccharomyces. (figura 7).
Ciertas cepas tolerantes a altos niveles de azcares, capaces de realizar activas fermentaciones, se describieron
en el suelo, pero no parecen ser habitantes normales, sino
que llegan a l con frutos y restos vegetales. Generalmente
se describen poblaciones de 103/g en reas templadas, pero
no es posible correlacionar su nmero con caractersticas
climticas o de suelo, y su rol en las transformaciones de
la materia orgnica o mineral no est definido.
117
Saccharomyces cerevisiae, principal agente de la fermentacin alcohlica, es una levadura ascomicete. En cierto
estado de su desarrollo la gemacin cesa y la clula vegetativa se transforma en un asco, cada una con 4 ascos-
116
Lillian Frioni
(mtodo tambin empleado en la lucha contra fitopatgenos). Como se observa en el cuadro 4, en condiciones de
sequedad, las especies que pueden esporular, lo hacen y
la mayor proporcin de estructuras fngicas las constituyen las esporas. La humedad favorece la germinacin de
stas y el desarrollo del micelio.
Aireacin: algunas especies pueden desarrollarse a bajos niveles de O2, pero en general un extremo de la hifa
accede al aire. Son aerobios y su dependencia frente a
este gas explica su mayor concentracin en los primeros
centmetros del suelo y su ausencia en niveles inferiores
en suelos mal drenados, en barros y estuarios. Las esporas pueden soportar largos perodos de inundacin; al drenar el suelo, los hongos retornan rpidamente a su posicin de importancia.
Ecologa
Los factores ecolgicos ms importantes son: nivel y naturaleza de la materia orgnica, pH, fertilizantes orgnicos y minerales, humedad, aereacin, temperatura, profundidad, estacin del ao y cubierta vegetal.
El nmero de hongos filamentosos vara directamente con
el contenido de materia orgnica. El agregado de restos
vegetales estimula la poblacin fngica y altera la composicn de la flora; ciertos gneros se hacen dominantes:
Penicillum, Trichoderma, Aspergillus, Fasarium, Mucor.
Algunas especies mantienen su nmero alto por perodos
relativamente largos, en medios cidos los hongos son la
microflora dominante cuando se agrega materia orgnica
y el nivel de nitrgeno es adecuado.
El pH es uno de los factores principales que gobiernan su
actividad y composicin. Muchas especies se desarrollan
en amplio rango de pH, en medio de cultivo lo hacen desde pH 2-3 hasta 9,0 o superior. Dominan en ambientes
cidos por falta de competencia de bacterias. Algunas
especies son ms sensibles a la acidez que el resto de la
comunidad y la acidificacin del suelo puede ser un mtodo de lucha, cuando se trata de hongos fitopatgenos.
Otros hongos prefieren la neutralidad o bien ambientes
alcalinos. El ptimo como grupo se sita en la vecindad
de pH 6.
Humedad: si sta es excesiva y la difusin del oxgeno
est limitada, los hongos son los primeros perjudicados
total
hifas
esporas
esporas
% del total
8,9
18,9
24,2
27,1
99
142
149
173
60
113
133
153
39
29
16
20
79
20
10
12
Temperatura: la mayora son mesfilos, pero el desarrollo termfilo no es infrecuente. En el suelo los termfilos
son escasos, pero son abundantes cuando la temperatura asciende por respiraciones (compost).
Profundidad: en suelos cultivados, los hongos son ms
abundantes en las capas superiores, pero pueden alcanzar gran densidad en los horizontes B de pasturas (ms
de 1 m), siguiendo la concentracin de la materia orgnica: son cepas adaptadas a bajas concentraciones de O2
o altas de CO2. El efecto de la profundidad sobre la abundancia y composicin de la flora fngica est asociado
con la concentracin de materia orgnica y la composicin de la atmsfera del suelo.
Estacin del ao: los meses clidos de primavera son
usualmente benficos pero el excesivo calor y sequedad
105
Este grupo comprende a un conjunto muy diverso de organismos cuyo estudio ha sido abordado por distintas disciplinas: Ficologa, Micologa y Protozoologa. Esta diversificacin se explica por el hecho de que los botnicos
reconocieron a las algas y a los hongos como plantas y
los zologos a los protozoos como animales. La caracterstica comn es la presencia de clula eucariota, son por
lo tanto microorganismos eucariotas.
Actualmente se reconocen como microorganismos, organismos muy simples, que han permanecido a travs de la
evolucin adaptndose a las condiciones modernas. Los
representantes ms especializados, como un alga de mar,
un ciliado, un moho, pueden ser asignados rpidamente
a las algas, protozoos y a los hongos, respectivamente.
Sin embargo, existen numerosos protistas superiores incluidos arbitrariamente en algn grupo, como el caso del
gnero Euglena, ubicado entre las algas y los protozoos.
En trminos generales:
Las algas pueden definirse como organismos con fotosntesis oxignica y que poseen cloroplastos. Pueden ser
unicelulares, filamentosas o cenocticas, algunas poseen
aspecto de planta debido al extensivo desarrollo multicelular, pero no se diferencian en tejidos ni rganos; por lo
general la especializacin celular se da en el caso de la
reproduccin. No deben confundirse con las cianobacterias, que tambin realizan fotosntesis oxignica, pero que
son bacterias y evolucionaron como ellas.
Los protozoos y los hongos son organismos no fotosintticos y la diferencia entre ellos es de carcter estructural;
los protozoos son predominantemente unicelulares y los
hongos, sobre todo cenocticos, se desarrollan dando origen a una estructura filamentosa y ramificada, el micelio.
El cloroplasto es el organelo clave en las relaciones entre los tres grupos. Se puede perder irreversiblemente,
dando origen a las algas incoloras o leucocitos, que se
desarrollan con nutrientes minerales simples, a la luz. As,
a partir de algas unicelulares, es fcil distinguir formas
que dependen de procesos fermentativos o respiratorios
para su nutricin, como los protozoos.
La separacin es muy marcada entre algas y protozoos en
estructura celular y fisiologa, pero a los evolucionistas les
resulta ms difcil vincular a los protozoos con los hongos:
los primeros son uniformemente unicelulares y mviles y
los hongos predominantemente cenocticos e inmviles, y
su hbitat fundamental es el suelo. No obstante, es necesario recordar que las formas primitivas son acuticas y
poseen esporas flageladas (zoosporas). Para los hongos
del suelo, el viento es la principal forma de propagacin.
Las algas
El suelo no es un hbitat ptimo para las algas (figura 1),
que prefieren los ambientes acuticos. Sin embargo, la
ficoflora terrestre est integrada por numerosas especies
unicelulares y filamentosas, cuya distribucin est ligada
a tipos pedolgicos y a la cubierta vegetal. En condiciones extremas, estos productores primarios (PP) de
materia orgnica pueden desempear un rol fundamental. La taxonoma que se emplea es la de los botnicos
(Talofitas) y se basa en propiedades celulares:
106
Lillian Frioni
multicelulares, de aspecto de planta. El mayor y ms variado grupo es el de las algas verdes (Chlorophyta), de
los cuales se originaron probablemente las plantas, incluye organismos unicelulares y hasta multicelulares con
aspecto de vegetal.
Oidios
Ascospora
Basidiospora
Aplanosporas
Zoosporas
Chlorophyta
algas verdes
Euglenophyta
euglenoides
a y b, sin pared, paramiln y grasas, 1, 2, 3 flagelos por
fotosintticos clula, unicelulares
Phyrrophyta
dinoflagelados a y c y carotenoides especiales, celulosa, almidn y aceites,
2 flagelos diferentes en forma y posicin, la mayora
unicelulares, pocas filamentosas
Chrysophyta
Algas amarillo- a+/-c y carotenoides especiales, 2 mitades superpuestas
verdosas,
de slice, otras sin pared, aceites, 2 flagelos por clula,
diatomeas
unicelulares, filamentosas, cenocticas
Phaeophyta
algas pardas, a y c, carotenoides especiales, celulosa y algina, grasas y
dinoflagelados luminarina, 2 flagelos de distinta longitud, pluricelulares
Rhodophyta
algas rojas
(Plantae)
Conidias
Clamidospora
Zoosporangio Esporangio
Grupo
10
Esporangiosporas
Esporangiforo
Hifa
vegetativa
Oidiforo
Asca
Basidiospora
Conidiforo
100
Myxomycota
Subdivisiones: Myxomycotina: clases como Myxomycetes, sin pared celular, cuerpo ameboide (plasmodios de
vida libre), masa multinuclear de protoplasma sin paredes definidas. Diploides, fructifican dando oosporas flageladas en la meiosis. Parecidos a los protozoos con
nutricin holozoica.
Eumycota
Hongos verdaderos, con paredes de celulosa o quitina,
estructura tpicamente filamentosa, algunos unicelulares.
Reproduccin sexual o asexual, esporas sin flagelos. Se
distinguen las clases:
a. Chytridiomycetes: variedad de talos, clulas mviles
con un solo flagelo posterior tipo ltigo, acuticos,
parsitos.
b. Oomycetes: hongos con micelio cenoctico bien desarrollado, cuyas clulas mviles poseen dos flagelos
dirigidos en direcciones opuestas: uno de tipo ltigo y
el otro cepillo. Reproduccin sexual: se forma una espora de resistencia (oospora) a partir de la osfera
fecundada, con pared celulsica. Parsitos y saprfitos acuticos.
c. Zygomycetes: hongos saprfitos o parsitos con micelio cenoctico o septado bien desarrollado. Reproduccin sexual por fusin de gametangios generalmente iguales que forma una espora de resistencia (zigospora). No producen clulas mviles.
115
d. Trichomycetes: hongos con talo cenoctico filamentoso simple o ramificado adherido al tracto digestivo y
cutcula externa de artrpodos vivos. Reproduccin
asexual por variedad de esporas. Reproduccin sexual
conocida como en los Zygomicetes.
e. Ascomycetes: hongos que forman esporas dentro de
estructuras especiales en forma de saco (asca) como
resultado de la cariogamia y meiosis. Las ascas se presentan libres o en fructificacin ms generalmente en
el tejido infectado.
f. Basidiomycetes: hongos que forman esporas resultantes de cariogamia y meiosis sobre la superficie de
estructuras especiales llamadas basidios.
g. Deuteromycetes: grupo en el cual se coloca a los hongos que por su estructura general y reproduccin
asexual se parecen a los Ascomycetes, pero no se ha
observado el estado sexual. Tambin llamado Fungi
imperfecti, incluyen a numerosas levaduras.
Funcin en el suelo
Los hongos son activos degradadores de sustratos
carbonados y su rol esencial es la mineralizacin de fuentes complejas de carbono, atacando gran volumen de residuos con poco nitrgeno. Predominan as en suelos
pobres, sobre restos vegetales frescos y sobre todo en
plantas maduras donde la C/N puede ser muy alta.
Segn los sustratos que emplean se distinguen los:
hongos glucoflicos, sobre todo al estado de esporas
con alto poder germinativo y rpido crecimiento. Son
los primeros en atacar sustratos frescos; cuando las fracciones fcilmente atacadas se agotan, el hongo fructifica y permanece en estado de latencia (Mucorales, Penicillum).
hongos que degradan la lignina, las fracciones ms
resistentes, sobre todo Basidiomycetes
patgenos verdaderos; slo una fraccin pequea de
los hongos que crecen o sobreviven en el suelo, como
Fusarium, Phytium, Ophiobulus, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillum.
Hongos patgenos del hombre pueden llegar al suelo,
sobre todo en la zona tropical y la infeccin se generaliza fcilmente en la poblacin. Una tcnica comn para
detectarlos y aislarlos es colocar una hebra de cabello
estril en el suelo, el hongo lo coloniza, pues emplea la
queratina.
114
Lillian Frioni
Reproduccin sexual
Comprende las tres etapas fundamentales:
plasmogamia (unin de dos protoplastos y los ncleos
haploides)
cariogamia (formacin de un zigote diploide)
divisin meitica (reduccin cromosmica).
Los hongos se dividen por su sexualidad en:
hermafroditas (rganos + y - en el mismo talo)
dioicos (en talos distintos)
indiferenciados (no se diferencian los sexos).
Taxonoma
Los criterios empleados en la clasificacin de este grupo
heterogneo incluyen caracteres morfolgicos casi exclusivamente:
naturaleza del micelio (tabicado o no)
tipo de reproduccin sexual
naturaleza de las esporas asexuadas (internas en
gametangio) y externas (conidios) (cuadro 3 y
figura 6).
Subdivisin
Clase
Mixomycotina
Mastigomycotina (esporas
asexuales flageladas)
Chrytridiomycetes
Oomycetes (antiguos Phycomycetes)
Zygomycotina (miceliales,
cenocticos, esporas asexuales
en esporangio)
Hemiascomycetidae
Hyphomycetes antiguos
Deuteromycetes
107
sinttica; si bien pueden obtener energa de su actividad fotosinttica, no pueden obtener el poder reductor
para convertir el CO2 en materiales celulares.
osmotrfas, muchas algas que realizan fotosntesis normal en la luz, pueden crecer en la oscuridad a expensas
de variedad de compuestos orgnicos, derivando su metabolismo hacia la respiracin. Las algas completamente
encerradas en pared celular dependen exclusivamente de
sustratos orgnicos disueltos en la oscuridad
fagotrfas, aquellas clulas desprovistas de pared o
que no estn completamente encerradas en ella, pueden predar bacterias u otros microorganismos.
No es correcto, entonces, describir a las algas como grupo exclusivamente fotosinttico, ya que muchos de sus
miembros unicelulares poseen las caractersticas nutricionales de los protozoos y de los hongos. Los leucofitos
que se forman por la prdida irreversible del cloroplasto,
son organismos no pigmentados derivados de grupos flagelados, de diatomeas y de formas inmviles de las algas
verdes unicelulares. No pueden fotosintetizar.
En el laboratorio, esta transicin pudo ser demostrada
experimentalmente, en ciertas cepas de Euglena, al ser
tratadas con estreptomicina o cuando son expuestas a
pequeas dosis de luz ultravioleta o a altas temperaturas.
La clasificacin de los leucofitos es un problema difcil:
por su estructura pueden ser asignados a una divisin
particular de algas, como representantes no fotosintticos. Pero como son eucariotas unicelulares no fotosintticos, pueden ser mirados como protozoos, y son incluidos
entre ellos por los zologos. Constituyen un grupo de transicin entre las algas y los protozoos.
Ecologa
Nutricin
108
Lillian Frioni
En ambientes con insolacin muy intensa, las algas tienden a concentrarse algunos centmetros debajo de la superficie. All se protegen debajo de minerales translcidos
como cuarzo o dolomita, de las radiaciones solares y de
la desecacin (sobre todo la ficoflora de los desiertos) y
contra el fro intenso en las regiones polares. Las radiaciones ultravioleta no son perjudiciales, de modo que son
empleadas en su aislamiento, eliminando los contaminantes bacterianos.
La humedad: las algas verdes son muy exigentes en agua
y a medida que aumenta la aridez, el nmero de especies
y su densidad disminuyen. Otras algas, por el contrario,
soportan mal la inundacin. El ptimo se sita, como para
otros grupos de microorganismos, alrededor del 40-60%
de la capacidad de campo. En la superficie de suelos agrcolas de la zona templada, la disponibilidad de agua para
las algas suele ser limitante. Las clulas se recubren de
capa muscilaginosa muy higroscpica que puede retener
10-15 veces su volumen en agua, la que es perdida muy
lentamente.
El efecto de la estacin del ao es marcado, en primavera su nmero es bajo; el congelamiento las perjudica y en
invierno la poblacin declina.
El efecto del pH vara con el tipo de suelo; en general las
algas son poco sensibles a las variaciones de pH. Los
valores prximos a la neutralidad o ligeramente alcalinos,
son ms favorables. En suelos cidos dominan las clorofceas, que se pueden encontrar a pH 5,0 y aun 4,0 (el ptimo para su desarrollo se sita entre pH 6,8 y 8,5), aunque
se encuentran en pH 9,3-10 y toleran hasta pH 13.
Antagonismos: muchas especies son susceptibles al ataque por bacterias, hongos, estreptomices, que con enzimas especficas destruyen la pared celular. Otros antagonismos ocurren con nemtodos, termites.
Funciones
Los protozoarios
Constituyen un grupo muy heterogneo de eucariotas, unicelulares y mviles, cuyo tamao vara entre algunas micras hasta algunos centmetros (figura 2) (Madigan
et al, 2000) y (figura 3). Los habitantes del suelo son de
talla ms pequea y aplanados, ya que deben moverse en
el film de agua que llena los poros. Presentan semejanzas
con varias divisiones de algas de las cuales derivan. Los
varios tipos de leucofitos proveen de pruebas sobre el origen evolucionario de muchos grupos de protozoos. La prdida de la capacidad fotosinttica reduce abruptamente la
potenciabilidad nutricional y es seguida de una serie de eventos a nivel celular que posibilitan al organismo el desarrollo
de nuevos mecanismos de nutricin osmotrfico o fagotr-
Las fuentes de carbono son variables, emplean de preferencia azcares, almidn y algunos celulosa y lignina. Con
respecto al nitrgeno, asimilan formas minerales y/o orgnicas (las ltimas de preferencia). Almacenan glucgeno y aceite. Especies de Penicillum (moho verde) y de
Rhizopus (moho negro) se desarrollan sobre cualquier tipo
de sustrato hmedo (aun en el refrigerador a 5C); otros
utilizan sustratos ms especficos, encontrndose en el
extremo de la escala a los parsitos obligados, que requieren determinada variedad vegetal.
Habitat
Los hongos estn muy distribuidos en todos los ecosistemas, desde 0 a 25C, aunque pocos a 0C y con un mximo de 50C. Para los hongos del suelo el ptimo se ubica
entre 20-30C, en pH muy variados: el ptimo para el grupo estara en la vecindad de pH 6 y dominan en ambientes cidos, por falta de competencia por parte de las bacterias. La luz es esencial para la esporulacin de muchas
especies y para la dispersin de esporas fototrficas. Las
esporas permiten una amplia distribucin. Como grupo son
aerobios pero algunos soportan la anaerobiosis (los patgenos).
Su rol es muy variado, desde la degradacin de molculas
orgnicas muy complejas hasta la formacin de humus.
113
Reproduccin
Reproduccin asexual
Llamada tambin somtica se realiza por fragmentacin
del talo, por fisin binaria y gemacin (caso de las levaduras) y por produccin de esporas. No incluye unin de
ncleos y es la forma ms frecuente de reproduccin.
El nmero, disposicin, forma, color y origen de las esporas son caractersticos de las especies.
Por el lugar en donde se originan, se distinguen las:
112
Lillian Frioni
Nutricin
Se distinguen tres formas de nutricin:
caractersticas
ejemplos
Mastigophora (flagelados)
Trypanosoma, Giarda,
Trichomonas
Euglenoides
(grupo tambin considerado
con las algas)
Flagelados fototrficos
Sarcodina (amebas)
Amoeba, Entamoeba
Ciliophora (ciliados)
Tetrahymena, Paramecium,
Vorticella, Didinium
Apicomplexa (parsitos)
Plasmodium, Toxoplasma
Fisiologa y nutricin
Se reconocen tres categoras de hongos por su relacin
con la materia orgnica:
109
Euglena
110
Lillian Frioni
cilias
fibras
contrctiles
vacuola
contrctil
citofaringe
microncleo
macronleo
vacuolas
alimenticias
pelcula
citoprocto
Trypanosoma
Rol en el suelo
Tetrahymena
Sarcodina
Existe evidencia de predacin por parte de hongos filamentosos sobre amebas y de otros organismos que pueden parasitar a los protozoos, pero su rol en la naturaleza, contribuyendo a la declinacin de este grupo, no est
claramente establecido.
Limitacin en el nmero de bacterias, se han realizado experiencias con modelos simplificados: suelo estril con protozoos y con bacterias y protozoos conjuntamente. Se demostr que la densidad bacteriana disminuye en presencia de protozoos. Se pens que este
hecho traera aparejada una disminucin en la fertilidad
del suelo, por disminucin de la actividad biolgica. Esta
idea no es mantenida actualmente, sino que ms bien
se piensa que la destruccin de una parte de la poblacin bacteriana estimula la actividad metablica de los
sobrevivientes, que compensaran la prdida del resto
de la poblacin.
Una de las hiptesis ms aceptada postula un rejuvenecimiento celular, con sntesis de sustancias estimulantes para las poblaciones de bacterias que resisten a
la predacin.
Diseminacin de esporas fngicas, ya que muchos
son incapaces de digerirlas y las transportan en su superficie.
Su rol efectivo en el suelo es entonces difcil de determinar: tienen poco efecto en las etapas de mineralizacin e
inmovilizacin de la materia orgnica. Muchas especies
son parsitas del hombre, aunque no encuentran en el
suelo ambiente apropiado.
Los hongos
Comprenden un grupo muy amplio de protistas superiores, incluidos por los botnicos entre las Talofitas (vegetales, sin clorofila) (figura 4).
Los principales grupos se reconocen como: mohos, levaduras y setas. Son todos hetertrofos y representan la
ltima etapa en la escala de evolucin de los protistas; su
hbitat ms frecuente es el suelo, aunque los hongos ms
primitivos son acuticos.
El talo est constituido por el micelio (figura 5) agregado
de hifas filiformes con tubos de paredes delgadas que
envuelven a la masa citoplasmtica continua (micelio cenoctico) y con tabiques (micelio tabicado) aunque en este
111
Estructuras de resistencia: en condiciones desfavorables para la subsistencia o cuando los parsitos rodean al
organismo, aparecen estas estructuras especializadas:
esclerocios: bien delimitados, de corteza oscura, segn el grado de cutinizacin, conjunto apretado de hifas con materiales de reserva. En condiciones favorables, entran en germinacin dando origen a fructificaciones de menor tamao: son los bulbillos (menos de 1
mm) y menos cutinizados.
Estructuras de fijacin: estolones y apresorios, el estoln es una hifa area que se extiende a gran distancia,
luego por su peso se curva, encuentra un soporte con el
cual se pone en contacto y se convierte en rgano de fijacin ms complicado, el apresorio, unido firmemente al
sustrato.
Haustorios: los hongos parsitos y simbiticos que penetran en las clulas vegetales aumentan la superficie
de absorcin, por ramificacin de las hifas. Su rol es
muy importante en las micorrizas, asociaciones simbiticas entre races y hongos. Tambin se los llama
arbsculos (captulo 16).
110
Lillian Frioni
cilias
fibras
contrctiles
vacuola
contrctil
citofaringe
microncleo
macronleo
vacuolas
alimenticias
pelcula
citoprocto
Trypanosoma
Rol en el suelo
Tetrahymena
Sarcodina
Existe evidencia de predacin por parte de hongos filamentosos sobre amebas y de otros organismos que pueden parasitar a los protozoos, pero su rol en la naturaleza, contribuyendo a la declinacin de este grupo, no est
claramente establecido.
Limitacin en el nmero de bacterias, se han realizado experiencias con modelos simplificados: suelo estril con protozoos y con bacterias y protozoos conjuntamente. Se demostr que la densidad bacteriana disminuye en presencia de protozoos. Se pens que este
hecho traera aparejada una disminucin en la fertilidad
del suelo, por disminucin de la actividad biolgica. Esta
idea no es mantenida actualmente, sino que ms bien
se piensa que la destruccin de una parte de la poblacin bacteriana estimula la actividad metablica de los
sobrevivientes, que compensaran la prdida del resto
de la poblacin.
Una de las hiptesis ms aceptada postula un rejuvenecimiento celular, con sntesis de sustancias estimulantes para las poblaciones de bacterias que resisten a
la predacin.
Diseminacin de esporas fngicas, ya que muchos
son incapaces de digerirlas y las transportan en su superficie.
Su rol efectivo en el suelo es entonces difcil de determinar: tienen poco efecto en las etapas de mineralizacin e
inmovilizacin de la materia orgnica. Muchas especies
son parsitas del hombre, aunque no encuentran en el
suelo ambiente apropiado.
Los hongos
Comprenden un grupo muy amplio de protistas superiores, incluidos por los botnicos entre las Talofitas (vegetales, sin clorofila) (figura 4).
Los principales grupos se reconocen como: mohos, levaduras y setas. Son todos hetertrofos y representan la
ltima etapa en la escala de evolucin de los protistas; su
hbitat ms frecuente es el suelo, aunque los hongos ms
primitivos son acuticos.
El talo est constituido por el micelio (figura 5) agregado
de hifas filiformes con tubos de paredes delgadas que
envuelven a la masa citoplasmtica continua (micelio cenoctico) y con tabiques (micelio tabicado) aunque en este
111
Estructuras de resistencia: en condiciones desfavorables para la subsistencia o cuando los parsitos rodean al
organismo, aparecen estas estructuras especializadas:
esclerocios: bien delimitados, de corteza oscura, segn el grado de cutinizacin, conjunto apretado de hifas con materiales de reserva. En condiciones favorables, entran en germinacin dando origen a fructificaciones de menor tamao: son los bulbillos (menos de 1
mm) y menos cutinizados.
Estructuras de fijacin: estolones y apresorios, el estoln es una hifa area que se extiende a gran distancia,
luego por su peso se curva, encuentra un soporte con el
cual se pone en contacto y se convierte en rgano de fijacin ms complicado, el apresorio, unido firmemente al
sustrato.
Haustorios: los hongos parsitos y simbiticos que penetran en las clulas vegetales aumentan la superficie
de absorcin, por ramificacin de las hifas. Su rol es
muy importante en las micorrizas, asociaciones simbiticas entre races y hongos. Tambin se los llama
arbsculos (captulo 16).
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Lillian Frioni
Nutricin
Se distinguen tres formas de nutricin:
caractersticas
ejemplos
Mastigophora (flagelados)
Trypanosoma, Giarda,
Trichomonas
Euglenoides
(grupo tambin considerado
con las algas)
Flagelados fototrficos
Sarcodina (amebas)
Amoeba, Entamoeba
Ciliophora (ciliados)
Tetrahymena, Paramecium,
Vorticella, Didinium
Apicomplexa (parsitos)
Plasmodium, Toxoplasma
Fisiologa y nutricin
Se reconocen tres categoras de hongos por su relacin
con la materia orgnica:
109
Euglena
108
Lillian Frioni
En ambientes con insolacin muy intensa, las algas tienden a concentrarse algunos centmetros debajo de la superficie. All se protegen debajo de minerales translcidos
como cuarzo o dolomita, de las radiaciones solares y de
la desecacin (sobre todo la ficoflora de los desiertos) y
contra el fro intenso en las regiones polares. Las radiaciones ultravioleta no son perjudiciales, de modo que son
empleadas en su aislamiento, eliminando los contaminantes bacterianos.
La humedad: las algas verdes son muy exigentes en agua
y a medida que aumenta la aridez, el nmero de especies
y su densidad disminuyen. Otras algas, por el contrario,
soportan mal la inundacin. El ptimo se sita, como para
otros grupos de microorganismos, alrededor del 40-60%
de la capacidad de campo. En la superficie de suelos agrcolas de la zona templada, la disponibilidad de agua para
las algas suele ser limitante. Las clulas se recubren de
capa muscilaginosa muy higroscpica que puede retener
10-15 veces su volumen en agua, la que es perdida muy
lentamente.
El efecto de la estacin del ao es marcado, en primavera su nmero es bajo; el congelamiento las perjudica y en
invierno la poblacin declina.
El efecto del pH vara con el tipo de suelo; en general las
algas son poco sensibles a las variaciones de pH. Los
valores prximos a la neutralidad o ligeramente alcalinos,
son ms favorables. En suelos cidos dominan las clorofceas, que se pueden encontrar a pH 5,0 y aun 4,0 (el ptimo para su desarrollo se sita entre pH 6,8 y 8,5), aunque
se encuentran en pH 9,3-10 y toleran hasta pH 13.
Antagonismos: muchas especies son susceptibles al ataque por bacterias, hongos, estreptomices, que con enzimas especficas destruyen la pared celular. Otros antagonismos ocurren con nemtodos, termites.
Funciones
Los protozoarios
Constituyen un grupo muy heterogneo de eucariotas, unicelulares y mviles, cuyo tamao vara entre algunas micras hasta algunos centmetros (figura 2) (Madigan
et al, 2000) y (figura 3). Los habitantes del suelo son de
talla ms pequea y aplanados, ya que deben moverse en
el film de agua que llena los poros. Presentan semejanzas
con varias divisiones de algas de las cuales derivan. Los
varios tipos de leucofitos proveen de pruebas sobre el origen evolucionario de muchos grupos de protozoos. La prdida de la capacidad fotosinttica reduce abruptamente la
potenciabilidad nutricional y es seguida de una serie de eventos a nivel celular que posibilitan al organismo el desarrollo
de nuevos mecanismos de nutricin osmotrfico o fagotr-
Las fuentes de carbono son variables, emplean de preferencia azcares, almidn y algunos celulosa y lignina. Con
respecto al nitrgeno, asimilan formas minerales y/o orgnicas (las ltimas de preferencia). Almacenan glucgeno y aceite. Especies de Penicillum (moho verde) y de
Rhizopus (moho negro) se desarrollan sobre cualquier tipo
de sustrato hmedo (aun en el refrigerador a 5C); otros
utilizan sustratos ms especficos, encontrndose en el
extremo de la escala a los parsitos obligados, que requieren determinada variedad vegetal.
Habitat
Los hongos estn muy distribuidos en todos los ecosistemas, desde 0 a 25C, aunque pocos a 0C y con un mximo de 50C. Para los hongos del suelo el ptimo se ubica
entre 20-30C, en pH muy variados: el ptimo para el grupo estara en la vecindad de pH 6 y dominan en ambientes cidos, por falta de competencia por parte de las bacterias. La luz es esencial para la esporulacin de muchas
especies y para la dispersin de esporas fototrficas. Las
esporas permiten una amplia distribucin. Como grupo son
aerobios pero algunos soportan la anaerobiosis (los patgenos).
Su rol es muy variado, desde la degradacin de molculas
orgnicas muy complejas hasta la formacin de humus.
113
Reproduccin
Reproduccin asexual
Llamada tambin somtica se realiza por fragmentacin
del talo, por fisin binaria y gemacin (caso de las levaduras) y por produccin de esporas. No incluye unin de
ncleos y es la forma ms frecuente de reproduccin.
El nmero, disposicin, forma, color y origen de las esporas son caractersticos de las especies.
Por el lugar en donde se originan, se distinguen las:
114
Lillian Frioni
Reproduccin sexual
Comprende las tres etapas fundamentales:
plasmogamia (unin de dos protoplastos y los ncleos
haploides)
cariogamia (formacin de un zigote diploide)
divisin meitica (reduccin cromosmica).
Los hongos se dividen por su sexualidad en:
hermafroditas (rganos + y - en el mismo talo)
dioicos (en talos distintos)
indiferenciados (no se diferencian los sexos).
Taxonoma
Los criterios empleados en la clasificacin de este grupo
heterogneo incluyen caracteres morfolgicos casi exclusivamente:
naturaleza del micelio (tabicado o no)
tipo de reproduccin sexual
naturaleza de las esporas asexuadas (internas en
gametangio) y externas (conidios) (cuadro 3 y
figura 6).
Subdivisin
Clase
Mixomycotina
Mastigomycotina (esporas
asexuales flageladas)
Chrytridiomycetes
Oomycetes (antiguos Phycomycetes)
Zygomycotina (miceliales,
cenocticos, esporas asexuales
en esporangio)
Hemiascomycetidae
Hyphomycetes antiguos
Deuteromycetes
107
sinttica; si bien pueden obtener energa de su actividad fotosinttica, no pueden obtener el poder reductor
para convertir el CO2 en materiales celulares.
osmotrfas, muchas algas que realizan fotosntesis normal en la luz, pueden crecer en la oscuridad a expensas
de variedad de compuestos orgnicos, derivando su metabolismo hacia la respiracin. Las algas completamente
encerradas en pared celular dependen exclusivamente de
sustratos orgnicos disueltos en la oscuridad
fagotrfas, aquellas clulas desprovistas de pared o
que no estn completamente encerradas en ella, pueden predar bacterias u otros microorganismos.
No es correcto, entonces, describir a las algas como grupo exclusivamente fotosinttico, ya que muchos de sus
miembros unicelulares poseen las caractersticas nutricionales de los protozoos y de los hongos. Los leucofitos
que se forman por la prdida irreversible del cloroplasto,
son organismos no pigmentados derivados de grupos flagelados, de diatomeas y de formas inmviles de las algas
verdes unicelulares. No pueden fotosintetizar.
En el laboratorio, esta transicin pudo ser demostrada
experimentalmente, en ciertas cepas de Euglena, al ser
tratadas con estreptomicina o cuando son expuestas a
pequeas dosis de luz ultravioleta o a altas temperaturas.
La clasificacin de los leucofitos es un problema difcil:
por su estructura pueden ser asignados a una divisin
particular de algas, como representantes no fotosintticos. Pero como son eucariotas unicelulares no fotosintticos, pueden ser mirados como protozoos, y son incluidos
entre ellos por los zologos. Constituyen un grupo de transicin entre las algas y los protozoos.
Ecologa
Nutricin
106
Lillian Frioni
multicelulares, de aspecto de planta. El mayor y ms variado grupo es el de las algas verdes (Chlorophyta), de
los cuales se originaron probablemente las plantas, incluye organismos unicelulares y hasta multicelulares con
aspecto de vegetal.
Oidios
Ascospora
Basidiospora
Aplanosporas
Zoosporas
Chlorophyta
algas verdes
Euglenophyta
euglenoides
a y b, sin pared, paramiln y grasas, 1, 2, 3 flagelos por
fotosintticos clula, unicelulares
Phyrrophyta
dinoflagelados a y c y carotenoides especiales, celulosa, almidn y aceites,
2 flagelos diferentes en forma y posicin, la mayora
unicelulares, pocas filamentosas
Chrysophyta
Algas amarillo- a+/-c y carotenoides especiales, 2 mitades superpuestas
verdosas,
de slice, otras sin pared, aceites, 2 flagelos por clula,
diatomeas
unicelulares, filamentosas, cenocticas
Phaeophyta
algas pardas, a y c, carotenoides especiales, celulosa y algina, grasas y
dinoflagelados luminarina, 2 flagelos de distinta longitud, pluricelulares
Rhodophyta
algas rojas
(Plantae)
Conidias
Clamidospora
Zoosporangio Esporangio
Grupo
10
Esporangiosporas
Esporangiforo
Hifa
vegetativa
Oidiforo
Asca
Basidiospora
Conidiforo
100
Myxomycota
Subdivisiones: Myxomycotina: clases como Myxomycetes, sin pared celular, cuerpo ameboide (plasmodios de
vida libre), masa multinuclear de protoplasma sin paredes definidas. Diploides, fructifican dando oosporas flageladas en la meiosis. Parecidos a los protozoos con
nutricin holozoica.
Eumycota
Hongos verdaderos, con paredes de celulosa o quitina,
estructura tpicamente filamentosa, algunos unicelulares.
Reproduccin sexual o asexual, esporas sin flagelos. Se
distinguen las clases:
a. Chytridiomycetes: variedad de talos, clulas mviles
con un solo flagelo posterior tipo ltigo, acuticos,
parsitos.
b. Oomycetes: hongos con micelio cenoctico bien desarrollado, cuyas clulas mviles poseen dos flagelos
dirigidos en direcciones opuestas: uno de tipo ltigo y
el otro cepillo. Reproduccin sexual: se forma una espora de resistencia (oospora) a partir de la osfera
fecundada, con pared celulsica. Parsitos y saprfitos acuticos.
c. Zygomycetes: hongos saprfitos o parsitos con micelio cenoctico o septado bien desarrollado. Reproduccin sexual por fusin de gametangios generalmente iguales que forma una espora de resistencia (zigospora). No producen clulas mviles.
115
d. Trichomycetes: hongos con talo cenoctico filamentoso simple o ramificado adherido al tracto digestivo y
cutcula externa de artrpodos vivos. Reproduccin
asexual por variedad de esporas. Reproduccin sexual
conocida como en los Zygomicetes.
e. Ascomycetes: hongos que forman esporas dentro de
estructuras especiales en forma de saco (asca) como
resultado de la cariogamia y meiosis. Las ascas se presentan libres o en fructificacin ms generalmente en
el tejido infectado.
f. Basidiomycetes: hongos que forman esporas resultantes de cariogamia y meiosis sobre la superficie de
estructuras especiales llamadas basidios.
g. Deuteromycetes: grupo en el cual se coloca a los hongos que por su estructura general y reproduccin
asexual se parecen a los Ascomycetes, pero no se ha
observado el estado sexual. Tambin llamado Fungi
imperfecti, incluyen a numerosas levaduras.
Funcin en el suelo
Los hongos son activos degradadores de sustratos
carbonados y su rol esencial es la mineralizacin de fuentes complejas de carbono, atacando gran volumen de residuos con poco nitrgeno. Predominan as en suelos
pobres, sobre restos vegetales frescos y sobre todo en
plantas maduras donde la C/N puede ser muy alta.
Segn los sustratos que emplean se distinguen los:
hongos glucoflicos, sobre todo al estado de esporas
con alto poder germinativo y rpido crecimiento. Son
los primeros en atacar sustratos frescos; cuando las fracciones fcilmente atacadas se agotan, el hongo fructifica y permanece en estado de latencia (Mucorales, Penicillum).
hongos que degradan la lignina, las fracciones ms
resistentes, sobre todo Basidiomycetes
patgenos verdaderos; slo una fraccin pequea de
los hongos que crecen o sobreviven en el suelo, como
Fusarium, Phytium, Ophiobulus, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillum.
Hongos patgenos del hombre pueden llegar al suelo,
sobre todo en la zona tropical y la infeccin se generaliza fcilmente en la poblacin. Una tcnica comn para
detectarlos y aislarlos es colocar una hebra de cabello
estril en el suelo, el hongo lo coloniza, pues emplea la
queratina.
116
Lillian Frioni
(mtodo tambin empleado en la lucha contra fitopatgenos). Como se observa en el cuadro 4, en condiciones de
sequedad, las especies que pueden esporular, lo hacen y
la mayor proporcin de estructuras fngicas las constituyen las esporas. La humedad favorece la germinacin de
stas y el desarrollo del micelio.
Aireacin: algunas especies pueden desarrollarse a bajos niveles de O2, pero en general un extremo de la hifa
accede al aire. Son aerobios y su dependencia frente a
este gas explica su mayor concentracin en los primeros
centmetros del suelo y su ausencia en niveles inferiores
en suelos mal drenados, en barros y estuarios. Las esporas pueden soportar largos perodos de inundacin; al drenar el suelo, los hongos retornan rpidamente a su posicin de importancia.
Ecologa
Los factores ecolgicos ms importantes son: nivel y naturaleza de la materia orgnica, pH, fertilizantes orgnicos y minerales, humedad, aereacin, temperatura, profundidad, estacin del ao y cubierta vegetal.
El nmero de hongos filamentosos vara directamente con
el contenido de materia orgnica. El agregado de restos
vegetales estimula la poblacin fngica y altera la composicn de la flora; ciertos gneros se hacen dominantes:
Penicillum, Trichoderma, Aspergillus, Fasarium, Mucor.
Algunas especies mantienen su nmero alto por perodos
relativamente largos, en medios cidos los hongos son la
microflora dominante cuando se agrega materia orgnica
y el nivel de nitrgeno es adecuado.
El pH es uno de los factores principales que gobiernan su
actividad y composicin. Muchas especies se desarrollan
en amplio rango de pH, en medio de cultivo lo hacen desde pH 2-3 hasta 9,0 o superior. Dominan en ambientes
cidos por falta de competencia de bacterias. Algunas
especies son ms sensibles a la acidez que el resto de la
comunidad y la acidificacin del suelo puede ser un mtodo de lucha, cuando se trata de hongos fitopatgenos.
Otros hongos prefieren la neutralidad o bien ambientes
alcalinos. El ptimo como grupo se sita en la vecindad
de pH 6.
Humedad: si sta es excesiva y la difusin del oxgeno
est limitada, los hongos son los primeros perjudicados
total
hifas
esporas
esporas
% del total
8,9
18,9
24,2
27,1
99
142
149
173
60
113
133
153
39
29
16
20
79
20
10
12
Temperatura: la mayora son mesfilos, pero el desarrollo termfilo no es infrecuente. En el suelo los termfilos
son escasos, pero son abundantes cuando la temperatura asciende por respiraciones (compost).
Profundidad: en suelos cultivados, los hongos son ms
abundantes en las capas superiores, pero pueden alcanzar gran densidad en los horizontes B de pasturas (ms
de 1 m), siguiendo la concentracin de la materia orgnica: son cepas adaptadas a bajas concentraciones de O2
o altas de CO2. El efecto de la profundidad sobre la abundancia y composicin de la flora fngica est asociado
con la concentracin de materia orgnica y la composicin de la atmsfera del suelo.
Estacin del ao: los meses clidos de primavera son
usualmente benficos pero el excesivo calor y sequedad
105
Este grupo comprende a un conjunto muy diverso de organismos cuyo estudio ha sido abordado por distintas disciplinas: Ficologa, Micologa y Protozoologa. Esta diversificacin se explica por el hecho de que los botnicos
reconocieron a las algas y a los hongos como plantas y
los zologos a los protozoos como animales. La caracterstica comn es la presencia de clula eucariota, son por
lo tanto microorganismos eucariotas.
Actualmente se reconocen como microorganismos, organismos muy simples, que han permanecido a travs de la
evolucin adaptndose a las condiciones modernas. Los
representantes ms especializados, como un alga de mar,
un ciliado, un moho, pueden ser asignados rpidamente
a las algas, protozoos y a los hongos, respectivamente.
Sin embargo, existen numerosos protistas superiores incluidos arbitrariamente en algn grupo, como el caso del
gnero Euglena, ubicado entre las algas y los protozoos.
En trminos generales:
Las algas pueden definirse como organismos con fotosntesis oxignica y que poseen cloroplastos. Pueden ser
unicelulares, filamentosas o cenocticas, algunas poseen
aspecto de planta debido al extensivo desarrollo multicelular, pero no se diferencian en tejidos ni rganos; por lo
general la especializacin celular se da en el caso de la
reproduccin. No deben confundirse con las cianobacterias, que tambin realizan fotosntesis oxignica, pero que
son bacterias y evolucionaron como ellas.
Los protozoos y los hongos son organismos no fotosintticos y la diferencia entre ellos es de carcter estructural;
los protozoos son predominantemente unicelulares y los
hongos, sobre todo cenocticos, se desarrollan dando origen a una estructura filamentosa y ramificada, el micelio.
El cloroplasto es el organelo clave en las relaciones entre los tres grupos. Se puede perder irreversiblemente,
dando origen a las algas incoloras o leucocitos, que se
desarrollan con nutrientes minerales simples, a la luz. As,
a partir de algas unicelulares, es fcil distinguir formas
que dependen de procesos fermentativos o respiratorios
para su nutricin, como los protozoos.
La separacin es muy marcada entre algas y protozoos en
estructura celular y fisiologa, pero a los evolucionistas les
resulta ms difcil vincular a los protozoos con los hongos:
los primeros son uniformemente unicelulares y mviles y
los hongos predominantemente cenocticos e inmviles, y
su hbitat fundamental es el suelo. No obstante, es necesario recordar que las formas primitivas son acuticas y
poseen esporas flageladas (zoosporas). Para los hongos
del suelo, el viento es la principal forma de propagacin.
Las algas
El suelo no es un hbitat ptimo para las algas (figura 1),
que prefieren los ambientes acuticos. Sin embargo, la
ficoflora terrestre est integrada por numerosas especies
unicelulares y filamentosas, cuya distribucin est ligada
a tipos pedolgicos y a la cubierta vegetal. En condiciones extremas, estos productores primarios (PP) de
materia orgnica pueden desempear un rol fundamental. La taxonoma que se emplea es la de los botnicos
(Talofitas) y se basa en propiedades celulares:
104
Lillian Frioni
Levaduras
Si bien el trmino levadura no tiene significado taxonmico, es muy empleado para designar a aquellos hongos de
estructura unicelular y que se reproducen por fisin binaria o gemacin. Los gneros ms encontrados en el suelo
son: Cndida, Hansenula, Lipomyces, Pichia, Pullularia,
Rhodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces, Torula,
Zygosaccharomyces. (figura 7).
Ciertas cepas tolerantes a altos niveles de azcares, capaces de realizar activas fermentaciones, se describieron
en el suelo, pero no parecen ser habitantes normales, sino
que llegan a l con frutos y restos vegetales. Generalmente
se describen poblaciones de 103/g en reas templadas, pero
no es posible correlacionar su nmero con caractersticas
climticas o de suelo, y su rol en las transformaciones de
la materia orgnica o mineral no est definido.
117
Saccharomyces cerevisiae, principal agente de la fermentacin alcohlica, es una levadura ascomicete. En cierto
estado de su desarrollo la gemacin cesa y la clula vegetativa se transforma en un asco, cada una con 4 ascos-
118
Lillian Frioni
Bibliografa
Dommergues, Y. y F. Mangenot, Ecologie Microbienne
du Sol, 1970, Masson & Cie. Pars.
Frioni, L. Procesos Microbianos, 1999 Fundacin de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina.
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biology of Microorganisms 2000 Prentice Hall International.
Prescott-Harley-Klein, Microbiologa, 1999 Mc Graw-Hill
Interamericana.
www.fagro.edu.uy/microbiologa/protistas superiores
Preguntas de repaso
Figura 7- Clulas de levaduras gemando (seudomicelio)
Rol en el suelo
No es bien conocido: se los considera como organismos
glucoflicos relacionados a la materia orgnica poco transformada, utilizan nitratos y azcares simples u oligosacridos, pero son incapaces de degradar glcidos complejos, tal vez con excepcin de las pectinas. Las levaduras
del gnero Lipomyces parecen una excepcin ya que pueden desarrollarse a dbiles dosis de nitrgeno, con lo que
pueden degradar mucho ms carbono orgnico, y parecen favorecidas por cidos hmicos. En la naturaleza se
las encuentra frecuentemente asociadas a bacterias fijadoras de N2 aerobias, sobre las que ejercen efecto estimulante.
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
Gneros representativos
Fusobacterium.
103
Bibliografa
ASM Methods for General and Molecular Bacteriology, 1994.
Madigan, Martinko y Parker. Brock, Biologa de los
microorganismos, 2000. Prentice Hall International.
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2001.
Prescott, Harley y Klein, Microbiologa, 1999 McGrawHill. Interamericana.
The prokaryotes, 2nd ed. 1992.
Preguntas de repaso
1) Resuma las ventajas de emplear las caractersticas
morfolgicas, fisiolgicas/metablicas, ecolgicas,
genticas y moleculares, en la clasificacin e identificacin.
2) Se le presenta el caso de dilucidar si dos aislamientos
de bacterias aisladas de ndulos de trbol son de la
misma especie. Qu caracteres les determinara?
En qu momento usara estudios de su ADN?
3) Conceptos de: taxonoma y filogenia.
4) Qu se entiende por caracteres morfolgicos?
Resultan ms tiles en estudios taxonmicos de
bacterias o de hongos? Por qu?
102
Lillian Frioni
Apndice
La ltima edicin del Manual Bergey
Ha habido un progreso considerable en el dominio de la
taxonoma bacteriana desde 1984, fecha de la publicacin del primer volumen del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. El nmero de especies descriptas se ha
duplicado y hay ms de 170 gneros nuevos, gracias a la
secuenciacin del ARN ribosomal, del ADN y de las protenas.
La segunda edicin del Manual Bergey (2001) es fundamentalmente filogentica en lugar de fnica (figura 3 y
resumen en cuadro 13) (Prescott et al., 1999).
Los microorganismos
en los ciclos biogeoqumicos
8 Ecologa microbiana y mtodos de estudio .................................. 121
9 Ciclo biolgico del carbono ........................................................... 143
10 Ciclo biolgico del nitrgeno ......................................................... 169
11 Fijacin biolgica del nitrgeno (FBN) .......................................... 191
12 Ciclos biolgicos del azufre, fsforo, hierro. ................................. 211
Figura 3- Filogenia en Eubacteria: rbol basado en comparaciones del segmento 16S del ARN ribosomal
119
120
Lillian Frioni
101
Bacteria
Archaea
Eucarya
Peptidoglicano
Lpidos de la membrana
Ribososmas +ARN iniciador
Intrones en ARNt
ARN polimerasa
si
Enlaces ster
70S
formilmetionina
no
Una (4 subunidades)
no
Enlaces eter
70S
metionina
si
Varias (8-12 subunidades)
no
Enlaces ster
80S
metionina
si
Tres (12-14 subunidades)
Ribosoma sensible a:
Toxina diftrica
Cloranfenicol
Kanamicina
Estreptomicina
No
Sensible
Sensible
No
Sensible
No
Otra aproximacin ms moderna es la taxonoma polifsica que busca el consenso en la integracin de distintos
tipos de caracteres:
* Fenotpicos:
* Genotpicos:
140
Lillian Frioni
La mineralizacin, pasaje de formas orgnicas a minerales, es un proceso muy general y ocurre prcticamente en
todas las condiciones ecolgicas. En efecto, no hay sustancia orgnica de origen biolgico que no sea degradado por algn grupo de microorganismos en ambientes
naturales. Existen sustancias naturales de mineralizacin
muy lenta, llamadas recalcitrantes, caso de la lignina,
algunos biocidas naturales, el humus. Numerosas sustancias orgnicas producto de las actividades del hombre llegan a los ecosistemas naturales y son muy difcilmente
degradadas, caso de los pesticidas. Estas sustancias que
producen serias poluciones, se denominan xonobiticas
(captulo 22).
Se habla de inmovilizacin cuando las sustancias inorgnicas son asimiladas por los microorganismos para
integrarlos a su biomasa (protenas, fosfolpidos, etc.). Se
produce una competencia con las plantas y animales,
quienes pueden sufrir carencias temporales. La biomasa
microbiana a su turno ser biodegradada y los nutrientes
vuelven a formas inorgnicas.
Oxidacin-reduccin
=
4
(SO , NO ,
CO2, c. org.)
oxidacin
(o)
Ejemplos:
materia orgnica + NO3
CO2,
H2O, N2 (N2O)
gases a la atmsfera
Sustancia gaseosa
Sustancia
no gaseosa
Volatilizacin
(v)
La fijacin es la conversin de sustancias voltiles en no
voltiles y los ejemplos ms tpicos son:
fijacin biolgica del C (fotosntesis o quimiosntesis)
fijacin biolgica del nitrgeno (FBN), muchas veces realizados en la misma clula (cianobacteria y bacterias fotosinttica fijadoras de N2):
FBN
Numerosos procesos de este tipo involucran a elementos importantes para ecosistemas naturales (C,N,S,P,Fe)
como la nitrificacin, sulfooxidacin, desnitrificacin,
sulfatorreduccin, metanognesis, oxidacin y reduccin
de compuestos con hierro, carbonados, etc. Las plantas
dependen de muchos de estos procesos para obtener
los nutrientes asimilables a partir de la reserva orgnica
del suelo (humus), si no existen aportes exgenos. Estos cambios en el estado de oxido-reduccin de ciertos
elementos, que pueden realizarse tanto en aerobiosis
como en anaerobiosis, son procesos muchas veces generadores de energa para el microorganismo y en algunos casos pueden convertir a los elementos en formas
aa
protenas
(no gaseosos)
La ecologa microbiana estudia las propiedades y el comportamiento de los microorganismos en su ambiente natural, sea el suelo, aguas, alimentos, animales (cuadro 1)
y su estudio interesa a los investigadores por muchos aspectos de dominio pblico (cuadro 2).
no gaseoso
8e, 8H+
N2
2 NH3 + H2
gas nitrogenasa
Fijacin
(f)
gas
Fijacin-volatilizacin
Sustrato reducido
=
121
reduccin
(r)
Sustrato
Solubilizacin-precipitacin
La solubilizacin es un proceso muy importante ya que permite hacer disponible a muchos elementos insolubles, como
Ecosistema: es el sistema limitado en el espacio constituido por el conjunto de condiciones energticas, fsicas,
qumicas y biolgicas que rodean a estos organismos
Lillian Frioni
in situ
clulas
ADN o ARN
clulas
que no obligatoriamente todas las etapas deben cumplirse en un ecosistema dado. As, la nitrificacin de sales
amoniacales puede detenerse por falta de oxgeno, el pH
puede limitar la entrada del N2 a la tierra por fijacin biolgica, la solubilizacin de fosfatos puede inhibirse por escasa actividad biolgica.
Los microorganismos actan sobre la materia orgnica y
mineral con el propsito de obtener:
energa
subunidades para sus macromolculas
hibridacin
ADN marcado simple hebra
vegetales
fijacin
lavado
(elimina el ADN
no fijado
animales
atmsfera
CO2, N2, N2O, CH4, H2
volatilizacin
La proporcin relativa de las distintas especies est afectada en cierto grado por el ambiente: los hongos dominan
en medios cidos de bosques, las bacterias predominan
en suelos inundados, los actinomicetes en ambientes secos, las algas son las primeras colonizadoras en suelos
quemados, erosionados, cuando ste se humedece.
oxidacin
minerales oxidados
minerales reducidos
reduccin
precipitacin
minerales solubles
minerales insolubles
solubilizacin
Lectura de la
seal retenida
(radioactividad,
fluorescencia)
(ambiente). La energa penetra a los ecosistemas sobretodo en forma de luz solar y los organismos fototrfos la
emplean para sintetizar nueva materia orgnica. Esta contiene todos los elementos (C, N, S, P, Fe, etc.) y cuando el
organismo muere se libera la energa de sus constituyentes qumicos que queda disponible para el ecosistema
permitiendo el desarrollo de nuevos organismos. Estos
realizan importantes procesos de sntesis y degradacin,
los auttrofos generan materia orgnica a partir de CO2 y
los otros son organtrofos y participan en la biodegradacin y reciclado de la materia orgnica e inorgnica.
139
mineralizacin
inmovilizacin
122
fijacin
cuantificacin
materia orgnica
biomasa microbiana
restos vegetales, animales
HUMUS
Procesos microbianos
Ciclos biogeoqumicos de los elementos
Los microorganismos participan en las transformaciones
de los elementos en la naturaleza. Si bien cuando un sustrato complejo llega a un ambiente particular, aguas, suelos, aire, comienza a degradarse en su globalidad, es
frecuente realizar el estudio en base a los ciclos biogeoqumicos de los distintos elementos. As, realizaremos esta abstraccin mental para estudiar las transformaciones que sufren los compuestos carbonados, nitrogenados, azufrados, fosforados, con hierro, etc., en combinaciones orgnicas e inorgnicas, en ecosistemas naturales, en particular en el ecosistema suelo-planta-hombre.
Un ciclo biolgico abarca todas las posibles vas que un
elemento puede seguir en la naturaleza (figura 11) aun-
En las transformaciones microbianas de la materia orgnica y mineral encontramos una serie de procesos simultneos y opuestos que podemos resumir en los siguientes 4 pares de procesos.
Mineralizacin inmovilizacin
Mineralizacin
(m)
Sustancia orgnica
Sustancia inorgnica
inmovilizacin
(azcares,
Protenas, etc.)
(i)
138
Lillian Frioni
duccin endgena de GUS. Puede utilizarse la hibridizacin de ADN para detectar estos marcadores fenotpicos.
1
El uso de marcadores que codifican para la protena luciferasa se ha extendido mucho ya que la formacin de luz
es fcilmente detectable. El gen lux emite luz va la actividad luciferasa sobre el sustrato luciferina: la actividad puede medirse en medio de cultivo slido o lquido (Rhizobium meliloti por siembra de contenidos nodulares, autoradiografa y visualizacin directa de colonias luminiscentes), o an en muestras de suelo o aguas.
El avance en la puesta a punto de todas estas tcnicas
moleculares ha facilitado el seguimiento de un microorganismo en ambientes altamente colonizados, como la rizosfera, restos orgnicos en degradacin y seguramente
conducir a importantes avances en los estudios de interacciones entre microorganismos y entre microorganismos
con plantas, animales y el hombre.
Numerosas tcnicas se emplean para evaluar la actividad
biolgica en ambientes naturales, algunas son aplicaciones de determinaciones clsicas de la microbiologa y otras
incursionan en tcnicas moleculares y taxoqumicas que
permiten el anlisis de las comunidades de ecosistemas
sin el cultivo previo de los microorganismos activos. Estas tcnicas se correlacionan en general con parmetros
fsicos, qumicos y biolgicos empleados.
Secuencias del ADN: las secuencias nicas de los microorganismos son analizadas por varios procedimientos que amplifica estas secuencias: REP-PCR y ERICPCR, analizan secuencias conservadas, repetitivas en
puntos diferentes de una bacteria en particular.
Deteccin de genes que codifican actividades microbianas: empleo de genes reporteros, extraccin de
ARNm, permiten estimar rangos especficos de biodegradacin de xenobiticos, genes lux pueden detectar E. coli,
invasores o alctonos. Estos ltimos, llamados zimgenos por Winogradsky (1924), crecen rpidamente cuando estn disponibles sustratos ricos en energa (pajas,
abonos), los autctonos son los microorganismos que
colonizan los materiales ms recalcitrantes que quedan
luego de un ataque primario.
Criterio de autoctona: posibilidad de aislamiento repetido de la especie en distintas muestras de un mismo
ecosistema, habilidad para usar los nutrientes comunes
del medio y para soportar variaciones del ambiente, alta
densidad del organismo, que ser mayor en lugares con
abundantes nutrientes y condiciones favorables como
en el suelo en la vecindad de races (aspecto cuantitativo).
Otra aproximacin de clasificacin basada en caractersticas de crecimiento es la de la escuela japonesa que
distingue:
123
124
Lillian Frioni
minutos. Se estima que ciertas bacterias del suelo se desarrollan a menos del 1% de la tasa que muestran en
medios de laboratorio, como reflejo de:
bajo suministro de nutrientes
la distribucin de los mismos no es uniforme
los microorganismos no crecen solos, salvo excepciones, en los ambientes naturales y sufren activa competencia de otros microorganismos
Sucesiones microbianas
Un principio fundamental del desarrollo de un ecosistema
es la sucesin, o sea los cambios en las poblaciones que
permiten el establecimiento de las llamadas comunidades climax. En lugar de competir por el mismo sustrato,
algunos microorganismos cooperan para realizar una
transformacin particular, que no realizaran si actuaran
solos. Se establece una progresin de cambios en las
poblaciones microbianas a medida que el sustrato es
metabolizado y las condiciones del ambiente (O2, pH, potencial redox) cambian.
La figura 1 ubica a los organismos productores, consumidores y degradadores en el ecosistema suelo-planta y
la figura 2 presenta un esquema de las interacciones entre los integrantes de la comunidad. Las del tipo 1 ocurren
entre la comunidad microbiana y los componentes del
suelo, las del tipo 2 entre los microorganismos entre si,
las del tipo 3 entre las comunidades vegetales y microbianas y finalmente las interacciones del tipo 4, que involucran al suelo y la vegetacin, interesan slo accesoriamente al bilogo del suelo y son dominio de la fisiologa y
patologa vegetal.
energa solar
productores primarios
vegetales
bacterias fotosintticas
y quimioauttrofas
algas
cianobacterias
sustancias solubles
herbvoros
consumidores primarios
restos vegetales
materia orgnica
del suelo
microorganismos
degradadores
consumidores
secundarios
hombre
consumidor
terciario
137
Perfil de plsmidos
vegetales
3
2
microorganismo
microorganismo
1
suelo (condiciones fsicas y qumicas)
Ambientes microbianos
Acuticos
Los entornos tpicos son los ocanos, estuarios, pantanos,
lagos, ros y manantiales. Difieren mucho entre s en propiedades fsicas y qumicas y en las especies microbianas
activas. Los organismos fotosintticos predominantes son
cianobacterias y algas en las zonas aerbicas y bacterias
fotosintticas en las anaerobias. Las algas que flotan reciben el nombre de fitoplancton y las de los lechos son algas bentnicas. Son los productores primarios de estos
ambientes. Los ocanos abiertos son muy bajos en productividad primaria, mientras que las reas en los ocanos
interiores son altas, siendo los lagos y manantiales los de
mayor productividad, donde la concentracin de nutrientes
minerales requeridos por las algas es abundante y facilitan
el desarrollo de peces y mariscos.
Las relaciones del oxgeno en un ro son de inters, sobretodo cuando stos reciben mucha materia orgnica
como aguas servidas y desechos de la industria. Puede
ocurrir un marcado dficit de O2, como se ve en la figura 3
(Madigan et al., 2000), consecuencia del incremento en
bacterias hetertrofas. Si hay mucho amonio, ste es oxidado a nitratos por las bacterias nitrificantes. El incremento
en algas y cianobacterias es una respuesta primaria a los
nutrientes inorgnicos, sobretodo el fosfato.
Las secuencias de cidos nucleicos no slo detectan organismos especficos, sino que tambin evidencian actividades. Los genes reporteros, que indican la actividad
de un gen de inters asociado, estn tpicamente insertados en un opern que contiene el gen que codifica la actividad de inters. Esta fusin de genes se logra a veces
empleando un transposn, que inserta al azar el gen reportero en el genoma bacteriano. El proceso produce
mutantes con diferentes fusiones de genes. La expresin
de los genes reporteros da una seal fcil de detectar,
como la produccin de -galactosidasa (gen lac z), fcil
de detectar colorimtricamente en medio slido.
Un gran nmero de marcadores genticos se han descrito, entre ellos genes de resistencia a antibiticos, como el
nptII que codifica resistencia a kanamicina, que fue el primer gen usado como marcador. Este mtodo presenta el
riesgo de expandir resistencias a otros organismos en la
naturaleza.
La sonda construida a partir de un plsmido de la cepa
Kim-5, confirma la presencia de la cepa Kim-5 en los carriles 1,3, y 4.Las restantes no contienen el ADN Kim-5
(figura 9) (Pepper y Josephson, 1998) .
136
Lillian Frioni
bacterias genticamente diferentes existen en una muestra de suelo (Torsvik et al, 1990).
Sondas gnicas
Su construccin resulta una tcnica muy especializada que
excede este texto. La metodologa especfica se puede
consultar en manuales como el de Sambrook et al (1990).
Para su construccin, la secuencia del gen de inters debe
ser conocida y ser particular a una especie microbiana:
esta secuencia resultar muy til en la deteccin de ese
organismo. Otras pueden codificar enzimas involucradas
en la fijacin del N2 y su uso puede indicar cuando un
suelo contiene bacterias con esos genes. Actualmente,
muchas secuencias se encuentran descriptas en la web,
permitiendo al investigador obtener la que desea para sus
estudios. La construccin de la sonda implica copiar la
hebra complementaria. Su tamao puede variar de 30 a
40 pb hasta varios cientos de pares de bases. Algunas de
ellas se marcan con un radiactivo (P32 en el P-azcar del
ADN) o no radiactivos, como resistencia a antibitico.
La deteccin de un grupo particular de bacterias se hace
en una membrana sobre la cual se lisaron las clulas aisladas antes de que se desnaturalicen ambas hlices. Lo
mismo ocurre con la sonda, que luego de un tiempo en
contacto se renen con la secuencia de bases complementaria de la bacteria en estudio, homologa evidenciada por radiofotografas (P32).
Southern blots/hibridacin
Esta tcnica permite identificar la localizacin de una secuencia de inters, por ejemplo, dentro de un plsmido.
Para ello, todos los plsmidos de la clula bacteriana son
extrados y separados en un gel de agarosa en electroforesis. Luego se transfieren a un membrana y se hibridizan
con la sonda especfica. Slo aquellos plsmidos con la
secuencia homloga a la sonda sern revelados por el
marcador usado.
El ciclo se repite muchas veces hasta llegar al nivel deseado de amplificacin, la que ocurre exponencialmente.
Un ADN de doble cadena producir dos hlices dobles
luego de un ciclo, cuatro luego de 2 ciclos, 8 luego de 3,
1024 luego de 10 ciclos y as sucesivamente. De esta forma se pueden conseguir muchas copias de una zona especfica de ADN. El producto de la amplificacin se somete a separacin electrofortica en gel de agarosa, y es
coloreado con bromuro de etidio, que al intercalarse entre
las bases del ADN puede ser fcilmente visualizado al
ser expuesto a luz ultra-violeta.
En el caso de bacterias, pueden utilizarse primers que
reconocen secuencias repetidas en el genoma (rep-PCR).
Con esto se obtiene una serie de bandas de amplificacin
de distinto tamao que son caractersticas de cada cepa
en particular. La distribucin de las mismas se analiza en
programas de computacin que emplean el principio de la
taxonoma numrica, agrupando individuos segn relaciones de homologa, que aparecen en dendogramas
(figura 8, Schneider y De Bruijn, 1996).
cantidad
relativa
de clulas,
concentracin O2
de nutrientes
bacterias y C orgnico
-3
algas y
cianobacterias
NH4 ,PO4
O2
-
NO3
ingreso
Las actividades de los microorganismos en este ambiente altamente heterogneo, difieren drsticamente del comportamiento manifestado en medios clsicos de laboratorio. Los microorganismos no actan solos; otros microorganismos, la micro y meso fauna, la vegetacin y las propiedades fsicas y qumicas del suelo y la accin del clima
y el hombre, contribuirn a exaltar o a inhibir un determinado proceso biolgico.
Terrestres
El comportamiento de una poblacin microbiana y sus efectos sobre el suelo estn gobernados en gran parte por las
caractersticas fsicas y qumicas de ste. El concepto suelo se puede abordar desde distintos puntos de vista:
edafolgico, el suelo es la capa ms externa de la superficie de la tierra, diferente a la roca madre de la cual
tom origen, por la accin combinada de factores muy
diversos como el clima, roca madre, vegetacin, microflora, en el transcurso del tiempo pedolgico
El suelo est compuesto de cinco componentes principales: la fraccin mineral, la orgnica, agua, aire y organismos vivos. El esquema siguiente resume las proporciones de cada uno, aunque los valores varan con los
suelos y con la profundidad. De la fraccin inanimada, la
cantidad de materia orgnica y mineral es relativamente
constante en un sitio dado, mientras que el aire y agua
fluctan (representan aproximadamente la mitad del
volumen del suelo y constituyen el espacio poroso)
(figura 4).
gases
minerales
lquidos
materia orgnica
Constituye una poderosa tecnologa que ha revolucionado las tcnicas en biologa molecular, de gran aplicacin
en: diagnstico clnico, microbiologa ambiental, inmunologa y muchos otros campos de investigacin.
La enzima aislada de Thermus aquaticus (Taq polimerasa), permite amplificar eficientemente el ADN a 72C y no
se desnaturaliza a altas temperaturas. Esta enzima puede alargar in vitro un pequeo oligonucletido (primer),
adicionando nucletidos en su secuencia si ste est hibridizado a una hebra de ADN complementario llamado
molde (template), siguiendo las reglas de complementariedad de Watson y Crick. Para esto es necesario un exceso de nucletidos en la solucin que sirven de unidades de montaje de la hlice a complementar en el molde.
El proceso de polimerizacin del ADN en el PCR comprende, por lo tanto, 3 pasos:
125
126
Lillian Frioni
La fraccin mineral
Esta fraccin, generalmente menos que el 50% del volumen del suelo, se origin por desintegracin de la roca
madre, meteorizada en el curso del tiempo. Ejerce gran
importancia en la disponibilidad de nutrientes, la aireacin, la retencin y el movimiento del agua y afecta a la
microflora. Las partculas varan desde gravas de ms
de 2 mm hasta las arcillas, menores a 2 micras, visibles
slo al microscopio. Forman agregados con la materia
orgnica que contribuyen a la estructuracin del suelo.
Qumicamente estn constituidos por aluminosilicatos,
xidos y carbonatos. Las arcillas presentan la mayor
reactividad ya que poseen una gran relacin superficie/
volumen.
La fraccin mineral presenta propiedades qumicas y actividades variables segn el tamao de las partculas. La
arena y el limo estn formados por cuarzo, feldespatos,
micas, y otros silicatos. Su actividad qumica es casi nula
a corto plazo. La arcilla est constituida por silicatos de
estructura folacea semejante a las micas y se caracterizan por presentar propiedades coloidales, con gran relacin superficie a volumen con predominio de cargas electrostticas negativas. Estn formadas por minerales secundarios del grupo de la montmorillonita, illita, caolinita,
etctera.
Las arcillas y el complejo arcilla-humus retienen iones de
signo contrario, generalmente cationes. Estos estn en equilibrio con la solucin del suelo, con los que se pueden intercambiar. Cuando aumenta la concentracin de un catin
en la solucin, por ejemplo al agregar un fertilizante, el catin agregado desplaza una parte de los otros cationes retenidos por el coloide, que a su turno pasan a la solucin.
La cantidad total de cationes que puede retener un suelo
constituye su capacidad de intercambio (CIC), que se expresa en miliequivalentes/100 g de suelo. Los cationes se
pueden ordenar por su capacidad de adsorcin:
La fraccin orgnica
Parmetros
Al+3 > H+ > Ca+2 > Mg+2 > K+ = NH4+ > Na+
Muchas sustancias asimiladas por |os microorganismos
son aninicas, como los bicarbonatos, nitratos, fosfatos,
sulfatos, molibdatos, pero la capacidad de intercambio
aninico no es apreciable. El amonio es fcilmente reteni-
C-orgnico total
N-total
densidad
espacio poroso con agua
aerobios totales
bacterias
hongos
anaerobios facultativos
anaerobios totales
LM/LC a
(7,5-15cm)
1,41
1,29
1,04
1,28
1,35
1,41
1,35
1,31
1,27
0,99
1,01
1,05
1,11
0,66
0,68
0,55
0,96
1,05
Medida de la biodiversidad
Se ha recurrido a mtodos genticos y bioqumicos que
no requieren el aislamiento y cultivo previo de los microorganismos activos en un ecosistema.
Histricamente una variedad de mtodos bioqumicos,
serolgicos y fenotpicos se han empleado para caracterizar bacterias, tales como rhizobios y otras asociadas a
las plantas: perfil de protenas totales, de plsmidos, anlisis de cidos grasos, resistencia intrnseca a antibiticos, sensibilidad a bacterifagos e isoenzimas.
Ms recientemente el desarrollo y la aplicacin de mtodos
moleculares, basados en estudios de cidos nucleicos, han
permitido grandes avances en la identificacin y determinacin de relaciones filogenticas de organismos de importancia para la agricultura y el medio ambiente.
Los mtodos ms recientes pueden agruparse en dos
categoras (Bottomley, 1998):
los basados en la caracterizacin de los cidos nucleicos, que permiten agrupar cepas en grupos coherentes, pudiendo establecerse relaciones filogenticas y
diferenciar cepas de igual gnero y especie
los basados en la deteccin fenotpica de marcadores genticos, como resistencia a antibiticos, enzimas
LM/LC a
(0-7,5cm)
135
Ecologa gentica
En los ltimos aos ha habido una eclosin de metodologas genticas para analizar las comunidades microbianas a nivel de laboratorio y en ecosistemas naturales. Son
relativamente simples aunque el equipamiento y los reactivos, pueden limitar su empleo masivo. Detectan pequeas cantidades de material gentico y tambin permiten
clasificar microorganismos en grupos filogenticos.
La doble hlice del ADN es la base de dos anlisis muy
importantes:
sondas genticas, construidas para reconocer secuencias especficas de un microorganismo
la reaccin en cadena de la polimerasa, conocida por
su abreviatura en ingls (PCR)
Estas tcnicas pueden tambin emplearse a secuencias
de ARN: ribosomal (rARN), mensajero (mARN) y de transferencia (tARN). Dos tipos, el rARN y el mARN se usan
mucho en anlisis genticos, estudios filogenticos y en
estimaciones de actividad metablica. La secuencia de
bases del ARN se transcribe a secuencias conservadas
del ADN.
Numerosos trabajos sealan la utilidad y las limitaciones
de estos mtodos basados en caracteres genotpicos,
sobre todo en estudios de microorganismos asociados a
plantas. El aislamiento del cido nucleico no siempre es
requerido para la aplicacin de mtodos de deteccin
molecular, que involucran tratamientos enzimticos o
amplificacin de trozos de ADN por la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR). Para este estudio puede utilizarse una colonia bacteriana entera, un trozo de planta colonizada por un hongo micorrtico, o un ndulo entero en el
caso de rhizobios (Schneider y De Bruijn, 1996).
Algunas de las tcnicas utilizadas para caracterizar cidos nucleicos incluyen: extraccin del ADN de una muestra de suelo y determinacin del rango de reasociacin de
ese ADN. Se ha determinado que unas 4.000 tipos de
134
Lillian Frioni
Este dato que representa 0,15% del peso del suelo, puede llevarse a kg/ha: una hectrea de suelo de 0,20 m de
profundidad pesa:
10.000 m2 x 0,2 m = 2.000 m3 (d aprox. = 1g/cm3), que
equivale a un peso de 2.000.000 kg de suelo. La biomasa
bacteriana ser de:
2,0 x 106kg x 1,5 x 10-3 kg = 3.000 kg/ha
El cuadro 7 presenta resultados de evaluaciones promedio del nmero y la biomasa de diferentes grupos de microorganismos del suelo. Ntese la importancia de la biomasa fngica, hecho no reflejado por el recuento de propgalos/g de suelo.
Cuadro 7- Nmero aproximado y biomasa (kg/ha
de suelo) de organismos en el suelo
Grupo
bacterias
actinomicetes
hongos
levaduras
algas
protozoos
virus (bacterifagos)
nemtodos
lombrices
Nmero/g suelo
Biomasa microbiana
kg/ha
3-500 millones
1-20
5.000-100.000
1.000-100.000
1.000-100.000
1.000-100.000
10
11
10 -10
10-100
300-10.000
300-3.000
500-5.000
100-5.000
10-1.500
5-200
1-100
10-1000
127
establecimiento de los umbrales de equilibrio o deseables de un indicador, se efecta a partir de los valores
medios resultantes de estudios realizados con anterioridad, en los mismos suelos. La determinacin de estos
lmites de comparacin constituye una limitante en muchos estudios.
El cuadro 8 seala las determinaciones ms corrientes
en la evaluacin de la actividad biolgica de suelos y
aguas, que incluyen anlisis fsicos, qumicos y biolgicos, a los cuales se van agregando aquellos que analizan presencia de microorganismos sin aislarlos (biodiversidad).
La seleccin de parmetros como indicadores biolgicos de la calidad del suelo, sensibles a cambios en el
uso y manejo del mismo y que se correlacionen con las
clsicas determinaciones fsicas y qumicas, es motivo
de numerosos estudios (Pankhurst et al, 1997; Smith et
al, 2000, van Bruggen y Semenov, 2000, Frioni et al,
2003, Albanesi et al, 2003).
Cuadro 8- Parmetros empleados como
indicadores de la calidad del suelo
Indicadores
fsicos
Indicadores
qumicos
textura
C-orgnico total
capacidad
de campo
pH
profundidad
conductividad
elctrica
densidad
Indicadores
biolgicos
recuentos, biomasa
microbiana
enzimas, respiracin
medida de la biodiversidad: perfil de cidos nucleicos, de cidos grasos, perfiles metablicos
N, P, K, extrables N-mineralizable
ses, nutrientes minerales y orgnicos, y el suelo les sirve como tampn en los cambios bruscos que pueden
ocurrir en el pH. Los microorganismos contribuyen, con
otros organismos, a la alteracin de la roca madre, formando la reserva orgnica (humus), pero participan tambin a su degradacin.
el desarrollo microbiano ms extensivo ocurre como microcolonias en la superficie de las partculas del suelo,
como se aprecia en la figura 5 (Madigan et al.,2000).
Como resumen, el cuadro 4 resume los factores que inciden en la actividad biolgica.
Cuadro 4- Factores que afectan la actividad
microbiana
caractersticas de los propios microorganismos
disponibilidad de nutrientes: materia orgnica, O ,
2
N, S, P, etc.
factores fsicos: temperatura, aireacin humedad, pH
manejo: aireacin/compactacin; distribucin de
la MO disponibilidad de agua; temperaturas en
primavera
residuos vegetales o aplicacin de abonos
sistemas de cultivo y rotaciones
interacciones con otros microorganismos
interacciones con otros organismos (plantas, animales)
La aireacin y la humedad estn directamente relacionados ya que la porcin del espacio poroso que no contiene agua est ocupada por gases, que constituyen la
atmsfera del suelo. Comnmente, la concentracin de
CO2 excede a la atmosfrica en un factor de 10 o 100 y el
O2 es menos abundante.
Estas variaciones estn relacionadas con la actividad respiratoria de la poblacin del suelo: vegetal y microbiana.
Un suelo bien aireado, desde el punto de vista microbiolgico, es aquel en el cual los procesos que requieren O2 proceden a rpida velocidad.
Un suelo mal aireado est asociado a un mal drenaje y
saturacin como ocurre en general en suelos pesados,
con muchas arcillas que poseen gran proporcin de
microporos que retienen fuertemente el agua. El oxgeno es poco soluble en agua y nuevos procesos ocurren,
muchos de ellos perjudiciales para los vegetales, por
ejemplo, se libera N2 o CH4, aparecen inhibidores orgnicos y se acumulan S=, Fe++, Mn++.
microcolonia
arcilla
aire
cuarzo
materia
orgnica
arcilla
agua
cuarzo
aire
128
Lillian Frioni
133
C-biomasa: F- NF/k
Donde: F-NF es la diferencia en los flujos de C-CO2 entre
la muestra fumigada (F) y la no fumigada (NF) y k es la
fraccin del C de la biomasa mineralizado a CO2 en el
curso del perodo de incubacin (usualmente entre 10 y
14 das).
Estos valores obtenidos a partir de cultivos puros de bacterias y hongos enriquecidos con C14 varan entre 43 y
50% (0,43 a 0,50) y la mayora de los autores emplean el
valor 0,45. En suelos minerales se suele emplear 0,33. El
desconocimiento de esta constante es una de las limitaciones del mtodo.
132
Lillian Frioni
Las enzimas del suelo no se recuperan fcilmente, y pocas veces son aisladas en forma pura. Ellas estn inmobilizadas con arcillas y el humus.
La actividad enzimtica flucta, como las poblaciones microbianas con condiciones biticas y abiticas. Las actividades son particularmente altas en suelos productivos ricos en materia orgnica. Muchos factores como la humedad, temperatura, aireacin, cambios estacionales, prcticas de manejo, la forestacin, etc. ejercen influencias en
la presencia y abundancia de enzimas.
3,0
2,5
2,0
1,5
10
15
20
das
La figura 7 indica que la reaccin de oxidacin del amonio es una actividad bacteriana ya que los hongos o actinomicetes no exhiben incrementos logartmicos en la
actividad bioqumica. La velocidad de reaccin se puede medir mejor por la acumulacin de nitrito y nitrato,
que por la desaparicin del amonio, que puede ser adsorbido a los coloides.
129
Recuentos
Las densidades microbianas se evalan por diferentes
mtodos de recuento:
de viables en medios lquidos o slidos o en plantas en
caso de simbiosis. No existe un medio de cultivo que permita el desarrollo de la poblacin microbiana hetertrofa.
130
Lillian Frioni
Se usa medio con extracto de suelo y una fuente de carbono y energa (glucosa). Ms frecuentemente se determinan las poblaciones de bacterias de acuerdo a los grupos fisiolgicos de inters para el investigador, para los
cuales es posible formular medios y condiciones de cultivo selectivos. (Anexo prctico).
de totales o microscpicos, evalan poblaciones viables
y no viables de bacterias en suelos: en general 108-109
clulas/g de suelo seco. Los recuentos de viables no representan un 10% de estas cifras, y muchas veces menos del 1%.
Las bacterias del suelo raramente se encuentran aisladas, sino que se agrupan en colonias (figura 5) y muchas
veces resulta difcil separarlas al efectuar las suspensiones-diluciones, para los recuentos de viables. Otra limitacin es la adsorcin sobre partculas de humus o arcillas,
que disminuye los recuentos de bacterias.
Actividad respiratoria
En el caso del suelo se correlaciona esta actividad con el
contenido de materia orgnica, humedad y prcticas de
manejo. Pero se incluye el CO2 de la mesofauna y de las
races, resultando difcil distinguir la contribucin de cada
uno en ensayos de campo. La actividad in situ se determina evaluando volmenes conocidos de la atmsfera sobre una superficie determinada de terreno (m2).
La determinacin del CO2 se realiza por varias tcnicas:
absorcin en solucin alcalina (KOH) y determinacin
volumtrica o gravimtrica
conductividad elctrica en solucin alcalina
espectrometra en la zona del infrarrojo
Actividad enzimtica
Es necesario trabajar al abrigo de la luz, pues estos aceptores de electrones son fotosensibles.
Las actividades de los microorganismos requieren la participacin de un conjunto de enzimas. La actividad de una
de ellas, bien escogida, puede reflejar la actividad biolgica global. El cuadro 6 muestra algunas de las enzimas
evaluadas en los suelos.
Se encontraron correlaciones significativas entre consumo de oxgeno y el nmero de bacterias con la actividad
N
H
N N
+ 2e + 2H
+ H + Cl
N
Cl
TTC (incoloro)
Ciertas enzimas son ubicuistas, se encuentran virtualmente en todos los tipos de suelos, como la ureasa, catalasa,
fosfatasas y los varios tipos de peptidasas. Otras pueden
producirse en el suelo bajo ciertas condiciones.
Entre las hidrolasas se evalan la sacarasa, amilasa,
celulasa, incorporando a muestras de suelo solucin con
el sustrato especfico. Luego de una incubacin apropiada en condiciones controladas, se extraen los productos
de la hidrlisis, determinndose los azcares reductores,
durante el tiempo de incubacin. Es muy empleado el acetato de fluorescena como sustrato de numerosas hidrolasas, evalundose la fluorescena liberada.
Otras enzimas evaluadas son: fosfatasas, con glicerofosfato como sustrato, proteasas, ureasas, ARNasa,
ADNasa. En la evaluacin de enzimas que catalizan
reacciones redox, se trabaja en ausencia de antisptico, pues las enzimas son endocelulares, como las deshidrogenasas.
TPF (rojo)
131
130
Lillian Frioni
Se usa medio con extracto de suelo y una fuente de carbono y energa (glucosa). Ms frecuentemente se determinan las poblaciones de bacterias de acuerdo a los grupos fisiolgicos de inters para el investigador, para los
cuales es posible formular medios y condiciones de cultivo selectivos. (Anexo prctico).
de totales o microscpicos, evalan poblaciones viables
y no viables de bacterias en suelos: en general 108-109
clulas/g de suelo seco. Los recuentos de viables no representan un 10% de estas cifras, y muchas veces menos del 1%.
Las bacterias del suelo raramente se encuentran aisladas, sino que se agrupan en colonias (figura 5) y muchas
veces resulta difcil separarlas al efectuar las suspensiones-diluciones, para los recuentos de viables. Otra limitacin es la adsorcin sobre partculas de humus o arcillas,
que disminuye los recuentos de bacterias.
Actividad respiratoria
En el caso del suelo se correlaciona esta actividad con el
contenido de materia orgnica, humedad y prcticas de
manejo. Pero se incluye el CO2 de la mesofauna y de las
races, resultando difcil distinguir la contribucin de cada
uno en ensayos de campo. La actividad in situ se determina evaluando volmenes conocidos de la atmsfera sobre una superficie determinada de terreno (m2).
La determinacin del CO2 se realiza por varias tcnicas:
absorcin en solucin alcalina (KOH) y determinacin
volumtrica o gravimtrica
conductividad elctrica en solucin alcalina
espectrometra en la zona del infrarrojo
Actividad enzimtica
Es necesario trabajar al abrigo de la luz, pues estos aceptores de electrones son fotosensibles.
Las actividades de los microorganismos requieren la participacin de un conjunto de enzimas. La actividad de una
de ellas, bien escogida, puede reflejar la actividad biolgica global. El cuadro 6 muestra algunas de las enzimas
evaluadas en los suelos.
Se encontraron correlaciones significativas entre consumo de oxgeno y el nmero de bacterias con la actividad
N
H
N N
+ 2e + 2H
+ H + Cl
N
Cl
TTC (incoloro)
Ciertas enzimas son ubicuistas, se encuentran virtualmente en todos los tipos de suelos, como la ureasa, catalasa,
fosfatasas y los varios tipos de peptidasas. Otras pueden
producirse en el suelo bajo ciertas condiciones.
Entre las hidrolasas se evalan la sacarasa, amilasa,
celulasa, incorporando a muestras de suelo solucin con
el sustrato especfico. Luego de una incubacin apropiada en condiciones controladas, se extraen los productos
de la hidrlisis, determinndose los azcares reductores,
durante el tiempo de incubacin. Es muy empleado el acetato de fluorescena como sustrato de numerosas hidrolasas, evalundose la fluorescena liberada.
Otras enzimas evaluadas son: fosfatasas, con glicerofosfato como sustrato, proteasas, ureasas, ARNasa,
ADNasa. En la evaluacin de enzimas que catalizan
reacciones redox, se trabaja en ausencia de antisptico, pues las enzimas son endocelulares, como las deshidrogenasas.
TPF (rojo)
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Lillian Frioni
Las enzimas del suelo no se recuperan fcilmente, y pocas veces son aisladas en forma pura. Ellas estn inmobilizadas con arcillas y el humus.
La actividad enzimtica flucta, como las poblaciones microbianas con condiciones biticas y abiticas. Las actividades son particularmente altas en suelos productivos ricos en materia orgnica. Muchos factores como la humedad, temperatura, aireacin, cambios estacionales, prcticas de manejo, la forestacin, etc. ejercen influencias en
la presencia y abundancia de enzimas.
3,0
2,5
2,0
1,5
10
15
20
das
La figura 7 indica que la reaccin de oxidacin del amonio es una actividad bacteriana ya que los hongos o actinomicetes no exhiben incrementos logartmicos en la
actividad bioqumica. La velocidad de reaccin se puede medir mejor por la acumulacin de nitrito y nitrato,
que por la desaparicin del amonio, que puede ser adsorbido a los coloides.
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Recuentos
Las densidades microbianas se evalan por diferentes
mtodos de recuento:
de viables en medios lquidos o slidos o en plantas en
caso de simbiosis. No existe un medio de cultivo que permita el desarrollo de la poblacin microbiana hetertrofa.
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Lillian Frioni
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C-biomasa: F- NF/k
Donde: F-NF es la diferencia en los flujos de C-CO2 entre
la muestra fumigada (F) y la no fumigada (NF) y k es la
fraccin del C de la biomasa mineralizado a CO2 en el
curso del perodo de incubacin (usualmente entre 10 y
14 das).
Estos valores obtenidos a partir de cultivos puros de bacterias y hongos enriquecidos con C14 varan entre 43 y
50% (0,43 a 0,50) y la mayora de los autores emplean el
valor 0,45. En suelos minerales se suele emplear 0,33. El
desconocimiento de esta constante es una de las limitaciones del mtodo.
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Lillian Frioni
Este dato que representa 0,15% del peso del suelo, puede llevarse a kg/ha: una hectrea de suelo de 0,20 m de
profundidad pesa:
10.000 m2 x 0,2 m = 2.000 m3 (d aprox. = 1g/cm3), que
equivale a un peso de 2.000.000 kg de suelo. La biomasa
bacteriana ser de:
2,0 x 106kg x 1,5 x 10-3 kg = 3.000 kg/ha
El cuadro 7 presenta resultados de evaluaciones promedio del nmero y la biomasa de diferentes grupos de microorganismos del suelo. Ntese la importancia de la biomasa fngica, hecho no reflejado por el recuento de propgalos/g de suelo.
Cuadro 7- Nmero aproximado y biomasa (kg/ha
de suelo) de organismos en el suelo
Grupo
bacterias
actinomicetes
hongos
levaduras
algas
protozoos
virus (bacterifagos)
nemtodos
lombrices
Nmero/g suelo
Biomasa microbiana
kg/ha
3-500 millones
1-20
5.000-100.000
1.000-100.000
1.000-100.000
1.000-100.000
10
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10 -10
10-100
300-10.000
300-3.000
500-5.000
100-5.000
10-1.500
5-200
1-100
10-1000
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establecimiento de los umbrales de equilibrio o deseables de un indicador, se efecta a partir de los valores
medios resultantes de estudios realizados con anterioridad, en los mismos suelos. La determinacin de estos
lmites de comparacin constituye una limitante en muchos estudios.
El cuadro 8 seala las determinaciones ms corrientes
en la evaluacin de la actividad biolgica de suelos y
aguas, que incluyen anlisis fsicos, qumicos y biolgicos, a los cuales se van agregando aquellos que analizan presencia de microorganismos sin aislarlos (biodiversidad).
La seleccin de parmetros como indicadores biolgicos de la calidad del suelo, sensibles a cambios en el
uso y manejo del mismo y que se correlacionen con las
clsicas determinaciones fsicas y qumicas, es motivo
de numerosos estudios (Pankhurst et al, 1997; Smith et
al, 2000, van Bruggen y Semenov, 2000, Frioni et al,
2003, Albanesi et al, 2003).
Cuadro 8- Parmetros empleados como
indicadores de la calidad del suelo
Indicadores
fsicos
Indicadores
qumicos
textura
C-orgnico total
capacidad
de campo
pH
profundidad
conductividad
elctrica
densidad
Indicadores
biolgicos
recuentos, biomasa
microbiana
enzimas, respiracin
medida de la biodiversidad: perfil de cidos nucleicos, de cidos grasos, perfiles metablicos
N, P, K, extrables N-mineralizable
ses, nutrientes minerales y orgnicos, y el suelo les sirve como tampn en los cambios bruscos que pueden
ocurrir en el pH. Los microorganismos contribuyen, con
otros organismos, a la alteracin de la roca madre, formando la reserva orgnica (humus), pero participan tambin a su degradacin.
el desarrollo microbiano ms extensivo ocurre como microcolonias en la superficie de las partculas del suelo,
como se aprecia en la figura 5 (Madigan et al.,2000).
Como resumen, el cuadro 4 resume los factores que inciden en la actividad biolgica.
Cuadro 4- Factores que afectan la actividad
microbiana
caractersticas de los propios microorganismos
disponibilidad de nutrientes: materia orgnica, O ,
2
N, S, P, etc.
factores fsicos: temperatura, aireacin humedad, pH
manejo: aireacin/compactacin; distribucin de
la MO disponibilidad de agua; temperaturas en
primavera
residuos vegetales o aplicacin de abonos
sistemas de cultivo y rotaciones
interacciones con otros microorganismos
interacciones con otros organismos (plantas, animales)
La aireacin y la humedad estn directamente relacionados ya que la porcin del espacio poroso que no contiene agua est ocupada por gases, que constituyen la
atmsfera del suelo. Comnmente, la concentracin de
CO2 excede a la atmosfrica en un factor de 10 o 100 y el
O2 es menos abundante.
Estas variaciones estn relacionadas con la actividad respiratoria de la poblacin del suelo: vegetal y microbiana.
Un suelo bien aireado, desde el punto de vista microbiolgico, es aquel en el cual los procesos que requieren O2 proceden a rpida velocidad.
Un suelo mal aireado est asociado a un mal drenaje y
saturacin como ocurre en general en suelos pesados,
con muchas arcillas que poseen gran proporcin de
microporos que retienen fuertemente el agua. El oxgeno es poco soluble en agua y nuevos procesos ocurren,
muchos de ellos perjudiciales para los vegetales, por
ejemplo, se libera N2 o CH4, aparecen inhibidores orgnicos y se acumulan S=, Fe++, Mn++.
microcolonia
arcilla
aire
cuarzo
materia
orgnica
arcilla
agua
cuarzo
aire
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La fraccin mineral
Esta fraccin, generalmente menos que el 50% del volumen del suelo, se origin por desintegracin de la roca
madre, meteorizada en el curso del tiempo. Ejerce gran
importancia en la disponibilidad de nutrientes, la aireacin, la retencin y el movimiento del agua y afecta a la
microflora. Las partculas varan desde gravas de ms
de 2 mm hasta las arcillas, menores a 2 micras, visibles
slo al microscopio. Forman agregados con la materia
orgnica que contribuyen a la estructuracin del suelo.
Qumicamente estn constituidos por aluminosilicatos,
xidos y carbonatos. Las arcillas presentan la mayor
reactividad ya que poseen una gran relacin superficie/
volumen.
La fraccin mineral presenta propiedades qumicas y actividades variables segn el tamao de las partculas. La
arena y el limo estn formados por cuarzo, feldespatos,
micas, y otros silicatos. Su actividad qumica es casi nula
a corto plazo. La arcilla est constituida por silicatos de
estructura folacea semejante a las micas y se caracterizan por presentar propiedades coloidales, con gran relacin superficie a volumen con predominio de cargas electrostticas negativas. Estn formadas por minerales secundarios del grupo de la montmorillonita, illita, caolinita,
etctera.
Las arcillas y el complejo arcilla-humus retienen iones de
signo contrario, generalmente cationes. Estos estn en equilibrio con la solucin del suelo, con los que se pueden intercambiar. Cuando aumenta la concentracin de un catin
en la solucin, por ejemplo al agregar un fertilizante, el catin agregado desplaza una parte de los otros cationes retenidos por el coloide, que a su turno pasan a la solucin.
La cantidad total de cationes que puede retener un suelo
constituye su capacidad de intercambio (CIC), que se expresa en miliequivalentes/100 g de suelo. Los cationes se
pueden ordenar por su capacidad de adsorcin:
La fraccin orgnica
Parmetros
Al+3 > H+ > Ca+2 > Mg+2 > K+ = NH4+ > Na+
Muchas sustancias asimiladas por |os microorganismos
son aninicas, como los bicarbonatos, nitratos, fosfatos,
sulfatos, molibdatos, pero la capacidad de intercambio
aninico no es apreciable. El amonio es fcilmente reteni-
C-orgnico total
N-total
densidad
espacio poroso con agua
aerobios totales
bacterias
hongos
anaerobios facultativos
anaerobios totales
LM/LC a
(7,5-15cm)
1,41
1,29
1,04
1,28
1,35
1,41
1,35
1,31
1,27
0,99
1,01
1,05
1,11
0,66
0,68
0,55
0,96
1,05
Medida de la biodiversidad
Se ha recurrido a mtodos genticos y bioqumicos que
no requieren el aislamiento y cultivo previo de los microorganismos activos en un ecosistema.
Histricamente una variedad de mtodos bioqumicos,
serolgicos y fenotpicos se han empleado para caracterizar bacterias, tales como rhizobios y otras asociadas a
las plantas: perfil de protenas totales, de plsmidos, anlisis de cidos grasos, resistencia intrnseca a antibiticos, sensibilidad a bacterifagos e isoenzimas.
Ms recientemente el desarrollo y la aplicacin de mtodos
moleculares, basados en estudios de cidos nucleicos, han
permitido grandes avances en la identificacin y determinacin de relaciones filogenticas de organismos de importancia para la agricultura y el medio ambiente.
Los mtodos ms recientes pueden agruparse en dos
categoras (Bottomley, 1998):
los basados en la caracterizacin de los cidos nucleicos, que permiten agrupar cepas en grupos coherentes, pudiendo establecerse relaciones filogenticas y
diferenciar cepas de igual gnero y especie
los basados en la deteccin fenotpica de marcadores genticos, como resistencia a antibiticos, enzimas
LM/LC a
(0-7,5cm)
135
Ecologa gentica
En los ltimos aos ha habido una eclosin de metodologas genticas para analizar las comunidades microbianas a nivel de laboratorio y en ecosistemas naturales. Son
relativamente simples aunque el equipamiento y los reactivos, pueden limitar su empleo masivo. Detectan pequeas cantidades de material gentico y tambin permiten
clasificar microorganismos en grupos filogenticos.
La doble hlice del ADN es la base de dos anlisis muy
importantes:
sondas genticas, construidas para reconocer secuencias especficas de un microorganismo
la reaccin en cadena de la polimerasa, conocida por
su abreviatura en ingls (PCR)
Estas tcnicas pueden tambin emplearse a secuencias
de ARN: ribosomal (rARN), mensajero (mARN) y de transferencia (tARN). Dos tipos, el rARN y el mARN se usan
mucho en anlisis genticos, estudios filogenticos y en
estimaciones de actividad metablica. La secuencia de
bases del ARN se transcribe a secuencias conservadas
del ADN.
Numerosos trabajos sealan la utilidad y las limitaciones
de estos mtodos basados en caracteres genotpicos,
sobre todo en estudios de microorganismos asociados a
plantas. El aislamiento del cido nucleico no siempre es
requerido para la aplicacin de mtodos de deteccin
molecular, que involucran tratamientos enzimticos o
amplificacin de trozos de ADN por la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR). Para este estudio puede utilizarse una colonia bacteriana entera, un trozo de planta colonizada por un hongo micorrtico, o un ndulo entero en el
caso de rhizobios (Schneider y De Bruijn, 1996).
Algunas de las tcnicas utilizadas para caracterizar cidos nucleicos incluyen: extraccin del ADN de una muestra de suelo y determinacin del rango de reasociacin de
ese ADN. Se ha determinado que unas 4.000 tipos de
136
Lillian Frioni
bacterias genticamente diferentes existen en una muestra de suelo (Torsvik et al, 1990).
Sondas gnicas
Su construccin resulta una tcnica muy especializada que
excede este texto. La metodologa especfica se puede
consultar en manuales como el de Sambrook et al (1990).
Para su construccin, la secuencia del gen de inters debe
ser conocida y ser particular a una especie microbiana:
esta secuencia resultar muy til en la deteccin de ese
organismo. Otras pueden codificar enzimas involucradas
en la fijacin del N2 y su uso puede indicar cuando un
suelo contiene bacterias con esos genes. Actualmente,
muchas secuencias se encuentran descriptas en la web,
permitiendo al investigador obtener la que desea para sus
estudios. La construccin de la sonda implica copiar la
hebra complementaria. Su tamao puede variar de 30 a
40 pb hasta varios cientos de pares de bases. Algunas de
ellas se marcan con un radiactivo (P32 en el P-azcar del
ADN) o no radiactivos, como resistencia a antibitico.
La deteccin de un grupo particular de bacterias se hace
en una membrana sobre la cual se lisaron las clulas aisladas antes de que se desnaturalicen ambas hlices. Lo
mismo ocurre con la sonda, que luego de un tiempo en
contacto se renen con la secuencia de bases complementaria de la bacteria en estudio, homologa evidenciada por radiofotografas (P32).
Southern blots/hibridacin
Esta tcnica permite identificar la localizacin de una secuencia de inters, por ejemplo, dentro de un plsmido.
Para ello, todos los plsmidos de la clula bacteriana son
extrados y separados en un gel de agarosa en electroforesis. Luego se transfieren a un membrana y se hibridizan
con la sonda especfica. Slo aquellos plsmidos con la
secuencia homloga a la sonda sern revelados por el
marcador usado.
El ciclo se repite muchas veces hasta llegar al nivel deseado de amplificacin, la que ocurre exponencialmente.
Un ADN de doble cadena producir dos hlices dobles
luego de un ciclo, cuatro luego de 2 ciclos, 8 luego de 3,
1024 luego de 10 ciclos y as sucesivamente. De esta forma se pueden conseguir muchas copias de una zona especfica de ADN. El producto de la amplificacin se somete a separacin electrofortica en gel de agarosa, y es
coloreado con bromuro de etidio, que al intercalarse entre
las bases del ADN puede ser fcilmente visualizado al
ser expuesto a luz ultra-violeta.
En el caso de bacterias, pueden utilizarse primers que
reconocen secuencias repetidas en el genoma (rep-PCR).
Con esto se obtiene una serie de bandas de amplificacin
de distinto tamao que son caractersticas de cada cepa
en particular. La distribucin de las mismas se analiza en
programas de computacin que emplean el principio de la
taxonoma numrica, agrupando individuos segn relaciones de homologa, que aparecen en dendogramas
(figura 8, Schneider y De Bruijn, 1996).
cantidad
relativa
de clulas,
concentracin O2
de nutrientes
bacterias y C orgnico
-3
algas y
cianobacterias
NH4 ,PO4
O2
-
NO3
ingreso
Las actividades de los microorganismos en este ambiente altamente heterogneo, difieren drsticamente del comportamiento manifestado en medios clsicos de laboratorio. Los microorganismos no actan solos; otros microorganismos, la micro y meso fauna, la vegetacin y las propiedades fsicas y qumicas del suelo y la accin del clima
y el hombre, contribuirn a exaltar o a inhibir un determinado proceso biolgico.
Terrestres
El comportamiento de una poblacin microbiana y sus efectos sobre el suelo estn gobernados en gran parte por las
caractersticas fsicas y qumicas de ste. El concepto suelo se puede abordar desde distintos puntos de vista:
edafolgico, el suelo es la capa ms externa de la superficie de la tierra, diferente a la roca madre de la cual
tom origen, por la accin combinada de factores muy
diversos como el clima, roca madre, vegetacin, microflora, en el transcurso del tiempo pedolgico
El suelo est compuesto de cinco componentes principales: la fraccin mineral, la orgnica, agua, aire y organismos vivos. El esquema siguiente resume las proporciones de cada uno, aunque los valores varan con los
suelos y con la profundidad. De la fraccin inanimada, la
cantidad de materia orgnica y mineral es relativamente
constante en un sitio dado, mientras que el aire y agua
fluctan (representan aproximadamente la mitad del
volumen del suelo y constituyen el espacio poroso)
(figura 4).
gases
minerales
lquidos
materia orgnica
Constituye una poderosa tecnologa que ha revolucionado las tcnicas en biologa molecular, de gran aplicacin
en: diagnstico clnico, microbiologa ambiental, inmunologa y muchos otros campos de investigacin.
La enzima aislada de Thermus aquaticus (Taq polimerasa), permite amplificar eficientemente el ADN a 72C y no
se desnaturaliza a altas temperaturas. Esta enzima puede alargar in vitro un pequeo oligonucletido (primer),
adicionando nucletidos en su secuencia si ste est hibridizado a una hebra de ADN complementario llamado
molde (template), siguiendo las reglas de complementariedad de Watson y Crick. Para esto es necesario un exceso de nucletidos en la solucin que sirven de unidades de montaje de la hlice a complementar en el molde.
El proceso de polimerizacin del ADN en el PCR comprende, por lo tanto, 3 pasos:
125
124
Lillian Frioni
minutos. Se estima que ciertas bacterias del suelo se desarrollan a menos del 1% de la tasa que muestran en
medios de laboratorio, como reflejo de:
bajo suministro de nutrientes
la distribucin de los mismos no es uniforme
los microorganismos no crecen solos, salvo excepciones, en los ambientes naturales y sufren activa competencia de otros microorganismos
Sucesiones microbianas
Un principio fundamental del desarrollo de un ecosistema
es la sucesin, o sea los cambios en las poblaciones que
permiten el establecimiento de las llamadas comunidades climax. En lugar de competir por el mismo sustrato,
algunos microorganismos cooperan para realizar una
transformacin particular, que no realizaran si actuaran
solos. Se establece una progresin de cambios en las
poblaciones microbianas a medida que el sustrato es
metabolizado y las condiciones del ambiente (O2, pH, potencial redox) cambian.
La figura 1 ubica a los organismos productores, consumidores y degradadores en el ecosistema suelo-planta y
la figura 2 presenta un esquema de las interacciones entre los integrantes de la comunidad. Las del tipo 1 ocurren
entre la comunidad microbiana y los componentes del
suelo, las del tipo 2 entre los microorganismos entre si,
las del tipo 3 entre las comunidades vegetales y microbianas y finalmente las interacciones del tipo 4, que involucran al suelo y la vegetacin, interesan slo accesoriamente al bilogo del suelo y son dominio de la fisiologa y
patologa vegetal.
energa solar
productores primarios
vegetales
bacterias fotosintticas
y quimioauttrofas
algas
cianobacterias
sustancias solubles
herbvoros
consumidores primarios
restos vegetales
materia orgnica
del suelo
microorganismos
degradadores
consumidores
secundarios
hombre
consumidor
terciario
137
Perfil de plsmidos
vegetales
3
2
microorganismo
microorganismo
1
suelo (condiciones fsicas y qumicas)
Ambientes microbianos
Acuticos
Los entornos tpicos son los ocanos, estuarios, pantanos,
lagos, ros y manantiales. Difieren mucho entre s en propiedades fsicas y qumicas y en las especies microbianas
activas. Los organismos fotosintticos predominantes son
cianobacterias y algas en las zonas aerbicas y bacterias
fotosintticas en las anaerobias. Las algas que flotan reciben el nombre de fitoplancton y las de los lechos son algas bentnicas. Son los productores primarios de estos
ambientes. Los ocanos abiertos son muy bajos en productividad primaria, mientras que las reas en los ocanos
interiores son altas, siendo los lagos y manantiales los de
mayor productividad, donde la concentracin de nutrientes
minerales requeridos por las algas es abundante y facilitan
el desarrollo de peces y mariscos.
Las relaciones del oxgeno en un ro son de inters, sobretodo cuando stos reciben mucha materia orgnica
como aguas servidas y desechos de la industria. Puede
ocurrir un marcado dficit de O2, como se ve en la figura 3
(Madigan et al., 2000), consecuencia del incremento en
bacterias hetertrofas. Si hay mucho amonio, ste es oxidado a nitratos por las bacterias nitrificantes. El incremento
en algas y cianobacterias es una respuesta primaria a los
nutrientes inorgnicos, sobretodo el fosfato.
Las secuencias de cidos nucleicos no slo detectan organismos especficos, sino que tambin evidencian actividades. Los genes reporteros, que indican la actividad
de un gen de inters asociado, estn tpicamente insertados en un opern que contiene el gen que codifica la actividad de inters. Esta fusin de genes se logra a veces
empleando un transposn, que inserta al azar el gen reportero en el genoma bacteriano. El proceso produce
mutantes con diferentes fusiones de genes. La expresin
de los genes reporteros da una seal fcil de detectar,
como la produccin de -galactosidasa (gen lac z), fcil
de detectar colorimtricamente en medio slido.
Un gran nmero de marcadores genticos se han descrito, entre ellos genes de resistencia a antibiticos, como el
nptII que codifica resistencia a kanamicina, que fue el primer gen usado como marcador. Este mtodo presenta el
riesgo de expandir resistencias a otros organismos en la
naturaleza.
La sonda construida a partir de un plsmido de la cepa
Kim-5, confirma la presencia de la cepa Kim-5 en los carriles 1,3, y 4.Las restantes no contienen el ADN Kim-5
(figura 9) (Pepper y Josephson, 1998) .
138
Lillian Frioni
duccin endgena de GUS. Puede utilizarse la hibridizacin de ADN para detectar estos marcadores fenotpicos.
1
El uso de marcadores que codifican para la protena luciferasa se ha extendido mucho ya que la formacin de luz
es fcilmente detectable. El gen lux emite luz va la actividad luciferasa sobre el sustrato luciferina: la actividad puede medirse en medio de cultivo slido o lquido (Rhizobium meliloti por siembra de contenidos nodulares, autoradiografa y visualizacin directa de colonias luminiscentes), o an en muestras de suelo o aguas.
El avance en la puesta a punto de todas estas tcnicas
moleculares ha facilitado el seguimiento de un microorganismo en ambientes altamente colonizados, como la rizosfera, restos orgnicos en degradacin y seguramente
conducir a importantes avances en los estudios de interacciones entre microorganismos y entre microorganismos
con plantas, animales y el hombre.
Numerosas tcnicas se emplean para evaluar la actividad
biolgica en ambientes naturales, algunas son aplicaciones de determinaciones clsicas de la microbiologa y otras
incursionan en tcnicas moleculares y taxoqumicas que
permiten el anlisis de las comunidades de ecosistemas
sin el cultivo previo de los microorganismos activos. Estas tcnicas se correlacionan en general con parmetros
fsicos, qumicos y biolgicos empleados.
Secuencias del ADN: las secuencias nicas de los microorganismos son analizadas por varios procedimientos que amplifica estas secuencias: REP-PCR y ERICPCR, analizan secuencias conservadas, repetitivas en
puntos diferentes de una bacteria en particular.
Deteccin de genes que codifican actividades microbianas: empleo de genes reporteros, extraccin de
ARNm, permiten estimar rangos especficos de biodegradacin de xenobiticos, genes lux pueden detectar E. coli,
invasores o alctonos. Estos ltimos, llamados zimgenos por Winogradsky (1924), crecen rpidamente cuando estn disponibles sustratos ricos en energa (pajas,
abonos), los autctonos son los microorganismos que
colonizan los materiales ms recalcitrantes que quedan
luego de un ataque primario.
Criterio de autoctona: posibilidad de aislamiento repetido de la especie en distintas muestras de un mismo
ecosistema, habilidad para usar los nutrientes comunes
del medio y para soportar variaciones del ambiente, alta
densidad del organismo, que ser mayor en lugares con
abundantes nutrientes y condiciones favorables como
en el suelo en la vecindad de races (aspecto cuantitativo).
Otra aproximacin de clasificacin basada en caractersticas de crecimiento es la de la escuela japonesa que
distingue:
123
Lillian Frioni
in situ
clulas
ADN o ARN
clulas
que no obligatoriamente todas las etapas deben cumplirse en un ecosistema dado. As, la nitrificacin de sales
amoniacales puede detenerse por falta de oxgeno, el pH
puede limitar la entrada del N2 a la tierra por fijacin biolgica, la solubilizacin de fosfatos puede inhibirse por escasa actividad biolgica.
Los microorganismos actan sobre la materia orgnica y
mineral con el propsito de obtener:
energa
subunidades para sus macromolculas
hibridacin
ADN marcado simple hebra
vegetales
fijacin
lavado
(elimina el ADN
no fijado
animales
atmsfera
CO2, N2, N2O, CH4, H2
volatilizacin
La proporcin relativa de las distintas especies est afectada en cierto grado por el ambiente: los hongos dominan
en medios cidos de bosques, las bacterias predominan
en suelos inundados, los actinomicetes en ambientes secos, las algas son las primeras colonizadoras en suelos
quemados, erosionados, cuando ste se humedece.
oxidacin
minerales oxidados
minerales reducidos
reduccin
precipitacin
minerales solubles
minerales insolubles
solubilizacin
Lectura de la
seal retenida
(radioactividad,
fluorescencia)
(ambiente). La energa penetra a los ecosistemas sobretodo en forma de luz solar y los organismos fototrfos la
emplean para sintetizar nueva materia orgnica. Esta contiene todos los elementos (C, N, S, P, Fe, etc.) y cuando el
organismo muere se libera la energa de sus constituyentes qumicos que queda disponible para el ecosistema
permitiendo el desarrollo de nuevos organismos. Estos
realizan importantes procesos de sntesis y degradacin,
los auttrofos generan materia orgnica a partir de CO2 y
los otros son organtrofos y participan en la biodegradacin y reciclado de la materia orgnica e inorgnica.
139
mineralizacin
inmovilizacin
122
fijacin
cuantificacin
materia orgnica
biomasa microbiana
restos vegetales, animales
HUMUS
Procesos microbianos
Ciclos biogeoqumicos de los elementos
Los microorganismos participan en las transformaciones
de los elementos en la naturaleza. Si bien cuando un sustrato complejo llega a un ambiente particular, aguas, suelos, aire, comienza a degradarse en su globalidad, es
frecuente realizar el estudio en base a los ciclos biogeoqumicos de los distintos elementos. As, realizaremos esta abstraccin mental para estudiar las transformaciones que sufren los compuestos carbonados, nitrogenados, azufrados, fosforados, con hierro, etc., en combinaciones orgnicas e inorgnicas, en ecosistemas naturales, en particular en el ecosistema suelo-planta-hombre.
Un ciclo biolgico abarca todas las posibles vas que un
elemento puede seguir en la naturaleza (figura 11) aun-
En las transformaciones microbianas de la materia orgnica y mineral encontramos una serie de procesos simultneos y opuestos que podemos resumir en los siguientes 4 pares de procesos.
Mineralizacin inmovilizacin
Mineralizacin
(m)
Sustancia orgnica
Sustancia inorgnica
inmovilizacin
(azcares,
Protenas, etc.)
(i)
140
Lillian Frioni
La mineralizacin, pasaje de formas orgnicas a minerales, es un proceso muy general y ocurre prcticamente en
todas las condiciones ecolgicas. En efecto, no hay sustancia orgnica de origen biolgico que no sea degradado por algn grupo de microorganismos en ambientes
naturales. Existen sustancias naturales de mineralizacin
muy lenta, llamadas recalcitrantes, caso de la lignina,
algunos biocidas naturales, el humus. Numerosas sustancias orgnicas producto de las actividades del hombre llegan a los ecosistemas naturales y son muy difcilmente
degradadas, caso de los pesticidas. Estas sustancias que
producen serias poluciones, se denominan xonobiticas
(captulo 22).
Se habla de inmovilizacin cuando las sustancias inorgnicas son asimiladas por los microorganismos para
integrarlos a su biomasa (protenas, fosfolpidos, etc.). Se
produce una competencia con las plantas y animales,
quienes pueden sufrir carencias temporales. La biomasa
microbiana a su turno ser biodegradada y los nutrientes
vuelven a formas inorgnicas.
Oxidacin-reduccin
=
4
(SO , NO ,
CO2, c. org.)
oxidacin
(o)
Ejemplos:
materia orgnica + NO3
CO2,
H2O, N2 (N2O)
gases a la atmsfera
Sustancia gaseosa
Sustancia
no gaseosa
Volatilizacin
(v)
La fijacin es la conversin de sustancias voltiles en no
voltiles y los ejemplos ms tpicos son:
fijacin biolgica del C (fotosntesis o quimiosntesis)
fijacin biolgica del nitrgeno (FBN), muchas veces realizados en la misma clula (cianobacteria y bacterias fotosinttica fijadoras de N2):
FBN
Numerosos procesos de este tipo involucran a elementos importantes para ecosistemas naturales (C,N,S,P,Fe)
como la nitrificacin, sulfooxidacin, desnitrificacin,
sulfatorreduccin, metanognesis, oxidacin y reduccin
de compuestos con hierro, carbonados, etc. Las plantas
dependen de muchos de estos procesos para obtener
los nutrientes asimilables a partir de la reserva orgnica
del suelo (humus), si no existen aportes exgenos. Estos cambios en el estado de oxido-reduccin de ciertos
elementos, que pueden realizarse tanto en aerobiosis
como en anaerobiosis, son procesos muchas veces generadores de energa para el microorganismo y en algunos casos pueden convertir a los elementos en formas
aa
protenas
(no gaseosos)
La ecologa microbiana estudia las propiedades y el comportamiento de los microorganismos en su ambiente natural, sea el suelo, aguas, alimentos, animales (cuadro 1)
y su estudio interesa a los investigadores por muchos aspectos de dominio pblico (cuadro 2).
no gaseoso
8e, 8H+
N2
2 NH3 + H2
gas nitrogenasa
Fijacin
(f)
gas
Fijacin-volatilizacin
Sustrato reducido
=
121
reduccin
(r)
Sustrato
Solubilizacin-precipitacin
La solubilizacin es un proceso muy importante ya que permite hacer disponible a muchos elementos insolubles, como
Ecosistema: es el sistema limitado en el espacio constituido por el conjunto de condiciones energticas, fsicas,
qumicas y biolgicas que rodean a estos organismos
160
Lillian Frioni
CO
2
CH
4
aerobio
anaerobio
turba
lignito
carbono
interfase
suelo-sedimento
CO
2
CH
4
Los taninos
Son compuestos muy abundantes en ciertas plantas, sobre todo en las conferas. Son molculas de gran tamao
con mltiples funciones fenoles que les permiten formar
complejos estables con protenas, celulosa, etctera.
Los taninos pueden ser:
solubles en agua: poseen molcula glucdica con funciones alcohlicas esterificadas por cido glico o sus
derivados; son hidrolizables qumica o enzimticamente por tanasas
condensados: son molculas de alto peso molecular,
insolubles en agua, algunos resisten la hidrlisis cida
y recuerdan a los flavonoides que se polimerizan para
dar pigmentos pardos.
Un alto nivel de taninos en el suelo puede disminuir la degradacin de molculas orgnicas, sea por toxicidad directa sobre la microflora activa o por la inactivacin de enzimas o formacin de complejos resistentes con el sustrato.
Precipitacin
(p)
Estas reacciones se observan en el caso de compuestos
con P, Fe, etc.
P insoluble
(PO4)2 Ca3
hidroxiapatita, etc.
polvo de huesos, etc.
La composicin qumica de la cutina no se conoce acertadamente, se sabe que la molcula contiene 16-18 cidos
grasos unidos por enlaces ster y puentes de O.
Fe++ + O2
soluble
disponible
La metodologa empleada en el estudio de estos procesos se resume en el cuadro 5 y lo detalles de las tcnicas
se encuentran en el Anexo prctico.
Los hidrocarburos
141
Solubilizacin
(s)
Sustancias solubles
Sustancias insolubles
Ms informacin se posee en la degradacin de los lpidos de la superficie vegetal, como la cutina, que es secretada a partir de clulas epidrmicas oxidndose por el
O2 atmosfrico. Puede recubrirse con ceras. Tambin puede formarse sobre la lmina media pctica o estar mezclada con la celulosa, protegiendo a esas sustancias de
la biodegradacin.
amonio
N-aa
reduccin de los NO3
compuestos orgnicos
reduccin del CO2
HS
S-aa
reduccin de los sulfatos
2
Procesos desasimilativos
Ocurren en condiciones anaerobias, compuestos de C, N y S
actan como aceptores de e- en respiraciones:
N gas Pseudomonas
desnitrificacin: NO3
2
CH Methanobacterium
metanognesis: CO2
4
sulfato reduccin: SO4= H2S Desulfovibrio,
Desulfotomaculum
Bibliografa
Constituyentes hidrfobos
La sntesis de sustancias hidrocarbonadas y su degradacin en el suelo son etapas importantes del ciclo del carbono. Muchos pesticidas estn formados por hidrocarburos modificados y de su biodegradacin depende la duracin de su accin biocida. Detergentes sintticos poseen
tambin esta estructura molecular.
Lillian Frioni
Preguntas de repaso
1) Concepto general de ecologa microbiana.
2) Seale dos ecosistemas diferentes por su tamao y diversidad biolgica, analice las fuentes de energa y de
nutrientes y las poblaciones microbianas dominantes.
3) Por qu la poblacin microbiana del suelo es tan diversa en composicin?
4) Seale ejemplos de poblaciones autctonas y zimgenas en una campo con pradera natural y en otro suelo
que recibe residuos de cosechas.
5) Analice las causas de las diferencias de las velocidades de crecimiento de un microorganismo (celuloltico)
en el suelo y en medio de cultivo.
6) Analice y de ejemplos de interacciones biolgicas en
el ecosistema suelo-planta-microorganismos.
7) Qu fraccin del suelo est en directa relacin con la
actividad biolgica y por qu?
8) Seale tcnicas de estudio a aplicar para incluir a aquellos microorganismos no cultivables.
9) En caso de la actividad respiratoria, cmo evaluara
las actividades reales y las potenciales?
10) Biomasa microbiana: concepto y explique el fundamento de dos tcnicas a aplicar para su evaluacin.
11) Indique alguna tcnica que permita determinar la estructura de una comunidad microbiana basada en el
anlisis de sus cidos nucleicos.
12) Ejemplos de procesos oxidativos en los ciclos biogeoqumicos y sus consecuencias ecolgicas.
13) Idem con los procesos reductivos.
14) Qu procesos ocurren prcticamente en todas las
condiciones ambientales compatibles con la vida? Consecuencias en el ecosistema.
15) Indique procesos de solubilizacin y de precipitacin
de elementos realizados por los microorganismos y sus
consecuencias en la nutricin vegetal.
variaciones relativas
142
glucosa
micelio
actividad
ligninoltica
das
N extracelular
159
Como resumen analizaremos la figura 10 donde se muestra las relaciones del complejo lignocelulosa en el ciclo
del carbono. En efecto, la mayora del carbono orgnico
de la tierra est en forma de compuestos lignocelulsicos, sintetizados a partir del CO2 y en productos de su
degradacin (humus, turba, lignitos y carbn), lentamente mineralizada en la naturaleza ya que la lignina, comparada a un material plstico, aunque de naturaleza biolgica, acta como efectiva barrera que impide la degradacin de los otros componentes.
En ambientes aerbicos, el polmero de lignina es erosionado biolgicamente por enzimas microbianas no especficas a productos ms simples y CO2 o sufre una complexacin con otros constituyentes para formar humus.
Lillian Frioni
Los organismos ms activos son los hongos responsables de las podredumbres de la madera: blanca, parda
y blanda, que han sido muy estudiadas por sus consecuencias en el deterioro de postes, vigas de madera. Son
sobre todo Basidiomycetes y algunos Ascomycetes.
Los hongos de la podredumbre blanca son los ms activos degradadores de la lignina, pudiendo convertir la madera en CO2 y H2O. Degradan lignina y otros polisacridos, con prdida de peso rpida: Pleurotus ostreatus,
Phanerochaete chrisosporium, Polyporus anceps.
Los hongos de la podredumbre parda degradan extensivamente polisacridos y causan modificaciones qumicas
limitadas de la lignina. Son incapaces de metabolizar anillos aromticos y son ms eficientes en la degradacin de
celulosa y hemicelulosas. Atacan cadenas laterales, dejando fenoles que se oxidan dando pigmentos marrones
o pardos. Estudios con Lenzites trabea demostraron que
la descomposicin es sobre todo oxidativa y que la demetilacin de unidades fenlicas y no fenlicas de la madera
constituyen las principales reacciones degradativas. Otros
hongos activos: Poria cocos, Lentinus lepideus, Poria
monticola.
Los hongos de las podredumbres blandas degradan los
principales componentes de la madera. El material se
transforma en una masa oscura, desorganizada, con poca
prdida de peso y la ligmina sufre alteraciones parciales.
Se comprob con algunas especies, como Preussia fleshhkii y Chaetomium piluliferum, descomposicin de anillos
marcados (3% a CO2 en 25 das) y demetoxilacin significativa. Son sobretodo Ascomycetes y Hongos Imperfectos.
El moho Fusarium solani crece sobre ligninas sintticas y
las degrada. Es interesante examinar la capacidad de otros
hongos para degradar ligninas naturales o industriales.
Entre los organismos procariticos, algunas bacterias han
sido referidas como ligninolticas, sobre todo en cultivos
mixtos, en el suelo. Especies de Azotobacter son capaces de degradar tanto los anillos como los grupos metoxilo cuando crecen con compuestos aromticos solubles,
aunque a velocidad menor que la actividad de poblaciones mixtas de bacterias.
Algunos actinomicetes poseen capacidad de degradar lignina, rompen enlaces -aril ter, presentes en ligninas
naturales, pero se requieren mayores conocimientos sobre los mecanismos de degradacin de estos organismos.
Las bacterias atacan sobretodo las cadenas laterales alifticas.
El rol que juegan los animales en la descomposicin de
la lignina no puede ser ignorado, aunque su principal actividad sea una disminucin del peso molecular como consecuencia de destruccin mecnica. Insectos, invertebrados y rumiantes contribuyen a la despolimerizacin
fsica de la lignina e incrementan la digestibilidad de la
lignocelulosa, atacada por los microorganismos asociados a sus tractos gastrointestinales (anaerobiosis).
Degradacin
La mayora de los estudios se realizaron con cultivos de
hongos de la podredumbre blanca, por su reconocida
habilidad de degradar completamente a este polmero. Los
trabajos no son sencillos; se emplearon ligninas libres de
otros compuestos carbonados, como madera molida, o
ligninas sintticas marcadas. En Phanerochaete chrysosporium, uno de los hongos mejor estudiados, se encontr
que ste no crece con lignina sola y requiere un sustrato
metabolizable, como celulosa o glucosa. Incluso en la
naturaleza, la presencia de celulosa estimula la actividad
ligninoltica de este hongo en mayor grado que el succinato o glicerol. P. chrysosporium prefiere pH cidos:
4,0-4,5, temperaturas ptimas relativamente altas, las
fuentes de nitrgeno pueden ser amonio, nitratos o aminocidos, pero altas concentraciones en medio de cultivo
inhiben la degradacin de la lignina y se requieren altas
presiones parciales de O2.
comp. orgnicos
respiracin
plantas, animales
microorganismos
fotoauttrofos:
vegetales, algas
cianobacterias
quimioauttrofos
nitrificantes, etc.
aerbicos
anaerbicos
respiracin anaerobia
bact. fotosintticas anaerobias
fermentacin
CO2
(CH2O)n
143
158
bacterias
metanognicas
(CH2O)n
comp. orgnicos
A nivel mundial, el carbono se cicla a travs de los 4 depsitos principales de C: la atmsfera, los suelos, los ocanos y otros ambientes acuticos, as como los sedimentos y las rocas (cuadro 1). El mayor depsito se encuentra en los sedimentos y las rocas de la corteza terrestre,
pero el tiempo de renovacin es demasiado largo, insignificante a escala humana.
Desde el punto de vista de los organismos, una gran cantidad de carbono se encuentra en las plantas terrestres
(fijacin del CO2). Sin embargo hay ms carbono en la
materia orgnica muerta (humus) que en los organismos
vivos. Las formas ms rpidas de transferencia global del
carbono son por va del CO2 de la atmsfera. Este consti-
X 10 toneladas
Reservas globales
Carbonatos en corteza
terrestre
# # Terrestre
Combustibles fsiles
Carbonatos del suelo
Materia orgnica del suelo
Plantas/animales
Fotosntesis
Respiracin
Prdidas netas/vegetacin
# # ocanos
sedimentos
carbonatos
Balance atmosfrico
Atmsfera
Total
6
1.000 x 10
Flujo
~8
5.000
800
1.500
830
+120
-60
-2
36.700
725
720
-2
Este ciclo no es muy complejo: la fotosntesis y la quimiosntesis auttrofa y la respiracin y/o fermentacin son
los principales procesos en que estn involucrados los
compuestos carbonados.
144
Lillian Frioni
Methylobacter: bacterias aerobias, Gram con sistema de membranas internas. Colonias a veces
rosadas
Metabolizan tanto metano (metanotrficas) o
-CH2O (metilotrfica) como nica fuente de C
Tambin oxidan NH , pero no como nica fuente
3
de energa
Los pasos de oxidacin necesitan metil monooxigenasa
Organismos de la rizosfera y de hojas en plantas
acuticas
Contaminantes frecuentes en tejidos vegetales
Se designa como:
protolignina o lignina natural a los polmeros insolubles en agua formada por polimerizacin deshidrogenativa de alcoholes coniferil, cumaril o sinapil, iniciada
por enzimas.
las ligninas industriales, maderas modificadas qumica o fsicamente, altamente polimerizadas. Difieren
como sustratos de las naturales; poseen en general
menor peso molecular, mayor solubilidad, con lo que
aumenta su biodegradacin: los lignosulfonatos se obtienen por tratamientos con soluciones cidas de
NaHSO3, las lcali ligninas son el resultado de la
extraccin con soda y sulfuro de sodio, las fenol ligninas o etanol ligninas aluden al procedimiento de extraccin, contienen una variedad de compuestos orgnicos
(azcares, polisacridos, aldehidos, etc.) y pueden variar considerablemente en estructura fsica.
157
Microflora ligninoltica
los modelos de lignina, compuestos aromticos solubles en agua sintetizados a partir de derivados del alcohol cinamlico que poseen uniones intermonmeras presentes en la lignina natural.
Los residuos de industrias papeleras y de las que preparan pulpa para papel, las aguas servidas y los desechos
resultantes de una ganadera extensiva, presentan serios
problemas de polucin por su alto contenido en lignina,
lignocelulosa, celulosa, de lenta biodegradacin.
Estos productos deben ser descompuestos antes de su
deposicin en gran escala en el ambiente: los ros que
reciben afluentes de la industria del papel se colorean intensamente y poseen grandes sedimentos de lignina (captulo 21).
A diferencia de los otros biopolmeros, los estudios microbiolgicos han avanzado poco por la complejidad de esta
molcula: en efecto la lignina constituye el producto natural ms recalcitrante, es decir escasamente biodegrada-
Entre los organismos estudiados, slo los microorganismos eucariticos mostraron capacidad para degradar
completamente a la protolignina. La accin de los distintos organismos en el proceso son variados. Los mtodos
empleados para cuantificar la degradacin incluyen estudios con especies aisladas sobre ligninas especficamente marcadas con C14 (en fracciones alqulicas, arlicas o
en los grupos metoxilo) y anlisis qumico y estructural de
maderas en decaimiento inoculadas y no inoculadas con
especies fngicas de inters. La degradacin de la celulosa es cerca de tres veces superior a la de la lignina.
Por la dificultad en la preparacin de medios selectivos, el
aislamiento de especies responsables es muy dificultoso.
Incluso, una disminucin en la concentracin del sustrato,
no siempre es ndice de degradacin. La molcula puede
ser adsorbida a micelios o clulas microbianas, e incluso
la degradacin puede enmascararse por la sntesis de
sustancias del tipo de la lignina por numerosos hongos.
Los estudios se realizan inoculando trozos de madera
esterilizados.
156
Lillian Frioni
OH
HOOC
+CO
2
COOH
OH
cido protocatquico
COOH
cido carboximucnico
cido cetoadpico
N
+NH
CHO
OH
COOH
OH
OH
HC
COOH COOH 2 COOH
+
COOH
COOH
cido actico
cido succinico
COOH
cido picolnico
HCOOH
+
CH COOH
HO
2
H
O
H
H
cido frmico y
c. OH cetovalrico
CH CHO
2
+
CH -CO-COOH
2
acetaldehdo y
cido pirvico
Lignina
contribuyen a incrementar su nivel en ecosistemas naturales que constituye la fuente de nutrientes y de energa
para la mayora de los habitantes del suelo, que son heterotrfos. Los valores citados sobre el aporte del carbono
en la tierra por la fotosntesis vegetal (9,0x1013kg) son
seguramente superados en lagos y ocanos.
La lignina constituye otro polmero natural muy importante responsable del 25% de la fitomasa seca producida
anualmente en la biosfera. Se encuentra en tejidos esenciales como el xilema y el esclernquima y tambin en
hongos como Humcola, Aspergillus y Gliocladium.
Anillo
bencnico
La materia orgnica que llega al suelo a travs de residuos de cosechas, la percolacin en el follaje, las races
y sus productos de descamacin y exudacin, los restos
animales y microbianos sufren una serie de procesos de
degradacin, que aseguran la continuidad de los ciclos
geoqumicas (cuadro 4). Los procesos degradativos bioenergticos realizados por los microorganismos dependern del nivel de O2 (cuadro 5). Los procesos se realizan en:
anaerobiosis: fermentaciones y respiraciones anaerobias (sulfatos, nitratos, CO2, Fe+++, como aceptores de
electrones). La actividad de los organismos del suelo
devolveran a la atmsfera un 40-75% del carbono fijado. La diferencia con la productividad primaria, o sea la
productividad neta, podra llegar a 2,0 x 1013 kg de C
orgnico/ao.
Las ligninas no constituyen un grupo homogneo de compuestos y su estructura vara con los vegetales y dentro
de una especie, con su grado de madurez. Resisten la
hidrlisis cida, en agua caliente y solventes orgnicos,
pero se solubilizan en lcalis.
Carbn
El espectro de absorcin en el ultravioleta (mxima absorcin en la vecindad de los 280 nm) indica que la lignina
145
Carbn
vegetales
citoplasmticos: azcares, protenas y cidos
nucleicos
reserva: protenas, grasas, almidn,glicgeno
componentes estructurales: celulosa, pectina,
lignina
Restos
animales
citoplasmticos: como arriba
de reserva: almidn, protenas y grasas
estructurales: quitina. protenas de pelos y uas;
mucopptidos; material fecal
146
Lillian Frioni
Enzimas
Oligmeros, monmeros
Anaerobiosis
(fermentaciones,
respiraciones
anaerobias)
CO2, H2O,
biomasa
microbiana
Aerobiosis
(ciclo ATC,
respiracin)
28
?
-
?
15-60
10-30
5-30
25-55
-
24
1,3
?
0,5
18
9
17
2,2
2-15
?
5-30
?
1-25
1-13
?
80
?
4,8
?
2,0-7,2
5,2
4,4
?
25-37
?
?
?
4-5
1
pigmentos,
fenoles,etc.
Mtodos de estudio
La materia orgnica nativa o humus, formada por procesos de descomposicin y resntesis posee estructura
diferente a la materia orgnica original. Su estabilidad frente a la descomposicin es mayor que los dems componentes orgnicos del suelo.
El anlisis de la biodegradacin de una sustancia orgnica se realiza por alguno de los mtodos de estudio discutidos en el captulo 8 y en el Anexo prctico, es decir:
actividad respiratoria, anlisis de enzimas involucradas en
los procesos, prdida de peso de los sustratos incorporados al suelo, aparicin de productos del metabolismo, recuentos de grupos fisiolgicos.
Analizaremos las distintas categoras de molculas contenidas en la materia orgnica fresca, cuya complejidad
glucosa. Constituye un elemento importante del exoesqueleto de artrpodos, paredes de hongos y de algunas
algas y huevos de nemtodos. La degradacin no est
limitada como en los polisacridos anteriores por el nitrgeno, ya que su molcula posee 6,9% de este elemento.
Se obtiene fcilmente glucosa y amonio.
Los quitosanos han perdido los grupos acetilos -COCH3 y
estn formados por largas cadenas glucosamina
(C6H9O4NH2). La quitina llega al suelo por aporte de insectos, hongos y otros integrantes de la comunidad. Si se
compara el ataque de pelculas de quitina y celofn se
observa que este ltimo permanece sin degradar por largos perodos de tiempo, mientras que la quitina es colonizada rpidamente (12 das en medio acutico y 12-32
semanas en suelo de bosque).
Numerosos hongos, bacterias y actinomicetes son responsables de la degradacin. Los actinomicetes dominan
en suelos agrcolas, las bacterias en los inundados y los
hongos en clima templado y ligera acidez.
155
gos, mananos en levaduras, glucanos y levanos en cpsulas bacterianas, poliurnidos en Cytophaga. Esta sntesis microbiana puede reflejarse en una aparente disminucin en la degradacin de los polisacridos vegetales.
La degradacin puede dificultarse cuando estn muy unidas a otras sustancias como a la celulosa.
Muchas enzimas estn involucradas:
Xilanasas, arabanasas, etc., actuando tanto sobre cualquier punto de la molcula (endoenzimas) o desde los extremos de aquella (exoenzima). Las xilanasas pueden liberar el dmero xilobiosa o xilosa que penetra en las clulas.
Glicosidasas actan sobre los disacridos u oligsidos
resultantes de la accin de las enzimas anteriores, liberando azcares simples o cidos urnicos metabolizables
dentro de las clulas.
La degradacin de estos polmeros est ms extendida
que la celulolisis.
Glucanasas, que han sido poco estudiadas a pesar de
su rol importante en la lisis de los micelios fngicos. Para
aislar a los microorganismos responsables se introducen
en el suelo trampas de caolinita con paredes de diversos
hongos. La microflora dominante est formada por hongos y actinomicetes.
Mananasas, son producidas extracelularmente por hongos y bacterias, en algunos es constitutiva, en otros inducible y atacan a heteroglicanos con manosa.
Estas enzimas extracelulares sufren degradacin biolgica
y son altamente inhibidas por adsorcin a arcillas y como
las celulasas, estn sometidas a represin catablica cuando la hidrlisis excede la magnitud de asimilacin.
Microflora
Es muy variada: hongos, actinomicetes y bacterias tpicas atacan a alguna fraccin de este complejo grupo en
cultivo puro, empleando el polisacrido como fuente de
carbono y/o energa. Trabajos que inoculan microorganismos sobre materiales vegetales esterilizados demostraron que sta es una actividad muy extendida entre los
microorganismos del suelo. La actividad es estimulada
Sustancias pcticas
Se encuentran en la lmina media de las paredes vegetales y su rol es unir las clulas, aunque tambin se localizan en paredes primarias y secundarias. Existen diferencias en longitud de la cadena y solubilidad:
la protopectina, es insoluble en agua
la pectina, soluble y parcialmente esterificada con metanol
los cidos pcticos, son solubles en agua pero no esterificados
Tres enzimas estn involucradas en la degradacin de
estos materiales:
protopectinasa, que convierte protopectina en pectina
soluble
pectin-metil esterasa, que ataca las uniones metil ster
de la pectina para dar cido pctico y metanol
poligalactouronasa, que ataca uniones entre unidades
de cido galactournico tanto de la pectina como de los
cidos pcticos
Quitina
Este polisacrido est constituido por largas cadenas de
glucosamina, a diferencia de la celulosa que contiene
Bacterias
Hongos
Enzimas
Productos
Celulosa
Hemicelulosa
celulasa, glucosidasas
hemicelulasas
c. orgnicos,
azcares,
cidos urnicos
Pectina
pectinmetilesterasa
galactouronasa
c. pctico, etanol
c. galactournico,
glucosa, arabinosa
Almidn
amilasas, glucosidasas
glucosa, maltosa
Quitina
quitinasa, quitinobiasa
glucosamina, c.
ctico, glucosa,
NH3
Ac.nuclecos
147
Nmero
Lillian Frioni
aminocidos,
cidos orgnicos,
NH3
steres fosfatados
fosfatasas, fitasas
alcohol, inositol,
HPO4-2
steres sulfatados
arilsulfatasa
alcohol, SO4=
Lignina
lacasa, peroxidasa
fenoloxidasa
cidos aromticos,
compuestos fenlicos
C-CO
2
Cantidad de carbono
154
Residuos
de plantas
animales y
microorganismos
Biomasa microbiana
C- Humus
Residuos frescos
agregados
Tiempo
Residuos
humificados
148
Lillian Frioni
Glcidos
Azcares simples y oligsidos
Estos compuestos llegan al suelo o se originan en l por
sntesis y degradacin de polisidos. Representan menos del 2% del carbono total del suelo y su presencia es
muy efmera, excepto tal vez, en el caso de la sacarosa
(remolacha o caa).
Su concentracin en el suelo refleja el equilibrio entre las
velocidades de aparicin y degradacin. Distintas vas metablicas han sido reconocidas en los suelos: la de la gliclisis (exosa di-fosfato), el ciclo de la exosa monofosfato
(Enter-Doudoroff), que originan azcares de 3, 4, 5 6
carbonos. En la clula microbiana, los glcidos proveen
de energa y subunidades para su biosntesis. La gran
mayora de los microorganismos del suelo pueden emplear los cidos orgnicos producidos por oxidaciones
de hidratos de carbono y protenas, de modo que el nivel
de cidos orgnicos de cadena simple es muy bajo y slo
pueden acumularse en condiciones de anaerobiosis.
Polisidos de reserva como almidn, glucgeno o los
provenientes de paredes celulares: celulosa, hemicelulosas y compuestos pcticos, polmeros de aminoazcares,
como la quitina.
Sustancias aromticas: simples como los fenoles, o polimerizadas como los taninos o la lignina.
Constituyentes hidrfobos: ceras, cutina, grasas.
Almidn
Representa una reserva para los vegetales que se encuentra transitoriamente en hojas y es movilizado hacia
los tallos, bulbos, rizomas, frutos y semillas. Integra en
pequea proporcin las paredes de algas. Como es movilizado en las clulas antes de la muerte llega al suelo en
poca cantidad. Est formado por amilosa y amilopectina; el primer componente posee estructura lineal, con
varios cientos de unidades glucosa unidas por enlaces
glucosdicos 1-4. En la amilopectina se presenta esta
misma organizacin, pero la molcula es ramificada, con
cadenas laterales unidas por enlaces 1-6. El almidn
contiene un 70-90% de amilosa, pero esta proporcin vara en distintas especies vegetales.
Microflora
La microflora amiloltica de los suelos es abundante, los
recuentos en medio slido presentan valores de 105 a
107/gramo de suelo. Una multiplicidad de bacterias poseen las enzimas especficas, y son Gram positivas o negativas, esporuladas o asporgenas, aerobias o anaerobias. Numerosos actinomicetes pueden emplear este polisacrido as como muchos hongos filamentosos. Otros
sustratos pueden ser empleados por estos microorganismos, incluida la celulosa.
La hidrlisis es catalizada por amilasas ( glucosidasas)
inducibles: se reconocen tres tipos: la , la amilasa y
una glucosidasa.
La amilasa es una endoenzima que acta al azar sobre amilosa y amilopectina. Con amilosa se acumulan
grandes cantidades de maltosa y pequeas cantidades
de glucosa y del trisacrido maltotriosa. En la amilopectina esta enzima detiene su hidrlisis en las ramificaciones, acumulndose fracciones de alto peso molecular (dextrinas). La amilasa es exoenzima, actuando desde los
extremos de la molcula, liberndose maltosa y dextrinas. Al llegar a una ramificacin se detiene la hidrlisis.
Otros organismos poseen otra exoenzima, la amilo 1-6
glucosidasa (glucoamilasa) capaz de hidrolizar la molcula en puntos de ramificacin, liberando al medio dextrinas y oligosacridos; los que no permanecen mucho
tiempo en el suelo pues otras enzimas los llevan a glucosa, asimilada por las clulas.
Estas enzimas son inducibles, pero la habilidad para producirlas depende del tipo de almidn de diferentes especies vegetales. La naturaleza exocelular las hace sensibles al ambiente y pueden ser muy adsorbidas por |os
coloides. Los azcares simples solubles penetran en la
clula donde son metabolizados.
Ecologa
Fuera de los casos descriptos de inhibicin de la degradacin por adsorcin de enzimas, el almidn es descom-
153
Celulosa
Lignina
% celulosa
descompuesta
A
B
C
D
E
99,2
95,5
89,3
82,7
75,6
0,0
3,3
6,3
11,9
12,6
100,0
95,6
83,1
37,9
17,7
En resumen: este importante proceso biolgico que asegura la degradacin de la gran masa de celulosa que cada
ao llega a suelos y aguas es realizado por una microflora variada (bacterias, incluidos los actinomicetes, hongos, protozoos), aunque el nmero de especies celulolticas no es muy amplio. El proceso ocurre en todos los
ambientes tanto en condiciones de aerobiosis como de
anegamiento. En ambientes cidos dominan los hongos;
en los cultivados y neutros, las bacterias; bajo desecacin y ligera alcalinidad, los actinomicetes.
La fauna: caros, colmbolos, termites, actan moliendo
y macerando a la celulosa nativa, lo que facilita su degradacin, pero no poseen celulasas. La microflora de su trac-
Hemicelulosa
Celulosa
0-4
4-8
8-16
43,5
6,5
5,4
2,3
9,1
25,0
150
300 horas
% celulosa degradada
Temperatura: el proceso ocurre desde temperaturas cercanas al punto de congelamiento hasta aproximadamente 65C. Los aumentos de temperatura inducen variaciones en la composicin de la poblacin con incrementos
de la velocidad de degradacin. En el rango termfilo son
Clostridium, actinomicetes y hongos, las poblaciones dominantes, aunque estos organismos son considerados
ms bien como mesfilos resistentes. En el suelo la mayora de las especies son mesfilas.
100
80
a) pH y aireacin
pH
aereacin
40
20
40
60
80
N-mineral (mg/kg)
4,5
aerobiosis
anaerobiosis
aerobiosis
anaerobiosis
7,0
Figura 6- Efecto de dosis creciente de N mineral
en la celulolisis
% celulosa
coeficiente de
degradada
mineralizacin
en 15 das
62,5
14,0
81,2
21,0
3,6
0,1
11,2
0,15
% celulosa descompuesta
no cultivado
cultivado
48
16
0
91
72
34
Otros nutrientes: se pensaba que los celulolticos verdaderos (con la enzima C1) no podan emplear otra fuente
de carbono y energa que no fuera la celulosa. Pero ac-
Constituyentes
Inulina
Constituye otro polisacrido de reserva, formado por unidades de fructosa (25-28), unidos a la cadena lateral por
enlaces 2-1. Numerosos microorganismos: bacterias, actinomicetes, hongos, poseen inulasa, exoenzima que libera un disacrido de fructosa. Su degradacin ocurre simultneamente con la del almidn.
centeno jven
Grasas y ceras
2,35
10,41
Solubles en agua
29,54
17,24
7,29
Hemicelulosas
12,67
13,14
18,98
Celulosa
17,84
23,65
16,43
Lignina
10,61
8,95
22,68
Protenas
12,26
12,81
2,19
Cenizas
12,55
10,30
2,51
joven
antes espigazn
23,92
antes floracin
casi maduro
celulosa
suelo solo
lignina
celulosa sola
Humedad y aireacin: como vimos, la microflora especfica puede ser aerobia o anaerobia, de modo que el nivel
hdrico de los suelos condicionar la actividad de cada
uno de estos grupos. Por su rendimiento energtico el
proceso es ms lento en ambientes anegados o en suelos con pobre intercambio de gases.
sitivas por steres fosfatados, los cidos teicoicos y lipoprotenas y lipopolisacridos en las Gram negativas.
pentosanos
celulosa y c. hmicos
puesto en todos los ambientes por accin de una microflora poco especfica. Los productos finales dependern
no solamente de la microflora dominante sino tambin de
las condiciones ecolgicas. Algunos autores han sealado velocidades diferentes de degradacin segn el origen
del almidn: el de arroz parece ser atacado por un gran
nmero de microorganismos.
soluble en
eter
celulosa + amonio
protenas
O2 consumido
149
cenizas
Lillian Frioni
hidrosoluble
152
Celulosa
Como vimos, la celulosa es uno de los constituyentes vegetales ms importantes, representando un 15% del peso
seco de leguminosas y gramneas jvenes y ms de 50%
en materiales leosos (en promedio representa 1/3 del
CO2 fijado por las plantas). Sin embargo, los anlisis de
suelos indican que slo representa una pequea fraccin
(menos del 1%) de la materia orgnica.
La celulolisis tal vez constituya la etapa mejor conocida
del ciclo del carbono. Las investigaciones en estos aspectos han sido estimuladas por los graves problemas ocasionados por los microorganismos celulolticos en la industria textil y papelera. Se calcula que anualmente unas
150
Lillian Frioni
10 millones de toneladas de carbono se fijan como celulosa, cantidad que los suelos deben degradar en el mismo
perodo.
La celulosa est constituida por unidades de glucosa, unidas en largas cadenas por enlaces 1-4 glucosdicos.
Pueden presentarse entre 2.000 a 10.000 y hasta a veces
ms de 15.000 unidades de glucosa en la molcula, segn la especie vegetal. La estructura fsica tambin vara,
las cadenas se renen en microfibrillas entre las cuales
se distinguen mallas cristalinas separadas por regiones
amorfas. Las mallas estn fuertemente unidas por puentes H o por fuerzas de Van der Waals. Segn la estructura, la orientacin de las fibrillas, la proporcin de constituyentes secundarios, la celulosa se comporta diferentemente frente a la biodegradacin.
Adems, los tratamientos mecnicos a que se somete a
las preparaciones industriales afectan la biodegradacin:
papel, celofn, celulosa precipitada, carboximetilcelulosa
(CMC) son empleados en los medios de cultivo, o llegan
al suelo. Estos preparados difieren en estructura y propiedades fsicas de la celulosa natural.
Microorganismos
Este polisacrido es hidrolizado por un complejo enzimtico, no completamente caracterizado, conocido como celulasa, presente en una variedad de bacterias, actinomicetes, hongos y protozoos. Las especies celulolticas no
son muy numerosas dentro de cada grupo. El cuadro 10
presenta las caractersticas de los microorganismos celulolticos.
La celulosa es en ocasiones degradada ms rpidamente
en cultivos mixtos, aun cuando los organismos asociados
sean incapaces individualmente de atacar el polisacrido. La microflora primaria se favorece por la remocin de
los productos de la degradacin o por la eliminacin de
sustancias inhibidoras (comensalismo).
Las bacterias son activas degradadoras, algunas especies actan como celulolticos verdaderos (atacan a la
celulosa nativa) como los gneros Cytophaga y Sporocytophaga. Dentro de los Actinomycetales numerosos
Streptomyces son capaces de emplear celulosa como
Orden
Gnero
Ecologa
protozoos
Hertmella
Rhizoctonia,
Humicola,
Botrytrichum
Alternaria,
Rhizopus
hongos
Ascomycetes
C1
hidrlisis
oxidacin?
Celulolisis: Las bacterias se observan a nivel de las regiones amorfas, pero no penetran en el lumen de las fibras salvo que stas estn lesionadas. Los hongos pueden atravesar las paredes a nivel de puntuaciones o fisuras: las fibras se hinchan y se observan estras profundas. Cambia la reaccin frente al iodo, se altera la estructura fsica y el material se transforma en una masa muscilaginosa hasta su desaparicin total.
La celulasa cataliza la conversin de la celulosa insoluble en mono, di, tri o tetrasacridos. Los dos primeros son
solubles en agua y penetran en la clula integrando las
vas metablicas que rinden energa o proveen de subunidades para sus macromolculas. La figura 4 esquematiza la degradacin. Se han determinado hasta 14 com-
glucosidasa que cataliza la ltima etapa de la degradacin, es una hidrolasa que lleva la celobiosa, celotriosa y otros oligosacridos de bajo peso molecular
hasta glucosa. El antiguo trmino de celobiasa es inapropiado pues la celobiosa no constituye su nico
sustrato.
Ecologa
celulosa activada
Entre los factores ms importantes que afectan a este proceso en la naturaleza citaremos el nivel de nitrgeno disponible, la temperatura, aireacin, humedad, pH, presencia de otros carbohidratos en los restos.
Los hongos son activos degradadores en ambientes desfavorables para las bacterias: pH cidos, alta humedad.
Numerosas especies participan en la degradacin de la
fraccin lignocelulsica de restos vegetales.
Los protozoos son activos degradadores en el rumen, en
anaerobiosis; en el suelo y aguas prefieren la fagocitosis
de pequeos organismos.
celulosa nativa
151
celobiosa
celotriosa
celotetralosa
Nitrgeno: la aplicacin de N-inorgnico estimula la celulolisis, hecho explicable ya que la celulosa no contiene
este elemento y la microflora lo requiere junto a otros minerales para satisfacer sus necesidades plsticas.
beta glucosidasa
glucosa
anaerobiosis
aerobiosis
biomasa microbiana, CO2
H2O, cidos urnicos, etc.
Figura 4- Celulolisis
La accin se realiza al azar (accin endoglucanasa), liberndose productos solubles como la celobiosa, aunque
los productos finales dependen del tipo de organismo (otros
oligosacridos y a veces glucosa).
Si el ataque se produce desde los extremos de la molcula (accin exoenzimtica), la celobiosa es el producto dominante. Estos trminos no deben confundirse con la accin a distancia de la clula productora (la C1 y Cx deben
actuar extracelularmente dada la insolubilidad de los sustratos y sus grandes dimensiones).
150
Lillian Frioni
10 millones de toneladas de carbono se fijan como celulosa, cantidad que los suelos deben degradar en el mismo
perodo.
La celulosa est constituida por unidades de glucosa, unidas en largas cadenas por enlaces 1-4 glucosdicos.
Pueden presentarse entre 2.000 a 10.000 y hasta a veces
ms de 15.000 unidades de glucosa en la molcula, segn la especie vegetal. La estructura fsica tambin vara,
las cadenas se renen en microfibrillas entre las cuales
se distinguen mallas cristalinas separadas por regiones
amorfas. Las mallas estn fuertemente unidas por puentes H o por fuerzas de Van der Waals. Segn la estructura, la orientacin de las fibrillas, la proporcin de constituyentes secundarios, la celulosa se comporta diferentemente frente a la biodegradacin.
Adems, los tratamientos mecnicos a que se somete a
las preparaciones industriales afectan la biodegradacin:
papel, celofn, celulosa precipitada, carboximetilcelulosa
(CMC) son empleados en los medios de cultivo, o llegan
al suelo. Estos preparados difieren en estructura y propiedades fsicas de la celulosa natural.
Microorganismos
Este polisacrido es hidrolizado por un complejo enzimtico, no completamente caracterizado, conocido como celulasa, presente en una variedad de bacterias, actinomicetes, hongos y protozoos. Las especies celulolticas no
son muy numerosas dentro de cada grupo. El cuadro 10
presenta las caractersticas de los microorganismos celulolticos.
La celulosa es en ocasiones degradada ms rpidamente
en cultivos mixtos, aun cuando los organismos asociados
sean incapaces individualmente de atacar el polisacrido. La microflora primaria se favorece por la remocin de
los productos de la degradacin o por la eliminacin de
sustancias inhibidoras (comensalismo).
Las bacterias son activas degradadoras, algunas especies actan como celulolticos verdaderos (atacan a la
celulosa nativa) como los gneros Cytophaga y Sporocytophaga. Dentro de los Actinomycetales numerosos
Streptomyces son capaces de emplear celulosa como
Orden
Gnero
Ecologa
protozoos
Hertmella
Rhizoctonia,
Humicola,
Botrytrichum
Alternaria,
Rhizopus
hongos
Ascomycetes
C1
hidrlisis
oxidacin?
Celulolisis: Las bacterias se observan a nivel de las regiones amorfas, pero no penetran en el lumen de las fibras salvo que stas estn lesionadas. Los hongos pueden atravesar las paredes a nivel de puntuaciones o fisuras: las fibras se hinchan y se observan estras profundas. Cambia la reaccin frente al iodo, se altera la estructura fsica y el material se transforma en una masa muscilaginosa hasta su desaparicin total.
La celulasa cataliza la conversin de la celulosa insoluble en mono, di, tri o tetrasacridos. Los dos primeros son
solubles en agua y penetran en la clula integrando las
vas metablicas que rinden energa o proveen de subunidades para sus macromolculas. La figura 4 esquematiza la degradacin. Se han determinado hasta 14 com-
glucosidasa que cataliza la ltima etapa de la degradacin, es una hidrolasa que lleva la celobiosa, celotriosa y otros oligosacridos de bajo peso molecular
hasta glucosa. El antiguo trmino de celobiasa es inapropiado pues la celobiosa no constituye su nico
sustrato.
Ecologa
celulosa activada
Entre los factores ms importantes que afectan a este proceso en la naturaleza citaremos el nivel de nitrgeno disponible, la temperatura, aireacin, humedad, pH, presencia de otros carbohidratos en los restos.
Los hongos son activos degradadores en ambientes desfavorables para las bacterias: pH cidos, alta humedad.
Numerosas especies participan en la degradacin de la
fraccin lignocelulsica de restos vegetales.
Los protozoos son activos degradadores en el rumen, en
anaerobiosis; en el suelo y aguas prefieren la fagocitosis
de pequeos organismos.
celulosa nativa
151
celobiosa
celotriosa
celotetralosa
Nitrgeno: la aplicacin de N-inorgnico estimula la celulolisis, hecho explicable ya que la celulosa no contiene
este elemento y la microflora lo requiere junto a otros minerales para satisfacer sus necesidades plsticas.
beta glucosidasa
glucosa
anaerobiosis
aerobiosis
biomasa microbiana, CO2
H2O, cidos urnicos, etc.
Figura 4- Celulolisis
La accin se realiza al azar (accin endoglucanasa), liberndose productos solubles como la celobiosa, aunque
los productos finales dependen del tipo de organismo (otros
oligosacridos y a veces glucosa).
Si el ataque se produce desde los extremos de la molcula (accin exoenzimtica), la celobiosa es el producto dominante. Estos trminos no deben confundirse con la accin a distancia de la clula productora (la C1 y Cx deben
actuar extracelularmente dada la insolubilidad de los sustratos y sus grandes dimensiones).
150
300 horas
% celulosa degradada
Temperatura: el proceso ocurre desde temperaturas cercanas al punto de congelamiento hasta aproximadamente 65C. Los aumentos de temperatura inducen variaciones en la composicin de la poblacin con incrementos
de la velocidad de degradacin. En el rango termfilo son
Clostridium, actinomicetes y hongos, las poblaciones dominantes, aunque estos organismos son considerados
ms bien como mesfilos resistentes. En el suelo la mayora de las especies son mesfilas.
100
80
a) pH y aireacin
pH
aereacin
40
20
40
60
80
N-mineral (mg/kg)
4,5
aerobiosis
anaerobiosis
aerobiosis
anaerobiosis
7,0
Figura 6- Efecto de dosis creciente de N mineral
en la celulolisis
% celulosa
coeficiente de
degradada
mineralizacin
en 15 das
62,5
14,0
81,2
21,0
3,6
0,1
11,2
0,15
% celulosa descompuesta
no cultivado
cultivado
48
16
0
91
72
34
Otros nutrientes: se pensaba que los celulolticos verdaderos (con la enzima C1) no podan emplear otra fuente
de carbono y energa que no fuera la celulosa. Pero ac-
Constituyentes
Inulina
Constituye otro polisacrido de reserva, formado por unidades de fructosa (25-28), unidos a la cadena lateral por
enlaces 2-1. Numerosos microorganismos: bacterias, actinomicetes, hongos, poseen inulasa, exoenzima que libera un disacrido de fructosa. Su degradacin ocurre simultneamente con la del almidn.
centeno jven
Grasas y ceras
2,35
10,41
Solubles en agua
29,54
17,24
7,29
Hemicelulosas
12,67
13,14
18,98
Celulosa
17,84
23,65
16,43
Lignina
10,61
8,95
22,68
Protenas
12,26
12,81
2,19
Cenizas
12,55
10,30
2,51
joven
antes espigazn
23,92
antes floracin
casi maduro
celulosa
suelo solo
lignina
celulosa sola
Humedad y aireacin: como vimos, la microflora especfica puede ser aerobia o anaerobia, de modo que el nivel
hdrico de los suelos condicionar la actividad de cada
uno de estos grupos. Por su rendimiento energtico el
proceso es ms lento en ambientes anegados o en suelos con pobre intercambio de gases.
sitivas por steres fosfatados, los cidos teicoicos y lipoprotenas y lipopolisacridos en las Gram negativas.
pentosanos
celulosa y c. hmicos
puesto en todos los ambientes por accin de una microflora poco especfica. Los productos finales dependern
no solamente de la microflora dominante sino tambin de
las condiciones ecolgicas. Algunos autores han sealado velocidades diferentes de degradacin segn el origen
del almidn: el de arroz parece ser atacado por un gran
nmero de microorganismos.
soluble en
eter
celulosa + amonio
protenas
O2 consumido
149
cenizas
Lillian Frioni
hidrosoluble
152
Celulosa
Como vimos, la celulosa es uno de los constituyentes vegetales ms importantes, representando un 15% del peso
seco de leguminosas y gramneas jvenes y ms de 50%
en materiales leosos (en promedio representa 1/3 del
CO2 fijado por las plantas). Sin embargo, los anlisis de
suelos indican que slo representa una pequea fraccin
(menos del 1%) de la materia orgnica.
La celulolisis tal vez constituya la etapa mejor conocida
del ciclo del carbono. Las investigaciones en estos aspectos han sido estimuladas por los graves problemas ocasionados por los microorganismos celulolticos en la industria textil y papelera. Se calcula que anualmente unas
148
Lillian Frioni
Glcidos
Azcares simples y oligsidos
Estos compuestos llegan al suelo o se originan en l por
sntesis y degradacin de polisidos. Representan menos del 2% del carbono total del suelo y su presencia es
muy efmera, excepto tal vez, en el caso de la sacarosa
(remolacha o caa).
Su concentracin en el suelo refleja el equilibrio entre las
velocidades de aparicin y degradacin. Distintas vas metablicas han sido reconocidas en los suelos: la de la gliclisis (exosa di-fosfato), el ciclo de la exosa monofosfato
(Enter-Doudoroff), que originan azcares de 3, 4, 5 6
carbonos. En la clula microbiana, los glcidos proveen
de energa y subunidades para su biosntesis. La gran
mayora de los microorganismos del suelo pueden emplear los cidos orgnicos producidos por oxidaciones
de hidratos de carbono y protenas, de modo que el nivel
de cidos orgnicos de cadena simple es muy bajo y slo
pueden acumularse en condiciones de anaerobiosis.
Polisidos de reserva como almidn, glucgeno o los
provenientes de paredes celulares: celulosa, hemicelulosas y compuestos pcticos, polmeros de aminoazcares,
como la quitina.
Sustancias aromticas: simples como los fenoles, o polimerizadas como los taninos o la lignina.
Constituyentes hidrfobos: ceras, cutina, grasas.
Almidn
Representa una reserva para los vegetales que se encuentra transitoriamente en hojas y es movilizado hacia
los tallos, bulbos, rizomas, frutos y semillas. Integra en
pequea proporcin las paredes de algas. Como es movilizado en las clulas antes de la muerte llega al suelo en
poca cantidad. Est formado por amilosa y amilopectina; el primer componente posee estructura lineal, con
varios cientos de unidades glucosa unidas por enlaces
glucosdicos 1-4. En la amilopectina se presenta esta
misma organizacin, pero la molcula es ramificada, con
cadenas laterales unidas por enlaces 1-6. El almidn
contiene un 70-90% de amilosa, pero esta proporcin vara en distintas especies vegetales.
Microflora
La microflora amiloltica de los suelos es abundante, los
recuentos en medio slido presentan valores de 105 a
107/gramo de suelo. Una multiplicidad de bacterias poseen las enzimas especficas, y son Gram positivas o negativas, esporuladas o asporgenas, aerobias o anaerobias. Numerosos actinomicetes pueden emplear este polisacrido as como muchos hongos filamentosos. Otros
sustratos pueden ser empleados por estos microorganismos, incluida la celulosa.
La hidrlisis es catalizada por amilasas ( glucosidasas)
inducibles: se reconocen tres tipos: la , la amilasa y
una glucosidasa.
La amilasa es una endoenzima que acta al azar sobre amilosa y amilopectina. Con amilosa se acumulan
grandes cantidades de maltosa y pequeas cantidades
de glucosa y del trisacrido maltotriosa. En la amilopectina esta enzima detiene su hidrlisis en las ramificaciones, acumulndose fracciones de alto peso molecular (dextrinas). La amilasa es exoenzima, actuando desde los
extremos de la molcula, liberndose maltosa y dextrinas. Al llegar a una ramificacin se detiene la hidrlisis.
Otros organismos poseen otra exoenzima, la amilo 1-6
glucosidasa (glucoamilasa) capaz de hidrolizar la molcula en puntos de ramificacin, liberando al medio dextrinas y oligosacridos; los que no permanecen mucho
tiempo en el suelo pues otras enzimas los llevan a glucosa, asimilada por las clulas.
Estas enzimas son inducibles, pero la habilidad para producirlas depende del tipo de almidn de diferentes especies vegetales. La naturaleza exocelular las hace sensibles al ambiente y pueden ser muy adsorbidas por |os
coloides. Los azcares simples solubles penetran en la
clula donde son metabolizados.
Ecologa
Fuera de los casos descriptos de inhibicin de la degradacin por adsorcin de enzimas, el almidn es descom-
153
Celulosa
Lignina
% celulosa
descompuesta
A
B
C
D
E
99,2
95,5
89,3
82,7
75,6
0,0
3,3
6,3
11,9
12,6
100,0
95,6
83,1
37,9
17,7
En resumen: este importante proceso biolgico que asegura la degradacin de la gran masa de celulosa que cada
ao llega a suelos y aguas es realizado por una microflora variada (bacterias, incluidos los actinomicetes, hongos, protozoos), aunque el nmero de especies celulolticas no es muy amplio. El proceso ocurre en todos los
ambientes tanto en condiciones de aerobiosis como de
anegamiento. En ambientes cidos dominan los hongos;
en los cultivados y neutros, las bacterias; bajo desecacin y ligera alcalinidad, los actinomicetes.
La fauna: caros, colmbolos, termites, actan moliendo
y macerando a la celulosa nativa, lo que facilita su degradacin, pero no poseen celulasas. La microflora de su trac-
Hemicelulosa
Celulosa
0-4
4-8
8-16
43,5
6,5
5,4
2,3
9,1
25,0
gos, mananos en levaduras, glucanos y levanos en cpsulas bacterianas, poliurnidos en Cytophaga. Esta sntesis microbiana puede reflejarse en una aparente disminucin en la degradacin de los polisacridos vegetales.
La degradacin puede dificultarse cuando estn muy unidas a otras sustancias como a la celulosa.
Muchas enzimas estn involucradas:
Xilanasas, arabanasas, etc., actuando tanto sobre cualquier punto de la molcula (endoenzimas) o desde los extremos de aquella (exoenzima). Las xilanasas pueden liberar el dmero xilobiosa o xilosa que penetra en las clulas.
Glicosidasas actan sobre los disacridos u oligsidos
resultantes de la accin de las enzimas anteriores, liberando azcares simples o cidos urnicos metabolizables
dentro de las clulas.
La degradacin de estos polmeros est ms extendida
que la celulolisis.
Glucanasas, que han sido poco estudiadas a pesar de
su rol importante en la lisis de los micelios fngicos. Para
aislar a los microorganismos responsables se introducen
en el suelo trampas de caolinita con paredes de diversos
hongos. La microflora dominante est formada por hongos y actinomicetes.
Mananasas, son producidas extracelularmente por hongos y bacterias, en algunos es constitutiva, en otros inducible y atacan a heteroglicanos con manosa.
Estas enzimas extracelulares sufren degradacin biolgica
y son altamente inhibidas por adsorcin a arcillas y como
las celulasas, estn sometidas a represin catablica cuando la hidrlisis excede la magnitud de asimilacin.
Microflora
Es muy variada: hongos, actinomicetes y bacterias tpicas atacan a alguna fraccin de este complejo grupo en
cultivo puro, empleando el polisacrido como fuente de
carbono y/o energa. Trabajos que inoculan microorganismos sobre materiales vegetales esterilizados demostraron que sta es una actividad muy extendida entre los
microorganismos del suelo. La actividad es estimulada
Sustancias pcticas
Se encuentran en la lmina media de las paredes vegetales y su rol es unir las clulas, aunque tambin se localizan en paredes primarias y secundarias. Existen diferencias en longitud de la cadena y solubilidad:
la protopectina, es insoluble en agua
la pectina, soluble y parcialmente esterificada con metanol
los cidos pcticos, son solubles en agua pero no esterificados
Tres enzimas estn involucradas en la degradacin de
estos materiales:
protopectinasa, que convierte protopectina en pectina
soluble
pectin-metil esterasa, que ataca las uniones metil ster
de la pectina para dar cido pctico y metanol
poligalactouronasa, que ataca uniones entre unidades
de cido galactournico tanto de la pectina como de los
cidos pcticos
Quitina
Este polisacrido est constituido por largas cadenas de
glucosamina, a diferencia de la celulosa que contiene
Bacterias
Hongos
Enzimas
Productos
Celulosa
Hemicelulosa
celulasa, glucosidasas
hemicelulasas
c. orgnicos,
azcares,
cidos urnicos
Pectina
pectinmetilesterasa
galactouronasa
c. pctico, etanol
c. galactournico,
glucosa, arabinosa
Almidn
amilasas, glucosidasas
glucosa, maltosa
Quitina
quitinasa, quitinobiasa
glucosamina, c.
ctico, glucosa,
NH3
Ac.nuclecos
147
Nmero
Lillian Frioni
aminocidos,
cidos orgnicos,
NH3
steres fosfatados
fosfatasas, fitasas
alcohol, inositol,
HPO4-2
steres sulfatados
arilsulfatasa
alcohol, SO4=
Lignina
lacasa, peroxidasa
fenoloxidasa
cidos aromticos,
compuestos fenlicos
C-CO
2
Cantidad de carbono
154
Residuos
de plantas
animales y
microorganismos
Biomasa microbiana
C- Humus
Residuos frescos
agregados
Tiempo
Residuos
humificados
146
Lillian Frioni
Enzimas
Oligmeros, monmeros
Anaerobiosis
(fermentaciones,
respiraciones
anaerobias)
CO2, H2O,
biomasa
microbiana
Aerobiosis
(ciclo ATC,
respiracin)
28
?
-
?
15-60
10-30
5-30
25-55
-
24
1,3
?
0,5
18
9
17
2,2
2-15
?
5-30
?
1-25
1-13
?
80
?
4,8
?
2,0-7,2
5,2
4,4
?
25-37
?
?
?
4-5
1
pigmentos,
fenoles,etc.
Mtodos de estudio
La materia orgnica nativa o humus, formada por procesos de descomposicin y resntesis posee estructura
diferente a la materia orgnica original. Su estabilidad frente a la descomposicin es mayor que los dems componentes orgnicos del suelo.
El anlisis de la biodegradacin de una sustancia orgnica se realiza por alguno de los mtodos de estudio discutidos en el captulo 8 y en el Anexo prctico, es decir:
actividad respiratoria, anlisis de enzimas involucradas en
los procesos, prdida de peso de los sustratos incorporados al suelo, aparicin de productos del metabolismo, recuentos de grupos fisiolgicos.
Analizaremos las distintas categoras de molculas contenidas en la materia orgnica fresca, cuya complejidad
glucosa. Constituye un elemento importante del exoesqueleto de artrpodos, paredes de hongos y de algunas
algas y huevos de nemtodos. La degradacin no est
limitada como en los polisacridos anteriores por el nitrgeno, ya que su molcula posee 6,9% de este elemento.
Se obtiene fcilmente glucosa y amonio.
Los quitosanos han perdido los grupos acetilos -COCH3 y
estn formados por largas cadenas glucosamina
(C6H9O4NH2). La quitina llega al suelo por aporte de insectos, hongos y otros integrantes de la comunidad. Si se
compara el ataque de pelculas de quitina y celofn se
observa que este ltimo permanece sin degradar por largos perodos de tiempo, mientras que la quitina es colonizada rpidamente (12 das en medio acutico y 12-32
semanas en suelo de bosque).
Numerosos hongos, bacterias y actinomicetes son responsables de la degradacin. Los actinomicetes dominan
en suelos agrcolas, las bacterias en los inundados y los
hongos en clima templado y ligera acidez.
155
156
Lillian Frioni
OH
HOOC
+CO
2
COOH
OH
cido protocatquico
COOH
cido carboximucnico
cido cetoadpico
N
+NH
CHO
OH
COOH
OH
OH
HC
COOH COOH 2 COOH
+
COOH
COOH
cido actico
cido succinico
COOH
cido picolnico
HCOOH
+
CH COOH
HO
2
H
O
H
H
cido frmico y
c. OH cetovalrico
CH CHO
2
+
CH -CO-COOH
2
acetaldehdo y
cido pirvico
Lignina
contribuyen a incrementar su nivel en ecosistemas naturales que constituye la fuente de nutrientes y de energa
para la mayora de los habitantes del suelo, que son heterotrfos. Los valores citados sobre el aporte del carbono
en la tierra por la fotosntesis vegetal (9,0x1013kg) son
seguramente superados en lagos y ocanos.
La lignina constituye otro polmero natural muy importante responsable del 25% de la fitomasa seca producida
anualmente en la biosfera. Se encuentra en tejidos esenciales como el xilema y el esclernquima y tambin en
hongos como Humcola, Aspergillus y Gliocladium.
Anillo
bencnico
La materia orgnica que llega al suelo a travs de residuos de cosechas, la percolacin en el follaje, las races
y sus productos de descamacin y exudacin, los restos
animales y microbianos sufren una serie de procesos de
degradacin, que aseguran la continuidad de los ciclos
geoqumicas (cuadro 4). Los procesos degradativos bioenergticos realizados por los microorganismos dependern del nivel de O2 (cuadro 5). Los procesos se realizan en:
anaerobiosis: fermentaciones y respiraciones anaerobias (sulfatos, nitratos, CO2, Fe+++, como aceptores de
electrones). La actividad de los organismos del suelo
devolveran a la atmsfera un 40-75% del carbono fijado. La diferencia con la productividad primaria, o sea la
productividad neta, podra llegar a 2,0 x 1013 kg de C
orgnico/ao.
Las ligninas no constituyen un grupo homogneo de compuestos y su estructura vara con los vegetales y dentro
de una especie, con su grado de madurez. Resisten la
hidrlisis cida, en agua caliente y solventes orgnicos,
pero se solubilizan en lcalis.
Carbn
El espectro de absorcin en el ultravioleta (mxima absorcin en la vecindad de los 280 nm) indica que la lignina
145
Carbn
vegetales
citoplasmticos: azcares, protenas y cidos
nucleicos
reserva: protenas, grasas, almidn,glicgeno
componentes estructurales: celulosa, pectina,
lignina
Restos
animales
citoplasmticos: como arriba
de reserva: almidn, protenas y grasas
estructurales: quitina. protenas de pelos y uas;
mucopptidos; material fecal
144
Lillian Frioni
Methylobacter: bacterias aerobias, Gram con sistema de membranas internas. Colonias a veces
rosadas
Metabolizan tanto metano (metanotrficas) o
-CH2O (metilotrfica) como nica fuente de C
Tambin oxidan NH , pero no como nica fuente
3
de energa
Los pasos de oxidacin necesitan metil monooxigenasa
Organismos de la rizosfera y de hojas en plantas
acuticas
Contaminantes frecuentes en tejidos vegetales
Se designa como:
protolignina o lignina natural a los polmeros insolubles en agua formada por polimerizacin deshidrogenativa de alcoholes coniferil, cumaril o sinapil, iniciada
por enzimas.
las ligninas industriales, maderas modificadas qumica o fsicamente, altamente polimerizadas. Difieren
como sustratos de las naturales; poseen en general
menor peso molecular, mayor solubilidad, con lo que
aumenta su biodegradacin: los lignosulfonatos se obtienen por tratamientos con soluciones cidas de
NaHSO3, las lcali ligninas son el resultado de la
extraccin con soda y sulfuro de sodio, las fenol ligninas o etanol ligninas aluden al procedimiento de extraccin, contienen una variedad de compuestos orgnicos
(azcares, polisacridos, aldehidos, etc.) y pueden variar considerablemente en estructura fsica.
157
Microflora ligninoltica
los modelos de lignina, compuestos aromticos solubles en agua sintetizados a partir de derivados del alcohol cinamlico que poseen uniones intermonmeras presentes en la lignina natural.
Los residuos de industrias papeleras y de las que preparan pulpa para papel, las aguas servidas y los desechos
resultantes de una ganadera extensiva, presentan serios
problemas de polucin por su alto contenido en lignina,
lignocelulosa, celulosa, de lenta biodegradacin.
Estos productos deben ser descompuestos antes de su
deposicin en gran escala en el ambiente: los ros que
reciben afluentes de la industria del papel se colorean intensamente y poseen grandes sedimentos de lignina (captulo 21).
A diferencia de los otros biopolmeros, los estudios microbiolgicos han avanzado poco por la complejidad de esta
molcula: en efecto la lignina constituye el producto natural ms recalcitrante, es decir escasamente biodegrada-
Entre los organismos estudiados, slo los microorganismos eucariticos mostraron capacidad para degradar
completamente a la protolignina. La accin de los distintos organismos en el proceso son variados. Los mtodos
empleados para cuantificar la degradacin incluyen estudios con especies aisladas sobre ligninas especficamente marcadas con C14 (en fracciones alqulicas, arlicas o
en los grupos metoxilo) y anlisis qumico y estructural de
maderas en decaimiento inoculadas y no inoculadas con
especies fngicas de inters. La degradacin de la celulosa es cerca de tres veces superior a la de la lignina.
Por la dificultad en la preparacin de medios selectivos, el
aislamiento de especies responsables es muy dificultoso.
Incluso, una disminucin en la concentracin del sustrato,
no siempre es ndice de degradacin. La molcula puede
ser adsorbida a micelios o clulas microbianas, e incluso
la degradacin puede enmascararse por la sntesis de
sustancias del tipo de la lignina por numerosos hongos.
Los estudios se realizan inoculando trozos de madera
esterilizados.
Lillian Frioni
Los organismos ms activos son los hongos responsables de las podredumbres de la madera: blanca, parda
y blanda, que han sido muy estudiadas por sus consecuencias en el deterioro de postes, vigas de madera. Son
sobre todo Basidiomycetes y algunos Ascomycetes.
Los hongos de la podredumbre blanca son los ms activos degradadores de la lignina, pudiendo convertir la madera en CO2 y H2O. Degradan lignina y otros polisacridos, con prdida de peso rpida: Pleurotus ostreatus,
Phanerochaete chrisosporium, Polyporus anceps.
Los hongos de la podredumbre parda degradan extensivamente polisacridos y causan modificaciones qumicas
limitadas de la lignina. Son incapaces de metabolizar anillos aromticos y son ms eficientes en la degradacin de
celulosa y hemicelulosas. Atacan cadenas laterales, dejando fenoles que se oxidan dando pigmentos marrones
o pardos. Estudios con Lenzites trabea demostraron que
la descomposicin es sobre todo oxidativa y que la demetilacin de unidades fenlicas y no fenlicas de la madera
constituyen las principales reacciones degradativas. Otros
hongos activos: Poria cocos, Lentinus lepideus, Poria
monticola.
Los hongos de las podredumbres blandas degradan los
principales componentes de la madera. El material se
transforma en una masa oscura, desorganizada, con poca
prdida de peso y la ligmina sufre alteraciones parciales.
Se comprob con algunas especies, como Preussia fleshhkii y Chaetomium piluliferum, descomposicin de anillos
marcados (3% a CO2 en 25 das) y demetoxilacin significativa. Son sobretodo Ascomycetes y Hongos Imperfectos.
El moho Fusarium solani crece sobre ligninas sintticas y
las degrada. Es interesante examinar la capacidad de otros
hongos para degradar ligninas naturales o industriales.
Entre los organismos procariticos, algunas bacterias han
sido referidas como ligninolticas, sobre todo en cultivos
mixtos, en el suelo. Especies de Azotobacter son capaces de degradar tanto los anillos como los grupos metoxilo cuando crecen con compuestos aromticos solubles,
aunque a velocidad menor que la actividad de poblaciones mixtas de bacterias.
Algunos actinomicetes poseen capacidad de degradar lignina, rompen enlaces -aril ter, presentes en ligninas
naturales, pero se requieren mayores conocimientos sobre los mecanismos de degradacin de estos organismos.
Las bacterias atacan sobretodo las cadenas laterales alifticas.
El rol que juegan los animales en la descomposicin de
la lignina no puede ser ignorado, aunque su principal actividad sea una disminucin del peso molecular como consecuencia de destruccin mecnica. Insectos, invertebrados y rumiantes contribuyen a la despolimerizacin
fsica de la lignina e incrementan la digestibilidad de la
lignocelulosa, atacada por los microorganismos asociados a sus tractos gastrointestinales (anaerobiosis).
Degradacin
La mayora de los estudios se realizaron con cultivos de
hongos de la podredumbre blanca, por su reconocida
habilidad de degradar completamente a este polmero. Los
trabajos no son sencillos; se emplearon ligninas libres de
otros compuestos carbonados, como madera molida, o
ligninas sintticas marcadas. En Phanerochaete chrysosporium, uno de los hongos mejor estudiados, se encontr
que ste no crece con lignina sola y requiere un sustrato
metabolizable, como celulosa o glucosa. Incluso en la
naturaleza, la presencia de celulosa estimula la actividad
ligninoltica de este hongo en mayor grado que el succinato o glicerol. P. chrysosporium prefiere pH cidos:
4,0-4,5, temperaturas ptimas relativamente altas, las
fuentes de nitrgeno pueden ser amonio, nitratos o aminocidos, pero altas concentraciones en medio de cultivo
inhiben la degradacin de la lignina y se requieren altas
presiones parciales de O2.
comp. orgnicos
respiracin
plantas, animales
microorganismos
fotoauttrofos:
vegetales, algas
cianobacterias
quimioauttrofos
nitrificantes, etc.
aerbicos
anaerbicos
respiracin anaerobia
bact. fotosintticas anaerobias
fermentacin
CO2
(CH2O)n
143
158
bacterias
metanognicas
(CH2O)n
comp. orgnicos
A nivel mundial, el carbono se cicla a travs de los 4 depsitos principales de C: la atmsfera, los suelos, los ocanos y otros ambientes acuticos, as como los sedimentos y las rocas (cuadro 1). El mayor depsito se encuentra en los sedimentos y las rocas de la corteza terrestre,
pero el tiempo de renovacin es demasiado largo, insignificante a escala humana.
Desde el punto de vista de los organismos, una gran cantidad de carbono se encuentra en las plantas terrestres
(fijacin del CO2). Sin embargo hay ms carbono en la
materia orgnica muerta (humus) que en los organismos
vivos. Las formas ms rpidas de transferencia global del
carbono son por va del CO2 de la atmsfera. Este consti-
X 10 toneladas
Reservas globales
Carbonatos en corteza
terrestre
# # Terrestre
Combustibles fsiles
Carbonatos del suelo
Materia orgnica del suelo
Plantas/animales
Fotosntesis
Respiracin
Prdidas netas/vegetacin
# # ocanos
sedimentos
carbonatos
Balance atmosfrico
Atmsfera
Total
6
1.000 x 10
Flujo
~8
5.000
800
1.500
830
+120
-60
-2
36.700
725
720
-2
Este ciclo no es muy complejo: la fotosntesis y la quimiosntesis auttrofa y la respiracin y/o fermentacin son
los principales procesos en que estn involucrados los
compuestos carbonados.
Lillian Frioni
Preguntas de repaso
1) Concepto general de ecologa microbiana.
2) Seale dos ecosistemas diferentes por su tamao y diversidad biolgica, analice las fuentes de energa y de
nutrientes y las poblaciones microbianas dominantes.
3) Por qu la poblacin microbiana del suelo es tan diversa en composicin?
4) Seale ejemplos de poblaciones autctonas y zimgenas en una campo con pradera natural y en otro suelo
que recibe residuos de cosechas.
5) Analice las causas de las diferencias de las velocidades de crecimiento de un microorganismo (celuloltico)
en el suelo y en medio de cultivo.
6) Analice y de ejemplos de interacciones biolgicas en
el ecosistema suelo-planta-microorganismos.
7) Qu fraccin del suelo est en directa relacin con la
actividad biolgica y por qu?
8) Seale tcnicas de estudio a aplicar para incluir a aquellos microorganismos no cultivables.
9) En caso de la actividad respiratoria, cmo evaluara
las actividades reales y las potenciales?
10) Biomasa microbiana: concepto y explique el fundamento de dos tcnicas a aplicar para su evaluacin.
11) Indique alguna tcnica que permita determinar la estructura de una comunidad microbiana basada en el
anlisis de sus cidos nucleicos.
12) Ejemplos de procesos oxidativos en los ciclos biogeoqumicos y sus consecuencias ecolgicas.
13) Idem con los procesos reductivos.
14) Qu procesos ocurren prcticamente en todas las
condiciones ambientales compatibles con la vida? Consecuencias en el ecosistema.
15) Indique procesos de solubilizacin y de precipitacin
de elementos realizados por los microorganismos y sus
consecuencias en la nutricin vegetal.
variaciones relativas
142
glucosa
micelio
actividad
ligninoltica
das
N extracelular
159
Como resumen analizaremos la figura 10 donde se muestra las relaciones del complejo lignocelulosa en el ciclo
del carbono. En efecto, la mayora del carbono orgnico
de la tierra est en forma de compuestos lignocelulsicos, sintetizados a partir del CO2 y en productos de su
degradacin (humus, turba, lignitos y carbn), lentamente mineralizada en la naturaleza ya que la lignina, comparada a un material plstico, aunque de naturaleza biolgica, acta como efectiva barrera que impide la degradacin de los otros componentes.
En ambientes aerbicos, el polmero de lignina es erosionado biolgicamente por enzimas microbianas no especficas a productos ms simples y CO2 o sufre una complexacin con otros constituyentes para formar humus.
160
Lillian Frioni
CO
2
CH
4
aerobio
anaerobio
turba
lignito
carbono
interfase
suelo-sedimento
CO
2
CH
4
Los taninos
Son compuestos muy abundantes en ciertas plantas, sobre todo en las conferas. Son molculas de gran tamao
con mltiples funciones fenoles que les permiten formar
complejos estables con protenas, celulosa, etctera.
Los taninos pueden ser:
solubles en agua: poseen molcula glucdica con funciones alcohlicas esterificadas por cido glico o sus
derivados; son hidrolizables qumica o enzimticamente por tanasas
condensados: son molculas de alto peso molecular,
insolubles en agua, algunos resisten la hidrlisis cida
y recuerdan a los flavonoides que se polimerizan para
dar pigmentos pardos.
Un alto nivel de taninos en el suelo puede disminuir la degradacin de molculas orgnicas, sea por toxicidad directa sobre la microflora activa o por la inactivacin de enzimas o formacin de complejos resistentes con el sustrato.
Precipitacin
(p)
Estas reacciones se observan en el caso de compuestos
con P, Fe, etc.
P insoluble
(PO4)2 Ca3
hidroxiapatita, etc.
polvo de huesos, etc.
La composicin qumica de la cutina no se conoce acertadamente, se sabe que la molcula contiene 16-18 cidos
grasos unidos por enlaces ster y puentes de O.
Fe++ + O2
soluble
disponible
La metodologa empleada en el estudio de estos procesos se resume en el cuadro 5 y lo detalles de las tcnicas
se encuentran en el Anexo prctico.
Los hidrocarburos
141
Solubilizacin
(s)
Sustancias solubles
Sustancias insolubles
Ms informacin se posee en la degradacin de los lpidos de la superficie vegetal, como la cutina, que es secretada a partir de clulas epidrmicas oxidndose por el
O2 atmosfrico. Puede recubrirse con ceras. Tambin puede formarse sobre la lmina media pctica o estar mezclada con la celulosa, protegiendo a esas sustancias de
la biodegradacin.
amonio
N-aa
reduccin de los NO3
compuestos orgnicos
reduccin del CO2
HS
S-aa
reduccin de los sulfatos
2
Procesos desasimilativos
Ocurren en condiciones anaerobias, compuestos de C, N y S
actan como aceptores de e- en respiraciones:
N gas Pseudomonas
desnitrificacin: NO3
2
CH Methanobacterium
metanognesis: CO2
4
sulfato reduccin: SO4= H2S Desulfovibrio,
Desulfotomaculum
Bibliografa
Constituyentes hidrfobos
La sntesis de sustancias hidrocarbonadas y su degradacin en el suelo son etapas importantes del ciclo del carbono. Muchos pesticidas estn formados por hidrocarburos modificados y de su biodegradacin depende la duracin de su accin biocida. Detergentes sintticos poseen
tambin esta estructura molecular.
180
Lillian Frioni
Inhibidores de la nitrificacin
Para disminuir prdidas de nitrgeno por lavado o desnitrificacin en suelos sin cubierta vegetal importante o que
sufre frecuentes perodos de anegamiento, se han desarrollado investigaciones tendientes a inhibir la nitrificacin.
Es sabido que:
los herbicidas e insecticidas empleados en dosis normales no afectan al proceso
los fungicidas y fumigantes ejercen gran accin como
inhibidores de la nitrificacin, aun en dosis normales
otras sustancias son empleadas como el 2 Cl 6
(tri Cl metil) piridina, conocido comercialmente como
N-serve; 2-amino-4 Cl-6 metilpiridina (AM); dicianodiamida; tiourea; 2-sulfanilamidotiazol (ST); los tiazoles;
triazinas; isocianatos, etc. El N-serve es uno de los ms
frecuentemente empleados que inhibe a los auttrofos
pero no a los nitrificantes hetertrofos y se usa mucho
en reas arroceras sometidas a alternancias de secado
e inundacin.
El inhibidor es degradado con el tiempo y la nitrificacin
recomienza, con el activo desarrollo del vegetal. El xito
del mtodo est vinculado a la velocidad a la que la microflora degrada al inhibidor.
CO2 + 4H2
CH4 + 2H2O
Los cidos orgnicos simples acumulados en estos ambientes anaerbicos son empleados tambin por las metanobacterias. La biosntesis de metano est limitada a
un grupo especializado de bacterias anaerobias que habitan suelos inundados, pantanos, abonos en fermentacin, sedimentos marinos y tracto intestinal de animales
superiores. Son difciles de aislar en cultivo puro y la produccin de CH4 es muy activa en poblaciones mixtas.
Methanobacterium, Methanosarcina y Methanococcus,
son los principales gneros encontrados en el suelo y actan al final de una cadena trfica (captulo 21).
Otro hidrocarburo simple encontrado en ecosistemas naturales es el etileno, liberado por numerosas especies de
hongos, bacterias esporuladas y actinomicetes. A bajas
concentraciones acta como una fitohormona: produce
elongacin de races y desarrollo de races laterales.
Otros hidrocarburos voltiles: etano, propano, propileno, son formados en atmsferas anaerobias, a partir de
miembros de la microflora del suelo. Los de mayor importancia son el metano y el etileno.
161
La aplicacin residuos animales al suelo es de prctica frecuente y su degradacin est asegurada por la actividad
biolgica del mismo, pero la acumulacin de grandes cantidades de ellos puede generar problemas en relacin a:
162
Lillian Frioni
Humus
45-65% en carbono, 30-40% en oxgeno, gran abundancia de grupos metoxilo (-OCH3), fenoles (-OH), carboxilo
(-COOH), poco nitrgeno (para algunos autores se tratara de impurezas) y S, P, Fe, etc.
El humus est constituido por mezcla de sustancias amorfas, que es originado de la fitomasa parcialmente descompuesta y de la sntesis microbiana. Son molculas elsticas, de carcter cido, de alto peso molecular y naturaleza coloidal, de gran superficie interna y externa, originadas por la accin de procesos fsico-qumicos y biolgicos a expensas de productos de la degradacin de la
materia orgnica.
Su lenta mineralizacin (1-2% al ao) hace de estas sustancias el verdadero reservorio de nutrientes del suelo,
liberndose lentamente los iones minerales aprovechables por los vegetales.
mineralizacin rpida
restos vegetales
estructuras
an organizadas
++
PO4 , Fe
reorganizacin
sntesis de complejos
hmicos coloidales
humificacin
mineralizacin lenta
Humedad: es otro de los factores que afectan profundamente a la nitrificacin auttrofa ya que regula el nivel de
oxigenacin del suelo. La formacin de nitratos cesa cuando el nivel de humedad es inferior al punto de marchitamiento permanente, mientras que la amonificacin es an
activa. La figura 4 presenta la nitrificacin en suelo franco
limoso con 500 mg/kg de N-NH4+ como fosfato diamnico
y sometido a diversas tensiones de succin desde 0
(saturado) hasta 15 barias e incubado a 21C. En general, se podra aceptar la siguiente escala de tensiones de
humedad para una mxima acumulacin de nitrato:
ques de conferas, ricos en sustancias fenlicas. La intensa inmovilizacin de formas minerales del nitrgeno por
microorganismos hetertrofos explica tambin la disminucin de nitratos en rizosferas. Se evitan as prdidas
por lavado o desnitrificacin de los nitratos formados, en
ambientes de baja tensin de O2.
Estacin del ao: el efecto de la estacin est condicionado por la interaccin de numerosos factores como la
disponibilidad de nutrientes, la temperatura, la humedad,
la aireacin, etc. No puede predecirse en que pocas del
ao el nivel de nitratos ser mayor. En general, en la regin templada la produccin de nitratos es ms activa en
primavera y otoo, ms lenta en verano e invierno. Pero
las fluctuaciones de temperatura y humedad y las prcticas culturales pueden alterar este comportamiento.
-3
N2 atmosfrico
El contenido y calidad de estas sustancias est en relacin directa con la fertilidad del suelo por sus propiedades
y es inclusive empleado en formulaciones comerciales de
los llamados bioestimulantes orgnicos (cuadro 14).
179
N-NO
3
mg/kg
0,1
300
0,33
200
1
5
100
15
0
saturado
0
10
15
20 das
El rehumedecimiento de suelos secos estimula la nitrificacin. Se explica este hecho por la accin de enzimas
liberadas por clulas muertas en la desecacin, que permaneceran adsorbidas a la fraccin organo-mineral del
suelo que se sumaran a las presentes en las clulas vivas. La temperatura favorece el proceso.
178
Lillian Frioni
Ecologa
Se analizarn aspectos ecolgicos de la nitrificacin auttrofa por su importancia cuantitativa y por el hecho de estar ms
afectada por las condiciones del medio. La gran similitud fisiolgica de las especies actuantes explica en parte la sensibilidad a condiciones del ambiente: el proceso puede no ocurrir o ser extremadamente lento en suelos anegados, de pH
muy bajo, o bajo temperaturas muy altas. Como la amonificacin es un proceso menos especfico, en el suelo se acumular amonio.
Analizaremos el efecto de los principales factores:
Nivel de nutrientes: el sustrato energtico puede ser el
factor limitante: amonio o nitrito. Nitrosomonas generalmente oxida 35 unidades de nitrgeno y Nitrobacter unas
100 unidades de nitrgeno por cada C-CO2 asimilado.
La produccin de nitratos es proporcional al amonio disponible. El carbono no es una limitante ya que lo toman
del CO2, carbonatos, bicarbonatos. El nitrito puede acumularse cuando se inhibe la actividad de los oxidantes
del nitrito, como ocurre luego de aplicar altas dosis de
urea, amonaco anhidro o sales de amonio, a pH alto.
La autoecologa de estos grupos nos explica ya esta inhibicin (cuadro 5).
Se observa que el primer paso de la oxidacin es ms
verstil. Condiciones adversas de pH, temperatura o dosis altas de fertilizantes amoniacales, conducen a la acumulacin de nitritos, txicos para los vegetales y la mayora de los microorganismos.
Cuadro 5- Autoecologa de Nitrosomonas
y Nitrobacter
pH
aun activo
a bajas
temperatura
Nitrobacter
inhibido a pH:
inactivo
inhibido a altas
dosis
superiores a 9,0
inferiores a 5,0
sobre 40 e
inferior a 5C
En las sustancias hmicas ms condensadas predominaran los ncleos, con iso o heterociclos, como derivados
del benceno, antraceno, furano, piridina, que pueden condensarse por puentes alifticos, oxgeno, nitrgeno o por
unin directa entre anillos. Estos enlaces le dan a la molcula gran estabilidad qumica y biolgica.
La poblacin nitrificante auttrofa es mayor en suelos neutros o ligeramente alcalinos y el encalado favorece el proceso en suelos cidos, que presentan una gran fase de
latencia (varios das) en la aparicin de los nitratos (ejemplo de la incidencia favorable del hombre sobre un proceso microbiano).
log N-NO
3
mg/litro
Las sustancias rpidamente degradables como la celulosa, hidratos de carbono simples, juegan un importante rol en la formacin del humus. Luego de 7 das
en el suelo, un 70-75% del C14 de la glucosa se localiz en fracciones hmicas, mientras que el C14 de acetato se distribuy luego de 6-9 horas en la humina, cidos flvicos y hmicos, en forma similar al carbono de
la paja.
Temperatura N- amoniacal
Nitrosomonas tolera pH
altos y bajos
NaNO2
3,0
NH4Cl
aminocido
2,0
1,0
5
10
15
20 das
163
El carbono de clulas microbianas contribuye a la fraccin ms simple del humus, los aminocidos.
La figura 12 (Allison, 1973) presenta un esquema de formacin de molculas hmicas. En los ltimos 50 aos
se han realizado numerosos estudios sobre la sntesis
de la fraccin orgnica del suelo. En el laboratorio una
serie de reacciones condujeron a distintos tipos de humus artificial. Los microorganismos se consideran intermediarios en estos procesos; los restos de sus clulas y
sus productos metablicos constituyen etapas en una
serie de reacciones. Los pigmentos microbianos como
las melaninas son muy estables a la degradacin, son
parcialmente solubles en soda y se extraen en la fraccin humus.
En el suelo los procesos son ms lentos que en el laboratorio, pero las reacciones se aceleran por:
la gran actividad superficial de las partculas (catlisis
inorgnica)
los sinergismos microbianos que posibilitan la formacin de los mismos productos finales.
La estabilidad del humus es muy grande. En turbas congeladas de Alaska se estim la edad de estas molculas
entre 1.775 +/- 110 y 11.005 +/-350 aos (a 1 m de
profundidad). A los 2 metros esta edad podra llegar a
25.300+/-300 aos. En suelos templados esta edad es
menor como consecuencia del mayor reciclamiento de la
materia orgnica.
En resumen, se piensa que el humus es el producto de
neosntesis a partir de compuestos ms o menos solubles
originados en la descomposicin de la materia orgnica fresca, mediante la combinacin de procesos biolgicos y fsico-qumicos, durante un largo perodo de tiempo.
La adicin de materia orgnica al suelo puede provocar
estimulacin de la descomposicin de la materia orgnica nativa. Este fenmeno se refiere como efecto renovador (priming effect) y fue observado luego del enriquecimiento del suelo con materia orgnica simple o restos vegetales.
164
Lillian Frioni
hidratos de carbono
1-3%
residuos no descompuestos
lignina
oxidacin
apertura:
p-OH
benzaldehido,
c. vanillico
descomposicin
microbiana
sntesis microbiana
compuestos con N
polisacridos
quinona melanina
ncleos
del humus
cidos
aa
azcares amonio
alcoholes
10-30%
celulosa
hemicelulosa
aminocidos
aceites
ceras
sustancias aminadas
de restos vegetales
50-60% de la MS
compuestos hmicos
heteropolicondensados
Microbiologa de la humificacin
Los microorganismos participan en la formacin de molculas hmicas, catalizando distintas reacciones bioqumicas. Algunos autores discuten si su rol es directo o
indirecto y una de las preguntas es cmo se concilia la
rpida mineralizacin de las sustancias vegetales con
su humificacin.
Hiptesis:
se postula la humificacin de los restos que quedan en
microporos donde no llegan las bacterias, pero s sus
enzimas, aunque no se puede olvidar la adsorcin que
pueden sufrir las enzimas en su camino hacia el sustrato.
las molculas son rpidamente policondensadas o polimerizadas a partir de radicales libres formados por la
accin enzimtica a altas concentraciones de sustancias monomricas, cuando los organismos capaces de
atacarlos estn ausentes. Se puede seguir la humificacin de hojas al microscopio.
se sostiene que la humificacin comienza en los restos
inmediatamente luego de la muerte celular, cuando las
enzimas autolticas estn activas, pero la destruccin
an no ha comenzado (condensacin de aminocidos
de la hidrlisis proteca con quinonas y polifenoles).
Las sustancias pardas aparecen en las clulas antes que
los tejidos lignificados presenten alteraciones visibles.
Cuando las clulas se descomponen, estas sustancias se
liberan al suelo, pudiendo adsorberse a arcillas y protegerse del ataque microbiano.
Nitrificacin hetertrofa
Los nitrificantes hetertrofos constituyen un grupo menos especializado que requieren medios con sustratos
orgnicos con amonio o nitritos y pueden acumular nitritos o nitratos cuando el crecimiento ces. Los organismos son bacterias, incluidos los actinomicetes, y hongos.
Aspergillus flavus es reconocido en la oxidacin del amonio hasta nitrato, a partir de nitropropionato con un equipo
enzimtico especializado, con nitrito intermediario:
peroxidasa
3 nitropropionato NO2 + CO2 + H2O
Energa: su principal fuente proviene de sustratos orgnicos pero la energa liberada es escasa y no satisface los
requerimientos plsticos de los microorganismos (no est
acoplada a procesos de biosntesis).
Organismo
sustrato
Arthrobacter spp
NH succinato
NH
Entre los principales factores que afectan el proceso citaremos: vegetacin, actividad biolgica del suelo, clima,
tipos de suelos, actividad del hombre.
C/N de los restos: relaciones menores de 25/1 estimulan rpida mineralizacin, limitando el potencial de humificacin, relaciones altas conducen a acumulacin de
humus libre.
177
y N-orgnico
4
+
NH y acetato
4
Pseudomonas
aeroginosa
Hansenula marakii
acetaldoxina
nitroetano
nitropropano
Aspergillus flavus
Nitrosomonas spp
Nitrobacter
+
4
+
4
NH y sacarosa
NH
NO2-
producto final
velocidad
gN/da/g biomasa
concentracin
gN/mL
hidroxilamina,
nitrito
nitrato
nitrito
nitrato
hidroxilamina
nitrito
nitrato
c. hidroxmico
1-nitroetanol
nitrito
12
375
250
4.500
9.000
660
600
300
2.000
0,2
1,6
14,1
15,0
18,0
2,0
6,0
10,0
150,0
nitrito
1.680
2,8
c. 3 nitropropinico
nitrato
nitrito
nitrato
1.400
1.350
1,3 x 106
5,7 x 10 6
45,0
75.0
2-4 x 10 3
2-4 x 10 3
176
Lillian Frioni
Nitrospira
Nitrococcus
Morfologa
( G+C)
Crecimiento
Habitat
47,4 - 51
5 - 40
aguas frescas
54,1
25 - 30C
suelo
56,5 - 51
2 - 30C
pH 6,0 - 8,2
suelo
60,7 - 61,7
5 - 40C
pH 5,7-10.2
suelo, mar,
aguas frescas
57,7
57,7
20 - 30C
20 - 30C
pH 7-8
mar
mar
G = -0,7 kcal/mol
G = -83,3 kcal/mol
NH4+ + 0,5 O2
NH2OH + O2
Directa: por agotamiento en cajas de Petri con slicogel nutritivo: solucin salina, sales de amonio o nitritos,
carbonato de calcio. Las microcolonias se detectan por
el halo transparente por disolucin del carbonato por
los cidos producidos.
Por enriquecimiento previo en el mismo medio selectivo lquido y varios pasajes en el mismo medio fresco,
que facilita el aislamiento en medio slido.
NO2 + H2O + H
cit c Fe+3 + NO2 cit c Fe+2 + NO2 (radical libre) cit a1 Fe+2 + NO2 +
NO2 + 0,5 O2 cit a1 Fe+3 + NO3
globalmente: NO2 cit c cit a1 O2
165
Ocurrir mxima humificacin cuando los procesos aerobios y anaerobios estn correctamente balanceados.
Si la anaerobiosis es permanente, la humificacin es
prcticamente nula y se conduce a la formacin de turbas. El proceso parece tener el ptimo en microaerofilia o en condiciones de alternancia de perodos de
aerobiosis y anaerobiosis.
Actividad del hombre: el laboreo disminuye el nivel de
materia orgnica al romper los agregados y exponer la
materia orgnica a la biodegradacin, pero el efecto de
mezclado favorece la calidad. Alternancias de cultivo y
barbecho favorecen la humificacin. Los suelos cultivados presentan un humus ms evolucionado, pero menos
abundante, que puede descender por debajo de niveles
crticos. Enterrar restos vegetales activa su mineralizacin
y una aplicacin ms profunda favorece la humificacin
(condiciones micraeroflicas).
Deshumificacin
El clima influye en la productividad (cantidad y calidad
del material vegetal) y directamente en la actividad biolgica. La degradacin del N del humus disminuye 2-3 veces por cada 10C de disminucin de la temperatura. En
regiones fras aumenta considerablemente el nivel de humus. El congelamiento y descongelamiento disminuyen
la estabilidad de las molculas hmicas. Por el contrario,
un congelamiento prolongado aumenta la estabilidad. La
desecacin favorece la polimerizacin de sustancias prehmicas (maduracin). Suelos permanentemente hmedos presentan formas poco condensadas y mviles (cidos flvicos).
Suelos: el contenido y calidad de las arcillas facilita la
humificacin. Un pH alto favorece la actividad mineralizante y la humificacin por bacterias. El calcio facilita la
floculacin y maduracin de las molculas prehmicas.
La humedad ms favorable para la humificacin se sita
en la vecindad del 60% de la capacidad de campo. La
saturacin no favorece al proceso; los suelos saturados
son pobres en humus. Un insuficiente drenaje conduce a
humus bruto o a turba.
Se encuentran gran nmero de dificultades en la investigacin de biodegradacin del humus: los microorganismos pueden crecer con cidos hmicos pero emplean
solamente los compuestos asociados, como los aminocidos, dejando la estructura aromtica intacta, hecho que
sumado a la falta de datos sobre la estructura exacta de
la molcula (si es que tienen una estructura bsica comn), tornan las comparaciones muy difciles.
Adems, las zonas claras alrededor de las colonias desarrolladas en medios con cidos hmicos no indican
necesariamente la degradacin de los mismos; muchas
veces, ellos son precipitados alrededor de las clulas.
A pesar de estos inconvenientes parece correcto afirmar
que ciertos hongos, sobre todo Ascomycetes y Basidiomycetes, pueden degradar cidos hmicos en el laboratorio por reduccin enzimtica de grupos aromticos carboxilo a aldehido y luego hasta alcoholes. Los sistemas
enzimticos son adaptativos. En filtrados de cultivos de
hongos creciendo sobre cidos hmicos se detectaron
alcohol saliclico y salicilaldehido.
166
Lillian Frioni
Modelos de simulacin
Las bacterias son activas sobre todo atacando las cadenas laterales alifticas. Los actinomicetes pueden adems
degradar molculas aromticas provocando decoloracin
del medio.
Los hongos son activos degradadores de molculas hmicas. Entre los productos de la degradacin de los cidos hmicos se han detectado residuos de la degradacin de la lignina bastante como cidos vanllico y sirngico. En suelos donde la lignina est ausente, como los
antrticos cubiertos de helechos, no se encontraron estos
productos. Otras sustancias que aparecen en la degradacin, como flavonoides, pueden derivar de sntesis microbiana o de la vegetacin.
Ecologa
Carbono: fuentes de carbono fcilmente degradables
(0,5-2%) estimulan el crecimiento microbiano favoreciendo la degradacin del humus en el laboratorio. Para otras
especies la celulosa es ms eficiente. El efecto sobre la
humificacin es el mismo que analizamos en la degradacin de otros biopolmeros: el aumento microbiano provoca agotamiento de nutrientes y la poblacin induce el equipo enzimtico para degradar molculas ms complejas.
Nitrgeno: el de las cadenas laterales es asimilado por los
microorganismos aunque en menor grado que las formas
inorgnicas u orgnicas simples del suelo. Otras fuentes
nitrogenadas ejercen efecto variable segn las especies.
Calcio: los humatos clcicos son ms fcilmente degradados in vitro que los de sodio (efecto tampn favorable
para la actividad enzimtica).
Arcillas: ejercen efecto protector: la oxidacin de los cidos hmicos es ms lenta con illita y montmorillonita. El
Muchos modelos se han elaborado a partir de 5 compartimientos que incluyen: la biomasa microbiana, dos formas
de materia orgnica estabilizada (en forma fsica o qumica) y el componente de residuos vegetales, dividido en
mos responsables. Confirm la naturaleza biolgica calentando una columna de suelo o tratndola con cloroformo: el proceso cesaba y los nitratos volvan a formarse al
reinocular este sistema con suspensin de suelo frtil.
La nitrificacin afecta a:
Los cultivos, ya que constituye un proceso fundamental para la nutricin vegetal, los nitratos son fcilmente
absorbidos, en menor grado el amonio y los nitritos resultan txicos.
Al ambiente, pues una intensa nitrificacin resulta muchas veces perjudicial para el hombre. Los iones nitrito
y nitrato son solubles y por lo tanto mviles con el agua
que puede llevarlos lejos de la zona de absorcin radical. El amonio, al ser fijado en el complejo de intercambio, resulta menos mvil. La polucin de las aguas por
los nitratos resulta un problema en los pases que emplean grandes dosis de fertilizantes. Los nitratos se reducen a nitritos en la sangre, unindose a la hemoglobina que se convierte en metahemoglobina, molcula
que no funciona en la transferencia del O2. La enfermedad es conocida como metahemoglobinemia (enfermedad de los chicos azules). Los estndares para consumo humano son inferiores a 10 mg/L de N-NO3 para
el agua potable.
Nitrificacin auttrofa
La nitrificacin auttrofa puede dividirse en dos pasos, cada
uno realizado por un grupo particular de organismos:
I) Nitritacin: NH4+ + 1,5 O2
II) Nitratacin: NO2 + 0,5 O2
+
NO2 + 2H + H2O G = 84 cal/mol
NO3
G = 17, 8 cal/mol
175
Nitrificantes auttrofos
Son bacterias muy relacionadas pertenecientes a la familia Nitrobacteriaceae, gram negativas, que no forman
esporas, bacilos, cocos o espirilos, en general mviles por
flagelos polares.
Auttrofos obligados, muchos compuestos orgnicos les
resultan txicos, por alteraciones producidas en la esterilizacin en autoclave. Fuentes de carbono: del CO2, bicarbonatos y carbonatos y de energa: de la oxidacin de
sales amoniacales o nitrosas.
El cuadro 3 resume las caractersticas de los 4 gneros
de bacterias oxidantes de amonio y de los 3 oxidantes del
nitrito. Las especies ms representativas son Nitrosomonas europea y Nitrobacter winogradsky. Los nitrificantes autotrficos secundarios, es decir, el resto de los que
figuran en el cuadro 3 aparecen en general en bajo nmero y presentan rangos ms estrechos de temperatura y
pH para su desarrollo. Otra importante diferencia la constituye la habilidad para crecer heterotrficamente de algunas especies del segundo grupo. Nitrobacter agilis puede
crecer con materia orgnica y es estimulado por extracto
de levadura. Nitrobacter winogradsky posee mayor potencial para crecer heterotrficamente que Nitrococcus y
Nitrospina. Piruvato y aminocidos estimulan el crecimiento de Nitrosomonas europea.
Velocidad de crecimiento: comparada con la de la mayora de las bacterias heterotrficas, la vc de las bacterias
nitrificantes es baja. Tiempos de generacin de 8 horas
han sido informados en medio de cultivo. Se piensa que
en la naturaleza se sobrepasan las 20-40 horas. El desarrollo en medio de cultivo se acelera con sales de bicarbonato solubles o de lcali para contrarrestar la cada del
pH. El rendimiento celular es tambin bajo (0,15 kg biomasa/kg N-NH4+ oxidado para la nitritacin y de 0,02kg de
biomasa/kg N-NO2 oxidado para la nitratacin).
Eficiencias bioqumicas (N inorgnico oxidado/C-CO2
asimilado) de 14-70/1 para Nitrosomonas y de 76-135/1
para Nitrobacter (gran capacidad sinttica, la mayora no
requieren factores de crecimiento). Como vimos, los oxidantes del amonio obtienen ms energa de la reaccin y
deben metabolizar menos nitrgeno por unidad de carbono asimilado.
Lillian Frioni
Ecologa
Como hemos visto este es un proceso muy poco especfico, realizado por gran nmero de microorganismos hetertrofos adaptados a las ms variadas condiciones ecolgicas.
La amonificacin ocurre en todas aquellas condiciones
compatibles con la vida (que aseguran que el agua se
encuentre en estado lquido).
Temperatura: como con todas las reacciones biolgicas,
una elevacin de temperatura estimula el proceso. El ptimo del amplio grupo de amonificantes se ubica en el rango termfilo.
pH: puede llevarse a cabo desde pH muy bajos (3,5-4,0)
a superiores a 9,0. Una fuerte acidez retarda el proceso y
son sobre todo las bacterias anaerobias y los hongos los
activos en esas condiciones. A pH superiores dominan
los actinomicetes y algunas algas que pueden emplear
fuentes de nitrgeno orgnicas.
Cultivos vegetales: ejercen un doble efecto, por un lado
proveen restos orgnicos nitrogenados por descamacin
de races, exudados, percolados a travs de las hojas y
follaje, estimulan la amonificacin real o bruta, pero tambin absorbe a los iones amonio: la amonificacin neta se
ve as inhibida.
En resumen: el proceso se realiza en amplias condiciones ambientales, con innumerables sustratos y la microflora responsable incluye prcticamente a todos los microorganismos hetertros. La actividad sera mxima en
aerobiosis, temperaturas en el rango termfilo, neutrofilia
y humedades medias
Estabilidad de compuestos nitrogenados orgnicos
Numerosos investigadores han remarcado la estabilidad
de la fraccin nitrogenada orgnica del suelo. En efecto,
Formacin de complejos entre protenas y fracciones orgnicas del suelo, como lignina, compuestos
fenlicos o sustancias del tipo del humus
Complexacin con minerales arcillosos: la adsorcin
externa al complejo de intercambio del suelo (ms firmemente si en la protena dominan las cargas electropositivas) o la inclusin dentro de las hojuelas, posibilitan un retardo en la biodegradacin. Esta hiptesis explica tambin la inhibicin de enzimas extracelulares
Toxicidad del ambiente: la vegetacin o el metabolismo microbiano producen sustancias inhibidoras cuya
concentracin aumenta con la concentracin hidrogeninica del medio y la anaerobiosis: cumarinas, taninos, resinas, contribuyen a estabilizar la materia orgnica en suelos forestales
La liberacin se realiza gradualmente a medida que la
vegetacin las requiere, evitando prdidas importantes por
lavado o desnitrificacin. Pero en algunos ecosistemas
este bloqueo puede ser negativo para la nutricin de las
plantas, como ocurre en horizontes superficiales (Ao) de
formaciones forestales.
Nitrificacin
La nitrificacin se define como la conversin biolgica
del nitrgeno desde un estado reducido (NH4+, N-orgnico) a otro ms oxidado (NO2, NO3), a partir de compuestos orgnicos o inorgnicos, por una microflora auto y
hetertrofa.
Es un proceso biolgico conocido desde hace mucho tiempo que se realiza en el suelo, en ambientes marinos, abonos, y en los procesos de depuracin de aguas servidas.
Ya en la poca napolenica se produca el nitro de Chile
en pilas de suelo, con abonos orgnicos y carbonato de
calcio. Pasteur postul la naturaleza microbiana del proceso y hacia 1890 Winogradsky aisl a los microorganis-
Sin embargo, los avances logrados en mtodos computacionales y en las tcnicas analticas para la determinacin de diferentes fracciones de la materia orgnica, hacen que estos modelos se vuelvan herramientas prcticas que economizan tiempo y numerosos experimentos
de laboratorio y campo.
En resumen: aumentar y/o mantener el nivel de materia
orgnica de un suelo es un objetivo prioritario en todo
manejo agrcola. La aplicacin de abonos orgnicos (restos de cosechas, subproductos industriales) contribuye a
evitar la prdida de humus en suelos sometidos a intensa
explotacin.
Los principales factores a tener en cuenta para elevar el
contenido de materia orgnica de los suelos son: canti-
* molculas recalcitrantes
100
% descomposicin
167
glucosa
protenas
80
restos de leguminosas
restos cereales
60
estircol
lignina
40
madera
cido hmico*
20
0
12
28 semanas
tasa de degradacin
174
azcares
almidn
protenas
celulosa
lignina
menos de 1 ao
6-8 aos
ms de 100 aos
tiempo
Lillian Frioni
Preguntas de repaso
Energa: la desaminacin no provee de energa al microorganismo, pero la misma puede obtenerse del catabolismo del esqueleto carbonado de la molcula: protena,
cidos hmicos, etc.
Evaluacin: La evolucin del amonio en suelos y aguas,
enriquecidos o no con sustancias orgnicas nitrogenadas,
se determina en el campo o en el laboratorio. Como el
amonio puede seguir distintas vas en la naturaleza lo que
evaluamos es la amonificacin neta, o sea la diferencia
entre el amonio producido y el que sigui otras vas en el
suelo. El empleo de compuestos con N15 permite evaluar
amonificacin real.
Bibliografa
173
protena
peptona pptido
aminocido
anaerobiosis: NH3,
CO2, aminas, cidos
orgnicos, indol
Los aminocidos son degradados rpidamente en suelos y aguas. Se encuentran libres en pequea proporcin,
producto de la actividad microbiana sobre protenas, o son
excretados por las races. La actividad es mayor en capas superficiales, en las ms profundas la adsorcin a
coloides puede ser importante y la nitrificacin menor.
C= O + H2O
NH2
NH2
COO
NH4
2NH3 + CO2
La cianamida clcica es otro fertilizante empleado comnmente. Por hidrlisis no biolgica se forma urea, la que es
mineralizada por la poblacin ureoltica:
CaCN2 + 2H2O
H2CN2
+
H2O
+ Ca(OH)2
ureasa
CO(NH2)2 2NH3 + CO2
H2N - C - C - NH2
O O
oxamida
168
ARN, ADN
mononucletido
azcar
purinas urea
pirimidinas
NH3, aa
172
Lillian Frioni
bles en agua. El hombre incide en estas transformaciones por el manejo que realiza de los ecosistemas, por la
tecnologa de depuracin de efluentes altamente contaminados y en el caso de suelos, por la aplicacin de fertilizantes y sustancias biocidas, la inoculacin de microorganismos fijadores de N2.
Mineralizacin-inmovilizacin
Las formas inorgnicas minerales amonio, nitrito y nitrato
se producen continuamente en el suelo por procesos de
mineralizacin y son la fuentes de nutrientes para los vegetales amonio y nitratos, los nitritos resultan txicos.
La mayor parte es soluble en agua y son desplazados
con sta a horizontes no alcanzados por las races. La
fraccin ms retenida es el amonio que puede estar adsorbido en forma intercambiable en el complejo arcillahumus o fijado dentro de las hojuelas de las arcillas y puede
representar una importante fraccin en horizontes inferiores y hasta 3,5-8% del N total en la capa arable.
La determinacin de estos iones posee un valor relativo
ya que son mltiples las vas que pueden seguir en el
suelo:
volatilizacin del NH
3
desnitrificacin de los nitratos
asimilacin por vegetales
inmovilizacin en clulas microbianas
fijacin a coloides (amonio)
lavado, erosin, quemado
Slo las mediciones peridicas pueden proveer informacin sobre la dinmica de las formas del nitrgeno en ecosistemas naturales.
La mineralizacin del nitrgeno orgnico comprende
dos etapas:
amonificacin que libera NH a partir de molculas or3
gnicas
nitrificacin, proceso por el cual se liberan nitritos o
nitratos, iones solubles en agua a partir de combinaciones minerales u orgnicas.
La amonificacin es realizada por un gran nmero de mi-
croorganismos hetertrofos y animales del suelo que atacan distintas molculas orgnicas: urea, aminocidos, protenas, aminoazcares, cidos nuclecos, sustancias hmicas. La nitrificacin es la produccin biolgica de nitritos o nitratos a partir de amonio o de combinaciones
orgnicas.
La inmovilizacin es el proceso simultneo e inverso a
la mineralizacin, por la cual las formas minerales: amonio, nitrito o nitrato entran a formar parte de combinaciones orgnicas en el citoplasma microbiano (ciclo interno
de los elementos).
Amonificacin
Sustrato: es muy variado, cualquier tipo de molcula orgnica nitrogenada.
Microflora: est integrada por innumerables especies de
bacterias, incluidos los actinomicetes, hongos, protozoos, algas, que poseen numerosas enzimas tanto extracelulares como: proteinasas, peptidasas, quitinasas, lisozima, ARNasa, etc. o intracelulares (asparaginasa, glutaminasa, aminocido deshidrogenasas).
Ambiente: como consecuencia de la falta de especificidad en los sustratos, la amonificacin es uno de los procesos menos sensibles a los cambios del ambiente y se
realiza tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, bajo un
rango de pH compatible con actividad biolgica, en regiones fras, como en el rango termfilo.
Cmineralizado/Nmineralizado: en ecosistemas en equilibrio, la relacin C-CO2/Nmineral es aproximadamente
10/1. Con aportes de sustancias orgnicas, esta relacin
se altera de acuerdo a la relacin C/N de las mismas: una
relacin alta provocar ms liberacin de CO2, si el N%
de los restos vegetales es alto, la proporcin de amonio y
nitrato ser mayor.
Amonio: se considera un producto de desecho celular.
Una vez satisfecha la demanda microbiolgica por el
nitrgeno, el resto metabolizado es eliminado como
NH3.
10
169
De los nutrientes fundamentales para el desarrollo vegetal, el nitrgeno constituye uno de los elementos sobre
cuyas transformaciones en el suelo se han realizado ms
investigaciones en los ltimos aos. Se presenta frecuentemente como limitante del crecimiento vegetal ya que es
removido en cantidades superiores al resto de los nutrientes y adems su nivel en los suelos es generalmente bajo.
Se emplea en la sntesis proteica, de cidos nucleicos,
aminoazcares y de otras molculas de importancia en la
clula. Favorece el crecimiento vegetativo, el tamao de
los granos y su porcentaje de protenas; aumenta la absorcin del fsforo y potasio.
La importancia del nitrgeno se reconoce en:
la agricultura, incrementando los rendimientos, modificando la composicin qumica y calidad de los vegetales
el ambiente: los problemas ambientales asociados a
excesos de compuestos nitrogenados son muy conocidos. Las principales fuentes de contaminacin de aguas
y suelos son las prcticas agrcolas y las provenientes
de la atmsfera. La industria vierte aguas con elevada
concentracin de xidos de N o amonaco que contamina los cursos de agua. Se puede llegar a la eutrificacin
(alta concentracin de sales, incluidas las nitrogenadas)
de las mismas y a la contaminacin de fuentes de agua
potable con nitratos, muy txicos.
Las transformaciones del nitrgeno en la naturaleza se
aprecian en la figura 1 y en el cuadro 1 se presentan las
reservas de nitrgeno en el planeta.
y ms de 2% en suelos muy orgnicos. En suelos minerales en clima templado con 2-3% de materia orgnica en el
horizonte 0-20 cm y 0,12-0,15% de nitrgeno, los valores
de 2000-3000 kgN/ha aseguran las necesidades de los
vegetales por muchos aos.
Sin embargo el agregado de 100 kgNO3/ha, que corresponde a menos del 1% del N de la capa arable, puede
favorecer el desarrollo vegetal. Este fenmeno se atribuye al hecho de que la mayor parte del nitrgeno no puede
ser asimilado directamente por los vegetales. Gran proporcin del humus es resistente al ataque microbiano y
solamente una pequea fraccin del N orgnico (1-3%)
se mineraliza cada ao.
La estabilidad del nitrgeno del suelo se explica por
la formacin de compuestos con constituyentes orgnicos (taninos, fenoles, lignina) o por adsorcin a
arcillas.
La mayor proporcin del nitrgeno del suelo es orgnica
(98% del total) y menos del 2% son formas minerales, N2,
N2O, NO, amonio, nitritos y nitratos, de muchas de las
cuales depende la nutricin vegetal. Esta pequea fraccin resulta muy importante porque es empleada como
nutriente, intermediarios metablicos, donadores o aceptores de electrones o son productos finales de muchas
transformaciones de este elemento.
La fraccin orgnica
vegetales
170
Lillian Frioni
vegetales
animales
fijacin
atmsfera
N2, N2O
desnitrificacin
volatilizacin
nitrificacin
NO3
NO2
inmovilizacin
NH4
chel et al, 1998) muestra los cambios en el estado de oxido-reduccin de este elemento, que pasa de -3 en el amonaco y en la materia orgnica, 0 en el N2 hasta + 5 en los
nitratos (cambio neto de 8 electrones). Como se aprecia
el amonio puede ser convertido en un gran nmero de
productos.
Reduccin
N org.
NH +
NH OH
NO
2
NO
NO
2
NO
3
amonificacin
biomasa
materia orgnica fresca
humus
-3
rocas primarias
La fuente primaria de nitrgeno para el suelo la constituye la atmsfera, en donde el N2 representa un 79%. En el
cuadro 1 se observa que la mayor reserva de nitrgeno la
constituyen las rocas primarias (98% de todo el N2), le
sigue la atmsfera, luego las rocas sedimentarias, los sedimentos marinos y el reservorio ms pequeo lo constituye el suelo (sobre cada hectrea de suelo se acumulan
80.000 ton de N2), de la litsfera (37 kg/cm2) y de las rocas sedimentarias (872 kg/cm2).
Como se observa, existe una gran masa de nitrgeno atrapado en las rocas como N2 no directamente aprovechable por los vegetales. El cuadro 2 cuantifica procesos que
involucran a compuestos con nitrgeno y la figura 2 (Fen-
15
atmsfera
3,9 x 10
rocas sedimentarias
mar
La naturaleza del resto del nitrgeno es difcil de determinar, integra los heterociclos de las molculas hmicas,
lentamente degradables. Es probable que el N-aminocidos provenga de peptidoglicanos y cidos teicoicos, constituyentes de paredes bacterianas y slo se detectan trazas en los suelos, pues son rpidamente biodegradados.
En la fraccin de los cidos hmicos, un 20-50% del N
est constituido por aminocidos, un 3-10% de aminoazcares y una pequea cantidad de bases derivadas de ADN
y ARN bacteriano, sobre todo. En la fraccin flvica, un
20-30% es N-aminocido y 8-10% son aminoazcares.
40-190 x 10
suelo
15
0,8-4 x 10
14
ton N2 (97,8%)
ton N2 (2%)
ton N2 (0,2%)
Oxidacin
+1
+2
+3
Estimacin cuantitativa
biolgico
fijacin del N
2
asimilacin
inmovilizacin
mineralizacin
desnitrificacin
precipitacin
60 x 10 ton N-NO3 /ao
N2
N2asa
+5
12
22 x 10 ton N2
11
5,4 x 10 ton N2 en sedimentos
11
11 x 10 ton de N en vegetales
Naturaleza
del proceso
-1
171
2 NH4+ + H2
aminocidos
2. De naturaleza no biolgica: las aguas de lluvia aportan nitrgeno combinado como amonio, nitrito, sustancias
albuminoides, que provienen del suelo o aguas, de la contaminacin en zonas industriales o de la fijacin no biolgica por radiaciones o reacciones fotoqumicas.
El hombre ha logrado la reduccin del N2 (proceso
Haber-Bosch)
vegetales
170
Lillian Frioni
vegetales
animales
fijacin
atmsfera
N2, N2O
desnitrificacin
volatilizacin
nitrificacin
NO3
NO2
inmovilizacin
NH4
chel et al, 1998) muestra los cambios en el estado de oxido-reduccin de este elemento, que pasa de -3 en el amonaco y en la materia orgnica, 0 en el N2 hasta + 5 en los
nitratos (cambio neto de 8 electrones). Como se aprecia
el amonio puede ser convertido en un gran nmero de
productos.
Reduccin
N org.
NH +
NH OH
NO
2
NO
NO
2
NO
3
amonificacin
biomasa
materia orgnica fresca
humus
-3
rocas primarias
La fuente primaria de nitrgeno para el suelo la constituye la atmsfera, en donde el N2 representa un 79%. En el
cuadro 1 se observa que la mayor reserva de nitrgeno la
constituyen las rocas primarias (98% de todo el N2), le
sigue la atmsfera, luego las rocas sedimentarias, los sedimentos marinos y el reservorio ms pequeo lo constituye el suelo (sobre cada hectrea de suelo se acumulan
80.000 ton de N2), de la litsfera (37 kg/cm2) y de las rocas sedimentarias (872 kg/cm2).
Como se observa, existe una gran masa de nitrgeno atrapado en las rocas como N2 no directamente aprovechable por los vegetales. El cuadro 2 cuantifica procesos que
involucran a compuestos con nitrgeno y la figura 2 (Fen-
15
atmsfera
3,9 x 10
rocas sedimentarias
mar
La naturaleza del resto del nitrgeno es difcil de determinar, integra los heterociclos de las molculas hmicas,
lentamente degradables. Es probable que el N-aminocidos provenga de peptidoglicanos y cidos teicoicos, constituyentes de paredes bacterianas y slo se detectan trazas en los suelos, pues son rpidamente biodegradados.
En la fraccin de los cidos hmicos, un 20-50% del N
est constituido por aminocidos, un 3-10% de aminoazcares y una pequea cantidad de bases derivadas de ADN
y ARN bacteriano, sobre todo. En la fraccin flvica, un
20-30% es N-aminocido y 8-10% son aminoazcares.
40-190 x 10
suelo
15
0,8-4 x 10
14
ton N2 (97,8%)
ton N2 (2%)
ton N2 (0,2%)
Oxidacin
+1
+2
+3
Estimacin cuantitativa
biolgico
fijacin del N
2
asimilacin
inmovilizacin
mineralizacin
desnitrificacin
precipitacin
60 x 10 ton N-NO3 /ao
N2
N2asa
+5
12
22 x 10 ton N2
11
5,4 x 10 ton N2 en sedimentos
11
11 x 10 ton de N en vegetales
Naturaleza
del proceso
-1
171
2 NH4+ + H2
aminocidos
2. De naturaleza no biolgica: las aguas de lluvia aportan nitrgeno combinado como amonio, nitrito, sustancias
albuminoides, que provienen del suelo o aguas, de la contaminacin en zonas industriales o de la fijacin no biolgica por radiaciones o reacciones fotoqumicas.
El hombre ha logrado la reduccin del N2 (proceso
Haber-Bosch)
172
Lillian Frioni
bles en agua. El hombre incide en estas transformaciones por el manejo que realiza de los ecosistemas, por la
tecnologa de depuracin de efluentes altamente contaminados y en el caso de suelos, por la aplicacin de fertilizantes y sustancias biocidas, la inoculacin de microorganismos fijadores de N2.
Mineralizacin-inmovilizacin
Las formas inorgnicas minerales amonio, nitrito y nitrato
se producen continuamente en el suelo por procesos de
mineralizacin y son la fuentes de nutrientes para los vegetales amonio y nitratos, los nitritos resultan txicos.
La mayor parte es soluble en agua y son desplazados
con sta a horizontes no alcanzados por las races. La
fraccin ms retenida es el amonio que puede estar adsorbido en forma intercambiable en el complejo arcillahumus o fijado dentro de las hojuelas de las arcillas y puede
representar una importante fraccin en horizontes inferiores y hasta 3,5-8% del N total en la capa arable.
La determinacin de estos iones posee un valor relativo
ya que son mltiples las vas que pueden seguir en el
suelo:
volatilizacin del NH
3
desnitrificacin de los nitratos
asimilacin por vegetales
inmovilizacin en clulas microbianas
fijacin a coloides (amonio)
lavado, erosin, quemado
Slo las mediciones peridicas pueden proveer informacin sobre la dinmica de las formas del nitrgeno en ecosistemas naturales.
La mineralizacin del nitrgeno orgnico comprende
dos etapas:
amonificacin que libera NH a partir de molculas or3
gnicas
nitrificacin, proceso por el cual se liberan nitritos o
nitratos, iones solubles en agua a partir de combinaciones minerales u orgnicas.
La amonificacin es realizada por un gran nmero de mi-
croorganismos hetertrofos y animales del suelo que atacan distintas molculas orgnicas: urea, aminocidos, protenas, aminoazcares, cidos nuclecos, sustancias hmicas. La nitrificacin es la produccin biolgica de nitritos o nitratos a partir de amonio o de combinaciones
orgnicas.
La inmovilizacin es el proceso simultneo e inverso a
la mineralizacin, por la cual las formas minerales: amonio, nitrito o nitrato entran a formar parte de combinaciones orgnicas en el citoplasma microbiano (ciclo interno
de los elementos).
Amonificacin
Sustrato: es muy variado, cualquier tipo de molcula orgnica nitrogenada.
Microflora: est integrada por innumerables especies de
bacterias, incluidos los actinomicetes, hongos, protozoos, algas, que poseen numerosas enzimas tanto extracelulares como: proteinasas, peptidasas, quitinasas, lisozima, ARNasa, etc. o intracelulares (asparaginasa, glutaminasa, aminocido deshidrogenasas).
Ambiente: como consecuencia de la falta de especificidad en los sustratos, la amonificacin es uno de los procesos menos sensibles a los cambios del ambiente y se
realiza tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, bajo un
rango de pH compatible con actividad biolgica, en regiones fras, como en el rango termfilo.
Cmineralizado/Nmineralizado: en ecosistemas en equilibrio, la relacin C-CO2/Nmineral es aproximadamente
10/1. Con aportes de sustancias orgnicas, esta relacin
se altera de acuerdo a la relacin C/N de las mismas: una
relacin alta provocar ms liberacin de CO2, si el N%
de los restos vegetales es alto, la proporcin de amonio y
nitrato ser mayor.
Amonio: se considera un producto de desecho celular.
Una vez satisfecha la demanda microbiolgica por el
nitrgeno, el resto metabolizado es eliminado como
NH3.
10
169
De los nutrientes fundamentales para el desarrollo vegetal, el nitrgeno constituye uno de los elementos sobre
cuyas transformaciones en el suelo se han realizado ms
investigaciones en los ltimos aos. Se presenta frecuentemente como limitante del crecimiento vegetal ya que es
removido en cantidades superiores al resto de los nutrientes y adems su nivel en los suelos es generalmente bajo.
Se emplea en la sntesis proteica, de cidos nucleicos,
aminoazcares y de otras molculas de importancia en la
clula. Favorece el crecimiento vegetativo, el tamao de
los granos y su porcentaje de protenas; aumenta la absorcin del fsforo y potasio.
La importancia del nitrgeno se reconoce en:
la agricultura, incrementando los rendimientos, modificando la composicin qumica y calidad de los vegetales
el ambiente: los problemas ambientales asociados a
excesos de compuestos nitrogenados son muy conocidos. Las principales fuentes de contaminacin de aguas
y suelos son las prcticas agrcolas y las provenientes
de la atmsfera. La industria vierte aguas con elevada
concentracin de xidos de N o amonaco que contamina los cursos de agua. Se puede llegar a la eutrificacin
(alta concentracin de sales, incluidas las nitrogenadas)
de las mismas y a la contaminacin de fuentes de agua
potable con nitratos, muy txicos.
Las transformaciones del nitrgeno en la naturaleza se
aprecian en la figura 1 y en el cuadro 1 se presentan las
reservas de nitrgeno en el planeta.
y ms de 2% en suelos muy orgnicos. En suelos minerales en clima templado con 2-3% de materia orgnica en el
horizonte 0-20 cm y 0,12-0,15% de nitrgeno, los valores
de 2000-3000 kgN/ha aseguran las necesidades de los
vegetales por muchos aos.
Sin embargo el agregado de 100 kgNO3/ha, que corresponde a menos del 1% del N de la capa arable, puede
favorecer el desarrollo vegetal. Este fenmeno se atribuye al hecho de que la mayor parte del nitrgeno no puede
ser asimilado directamente por los vegetales. Gran proporcin del humus es resistente al ataque microbiano y
solamente una pequea fraccin del N orgnico (1-3%)
se mineraliza cada ao.
La estabilidad del nitrgeno del suelo se explica por
la formacin de compuestos con constituyentes orgnicos (taninos, fenoles, lignina) o por adsorcin a
arcillas.
La mayor proporcin del nitrgeno del suelo es orgnica
(98% del total) y menos del 2% son formas minerales, N2,
N2O, NO, amonio, nitritos y nitratos, de muchas de las
cuales depende la nutricin vegetal. Esta pequea fraccin resulta muy importante porque es empleada como
nutriente, intermediarios metablicos, donadores o aceptores de electrones o son productos finales de muchas
transformaciones de este elemento.
La fraccin orgnica
Lillian Frioni
Preguntas de repaso
Energa: la desaminacin no provee de energa al microorganismo, pero la misma puede obtenerse del catabolismo del esqueleto carbonado de la molcula: protena,
cidos hmicos, etc.
Evaluacin: La evolucin del amonio en suelos y aguas,
enriquecidos o no con sustancias orgnicas nitrogenadas,
se determina en el campo o en el laboratorio. Como el
amonio puede seguir distintas vas en la naturaleza lo que
evaluamos es la amonificacin neta, o sea la diferencia
entre el amonio producido y el que sigui otras vas en el
suelo. El empleo de compuestos con N15 permite evaluar
amonificacin real.
Bibliografa
173
protena
peptona pptido
aminocido
anaerobiosis: NH3,
CO2, aminas, cidos
orgnicos, indol
Los aminocidos son degradados rpidamente en suelos y aguas. Se encuentran libres en pequea proporcin,
producto de la actividad microbiana sobre protenas, o son
excretados por las races. La actividad es mayor en capas superficiales, en las ms profundas la adsorcin a
coloides puede ser importante y la nitrificacin menor.
C= O + H2O
NH2
NH2
COO
NH4
2NH3 + CO2
La cianamida clcica es otro fertilizante empleado comnmente. Por hidrlisis no biolgica se forma urea, la que es
mineralizada por la poblacin ureoltica:
CaCN2 + 2H2O
H2CN2
+
H2O
+ Ca(OH)2
ureasa
CO(NH2)2 2NH3 + CO2
H2N - C - C - NH2
O O
oxamida
168
ARN, ADN
mononucletido
azcar
purinas urea
pirimidinas
NH3, aa
Lillian Frioni
Ecologa
Como hemos visto este es un proceso muy poco especfico, realizado por gran nmero de microorganismos hetertrofos adaptados a las ms variadas condiciones ecolgicas.
La amonificacin ocurre en todas aquellas condiciones
compatibles con la vida (que aseguran que el agua se
encuentre en estado lquido).
Temperatura: como con todas las reacciones biolgicas,
una elevacin de temperatura estimula el proceso. El ptimo del amplio grupo de amonificantes se ubica en el rango termfilo.
pH: puede llevarse a cabo desde pH muy bajos (3,5-4,0)
a superiores a 9,0. Una fuerte acidez retarda el proceso y
son sobre todo las bacterias anaerobias y los hongos los
activos en esas condiciones. A pH superiores dominan
los actinomicetes y algunas algas que pueden emplear
fuentes de nitrgeno orgnicas.
Cultivos vegetales: ejercen un doble efecto, por un lado
proveen restos orgnicos nitrogenados por descamacin
de races, exudados, percolados a travs de las hojas y
follaje, estimulan la amonificacin real o bruta, pero tambin absorbe a los iones amonio: la amonificacin neta se
ve as inhibida.
En resumen: el proceso se realiza en amplias condiciones ambientales, con innumerables sustratos y la microflora responsable incluye prcticamente a todos los microorganismos hetertros. La actividad sera mxima en
aerobiosis, temperaturas en el rango termfilo, neutrofilia
y humedades medias
Estabilidad de compuestos nitrogenados orgnicos
Numerosos investigadores han remarcado la estabilidad
de la fraccin nitrogenada orgnica del suelo. En efecto,
Formacin de complejos entre protenas y fracciones orgnicas del suelo, como lignina, compuestos
fenlicos o sustancias del tipo del humus
Complexacin con minerales arcillosos: la adsorcin
externa al complejo de intercambio del suelo (ms firmemente si en la protena dominan las cargas electropositivas) o la inclusin dentro de las hojuelas, posibilitan un retardo en la biodegradacin. Esta hiptesis explica tambin la inhibicin de enzimas extracelulares
Toxicidad del ambiente: la vegetacin o el metabolismo microbiano producen sustancias inhibidoras cuya
concentracin aumenta con la concentracin hidrogeninica del medio y la anaerobiosis: cumarinas, taninos, resinas, contribuyen a estabilizar la materia orgnica en suelos forestales
La liberacin se realiza gradualmente a medida que la
vegetacin las requiere, evitando prdidas importantes por
lavado o desnitrificacin. Pero en algunos ecosistemas
este bloqueo puede ser negativo para la nutricin de las
plantas, como ocurre en horizontes superficiales (Ao) de
formaciones forestales.
Nitrificacin
La nitrificacin se define como la conversin biolgica
del nitrgeno desde un estado reducido (NH4+, N-orgnico) a otro ms oxidado (NO2, NO3), a partir de compuestos orgnicos o inorgnicos, por una microflora auto y
hetertrofa.
Es un proceso biolgico conocido desde hace mucho tiempo que se realiza en el suelo, en ambientes marinos, abonos, y en los procesos de depuracin de aguas servidas.
Ya en la poca napolenica se produca el nitro de Chile
en pilas de suelo, con abonos orgnicos y carbonato de
calcio. Pasteur postul la naturaleza microbiana del proceso y hacia 1890 Winogradsky aisl a los microorganis-
Sin embargo, los avances logrados en mtodos computacionales y en las tcnicas analticas para la determinacin de diferentes fracciones de la materia orgnica, hacen que estos modelos se vuelvan herramientas prcticas que economizan tiempo y numerosos experimentos
de laboratorio y campo.
En resumen: aumentar y/o mantener el nivel de materia
orgnica de un suelo es un objetivo prioritario en todo
manejo agrcola. La aplicacin de abonos orgnicos (restos de cosechas, subproductos industriales) contribuye a
evitar la prdida de humus en suelos sometidos a intensa
explotacin.
Los principales factores a tener en cuenta para elevar el
contenido de materia orgnica de los suelos son: canti-
* molculas recalcitrantes
100
% descomposicin
167
glucosa
protenas
80
restos de leguminosas
restos cereales
60
estircol
lignina
40
madera
cido hmico*
20
0
12
28 semanas
tasa de degradacin
174
azcares
almidn
protenas
celulosa
lignina
menos de 1 ao
6-8 aos
ms de 100 aos
tiempo
166
Lillian Frioni
Modelos de simulacin
Las bacterias son activas sobre todo atacando las cadenas laterales alifticas. Los actinomicetes pueden adems
degradar molculas aromticas provocando decoloracin
del medio.
Los hongos son activos degradadores de molculas hmicas. Entre los productos de la degradacin de los cidos hmicos se han detectado residuos de la degradacin de la lignina bastante como cidos vanllico y sirngico. En suelos donde la lignina est ausente, como los
antrticos cubiertos de helechos, no se encontraron estos
productos. Otras sustancias que aparecen en la degradacin, como flavonoides, pueden derivar de sntesis microbiana o de la vegetacin.
Ecologa
Carbono: fuentes de carbono fcilmente degradables
(0,5-2%) estimulan el crecimiento microbiano favoreciendo la degradacin del humus en el laboratorio. Para otras
especies la celulosa es ms eficiente. El efecto sobre la
humificacin es el mismo que analizamos en la degradacin de otros biopolmeros: el aumento microbiano provoca agotamiento de nutrientes y la poblacin induce el equipo enzimtico para degradar molculas ms complejas.
Nitrgeno: el de las cadenas laterales es asimilado por los
microorganismos aunque en menor grado que las formas
inorgnicas u orgnicas simples del suelo. Otras fuentes
nitrogenadas ejercen efecto variable segn las especies.
Calcio: los humatos clcicos son ms fcilmente degradados in vitro que los de sodio (efecto tampn favorable
para la actividad enzimtica).
Arcillas: ejercen efecto protector: la oxidacin de los cidos hmicos es ms lenta con illita y montmorillonita. El
Muchos modelos se han elaborado a partir de 5 compartimientos que incluyen: la biomasa microbiana, dos formas
de materia orgnica estabilizada (en forma fsica o qumica) y el componente de residuos vegetales, dividido en
mos responsables. Confirm la naturaleza biolgica calentando una columna de suelo o tratndola con cloroformo: el proceso cesaba y los nitratos volvan a formarse al
reinocular este sistema con suspensin de suelo frtil.
La nitrificacin afecta a:
Los cultivos, ya que constituye un proceso fundamental para la nutricin vegetal, los nitratos son fcilmente
absorbidos, en menor grado el amonio y los nitritos resultan txicos.
Al ambiente, pues una intensa nitrificacin resulta muchas veces perjudicial para el hombre. Los iones nitrito
y nitrato son solubles y por lo tanto mviles con el agua
que puede llevarlos lejos de la zona de absorcin radical. El amonio, al ser fijado en el complejo de intercambio, resulta menos mvil. La polucin de las aguas por
los nitratos resulta un problema en los pases que emplean grandes dosis de fertilizantes. Los nitratos se reducen a nitritos en la sangre, unindose a la hemoglobina que se convierte en metahemoglobina, molcula
que no funciona en la transferencia del O2. La enfermedad es conocida como metahemoglobinemia (enfermedad de los chicos azules). Los estndares para consumo humano son inferiores a 10 mg/L de N-NO3 para
el agua potable.
Nitrificacin auttrofa
La nitrificacin auttrofa puede dividirse en dos pasos, cada
uno realizado por un grupo particular de organismos:
I) Nitritacin: NH4+ + 1,5 O2
II) Nitratacin: NO2 + 0,5 O2
+
NO2 + 2H + H2O G = 84 cal/mol
NO3
G = 17, 8 cal/mol
175
Nitrificantes auttrofos
Son bacterias muy relacionadas pertenecientes a la familia Nitrobacteriaceae, gram negativas, que no forman
esporas, bacilos, cocos o espirilos, en general mviles por
flagelos polares.
Auttrofos obligados, muchos compuestos orgnicos les
resultan txicos, por alteraciones producidas en la esterilizacin en autoclave. Fuentes de carbono: del CO2, bicarbonatos y carbonatos y de energa: de la oxidacin de
sales amoniacales o nitrosas.
El cuadro 3 resume las caractersticas de los 4 gneros
de bacterias oxidantes de amonio y de los 3 oxidantes del
nitrito. Las especies ms representativas son Nitrosomonas europea y Nitrobacter winogradsky. Los nitrificantes autotrficos secundarios, es decir, el resto de los que
figuran en el cuadro 3 aparecen en general en bajo nmero y presentan rangos ms estrechos de temperatura y
pH para su desarrollo. Otra importante diferencia la constituye la habilidad para crecer heterotrficamente de algunas especies del segundo grupo. Nitrobacter agilis puede
crecer con materia orgnica y es estimulado por extracto
de levadura. Nitrobacter winogradsky posee mayor potencial para crecer heterotrficamente que Nitrococcus y
Nitrospina. Piruvato y aminocidos estimulan el crecimiento de Nitrosomonas europea.
Velocidad de crecimiento: comparada con la de la mayora de las bacterias heterotrficas, la vc de las bacterias
nitrificantes es baja. Tiempos de generacin de 8 horas
han sido informados en medio de cultivo. Se piensa que
en la naturaleza se sobrepasan las 20-40 horas. El desarrollo en medio de cultivo se acelera con sales de bicarbonato solubles o de lcali para contrarrestar la cada del
pH. El rendimiento celular es tambin bajo (0,15 kg biomasa/kg N-NH4+ oxidado para la nitritacin y de 0,02kg de
biomasa/kg N-NO2 oxidado para la nitratacin).
Eficiencias bioqumicas (N inorgnico oxidado/C-CO2
asimilado) de 14-70/1 para Nitrosomonas y de 76-135/1
para Nitrobacter (gran capacidad sinttica, la mayora no
requieren factores de crecimiento). Como vimos, los oxidantes del amonio obtienen ms energa de la reaccin y
deben metabolizar menos nitrgeno por unidad de carbono asimilado.
176
Lillian Frioni
Nitrospira
Nitrococcus
Morfologa
( G+C)
Crecimiento
Habitat
47,4 - 51
5 - 40
aguas frescas
54,1
25 - 30C
suelo
56,5 - 51
2 - 30C
pH 6,0 - 8,2
suelo
60,7 - 61,7
5 - 40C
pH 5,7-10.2
suelo, mar,
aguas frescas
57,7
57,7
20 - 30C
20 - 30C
pH 7-8
mar
mar
G = -0,7 kcal/mol
G = -83,3 kcal/mol
NH4+ + 0,5 O2
NH2OH + O2
Directa: por agotamiento en cajas de Petri con slicogel nutritivo: solucin salina, sales de amonio o nitritos,
carbonato de calcio. Las microcolonias se detectan por
el halo transparente por disolucin del carbonato por
los cidos producidos.
Por enriquecimiento previo en el mismo medio selectivo lquido y varios pasajes en el mismo medio fresco,
que facilita el aislamiento en medio slido.
NO2 + H2O + H
cit c Fe+3 + NO2 cit c Fe+2 + NO2 (radical libre) cit a1 Fe+2 + NO2 +
NO2 + 0,5 O2 cit a1 Fe+3 + NO3
globalmente: NO2 cit c cit a1 O2
165
Ocurrir mxima humificacin cuando los procesos aerobios y anaerobios estn correctamente balanceados.
Si la anaerobiosis es permanente, la humificacin es
prcticamente nula y se conduce a la formacin de turbas. El proceso parece tener el ptimo en microaerofilia o en condiciones de alternancia de perodos de
aerobiosis y anaerobiosis.
Actividad del hombre: el laboreo disminuye el nivel de
materia orgnica al romper los agregados y exponer la
materia orgnica a la biodegradacin, pero el efecto de
mezclado favorece la calidad. Alternancias de cultivo y
barbecho favorecen la humificacin. Los suelos cultivados presentan un humus ms evolucionado, pero menos
abundante, que puede descender por debajo de niveles
crticos. Enterrar restos vegetales activa su mineralizacin
y una aplicacin ms profunda favorece la humificacin
(condiciones micraeroflicas).
Deshumificacin
El clima influye en la productividad (cantidad y calidad
del material vegetal) y directamente en la actividad biolgica. La degradacin del N del humus disminuye 2-3 veces por cada 10C de disminucin de la temperatura. En
regiones fras aumenta considerablemente el nivel de humus. El congelamiento y descongelamiento disminuyen
la estabilidad de las molculas hmicas. Por el contrario,
un congelamiento prolongado aumenta la estabilidad. La
desecacin favorece la polimerizacin de sustancias prehmicas (maduracin). Suelos permanentemente hmedos presentan formas poco condensadas y mviles (cidos flvicos).
Suelos: el contenido y calidad de las arcillas facilita la
humificacin. Un pH alto favorece la actividad mineralizante y la humificacin por bacterias. El calcio facilita la
floculacin y maduracin de las molculas prehmicas.
La humedad ms favorable para la humificacin se sita
en la vecindad del 60% de la capacidad de campo. La
saturacin no favorece al proceso; los suelos saturados
son pobres en humus. Un insuficiente drenaje conduce a
humus bruto o a turba.
Se encuentran gran nmero de dificultades en la investigacin de biodegradacin del humus: los microorganismos pueden crecer con cidos hmicos pero emplean
solamente los compuestos asociados, como los aminocidos, dejando la estructura aromtica intacta, hecho que
sumado a la falta de datos sobre la estructura exacta de
la molcula (si es que tienen una estructura bsica comn), tornan las comparaciones muy difciles.
Adems, las zonas claras alrededor de las colonias desarrolladas en medios con cidos hmicos no indican
necesariamente la degradacin de los mismos; muchas
veces, ellos son precipitados alrededor de las clulas.
A pesar de estos inconvenientes parece correcto afirmar
que ciertos hongos, sobre todo Ascomycetes y Basidiomycetes, pueden degradar cidos hmicos en el laboratorio por reduccin enzimtica de grupos aromticos carboxilo a aldehido y luego hasta alcoholes. Los sistemas
enzimticos son adaptativos. En filtrados de cultivos de
hongos creciendo sobre cidos hmicos se detectaron
alcohol saliclico y salicilaldehido.
164
Lillian Frioni
hidratos de carbono
1-3%
residuos no descompuestos
lignina
oxidacin
apertura:
p-OH
benzaldehido,
c. vanillico
descomposicin
microbiana
sntesis microbiana
compuestos con N
polisacridos
quinona melanina
ncleos
del humus
cidos
aa
azcares amonio
alcoholes
10-30%
celulosa
hemicelulosa
aminocidos
aceites
ceras
sustancias aminadas
de restos vegetales
50-60% de la MS
compuestos hmicos
heteropolicondensados
Microbiologa de la humificacin
Los microorganismos participan en la formacin de molculas hmicas, catalizando distintas reacciones bioqumicas. Algunos autores discuten si su rol es directo o
indirecto y una de las preguntas es cmo se concilia la
rpida mineralizacin de las sustancias vegetales con
su humificacin.
Hiptesis:
se postula la humificacin de los restos que quedan en
microporos donde no llegan las bacterias, pero s sus
enzimas, aunque no se puede olvidar la adsorcin que
pueden sufrir las enzimas en su camino hacia el sustrato.
las molculas son rpidamente policondensadas o polimerizadas a partir de radicales libres formados por la
accin enzimtica a altas concentraciones de sustancias monomricas, cuando los organismos capaces de
atacarlos estn ausentes. Se puede seguir la humificacin de hojas al microscopio.
se sostiene que la humificacin comienza en los restos
inmediatamente luego de la muerte celular, cuando las
enzimas autolticas estn activas, pero la destruccin
an no ha comenzado (condensacin de aminocidos
de la hidrlisis proteca con quinonas y polifenoles).
Las sustancias pardas aparecen en las clulas antes que
los tejidos lignificados presenten alteraciones visibles.
Cuando las clulas se descomponen, estas sustancias se
liberan al suelo, pudiendo adsorberse a arcillas y protegerse del ataque microbiano.
Nitrificacin hetertrofa
Los nitrificantes hetertrofos constituyen un grupo menos especializado que requieren medios con sustratos
orgnicos con amonio o nitritos y pueden acumular nitritos o nitratos cuando el crecimiento ces. Los organismos son bacterias, incluidos los actinomicetes, y hongos.
Aspergillus flavus es reconocido en la oxidacin del amonio hasta nitrato, a partir de nitropropionato con un equipo
enzimtico especializado, con nitrito intermediario:
peroxidasa
3 nitropropionato NO2 + CO2 + H2O
Energa: su principal fuente proviene de sustratos orgnicos pero la energa liberada es escasa y no satisface los
requerimientos plsticos de los microorganismos (no est
acoplada a procesos de biosntesis).
Organismo
sustrato
Arthrobacter spp
NH succinato
NH
Entre los principales factores que afectan el proceso citaremos: vegetacin, actividad biolgica del suelo, clima,
tipos de suelos, actividad del hombre.
C/N de los restos: relaciones menores de 25/1 estimulan rpida mineralizacin, limitando el potencial de humificacin, relaciones altas conducen a acumulacin de
humus libre.
177
y N-orgnico
4
+
NH y acetato
4
Pseudomonas
aeroginosa
Hansenula marakii
acetaldoxina
nitroetano
nitropropano
Aspergillus flavus
Nitrosomonas spp
Nitrobacter
+
4
+
4
NH y sacarosa
NH
NO2-
producto final
velocidad
gN/da/g biomasa
concentracin
gN/mL
hidroxilamina,
nitrito
nitrato
nitrito
nitrato
hidroxilamina
nitrito
nitrato
c. hidroxmico
1-nitroetanol
nitrito
12
375
250
4.500
9.000
660
600
300
2.000
0,2
1,6
14,1
15,0
18,0
2,0
6,0
10,0
150,0
nitrito
1.680
2,8
c. 3 nitropropinico
nitrato
nitrito
nitrato
1.400
1.350
1,3 x 106
5,7 x 10 6
45,0
75.0
2-4 x 10 3
2-4 x 10 3
178
Lillian Frioni
Ecologa
Se analizarn aspectos ecolgicos de la nitrificacin auttrofa por su importancia cuantitativa y por el hecho de estar ms
afectada por las condiciones del medio. La gran similitud fisiolgica de las especies actuantes explica en parte la sensibilidad a condiciones del ambiente: el proceso puede no ocurrir o ser extremadamente lento en suelos anegados, de pH
muy bajo, o bajo temperaturas muy altas. Como la amonificacin es un proceso menos especfico, en el suelo se acumular amonio.
Analizaremos el efecto de los principales factores:
Nivel de nutrientes: el sustrato energtico puede ser el
factor limitante: amonio o nitrito. Nitrosomonas generalmente oxida 35 unidades de nitrgeno y Nitrobacter unas
100 unidades de nitrgeno por cada C-CO2 asimilado.
La produccin de nitratos es proporcional al amonio disponible. El carbono no es una limitante ya que lo toman
del CO2, carbonatos, bicarbonatos. El nitrito puede acumularse cuando se inhibe la actividad de los oxidantes
del nitrito, como ocurre luego de aplicar altas dosis de
urea, amonaco anhidro o sales de amonio, a pH alto.
La autoecologa de estos grupos nos explica ya esta inhibicin (cuadro 5).
Se observa que el primer paso de la oxidacin es ms
verstil. Condiciones adversas de pH, temperatura o dosis altas de fertilizantes amoniacales, conducen a la acumulacin de nitritos, txicos para los vegetales y la mayora de los microorganismos.
Cuadro 5- Autoecologa de Nitrosomonas
y Nitrobacter
pH
aun activo
a bajas
temperatura
Nitrobacter
inhibido a pH:
inactivo
inhibido a altas
dosis
superiores a 9,0
inferiores a 5,0
sobre 40 e
inferior a 5C
En las sustancias hmicas ms condensadas predominaran los ncleos, con iso o heterociclos, como derivados
del benceno, antraceno, furano, piridina, que pueden condensarse por puentes alifticos, oxgeno, nitrgeno o por
unin directa entre anillos. Estos enlaces le dan a la molcula gran estabilidad qumica y biolgica.
La poblacin nitrificante auttrofa es mayor en suelos neutros o ligeramente alcalinos y el encalado favorece el proceso en suelos cidos, que presentan una gran fase de
latencia (varios das) en la aparicin de los nitratos (ejemplo de la incidencia favorable del hombre sobre un proceso microbiano).
log N-NO
3
mg/litro
Las sustancias rpidamente degradables como la celulosa, hidratos de carbono simples, juegan un importante rol en la formacin del humus. Luego de 7 das
en el suelo, un 70-75% del C14 de la glucosa se localiz en fracciones hmicas, mientras que el C14 de acetato se distribuy luego de 6-9 horas en la humina, cidos flvicos y hmicos, en forma similar al carbono de
la paja.
Temperatura N- amoniacal
Nitrosomonas tolera pH
altos y bajos
NaNO2
3,0
NH4Cl
aminocido
2,0
1,0
5
10
15
20 das
163
El carbono de clulas microbianas contribuye a la fraccin ms simple del humus, los aminocidos.
La figura 12 (Allison, 1973) presenta un esquema de formacin de molculas hmicas. En los ltimos 50 aos
se han realizado numerosos estudios sobre la sntesis
de la fraccin orgnica del suelo. En el laboratorio una
serie de reacciones condujeron a distintos tipos de humus artificial. Los microorganismos se consideran intermediarios en estos procesos; los restos de sus clulas y
sus productos metablicos constituyen etapas en una
serie de reacciones. Los pigmentos microbianos como
las melaninas son muy estables a la degradacin, son
parcialmente solubles en soda y se extraen en la fraccin humus.
En el suelo los procesos son ms lentos que en el laboratorio, pero las reacciones se aceleran por:
la gran actividad superficial de las partculas (catlisis
inorgnica)
los sinergismos microbianos que posibilitan la formacin de los mismos productos finales.
La estabilidad del humus es muy grande. En turbas congeladas de Alaska se estim la edad de estas molculas
entre 1.775 +/- 110 y 11.005 +/-350 aos (a 1 m de
profundidad). A los 2 metros esta edad podra llegar a
25.300+/-300 aos. En suelos templados esta edad es
menor como consecuencia del mayor reciclamiento de la
materia orgnica.
En resumen, se piensa que el humus es el producto de
neosntesis a partir de compuestos ms o menos solubles
originados en la descomposicin de la materia orgnica fresca, mediante la combinacin de procesos biolgicos y fsico-qumicos, durante un largo perodo de tiempo.
La adicin de materia orgnica al suelo puede provocar
estimulacin de la descomposicin de la materia orgnica nativa. Este fenmeno se refiere como efecto renovador (priming effect) y fue observado luego del enriquecimiento del suelo con materia orgnica simple o restos vegetales.
162
Lillian Frioni
Humus
45-65% en carbono, 30-40% en oxgeno, gran abundancia de grupos metoxilo (-OCH3), fenoles (-OH), carboxilo
(-COOH), poco nitrgeno (para algunos autores se tratara de impurezas) y S, P, Fe, etc.
El humus est constituido por mezcla de sustancias amorfas, que es originado de la fitomasa parcialmente descompuesta y de la sntesis microbiana. Son molculas elsticas, de carcter cido, de alto peso molecular y naturaleza coloidal, de gran superficie interna y externa, originadas por la accin de procesos fsico-qumicos y biolgicos a expensas de productos de la degradacin de la
materia orgnica.
Su lenta mineralizacin (1-2% al ao) hace de estas sustancias el verdadero reservorio de nutrientes del suelo,
liberndose lentamente los iones minerales aprovechables por los vegetales.
mineralizacin rpida
restos vegetales
estructuras
an organizadas
++
PO4 , Fe
reorganizacin
sntesis de complejos
hmicos coloidales
humificacin
mineralizacin lenta
Humedad: es otro de los factores que afectan profundamente a la nitrificacin auttrofa ya que regula el nivel de
oxigenacin del suelo. La formacin de nitratos cesa cuando el nivel de humedad es inferior al punto de marchitamiento permanente, mientras que la amonificacin es an
activa. La figura 4 presenta la nitrificacin en suelo franco
limoso con 500 mg/kg de N-NH4+ como fosfato diamnico
y sometido a diversas tensiones de succin desde 0
(saturado) hasta 15 barias e incubado a 21C. En general, se podra aceptar la siguiente escala de tensiones de
humedad para una mxima acumulacin de nitrato:
ques de conferas, ricos en sustancias fenlicas. La intensa inmovilizacin de formas minerales del nitrgeno por
microorganismos hetertrofos explica tambin la disminucin de nitratos en rizosferas. Se evitan as prdidas
por lavado o desnitrificacin de los nitratos formados, en
ambientes de baja tensin de O2.
Estacin del ao: el efecto de la estacin est condicionado por la interaccin de numerosos factores como la
disponibilidad de nutrientes, la temperatura, la humedad,
la aireacin, etc. No puede predecirse en que pocas del
ao el nivel de nitratos ser mayor. En general, en la regin templada la produccin de nitratos es ms activa en
primavera y otoo, ms lenta en verano e invierno. Pero
las fluctuaciones de temperatura y humedad y las prcticas culturales pueden alterar este comportamiento.
-3
N2 atmosfrico
El contenido y calidad de estas sustancias est en relacin directa con la fertilidad del suelo por sus propiedades
y es inclusive empleado en formulaciones comerciales de
los llamados bioestimulantes orgnicos (cuadro 14).
179
N-NO
3
mg/kg
0,1
300
0,33
200
1
5
100
15
0
saturado
0
10
15
20 das
El rehumedecimiento de suelos secos estimula la nitrificacin. Se explica este hecho por la accin de enzimas
liberadas por clulas muertas en la desecacin, que permaneceran adsorbidas a la fraccin organo-mineral del
suelo que se sumaran a las presentes en las clulas vivas. La temperatura favorece el proceso.
180
Lillian Frioni
Inhibidores de la nitrificacin
Para disminuir prdidas de nitrgeno por lavado o desnitrificacin en suelos sin cubierta vegetal importante o que
sufre frecuentes perodos de anegamiento, se han desarrollado investigaciones tendientes a inhibir la nitrificacin.
Es sabido que:
los herbicidas e insecticidas empleados en dosis normales no afectan al proceso
los fungicidas y fumigantes ejercen gran accin como
inhibidores de la nitrificacin, aun en dosis normales
otras sustancias son empleadas como el 2 Cl 6
(tri Cl metil) piridina, conocido comercialmente como
N-serve; 2-amino-4 Cl-6 metilpiridina (AM); dicianodiamida; tiourea; 2-sulfanilamidotiazol (ST); los tiazoles;
triazinas; isocianatos, etc. El N-serve es uno de los ms
frecuentemente empleados que inhibe a los auttrofos
pero no a los nitrificantes hetertrofos y se usa mucho
en reas arroceras sometidas a alternancias de secado
e inundacin.
El inhibidor es degradado con el tiempo y la nitrificacin
recomienza, con el activo desarrollo del vegetal. El xito
del mtodo est vinculado a la velocidad a la que la microflora degrada al inhibidor.
CO2 + 4H2
CH4 + 2H2O
Los cidos orgnicos simples acumulados en estos ambientes anaerbicos son empleados tambin por las metanobacterias. La biosntesis de metano est limitada a
un grupo especializado de bacterias anaerobias que habitan suelos inundados, pantanos, abonos en fermentacin, sedimentos marinos y tracto intestinal de animales
superiores. Son difciles de aislar en cultivo puro y la produccin de CH4 es muy activa en poblaciones mixtas.
Methanobacterium, Methanosarcina y Methanococcus,
son los principales gneros encontrados en el suelo y actan al final de una cadena trfica (captulo 21).
Otro hidrocarburo simple encontrado en ecosistemas naturales es el etileno, liberado por numerosas especies de
hongos, bacterias esporuladas y actinomicetes. A bajas
concentraciones acta como una fitohormona: produce
elongacin de races y desarrollo de races laterales.
Otros hidrocarburos voltiles: etano, propano, propileno, son formados en atmsferas anaerobias, a partir de
miembros de la microflora del suelo. Los de mayor importancia son el metano y el etileno.
161
La aplicacin residuos animales al suelo es de prctica frecuente y su degradacin est asegurada por la actividad
biolgica del mismo, pero la acumulacin de grandes cantidades de ellos puede generar problemas en relacin a:
200
Lillian Frioni
en las unicelulares, como Gloecapsa, aunque stas pueden fijar N2 en el aire, existiendo una separacin temporal entre la liberacin fotosinttica del O2 y la actividad
nitrogensica.
Peltigera aphtosa). Son muy estudiados por su contribucin en nitrgeno en suelos muy fros y en bosques tropicales, donde especies de Stricta, Leptogium y Collema
pueden contribuir con 1 a 8 kg N/ha/ao.
descomposicin de los
restos vegetales
CO
2
luz
Las cianobacterias son responsables del nitrgeno fijado en reas marinas, en mayor medida por las heterocsticas. Las que no poseen estas clulas especializadas fijan N2 en zonas de bajo nivel de O2, aguas estancadas y eutrofizadas, de importancia en algunos ecosistemas.
Otras asociaciones
En zona tropical se describe una asociacin con una
gimnosperma, la Cycadaceae, donde especies de Nostoc forman estructuras parecidas a ndulos en las races. Aproximadamente un tercio de las 90 especies
poseen estos ndulos, con aportes de unos 19 kg N/
ha/ao en Macrozamia riedlei. Entre las angiospermas
slo se conoce un representante subtropical, Gunnera, que se asocia a Nostoc con heterocistos y que fija
N 2 en glndulas de la base de las hojas. El nitrgeno
fijado es rpidamente transferido al eucariote, sobre
todo como amonio.
Bacterias hetertrofas
El cuadro 4 presenta los ms importantes gneros de bacterias hetertrofas fijadoras de nitrgeno. El grupo contiene organismos acuticos o terrestres de organismos aerobios, anaerobios y anaerobios facultativos. Las especies facultativas slo fijan N2 anaerbicamente y los aerobios presentan varios grados de sensibilidad frente al oxgeno.
Su distribucin es muy variada, aunque slo alcanzan altas densidades cuando se renen ciertas condiciones,
sobre todo sustratos carbonados, temperatura, pH, humedad.
Los gneros ms conocidos desde hace ms de 50 aos
son Azotobacter y Clostridium, aerobio el primero y anaerobio el ltimo. Actualmente son muchos los gneros reconocidos como activos en el suelo y en la rizosfera.
181
rizosfera
PO4
SO4
K
-3
CO2
NO3
Mg
aminoazcares
compuestos
inorgnicos
CO2
inmovilizacin
temporaria en
la biomasa
+2
CO2
nutrientes
disponibles
lavado
adsorcin
C/N
1,5
80/1
60/1
40/1
NH4
NO2
-
nitrificacin(NO2 ,NO3 )
inmovilizacin(N-org)
asimilacin(N-org)
adsorcin a coloides
fijacin a coloides
lavado, menos
erosin
volatilizacin
NO3
-
nitratacin(NO3 )
idem
idem
lavado
reduccin(N2)
lavado
idem
-
desnitrificacin (N )
2
idem
idem
lavado
+
idem (NO2 , NH4 )
lavado
idem
-
1,0
20/1
10/1
0,5
0
30
60
90
120 das
182
Lillian Frioni
La naturaleza qumica de las fracciones carbonadas y nitrogenadas puede hacer variar esta relacin. As, restos
ricos en lignina, difcilmente degradables, pueden considerarse con relaciones crticas superiores.
En el cuadro 8 se muestra la relacin C/N tpica de algunos materiales orgnicos (Stevenson y Cole, 1999).
Cuadro 8- C/N de materiales orgnicos
Material
Biomasa microbiana
Aguas residuales
Humus
Abonos animales
Residuos de leguminosas y abonos verdes
Residuos de cereales y pajas
Residuos de bosques (madera)
composts
C/N
6 - 12
5 - 14
10 - 12
9 - 25
13 - 25
60 - 80
150 - 500
15 - 20
En el cuadro 9 se efecta un clculo terico, para predecir cul de los procesos (mineralizacin-inmovilizacin) dominar en un suelo cuando el resto de paja es
atacado por poblaciones puras, por ejemplo, por bacterias aerobias, actinomicetes, u hongos, cuya C/N promedio y la eficiencia en la asimilacin del carbono, se
determin:
Eficiencia = (C celular formado/C total degradado) x 100
EficienciaC/N
C asim
N asim
hongos
30-40%
10/1
12-16
1,2-1,6
10-30
15-30
10/1
5/1
bacterias
aerobias
actinomices
Dficit/exceso
-0,7, -1,1
(i neta)
199
Los heterocistos son clulas rodeadas de gruesas paredes y parecen vacas al microscopio de luz. Son en
general de mayor tamao que las clulas vegetativas y
estn ubicadas a intervalos a lo largo del filamento o
pueden presentarse terminalmente. Presentan sistemas
membranosos muy desarrollados con invaginaciones.
Poseen abundantes ribosomas y han perdido los grnulos estructurales de glicgeno y polifosfato. Estn conectados a clulas adyacentes por un poro en la pared
celular (figura 4).
Abonos verdes
Materiales ricos en N% como los abonos verdes, las leguminosas (2-3% N%), no presentan esta limitante y el nitrgeno mineral puede aparecer en el suelo desde el comienzo de la degradacin. Estas consideraciones tericas basadas en datos de nutricin microbiana resultan
difciles de aplicar a la poblacin microbiana en ambientes naturales ya que all la heterogeneidad es enorme, en
tipos de organismos, estado fisiolgico y resulta difcil calcular las relaciones C/N y la eficiencia media en la utilizacin del carbono.
Suborden
Familia
Chroococcales
Chroococcaceae
Gleocapsa (1)
Unicelulares
Nostocales
Nostocaceae
Oscillatoriaceae
Trichodesmiun (1)
Oscillatoria (1)
Plectonema (1)
Lynbgbya
(1)
Phormidium (1)
Filamentosas sin
heterosistos
maz
10
avena
alfalfa
aserrn
Stigonematales
Rivulariaceae
Scytonemataceae
Calothrix (5)
Scytonema (2)
Tolypothrix
Stigonemataceae
Fischerella (2)
Hapalosiphon (1)
Stigonema (1)
Westielipsis (1)
Mastigociadus (1)
6
2
16
32 semanas
Anabaena (12)
Anabaenopsis (1)
Aulosira (1)
Cylindrospermun (4)
Nostoc (8)
Nodularia (1)
Filamentosas
con heterosistos
inmovilizacin neta
del N (mgN/g vegetal
original
12
Gnero
Mastigociadaceae
Segn algunos autores se originan en clulas preexistentes llamadas preheterocistos ubicadas a intervalos regulares del filamento, de tamao algo mayor que el resto de la
clula y segn las condiciones ambientales pueden formarse los heterocistos. Otros autores opinan que la posicin
de ellos est determinada por los ya preexistentes, originndose nuevos cuando algunas sustancias, como el amonio fijado en los heterocistos, alcanzan niveles muy bajos.
Su desarrollo es inhibido por niveles elevados de nitrgeno
combinado.
Fijacin en relacin al O2
Aerobiosis: las cianobacterias filamentosas heterocsticas
(Anabaena, Nostoc) pueden fijar N2 en estas condiciones
ya que los heterocistos poseen activo fotosistema I, pueden fotofosforilar, pero no liberan O2 ni reducen el CO2.
Poseen alta actividad reductora, recibiendo los compuestos carbonados, el ATP y el poder reductor de clulas adyacentes a las cuales les brindan el nitrgeno combinado resultante de la fijacin. El sistema membranoso ofrece una
proteccin estructural subcelular y la fotorrespiracin activa
remueve excesos de O2 (proteccin fisiolgica).
Microaerofilia, las cianobacterias filamentosas sin heterocistos como Plectonema pueden fijar N2, pero no en
condiciones de intensa oxigenacin. Lo mismo ocurre
198
Lillian Frioni
Diazotrofos fotosintticos
Cianobacterias
Este grupo posee todas las caractersticas subcelulares de
los procariotas, excepto el tipo de fotosntesis, que es la de
las algas y vegetales. Son capaces de desarrollarse en medio mineral y obtienen su C y N de la fijacin fotosinttica del
CO2 y N2. Con la obtencin de cultivos libres de contaminantes bacterianos (muchas veces los responsables de la fijacin) por radiacin U.V. o agregado de antibiticos o colorantes en los medios de cultivo, el nmero de especies fijadoras
se increment rpidamente: de aproximadamente 165 gneros, en 8 familias y 3 rdenes, se encontr fijacin en 46
gneros, de 7 familias y 3 subrdenes (cuadro 5).
Las cianobacterias presentan tres tipos de clulas: vegetativas, esporas o acinetos y heterocistos. Una
clula vegetativa puede diferenciarse en esporas y heterocistos y todas poseen la informacin gentica para
la sntesis de la nitrogenasa, que como vimos es muy
sensible al O2.
O
enzimas
extracelulares
CO
2
biomasa
microbiana
enzimas
extracelulares
sustrato
compuestos
simples
pobre en N,P,S
C/N>30/1
i m
i neta
C/P>300/1
C/S>400/1
disminuda
disponibilidad de
nutrientes en el
ecosistema
++
+
-3
(NH4 , NO3 , PO4 , Fe )
sustrato compuestos
simples
rico en N, P, S
C/N<20/1
m neta
C/P<200/1
C/S<200/1
aumentada
183
184
Lillian Frioni
Clostridium
Desulfovibrio
Autotrofos
Asociaciones con nodulos
s/nodulos
Azolla
Gunnera
Plectonema
Lyngbya
Oscillatoria
Spirulina
lquenes
Briofitas
hepticas
bacterias
fotoauttrofas
Rhodospirillum
Rhodopseudomonas
Chromatium
Chlorobium
quimioauttrofas
Thiobacullus ferooxidans
Anabaena
Nostoc
Calothrix
microaeroflicas
con animales
no leguminosas
Frankia, con:
Alnus, Casuarina
Eleagnus, Myrica
Dryas, Ceanothus
Mycobacterium
Azospirillum
Aquaspirillum
Rhizobium
Frankia
filosfera
Vida libre
Biolgicas
Volatilizacin del NH3, puede ocurrir a partir del agregado de abonos a base de urea, amonio anhidro, sales amoniacales, pero tambin luego de la incorporacin de restos vegetales. Las prdidas son particularmente importantes en las siguientes situaciones:
pH superior a 8,0 (suelos calcreos o aquellos cuyo pH
local se eleva por amonificacin intensa)
temperatura elevada y desecacin
aplicacin de fertilizantes en la superficie del suelo
suelos de baja capacidad de intercambio catinico.
Klebsiella
Bacillus
Enterobacter
Escherichia
Propionibacterium
leguminosas
Rhizobium lupini
R. leguminosarum bv viciae,trifolii,phaseoli
Sinorhizobium meliloti
S. fredii
S. terangae
Bradyrhizobium japonicum
B. elkani
Azorhizobium cualinodans
anaerobios
estrictos
cianobacterias
aerobias
Abiolgicas
rizosfera
microaerfilos
(aerobios
cuando no
fijan N2)
En esta seccin analizaremos las causas ms importantes por las cuales las distintas formas qumicas del nitrgeno son volatilizadas o convertidas en formas no aprovechables por los vegetales y la mayora de los microorganismos.
Azotobacter
Azotococcus
Azomonas
Beijerinckia
Derxia
Prdidas de nitrgeno
anaerobios
facultativos
(aerobios
cuando no
fijan N2)
Lavado, como vimos, parte del amonio, los nitritos y nitratos son solubles en agua y pueden por lo tanto ser llevados a horizontes fuera del contacto con las races.
aerobios
Ciertos elementos, Cu y Mn, en suelos cidos, reaccionan con los nitritos, liberando NO (xido nitrico), que es
bastante estable y puede pasar a la atmsfera:
NO + O2 NO2 N2O4, o ser absorbido por el suelo.
Los xidos de nitrgeno reaccionan con el agua del aire,
a pH inferior a 5,5:
N2O4 + H2O + 0,5 O2 2 HNO3 Estas causas de
prdidas de N no son importantes, ya que poco nitrito puede formarse a pH cido.
HNO2 + RNH2 N2 + H2O + ROH (reaccin de Van
Slyke). Tambin poco importante pues requiere acidez y
aerobiosis.
HNO2 + NH3 NO2NH4 2 H2O + N 2 Reaccin
importante a pH alcalino.
Heterotrofos
Vida libre
Las mayores prdidas ocurren en suelos livianos, arenosos. Conviene mezclar los fertilizantes que liberan amonio con los primeros 5cm del suelo.
197
Cycadacea
196
Lillian Frioni
se oxida este amonio a N2 el que se analiza en espectrmetro de masa, que separa en un campo magntico los
distintos istopos segn su masa (30, 29 ,28). El mtodo
posee escasa utilidad en condiciones naturales y limitaciones en condiciones controladas.
15
:
I. tcnica de la dilucin isotpica, se acepta como el ms
til para medir la FBN
II. tcnica que usa el valor A (proporcin del N15 que la
planta toma del fertilizante)
N2 + 8H+ + 8-
2NH3 + H2
C2H4
Los resultados se expresan en etileno formado o acetileno reducido sin efectuar extrapolaciones a nitrgeno
fijado. El mtodo se usa para comparar gran cantidad
de muestras (cepas, suelos, plantas noduladas) pero no
hay que olvidar que la prueba ms concluyente de capacidad fijadora la constituye la incorporacin de tomos de N15.
185
En suelos cidos de pH 5,0 o menor, los gases nitrogenados pueden producirse qumicamente, con NO a partir de
nitritos. En la mayora de los suelos, la desnitrificacin
respiratoria constituye la principal causa de prdidas de
nitratos. En la llamada desnitrificacin no respiratoria
(Mayrold, 1998), los organismos producen xido nitroso
en condiciones aerobias, pero no obtienen energa de este
proceso que es realizado por numerosas bacterias, hongos y algas. Con excepcin de pocos gneros, (Lactobacillus, Fusarium), la fraccin de nitratos convertida, es en
general menos de 25%, pero su importancia en la naturaleza no est bien determinada.
Si el N2 el N2O son los productos formados en la respiracin de los nitratos, el proceso recibe el nombre de desnitrificacin.
Metodologa: la cromatografa de gases permite seguir
con mucha precisin el contenido de N2 y N2O en la atmsfera del suelo y el empleo de N15-NO3 permite evaluar con exactitud estas causas de prdidas de nitrgeno. Actualmente se trata de evaluar esta importante causa de prdida de fertilizantes en suelos y aguas, aplicando tcnicas de evaluacin tanto in-vitro como in-situ.
Se analizarn los grupos ms importantes de diazotrofos, comenzando por aquellos reconocidos como fijadores en vida libre, es decir los que expresan su nitrogenasa sin requerir la proteccin o la colaboracin de otro
organismo, aunque pueden ser favorecidos por los nutrientes y el ambiente con baja pO2 que le ofrece la rizosfera.
Ningn eucariota posee esta importante capacidad y
los intentos de la ingeniera gentica tratando de transferir esta propiedad cuando los genes nif se encuentran en plsmidos o estn integrados al cromosoma
bacteriano, son numerosos y se han logrado algunos
diazotrofos sintticos. Numerosos experimentos intentan transferir esta propiedad a vegetales, sobre todo
a gramneas, pero el funcionamiento de estas plantas
transgnicas en la naturaleza, es motivo de controversia.
Asimilativo
Asimilacin o
inmovilizacin
de nitratos
Desasimilativo
*quimiodesnitrificacin
*desnitrificacin
no respiratoria
* respiracin
NO3 (*)
Productos
+
NH4
no
Regulada por
+
NH4 , N-org
NO ms que no
N2
NO
Condiciones
del suelo
baja conc.NH
cidas
no
aerbica
NO2
si
O2
anaerbica
pocas cepas
O2
anaerbica
O2
anaerbica
N2 N2O NO si
NH4+ + 3H2O
+
4
*NO3 reduccin
desasimilativa
a NH4+
NH4+ N2O
*desnitrificacin
respiratoria
Energa
conservada
186
Lillian Frioni
Desnitrificacin
Efectos en la naturaleza
los vegetales se perjudican ya que los nitratos son su
principal fuente de nitrgeno
el ambiente se beneficia ya que los nitratos altamente
txicos y solubles son lavados del suelo y llevados a
cauces de agua. La desnitrificacin es vital en la continuidad del ciclo del nitrgeno. Si no ocurriera este proceso, el nitrgeno de la tierra, incluyendo el N2 atmosfrico, se acumulara en los ocanos, impidiendo la vida
terrestre. La desnitrificacin mantiene tambin la potabilidad de las aguas, ya que altas concentraciones de
nitratos son txicas.
Microorganismos responsables
Los microorganismos vinculados a la desnitrificacin no
dependen de los nitratos para su desarrollo. Muchos de
ellos son tambin activos en la proteolisis, amonificacin
y otras transformaciones biolgicas. La presencia de una
alta poblacin desnitrificante en suelos, aguas, no implica
que las condiciones sean las ptimas para el proceso; se
refleja solamente un gran potencial desnitrificante.
inhibicin por
glutamato retroalimentacin
As, la capa arable de suelos contiene ms de 10 desnitrificantes/g suelo seco. La poblacin es mayor en la
vecindad de las races y el potencial de volatilizacin es
grande, pero deben reunirse las condiciones para que
los organismos cambien su metabolismo aerobio por una
respiracin anaerobia, con nitrato como aceptor final de
electrones.
en anaerobiosis degradan el mismo sustrato por respiracin anaerobia con nitrato como aceptor de electrones
Un 85% de las especies testadas pueden reducir nitratos a nitritos. El grupo que reduce los nitratos hasta amonio es tambin amplio, un 45% del total, e incluye a la
de la sntesis de aminocidos. Alta concentracin de glutamina o de algn otro aminocido disminuye la actividad
de la enzima y suprime tambin la produccin de aminocidos adicionales.
Regulacin de la nitrogenasa
La figura 2 esquematiza los mecanismos de regulacin
de la FBN. El nitrgeno combinado suprime la fijacin por
inhibicin de la sntesis de la nitrogenasa, mediante mecanismos de represin de la expresin de los genes responsables de la sntesis de los componentes de la enzima (genes nif). En Klebsiella pneumoniae la represin ha
sido estudiada en detalle y la molcula crucial es una enzima, la glutamino sintetasa, que cataliza el primer paso
en la sntesis de aminocidos: el amonio reacciona con el
glutamato formando otro aminocido: la glutamina.
NH3
N2
glutamato
sintetasa
nitrogenasa
transporte
de e-
comp. II
reducido
glutamina
otros
aminocidos
cofactor Mo
195
N2, como los heterocistos en cianobacterias filamentosas y las vesculas, en Frankia, es indicio de que el
organismo puede fijar N2.
Contenido de nitrgeno
Se permite desarrollar al microorganismo o sistema simbitico en un medio sin nitrgeno o con muy poca cantidad. Las medidas de este elemento por tcnicas convencionales como la de Kjeldahl (digestin cida en caliente
de la materia orgnica, destilacin y titulacin del NH3),
permiten detectar fijacin si sta es de cierta magnitud
(ms del 1% del N inicial). Los errores son altos y la muestra se destruye en el anlisis.
proteinas
componente I
nif B
comp. II oxidado
nif F
nif D
nif H
control de la expresin de los genes
La mayora de los otros aminocidos se forman por transferencia del nitrgeno desde la glutamina a otros compuestos.
La glutamino sintetasa es regulada por inhibicin feed
back o retroalimentacin, por distintos productos finales
194
Lillian Frioni
cianuro, azidas, etc. (Zuberer, 1998). Se demostr que estas molculas son sustratos que podan ser reducidas por
la enzima (cuadro 3). El acetileno es un inhibidor no competitivo de la reduccin del N2 (figura 1), mientras que el N2
inhibe competitivamente la reduccin del acetileno
Inhibidores
El H2 es un inhibidor competitivo de la reduccin del N2,
pero no de la de protones, ni de otra reduccin catalizada
por la enzima. El O2 inactiva ambos componentes de la
N2asa, acta como inhibidor no competitivo. El mecanismo no est totalmente dilucidado, puede relacionarse con
la expresin de los genes nif o con la formacin de radicales libres (superxidos) generados en el ambiente altamente reductor donde funciona la enzima.
e
2MgATP 2MgADP
+2Pi
2MgATP 2MgADP
+2Pi
N2
H+
C2H2
H2
NH3+H2
C2H4
N2
H+
C2H2
H2
NH3+H2
C2H6
C2H4
Km(mM)
Productos
0,1
1,0
0,4
1,0
0,1
-
NH3, H2
N2, NH3, N2H4
CH3NH2, NH3, CH4
N2, H20
C2H4
H2
10
RCH3, NH3
187
Ecologa
La restriccin de la actividad desnitrificante a pocos gneros hace que la magnitud el proceso est marcadamente
afectada por el ambiente. Los cambios en ste pueden
estimular o bien inhibir las prdidas de nitratos.
Las condiciones que deben reunirse para que el proceso hetertrofo sea estimulado:
alto nivel de nitratos,
sustancias donadoras de electrones (materia orgnica)
anaerobiosis
Los nitratos se producen por nitrificacin o son aportados en fertilizantes ntricos, amoniacales u orgnicos que
pueden ser llevados a nitratos. Tambin pueden provenir
de otros horizontes arrastrados por el agua. Incluso en
suelos de arrozales donde en general se fertiliza con amonio, ste puede oxidarse a nitrato en las capas superiores
del agua y luego ser desnitrificado ms abajo.
La anaerobiosis se logra fcilmente en aguas, a unos
pocos centmetros de la superficie y en los suelos existen
microagregados en los cuales la demanda biolgica agota rpidamente el O2 y como ste es un gas que difunde
lentamente por los poros del suelo y es poco soluble en
agua, se crean ambientes anaerobios en el seno de suelos bien estructurados.
Otros factores
Humedad: en suelos bien drenados la desnitrificacin se
correlaciona con el nivel de humedad. Los nitratos se re-
188
Lillian Frioni
75
400
100
50
200
25
0
50
0
10
14
18
En los organismos fotosintticos la fuente de poder reductor proviene del flujo electrnico derivado de la clorofila.
pH: la desnitrificacin es sensible a la acidez y las prdidas en ambientes muy cidos no pueden atriburse directamente a causas biolgicas. Sobre el pH 6,0 se forma
N2O pero se reduce a N2 que es el gas dominante. Debajo
de pH 6,0 la reduccin es inhibida y predomina el xido
nitroso: la produccin de N2O es mxima en suelos cidos y mnima en neutros. La reduccin ulterior N2O a N2
se produce en todos los casos. El ptimo del grupo se
sita en el rango neutrfilo: 7,0 - 8,2 coincidente con la
mxima actividad bacteriana, pero los rangos se extienden desde pH 4,5 a 10,0.
El componente I, tambin denominado Mo-Fe protena, Azofermo, dinitrogenasa y est formada por 4 subunidades de cadenas polipeptdicas. En Azotobacter su PM
es de 220.000 y posee 22-24 tomos de Fe y 2 de Mo.
Vida media en el aire: hasta 20 minutos.
El componente II, o Fe protena o Azofer, ferroprotena, dinitrogenasa reductasa, PM 55.000-66.000, posee 2 subunidades proteicas con 4 tomos de Fe y uniones sulfuro lbil., vida media en el aire 0,5-0,75 segundos. El complejo estara en equilibrio dinmico con sus
dos componentes:
22 das de incubacin
La alternancia de perodos de buena y mala aireacin ejerce un efecto acelerador de las prdidas de N por desnitrificacin. La figura 10 muestra la evolucin del nitrgeno
total (Nt) y del N-NO3 en un suelo incubado a 35C durante 60 semanas en tres condiciones:
a.mantenido constantemente a 16-20% de humedad
b.mantenido siempre saturado en agua
c.saturado en agua la primera mitad del ciclo (3 semanas) y secado hasta 18% de humedad y mantenido as
la segunda mitad del ciclo (3 semanas).
Temperatura: el proceso ocurre lentamente a bajas temperaturas (2C) y la velocidad de prdida de nitratos aumenta con la temperatura. El ptimo para algunos autores se sita en el rango termfilo (40-75C). La desnitrificacin a bajas temperaturas tiene gran significado agrcola ya que posibilita prdida de nitrgeno en las estaciones fras cuando el suelo no posee una cubierta vegetal
que absorba a los nitratos. Es aconsejable mantener una
vegetacin extendida que puede luego ser enterrada evitando prdidas de nitrgeno.
N-NO3
mg/kg
1000
800
Nt
mg/kg
600
150
193
a
100
50
b
400
ciclos de 6 semanas
ciclos de 6 semanas
El cuadro 12 muestra el efecto de la temperatura de incubacin en la desnitrificacin de nitratos en 30 das en suelo inundado con glucosa. Se verifica el ptimo en el rango
termfilo.
La nitrogenasa es la enzima responsable de la reduccin y dada su complejidad resulta muy difcil de purificar.
Adems, por su extremada sensibilidad frente al O2 los
trabajos in-vitro se han limitado en el tiempo. Recin en
1960, se logr purificar la enzima a partir de un organismo anaerobio, el Clostridium pasteurianum. Hacia 1974
se lograron aislamientos a partir de unos 25 microorganismos, incluidos los aerobios, pero trabajando siempre
en ausencia de O2.
La enzima est integrada por dos componentes, dos
metaloprotenas fcilmente separables que recibieron
N2asa
Sustratos de la enzima
El dinitrgeno es el sustrato natural de la enzima, es reducido a amonio en una reaccin irreversible que va acompaada de la liberacin de H2. La relacin entre H2 producido/N2 reducido puede variar segn las nitrogenasas de
los microorganismos, pero nunca es inferior a 1.
N2 + 16 ATP + 8 e- + 10 H+
+
2NH4 + H2 + 16 Pi
192
Lillian Frioni
x 106 toneladas/ao
49
10
35
FBN total
sistemas simbiticos
total en sistemas terrestres
170
50
139
Leguminosas
arbreas (100-300 kg/ha/ao)
granos (40-240 kg/ha/ao)
abonos verdes (100-360 kg/Ha/ao)
35
4
45
5
5
10
cantidad N en suelos
absorcin total de N
N mineralizado
N desnitrificado
N perdido por erosin/lavado
CH3-CH-(NH2)-COOH + H2O
alanina
HNO
(% N-NO3 agregado)
temperaturaC
N-perdido
2 10 13 16 20 25 30 40 50 60
20 80 80 83 85 87 92 91 90 92
NO
NO2
H2N2O2
NO2NH2
70
0
N2O
N2
FAD
citc
NO3 reductasa
NO3
NO2
industrial (fertilizantes)
atmosfrica (electroqumica)
otros procesos qumicos
NO3
Fuente de fijacin
Cuadro 2 - Fijacin biolgica del nitrgeno atmosfrico y flujo anual de N en trminos globales
Este proceso representa menos del 30% de la fijacin total mundial. Vimos que otro 10% provendra de los procesos no biolgicos realizados en la atmsfera, es de suponer entonces que ms de un 60% del total de nitrgeno
que se incorpora cada ao en el suelo y aguas provendra
de la FBN.
189
cit. oxidasa
O2
H2O
Requisitos
105.000
1.400
3.500
135
85
La produccin de fertilizantes qumicos requiere una energa muy considerable para separar el H2 del gas natural o
del petrleo, menos cantidad para comprimir los reactivos
y calentarlos y otra importante cantidad para el traslado
y distribucin desde las plantas industriales al campo. La
necesidad de conservar los combustibles fsiles, el carbn, el metano y el petrleo incentiva las investigaciones
sobre la FBN.
La nitrato reductasa (Mo-Fe protena no hemnica) es inhibida por el O2 que reprime su biosntesis. El paso siguiente:
NO2 NO es mediatizado por una nitrito reductasa, que segn el organismo es una hemoprotena con dos hemos de
tipo c y d o una cuproprotena, ambas solubles, que emplean
el NADH o FADH. Se formara un intermediario hipottico, el
nitroxilo, tal vez en forma de complejo con la enzima.
Resumen
Como vimos el ciclo del nitrgeno es complejo y el conocimiento de su funcionamiento en ecosistemas naturales
es de sumo inters a los efectos de lograr mayor productividad y sustentabilidad y para mejorar los problemas del
ambiente. La mayora del N de los suelos se encuentra
en formas orgnicas que liberan lentamente las formas
minerales ms dinmicas. Los procesos de mineralizacin-inmobilizacin gobiernan el nivel de minerales y la
relacin C/N de la materia orgnica en descomposicin
es uno de los factores que regulan estos procesos. La
amonificacin es un proceso ms difundido y menos especfico y exigente que el paso siguiente, la nitrificacin.
Bioqumica de la desnitrificacin
El esquema siguiente presenta los posibles mecanismos:
190
Lillian Frioni
mvil y se lava (prdidas y riesgos de polucin) y finalmente se pierde en la atmsfera como gases, por la desnitrificacin (N2 y N2O). El xido nitroso es muy peligroso
por su marcado efecto invernadero, con destruccin de la
capa de ozono. Esta ltima ocurre en anaerobiosis, pero
tambin en suelos aireados, dentro de micrositios o agregados donde se establece anaerobiosis. La alternancia
de ciclos de aireacin y saturacin estimulan estas prdidas. Las bacterias responsables son anaerobias facultativas.
Finalmente el ciclo del nitrgeno se cierra por el proceso
de fijacin del N2, el cual es la fuente ltima de este elemento en la naturaleza.
El cuadro 13 resume algunas consideraciones sobre futuros desafos relacionados a este importante elemento.
Cuadro 13- Perspectivas y opciones de manejo en
relacin al ciclo global del N
Bibliografa
Dommergues, Y., Mangenot, F. Ecologie microbienne du
sol, 1970, Masson, Pars
Frioni, L. Procesos microbianos, 1999, Fundacin de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina,
Mayrold, D. D. Transformations of Nitrogen, En: Principles and Applications of Soil Microbiology 1998,
Sylvia, D. M., J. J. Fuhrmann, P. G. Hartel, D. A.
Zuberer, (eds), Prentice Hall, New Jersey, 259-294
191
Stevenson, F. J. & M. A. Cole, (eds) Cycles of Soils: carbon, nitrogen, phosphorus, sulphur, micronutrients, 1999, Wiley & Sons, New York: 139-229
Preguntas de repaso
1) Dibuje su propio diagrama del ciclo terrestre del N,
incluyendo las principales fuentes y las transformaciones que puede sufrir.
2) Describa la composicin del N-orgnico y su relacin
con su biodegradacin.
3) A partir de los siguientes sustratos, analice las enzimas involucradas en su mineralizacin, los productos intermediarios y finales:
Sustrato
enzimas
productos
Protenas
Pptidos
Quitina
Peptidoglicano
ARN, ADN
Urea
4) Describa la formacin de nitratos y las vas que puede seguir en el suelo.
5) Ciclo interno del nitrgeno.
6) Compare los procesos de nitrificacin y desnitrificacin en relacin a la microflora actuante y los mecanismos de obtencin de energa en cada caso.
7) Por qu una alternancia de aerobiosis/anaerobiosis
estimula la prdida de nitrgeno de los ecosistemas
terrestres?
8) Desnitrificacin en la rizosfera: es estimulada?
Cmo evidenciara el efecto neto en este ambiente?
9) Un residuo vegetal (45%C y 1,5%N) es picado y mezclado en el suelo. Asumiendo que la biomasa microbiana tiene una relacin C/N de 8/1 y la eficiencia en
el uso del carbono de la poblacin es del 40%, calcule si dominar la mineralizacin o la inmovilizacin
neta. Explique sus resultados.
10) Analice las causas de prdidas de nitrgeno en ecosistemas naturales y formas a implementar para evitarlas.
11
92
146
192
N-N
N=N
NN
38
98
225
En la naturaleza el nitrgeno se presenta en numerosos compuestos con estados de oxidacin que van desde (+5) a (-3):
(+ 5) cido ntrico (HNO3)
(+ 4) dixido de N (NO2)
(+ 3) cido nitroso (HNO2)
(+ 2) xido ntrico (NO)
(+ 1) xido nitroso (N2O)
Este proceso microbiano es realizado por un grupo limitado de protistas inferiores llamados tambin diazotrofos
(diazo=N2, trofo=nutricin) a temperaturas y presiones
normales, gracias a la accin de una enzima muy compleja, la nitrogenasa. El N2 se reduce tambin por vas
no biolgicas.
2NH3 + H2
aminocidos, uredos
NH3 + O
NO3
ozonizacin del N2
fotlisis del N2O
ozonizacin del NO
hidratacin del NO2
oxidacin del NH3
190
Lillian Frioni
mvil y se lava (prdidas y riesgos de polucin) y finalmente se pierde en la atmsfera como gases, por la desnitrificacin (N2 y N2O). El xido nitroso es muy peligroso
por su marcado efecto invernadero, con destruccin de la
capa de ozono. Esta ltima ocurre en anaerobiosis, pero
tambin en suelos aireados, dentro de micrositios o agregados donde se establece anaerobiosis. La alternancia
de ciclos de aireacin y saturacin estimulan estas prdidas. Las bacterias responsables son anaerobias facultativas.
Finalmente el ciclo del nitrgeno se cierra por el proceso
de fijacin del N2, el cual es la fuente ltima de este elemento en la naturaleza.
El cuadro 13 resume algunas consideraciones sobre futuros desafos relacionados a este importante elemento.
Cuadro 13- Perspectivas y opciones de manejo en
relacin al ciclo global del N
Bibliografa
Dommergues, Y., Mangenot, F. Ecologie microbienne du
sol, 1970, Masson, Pars
Frioni, L. Procesos microbianos, 1999, Fundacin de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina,
Mayrold, D. D. Transformations of Nitrogen, En: Principles and Applications of Soil Microbiology 1998,
Sylvia, D. M., J. J. Fuhrmann, P. G. Hartel, D. A.
Zuberer, (eds), Prentice Hall, New Jersey, 259-294
191
Stevenson, F. J. & M. A. Cole, (eds) Cycles of Soils: carbon, nitrogen, phosphorus, sulphur, micronutrients, 1999, Wiley & Sons, New York: 139-229
Preguntas de repaso
1) Dibuje su propio diagrama del ciclo terrestre del N,
incluyendo las principales fuentes y las transformaciones que puede sufrir.
2) Describa la composicin del N-orgnico y su relacin
con su biodegradacin.
3) A partir de los siguientes sustratos, analice las enzimas involucradas en su mineralizacin, los productos intermediarios y finales:
Sustrato
enzimas
productos
Protenas
Pptidos
Quitina
Peptidoglicano
ARN, ADN
Urea
4) Describa la formacin de nitratos y las vas que puede seguir en el suelo.
5) Ciclo interno del nitrgeno.
6) Compare los procesos de nitrificacin y desnitrificacin en relacin a la microflora actuante y los mecanismos de obtencin de energa en cada caso.
7) Por qu una alternancia de aerobiosis/anaerobiosis
estimula la prdida de nitrgeno de los ecosistemas
terrestres?
8) Desnitrificacin en la rizosfera: es estimulada?
Cmo evidenciara el efecto neto en este ambiente?
9) Un residuo vegetal (45%C y 1,5%N) es picado y mezclado en el suelo. Asumiendo que la biomasa microbiana tiene una relacin C/N de 8/1 y la eficiencia en
el uso del carbono de la poblacin es del 40%, calcule si dominar la mineralizacin o la inmovilizacin
neta. Explique sus resultados.
10) Analice las causas de prdidas de nitrgeno en ecosistemas naturales y formas a implementar para evitarlas.
11
92
146
192
N-N
N=N
NN
38
98
225
En la naturaleza el nitrgeno se presenta en numerosos compuestos con estados de oxidacin que van desde (+5) a (-3):
(+ 5) cido ntrico (HNO3)
(+ 4) dixido de N (NO2)
(+ 3) cido nitroso (HNO2)
(+ 2) xido ntrico (NO)
(+ 1) xido nitroso (N2O)
Este proceso microbiano es realizado por un grupo limitado de protistas inferiores llamados tambin diazotrofos
(diazo=N2, trofo=nutricin) a temperaturas y presiones
normales, gracias a la accin de una enzima muy compleja, la nitrogenasa. El N2 se reduce tambin por vas
no biolgicas.
2NH3 + H2
aminocidos, uredos
NH3 + O
NO3
ozonizacin del N2
fotlisis del N2O
ozonizacin del NO
hidratacin del NO2
oxidacin del NH3
192
Lillian Frioni
x 106 toneladas/ao
49
10
35
FBN total
sistemas simbiticos
total en sistemas terrestres
170
50
139
Leguminosas
arbreas (100-300 kg/ha/ao)
granos (40-240 kg/ha/ao)
abonos verdes (100-360 kg/Ha/ao)
35
4
45
5
5
10
cantidad N en suelos
absorcin total de N
N mineralizado
N desnitrificado
N perdido por erosin/lavado
CH3-CH-(NH2)-COOH + H2O
alanina
HNO
(% N-NO3 agregado)
temperaturaC
N-perdido
2 10 13 16 20 25 30 40 50 60
20 80 80 83 85 87 92 91 90 92
NO
NO2
H2N2O2
NO2NH2
70
0
N2O
N2
FAD
citc
NO3 reductasa
NO3
NO2
industrial (fertilizantes)
atmosfrica (electroqumica)
otros procesos qumicos
NO3
Fuente de fijacin
Cuadro 2 - Fijacin biolgica del nitrgeno atmosfrico y flujo anual de N en trminos globales
Este proceso representa menos del 30% de la fijacin total mundial. Vimos que otro 10% provendra de los procesos no biolgicos realizados en la atmsfera, es de suponer entonces que ms de un 60% del total de nitrgeno
que se incorpora cada ao en el suelo y aguas provendra
de la FBN.
189
cit. oxidasa
O2
H2O
Requisitos
105.000
1.400
3.500
135
85
La produccin de fertilizantes qumicos requiere una energa muy considerable para separar el H2 del gas natural o
del petrleo, menos cantidad para comprimir los reactivos
y calentarlos y otra importante cantidad para el traslado
y distribucin desde las plantas industriales al campo. La
necesidad de conservar los combustibles fsiles, el carbn, el metano y el petrleo incentiva las investigaciones
sobre la FBN.
La nitrato reductasa (Mo-Fe protena no hemnica) es inhibida por el O2 que reprime su biosntesis. El paso siguiente:
NO2 NO es mediatizado por una nitrito reductasa, que segn el organismo es una hemoprotena con dos hemos de
tipo c y d o una cuproprotena, ambas solubles, que emplean
el NADH o FADH. Se formara un intermediario hipottico, el
nitroxilo, tal vez en forma de complejo con la enzima.
Resumen
Como vimos el ciclo del nitrgeno es complejo y el conocimiento de su funcionamiento en ecosistemas naturales
es de sumo inters a los efectos de lograr mayor productividad y sustentabilidad y para mejorar los problemas del
ambiente. La mayora del N de los suelos se encuentra
en formas orgnicas que liberan lentamente las formas
minerales ms dinmicas. Los procesos de mineralizacin-inmobilizacin gobiernan el nivel de minerales y la
relacin C/N de la materia orgnica en descomposicin
es uno de los factores que regulan estos procesos. La
amonificacin es un proceso ms difundido y menos especfico y exigente que el paso siguiente, la nitrificacin.
Bioqumica de la desnitrificacin
El esquema siguiente presenta los posibles mecanismos:
188
Lillian Frioni
75
400
100
50
200
25
0
50
0
10
14
18
En los organismos fotosintticos la fuente de poder reductor proviene del flujo electrnico derivado de la clorofila.
pH: la desnitrificacin es sensible a la acidez y las prdidas en ambientes muy cidos no pueden atriburse directamente a causas biolgicas. Sobre el pH 6,0 se forma
N2O pero se reduce a N2 que es el gas dominante. Debajo
de pH 6,0 la reduccin es inhibida y predomina el xido
nitroso: la produccin de N2O es mxima en suelos cidos y mnima en neutros. La reduccin ulterior N2O a N2
se produce en todos los casos. El ptimo del grupo se
sita en el rango neutrfilo: 7,0 - 8,2 coincidente con la
mxima actividad bacteriana, pero los rangos se extienden desde pH 4,5 a 10,0.
El componente I, tambin denominado Mo-Fe protena, Azofermo, dinitrogenasa y est formada por 4 subunidades de cadenas polipeptdicas. En Azotobacter su PM
es de 220.000 y posee 22-24 tomos de Fe y 2 de Mo.
Vida media en el aire: hasta 20 minutos.
El componente II, o Fe protena o Azofer, ferroprotena, dinitrogenasa reductasa, PM 55.000-66.000, posee 2 subunidades proteicas con 4 tomos de Fe y uniones sulfuro lbil., vida media en el aire 0,5-0,75 segundos. El complejo estara en equilibrio dinmico con sus
dos componentes:
22 das de incubacin
La alternancia de perodos de buena y mala aireacin ejerce un efecto acelerador de las prdidas de N por desnitrificacin. La figura 10 muestra la evolucin del nitrgeno
total (Nt) y del N-NO3 en un suelo incubado a 35C durante 60 semanas en tres condiciones:
a.mantenido constantemente a 16-20% de humedad
b.mantenido siempre saturado en agua
c.saturado en agua la primera mitad del ciclo (3 semanas) y secado hasta 18% de humedad y mantenido as
la segunda mitad del ciclo (3 semanas).
Temperatura: el proceso ocurre lentamente a bajas temperaturas (2C) y la velocidad de prdida de nitratos aumenta con la temperatura. El ptimo para algunos autores se sita en el rango termfilo (40-75C). La desnitrificacin a bajas temperaturas tiene gran significado agrcola ya que posibilita prdida de nitrgeno en las estaciones fras cuando el suelo no posee una cubierta vegetal
que absorba a los nitratos. Es aconsejable mantener una
vegetacin extendida que puede luego ser enterrada evitando prdidas de nitrgeno.
N-NO3
mg/kg
1000
800
Nt
mg/kg
600
150
193
a
100
50
b
400
ciclos de 6 semanas
ciclos de 6 semanas
El cuadro 12 muestra el efecto de la temperatura de incubacin en la desnitrificacin de nitratos en 30 das en suelo inundado con glucosa. Se verifica el ptimo en el rango
termfilo.
La nitrogenasa es la enzima responsable de la reduccin y dada su complejidad resulta muy difcil de purificar.
Adems, por su extremada sensibilidad frente al O2 los
trabajos in-vitro se han limitado en el tiempo. Recin en
1960, se logr purificar la enzima a partir de un organismo anaerobio, el Clostridium pasteurianum. Hacia 1974
se lograron aislamientos a partir de unos 25 microorganismos, incluidos los aerobios, pero trabajando siempre
en ausencia de O2.
La enzima est integrada por dos componentes, dos
metaloprotenas fcilmente separables que recibieron
N2asa
Sustratos de la enzima
El dinitrgeno es el sustrato natural de la enzima, es reducido a amonio en una reaccin irreversible que va acompaada de la liberacin de H2. La relacin entre H2 producido/N2 reducido puede variar segn las nitrogenasas de
los microorganismos, pero nunca es inferior a 1.
N2 + 16 ATP + 8 e- + 10 H+
+
2NH4 + H2 + 16 Pi
194
Lillian Frioni
cianuro, azidas, etc. (Zuberer, 1998). Se demostr que estas molculas son sustratos que podan ser reducidas por
la enzima (cuadro 3). El acetileno es un inhibidor no competitivo de la reduccin del N2 (figura 1), mientras que el N2
inhibe competitivamente la reduccin del acetileno
Inhibidores
El H2 es un inhibidor competitivo de la reduccin del N2,
pero no de la de protones, ni de otra reduccin catalizada
por la enzima. El O2 inactiva ambos componentes de la
N2asa, acta como inhibidor no competitivo. El mecanismo no est totalmente dilucidado, puede relacionarse con
la expresin de los genes nif o con la formacin de radicales libres (superxidos) generados en el ambiente altamente reductor donde funciona la enzima.
e
2MgATP 2MgADP
+2Pi
2MgATP 2MgADP
+2Pi
N2
H+
C2H2
H2
NH3+H2
C2H4
N2
H+
C2H2
H2
NH3+H2
C2H6
C2H4
Km(mM)
Productos
0,1
1,0
0,4
1,0
0,1
-
NH3, H2
N2, NH3, N2H4
CH3NH2, NH3, CH4
N2, H20
C2H4
H2
10
RCH3, NH3
187
Ecologa
La restriccin de la actividad desnitrificante a pocos gneros hace que la magnitud el proceso est marcadamente
afectada por el ambiente. Los cambios en ste pueden
estimular o bien inhibir las prdidas de nitratos.
Las condiciones que deben reunirse para que el proceso hetertrofo sea estimulado:
alto nivel de nitratos,
sustancias donadoras de electrones (materia orgnica)
anaerobiosis
Los nitratos se producen por nitrificacin o son aportados en fertilizantes ntricos, amoniacales u orgnicos que
pueden ser llevados a nitratos. Tambin pueden provenir
de otros horizontes arrastrados por el agua. Incluso en
suelos de arrozales donde en general se fertiliza con amonio, ste puede oxidarse a nitrato en las capas superiores
del agua y luego ser desnitrificado ms abajo.
La anaerobiosis se logra fcilmente en aguas, a unos
pocos centmetros de la superficie y en los suelos existen
microagregados en los cuales la demanda biolgica agota rpidamente el O2 y como ste es un gas que difunde
lentamente por los poros del suelo y es poco soluble en
agua, se crean ambientes anaerobios en el seno de suelos bien estructurados.
Otros factores
Humedad: en suelos bien drenados la desnitrificacin se
correlaciona con el nivel de humedad. Los nitratos se re-
186
Lillian Frioni
Desnitrificacin
Efectos en la naturaleza
los vegetales se perjudican ya que los nitratos son su
principal fuente de nitrgeno
el ambiente se beneficia ya que los nitratos altamente
txicos y solubles son lavados del suelo y llevados a
cauces de agua. La desnitrificacin es vital en la continuidad del ciclo del nitrgeno. Si no ocurriera este proceso, el nitrgeno de la tierra, incluyendo el N2 atmosfrico, se acumulara en los ocanos, impidiendo la vida
terrestre. La desnitrificacin mantiene tambin la potabilidad de las aguas, ya que altas concentraciones de
nitratos son txicas.
Microorganismos responsables
Los microorganismos vinculados a la desnitrificacin no
dependen de los nitratos para su desarrollo. Muchos de
ellos son tambin activos en la proteolisis, amonificacin
y otras transformaciones biolgicas. La presencia de una
alta poblacin desnitrificante en suelos, aguas, no implica
que las condiciones sean las ptimas para el proceso; se
refleja solamente un gran potencial desnitrificante.
inhibicin por
glutamato retroalimentacin
As, la capa arable de suelos contiene ms de 10 desnitrificantes/g suelo seco. La poblacin es mayor en la
vecindad de las races y el potencial de volatilizacin es
grande, pero deben reunirse las condiciones para que
los organismos cambien su metabolismo aerobio por una
respiracin anaerobia, con nitrato como aceptor final de
electrones.
en anaerobiosis degradan el mismo sustrato por respiracin anaerobia con nitrato como aceptor de electrones
Un 85% de las especies testadas pueden reducir nitratos a nitritos. El grupo que reduce los nitratos hasta amonio es tambin amplio, un 45% del total, e incluye a la
de la sntesis de aminocidos. Alta concentracin de glutamina o de algn otro aminocido disminuye la actividad
de la enzima y suprime tambin la produccin de aminocidos adicionales.
Regulacin de la nitrogenasa
La figura 2 esquematiza los mecanismos de regulacin
de la FBN. El nitrgeno combinado suprime la fijacin por
inhibicin de la sntesis de la nitrogenasa, mediante mecanismos de represin de la expresin de los genes responsables de la sntesis de los componentes de la enzima (genes nif). En Klebsiella pneumoniae la represin ha
sido estudiada en detalle y la molcula crucial es una enzima, la glutamino sintetasa, que cataliza el primer paso
en la sntesis de aminocidos: el amonio reacciona con el
glutamato formando otro aminocido: la glutamina.
NH3
N2
glutamato
sintetasa
nitrogenasa
transporte
de e-
comp. II
reducido
glutamina
otros
aminocidos
cofactor Mo
195
N2, como los heterocistos en cianobacterias filamentosas y las vesculas, en Frankia, es indicio de que el
organismo puede fijar N2.
Contenido de nitrgeno
Se permite desarrollar al microorganismo o sistema simbitico en un medio sin nitrgeno o con muy poca cantidad. Las medidas de este elemento por tcnicas convencionales como la de Kjeldahl (digestin cida en caliente
de la materia orgnica, destilacin y titulacin del NH3),
permiten detectar fijacin si sta es de cierta magnitud
(ms del 1% del N inicial). Los errores son altos y la muestra se destruye en el anlisis.
proteinas
componente I
nif B
comp. II oxidado
nif F
nif D
nif H
control de la expresin de los genes
La mayora de los otros aminocidos se forman por transferencia del nitrgeno desde la glutamina a otros compuestos.
La glutamino sintetasa es regulada por inhibicin feed
back o retroalimentacin, por distintos productos finales
196
Lillian Frioni
se oxida este amonio a N2 el que se analiza en espectrmetro de masa, que separa en un campo magntico los
distintos istopos segn su masa (30, 29 ,28). El mtodo
posee escasa utilidad en condiciones naturales y limitaciones en condiciones controladas.
15
:
I. tcnica de la dilucin isotpica, se acepta como el ms
til para medir la FBN
II. tcnica que usa el valor A (proporcin del N15 que la
planta toma del fertilizante)
N2 + 8H+ + 8-
2NH3 + H2
C2H4
Los resultados se expresan en etileno formado o acetileno reducido sin efectuar extrapolaciones a nitrgeno
fijado. El mtodo se usa para comparar gran cantidad
de muestras (cepas, suelos, plantas noduladas) pero no
hay que olvidar que la prueba ms concluyente de capacidad fijadora la constituye la incorporacin de tomos de N15.
185
En suelos cidos de pH 5,0 o menor, los gases nitrogenados pueden producirse qumicamente, con NO a partir de
nitritos. En la mayora de los suelos, la desnitrificacin
respiratoria constituye la principal causa de prdidas de
nitratos. En la llamada desnitrificacin no respiratoria
(Mayrold, 1998), los organismos producen xido nitroso
en condiciones aerobias, pero no obtienen energa de este
proceso que es realizado por numerosas bacterias, hongos y algas. Con excepcin de pocos gneros, (Lactobacillus, Fusarium), la fraccin de nitratos convertida, es en
general menos de 25%, pero su importancia en la naturaleza no est bien determinada.
Si el N2 el N2O son los productos formados en la respiracin de los nitratos, el proceso recibe el nombre de desnitrificacin.
Metodologa: la cromatografa de gases permite seguir
con mucha precisin el contenido de N2 y N2O en la atmsfera del suelo y el empleo de N15-NO3 permite evaluar con exactitud estas causas de prdidas de nitrgeno. Actualmente se trata de evaluar esta importante causa de prdida de fertilizantes en suelos y aguas, aplicando tcnicas de evaluacin tanto in-vitro como in-situ.
Se analizarn los grupos ms importantes de diazotrofos, comenzando por aquellos reconocidos como fijadores en vida libre, es decir los que expresan su nitrogenasa sin requerir la proteccin o la colaboracin de otro
organismo, aunque pueden ser favorecidos por los nutrientes y el ambiente con baja pO2 que le ofrece la rizosfera.
Ningn eucariota posee esta importante capacidad y
los intentos de la ingeniera gentica tratando de transferir esta propiedad cuando los genes nif se encuentran en plsmidos o estn integrados al cromosoma
bacteriano, son numerosos y se han logrado algunos
diazotrofos sintticos. Numerosos experimentos intentan transferir esta propiedad a vegetales, sobre todo
a gramneas, pero el funcionamiento de estas plantas
transgnicas en la naturaleza, es motivo de controversia.
Asimilativo
Asimilacin o
inmovilizacin
de nitratos
Desasimilativo
*quimiodesnitrificacin
*desnitrificacin
no respiratoria
* respiracin
NO3 (*)
Productos
+
NH4
no
Regulada por
+
NH4 , N-org
NO ms que no
N2
NO
Condiciones
del suelo
baja conc.NH
cidas
no
aerbica
NO2
si
O2
anaerbica
pocas cepas
O2
anaerbica
O2
anaerbica
N2 N2O NO si
NH4+ + 3H2O
+
4
*NO3 reduccin
desasimilativa
a NH4+
NH4+ N2O
*desnitrificacin
respiratoria
Energa
conservada
184
Lillian Frioni
Clostridium
Desulfovibrio
Autotrofos
Asociaciones con nodulos
s/nodulos
Azolla
Gunnera
Plectonema
Lyngbya
Oscillatoria
Spirulina
lquenes
Briofitas
hepticas
bacterias
fotoauttrofas
Rhodospirillum
Rhodopseudomonas
Chromatium
Chlorobium
quimioauttrofas
Thiobacullus ferooxidans
Anabaena
Nostoc
Calothrix
microaeroflicas
con animales
no leguminosas
Frankia, con:
Alnus, Casuarina
Eleagnus, Myrica
Dryas, Ceanothus
Mycobacterium
Azospirillum
Aquaspirillum
Rhizobium
Frankia
filosfera
Vida libre
Biolgicas
Volatilizacin del NH3, puede ocurrir a partir del agregado de abonos a base de urea, amonio anhidro, sales amoniacales, pero tambin luego de la incorporacin de restos vegetales. Las prdidas son particularmente importantes en las siguientes situaciones:
pH superior a 8,0 (suelos calcreos o aquellos cuyo pH
local se eleva por amonificacin intensa)
temperatura elevada y desecacin
aplicacin de fertilizantes en la superficie del suelo
suelos de baja capacidad de intercambio catinico.
Klebsiella
Bacillus
Enterobacter
Escherichia
Propionibacterium
leguminosas
Rhizobium lupini
R. leguminosarum bv viciae,trifolii,phaseoli
Sinorhizobium meliloti
S. fredii
S. terangae
Bradyrhizobium japonicum
B. elkani
Azorhizobium cualinodans
anaerobios
estrictos
cianobacterias
aerobias
Abiolgicas
rizosfera
microaerfilos
(aerobios
cuando no
fijan N2)
En esta seccin analizaremos las causas ms importantes por las cuales las distintas formas qumicas del nitrgeno son volatilizadas o convertidas en formas no aprovechables por los vegetales y la mayora de los microorganismos.
Azotobacter
Azotococcus
Azomonas
Beijerinckia
Derxia
Prdidas de nitrgeno
anaerobios
facultativos
(aerobios
cuando no
fijan N2)
Lavado, como vimos, parte del amonio, los nitritos y nitratos son solubles en agua y pueden por lo tanto ser llevados a horizontes fuera del contacto con las races.
aerobios
Ciertos elementos, Cu y Mn, en suelos cidos, reaccionan con los nitritos, liberando NO (xido nitrico), que es
bastante estable y puede pasar a la atmsfera:
NO + O2 NO2 N2O4, o ser absorbido por el suelo.
Los xidos de nitrgeno reaccionan con el agua del aire,
a pH inferior a 5,5:
N2O4 + H2O + 0,5 O2 2 HNO3 Estas causas de
prdidas de N no son importantes, ya que poco nitrito puede formarse a pH cido.
HNO2 + RNH2 N2 + H2O + ROH (reaccin de Van
Slyke). Tambin poco importante pues requiere acidez y
aerobiosis.
HNO2 + NH3 NO2NH4 2 H2O + N 2 Reaccin
importante a pH alcalino.
Heterotrofos
Vida libre
Las mayores prdidas ocurren en suelos livianos, arenosos. Conviene mezclar los fertilizantes que liberan amonio con los primeros 5cm del suelo.
197
Cycadacea
198
Lillian Frioni
Diazotrofos fotosintticos
Cianobacterias
Este grupo posee todas las caractersticas subcelulares de
los procariotas, excepto el tipo de fotosntesis, que es la de
las algas y vegetales. Son capaces de desarrollarse en medio mineral y obtienen su C y N de la fijacin fotosinttica del
CO2 y N2. Con la obtencin de cultivos libres de contaminantes bacterianos (muchas veces los responsables de la fijacin) por radiacin U.V. o agregado de antibiticos o colorantes en los medios de cultivo, el nmero de especies fijadoras
se increment rpidamente: de aproximadamente 165 gneros, en 8 familias y 3 rdenes, se encontr fijacin en 46
gneros, de 7 familias y 3 subrdenes (cuadro 5).
Las cianobacterias presentan tres tipos de clulas: vegetativas, esporas o acinetos y heterocistos. Una
clula vegetativa puede diferenciarse en esporas y heterocistos y todas poseen la informacin gentica para
la sntesis de la nitrogenasa, que como vimos es muy
sensible al O2.
O
enzimas
extracelulares
CO
2
biomasa
microbiana
enzimas
extracelulares
sustrato
compuestos
simples
pobre en N,P,S
C/N>30/1
i m
i neta
C/P>300/1
C/S>400/1
disminuda
disponibilidad de
nutrientes en el
ecosistema
++
+
-3
(NH4 , NO3 , PO4 , Fe )
sustrato compuestos
simples
rico en N, P, S
C/N<20/1
m neta
C/P<200/1
C/S<200/1
aumentada
183
182
Lillian Frioni
La naturaleza qumica de las fracciones carbonadas y nitrogenadas puede hacer variar esta relacin. As, restos
ricos en lignina, difcilmente degradables, pueden considerarse con relaciones crticas superiores.
En el cuadro 8 se muestra la relacin C/N tpica de algunos materiales orgnicos (Stevenson y Cole, 1999).
Cuadro 8- C/N de materiales orgnicos
Material
Biomasa microbiana
Aguas residuales
Humus
Abonos animales
Residuos de leguminosas y abonos verdes
Residuos de cereales y pajas
Residuos de bosques (madera)
composts
C/N
6 - 12
5 - 14
10 - 12
9 - 25
13 - 25
60 - 80
150 - 500
15 - 20
En el cuadro 9 se efecta un clculo terico, para predecir cul de los procesos (mineralizacin-inmovilizacin) dominar en un suelo cuando el resto de paja es
atacado por poblaciones puras, por ejemplo, por bacterias aerobias, actinomicetes, u hongos, cuya C/N promedio y la eficiencia en la asimilacin del carbono, se
determin:
Eficiencia = (C celular formado/C total degradado) x 100
EficienciaC/N
C asim
N asim
hongos
30-40%
10/1
12-16
1,2-1,6
10-30
15-30
10/1
5/1
bacterias
aerobias
actinomices
Dficit/exceso
-0,7, -1,1
(i neta)
199
Los heterocistos son clulas rodeadas de gruesas paredes y parecen vacas al microscopio de luz. Son en
general de mayor tamao que las clulas vegetativas y
estn ubicadas a intervalos a lo largo del filamento o
pueden presentarse terminalmente. Presentan sistemas
membranosos muy desarrollados con invaginaciones.
Poseen abundantes ribosomas y han perdido los grnulos estructurales de glicgeno y polifosfato. Estn conectados a clulas adyacentes por un poro en la pared
celular (figura 4).
Abonos verdes
Materiales ricos en N% como los abonos verdes, las leguminosas (2-3% N%), no presentan esta limitante y el nitrgeno mineral puede aparecer en el suelo desde el comienzo de la degradacin. Estas consideraciones tericas basadas en datos de nutricin microbiana resultan
difciles de aplicar a la poblacin microbiana en ambientes naturales ya que all la heterogeneidad es enorme, en
tipos de organismos, estado fisiolgico y resulta difcil calcular las relaciones C/N y la eficiencia media en la utilizacin del carbono.
Suborden
Familia
Chroococcales
Chroococcaceae
Gleocapsa (1)
Unicelulares
Nostocales
Nostocaceae
Oscillatoriaceae
Trichodesmiun (1)
Oscillatoria (1)
Plectonema (1)
Lynbgbya
(1)
Phormidium (1)
Filamentosas sin
heterosistos
maz
10
avena
alfalfa
aserrn
Stigonematales
Rivulariaceae
Scytonemataceae
Calothrix (5)
Scytonema (2)
Tolypothrix
Stigonemataceae
Fischerella (2)
Hapalosiphon (1)
Stigonema (1)
Westielipsis (1)
Mastigociadus (1)
6
2
16
32 semanas
Anabaena (12)
Anabaenopsis (1)
Aulosira (1)
Cylindrospermun (4)
Nostoc (8)
Nodularia (1)
Filamentosas
con heterosistos
inmovilizacin neta
del N (mgN/g vegetal
original
12
Gnero
Mastigociadaceae
Segn algunos autores se originan en clulas preexistentes llamadas preheterocistos ubicadas a intervalos regulares del filamento, de tamao algo mayor que el resto de la
clula y segn las condiciones ambientales pueden formarse los heterocistos. Otros autores opinan que la posicin
de ellos est determinada por los ya preexistentes, originndose nuevos cuando algunas sustancias, como el amonio fijado en los heterocistos, alcanzan niveles muy bajos.
Su desarrollo es inhibido por niveles elevados de nitrgeno
combinado.
Fijacin en relacin al O2
Aerobiosis: las cianobacterias filamentosas heterocsticas
(Anabaena, Nostoc) pueden fijar N2 en estas condiciones
ya que los heterocistos poseen activo fotosistema I, pueden fotofosforilar, pero no liberan O2 ni reducen el CO2.
Poseen alta actividad reductora, recibiendo los compuestos carbonados, el ATP y el poder reductor de clulas adyacentes a las cuales les brindan el nitrgeno combinado resultante de la fijacin. El sistema membranoso ofrece una
proteccin estructural subcelular y la fotorrespiracin activa
remueve excesos de O2 (proteccin fisiolgica).
Microaerofilia, las cianobacterias filamentosas sin heterocistos como Plectonema pueden fijar N2, pero no en
condiciones de intensa oxigenacin. Lo mismo ocurre
200
Lillian Frioni
en las unicelulares, como Gloecapsa, aunque stas pueden fijar N2 en el aire, existiendo una separacin temporal entre la liberacin fotosinttica del O2 y la actividad
nitrogensica.
Peltigera aphtosa). Son muy estudiados por su contribucin en nitrgeno en suelos muy fros y en bosques tropicales, donde especies de Stricta, Leptogium y Collema
pueden contribuir con 1 a 8 kg N/ha/ao.
descomposicin de los
restos vegetales
CO
2
luz
Las cianobacterias son responsables del nitrgeno fijado en reas marinas, en mayor medida por las heterocsticas. Las que no poseen estas clulas especializadas fijan N2 en zonas de bajo nivel de O2, aguas estancadas y eutrofizadas, de importancia en algunos ecosistemas.
Otras asociaciones
En zona tropical se describe una asociacin con una
gimnosperma, la Cycadaceae, donde especies de Nostoc forman estructuras parecidas a ndulos en las races. Aproximadamente un tercio de las 90 especies
poseen estos ndulos, con aportes de unos 19 kg N/
ha/ao en Macrozamia riedlei. Entre las angiospermas
slo se conoce un representante subtropical, Gunnera, que se asocia a Nostoc con heterocistos y que fija
N 2 en glndulas de la base de las hojas. El nitrgeno
fijado es rpidamente transferido al eucariote, sobre
todo como amonio.
Bacterias hetertrofas
El cuadro 4 presenta los ms importantes gneros de bacterias hetertrofas fijadoras de nitrgeno. El grupo contiene organismos acuticos o terrestres de organismos aerobios, anaerobios y anaerobios facultativos. Las especies facultativas slo fijan N2 anaerbicamente y los aerobios presentan varios grados de sensibilidad frente al oxgeno.
Su distribucin es muy variada, aunque slo alcanzan altas densidades cuando se renen ciertas condiciones,
sobre todo sustratos carbonados, temperatura, pH, humedad.
Los gneros ms conocidos desde hace ms de 50 aos
son Azotobacter y Clostridium, aerobio el primero y anaerobio el ltimo. Actualmente son muchos los gneros reconocidos como activos en el suelo y en la rizosfera.
181
rizosfera
PO4
SO4
K
-3
CO2
NO3
Mg
aminoazcares
compuestos
inorgnicos
CO2
inmovilizacin
temporaria en
la biomasa
+2
CO2
nutrientes
disponibles
lavado
adsorcin
C/N
1,5
80/1
60/1
40/1
NH4
NO2
-
nitrificacin(NO2 ,NO3 )
inmovilizacin(N-org)
asimilacin(N-org)
adsorcin a coloides
fijacin a coloides
lavado, menos
erosin
volatilizacin
NO3
-
nitratacin(NO3 )
idem
idem
lavado
reduccin(N2)
lavado
idem
-
desnitrificacin (N )
2
idem
idem
lavado
+
idem (NO2 , NH4 )
lavado
idem
-
1,0
20/1
10/1
0,5
0
30
60
90
120 das
220
Lillian Frioni
Aerobios
Azotobacteriaceae
Es una familia curiosamente integrada exclusivamente con
diazotrofos. Ya en 1901, el microbilogo holands Beijerinck describi al Azotobacter chroococcum, luego que
Winogradsky, de la escuela rusa, describiera al anaerobio
Clostridium pasteurianum. Los integrantes de esta familia
se presentan con clulas grandes, predominantemente
bacilos romos u ovales, pero cambian su morfologa con
el tiempo o las condiciones de desarrollo. En la figura 5
(Gonzalez-Lopez, Lluch-Pl, 1992) se aprecian las formas
bacilares y la formacin de estructuras de resistencia,
menos resistentes que las endosporas bacterianas, llamadas cistos.
Las clulas se presentan frecuentemente en pares, son
Gram negativas, aunque pueden aparecer como Gram
variables, aerobios estrictos, pero pueden crecer y fijar N2
bajo presin reducida de O2. Son mviles por flagelos
peritricos o polares, o inmviles. Los gneros son:
201
contiene un complejo lipdico con lipoprotenas y lipopolisacridos, con calcio como principal componente
mineral. La intina posee ms carbohidratos y lpidos,
pero menos protenas, con alto nivel en calcio. Adems de los cambios morfolgicos, en los cistos se acumula cido poli- OH-butrico (PHB). Parte de esta
sustancia se emplea en la sntesis de los componentes del saco del cisto.
Estas estructuras, de muy baja actividad metablica, permiten ventaja ecolgica a los azotobacter en el suelo. En
medio favorable, la germinacin y crecimiento activo ocurren rpidamente.
Otros cambios morfolgicos son la aparicin de clulas
grandes, que recuerdan a levaduras, o de grandes bacilos en A. paspali a las pocas horas de cultivo. La formacin de conglomerados de clulas cocoides, rodeadas de
espeso muclago, que recuerdan a ttradas, son comunes en A. macrocytogenes
-3
PO4 en
solucin
animales
-3
PO4 absorbido
inmovilizacin
solubilizacin
II. Pequeos bacilos, producen mucha viscosidad extracelular y cuerpos lipdicos globulares internos. Desarrollo lento, pueden o no producir catalasa:
fsforo mineral
insoluble
mineralizacin
materia orgnica-microfibra
Otras caractersticas
La formacin de depsitos intracelulares de lpidos (PHB)
es caracterstica del grupo, sobre todo en cultivos viejos.
En Beijerinckia indica se presentan dos glbulos por clula, polares, pudiendo alcanzar en cultivos viejos ms del
50% del volumen celular.
Materiales mucosos extracelulares son tambin caractersticos de ciertas especies, incluyen azcares y cidos
urnicos. Muchas veces su excesiva acumulacin en Bei-
202
Lillian Frioni
Microaeroflicos
Azospirillaceae
Activa
respiracin: remueve el oxgeno de las vecindades de la nitrogenasa. La tasa de respiracin puede incrementarse de 10 a 50 veces y A. chroococcum
consume muchos hidratos de carbono en la fijacin
del N2 (eficiencia baja, de 10-15 mg N2 fijado/g az-
anaerobiosis que se logran en suelos sometidos a hidromorfismo muy reductor, en suelos salinos con alto
nivel en sulfatos y en la rizosfera.
Se aprecia el precipitado negro caracterstico del sulfuro ferroso. El proceso es de consecuencias desfavorables para las plantas pues consume sulfatos, uno de
los principales nutrientes y adems el H2S es txico
para la mayora de las especies. La precipitacin como
SFe elimina esta toxicidad. El suelo se alcaliniza localmente, los sulfuros dan origen a bases que forman carbonatos o bicarbonatos de sodio. En aguas, se favorece la eliminacin de sulfatos, depurando los cauces de
agua.
La figura 3 presenta resultados en suelo no rizosfrico
salino y en la rizosfera de plntulas de maz creciendo
en el mismo suelo (Dommergues, Mangenot, 1970). Se
observa el efecto positivo en la interaccin de un factor biolgico: presencia o ausencia de races y factores fsicos del suelo: saturacin y compactacin. Los
donadores de electrones y las condiciones de anaerobiosis se reunieron en el suelo rizosfrico, naturalmente salino.
suelo no rizosfrico
suelo saturado
suelo rizofrico
saturado y
compactado
saturado
saturado y
compactado
4.2
4.0
4.6
5.7
(0.1)
(0.2)
(0.1)
(10.7)
219
218
Lillian Frioni
inhspita la regin para la vegetacin a causa de la toxicidad del H2S. La rizosfera de muchos cultivos puede favorecer el proceso por la exudacin de materiales carbonados. Estos cultivos no se desarrollan normalmente en
suelos salinos, con alto nivel de sulfatos, anegados y donde
la temperatura es alta, y los pH neutros. El proceso es
retardado por aireacin o el agregado de nitratos, sales
frricas o mangnicas, que permiten elevar el potencial
de xido-reduccin.
La microflora responsable est confinada a dos grupos
de anaerobios estrictos: formadores de esporas del gnero Desulfotomaculum y asporgenas del gnero Desulfovibrio. Son tpicos habitantes de sedimentos anaerobios
con materia orgnica y sulfatos, resultando en una masiva generacin del gas H2S. Esta actividad permite, tambin en anaerobiosis, la actividad de las bacterias fotosintticas sulfurosas (prpuras o verdes) que emplean el H2S
como donador de electrones en la fotosntesis, reoxidndolo en anaerobiosis y a la luz, constituyendo un verdadero ciclo.
Los sulfatorreductores del gnero Desulfovibrio son Gram
negativos, asporgenos, bacilos curvados o vibrioides, con
flagelos polares. No pueden emplear el acetato, que se
acumula como producto final en la oxidacin de sustratos
orgnicos. Emplean malato y lactato, obtenienen energa
por fosforilacin a nivel del sustrato con participacin de
la acetil Co-A. En ausencia de sulfatos, algunos de estos
microorganismos pueden fermentar piruvato, malato o fumarato.
Las especies ms conocidas son D. desulfuricans; D. vulgaris; D. africans y algunos pueden emplear adems de los
donadores de electrones orgnicos, el H2, aunque son incapaces de crecer en medio estrictamente mineral con CO2
y requieren adicin de acetato. La ecuacin general es:
2 CH3CHOH-COOH + SO4=
4 H2 + SO4=
2 CH COOH +
3
2CO2 + S= + 2H2O
4 H2O + S=
Los compuestos menos oxidados que los sulfatos (sulfitos, politionatos, tiosulfatos, S) son reducidos ms fcilmente que los sulfatos, ya sea en la va asimilativa o en la
desasimilativa.
Mecanismo enzimtico
ta longitud de onda empleados para desplazarse en superficies slidas o un flagelo polar, para nadar.
SO4= + ATP
APS + P-P
pirofosforilasa
P-P + H2O
2P
APS reductasa
APS + 2e
AMP + SO
=
3
S3O6=
Otras dos enzimas (tritionato y tiosulfato reductasas) reducen tritionito a S= con produccin de sulfito:
S3O6= + 2eS2O3= + 2e-
S2O3= + SO3=
S= + SO3=
Depsitos de PHB pueden deformar las clulas. Se desarrollan tanto en condiciones aerbicas como anaerbicas
(con aporte de nitratos y una fuente de C orgnico). Son
preferencialmente microaeroflicos en presencia o ausencia de N-combinado en el medio.
No poseen ningn mecanismo de proteccin
de la nitrogenasa frente al oxgeno
El crecimiento es rpido con amonio y O2 y ms lento con
N2 (5-7 horas de tiempo de generacin). Sin N combinado el desarrollo es rpido en medio semislido, formando una densa pelcula debajo de la superficie, donde encuentran la tensin de O2 apropiada. A medida que la demanda de O2 se incrementa la pelcula se desplaza hacia
la superficie. Esta sensibilidad al O2 hizo que por mucho
tiempo no fueran descriptos como activos fijadores.
En medio con malato y extracto de levadura o cloruro de
amonio, desarrollan colonias blancas o rosadas, pequeas y secas, elevadas, circulares o irregulares.
tectar Azospirillum. Las bacterias se ubican en el gradiente de oxgeno creado entre la superficie y el fondo del
tubo en el nivel adecuado para su metabolismo aerobio y
para la proteccin de la nitrogenasa.
Esta bacteria es capaz de crecer y fijar N2 en pH cido y
en presencia de altas concentraciones de azcar: glucosa y sacarosa pero no de gluconato. No posee nitrato reductasa y puede fijar N2 incluso con niveles de 10mM de
nitrato. Aislada de caa de azcar, en Brasil, fue luego
encontrada en otros pases a partir de tallos, hojas, races
y en la savia del xilema de diferentes cultivos (sorgo, batata dulce). Su crecimiento ptimo a pH 5,5 y 10% de azcar, condiciones prevalentes en el caldo de caa, evidencia su adaptacin a la planta. Recuentos de 10 3-105
bacterias.g-1 han sido informados en la rizosfera de caa
de azcar Como no ha sido aislada del suelo, se piensa
en una bacteria endoftica, de gran inters ya que el nitrgeno sera fijado dentro de la planta. Se ha determinado
de que A. diazotrophicus produce cido indol-actico, promotor del crecimiento vegetal y puede excretar amonio,
hasta un 40% del fijado, lo que explicara los altos niveles
de fijacin en caa de azcar.
Acetobacter
203
Acetobacter diazotrophicus una nueva bacteria Gram negativa fijadora de N2 fue aislada en caa de azcar en
medio semislido, sin N combinado, empleado para de-
204
Lillian Frioni
Rhizobios
Bacillus polymyxa, Bacillus macerans y Bacillus pasteurianum son especies muy conocidas entre los diazotrofos. Son bacilos Gram positivos, esporulados,
aerobios, que fijan en microaerofilia, de la familia Bacillaceae, cuyos representantes anaerobios fijadores
pertenecen al gnero Clostridium. Las bacterias propinicas citadas en el cuadro 4, se encuentran en leches fermentadas y han sido descriptas como fijadores de N2 en anaerobiosis.
El cuadro 3 resume algunas de las funciones benficas de este grupo bacteriano y el cuadro 4 seala algunas de las contraindicaciones de la actividad sulfooxidante.
Bacterias anaerobias
Acidificacin
Otros diazotrofos anaerobios son bacterias sulfatorreductoras, que usan sulfatos como aceptores de electrones finales en la respiracin anaerobia. Frecuentemente
se libera cido sulfhdrico (H2S), voltil, de olor desagradable. Los gneros conocidos son Desulfovibrio y Desulfotomaculum. Entre los primeros, varias especies pueden
fijar N2; algunas tienen importancia en el mar, fijando N2
en sedimentos. El segundo gnero posee menos representantes diazotrofos.
Las bacterias productoras de metano son anaerobias
estrictas y son abundantes en ambientes en fermentacin
y en el fondo de estanques. La cepa en la que se detect
fijacin, result ser una poblacin mixta.
Sulfatorreduccin
La reduccin asimilativa de sulfatos es similar a la de
los nitratos y es realizada en la biomasa microbiana.
La reduccin desasimilativa la realizan las bacterias
sulfatorreductoras, que oxidan compuestos orgnicos e
H2 y emplean a los sulfatos como aceptores de electrones en la cadena transportadora anaerobia. Su rol en el
ciclo del azufre es similar al de las bacterias desnitrificantes, con la diferencia que stas son estrictamente anaerobias y aqullas, anaerobias facultativas. Esta actividad
(cuadro 5) es muy evidente en zonas de barros, en el fondo de estanques y lagos y a lo largo de la costa del mar.
Signos de este proceso son:
Clostridium pasteurianum fue el primer diazotrofo descrito por Winogradsky en 1893. Otras especies de este gnero pueden tambin fijar nitrgeno y son habitantes de
suelos, abonos en fermentacin, rumen, compost. Una
pasteurizacin previa de la muestra de suelo y otros materiales (10' a 80C) facilita el aislamiento al eliminar las
formas no esporuladas. No pueden emplear el O2 bajo
ninguna circunstancia.
217
La sulfooxidacin tiene consecuencias nefastas en la corrosin aerobia de diversos materiales, como cemento, piedra y metales por la intervencin de un conjunto
de especies que llevan la oxidacin hasta la formacin
de cido sulfrico. Estos materiales se disuelven literalmente con el consiguiente deterioro en monumentos, edificios, etc. Los sulfuros provienen del suelo o de la polucin atmosfrica.
En ciertas zonas donde la acumulacin de materia orgnica es importante y el nivel de sulfatos en aguas freticas es muy alto, la sulfatorreduccin puede convertir en
216
Lillian Frioni
los
+++
3Fe
En
La aplicacin de inoculantes granulados con azufre elemental y fosfato de roca inoculado con thiobacilos
permiten aportar a las pasturas sulfatos y fosfatos ms
rpidamente en el trpico hmedo que en regiones templadas y ridas. El cido sulfrico formado ayuda en la
solubilizacin de:
), K, Ca, Al,
Mg. Se requiere humedad (lluvias) y es ms efectivo en
suelos cidos. Estos inoculantes son usados cuando
fertilizantes como el superfosfato no estn disponibles
y se cuentan con depsitos de fosfato de roca.
A partir de ndulos
Como no presentan mecanismos de proteccin de la nitrogenasa en vida libre, debe aislarse por siembra de contenido nodular en medios ricos, como el EMA (extracto de
levadura-manitol-agar), con agua, sales, manitol como
fuente de carbono y energa, extracto de levadura, como
fuente de nitrgeno y de factores de crecimiento.
Fuentes de carbono: los rhizobios de crecimiento rpi-
En base a sus propiedades culturales los rhizobios se diferencian en dos grupos, que dieron lugar a dos gneros:
de crecimiento rpido (CR), con tiempo de generacin entre 3 y 4,5 horas, acidifican el medio y liberan
abundante cantidad de polisacridos, gnero Rhizobium
(R.loti, R. leguminosarum)
+ 4H + 6SO
Se presentan en grupos aislados, encerrados en envolturas membranosas originadas por la planta. Para algunos autores estos cambios constituyen otro ejemplo de
ciclo celular, que como el que incluye la formacin de
endosporas bacterianas, originan dentro de un mismo
organismo estructuras con propiedades diferentes a las
de las clulas que las originaron. Un conjunto de cambios conducen en medios de cultivo a las formas vegetativas clsicas.
=
4
Ecologa de la sulfooxidacin
205
Fuentes de factores de crecimiento: muchas especies de rhizobio son estimuladas por factores de crecimiento como biotina, tiamina, riboflavina o pantotenato
de calcio. El requerimiento es variable y algunas especies y cepas se desarrollan mejor sin su agregado. El
206
Lillian Frioni
Minerales: algunos aniones y cationes son tambin requeridos para el desarrollo bacteriano, como K+, Mg++,
PO4-3, SO4=, Cl-, adems de trazas de Co++, Ca++ (relacionado con la estructura de la pared).
plazado por compuestos nitrogenados inorgnicos, aminocidos y cofactores, se emplean para determinar los
requerimientos nutritivos, los productos del catabolismo,
las vas metablicas y la identificacin de mutantes.
A partir de suelo (sin leguminosas) (Anexo prctico)
* sembrar la leguminosa especfica en el suelo en cuestin (campo, maceta, tubos) y esperar la aparicin de
ndulos, para proceder como anteriormente
* inocular muestras del suelo en estudio en suspensin
con agua en tubos y/o macetas con soporte inerte (arena/vermiculita, agar, etc.) con plntulas creciendo aspticamente (semillas desinfectadas previamente). El
medio es para plantas: agua y sales, sin carbono (fotosntesis) ni nitrgeno (fijacin de N2), ambos elementos
son tomados del aire.
215
H2SO4
2. S + 1,5 O2 + 2H
3. S2O3= + O2 + H2O
(kcal/mol)
- 160
H2SO4
- 118
2SO4 = + 2H+
- 211
SO4=
- 60
para el resto predominan las preferencias en la neutralidad o ligeramente alcalino. Salvo el T. denitrificans son
aerobios obligados
1. H2S + 2 02
SO3= +
+
3NAD(P)H +5H
+ 186
SO4= + NAD(P) + H+
+ 34
O = S4O6= S3O6=
tiosulfato tetrationato tritionato
2 3
Fe (SO4)3 + 4 Fe(OH)3
Todos los thiobacilos, con excepcin del T. novellus, emplean CO2 como fuente de carbono y sales amoniacales
como fuente de N, incluso el T. denitrificans que no es
capaz de asimilar nitratos.
SO3=
sulfito
SO4=
sulfato
214
Lillian Frioni
nes crticas son altas y slo excepcionalmente los vegetales se ven perjudicados por la accin microbiana. En ese
caso resulta favorable fertilizar con compuestos con azufre.
Algunos microorganismos, sobre todo los anaerobios, que
no pueden emplear sulfatos, porque no son formados en
ambientes carentes de oxgeno, pueden asimilar formas
orgnicas del azufre, como los aminocidos, protenas.
aumento de temperatura en el rango mesfilo, la liberacin de sulfatos es escasa debajo de 10C y se eleva
con la temperatura hasta 35C
1. Thiobacteriaceae: estas bacterias sulfooxidantes poseen la capacidad de obtener energa y poder reductor
para su biosntesis celular de la oxidacin de compuestos inorgnicos del azufre. La actividad metablica de
las bacterias oxidantes del azufre y del hierro juega importante rol en distintos campos de importancia econmica como son la purificacin de minerales con uranio,
cobre y otros metales, la corrosin de caeras metlicas, en la tecnologa del petrleo, polucin de aguas y
fertilidad de suelos.
En general, se piensa que el azufre se mineraliza al mismo rango que el nitrgeno, es decir entre un 1 al 3% al
ao en suelos de la zona templada
Sulfooxidacin
Numerosos compuestos inorgnicos del azufre con estado de oxidacin menor que el sulfato (+6) pueden ser
oxidados biolgicamente o qumicamente hasta sulfato:
sulfuros (-2); S (O); tiosulfato S2O3= (-2); sulfitos SO3=
(+ 4).
En el suelo son los thiobacilos y los organismos hetertrofos los que desempean un rol cuantitativamente ms
importante, los otros dos grupos son sobre todo acuticos
y las bacterias fotosintticas requieren anaerobiosis y dosis altas de sulfuros.
Adems de la habilidad para producir cido sulfrico, algunos de sus integrantes son capaces de reducir nitratos
y otros xidos del N hasta N2, limitando la provisin de
uno de los ms importantes nutrientes nitrogenados. Mucha atencin han recibido las transformaciones realizadas por miembros del gnero Thiobacillus, pero an restan sin dilucidar mecanismos enzimticos y la naturaleza
de muchos intermediarios en la oxidacin (cuadro 2).
Los thiobacilos son bacterias Gram negativos, no esporulados, algunos mviles por flagelo polar, y deposi-
207
), la propiedad ms
2
importante en una seleccin de cepas para preparar un
inoculante
to con distintas fuentes de carbono, produccin de cidos, resistencias a salinidad, acidez, antibiticos, etc.
anlisis serolgico, estos estudios han sido relativamente poco utilizados para clasificar a los rhizobios debido a la variedad de antgenos que poseen estos organismos.
Especies
Hospedantes
B. japonicum
Glycine max
B. elkanii
Glycine max
Bradhyrhizobium spp. Vigna, Macroptilium
Arachis, Acacia
Rhizobium
R. leguminosarum
biovar viciae
Vicia
biovar trifolii
Trifolium
biovar phaseoli
Phaseolus y
leguminosas templadas
R. lupini
Lupinus
R. galegae
Galega officinalis
R. etli
Phaseolus vulgaris
R. tropici
P. vulgaris y Leucaena
Azorhizobium
A. caulinodans
Sesbania rostrata
(areos)
Sinorhizobium
S. meliloti
Medicago, Melilotus,
Trigonella
S. fredii
Glycine spp., Leucaena
leucocephala
S. saheli
Sesbania cannabina,
S. rostrata
S. terangae
Acacia, Sesbania
Mesorhizobium
M. loti
Lotus, Lupinus
M. huakuii
Astragalus sinicus
M. ciceri
Cicer arietinum
M. hainanensis
Leguminosas de
regiones ridas
M. tianshanense
Leguminosas de
regiones tropicales
Allorhizobium
A. undicola
Neptunia natans
Blastobacter
B. denitrificans
Aeschynomene
indica
Methylobacterium M. nodulans
Crotalaria
Burkholderia
B. sp
Aspalathus
Ralstonia
R. taiwanensis
Mimosa
208
Lillian Frioni
Frankia
El endofito de ndulos tipo Alnus ha sido frecuentemente descrito como simbionte obligado y pocas referencias a ellos se encuentran en los textos clsicos de
microbiologa. Han sido introducidos en la 8 edicin
del Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, pero
no figuran muchos textos sobre actinomicetes. La causa principal de esta omisin ha sido la incapacidad de
cultivarlos in-vitro. Este inconveniente ha sido superado y se han aislado con xito endofitos de Comptonia
peregrina, de Alnus glutinosa, Colletia spinosissima
(Diem et a.l., 1982).
Algunos autores presentaron evidencias para la subdivisin de los endofitos tipo Alnus basadas en las barreras
de inoculacin cruzada entre especies vegetales. Las experiencias se realizaron desde 1978 inoculando con cultivos puros de Frankia y se comprob que un mismo aislamiento poda nodular distintas especies, resultando difcil
la subdivisin en especies basada en la especificidad
endofito-hospedante, como en el caso de los rhizobios.
Otros caracteres que se toman en cuenta para establecer
claves taxonmicas en Frankia incluyen:
isoenzimas
taxonoma gentica
Aislamiento
Se han empleado distintas tcnicas para lograr el aislamiento de Frankia: digestin enzimtica de macerados
de ndulos, microdiseccin, fraccionamiento en gradiente
de sacarosa, diluciones seriadas o aislamiento directo a
partir de trozos de ndulos desinfectados superficialmente. Se han desarrollado numerosos medios de cultivos.
Las plntulas se desarrollan en medio sin nitrgeno en
tubos, al mes se inoculan con macerado nodular y los
ndulos se hacen visibles entre 1 y 2 meses. A partir de
ellos se efecta el aislamiento de Frankia (Anexo prctico).
Morfologa Esta bacteria presenta distintas estructuras
en medios de cultivo (figura 8) y en los ndulos
213
Mineralizacin-inmovilizacin
Los vegetales requieren sulfatos como fuente de azufre,
el que deben reducir a forma sulfhidrilo (-SH) en sus
clulas. La mineralizacin de las formas orgnicas de
este elemento es un importante proceso microbiolgico
que asegura la provisin de sulfatos en la zona radical.
Formas orgnicas como protenas, aminocidos, antibiticos como la penicilina, compuestos hmicos, steres sulfricos, etc. son transformados en compuestos
cada vez ms simples por una micropoblacin muy variada, en condiciones muy amplias de aireacin, temperatura, pH, liberando finalmente compuestos inorgnicos, sulfatos y/o sulfuros.
productos finales estn en parte gobernados por las condiciones del medio:
en aerobiosis el producto final es el sulfato, acompaado de nitratos, CO2, H2O, fosfatos, etc.
Los aminocidos son rpidamente degradados en suelos bien aereados, con liberacin de sulfatos. Los microorganismos hetertrofos pueden tambin liberar sulfatos
de compuestos de estructura R-SH. La cistena desulfhidrasa es responsable de la liberacin de sulfuros a partir
de cistina:
HSCH2CHNH2COOH + H2O
H2S + NH3
CH3COCOOH +
R-OH + SO4= + H+
La mineralizacin de compuestos azufrados y la liberacin de formas minerales, reducidas u oxidadas (mineralizacin neta) depende, como en el caso del nitrgeno, del contenido de S%, de la relacin C/S y a veces de
la N/S.
La relacin crtica C/S debajo de la cual el azufre excede
las necesidades de la microflora y se libera al medio, vara
como en el caso ya considerado del nitrgeno, con los materiales orgnicos que llegan al suelo, pero se puede establecer valores entre 100 a 150/1. En general, las relacio-
212
Lillian Frioni
reduccin
Azufre elemental
SH2
xido-reduccin
volatilizacin, de menor importancia, excepto las prdidas de H2S o anhidrdos de azufre, debido a actividades del hombre.
Su
lfo
ox
ida
ci
n
Su
lfat
orr
edu
cci
n
SO2
atmosfrico
Mineralizacin
Tiosulfato
S2 O 3
Sulfito
SO3=
SO4=
sulfato
oxidacin
FeS
Animales
Sulfuro
de hierro
-2
Vegetales
S-org
mineralizacin-inmovilizacin
+2
+4
+8
S0
S=
Inmovilizacin
Mineralizacin
la sulfhidrizacin, o mineralizacin de compuestos azufrados orgnicos hasta sulfuros o H2S, es muy similar a
la amonificacin
Gentica de Frankia
209
la desnitrificacin, con las mismas consecuencias negativas en la nutricin vegetal pero importante para eliminar a la atmsfera sulfatos en aguas.
El polimorfismo de Frankia dificulta los estudios fisiolgicos y la evaluacin del crecimiento, ya que no produce turbidez uniforme como los microorganismos unicelulares. La
curva de crecimiento se analiza por determinaciones de
biomasa por medio de diferentes tcnicas, como anlisis
del contenido de protenas, determinacin de actividad
deshidrogenasas (TTC, INT), turbidimetra luego de sonicacin de las hifas, actividad N2asa. Para la preparacin
de inoculantes y en estudios fisiolgicos se trabaja con cultivos frescos, repicados varias veces en medios nuevos.
Los estudios han avanzado lentamente por la baja velocidad de crecimiento, la escasa germinacin de las esporas. Mucha de la informacin obtenida se ha logrado con
las tcnicas usadas para los rhizobios y actinomicetes.
Se ha avanzado en la determinacin de los plsmidos y
los genes nod, nif y genes que codifican la asimilacin del
amonio. Una herramienta muy til en el establecimiento
de relaciones filogenticas es el estudio de las secuencias conservadas en los segmentos 16S de los rARN.
Los diazotrofos asociados a los vegetales en relaciones
no simbiticas (rizosfricas, filosfricas) y simbiticas nodulares, son analizados en el captulo 15.
Eficiencia de la fijacin del N2 por diazotrofos
vida libre
asociaciones
rizosfricas
asociaciones
nodulares
Causas:
aportes constantes de nutrientes
concentracin de O2 bajas
exportacin productos de la fijacin (inhiben a la FBN)
210
Lillian Frioni
Bibliografa
Barea, J. M. Cuantificacin de la fijacin biolgica de N
mediante el uso de N 15 . En: Fijacin y movilizacin de nutrientes, vol II, 1991, Olivares y Barea,
coordinadores. CSIC, Coleccin Nuevas Tendencias,
Madrid
Diem, H. G.; D. Gauthier y Y. Dommergues, Isolation of
Frankia from Nodules of Casuarina equisetifolia, 1982,
Can. J. Microb., 28 (5), 526-530.
Dbereiner, J. y F. P. Pedrosa, Nitrogen-fixing Bacteria
in Non-Legumes Cops Plants. 1987, Springer-Berlag,
Berln
Duhoux, E. y Nicole, M. Biologie Vgtale, Associations et interactions chez les plantes, 2003 IRD, Dunod, Pars
Frioni, L. Procesos microbianos. 1999, Fundacin de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina
Frioni, L.; Spinelli, A. y Maggi, A. Nodulacin y fijacin de
nitrgeno en Casuarina y Allocasuarina cultivadas en
el pas. 1991, Bol. Inv. Fac. Agronoma (Montevideo),
N 30: 1-20
Gillis, M, y B. Reinhold-Hurek Taxonomy of Azospirillum, en:
Azospirillum-Plant Associations. 1994 Y.Okon (ed), CRC
Press, Boca Raton, Florida
Gonzalez-Lopez, J. Y Lluch Pl, C. (eds) Interaccin
Planta-Microorganismo, 1992, Biologa del Nitrgeno,
Editorial Rueda, Madrid
Lechevalier, M.P. Taxonomy of the genus Frankia. 1994,
Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 1-8
Martinez, E., D. Romero y J. Caballero-Mellado, Rhizobium phylogenies and bacterial genetic diversity. 1996,
Crit. Rev. Plant Sci. 15(2):113-140
Okon, Y. (ed) Azospirillum-Plant Associations. 1994,
CRS Press, Boca Raton, Florida
Preguntas de repaso
1) Por qu resulta de difcil asimilacin el N contenido
en el N2?
2) Organismos diazotrofos. Cmo pondra en evidencia a estos organismos?
3) Cuales se consideran requisitos indispensables para
que ocurra la FBN?
4) Puede comparar este proceso con la Fijacin Industrial?
5) Si bien los costos de la sntesis qumica de fertilizantes nitrogenados est bajando, explique los motivos
de continuar explotando la FBN.
6) Seale algn mtodo para evidenciar que una pradera natural (leguminosas, gramneas) est fijando N2.
7) Compare y explique las variaciones en la eficiencia de
la FBN en diazotrofos en vida libre, en asociaciones
rizosfricas y en simbiosis nodulares.
8) Compare simbiosis con rhizobio y con frankia.
9) Compare las asociaciones entre diazotrofos fotosintticos y hetertrofos con los vegetales.
10) Cual es el proceso biolgico que contrarresta a la
FBN en la naturaleza?
211
12
10-50
5-20
0-5
2-20
0-50
0-5
desconocidas
210
Lillian Frioni
Bibliografa
Barea, J. M. Cuantificacin de la fijacin biolgica de N
mediante el uso de N 15 . En: Fijacin y movilizacin de nutrientes, vol II, 1991, Olivares y Barea,
coordinadores. CSIC, Coleccin Nuevas Tendencias,
Madrid
Diem, H. G.; D. Gauthier y Y. Dommergues, Isolation of
Frankia from Nodules of Casuarina equisetifolia, 1982,
Can. J. Microb., 28 (5), 526-530.
Dbereiner, J. y F. P. Pedrosa, Nitrogen-fixing Bacteria
in Non-Legumes Cops Plants. 1987, Springer-Berlag,
Berln
Duhoux, E. y Nicole, M. Biologie Vgtale, Associations et interactions chez les plantes, 2003 IRD, Dunod, Pars
Frioni, L. Procesos microbianos. 1999, Fundacin de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina
Frioni, L.; Spinelli, A. y Maggi, A. Nodulacin y fijacin de
nitrgeno en Casuarina y Allocasuarina cultivadas en
el pas. 1991, Bol. Inv. Fac. Agronoma (Montevideo),
N 30: 1-20
Gillis, M, y B. Reinhold-Hurek Taxonomy of Azospirillum, en:
Azospirillum-Plant Associations. 1994 Y.Okon (ed), CRC
Press, Boca Raton, Florida
Gonzalez-Lopez, J. Y Lluch Pl, C. (eds) Interaccin
Planta-Microorganismo, 1992, Biologa del Nitrgeno,
Editorial Rueda, Madrid
Lechevalier, M.P. Taxonomy of the genus Frankia. 1994,
Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 1-8
Martinez, E., D. Romero y J. Caballero-Mellado, Rhizobium phylogenies and bacterial genetic diversity. 1996,
Crit. Rev. Plant Sci. 15(2):113-140
Okon, Y. (ed) Azospirillum-Plant Associations. 1994,
CRS Press, Boca Raton, Florida
Preguntas de repaso
1) Por qu resulta de difcil asimilacin el N contenido
en el N2?
2) Organismos diazotrofos. Cmo pondra en evidencia a estos organismos?
3) Cuales se consideran requisitos indispensables para
que ocurra la FBN?
4) Puede comparar este proceso con la Fijacin Industrial?
5) Si bien los costos de la sntesis qumica de fertilizantes nitrogenados est bajando, explique los motivos
de continuar explotando la FBN.
6) Seale algn mtodo para evidenciar que una pradera natural (leguminosas, gramneas) est fijando N2.
7) Compare y explique las variaciones en la eficiencia de
la FBN en diazotrofos en vida libre, en asociaciones
rizosfricas y en simbiosis nodulares.
8) Compare simbiosis con rhizobio y con frankia.
9) Compare las asociaciones entre diazotrofos fotosintticos y hetertrofos con los vegetales.
10) Cual es el proceso biolgico que contrarresta a la
FBN en la naturaleza?
211
12
10-50
5-20
0-5
2-20
0-50
0-5
desconocidas
212
Lillian Frioni
reduccin
Azufre elemental
SH2
xido-reduccin
volatilizacin, de menor importancia, excepto las prdidas de H2S o anhidrdos de azufre, debido a actividades del hombre.
Su
lfo
ox
ida
ci
n
Su
lfat
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edu
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SO2
atmosfrico
Mineralizacin
Tiosulfato
S2 O 3
Sulfito
SO3=
SO4=
sulfato
oxidacin
FeS
Animales
Sulfuro
de hierro
-2
Vegetales
S-org
mineralizacin-inmovilizacin
+2
+4
+8
S0
S=
Inmovilizacin
Mineralizacin
la sulfhidrizacin, o mineralizacin de compuestos azufrados orgnicos hasta sulfuros o H2S, es muy similar a
la amonificacin
Gentica de Frankia
209
la desnitrificacin, con las mismas consecuencias negativas en la nutricin vegetal pero importante para eliminar a la atmsfera sulfatos en aguas.
El polimorfismo de Frankia dificulta los estudios fisiolgicos y la evaluacin del crecimiento, ya que no produce turbidez uniforme como los microorganismos unicelulares. La
curva de crecimiento se analiza por determinaciones de
biomasa por medio de diferentes tcnicas, como anlisis
del contenido de protenas, determinacin de actividad
deshidrogenasas (TTC, INT), turbidimetra luego de sonicacin de las hifas, actividad N2asa. Para la preparacin
de inoculantes y en estudios fisiolgicos se trabaja con cultivos frescos, repicados varias veces en medios nuevos.
Los estudios han avanzado lentamente por la baja velocidad de crecimiento, la escasa germinacin de las esporas. Mucha de la informacin obtenida se ha logrado con
las tcnicas usadas para los rhizobios y actinomicetes.
Se ha avanzado en la determinacin de los plsmidos y
los genes nod, nif y genes que codifican la asimilacin del
amonio. Una herramienta muy til en el establecimiento
de relaciones filogenticas es el estudio de las secuencias conservadas en los segmentos 16S de los rARN.
Los diazotrofos asociados a los vegetales en relaciones
no simbiticas (rizosfricas, filosfricas) y simbiticas nodulares, son analizados en el captulo 15.
Eficiencia de la fijacin del N2 por diazotrofos
vida libre
asociaciones
rizosfricas
asociaciones
nodulares
Causas:
aportes constantes de nutrientes
concentracin de O2 bajas
exportacin productos de la fijacin (inhiben a la FBN)
208
Lillian Frioni
Frankia
El endofito de ndulos tipo Alnus ha sido frecuentemente descrito como simbionte obligado y pocas referencias a ellos se encuentran en los textos clsicos de
microbiologa. Han sido introducidos en la 8 edicin
del Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, pero
no figuran muchos textos sobre actinomicetes. La causa principal de esta omisin ha sido la incapacidad de
cultivarlos in-vitro. Este inconveniente ha sido superado y se han aislado con xito endofitos de Comptonia
peregrina, de Alnus glutinosa, Colletia spinosissima
(Diem et a.l., 1982).
Algunos autores presentaron evidencias para la subdivisin de los endofitos tipo Alnus basadas en las barreras
de inoculacin cruzada entre especies vegetales. Las experiencias se realizaron desde 1978 inoculando con cultivos puros de Frankia y se comprob que un mismo aislamiento poda nodular distintas especies, resultando difcil
la subdivisin en especies basada en la especificidad
endofito-hospedante, como en el caso de los rhizobios.
Otros caracteres que se toman en cuenta para establecer
claves taxonmicas en Frankia incluyen:
isoenzimas
taxonoma gentica
Aislamiento
Se han empleado distintas tcnicas para lograr el aislamiento de Frankia: digestin enzimtica de macerados
de ndulos, microdiseccin, fraccionamiento en gradiente
de sacarosa, diluciones seriadas o aislamiento directo a
partir de trozos de ndulos desinfectados superficialmente. Se han desarrollado numerosos medios de cultivos.
Las plntulas se desarrollan en medio sin nitrgeno en
tubos, al mes se inoculan con macerado nodular y los
ndulos se hacen visibles entre 1 y 2 meses. A partir de
ellos se efecta el aislamiento de Frankia (Anexo prctico).
Morfologa Esta bacteria presenta distintas estructuras
en medios de cultivo (figura 8) y en los ndulos
213
Mineralizacin-inmovilizacin
Los vegetales requieren sulfatos como fuente de azufre,
el que deben reducir a forma sulfhidrilo (-SH) en sus
clulas. La mineralizacin de las formas orgnicas de
este elemento es un importante proceso microbiolgico
que asegura la provisin de sulfatos en la zona radical.
Formas orgnicas como protenas, aminocidos, antibiticos como la penicilina, compuestos hmicos, steres sulfricos, etc. son transformados en compuestos
cada vez ms simples por una micropoblacin muy variada, en condiciones muy amplias de aireacin, temperatura, pH, liberando finalmente compuestos inorgnicos, sulfatos y/o sulfuros.
productos finales estn en parte gobernados por las condiciones del medio:
en aerobiosis el producto final es el sulfato, acompaado de nitratos, CO2, H2O, fosfatos, etc.
Los aminocidos son rpidamente degradados en suelos bien aereados, con liberacin de sulfatos. Los microorganismos hetertrofos pueden tambin liberar sulfatos
de compuestos de estructura R-SH. La cistena desulfhidrasa es responsable de la liberacin de sulfuros a partir
de cistina:
HSCH2CHNH2COOH + H2O
H2S + NH3
CH3COCOOH +
R-OH + SO4= + H+
La mineralizacin de compuestos azufrados y la liberacin de formas minerales, reducidas u oxidadas (mineralizacin neta) depende, como en el caso del nitrgeno, del contenido de S%, de la relacin C/S y a veces de
la N/S.
La relacin crtica C/S debajo de la cual el azufre excede
las necesidades de la microflora y se libera al medio, vara
como en el caso ya considerado del nitrgeno, con los materiales orgnicos que llegan al suelo, pero se puede establecer valores entre 100 a 150/1. En general, las relacio-
214
Lillian Frioni
nes crticas son altas y slo excepcionalmente los vegetales se ven perjudicados por la accin microbiana. En ese
caso resulta favorable fertilizar con compuestos con azufre.
Algunos microorganismos, sobre todo los anaerobios, que
no pueden emplear sulfatos, porque no son formados en
ambientes carentes de oxgeno, pueden asimilar formas
orgnicas del azufre, como los aminocidos, protenas.
aumento de temperatura en el rango mesfilo, la liberacin de sulfatos es escasa debajo de 10C y se eleva
con la temperatura hasta 35C
1. Thiobacteriaceae: estas bacterias sulfooxidantes poseen la capacidad de obtener energa y poder reductor
para su biosntesis celular de la oxidacin de compuestos inorgnicos del azufre. La actividad metablica de
las bacterias oxidantes del azufre y del hierro juega importante rol en distintos campos de importancia econmica como son la purificacin de minerales con uranio,
cobre y otros metales, la corrosin de caeras metlicas, en la tecnologa del petrleo, polucin de aguas y
fertilidad de suelos.
En general, se piensa que el azufre se mineraliza al mismo rango que el nitrgeno, es decir entre un 1 al 3% al
ao en suelos de la zona templada
Sulfooxidacin
Numerosos compuestos inorgnicos del azufre con estado de oxidacin menor que el sulfato (+6) pueden ser
oxidados biolgicamente o qumicamente hasta sulfato:
sulfuros (-2); S (O); tiosulfato S2O3= (-2); sulfitos SO3=
(+ 4).
En el suelo son los thiobacilos y los organismos hetertrofos los que desempean un rol cuantitativamente ms
importante, los otros dos grupos son sobre todo acuticos
y las bacterias fotosintticas requieren anaerobiosis y dosis altas de sulfuros.
Adems de la habilidad para producir cido sulfrico, algunos de sus integrantes son capaces de reducir nitratos
y otros xidos del N hasta N2, limitando la provisin de
uno de los ms importantes nutrientes nitrogenados. Mucha atencin han recibido las transformaciones realizadas por miembros del gnero Thiobacillus, pero an restan sin dilucidar mecanismos enzimticos y la naturaleza
de muchos intermediarios en la oxidacin (cuadro 2).
Los thiobacilos son bacterias Gram negativos, no esporulados, algunos mviles por flagelo polar, y deposi-
207
), la propiedad ms
2
importante en una seleccin de cepas para preparar un
inoculante
to con distintas fuentes de carbono, produccin de cidos, resistencias a salinidad, acidez, antibiticos, etc.
anlisis serolgico, estos estudios han sido relativamente poco utilizados para clasificar a los rhizobios debido a la variedad de antgenos que poseen estos organismos.
Especies
Hospedantes
B. japonicum
Glycine max
B. elkanii
Glycine max
Bradhyrhizobium spp. Vigna, Macroptilium
Arachis, Acacia
Rhizobium
R. leguminosarum
biovar viciae
Vicia
biovar trifolii
Trifolium
biovar phaseoli
Phaseolus y
leguminosas templadas
R. lupini
Lupinus
R. galegae
Galega officinalis
R. etli
Phaseolus vulgaris
R. tropici
P. vulgaris y Leucaena
Azorhizobium
A. caulinodans
Sesbania rostrata
(areos)
Sinorhizobium
S. meliloti
Medicago, Melilotus,
Trigonella
S. fredii
Glycine spp., Leucaena
leucocephala
S. saheli
Sesbania cannabina,
S. rostrata
S. terangae
Acacia, Sesbania
Mesorhizobium
M. loti
Lotus, Lupinus
M. huakuii
Astragalus sinicus
M. ciceri
Cicer arietinum
M. hainanensis
Leguminosas de
regiones ridas
M. tianshanense
Leguminosas de
regiones tropicales
Allorhizobium
A. undicola
Neptunia natans
Blastobacter
B. denitrificans
Aeschynomene
indica
Methylobacterium M. nodulans
Crotalaria
Burkholderia
B. sp
Aspalathus
Ralstonia
R. taiwanensis
Mimosa
206
Lillian Frioni
Minerales: algunos aniones y cationes son tambin requeridos para el desarrollo bacteriano, como K+, Mg++,
PO4-3, SO4=, Cl-, adems de trazas de Co++, Ca++ (relacionado con la estructura de la pared).
plazado por compuestos nitrogenados inorgnicos, aminocidos y cofactores, se emplean para determinar los
requerimientos nutritivos, los productos del catabolismo,
las vas metablicas y la identificacin de mutantes.
A partir de suelo (sin leguminosas) (Anexo prctico)
* sembrar la leguminosa especfica en el suelo en cuestin (campo, maceta, tubos) y esperar la aparicin de
ndulos, para proceder como anteriormente
* inocular muestras del suelo en estudio en suspensin
con agua en tubos y/o macetas con soporte inerte (arena/vermiculita, agar, etc.) con plntulas creciendo aspticamente (semillas desinfectadas previamente). El
medio es para plantas: agua y sales, sin carbono (fotosntesis) ni nitrgeno (fijacin de N2), ambos elementos
son tomados del aire.
215
H2SO4
2. S + 1,5 O2 + 2H
3. S2O3= + O2 + H2O
(kcal/mol)
- 160
H2SO4
- 118
2SO4 = + 2H+
- 211
SO4=
- 60
para el resto predominan las preferencias en la neutralidad o ligeramente alcalino. Salvo el T. denitrificans son
aerobios obligados
1. H2S + 2 02
SO3= +
+
3NAD(P)H +5H
+ 186
SO4= + NAD(P) + H+
+ 34
O = S4O6= S3O6=
tiosulfato tetrationato tritionato
2 3
Fe (SO4)3 + 4 Fe(OH)3
Todos los thiobacilos, con excepcin del T. novellus, emplean CO2 como fuente de carbono y sales amoniacales
como fuente de N, incluso el T. denitrificans que no es
capaz de asimilar nitratos.
SO3=
sulfito
SO4=
sulfato
216
Lillian Frioni
los
+++
3Fe
En
La aplicacin de inoculantes granulados con azufre elemental y fosfato de roca inoculado con thiobacilos
permiten aportar a las pasturas sulfatos y fosfatos ms
rpidamente en el trpico hmedo que en regiones templadas y ridas. El cido sulfrico formado ayuda en la
solubilizacin de:
), K, Ca, Al,
Mg. Se requiere humedad (lluvias) y es ms efectivo en
suelos cidos. Estos inoculantes son usados cuando
fertilizantes como el superfosfato no estn disponibles
y se cuentan con depsitos de fosfato de roca.
A partir de ndulos
Como no presentan mecanismos de proteccin de la nitrogenasa en vida libre, debe aislarse por siembra de contenido nodular en medios ricos, como el EMA (extracto de
levadura-manitol-agar), con agua, sales, manitol como
fuente de carbono y energa, extracto de levadura, como
fuente de nitrgeno y de factores de crecimiento.
Fuentes de carbono: los rhizobios de crecimiento rpi-
En base a sus propiedades culturales los rhizobios se diferencian en dos grupos, que dieron lugar a dos gneros:
de crecimiento rpido (CR), con tiempo de generacin entre 3 y 4,5 horas, acidifican el medio y liberan
abundante cantidad de polisacridos, gnero Rhizobium
(R.loti, R. leguminosarum)
+ 4H + 6SO
Se presentan en grupos aislados, encerrados en envolturas membranosas originadas por la planta. Para algunos autores estos cambios constituyen otro ejemplo de
ciclo celular, que como el que incluye la formacin de
endosporas bacterianas, originan dentro de un mismo
organismo estructuras con propiedades diferentes a las
de las clulas que las originaron. Un conjunto de cambios conducen en medios de cultivo a las formas vegetativas clsicas.
=
4
Ecologa de la sulfooxidacin
205
Fuentes de factores de crecimiento: muchas especies de rhizobio son estimuladas por factores de crecimiento como biotina, tiamina, riboflavina o pantotenato
de calcio. El requerimiento es variable y algunas especies y cepas se desarrollan mejor sin su agregado. El
204
Lillian Frioni
Rhizobios
Bacillus polymyxa, Bacillus macerans y Bacillus pasteurianum son especies muy conocidas entre los diazotrofos. Son bacilos Gram positivos, esporulados,
aerobios, que fijan en microaerofilia, de la familia Bacillaceae, cuyos representantes anaerobios fijadores
pertenecen al gnero Clostridium. Las bacterias propinicas citadas en el cuadro 4, se encuentran en leches fermentadas y han sido descriptas como fijadores de N2 en anaerobiosis.
El cuadro 3 resume algunas de las funciones benficas de este grupo bacteriano y el cuadro 4 seala algunas de las contraindicaciones de la actividad sulfooxidante.
Bacterias anaerobias
Acidificacin
Otros diazotrofos anaerobios son bacterias sulfatorreductoras, que usan sulfatos como aceptores de electrones finales en la respiracin anaerobia. Frecuentemente
se libera cido sulfhdrico (H2S), voltil, de olor desagradable. Los gneros conocidos son Desulfovibrio y Desulfotomaculum. Entre los primeros, varias especies pueden
fijar N2; algunas tienen importancia en el mar, fijando N2
en sedimentos. El segundo gnero posee menos representantes diazotrofos.
Las bacterias productoras de metano son anaerobias
estrictas y son abundantes en ambientes en fermentacin
y en el fondo de estanques. La cepa en la que se detect
fijacin, result ser una poblacin mixta.
Sulfatorreduccin
La reduccin asimilativa de sulfatos es similar a la de
los nitratos y es realizada en la biomasa microbiana.
La reduccin desasimilativa la realizan las bacterias
sulfatorreductoras, que oxidan compuestos orgnicos e
H2 y emplean a los sulfatos como aceptores de electrones en la cadena transportadora anaerobia. Su rol en el
ciclo del azufre es similar al de las bacterias desnitrificantes, con la diferencia que stas son estrictamente anaerobias y aqullas, anaerobias facultativas. Esta actividad
(cuadro 5) es muy evidente en zonas de barros, en el fondo de estanques y lagos y a lo largo de la costa del mar.
Signos de este proceso son:
Clostridium pasteurianum fue el primer diazotrofo descrito por Winogradsky en 1893. Otras especies de este gnero pueden tambin fijar nitrgeno y son habitantes de
suelos, abonos en fermentacin, rumen, compost. Una
pasteurizacin previa de la muestra de suelo y otros materiales (10' a 80C) facilita el aislamiento al eliminar las
formas no esporuladas. No pueden emplear el O2 bajo
ninguna circunstancia.
217
La sulfooxidacin tiene consecuencias nefastas en la corrosin aerobia de diversos materiales, como cemento, piedra y metales por la intervencin de un conjunto
de especies que llevan la oxidacin hasta la formacin
de cido sulfrico. Estos materiales se disuelven literalmente con el consiguiente deterioro en monumentos, edificios, etc. Los sulfuros provienen del suelo o de la polucin atmosfrica.
En ciertas zonas donde la acumulacin de materia orgnica es importante y el nivel de sulfatos en aguas freticas es muy alto, la sulfatorreduccin puede convertir en
218
Lillian Frioni
inhspita la regin para la vegetacin a causa de la toxicidad del H2S. La rizosfera de muchos cultivos puede favorecer el proceso por la exudacin de materiales carbonados. Estos cultivos no se desarrollan normalmente en
suelos salinos, con alto nivel de sulfatos, anegados y donde
la temperatura es alta, y los pH neutros. El proceso es
retardado por aireacin o el agregado de nitratos, sales
frricas o mangnicas, que permiten elevar el potencial
de xido-reduccin.
La microflora responsable est confinada a dos grupos
de anaerobios estrictos: formadores de esporas del gnero Desulfotomaculum y asporgenas del gnero Desulfovibrio. Son tpicos habitantes de sedimentos anaerobios
con materia orgnica y sulfatos, resultando en una masiva generacin del gas H2S. Esta actividad permite, tambin en anaerobiosis, la actividad de las bacterias fotosintticas sulfurosas (prpuras o verdes) que emplean el H2S
como donador de electrones en la fotosntesis, reoxidndolo en anaerobiosis y a la luz, constituyendo un verdadero ciclo.
Los sulfatorreductores del gnero Desulfovibrio son Gram
negativos, asporgenos, bacilos curvados o vibrioides, con
flagelos polares. No pueden emplear el acetato, que se
acumula como producto final en la oxidacin de sustratos
orgnicos. Emplean malato y lactato, obtenienen energa
por fosforilacin a nivel del sustrato con participacin de
la acetil Co-A. En ausencia de sulfatos, algunos de estos
microorganismos pueden fermentar piruvato, malato o fumarato.
Las especies ms conocidas son D. desulfuricans; D. vulgaris; D. africans y algunos pueden emplear adems de los
donadores de electrones orgnicos, el H2, aunque son incapaces de crecer en medio estrictamente mineral con CO2
y requieren adicin de acetato. La ecuacin general es:
2 CH3CHOH-COOH + SO4=
4 H2 + SO4=
2 CH COOH +
3
2CO2 + S= + 2H2O
4 H2O + S=
Los compuestos menos oxidados que los sulfatos (sulfitos, politionatos, tiosulfatos, S) son reducidos ms fcilmente que los sulfatos, ya sea en la va asimilativa o en la
desasimilativa.
Mecanismo enzimtico
ta longitud de onda empleados para desplazarse en superficies slidas o un flagelo polar, para nadar.
SO4= + ATP
APS + P-P
pirofosforilasa
P-P + H2O
2P
APS reductasa
APS + 2e
AMP + SO
=
3
S3O6=
Otras dos enzimas (tritionato y tiosulfato reductasas) reducen tritionito a S= con produccin de sulfito:
S3O6= + 2eS2O3= + 2e-
S2O3= + SO3=
S= + SO3=
Depsitos de PHB pueden deformar las clulas. Se desarrollan tanto en condiciones aerbicas como anaerbicas
(con aporte de nitratos y una fuente de C orgnico). Son
preferencialmente microaeroflicos en presencia o ausencia de N-combinado en el medio.
No poseen ningn mecanismo de proteccin
de la nitrogenasa frente al oxgeno
El crecimiento es rpido con amonio y O2 y ms lento con
N2 (5-7 horas de tiempo de generacin). Sin N combinado el desarrollo es rpido en medio semislido, formando una densa pelcula debajo de la superficie, donde encuentran la tensin de O2 apropiada. A medida que la demanda de O2 se incrementa la pelcula se desplaza hacia
la superficie. Esta sensibilidad al O2 hizo que por mucho
tiempo no fueran descriptos como activos fijadores.
En medio con malato y extracto de levadura o cloruro de
amonio, desarrollan colonias blancas o rosadas, pequeas y secas, elevadas, circulares o irregulares.
tectar Azospirillum. Las bacterias se ubican en el gradiente de oxgeno creado entre la superficie y el fondo del
tubo en el nivel adecuado para su metabolismo aerobio y
para la proteccin de la nitrogenasa.
Esta bacteria es capaz de crecer y fijar N2 en pH cido y
en presencia de altas concentraciones de azcar: glucosa y sacarosa pero no de gluconato. No posee nitrato reductasa y puede fijar N2 incluso con niveles de 10mM de
nitrato. Aislada de caa de azcar, en Brasil, fue luego
encontrada en otros pases a partir de tallos, hojas, races
y en la savia del xilema de diferentes cultivos (sorgo, batata dulce). Su crecimiento ptimo a pH 5,5 y 10% de azcar, condiciones prevalentes en el caldo de caa, evidencia su adaptacin a la planta. Recuentos de 10 3-105
bacterias.g-1 han sido informados en la rizosfera de caa
de azcar Como no ha sido aislada del suelo, se piensa
en una bacteria endoftica, de gran inters ya que el nitrgeno sera fijado dentro de la planta. Se ha determinado
de que A. diazotrophicus produce cido indol-actico, promotor del crecimiento vegetal y puede excretar amonio,
hasta un 40% del fijado, lo que explicara los altos niveles
de fijacin en caa de azcar.
Acetobacter
203
Acetobacter diazotrophicus una nueva bacteria Gram negativa fijadora de N2 fue aislada en caa de azcar en
medio semislido, sin N combinado, empleado para de-
202
Lillian Frioni
Microaeroflicos
Azospirillaceae
Activa
respiracin: remueve el oxgeno de las vecindades de la nitrogenasa. La tasa de respiracin puede incrementarse de 10 a 50 veces y A. chroococcum
consume muchos hidratos de carbono en la fijacin
del N2 (eficiencia baja, de 10-15 mg N2 fijado/g az-
anaerobiosis que se logran en suelos sometidos a hidromorfismo muy reductor, en suelos salinos con alto
nivel en sulfatos y en la rizosfera.
Se aprecia el precipitado negro caracterstico del sulfuro ferroso. El proceso es de consecuencias desfavorables para las plantas pues consume sulfatos, uno de
los principales nutrientes y adems el H2S es txico
para la mayora de las especies. La precipitacin como
SFe elimina esta toxicidad. El suelo se alcaliniza localmente, los sulfuros dan origen a bases que forman carbonatos o bicarbonatos de sodio. En aguas, se favorece la eliminacin de sulfatos, depurando los cauces de
agua.
La figura 3 presenta resultados en suelo no rizosfrico
salino y en la rizosfera de plntulas de maz creciendo
en el mismo suelo (Dommergues, Mangenot, 1970). Se
observa el efecto positivo en la interaccin de un factor biolgico: presencia o ausencia de races y factores fsicos del suelo: saturacin y compactacin. Los
donadores de electrones y las condiciones de anaerobiosis se reunieron en el suelo rizosfrico, naturalmente salino.
suelo no rizosfrico
suelo saturado
suelo rizofrico
saturado y
compactado
saturado
saturado y
compactado
4.2
4.0
4.6
5.7
(0.1)
(0.2)
(0.1)
(10.7)
219
220
Lillian Frioni
Aerobios
Azotobacteriaceae
Es una familia curiosamente integrada exclusivamente con
diazotrofos. Ya en 1901, el microbilogo holands Beijerinck describi al Azotobacter chroococcum, luego que
Winogradsky, de la escuela rusa, describiera al anaerobio
Clostridium pasteurianum. Los integrantes de esta familia
se presentan con clulas grandes, predominantemente
bacilos romos u ovales, pero cambian su morfologa con
el tiempo o las condiciones de desarrollo. En la figura 5
(Gonzalez-Lopez, Lluch-Pl, 1992) se aprecian las formas
bacilares y la formacin de estructuras de resistencia,
menos resistentes que las endosporas bacterianas, llamadas cistos.
Las clulas se presentan frecuentemente en pares, son
Gram negativas, aunque pueden aparecer como Gram
variables, aerobios estrictos, pero pueden crecer y fijar N2
bajo presin reducida de O2. Son mviles por flagelos
peritricos o polares, o inmviles. Los gneros son:
201
contiene un complejo lipdico con lipoprotenas y lipopolisacridos, con calcio como principal componente
mineral. La intina posee ms carbohidratos y lpidos,
pero menos protenas, con alto nivel en calcio. Adems de los cambios morfolgicos, en los cistos se acumula cido poli- OH-butrico (PHB). Parte de esta
sustancia se emplea en la sntesis de los componentes del saco del cisto.
Estas estructuras, de muy baja actividad metablica, permiten ventaja ecolgica a los azotobacter en el suelo. En
medio favorable, la germinacin y crecimiento activo ocurren rpidamente.
Otros cambios morfolgicos son la aparicin de clulas
grandes, que recuerdan a levaduras, o de grandes bacilos en A. paspali a las pocas horas de cultivo. La formacin de conglomerados de clulas cocoides, rodeadas de
espeso muclago, que recuerdan a ttradas, son comunes en A. macrocytogenes
-3
PO4 en
solucin
animales
-3
PO4 absorbido
inmovilizacin
solubilizacin
II. Pequeos bacilos, producen mucha viscosidad extracelular y cuerpos lipdicos globulares internos. Desarrollo lento, pueden o no producir catalasa:
fsforo mineral
insoluble
mineralizacin
materia orgnica-microfibra
Otras caractersticas
La formacin de depsitos intracelulares de lpidos (PHB)
es caracterstica del grupo, sobre todo en cultivos viejos.
En Beijerinckia indica se presentan dos glbulos por clula, polares, pudiendo alcanzar en cultivos viejos ms del
50% del volumen celular.
Materiales mucosos extracelulares son tambin caractersticos de ciertas especies, incluyen azcares y cidos
urnicos. Muchas veces su excesiva acumulacin en Bei-
240
Lillian Frioni
La filsfera
As como las races estn rodeadas de una verdadera
vaina de microorganismos rizosfricos, las hojas de las
plantas presentan en su superficie poblaciones muchas
veces importantes, de bacterias, levaduras, hongos filamentosos, y, en regiones tropicales hmedas, algas, lquenes y hepticas. Este hbitat est sometido a humedades fluctuantes, ligadas a las precipitaciones. La transpiracin de las hojas puede mantener un microclima algo
ms hmedo que el del aire.
El desarrollo de organismos es muy abundante en las hojas
de las zonas tropicales hmedas, donde forman una pelcula mucilaginosa de varias micras de espesor. La intensidad luminosa, la temperatura y la naturaleza de los exudados varan con el clima y la naturaleza de la planta.
Las poblaciones bacterianas de la filosfera son ricas en
especies pigmentadas: Flavobacterium, Xanthomonas,
Pseudomonas.
Levaduras, como la Rhodotorula, Sporobolomyces, poseen pigmentos rosados y son muy numerosas las especies de hongos. Entre las funciones microbianas ms estimuladas en este hbitat se citan la amonificacin, la fijacin del N2 y la lipolisis. La produccin de antibiticos es
frecuente en las poblaciones epifitas.
Los fenmenos que se desarrollan a nivel de la filosfera
interesan mucho al fitopatlogo y al agrnomo, quienes
tienen una puerta abierta a experiencias de inoculacin
con fijadores de N2 o con microorganismos antagnicos
de patgenos que protegen a la planta de las infecciones.
hemos analizado, por el aporte al suelo de residuos vegetales subterrneos (races) o areos (hojas, ramas) o de
productos diversos arrastrados por el agua a travs del
follaje. Estos ltimos aportes contienen elementos minerales (K, Na, etc.) y orgnicos: hidratos de carbono, aminocidos.
Resulta difcil separar el efecto rizosfrico del efecto de
los restos sobre el suelo, puede observarse que, en el
caso de bosques, los mantillos juegan un rol preponderante. Esta capa constituye para la microflora del suelo la
principal fuente de:
energa y de elementos nutritivos que en kg C/ha/
ao varan de 0,5 a 2 toneladas en bosques de zonas
templadas y fras, para alcanzar 2 a 8 toneladas en bosques tropicales hmedos. Los mantillos en zona tropical
son ms ricos, adems, en elementos minerales y en nitrgeno que los de las regiones templadas.
de sustancias estimulantes o inhibidoras: como vitaminas y sustancias diversas an no bien determinadas, que llegan al suelo. Inversamente, ciertos mantillos
liberan productos txicos frente a especies bacterianas
muy sensibles: bacterias nitrificantes auttrofas, fijadores del N2, y otros organismos, como los celulolticos. La
toxicidad frente a los nitrificantes se manifiesta en formaciones forestales de la zona tropical hmeda o regiones templadas (bosques de pino silvestre, cedro, conferas). Lo mismo puede ocurrir en ciertas praderas y
bosques de conferas, de la zona templada. Las sustancias responsables seran esencialmente fenoles o compuestos con radicales fenlicos: cido glico, floroglucinol.
otros efectos: modificacin del pH del suelo: la vegetacin puede elevar el pH de los horizontes superficiales, por concentracin de sustancias bsicas. Pero ms
frecuentemente, la vegetacin acidifica el suelo, caso de
bosques de conferas. Si sta no es excesiva, la microflora fngica, que en conjunto es indiferente al pH, puede
indirectamente ser estimulada, por reduccin de la competencia de otros organismos. Si se bajan una o dos unidades de pH, se puede observar efecto depresivo en la
actividad biolgica, ms marcado si se acompaa de sustancias txicas hidrosolubles
las orgnicas. Escasos estudios se han realizado con compuestos individuales fosforados y se cuenta con pocos
detalles sobre la descripcin de la microflora involucrada.
Numerosas evidencias indican importante rol del P orgnico (P-org) en la nutricin vegetal, se ha observado que
esta fraccin es la que disminuye en mayor proporcin,
por procesos de mineralizacin.
-H+
221
H3PO4
+ H+
-H+
H2PO4-
HPO4-2
+ H+
+ H+
solubilizacin-precipitacin
P no lbil
muy lento
mineralizacin-inmovilizacin
Pi lbil
PO4-3
muy rpido
-H+
Mineralizacin-inmovilizacin
Un grupo amplio de microorganismos posee las enzimas
necesarias (fosfatasas) para liberar fosfatos de molcu-
O
ROH
+ HOPOH
OH
Fitasas: hidrolizan la unin ster-fosfato de sales solubles de cido ftico o de sus sales de Mg o Ca: la fitina,
222
Lillian Frioni
Nucleasas: estn ampliamente distribuidas y la liberacin de ortofosfato es rpida en el suelo a partir tanto
de ARN como de ADN. Para muchos microorganismos
hetertrofos los cidos nuclecos pueden ser empleados como nica fuente de nutrientes y de energa y la
liberacin de Pi ocurre luego de la accin de enzimas
despolimerizantes.
Fosfolipasas: los fosfolpidos ms comunes en el suelo como la lecitina (fosfatidil colina) y la fosfatidiletanolamina, liberan Pi luego de hidrlisis enzimtica, la
poblacin emplea el esqueleto orgnico de la molcula
y el P necesario, el que excede la demanda microbiolgica, es liberado.
Procesos de xido-reduccin
Poca atencin se ha prestado a los procesos de xidoreduccin llevados a cabo por la microflora del suelo en
compuestos fosforados. Este elemento, como en nitrgeno, puede encontrarse en combinaciones desde fosfina
(P-3) a ortofosfato (P+5). Algunos microorganismos hetertrofos pueden asimilar fosfita (HPO3-2) y oxidarlo a fosfato.
En suelos hmedos, Clostridium butyricum puede reducir
fosfato a fosfita e hipofosfita. Estas reacciones son biolgicas ya que no ocurren al agregar inhibidores al suelo.
como el tolueno.
En presencia de nitrato o sulfato la reduccin de fosfato
es ms lenta ya que los primeros iones son empleados de
preferencia como aceptores de electrones. Como estas
reacciones no son importantes en la naturaleza, no han
recibido mayor atencin y son muy pocas las referencias
bibliogrficas.
239
Solubilizacin
Una proporcin importante de fosfatos solubles agregados a suelos cidos puede insolubilizarse o fijarse a coloides (adsorcin). Muchos suelos contienen minerales,
como la fluorapatita (Ca10 (PO4)6F2) o hidroxiapatita que
Suelo y ambiente: el efecto rizosfrico es ms pronunciado en suelos livianos, arenosos. En suelos desrticos,
la rizosfera de la escasa vegetacin colonizadora consti-
Estado fenolgico
R/S
Trbol
vegetativo (4 hojas)
vegetativo (6-8 hojas)
floracin
5,2
6,1
5,6
5,3
8,1
318,0
1,0
1,3
56,8
Trigo
germinacin
vegetativo
grano en formacin
5,2
6,1
5,6
6,8
50,3
52,0
1,3
8,2
9,3
Colza
vegetativo (6 hojas)
floracin
fructificacin
5,2
6,1
5,6
14,5
310,5
491,0
2,8
50,9
87,7
La incorporacin de restos vegetales o animales, la fertilizacin, causan menos efectos en la rizsfera, la que manifiesta capacidad para mantener su equilibrio biolgico.
La espermatsfera
Las semillas en germinacin no realizan fotosntesis pero
ejercen efecto en el suelo vecino al movilizar sus reservas. Se considera que la espermatsfera es el origen de
iniciacin del efecto rizosfrico de las races en desarrollo. A su nivel ocurren mltiples interacciones entre la planta, las poblaciones microbianas y el ambiente. Los productos liberados por |os granos son de naturaleza variable, segn la edad, la especie y las caractersticas del
medio (fuentes de C, N, sustancias biolgicamente activas, como vitaminas, aminocidos, otras inhibidoras). La
liberacin de exudados por las semillas es responsable
de la alta mortalidad de las mismas a causa de la sulfatorreduccin, cuando cultivos, como el de maz, germinan
en suelos ricos en sulfatos, compactados y saturados en
agua. Otras actividades biolgicas son estimuladas, como
la solubilizacin de fosfatos, amonificacin, celulolisis, y
ciertas actividades enzimticas.
238
Lillian Frioni
Algas
Este grupo ha sido poco estudiado, ya que por su carcter auttrofo no es afectado directamente por los exudados radicales. Sin embargo, numerosos trabajos sealan
estimulacin de algunas rizosferas sobre las algas; fenmeno que se ha tratado de explicar por la liberacin de
factores de crecimiento, el contenido de antibiticos en la
rizosfera o por cambios en las propiedades fsicas del
medio.
Las interacciones entre microorganismos tanto sinrgicas como antagnicas son muy afectadas a nivel de este
ambiente particular, ya que las poblaciones en altas densidades se afectan intensamente compitiendo por los nutrientes, el espacio.
C
D
N de microorganismos
F
G
Interior de la raz
Lmite
Tejido radical
tipo F: microorganismos tpicos del suelo, excluidos fsicamente de los ambientes sobre o cerca de las races, pero resistentes a productos o actividades de los
organismos rizosfricos (antibiticos, quelantes del hierro, etc.)
tipo G: microorganismos generales del suelo excluidos de la rizosfera por actividades o productos de los
otros tipos.
tipo B: crece en el rizoplano y su densidad cae a niveles basales a muy corta distancia de la superficie radi-
Los efectos sobre la poblacin del suelo varan con la especie o la variedad del vegetal. Si las lneas de una especie varan en un solo gen, sus caractersticas rizosfricas
pueden cambiar. La edad de la planta, su estado sanitario
y vigor, el tipo y posicin de la raz, y por supuesto, el tipo
de suelo y el ambiente afectan al efecto rizosfrico.
223
Fsforo
en los
tejidos
suelo +S
suelo con SO4(NH4)2
suelo solo
12 tiempo (das)
224
Lillian Frioni
Como ms de dos tercios del P total de los suelos es orgnico, con picos mximos en turbas, suelos forestales
no cultivados y suelos tropicales, un ciclo muy activo ocurre que posibilita el reciclaje de formas orgnicas e inorgnicas (mineralizacin-inmovilizacin). La mineralizacin est asegurada por una micropoblacin poco especfica que emplea al P en sus necesidades plsticas y
libera el exceso como ortofosfato.
frecuentemente en forma no disponible para los vegetales como (Fe+++) y los ejemplos de carencias son frecuentes. La figura 6 presenta las transformaciones de origen
biolgico que ocurren entre los compuestos con hierro.
animales
anaerobios (fermentacin de pajas) y difunden a la rizosfera. Sus efectos dependen de la longitud de la raz
expuesta al txico. Por otro lado la acidez protegera a
la planta de microorganismos perjudiciales. Los cidos
aromticos son ms txicos
vegetales
reduccin
Fe+++
Fe++
oxidacin
m
materia orgnica
microflora
mineralizacin
inmovilizacin
oxidacin
reduccin
(el Fe+++ precipita como hidrxido)
237
solubilizacin
precipitacin
Antibiticos: numerosas molculas con carcter biosttico y biocida son liberados por bacterias, actinomicetes, hongos (patulina, gliovirina,etc). Algunos microorganismos como Pseudomonas fluorescens, Trichoderma viride se emplean a nivel experimental como promotores del crecimiento vegetal y en el control biolgico de microorganismos fitopatgenos. (captulo 17)
Aglutininas y agentes de agregacin del suelo: las
lectinas son glicoprotenas que actan como receptores reconociendo sitios de adhesin en la superficie de
la pared de races y de bacterias (rhizobios, azospirilos). Los microorganismos liberan sustancias como gomas, exopolisacridos, capas mucosas, polmeros que
contribuyen a formar agregados entre partculas minerales y el humus.
Enzimas: ms de 50 enzimas han sido detectadas en
la rizosfera: hidrolasas, pectinasas, ADNasas, oxidorreductasas, que regulan los procesos biolgicos en este
habitat
Hongos
Las tcnicas de recuento muestran en general un efecto
rizosfrico positivo sobre este grupo (cuadro 7), aunque
menos marcado que para las bacterias. Muchos autores
sostienen que si el efecto se expresa en funcin de la
biomasa de ambos grupos y no en funcin del nmero de
individuos, los resultados se invertiran. En los ltimos aos
se ha brindado gran atencin a los hongos que colonizan
la superficie de las races.
La colonizacin inicial sera realizada por una variedad de especies fngicas, habitantes del suelo, que a
los pocos das sera desplazada por una micoflora ms
especfica, formas tpicas de la superficie de las races, que persisten hasta la senescencia. Para la deteccin de estos hongos es necesario lavar las races
vigorosamente, para eliminar las formas esporgenas,
dominantes.
Bacterias
Numerosas revisiones ilustran sobre efectos rizosfricos
positivos. En general se admite, que son las bacterias no
esporuladas, Gram negativas, las ms favorecidas. La
predominancia de especies de Pseudomonas en la rizosfera se explica por su alta tasa de crecimiento, latencia
reducida, por la aptitud a producir sustancias inhibidoras
en el curso del metabolismo de hidratos de carbono y por
la sntesis de pigmentos flurorescentes, frecuentemente
inhibidores de otras especies.
Las formas filamentosas ramificadas son muy abundantes en la superficie de las races, como Corynebacterium,
Mycobacterium.
Rizosfrico
120
12
49
24
500
1,3
x
x
x
x
x
x
107
105
106
102
106
108
No rizosfrico
5,3
1
7
10
4
1
x
x
x
x
x
x
107
105
106
102
106
108
R/S
24/1
12/1
7/1
2,4/1
125/1
1.260/1
236
Lillian Frioni
Cuadro 5- Rizodeposicin
Exudados (solubles en agua): azcares, aminocidos,
cidos orgnicos, hormonas, vitaminas
Secreciones
HdeC, enzimas
Lisados
autolisis de clulas de paredes vegetales,
de races, fauna, microorganismos
Gases
C2H2, CO2, H2
27% del total de la fotosntesis
Medidas en hidroponia:
700m3/ha/ao en trigo
300m3/ha/ao en cebada
1.250m3/ha/ao en maz
En estudios en hidroponia de cultivos estriles se ha calculado la cantidad de materiales liberados por las races,
los que extrapolados a campo dan valores muy altos. Estas cifras pueden representar un peso de entre 7,3 y 12,5
toneladas mtricas de materia orgnica, excediendo a los
mejores rendimientos en grano. Para algunos autores
pueden representar un 27% de la masa total de la planta
(cuadro 5). En el suelo, su biodegradacin y la adsorcin
a los coloides, disminuyen la produccin neta.
La figura 4 resume los conceptos sobre las transferencias
del carbono y su utilizacin en la rizosfera. El CO2 asimilado es llevado de la parte area a las races para la sntesis de nuevas estructuras y puede tambin ser liberado
como exudados: solubles, que difunden, o bien no difusibles, que permanecen en el mucigel. La degradacin de
estos compuestos ms resistentes explicara un segundo
pico en la liberacin del CO2. Un posible tercer pico en el
flujo de CO2 sera resultante de la degradacin de restos
de clulas y tejidos y de la penetracin de microorganismos en clulas corticales.
CO2
CO2
microorganismo
exudados libres
races
mucigel
tiempo
compuestos simples
microorganismos
CO2
descamacin
tejidos
tiempo microorganismos
CO2
4 Fe+++ + 2 H2O
Muchas cepas pueden emplear en lugar de sales ferrosas, compuestos de azufre reducidos: S, S= o S2O3=. La
oxidacin del hierro es realizada por sistema transporta-
2Fe
(OH)3 + 3 H2SO4
compuestos simples
225
Reduccin
En suelos mal drenados o sometidos a perodos de anaerobiosis el hierro al estado ferroso se hace predominante.
El proceso de reduccin del ion frrico a ferroso es casi
exclusivamente biolgico, ya que no se detectan mayores
cambios en suelos estriles o con agregados de inhibidores metablicos. La figura 7 muestra lo que ocurre en
ambientes sometidos a anegamiento: el potencial de xido-reduccin (Eh) desciende provocando la reduccin rpida del hierro y del manganeso. La materia orgnica estimula el proceso, comparable desde el punto de vista
metablico con la desnitrificacin y la sulfatorreduccin,
es decir respiraciones anaerobias con sustratos orgnicos. En medios cidos no se requieren potenciales redox
tan bajos para solubilizar el hierro.
Otro mecanismo biolgico indirecto est relacionado a la
liberacin de sustancias orgnicas de carcter reductor
por parte de los microorganismos del suelo: cidos orgnicos, aldehidos, que provocaran ligera reduccin del hierro. El consumo de O2 por microorganismos aerobios, provoca descenso del potencial redox del suelo y reduccin
del hierro.
226
Lillian Frioni
Fe++
Mg++
Eh(v)
(mg/100g) (mg/100g)
200
20
0.4
100
0.2
10
El lquido toma las coloraciones tpicas del hierro al estado reducido y la velocidad de desaparicin del azcar y la
aparicin de Fe++ tienen la forma sigmoide tpica del crecimiento bacteriano.
Mn
Eh
Fe
y relacin R/S (densidades en suelo rizosfrico/ densidades en suelo sin efecto radical)
10
20
++
30
das
++
FeS
Otra consecuencia del proceso es la aparicin en suelos hidromrficos de horizontes de reduccin, o gley, de
coloracin gris verdosa o azulada, debida fundamentalmente al hierro ferroso. Puede precipitar sulfuro ferroso, de color negro. La presencia de donadores de electrones orgnicos es necesaria en la reduccin. Este fenmeno puede reproducirse en una columna de suelo
enriquecida con un azcar en anaerobiosis parcial o completa (columna de Winogradsky) (captulo 3).
235
colonizacin
empleo
Origen y naturaleza de
los materiales orgnicos
Se reconocen varias categoras de compuestos orgnicos en la vecindad de las races (figura 3 y cuadro 5). Es
necesario establecer si la sustancia en cuestin es producida por el microorganismo en cultivo puro y se encuentra a concentracin fisiolgicamente activa en la rizosfera.
1. Exudados: compuestos de bajo peso molecular en
general solubles en agua que liberan las clulas hacia
espacios intercelulares y luego al suelo. Su liberacin no
est mediatizada por un metabolismo. Son azcares,
aminocidos, cidos orgnicos, hormonas, vitaminas. La
exudacin radical se puso de manifiesto luego de aplicaciones foliares de sustancias con elementos radioactivos
(P32, 14CO2, N15, etc.)
2. Secreciones, compuestos de bajo o alto peso molecular liberados como resultado de procesos metablicos
mediados por el aparato de Golgi (hidratos de carbono
polimerizados, enzimas)
Raz
Suelo
Tipo de material
2mm
m.o. miclagos
vegetales y
microbianos
micigel (4)
exudados y secreciones (1-2)
muclago secretado por
clulas epidrmicas
decamacin de clulas
pice de la raz
muclago (hidrolizado de
polisacrido de clulas
epidrmicas
234
Lillian Frioni
colonizacin de la raz (microscopa de luz, fluorescente, electrnica) muy til para conocer la distribucin
de los microorganismos y su grado de colonizacin. El
microscopio ptico permiti mostrar que slo entre un
5 a 10% de la superficie de la raz est cubierta de microorganismos, hecho que desmiente la creencia muy
extendida de que las races estaban cubiertas por un
espeso manto microbiano. Esta idea se sustent en los
altos recuentos, al expresarlos por gramo de raz.
La microscopa fluorescente, con anticuerpos marcados con sustancias que fluorescen en luz ultravioleta, permite determinar la colonizacin de distintas porciones de
la raz por cepas de inters agrcola, como los rhizobios, y
brindan invalorable informacin sobre la distribucin de
bacterias en el sistema radical.
El microscopio electrnico de transmisin y de barrido
permiti grandes avances en el conocimiento de la distribucin espacial de los componentes de la interfase sueloraz, la forma de agrupacin de las poblaciones, la pre-
(C- biomasa/
C-orgnico
total) %
maz
sorgo
mijo
perla
mijo suelo
comn solo
6,19a
5,99
5,35ab
5,64a
4,52b
empleo de elementos radioactivos, C,N,S, etc. permiten un estudio ms detallado de procesos microbianos en este ambiente
Bibliografa
Dommergues, Y. , Mangenot, F. Ecologie microbienne
du sol. 1970, Masson, Pars.
Fenchel, T., King, G. M. & T. H. Blackburn, Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral
Cycling, 1998, Academic Press
Frioni, L. Procesos microbianos. 1999, Fundacin de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina
Stevenson, F. J. & M. A. Cole Cycles of Soils: carbon,
227
Preguntas de repaso
1) Cmo se relaciona la quimiosntesis con las transformaciones del azufre?
2) Discuta cmo la oxidacin de compuestos reducidos
del azufre pueden permitir incrementar la productividad primaria en el fondo de efluentes termales
3) Cmo se explican los depsitos negros alrededor de
races en suelos salinos anegados?
4) Analice similitudes y diferencias entre los ciclos del S
y del N
5) En qu tipos de suelos puede encontrar bacterias
sulfatorreductoras activas?
6) Si un rastrojo con relaciones: C/N/P de 500/20/1 se
agrega al suelo, dominar la mineralizacin o la inmovilizacin del P? Por qu?
7) Puede un microorganismo facilitar la solubilizacin de
compuestos con Fe y P simultneamente?
228
Lillian Frioni
Conceptos generales
Desde comienzos del siglo pasado se reconoci que la
zona del suelo vecina a las races induca, en general,
una mayor actividad de los microorganismos y se introdujo el trmino rizosfera, para definir a esta regin. Desde
entonces, son numerosos los estudios sobre las actividades microbianas en esta zona, que se define como el volumen de interaccin entre el sistema radical de los
vegetales y su inmediato medio suelo. Su validez en
trminos de gradientes microbiolgico y qumico ha sido
demostrada por varios autores, con un mximo de efecto
en la zona de contacto con las races, hasta distancias
variables que podran llegar a algunos milmetros. Luego
el efecto es despreciable. El cuadro 2 muestra la importancia de la masa radical y los aportes en forma de exudados, lisados, secreciones, que resultan importantes insumos para los microorganismos.
La microflora es afectada por los exudados radicales y
por los aportes de restos de tejidos y clulas.
Los microorganismos estimulados actan sobre la planta,
poniendo a su disposicin molculas orgnicas que son
absorbidas por las races, como aminocidos, vitaminas,
antibiticos, fitohormonas y contribuyen a su nutricin mineral por los procesos de mineralizacin y solubilizacin,
de ciertos elementos.
Las interacciones biolgicas son muy intensas en esta
regin y los fenmenos de sinergismo o de antagonismo
son exaltados.
La rizosfera, en sentido amplio, se define como la fina
capa de suelo que se adhiere firmemente a las races,
pero que se puede separar por lavado y agitacin moderada en agua. Se puede dividir en rizosfera prxima
y alejada, segn el tiempo y la intensidad de agitacin.
Es la zona del suelo con influencia de las races, con mximo efecto desde la superficie de la raz hasta 1-3 mm
(pudiendo llegar a 5 mm). Constituye un microecosistema muy especializado que propicia el crecimiento de una
poblacin microbiana diversificada.
El rizoplano lo constituye el suelo en contacto ntimo con
la superficie de las races y se extrae por agitacin vigoro-
233
Mtodos de estudio
Las investigaciones en esta regin no son sencillas, es
necesario trabajar con plantas vivas, en medios artificiales: soluciones hidropnicas, cultivos sobre agar, vermiculita u otros soportes, o en el suelo mismo, en macetas en invernculo o en el campo. Los datos obtenidos son puntuales y brindan informacin sobre las relaciones microflora-vegetal en un momento dado. Las
condiciones en este hbitat son muy dinmicas y los
productos liberados por |os vegetales son simultneamente biodegradados o adsorbidos fuertemente a los
coloides del suelo.
Por este motivo, los estudios sobre exudacin se realizan
en medios estriles y el nivel de produccin no pueden
extrapolarse a condiciones naturales y adems los datos
son puntuales: las sustancias son producidas y biodegradadas en forma simultnea.
232
Lillian Frioni
Deletreos: que pueden afectar negativamente el crecimiento vegetal, sin necesariamente parasitar al tejido (alteraciones en el aporte de agua, iones y sustancias promotoras del crecimiento vegetal, cambiando las funciones y/o limitando el crecimiento de races).
Benficos: existe creciente evidencia de que la microflora saprofita de la rizosfera incluye componentes benficos que pueden incrementar el crecimiento vegetal y los
rendimientos significativamente por:
Los microorganismos
y sus interacciones
13 La rizosfera ................................................................................... 231
Benficos
Fijacin N2
Biocontrol
Estabilizacin
suelo
Antibiosis
Toma de
agua
Simbiosis
Flujo
nutrientes
Enfermedad
os
ov
ari
ab
les
Per
Ne
utr
jud
Fitotoxicidad
Liberacin
enzimas
icia
les
Competencia
Adhesin
Alelopata
Figura 2- Efectos neutros, benficos, perjudiciales y variables de la comunidad microbiana rizosfrica sobre le crecimiento vegetal
229
230
Lillian Frioni
13
231
La rizosfera
espermatosfera (zona del suelo afectada por los exudados y descamaciones de las semillas) (E)
El cuadro 1 resume los efectos recprocos entre vegetales y microorganismos y el cuadro 2 seala la importancia de las sustancias liberadas por los vegetales al
suelo.
M
R
Indirectos
modificacin del medio qumico por los procesos
de mineralizacin-inmovilizacin, precipitacin
solubilizacin, oxido-reduccin de materiales
orgnicos o minerales, el ambiente fsico alterando la estructura, el rgimen hdrico, el pH,
la composicin de la atmsfera del suelo y el
ambiente biolgico, estimulando las interacciones microbianas a ese nivel
230
Lillian Frioni
13
231
La rizosfera
espermatosfera (zona del suelo afectada por los exudados y descamaciones de las semillas) (E)
El cuadro 1 resume los efectos recprocos entre vegetales y microorganismos y el cuadro 2 seala la importancia de las sustancias liberadas por los vegetales al
suelo.
M
R
Indirectos
modificacin del medio qumico por los procesos
de mineralizacin-inmovilizacin, precipitacin
solubilizacin, oxido-reduccin de materiales
orgnicos o minerales, el ambiente fsico alterando la estructura, el rgimen hdrico, el pH,
la composicin de la atmsfera del suelo y el
ambiente biolgico, estimulando las interacciones microbianas a ese nivel
232
Lillian Frioni
Deletreos: que pueden afectar negativamente el crecimiento vegetal, sin necesariamente parasitar al tejido (alteraciones en el aporte de agua, iones y sustancias promotoras del crecimiento vegetal, cambiando las funciones y/o limitando el crecimiento de races).
Benficos: existe creciente evidencia de que la microflora saprofita de la rizosfera incluye componentes benficos que pueden incrementar el crecimiento vegetal y los
rendimientos significativamente por:
Los microorganismos
y sus interacciones
13 La rizosfera ................................................................................... 231
Benficos
Fijacin N2
Biocontrol
Estabilizacin
suelo
Antibiosis
Toma de
agua
Simbiosis
Flujo
nutrientes
Enfermedad
os
ov
ari
ab
les
Per
Ne
utr
jud
Fitotoxicidad
Liberacin
enzimas
icia
les
Competencia
Adhesin
Alelopata
Figura 2- Efectos neutros, benficos, perjudiciales y variables de la comunidad microbiana rizosfrica sobre le crecimiento vegetal
229
228
Lillian Frioni
Conceptos generales
Desde comienzos del siglo pasado se reconoci que la
zona del suelo vecina a las races induca, en general,
una mayor actividad de los microorganismos y se introdujo el trmino rizosfera, para definir a esta regin. Desde
entonces, son numerosos los estudios sobre las actividades microbianas en esta zona, que se define como el volumen de interaccin entre el sistema radical de los
vegetales y su inmediato medio suelo. Su validez en
trminos de gradientes microbiolgico y qumico ha sido
demostrada por varios autores, con un mximo de efecto
en la zona de contacto con las races, hasta distancias
variables que podran llegar a algunos milmetros. Luego
el efecto es despreciable. El cuadro 2 muestra la importancia de la masa radical y los aportes en forma de exudados, lisados, secreciones, que resultan importantes insumos para los microorganismos.
La microflora es afectada por los exudados radicales y
por los aportes de restos de tejidos y clulas.
Los microorganismos estimulados actan sobre la planta,
poniendo a su disposicin molculas orgnicas que son
absorbidas por las races, como aminocidos, vitaminas,
antibiticos, fitohormonas y contribuyen a su nutricin mineral por los procesos de mineralizacin y solubilizacin,
de ciertos elementos.
Las interacciones biolgicas son muy intensas en esta
regin y los fenmenos de sinergismo o de antagonismo
son exaltados.
La rizosfera, en sentido amplio, se define como la fina
capa de suelo que se adhiere firmemente a las races,
pero que se puede separar por lavado y agitacin moderada en agua. Se puede dividir en rizosfera prxima
y alejada, segn el tiempo y la intensidad de agitacin.
Es la zona del suelo con influencia de las races, con mximo efecto desde la superficie de la raz hasta 1-3 mm
(pudiendo llegar a 5 mm). Constituye un microecosistema muy especializado que propicia el crecimiento de una
poblacin microbiana diversificada.
El rizoplano lo constituye el suelo en contacto ntimo con
la superficie de las races y se extrae por agitacin vigoro-
233
Mtodos de estudio
Las investigaciones en esta regin no son sencillas, es
necesario trabajar con plantas vivas, en medios artificiales: soluciones hidropnicas, cultivos sobre agar, vermiculita u otros soportes, o en el suelo mismo, en macetas en invernculo o en el campo. Los datos obtenidos son puntuales y brindan informacin sobre las relaciones microflora-vegetal en un momento dado. Las
condiciones en este hbitat son muy dinmicas y los
productos liberados por |os vegetales son simultneamente biodegradados o adsorbidos fuertemente a los
coloides del suelo.
Por este motivo, los estudios sobre exudacin se realizan
en medios estriles y el nivel de produccin no pueden
extrapolarse a condiciones naturales y adems los datos
son puntuales: las sustancias son producidas y biodegradadas en forma simultnea.
234
Lillian Frioni
colonizacin de la raz (microscopa de luz, fluorescente, electrnica) muy til para conocer la distribucin
de los microorganismos y su grado de colonizacin. El
microscopio ptico permiti mostrar que slo entre un
5 a 10% de la superficie de la raz est cubierta de microorganismos, hecho que desmiente la creencia muy
extendida de que las races estaban cubiertas por un
espeso manto microbiano. Esta idea se sustent en los
altos recuentos, al expresarlos por gramo de raz.
La microscopa fluorescente, con anticuerpos marcados con sustancias que fluorescen en luz ultravioleta, permite determinar la colonizacin de distintas porciones de
la raz por cepas de inters agrcola, como los rhizobios, y
brindan invalorable informacin sobre la distribucin de
bacterias en el sistema radical.
El microscopio electrnico de transmisin y de barrido
permiti grandes avances en el conocimiento de la distribucin espacial de los componentes de la interfase sueloraz, la forma de agrupacin de las poblaciones, la pre-
(C- biomasa/
C-orgnico
total) %
maz
sorgo
mijo
perla
mijo suelo
comn solo
6,19a
5,99
5,35ab
5,64a
4,52b
empleo de elementos radioactivos, C,N,S, etc. permiten un estudio ms detallado de procesos microbianos en este ambiente
Bibliografa
Dommergues, Y. , Mangenot, F. Ecologie microbienne
du sol. 1970, Masson, Pars.
Fenchel, T., King, G. M. & T. H. Blackburn, Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral
Cycling, 1998, Academic Press
Frioni, L. Procesos microbianos. 1999, Fundacin de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina
Stevenson, F. J. & M. A. Cole Cycles of Soils: carbon,
227
Preguntas de repaso
1) Cmo se relaciona la quimiosntesis con las transformaciones del azufre?
2) Discuta cmo la oxidacin de compuestos reducidos
del azufre pueden permitir incrementar la productividad primaria en el fondo de efluentes termales
3) Cmo se explican los depsitos negros alrededor de
races en suelos salinos anegados?
4) Analice similitudes y diferencias entre los ciclos del S
y del N
5) En qu tipos de suelos puede encontrar bacterias
sulfatorreductoras activas?
6) Si un rastrojo con relaciones: C/N/P de 500/20/1 se
agrega al suelo, dominar la mineralizacin o la inmovilizacin del P? Por qu?
7) Puede un microorganismo facilitar la solubilizacin de
compuestos con Fe y P simultneamente?
226
Lillian Frioni
Fe++
Mg++
Eh(v)
(mg/100g) (mg/100g)
200
20
0.4
100
0.2
10
El lquido toma las coloraciones tpicas del hierro al estado reducido y la velocidad de desaparicin del azcar y la
aparicin de Fe++ tienen la forma sigmoide tpica del crecimiento bacteriano.
Mn
Eh
Fe
y relacin R/S (densidades en suelo rizosfrico/ densidades en suelo sin efecto radical)
10
20
++
30
das
++
FeS
Otra consecuencia del proceso es la aparicin en suelos hidromrficos de horizontes de reduccin, o gley, de
coloracin gris verdosa o azulada, debida fundamentalmente al hierro ferroso. Puede precipitar sulfuro ferroso, de color negro. La presencia de donadores de electrones orgnicos es necesaria en la reduccin. Este fenmeno puede reproducirse en una columna de suelo
enriquecida con un azcar en anaerobiosis parcial o completa (columna de Winogradsky) (captulo 3).
235
colonizacin
empleo
Origen y naturaleza de
los materiales orgnicos
Se reconocen varias categoras de compuestos orgnicos en la vecindad de las races (figura 3 y cuadro 5). Es
necesario establecer si la sustancia en cuestin es producida por el microorganismo en cultivo puro y se encuentra a concentracin fisiolgicamente activa en la rizosfera.
1. Exudados: compuestos de bajo peso molecular en
general solubles en agua que liberan las clulas hacia
espacios intercelulares y luego al suelo. Su liberacin no
est mediatizada por un metabolismo. Son azcares,
aminocidos, cidos orgnicos, hormonas, vitaminas. La
exudacin radical se puso de manifiesto luego de aplicaciones foliares de sustancias con elementos radioactivos
(P32, 14CO2, N15, etc.)
2. Secreciones, compuestos de bajo o alto peso molecular liberados como resultado de procesos metablicos
mediados por el aparato de Golgi (hidratos de carbono
polimerizados, enzimas)
Raz
Suelo
Tipo de material
2mm
m.o. miclagos
vegetales y
microbianos
micigel (4)
exudados y secreciones (1-2)
muclago secretado por
clulas epidrmicas
decamacin de clulas
pice de la raz
muclago (hidrolizado de
polisacrido de clulas
epidrmicas
236
Lillian Frioni
Cuadro 5- Rizodeposicin
Exudados (solubles en agua): azcares, aminocidos,
cidos orgnicos, hormonas, vitaminas
Secreciones
HdeC, enzimas
Lisados
autolisis de clulas de paredes vegetales,
de races, fauna, microorganismos
Gases
C2H2, CO2, H2
27% del total de la fotosntesis
Medidas en hidroponia:
700m3/ha/ao en trigo
300m3/ha/ao en cebada
1.250m3/ha/ao en maz
En estudios en hidroponia de cultivos estriles se ha calculado la cantidad de materiales liberados por las races,
los que extrapolados a campo dan valores muy altos. Estas cifras pueden representar un peso de entre 7,3 y 12,5
toneladas mtricas de materia orgnica, excediendo a los
mejores rendimientos en grano. Para algunos autores
pueden representar un 27% de la masa total de la planta
(cuadro 5). En el suelo, su biodegradacin y la adsorcin
a los coloides, disminuyen la produccin neta.
La figura 4 resume los conceptos sobre las transferencias
del carbono y su utilizacin en la rizosfera. El CO2 asimilado es llevado de la parte area a las races para la sntesis de nuevas estructuras y puede tambin ser liberado
como exudados: solubles, que difunden, o bien no difusibles, que permanecen en el mucigel. La degradacin de
estos compuestos ms resistentes explicara un segundo
pico en la liberacin del CO2. Un posible tercer pico en el
flujo de CO2 sera resultante de la degradacin de restos
de clulas y tejidos y de la penetracin de microorganismos en clulas corticales.
CO2
CO2
microorganismo
exudados libres
races
mucigel
tiempo
compuestos simples
microorganismos
CO2
descamacin
tejidos
tiempo microorganismos
CO2
4 Fe+++ + 2 H2O
Muchas cepas pueden emplear en lugar de sales ferrosas, compuestos de azufre reducidos: S, S= o S2O3=. La
oxidacin del hierro es realizada por sistema transporta-
2Fe
(OH)3 + 3 H2SO4
compuestos simples
225
Reduccin
En suelos mal drenados o sometidos a perodos de anaerobiosis el hierro al estado ferroso se hace predominante.
El proceso de reduccin del ion frrico a ferroso es casi
exclusivamente biolgico, ya que no se detectan mayores
cambios en suelos estriles o con agregados de inhibidores metablicos. La figura 7 muestra lo que ocurre en
ambientes sometidos a anegamiento: el potencial de xido-reduccin (Eh) desciende provocando la reduccin rpida del hierro y del manganeso. La materia orgnica estimula el proceso, comparable desde el punto de vista
metablico con la desnitrificacin y la sulfatorreduccin,
es decir respiraciones anaerobias con sustratos orgnicos. En medios cidos no se requieren potenciales redox
tan bajos para solubilizar el hierro.
Otro mecanismo biolgico indirecto est relacionado a la
liberacin de sustancias orgnicas de carcter reductor
por parte de los microorganismos del suelo: cidos orgnicos, aldehidos, que provocaran ligera reduccin del hierro. El consumo de O2 por microorganismos aerobios, provoca descenso del potencial redox del suelo y reduccin
del hierro.
224
Lillian Frioni
Como ms de dos tercios del P total de los suelos es orgnico, con picos mximos en turbas, suelos forestales
no cultivados y suelos tropicales, un ciclo muy activo ocurre que posibilita el reciclaje de formas orgnicas e inorgnicas (mineralizacin-inmovilizacin). La mineralizacin est asegurada por una micropoblacin poco especfica que emplea al P en sus necesidades plsticas y
libera el exceso como ortofosfato.
frecuentemente en forma no disponible para los vegetales como (Fe+++) y los ejemplos de carencias son frecuentes. La figura 6 presenta las transformaciones de origen
biolgico que ocurren entre los compuestos con hierro.
animales
anaerobios (fermentacin de pajas) y difunden a la rizosfera. Sus efectos dependen de la longitud de la raz
expuesta al txico. Por otro lado la acidez protegera a
la planta de microorganismos perjudiciales. Los cidos
aromticos son ms txicos
vegetales
reduccin
Fe+++
Fe++
oxidacin
m
materia orgnica
microflora
mineralizacin
inmovilizacin
oxidacin
reduccin
(el Fe+++ precipita como hidrxido)
237
solubilizacin
precipitacin
Antibiticos: numerosas molculas con carcter biosttico y biocida son liberados por bacterias, actinomicetes, hongos (patulina, gliovirina,etc). Algunos microorganismos como Pseudomonas fluorescens, Trichoderma viride se emplean a nivel experimental como promotores del crecimiento vegetal y en el control biolgico de microorganismos fitopatgenos. (captulo 17)
Aglutininas y agentes de agregacin del suelo: las
lectinas son glicoprotenas que actan como receptores reconociendo sitios de adhesin en la superficie de
la pared de races y de bacterias (rhizobios, azospirilos). Los microorganismos liberan sustancias como gomas, exopolisacridos, capas mucosas, polmeros que
contribuyen a formar agregados entre partculas minerales y el humus.
Enzimas: ms de 50 enzimas han sido detectadas en
la rizosfera: hidrolasas, pectinasas, ADNasas, oxidorreductasas, que regulan los procesos biolgicos en este
habitat
Hongos
Las tcnicas de recuento muestran en general un efecto
rizosfrico positivo sobre este grupo (cuadro 7), aunque
menos marcado que para las bacterias. Muchos autores
sostienen que si el efecto se expresa en funcin de la
biomasa de ambos grupos y no en funcin del nmero de
individuos, los resultados se invertiran. En los ltimos aos
se ha brindado gran atencin a los hongos que colonizan
la superficie de las races.
La colonizacin inicial sera realizada por una variedad de especies fngicas, habitantes del suelo, que a
los pocos das sera desplazada por una micoflora ms
especfica, formas tpicas de la superficie de las races, que persisten hasta la senescencia. Para la deteccin de estos hongos es necesario lavar las races
vigorosamente, para eliminar las formas esporgenas,
dominantes.
Bacterias
Numerosas revisiones ilustran sobre efectos rizosfricos
positivos. En general se admite, que son las bacterias no
esporuladas, Gram negativas, las ms favorecidas. La
predominancia de especies de Pseudomonas en la rizosfera se explica por su alta tasa de crecimiento, latencia
reducida, por la aptitud a producir sustancias inhibidoras
en el curso del metabolismo de hidratos de carbono y por
la sntesis de pigmentos flurorescentes, frecuentemente
inhibidores de otras especies.
Las formas filamentosas ramificadas son muy abundantes en la superficie de las races, como Corynebacterium,
Mycobacterium.
Rizosfrico
120
12
49
24
500
1,3
x
x
x
x
x
x
107
105
106
102
106
108
No rizosfrico
5,3
1
7
10
4
1
x
x
x
x
x
x
107
105
106
102
106
108
R/S
24/1
12/1
7/1
2,4/1
125/1
1.260/1
238
Lillian Frioni
Algas
Este grupo ha sido poco estudiado, ya que por su carcter auttrofo no es afectado directamente por los exudados radicales. Sin embargo, numerosos trabajos sealan
estimulacin de algunas rizosferas sobre las algas; fenmeno que se ha tratado de explicar por la liberacin de
factores de crecimiento, el contenido de antibiticos en la
rizosfera o por cambios en las propiedades fsicas del
medio.
Las interacciones entre microorganismos tanto sinrgicas como antagnicas son muy afectadas a nivel de este
ambiente particular, ya que las poblaciones en altas densidades se afectan intensamente compitiendo por los nutrientes, el espacio.
C
D
N de microorganismos
F
G
Interior de la raz
Lmite
Tejido radical
tipo F: microorganismos tpicos del suelo, excluidos fsicamente de los ambientes sobre o cerca de las races, pero resistentes a productos o actividades de los
organismos rizosfricos (antibiticos, quelantes del hierro, etc.)
tipo G: microorganismos generales del suelo excluidos de la rizosfera por actividades o productos de los
otros tipos.
tipo B: crece en el rizoplano y su densidad cae a niveles basales a muy corta distancia de la superficie radi-
Los efectos sobre la poblacin del suelo varan con la especie o la variedad del vegetal. Si las lneas de una especie varan en un solo gen, sus caractersticas rizosfricas
pueden cambiar. La edad de la planta, su estado sanitario
y vigor, el tipo y posicin de la raz, y por supuesto, el tipo
de suelo y el ambiente afectan al efecto rizosfrico.
223
Fsforo
en los
tejidos
suelo +S
suelo con SO4(NH4)2
suelo solo
12 tiempo (das)
222
Lillian Frioni
Nucleasas: estn ampliamente distribuidas y la liberacin de ortofosfato es rpida en el suelo a partir tanto
de ARN como de ADN. Para muchos microorganismos
hetertrofos los cidos nuclecos pueden ser empleados como nica fuente de nutrientes y de energa y la
liberacin de Pi ocurre luego de la accin de enzimas
despolimerizantes.
Fosfolipasas: los fosfolpidos ms comunes en el suelo como la lecitina (fosfatidil colina) y la fosfatidiletanolamina, liberan Pi luego de hidrlisis enzimtica, la
poblacin emplea el esqueleto orgnico de la molcula
y el P necesario, el que excede la demanda microbiolgica, es liberado.
Procesos de xido-reduccin
Poca atencin se ha prestado a los procesos de xidoreduccin llevados a cabo por la microflora del suelo en
compuestos fosforados. Este elemento, como en nitrgeno, puede encontrarse en combinaciones desde fosfina
(P-3) a ortofosfato (P+5). Algunos microorganismos hetertrofos pueden asimilar fosfita (HPO3-2) y oxidarlo a fosfato.
En suelos hmedos, Clostridium butyricum puede reducir
fosfato a fosfita e hipofosfita. Estas reacciones son biolgicas ya que no ocurren al agregar inhibidores al suelo.
como el tolueno.
En presencia de nitrato o sulfato la reduccin de fosfato
es ms lenta ya que los primeros iones son empleados de
preferencia como aceptores de electrones. Como estas
reacciones no son importantes en la naturaleza, no han
recibido mayor atencin y son muy pocas las referencias
bibliogrficas.
239
Solubilizacin
Una proporcin importante de fosfatos solubles agregados a suelos cidos puede insolubilizarse o fijarse a coloides (adsorcin). Muchos suelos contienen minerales,
como la fluorapatita (Ca10 (PO4)6F2) o hidroxiapatita que
Suelo y ambiente: el efecto rizosfrico es ms pronunciado en suelos livianos, arenosos. En suelos desrticos,
la rizosfera de la escasa vegetacin colonizadora consti-
Estado fenolgico
R/S
Trbol
vegetativo (4 hojas)
vegetativo (6-8 hojas)
floracin
5,2
6,1
5,6
5,3
8,1
318,0
1,0
1,3
56,8
Trigo
germinacin
vegetativo
grano en formacin
5,2
6,1
5,6
6,8
50,3
52,0
1,3
8,2
9,3
Colza
vegetativo (6 hojas)
floracin
fructificacin
5,2
6,1
5,6
14,5
310,5
491,0
2,8
50,9
87,7
La incorporacin de restos vegetales o animales, la fertilizacin, causan menos efectos en la rizsfera, la que manifiesta capacidad para mantener su equilibrio biolgico.
La espermatsfera
Las semillas en germinacin no realizan fotosntesis pero
ejercen efecto en el suelo vecino al movilizar sus reservas. Se considera que la espermatsfera es el origen de
iniciacin del efecto rizosfrico de las races en desarrollo. A su nivel ocurren mltiples interacciones entre la planta, las poblaciones microbianas y el ambiente. Los productos liberados por |os granos son de naturaleza variable, segn la edad, la especie y las caractersticas del
medio (fuentes de C, N, sustancias biolgicamente activas, como vitaminas, aminocidos, otras inhibidoras). La
liberacin de exudados por las semillas es responsable
de la alta mortalidad de las mismas a causa de la sulfatorreduccin, cuando cultivos, como el de maz, germinan
en suelos ricos en sulfatos, compactados y saturados en
agua. Otras actividades biolgicas son estimuladas, como
la solubilizacin de fosfatos, amonificacin, celulolisis, y
ciertas actividades enzimticas.
240
Lillian Frioni
La filsfera
As como las races estn rodeadas de una verdadera
vaina de microorganismos rizosfricos, las hojas de las
plantas presentan en su superficie poblaciones muchas
veces importantes, de bacterias, levaduras, hongos filamentosos, y, en regiones tropicales hmedas, algas, lquenes y hepticas. Este hbitat est sometido a humedades fluctuantes, ligadas a las precipitaciones. La transpiracin de las hojas puede mantener un microclima algo
ms hmedo que el del aire.
El desarrollo de organismos es muy abundante en las hojas
de las zonas tropicales hmedas, donde forman una pelcula mucilaginosa de varias micras de espesor. La intensidad luminosa, la temperatura y la naturaleza de los exudados varan con el clima y la naturaleza de la planta.
Las poblaciones bacterianas de la filosfera son ricas en
especies pigmentadas: Flavobacterium, Xanthomonas,
Pseudomonas.
Levaduras, como la Rhodotorula, Sporobolomyces, poseen pigmentos rosados y son muy numerosas las especies de hongos. Entre las funciones microbianas ms estimuladas en este hbitat se citan la amonificacin, la fijacin del N2 y la lipolisis. La produccin de antibiticos es
frecuente en las poblaciones epifitas.
Los fenmenos que se desarrollan a nivel de la filosfera
interesan mucho al fitopatlogo y al agrnomo, quienes
tienen una puerta abierta a experiencias de inoculacin
con fijadores de N2 o con microorganismos antagnicos
de patgenos que protegen a la planta de las infecciones.
hemos analizado, por el aporte al suelo de residuos vegetales subterrneos (races) o areos (hojas, ramas) o de
productos diversos arrastrados por el agua a travs del
follaje. Estos ltimos aportes contienen elementos minerales (K, Na, etc.) y orgnicos: hidratos de carbono, aminocidos.
Resulta difcil separar el efecto rizosfrico del efecto de
los restos sobre el suelo, puede observarse que, en el
caso de bosques, los mantillos juegan un rol preponderante. Esta capa constituye para la microflora del suelo la
principal fuente de:
energa y de elementos nutritivos que en kg C/ha/
ao varan de 0,5 a 2 toneladas en bosques de zonas
templadas y fras, para alcanzar 2 a 8 toneladas en bosques tropicales hmedos. Los mantillos en zona tropical
son ms ricos, adems, en elementos minerales y en nitrgeno que los de las regiones templadas.
de sustancias estimulantes o inhibidoras: como vitaminas y sustancias diversas an no bien determinadas, que llegan al suelo. Inversamente, ciertos mantillos
liberan productos txicos frente a especies bacterianas
muy sensibles: bacterias nitrificantes auttrofas, fijadores del N2, y otros organismos, como los celulolticos. La
toxicidad frente a los nitrificantes se manifiesta en formaciones forestales de la zona tropical hmeda o regiones templadas (bosques de pino silvestre, cedro, conferas). Lo mismo puede ocurrir en ciertas praderas y
bosques de conferas, de la zona templada. Las sustancias responsables seran esencialmente fenoles o compuestos con radicales fenlicos: cido glico, floroglucinol.
otros efectos: modificacin del pH del suelo: la vegetacin puede elevar el pH de los horizontes superficiales, por concentracin de sustancias bsicas. Pero ms
frecuentemente, la vegetacin acidifica el suelo, caso de
bosques de conferas. Si sta no es excesiva, la microflora fngica, que en conjunto es indiferente al pH, puede
indirectamente ser estimulada, por reduccin de la competencia de otros organismos. Si se bajan una o dos unidades de pH, se puede observar efecto depresivo en la
actividad biolgica, ms marcado si se acompaa de sustancias txicas hidrosolubles
las orgnicas. Escasos estudios se han realizado con compuestos individuales fosforados y se cuenta con pocos
detalles sobre la descripcin de la microflora involucrada.
Numerosas evidencias indican importante rol del P orgnico (P-org) en la nutricin vegetal, se ha observado que
esta fraccin es la que disminuye en mayor proporcin,
por procesos de mineralizacin.
-H+
221
H3PO4
+ H+
-H+
H2PO4-
HPO4-2
+ H+
+ H+
solubilizacin-precipitacin
P no lbil
muy lento
mineralizacin-inmovilizacin
Pi lbil
PO4-3
muy rpido
-H+
Mineralizacin-inmovilizacin
Un grupo amplio de microorganismos posee las enzimas
necesarias (fosfatasas) para liberar fosfatos de molcu-
O
ROH
+ HOPOH
OH
Fitasas: hidrolizan la unin ster-fosfato de sales solubles de cido ftico o de sus sales de Mg o Ca: la fitina,
260
Lillian Frioni
Las leguminosas
Las plantas de la familia de las Leguminosas o Leguminoseae (cuadro 3) son muy numerosas (entre 16.000 y 19.000
especies). Tambin se la designa como Fabaceae o Fabales. De origen tropical arborescente cuyos ms recientes
derivados son pequeas matas o hierbas de las regiones
templadas. Representan la tercera familia de plantas de flor,
superadas por las Compositae y las Orchidacea. Desde su
origen en el Cretceo superior, en condiciones tropicales hmedas, fueron extendindose a otras condiciones climticas.
Grupo muy diversificado en el plano taxonmico con 3
sub-familias: Caesalpinoideae, Mimosoideae y Papilionoideae. No todas las especies estn noduladas: cerca del
20% de las Papilionoideae (unas 3.400 especies) se han
analizado por su aptitud para nodular.
En las Mimosoideae y Papilionoideae, el 90 y 97%, respectivamente, poseen especies noduladas, mientras que
en Caesalpinioideae slo el 23% de los gneros examinados evidenciaron habilidad para nodular.
Los siguientes son los gneros que poseen el mayor nmero de especies noduladas: en Mimosoideae, Acacia
(217); en Papilionoideae, Indigofera (194), Crotalaria
(145),Trifolium (141), Astragalus (102), Tephrosia (95),
Desmodium (76), Vicia (65) y Aspalathus (60); en Caesalpinioideae, Cassia (99).
N gneros
+
Mimosoideae
Caesalpinoideae
Papilionoideae
Total
66
177
505
748
18
13
241
272
N gneros analizados
N especies
+/total
+
8
13
14
35
5
39
14
58
Las prcticas de inoculacin con numerosos microorganismos que han logrado instalarse y actuar en la rizsfera, espermatsfera y en la superficie de las hojas, como
los fijadores de nitrgeno libres y simbiticos, bacterias y
hongos controladores de plagas vegetales, solubilizadores de fsforo, hongos micorrcicos, etc. demuestran que
es posible dirigir esta colonizacin con xito.
Bibliografa
Una de las principales caractersticas que evidencian el carcter evolutivo de la leguminosas se relaciona con las modificaciones en su forma y tamao: desde rboles tropicales
muy altos, pasando por arbustos , a trepadoras leosas, hier-
31
65
169
365
2900
2800
14000
19700
351
72
2316
2839
N especies analizadas
+/total
6
6
37
180
46
263
388
258
2462
3108
Bazin, M. J., P. Markham y E. M. Scott Population dynamics and rhizosphere interactions, en the rhizosphere. 1990, J. M. Lynch (ed), Wiley Interscience, New York:
99-127
Dommergues, Y. y F. Mangenot, La rhizosphre, en: Ecologie microbinne du sol, 1970, Dommergues, Mangenot (eds.), Masson et Cie., Pars: 549-594.
Frioni, L. Ecologa microbiana del suelo, 1990, Depto.
de Publicaciones de la Universidad de la Repblica,
241
Preguntas de repaso
1) Seale dos ejemplos de efectos: i) benficos y ii) perjudiciales, de los microorganismos sobre las plantas y
cmo los pondra en evidencia
2) Idem, pero efectos de los vegetales sobre los microorganismos
3) Por qu es la rizosfera una regin del suelo con actividad microbiana incrementada?
4) Por qu resulta la espermatsfera otra importante rea
de estudio?
5) Rol de las distintas sustancias orgnicas liberadas en
la rizosfera.
6) Cmo podemos distinguir la rizosfera, el rizoplano y
la superficie de las races?
7) Mediante cuales mecanismos las poblaciones microbianas pueden tener carcter benfico, neutro o perjudicial?
8) Qu factores afectan la colonizacin radical?
9) Seale dos tcnicas para evaluar el efecto del cultivo
de cierta variedad de tomate sobre los microorganismos del suelo.
242
Lillian Frioni
Las clulas en simbiosis presentan tambin ms bajo contenido de grnulos de cianoficina que representan reservas de nitrgeno con cido asprtico y arginina en relacin 1/1 molar. Los grnulos de polifosfatos son abundantes en simbiosis. Las ficobiliprotenas constituyen
reservas de nitrgeno, adems de actuar como pigmentos accesorios en el fotosistema II.
La luz es necesaria para la fijacin. Los lquenes toleran
condiciones extremas: en regiones de Suecia y Noruega,
la fijacin ocurre a OC y los organismos sobreviven a
heladas prolongadas y a la sequedad, aunque no fijan N2
hasta que se rehumedecen. Constituyen la vegetacin
principal de ambientes extremos como piedras, zonas arenosas, facilitando luego la colonizacin por otros microorganismos. La cianobacteria posee escasa actividad de
glutamino sintetasa, bloqueando parcialmente la ruta
primaria de asimilacin de NH3, que es liberado y transferido al hongo.
259
leguminosas se han incrementado rpidamente. Boussingault puso en evidencia en 1838 la capacidad de las leguminosas en emplear el N2 atmosfrico, pero, solamente
50 aos ms tarde, Hellriegel y Wilfarth demostraron de
manera indiscutible que slo las leguminosas noduladas
pueden hacerlo y que el lugar de fijacin eran los ndulos. Luego de estas clsicas experiencias se pudo comprobar fehacientemente que el lugar de fijacin son los
ndulos y que los microorganismos se encuentran en el
suelo o deben inocularse.
se compara el tenor de nitrgeno en leguminosas noduladas con el de las no noduladas cultivadas en ausencia de nitrgeno combinado
258
Lillian Frioni
La produccin de sustancias promotoras del crecimiento vegetal parece ser el principal mecanismo. La colonizacin bacteriana ocurre principalmente en la mayora
de las especies vegetales estudiadas en la zona de elongacin de las races
La inoculacin con Azospirillum afecta la concentracin de cido 3-indol actico y 3-indol butrico libres, as
como las velocidades especficas de respiracin y actividades de enzimas del ciclo de los cidos tricarboxlicos y de la gliclisis en races de maz y otras plantas.
Esto contribuye a que las races tomen ms agua y nutrientes minerales que favorecen un mayor crecimiento
de las plantas inoculadas
El efecto de la inoculacin parece evidenciarse principalmente en los estados tempranos del desarrollo vegetal, durante las primeras semanas luego de una correcta colonizacin de las races
La evaluacin de datos acumulados en los ltimos 20
aos indica que la inoculacin a campo Azospirillum,
puede incrementar el crecimiento de importantes cultivos (Okon y Labandera, 1994).
243
b)
condicin
suelo mal
drenado
suelo drenado
agua
continuo
c/sequa
continuo
c/sequa
rendimiento
testigo
45
inoculado
60
testigo
30
inoculado
38
% de incremento
33
26
Efecto
Interaccin
0
+
-
neutralismo
sinergismo
antagonismo
A pesar de la estrecha proximidad en que puedan encontrarse dos o ms especies que coexisten en el espacio o
en el tiempo, pueden no afectarse mutuamente. El neutralismo es evidente in vitro cuando las velocidades de
crecimiento y las densidades finales de dos poblaciones
son semejantes. La demostracin del neutralismo in vivo
es ms difcil. Es probable que ocurra cuando las densidades de las poblaciones son bajas, el aporte de nutrientes abundante y son satisfechos los requerimientos para
el desarrollo de las poblaciones, de modo que no interacten para los nutrientes, el espacio, etctera, pero cuando el ambiente comienza a modificarse por la actividad
biolgica o cuando el aporte de nutrientes comienza a disminuir, las especies comienzan a interactuar.
Se distinguen tres tipos de asociaciones sinrgicas, a
pesar de que las lneas de demarcacin no son siempre
ntidas y estn muy afectadas por el ambiente:
protocooperacin, simbiosis nutricional, o mutualismo, en donde el beneficio es mutuo, sin llegar a presentar carcter obligatorio
benefician en situaciones en que ninguno de ellos podra realizar una funcin vital o sobrevivir
Las interacciones antagnicas presentan un carcter
perjudicial para una parte de la poblacin e incluyen la:
competencia por los nutrientes (C, N, S, P, etc.), el espacio, luz, O2, CO2
244
Lillian Frioni
predacin, que implica el ataque directo de una especie sobre otra, con la muerte de la presa
sustrato A
Algunos ejemplos implican una estrecha unin fsica entre ellos, en otros casos no se requiere proximidad entre
los individuos. Ejemplos de esta asociacin:
degradacin de polmeros como celulosa, almidn, quitina, sustancias pcticas, lignina, pesticidas: intervienen
primero poblaciones especializadas que permiten el desarrollo posterior de otras que emplean molculas ms
simples (cadena alimenticia).
org. b
vitamina
org b (comensal)
Modificacin de un sustrato: una poblacin convierte un sustrato no disponible para otra poblacin en un
producto que puede ser asimilado y usado como nutriente:
productos finales
Comensalismo
Constituye una interaccin muy comn en la naturaleza,
en donde los procesos de degradacin de molculas complejas son realizados por lo general por poblaciones mixtas (cadenas alimenticias), cada una de las cuales ofrece
a las otras un sustrato ms simple. El organismo que recibe el beneficio se denomina comensal y la relacin es
con frecuencia, pero no necesariamente, casual, ya que
gran nmero de especies puede colaborar, existiendo poca
especializacin entre los asociados.
sustrato B
org. a
Interacciones sinrgicas
Remocin de factores inhibidores: una especie metaboliza toxinas u otros factores inhibidores, permitiendo, entonces, la multiplicacin de su asociado. Las variaciones del pH o del Eh, la remocin del O2, la reduccin de la presin osmtica, los cambios en los niveles
de nutrientes por la actividad biolgica, son causas de
beneficio para el comensal
Ejemplos:
organismo sensible a un biocida y otro que lo degrada
org. b
org. a
enzimas
sustrato
productos
finales
antibitico inactivado
257
Nutrientes: el nivel de N combinado fcilmente asimilable en el suelo (amonio y/o nitrato) afecta este proceso. Se tiende a la seleccin y empleo de mutantes
de diazotrofos resistentes a altos niveles de N mineral
y que adems excreten rpidamente el amonio fijado.
Una ligera fertilizacin en la siembra (10-30 kg N/ha)
es empleada en gramneas, en suelos pobres. El establecimiento del cultivo estimula la FBN rizosfrica
que contribuye con parte de la demanda en nitrgeno.
Fsforo, molibdeno, hierro, inciden en el funcionamiento de la nitrogenasa. El fsforo actuara ms bien a
nivel del vegetal.
Gases: es bien conocido el efecto del O2 en la enzima. En general, la rizosfera de la mayora de los cultivos presenta baja pO2, alto nivel de CO2 y suficiente
N2, que nunca es limitante, como para favorecer la fijacin.
pH: ciertas rizosferas presentan pH demasiado bajo
para el desarrollo de diazotrofos neutrfilos, como el
Azotobacter.
Pesticidas, la aplicacin de altas dosis de herbicidas y
fungicidas puede afectar las densidades de estas bacterias. Alta inhibicin de la actividad nitrogenasa se encontr en rizosferas de numerosos cultivos.
Inoculacin
Desde la dcada de los sesenta, se citan en la bibliografa incrementos en los rendimientos de maz y trigo de un
10 a un 20% al inocularlos con Azotobacter spp. El tema
ha sido retomado en la dcada de los setenta, donde se
citan aumentos de materia seca sobre el control de un
66% al inocular Digitaria decumbens y Pannicum maximum con Azospirillum. En mijo perla, la inoculacin con
40 kg N/ha/ao produjo materia seca equivalente a una
fertilizacin con 80 kg N/ha/ao, a los 70 das de crecimiento. Una ligera fertilizacin nitrogenada en la siembra
favorece la fijacin rizofrica.
En algunos ensayos se obtiene ms respuesta en los testigos regados con el filtrado acelular de los diazotrofos,
indicando que los efectos pueden explicarse por la produccin de sustancias reguladoras del crecimiento vegetal por estos organismos.
Se observan: cambios en la morfologa radical de plantas inoculadas, aumento del nmero de races laterales
profusamente cubiertas con pelos radicales.
Se han identificado giberelinas del tipo A1, A3 e iso-A3 en
cultivos de A. ipoferum (Bottini et al, 1989) y la inoculacin
en maz increment el peso seco, la densidad de pelos
radicales y la longitud total de la raz, con efecto similar al
agregado de 40 pg/mL de GA3 y 2000 pg/mL de AIA.
Para verificar estos efectos se trabaja con mutantes de
espirilos sin nitrogenasa funcional, pero capaces de elaborar sustancias del tipo de las fitohormonas, para incluirlas en las parcelas control.
Estos microorganismos son empleados como inoculantes en zonas agrcolas de distintas partes del mundo, en
maz, arroz, cultivos hortcolas, trigo, yute, algodn, caa
de azcar (Urquiaga, Dbereiner, 1991), solos o en combinacin con fertilizantes (Gonzlez-Lopez, 1992).
El cuadro 1 muestra el efecto de inoculacin (I) de maz
con tres cepas de Azospirillum en suelo Haplustol, de
Argentina. Adems de un incremento en los rendimientos similar a la fertilizacin (N) con 60 kg N-urea/ha en
los tratamientos inoculados, se apreci importante desarrollo de races y persistencia de altos niveles de inculo (108 clulas.g-1 raz en la cosecha ) (Fulchieri y
Frioni, 1994).
N-urea
90,84a
Inoculada
79,16a
Testigo
46,19b
34,00
65,50
26,93
5,82b
8,03a
4,55b
333
359
109
4122a
4447a
2792b
Dos o ms tratamientos sealados con la misma letra no difieren por Tuckey 5%.
256
Lillian Frioni
nia, Argentina. Se determin efecto estimulante de la rizosfera de sorgo, maz, mijo perla y mijo comn sobre
Azotobacter, Azospirillum y Clostridium en el campo, sobre todo en los dos perodos ms crticos en N para los
cultivos: floracin y grano al estado lechoso.
Se postula la existencia de lectinas que uniran especficamente los espirilos a los pelos capilares de ciertas gramneas. En presencia de nitrgeno combinado, la bacteria slo se asocia al mucigel del pice y a clulas epidrmicas no diferenciadas.
A diferencia de las asociaciones nodulares, estas asociaciones rizosfricas, llamadas tambin simbiosis asociativas o rizocenosis, se encuentran muy afectadas por las
fluctuaciones del ambiente, que impide muchas veces una
fijacin acorde a las necesidades del vegetal. La figura 1
presenta la compleja serie de requerimientos que deben
Factores fsicos: como es de suponer, una excesiva humedad o extrema desecacin afectarn de gran manera a
este proceso. La temperatura es otro de los factores que
inciden limitando el proceso cuando los umbrales trmicos
son muy bajos o muy altos. Rangos entre 18 y 30C se
citan como ptimos para cultivos en zona templada.
Aire
Luz
CO2
O2
redox bajo
Fotosntesis
(luz, temperatura)
N2
H2 O
potencial hdrico
es frecuente observar bacterias que se desarrollan sobre algas, adhirindose a los organismos fottrofos (ectocomensalismo).
Protocooperacin
Estas relaciones involucran beneficio mutuo para dos o
ms especies y presentan carcter bastante laxo, es decir que la existencia de cada integrante de la asociacin
en un ambiente no requiere una especie particular, sino
que muchos integrantes de la poblacin pueden brindarle
los requisitos para su crecimiento. Los organismos que
interactan bajo ciertas condiciones ambientales, pueden
proliferar independientemente, en otras condiciones. Se
las denomina tambin mutualismo no obligatorio, simbiosis nutricional o sintrofismo.
Se reconocen algunas categoras de protocooperacin:
sntesis y degradacin de macromolculas: polisacridos como la celulosa, lignina, etc. son degradados por
cultivos mixtos.
cada integrante de la pareja excreta un factor de crecimiento sin el cual el asociado no puede desarrollarse
difusin N2
aceptor de eexudacin
(C, energa)
FBN
(niveles ptimos de C,
temperatura, exudacin , etc.)
A tiaminariboflavina+
represin
NH4
otros microorganismos
P, etc.
NO3
materia orgnica
translocacin
Rizosfera
redox alto
redox ptimo
Algunos de los factores que afectan la fijacin del nitrgeno a nivel rizosfrico son:
mineralizacin de N
fertilizantes N
suelo
Figura 1- Fijacin biolgica de N en la rizosfera de arroz y efecto de factores edficos, climticos y del cultivo
2
245
B tiamina+
riboflavina -
246
Lillian Frioni
cada integrante puede aportar fragmentos de la molcula de un factor de crecimiento, como la vitamina B1 o
tiamina: A (tiazol+ y piramidina-) y B (tiazol- y pirimidina+), la pareja sintetiza la tiamina formada por tiazol y
pirimidina, requerida por ambos.
Azotobacter y celulolticos en ambientes pobres en nitrgeno y ricos en pajas. El primer organismo le brinda
el nitrgeno fijado va excrecin y el segundo hidratos
de carbono simples
Densidad ptica
150
Cultivo mixto
100
L. arabinosus
50
S. faecalis
Tiempo
El cuadro 1 seala la importancia de este tipo de asociaciones en biodigestores rurales, donde una sucesin de
microorganismos asegura la degradacin de la materia
orgnica en anaerobiosis y la liberacin final de metano
(captulo 21). Un grupo de organismos libera hidrgeno,
necesario para el accionar del otro grupo, que lo consume. A su vez, el segundo grupo mantiene concentracin
baja de H2 y promueve la fermentacin de los cidos
grasos y la produccin de H2 que regula el funciona-
255
acetato + CO2 + H2
CH4 + 2 H20
15
Simbiosis
Involucran relaciones bastante duraderas en las cuales
dos o ms especies viven en inmediata proximidad y obtienen beneficios mutuos de su interaccin. En un hbitat dado, la simbiosis resulta casi siempre de carcter
obligatorio, para que los simbiontes realicen sus funciones vitales. Algunos bilogos emplean el trmino mutualismo para referirse a estas asociaciones y reconocen las simbiosis mutualsticas, en donde ambos integrantes se benefician, y las simbiosis parsitas, en las
cuales un integrante se beneficia pero el otro no se afecta, o a veces sufre perjuicio ms o menos severo (no
usaremos en este texto esta acepcin). Consideraremos
a las simbiosis cuando al menos un integrante de la asociacin obtuvo algn beneficio.
Los lmites de separacin de ambas resultan a veces difciles de determinar. Adems, el ambiente puede ejercer
profundos cambios en las relaciones, de modo que una
asociacin que comenz siendo mutualstica puede volverse parsita, o viceversa.
Algunas simbiosis involucran microorganismos entre s,
otras incluyen microorganismos con insectos, plantas y
animales superiores. Analizaremos solamente aquellas
entre microorganismos, muchas veces no distinguibles
fcilmente por el tamao submicroscpico de la mayora
de los integrantes.
lquenes,
Fijacin de N2 en la rizosfera
La eficiencia de la fijacin de organismos hetertrofos
evaluada en medios de cultivo estticos, es baja: 10 a
50 mg N fijado/g sustrato carbonado consumido. As,
para fijar 100 kg N/ha/ao se requerira el metabolismo
de aproximadamente 10 toneladas de materia orgnica,
muy difcil de reunir en suelos sometidos a agricultura
tradicional.
La fijacin biolgica del nitrgeno (FBN ) es favorecida en
ambientes como la rizosfera, regin del suelo donde la
actividad microbiana es modificada por la presencia de
las races, la filosfera, superficie de las hojas y la espermatosfera, zona del suelo afectada por la presencia de
semillas y granos. (captulo 13).
lum notatum de la variedad batatais realizado por el grupo de Dbereiner al comienzo de los aos 70, en Brasil,
numerosos trabajos sealan estimulacin en la rizosfera
de cultivos de inters econmico, como cereales, gramneas forrajeras, por especies de Azotobacter, Beijerinckia, Azospirillum, Bacillus, Clostridium, etc. (Dbereiner,
Pedrosa, 1987; Dbereiner et al, 1992).
Se reconocen varios mecanismos de promocin del crecimiento vegetal por estos organismos:
254
Lillian Frioni
Preguntas de repaso
1) Cmo se explica la presencia de microorganismos exi-
247
alga
hongo
fuentes de C por la fotosntesis: las algas en simbiosis en lquenes, o en protozoos o invertebrados acuticos o con plantas, fotosintetizan en exceso para sus
necesidades y satisfacen as los requerimientos de sus
asociados. La capacidad de muchos paramecios para
desarrollarse en medio inorgnico en la luz cuando estn asociados a un alga clorofcea, explica esto
generacin de CO2 para la fotosntesis, o la produccin de O2 para el simbionte por accin de la actividad
fotosinttica.
levaduras como Lypomyces starkey estimulan el crecimiento y fijacin del N2 de Beijerinckia indica. Se describe esta asociacin como una simbiosis.
248
Lillian Frioni
Interacciones antagnicas
Al introducir un inoculante biolgico, con rhizobios, Frankia, bacterias solubilizadoras de fosfatos, en ambientes
densamente colonizados como el suelo, es frecuente observar que la poblacin no logra sobrevivir y desaparece.
Como vimos, cada microorganismo requiere de un conjunto de condiciones nutricionales y ambientales que le
permiten desarrollarse.
Las interacciones antagnicas pueden explicar la desaparicin o disminucin significativa de algn organismo de
inters cuando las condiciones fsico- qumicas son las
adecuadas.
Competencia
En ambientes naturales, suelo, aguas, los sustratos energticos y los nutrientes son por lo general limitantes como
para mantener altas poblaciones microbianas, las que interactan compitiendo por los sustratos: se habla de competencia nutricional. Si, excepcionalmente, el ambiente
es rico en nutrientes, la competencia puede ejercerse por
el espacio, la luz, etctera.
Predacin
En este antagonismo el perodo de contacto es generalmente corto y la presa es muerta y digerida rpidamente.
El predator vive, por lo general, libre, es mayor en tamao que su presa y presenta menor especificidad en sus
hbitos alimenticios.
Constituye una de las ms dramticas interacciones entre microorganismos en la naturaleza. Las bacterias son
los organismos ms expuestas al ataque de predatores,
sobre todo protozoos, algas, hongos. El predator exhibe,
por lo general, hbitos alimenticios fagotrficos, ingiriendo
organismos vivos, a pesar de que algunos predatores lisan la presa y asimilan slo los constituyentes solubles.
Muchos protozoos viven toda su vida como fagotrofos,
alimentndose de millones de bacterias por cada ciclo
celular. La presa, sin embargo, no desaparece completamente, existe un equilibrio dinmico: el cambio en un grupo conduce a cambios cuali y cuantitativos en el otro y la
poblacin bacteriana atacada estimula su metabolismo y
se divide ms rpidamente, evitando en muchos casos su
total extincin.
8
Especie B sola
7
6
B creciendo con A
5
12
Horas
Muchas bacterias son resistentes a la predacin, excretando toxinas inhibidoras de los protozoos, pigmentos o
formando estructuras ms resistentes a condiciones adversas y a la predacin, como los cistos. La habilidad de
la bacteria para mantener sustanciales poblaciones depende de su constante multiplicacin en presencia del
protozoo, por lo que ciertas bacterias no se reducen por
los protozoos debajo de cierta densidad crtica, en el suelo y en medio lquido.
253
Existe evidencia de que los protozoos predatores aceleran procesos bioqumicos, incluyendo la descomposicin
de la materia orgnica, como consecuencia del hecho de
que los protozoos evitan que las bacterias alcancen un
nmero muy grande que resultara autoinhibitorio. Se las
mantiene, adems, en estado prolongado de alta actividad metablica.
Los protozoos pueden predar tambin a pequeas algas,
hongos, a pesar de que en este caso la presa es de mayor tamao. Se piensa que los protozoos consumen bacterias si stas estn suficientemente prximas, de modo
que la energa ganada en la predacin es mayor que la
requerida para predarlas. Cuando el nmero de bacterias
cae a valores en los que la energa requerida por el protozoo para encontrar a su presa es igual o mayor que la que
obtienen como alimento, entonces el protozoo cesa de
predar, y se reproduce.
Como vimos, las interacciones antagnicas pueden conducir a una disminucin importante e incluso al fracaso de
prcticas agrcolas, como la inoculacin de semillas y el
suelo con organismos de inters en la fijacin del N2, solubilizacin de fosfatos, control biolgico de microorganismos fitopatgenos, etc. La predacin se encuentra entre
las causas ms importantes.
En resumen: las relaciones tanto benficas como antagnicas entre microorganismos permiten explicar hechos aparentemente contradictorios, como son la presencia de microorganismos exigentes nutricionalmente en ambientes pobres, como el agua de mar u ocano, a supremaca de ciertos agentes en situaciones
desfavorables, el control biolgico que se ejerce sobre
microorganismos patgenos o deletreos de plantas.
Los suelos contienen una enorme diversidad de poblaciones microbianas y aun ignoramos muchos de los
factores que controlan la composicin de esas poblaciones.
Bibliografa
Atlas, R. M. y R. Bartha, Microbial Ecology: Fundamentals an Applications. 3 ed., 1993, Benjamin/Cummings, Publishing Co. New York
252
Lillian Frioni
Se distinguen los:
endoparsitos, que habitan dentro de un organismo, como
los bacterifagos, los actinfagos, etc., y otros microorganismos que viven dentro de hongos, algas, etc. y los
ectoparsitos que se localizan externamente en sus
hospedantes, menos frecuentes entre microorganismos.
Una pequea bacteria, de forma de vibrio, llamada Bdellovibrio, es parsita obligada de bacterias Gram negativas, entre ellas rhizobios, llegando incluso a su lisis. Su
ciclo de vida es muy particular: se desplazan a gran velocidad, colisionan con las clulas que van a atacar por su
extremo no flagelado y un orificio en la pared producido
por enzimas permite al parsito penetrar, el que se ubica
en el espacio entre pared y membrana (figura 8) (Prescott
et al., 1999). La rotacin permanente ayuda a debilitar la
pared.
La membrana no es atravesada por el parsito pero se
vuelve porosa y la clula se lisa. En la superficie de cajas
de Petri con la especie hospedante, Bdellovibrio forma
placas lticas, similares a las producidas por infeccin por
fagos.
No han sido descriptos muchos parasitismos entre bacterias.
sin KNO3
Fusarium y
Agrobacterium
Glucosa%
Pared
150-210 minutos
Membrana
1
10 segundos
3,0
0
0,25
0,50
2,5
2,8
2,9
3,1
2,8
1,2
1,0
0,8
2,9
0
0,25
0,50
2,5
5,5
5,2
5,4
5,4
2,1
1,9
1,9
5,0
0
0,25
0,50
2,5
5,3
5,2
5,4
5,2
1,8
1,8
2,0
5,2
La capacidad de un organismo para competir est gobernada por una serie de factores:
Fusarium +
Agrobacterium
Los competidores ms efectivos de este hongo fitopatgeno son organismos con requerimientos nutritivos
simples.
20 minutos
ras, altas intensidades luminosas, bajos niveles de humedad, brindan al organismo ventaja ecolgica indudable
tolerancia a fluctuaciones del ambiente: de tempera-
Bacteria
10 minutos
0,5g KNO3
Fusarium solo
Bdellovibrio
20 minutos
0,1 g KNO3
tolerancia
249
eficiencia en el uso de nutrientes limitantes: son favorecidos aquellos organismos que pueden sintetizar
citoplasma con niveles bajos de nutrientes asimilables
requerimientos de factores de crecimiento: en ambientes pobres, organismos prototrofos poseern ventaja frente a un auxtrofo para estas sustancias
capacidad de desplazarse hacia reas en donde el nivel de nutrientes limitantes es mayor (quimiostasis)
250
Lillian Frioni
nas sin colonizar, indicando que aparentemente habran escasas limitaciones espaciales para el desarrollo de microorganismos. Aunque esta limitacin podra ocurrir a nivel de
microporos, donde una pequea partcula de materia orgnica estimula la proliferacin de clulas y micelio fngico que
puede obstruir rpidamente el microhabitat.
Este tipo de interaccin antagnica es una de las ms
difciles de demostrar en comunidades naturales y se recurre a modelos con suelo estril y la inoculacin simultnea de los organismos sospechosos de interactuar.
Amensalismo
Resulta de la produccin por una especie microbiana, el
antagonista, de sustancias:
inhibidoras (microbiostticas)
altamente especficas, como en el caso de antibiticos, sulfas, toxinas, enzimas, las que actan a muy bajas concentraciones.
Incubar
Colonias de Streptomyces spp.
Microorganismos no
productores
Zona de inhibicin
del crecimiento
Antibiticos
Son metabolitos secundarios, productos de desecho liberados por bacterias, actinomicetes, hongos, que juegan
251
Microorganismos
productores
Parasitismo
Un parsito es un organismo que se nutre a partir de clulas, tejidos o fluidos de otro organismo, usualmente mayor,
llamado hospedante, el que generalmente es injuriado en
el proceso. El parsito es dependiente en alto grado del
hospedante, a expensas del cual se nutre y con el que se
mantiene en contacto fsico y metablico ntimo durante
considerable fraccin de su vida. Muy pocos organismos
estn libres del ataque de parsitos microbianos. Resulta
muchas veces difcil determinar las lneas de demarcacin
entre parasitismo e interacciones relacionadas, sobretodo
la predacin y el parasitismo, ya que ambos implican beneficio para unos y perjuicio para otros organismos.
Numerosos parsitos mantienen contacto prolongado y
se alimentan por largo perodo de su hospedante y pueden atacar un rango estrecho de organismos. Hay especies que viven independientemente, como saprofitas y en
ciertas oportunidades como parsitas, son los parsitos
facultativos. Los obligados, por el contrario, deben vivir
en las clulas, tejidos o fluidos de un organismo durante
gran parte de su ciclo de vida.
250
Lillian Frioni
nas sin colonizar, indicando que aparentemente habran escasas limitaciones espaciales para el desarrollo de microorganismos. Aunque esta limitacin podra ocurrir a nivel de
microporos, donde una pequea partcula de materia orgnica estimula la proliferacin de clulas y micelio fngico que
puede obstruir rpidamente el microhabitat.
Este tipo de interaccin antagnica es una de las ms
difciles de demostrar en comunidades naturales y se recurre a modelos con suelo estril y la inoculacin simultnea de los organismos sospechosos de interactuar.
Amensalismo
Resulta de la produccin por una especie microbiana, el
antagonista, de sustancias:
inhibidoras (microbiostticas)
altamente especficas, como en el caso de antibiticos, sulfas, toxinas, enzimas, las que actan a muy bajas concentraciones.
Incubar
Colonias de Streptomyces spp.
Microorganismos no
productores
Zona de inhibicin
del crecimiento
Antibiticos
Son metabolitos secundarios, productos de desecho liberados por bacterias, actinomicetes, hongos, que juegan
251
Microorganismos
productores
Parasitismo
Un parsito es un organismo que se nutre a partir de clulas, tejidos o fluidos de otro organismo, usualmente mayor,
llamado hospedante, el que generalmente es injuriado en
el proceso. El parsito es dependiente en alto grado del
hospedante, a expensas del cual se nutre y con el que se
mantiene en contacto fsico y metablico ntimo durante
considerable fraccin de su vida. Muy pocos organismos
estn libres del ataque de parsitos microbianos. Resulta
muchas veces difcil determinar las lneas de demarcacin
entre parasitismo e interacciones relacionadas, sobretodo
la predacin y el parasitismo, ya que ambos implican beneficio para unos y perjuicio para otros organismos.
Numerosos parsitos mantienen contacto prolongado y
se alimentan por largo perodo de su hospedante y pueden atacar un rango estrecho de organismos. Hay especies que viven independientemente, como saprofitas y en
ciertas oportunidades como parsitas, son los parsitos
facultativos. Los obligados, por el contrario, deben vivir
en las clulas, tejidos o fluidos de un organismo durante
gran parte de su ciclo de vida.
252
Lillian Frioni
Se distinguen los:
endoparsitos, que habitan dentro de un organismo, como
los bacterifagos, los actinfagos, etc., y otros microorganismos que viven dentro de hongos, algas, etc. y los
ectoparsitos que se localizan externamente en sus
hospedantes, menos frecuentes entre microorganismos.
Una pequea bacteria, de forma de vibrio, llamada Bdellovibrio, es parsita obligada de bacterias Gram negativas, entre ellas rhizobios, llegando incluso a su lisis. Su
ciclo de vida es muy particular: se desplazan a gran velocidad, colisionan con las clulas que van a atacar por su
extremo no flagelado y un orificio en la pared producido
por enzimas permite al parsito penetrar, el que se ubica
en el espacio entre pared y membrana (figura 8) (Prescott
et al., 1999). La rotacin permanente ayuda a debilitar la
pared.
La membrana no es atravesada por el parsito pero se
vuelve porosa y la clula se lisa. En la superficie de cajas
de Petri con la especie hospedante, Bdellovibrio forma
placas lticas, similares a las producidas por infeccin por
fagos.
No han sido descriptos muchos parasitismos entre bacterias.
sin KNO3
Fusarium y
Agrobacterium
Glucosa%
Pared
150-210 minutos
Membrana
1
10 segundos
3,0
0
0,25
0,50
2,5
2,8
2,9
3,1
2,8
1,2
1,0
0,8
2,9
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0,25
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5,5
5,2
5,4
5,4
2,1
1,9
1,9
5,0
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0,25
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2,5
5,3
5,2
5,4
5,2
1,8
1,8
2,0
5,2
La capacidad de un organismo para competir est gobernada por una serie de factores:
Fusarium +
Agrobacterium
Los competidores ms efectivos de este hongo fitopatgeno son organismos con requerimientos nutritivos
simples.
20 minutos
ras, altas intensidades luminosas, bajos niveles de humedad, brindan al organismo ventaja ecolgica indudable
tolerancia a fluctuaciones del ambiente: de tempera-
Bacteria
10 minutos
0,5g KNO3
Fusarium solo
Bdellovibrio
20 minutos
0,1 g KNO3
tolerancia
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eficiencia en el uso de nutrientes limitantes: son favorecidos aquellos organismos que pueden sintetizar
citoplasma con niveles bajos de nutrientes asimilables
requerimientos de factores de crecimiento: en ambientes pobres, organismos prototrofos poseern ventaja frente a un auxtrofo para estas sustancias
capacidad de desplazarse hacia reas en donde el nivel de nutrientes limitantes es mayor (quimiostasis)
248
Lillian Frioni
Interacciones antagnicas
Al introducir un inoculante biolgico, con rhizobios, Frankia, bacterias solubilizadoras de fosfatos, en ambientes
densamente colonizados como el suelo, es frecuente observar que la poblacin no logra sobrevivir y desaparece.
Como vimos, cada microorganismo requiere de un conjunto de condiciones nutricionales y ambientales que le
permiten desarrollarse.
Las interacciones antagnicas pueden explicar la desaparicin o disminucin significativa de algn organismo de
inters cuando las condiciones fsico- qumicas son las
adecuadas.
Competencia
En ambientes naturales, suelo, aguas, los sustratos energticos y los nutrientes son por lo general limitantes como
para mantener altas poblaciones microbianas, las que interactan compitiendo por los sustratos: se habla de competencia nutricional. Si, excepcionalmente, el ambiente
es rico en nutrientes, la competencia puede ejercerse por
el espacio, la luz, etctera.
Predacin
En este antagonismo el perodo de contacto es generalmente corto y la presa es muerta y digerida rpidamente.
El predator vive, por lo general, libre, es mayor en tamao que su presa y presenta menor especificidad en sus
hbitos alimenticios.
Constituye una de las ms dramticas interacciones entre microorganismos en la naturaleza. Las bacterias son
los organismos ms expuestas al ataque de predatores,
sobre todo protozoos, algas, hongos. El predator exhibe,
por lo general, hbitos alimenticios fagotrficos, ingiriendo
organismos vivos, a pesar de que algunos predatores lisan la presa y asimilan slo los constituyentes solubles.
Muchos protozoos viven toda su vida como fagotrofos,
alimentndose de millones de bacterias por cada ciclo
celular. La presa, sin embargo, no desaparece completamente, existe un equilibrio dinmico: el cambio en un grupo conduce a cambios cuali y cuantitativos en el otro y la
poblacin bacteriana atacada estimula su metabolismo y
se divide ms rpidamente, evitando en muchos casos su
total extincin.
8
Especie B sola
7
6
B creciendo con A
5
12
Horas
Muchas bacterias son resistentes a la predacin, excretando toxinas inhibidoras de los protozoos, pigmentos o
formando estructuras ms resistentes a condiciones adversas y a la predacin, como los cistos. La habilidad de
la bacteria para mantener sustanciales poblaciones depende de su constante multiplicacin en presencia del
protozoo, por lo que ciertas bacterias no se reducen por
los protozoos debajo de cierta densidad crtica, en el suelo y en medio lquido.
253
Existe evidencia de que los protozoos predatores aceleran procesos bioqumicos, incluyendo la descomposicin
de la materia orgnica, como consecuencia del hecho de
que los protozoos evitan que las bacterias alcancen un
nmero muy grande que resultara autoinhibitorio. Se las
mantiene, adems, en estado prolongado de alta actividad metablica.
Los protozoos pueden predar tambin a pequeas algas,
hongos, a pesar de que en este caso la presa es de mayor tamao. Se piensa que los protozoos consumen bacterias si stas estn suficientemente prximas, de modo
que la energa ganada en la predacin es mayor que la
requerida para predarlas. Cuando el nmero de bacterias
cae a valores en los que la energa requerida por el protozoo para encontrar a su presa es igual o mayor que la que
obtienen como alimento, entonces el protozoo cesa de
predar, y se reproduce.
Como vimos, las interacciones antagnicas pueden conducir a una disminucin importante e incluso al fracaso de
prcticas agrcolas, como la inoculacin de semillas y el
suelo con organismos de inters en la fijacin del N2, solubilizacin de fosfatos, control biolgico de microorganismos fitopatgenos, etc. La predacin se encuentra entre
las causas ms importantes.
En resumen: las relaciones tanto benficas como antagnicas entre microorganismos permiten explicar hechos aparentemente contradictorios, como son la presencia de microorganismos exigentes nutricionalmente en ambientes pobres, como el agua de mar u ocano, a supremaca de ciertos agentes en situaciones
desfavorables, el control biolgico que se ejerce sobre
microorganismos patgenos o deletreos de plantas.
Los suelos contienen una enorme diversidad de poblaciones microbianas y aun ignoramos muchos de los
factores que controlan la composicin de esas poblaciones.
Bibliografa
Atlas, R. M. y R. Bartha, Microbial Ecology: Fundamentals an Applications. 3 ed., 1993, Benjamin/Cummings, Publishing Co. New York
254
Lillian Frioni
Preguntas de repaso
1) Cmo se explica la presencia de microorganismos exi-
247
alga
hongo
fuentes de C por la fotosntesis: las algas en simbiosis en lquenes, o en protozoos o invertebrados acuticos o con plantas, fotosintetizan en exceso para sus
necesidades y satisfacen as los requerimientos de sus
asociados. La capacidad de muchos paramecios para
desarrollarse en medio inorgnico en la luz cuando estn asociados a un alga clorofcea, explica esto
generacin de CO2 para la fotosntesis, o la produccin de O2 para el simbionte por accin de la actividad
fotosinttica.
levaduras como Lypomyces starkey estimulan el crecimiento y fijacin del N2 de Beijerinckia indica. Se describe esta asociacin como una simbiosis.
246
Lillian Frioni
cada integrante puede aportar fragmentos de la molcula de un factor de crecimiento, como la vitamina B1 o
tiamina: A (tiazol+ y piramidina-) y B (tiazol- y pirimidina+), la pareja sintetiza la tiamina formada por tiazol y
pirimidina, requerida por ambos.
Azotobacter y celulolticos en ambientes pobres en nitrgeno y ricos en pajas. El primer organismo le brinda
el nitrgeno fijado va excrecin y el segundo hidratos
de carbono simples
Densidad ptica
150
Cultivo mixto
100
L. arabinosus
50
S. faecalis
Tiempo
El cuadro 1 seala la importancia de este tipo de asociaciones en biodigestores rurales, donde una sucesin de
microorganismos asegura la degradacin de la materia
orgnica en anaerobiosis y la liberacin final de metano
(captulo 21). Un grupo de organismos libera hidrgeno,
necesario para el accionar del otro grupo, que lo consume. A su vez, el segundo grupo mantiene concentracin
baja de H2 y promueve la fermentacin de los cidos
grasos y la produccin de H2 que regula el funciona-
255
acetato + CO2 + H2
CH4 + 2 H20
15
Simbiosis
Involucran relaciones bastante duraderas en las cuales
dos o ms especies viven en inmediata proximidad y obtienen beneficios mutuos de su interaccin. En un hbitat dado, la simbiosis resulta casi siempre de carcter
obligatorio, para que los simbiontes realicen sus funciones vitales. Algunos bilogos emplean el trmino mutualismo para referirse a estas asociaciones y reconocen las simbiosis mutualsticas, en donde ambos integrantes se benefician, y las simbiosis parsitas, en las
cuales un integrante se beneficia pero el otro no se afecta, o a veces sufre perjuicio ms o menos severo (no
usaremos en este texto esta acepcin). Consideraremos
a las simbiosis cuando al menos un integrante de la asociacin obtuvo algn beneficio.
Los lmites de separacin de ambas resultan a veces difciles de determinar. Adems, el ambiente puede ejercer
profundos cambios en las relaciones, de modo que una
asociacin que comenz siendo mutualstica puede volverse parsita, o viceversa.
Algunas simbiosis involucran microorganismos entre s,
otras incluyen microorganismos con insectos, plantas y
animales superiores. Analizaremos solamente aquellas
entre microorganismos, muchas veces no distinguibles
fcilmente por el tamao submicroscpico de la mayora
de los integrantes.
lquenes,
Fijacin de N2 en la rizosfera
La eficiencia de la fijacin de organismos hetertrofos
evaluada en medios de cultivo estticos, es baja: 10 a
50 mg N fijado/g sustrato carbonado consumido. As,
para fijar 100 kg N/ha/ao se requerira el metabolismo
de aproximadamente 10 toneladas de materia orgnica,
muy difcil de reunir en suelos sometidos a agricultura
tradicional.
La fijacin biolgica del nitrgeno (FBN ) es favorecida en
ambientes como la rizosfera, regin del suelo donde la
actividad microbiana es modificada por la presencia de
las races, la filosfera, superficie de las hojas y la espermatosfera, zona del suelo afectada por la presencia de
semillas y granos. (captulo 13).
lum notatum de la variedad batatais realizado por el grupo de Dbereiner al comienzo de los aos 70, en Brasil,
numerosos trabajos sealan estimulacin en la rizosfera
de cultivos de inters econmico, como cereales, gramneas forrajeras, por especies de Azotobacter, Beijerinckia, Azospirillum, Bacillus, Clostridium, etc. (Dbereiner,
Pedrosa, 1987; Dbereiner et al, 1992).
Se reconocen varios mecanismos de promocin del crecimiento vegetal por estos organismos:
256
Lillian Frioni
nia, Argentina. Se determin efecto estimulante de la rizosfera de sorgo, maz, mijo perla y mijo comn sobre
Azotobacter, Azospirillum y Clostridium en el campo, sobre todo en los dos perodos ms crticos en N para los
cultivos: floracin y grano al estado lechoso.
Se postula la existencia de lectinas que uniran especficamente los espirilos a los pelos capilares de ciertas gramneas. En presencia de nitrgeno combinado, la bacteria slo se asocia al mucigel del pice y a clulas epidrmicas no diferenciadas.
A diferencia de las asociaciones nodulares, estas asociaciones rizosfricas, llamadas tambin simbiosis asociativas o rizocenosis, se encuentran muy afectadas por las
fluctuaciones del ambiente, que impide muchas veces una
fijacin acorde a las necesidades del vegetal. La figura 1
presenta la compleja serie de requerimientos que deben
Factores fsicos: como es de suponer, una excesiva humedad o extrema desecacin afectarn de gran manera a
este proceso. La temperatura es otro de los factores que
inciden limitando el proceso cuando los umbrales trmicos
son muy bajos o muy altos. Rangos entre 18 y 30C se
citan como ptimos para cultivos en zona templada.
Aire
Luz
CO2
O2
redox bajo
Fotosntesis
(luz, temperatura)
N2
H2 O
potencial hdrico
es frecuente observar bacterias que se desarrollan sobre algas, adhirindose a los organismos fottrofos (ectocomensalismo).
Protocooperacin
Estas relaciones involucran beneficio mutuo para dos o
ms especies y presentan carcter bastante laxo, es decir que la existencia de cada integrante de la asociacin
en un ambiente no requiere una especie particular, sino
que muchos integrantes de la poblacin pueden brindarle
los requisitos para su crecimiento. Los organismos que
interactan bajo ciertas condiciones ambientales, pueden
proliferar independientemente, en otras condiciones. Se
las denomina tambin mutualismo no obligatorio, simbiosis nutricional o sintrofismo.
Se reconocen algunas categoras de protocooperacin:
sntesis y degradacin de macromolculas: polisacridos como la celulosa, lignina, etc. son degradados por
cultivos mixtos.
cada integrante de la pareja excreta un factor de crecimiento sin el cual el asociado no puede desarrollarse
difusin N2
aceptor de eexudacin
(C, energa)
FBN
(niveles ptimos de C,
temperatura, exudacin , etc.)
A tiaminariboflavina+
represin
NH4
otros microorganismos
P, etc.
NO3
materia orgnica
translocacin
Rizosfera
redox alto
redox ptimo
Algunos de los factores que afectan la fijacin del nitrgeno a nivel rizosfrico son:
mineralizacin de N
fertilizantes N
suelo
Figura 1- Fijacin biolgica de N en la rizosfera de arroz y efecto de factores edficos, climticos y del cultivo
2
245
B tiamina+
riboflavina -
244
Lillian Frioni
predacin, que implica el ataque directo de una especie sobre otra, con la muerte de la presa
sustrato A
Algunos ejemplos implican una estrecha unin fsica entre ellos, en otros casos no se requiere proximidad entre
los individuos. Ejemplos de esta asociacin:
degradacin de polmeros como celulosa, almidn, quitina, sustancias pcticas, lignina, pesticidas: intervienen
primero poblaciones especializadas que permiten el desarrollo posterior de otras que emplean molculas ms
simples (cadena alimenticia).
org. b
vitamina
org b (comensal)
Modificacin de un sustrato: una poblacin convierte un sustrato no disponible para otra poblacin en un
producto que puede ser asimilado y usado como nutriente:
productos finales
Comensalismo
Constituye una interaccin muy comn en la naturaleza,
en donde los procesos de degradacin de molculas complejas son realizados por lo general por poblaciones mixtas (cadenas alimenticias), cada una de las cuales ofrece
a las otras un sustrato ms simple. El organismo que recibe el beneficio se denomina comensal y la relacin es
con frecuencia, pero no necesariamente, casual, ya que
gran nmero de especies puede colaborar, existiendo poca
especializacin entre los asociados.
sustrato B
org. a
Interacciones sinrgicas
Remocin de factores inhibidores: una especie metaboliza toxinas u otros factores inhibidores, permitiendo, entonces, la multiplicacin de su asociado. Las variaciones del pH o del Eh, la remocin del O2, la reduccin de la presin osmtica, los cambios en los niveles
de nutrientes por la actividad biolgica, son causas de
beneficio para el comensal
Ejemplos:
organismo sensible a un biocida y otro que lo degrada
org. b
org. a
enzimas
sustrato
productos
finales
antibitico inactivado
257
Nutrientes: el nivel de N combinado fcilmente asimilable en el suelo (amonio y/o nitrato) afecta este proceso. Se tiende a la seleccin y empleo de mutantes
de diazotrofos resistentes a altos niveles de N mineral
y que adems excreten rpidamente el amonio fijado.
Una ligera fertilizacin en la siembra (10-30 kg N/ha)
es empleada en gramneas, en suelos pobres. El establecimiento del cultivo estimula la FBN rizosfrica
que contribuye con parte de la demanda en nitrgeno.
Fsforo, molibdeno, hierro, inciden en el funcionamiento de la nitrogenasa. El fsforo actuara ms bien a
nivel del vegetal.
Gases: es bien conocido el efecto del O2 en la enzima. En general, la rizosfera de la mayora de los cultivos presenta baja pO2, alto nivel de CO2 y suficiente
N2, que nunca es limitante, como para favorecer la fijacin.
pH: ciertas rizosferas presentan pH demasiado bajo
para el desarrollo de diazotrofos neutrfilos, como el
Azotobacter.
Pesticidas, la aplicacin de altas dosis de herbicidas y
fungicidas puede afectar las densidades de estas bacterias. Alta inhibicin de la actividad nitrogenasa se encontr en rizosferas de numerosos cultivos.
Inoculacin
Desde la dcada de los sesenta, se citan en la bibliografa incrementos en los rendimientos de maz y trigo de un
10 a un 20% al inocularlos con Azotobacter spp. El tema
ha sido retomado en la dcada de los setenta, donde se
citan aumentos de materia seca sobre el control de un
66% al inocular Digitaria decumbens y Pannicum maximum con Azospirillum. En mijo perla, la inoculacin con
40 kg N/ha/ao produjo materia seca equivalente a una
fertilizacin con 80 kg N/ha/ao, a los 70 das de crecimiento. Una ligera fertilizacin nitrogenada en la siembra
favorece la fijacin rizofrica.
En algunos ensayos se obtiene ms respuesta en los testigos regados con el filtrado acelular de los diazotrofos,
indicando que los efectos pueden explicarse por la produccin de sustancias reguladoras del crecimiento vegetal por estos organismos.
Se observan: cambios en la morfologa radical de plantas inoculadas, aumento del nmero de races laterales
profusamente cubiertas con pelos radicales.
Se han identificado giberelinas del tipo A1, A3 e iso-A3 en
cultivos de A. ipoferum (Bottini et al, 1989) y la inoculacin
en maz increment el peso seco, la densidad de pelos
radicales y la longitud total de la raz, con efecto similar al
agregado de 40 pg/mL de GA3 y 2000 pg/mL de AIA.
Para verificar estos efectos se trabaja con mutantes de
espirilos sin nitrogenasa funcional, pero capaces de elaborar sustancias del tipo de las fitohormonas, para incluirlas en las parcelas control.
Estos microorganismos son empleados como inoculantes en zonas agrcolas de distintas partes del mundo, en
maz, arroz, cultivos hortcolas, trigo, yute, algodn, caa
de azcar (Urquiaga, Dbereiner, 1991), solos o en combinacin con fertilizantes (Gonzlez-Lopez, 1992).
El cuadro 1 muestra el efecto de inoculacin (I) de maz
con tres cepas de Azospirillum en suelo Haplustol, de
Argentina. Adems de un incremento en los rendimientos similar a la fertilizacin (N) con 60 kg N-urea/ha en
los tratamientos inoculados, se apreci importante desarrollo de races y persistencia de altos niveles de inculo (108 clulas.g-1 raz en la cosecha ) (Fulchieri y
Frioni, 1994).
N-urea
90,84a
Inoculada
79,16a
Testigo
46,19b
34,00
65,50
26,93
5,82b
8,03a
4,55b
333
359
109
4122a
4447a
2792b
Dos o ms tratamientos sealados con la misma letra no difieren por Tuckey 5%.
258
Lillian Frioni
La produccin de sustancias promotoras del crecimiento vegetal parece ser el principal mecanismo. La colonizacin bacteriana ocurre principalmente en la mayora
de las especies vegetales estudiadas en la zona de elongacin de las races
La inoculacin con Azospirillum afecta la concentracin de cido 3-indol actico y 3-indol butrico libres, as
como las velocidades especficas de respiracin y actividades de enzimas del ciclo de los cidos tricarboxlicos y de la gliclisis en races de maz y otras plantas.
Esto contribuye a que las races tomen ms agua y nutrientes minerales que favorecen un mayor crecimiento
de las plantas inoculadas
El efecto de la inoculacin parece evidenciarse principalmente en los estados tempranos del desarrollo vegetal, durante las primeras semanas luego de una correcta colonizacin de las races
La evaluacin de datos acumulados en los ltimos 20
aos indica que la inoculacin a campo Azospirillum,
puede incrementar el crecimiento de importantes cultivos (Okon y Labandera, 1994).
243
b)
condicin
suelo mal
drenado
suelo drenado
agua
continuo
c/sequa
continuo
c/sequa
rendimiento
testigo
45
inoculado
60
testigo
30
inoculado
38
% de incremento
33
26
Efecto
Interaccin
0
+
-
neutralismo
sinergismo
antagonismo
A pesar de la estrecha proximidad en que puedan encontrarse dos o ms especies que coexisten en el espacio o
en el tiempo, pueden no afectarse mutuamente. El neutralismo es evidente in vitro cuando las velocidades de
crecimiento y las densidades finales de dos poblaciones
son semejantes. La demostracin del neutralismo in vivo
es ms difcil. Es probable que ocurra cuando las densidades de las poblaciones son bajas, el aporte de nutrientes abundante y son satisfechos los requerimientos para
el desarrollo de las poblaciones, de modo que no interacten para los nutrientes, el espacio, etctera, pero cuando el ambiente comienza a modificarse por la actividad
biolgica o cuando el aporte de nutrientes comienza a disminuir, las especies comienzan a interactuar.
Se distinguen tres tipos de asociaciones sinrgicas, a
pesar de que las lneas de demarcacin no son siempre
ntidas y estn muy afectadas por el ambiente:
protocooperacin, simbiosis nutricional, o mutualismo, en donde el beneficio es mutuo, sin llegar a presentar carcter obligatorio
benefician en situaciones en que ninguno de ellos podra realizar una funcin vital o sobrevivir
Las interacciones antagnicas presentan un carcter
perjudicial para una parte de la poblacin e incluyen la:
competencia por los nutrientes (C, N, S, P, etc.), el espacio, luz, O2, CO2
242
Lillian Frioni
Las clulas en simbiosis presentan tambin ms bajo contenido de grnulos de cianoficina que representan reservas de nitrgeno con cido asprtico y arginina en relacin 1/1 molar. Los grnulos de polifosfatos son abundantes en simbiosis. Las ficobiliprotenas constituyen
reservas de nitrgeno, adems de actuar como pigmentos accesorios en el fotosistema II.
La luz es necesaria para la fijacin. Los lquenes toleran
condiciones extremas: en regiones de Suecia y Noruega,
la fijacin ocurre a OC y los organismos sobreviven a
heladas prolongadas y a la sequedad, aunque no fijan N2
hasta que se rehumedecen. Constituyen la vegetacin
principal de ambientes extremos como piedras, zonas arenosas, facilitando luego la colonizacin por otros microorganismos. La cianobacteria posee escasa actividad de
glutamino sintetasa, bloqueando parcialmente la ruta
primaria de asimilacin de NH3, que es liberado y transferido al hongo.
259
leguminosas se han incrementado rpidamente. Boussingault puso en evidencia en 1838 la capacidad de las leguminosas en emplear el N2 atmosfrico, pero, solamente
50 aos ms tarde, Hellriegel y Wilfarth demostraron de
manera indiscutible que slo las leguminosas noduladas
pueden hacerlo y que el lugar de fijacin eran los ndulos. Luego de estas clsicas experiencias se pudo comprobar fehacientemente que el lugar de fijacin son los
ndulos y que los microorganismos se encuentran en el
suelo o deben inocularse.
se compara el tenor de nitrgeno en leguminosas noduladas con el de las no noduladas cultivadas en ausencia de nitrgeno combinado
260
Lillian Frioni
Las leguminosas
Las plantas de la familia de las Leguminosas o Leguminoseae (cuadro 3) son muy numerosas (entre 16.000 y 19.000
especies). Tambin se la designa como Fabaceae o Fabales. De origen tropical arborescente cuyos ms recientes
derivados son pequeas matas o hierbas de las regiones
templadas. Representan la tercera familia de plantas de flor,
superadas por las Compositae y las Orchidacea. Desde su
origen en el Cretceo superior, en condiciones tropicales hmedas, fueron extendindose a otras condiciones climticas.
Grupo muy diversificado en el plano taxonmico con 3
sub-familias: Caesalpinoideae, Mimosoideae y Papilionoideae. No todas las especies estn noduladas: cerca del
20% de las Papilionoideae (unas 3.400 especies) se han
analizado por su aptitud para nodular.
En las Mimosoideae y Papilionoideae, el 90 y 97%, respectivamente, poseen especies noduladas, mientras que
en Caesalpinioideae slo el 23% de los gneros examinados evidenciaron habilidad para nodular.
Los siguientes son los gneros que poseen el mayor nmero de especies noduladas: en Mimosoideae, Acacia
(217); en Papilionoideae, Indigofera (194), Crotalaria
(145),Trifolium (141), Astragalus (102), Tephrosia (95),
Desmodium (76), Vicia (65) y Aspalathus (60); en Caesalpinioideae, Cassia (99).
N gneros
+
Mimosoideae
Caesalpinoideae
Papilionoideae
Total
66
177
505
748
18
13
241
272
N gneros analizados
N especies
+/total
+
8
13
14
35
5
39
14
58
Las prcticas de inoculacin con numerosos microorganismos que han logrado instalarse y actuar en la rizsfera, espermatsfera y en la superficie de las hojas, como
los fijadores de nitrgeno libres y simbiticos, bacterias y
hongos controladores de plagas vegetales, solubilizadores de fsforo, hongos micorrcicos, etc. demuestran que
es posible dirigir esta colonizacin con xito.
Bibliografa
Una de las principales caractersticas que evidencian el carcter evolutivo de la leguminosas se relaciona con las modificaciones en su forma y tamao: desde rboles tropicales
muy altos, pasando por arbustos , a trepadoras leosas, hier-
31
65
169
365
2900
2800
14000
19700
351
72
2316
2839
N especies analizadas
+/total
6
6
37
180
46
263
388
258
2462
3108
Bazin, M. J., P. Markham y E. M. Scott Population dynamics and rhizosphere interactions, en the rhizosphere. 1990, J. M. Lynch (ed), Wiley Interscience, New York:
99-127
Dommergues, Y. y F. Mangenot, La rhizosphre, en: Ecologie microbinne du sol, 1970, Dommergues, Mangenot (eds.), Masson et Cie., Pars: 549-594.
Frioni, L. Ecologa microbiana del suelo, 1990, Depto.
de Publicaciones de la Universidad de la Repblica,
241
Preguntas de repaso
1) Seale dos ejemplos de efectos: i) benficos y ii) perjudiciales, de los microorganismos sobre las plantas y
cmo los pondra en evidencia
2) Idem, pero efectos de los vegetales sobre los microorganismos
3) Por qu es la rizosfera una regin del suelo con actividad microbiana incrementada?
4) Por qu resulta la espermatsfera otra importante rea
de estudio?
5) Rol de las distintas sustancias orgnicas liberadas en
la rizosfera.
6) Cmo podemos distinguir la rizosfera, el rizoplano y
la superficie de las races?
7) Mediante cuales mecanismos las poblaciones microbianas pueden tener carcter benfico, neutro o perjudicial?
8) Qu factores afectan la colonizacin radical?
9) Seale dos tcnicas para evaluar el efecto del cultivo
de cierta variedad de tomate sobre los microorganismos del suelo.
280
Lillian Frioni
seleccionar genotipos del husped por su mayor actividad reductora del acetileno en presencia de una mezcla comercial de cepas de rhizobio. Explorar especies
con ndulos en los tallos
transferir genes nif a mitocondrias o cloroplastos vegetales es otra de las aspiraciones de los genetistas.
Se piensa que los nif penetran en los vegetales frecuentemente por heridas o llevados por parsitos. El
problema radica en el mantenimiento de estos genes
y su funcionamiento dentro del organismo superior. Se
piensa tambin en su introduccin en microorganismos del rumen
La simbiosis rhizobio-Parasponia
Hasta no hace mucho tiempo se pensaba que los rhizobios formaban ndulos solamente con leguminosas. En
1973 se describi nodulacin en ciertas Ulmaceae, por
rhizobios. Son rboles muy altos, ampliamente distribui-
261
El tercer grupo est integrado por especies que son especficas en sus requerimientos, por lo que nodulan efectivamente con un pequeo rango de cepas: son especficas para la nodulacin y tambin para la efectividad.
Ejemplos: Leucaena leucocephala (CR), Gliricidia sepium
(CR), Calliandra calothyrsus (CR)
272 spp
48 spp
23 spp
201 spp (130 nativas,
71 adventicias y/o cultivadas)
Gneros con mayor nmero de especies
Adesmia Vicia Desmodium Lathyrus Galactia
Especificidad en la infectividad y en
la efectividad
Algunas cepas de Rhizobium o Frankia poseen un amplio
espectro de huspedes. Otras cepas poseen un pequeo
espectro y se les dice especficas. Este tema de la especificidad debe verse desde el punto de vista del micro y
del macrosimbionte. Basados en sus caractersticas de
especificidad para la nodulacin y la fijacin, se reconocen tres tipos de leguminosas:
El primer grupo est integrado por especies noduladas por amplio rango de cepas genticamente diversas
Nodulacin
La fijacin biolgica del N2 en los ndulos de leguminosas
es el resultado de complejas interacciones entre el husped y el endofito la instalacin de la simbiosis est controlada por un dialogo molecular entre ambos integrantes
(Kondorosi, 1991). La eficiencia es mxima en estos sistemas ya que existe:
1. proteccin de variables ambientales y la FBN puede funcionar bajo amplio rango de condiciones. As,
ndulos de soja, son relativamente insensibles a la temperatura sobre un rango de 15C, y pueden fijar N2 a
concentraciones externas de O2 entre 0,05 y 0,8 atm,
mientras que los bacteroides fijan N2 en rango ms
estrecho (10-6, 10-4 atm). La proteccin frente al O2 es
una de las principales ventajas de los sistemas simbiticos
262
Lillian Frioni
La figura 3 (Dommergues et al., 1999) presenta un esquema que resume el dilogo molecular entre Sinorhizobium y alfalfa que se traduce en intercambio de seales
que permiten distinguir tres niveles de especificidad indicadas en el esquema por asteriscos.
El proceso comienza con la exudacin de sustancias inductores (flavonoides, betanas) por la raz. En su presencia, las protenas reguladoras sintetizadas por los genes
nodD de la bacteria son activadas e inducen los genes estructurales de la nodulacin. Estos incluyen los genes coAlfalfa
munes A, B y C, encontrados en todas las especies de Rhizobium y genes especficos a una especie de Rhizobium.
La expresin de genes estructurales conduce a la produccin de seales bacterianas constituidas por lipo-oligosacridos de glucosamina sulfatado, de PM 1.102, inducido por flavonoides; stos son los factores de nodulacin o factores Nod, que estimulan la curvatura de pelo y
la divisin de las clulas corticales.
Los sustituyentes qumicos en la molcula base son los
responsables en gran parte, de la especificidad hacia el
hospedante.
El cuadro 12 presenta valores sobre la fijacin en diferentes especies. La cantidad derivada del aire vara y representa en general un 50% del total en suelos frtiles, es mayor
en suelos deficientes y menor con fertilizacin nitrogenada.
En asociaciones con gramneas la proporcin derivada de
la fijacin puede llegar al 80 o 90% pues el cultivo asociado
toma la mayora del nitrgeno disponible en el suelo.
Forrajeras
Templadas
Medicago sativa (alfalfa)
Trifolium platense (trbol rojo)
Trifolim repens (trbol blanco)
legum.consociadas(pradera mixta)
125
Melilotus alba (trbol de olor, blanco)
104
Medicago polymorpha (trbol carretilla)
63
Trifolium subterraneum (trbol subterrneo)
24
Lotus corniculatus(cuernecillo)
27
Tropicales
Centrosema pubesens(centro)
112
Stylosanthes guianensis
115
Neonotonia wightii
160-450
Leguminosas de grano
templadas
Vicia
57-190
Phaseolus vulgaris (poroto)
46
Lupinus sp.. (lupino)
128
Tropicales
Vigna unguiculata
35 - 77
Glycine max (soja)
17-124
Arachis hipogea (mani)
33-117
Protena NodD
genes nod estructurales
precursores nod
proteina nod
grupo con:
acetil,
carbonil
H, acetato,
sulfato, fucosa,
metilfucosa,
sulfometilfucosa,
acetil-metilfucosa,
D-arabinosa
factores nod
Induccin de ndulos radicales
La cantidad de nitrgeno tomada por una leguminosa vara considerablemente con la especie, la efectividad de la
simbiosis, las condiciones del ambiente, del manejo, etc.
pastoreo animal
Se citan valores de N% en distintas partes de una leguminosa, evaluado en floracin o hacia el final de sta:
hojas (2,6-5,0); tallos (1,2-1,8), races (1,6-2,4), ndulos
(3,9-6,5), vainas (3,1-4,2) y en la planta entera en leguminosas tropicales (2,0-3,0).
Perspectivas
En el curso de esta simbiosis, el programa gentico de la
planta hospedera es considerablemente modificado y
muchos genes de la planta se expresan en los ndulos.
Sinorhizobium mililoti
nodD
279
H
carbonil
18C
16C
20C
H
glicerol
177
115
149
metil
El N de las leguminosas puede transferirse a otros cultivos en mayor o menor grado por las siguientes vas:
278
Lillian Frioni
empleo de inoculantes a base de turba que aseguran buena sobrevivencia en la semilla hasta la germinacin. La esterilidad de la turba permite extender los
plazos de vencimiento (cuadro 11). Las formas pildorizadas que emplean adhesivos como goma arbiga o
derivados celulsicos, para lograr mayor contacto con
la semilla, que se recubre con carbonato de calcio y
fosfato de roca, mejoran la inoculacin.
biocidas y fertilizantes: asegurarse que las semillas no hayan sido tratadas con sustancias txicos y
fertilizantes y que los recipientes empleados en la inoculacin estn libres de aceites, petrleo, metales pesados, etc.
Peso cajas
kg/ha
Grano
N%
kgN/ha
testigo
urea
70kgN/ha
M-4
M-13
M-10
2.115b
3.590a
1.379b
2.342a
4,77
4.34
65.76b
101,64a
2.853a
2.679a
2.673a
1.822a
1.500ab
1.560ab
4,74
4,61
4.62
86,36a
69,56a
72,07a
Requerimientos
Observaciones
Especificidad variable
Especificidad variable
Entrada de la bacteria
Cordn de infeccin
Formacin de ndulos
Formacin bacteroides,
sntesis N2asa y leghemo
globina
Intercambio de metabolitos
(HdeC, N-org)
Fases
Cultivo
4 semanas
A
B
C
26 semanas
A B C
R. leguminosarum
bv trifolii TA1
660
990
110
S. meliloti SU47
1500
1800
697
Bradyrhizobium
CB 756
1100
1200
16
25 190 1,0
A= esterilizacin en autoclave
B= esterilizacin por rayos gama
C= turba no estril
79
263
2,8
tetizan lectinas con diferente afinidad por azcares. Estas sustancias se encuentran en semillas, races, hojas o
tallos y se piensa que cumplen varias funciones
Algunos autores comparan a estas molculas con los anticuerpos: los sitios a unir, en la bacteria y la planta, poseen afinidad por la misma molcula, llamada trifolina,
en trboles.
264
Lillian Frioni
Figura 4 Etapas tempranas en la nodulacin en alfalfa: a) pelo absorbente no inoculado, n=ncleo, v=vacuola),
b) encurvamiento del pelo, 8 horas luego de la inoculacin, la flecha grande muestra masa de bacterias en el bucle,
c) raz luego de 11 horas de la inoculacin, con cordn de infeccin,
d) raz colonizada luego de 5 das de la inoculacin con un ndulo en formacin.
Encurvamiento de los pelos y marcada deformacin de los mismos, constituyen los primeros pasos
de la infeccin. El pelo se encurva y encierra al rhizobio
adherido. El fenotipo se designa como Hac+. Rhizobios
heterlogos son incapaces de inducir encurvamiento de
los pelos. La produccin de sustancias con caracter de
fitohormonas como el AIA, debilitara las paredes de
los pelos, facilitando la deformacin que precede a la
277
Respuesta a la inoculacin
poblacin nativa de rhizobios es escasa o nula o
ineficiente, se obtienen en esta situacin muy buenos resultados. Esto ocurre con el cultivo de soja en suelos sin
276
Lillian Frioni
ducir las leguminosas. Esta tcnica resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas, sobre todo
si son huspedes de alta especificidad (Trifolium, Medicago, Glycine), cuando la poblacin nativa es ineficiente
o cuando la deficiencia en nitrgeno limita el desarrollo
vegetal.
3. fertilizada con dosis ptmas de N inorgnico (N), puede ser incluso inoculada, donde se logra el mximo desarrollo
265
Ejemplos de resultados
La figura 9 presenta algunas de las respuestas posibles.
Tcnicas de inoculacin
Los testigos crecen pobremente y con ndulos inefectivos, mientras que los inoculados lo hacen bien y con
abundante nodulacin, indican buena respuesta a la inoculacin (caso B)
bajo
alto
medio
bajo
D
sin inocular
inoculado
alto N mineral
La membrana de la clula vegetal forma otro envoltorio para saparar los rhizobios de la planta: es la membrana peribacterial. Otro mecanismo de infeccin es
por heridas, que se presenta en algunas simbiosis,
como en rhizobio-mani y en el caso de Frankia-no leguminosas.
medio
1. testigo sin inocular para evidenciar la presencia y eficiencia de cepas nativas (T)
N alto
La coleccin y seleccin de cepas de rhizobio puede resultar intil si las leguminosas nodulan eficientemente con
poblaciones nativas, situacin frecuentemente encontrada en leguminosas tropicales, que nodulan con el mismo
tipo de rhizobio o si el suelo contiene alto nivel de nitrgeno combinado. Se emplea un ensayo simple de campo en
parcelas con 3 tratamientos, para determinar la necesidad de inoculacin:
Fijacin de N2, varios das despus la bacteria dentro de las clulas hospedantes en ndulos efectivos
comienzan a fijar nitrgeno y excretan amonio en el
citosol de las clulas de la planta donde puede ser
asimilado por accin de la glutamato deshidrogenasa (GDH) y por accin de la glutamino sintetasa
(GS) o de la glutamino-2-oxiglutarato-amino-transferasa (GOGAT). Esta segunda ruta es empleada ms
frecuentemente.
El costo exacto en la simbiosis con leguminosas en trminos de ATP empleado es motivo de polmica. Desde
que la transferencia de cada electrn de los 8 involucrados en la reaccin requiere la hidrlisis de 2 ATP, signifi-
genes de la nodulacin, genotipo especficos, juegan un importante rol. Por ejemplo el genotipo arveja,
Pisium sativum bv Afghanistan es nodulada por cepas
de Rhizobium TOM pero no lo es por cepas europeas
de rhizobio. Los genes que permiten a las cepas TOM a
nodular arveja Afghanistan se han localizado en el plsmido simbitico.
induccin de genes de la nodulacin por flavonoides e isoflavonoides, seales de la planta que inducen los genes nod han sido mostradas como necesarias para la induccin de los genes de la nodulacin. Un hecho interesante es que los rhizobios de
amplio rango de huspedes, responden a un amplia
gama de compuestos y aquellos con estrecho rango
aceptan solamente un limitado nmero de flavonoides. Pico moles (pmol = 10-12 moles) de estos compuestos pueden inducir la expresin de los genes nod
de rhizobio.
Genes de la nodulacin
Las secuencias de ADN bacteriano que se requieren para
la formacin de ndulos fijadores de N2 en races o tallos
se refieren como genes nod. Ms de 30 genes nod han
sido identificados y secuenciados, ms que las letras del
alfabeto (nod A, nod Z) los futuros loci de nodulacin son
referidos como genes nol (nodulacin loci).
266
Lillian Frioni
Rhizobium, los genes nod estn localizados en plsmidos (tambin llamados plsmidos simbiticos o
sym)
lizan en el cromosoma
Tres tipos de loci de nodulacin han sido identificados en
varios rhizobios:
genes
nod comunes
genes nod especficos para el husped (hsn)
genes nod genotipo especficos (GSN)
Los genes nod comunes son funcionalmente similares
entre especies de rhizobios. Incluyen nod ABC y son
necesarios para la iniciacin y formacin del ndulo
(cuadro 7).
Los genes nod D estn estrechamente ligados a los genes nod comunes. Poseen una funcin regulatoria, sus
productos interactan con seales moleculares vegetales
(flavonoides e isoflavonoides) y activan la transcripcin
de otros genes nod inducibles. Los genes nod ABC codifican protenas que determinan factores extracelulares que
causan deformacin de los pelos y divisin de clulas corticales de la raz.
hsn (host specific nodulation) son los loci requeridos para nodulacin de una planta especfica en diferentes gneros de leguminosas. Cuando un locus
de nodulacin de un organismo donador es transferido a una cepa recipiente apropiada, la inhabilita a
nodular la planta husped del donador, el gen es
considerado hsn.
GSN (genotype-specific nodulation) se refieren a genes que permiten la nodulacin de genotipos especficos de plantas dentro de una especie de leguminosa
dada.
A pesar de que muchos de los mismos genes de nodulacin han sido encontrados en especies de Rhizobium y
En B. japonicum los genes de nodulacin no se localizan en plsmidos sino que se distribuyen en el cromosoma.
En el caso de rhizobios de crecimiento rpido las sustancias que inducen los genes nod (molculas seal
derivadas de las plantas) pertenecen a la clase conocida como flavonoles, flavonas y flavanonas. En B. japonicum las principales sustancias inductoras son isoflavonas.
Factores biolgicos
Se han aislado de la rizosfera o del rizoplano cierto nmero de bacterias, hongos y sobre todo actinomicetes, que
se muestran antagnicos frente al rhizobio in vitro. Este
antagonismo puede deberse a competencia por los nutrientes, acidificacin, produccin de antibiticos u otras
sustancias, y aun a la predacin por protozoos o a la infeccin por fagos lticos.
Los
camente involucrados en la FBN, pero no se correlacionan con los de K.pneumoniae. Esta fue la primera
bacteria fijadora de N2 estudiada en detalle, por la
adaptacin de tcnicas empleadas primeramente en
E.coli.
Los productos de los genes nif A y nif L controlan el opern de todos los otros genes nif.
Genes fix junto a otros genes involucrados en la FBN
son referidos colectivamente como genes sym, que incluyen a los necesarios para las interacciones iniciales
con la planta (reconocimiento, encurvamiento, formacin cordn de infeccin) y la formacin y mantenimiento de los ndulos radicales o de tallos (nod, nol, GSN
y hsn). Adems otro conjunto de genes bacterianos
estn involucrados en la biosntesis de la parte hemo
de la nodulina leghemoglobina, necesaria para la
proteccin del O2.
275
nosarum bv trifolii y S. meliloti en suelo estril y no estril. Se observa que estas bacterias mantienen alta densidad en suelo estril y declinan lentamente en suelo no
estril, debido a interacciones biolgicas. La seleccin
de cepas buenas competidoras en los suelos donde va
a ser empleada, es un requisito importante cuando se
desea xito en la colonizacin temprana de races de
plntulas inoculadas.
log10 N/g suelo
9.0
estril
no estril
8.0
7.0
R. leguminosarum bv trifolii
9.0
8.0
S. meliloti
7.0
1
14
21
28
35
42 das
274
Lillian Frioni
Productos de la fotosntesis
El amonio es asimilado inmediatamente, pero el nitrato
requiere un perodo de tiempo antes de ser asimilado,
coincidente con su reduccin por nitrato reductasas. El
exceso de amonio, o de glutamina, reprime la produccin y actividad de la nitrogenasa. Con alta disponibildiad de N en la parte area se disminuye el nivel de
fotosintetizados que llegan al ndulo. Sesbania rostrata
es una leguminosa que produce ndulos en races y
tallos, present marcada inhibicin de los ndulos radicales por la presencia de nitrato de amonio, pero los ndulos del tallo no fueron afectados y redujeron activamente el acetileno. Esta planta posee una alternativa para
evitar la inhibicin de la nodulacin radical y se ampla
el conocimiento sobre especies de leguminosas y de
plantas actinorrticas (simbiosis con Frankia) que pueden formar ndulos en tallos.
Interesa en muchos casos complementar el aporte de N
por FBN con una fertilizacin con N combinado. Es necesario analizar el perodo de mayor fijacin a los efectos de
incorporarlo antes o despus (evaluacin actividades de
nitrogenasa y nitratoreductasa). La inhibicin por nitratos
es afectada por la combinacin rhizobio-leguminosa. El
empleo de mutantes nitrato-reductasa negativas, incapaces de reducir nitratos, ofrecen la alternativa de seguir
fijando N2 en presencia de N-NO3-
Polucin
El uso indiscriminado de herbicidas, fungicidas, la acumulacin de sales de metales pesados en suelos y aguas
resulta perjudicial para el rhizobio. Se han descrito diversas tcnicas de incorporacin de biocidas a las semillas
evitando su ntimo contacto con la bacteria. A pesar de la
multiplicidad de resultados obtenidos, se piensa que los
pesticidas aplicados en dosis aconsejadas no perjudican
al rhizobio.
Gen Concepto
Funcin
hac
encurvamiento
Encurvamiento de pelos
capilares
nod
nodulacin
Eventos en desarrollo de
ndulos
hsn
especficos del,
hospedante
efn
eficiencia de la nodulacin
ndv
desarrollo ndulo
Regulacin de infeccin y
liberacin de bacteroides
nif
fijacin de N2
Involucrados en FBN
homogos a los
de Klebsiella
fix
fijacin
Genes adicionales involucrados en la FBN en estado simbitico (sin homologa con los genes nif de
Klebsiella)
dct
transporte c. di carboxlicos
Transporte de c. di
COOH- como sustratos
para la FBN en bacteroides
267
Estructura nodular
Se cree que la formacin de los ndulos est controlada por fitohormonas: citoquininas, auxinas, giberelinas, producidas no slo por los rhizobios, sino tambin por el husped frente al estmulo de la bacteria.
Estas sustancias inducen repetidas divisiones celulares de clulas poliploides. El cido abssico exgeno
ejerce una inhibicin especfica y detiene la iniciacin
nodular.
268
Lillian Frioni
En el futuro desarrollo del ndulo ocurren drsticos cambios anatmicos y citolgicos en clulas de la corteza. Pequeas clulas meristemticas se convierten en grandes
clulas con bacteroides. Su rpida senescencia una vez
cumplida la funcin de fijacin del N2 est tambin relacionada con cambios en el balance hormonal. Los ndulos de leguminosas y los tumores de agallas de corona
estn inducidos por bacterias estrechamente relacionadas: Rhizobium o Bradhyrhizobium y Agrobacterium, y en
ambos casos se reconoce la induccin hormonal: en ndulos posiblemente por auxinas y citoquininas, liberadas
por los rhizobios, en las agallas, por hormonas que producen heridas.
Raz
273
El cobalto (Co), hierro (Fe) y magnesio (Mg) son importantes en el funcionamiento de la nitrogenasa y para la
planta, por lo que los requerimientos en leguminosas noduladas se incrementan.
El nitrgeno combinado afecta el desarrollo de los ndulos y la fijacin del N2. Es bien conocida la inhibicin de
la nodulacin por los iones nitrato o amonio, aunque las
leguminosas difieren en la susceptibilidad a estos compuestos. Se citan numerosas experiencias en la bibliografa sobre los niveles mnimos de iones amonio que no inhiben a la nitrogenasa; en general, 40 mg/kg de N-NH4+
son tolerados, pero cantidades superiores a 100 mg/kg
inhiben la fijacin en la rizosfera, efecto que ha sido relacionado con inhibicin en la produccin de fitohormonas
cerca del sitio de infeccin.
El crecimiento de los ndulos es ms sensible al exceso
de N que la nitrogenasa y ambos son ms sensibles que
la infeccin y los eventos iniciales de la nodulacin. La
figura 7 muestra la sensibilidad al nitrato de amonio de
algunas cepas de R. leguminosarum y la importancia de
la seleccin de cepas que mantengan la fijacin del N2 en
presencia de N-combinado.
mgN fijado/planta
50
40
30
V19
20
V200
10
V32
0
2,5
5,0
7,5
10,0
mg N-NH4NO3/planta
Un exceso de nitratos disminuye la deformacin de pelos capilares, la adhersin a sus paredes, el nmero de
272
Lillian Frioni
0
0,5
2
6
0
0,5
2
6
rhizobio/g suelo
inoculados
ndulos/
planta
N%
3,5. 104
20,2
19,0
22,7
67,8
23,1
23,4
30,0
56,8
1,4
1,3
2,0
3,5
2,5
2,4
3,2
3,0
Salinidad
Los suelos se clasifican en salinos si su conductividad elctrica es mayor que 4dS/m. Contienen adems de sodio,
un pH desfavorable, un desbalance de iones esenciales
(P, Fe, Zn, Mn, Bo), una estructura y textura alterada que
reduce la aireacin y la retencin de agua.
La tolerancia de los rhizobios a las sales vara mucho y de
hecho las leguminosas y las plantas actinorrticas son ms
sensibles a la salinidad que la mayora de las bacterias.
Los hongos ectomicorrcicos pueden incrementar la resistencia a la salinidad de leguminosas noduladas.
269
Las relaciones entre la bacteria, el husped y su ambiente pueden afectar a la fijacin del N2. Usualmente, la restriccin en el nmero de ndulos es compensada por un
mayor tamao de los mismos. Para evaluar tempranamente la fijacin se tiene ms en cuenta la masa de tejido
nodular, que su nmero.
El cuadro 8 presenta algunas de las caractersticas de
los ndulos efectivos y de los inefectivos (que no fijan
cantidades detectables de N2). Entre ambos grupos
existen varios grados de efectividad.
Ndulos areos
La interaccin rhizobio-leguminosa se da tambin en
ciertas plantas a nivel de los tallos (nodulacin area
Ndulos inefectivos
pocos y situados
sobretodo en la
raz primaria
numerosos y repartidos
en todo el sistema
radical
voluminosos de
superficie lisa o rugosa
actividad meristemtica
y nodular corta
infeccin generalizada,
zona bacteriana grande,
con bacteroides
no pigmentados de rojo
Las bacterias simbiticas que nodulan tallos de Aeschynomene son Bradyrhizobium, fijadoras al estado
libre in-vitro, como Azorhizobium, algunos son adems fotosintticos con pigmentos como la bacterioclorofila, carotenoids y fotocromos. En la isla de La
Reunin y en Mxico, casuarinas localizadas en lugares de mucha lluvia, presentan en sus troncos protuberancias con ndulos (figura 6 ) (Duhoux y Nicole, 2004).
270
Lillian Frioni
provee una fuente de poder reductor que puede resultar metablicamente til, por ejemplo en la regeneracin de ATP.
la oxidacin del H
H2X
el H
Experimentalmente se determina:
la leghemoglobina en leguminosas o hemoglobina en
la respiracin de los bacteroides contribuye a la remocin del O2 (6 veces ms alta que en ndulos inefectivos)
nasa al eliminar el H2
Los problemas de la competencia de la cepa del inoculante con rhizobios nativos es motivo de estudios a nivel
gentico y caracteres que favorecen la colonizacin como:
movilidad, produccin de antibiticos, caractersticas de
superficie para la adhesin, velocidad de nodulacin, se
estn identificando e introduciendo en cepas altamente
fijadoras. El empleo de un par rhizobio-leguminosa con
infectividad suficientemente restringida para prevenir la
nodulacin por la poblacin indgena ser una muy buena
solucin, independizando al inoculante del nivel de rhizobios del suelo.
271
Fisico-qumicos
pH
Este factor afecta distintas etapas de la simbiosis:
La bacteria es muy sensible a la acidez, aunque diferentes cepas de una misma especie difieren marcadamente
por su sensibilidad al pH. El encalado permite incrementos en la nodulacin. Se seleccionan rhizobios por su resistencia a pH cidos (pH 4,5).
Las leguminosas se afectan directamente por accin de
altas concentraciones de H+, o bien indirectamente por
deficiencias (Ca, Mg) o toxicidad (Al, Mn). La FBN puede
ocurrir a pH menores que los necesarios para la persistencia de la bacteria y la infeccin.
El encurvamiento de pelos capilares de Medicago sativa
por S. meliloti se detuvo a pH 4,5 pero ocurri cuando ste
se elev a 5,5. La iniciacin de los ndulos y del cordn de
infeccin son sensibles a la acidez algunas horas luego de
que el encurvamiento se ha completado. Los niveles crticos de pH para la nodulacin varan con las especies y aun
dentro de estas, sitandose entre pH 3,5 y 5,5, con mayor
tolerancia en especies tropicales, como el caupi, productora de granos y estilosante, forrajera. La leguminosa puede
aumentar el pH de su rizosfera, favoreciendo al rhizobio y
la nodulacin. La inoculacin con altas dosis de rhizobios
facilita la infeccin y la nodulacin.
El encalado es el mtodo ms empleado para mejorar
estos suelos. En Brasil se lograron grandes aumentos en
los rendimientos por el encalado y la inoculacin de leguminosa. El cuadro 9 muestra este efecto y la inoculacin
con R. leguminosarum bv phaseoli en poroto en suelos
altamente cidos de Colombia.
Temperatura y humedad
Los rhizobios son organismos mesfilos pero estn sin
embargo, distribuidos en todas las regiones del mundo.
Difieren marcadamente en su tolerancia a elevadas temperaturas. En general, S. meliloti es la especie ms tole-
270
Lillian Frioni
provee una fuente de poder reductor que puede resultar metablicamente til, por ejemplo en la regeneracin de ATP.
la oxidacin del H
H2X
el H
Experimentalmente se determina:
la leghemoglobina en leguminosas o hemoglobina en
la respiracin de los bacteroides contribuye a la remocin del O2 (6 veces ms alta que en ndulos inefectivos)
nasa al eliminar el H2
Los problemas de la competencia de la cepa del inoculante con rhizobios nativos es motivo de estudios a nivel
gentico y caracteres que favorecen la colonizacin como:
movilidad, produccin de antibiticos, caractersticas de
superficie para la adhesin, velocidad de nodulacin, se
estn identificando e introduciendo en cepas altamente
fijadoras. El empleo de un par rhizobio-leguminosa con
infectividad suficientemente restringida para prevenir la
nodulacin por la poblacin indgena ser una muy buena
solucin, independizando al inoculante del nivel de rhizobios del suelo.
271
Fisico-qumicos
pH
Este factor afecta distintas etapas de la simbiosis:
La bacteria es muy sensible a la acidez, aunque diferentes cepas de una misma especie difieren marcadamente
por su sensibilidad al pH. El encalado permite incrementos en la nodulacin. Se seleccionan rhizobios por su resistencia a pH cidos (pH 4,5).
Las leguminosas se afectan directamente por accin de
altas concentraciones de H+, o bien indirectamente por
deficiencias (Ca, Mg) o toxicidad (Al, Mn). La FBN puede
ocurrir a pH menores que los necesarios para la persistencia de la bacteria y la infeccin.
El encurvamiento de pelos capilares de Medicago sativa
por S. meliloti se detuvo a pH 4,5 pero ocurri cuando ste
se elev a 5,5. La iniciacin de los ndulos y del cordn de
infeccin son sensibles a la acidez algunas horas luego de
que el encurvamiento se ha completado. Los niveles crticos de pH para la nodulacin varan con las especies y aun
dentro de estas, sitandose entre pH 3,5 y 5,5, con mayor
tolerancia en especies tropicales, como el caupi, productora de granos y estilosante, forrajera. La leguminosa puede
aumentar el pH de su rizosfera, favoreciendo al rhizobio y
la nodulacin. La inoculacin con altas dosis de rhizobios
facilita la infeccin y la nodulacin.
El encalado es el mtodo ms empleado para mejorar
estos suelos. En Brasil se lograron grandes aumentos en
los rendimientos por el encalado y la inoculacin de leguminosa. El cuadro 9 muestra este efecto y la inoculacin
con R. leguminosarum bv phaseoli en poroto en suelos
altamente cidos de Colombia.
Temperatura y humedad
Los rhizobios son organismos mesfilos pero estn sin
embargo, distribuidos en todas las regiones del mundo.
Difieren marcadamente en su tolerancia a elevadas temperaturas. En general, S. meliloti es la especie ms tole-
272
Lillian Frioni
0
0,5
2
6
0
0,5
2
6
rhizobio/g suelo
inoculados
ndulos/
planta
N%
3,5. 104
20,2
19,0
22,7
67,8
23,1
23,4
30,0
56,8
1,4
1,3
2,0
3,5
2,5
2,4
3,2
3,0
Salinidad
Los suelos se clasifican en salinos si su conductividad elctrica es mayor que 4dS/m. Contienen adems de sodio,
un pH desfavorable, un desbalance de iones esenciales
(P, Fe, Zn, Mn, Bo), una estructura y textura alterada que
reduce la aireacin y la retencin de agua.
La tolerancia de los rhizobios a las sales vara mucho y de
hecho las leguminosas y las plantas actinorrticas son ms
sensibles a la salinidad que la mayora de las bacterias.
Los hongos ectomicorrcicos pueden incrementar la resistencia a la salinidad de leguminosas noduladas.
269
Las relaciones entre la bacteria, el husped y su ambiente pueden afectar a la fijacin del N2. Usualmente, la restriccin en el nmero de ndulos es compensada por un
mayor tamao de los mismos. Para evaluar tempranamente la fijacin se tiene ms en cuenta la masa de tejido
nodular, que su nmero.
El cuadro 8 presenta algunas de las caractersticas de
los ndulos efectivos y de los inefectivos (que no fijan
cantidades detectables de N2). Entre ambos grupos
existen varios grados de efectividad.
Ndulos areos
La interaccin rhizobio-leguminosa se da tambin en
ciertas plantas a nivel de los tallos (nodulacin area
Ndulos inefectivos
pocos y situados
sobretodo en la
raz primaria
numerosos y repartidos
en todo el sistema
radical
voluminosos de
superficie lisa o rugosa
actividad meristemtica
y nodular corta
infeccin generalizada,
zona bacteriana grande,
con bacteroides
no pigmentados de rojo
Las bacterias simbiticas que nodulan tallos de Aeschynomene son Bradyrhizobium, fijadoras al estado
libre in-vitro, como Azorhizobium, algunos son adems fotosintticos con pigmentos como la bacterioclorofila, carotenoids y fotocromos. En la isla de La
Reunin y en Mxico, casuarinas localizadas en lugares de mucha lluvia, presentan en sus troncos protuberancias con ndulos (figura 6 ) (Duhoux y Nicole, 2004).
268
Lillian Frioni
En el futuro desarrollo del ndulo ocurren drsticos cambios anatmicos y citolgicos en clulas de la corteza. Pequeas clulas meristemticas se convierten en grandes
clulas con bacteroides. Su rpida senescencia una vez
cumplida la funcin de fijacin del N2 est tambin relacionada con cambios en el balance hormonal. Los ndulos de leguminosas y los tumores de agallas de corona
estn inducidos por bacterias estrechamente relacionadas: Rhizobium o Bradhyrhizobium y Agrobacterium, y en
ambos casos se reconoce la induccin hormonal: en ndulos posiblemente por auxinas y citoquininas, liberadas
por los rhizobios, en las agallas, por hormonas que producen heridas.
Raz
273
El cobalto (Co), hierro (Fe) y magnesio (Mg) son importantes en el funcionamiento de la nitrogenasa y para la
planta, por lo que los requerimientos en leguminosas noduladas se incrementan.
El nitrgeno combinado afecta el desarrollo de los ndulos y la fijacin del N2. Es bien conocida la inhibicin de
la nodulacin por los iones nitrato o amonio, aunque las
leguminosas difieren en la susceptibilidad a estos compuestos. Se citan numerosas experiencias en la bibliografa sobre los niveles mnimos de iones amonio que no inhiben a la nitrogenasa; en general, 40 mg/kg de N-NH4+
son tolerados, pero cantidades superiores a 100 mg/kg
inhiben la fijacin en la rizosfera, efecto que ha sido relacionado con inhibicin en la produccin de fitohormonas
cerca del sitio de infeccin.
El crecimiento de los ndulos es ms sensible al exceso
de N que la nitrogenasa y ambos son ms sensibles que
la infeccin y los eventos iniciales de la nodulacin. La
figura 7 muestra la sensibilidad al nitrato de amonio de
algunas cepas de R. leguminosarum y la importancia de
la seleccin de cepas que mantengan la fijacin del N2 en
presencia de N-combinado.
mgN fijado/planta
50
40
30
V19
20
V200
10
V32
0
2,5
5,0
7,5
10,0
mg N-NH4NO3/planta
Un exceso de nitratos disminuye la deformacin de pelos capilares, la adhersin a sus paredes, el nmero de
274
Lillian Frioni
Productos de la fotosntesis
El amonio es asimilado inmediatamente, pero el nitrato
requiere un perodo de tiempo antes de ser asimilado,
coincidente con su reduccin por nitrato reductasas. El
exceso de amonio, o de glutamina, reprime la produccin y actividad de la nitrogenasa. Con alta disponibildiad de N en la parte area se disminuye el nivel de
fotosintetizados que llegan al ndulo. Sesbania rostrata
es una leguminosa que produce ndulos en races y
tallos, present marcada inhibicin de los ndulos radicales por la presencia de nitrato de amonio, pero los ndulos del tallo no fueron afectados y redujeron activamente el acetileno. Esta planta posee una alternativa para
evitar la inhibicin de la nodulacin radical y se ampla
el conocimiento sobre especies de leguminosas y de
plantas actinorrticas (simbiosis con Frankia) que pueden formar ndulos en tallos.
Interesa en muchos casos complementar el aporte de N
por FBN con una fertilizacin con N combinado. Es necesario analizar el perodo de mayor fijacin a los efectos de
incorporarlo antes o despus (evaluacin actividades de
nitrogenasa y nitratoreductasa). La inhibicin por nitratos
es afectada por la combinacin rhizobio-leguminosa. El
empleo de mutantes nitrato-reductasa negativas, incapaces de reducir nitratos, ofrecen la alternativa de seguir
fijando N2 en presencia de N-NO3-
Polucin
El uso indiscriminado de herbicidas, fungicidas, la acumulacin de sales de metales pesados en suelos y aguas
resulta perjudicial para el rhizobio. Se han descrito diversas tcnicas de incorporacin de biocidas a las semillas
evitando su ntimo contacto con la bacteria. A pesar de la
multiplicidad de resultados obtenidos, se piensa que los
pesticidas aplicados en dosis aconsejadas no perjudican
al rhizobio.
Gen Concepto
Funcin
hac
encurvamiento
Encurvamiento de pelos
capilares
nod
nodulacin
Eventos en desarrollo de
ndulos
hsn
especficos del,
hospedante
efn
eficiencia de la nodulacin
ndv
desarrollo ndulo
Regulacin de infeccin y
liberacin de bacteroides
nif
fijacin de N2
Involucrados en FBN
homogos a los
de Klebsiella
fix
fijacin
Genes adicionales involucrados en la FBN en estado simbitico (sin homologa con los genes nif de
Klebsiella)
dct
transporte c. di carboxlicos
Transporte de c. di
COOH- como sustratos
para la FBN en bacteroides
267
Estructura nodular
Se cree que la formacin de los ndulos est controlada por fitohormonas: citoquininas, auxinas, giberelinas, producidas no slo por los rhizobios, sino tambin por el husped frente al estmulo de la bacteria.
Estas sustancias inducen repetidas divisiones celulares de clulas poliploides. El cido abssico exgeno
ejerce una inhibicin especfica y detiene la iniciacin
nodular.
266
Lillian Frioni
Rhizobium, los genes nod estn localizados en plsmidos (tambin llamados plsmidos simbiticos o
sym)
lizan en el cromosoma
Tres tipos de loci de nodulacin han sido identificados en
varios rhizobios:
genes
nod comunes
genes nod especficos para el husped (hsn)
genes nod genotipo especficos (GSN)
Los genes nod comunes son funcionalmente similares
entre especies de rhizobios. Incluyen nod ABC y son
necesarios para la iniciacin y formacin del ndulo
(cuadro 7).
Los genes nod D estn estrechamente ligados a los genes nod comunes. Poseen una funcin regulatoria, sus
productos interactan con seales moleculares vegetales
(flavonoides e isoflavonoides) y activan la transcripcin
de otros genes nod inducibles. Los genes nod ABC codifican protenas que determinan factores extracelulares que
causan deformacin de los pelos y divisin de clulas corticales de la raz.
hsn (host specific nodulation) son los loci requeridos para nodulacin de una planta especfica en diferentes gneros de leguminosas. Cuando un locus
de nodulacin de un organismo donador es transferido a una cepa recipiente apropiada, la inhabilita a
nodular la planta husped del donador, el gen es
considerado hsn.
GSN (genotype-specific nodulation) se refieren a genes que permiten la nodulacin de genotipos especficos de plantas dentro de una especie de leguminosa
dada.
A pesar de que muchos de los mismos genes de nodulacin han sido encontrados en especies de Rhizobium y
En B. japonicum los genes de nodulacin no se localizan en plsmidos sino que se distribuyen en el cromosoma.
En el caso de rhizobios de crecimiento rpido las sustancias que inducen los genes nod (molculas seal
derivadas de las plantas) pertenecen a la clase conocida como flavonoles, flavonas y flavanonas. En B. japonicum las principales sustancias inductoras son isoflavonas.
Factores biolgicos
Se han aislado de la rizosfera o del rizoplano cierto nmero de bacterias, hongos y sobre todo actinomicetes, que
se muestran antagnicos frente al rhizobio in vitro. Este
antagonismo puede deberse a competencia por los nutrientes, acidificacin, produccin de antibiticos u otras
sustancias, y aun a la predacin por protozoos o a la infeccin por fagos lticos.
Los
camente involucrados en la FBN, pero no se correlacionan con los de K.pneumoniae. Esta fue la primera
bacteria fijadora de N2 estudiada en detalle, por la
adaptacin de tcnicas empleadas primeramente en
E.coli.
Los productos de los genes nif A y nif L controlan el opern de todos los otros genes nif.
Genes fix junto a otros genes involucrados en la FBN
son referidos colectivamente como genes sym, que incluyen a los necesarios para las interacciones iniciales
con la planta (reconocimiento, encurvamiento, formacin cordn de infeccin) y la formacin y mantenimiento de los ndulos radicales o de tallos (nod, nol, GSN
y hsn). Adems otro conjunto de genes bacterianos
estn involucrados en la biosntesis de la parte hemo
de la nodulina leghemoglobina, necesaria para la
proteccin del O2.
275
nosarum bv trifolii y S. meliloti en suelo estril y no estril. Se observa que estas bacterias mantienen alta densidad en suelo estril y declinan lentamente en suelo no
estril, debido a interacciones biolgicas. La seleccin
de cepas buenas competidoras en los suelos donde va
a ser empleada, es un requisito importante cuando se
desea xito en la colonizacin temprana de races de
plntulas inoculadas.
log10 N/g suelo
9.0
estril
no estril
8.0
7.0
R. leguminosarum bv trifolii
9.0
8.0
S. meliloti
7.0
1
14
21
28
35
42 das
276
Lillian Frioni
ducir las leguminosas. Esta tcnica resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas, sobre todo
si son huspedes de alta especificidad (Trifolium, Medicago, Glycine), cuando la poblacin nativa es ineficiente
o cuando la deficiencia en nitrgeno limita el desarrollo
vegetal.
3. fertilizada con dosis ptmas de N inorgnico (N), puede ser incluso inoculada, donde se logra el mximo desarrollo
265
Ejemplos de resultados
La figura 9 presenta algunas de las respuestas posibles.
Tcnicas de inoculacin
Los testigos crecen pobremente y con ndulos inefectivos, mientras que los inoculados lo hacen bien y con
abundante nodulacin, indican buena respuesta a la inoculacin (caso B)
bajo
alto
medio
bajo
D
sin inocular
inoculado
alto N mineral
La membrana de la clula vegetal forma otro envoltorio para saparar los rhizobios de la planta: es la membrana peribacterial. Otro mecanismo de infeccin es
por heridas, que se presenta en algunas simbiosis,
como en rhizobio-mani y en el caso de Frankia-no leguminosas.
medio
1. testigo sin inocular para evidenciar la presencia y eficiencia de cepas nativas (T)
N alto
La coleccin y seleccin de cepas de rhizobio puede resultar intil si las leguminosas nodulan eficientemente con
poblaciones nativas, situacin frecuentemente encontrada en leguminosas tropicales, que nodulan con el mismo
tipo de rhizobio o si el suelo contiene alto nivel de nitrgeno combinado. Se emplea un ensayo simple de campo en
parcelas con 3 tratamientos, para determinar la necesidad de inoculacin:
Fijacin de N2, varios das despus la bacteria dentro de las clulas hospedantes en ndulos efectivos
comienzan a fijar nitrgeno y excretan amonio en el
citosol de las clulas de la planta donde puede ser
asimilado por accin de la glutamato deshidrogenasa (GDH) y por accin de la glutamino sintetasa
(GS) o de la glutamino-2-oxiglutarato-amino-transferasa (GOGAT). Esta segunda ruta es empleada ms
frecuentemente.
El costo exacto en la simbiosis con leguminosas en trminos de ATP empleado es motivo de polmica. Desde
que la transferencia de cada electrn de los 8 involucrados en la reaccin requiere la hidrlisis de 2 ATP, signifi-
genes de la nodulacin, genotipo especficos, juegan un importante rol. Por ejemplo el genotipo arveja,
Pisium sativum bv Afghanistan es nodulada por cepas
de Rhizobium TOM pero no lo es por cepas europeas
de rhizobio. Los genes que permiten a las cepas TOM a
nodular arveja Afghanistan se han localizado en el plsmido simbitico.
induccin de genes de la nodulacin por flavonoides e isoflavonoides, seales de la planta que inducen los genes nod han sido mostradas como necesarias para la induccin de los genes de la nodulacin. Un hecho interesante es que los rhizobios de
amplio rango de huspedes, responden a un amplia
gama de compuestos y aquellos con estrecho rango
aceptan solamente un limitado nmero de flavonoides. Pico moles (pmol = 10-12 moles) de estos compuestos pueden inducir la expresin de los genes nod
de rhizobio.
Genes de la nodulacin
Las secuencias de ADN bacteriano que se requieren para
la formacin de ndulos fijadores de N2 en races o tallos
se refieren como genes nod. Ms de 30 genes nod han
sido identificados y secuenciados, ms que las letras del
alfabeto (nod A, nod Z) los futuros loci de nodulacin son
referidos como genes nol (nodulacin loci).
264
Lillian Frioni
Figura 4 Etapas tempranas en la nodulacin en alfalfa: a) pelo absorbente no inoculado, n=ncleo, v=vacuola),
b) encurvamiento del pelo, 8 horas luego de la inoculacin, la flecha grande muestra masa de bacterias en el bucle,
c) raz luego de 11 horas de la inoculacin, con cordn de infeccin,
d) raz colonizada luego de 5 das de la inoculacin con un ndulo en formacin.
Encurvamiento de los pelos y marcada deformacin de los mismos, constituyen los primeros pasos
de la infeccin. El pelo se encurva y encierra al rhizobio
adherido. El fenotipo se designa como Hac+. Rhizobios
heterlogos son incapaces de inducir encurvamiento de
los pelos. La produccin de sustancias con caracter de
fitohormonas como el AIA, debilitara las paredes de
los pelos, facilitando la deformacin que precede a la
277
Respuesta a la inoculacin
poblacin nativa de rhizobios es escasa o nula o
ineficiente, se obtienen en esta situacin muy buenos resultados. Esto ocurre con el cultivo de soja en suelos sin
278
Lillian Frioni
empleo de inoculantes a base de turba que aseguran buena sobrevivencia en la semilla hasta la germinacin. La esterilidad de la turba permite extender los
plazos de vencimiento (cuadro 11). Las formas pildorizadas que emplean adhesivos como goma arbiga o
derivados celulsicos, para lograr mayor contacto con
la semilla, que se recubre con carbonato de calcio y
fosfato de roca, mejoran la inoculacin.
biocidas y fertilizantes: asegurarse que las semillas no hayan sido tratadas con sustancias txicos y
fertilizantes y que los recipientes empleados en la inoculacin estn libres de aceites, petrleo, metales pesados, etc.
Peso cajas
kg/ha
Grano
N%
kgN/ha
testigo
urea
70kgN/ha
M-4
M-13
M-10
2.115b
3.590a
1.379b
2.342a
4,77
4.34
65.76b
101,64a
2.853a
2.679a
2.673a
1.822a
1.500ab
1.560ab
4,74
4,61
4.62
86,36a
69,56a
72,07a
Requerimientos
Observaciones
Especificidad variable
Especificidad variable
Entrada de la bacteria
Cordn de infeccin
Formacin de ndulos
Formacin bacteroides,
sntesis N2asa y leghemo
globina
Intercambio de metabolitos
(HdeC, N-org)
Fases
Cultivo
4 semanas
A
B
C
26 semanas
A B C
R. leguminosarum
bv trifolii TA1
660
990
110
S. meliloti SU47
1500
1800
697
Bradyrhizobium
CB 756
1100
1200
16
25 190 1,0
A= esterilizacin en autoclave
B= esterilizacin por rayos gama
C= turba no estril
79
263
2,8
tetizan lectinas con diferente afinidad por azcares. Estas sustancias se encuentran en semillas, races, hojas o
tallos y se piensa que cumplen varias funciones
Algunos autores comparan a estas molculas con los anticuerpos: los sitios a unir, en la bacteria y la planta, poseen afinidad por la misma molcula, llamada trifolina,
en trboles.
262
Lillian Frioni
La figura 3 (Dommergues et al., 1999) presenta un esquema que resume el dilogo molecular entre Sinorhizobium y alfalfa que se traduce en intercambio de seales
que permiten distinguir tres niveles de especificidad indicadas en el esquema por asteriscos.
El proceso comienza con la exudacin de sustancias inductores (flavonoides, betanas) por la raz. En su presencia, las protenas reguladoras sintetizadas por los genes
nodD de la bacteria son activadas e inducen los genes estructurales de la nodulacin. Estos incluyen los genes coAlfalfa
munes A, B y C, encontrados en todas las especies de Rhizobium y genes especficos a una especie de Rhizobium.
La expresin de genes estructurales conduce a la produccin de seales bacterianas constituidas por lipo-oligosacridos de glucosamina sulfatado, de PM 1.102, inducido por flavonoides; stos son los factores de nodulacin o factores Nod, que estimulan la curvatura de pelo y
la divisin de las clulas corticales.
Los sustituyentes qumicos en la molcula base son los
responsables en gran parte, de la especificidad hacia el
hospedante.
El cuadro 12 presenta valores sobre la fijacin en diferentes especies. La cantidad derivada del aire vara y representa en general un 50% del total en suelos frtiles, es mayor
en suelos deficientes y menor con fertilizacin nitrogenada.
En asociaciones con gramneas la proporcin derivada de
la fijacin puede llegar al 80 o 90% pues el cultivo asociado
toma la mayora del nitrgeno disponible en el suelo.
Forrajeras
Templadas
Medicago sativa (alfalfa)
Trifolium platense (trbol rojo)
Trifolim repens (trbol blanco)
legum.consociadas(pradera mixta)
125
Melilotus alba (trbol de olor, blanco)
104
Medicago polymorpha (trbol carretilla)
63
Trifolium subterraneum (trbol subterrneo)
24
Lotus corniculatus(cuernecillo)
27
Tropicales
Centrosema pubesens(centro)
112
Stylosanthes guianensis
115
Neonotonia wightii
160-450
Leguminosas de grano
templadas
Vicia
57-190
Phaseolus vulgaris (poroto)
46
Lupinus sp.. (lupino)
128
Tropicales
Vigna unguiculata
35 - 77
Glycine max (soja)
17-124
Arachis hipogea (mani)
33-117
Protena NodD
genes nod estructurales
precursores nod
proteina nod
grupo con:
acetil,
carbonil
H, acetato,
sulfato, fucosa,
metilfucosa,
sulfometilfucosa,
acetil-metilfucosa,
D-arabinosa
factores nod
Induccin de ndulos radicales
La cantidad de nitrgeno tomada por una leguminosa vara considerablemente con la especie, la efectividad de la
simbiosis, las condiciones del ambiente, del manejo, etc.
pastoreo animal
Se citan valores de N% en distintas partes de una leguminosa, evaluado en floracin o hacia el final de sta:
hojas (2,6-5,0); tallos (1,2-1,8), races (1,6-2,4), ndulos
(3,9-6,5), vainas (3,1-4,2) y en la planta entera en leguminosas tropicales (2,0-3,0).
Perspectivas
En el curso de esta simbiosis, el programa gentico de la
planta hospedera es considerablemente modificado y
muchos genes de la planta se expresan en los ndulos.
Sinorhizobium mililoti
nodD
279
H
carbonil
18C
16C
20C
H
glicerol
177
115
149
metil
El N de las leguminosas puede transferirse a otros cultivos en mayor o menor grado por las siguientes vas:
280
Lillian Frioni
seleccionar genotipos del husped por su mayor actividad reductora del acetileno en presencia de una mezcla comercial de cepas de rhizobio. Explorar especies
con ndulos en los tallos
transferir genes nif a mitocondrias o cloroplastos vegetales es otra de las aspiraciones de los genetistas.
Se piensa que los nif penetran en los vegetales frecuentemente por heridas o llevados por parsitos. El
problema radica en el mantenimiento de estos genes
y su funcionamiento dentro del organismo superior. Se
piensa tambin en su introduccin en microorganismos del rumen
La simbiosis rhizobio-Parasponia
Hasta no hace mucho tiempo se pensaba que los rhizobios formaban ndulos solamente con leguminosas. En
1973 se describi nodulacin en ciertas Ulmaceae, por
rhizobios. Son rboles muy altos, ampliamente distribui-
261
El tercer grupo est integrado por especies que son especficas en sus requerimientos, por lo que nodulan efectivamente con un pequeo rango de cepas: son especficas para la nodulacin y tambin para la efectividad.
Ejemplos: Leucaena leucocephala (CR), Gliricidia sepium
(CR), Calliandra calothyrsus (CR)
272 spp
48 spp
23 spp
201 spp (130 nativas,
71 adventicias y/o cultivadas)
Gneros con mayor nmero de especies
Adesmia Vicia Desmodium Lathyrus Galactia
Especificidad en la infectividad y en
la efectividad
Algunas cepas de Rhizobium o Frankia poseen un amplio
espectro de huspedes. Otras cepas poseen un pequeo
espectro y se les dice especficas. Este tema de la especificidad debe verse desde el punto de vista del micro y
del macrosimbionte. Basados en sus caractersticas de
especificidad para la nodulacin y la fijacin, se reconocen tres tipos de leguminosas:
El primer grupo est integrado por especies noduladas por amplio rango de cepas genticamente diversas
Nodulacin
La fijacin biolgica del N2 en los ndulos de leguminosas
es el resultado de complejas interacciones entre el husped y el endofito la instalacin de la simbiosis est controlada por un dialogo molecular entre ambos integrantes
(Kondorosi, 1991). La eficiencia es mxima en estos sistemas ya que existe:
1. proteccin de variables ambientales y la FBN puede funcionar bajo amplio rango de condiciones. As,
ndulos de soja, son relativamente insensibles a la temperatura sobre un rango de 15C, y pueden fijar N2 a
concentraciones externas de O2 entre 0,05 y 0,8 atm,
mientras que los bacteroides fijan N2 en rango ms
estrecho (10-6, 10-4 atm). La proteccin frente al O2 es
una de las principales ventajas de los sistemas simbiticos
300
Lillian Frioni
El endofito
Los hongos son no-tabicados, se los ubica entre los
Zygomycotina, del orden Glomales (familias Glomaceae,
Acaulosporaceae y Gigasporaceae) y Endogonales (familias Gigasporaceae y Endogonaceae) (cuadro 4). No
se les conoce estado sexual (Honrubia et al., 1994).
Como estos hongos no han logrado crecer en medios de
cultivo la taxonoma se basa en caractersticas de las esporas (figura 8), que se colectan de suelo rizosfrico por
tcnicas de tamizado hmedo y decantacin. El empleo de gradientes de sacarosa ayuda a separar las esporas de partculas inertes, huevos de insectos, etc. Se
emplean combinaciones de tcnicas (Anexo prctico). El
empleo de sondas moleculares ha permitido la identificacin del microsimbionte y ha contribuido mucho en los
estudios de inoculacin.
dos de races micorrizadas no ofrece las mismas garantas. La inoculacin con esporas desinfectadas mostr
que el rango de hospedantes para la mayora de los aislamientos estudiados es amplio, hecho que contradice
la incapacidad del hongo para desarrollarse fuera del
hospedante.
cordn de infeccin altamente ramificado y pocas bacterias se liberan de l y se diferencian en bacteroides. En las leguminosas, la mayora de los rhizobios se
transforman en bacteroides
los ndulos de Parasponia no poseen leghemoglobina, lo que muestra claramente que tanto la formacin
de bacteroides como la sntesis de leghemoglobina, estn determinados por el hospedante. La masa coraloide puede alcanzar tamaos de hasta 6 cm de dimetro
y se parecen ms a los ndulos actinorrticos de Coriaria o Datisca que a los de las leguminosas
Suelo
1
2
Glomus puede presentar esporocarpos o no con clamidosporas generalmente terminales en una hifa indiferenciada, las de Sclerocystis se ubican dentro de esporocarpos, en capa simple. Gigaspora posee azigosporas en
extremo de clula alargada en una hifa que se proyecta
hacia la espora y Acaulospora no forma esporocarpo y las
esporas estn ubicadas en hifas prximas a una vescula
de gran tamao.
Parasponia, como Casuarina y rboles leguminosos crecen rpidamente en suelos vrgenes del sudeste de Asia y
juegan importante papel en la reforestacin de suelos erosionados, donde son empleados desde muy antiguamente.
Con estas esporas es posible realizar ensayos de sntesis de endomicorrizas y probar la eficiencia de distintas
combinaciones planta-endofito. El empleo de macera-
281
bargo, muchas de ellas establecen asociaciones simbiticas variadas, con hongos, en los lquenes, con hepticas,
musgos, con el helecho acutico Azolla y una angiosperma, Gunnera.
Cycas
Las Cycadales son consideradas gimnospermas primitivas, reliquias de una flora tropical muy antigua: su origen
se ubica en los perodos Trisico, Jursico y Cretceo. Se
piensa que jugaron importante rol en el ciclo del nitrgeno
de esas pocas. De las 90 especies actuales (9 gneros),
slo algunas, como Macrozamia, se desarrollan en Australia a un nivel suficiente como para intervenir activamente
en el ciclo del nitrgeno. No han sido muy estudiadas y
muchos aspectos relativos al proceso de infeccin y a la
naturaleza de la especificidad hospedante-endofito, no han
sido aclarados.
Desarrollo y estructura de los ndulos: se parecen
superficialmente a los de no-leguminosas angiospermas,
pero su formacin y estructura varan. Se originan a partir de races especializadas, llamadas coraloides, que
presentan estructuras del tipo nodular an antes de ser
colonizadas por la cianobacteria, inducidas posiblemente por bacterias. Los ndulos se inician en la raz embrional y el hipoctilo y recin luego de su emergencia
son infectados por cianobacterias heterocsticas de los
gneros Nostoc y Anabaena, por rupturas de los estratos superficiales.
Las races coraloides se desarrollan en forma de grandes
racimos y pierden su caracterstico geotropismo negativo. Las races no infectadas permanecen pequeas y
mueren en el correr del ao. Todos los aislamientos mostraron capacidad para fijar N2.
En Argentina se describi nodulacin en ejemplares de
Cyca revoluta cultivada en parques y jardines. La fijacin
en cultivos de Cycas spp. y Macrozamia spp se realiza
tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. Los productos
de la fijacin son transportados al hospedante y se piensa
que gran parte es exudado por el endosimbionte, a diferencia de lo que ocurre con la cinobacterias en vida libre.
Las causas de mayor exudacin podran deberse a:
282
Lillian Frioni
299
Figura 10- La simbiosis Azolla-Anabaena. a) Morfologa de hojas de Azolla, b) Racimo de hojas de Azolla, c) Poros con Anabaena
luego de accin de pectinasas, d) Anabaena: h= heterocisto, c= clula vegetativa, e) heterocisto de Nostoc con gruesa pared de
varias capas (flecha) y la pared externa muscilaginosa, menos densa (*).
Estas asociaciones son las ms numerosas, las presentan la mayora de las fanergamas, de lo que se deduce
el enorme potencial econmico que puede derivarse de
un correcto manejo de ellas en suelos de baja fertilidad.
Los estudios se han incrementado mucho en los ltimos
aos y se trata de seleccionar las mejores combinaciones planta-hongo con el objeto de inocular cultivos de
inters. En las leguminosas se tienden a usar inoculantes dobles, con rhizobio y esporas del hongo endomicorrcico.
Hifas externas
Vesculas
Clamidospora
Hifas internas
Pelo radical
Arbsculo
Los hospedantes se encuentran distribuidos en las principales familias cultivadas, las gramneas y leguminosas.
Muy pocas de las familias examinadas carecen de endomicorrizas MA. Se piensa que Ericaceae, Orquidaceae y
ciertas familias tpicamente ectomicorrcicas como Pinaceae y Betulaceae, carecen de micorrizas arbusculares.
Esporocarpo
Clula epidrmica
Clula cortical
ficocianina
Azolla
La simbiosis Azolla-Anabaena es ecolgicamente la ms
importante, muy abundante en aguas calmas templadas
y tropicales. La cianobacteria se encuentra en poros ubicados en cara ventral de las hojas, que se cierran en hojas maduras. Se han contado hasta 2.000 a 5.000 clulas
de Anabaena azollae en una sola cavidad. La fijacin del
N2 tiene lugar en los heterocistos que representan entre
el 20 y 30% de clulas de la cianobacteria y estn rodeados de gruesas paredes (figura 10: a, b, c y d Franche et
al., 1998; e, Selosse, 1996). En el filamento ocurre fotosntesis y en los heterocistos, que carecen de fotosistema
II, se expresa la nitrogenasa.
Azolla se usa como biofertilizante en vastas regiones de
Asia, Africa, como abono verde. Se cultiva en estanques
y luego se libera con el agua que inunda el arroz. La inoculacin puede aumentar los rendimientos entre un 30 y
50%. La agricultura cada vez ms intensiva y la fertiliza-
Orden
Suborden
Familia
Gnero
Micorriza
Glomales
Glominae
Glomaceae
Glomus
Sclerocystis
A
A
Acaulosporaceae
Acaulospora
Entrophospora
A
A
Gigasporinae
Gigasporaceae
Gigaspora
Scutellospora
A
A
Endogonaceae
Endogone
Endogonales
A, EC
284
Lillian Frioni
Nodulacin
El ndulo es un rgano compuesto de unidades elementales llamadas lbulos nodulares, cada uno originado por invasin de frankia en races adventicias. En
funcin de variaciones del ambiente, se van formando
nuevos lbulos, lo que origina un ndulo muy grande,
de aspecto coraloide, que se va lignificando. Un ndulo
puede persistir durante 5 a 10 aos, en ese caso slo
los lbulos perifricos son activos
Cada lbulo es una raz modificada: su vascularizacin
es central y como las races adventicias o laterales, se
origina en el periciclo (figura 11) (Dommergues et al.,
1999)
Los lbulos son invadidos, en su corteza, por el microsimbionte Frankia, que penetra las clulas vegetales y
asegura la fijacin de N2
La figura 12 muestra ndulos jvenes de Casuarina y Allocasuarina y ndulos de varios aos donde se aprecia la
suberizacin (Duhoux y Nicole, 2004).
Formacin de los ndulos: el proceso ha sido ms
estudiado con Alnus glutinosa y pueden distinguirse 4
fases:
a. desarrollo del endofito en la rizosfera
b. invasin de pelos capilares
pe
NR
3
Prcticas de inoculacin
Se distinguen dos tipos de ndulos: los de tipo coraloide, como los de Alnus donde el meristema nodular cesa
su actividad una vez que el lbulo se form y los de
tipo Casuarina, Eleagnus, Myrica , en los cuales el meristema del lbulo contina con un desarrollo modificado que conduce a la formacin de una raz nodular con
geotropismo negativo, la cual puede a su vez ser colonizada.
pe
end
per
baja
o moderada fertilidad
en la inoculacin de plntulas. Las esporas son fciles de coleccionar a partir de esporocarpos maduros
de muchos Gasteromycetes que se colectan en el
terreno en la vecindad de rboles bien micorrizados
y se agregan a las macetas regando con un licuado
en agua
El reconocimiento del hongo y el hospedante apropiado es seguido por la colonizacin y la formacin del
manto fngico. El desarrollo del hongo en la rizosfera
del hospedante es estimulado por los exudados radicales.
La fertilidad del suelo y la actividad fotosinttica del
vegetal afectan marcadamente a la micorrizacin.
297
con cultivos puros, desde la dcada del 50 se comenz con xito a inocular con cultivos puros. Los suelos o
los soportes de plntulas se fumigan frecuentemente
para eliminar patgenos y la poblacin nativa, que puede competir con el inculo
Las esporas asexuadas desarrolladas en medios de cultivo son tambin un buen inculo, pero los cultivos con micelio se emplean mucho ltimamente ya que ofrecen mayores garantas.
Programas de inoculacin: comienzan con la seleccin
del hongo ectomicorrcico, la que puede realizarse simultneamente con un diazotrofo, en leguminosa o en noleguminosa fijadora de N2. Los ensayos para evaluar la
especificidad y eficiencia de la simbiosis se realizan en
plntulas creciendo en tubos con vermiculita/turba, arena, con solucin nutritiva. La inoculacin se puede realizar a partir de discos de agar con micelio activo. Los ensayos sontinan en invernculo, incluyendo suelo, niveles de fertilizacin, tipos de inculos, etc.
La introduccin de especies de Pisolithus en viveros ha
incrementado significativamente la calidad de plntulas
de pino. El cuadro 2 muestra un ejemplo de inoculacin
en suelos muy erosionados, cerca de minas de cobre, en
el sur de Estados Unidos, pobres en materia orgnica y
nutrientes minerales. Como se observa se presentan marcadas diferencias entre los hongos. Las ectomicorrizas
con Pisolithus incrementaron el crecimiento cerca del
100%, en ambas especies, en relacin a las formadas
por Thelephora, menos adaptado a las condiciones adversas del suelo.
En otras partes del mundo Pisolithus tinctorius responde
muy bien en la simbiosis, persiste en el suelo a pesar de la
competencia de los hongos ectomicorrcicos nativos. Ntese que no aparecen los testigos sin inocular ni fertilizar, ya
que los pinos son muy dependientes de los hongos y no se
298
Lillian Frioni
desarrollan en suelos pobres. Considerando la enorme extensin sembrada con especies forestales, se comprende
la importancia de lograr incrementar los rendimientos mediante una correcta seleccin de estos hongos.
altura
(cm)
dimetro
tallo (cm)
vol.plntula
(cm3)
52.3*
44.8
1.46*
1.15
111.5*
59.3
48.7*
41.3
1.29*
1.01
81.0*
42.1
peso seco
lignina
(mg)
(% de peso seco)
inoculado
no
inoculado
no
inoculado
inoculado
Efectos de la inoculacin: incrementos en tamao (altura, peso seco de las plantas), diferencias en la anatoma y
morfologa de los cultivos, han sido atribuidas a esta simbiosis, cambios en la relacin raz/parte area, estructura
de tejidos radicales, longitud de acculas, longevidad de
races cortas, incremento en el nmero de cloroplastos.
Algunas de estas variaciones se atribuyen al incremento
del aporte de nutrientes, pero otras son consecuencia de la
actividad del hongo o de fitohormonas que libera.
El cuadro 3 muestra ligeros aumentos en la lignificacin
de plantas de pino inoculadas (en experimentos con CO214)
y del tamao y peso del orden del 44%.
Resumiendo: se reconoce la importancia de estas asociaciones en el desarrollo de especies arbreas, sobre
todo en suelos de baja fertilidad. El endosimbionte moviliza nutrientes desde el suelo hacia el hospedante. La inoculacin con especies fngicas correctamente seleccionadas ofrece una interesante perspectiva en el manejo
de cultivos forestales en:
a. cultivos exticos
b. suelos degradados por la erosin, mineralizacin o por
construcciones civiles
283
770
265
91
108
305
354
125
56
44
282
30
35
29,5
-
28
30
24,5
-
Endomicorrizas
Se piensa, dada la abundancia de estas asociaciones, que
la presencia de hongos endomicorrcicos en races en condiciones naturales, es una constante, ms que una excepcin, Han sido reconocidas desde hace ms de 100
aos y se destaca su presencia en fsiles de ms de 300
millones de aos.
La mayora de las endomicorrizas poseen caractersticas
comunes: el hongo invade las races desde el suelo, lo que
implica que debe poseer mecanismos para sobrevivir en l
o poseer una existencia saproftica (figura 7). Dentro de la
raz, el hongo coloniza las clulas de la corteza, pero no las
de la endodermis y los vasos, los que no presentan cambios morfolgicos (Barea et al., 1991).
Se distinguen dos tipos de endomicorrizas:
las que albergan hongos no tabicados: Zygomycotina. Constituyen un grupo heterogneo, incluyen plan-
Gneros
Betulaceae
Alnus (aliso)
Casuarinaceae
Coriaceae
Coriaria
Datiscaceae
Datisca
Eleagnaceae
Myricaceae
Comptonia, Myrica
Rhamnaceae
Rosaceae
296
Lillian Frioni
patgenos, a toxinas, pH, temperatura y humedades adversas. La suberizacin de las races est limitada y se
alarga su vida til
El
hongo, por su parte, obtiene los nutrientes carbonados simples que requiere en las etapas iniciales y un
ambiente que lo protege de la intensa competencia microbiana
Fisiolgicamente, las asociaciones micorrcicas constituyen uno de los mejores ejemplos de parasitismo controlado. Los intercambios entre ambos componentes de esta
asociacin se estudian con elementos marcados:
14
32
CO2 en las plantas para seguir los compuestos orgnicos radioactivos en el manto fngico y en las hifas
P en compuestos orgnicos o minerales insolubles en
el suelo, que es transferido hacia la planta, por las hifas
del hongo. Las plantas micorrizadas se desarrollan mejor
en suelos deficientes en nutrientes como N, P, K.
la penetracin por el patgeno: en cortes de races micorrizadas y controles inoculadas por esporas de hongo patgeno, se aprecia la invasin slo en el caso de
races no micorrizadas
la
El proceso es muy parecido al que ocurre en leguminosas: los pelos radicales en contacto con el endofito se
encurvan y las hifas penetran avanzando hacia clulas
corticales que son estimuladas a dividirse (figura 13).
Las hifas penetran en las clulas en divisin, se ramifican y forman las clsicas vesculas en la periferia de
estos conglomerados. La infeccin progresa y se forma
el llamado ndulo primario, que se reconoce como una
deformacin de una raz lateral cuyo crecimiento se detiene. El ndulo verdadero se completa por surgimiento
de races laterales inducidas cerca de los ndulos primarios, que se transforman en lbulos nodulares por
infeccin persistente de su regin cortical. En los ndulos verdaderos, la penetracin de las clulas jvenes
de la corteza y la diferenciacin del endofito es esencialmente la misma que en los ndulos primarios.
En Casuarina y Myrica, el pice de cada lbulo nodular
da lugar a una raz pero con geotropismo negativo (figuras 11 y 12), debido a bajos niveles de cido indolactico,
lo que le da a los ndulos una apariencia muy particular.
En el campo, los ndulos pueden alcanzar dimetros de
ms de 8 cm y muchas veces resulta difcil obtenerlos,
pues se distribuyen a lo largo de un sistema radical muy
extenso, que en suelos pedregosos y compactados puede llegar a varios metros.
clulas de la corteza
colonizadas
polisacridos
pelo
capilar
hifa
endoftica
La regin apical (2-3 mm) de los lbulos del ndulo parecen constituir las partes ms activas en la fijacin del nitrgeno. All precisamente, los racimos de vesculas presentan la mayor actividad y reducen activamente las sales de tetrazolium. El aislamiento de las vesculas y la incorporacin de ATP y ditionito permiti comprobar que son
el sitio de la fijacin. Incluso los resultados de fijacin se
expresan por nmero de vesculas.
Usos: el empleo que se les da a estas plantas es variable:
muchas especies de Alnus pueden alcanzar 30-35 m en
50 aos con dimetros de 0,6 m y se emplean en muebles, postes, enchapados, y en la preparacin de pulpas para la elaboracin de tejidos
como alimento se usan poco: Hippophae da frutas ricas en vitamina C y en aceite y suele complementar la
dieta humana
vesculas
clula basal de
pelo capilar
hifa
infectiva
285
1a
1b
pero el empleo ms promisorio es sin duda el de la recuperacin de suelos erosionados, la fijacin de dunas y su inclusin en sistemas silvopastoriles ya
que brindan abrigo y sombra a los animales, adems
de brindar N fijado a la pastura asociada
286
Lillian Frioni
suelos pobres. Estos rboles son empleados en silvicultura, en planes de forestacin, en sistemas agroforestales, contribuyendo a incrementar el nivel de nitrgeno de
los mismos.
El cuadro 15 muestra el contenido de nitrgeno en hojas
de algunas de estas plantas. Los datos de N en los rastrojos no deben tomarse como todo el nitrgeno fijado, ya
que, dependiendo del nivel de N del suelo, una parte es
reciclada a partir del mismo.
N% en Mantillo N% Edad
N total
hojas ton/ha/ao
aos kgN/ha/ao
Alnus incana
A. crispa
A. rubra
A. glutinosa
Casuarina littoralis
C. equisetifolia
Ceanothus velutinus
Eleagnus orientalis
2,82
1,5
1,3
2,17
2,57
1,30
3,0
2,0
9,3
2,9
-
5
0-40
1,82
1,0
-
157
30
12
-
169
290
-
6,2
13,5
1,46
1,35
9
-
91
183
Numerosos estudios se han realizado a los efectos de lograr buena sobrevivencia de este organismo en inoculantes comerciales a emplear en los viveros. Los ensayos
incluyen soportes inertes como la vermiculita. Frankia result muy resistente al ser atrapada en bolitas de alginato, las que desecadas se conservan por largos perodos
de tiempo (Frioni et al., 1994)(Anexo prctico).
pre que se agregue algo de glucosa (induccin enzimtica). Se han detectado actividades de celulasas, hemicelulasas y amilasas pero, como grupo, estos hongos
son en general incapaces de descomponer mantillos u
otras formas de materia orgnica del suelo, y dependen
del hospedante para la provisin de compuestos carbonados simples.
Muchas experiencias se realizaron para determinar la distribucin de los endofitos y de sus respectivas plantas
hospedantes. Se encontraron:
Los ndulos de estas plantas fijan nitrgeno, como lo hacen otros sistemas fijadores, dependiendo su actividad de
la biomasa del tejido nodular, de la actividad de la nitrogenasa y del perodo en que permanecen activos. La respiracin y la actividad nitrogenasa de los ndulos declina
con los incrementos de la edad de los ndulos, como ocurre en general en ndulos perennes. De modo que, en
promedio, estos ndulos fijan menos que ndulos jvenes de leguminosas anuales.
El cuadro 16 (Gauthier et al., 1984) muestra la actividad
nitrogenasa de Colletia spinosissima, su contenido de N%,
el N total por planta y su peso seco en ensayo control e
inoculado en cultivo hidropnico.
Control
Inoculado
Peso seco
mg/planta
ARA
N%
N total
mMC2H4/
h/planta
56
113
0,8
1,5
0,45
1,69
0
0,68
295
Factores de crecimiento: muchos de estos hongos requieren ciertas vitaminas del complejo B, como tiamina y
biotina; otras especies prefieren inositol, cido nicotnico
y cido pantotnico.
Los hongos ectomicorrcicos producen auxinas, giberelinas, citoquininas y una variedad de vitaminas,
antibiticos, cidos grasos. Las sustancias de naturaleza auxnica reproducen caracteres de la micorrizacin al incorporarlas a races creciendo aspticamente: se forman races cortas y gruesas con ausencia de pelos y elongacin radial de clulas con corticales. La microflora rizosfrica puede brindar el triptofano para la sntesis del AIA (cido indol actico),
que induce estos cambios.
Si las races micorrizadas pierden al hongo asociado, las
caractersticas estructurales desaparecen y se transforman en races normales. El exceso de nitrgeno afecta a
la micorrizacin: puede provocar que las auxinas se conviertan en compuestos relacionados, pero sin actividad
promotora del crecimiento, e incluso inhibir su sntesis por
el hongo.
Los factores fsicos tambin afectan el desarrollo de
estos hongos. El ptimo del crecimiento se sita entre 18
y 27C, para muchos cesa sobre 35C y debajo de 5C.
Se consideran acidfilos, con pH ptimo entre 4 y 6, algunos crecen bien a pH 3,0. Son aerobios, por esto los cultivos para preparar inoculantes se agitan, y sensibles a la
falta de agua.
294
Lillian Frioni
ta directamente a la nodulacin y por lo tanto a la fijacin del N2. La inoculacin tendr efectos positivos cuando ese nmero es bajo
normalmente micorrcicos, con amplio rango de hospedantes, y con capacidad saproftica. La mayora de
los hongos que forman EM poseen escasa o nula habilidad para vivir libremente, pero poseen amplio rango
de hospedantes.
El nitrgeno combinado afecta negativamente a la fijacin por estos organismos, al igual que el proceso en
leguminosas. Se observaron, sin embargo, diferencias
entre la sensibilidad de especies vegetales frente al nitrgeno combinado; Alnus es bastante insensible y se
los puede encontrar nodulados en suelos relativamente
ricos en nitrgeno
Fuentes de carbono: muchas especies ectomicorrcicas obligadas han podido desarrollarse en cultivo puro,
con nutrientes relativamente simples, como glucosa y
otros azcares. Muchas no pueden emplear disacridos
y otras especies pueden degradar polisacridos siem-
La humedad, muchas especies actinorrticas que crecen en reas secas son afectadas por una sequa transitoria y la actividad nitrogenasa cesa en plantas sometidas a una succin de -25 barias en el xilema. En general ocurre un decaimiento masivo de ndulos en el verano. La inundacin, al limitar la difusin de los gases,
limita la actividad de los ndulos. Algunas especies
poseen estructuras en las extremidades de los ndulos
llamadas lenticelas, que facilitan la difusin del O2 a
travs del tejido nodular
La acidez: se piensa en general que las no-leguminosas son ms tolerantes a los bajos pH que las legumi-
287
288
Lillian Frioni
Resumen
293
un conjunto de filamentos miceliares que exploran el suelo para asegurar la nutricin mineral de la asociacin, relacionados a las fructificaciones fngicas o carpforos.
Endodermis
El cuadro 17 compara las simbiosis por rhizobio y por Frankia y la figura 14 esquematiza ambos tipos de ndulos.
Se aprecia la colonizacin central en las leguminosas y
perifrica en no-leguminosas.
Clulas corticales
Red de Hartig
(hifas intercelulares)
Perspectivas
Tejido vascular
Los hongos
El empleo de las plantas actinorrticas como pioneras en
suelos pobres o degradados es ya prctica comn en
muchos pases. Algunas especies se pastorean, como
jvenes ejemplares de Alnus spp. Representan una buena alternativa frente a las leguminosas en ciertas zonas.
Progresan los estudios sobre las relaciones de especificidad endofito-hospedante, los mecanismos de reconocimiento y los procesos de colonizacin. Constituye un rea
cuyos estudios se incrementan rpidamente por la importancia del nitrgeno como elemento limitante del desarrollo vegetal y la capacidad de estas plantas de colonizar
Morfologa ndulo
Velocidad de crecimiento de la bacteria
Sistema vascular en ndulos
Hidrogenasa (Hup+)
Fijacin de N2 in vitro
Proteccin O2: hemoglobina
Nodulacin area
Transporte N fijado como uredos
Nodulacin perenne
Leguminosas
Actinorrizas
Simple
Lentas: ms 6h(tg)
Rpidas: menos 6h
Perifrico
No general
Excepcional
Siempre presente
Varias especies
Puede emplearse en
plantas (tropicales)
Excepcional
Complejo
Ms 15 horas (tg)
Central
General
General
Variable, algunas excepciones
Excepcional
No lo forman
Es la regla
El manto fngico puede representar en 40% del peso total del rgano (figura 3). Las hifas se pueden extender al
suelo vecino y tambin penetrar espacios intercelulares
de la corteza. Las clulas corticales se alargan transversalmente y los pelos capilares estn ausentes. Los tejidos meristemticos y los del pice estn reducidos en relacin a races no micorrizadas. Las races colonizadas
son por lo general laterales, al emerger de la corteza de
races micorrizadas. Estas races son de corta longitud,
muy ramificadas y son reemplazadas peridicamente.
La morfologa y anatoma de las ectomicorrizas son variadas segn el estado de desarrollo, el hongo asociado y la
presencia de ms de una especie fngica (figuras 4 y 5).
Caracteres anatmicos, fisiolgicos, ecolgicos y taxonmicos se tienen en cuenta en la descripcin de las ectomicorrizas, como la morfologa de las hifas, estructura y
aspecto del manto fngico, presencia de rizomorfos, color, flourescencia, olor, hbitat (Alvarez, 1991).
Las ectomicorrizas de rboles forestales pueden ser pardas, negras, rojas, amarillas, blancas. Muchos hongos
inducen ramificaciones dicotmicas en las races, las que
le dan forma coraloide caracterstica; otras pueden tener
formas ramificadas, pinadas, globulosas, etc. (figura 4).
Contrariamente a lo observado con los hongos que forman endomicorrizas, son numerosos las especies ectomicorrticas, con ms de 5.000 especies. Pertenecen a
las subdivisiones Ascomycotina y Basidiomycotina, cuyos
ciclos sexuados son bien conocidos. Muchos presentan
rganos de reproduccin sexual o carpforos comestibles
(boletos, agaricales, trufas), mientras que otros son txicos (Amanita phallodes). Algunos hongos presentan un
espectro de especificidad estrecho, como Boletus betulicola, y otros como Pisolithus tinctorius, coloniza ms de
una decena de especies vegetales.
Raz no micorrizada
Raz micorrizada
Lmite de la zona
de absorcin de P
292
Lillian Frioni
rizoderma
red Hartig
pelo absorbente
manto
parenquima
cortical
pelotn
cilindro
central
parenquima
cortical
los dos grupos precedentes y que se aprecian frecuentemente en los viveros forestales.
Las micorrizas tipo arbutoide, son ectendomicorrizas cuyas hifas en forma de pelotones intracelulares estn muy
desarrolladas. Otros tipos han sido descriptos (endomicorrizas con pelotones) en las Orchidaceae, las Monotropeae
y en las Erycaceae.
Los estudios relacionados con la naturaleza del hongo, la
fisiologa de la micorriza, el aislamiento y propagacin del
endosimbionte y las prcticas de inoculacin, se han incrementado en los ltimos aos (Agerer, 1994, Allen, 1991,
Norris et al, 1994, Siquiera et al, 1994).
arbsculo
hifas externas
vescula
esporas
esporocarpo
pelotn
pared del hongo
pared de la clula vegetal
interfase
membrana perifngica
vacuola
ncleo
ectomicorriza
membrana plasmtica de la
clula vegetal, endomicorriza A
Arbusculares
Ectomicorrizas
+
+
+o+
Zygomycetes=
Glomeromycetes
+
+
+
Basidiomycetes,
Ascomycetes
Zygomycetes
Bryophytas, Pteridophytas
Gymnospermas
Angiospermas
Pocas Pteridophytas
Gimnospermas
Angiospermas
hongo
hifas septadas
hifas no septadas
intracelulares
manto fngico
red de Hartig
vesculas
arbsculos
taxonoma
planta
taxonoma
Ectomicorrizas
La simbiosis ectomicorrtica (figura 2)(Dommergues, Mangenot, 1970) ocurre sobretodo en plantas leosas, rboles o arbustos y solamente en un 3%-5% del total de
especies vegetales, pero la gran distribucin geogrfica y
la importancia econmica de esas especies contribuy al
desarrollo de los estudios en esta asociacin.
Caractersticas: se aprecia un manto fngico alrededor
de las races (figura 2), hifas intercelulares, formando la
tpica red de Hartig entre las primeras clulas corticales y
Bibliografa
Barea, J. M., Cuantificacin de la fijacin biolgica de N
mediante el uso de N15. En: Fijacin y Movilizacin
Biolgica de Nutrientes, vol II, 1991, Olivares, J. y J.
M. Barea (coord), Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, Coleccin Nuevas tendencias, Madrid:
105-127
Bottini, R., Fulchieri, M. Pearce, D. y Pharis, R. P. Identification of giberelins A1, A3 and iso-A3 in cultures de
Azospirillum lipoferum. 1989, Plant Physiol. 90:45-47
Dbereiner, J., y F.P. Pedrosa; Nitrogen-fixing Bacteria
in Non-Legumineus Crop Plants. 1987, Springer-Verlag, Berln
Dbereiner, J., V.M. Reis, M. A. Paula y F. Olivares, Endophytic diazotrophs in sugar cane, cereals and tuber
plants. En: New Horizons in Nitrogen Fixation, 1992
R. Palacios, J. Mora y W. E. Newton, (eds) Kluver Academic Publishers, Dordrecht: 671-676
Dommergues, Y. Nitrogen fixation by trees in relation to
soil nitrogen economy. 1995, Fertilizer Research 42:
215-230
Dommergues, Y., Duhoux, E. y Diem, H. G. Les arbres
fixateurs dazote. 1999, Co-edicin CIRAD/FAO/IRD
Espaces 34, Pars
Duhoux, E. y Nicole, M. Biologie Vgtale: Associations et interactions chez les plantes. 2004, Dunod,
Pars
Franche, C., Laplaze, L., Duhoux, E., Bogusz, D. Actinorhizal symbioses: recent advances inplant molecular and
genetic transformation studies, 1998. Critic Rev. Plant
Sci, 17:1-28
Frioni, L., Le Roux, C., Dommergues, Y. y Diem, H. G.
Inoculant made of encapsulated Frankia: assessment
of Frankia growth within alginate beads. 1994 World
J. Microbiol. & Biotech 10: 118-121
Frioni, L., R. Dodera, D. Malates e I. Irigoyen An assessment of nitrogen fixation capability of leguminous
trees in Uruguay. 1998, Applied Soil Ecology 7: 271279
Frioni, L., D. Malates, I. Irigoyen y R. Dodera Promiscuity
for nodulation and effectivity in the N2-fixing legume
tree Acacia caven in Uruguay, 1998, Applied Soil
Ecology 7: 239-244
Fulchieri, M. y L. Frioni, Azospirillum inoculation on maize (Zea mays). Effect on yield in a field experiment in
289
290
Lillian Frioni
Urquiaga, S. y J. Dbereiner Fijacin biolgica de nitrgeno asociada con gramneas forrajeras, cereales y caa
de azcar. En : Fijacin y Movilizacin de Nutrientes, vol II, 1991, Olivares, J. y J. M. Barea (coord),
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, coleccin Nuevas Tendencias, vol 18, Madrid: 71-89
Vincent, J. M. Nitrogen Fixation in Legumes, 1982, Academic Press, Londres
Wood, S. M., Newcomb, W., Nodule morphogenesis: the
early infection of alfalfa (Medicago sativa) root hairs
by Rhizobium meliloti. 1989. Can. J. Bot., 67: 31083122.
Preguntas de repaso
1) Explique por qu la fijacin biolgica de N2 es ms
eficiente en asociaciones simbiticas nodulares.
2) Cmo demostrara la respuesta anterior?
3) Seale relaciones de diazotrofos hetertrofos con el
O2 y explique en qu condiciones fijan N2.
4) Qu mecanismos de proteccin de la N2asa puede
sealar?
5) Cul o cuales de ellos presenta: Azotobacter, Azospirillum, Clostridium, Klebsiella, Bacillus?
6) Explique una asociacin de una cianobacteria fijadora de N2 con vegetales y su aplicacin agronmica
7) A qu se llama azollizacin?
8) Qu importancia prctica pueden tener las bacterias fotosintticas anaerobias? Y que rol cumplieron
en estudios bioqumicos y metablicos?
9) Seale 3 asociaciones simbiticas fijadoras de N2:
10) Caractersticas de rhizobio:
11) Aislamiento a partir de suelo sin cultivo de leguminosas
12) Seales moleculares en la iniciacin de la nodulacin:
13) Diferencias entre ndulos de rhizobio y de frankia
14) Por qu Frankia puede fijar al aire?
15) Qu se entiende por inoculacin?
16) En qu situaciones aconsejara inocular una leguminosa?
17) Cmo evaluara el efecto de un inoculante?
18) Principales cultivos inoculados con diazotrofos que
conozca
19) Si debe inocular y no dispone de cepas eficientes,
qu procedimiento seguira?
20) Qu ensayos efectuara en la evaluacin de un inoculante comercial?
16
Las micorrizas
291
sequa
sales
metales pesados
patgenos
estabilizacin del suelo
Las caractersticas de los dos tipos ms importantes: endomicorrizas arbusculares (MA), llamadas tambin vesculo-arbusculares, V-A y las ectomicorrizas (EM) se
sealan en el cuadro 2 y en la figura 1 (Duhoux y Nicole,
2004).
En las ectomicorrizas, la raz est completamente rodeada por un manto fngico, bien desarrollado, cuyas hi-
290
Lillian Frioni
Urquiaga, S. y J. Dbereiner Fijacin biolgica de nitrgeno asociada con gramneas forrajeras, cereales y caa
de azcar. En : Fijacin y Movilizacin de Nutrientes, vol II, 1991, Olivares, J. y J. M. Barea (coord),
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, coleccin Nuevas Tendencias, vol 18, Madrid: 71-89
Vincent, J. M. Nitrogen Fixation in Legumes, 1982, Academic Press, Londres
Wood, S. M., Newcomb, W., Nodule morphogenesis: the
early infection of alfalfa (Medicago sativa) root hairs
by Rhizobium meliloti. 1989. Can. J. Bot., 67: 31083122.
Preguntas de repaso
1) Explique por qu la fijacin biolgica de N2 es ms
eficiente en asociaciones simbiticas nodulares.
2) Cmo demostrara la respuesta anterior?
3) Seale relaciones de diazotrofos hetertrofos con el
O2 y explique en qu condiciones fijan N2.
4) Qu mecanismos de proteccin de la N2asa puede
sealar?
5) Cul o cuales de ellos presenta: Azotobacter, Azospirillum, Clostridium, Klebsiella, Bacillus?
6) Explique una asociacin de una cianobacteria fijadora de N2 con vegetales y su aplicacin agronmica
7) A qu se llama azollizacin?
8) Qu importancia prctica pueden tener las bacterias fotosintticas anaerobias? Y que rol cumplieron
en estudios bioqumicos y metablicos?
9) Seale 3 asociaciones simbiticas fijadoras de N2:
10) Caractersticas de rhizobio:
11) Aislamiento a partir de suelo sin cultivo de leguminosas
12) Seales moleculares en la iniciacin de la nodulacin:
13) Diferencias entre ndulos de rhizobio y de frankia
14) Por qu Frankia puede fijar al aire?
15) Qu se entiende por inoculacin?
16) En qu situaciones aconsejara inocular una leguminosa?
17) Cmo evaluara el efecto de un inoculante?
18) Principales cultivos inoculados con diazotrofos que
conozca
19) Si debe inocular y no dispone de cepas eficientes,
qu procedimiento seguira?
20) Qu ensayos efectuara en la evaluacin de un inoculante comercial?
16
Las micorrizas
291
sequa
sales
metales pesados
patgenos
estabilizacin del suelo
Las caractersticas de los dos tipos ms importantes: endomicorrizas arbusculares (MA), llamadas tambin vesculo-arbusculares, V-A y las ectomicorrizas (EM) se
sealan en el cuadro 2 y en la figura 1 (Duhoux y Nicole,
2004).
En las ectomicorrizas, la raz est completamente rodeada por un manto fngico, bien desarrollado, cuyas hi-
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Lillian Frioni
rizoderma
red Hartig
pelo absorbente
manto
parenquima
cortical
pelotn
cilindro
central
parenquima
cortical
los dos grupos precedentes y que se aprecian frecuentemente en los viveros forestales.
Las micorrizas tipo arbutoide, son ectendomicorrizas cuyas hifas en forma de pelotones intracelulares estn muy
desarrolladas. Otros tipos han sido descriptos (endomicorrizas con pelotones) en las Orchidaceae, las Monotropeae
y en las Erycaceae.
Los estudios relacionados con la naturaleza del hongo, la
fisiologa de la micorriza, el aislamiento y propagacin del
endosimbionte y las prcticas de inoculacin, se han incrementado en los ltimos aos (Agerer, 1994, Allen, 1991,
Norris et al, 1994, Siquiera et al, 1994).
arbsculo
hifas externas
vescula
esporas
esporocarpo
pelotn
pared del hongo
pared de la clula vegetal
interfase
membrana perifngica
vacuola
ncleo
ectomicorriza
membrana plasmtica de la
clula vegetal, endomicorriza A
Arbusculares
Ectomicorrizas
+
+
+o+
Zygomycetes=
Glomeromycetes
+
+
+
Basidiomycetes,
Ascomycetes
Zygomycetes
Bryophytas, Pteridophytas
Gymnospermas
Angiospermas
Pocas Pteridophytas
Gimnospermas
Angiospermas
hongo
hifas septadas
hifas no septadas
intracelulares
manto fngico
red de Hartig
vesculas
arbsculos
taxonoma
planta
taxonoma
Ectomicorrizas
La simbiosis ectomicorrtica (figura 2)(Dommergues, Mangenot, 1970) ocurre sobretodo en plantas leosas, rboles o arbustos y solamente en un 3%-5% del total de
especies vegetales, pero la gran distribucin geogrfica y
la importancia econmica de esas especies contribuy al
desarrollo de los estudios en esta asociacin.
Caractersticas: se aprecia un manto fngico alrededor
de las races (figura 2), hifas intercelulares, formando la
tpica red de Hartig entre las primeras clulas corticales y
Bibliografa
Barea, J. M., Cuantificacin de la fijacin biolgica de N
mediante el uso de N15. En: Fijacin y Movilizacin
Biolgica de Nutrientes, vol II, 1991, Olivares, J. y J.
M. Barea (coord), Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, Coleccin Nuevas tendencias, Madrid:
105-127
Bottini, R., Fulchieri, M. Pearce, D. y Pharis, R. P. Identification of giberelins A1, A3 and iso-A3 in cultures de
Azospirillum lipoferum. 1989, Plant Physiol. 90:45-47
Dbereiner, J., y F.P. Pedrosa; Nitrogen-fixing Bacteria
in Non-Legumineus Crop Plants. 1987, Springer-Verlag, Berln
Dbereiner, J., V.M. Reis, M. A. Paula y F. Olivares, Endophytic diazotrophs in sugar cane, cereals and tuber
plants. En: New Horizons in Nitrogen Fixation, 1992
R. Palacios, J. Mora y W. E. Newton, (eds) Kluver Academic Publishers, Dordrecht: 671-676
Dommergues, Y. Nitrogen fixation by trees in relation to
soil nitrogen economy. 1995, Fertilizer Research 42:
215-230
Dommergues, Y., Duhoux, E. y Diem, H. G. Les arbres
fixateurs dazote. 1999, Co-edicin CIRAD/FAO/IRD
Espaces 34, Pars
Duhoux, E. y Nicole, M. Biologie Vgtale: Associations et interactions chez les plantes. 2004, Dunod,
Pars
Franche, C., Laplaze, L., Duhoux, E., Bogusz, D. Actinorhizal symbioses: recent advances inplant molecular and
genetic transformation studies, 1998. Critic Rev. Plant
Sci, 17:1-28
Frioni, L., Le Roux, C., Dommergues, Y. y Diem, H. G.
Inoculant made of encapsulated Frankia: assessment
of Frankia growth within alginate beads. 1994 World
J. Microbiol. & Biotech 10: 118-121
Frioni, L., R. Dodera, D. Malates e I. Irigoyen An assessment of nitrogen fixation capability of leguminous
trees in Uruguay. 1998, Applied Soil Ecology 7: 271279
Frioni, L., D. Malates, I. Irigoyen y R. Dodera Promiscuity
for nodulation and effectivity in the N2-fixing legume
tree Acacia caven in Uruguay, 1998, Applied Soil
Ecology 7: 239-244
Fulchieri, M. y L. Frioni, Azospirillum inoculation on maize (Zea mays). Effect on yield in a field experiment in
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288
Lillian Frioni
Resumen
293
un conjunto de filamentos miceliares que exploran el suelo para asegurar la nutricin mineral de la asociacin, relacionados a las fructificaciones fngicas o carpforos.
Endodermis
El cuadro 17 compara las simbiosis por rhizobio y por Frankia y la figura 14 esquematiza ambos tipos de ndulos.
Se aprecia la colonizacin central en las leguminosas y
perifrica en no-leguminosas.
Clulas corticales
Red de Hartig
(hifas intercelulares)
Perspectivas
Tejido vascular
Los hongos
El empleo de las plantas actinorrticas como pioneras en
suelos pobres o degradados es ya prctica comn en
muchos pases. Algunas especies se pastorean, como
jvenes ejemplares de Alnus spp. Representan una buena alternativa frente a las leguminosas en ciertas zonas.
Progresan los estudios sobre las relaciones de especificidad endofito-hospedante, los mecanismos de reconocimiento y los procesos de colonizacin. Constituye un rea
cuyos estudios se incrementan rpidamente por la importancia del nitrgeno como elemento limitante del desarrollo vegetal y la capacidad de estas plantas de colonizar
Morfologa ndulo
Velocidad de crecimiento de la bacteria
Sistema vascular en ndulos
Hidrogenasa (Hup+)
Fijacin de N2 in vitro
Proteccin O2: hemoglobina
Nodulacin area
Transporte N fijado como uredos
Nodulacin perenne
Leguminosas
Actinorrizas
Simple
Lentas: ms 6h(tg)
Rpidas: menos 6h
Perifrico
No general
Excepcional
Siempre presente
Varias especies
Puede emplearse en
plantas (tropicales)
Excepcional
Complejo
Ms 15 horas (tg)
Central
General
General
Variable, algunas excepciones
Excepcional
No lo forman
Es la regla
El manto fngico puede representar en 40% del peso total del rgano (figura 3). Las hifas se pueden extender al
suelo vecino y tambin penetrar espacios intercelulares
de la corteza. Las clulas corticales se alargan transversalmente y los pelos capilares estn ausentes. Los tejidos meristemticos y los del pice estn reducidos en relacin a races no micorrizadas. Las races colonizadas
son por lo general laterales, al emerger de la corteza de
races micorrizadas. Estas races son de corta longitud,
muy ramificadas y son reemplazadas peridicamente.
La morfologa y anatoma de las ectomicorrizas son variadas segn el estado de desarrollo, el hongo asociado y la
presencia de ms de una especie fngica (figuras 4 y 5).
Caracteres anatmicos, fisiolgicos, ecolgicos y taxonmicos se tienen en cuenta en la descripcin de las ectomicorrizas, como la morfologa de las hifas, estructura y
aspecto del manto fngico, presencia de rizomorfos, color, flourescencia, olor, hbitat (Alvarez, 1991).
Las ectomicorrizas de rboles forestales pueden ser pardas, negras, rojas, amarillas, blancas. Muchos hongos
inducen ramificaciones dicotmicas en las races, las que
le dan forma coraloide caracterstica; otras pueden tener
formas ramificadas, pinadas, globulosas, etc. (figura 4).
Contrariamente a lo observado con los hongos que forman endomicorrizas, son numerosos las especies ectomicorrticas, con ms de 5.000 especies. Pertenecen a
las subdivisiones Ascomycotina y Basidiomycotina, cuyos
ciclos sexuados son bien conocidos. Muchos presentan
rganos de reproduccin sexual o carpforos comestibles
(boletos, agaricales, trufas), mientras que otros son txicos (Amanita phallodes). Algunos hongos presentan un
espectro de especificidad estrecho, como Boletus betulicola, y otros como Pisolithus tinctorius, coloniza ms de
una decena de especies vegetales.
Raz no micorrizada
Raz micorrizada
Lmite de la zona
de absorcin de P
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Lillian Frioni
ta directamente a la nodulacin y por lo tanto a la fijacin del N2. La inoculacin tendr efectos positivos cuando ese nmero es bajo
normalmente micorrcicos, con amplio rango de hospedantes, y con capacidad saproftica. La mayora de
los hongos que forman EM poseen escasa o nula habilidad para vivir libremente, pero poseen amplio rango
de hospedantes.
El nitrgeno combinado afecta negativamente a la fijacin por estos organismos, al igual que el proceso en
leguminosas. Se observaron, sin embargo, diferencias
entre la sensibilidad de especies vegetales frente al nitrgeno combinado; Alnus es bastante insensible y se
los puede encontrar nodulados en suelos relativamente
ricos en nitrgeno
Fuentes de carbono: muchas especies ectomicorrcicas obligadas han podido desarrollarse en cultivo puro,
con nutrientes relativamente simples, como glucosa y
otros azcares. Muchas no pueden emplear disacridos
y otras especies pueden degradar polisacridos siem-
La humedad, muchas especies actinorrticas que crecen en reas secas son afectadas por una sequa transitoria y la actividad nitrogenasa cesa en plantas sometidas a una succin de -25 barias en el xilema. En general ocurre un decaimiento masivo de ndulos en el verano. La inundacin, al limitar la difusin de los gases,
limita la actividad de los ndulos. Algunas especies
poseen estructuras en las extremidades de los ndulos
llamadas lenticelas, que facilitan la difusin del O2 a
travs del tejido nodular
La acidez: se piensa en general que las no-leguminosas son ms tolerantes a los bajos pH que las legumi-
287
286
Lillian Frioni
suelos pobres. Estos rboles son empleados en silvicultura, en planes de forestacin, en sistemas agroforestales, contribuyendo a incrementar el nivel de nitrgeno de
los mismos.
El cuadro 15 muestra el contenido de nitrgeno en hojas
de algunas de estas plantas. Los datos de N en los rastrojos no deben tomarse como todo el nitrgeno fijado, ya
que, dependiendo del nivel de N del suelo, una parte es
reciclada a partir del mismo.
N% en Mantillo N% Edad
N total
hojas ton/ha/ao
aos kgN/ha/ao
Alnus incana
A. crispa
A. rubra
A. glutinosa
Casuarina littoralis
C. equisetifolia
Ceanothus velutinus
Eleagnus orientalis
2,82
1,5
1,3
2,17
2,57
1,30
3,0
2,0
9,3
2,9
-
5
0-40
1,82
1,0
-
157
30
12
-
169
290
-
6,2
13,5
1,46
1,35
9
-
91
183
Numerosos estudios se han realizado a los efectos de lograr buena sobrevivencia de este organismo en inoculantes comerciales a emplear en los viveros. Los ensayos
incluyen soportes inertes como la vermiculita. Frankia result muy resistente al ser atrapada en bolitas de alginato, las que desecadas se conservan por largos perodos
de tiempo (Frioni et al., 1994)(Anexo prctico).
pre que se agregue algo de glucosa (induccin enzimtica). Se han detectado actividades de celulasas, hemicelulasas y amilasas pero, como grupo, estos hongos
son en general incapaces de descomponer mantillos u
otras formas de materia orgnica del suelo, y dependen
del hospedante para la provisin de compuestos carbonados simples.
Muchas experiencias se realizaron para determinar la distribucin de los endofitos y de sus respectivas plantas
hospedantes. Se encontraron:
Los ndulos de estas plantas fijan nitrgeno, como lo hacen otros sistemas fijadores, dependiendo su actividad de
la biomasa del tejido nodular, de la actividad de la nitrogenasa y del perodo en que permanecen activos. La respiracin y la actividad nitrogenasa de los ndulos declina
con los incrementos de la edad de los ndulos, como ocurre en general en ndulos perennes. De modo que, en
promedio, estos ndulos fijan menos que ndulos jvenes de leguminosas anuales.
El cuadro 16 (Gauthier et al., 1984) muestra la actividad
nitrogenasa de Colletia spinosissima, su contenido de N%,
el N total por planta y su peso seco en ensayo control e
inoculado en cultivo hidropnico.
Control
Inoculado
Peso seco
mg/planta
ARA
N%
N total
mMC2H4/
h/planta
56
113
0,8
1,5
0,45
1,69
0
0,68
295
Factores de crecimiento: muchos de estos hongos requieren ciertas vitaminas del complejo B, como tiamina y
biotina; otras especies prefieren inositol, cido nicotnico
y cido pantotnico.
Los hongos ectomicorrcicos producen auxinas, giberelinas, citoquininas y una variedad de vitaminas,
antibiticos, cidos grasos. Las sustancias de naturaleza auxnica reproducen caracteres de la micorrizacin al incorporarlas a races creciendo aspticamente: se forman races cortas y gruesas con ausencia de pelos y elongacin radial de clulas con corticales. La microflora rizosfrica puede brindar el triptofano para la sntesis del AIA (cido indol actico),
que induce estos cambios.
Si las races micorrizadas pierden al hongo asociado, las
caractersticas estructurales desaparecen y se transforman en races normales. El exceso de nitrgeno afecta a
la micorrizacin: puede provocar que las auxinas se conviertan en compuestos relacionados, pero sin actividad
promotora del crecimiento, e incluso inhibir su sntesis por
el hongo.
Los factores fsicos tambin afectan el desarrollo de
estos hongos. El ptimo del crecimiento se sita entre 18
y 27C, para muchos cesa sobre 35C y debajo de 5C.
Se consideran acidfilos, con pH ptimo entre 4 y 6, algunos crecen bien a pH 3,0. Son aerobios, por esto los cultivos para preparar inoculantes se agitan, y sensibles a la
falta de agua.
296
Lillian Frioni
patgenos, a toxinas, pH, temperatura y humedades adversas. La suberizacin de las races est limitada y se
alarga su vida til
El
hongo, por su parte, obtiene los nutrientes carbonados simples que requiere en las etapas iniciales y un
ambiente que lo protege de la intensa competencia microbiana
Fisiolgicamente, las asociaciones micorrcicas constituyen uno de los mejores ejemplos de parasitismo controlado. Los intercambios entre ambos componentes de esta
asociacin se estudian con elementos marcados:
14
32
CO2 en las plantas para seguir los compuestos orgnicos radioactivos en el manto fngico y en las hifas
P en compuestos orgnicos o minerales insolubles en
el suelo, que es transferido hacia la planta, por las hifas
del hongo. Las plantas micorrizadas se desarrollan mejor
en suelos deficientes en nutrientes como N, P, K.
la penetracin por el patgeno: en cortes de races micorrizadas y controles inoculadas por esporas de hongo patgeno, se aprecia la invasin slo en el caso de
races no micorrizadas
la
El proceso es muy parecido al que ocurre en leguminosas: los pelos radicales en contacto con el endofito se
encurvan y las hifas penetran avanzando hacia clulas
corticales que son estimuladas a dividirse (figura 13).
Las hifas penetran en las clulas en divisin, se ramifican y forman las clsicas vesculas en la periferia de
estos conglomerados. La infeccin progresa y se forma
el llamado ndulo primario, que se reconoce como una
deformacin de una raz lateral cuyo crecimiento se detiene. El ndulo verdadero se completa por surgimiento
de races laterales inducidas cerca de los ndulos primarios, que se transforman en lbulos nodulares por
infeccin persistente de su regin cortical. En los ndulos verdaderos, la penetracin de las clulas jvenes
de la corteza y la diferenciacin del endofito es esencialmente la misma que en los ndulos primarios.
En Casuarina y Myrica, el pice de cada lbulo nodular
da lugar a una raz pero con geotropismo negativo (figuras 11 y 12), debido a bajos niveles de cido indolactico,
lo que le da a los ndulos una apariencia muy particular.
En el campo, los ndulos pueden alcanzar dimetros de
ms de 8 cm y muchas veces resulta difcil obtenerlos,
pues se distribuyen a lo largo de un sistema radical muy
extenso, que en suelos pedregosos y compactados puede llegar a varios metros.
clulas de la corteza
colonizadas
polisacridos
pelo
capilar
hifa
endoftica
La regin apical (2-3 mm) de los lbulos del ndulo parecen constituir las partes ms activas en la fijacin del nitrgeno. All precisamente, los racimos de vesculas presentan la mayor actividad y reducen activamente las sales de tetrazolium. El aislamiento de las vesculas y la incorporacin de ATP y ditionito permiti comprobar que son
el sitio de la fijacin. Incluso los resultados de fijacin se
expresan por nmero de vesculas.
Usos: el empleo que se les da a estas plantas es variable:
muchas especies de Alnus pueden alcanzar 30-35 m en
50 aos con dimetros de 0,6 m y se emplean en muebles, postes, enchapados, y en la preparacin de pulpas para la elaboracin de tejidos
como alimento se usan poco: Hippophae da frutas ricas en vitamina C y en aceite y suele complementar la
dieta humana
vesculas
clula basal de
pelo capilar
hifa
infectiva
285
1a
1b
pero el empleo ms promisorio es sin duda el de la recuperacin de suelos erosionados, la fijacin de dunas y su inclusin en sistemas silvopastoriles ya
que brindan abrigo y sombra a los animales, adems
de brindar N fijado a la pastura asociada
284
Lillian Frioni
Nodulacin
El ndulo es un rgano compuesto de unidades elementales llamadas lbulos nodulares, cada uno originado por invasin de frankia en races adventicias. En
funcin de variaciones del ambiente, se van formando
nuevos lbulos, lo que origina un ndulo muy grande,
de aspecto coraloide, que se va lignificando. Un ndulo
puede persistir durante 5 a 10 aos, en ese caso slo
los lbulos perifricos son activos
Cada lbulo es una raz modificada: su vascularizacin
es central y como las races adventicias o laterales, se
origina en el periciclo (figura 11) (Dommergues et al.,
1999)
Los lbulos son invadidos, en su corteza, por el microsimbionte Frankia, que penetra las clulas vegetales y
asegura la fijacin de N2
La figura 12 muestra ndulos jvenes de Casuarina y Allocasuarina y ndulos de varios aos donde se aprecia la
suberizacin (Duhoux y Nicole, 2004).
Formacin de los ndulos: el proceso ha sido ms
estudiado con Alnus glutinosa y pueden distinguirse 4
fases:
a. desarrollo del endofito en la rizosfera
b. invasin de pelos capilares
pe
NR
3
Prcticas de inoculacin
Se distinguen dos tipos de ndulos: los de tipo coraloide, como los de Alnus donde el meristema nodular cesa
su actividad una vez que el lbulo se form y los de
tipo Casuarina, Eleagnus, Myrica , en los cuales el meristema del lbulo contina con un desarrollo modificado que conduce a la formacin de una raz nodular con
geotropismo negativo, la cual puede a su vez ser colonizada.
pe
end
per
baja
o moderada fertilidad
en la inoculacin de plntulas. Las esporas son fciles de coleccionar a partir de esporocarpos maduros
de muchos Gasteromycetes que se colectan en el
terreno en la vecindad de rboles bien micorrizados
y se agregan a las macetas regando con un licuado
en agua
El reconocimiento del hongo y el hospedante apropiado es seguido por la colonizacin y la formacin del
manto fngico. El desarrollo del hongo en la rizosfera
del hospedante es estimulado por los exudados radicales.
La fertilidad del suelo y la actividad fotosinttica del
vegetal afectan marcadamente a la micorrizacin.
297
con cultivos puros, desde la dcada del 50 se comenz con xito a inocular con cultivos puros. Los suelos o
los soportes de plntulas se fumigan frecuentemente
para eliminar patgenos y la poblacin nativa, que puede competir con el inculo
Las esporas asexuadas desarrolladas en medios de cultivo son tambin un buen inculo, pero los cultivos con micelio se emplean mucho ltimamente ya que ofrecen mayores garantas.
Programas de inoculacin: comienzan con la seleccin
del hongo ectomicorrcico, la que puede realizarse simultneamente con un diazotrofo, en leguminosa o en noleguminosa fijadora de N2. Los ensayos para evaluar la
especificidad y eficiencia de la simbiosis se realizan en
plntulas creciendo en tubos con vermiculita/turba, arena, con solucin nutritiva. La inoculacin se puede realizar a partir de discos de agar con micelio activo. Los ensayos sontinan en invernculo, incluyendo suelo, niveles de fertilizacin, tipos de inculos, etc.
La introduccin de especies de Pisolithus en viveros ha
incrementado significativamente la calidad de plntulas
de pino. El cuadro 2 muestra un ejemplo de inoculacin
en suelos muy erosionados, cerca de minas de cobre, en
el sur de Estados Unidos, pobres en materia orgnica y
nutrientes minerales. Como se observa se presentan marcadas diferencias entre los hongos. Las ectomicorrizas
con Pisolithus incrementaron el crecimiento cerca del
100%, en ambas especies, en relacin a las formadas
por Thelephora, menos adaptado a las condiciones adversas del suelo.
En otras partes del mundo Pisolithus tinctorius responde
muy bien en la simbiosis, persiste en el suelo a pesar de la
competencia de los hongos ectomicorrcicos nativos. Ntese que no aparecen los testigos sin inocular ni fertilizar, ya
que los pinos son muy dependientes de los hongos y no se
298
Lillian Frioni
desarrollan en suelos pobres. Considerando la enorme extensin sembrada con especies forestales, se comprende
la importancia de lograr incrementar los rendimientos mediante una correcta seleccin de estos hongos.
altura
(cm)
dimetro
tallo (cm)
vol.plntula
(cm3)
52.3*
44.8
1.46*
1.15
111.5*
59.3
48.7*
41.3
1.29*
1.01
81.0*
42.1
peso seco
lignina
(mg)
(% de peso seco)
inoculado
no
inoculado
no
inoculado
inoculado
Efectos de la inoculacin: incrementos en tamao (altura, peso seco de las plantas), diferencias en la anatoma y
morfologa de los cultivos, han sido atribuidas a esta simbiosis, cambios en la relacin raz/parte area, estructura
de tejidos radicales, longitud de acculas, longevidad de
races cortas, incremento en el nmero de cloroplastos.
Algunas de estas variaciones se atribuyen al incremento
del aporte de nutrientes, pero otras son consecuencia de la
actividad del hongo o de fitohormonas que libera.
El cuadro 3 muestra ligeros aumentos en la lignificacin
de plantas de pino inoculadas (en experimentos con CO214)
y del tamao y peso del orden del 44%.
Resumiendo: se reconoce la importancia de estas asociaciones en el desarrollo de especies arbreas, sobre
todo en suelos de baja fertilidad. El endosimbionte moviliza nutrientes desde el suelo hacia el hospedante. La inoculacin con especies fngicas correctamente seleccionadas ofrece una interesante perspectiva en el manejo
de cultivos forestales en:
a. cultivos exticos
b. suelos degradados por la erosin, mineralizacin o por
construcciones civiles
283
770
265
91
108
305
354
125
56
44
282
30
35
29,5
-
28
30
24,5
-
Endomicorrizas
Se piensa, dada la abundancia de estas asociaciones, que
la presencia de hongos endomicorrcicos en races en condiciones naturales, es una constante, ms que una excepcin, Han sido reconocidas desde hace ms de 100
aos y se destaca su presencia en fsiles de ms de 300
millones de aos.
La mayora de las endomicorrizas poseen caractersticas
comunes: el hongo invade las races desde el suelo, lo que
implica que debe poseer mecanismos para sobrevivir en l
o poseer una existencia saproftica (figura 7). Dentro de la
raz, el hongo coloniza las clulas de la corteza, pero no las
de la endodermis y los vasos, los que no presentan cambios morfolgicos (Barea et al., 1991).
Se distinguen dos tipos de endomicorrizas:
las que albergan hongos no tabicados: Zygomycotina. Constituyen un grupo heterogneo, incluyen plan-
Gneros
Betulaceae
Alnus (aliso)
Casuarinaceae
Coriaceae
Coriaria
Datiscaceae
Datisca
Eleagnaceae
Myricaceae
Comptonia, Myrica
Rhamnaceae
Rosaceae
282
Lillian Frioni
299
Figura 10- La simbiosis Azolla-Anabaena. a) Morfologa de hojas de Azolla, b) Racimo de hojas de Azolla, c) Poros con Anabaena
luego de accin de pectinasas, d) Anabaena: h= heterocisto, c= clula vegetativa, e) heterocisto de Nostoc con gruesa pared de
varias capas (flecha) y la pared externa muscilaginosa, menos densa (*).
Estas asociaciones son las ms numerosas, las presentan la mayora de las fanergamas, de lo que se deduce
el enorme potencial econmico que puede derivarse de
un correcto manejo de ellas en suelos de baja fertilidad.
Los estudios se han incrementado mucho en los ltimos
aos y se trata de seleccionar las mejores combinaciones planta-hongo con el objeto de inocular cultivos de
inters. En las leguminosas se tienden a usar inoculantes dobles, con rhizobio y esporas del hongo endomicorrcico.
Hifas externas
Vesculas
Clamidospora
Hifas internas
Pelo radical
Arbsculo
Los hospedantes se encuentran distribuidos en las principales familias cultivadas, las gramneas y leguminosas.
Muy pocas de las familias examinadas carecen de endomicorrizas MA. Se piensa que Ericaceae, Orquidaceae y
ciertas familias tpicamente ectomicorrcicas como Pinaceae y Betulaceae, carecen de micorrizas arbusculares.
Esporocarpo
Clula epidrmica
Clula cortical
ficocianina
Azolla
La simbiosis Azolla-Anabaena es ecolgicamente la ms
importante, muy abundante en aguas calmas templadas
y tropicales. La cianobacteria se encuentra en poros ubicados en cara ventral de las hojas, que se cierran en hojas maduras. Se han contado hasta 2.000 a 5.000 clulas
de Anabaena azollae en una sola cavidad. La fijacin del
N2 tiene lugar en los heterocistos que representan entre
el 20 y 30% de clulas de la cianobacteria y estn rodeados de gruesas paredes (figura 10: a, b, c y d Franche et
al., 1998; e, Selosse, 1996). En el filamento ocurre fotosntesis y en los heterocistos, que carecen de fotosistema
II, se expresa la nitrogenasa.
Azolla se usa como biofertilizante en vastas regiones de
Asia, Africa, como abono verde. Se cultiva en estanques
y luego se libera con el agua que inunda el arroz. La inoculacin puede aumentar los rendimientos entre un 30 y
50%. La agricultura cada vez ms intensiva y la fertiliza-
Orden
Suborden
Familia
Gnero
Micorriza
Glomales
Glominae
Glomaceae
Glomus
Sclerocystis
A
A
Acaulosporaceae
Acaulospora
Entrophospora
A
A
Gigasporinae
Gigasporaceae
Gigaspora
Scutellospora
A
A
Endogonaceae
Endogone
Endogonales
A, EC
300
Lillian Frioni
El endofito
Los hongos son no-tabicados, se los ubica entre los
Zygomycotina, del orden Glomales (familias Glomaceae,
Acaulosporaceae y Gigasporaceae) y Endogonales (familias Gigasporaceae y Endogonaceae) (cuadro 4). No
se les conoce estado sexual (Honrubia et al., 1994).
Como estos hongos no han logrado crecer en medios de
cultivo la taxonoma se basa en caractersticas de las esporas (figura 8), que se colectan de suelo rizosfrico por
tcnicas de tamizado hmedo y decantacin. El empleo de gradientes de sacarosa ayuda a separar las esporas de partculas inertes, huevos de insectos, etc. Se
emplean combinaciones de tcnicas (Anexo prctico). El
empleo de sondas moleculares ha permitido la identificacin del microsimbionte y ha contribuido mucho en los
estudios de inoculacin.
dos de races micorrizadas no ofrece las mismas garantas. La inoculacin con esporas desinfectadas mostr
que el rango de hospedantes para la mayora de los aislamientos estudiados es amplio, hecho que contradice
la incapacidad del hongo para desarrollarse fuera del
hospedante.
cordn de infeccin altamente ramificado y pocas bacterias se liberan de l y se diferencian en bacteroides. En las leguminosas, la mayora de los rhizobios se
transforman en bacteroides
los ndulos de Parasponia no poseen leghemoglobina, lo que muestra claramente que tanto la formacin
de bacteroides como la sntesis de leghemoglobina, estn determinados por el hospedante. La masa coraloide puede alcanzar tamaos de hasta 6 cm de dimetro
y se parecen ms a los ndulos actinorrticos de Coriaria o Datisca que a los de las leguminosas
Suelo
1
2
Glomus puede presentar esporocarpos o no con clamidosporas generalmente terminales en una hifa indiferenciada, las de Sclerocystis se ubican dentro de esporocarpos, en capa simple. Gigaspora posee azigosporas en
extremo de clula alargada en una hifa que se proyecta
hacia la espora y Acaulospora no forma esporocarpo y las
esporas estn ubicadas en hifas prximas a una vescula
de gran tamao.
Parasponia, como Casuarina y rboles leguminosos crecen rpidamente en suelos vrgenes del sudeste de Asia y
juegan importante papel en la reforestacin de suelos erosionados, donde son empleados desde muy antiguamente.
Con estas esporas es posible realizar ensayos de sntesis de endomicorrizas y probar la eficiencia de distintas
combinaciones planta-endofito. El empleo de macera-
281
bargo, muchas de ellas establecen asociaciones simbiticas variadas, con hongos, en los lquenes, con hepticas,
musgos, con el helecho acutico Azolla y una angiosperma, Gunnera.
Cycas
Las Cycadales son consideradas gimnospermas primitivas, reliquias de una flora tropical muy antigua: su origen
se ubica en los perodos Trisico, Jursico y Cretceo. Se
piensa que jugaron importante rol en el ciclo del nitrgeno
de esas pocas. De las 90 especies actuales (9 gneros),
slo algunas, como Macrozamia, se desarrollan en Australia a un nivel suficiente como para intervenir activamente
en el ciclo del nitrgeno. No han sido muy estudiadas y
muchos aspectos relativos al proceso de infeccin y a la
naturaleza de la especificidad hospedante-endofito, no han
sido aclarados.
Desarrollo y estructura de los ndulos: se parecen
superficialmente a los de no-leguminosas angiospermas,
pero su formacin y estructura varan. Se originan a partir de races especializadas, llamadas coraloides, que
presentan estructuras del tipo nodular an antes de ser
colonizadas por la cianobacteria, inducidas posiblemente por bacterias. Los ndulos se inician en la raz embrional y el hipoctilo y recin luego de su emergencia
son infectados por cianobacterias heterocsticas de los
gneros Nostoc y Anabaena, por rupturas de los estratos superficiales.
Las races coraloides se desarrollan en forma de grandes
racimos y pierden su caracterstico geotropismo negativo. Las races no infectadas permanecen pequeas y
mueren en el correr del ao. Todos los aislamientos mostraron capacidad para fijar N2.
En Argentina se describi nodulacin en ejemplares de
Cyca revoluta cultivada en parques y jardines. La fijacin
en cultivos de Cycas spp. y Macrozamia spp se realiza
tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. Los productos
de la fijacin son transportados al hospedante y se piensa
que gran parte es exudado por el endosimbionte, a diferencia de lo que ocurre con la cinobacterias en vida libre.
Las causas de mayor exudacin podran deberse a:
320
Lillian Frioni
% de infeccin
74
51
18
13
6
* 1986 Schipers obtiene mutante sid (Tn5) de P. fluorescens WCS 358 que no promueve crecimiento de papas
en campo, si lo hace su recombinante sid+
* Se incrementan los trabajos en bacterias: P. fluorescens,
P. putida. Bacillus, Azospirillum, hongos: Thrichoderma,
Penicillum, Cladosporium, Gliocladium
* 1993 mercado agroqumicos en el mundo U$S 12.106,
agentes biolgicos 1% (120 millones de dlares), 92%
corresponde a Bt (Bacillus thuringensis).
Germinacin de las esporas y crecimiento de las hifas: las esporas plurinucleadas germinan en el suelo o
in-vitro, se forma un tubo germinativo cenoctico. El hongo responde a exudados radicales aumentando significativamente el crecimiento de los filamentos y las ramificaciones. Se ste no se encuentra con una raz compatible, el crecimiento se detiene.
una latencia inicial atribuida al desarrollo de las plntulas y germinacin de esporas, el crecimiento del tubo
de germinacin y la colonizacin (20-25 das)
Entrada a la raz: en la proximidad de una raz compatible, el crecimiento del tubo germinativo es estimulado
por variados factores, como CO2, exudados, etc. y las
ramificaciones sucesivas penetran en la raz. Se observan estructuras especializadas llamadas apresorios,
englobamientos redondeados de hifas, cuya pared impregnada de melanina se espesa y asegura una presin osmtica elevada. Los apresorios se forman por
molculas liberadas por el hospedero. Los filamentos
se propagan en la exodermis y el parnquima cortical,
sin llegar nunca a la endodermis. Hidrolasas degradan
la pared de la planta provocando la progresin del filamento fngico, bajo el efecto de una presin hidrosttica elevada.
Colonizacin radical: en el desarrollo del hongo simbitico, aparecen las estructuras tpicas de estas asociaciones, los arbsculos y las vesculas.
Bibliografa
Resumiendo: el hongo endomicorrcico presenta dos tipos de hifas: las de infeccin con crecimiento centrpeto
en relacin a la raz y las hifas extraradicales, de crecimiento centrfugo. El aporte de esqueletos carbonados por
parte de la planta asegura el equilibrio de esta simbiosis.
301
rrizadas y no micorrizadas permanece constante, coincide con la etapa de fructificacin del hospedante y contina hasta la senectud.
Las endomicorrizas colaboran con la nutricin del vegetal
durante el perodo de mximo desarrollo.
Las estructuras fngicas caractersticas son (figura 10)
Los arbsculos que se forman por repetidas divisiones
dicotmicas de una hifa, presentan el aspecto arborescente caracterstico, llamados tambin haustorios o apresorios, con gran superficie de intercambio con el hospedante y es a este nivel que se realizan la transferencia de
nutrientes (C, P, etc.). Presentan viabilidad slo por algunos das, son digeridos por la planta y su formacin recomienza.
Las ramificaciones de los arbsculos estn limitados por
una membrana periarbuscular de origen vegetal que rodea la pared fngica muy fina y acompaa a la hifa. Esta
membrana presenta modificaciones funcionales importantes: se ha detectado actividad ATPasa muy activa, ausente en races no micorrizadas,que podra estar implicada
en el transporte a travs de la membrana en esta simbiosis (fosfatos hacia la planta).
Las vesculas son estructuras de gruesas paredes, que
se desarrollan en extremos de hifas inter o intracelularmente, a medida que la infeccin progresa, aunque se
las ha descripto en etapas tempranas de la colonizacin.
Se encuentran en general en las capas superficiales de
la raz y funcionan como rganos de almacenamiento
de grasas, aceite y colaboran en la propagacin del endofito. El hongo determina su formacin y morfologa.
Algunos hongos como Gigaspora y Scutellospora no las
forman.
302
Lillian Frioni
MA, observando segmentos de 1 cm a intervalos regulares. Esta longitud puede llegar a un tercio del total en muchas plantas cultivadas y superar 70-80% (Honrubia et
al., 1994; Sieverding y Barea, 1991), en plantas inoculadas, en vivero.
Ecologa
Muchos son los factores que afectan la formacin y desarrollo de las micorrizas MA. La fotosntesis es uno de los
ms importantes, pero el manejo de los cultivos (fertilizacin, biocidas, rotaciones), la abundancia de inculo en
los suelos, la susceptibilidad de la planta, las condiciones
de temperatura, humedad, pH, estacin del ao, afectarn el grado y la eficiencia de la asociacin.
Fotosntesis: con CO2 marcado se demostr la transferencia de compuestos carbonados hacia el hongo. Sombreado o corte de la parte area afectan la micorrizacin.
El efecto estacional incide en la colonizacin, sta aumenta
en la estacin de activo crecimiento vegetal.
La incidencia de la micorrizacin es mayor cuando la actividad biolgica del cultivo es ms intensa, con preponderancia de arbsculos, responsables de los intercambios
nutritivos con el hospedante. Las hifas y esporas contribuyen a la propagacin del endofito y las vesculas almacenan nutrientes que el hongo moviliza en condiciones
adversas.
Figura 10- Estructuras de hongos endomicorrcicos: esporas,
vesculas y arbsculos.
Las hifas que se desarrollan dentro de la raz estn conectadas a un fino micelio que se extiende en el suelo
vecino. Los pices radicales no se presentan frecuentemente colonizados, como tampoco las races gruesas
Las esporas presentes en las clulas colonizadas y en el
suelo vecino. Su morfologa permite la caracterizacin de
especies (Schenck y Prez, 1988) luego de trabajoso procedimiento de aislamiento a partir se suelo rizosfrico por
tamizado hmedo (Anexo prctico).
Se suele determinar la longitud de la raz con alguna de
las estructuras de los hongos que forman micorrizas tipo
Otros factores del ambiente, como la luz y la temperatura, afectan el desarrollo del hospedante y por ende la disponibilidad de nutrientes para el hongo. Existe correlacin entre grado de colonizacin y nivel de hidratos de
carbono en jvenes plntulas.
La temperatura del suelo parece afectar ms la actividad
fisiolgica de la micorriza que su desarrollo
La aireacin: la escasa colonizacin en suelos inundados est relacionada a la falta de oxgeno
La fertilizacin afecta el establecimiento del hongo. La
inhibicin por fosfatos solubles ha sido bien documentada: cuando la concentracin de P en los tejidos vegeta-
plagas. Goult (1990) y Campbell (1990) sealan algunas de las lneas futuras de investigacin en el tema (cuadro 12).
319
Alternativas a la inoculacin
Muchas prcticas de manejo conducen al control de microorganismos fitopatgenos por estimulacin de la microflora antagonista naturalmente presente, a veces en
bajo nivel, en los suelos. Algunos ejemplos de estas prcticas incluyen:
318
Lillian Frioni
ser degradadas tanto por aislamientos de Serratia marcescens como por extractos acelulares de la misma cepa
con actividad quitinoltica. La adicin de quitina al suelo
incrementa el nmero de bacterias y actinomicetes, muchos de ellos inducen quitinasa afectando a la poblacin
fngica.
Beneficios mutuos
Beneficios para la planta
En general cultivos creciendo en suelos deficientes en P
responden rpidamente a la inoculacin y en las primeras
semanas ya se aprecian diferencias en el desarrollo de
plntulas inoculadas y a los pocos das se visualizan los
arbsculos intracelulares. En general, se encuentra que
303
la respuesta a la micorrizacin est inversamente correlacionada con el contenido de P lbil del suelo.
Absorcin de P por las hifas El P32 se acumula en
estructuras fngicas, a partir de la fraccin soluble, en
ensayos de corta duracin. La fraccin asimilable o
intercambiable de fosfato representa slo entre el 1 y
el 5% del contenido total de P en los suelos. Los hongos MA, al mismo tiempo que incrementan la capacidad de absorcin de fosfato asimilable, pueden tambin solubilizar fuentes no disponibles o escasamente
disponibles. Las plantas micorrizadas responden al
agregado de fuentes insolubles de P como fosfato de
roca, hidroxiapatita.
Translocacin de P a lo largo de las hifas. Las hifas
acumulan grandes cantidades de P que podra interferir en el metabolismo celular, lo que se evita por su
rpida conversin en polifosfato, osmticamente inactivo. Los grnulos, contenidos en vacuolas que pueden representar entre un 16 y 40% del total de P en
estos hongos, se evidencian en el microscopio electrnico. La translocacin tiene lugar por corrientes citoplasmticas rpidas. Los hongos poseen las enzimas
necesarias para la sntesis y degradacin de los polifosfatos, asi como fosfatasas, cuyo nivel disminuye con
la fertilizacin fosfatada.
Transferencia de P a la planta. La interfase entre ambos
facilita los intercambios, se ha referido un incremento en
la permeabilidad de la membrana de la hifa inducida por
el hospedero, la transferencia de fosfatos estara acoplada de alguna manera a la transferencia de carbohidratos
desde el mismo.
Otros beneficios:
* numerosos minerales son absorbidos en mayor grado
por plantas micorrizadas con hongos tipo MA, pero no
existen referencias sobre absorcin incrementada de
iones mviles en el suelo, como los nitratos. La toma de
agua parecera estar incrementada y la resistencia a
condiciones de sequedad se atribuye a la capacidad de
la planta micorrizada para mantener un adecuado nivel
de fsforo ya que la baja humedad disminuye la movilidad de los iones fosfato, ms que a un efecto directo
sobre la absorcin del agua.
304
Lillian Frioni
* detoxificacin del medio: remocin de inhibidores, presentes en el suelo o producidos por los mtodos de esterilizacin, ejemplo, metales pesados
* produccin de sustancias biticas, solubles en agua
o voltiles, como aminocidos, vitaminas, fitohormonas
* cambios en el pH, como en el caso de los solubilizadores de fosfatos (captulo 12)
* produccin de fitohormonas, como lo hacen bacterias
y otros organismos del suelo. Su balance resulta de fundamental importancia en la regulacin del crecimiento
vegetal
Las clulas de la corteza colonizadas con hongos que forman MA incrementan las mitocondrias, retculo endoplasmtico, clorofila, respiracin, tamao del ncleo y disminuyen su contenido en almidn y la invasin por hongos
patgenos.
Los hongos micorrcicos tanto ecto como endomicorrcicos, pueden contribuir entonces a:
la mineralizacin de P orgnico por actividad de fosfatasas localizadas en arbsculos maduros e hifas intercelulares y
la solubilizacin de P insoluble (fosfato triclcico, hidroxiapatita, polvo de roca) mediante la produccin de
cidos. La seleccin de inoculantes se realiza incluyendo
estas propiedades.
Inoculacin
La principal limitante en la inoculacin de plantines con
hongos endomicorrcicos es la incapacidad de desarrollarse en cultivo puro en medios de laboratorio, por lo
que no se cuenta al presente con inoculante a base de
micelio.
Existen, sin embargo, numerosas publicaciones sobre
efectos en los rendimientos de varios cultivos luego de
la inoculacin con Endogonaceae, sobre todo a nivel experimental. La inoculacin es promisoria en el caso de
plantas de valor econmico: ornamentales y micropropagadas (citrus, caf, etc.). No se puede pensar por el
momento su uso en cultivos extensivos. Para que la
inoculacin sea exitosa se deben reunir una serie de condiciones:
alta competencia del inculo en caso de que la poblacin nativa sea alta y gran capacidad para estimular la
toma de nutrientes y el crecimiento vegetal.
Micoparasitismo
El empleo de hongos como agentes de biocontrol se ha
extendido mucho en los ltimos aos y la literatura es muy
amplia sobre resultados de antagonismo de patgenos,
sobretodo de otros hongos (Howell, 1990). El grupo de
Hyphomycetes ms empleado en el control biolgico lo
integran los gneros: Verticillium, Trichoderma y Gliocladium, los 3 son micoparsitos necrotrficos (matan inmediatamente del contacto con el hospedante) y buenos
saprofitas que crecen en medios corrientes de laboratorio. V. biguttatum se encuentra en asociacin con esclerocios de Rhizoctonia solani y se usa en el tratamiento de
semillas de papa, donde reduce significativamente el nmero de esclerocios patgenos en los nuevos tubrculos.
317
te, aunque las tcnicas de manipulacin gentica en hongos han prosperado menos que en bacterias. La mutagnesis en hongos es un proceso bastante inespecfico y se
han realizado avances con la fusin de protoplastos a los
efectos de lograr la transferencia de caracteres de inters
asociados al biocontrol de una cepa de hongo a otra.
Otros mecanismos
Se han propuesto otras explicaciones de los incrementos en el crecimiento vegetal y la resistencia a enfermedades en plantas inoculadas con microorganismos de
biocontrol:
* enzimas lticas extracelulares que destruyen la integridad de las paredes de hongos, como quitinasas. Se
ha demostrado que las hifas de Sclerotium rolfsii pueden
316
Lillian Frioni
Antagonista
% germinacin
-Fe
+Fe
Control
Pseudomonas 346
Pseudomonas NIR
83
10
15
94
46
50
Enterobacter
12
40
El cuadro 10 presenta los resultados de un ensayo sobre actividad antagonista ltica y de antibiosis contra Rhizoctonia solani en suelos supresivos y conductivos para
este patgeno. Se aprecia que el efecto parece deberse
al incremento en hongos totales y entre ellos a un antagonista natural productor de antibiticos.
Control
15
No supresivo 6
56
57
1,5 x 104
2,0 x 102
Supresivo
63
4,0 x 104
17
Botrytis cinerea
Cochliobolus sativus
C. victoria
Fusarium solani
Trichoderma hamatum
T. harzianum
cepa 429
-Fe
+Fe
2,7
0
3,8
0
6,0
0
0
0
6,3
0
6,5
0
cepa 374
-Fe
+Fe
15,0
4,0
9,5
4,2
4,3
1,0
0
0
4,8
3,0
4,6
1,3
El inculo:
control
mezcla de suelo con races de plantas trampa (sorgo, cebolla, etc.) inoculadas con esporas, crecidas y luego sometidas a estrs (sequedad) a los efectos de que
el hongo esporule (Anexo prctico).
Testigo
rhizobio (Rh)
ME3
MYV
ME3 + Rh
MYV + Rh
Peso seco
parte area
(mg)
Peso seco
raz (mg)
N ndulos
por planta
%
colonizacin
micorrcica
155
161
162
161
320
357
60
64
63
68
117
136
0
6
0
0
16
16
0
0
62
67
88
90
Plntulas
Tratamiento
El cuadro 5 publicado por Frioni, (1990), muestra los resultados de inoculacin de plntulas de soja con R. japonicum y una mezcla de esporas, hifas, micelio de hongos
endomicorrcicos Glomus fasciculatus (E3) y Glomus mosseae (YV) y de trozos de races colonizadas, con distintas
dosis de fosfato de roca y el cuadro 6 informa los resultados de inoculacin de Pinus strobus con hongos ectomicorrcicos (Smith y Read, 1997).
altas
305
Peso seco
planta (mg)
Peso seco
races (mg)
N (mg/planta)
Fosfato
(mg/planta)
Potasio
(mg/planta)
ectomicorrizadas
404
175
5,00
0,789
2,97
no micorrizadas
331
166
2,45
0,239
1,55
306
Lillian Frioni
315
6) Micorrizas y plantas micropropagadas: muchas especies hortcolas y forestales son micropropagadas invitro, en medio con agar y azcares y luego transplantadas a sustrato adecuado. Esta etapa constituye una
fase de aclimatacin y con el fin de evitar estrs hdrico
y nutricional, se las inocula con hongos endomicorrcicos (esporas, plantas trampa micorrizadas y picadas)
7) Produccin de hongos comestibles: muchos hongos ectomicorrcicos son tambin comestibles, de modo
que las fructificaciones de ellos en bosques con especies inoculadas son cosechadas y aportan otra fuente
de ingreso al productor forestal (Lactarius deliciosus,
trufas, como Suillus luteus, Cantharellus cibarius). Otros
hongos comestibles son saprofitas y algunos hasta patgenos: Agaricus, Amanita, Tricholome, por lo que no
ofrecen esta dualidad de empleo: micorrizacin y comercializacin.
A modo de repaso el cuadro 6 compara caractersticas
de las ectomicorrizas y las endo del tipo arbuscular (A) y
en el figura 12 (Duhoux y Nicole, 2004) se compara el
funcionamiento de ambos tipos de micorrizas. Las ectomicorrizas excretan enzimas hidrolticas que le permiten
absorber formas orgnicas del N y P. La absorcin de
formas solubles puede realizarse tambin a partir de quelatos (complejos organo minerales). Las hifas de los hongos endomicorrcicos de tipo arbuscular secretan fosfatasas. Tambin se mejora la asimilacin de ciertos oligoelementos como Cu, Zn.
Ectomicorrizas
Endomicorrizas A
Aminocidos
Pelo
absorbente
Fosfatasas
Fosfatasas
P-orgnico
OH
C
N
H
1
OH
N
NO2
CI
N
N
OH
R1
N
H
R2
H
+
N
CH3
O
OH
OH
N
H 2N
OH
CI
CI
N CI
H
N
HC=C-C=C - CH=C=CH
O
O O
OH
la adicin de hierro
Amensalismo
Uno de los principales mecanismos de control biolgico
es la produccin de metabolitos secundarios txicos,
como los antibiticos, o toxinas especficas como las
bacteriocinas que actan sobre hongos patgenos induciendo fungiostasis, inhibiendo la germinacin, lisando el micelio o ejerciendo efectos fungicidas. Son molculas orgnicas liberadas por los microorganismos al
ambiente donde pueden perder efectividad a distancia
de las clulas productoras porque son adsorbidas a los
coloides orgnicos o minerales o son degradadas qumica o biolgicamente. La aparicin de resistencias en
los patgenos, codificada en general en plsmidos, limita muchas veces su efectividad.
Las pseudomonas fluorescentes han sido consideradas para
el control biolgico ya que producen gran nmero de metabolitos secundarios, (figura 3, a y b), muchos con accin
antimicrobiana (1 a 5 figura 3a). Otras pseudomonas producen potentes antibiticos (1 a 5, fig 3b) como tropolone,
bacteriosttico y bactericida de amplio rango de bacterias y
tambin fungicida. Producen tambin HCN.
Algunas pseudomonas han sido patentadas y se emplean
en inoculantes comerciales:
314
Lillian Frioni
Competencia
Se da por nutrientes (C, N, S, P, Fe, micronutrientes, etc.),
espacio, agua, O2, CO2, luz, etc. Una colonizacin agresiva por estos antagonistas desplaza especies rizosfricas
deletreas disminuyendo el riesgo de reduccin del crecimiento vegetal. Se reduce tambin el inculo de patgenos del suelo.
Metabolismo
energtico a
nivel celular
Clula A
SID
Fe+++ + SID
CN-
Clula B
CN -
Fe+++ + SID
Asimilacin
reducida
Estas sustancias favorecen las posibilidades de asimilacin de este in por la bacteria productora en ambientes
de baja disponibilidad, compitiendo con el microorganismo deletreo o patgeno (figura 2).
Ectomicorrizas
Presentes en un 97%
fanergamas y algunos
rboles
Visibles macroscpicamente
Manto fngico, a veces coloreado, red de Hartig; hifas intercelulares, rara vez penetran en las
clulas
Hongos no tabicados
Zygomycotina
(Endogonales)
Basidiomycotina, Ascomycotina
micelio tabicado
No fructifican en medios de
laboratorio, salvo excepciones
Inoculacin en pequea y
mediana escala con esporas
o suelo y races de plantas
trampa
No se conocen especies
venenosas ni comestibles
Requieren al hospedante
para crecer
No lo requieren
Bibliografa
Agerer, R. Characterization of Ectomycorhiza. En: Techniques for Mycorrhizal Research, 1994, J. R. Norris, D. Read y A. K. Varma (eds), Academic Press:
25-73, London
307
Allen, M.F. (ed) Mycorrhizal Functioning, An integrative Plant-Fungal Process, 1991, Chapman & Hall,
New York, 534 pp.
Alvarez, I. F. Ecologa, fisiologa e implicancias prcticas
de las ectomicorrizas. En: Fijacin y Movilizacin de
Nutrientes, vol II, 1991, Coleccin Nuevas tendencias,
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, Madrid: 247-259
Bago, B.; Pfeffer, P. E.; Shachar-Hill. Y. Carbon metabolism and transport in arbuscular mycorrhizas. 2000,
Plant Physiology 124: 949-957
Barea, J. M., C. Azcon-Aguilar, J. A. Ocampo y R. Azcon
Morfologa, anatoma y citologa de las micorrizas vesculo-arbusculares. En: Fijacin y Movilizacin Biolgica de Nutrientes, Vol II, 199, Coleccin Nuevas
Tendencias, vol 18, Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, Madrid: 149-173
Dommergues, Y. y Mangenot, F. Ecologie microbienne
du sol. 1970, Masson, Pars
Dommergues, Y. Duhoux, E. Y Diem, H. G. Les arbres
fixateurs dazote. 1999 Co-edicin CIRAD/FAO/IRD/
Espaces 34, Pars
Duhoux, E. y Nicole, M. Biologie Vgtal: Associations
et Interactions chez les Plantes. 2004, Dunod, Pars: 54-93
Frioni, L. Ecologa microbiana del suelo, 1990 Ed. Universidad de la Repblica, Montevideo
Honrubia, M., P. Torres, G. Diaz y A: Morte, Biotecnologa Forestal: Tcnicas de Micorrizacin y Micropropagacin de Plantas, 1994, Universidad de Murcia, 167 pp.
Le Tacon, E. (editor) Champignons et mycorrhizes en
fret. 1997 Revue Forestire Franaise, N especial.
Ed. Ecole Nacional du Gnie Rural, des eaux et forts.
Nancy
Malvrez, G., Major, G., Curbelo, V. y Frioni, L. Hongos ectomicorrticos en Eucalyptus grandis. 1997,
Agrociencia 1:38-43, Facultad de Agronoma, Montevideo
Marx, D. H., J. L. Ruehle y C. E. Cordell, Methods for studying nursery and field response of trees to specific
ectomycorrhyza. En: Methods in Microbiology, vol
23, Techniques for the Study of Mycorrhyza, 1991,
J. R. Norris,D. J. Read y A. K. Varma (eds), Academic
Press, London: 383-412.
308
Lillian Frioni
Preguntas de repaso
1) En qu momento de la evolucin las plantas necesitaron de hongos asociados? Qu ventajas adquirieron?
La evidencia de control biolgico se obtuvo en la dcada del 80 cuando monocultivos de trigo o cebada infectados con un hongo Gaeumannomyces graminis se trataron con un suelo supresivo para la enfermedad (takeall), es decir un suelo que no permite el desarrollo de
este patgeno.
Los suelos conductivos (que manifiestan la enfermedad)
se convirtieron en supresivos, sugiriendo la participacin
de un factor biolgico. En efecto, se encontr mayor nmero de pseudomonas fluorescentes antagonistas del
hongo en la rizosfera de trigo en relacin al resto del suelo. Actualmente, numerosas pseudomonas se reconocen
efectivas en el control de esta enfermedad.
El control biolgico de enfermedades de races se puede
lograr de varias maneras (cuadro 5).
Cuadro 5- Prcticas de control biolgico
* Inoculacin directa de las bacterias u hongos seleccionados en semillas o trozos de tallos (propagacin vegetativa)
313
312
Lillian Frioni
Control qumico: innumerables sustancias de gran toxicidad se emplean en el tratamiento de enfermedades vegetales. Se calculan 500.000 toneladas de agrotxicos
usadas en el mundo al ao, lo que ha despertado gran
inquietud por los efectos laterales contra los animales y
el hombre, la lenta biodegradacin de muchos y su acumulacin en aguas y suelos.
309
17
En este captulo analizaremos el manejo de las interacciones benficas entre los microorganismos y los vegetales a los efectos de disminuir enfermedades en los mismos causadas por microorganismos del suelo. Los mismos criterios se emplean para control de enfermedades
provocadas por integrantes de la fauna (nemtodos, colmbolos), insectos, etc., que escapan a esta revisin.
Ventajas
* Los microorganismos ofrecen mayor seguridad en el uso
en relacin a muchos agentes qumicos
Neutros o
variables
Perjudiciales
fitotoxicidad, infeccin
Patgeno
Hospedero
Ambiente y
antagnistas
Como el suelo cambia menos rpidamente que la atmsfera sobre l, los microorganismos estn adaptados a este
habitat relativamente estable. Las poblaciones de antagonistas, patgenos y plantas fluctan dentro de ciertos
lmites en respuesta a las interacciones biticas y abiticas. Ligeros cambios en las condiciones del ambiente
pueden ejercer profundos efectos en poblaciones de patgenos o antagonistas aislados. Los cambios producidos por la agricultura son en general rpidos, variados y
permiten en poco tiempo recuperar el equilibrio biolgico.
Pero el uso intensivo de fertilizantes, pesticidas, irrigacin,
labranzas y otras prcticas que tienden a incrementar los
310
Lillian Frioni
rendimientos han resultado en incrementos en la severidad o incidencia de enfermedades vegetales. Los monocultivos estimulan ciertas enfermedades que ocurriran
raramente en ecosistemas no perturbados.
Benficos
Bacterias fijadoras de N2:
no simbiticos: Azospirillum, Azotobacter, Clostridium,
Acetobacter
simbiticos: Rhizobium, Bradyrhizobium, Frankia, Azorhizobium
Rizobacterias estimulantes del crecimiento vegetal
(PGPR en ingls)
solubilizacin de Pi
liberacin sustancias estimulantes crecimiento
mayor absorcin de agua y de nutrientes
antagonistas de patgenos
degradacin de sustancias fitotxicas
Hongos micorrticos
ectomicorrticos: Pisolithus, Suillus, Laccaria
endomicorrticos: Glomus, Acaulospora
Microorganismos empleados en control biolgico
antagonistas de bacterias (Agrobacterium tumefaciens)
antagonistas de hongos (bacterias, otros hongos)
Microorganismos en la rehabilitacin de suelos
revegetacin
manejo de residuos txicos
solubilizacin de fosfatos
Tcnicas de estimulacin de estos microorganismos
manejo de residuos (abonos, pajas)
inoculacin
Patgenos
bacterias
hongos
los virus (entidades biolgicas)
Deletreos
Asociados al mantillo
inmovilizantes del N
sntesis de sustancias txicas (cidos orgnicos,
toxinas)
Rizobacterias
reductoras de S, Fe, Mn
antagonistas de microorganismos promotores
311
Mecanismos de accin
1. Produccin de sustancias estimulantes del crecimiento vegetal. En medios de cultivo se ha verificado
la produccin de sustancias del tipo de las fitohormonas; auxinas, giberelinas, citoquininas. El cido indol
actico (AIA) a bajas concentraciones promueve la elongacin radical e incrementa las ramificaciones laterales
(aumenta el rea radical), mientras que mayores concentraciones pueden resultar inhibitorias. Algunos autores relacionan la produccin de AIA con aumentos en
la permeabilidad celular con consiguiente incremento
en la exudacin radical. Se han logrado los mismos efectos con la adicin de giberelinas o AIA que con la inoculacin con diazotrofos, como por ejemplo, Azospirillum,
evidenciando que el efecto en los incrementos de los
rendimientos se deben principalmente a estas sustancias (Fulchieri, 1992).
2. Incrementos en la capacidad de absorcin de agua
y minerales. Los MPCV aumentan la disponibilidad de
nutrientes poco mviles (fosfatos) y su absorcin por la
planta. Los microorganismos solublizadores de fsforo
como Bacillus megaterium, B. fluorescens son capaces
de mineralizar P orgnico (fosfatasas) o solubilizar el P
inorgnico por produccin de cidos (captulos 12 y 16).
Los procesos de oxido-reduccin ponen a disposicin
de los vegetales nutrientes solubles asimilables (nitratos, sulfatos, sales ferrosas, etc.) (captulos 10 y 12).
La inoculacin con diazotrofos como Azospirillum y la simbiosis con hongos ecto y endomicorrticos producen estos efectos.
3. Estimulacin de la germinacin y emergencia
Se verific la produccin de sustancias de tipo fenoles
como las quinonas por Pseudomonas estimulan la germinacin de semillas y la emergencia de plntulas.
310
Lillian Frioni
rendimientos han resultado en incrementos en la severidad o incidencia de enfermedades vegetales. Los monocultivos estimulan ciertas enfermedades que ocurriran
raramente en ecosistemas no perturbados.
Benficos
Bacterias fijadoras de N2:
no simbiticos: Azospirillum, Azotobacter, Clostridium,
Acetobacter
simbiticos: Rhizobium, Bradyrhizobium, Frankia, Azorhizobium
Rizobacterias estimulantes del crecimiento vegetal
(PGPR en ingls)
solubilizacin de Pi
liberacin sustancias estimulantes crecimiento
mayor absorcin de agua y de nutrientes
antagonistas de patgenos
degradacin de sustancias fitotxicas
Hongos micorrticos
ectomicorrticos: Pisolithus, Suillus, Laccaria
endomicorrticos: Glomus, Acaulospora
Microorganismos empleados en control biolgico
antagonistas de bacterias (Agrobacterium tumefaciens)
antagonistas de hongos (bacterias, otros hongos)
Microorganismos en la rehabilitacin de suelos
revegetacin
manejo de residuos txicos
solubilizacin de fosfatos
Tcnicas de estimulacin de estos microorganismos
manejo de residuos (abonos, pajas)
inoculacin
Patgenos
bacterias
hongos
los virus (entidades biolgicas)
Deletreos
Asociados al mantillo
inmovilizantes del N
sntesis de sustancias txicas (cidos orgnicos,
toxinas)
Rizobacterias
reductoras de S, Fe, Mn
antagonistas de microorganismos promotores
311
Mecanismos de accin
1. Produccin de sustancias estimulantes del crecimiento vegetal. En medios de cultivo se ha verificado
la produccin de sustancias del tipo de las fitohormonas; auxinas, giberelinas, citoquininas. El cido indol
actico (AIA) a bajas concentraciones promueve la elongacin radical e incrementa las ramificaciones laterales
(aumenta el rea radical), mientras que mayores concentraciones pueden resultar inhibitorias. Algunos autores relacionan la produccin de AIA con aumentos en
la permeabilidad celular con consiguiente incremento
en la exudacin radical. Se han logrado los mismos efectos con la adicin de giberelinas o AIA que con la inoculacin con diazotrofos, como por ejemplo, Azospirillum,
evidenciando que el efecto en los incrementos de los
rendimientos se deben principalmente a estas sustancias (Fulchieri, 1992).
2. Incrementos en la capacidad de absorcin de agua
y minerales. Los MPCV aumentan la disponibilidad de
nutrientes poco mviles (fosfatos) y su absorcin por la
planta. Los microorganismos solublizadores de fsforo
como Bacillus megaterium, B. fluorescens son capaces
de mineralizar P orgnico (fosfatasas) o solubilizar el P
inorgnico por produccin de cidos (captulos 12 y 16).
Los procesos de oxido-reduccin ponen a disposicin
de los vegetales nutrientes solubles asimilables (nitratos, sulfatos, sales ferrosas, etc.) (captulos 10 y 12).
La inoculacin con diazotrofos como Azospirillum y la simbiosis con hongos ecto y endomicorrticos producen estos efectos.
3. Estimulacin de la germinacin y emergencia
Se verific la produccin de sustancias de tipo fenoles
como las quinonas por Pseudomonas estimulan la germinacin de semillas y la emergencia de plntulas.
312
Lillian Frioni
Control qumico: innumerables sustancias de gran toxicidad se emplean en el tratamiento de enfermedades vegetales. Se calculan 500.000 toneladas de agrotxicos
usadas en el mundo al ao, lo que ha despertado gran
inquietud por los efectos laterales contra los animales y
el hombre, la lenta biodegradacin de muchos y su acumulacin en aguas y suelos.
309
17
En este captulo analizaremos el manejo de las interacciones benficas entre los microorganismos y los vegetales a los efectos de disminuir enfermedades en los mismos causadas por microorganismos del suelo. Los mismos criterios se emplean para control de enfermedades
provocadas por integrantes de la fauna (nemtodos, colmbolos), insectos, etc., que escapan a esta revisin.
Ventajas
* Los microorganismos ofrecen mayor seguridad en el uso
en relacin a muchos agentes qumicos
Neutros o
variables
Perjudiciales
fitotoxicidad, infeccin
Patgeno
Hospedero
Ambiente y
antagnistas
Como el suelo cambia menos rpidamente que la atmsfera sobre l, los microorganismos estn adaptados a este
habitat relativamente estable. Las poblaciones de antagonistas, patgenos y plantas fluctan dentro de ciertos
lmites en respuesta a las interacciones biticas y abiticas. Ligeros cambios en las condiciones del ambiente
pueden ejercer profundos efectos en poblaciones de patgenos o antagonistas aislados. Los cambios producidos por la agricultura son en general rpidos, variados y
permiten en poco tiempo recuperar el equilibrio biolgico.
Pero el uso intensivo de fertilizantes, pesticidas, irrigacin,
labranzas y otras prcticas que tienden a incrementar los
308
Lillian Frioni
Preguntas de repaso
1) En qu momento de la evolucin las plantas necesitaron de hongos asociados? Qu ventajas adquirieron?
La evidencia de control biolgico se obtuvo en la dcada del 80 cuando monocultivos de trigo o cebada infectados con un hongo Gaeumannomyces graminis se trataron con un suelo supresivo para la enfermedad (takeall), es decir un suelo que no permite el desarrollo de
este patgeno.
Los suelos conductivos (que manifiestan la enfermedad)
se convirtieron en supresivos, sugiriendo la participacin
de un factor biolgico. En efecto, se encontr mayor nmero de pseudomonas fluorescentes antagonistas del
hongo en la rizosfera de trigo en relacin al resto del suelo. Actualmente, numerosas pseudomonas se reconocen
efectivas en el control de esta enfermedad.
El control biolgico de enfermedades de races se puede
lograr de varias maneras (cuadro 5).
Cuadro 5- Prcticas de control biolgico
* Inoculacin directa de las bacterias u hongos seleccionados en semillas o trozos de tallos (propagacin vegetativa)
313
314
Lillian Frioni
Competencia
Se da por nutrientes (C, N, S, P, Fe, micronutrientes, etc.),
espacio, agua, O2, CO2, luz, etc. Una colonizacin agresiva por estos antagonistas desplaza especies rizosfricas
deletreas disminuyendo el riesgo de reduccin del crecimiento vegetal. Se reduce tambin el inculo de patgenos del suelo.
Metabolismo
energtico a
nivel celular
Clula A
SID
Fe+++ + SID
CN-
Clula B
CN -
Fe+++ + SID
Asimilacin
reducida
Estas sustancias favorecen las posibilidades de asimilacin de este in por la bacteria productora en ambientes
de baja disponibilidad, compitiendo con el microorganismo deletreo o patgeno (figura 2).
Ectomicorrizas
Presentes en un 97%
fanergamas y algunos
rboles
Visibles macroscpicamente
Manto fngico, a veces coloreado, red de Hartig; hifas intercelulares, rara vez penetran en las
clulas
Hongos no tabicados
Zygomycotina
(Endogonales)
Basidiomycotina, Ascomycotina
micelio tabicado
No fructifican en medios de
laboratorio, salvo excepciones
Inoculacin en pequea y
mediana escala con esporas
o suelo y races de plantas
trampa
No se conocen especies
venenosas ni comestibles
Requieren al hospedante
para crecer
No lo requieren
Bibliografa
Agerer, R. Characterization of Ectomycorhiza. En: Techniques for Mycorrhizal Research, 1994, J. R. Norris, D. Read y A. K. Varma (eds), Academic Press:
25-73, London
307
Allen, M.F. (ed) Mycorrhizal Functioning, An integrative Plant-Fungal Process, 1991, Chapman & Hall,
New York, 534 pp.
Alvarez, I. F. Ecologa, fisiologa e implicancias prcticas
de las ectomicorrizas. En: Fijacin y Movilizacin de
Nutrientes, vol II, 1991, Coleccin Nuevas tendencias,
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, Madrid: 247-259
Bago, B.; Pfeffer, P. E.; Shachar-Hill. Y. Carbon metabolism and transport in arbuscular mycorrhizas. 2000,
Plant Physiology 124: 949-957
Barea, J. M., C. Azcon-Aguilar, J. A. Ocampo y R. Azcon
Morfologa, anatoma y citologa de las micorrizas vesculo-arbusculares. En: Fijacin y Movilizacin Biolgica de Nutrientes, Vol II, 199, Coleccin Nuevas
Tendencias, vol 18, Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, Madrid: 149-173
Dommergues, Y. y Mangenot, F. Ecologie microbienne
du sol. 1970, Masson, Pars
Dommergues, Y. Duhoux, E. Y Diem, H. G. Les arbres
fixateurs dazote. 1999 Co-edicin CIRAD/FAO/IRD/
Espaces 34, Pars
Duhoux, E. y Nicole, M. Biologie Vgtal: Associations
et Interactions chez les Plantes. 2004, Dunod, Pars: 54-93
Frioni, L. Ecologa microbiana del suelo, 1990 Ed. Universidad de la Repblica, Montevideo
Honrubia, M., P. Torres, G. Diaz y A: Morte, Biotecnologa Forestal: Tcnicas de Micorrizacin y Micropropagacin de Plantas, 1994, Universidad de Murcia, 167 pp.
Le Tacon, E. (editor) Champignons et mycorrhizes en
fret. 1997 Revue Forestire Franaise, N especial.
Ed. Ecole Nacional du Gnie Rural, des eaux et forts.
Nancy
Malvrez, G., Major, G., Curbelo, V. y Frioni, L. Hongos ectomicorrticos en Eucalyptus grandis. 1997,
Agrociencia 1:38-43, Facultad de Agronoma, Montevideo
Marx, D. H., J. L. Ruehle y C. E. Cordell, Methods for studying nursery and field response of trees to specific
ectomycorrhyza. En: Methods in Microbiology, vol
23, Techniques for the Study of Mycorrhyza, 1991,
J. R. Norris,D. J. Read y A. K. Varma (eds), Academic
Press, London: 383-412.
306
Lillian Frioni
315
6) Micorrizas y plantas micropropagadas: muchas especies hortcolas y forestales son micropropagadas invitro, en medio con agar y azcares y luego transplantadas a sustrato adecuado. Esta etapa constituye una
fase de aclimatacin y con el fin de evitar estrs hdrico
y nutricional, se las inocula con hongos endomicorrcicos (esporas, plantas trampa micorrizadas y picadas)
7) Produccin de hongos comestibles: muchos hongos ectomicorrcicos son tambin comestibles, de modo
que las fructificaciones de ellos en bosques con especies inoculadas son cosechadas y aportan otra fuente
de ingreso al productor forestal (Lactarius deliciosus,
trufas, como Suillus luteus, Cantharellus cibarius). Otros
hongos comestibles son saprofitas y algunos hasta patgenos: Agaricus, Amanita, Tricholome, por lo que no
ofrecen esta dualidad de empleo: micorrizacin y comercializacin.
A modo de repaso el cuadro 6 compara caractersticas
de las ectomicorrizas y las endo del tipo arbuscular (A) y
en el figura 12 (Duhoux y Nicole, 2004) se compara el
funcionamiento de ambos tipos de micorrizas. Las ectomicorrizas excretan enzimas hidrolticas que le permiten
absorber formas orgnicas del N y P. La absorcin de
formas solubles puede realizarse tambin a partir de quelatos (complejos organo minerales). Las hifas de los hongos endomicorrcicos de tipo arbuscular secretan fosfatasas. Tambin se mejora la asimilacin de ciertos oligoelementos como Cu, Zn.
Ectomicorrizas
Endomicorrizas A
Aminocidos
Pelo
absorbente
Fosfatasas
Fosfatasas
P-orgnico
OH
C
N
H
1
OH
N
NO2
CI
N
N
OH
R1
N
H
R2
H
+
N
CH3
O
OH
OH
N
H 2N
OH
CI
CI
N CI
H
N
HC=C-C=C - CH=C=CH
O
O O
OH
la adicin de hierro
Amensalismo
Uno de los principales mecanismos de control biolgico
es la produccin de metabolitos secundarios txicos,
como los antibiticos, o toxinas especficas como las
bacteriocinas que actan sobre hongos patgenos induciendo fungiostasis, inhibiendo la germinacin, lisando el micelio o ejerciendo efectos fungicidas. Son molculas orgnicas liberadas por los microorganismos al
ambiente donde pueden perder efectividad a distancia
de las clulas productoras porque son adsorbidas a los
coloides orgnicos o minerales o son degradadas qumica o biolgicamente. La aparicin de resistencias en
los patgenos, codificada en general en plsmidos, limita muchas veces su efectividad.
Las pseudomonas fluorescentes han sido consideradas para
el control biolgico ya que producen gran nmero de metabolitos secundarios, (figura 3, a y b), muchos con accin
antimicrobiana (1 a 5 figura 3a). Otras pseudomonas producen potentes antibiticos (1 a 5, fig 3b) como tropolone,
bacteriosttico y bactericida de amplio rango de bacterias y
tambin fungicida. Producen tambin HCN.
Algunas pseudomonas han sido patentadas y se emplean
en inoculantes comerciales:
316
Lillian Frioni
Antagonista
% germinacin
-Fe
+Fe
Control
Pseudomonas 346
Pseudomonas NIR
83
10
15
94
46
50
Enterobacter
12
40
El cuadro 10 presenta los resultados de un ensayo sobre actividad antagonista ltica y de antibiosis contra Rhizoctonia solani en suelos supresivos y conductivos para
este patgeno. Se aprecia que el efecto parece deberse
al incremento en hongos totales y entre ellos a un antagonista natural productor de antibiticos.
Control
15
No supresivo 6
56
57
1,5 x 104
2,0 x 102
Supresivo
63
4,0 x 104
17
Botrytis cinerea
Cochliobolus sativus
C. victoria
Fusarium solani
Trichoderma hamatum
T. harzianum
cepa 429
-Fe
+Fe
2,7
0
3,8
0
6,0
0
0
0
6,3
0
6,5
0
cepa 374
-Fe
+Fe
15,0
4,0
9,5
4,2
4,3
1,0
0
0
4,8
3,0
4,6
1,3
El inculo:
control
mezcla de suelo con races de plantas trampa (sorgo, cebolla, etc.) inoculadas con esporas, crecidas y luego sometidas a estrs (sequedad) a los efectos de que
el hongo esporule (Anexo prctico).
Testigo
rhizobio (Rh)
ME3
MYV
ME3 + Rh
MYV + Rh
Peso seco
parte area
(mg)
Peso seco
raz (mg)
N ndulos
por planta
%
colonizacin
micorrcica
155
161
162
161
320
357
60
64
63
68
117
136
0
6
0
0
16
16
0
0
62
67
88
90
Plntulas
Tratamiento
El cuadro 5 publicado por Frioni, (1990), muestra los resultados de inoculacin de plntulas de soja con R. japonicum y una mezcla de esporas, hifas, micelio de hongos
endomicorrcicos Glomus fasciculatus (E3) y Glomus mosseae (YV) y de trozos de races colonizadas, con distintas
dosis de fosfato de roca y el cuadro 6 informa los resultados de inoculacin de Pinus strobus con hongos ectomicorrcicos (Smith y Read, 1997).
altas
305
Peso seco
planta (mg)
Peso seco
races (mg)
N (mg/planta)
Fosfato
(mg/planta)
Potasio
(mg/planta)
ectomicorrizadas
404
175
5,00
0,789
2,97
no micorrizadas
331
166
2,45
0,239
1,55
304
Lillian Frioni
* detoxificacin del medio: remocin de inhibidores, presentes en el suelo o producidos por los mtodos de esterilizacin, ejemplo, metales pesados
* produccin de sustancias biticas, solubles en agua
o voltiles, como aminocidos, vitaminas, fitohormonas
* cambios en el pH, como en el caso de los solubilizadores de fosfatos (captulo 12)
* produccin de fitohormonas, como lo hacen bacterias
y otros organismos del suelo. Su balance resulta de fundamental importancia en la regulacin del crecimiento
vegetal
Las clulas de la corteza colonizadas con hongos que forman MA incrementan las mitocondrias, retculo endoplasmtico, clorofila, respiracin, tamao del ncleo y disminuyen su contenido en almidn y la invasin por hongos
patgenos.
Los hongos micorrcicos tanto ecto como endomicorrcicos, pueden contribuir entonces a:
la mineralizacin de P orgnico por actividad de fosfatasas localizadas en arbsculos maduros e hifas intercelulares y
la solubilizacin de P insoluble (fosfato triclcico, hidroxiapatita, polvo de roca) mediante la produccin de
cidos. La seleccin de inoculantes se realiza incluyendo
estas propiedades.
Inoculacin
La principal limitante en la inoculacin de plantines con
hongos endomicorrcicos es la incapacidad de desarrollarse en cultivo puro en medios de laboratorio, por lo
que no se cuenta al presente con inoculante a base de
micelio.
Existen, sin embargo, numerosas publicaciones sobre
efectos en los rendimientos de varios cultivos luego de
la inoculacin con Endogonaceae, sobre todo a nivel experimental. La inoculacin es promisoria en el caso de
plantas de valor econmico: ornamentales y micropropagadas (citrus, caf, etc.). No se puede pensar por el
momento su uso en cultivos extensivos. Para que la
inoculacin sea exitosa se deben reunir una serie de condiciones:
alta competencia del inculo en caso de que la poblacin nativa sea alta y gran capacidad para estimular la
toma de nutrientes y el crecimiento vegetal.
Micoparasitismo
El empleo de hongos como agentes de biocontrol se ha
extendido mucho en los ltimos aos y la literatura es muy
amplia sobre resultados de antagonismo de patgenos,
sobretodo de otros hongos (Howell, 1990). El grupo de
Hyphomycetes ms empleado en el control biolgico lo
integran los gneros: Verticillium, Trichoderma y Gliocladium, los 3 son micoparsitos necrotrficos (matan inmediatamente del contacto con el hospedante) y buenos
saprofitas que crecen en medios corrientes de laboratorio. V. biguttatum se encuentra en asociacin con esclerocios de Rhizoctonia solani y se usa en el tratamiento de
semillas de papa, donde reduce significativamente el nmero de esclerocios patgenos en los nuevos tubrculos.
317
te, aunque las tcnicas de manipulacin gentica en hongos han prosperado menos que en bacterias. La mutagnesis en hongos es un proceso bastante inespecfico y se
han realizado avances con la fusin de protoplastos a los
efectos de lograr la transferencia de caracteres de inters
asociados al biocontrol de una cepa de hongo a otra.
Otros mecanismos
Se han propuesto otras explicaciones de los incrementos en el crecimiento vegetal y la resistencia a enfermedades en plantas inoculadas con microorganismos de
biocontrol:
* enzimas lticas extracelulares que destruyen la integridad de las paredes de hongos, como quitinasas. Se
ha demostrado que las hifas de Sclerotium rolfsii pueden
318
Lillian Frioni
ser degradadas tanto por aislamientos de Serratia marcescens como por extractos acelulares de la misma cepa
con actividad quitinoltica. La adicin de quitina al suelo
incrementa el nmero de bacterias y actinomicetes, muchos de ellos inducen quitinasa afectando a la poblacin
fngica.
Beneficios mutuos
Beneficios para la planta
En general cultivos creciendo en suelos deficientes en P
responden rpidamente a la inoculacin y en las primeras
semanas ya se aprecian diferencias en el desarrollo de
plntulas inoculadas y a los pocos das se visualizan los
arbsculos intracelulares. En general, se encuentra que
303
la respuesta a la micorrizacin est inversamente correlacionada con el contenido de P lbil del suelo.
Absorcin de P por las hifas El P32 se acumula en
estructuras fngicas, a partir de la fraccin soluble, en
ensayos de corta duracin. La fraccin asimilable o
intercambiable de fosfato representa slo entre el 1 y
el 5% del contenido total de P en los suelos. Los hongos MA, al mismo tiempo que incrementan la capacidad de absorcin de fosfato asimilable, pueden tambin solubilizar fuentes no disponibles o escasamente
disponibles. Las plantas micorrizadas responden al
agregado de fuentes insolubles de P como fosfato de
roca, hidroxiapatita.
Translocacin de P a lo largo de las hifas. Las hifas
acumulan grandes cantidades de P que podra interferir en el metabolismo celular, lo que se evita por su
rpida conversin en polifosfato, osmticamente inactivo. Los grnulos, contenidos en vacuolas que pueden representar entre un 16 y 40% del total de P en
estos hongos, se evidencian en el microscopio electrnico. La translocacin tiene lugar por corrientes citoplasmticas rpidas. Los hongos poseen las enzimas
necesarias para la sntesis y degradacin de los polifosfatos, asi como fosfatasas, cuyo nivel disminuye con
la fertilizacin fosfatada.
Transferencia de P a la planta. La interfase entre ambos
facilita los intercambios, se ha referido un incremento en
la permeabilidad de la membrana de la hifa inducida por
el hospedero, la transferencia de fosfatos estara acoplada de alguna manera a la transferencia de carbohidratos
desde el mismo.
Otros beneficios:
* numerosos minerales son absorbidos en mayor grado
por plantas micorrizadas con hongos tipo MA, pero no
existen referencias sobre absorcin incrementada de
iones mviles en el suelo, como los nitratos. La toma de
agua parecera estar incrementada y la resistencia a
condiciones de sequedad se atribuye a la capacidad de
la planta micorrizada para mantener un adecuado nivel
de fsforo ya que la baja humedad disminuye la movilidad de los iones fosfato, ms que a un efecto directo
sobre la absorcin del agua.
302
Lillian Frioni
MA, observando segmentos de 1 cm a intervalos regulares. Esta longitud puede llegar a un tercio del total en muchas plantas cultivadas y superar 70-80% (Honrubia et
al., 1994; Sieverding y Barea, 1991), en plantas inoculadas, en vivero.
Ecologa
Muchos son los factores que afectan la formacin y desarrollo de las micorrizas MA. La fotosntesis es uno de los
ms importantes, pero el manejo de los cultivos (fertilizacin, biocidas, rotaciones), la abundancia de inculo en
los suelos, la susceptibilidad de la planta, las condiciones
de temperatura, humedad, pH, estacin del ao, afectarn el grado y la eficiencia de la asociacin.
Fotosntesis: con CO2 marcado se demostr la transferencia de compuestos carbonados hacia el hongo. Sombreado o corte de la parte area afectan la micorrizacin.
El efecto estacional incide en la colonizacin, sta aumenta
en la estacin de activo crecimiento vegetal.
La incidencia de la micorrizacin es mayor cuando la actividad biolgica del cultivo es ms intensa, con preponderancia de arbsculos, responsables de los intercambios
nutritivos con el hospedante. Las hifas y esporas contribuyen a la propagacin del endofito y las vesculas almacenan nutrientes que el hongo moviliza en condiciones
adversas.
Figura 10- Estructuras de hongos endomicorrcicos: esporas,
vesculas y arbsculos.
Las hifas que se desarrollan dentro de la raz estn conectadas a un fino micelio que se extiende en el suelo
vecino. Los pices radicales no se presentan frecuentemente colonizados, como tampoco las races gruesas
Las esporas presentes en las clulas colonizadas y en el
suelo vecino. Su morfologa permite la caracterizacin de
especies (Schenck y Prez, 1988) luego de trabajoso procedimiento de aislamiento a partir se suelo rizosfrico por
tamizado hmedo (Anexo prctico).
Se suele determinar la longitud de la raz con alguna de
las estructuras de los hongos que forman micorrizas tipo
Otros factores del ambiente, como la luz y la temperatura, afectan el desarrollo del hospedante y por ende la disponibilidad de nutrientes para el hongo. Existe correlacin entre grado de colonizacin y nivel de hidratos de
carbono en jvenes plntulas.
La temperatura del suelo parece afectar ms la actividad
fisiolgica de la micorriza que su desarrollo
La aireacin: la escasa colonizacin en suelos inundados est relacionada a la falta de oxgeno
La fertilizacin afecta el establecimiento del hongo. La
inhibicin por fosfatos solubles ha sido bien documentada: cuando la concentracin de P en los tejidos vegeta-
plagas. Goult (1990) y Campbell (1990) sealan algunas de las lneas futuras de investigacin en el tema (cuadro 12).
319
Alternativas a la inoculacin
Muchas prcticas de manejo conducen al control de microorganismos fitopatgenos por estimulacin de la microflora antagonista naturalmente presente, a veces en
bajo nivel, en los suelos. Algunos ejemplos de estas prcticas incluyen:
320
Lillian Frioni
% de infeccin
74
51
18
13
6
* 1986 Schipers obtiene mutante sid (Tn5) de P. fluorescens WCS 358 que no promueve crecimiento de papas
en campo, si lo hace su recombinante sid+
* Se incrementan los trabajos en bacterias: P. fluorescens,
P. putida. Bacillus, Azospirillum, hongos: Thrichoderma,
Penicillum, Cladosporium, Gliocladium
* 1993 mercado agroqumicos en el mundo U$S 12.106,
agentes biolgicos 1% (120 millones de dlares), 92%
corresponde a Bt (Bacillus thuringensis).
Germinacin de las esporas y crecimiento de las hifas: las esporas plurinucleadas germinan en el suelo o
in-vitro, se forma un tubo germinativo cenoctico. El hongo responde a exudados radicales aumentando significativamente el crecimiento de los filamentos y las ramificaciones. Se ste no se encuentra con una raz compatible, el crecimiento se detiene.
una latencia inicial atribuida al desarrollo de las plntulas y germinacin de esporas, el crecimiento del tubo
de germinacin y la colonizacin (20-25 das)
Entrada a la raz: en la proximidad de una raz compatible, el crecimiento del tubo germinativo es estimulado
por variados factores, como CO2, exudados, etc. y las
ramificaciones sucesivas penetran en la raz. Se observan estructuras especializadas llamadas apresorios,
englobamientos redondeados de hifas, cuya pared impregnada de melanina se espesa y asegura una presin osmtica elevada. Los apresorios se forman por
molculas liberadas por el hospedero. Los filamentos
se propagan en la exodermis y el parnquima cortical,
sin llegar nunca a la endodermis. Hidrolasas degradan
la pared de la planta provocando la progresin del filamento fngico, bajo el efecto de una presin hidrosttica elevada.
Colonizacin radical: en el desarrollo del hongo simbitico, aparecen las estructuras tpicas de estas asociaciones, los arbsculos y las vesculas.
Bibliografa
Resumiendo: el hongo endomicorrcico presenta dos tipos de hifas: las de infeccin con crecimiento centrpeto
en relacin a la raz y las hifas extraradicales, de crecimiento centrfugo. El aporte de esqueletos carbonados por
parte de la planta asegura el equilibrio de esta simbiosis.
301
rrizadas y no micorrizadas permanece constante, coincide con la etapa de fructificacin del hospedante y contina hasta la senectud.
Las endomicorrizas colaboran con la nutricin del vegetal
durante el perodo de mximo desarrollo.
Las estructuras fngicas caractersticas son (figura 10)
Los arbsculos que se forman por repetidas divisiones
dicotmicas de una hifa, presentan el aspecto arborescente caracterstico, llamados tambin haustorios o apresorios, con gran superficie de intercambio con el hospedante y es a este nivel que se realizan la transferencia de
nutrientes (C, P, etc.). Presentan viabilidad slo por algunos das, son digeridos por la planta y su formacin recomienza.
Las ramificaciones de los arbsculos estn limitados por
una membrana periarbuscular de origen vegetal que rodea la pared fngica muy fina y acompaa a la hifa. Esta
membrana presenta modificaciones funcionales importantes: se ha detectado actividad ATPasa muy activa, ausente en races no micorrizadas,que podra estar implicada
en el transporte a travs de la membrana en esta simbiosis (fosfatos hacia la planta).
Las vesculas son estructuras de gruesas paredes, que
se desarrollan en extremos de hifas inter o intracelularmente, a medida que la infeccin progresa, aunque se
las ha descripto en etapas tempranas de la colonizacin.
Se encuentran en general en las capas superficiales de
la raz y funcionan como rganos de almacenamiento
de grasas, aceite y colaboran en la propagacin del endofito. El hongo determina su formacin y morfologa.
Algunos hongos como Gigaspora y Scutellospora no las
forman.
340
Lillian Frioni
321
Preguntas de repaso
1) Cmo afectan las plantas la dinmica del equilibrio
entre los microorganismos en el suelo?
2) Qu acciones de los microorganismos pueden afectar negativamente a las plantas? Seale algn ejemplo
3) Qu mecanismos utilizan los microorganismos para
limitar poblaciones de patgenos vegetales?
4) Seale procedimientos que le permitan demostrar alguno de esos mecanismos como involucrados en el
control biolgico de microorganismos fitopatgenos.
5) Caractersticas importantes en la competencia rizosfrica de microorganismos del suelo?
6) Por qu muchas veces una mezcla de agentes de
control puede resultar ms efectivo que el uso de un
solo microorganismo?
7) Pasos a seguir en la elaboracin de un producto biolgico a usar para control de una fusariosis en raz de
trigo.
8) Discuta los trminos: control qumico, control integrado, control biolgico
322
Lillian Frioni
Los microorganismos en
los alimentos y la industria
19 Fermentacin lctica y alcohlica.
Aplicaciones biotecnolgicas ....................................................... 341
20 Aplicaciones industriales de los
microorganismos ........................................................................... 357
339
338
Lillian Frioni
metanognicas, son los ms antiguos en la escala biolgica (ms de 3.000 millones de aos), deben haber tenido suficientes oportunidades para evolucionar y cambiar
hacia mayor eficiencia.
Parecera ms oportuno, para este autor modificar los
materiales vegetales, hacindolos ms degradables por
la microflora. Cita, sin embargo, casos de xitos en la inoculacin de microorganismos que degradan mimosina,
aminocido txico contenido en Leucaena, ausentes en
la mayora de los rumiantes.
Conclusiones
Esta breve descripcin del ecosistema del rumen trat de
evidenciar su complejidad y dinamismo. Las interacciones microbianas son all numerosas y es precisamente la
flexibilidad de este complejo sistema que hace posible la
conversin de un amplio espectro de sustratos en cidos
grasos voltiles de los cuales depende el rumiante para
obtener energa.
Las predicciones sobre la marcha de las fermentaciones resulta difcil dada la suma de factores que inciden: ambiente, especie animal, dieta. En general, la
activa fermentacin de sustratos celulsicos resulta en
mayores proporciones de cido actico. La fermentacin de almidn resulta en mayor proporcin de cido
propinico.
Los tipos de fermentacin con dietas ricas en azcares, incluyendo melazas, es difcil de predecir. Efectos asociativos positivos o negativos pueden resultar
cuando se combinan alimentos. Muchos de los ltimos efectos pueden minimizarse regulando el rgimen alimenticio, el grado de procesamiento de los
granos y el tipo de concentrado adecuado a cada combinacin nutritiva.
Numerosos intentos de mejoramiento de la actividad de
los microorganismos del rumen se llevan adelante e incluyen manejo de la dieta, de aditivos (antibiticos, sustancias tampones, antiprotozoarias), que tienden a incrementan el nivel nutritivo del animal.
323
Bibliografa
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Preguntas de repaso
1) Por qu el ambiente del rumen es muy particular?
2) Cmo funcionan los microorganismos en este ambiente?
3) Explique brevemente las transformaciones de la celulosa hasta los compuestos que son absorbidos por el
animal
4) La metodologa de estudio resulta sencilla? Por qu?
5) Se puede alterar la microbiologa del rumen?
6) De donde se origina el metano eliminado por el ganado?
7) Cmo se puede regular el funcionamiento del rumen?
8) Qu sucede con la lignina de las ingestas?
9) Seale algunos ejemplos de sinergismo entre microorganismos del rumen
10) Analice los gases que se liberan en los rumiantes y su
relacin con el efecto invernadero
18
Los rumiantes constituyen un grupo de animales herbvoros con un estmago dividido en cuatro compartimentos y
rumian un bolo alimenticio parcialmente digerido. Ejemplos: el ganado vacuno, ovino y caprino, alces, camellos,
ciervos, jirafas y bfalos.
Todos estos animales poseen una porcin dilatada en
su tubo digestivo donde los alimentos fibrosos voluminosos, que forman gran proporcin de su dieta, pueden
ser detenidos y sufrir una serie de fermentaciones, que
los hacen disponibles para su asimilacin (figura 1)(Prescott et al, 1999).
La parte superior del estmago se expande para formar
una gran bolsa, denominada rumen, y un pequeo retculo
o redecilla. La parte inferior del estmago est constituida
por una antecmara, el omaso, detrs de la cual se sita el
verdadero estmago (abomaso). Los polisacridos insolubles y la celulosa se mezclan con la saliva y pasan al rumen, donde sufren movimiento de rotacin constante y forman una masa pulposa que es atacada por una activa poblacin microbiana (1012 bacterias/mL). Luego el alimento
pasa al retculo y de all es regurgitado en forma de bolo
alimenticio que el animal rumia. El alimento se mezcla con
saliva, se traga de nuevo y vuelve al rumen al tiempo que
llega otro bolo a la boca. En estas etapas el material va
siendo digerido y se hace ms lquido.
Este material pasa entonces al retculo y de all a la parte inferior del estmago: al omaso y luego al abomaso
(estmago verdadero) donde el alimento es atacado por
las enzimas digestivas normales del animal y el proceso
de digestin contina en forma similar al resto de los
mamferos.
Bolo alimenticio
Esfago
Intestino
delgado
Rumen
Omaso
Abomaso
(estmago verdadero)
Retculo
Estos animales aprovechan la accin de los microorganismos que habitan su tracto gastrointestinal y que
son los principales agentes de la degradacin de las
paredes gruesas de los vegetales y permiten la asimilacin de hidratos de carbono complejos ingeridos por
el animal.
Como los rumiantes no pueden sintetizar celulasas, aprovechan las relaciones simbiticas con microorganismos
anaerobios que las poseen.
El rumen es un ecosistema microbiano complejo, donde
coexisten relaciones simbiticas entre el animal y las poblaciones microbianas. Los alimentos ingeridos son fermentados y los productos finales son cidos grasos vol-
324
Lillian Frioni
Flujo sangineo
hacia las clulas
Rumen
Celulosa y otros hidratos
de carbono complejos
Material
vegetal
+
Rumia
+
Regurgitacin
Se produce biomasa microbiana rica en protenas, hidratos de carbono y lpidos que son usados por el animal. El
sistema presenta un rango de potencial de oxido-reduccin entre250 a 450 mV. Los rangos de temperatura
varan entre 38 y 42 C
D-glucosa + celobiosa
Saliva
Fermentacin
microbiana
CH4+CO2+H2
Eructacin
Pectina
Hemicelulosa
Celulosa
Principal fuente
de energa
Almidn
b)
Acido galacturnico
Xilobiosa
Xilosa
Va de las
pentosas
fosfato
Xilosa
Celobiosa
Glucosa
Glucosa-6-P
El rumen ha sido comparado a un fermentador: su temperatura y estado anaerobio son estables, las fluctuaciones
de pH son limitados. Pero se diferencia de un dispositivo
industrial en que la composicin qumica y la estructura de
los sustratos ingeridos, varan amplia y rpidamente.
Maltosa
Glucosa-6-P
Fructosa-6-P
El rumen, es en esencia, un sistema anaerobio muy reductor, un medio ligeramente cido, de pH fijo, isotrmico, con
una temperatura de unos 39oC y con una fase gaseosa
compuesta principalmente de CO2, metano y nitrgeno. El
pH se mantiene relativamente constante (6-7) por la absorcin de de los cidos grasos por la pared del rumen o por
neutralizacin por sistemas tampones de la saliva.
(Va de Embden-Meyerhof)
CO2 + H2 +
2 Acetil-CoA
CO2 + H2 +
Acetil-CoA
Pi
Acetoacetil-CoA
Acetil-P
Piruvato
NADH
-P
CO2
Formato
Oxaloacetato Lactato
NADH
Fumarato
-OH butiril-CoA
Succinato
Acrilil-CoA
H2
-P
CO2
Propionil-CoA
H2
-P
Metilmalonil-CoA
Crotonil-CoA
Propionil-CoA
Butirato
Acetato
Propionato
Metano (CH4)
Los microorganismos que colonizan a los jvenes animales por la ingesta, saliva, aire, heces son estrictamente
anaerobios, aunque algo de O2 es tolerado y si la fermentacin es activa el Eh se mantiene en lmites normales
(-250 a -450mV).
Las enzimas para la fermentacin son provistas por un
significativo nmero de especies de bacterias, hongos y
protozoos y el nmero relativo de las distintas especies
vara con la composicin y estructura del alimento. Por
otra parte, las interacciones biolgicas que se dan entre
ellas son altamente complejas.
La proliferacin continua de los microorganismos est
asegurada por la ingestin peridica de los alimentos y el
Produccin de CH4
Ninguna de las bacterias o protozoos fermentadores
producen metano, pero algunas producen formiato, H2
y CO 2. Las bacterias metanognicas pueden luego
transformar el H2 y el CO2 en CH4. En el rumen la principal va de formacin de metano es a partir de H2 y
CO2. Su formacin a partir de acetato (formado por
337
336
Lillian Frioni
En general, los organismos sobreviven en este ecosistema si su tiempo de generacin es menor que el tiempo
de retencin en este rgano. Muchos microorganismos
pueden sobrevivir en situaciones de rpido trnsito por
adhesin a las paredes o a partculas grandes de alimentos.
celulosa + CO2
Fibrobacter succinogenes
Protenas en la dieta
succinato
c. grasos aromticos
propionato
+
acetato
CO2
Otras
fuentes
de C
AGV Cadena
lineal ramificada
Selenomonas ruminantium
formiato
Protenas bacterianas
CO2
Pptidos
Urea
Aminocidos
Mayor importancia
Importancia media
NH3
Importancia menor
fragmentos de celulosa
acetato
Protenas en Protozoos
Generalmente, las especies dominantes en el rumen convierten la energa del sustrato en biomasa, resultando
en menor formacin de cidos por unidad de sustrato.
La seleccin natural tambin favorece el mximo trabajo bioqumico, en general en relacin inversa al tamao
celular.
325
Metodologa de estudio
Se han empleado numerosas tcnicas para estos estudios.
Suspensiones lavadas: un gran volumen de contenido
ruminal se filtra por tela y luego se centrifuga primero lentamente para eliminar los protozoos grandes y luego a
mayor velocidad por 30 y se incuba con solucin de fosfatos para regular el pH, en anaerobiosis con el sustrato a
analizar. Se siguen procesos como la decarboxilacin del
cido succnico y la reduccin de los nitratos. Se aprecia
generalmente correlacin con los resultados obtenidos invivo. Esta tcnica constituye un medio til para estudiar
con detalle las propiedades de la flora mixta del rumen
luego de la eliminacin de complicaciones como la absorcin a partculas y la presencia de varios sustratos.
Rumen artificial: existen numerosos dispositivos para realizar los estudios in-vitro que tienden a similar las condiciones fsico-qumicas y ambientales del rumen natural.
Estos se perfeccionan de modo de analizar efectos de
poblaciones microbianas, condiciones vinculadas a la nutricin y factores ambientales. Constituyen verdaderos
reactores con controles de entrada y salida de metabolitos, regulacin de condiciones de incubacin, como temperatura, pH, presin osmtica, etc. y permiten estudiar la
degradacin de diferentes sustancias por poblaciones
microbianas solas o asociadas.
Aislamiento y cultivo de microorganismos del rumen
La mayor dificultad en estos estudios radica en el mantenimiento de las condiciones de anaerobiosis durante el
muestreo, siembra y cultivo de los microorganismos, muchos de los cuales viven asociados entre si, lo que dificulta su aislamiento.
Muestro y cultivo
El contenido ruminal se obtiene por succin luego de efectuar una homogeneizacin manual y despus de una agitacin suave bajo CO2 , se filtra por gasa y se liberan
las clulas adheridas a las partculas (0,1% de Tween 80,
con 6-8 horas a 0, o 0,1% de metilcelulosa). Se efectan
suspensiones-diluciones decimales en diluyente en anae-
326
Lillian Frioni
robiosis las que se inoculan e incuban en los medios escogidos para efectuar el recuento de bacterias, manteniendo siempre la anaerobiosis.
Se usan diferentes cmaras de incubacin con atmsfera controlada, en general con suficiente CO2, que mantiene el pH a niveles adecuados y es empleado por numerosas bacterias. Se usa tambin una mezcla con
95% de CO2 y 5% de H2.
Se emplean medios no selectivos para recuento, aislamiento y mantenimiento de bacterias del rumen. Los recuentos se hacen en tubos con medio slido, previamente fundido a 45C antes de inocular, girado sobre las paredes hasta que el agar solidifica (roll-tubes). Las colonias
quedan incluidas en el agar, a lo largo del tubo.
Adems de los medios no selectivos, se emplean gran
nmero de medios selectivos, que permiten evaluar grupos particulares, como amilolticos, pectinolticos, lipolticos, metanognicos.
335
Los protozoos ingieren bacterias como fuente de protenas. Ellos tambin aparecen como estabilizadores de productos finales de la fermentacin. Los protozoos, como
las bacterias y los hongos contribuyen a la digestin de
las fibras. Mientras que los protozoos son parte integral
de la poblacin microbiana del rumen y ejercen marcado
efecto en la fermentacin, su beneficio al rumiante es aun
controvertido.
Los hongos anaerobios constituyen el grupo ms recientemente reconocido de microorganismos del rumen. Cuando los animales se nutren con dieta rica en forrajes, los
hongos del rumen pueden contribuir con ms del 8% de
la biomasa microbiana. Aunque no est claro si estos hongos son funcionalmente significativos, se ha mostrado que
pueden degradar celulosa y xilanos, indicando rol en la
digestin de fibras.
Las interacciones metablicas entre las distintas poblaciones del rumen resultan esenciales para sostener a la
comunidad microbiana y sus actividades. Productos del
metabolismo de algunos microorganismos son fuente de
energa para otros. La liberacin de vitaminas y productos del metabolismo del nitrgeno constituyen fuentes
para otros microorganismos. El tipo y grado de estas interacciones regulan las concentraciones y actividades
de especies individuales y la naturaleza cuali y cuantitativa de los productos de la fermentacin de los sustratos ingeridos.
cido actico:
Interacciones nutritivas
Existen tres ambientes interconectados en el rumen donde se localizan los microorganismos. La primera es la fase
C6H12O6
2CH3COOH+ CO2+ H2
2CH3-CH2-COOH + 2H2O
CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + H2
334
Lillian Frioni
b) son capaces de almacenar hidratos de carbono adicionales en forma de un polmero insoluble, la amilopectina
c) los Holotriches son ms fcilmente destruidos por la
acidez y los Entodiniomorphes son menos sensibles.
d) no pueden sintetizar aminocidos a partir de compuestos simples de nitrgeno y dependen de las bacterias,
cuyos aminocidos emplean luego de fagocitarlas (1%
de las bacterias del rumen pueden ser fagocitadas por
cilados en cada minuto). Son responsables de la produccin de gran parte del amonio en el rumen
e) a diferencia de las bacterias, los ciliados del rumen no
son esenciales para los procesos de fermentacin, pero
contribuyen a su eficiencia.
lquida, el fluido ruminal, donde grupos de microorganismos se encuentran libres, se nutren de protenas y carbohidratos solubles. Esta porcin constituye un 25% de la
biomasa microbiana.
des cantidades de hidratos de carbono fcilmente fermentables, ocurren varios cambios en la poblacin microbiana, con predominio de aquellos que producen y
utilizan lactato.
Luego se encuentra la fase slida, donde los grupos microbianos asociados o adheridos a partculas alimenticias
digieren polisacridos insolubles, como almidn o fibras,
as como a las protenas menos solubles. Constituyen
ms del 70% de la biomasa microbiana.
Pocos gneros de Epidinium estn involucrados en la fragmentacin de los restos vegetales. Secretan enzimas que
promueven la separacin de las clulas y la fragmentacin del material.
En condiciones adecuadas ms de la mitad de la actividad celuloltica del rumen se asocia con los ciliados. La
mayor actividad se da cuando la enzima es liberada luego
de la lisis celular que ocurre por exposicin al O2 en la
ruminacin o por hipotona causada luego de la ingestin
de agua.
La composicin de la dieta afecta el nmero y las proporciones relativas de las diferentes especies microbianas en el rumen. La mayora de los cambios en la
dieta requieren un perodo de transicin para permitir
incrementar diferentes especies microbianas, periodo
que puede durar varios das. Cuando se incluyen gran-
Ciliados celulolticos
Ciliados amilolticos
Todos los Entodiniomorphes emplean almidn, cuyo exceso almacenan como amilopectina. Sin embargo, uno
de los dos gneros de Holotriches no puede usar almidn. La mayora prefiere azcares solubles y se mueven
rpidamente hacia ellos. Se estima que ms de 1/3 de los
azcares ingeridos por el animal puede convertirse en
amilopectina.
Otras fuentes de energa: Los ciliados son responsables
de del 30-40% de la lipolisis. Incrementan el contenido de
cidos grasos saturados. Un 75% de los lpidos microbianos estn normalmente asociados con los ciliados, por lo
que su contribucin al husped puede ser significativa.
No son muy importantes en la degradacin de protenas
327
N/mL
Vol celular
(3 )
Biomasa
(mg/100mL)
tg
% de la
biomasa total
Bacterias pequeas
Selenomonas
1x1010
1x108
1
30
1.600
300
20min
60-90
Oscillospira flagellates
Protozoos,ciliados
Entodinia
Dashytricha + Diplodinia
Isotricha + Epidinia
Isotricha + Epidinia
1x106
250
25
10-40
3x10
3x104
1x104
1x104
1x10
1x105
1x106
1x105
300
300
1100
8h
36h
24h
5-10
328
Lillian Frioni
Bacterias en el rumen
Las bacterias del rumen son integrantes de un consorcio
que realiza varias funciones vitales para el desarrollo del
husped:
1) Las fibras y otros restos de polmeros vegetales no
degradados por enzimas del animal, son fermentados a
cidos grasos voltiles, CO2 y CH4. Los AGV pasan las
paredes del rumen hacia el sistema circulatorio y son
oxidados en el hgado, constituyendo la mayor parte de
la energa requerida por el husped (figura 1). Tambin
se usan en la sntesis de materiales celulares.
2) La fermentacin est acoplada al crecimiento microbiano y las protenas de la biomasa constituyen la principal fuente de nitrgeno para el animal.
3) Los microorganismos del rumen sintetizan vitaminas,
sobretodo del complejo B, empleadas por el husped.
4) Algunas bacterias degradan componentes txicos de
la dieta. Ejemplo son los aminocidos mimosina y sus
derivados, componentes del forraje de Leucaena, fenoles vegetales, como la cumarina (1,2 benzopirona), la
canavanina, anloga de la arginina, componente de la
leguminosa Canavalia ensiformis, que inhibe a algunas
bacterias del rumen, pero es hidrolizada por otras.
Representan la clase predominante de microorganismos:
1.1010 a 1011 /g de contenido ruminal.
Probablemente acten ms de 200 especies, pero slo
unas pocas parecen tener significado cuantitativo. Las
nuevas tcnicas de biologa molecular que emplean sondas gnicas han hecho cambiar rpidamente la identificacin de las bacterias ruminales Se han informado de 22
gneros y 63 especies.
La mayora son anaerobios obligados, pero coexisten las
anaerobias facultativas que pueden representar un 107 to
108 por gramo de contenido ruminal, adheridas a las paredes del rumen y usan el O2 que difunde del torrente
circulatorio. Son ms fciles de aislar, aunque no son importantes en las funciones del rumen, pero se hacen dominantes en disfunciones de este sistema. Las ms importantes son las que fermentan la celulosa.
333
La mayora de los componentes son Ciliata, los organismos unicelulares ms complejos. Su biomasa es en general similar a la de las bacterias, pero pueden sobrepasarla ms de 3 veces segn la dieta, o incluso desaparecer. Su densidad es del orden de 105-106/mL. Las
distintas especies varan en tamao entre 25 a 250
micras, agrupados en 17 gneros de la sub-clase Entodiniomorphes y 2 gneros de la sub-clase Holotriches,
que difieren en su morfologa y metabolismo. Las especies presentes varan con la especie animal, la localidad, la dieta.
332
Lillian Frioni
Bacterias hidrolticas
Oligosacridos y azcares solubles, productos finales de la
degradacin de la celulosa, son empleados por numerosos
microorganismos que los degradan obteniendo energa,
de modo que la biomasa crece rpidamente. Se forma ATP,
poder reductor (NADH) y ferredoxina reducida, que se reciclan por oxidacin con liberacin de H2, que puede inhibir a
las enzimas responsables. Otros mecanismos biosintticos
ocurren, con produccin de propionato y butirato, pero esta
diversificacin puede limitarse en el rumen por las bacterias metanognicas (CO2 + H2= CH4).
329
Bacterias verstiles incluyen Butyrivibrio, algunas de cuyas especies son celulolticas, Bacteroides ruminicola y
Selenomonas. Clostridium polysaccharolyticum es uno de
las pocas bacterias del rumen capaces de emplear celulosa y almidn como sustratos.
+
Gram positivas
Especie
Morfologa
(G+C)%
Productos
Sustratos
bacilo
49-50
AS
amplio: hidrol.proteinas
Ruminobacte amylophilus
40.42
FAS
almidn
Fibrobacter succinogenes
47-49
AS
celulosa
Selenomonas ruminantium
variada
54
LPA
amplio
Butyrivibrio fibrisolvens
bacilo curvo
36-41
FBA
FBA
Anaerovibrio lipolytica
bacilo
ND
PSA
lipoltico
Veillonella parvula
Cocos
38-41
AP H2
lactato
Succinimonas amylolytica
cocos
ND
Almidn
Bacteroides ruminicola
Gram negativas
Ruminococcus albus
cocos
42-46
A H2 CO2
celulosa
R. flavefaciens
cocos
39-44
AS H2
celulosa
Streptococcus bovis
cocos
37-39
L CO2
almidn
Lachnospira multiparus
bacilos
ND
FAL H2 CO2
pectina
Eubacterium riminantium
bacilos
ND
FBL CO2
xilano
E. oxidoreducens
bacilos
36
L H2
aromticos ?
Lactobacillus ruminis
bacilos
44-47
azcares
L. vitulinus
bacilos
34-37
azcares
Clostridium polysaccharolyticum
bacilos
ND
FBA H2
celulosa/almidn
(esporas)
330
Lillian Frioni
Bacterias celulolticas
La degradacin de la celulosa es definida usualmente
como la principal funcin del rumen. Las enzimas responsables de la degradacin de la celulosa la presentan principalmente en bacterias. Los vertebrados carecen de estas enzimas. Principales especies:
a) Fibrobacter succinogenes - bacilos o cocos Gramb) Ruminococcus albus - cocos Gram+
Las bacterias celulolticas colonizan la superficie de restos vegetales en los 5 minutos de su entrada al rumen.
Como existe amonio, ellas se multiplican rpidamente. El
agregado de urea al alimento, favorece esta multiplicacin. Sin embargo, si el pH del rumen cae debajo de 6,0,
el crecimiento de las bacterias y la celulolisis se hacen
ms lentas. Debajo de 5,6 su desarrollo cesa, de modo
que la presencia en la dieta de productos que favorecen
la acidez, inhiben la digestin de materiales fibrosos. Disminuyen tambin en presencia de sustratos competitivos,
como el almidn.
Bacterias amilolticas
La mayora de las bacterias amilolticas son incapaces de
usar celulosa. Las enzimas amilolticas estn muy distribuidas entre las bacterias y son ellas la que aseguran la
conversin de materiales amilceos, como granos de cereales, en cidos grasos voltiles.
Con amonio, el proceso es ms eficiente. Asi, Streptococcus bovis produce acetato y etanol cuando se multiplica
lentamente, pero forma lactato si crece rpidamente. Esta
especie es ms tolerante a la acidez que la mayora de
las bacterias del rumen. No son muy abundantes, pero
se hacen dominantes si la acumulacin de cido lctico
sobrepasa la capacidad tampn del rumen. Severa acidosis (pH 5,0) puede ocurrir cuando la dieta se cambia abruptamente de celulosa a almidn o sacarosa.
La microflora que convierte lactato en acetato y propionato no est presente en nmero suficiente o se multi-
331
Bacterias metanognicas
Principales bacterias proteolticas
El catabolismo de protenas y aminocidos que libera
amonio en el rumen es de gran inters en la nutricin del
animal, aunque su exceso puede ocasionar problemas.
El amonio es tambin requerido por microorganismos fermentadores, algunos de los cuales pueden tambin usar
aminocidos o pptidos.
330
Lillian Frioni
Bacterias celulolticas
La degradacin de la celulosa es definida usualmente
como la principal funcin del rumen. Las enzimas responsables de la degradacin de la celulosa la presentan principalmente en bacterias. Los vertebrados carecen de estas enzimas. Principales especies:
a) Fibrobacter succinogenes - bacilos o cocos Gramb) Ruminococcus albus - cocos Gram+
Las bacterias celulolticas colonizan la superficie de restos vegetales en los 5 minutos de su entrada al rumen.
Como existe amonio, ellas se multiplican rpidamente. El
agregado de urea al alimento, favorece esta multiplicacin. Sin embargo, si el pH del rumen cae debajo de 6,0,
el crecimiento de las bacterias y la celulolisis se hacen
ms lentas. Debajo de 5,6 su desarrollo cesa, de modo
que la presencia en la dieta de productos que favorecen
la acidez, inhiben la digestin de materiales fibrosos. Disminuyen tambin en presencia de sustratos competitivos,
como el almidn.
Bacterias amilolticas
La mayora de las bacterias amilolticas son incapaces de
usar celulosa. Las enzimas amilolticas estn muy distribuidas entre las bacterias y son ellas la que aseguran la
conversin de materiales amilceos, como granos de cereales, en cidos grasos voltiles.
Con amonio, el proceso es ms eficiente. Asi, Streptococcus bovis produce acetato y etanol cuando se multiplica
lentamente, pero forma lactato si crece rpidamente. Esta
especie es ms tolerante a la acidez que la mayora de
las bacterias del rumen. No son muy abundantes, pero
se hacen dominantes si la acumulacin de cido lctico
sobrepasa la capacidad tampn del rumen. Severa acidosis (pH 5,0) puede ocurrir cuando la dieta se cambia abruptamente de celulosa a almidn o sacarosa.
La microflora que convierte lactato en acetato y propionato no est presente en nmero suficiente o se multi-
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Bacterias metanognicas
Principales bacterias proteolticas
El catabolismo de protenas y aminocidos que libera
amonio en el rumen es de gran inters en la nutricin del
animal, aunque su exceso puede ocasionar problemas.
El amonio es tambin requerido por microorganismos fermentadores, algunos de los cuales pueden tambin usar
aminocidos o pptidos.
332
Lillian Frioni
Bacterias hidrolticas
Oligosacridos y azcares solubles, productos finales de la
degradacin de la celulosa, son empleados por numerosos
microorganismos que los degradan obteniendo energa,
de modo que la biomasa crece rpidamente. Se forma ATP,
poder reductor (NADH) y ferredoxina reducida, que se reciclan por oxidacin con liberacin de H2, que puede inhibir a
las enzimas responsables. Otros mecanismos biosintticos
ocurren, con produccin de propionato y butirato, pero esta
diversificacin puede limitarse en el rumen por las bacterias metanognicas (CO2 + H2= CH4).
329
Bacterias verstiles incluyen Butyrivibrio, algunas de cuyas especies son celulolticas, Bacteroides ruminicola y
Selenomonas. Clostridium polysaccharolyticum es uno de
las pocas bacterias del rumen capaces de emplear celulosa y almidn como sustratos.
+
Gram positivas
Especie
Morfologa
(G+C)%
Productos
Sustratos
bacilo
49-50
AS
amplio: hidrol.proteinas
Ruminobacte amylophilus
40.42
FAS
almidn
Fibrobacter succinogenes
47-49
AS
celulosa
Selenomonas ruminantium
variada
54
LPA
amplio
Butyrivibrio fibrisolvens
bacilo curvo
36-41
FBA
FBA
Anaerovibrio lipolytica
bacilo
ND
PSA
lipoltico
Veillonella parvula
Cocos
38-41
AP H2
lactato
Succinimonas amylolytica
cocos
ND
Almidn
Bacteroides ruminicola
Gram negativas
Ruminococcus albus
cocos
42-46
A H2 CO2
celulosa
R. flavefaciens
cocos
39-44
AS H2
celulosa
Streptococcus bovis
cocos
37-39
L CO2
almidn
Lachnospira multiparus
bacilos
ND
FAL H2 CO2
pectina
Eubacterium riminantium
bacilos
ND
FBL CO2
xilano
E. oxidoreducens
bacilos
36
L H2
aromticos ?
Lactobacillus ruminis
bacilos
44-47
azcares
L. vitulinus
bacilos
34-37
azcares
Clostridium polysaccharolyticum
bacilos
ND
FBA H2
celulosa/almidn
(esporas)
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Lillian Frioni
Bacterias en el rumen
Las bacterias del rumen son integrantes de un consorcio
que realiza varias funciones vitales para el desarrollo del
husped:
1) Las fibras y otros restos de polmeros vegetales no
degradados por enzimas del animal, son fermentados a
cidos grasos voltiles, CO2 y CH4. Los AGV pasan las
paredes del rumen hacia el sistema circulatorio y son
oxidados en el hgado, constituyendo la mayor parte de
la energa requerida por el husped (figura 1). Tambin
se usan en la sntesis de materiales celulares.
2) La fermentacin est acoplada al crecimiento microbiano y las protenas de la biomasa constituyen la principal fuente de nitrgeno para el animal.
3) Los microorganismos del rumen sintetizan vitaminas,
sobretodo del complejo B, empleadas por el husped.
4) Algunas bacterias degradan componentes txicos de
la dieta. Ejemplo son los aminocidos mimosina y sus
derivados, componentes del forraje de Leucaena, fenoles vegetales, como la cumarina (1,2 benzopirona), la
canavanina, anloga de la arginina, componente de la
leguminosa Canavalia ensiformis, que inhibe a algunas
bacterias del rumen, pero es hidrolizada por otras.
Representan la clase predominante de microorganismos:
1.1010 a 1011 /g de contenido ruminal.
Probablemente acten ms de 200 especies, pero slo
unas pocas parecen tener significado cuantitativo. Las
nuevas tcnicas de biologa molecular que emplean sondas gnicas han hecho cambiar rpidamente la identificacin de las bacterias ruminales Se han informado de 22
gneros y 63 especies.
La mayora son anaerobios obligados, pero coexisten las
anaerobias facultativas que pueden representar un 107 to
108 por gramo de contenido ruminal, adheridas a las paredes del rumen y usan el O2 que difunde del torrente
circulatorio. Son ms fciles de aislar, aunque no son importantes en las funciones del rumen, pero se hacen dominantes en disfunciones de este sistema. Las ms importantes son las que fermentan la celulosa.
333
La mayora de los componentes son Ciliata, los organismos unicelulares ms complejos. Su biomasa es en general similar a la de las bacterias, pero pueden sobrepasarla ms de 3 veces segn la dieta, o incluso desaparecer. Su densidad es del orden de 105-106/mL. Las
distintas especies varan en tamao entre 25 a 250
micras, agrupados en 17 gneros de la sub-clase Entodiniomorphes y 2 gneros de la sub-clase Holotriches,
que difieren en su morfologa y metabolismo. Las especies presentes varan con la especie animal, la localidad, la dieta.
334
Lillian Frioni
b) son capaces de almacenar hidratos de carbono adicionales en forma de un polmero insoluble, la amilopectina
c) los Holotriches son ms fcilmente destruidos por la
acidez y los Entodiniomorphes son menos sensibles.
d) no pueden sintetizar aminocidos a partir de compuestos simples de nitrgeno y dependen de las bacterias,
cuyos aminocidos emplean luego de fagocitarlas (1%
de las bacterias del rumen pueden ser fagocitadas por
cilados en cada minuto). Son responsables de la produccin de gran parte del amonio en el rumen
e) a diferencia de las bacterias, los ciliados del rumen no
son esenciales para los procesos de fermentacin, pero
contribuyen a su eficiencia.
lquida, el fluido ruminal, donde grupos de microorganismos se encuentran libres, se nutren de protenas y carbohidratos solubles. Esta porcin constituye un 25% de la
biomasa microbiana.
des cantidades de hidratos de carbono fcilmente fermentables, ocurren varios cambios en la poblacin microbiana, con predominio de aquellos que producen y
utilizan lactato.
Luego se encuentra la fase slida, donde los grupos microbianos asociados o adheridos a partculas alimenticias
digieren polisacridos insolubles, como almidn o fibras,
as como a las protenas menos solubles. Constituyen
ms del 70% de la biomasa microbiana.
Pocos gneros de Epidinium estn involucrados en la fragmentacin de los restos vegetales. Secretan enzimas que
promueven la separacin de las clulas y la fragmentacin del material.
En condiciones adecuadas ms de la mitad de la actividad celuloltica del rumen se asocia con los ciliados. La
mayor actividad se da cuando la enzima es liberada luego
de la lisis celular que ocurre por exposicin al O2 en la
ruminacin o por hipotona causada luego de la ingestin
de agua.
La composicin de la dieta afecta el nmero y las proporciones relativas de las diferentes especies microbianas en el rumen. La mayora de los cambios en la
dieta requieren un perodo de transicin para permitir
incrementar diferentes especies microbianas, periodo
que puede durar varios das. Cuando se incluyen gran-
Ciliados celulolticos
Ciliados amilolticos
Todos los Entodiniomorphes emplean almidn, cuyo exceso almacenan como amilopectina. Sin embargo, uno
de los dos gneros de Holotriches no puede usar almidn. La mayora prefiere azcares solubles y se mueven
rpidamente hacia ellos. Se estima que ms de 1/3 de los
azcares ingeridos por el animal puede convertirse en
amilopectina.
Otras fuentes de energa: Los ciliados son responsables
de del 30-40% de la lipolisis. Incrementan el contenido de
cidos grasos saturados. Un 75% de los lpidos microbianos estn normalmente asociados con los ciliados, por lo
que su contribucin al husped puede ser significativa.
No son muy importantes en la degradacin de protenas
327
N/mL
Vol celular
(3 )
Biomasa
(mg/100mL)
tg
% de la
biomasa total
Bacterias pequeas
Selenomonas
1x1010
1x108
1
30
1.600
300
20min
60-90
Oscillospira flagellates
Protozoos,ciliados
Entodinia
Dashytricha + Diplodinia
Isotricha + Epidinia
Isotricha + Epidinia
1x106
250
25
10-40
3x10
3x104
1x104
1x104
1x10
1x105
1x106
1x105
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300
1100
8h
36h
24h
5-10
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Lillian Frioni
robiosis las que se inoculan e incuban en los medios escogidos para efectuar el recuento de bacterias, manteniendo siempre la anaerobiosis.
Se usan diferentes cmaras de incubacin con atmsfera controlada, en general con suficiente CO2, que mantiene el pH a niveles adecuados y es empleado por numerosas bacterias. Se usa tambin una mezcla con
95% de CO2 y 5% de H2.
Se emplean medios no selectivos para recuento, aislamiento y mantenimiento de bacterias del rumen. Los recuentos se hacen en tubos con medio slido, previamente fundido a 45C antes de inocular, girado sobre las paredes hasta que el agar solidifica (roll-tubes). Las colonias
quedan incluidas en el agar, a lo largo del tubo.
Adems de los medios no selectivos, se emplean gran
nmero de medios selectivos, que permiten evaluar grupos particulares, como amilolticos, pectinolticos, lipolticos, metanognicos.
335
Los protozoos ingieren bacterias como fuente de protenas. Ellos tambin aparecen como estabilizadores de productos finales de la fermentacin. Los protozoos, como
las bacterias y los hongos contribuyen a la digestin de
las fibras. Mientras que los protozoos son parte integral
de la poblacin microbiana del rumen y ejercen marcado
efecto en la fermentacin, su beneficio al rumiante es aun
controvertido.
Los hongos anaerobios constituyen el grupo ms recientemente reconocido de microorganismos del rumen. Cuando los animales se nutren con dieta rica en forrajes, los
hongos del rumen pueden contribuir con ms del 8% de
la biomasa microbiana. Aunque no est claro si estos hongos son funcionalmente significativos, se ha mostrado que
pueden degradar celulosa y xilanos, indicando rol en la
digestin de fibras.
Las interacciones metablicas entre las distintas poblaciones del rumen resultan esenciales para sostener a la
comunidad microbiana y sus actividades. Productos del
metabolismo de algunos microorganismos son fuente de
energa para otros. La liberacin de vitaminas y productos del metabolismo del nitrgeno constituyen fuentes
para otros microorganismos. El tipo y grado de estas interacciones regulan las concentraciones y actividades
de especies individuales y la naturaleza cuali y cuantitativa de los productos de la fermentacin de los sustratos ingeridos.
cido actico:
Interacciones nutritivas
Existen tres ambientes interconectados en el rumen donde se localizan los microorganismos. La primera es la fase
C6H12O6
2CH3COOH+ CO2+ H2
2CH3-CH2-COOH + 2H2O
CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + H2
336
Lillian Frioni
En general, los organismos sobreviven en este ecosistema si su tiempo de generacin es menor que el tiempo
de retencin en este rgano. Muchos microorganismos
pueden sobrevivir en situaciones de rpido trnsito por
adhesin a las paredes o a partculas grandes de alimentos.
celulosa + CO2
Fibrobacter succinogenes
Protenas en la dieta
succinato
c. grasos aromticos
propionato
+
acetato
CO2
Otras
fuentes
de C
AGV Cadena
lineal ramificada
Selenomonas ruminantium
formiato
Protenas bacterianas
CO2
Pptidos
Urea
Aminocidos
Mayor importancia
Importancia media
NH3
Importancia menor
fragmentos de celulosa
acetato
Protenas en Protozoos
Generalmente, las especies dominantes en el rumen convierten la energa del sustrato en biomasa, resultando
en menor formacin de cidos por unidad de sustrato.
La seleccin natural tambin favorece el mximo trabajo bioqumico, en general en relacin inversa al tamao
celular.
325
Metodologa de estudio
Se han empleado numerosas tcnicas para estos estudios.
Suspensiones lavadas: un gran volumen de contenido
ruminal se filtra por tela y luego se centrifuga primero lentamente para eliminar los protozoos grandes y luego a
mayor velocidad por 30 y se incuba con solucin de fosfatos para regular el pH, en anaerobiosis con el sustrato a
analizar. Se siguen procesos como la decarboxilacin del
cido succnico y la reduccin de los nitratos. Se aprecia
generalmente correlacin con los resultados obtenidos invivo. Esta tcnica constituye un medio til para estudiar
con detalle las propiedades de la flora mixta del rumen
luego de la eliminacin de complicaciones como la absorcin a partculas y la presencia de varios sustratos.
Rumen artificial: existen numerosos dispositivos para realizar los estudios in-vitro que tienden a similar las condiciones fsico-qumicas y ambientales del rumen natural.
Estos se perfeccionan de modo de analizar efectos de
poblaciones microbianas, condiciones vinculadas a la nutricin y factores ambientales. Constituyen verdaderos
reactores con controles de entrada y salida de metabolitos, regulacin de condiciones de incubacin, como temperatura, pH, presin osmtica, etc. y permiten estudiar la
degradacin de diferentes sustancias por poblaciones
microbianas solas o asociadas.
Aislamiento y cultivo de microorganismos del rumen
La mayor dificultad en estos estudios radica en el mantenimiento de las condiciones de anaerobiosis durante el
muestreo, siembra y cultivo de los microorganismos, muchos de los cuales viven asociados entre si, lo que dificulta su aislamiento.
Muestro y cultivo
El contenido ruminal se obtiene por succin luego de efectuar una homogeneizacin manual y despus de una agitacin suave bajo CO2 , se filtra por gasa y se liberan
las clulas adheridas a las partculas (0,1% de Tween 80,
con 6-8 horas a 0, o 0,1% de metilcelulosa). Se efectan
suspensiones-diluciones decimales en diluyente en anae-
324
Lillian Frioni
Flujo sangineo
hacia las clulas
Rumen
Celulosa y otros hidratos
de carbono complejos
Material
vegetal
+
Rumia
+
Regurgitacin
Se produce biomasa microbiana rica en protenas, hidratos de carbono y lpidos que son usados por el animal. El
sistema presenta un rango de potencial de oxido-reduccin entre250 a 450 mV. Los rangos de temperatura
varan entre 38 y 42 C
D-glucosa + celobiosa
Saliva
Fermentacin
microbiana
CH4+CO2+H2
Eructacin
Pectina
Hemicelulosa
Celulosa
Principal fuente
de energa
Almidn
b)
Acido galacturnico
Xilobiosa
Xilosa
Va de las
pentosas
fosfato
Xilosa
Celobiosa
Glucosa
Glucosa-6-P
El rumen ha sido comparado a un fermentador: su temperatura y estado anaerobio son estables, las fluctuaciones
de pH son limitados. Pero se diferencia de un dispositivo
industrial en que la composicin qumica y la estructura de
los sustratos ingeridos, varan amplia y rpidamente.
Maltosa
Glucosa-6-P
Fructosa-6-P
El rumen, es en esencia, un sistema anaerobio muy reductor, un medio ligeramente cido, de pH fijo, isotrmico, con
una temperatura de unos 39oC y con una fase gaseosa
compuesta principalmente de CO2, metano y nitrgeno. El
pH se mantiene relativamente constante (6-7) por la absorcin de de los cidos grasos por la pared del rumen o por
neutralizacin por sistemas tampones de la saliva.
(Va de Embden-Meyerhof)
CO2 + H2 +
2 Acetil-CoA
CO2 + H2 +
Acetil-CoA
Pi
Acetoacetil-CoA
Acetil-P
Piruvato
NADH
-P
CO2
Formato
Oxaloacetato Lactato
NADH
Fumarato
-OH butiril-CoA
Succinato
Acrilil-CoA
H2
-P
CO2
Propionil-CoA
H2
-P
Metilmalonil-CoA
Crotonil-CoA
Propionil-CoA
Butirato
Acetato
Propionato
Metano (CH4)
Los microorganismos que colonizan a los jvenes animales por la ingesta, saliva, aire, heces son estrictamente
anaerobios, aunque algo de O2 es tolerado y si la fermentacin es activa el Eh se mantiene en lmites normales
(-250 a -450mV).
Las enzimas para la fermentacin son provistas por un
significativo nmero de especies de bacterias, hongos y
protozoos y el nmero relativo de las distintas especies
vara con la composicin y estructura del alimento. Por
otra parte, las interacciones biolgicas que se dan entre
ellas son altamente complejas.
La proliferacin continua de los microorganismos est
asegurada por la ingestin peridica de los alimentos y el
Produccin de CH4
Ninguna de las bacterias o protozoos fermentadores
producen metano, pero algunas producen formiato, H2
y CO 2. Las bacterias metanognicas pueden luego
transformar el H2 y el CO2 en CH4. En el rumen la principal va de formacin de metano es a partir de H2 y
CO2. Su formacin a partir de acetato (formado por
337
338
Lillian Frioni
metanognicas, son los ms antiguos en la escala biolgica (ms de 3.000 millones de aos), deben haber tenido suficientes oportunidades para evolucionar y cambiar
hacia mayor eficiencia.
Parecera ms oportuno, para este autor modificar los
materiales vegetales, hacindolos ms degradables por
la microflora. Cita, sin embargo, casos de xitos en la inoculacin de microorganismos que degradan mimosina,
aminocido txico contenido en Leucaena, ausentes en
la mayora de los rumiantes.
Conclusiones
Esta breve descripcin del ecosistema del rumen trat de
evidenciar su complejidad y dinamismo. Las interacciones microbianas son all numerosas y es precisamente la
flexibilidad de este complejo sistema que hace posible la
conversin de un amplio espectro de sustratos en cidos
grasos voltiles de los cuales depende el rumiante para
obtener energa.
Las predicciones sobre la marcha de las fermentaciones resulta difcil dada la suma de factores que inciden: ambiente, especie animal, dieta. En general, la
activa fermentacin de sustratos celulsicos resulta en
mayores proporciones de cido actico. La fermentacin de almidn resulta en mayor proporcin de cido
propinico.
Los tipos de fermentacin con dietas ricas en azcares, incluyendo melazas, es difcil de predecir. Efectos asociativos positivos o negativos pueden resultar
cuando se combinan alimentos. Muchos de los ltimos efectos pueden minimizarse regulando el rgimen alimenticio, el grado de procesamiento de los
granos y el tipo de concentrado adecuado a cada combinacin nutritiva.
Numerosos intentos de mejoramiento de la actividad de
los microorganismos del rumen se llevan adelante e incluyen manejo de la dieta, de aditivos (antibiticos, sustancias tampones, antiprotozoarias), que tienden a incrementan el nivel nutritivo del animal.
323
Bibliografa
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Preguntas de repaso
1) Por qu el ambiente del rumen es muy particular?
2) Cmo funcionan los microorganismos en este ambiente?
3) Explique brevemente las transformaciones de la celulosa hasta los compuestos que son absorbidos por el
animal
4) La metodologa de estudio resulta sencilla? Por qu?
5) Se puede alterar la microbiologa del rumen?
6) De donde se origina el metano eliminado por el ganado?
7) Cmo se puede regular el funcionamiento del rumen?
8) Qu sucede con la lignina de las ingestas?
9) Seale algunos ejemplos de sinergismo entre microorganismos del rumen
10) Analice los gases que se liberan en los rumiantes y su
relacin con el efecto invernadero
18
Los rumiantes constituyen un grupo de animales herbvoros con un estmago dividido en cuatro compartimentos y
rumian un bolo alimenticio parcialmente digerido. Ejemplos: el ganado vacuno, ovino y caprino, alces, camellos,
ciervos, jirafas y bfalos.
Todos estos animales poseen una porcin dilatada en
su tubo digestivo donde los alimentos fibrosos voluminosos, que forman gran proporcin de su dieta, pueden
ser detenidos y sufrir una serie de fermentaciones, que
los hacen disponibles para su asimilacin (figura 1)(Prescott et al, 1999).
La parte superior del estmago se expande para formar
una gran bolsa, denominada rumen, y un pequeo retculo
o redecilla. La parte inferior del estmago est constituida
por una antecmara, el omaso, detrs de la cual se sita el
verdadero estmago (abomaso). Los polisacridos insolubles y la celulosa se mezclan con la saliva y pasan al rumen, donde sufren movimiento de rotacin constante y forman una masa pulposa que es atacada por una activa poblacin microbiana (1012 bacterias/mL). Luego el alimento
pasa al retculo y de all es regurgitado en forma de bolo
alimenticio que el animal rumia. El alimento se mezcla con
saliva, se traga de nuevo y vuelve al rumen al tiempo que
llega otro bolo a la boca. En estas etapas el material va
siendo digerido y se hace ms lquido.
Este material pasa entonces al retculo y de all a la parte inferior del estmago: al omaso y luego al abomaso
(estmago verdadero) donde el alimento es atacado por
las enzimas digestivas normales del animal y el proceso
de digestin contina en forma similar al resto de los
mamferos.
Bolo alimenticio
Esfago
Intestino
delgado
Rumen
Omaso
Abomaso
(estmago verdadero)
Retculo
Estos animales aprovechan la accin de los microorganismos que habitan su tracto gastrointestinal y que
son los principales agentes de la degradacin de las
paredes gruesas de los vegetales y permiten la asimilacin de hidratos de carbono complejos ingeridos por
el animal.
Como los rumiantes no pueden sintetizar celulasas, aprovechan las relaciones simbiticas con microorganismos
anaerobios que las poseen.
El rumen es un ecosistema microbiano complejo, donde
coexisten relaciones simbiticas entre el animal y las poblaciones microbianas. Los alimentos ingeridos son fermentados y los productos finales son cidos grasos vol-
322
Lillian Frioni
Los microorganismos en
los alimentos y la industria
19 Fermentacin lctica y alcohlica.
Aplicaciones biotecnolgicas ....................................................... 341
20 Aplicaciones industriales de los
microorganismos ........................................................................... 357
339
340
Lillian Frioni
321
Preguntas de repaso
1) Cmo afectan las plantas la dinmica del equilibrio
entre los microorganismos en el suelo?
2) Qu acciones de los microorganismos pueden afectar negativamente a las plantas? Seale algn ejemplo
3) Qu mecanismos utilizan los microorganismos para
limitar poblaciones de patgenos vegetales?
4) Seale procedimientos que le permitan demostrar alguno de esos mecanismos como involucrados en el
control biolgico de microorganismos fitopatgenos.
5) Caractersticas importantes en la competencia rizosfrica de microorganismos del suelo?
6) Por qu muchas veces una mezcla de agentes de
control puede resultar ms efectivo que el uso de un
solo microorganismo?
7) Pasos a seguir en la elaboracin de un producto biolgico a usar para control de una fusariosis en raz de
trigo.
8) Discuta los trminos: control qumico, control integrado, control biolgico
360
Lillian Frioni
Cultivo de
reserva
Cultivo en
matrz
Fermentador
inoculante
Azcar
Sobrenadante
Medio
esterilizado
Extraccin
del producto
Preparacin del
medio
Metabolismo 2ario.
Purificacin
del producto
Tratamiento
de efluentes
EtOH
19
Fermentador de
produccin
Biomasa
Envasado
Clulas
Desde muy antiguo el hombre emple a los microorganismos en la produccin y conservacin de alimentos, aun
sin conocerlos. Los mtodos empleados antes de la introduccin de la refrigeracin, radiaciones, aditivos, etc., para
la conservacin de hortalizas, pasturas, granos, leche,
etc. eran
* salado
* secado al aire o ahumado
* fermentaciones cidas
Penicilina
341
Fermentacin lctica
Es uno de los procesos microbianos ms empleados a
nivel mundial ya que involucra a la leche y sus derivados:
manteca, yogur, leches cidas, quesos, produccin de
casena, otros subproductos, en los ensilados (forrajes,
granos, pescado, etc.), en la conservacin de frutas y hortalizas. La fermentacin lctica puede ser como vimos en
el captulo 3, homo o heterofermentativa.
La mayora de las bacterias acidolcticas obtienen energa slo del metabolismo de los carbohidratos y su distribucin est restringida a ambientes con azcares. Exigen
adems aminocidos, vitaminas, purinas y pirimidinas.
culares. Las bacterias carecen de enzimas de la va glicoltica (aldolasa y triosafosfato isomerasa) y la degradacin de la glucosa se realiza por la va de las pentosas. El
rendimiento energtico es menor: 1 solo mol de ATP, en
lugar de 2 como en los homofermentadores que producen el doble de biomasa por mol de azcar fermentado.
342
Lillian Frioni
forma y agrupaciones
fermentacin
Genticamente estable
Crecimiento rpido en cultivo en gran escala con alto rendimiento del producto deseado
Streptococcus
cocos en cadena
homofermentativo
34-46
Leuconostoc
cocos en cadena
heterofermentativo
38-41
Pediococcus
cocos en ttrada
homofermentativo
34-42
Lactobacillus
bacilos en cadena
homofermentativo
32-53
bacilos en cadena
heterofermentativo
34-53
Enterococcus
cocos en cadena
homofermentativo
38-40
Lactococcus
cocos en cadena
homofermentativo
38-41
Como se aprecia los gneros Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus presentan relaciones de bases en su
ADN bastante similares y existe pequea variacin entre
cepas. El gnero Lactobacillus, por el contrario posee
miembros con diversa composicin del ADN y no constituye un grupo homogneo.
Streptococcus: se presentan en cadenas de cocos, son
mesfilos (ptimo entre 20 y 30C), por lo que el calentamiento los destruye con facilidad, son homofermentativos
y presentan una amplia variedad de especies con habitats muy diversos, algunos son patgenos. Constituyen la
flora normal de la leche (figura 1) (Prescott et al., 1999).
Leuconostoc: son diplococos o en cadenas, heterofermentativos, por lo que son poco acidificantes. Su habitat
359
natural lo constituyen los vegetales y tambin se encuentran en la leche. Se emplean mucho como cultivos iniciales en la industria lctica por sus propiedades aromatizantes (diacetilo y acetona al descomponer el citrato),
aunque han sido desplazados por el S. diacetilactis. Algunas cepas producen grandes cantidades del polisacrido
dextrano ( 1,6-glucano), de uso mdico.
Lactobacillus: son bastones que varan de largos y delgados a cortos y curvos. La mayora son homofermentativos, pero algunas especies son heterofermentativas. El
gnero se ha dividido en tres subgrupos principales (cuadro 2). Se los encuentra en la leche, ensilados, frutas y
hortalizas conservadas, en la saliva, en el intestino humano y de animales. Producen grandes cantidades de cido
lctico, resisten altas temperaturas, son termodricos. L.
Motor
Adicin de cultivo o
nutriente
Sonda de pH
Sonda de oxgeno
disuelto
Salida del agua
de refrigeracin
Toma de
muestras
Vlvula
Propulsores
Sensor de
temperatura y
unidad de control
Revestimiento
de refrigeracin
Unidad del
biosensor
Entrada del
agua de
refrigeracin
Vlvula
Entrada de aire
Vlvula
Figura 1- Estreptococos. a) Streptococcus pyogenes (x900), b) micrografa electrnica de barrido de Streptococcus (x33.000), c)
S. pneumoniae (x900)
Salida de
captacin
358
Lillian Frioni
Fermentaciones
Metabolitos secundarios
antibiticos: Penicillum notatum (penicilina), Streptomy-
Ingeniera gentica
vacunas
E.
coli recombinante hiperacumuladora; hormona del crecimiento humano, interferones)
agentes para el control de insectos: la protena txica del Bacillus thuringensis (Bt) es introducida a vegetales
Microbiologa industrial
Esta rama de la microbiologa tiene por objeto la produccin a gran escala de microorganismos de inters (biomasa microbiana), que sern empleados como inoculantes en la produccin de vinos, cervezas, pan, derivados
lcteos, etc., para la obtencin de enzimas de inters,
como celulasa, lipasas, Taq-polimerasa, enzima termolbil, empleada en la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), de metabolitos de inters: aminocidos, hormonas, vitaminas, antibiticos, etc. Los microorganismos se
emplean tambin en el control de insectos y otras plagas,
en la recuperacin de metales y en el cuidado del ambiente (cuadro 2).
En sus comienzos la biotecnologa, aplic los mtodos de
seleccin, mutacin e intercambio gentico. Si bien este
mtodo se sigue empleando, en la biotecnologa moderna estas tcnicas se complementan con el empleo de la
343
organismos genticamente modificadas (OGM) a los cuales se les integraron genes de inters en plsmidos, mediante tcnicas de ingeniera gentica
delbrueckii se emplea en la produccin de yogur, L. acidophilus en la de leche cida y otras especies participan
en la produccin de repollo fermentado, ensilaje y pickles.
Resisten los pH bajos por lo que continan creciendo
cuando el pH descendi e inhibi a otras bacterias lcticas. Son, por lo tanto responsables de las etapas finales
de las fermentaciones acidolcticas. Raramente son
patgenos.
Se los encuentra en la superficie de las plantas, en productos lcteos, carne, cerveza, frutas y muchos otros
materiales.
Especies
Homofermentativos
Ac.lct. principal producto
(ms 85% de la glucosa, no dan
gas,aldolasa)
1) crecen a 45C pero no a 15C
bacilos cortos
L.delbrueckii
L. acidophilus
Heterofermentativos
producen cerca del 50% de c.
lctico, CO2 y etanol, sin
aldolasa, fosfocetolasa presente,
bacilos largos y cortos
ADN
(mol%GC)
50
32-37
L. casei
L. plantarum
L. curvatus
45-46
42-44
L. fermentum
L. brevis,
L.buchneri
L. kefir
53
45
45
41
Leche y derivados
La leche se define como el producto ntegro de ordee
total e ininterrumpido de una hembra lechera sana, descansada y bien alimentada, recogida higinicamente y sin
calostro. Su composicin (g/L) indica que es un muy buen
sustrato para la microflora:
agua
glcidos:lactosa
lpidos
materia grasa
lecitina
fraccin insaponificable
protenas
casena
protena soluble
N no proteco
873
49
35
34
0,5
0,5
34
27
5,5
1,5
sales
del cido ctrico
del c. fosfrico
otras
compuestos diversos
extracto seco total
extracto seco desgrasado
9
2
2,6
4,4
127
93
Se deben incluir carotenoides, vitaminas, enzimas, esteroles, que se encuentran en pequeas cantidades pero
ejercen un efecto relevante. El pH neutro es adecuado
para la mayora de los microorganismos, por lo que este
alimento es atacado por una micropoblacin variada. La
temperatura regular la composicin y velocidad de crecimiento de la misma.
A medida que aumenta la temperatura de conservacin de la leche hasta 35-40C se evidencia mayor desarrollo microbiano. Por encima de 40C se desarrollan especies termfilas como Bacillus, Clostridium y
Steptococcus. Entre 20 y 40C prodominan mesfilos
como Streptococcus. A bajas temperaturas predominan
sicrfilos como Pseudomonas, Alcaligenes y Achromobacter.
Alteracin natural
Por tratarse de un producto muy rico en nutrientes y poseer un azcar fcilmente degradable, la leche es muy
alterable. Se evidencian 4 etapas:
* Perodo germicida: luego de ordeada no se detecta
crecimiento microbiano por la presencia de sustancias
inhibidoras como lactoperoxidasa y aglutininas. Este
perodo vara de pocos minutos a 2 horas dependiendo
de condiciones de temperatura.
344
Lillian Frioni
* Perodo de acidificacin, en el que se desarrollan activamente los microorganismos productores de cido lctico a partir de lactosa hasta que su concentracin llega
a un 1%. La figura 2a muestra la variacin de pH del
sustrato a medida que la fermentacin progresa. A pH
cercanos a 4,0 la acidificacin se detiene por autoinhibicin de la flora lctica. En la figura 2b se aprecian las
variaciones de la lactosa, azcar de la leche, y el cido
lctico, en el tiempo.
* Fase de neutralizacin: el cido estabiliza al producto
pero pueden prosperar hongos y levaduras si la temperatura es adecuada, que consumen el cido lctico. En
la superficie se aprecia densa capa de hongos. El producto se desestabiliza y el resto de las fracciones orgnicas son degradadas.
* Fase de putrefaccin llevada a cabo por bacterias y
hongos que permanecieron al estado latente a pH bajo
y ahora atacan la casena (proteolisis) y luego los lpidos (lipolisis), descomponen totalmente la leche dejando un lquido claro, que puede poseer sustancias
txicas.
9
8
7
6
5
4
3
2
1
pH
tiempo
concentracin
cido lctico
5. Fermentacin lipoltica: causada por microorganismos que desdoblan las grasas en glicerol y cidos grasos y en consecuencia se produce rancidez: Pseudomonas fluorescens, Achromobactyer lipoliticum, levaduras (Candida lipolitica), hongos (Penicullum spp., Geotrochum candidum).
Derivados de la leche
lactosa
b
tiempo
357
4. Fermentacin proteoltica: producida por microorganismos que desdoblan protenas dando olores y sabores desagradables. Los organismos son Streptococcus
liquefaciens, Clostridium butyricum, Bacillus subtilis, Serratia marcens, Pseudomonas putrefaciens.
20
Los microorganismos son muy empleados en procesos vinculados a las industrias alimenticia, qumica, farmacutica, en la elaboracin de inoculantes para la agricultura y la proteccin del ambiente. El hombre, desde
muy antiguo, an sin reconocer la accin de los microorganismos se vali de ellos para conservar alimentos, como por ejemplo, mediante el empleo de las fermentaciones, especialmente la alcohlica, ya referidas
en Egipto, 6.000 aos AC. Pero cuando se emplean
los microorganismos en microbiologa industrial o biotecnologa, se trabaja con el organismo o la comunidad seleccionada el que se propaga en un ambiente
controlado.
Produccin de biomasa
fuente
Ejemplos: Candida lipolytica, levadura que crece en hidrocarburos derivados del petrleo crudo y en hidrocarburos alifticos de cadenas largas (C12-C18)
356
Lillian Frioni
La pasteurizacin elimina a la mayora de los microorganismos que alteran el producto, pero no esteriliza.
Tipos: baja 62C durante 30
alta 72C durante 15
ultrapasteurizacin 140C durante 1
Esterilizacin : se incrementa la distribucin de leches
esterilizadas (larga vida), las que son sometidas a 143C
durante 3 segundos, en tubos concntricos y enfriada rpidamente.
En la ltima parte del siglo 19 se aislaron por primera vez
los microorganismos responsables de la fermentacin lctica. En la actualidad se emplean grandes volmenes de
inoculantes adecuadamente seleccionados por criterios:
345
Leches cidas
Yogur
Se prepara a partir de leche con poca grasa inoculada
con cultivo mixto de:
Leche cida
Es otro tipo de leche fermentada preparada con cultivos
de Lactobacillus acidophillus a la que se le atribuye mayor efecto diettico debido a que la bacteria sobrevive en
el estmago y produce cido lctico en el intestino lo que
inhibe el desarrollo de microorganismos de la putrefaccin. Crece ms lentamente y coagula la leche dentro de
las 4 a 8 horas.
346
Lillian Frioni
Materia prima
Microorganismo
queso
cuajo de leche
Streptococcus spp.
Leuconostoc spp.
Kefir
leche
Streptococcus spp.
Saccharomyces kefir
yogur
leche desnatada y
leche en polvo
Streptomyces thermophillus
Lactobacillus bulgaricus
leche cida
leche
Lactobacillus acidophillus
manteca
crema de leche
Lactobacillus bulgaricus
Leche tipificada
Leche desnatada
seleccin de la leche
homogeneizacin
pasteurizacin
leche en polvo
concentracin
siembra
leche concentrada
incubacin
pH 4,6
refrigeracin
L. bulgaricus (aroma)
cultivo 2-5%
S. tehemophillus
Kefir
Esta leche cida se consume mucho en Europa Oriental.
Las bacterias lcticas se suplementan con una levadura
fermentadora de la glucosa que le proporciona a esta bebida contenido alcohlico de 1-2%. La levadura es Saccharomyces kefir y las bacterias Lactobacillus caucasicus
y Streptococcus spp. El alimento se prepara agregando a
la leche grnulos de kefir de una fermentacin anterior.
Otras bacterias de inters son las bifidobacterias (pertenecientes a los actinomicetes). El gnero Bifidobacterium contiene bacilos Gram positivos irregulares, no es-
Figura 4- Bifidobacterias
Manteca
Su preparacin es en parte microbiolgica ya que el
agriado inicial de la leche por Streptococcus es necesario para la separacin de la grasa. Estos organismos
producen pequeas cantidades de acetona que es oxidada a diacetilo (CH3-CO-CO-CH3), compuesto responsable del sabor. Es comn inocular crema pasteurizada
con cultivos puros de S. lactis, S. cremoris, L. citrovorum y L. diacetylactis.
Preguntas de repaso
1) Concepto general del proceso de fermentacin, rendimientos energticos y en poder reductor de las principales fermentaciones.
2) Compare la fermentacin homo y la heterolctica
3) Ejemplos de aplicaciones biotecnolgicas de la fer-
355
mentacin lctica
4) Dnde puede obtener inculos de bacterias lcticas?
Y cmo se usan los comerciales?
5) Caractersticas de un buen ensilado.
6) Por qu los medios de cultivo con extracto de levadura se denominan complejos?
7) Factores que hacen del vino un producto estable.
354
Lillian Frioni
Elaboracin de cerveza
Esta bebida se produce por fermentacin de granos sin
azcares fermentables. El almidn debe ser hidrolizado a
azcares (maltosa y glucosa) antes de usarse como sustrato por las levaduras para su fermentacin. Este proceso
se llama sacarificacin. Los granos usados pueden ser de
cebada, arroz o maz. Granos de arroz se usan en Asia,
mientras que el maz es utilizado en algunas regiones de
Amrica. Los granos ms empleados son los de cebada.
La conversin de los granos de cebada en malta se denomina malteado: los granos se dejan germinar, luego son
secados y molidos. La malta contiene amilasas que son
las enzimas necesarias para degradar el almidn en azcares fcilmente fermentables. Posteriormente se muele
la malta y se deja hidrolizar su suspensin en agua. Algunos productos incluyen la hidrlisis de protenas, entonces esta mezcla se somete a altas temperaturas para detener estos cambios enzimticos y se filtra.
Agregado de lpulo (inflorescencia del vegetal Humulus
lupus), a la malta para impartirle el caracterstico sabor
amargo de la cerveza por la presencia de una resina soluble que adems acta previniendo el desarrollo de microorganismos no deseados.
Fermentacin
La maltosa y la glucosa son fermentados por cepas seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae conocidas
como levaduras cerveceras. Este proceso se realiza a baja
temperatura por espacio de 5 a 10 das producindose
etanol y CO2.
Maduracin
Luego de la fermentacin la cerveza se almacena a 0C y
precipitan las protenas, resinas y el lquido se aclara.
Enfermedades
Se pueden producir durante el proceso de fermentacin,
en la maduracin y en el embotellamiento. Un agente
nocivo muy comn lo constituye la levadura salvaje Saccharomyces pasteurianus que provoca un sabor amargo
y desagradable. Si la temperatura se hace demasiado
alta durante el proceso de maduracin y almacenamiento
se desarrollan bacterias lcticas produciendo cido lcti-
Esquema
Pasteurizacin
NATA
Refrigeracin
Maduracin
(inculo)
Panificacin
En la elaboracin de pan se usan levaduras para leudar
la masa. La levadura usada es Saccharomyces cerevisiae que por fermentacin alcohlica de los azcares produce etanol y dixido de carbono. En el caso del pan lo
que interesa es la produccin de dixido de carbono que
hace que aumente el volumen de la masa, el alcohol se
evapora en el horno.
Inculos: se usan inculos comerciales, levaduras producidas en gran escala, en sistemas aireados, donde el
rendimiento energtico es ms alto que en la fermentacin. Mediante centrifugado se elimina el lquido y se obtienen los pellets celulares a los que se les agrega aceites
vegetales y se forman los panes de levadura. La levadura
tambin se vende seca, en polvo.
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347
Batido
Suero
Grnulos
Lavado, salado,
armado envasado
Quesos
Es el producto resultante de la concentracin de la materia seca de la leche por coagulacin a travs de la accin
de microorganismos lcticos. La leche posee microorganismos propios y provenientes del ambiente. Algunos son
perjudiciales y otros se usan para elaborar quesos en forma artesanal. La leche pasteurizada asegura la estandarizacin de la produccin al destruir microorganismos
patgenos y saprofitas, colibacterias, levaduras y enzimas
de la leche.
Etapas
* Fermentacin, con o sin inoculacin con S. lactis, S. cremoris, S. casei, Lactobacillus spp.
Aunque hay innumerables tipos de quesos todos requieren la formacin de la cuajada, que se separa de de la
fraccin lquida o suero. La casena sufre cambios fsicoqumicos y precipita como paracaseinato de calcio. Como
coagulante se puede usar cuajo o cido.
El primero es ms usado y se obtiene del estmago de
terneros lactantes y su principio activo es una protena, la
renina, activa a pH cidos (pH 3,8) que se logra por el
cido lctico de las lactobacterias al fermentar la lactosa.
El cido lctico produce adems sabores caractersticos
de estos productos.
* La cuajada pasa por un proceso de maduracin, excepto en algunos quesos frescos o ricota. La dureza del
queso se obtiene en esta etapa: cuanto ms agua pierda la cuajada y ms se comprima, ms duro ser el
producto. Tambin ocurre hidrlisis de de grasas por
enzimas microbianas y la renina.
Los quesos livianos maduran por enzimas de bacterias,
levaduras y hongos que crecen en su superficie.
Los semiblandos como Limburger maduran por bacterias y otros contaminantes de su superficie. El Roquefort lo hace por accin de mohos del gnero Penicillum
cuyas esporas se inoculan en la suferficie, luego se aprecia el color de las hifas (verde, azul, blanco) penetrando
en la pasta. El Camambert madura en pequeos envases para que las enzimas del Penicillum que ha crecido
aerbicamente en la superficie, difundan a interior para
realizar la maduracin. Propionibacterium produce en el
queso tipo suizo los tpicos ojos producidos por la liberacin de gases.
En los quesos de pasta dura, como Cheddar o Suizo, las
bacterias lcticas crecen anaerbicamente en su interior,
mueren y se autolizan.
El cuadro 4 muestra caractersticas de procesos microbiolgicos y bioqumicos y los microorganismos responsables de la produccin de distintos tipos de quesos.
Cuadro 4 - Microbiologa de distintos tipos de queso
Tipos
Proceso
Microorganismo
quesos
(en general)
temperatura de
fermentacin: 35C
42C
S. lactis o cremoris
Lactobacillus (termfilo)
quesos duros
(Chedar, suizo)
proteolisis, lipolisis
quesos blandos
no madurados:
Requesn
Mozzarella
bacterias lcticas
dentro del queso
Lactococcus lactis
S. thermophilus,
L. bulgaricus
madurados
(Camambert)
proteolisis, lipolisis
crecimiento superficial
de hongos: Penicillum spp.
Seguidos de bacterias
Bacterium
queso suizo
ferm. propinica,
lipolisis y produccin
pigmento azul
Propionibacterium spp.
Penicillum roqueforti
quesos muy
duros
madurados
12-16 meses de
maduracin
(Parmesano)
Lactobacillus lactis,
L. cremoris,
S. thermophilus
348
Lillian Frioni
Esquema general:
empaque
maduracin
Coagulacin
(con cuajo)
salado
Corte y
desuerado
trabajo mecnico
y cocido
moldeado
Se estimula as la accin de las bacterias lcticas completndose la secuencia. Pediococcus cereviseae fermenta manitol y dextranos producido por Leuconostoc mesenteroides. Lactobacillus plantarum es el principal productor
de cido lctico de esta secuencia microbiana.
Leche
Fermentacin
seleccionada
con o sin
inoculacin
Para finalizar, los subproductos lcteos se pueden agrupar segn su contenido de agua:
con alto porcentaje de agua: la leche
con alto contenido de gasa: la manteca y crema de leche
con alto porcentaje de protenas: el queso
Pickle
Producto acidificado resultante de la fermentacin lctica de ciertos vegetales.
La fermentacin lctica la realizan las bacterias que se
encuentran en la superficie de los vegetales. En el proceso de conservacin se procura favorecer el desarrollo de
las bacterias lcticas e impedir el desarrollo de otros microorganismos que pueden alterar la calidad del alimento. Las condiciones que favorecen el desarrollo de la flora
lctica son: anaerobiosis y concentracin de sal a 5%.
Se produce la siguiente secuencia de microorganismos:
Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus cereviseae,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis
Leuconostoc mesenteroides realiza fermentacin heterolctica y los productos finales son cido lctico, cido actico, alcohol y CO2. El CO2 desaloja el O2 del medio y asegura la anaerobiosis. El cido lctico baja el pH del medio, lo que inhibe la actividad de la restante microflora presente en los vegetales.
353
Chucrut
Es otra tcnica de conservacin de vegetales por acidificacin. En este caso el vegetal usado es el repollo que se
corta en tiras, se sala en seco y se deja fermentar en recipientes adecuados. El iniciador del proceso fermentativo
es Leuconostoc mesenteroides que produce las condiciones necesarias para la actuacin de las restantes bacterias lcticas.
Materia prima
Microorganismo
Pickle
Ciertas
hortalizas y
frutas
Leuconostoc
mesenteroides
Pediococcus cereviseae
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus brevis
Leuconostoc
mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Chucrut
Repollo
Salchichas
ahumadas
Salame
Carnes y
pescado
Salsas de
pescado
Pediococcus cerevisiae
Lactobacillus plantarum
Lactobacuillus spp
Aspergillus glaucus (Japon)
Luego se debe obtener la anaerobiosis dejando en reposo el contenido de la cuba, para que se produzca la fermentacin. Se debe tener en cuenta el pH, temperatura y
concentracin de azcar del medio, para posibilitar el buen
trabajo de las levaduras. El alto contenido de alcohol y
bajo pH, hacen al vino un medio inapropiado para el crecimiento de la mayora de los microorganismos pero a
veces se puede alterar (cuadro 12). Pasteur fue el primero que describi estas alteraciones:
1. si el vino queda expuesto al aire pueden actuar levaduras no deseadas y bacterias que producen cido actico transformando al vino en vinagre
Vinificacin
El vino se produce por la fermentacin alcohlica del mosto
de uva y el microorganismo responsable es la levadura
Saccharomyces cerevisiae (cuadro 11). La uva colectada
debe tener un contenido adecuado de azcar (160 a 180 g/
L) para posibilitar un buen sustrato para la fermentacin.
En la superficie de las uvas existen levaduras salvajes que
estn naturalmente presentes, pero que no hay que dejar
prosperar porque no producen buenas fermentaciones. Para
eliminarlas se trata la superficie vegetal con sustancias como
dixido de azufre o metabisulfito de potasio. Luego de formado el mosto se le agrega el cultivo de Saccharomyces
cerevisiae aireando el contenido de la cuba para que la levadura se reproduzca rpidamente por respiracin.
Vino
etanol (11%)
levaduras y azcares < 2g/L
pH 3,0-3,8
cidos, idem
aminocidos, amonio, vitaminas
aromas, en mayor proporcin
Ensilados
La conservacin de forrajes o alimentos, granos, tubrculos, pescado, etc. en ausencia del aire, ha sido empleada por el hombre desde hace miles de aos. En el
caso de alimentos para el ganado, la finalidad del proceso es conservar los forrajes con la mayor calidad posible, por un lapso ms o menos prolongado, de forma de
emplearlos en el momento en que se los necesite. Conserva el valor nutritivo del forraje a diferencia del proceso de secado al aire (heno).
Organismo
Saccharomyces cerevisiae var ellipsoideus
Levaduras superficiales
Saccharomyces beticus
Botrytris cineres
Cambios
glucosa y/o fructosa
etanol y CO2
352
Lillian Frioni
Inhibidores: se agregan para evitar el desarrollo de organismos indeseables, como el SO2 que es gas, metabisulfito de sodio, CO2 al 1%.
rios factores; estado de madurez, contenido de humedad, sistema de cosecha del forraje, mtodo empleado. Cuando el silo est bien construido, sin posibilidad de entrada de aire, esta etapa es breve, se
anula la actividad de microorganismos aerobios, se
liberan los jugos celulares y la temperatura comienza a disminuir.
* extraer el aire
Cultivos bacterianos en algunos pases se inoculan
los silos con productos comerciales con bacterias lcticas seleccionadas por su rpida produccin de cido. Si
bien la microflora activa est presente en los vegetales,
puede encontrarse en bajo nmero o las condiciones
pueden no ser las ptimas. La inoculacin puede acelerar el proceso.
La figura 7 esquematiza procesos tanto en la formacin como en el deterioro de los silos. Al entrar aire se
desarrollan microorganismos, sobretodo levaduras y
hongos, que consumen el cido lctico. El silo pierde
la sustancia que lo estabiliza, el pH asciende y se consumen las otras sustancias nutritivas, protenas, lpidos. Es importante evitar esto deterioros, manteniendo cubierto el forraje.
pH
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
O2
20
15
10
5
0
pH
ac. lac.
2.0
1.5
O2
1.0
0 1 hora
1 da
10 das 100 das
tiempo
Etapa de campo Fermentacin Almacenamiento Apertura
Fermentacin alcohlica
Glucosa
(gliclisis)
pirvico
acetaldehdo
etanol
CO2
azcares + O2
349
La figura 6 esquematiza las fases del proceso en forrajes: una fase aerbica en el campo, una fase de fermentacin inicialmente aerobia, una de almacenamiento y
descarga que resulta en estabilizacin o deterioro, dependiendo del nivel de pH obtenido y el grado de entrada del aire.
350
Lillian Frioni
Ausencia de O2
Desarrollo de bacterias lcticas
Pobre en azcares
Rico en azcares
Fermentacin
Aditivos
Mal ensilado
Buen ensilado
Temperatura
pH
lctica
5 a 60C
ptimo 35C
3y4
actica
18-25C
butrica
20-40C
mizan las prdidas por respiracin. Los microorganismos responsables se encuentran normalmente en nmero suficiente en el exterior de forrajes y su sabor y
olor son apetecidos por el ganado
Hidratos de C
Humedad, jugos
vegetales
Bacterias lcticas
Organismo
L. plantarum
L. brevis
L. casei
S. lactis
grupo coliforme
4y5
Clostridium
La produccin de cido actico, causada por microorganismos del grupo coliforme es de escaso significado en
los silos. La fermentacin butrica no es deseada, pues
causa sabores desagradables, sobre todo para el hombre. Los animales pueden tolerarlo. Se puede producir
tambin mezcla de cido actico, etanol e H2. La temperatura ms favorable para especies de Clostridium es entre 20 y 40C y no soportan pH inferiores a 4,0.
Carbohidratos
Protenas
maz o sorgo
gramneas (pasturas)
gramneas + leguminosas
leguminosas
elevado
alto
mediano
muy bajo
muy bajo
regular
mediano
elevado
45
30
22
% c. lctico
% c. butrico
0,4
1,9
1,2
3,7
0,1
0,1
* Facilitar rpido contacto entre las bacterias y los carbohidratos; el picado o triturado de los forrajes permite la
exclusin del aire y el contacto con las bacterias. El proceso se acelera.
alfalfa
sorgo
maz
sorgo
maz
alfalfa
Silo
Materia
seca %
Protena
bruta %
Azcares
solubles %
Azcares/
protenas
24,4
35,2
24,1
25,2
9,4
8,6
3,9
10,4
15,9
0,15
1,10
1,80
%M.S.
34,7
22,4
21,2
%
%
Prot Azcares
pH
8,5
10,2
16,7
4,2
3,9
5,7
1,8
1,7
0,0
2,8
3,8
1,3
cidos %
A
P
0,6
0,6
1,1
0,0
0,0
0,5
Aditivos
Se recomienda el uso de estas sustancias cuando la escasez o el exceso de algn elemento en la planta hace
insegura la conservacin del silo, o cuando se desea mejorar el valor nutritivo, la apeticibilidad, o ambos. La correcta distribucin de estas sustancias en toda la masa
del silo asegura su eficacia.
Productos ricos en carbohidratos: se agregan a materiales pobres en ellos, como las leguminosas:
Cultivos a ensilar
351
* melaza, subproducto de la refinera de la caa de azcar, se presenta como un lquido oscuro, espeso, con
olor caracterstico que es muy empleada por su bajo
costo. Se mezcla en partes iguales con agua y puede
agregarse a la cosechadora que va regando el forraje
(3-5% en peso), con este aditivo.
* granos: poseen almidn, poco empleado por la flora lctica hasta desdoblamiento enzimtico en azcares. Se
aconseja ms la harina de granos (70 a 100 kg/ton forraje).
* suero de leche: posee entre 4 y 5% de lactosa, pero los
volmenes a manejar son grandes (250 L/ton forraje).
Se usan ms sueros desecados (20-30 kg/ton)
* papas, remolacha azucarera, desechos de frutas, etc.
son tambin empleados.
B
0,0
0,0
1,9
Conservadores: agregado de cidos directamente al forraje hasta bajar su pH a menos de 4,0. Mtodo AIV: se
emplean 4 partes de cido sulfrico y 6 de cido clorhdrico, que se mezcla en el momento de ensilar diluyendo en
5-6 veces su peso en agua. Se detiene la actividad de las
clulas, que se marchitan y el desarrollo de microorganismos indeseables. Se usa en pases nrdicos, muy fros,
donde cuesta establecer la fermentacin.
350
Lillian Frioni
Ausencia de O2
Desarrollo de bacterias lcticas
Pobre en azcares
Rico en azcares
Fermentacin
Aditivos
Mal ensilado
Buen ensilado
Temperatura
pH
lctica
5 a 60C
ptimo 35C
3y4
actica
18-25C
butrica
20-40C
mizan las prdidas por respiracin. Los microorganismos responsables se encuentran normalmente en nmero suficiente en el exterior de forrajes y su sabor y
olor son apetecidos por el ganado
Hidratos de C
Humedad, jugos
vegetales
Bacterias lcticas
Organismo
L. plantarum
L. brevis
L. casei
S. lactis
grupo coliforme
4y5
Clostridium
La produccin de cido actico, causada por microorganismos del grupo coliforme es de escaso significado en
los silos. La fermentacin butrica no es deseada, pues
causa sabores desagradables, sobre todo para el hombre. Los animales pueden tolerarlo. Se puede producir
tambin mezcla de cido actico, etanol e H2. La temperatura ms favorable para especies de Clostridium es entre 20 y 40C y no soportan pH inferiores a 4,0.
Carbohidratos
Protenas
maz o sorgo
gramneas (pasturas)
gramneas + leguminosas
leguminosas
elevado
alto
mediano
muy bajo
muy bajo
regular
mediano
elevado
45
30
22
% c. lctico
% c. butrico
0,4
1,9
1,2
3,7
0,1
0,1
* Facilitar rpido contacto entre las bacterias y los carbohidratos; el picado o triturado de los forrajes permite la
exclusin del aire y el contacto con las bacterias. El proceso se acelera.
alfalfa
sorgo
maz
sorgo
maz
alfalfa
Silo
Materia
seca %
Protena
bruta %
Azcares
solubles %
Azcares/
protenas
24,4
35,2
24,1
25,2
9,4
8,6
3,9
10,4
15,9
0,15
1,10
1,80
%M.S.
34,7
22,4
21,2
%
%
Prot Azcares
pH
8,5
10,2
16,7
4,2
3,9
5,7
1,8
1,7
0,0
2,8
3,8
1,3
cidos %
A
P
0,6
0,6
1,1
0,0
0,0
0,5
Aditivos
Se recomienda el uso de estas sustancias cuando la escasez o el exceso de algn elemento en la planta hace
insegura la conservacin del silo, o cuando se desea mejorar el valor nutritivo, la apeticibilidad, o ambos. La correcta distribucin de estas sustancias en toda la masa
del silo asegura su eficacia.
Productos ricos en carbohidratos: se agregan a materiales pobres en ellos, como las leguminosas:
Cultivos a ensilar
351
* melaza, subproducto de la refinera de la caa de azcar, se presenta como un lquido oscuro, espeso, con
olor caracterstico que es muy empleada por su bajo
costo. Se mezcla en partes iguales con agua y puede
agregarse a la cosechadora que va regando el forraje
(3-5% en peso), con este aditivo.
* granos: poseen almidn, poco empleado por la flora lctica hasta desdoblamiento enzimtico en azcares. Se
aconseja ms la harina de granos (70 a 100 kg/ton forraje).
* suero de leche: posee entre 4 y 5% de lactosa, pero los
volmenes a manejar son grandes (250 L/ton forraje).
Se usan ms sueros desecados (20-30 kg/ton)
* papas, remolacha azucarera, desechos de frutas, etc.
son tambin empleados.
B
0,0
0,0
1,9
Conservadores: agregado de cidos directamente al forraje hasta bajar su pH a menos de 4,0. Mtodo AIV: se
emplean 4 partes de cido sulfrico y 6 de cido clorhdrico, que se mezcla en el momento de ensilar diluyendo en
5-6 veces su peso en agua. Se detiene la actividad de las
clulas, que se marchitan y el desarrollo de microorganismos indeseables. Se usa en pases nrdicos, muy fros,
donde cuesta establecer la fermentacin.
352
Lillian Frioni
Inhibidores: se agregan para evitar el desarrollo de organismos indeseables, como el SO2 que es gas, metabisulfito de sodio, CO2 al 1%.
rios factores; estado de madurez, contenido de humedad, sistema de cosecha del forraje, mtodo empleado. Cuando el silo est bien construido, sin posibilidad de entrada de aire, esta etapa es breve, se
anula la actividad de microorganismos aerobios, se
liberan los jugos celulares y la temperatura comienza a disminuir.
* extraer el aire
Cultivos bacterianos en algunos pases se inoculan
los silos con productos comerciales con bacterias lcticas seleccionadas por su rpida produccin de cido. Si
bien la microflora activa est presente en los vegetales,
puede encontrarse en bajo nmero o las condiciones
pueden no ser las ptimas. La inoculacin puede acelerar el proceso.
La figura 7 esquematiza procesos tanto en la formacin como en el deterioro de los silos. Al entrar aire se
desarrollan microorganismos, sobretodo levaduras y
hongos, que consumen el cido lctico. El silo pierde
la sustancia que lo estabiliza, el pH asciende y se consumen las otras sustancias nutritivas, protenas, lpidos. Es importante evitar esto deterioros, manteniendo cubierto el forraje.
pH
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
O2
20
15
10
5
0
pH
ac. lac.
2.0
1.5
O2
1.0
0 1 hora
1 da
10 das 100 das
tiempo
Etapa de campo Fermentacin Almacenamiento Apertura
Fermentacin alcohlica
Glucosa
(gliclisis)
pirvico
acetaldehdo
etanol
CO2
azcares + O2
349
La figura 6 esquematiza las fases del proceso en forrajes: una fase aerbica en el campo, una fase de fermentacin inicialmente aerobia, una de almacenamiento y
descarga que resulta en estabilizacin o deterioro, dependiendo del nivel de pH obtenido y el grado de entrada del aire.
348
Lillian Frioni
Esquema general:
empaque
maduracin
Coagulacin
(con cuajo)
salado
Corte y
desuerado
trabajo mecnico
y cocido
moldeado
Se estimula as la accin de las bacterias lcticas completndose la secuencia. Pediococcus cereviseae fermenta manitol y dextranos producido por Leuconostoc mesenteroides. Lactobacillus plantarum es el principal productor
de cido lctico de esta secuencia microbiana.
Leche
Fermentacin
seleccionada
con o sin
inoculacin
Para finalizar, los subproductos lcteos se pueden agrupar segn su contenido de agua:
con alto porcentaje de agua: la leche
con alto contenido de gasa: la manteca y crema de leche
con alto porcentaje de protenas: el queso
Pickle
Producto acidificado resultante de la fermentacin lctica de ciertos vegetales.
La fermentacin lctica la realizan las bacterias que se
encuentran en la superficie de los vegetales. En el proceso de conservacin se procura favorecer el desarrollo de
las bacterias lcticas e impedir el desarrollo de otros microorganismos que pueden alterar la calidad del alimento. Las condiciones que favorecen el desarrollo de la flora
lctica son: anaerobiosis y concentracin de sal a 5%.
Se produce la siguiente secuencia de microorganismos:
Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus cereviseae,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis
Leuconostoc mesenteroides realiza fermentacin heterolctica y los productos finales son cido lctico, cido actico, alcohol y CO2. El CO2 desaloja el O2 del medio y asegura la anaerobiosis. El cido lctico baja el pH del medio, lo que inhibe la actividad de la restante microflora presente en los vegetales.
353
Chucrut
Es otra tcnica de conservacin de vegetales por acidificacin. En este caso el vegetal usado es el repollo que se
corta en tiras, se sala en seco y se deja fermentar en recipientes adecuados. El iniciador del proceso fermentativo
es Leuconostoc mesenteroides que produce las condiciones necesarias para la actuacin de las restantes bacterias lcticas.
Materia prima
Microorganismo
Pickle
Ciertas
hortalizas y
frutas
Leuconostoc
mesenteroides
Pediococcus cereviseae
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus brevis
Leuconostoc
mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Chucrut
Repollo
Salchichas
ahumadas
Salame
Carnes y
pescado
Salsas de
pescado
Pediococcus cerevisiae
Lactobacillus plantarum
Lactobacuillus spp
Aspergillus glaucus (Japon)
Luego se debe obtener la anaerobiosis dejando en reposo el contenido de la cuba, para que se produzca la fermentacin. Se debe tener en cuenta el pH, temperatura y
concentracin de azcar del medio, para posibilitar el buen
trabajo de las levaduras. El alto contenido de alcohol y
bajo pH, hacen al vino un medio inapropiado para el crecimiento de la mayora de los microorganismos pero a
veces se puede alterar (cuadro 12). Pasteur fue el primero que describi estas alteraciones:
1. si el vino queda expuesto al aire pueden actuar levaduras no deseadas y bacterias que producen cido actico transformando al vino en vinagre
Vinificacin
El vino se produce por la fermentacin alcohlica del mosto
de uva y el microorganismo responsable es la levadura
Saccharomyces cerevisiae (cuadro 11). La uva colectada
debe tener un contenido adecuado de azcar (160 a 180 g/
L) para posibilitar un buen sustrato para la fermentacin.
En la superficie de las uvas existen levaduras salvajes que
estn naturalmente presentes, pero que no hay que dejar
prosperar porque no producen buenas fermentaciones. Para
eliminarlas se trata la superficie vegetal con sustancias como
dixido de azufre o metabisulfito de potasio. Luego de formado el mosto se le agrega el cultivo de Saccharomyces
cerevisiae aireando el contenido de la cuba para que la levadura se reproduzca rpidamente por respiracin.
Vino
etanol (11%)
levaduras y azcares < 2g/L
pH 3,0-3,8
cidos, idem
aminocidos, amonio, vitaminas
aromas, en mayor proporcin
Ensilados
La conservacin de forrajes o alimentos, granos, tubrculos, pescado, etc. en ausencia del aire, ha sido empleada por el hombre desde hace miles de aos. En el
caso de alimentos para el ganado, la finalidad del proceso es conservar los forrajes con la mayor calidad posible, por un lapso ms o menos prolongado, de forma de
emplearlos en el momento en que se los necesite. Conserva el valor nutritivo del forraje a diferencia del proceso de secado al aire (heno).
Organismo
Saccharomyces cerevisiae var ellipsoideus
Levaduras superficiales
Saccharomyces beticus
Botrytris cineres
Cambios
glucosa y/o fructosa
etanol y CO2
354
Lillian Frioni
Elaboracin de cerveza
Esta bebida se produce por fermentacin de granos sin
azcares fermentables. El almidn debe ser hidrolizado a
azcares (maltosa y glucosa) antes de usarse como sustrato por las levaduras para su fermentacin. Este proceso
se llama sacarificacin. Los granos usados pueden ser de
cebada, arroz o maz. Granos de arroz se usan en Asia,
mientras que el maz es utilizado en algunas regiones de
Amrica. Los granos ms empleados son los de cebada.
La conversin de los granos de cebada en malta se denomina malteado: los granos se dejan germinar, luego son
secados y molidos. La malta contiene amilasas que son
las enzimas necesarias para degradar el almidn en azcares fcilmente fermentables. Posteriormente se muele
la malta y se deja hidrolizar su suspensin en agua. Algunos productos incluyen la hidrlisis de protenas, entonces esta mezcla se somete a altas temperaturas para detener estos cambios enzimticos y se filtra.
Agregado de lpulo (inflorescencia del vegetal Humulus
lupus), a la malta para impartirle el caracterstico sabor
amargo de la cerveza por la presencia de una resina soluble que adems acta previniendo el desarrollo de microorganismos no deseados.
Fermentacin
La maltosa y la glucosa son fermentados por cepas seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae conocidas
como levaduras cerveceras. Este proceso se realiza a baja
temperatura por espacio de 5 a 10 das producindose
etanol y CO2.
Maduracin
Luego de la fermentacin la cerveza se almacena a 0C y
precipitan las protenas, resinas y el lquido se aclara.
Enfermedades
Se pueden producir durante el proceso de fermentacin,
en la maduracin y en el embotellamiento. Un agente
nocivo muy comn lo constituye la levadura salvaje Saccharomyces pasteurianus que provoca un sabor amargo
y desagradable. Si la temperatura se hace demasiado
alta durante el proceso de maduracin y almacenamiento
se desarrollan bacterias lcticas produciendo cido lcti-
Esquema
Pasteurizacin
NATA
Refrigeracin
Maduracin
(inculo)
Panificacin
En la elaboracin de pan se usan levaduras para leudar
la masa. La levadura usada es Saccharomyces cerevisiae que por fermentacin alcohlica de los azcares produce etanol y dixido de carbono. En el caso del pan lo
que interesa es la produccin de dixido de carbono que
hace que aumente el volumen de la masa, el alcohol se
evapora en el horno.
Inculos: se usan inculos comerciales, levaduras producidas en gran escala, en sistemas aireados, donde el
rendimiento energtico es ms alto que en la fermentacin. Mediante centrifugado se elimina el lquido y se obtienen los pellets celulares a los que se les agrega aceites
vegetales y se forman los panes de levadura. La levadura
tambin se vende seca, en polvo.
Bibliografa
Frazier, W. C., D. C. Westhoff Microbiologa de los Alimentos, 1985, Ed. Acribia, Barcelona
Frioni, L. Procesos microbianos. 1999 Fundacin de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto, Argentina
Jonsson, A. The role of yeasts and clostridia in silage deterioration, 1989, Sveriges lantbruksuniversitet, Inst. fr
Mikrobiologi, Rapport 42, Uppsala: 1-51
Madigan, Martinko, Parker Brock, Biologa de los microorganismos, 2000. Prentice Hall International
National Academy of Sciences, Microbial processes:
Promisiong Technologies for Developing Countries, 1979, Washington DC
Peagaricano, J. A. , W. Arias y N. J. Llaneza Ensilaje,1988, Ed. Hemisferio Sur
Prescott, Harley y Klein Microbiologa, 1999, McGrawHill.Interamericana
Salminen, S. y A. von Wright, Lactic Acid bacteria, 1993,
Marcel Dekker, New York
Varnam, A. H. The exploitation of microorganisms in the
processing of dairy products. En : Exploitation of Microorganisms, 1993 D. Gareth Jones (ed), Chapman
& Hall, London: 273-296
347
Batido
Suero
Grnulos
Lavado, salado,
armado envasado
Quesos
Es el producto resultante de la concentracin de la materia seca de la leche por coagulacin a travs de la accin
de microorganismos lcticos. La leche posee microorganismos propios y provenientes del ambiente. Algunos son
perjudiciales y otros se usan para elaborar quesos en forma artesanal. La leche pasteurizada asegura la estandarizacin de la produccin al destruir microorganismos
patgenos y saprofitas, colibacterias, levaduras y enzimas
de la leche.
Etapas
* Fermentacin, con o sin inoculacin con S. lactis, S. cremoris, S. casei, Lactobacillus spp.
Aunque hay innumerables tipos de quesos todos requieren la formacin de la cuajada, que se separa de de la
fraccin lquida o suero. La casena sufre cambios fsicoqumicos y precipita como paracaseinato de calcio. Como
coagulante se puede usar cuajo o cido.
El primero es ms usado y se obtiene del estmago de
terneros lactantes y su principio activo es una protena, la
renina, activa a pH cidos (pH 3,8) que se logra por el
cido lctico de las lactobacterias al fermentar la lactosa.
El cido lctico produce adems sabores caractersticos
de estos productos.
* La cuajada pasa por un proceso de maduracin, excepto en algunos quesos frescos o ricota. La dureza del
queso se obtiene en esta etapa: cuanto ms agua pierda la cuajada y ms se comprima, ms duro ser el
producto. Tambin ocurre hidrlisis de de grasas por
enzimas microbianas y la renina.
Los quesos livianos maduran por enzimas de bacterias,
levaduras y hongos que crecen en su superficie.
Los semiblandos como Limburger maduran por bacterias y otros contaminantes de su superficie. El Roquefort lo hace por accin de mohos del gnero Penicillum
cuyas esporas se inoculan en la suferficie, luego se aprecia el color de las hifas (verde, azul, blanco) penetrando
en la pasta. El Camambert madura en pequeos envases para que las enzimas del Penicillum que ha crecido
aerbicamente en la superficie, difundan a interior para
realizar la maduracin. Propionibacterium produce en el
queso tipo suizo los tpicos ojos producidos por la liberacin de gases.
En los quesos de pasta dura, como Cheddar o Suizo, las
bacterias lcticas crecen anaerbicamente en su interior,
mueren y se autolizan.
El cuadro 4 muestra caractersticas de procesos microbiolgicos y bioqumicos y los microorganismos responsables de la produccin de distintos tipos de quesos.
Cuadro 4 - Microbiologa de distintos tipos de queso
Tipos
Proceso
Microorganismo
quesos
(en general)
temperatura de
fermentacin: 35C
42C
S. lactis o cremoris
Lactobacillus (termfilo)
quesos duros
(Chedar, suizo)
proteolisis, lipolisis
quesos blandos
no madurados:
Requesn
Mozzarella
bacterias lcticas
dentro del queso
Lactococcus lactis
S. thermophilus,
L. bulgaricus
madurados
(Camambert)
proteolisis, lipolisis
crecimiento superficial
de hongos: Penicillum spp.
Seguidos de bacterias
Bacterium
queso suizo
ferm. propinica,
lipolisis y produccin
pigmento azul
Propionibacterium spp.
Penicillum roqueforti
quesos muy
duros
madurados
12-16 meses de
maduracin
(Parmesano)
Lactobacillus lactis,
L. cremoris,
S. thermophilus
346
Lillian Frioni
Materia prima
Microorganismo
queso
cuajo de leche
Streptococcus spp.
Leuconostoc spp.
Kefir
leche
Streptococcus spp.
Saccharomyces kefir
yogur
leche desnatada y
leche en polvo
Streptomyces thermophillus
Lactobacillus bulgaricus
leche cida
leche
Lactobacillus acidophillus
manteca
crema de leche
Lactobacillus bulgaricus
Leche tipificada
Leche desnatada
seleccin de la leche
homogeneizacin
pasteurizacin
leche en polvo
concentracin
siembra
leche concentrada
incubacin
pH 4,6
refrigeracin
L. bulgaricus (aroma)
cultivo 2-5%
S. tehemophillus
Kefir
Esta leche cida se consume mucho en Europa Oriental.
Las bacterias lcticas se suplementan con una levadura
fermentadora de la glucosa que le proporciona a esta bebida contenido alcohlico de 1-2%. La levadura es Saccharomyces kefir y las bacterias Lactobacillus caucasicus
y Streptococcus spp. El alimento se prepara agregando a
la leche grnulos de kefir de una fermentacin anterior.
Otras bacterias de inters son las bifidobacterias (pertenecientes a los actinomicetes). El gnero Bifidobacterium contiene bacilos Gram positivos irregulares, no es-
Figura 4- Bifidobacterias
Manteca
Su preparacin es en parte microbiolgica ya que el
agriado inicial de la leche por Streptococcus es necesario para la separacin de la grasa. Estos organismos
producen pequeas cantidades de acetona que es oxidada a diacetilo (CH3-CO-CO-CH3), compuesto responsable del sabor. Es comn inocular crema pasteurizada
con cultivos puros de S. lactis, S. cremoris, L. citrovorum y L. diacetylactis.
Preguntas de repaso
1) Concepto general del proceso de fermentacin, rendimientos energticos y en poder reductor de las principales fermentaciones.
2) Compare la fermentacin homo y la heterolctica
3) Ejemplos de aplicaciones biotecnolgicas de la fer-
355
mentacin lctica
4) Dnde puede obtener inculos de bacterias lcticas?
Y cmo se usan los comerciales?
5) Caractersticas de un buen ensilado.
6) Por qu los medios de cultivo con extracto de levadura se denominan complejos?
7) Factores que hacen del vino un producto estable.
356
Lillian Frioni
La pasteurizacin elimina a la mayora de los microorganismos que alteran el producto, pero no esteriliza.
Tipos: baja 62C durante 30
alta 72C durante 15
ultrapasteurizacin 140C durante 1
Esterilizacin : se incrementa la distribucin de leches
esterilizadas (larga vida), las que son sometidas a 143C
durante 3 segundos, en tubos concntricos y enfriada rpidamente.
En la ltima parte del siglo 19 se aislaron por primera vez
los microorganismos responsables de la fermentacin lctica. En la actualidad se emplean grandes volmenes de
inoculantes adecuadamente seleccionados por criterios:
345
Leches cidas
Yogur
Se prepara a partir de leche con poca grasa inoculada
con cultivo mixto de:
Leche cida
Es otro tipo de leche fermentada preparada con cultivos
de Lactobacillus acidophillus a la que se le atribuye mayor efecto diettico debido a que la bacteria sobrevive en
el estmago y produce cido lctico en el intestino lo que
inhibe el desarrollo de microorganismos de la putrefaccin. Crece ms lentamente y coagula la leche dentro de
las 4 a 8 horas.
344
Lillian Frioni
* Perodo de acidificacin, en el que se desarrollan activamente los microorganismos productores de cido lctico a partir de lactosa hasta que su concentracin llega
a un 1%. La figura 2a muestra la variacin de pH del
sustrato a medida que la fermentacin progresa. A pH
cercanos a 4,0 la acidificacin se detiene por autoinhibicin de la flora lctica. En la figura 2b se aprecian las
variaciones de la lactosa, azcar de la leche, y el cido
lctico, en el tiempo.
* Fase de neutralizacin: el cido estabiliza al producto
pero pueden prosperar hongos y levaduras si la temperatura es adecuada, que consumen el cido lctico. En
la superficie se aprecia densa capa de hongos. El producto se desestabiliza y el resto de las fracciones orgnicas son degradadas.
* Fase de putrefaccin llevada a cabo por bacterias y
hongos que permanecieron al estado latente a pH bajo
y ahora atacan la casena (proteolisis) y luego los lpidos (lipolisis), descomponen totalmente la leche dejando un lquido claro, que puede poseer sustancias
txicas.
9
8
7
6
5
4
3
2
1
pH
tiempo
concentracin
cido lctico
5. Fermentacin lipoltica: causada por microorganismos que desdoblan las grasas en glicerol y cidos grasos y en consecuencia se produce rancidez: Pseudomonas fluorescens, Achromobactyer lipoliticum, levaduras (Candida lipolitica), hongos (Penicullum spp., Geotrochum candidum).
Derivados de la leche
lactosa
b
tiempo
357
4. Fermentacin proteoltica: producida por microorganismos que desdoblan protenas dando olores y sabores desagradables. Los organismos son Streptococcus
liquefaciens, Clostridium butyricum, Bacillus subtilis, Serratia marcens, Pseudomonas putrefaciens.
20
Los microorganismos son muy empleados en procesos vinculados a las industrias alimenticia, qumica, farmacutica, en la elaboracin de inoculantes para la agricultura y la proteccin del ambiente. El hombre, desde
muy antiguo, an sin reconocer la accin de los microorganismos se vali de ellos para conservar alimentos, como por ejemplo, mediante el empleo de las fermentaciones, especialmente la alcohlica, ya referidas
en Egipto, 6.000 aos AC. Pero cuando se emplean
los microorganismos en microbiologa industrial o biotecnologa, se trabaja con el organismo o la comunidad seleccionada el que se propaga en un ambiente
controlado.
Produccin de biomasa
fuente
Ejemplos: Candida lipolytica, levadura que crece en hidrocarburos derivados del petrleo crudo y en hidrocarburos alifticos de cadenas largas (C12-C18)
358
Lillian Frioni
Fermentaciones
Metabolitos secundarios
antibiticos: Penicillum notatum (penicilina), Streptomy-
Ingeniera gentica
vacunas
E.
coli recombinante hiperacumuladora; hormona del crecimiento humano, interferones)
agentes para el control de insectos: la protena txica del Bacillus thuringensis (Bt) es introducida a vegetales
Microbiologa industrial
Esta rama de la microbiologa tiene por objeto la produccin a gran escala de microorganismos de inters (biomasa microbiana), que sern empleados como inoculantes en la produccin de vinos, cervezas, pan, derivados
lcteos, etc., para la obtencin de enzimas de inters,
como celulasa, lipasas, Taq-polimerasa, enzima termolbil, empleada en la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), de metabolitos de inters: aminocidos, hormonas, vitaminas, antibiticos, etc. Los microorganismos se
emplean tambin en el control de insectos y otras plagas,
en la recuperacin de metales y en el cuidado del ambiente (cuadro 2).
En sus comienzos la biotecnologa, aplic los mtodos de
seleccin, mutacin e intercambio gentico. Si bien este
mtodo se sigue empleando, en la biotecnologa moderna estas tcnicas se complementan con el empleo de la
343
organismos genticamente modificadas (OGM) a los cuales se les integraron genes de inters en plsmidos, mediante tcnicas de ingeniera gentica
delbrueckii se emplea en la produccin de yogur, L. acidophilus en la de leche cida y otras especies participan
en la produccin de repollo fermentado, ensilaje y pickles.
Resisten los pH bajos por lo que continan creciendo
cuando el pH descendi e inhibi a otras bacterias lcticas. Son, por lo tanto responsables de las etapas finales
de las fermentaciones acidolcticas. Raramente son
patgenos.
Se los encuentra en la superficie de las plantas, en productos lcteos, carne, cerveza, frutas y muchos otros
materiales.
Especies
Homofermentativos
Ac.lct. principal producto
(ms 85% de la glucosa, no dan
gas,aldolasa)
1) crecen a 45C pero no a 15C
bacilos cortos
L.delbrueckii
L. acidophilus
Heterofermentativos
producen cerca del 50% de c.
lctico, CO2 y etanol, sin
aldolasa, fosfocetolasa presente,
bacilos largos y cortos
ADN
(mol%GC)
50
32-37
L. casei
L. plantarum
L. curvatus
45-46
42-44
L. fermentum
L. brevis,
L.buchneri
L. kefir
53
45
45
41
Leche y derivados
La leche se define como el producto ntegro de ordee
total e ininterrumpido de una hembra lechera sana, descansada y bien alimentada, recogida higinicamente y sin
calostro. Su composicin (g/L) indica que es un muy buen
sustrato para la microflora:
agua
glcidos:lactosa
lpidos
materia grasa
lecitina
fraccin insaponificable
protenas
casena
protena soluble
N no proteco
873
49
35
34
0,5
0,5
34
27
5,5
1,5
sales
del cido ctrico
del c. fosfrico
otras
compuestos diversos
extracto seco total
extracto seco desgrasado
9
2
2,6
4,4
127
93
Se deben incluir carotenoides, vitaminas, enzimas, esteroles, que se encuentran en pequeas cantidades pero
ejercen un efecto relevante. El pH neutro es adecuado
para la mayora de los microorganismos, por lo que este
alimento es atacado por una micropoblacin variada. La
temperatura regular la composicin y velocidad de crecimiento de la misma.
A medida que aumenta la temperatura de conservacin de la leche hasta 35-40C se evidencia mayor desarrollo microbiano. Por encima de 40C se desarrollan especies termfilas como Bacillus, Clostridium y
Steptococcus. Entre 20 y 40C prodominan mesfilos
como Streptococcus. A bajas temperaturas predominan
sicrfilos como Pseudomonas, Alcaligenes y Achromobacter.
Alteracin natural
Por tratarse de un producto muy rico en nutrientes y poseer un azcar fcilmente degradable, la leche es muy
alterable. Se evidencian 4 etapas:
* Perodo germicida: luego de ordeada no se detecta
crecimiento microbiano por la presencia de sustancias
inhibidoras como lactoperoxidasa y aglutininas. Este
perodo vara de pocos minutos a 2 horas dependiendo
de condiciones de temperatura.
342
Lillian Frioni
forma y agrupaciones
fermentacin
Genticamente estable
Crecimiento rpido en cultivo en gran escala con alto rendimiento del producto deseado
Streptococcus
cocos en cadena
homofermentativo
34-46
Leuconostoc
cocos en cadena
heterofermentativo
38-41
Pediococcus
cocos en ttrada
homofermentativo
34-42
Lactobacillus
bacilos en cadena
homofermentativo
32-53
bacilos en cadena
heterofermentativo
34-53
Enterococcus
cocos en cadena
homofermentativo
38-40
Lactococcus
cocos en cadena
homofermentativo
38-41
Como se aprecia los gneros Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus presentan relaciones de bases en su
ADN bastante similares y existe pequea variacin entre
cepas. El gnero Lactobacillus, por el contrario posee
miembros con diversa composicin del ADN y no constituye un grupo homogneo.
Streptococcus: se presentan en cadenas de cocos, son
mesfilos (ptimo entre 20 y 30C), por lo que el calentamiento los destruye con facilidad, son homofermentativos
y presentan una amplia variedad de especies con habitats muy diversos, algunos son patgenos. Constituyen la
flora normal de la leche (figura 1) (Prescott et al., 1999).
Leuconostoc: son diplococos o en cadenas, heterofermentativos, por lo que son poco acidificantes. Su habitat
359
natural lo constituyen los vegetales y tambin se encuentran en la leche. Se emplean mucho como cultivos iniciales en la industria lctica por sus propiedades aromatizantes (diacetilo y acetona al descomponer el citrato),
aunque han sido desplazados por el S. diacetilactis. Algunas cepas producen grandes cantidades del polisacrido
dextrano ( 1,6-glucano), de uso mdico.
Lactobacillus: son bastones que varan de largos y delgados a cortos y curvos. La mayora son homofermentativos, pero algunas especies son heterofermentativas. El
gnero se ha dividido en tres subgrupos principales (cuadro 2). Se los encuentra en la leche, ensilados, frutas y
hortalizas conservadas, en la saliva, en el intestino humano y de animales. Producen grandes cantidades de cido
lctico, resisten altas temperaturas, son termodricos. L.
Motor
Adicin de cultivo o
nutriente
Sonda de pH
Sonda de oxgeno
disuelto
Salida del agua
de refrigeracin
Toma de
muestras
Vlvula
Propulsores
Sensor de
temperatura y
unidad de control
Revestimiento
de refrigeracin
Unidad del
biosensor
Entrada del
agua de
refrigeracin
Vlvula
Entrada de aire
Vlvula
Figura 1- Estreptococos. a) Streptococcus pyogenes (x900), b) micrografa electrnica de barrido de Streptococcus (x33.000), c)
S. pneumoniae (x900)
Salida de
captacin
360
Lillian Frioni
Cultivo de
reserva
Cultivo en
matrz
Fermentador
inoculante
Azcar
Sobrenadante
Medio
esterilizado
Extraccin
del producto
Preparacin del
medio
Metabolismo 2ario.
Purificacin
del producto
Tratamiento
de efluentes
EtOH
19
Fermentador de
produccin
Biomasa
Envasado
Clulas
Desde muy antiguo el hombre emple a los microorganismos en la produccin y conservacin de alimentos, aun
sin conocerlos. Los mtodos empleados antes de la introduccin de la refrigeracin, radiaciones, aditivos, etc., para
la conservacin de hortalizas, pasturas, granos, leche,
etc. eran
* salado
* secado al aire o ahumado
* fermentaciones cidas
Penicilina
341
Fermentacin lctica
Es uno de los procesos microbianos ms empleados a
nivel mundial ya que involucra a la leche y sus derivados:
manteca, yogur, leches cidas, quesos, produccin de
casena, otros subproductos, en los ensilados (forrajes,
granos, pescado, etc.), en la conservacin de frutas y hortalizas. La fermentacin lctica puede ser como vimos en
el captulo 3, homo o heterofermentativa.
La mayora de las bacterias acidolcticas obtienen energa slo del metabolismo de los carbohidratos y su distribucin est restringida a ambientes con azcares. Exigen
adems aminocidos, vitaminas, purinas y pirimidinas.
culares. Las bacterias carecen de enzimas de la va glicoltica (aldolasa y triosafosfato isomerasa) y la degradacin de la glucosa se realiza por la va de las pentosas. El
rendimiento energtico es menor: 1 solo mol de ATP, en
lugar de 2 como en los homofermentadores que producen el doble de biomasa por mol de azcar fermentado.
380
Lillian Frioni
Actinomicetes
Termotolerantes
Micromonospora vulgaris
Nocardia brasiliensis
Streptomyces rectus
S. thermofuscus
S. thermophillus
S. thermoviolaceus
Thermonospora fusca
T. glaucus
Thermoactinomyces sp.
Thermopolyspora sp.
Termfilas
Bacillus stearotermophilis
Hongos
Mesfilos
Fusarium culmorum
F. roseum
Stysanus stemonitis
Coprinus cinereus
Aspergillus niger
Geothricum candidum
Mucor jansseni
Termfilos
Aspergillus fumigatus
Humicola insolens
Mucor pusillus
Dactylomyces crustaceous
Torula thermophila
Inoculacin
Se ha intentado seleccionar microorganismos para usarlos
como inoculante en cultivos puros o mezclas. Existen a nivel comercial productos recomendados para la inoculacin
de diferentes tipos de residuos. Sin embargo, los datos encontrados en la bibliografa sealan escasas diferencias en
el producto final entre restos inoculados y sin inocular.
A continuacin analizaremos algunos de los grupos microbianos de inters para el hombre que tienen desarrollo
industrial (cuadro 6). El tema Antibiticos es tratado en
los captulos 4, 14 y 17.
bacterias lcticas: inoculantes para alimentos, leche y derivados (yogur, queso, pickles)
ticas
das, para el tratamiento de grandes volmenes de slidos, como por ejemplo los residuos domiciliarios. Se
usan reactores cerrados con control de aireacin, humedad, temperatura y tiempo de retencin. En estos
ltimos, el proceso puede completarse entre 5-7 das,
mientras que en las pilas, puede llevar 3 a 8 semanas,
o ms para lograr un compost adecuado
La experiencia ha demostrado que las dimensiones ideales para las pilas de desechos son las siguientes:
Piruvato
CO2
4
acetolactato
Oxaloacetato
Formato
Acetil -CoA
Pi
CoA
NADH
Acetil
Malato
H2O
H2
P Acetaldehdo
ADP
NAHD
ATP
CO2
CO2
Acetona
NADH
Etanol
Acetato
6
Acetoacetil-CoA
NADH
NADH Etanol
Acetaldehdo
Piruvato
CO2
CO2
NADH
Fumarato
Tecnologa
Lactato
CoASH
361
CO2
Succinato
CO2
Propionato
Acetona
NADH
Isupropanol
Butiril -CoA
Pi
Coa
CoA
Butiraldehdo Butiril P
ADP
NADH
ATP
NADH
362
Lillian Frioni
Probiticos
Se definen como: alimentos suplementados con microorganismos viables que benefician al consumidor por
mejoramiento del balance microbiano. La FAO los define como organismos vivos administrados en cantidades adecuadas que ejercen efectos benficos en la salud
del hospedante. Se consideran hospedantes a los animales (ganado vacuno, ovino, etc.) y el hombre. La ma-
La materia orgnica se descompone ms eficiente y completamente en condiciones de oxgeno disponible y a temperaturas elevadas. Las protenas liberan amonaco y
nitratos, mientras que las grasas y carbohidratos forman
dixido de carbono y agua, va cidos orgnicos. Se suceden fases:
fase mesfila, en la que predominan bacterias y hongos productores de cidos que atacan a la materia orgnica fcilmente degradable, generando calor que favorece el desarrollo de organismos termfilos
termfila: a partir del 10o da, con la elevacin de
la temperatura, comienza esta etapa y la poblacin dominante se compone de actinomicetes, bacterias y hongos termfilos o termotolerantes.
fase
379
Microorganismos presentes
La pila se da vuelta o se airea forzadamente, para permitir bajar la temperatura y adems reinocular el material
con microorganismos desde la atmsfera ya que la alta
temperatura produjo disminucin de microorganismos
mesfilos, por pasteurizacin del sustrato. La temperatura vuelve a ascender, reinicindose el ciclo. Las pilas se
dejan de remover y/o airear cuando la temperatura no se
eleva ms, lo que indica que los sustratos fcilmente degradables han sido mineralizados.
378
Lillian Frioni
* Contaminantes orgnicos persistentes (COP) se encuentran en menor concentracin en el compost de bioresiduos y de residuos de poda en relacin a los que se
acumulan a partir de residuos slidos urbanos (RSU)
* La presencia de plsticos en los residuos est desafiando los sistemas industriales del bioproceso ya que las
partculas pequeas pueden permanecer en el compost
an despus de repetidos tamizados
Proceso de compostaje
Es un proceso microbiolgico realizado en la naturaleza
por organismos nativos: bacterias, hongos y actinomicetes, principalmente, actuando en sucesin de predominancia, segn la influencia de factores, como la composicin
qumica del material original, su relacin C/N, humedad,
aireacin, temperatura, pH.
Los primeros sustratos atacados son hidratos de carbono
simples, protenas, compuestos solubles en alcohol y otros
solventes orgnicos (ceras, grasas, cutinas).
En la naturaleza esta estabilizacin se da en tiempo indeterminado, de acuerdo a las condiciones que encuentra el
sustrato.
La fraccin ligno-celulsica no es degradada en su totalidad y se mezcla con la biomasa microbiana en el producto final.
Involucra 3 etapas:
pre-proceso
biodegradacin
reduccin
maduracin
Pre-proceso puede incluir solamente la molienda y pulverizacin (residuos de parques y jardines) o puede requerir tratamientos ms complejos para remover contaminantes. El tamizado separa partculas segn su tamao. Las mquinas separan papel, plsticos y otros constituyentes no deseados de la materia orgnica.
Biodegradacin requiere aireacin en pilas o en dispositivos adecuados con aireacin forzada. Durante las primeras semanas, la temperatura de la pila aumenta drsticamente debido a la energa generada por los microorganismos.
363
364
Lillian Frioni
ple vista si son externos (hongos de sombrero) o subterrneos, como los hipogeos, globulosos, como las trufas.
Estos hongos son cosechados, producindose sucesivos
ciclos sobre sustratos lignocelulsicos (rastrojos, maderas) complementados con nutrientes. No se emplean medios ricos para evitar el desarrollo de hongos contaminantes saprofitas.
compuestos
con fsforo
en aerobiosis
Pi + poli-PO
en anaerobiosis
metales
-3
4
poli-PO4
poli-PO4-3 (n+1)
-3
(n+1)
Restos slidos
+ Me++
SMe que
precipita
caloras
grasa
sodio
hidratos de carbono
fibra
proteinas
vitA
vitC
Ca
Fe
Agaricus sp
mg (%)
Pleurotus sp
mg (%)
24
0
0
15,5%
0mg
2,4%
0%
2,4%
0%
2,4%
27
0
0
3,2%
0mg
3,2%
menos 2%
2%
menos 2%
menos 2%
N2
Biodiscos aireados
Efluentes en
anaerobiosis
Reactor
metanognico
tratamiento anaerobio donde ocurren respiraciones anaerobias que aseguran la prdida de estos elementos a la
atmsfera.
poli-PO4-3 + Pi
pesados
CH4
377
Efluentes en
anaerobiosis
Reactor
desnitrificante
Reactor
nitrificante
Las aguas vertidas por industrias, establecimientos agropecuarios se tratan ms aceleradamente en reactores.
En la figura 1 se esquematiza un modelo donde primero
el proceso es anaerobio, se pierde metano y N2. Luego
el proceso es aerobio y los compuestos reducidos de N
y S se transforman en nitratos y sulfatos, que vuelven al
Compostaje
Compostaje es el trmino que se usa para designar la
degradacin aerbica y termfila de materiales orgnicos de diferente origen, en estado slido, realizado por
comunidades microbianas quimioheterotrficas existentes
en los propios residuos, bajo condiciones controladas del
que se obtiene un producto estable, el compost, que puede ser utilizado como fertilizante. Debera traducirse el
trmino compost por compuesto, pero lamentablemente
se contina con la denominacin inglesa la que es usada
tambin en otros idiomas.
376
Lillian Frioni
No biolgicos
Orgnicos
biogs, protenas unicelulares, etanol
Orgnicos
incineracin, fabricacin
de ladrillos
Inorgnicos
lixiviacin bacteriana, nitrificacin-desnitrificacin
Inorgnicos
reciclaje de minerales
Procesos biolgicos
En los residuos orgnicos derivados de vegetales, el complejo lignocelulsico es el ms lentamente degradable en
procesos aerobios o anaerobios.
100%
60%
45%
B. Residuos inorgnicos
compuestos nitrogenados
en aerobiosis
NH4 + O2
en anaerobiosis
NO3 + e + H+
NO2
con azufre
en aerobiosis
S, S=
N2+ N2O
SO4=
SO4= + e + H
La propagacin se realiza en lugares apropiados, tipo stanos o galpones oscuros y con control de humedad y
temperatura. La cama de siembra consiste, en general,
en materiales como pajas, con suelo, estircol. Pueden
usarse grandes bolsas de plstico, colgadas en forma
vertical. Luego de varias semanas comienzan a verse los
cuerpos fructferos, que se colectan y conservan frescos
hasta su envo al mercado.
Otro hongo muy empleado es el Lentinus edulus, conocido como shiitake (figura 5). Es un hongo degradador de
celulosa que se cultiva en troncos humedecidos o sobre
aserrn. El inculo se deposita en pequeos orificios de la
madera y aproximadamente luego de un ao, produce las
fructificaciones, ms sabrosas que las de Agaricus y de
mayor precio.
Otro hongo de fcil propagacin son las numerosas variantes de Pleurotus, tpico hongo de sombrero de color
pardo, gris, amarillo y rosado.
La figura 6 esquematiza el cultivo de hongos comestibles.
Los cultivos se adquieren en forma de micelio, el que se
conserva en frascos con granos y medio de cultivo. El
micelio se propaga intensamente alrededor de los granos
aprovechando liberacin de sustancias orgnicas.
El cultivo puede realizarse en distintos dispositivos, como
estanteras con cama de materiales ligno-celulsicos (pajas, aserrn, madera), o en bolsas de plstico colgadas a
la sombra, a las cuales se les efectan orificios a los efectos de que salgan al exterior los carpforos y se puedan
cosechar.
H2S
+ Me
(SO4= reduccin)
Medio estril
Aislamiento
Esterilizacin
Inoculacin medio
de granos
Inoculacin del soporte
En
madera
En bandejas
NO3
El ciclo de nitrificacin y desnitrificacin asegura la eliminacin del N de los ecosistemas hacia la atmsfera, en forma de gases.
compuestos
10%
A. Residuos orgnicos
residuos
45%
en anaerobiosis
40%
C6H12O6
l00%
365
SMe
(metales)
(precipitado, por ejemplo como S Fe, negro)
En el suelo
Cultivos en bolsas
366
Lillian Frioni
destapar caeras, etc. Otros producen antibiticos y algunos son reconocidos en el control biolgico de enfermedades vegetales y como bioinsecticidas.
Clostridium, con numerosos representantes anaerobios
que incluyen especies benficas, fijadoras de N2, por ejemplo y otros patgenos como C. tetanii, C. botulinicum, etc.
(cuadro 10 y figura 7)
El cuadro 11 esquematiza otra importante funcin de especies de Bacillus, que es la lucha biolgica, en este
caso contra larvas de insectos, sensibles a una poderosa toxina que se sintetiza junto a la espora bacteriana.
Se ha logrado clonar este pptido y se ha incluido en
vegetales, que se convierten en resistentes a insectos
(arroz, maz, etc. Bt, que presenta incluido genes con
efecto insecticida).
Anaerobios
Ej. Clostridium
Endosporas resistentes
Comn en suelos
Biodegradadores, produccin
de enzimas
Algunos fijan N2
Actinomicetes
Aerobios o facultativos
Ej. Bacillus
375
El cuadro 2 (publicado por Stevenson y Cole, 1999) muestra el contenido promedio de nutrientes en estircol de 23
establecimientos de cra de ganado (la humedad vari
entre 21 y 54%).
Complejos sistemas microbiolgicos que transforman estos residuos resultantes de la actividad humana y que pueden llegar a provocar graves problemas de contaminacin, se desarrollaron a lo largo de miles de aos, sobretodo en el suelo. Como en general, la tasa de degradacin de residuos orgnicos es extremadamente inferior a
su tasa de generacin, y adems, muchos de los residuos no son productos naturales, el hombre se ve obligado a su tratamiento en el campo, donde se producen, o en
plantas con reactores, especialmente diseados.
Los tratamientos a que son sometidos los residuos se
pueden agrupar en:
fsicos: transformaciones termoqumicas, pirlisis (altas temperaturas)
Rango
kg/ton
N
P
K
Na
Ca
Mg
Fe
Zn
1,16-1,96
0,32-0,85
0,75-2,35
0,29-1,43
0,81-1,75
0,32-0,66
0,09-0,55
0,005-0,012
1,34
0,53
1,50
0,74
1,30
0,50
0,21
0,009
13,4
5,3
15
7,4
13
5,0
2,1
0,09
qumicos:
aprovechar
374
Lillian Frioni
Muchos residuos orgnicos (estircol, residuos de cosechas, abonos animales, aguas servidas), se emplean
directamente como abonos en el suelo, pero se sealan numerosas limitaciones a esta prctica que se resumen:
* Son en general fertilizantes de baja concentracin en N,
P, K, etc. , de composicin variable, con alto contenido
de agua. Los gastos de transporte son en general, superiores a su valor como fertilizante. La aplicacin debe
separase de la siembra a los efectos de permitir la eliminacin del exceso de agua del abono.
* La concentracin de nutrientes, sales solubles, micronutrientes y agua vara mucho de un lugar a otro y raramente son analizados antes de su empleo. Resulta difcil recomendar una dosis correcta.
* Las sales solubles pueden causar problemas de lavado
de nitratos hacia aguas subsuperficiales, sobretodo en
cultivos irrigados,
* Muchos residuos pueden contener metales pesados
y/o compuestos orgnicos sintticos que pueden acumularse en los suelos a niveles txicos para los vegetales. Muchos vegetales no sufren daos visibles
pero acumulan estas sustancias txicas en sus tejidos y se convierten en peligro para el consumo humano. Las aplicaciones repetidas de abonos orgnicos y aguas servidas al suelo pueden incrementar
los niveles de As, Cd, Cr, Hg, Mo, Pb, Ni, Se y Zn.
Muchos estn ligados a la materia orgnica y son
liberados a formas asimilables a medida que el restos es degradado en perodos de varios aos. Existen diferencias entre pases sobre los niveles aceptables de metales txicos en los productos aplicados
al suelo.
* Residuos de la produccin avcola y animales no rumiantes contienen bacterias, virus y otros patgenos peligrosos para la salud humana cuando entran en la cadena alimenticia. La mayora de ellos muere cuando los
restos o aguas son pretratadas en lagunas u oxidadas
biolgicamente. E. coli, habitante normal del intestino
humano es una bacteria indicadora de la calidad de los
residuos y aguas, ya que no se encuentra en general
en residuos pretratados. Su poblacin en aguas tratadas, en compostajes, debe ser menor a 1000 organismos/g o por mL para que el material se considere apto
para su aplicacin.
Micropolyspora
Dactylosporangium
Streptosporangium
Microeliobosporia
Nocardia
367
les que producen. Este grupo ha adquirido importancia econmica, por el gran nmero de antibiticos formados como
metabolitos secundarios. Las esporas tienen rol reproductivo y son diseminadas por el aire o el agua. Thermoactinomyces produce esporas extremadamente resistentes al
calor, similares a las endosporas de las bacterias tpicas y
la temperatura mxima de crecimiento es de 65-68C. Son
activos en compostajes (captulo 21), o abonos.
Los representantes del gnero Frankia se asocian simbiticamente a especies de no-leguminosas (captulos 11 y 15).
Actividades y ecologa
la mayora de las especies son mesfilas (ptimo 2530C, aunque hay especies termfilas
abundan en suelos de pH 6,8-8,0 y slo excepcionalmente en suelos de pH inferior a 5,0. Esta sensibilidad
a pH cidos es empleada en el control de organismos
fitopatgenos
por su capacidad para sobrevivir en condiciones desfavorables, constituyen uno de los grupos ms distribuidos en los suelos
Funciones
Degradacin de compuestos resistentes: responden al
368
Lillian Frioni
hongos, cuando abundan los compuestos simples. Su participacin aumenta cuando quedan materiales resistentes
Agrobacterium
El gnero comprende organismos que producen tumores
en vegetales. A. tumefaciens posee un plsmido Ti responsable de la virulencia. Se han construido vectores de
transferencia generalizado para plantas (figura 10) (Prescott et al., 1999). A. rhizogenes ha sido reclasificada actualmente con los rhizobios, por la similitud gentica observada en los anlisis de fragmentos de ARN y ADN.
T-ADN
Vector de
clonacin
Secuencia del
plsmido Ti
Produccin de sustancias probiticas, como vitaminas (B1, B2, B6, B12, biotina, cido flico)
Fijacin biolgica de N
: el gnero Frankia es empleado en algunos pases como inoculante de plntulas actinorrcicas en viveros (captulo 15 y Anexo prctico).
Estas bacterias, tienen importantes aplicaciones biotecnolgicas, ya que son grandes productores de sustancias biticas (vitaminas) y antibiticas. La figura 9 muestra las esporas y los filamentos de especies del gnero Streptomyces:
Plsmido
recombinante
Transformacin de
Agrobacterium e
infeccin de la planta
del tabaco
Genoma de
la planta
373
T-ADN y gen de la
luciferasa
Genoma de la
planta
21
Biotransformacin de residuos
orgnicos
Stevenson y Cole (1999) sealan que en los estados Unidos, los animales de granja acumulan 10 veces ms residuos orgnicos que los habitantes y que una vaca o 7
aves generan 16 veces ms residuos en relacin a los de
un hombre.
Estos aspectos ambientales del ciclo terrestre del carbono han preocupado mucho a gobiernos e investigadores
desde la dcada del 60 por la necesidad de resolver problemas creados por actividades incorrectas en el pasado.
Los estudios se han enfocado sobretodo en los problemas derivados de la acumulacin de desechos orgnicos
e inorgnicos en los suelos y causes de agua, la acumulacin de productos qumicos sintticos, la acumulacin
de materia orgnica y su contribucin al CO2 atmosfrico
y la produccin de sustancias txicas para el hombre.
El cuadro 1 muestra la composicin de los residuos orgnicos ms comunes producidos cada ao a partir de actividades domsticas, residuos urbanos slidos y lquidos,
produccin animal, industrias de alimentos, aserraderos
y gran variedad de industrias orgnicas. Estos desechos
no constituyen un problema ambiental solamente en las
ciudades, en efecto, la agricultura intensiva es fuente importante de desechos orgnicos.
Muchos residuos orgnicos constituyen fuentes potenciales de nutrientes para los vegetales (N, P, K), pueden contribuir positivamente a la calidad de los suelos, mejorar su
estructura, de modo que su empleo como abonos orgnicos resulta una prctica til para la sociedad por su bajo
costo, estimulacin de la fertilidad y produccin agrcola y
mejora de la calidad de las aguas, evitando su vertido en
las mismas.
372
Lillian Frioni
369
Rhizobios
Esta bacteria, responsable de la introduccin de nitrgeno a ecosistemas agrcolas y acuticos, es analizada
en los captulos 11 y 15. En biotecnologa son empleados por la gran produccin de exopolisacridos (EPS) y
de fenoxialcanos (cido poli OH butrico) empleados
como plsticos biodegradables (figura 11). Son bacilos
mviles, no forman esporas y fijan N2 en simbiosis con
vegetales. Una de las principales industrias vinculadas
con la agronoma es la de los inoculantes para leguminosas que incluyen cultivos seleccionados de rhizobio
(Anexo prctico).
Cu
+ SO4Fe
Pseudomonas
Gnero de bacilos Gram negativos con numerosas especies, muchas de ellas con importante aplicacin biotecnolgica. Inoculantes de cepas seleccionadas son introducidas al suelo como inoculantes de semillas ya que actan
como agentes de biocontrol (producen antibiticos, siderforos, compiten por nutrientes) contra otras bacterias y
hongos y en prcticas de bioremediacin, por su capacidad biodegradante. Otras producen desnitrificacin (P. fluorescens, P. aeruginosa), enfermedades en plantas (P.
syringae) y en animales.
370
Lillian Frioni
, vitaminas)
Madigan, Martinko, Parker, Brock, Biologa de los microorganismos, 2000. Prentice Hall International
Prescott, Harley y Klein, Microbiologa, 1999, McGrawHill.Interamericana
Hongos comestibles: www.attra.ncat.org/attra-pub.PDF/
mushroom.pdf. 24pag.
Preguntas de repaso
1) Seale las condiciones ms econmicas para producir protenas de origen microbiano
2) Cual sera el uso a darle a estos productos?
3) Seale dos productos importantes empleados en
la dieta diaria del hombre producidos por va biolgica. Compare el proceso con alternativas qumicas de sntesis
4) Cmo procedera a la bsqueda de nuevos antibiticos?
5) Por qu estas sustancias van perdiendo eficiencia?
Los microorganismos y
la proteccin ambiental
21 Biotransformacin de residuos orgnicos ..................................... 373
Bibliografa
12) Resuma algunas de las funciones por las cuales los microorganismos son empleados a nivel
industrial
13) Seale algunos de los alimentos producidos por fermentaciones y los sustratos originales.
371
370
Lillian Frioni
, vitaminas)
Madigan, Martinko, Parker, Brock, Biologa de los microorganismos, 2000. Prentice Hall International
Prescott, Harley y Klein, Microbiologa, 1999, McGrawHill.Interamericana
Hongos comestibles: www.attra.ncat.org/attra-pub.PDF/
mushroom.pdf. 24pag.
Preguntas de repaso
1) Seale las condiciones ms econmicas para producir protenas de origen microbiano
2) Cual sera el uso a darle a estos productos?
3) Seale dos productos importantes empleados en
la dieta diaria del hombre producidos por va biolgica. Compare el proceso con alternativas qumicas de sntesis
4) Cmo procedera a la bsqueda de nuevos antibiticos?
5) Por qu estas sustancias van perdiendo eficiencia?
Los microorganismos y
la proteccin ambiental
21 Biotransformacin de residuos orgnicos ..................................... 373
Bibliografa
12) Resuma algunas de las funciones por las cuales los microorganismos son empleados a nivel
industrial
13) Seale algunos de los alimentos producidos por fermentaciones y los sustratos originales.
371
372
Lillian Frioni
369
Rhizobios
Esta bacteria, responsable de la introduccin de nitrgeno a ecosistemas agrcolas y acuticos, es analizada
en los captulos 11 y 15. En biotecnologa son empleados por la gran produccin de exopolisacridos (EPS) y
de fenoxialcanos (cido poli OH butrico) empleados
como plsticos biodegradables (figura 11). Son bacilos
mviles, no forman esporas y fijan N2 en simbiosis con
vegetales. Una de las principales industrias vinculadas
con la agronoma es la de los inoculantes para leguminosas que incluyen cultivos seleccionados de rhizobio
(Anexo prctico).
Cu
+ SO4Fe
Pseudomonas
Gnero de bacilos Gram negativos con numerosas especies, muchas de ellas con importante aplicacin biotecnolgica. Inoculantes de cepas seleccionadas son introducidas al suelo como inoculantes de semillas ya que actan
como agentes de biocontrol (producen antibiticos, siderforos, compiten por nutrientes) contra otras bacterias y
hongos y en prcticas de bioremediacin, por su capacidad biodegradante. Otras producen desnitrificacin (P. fluorescens, P. aeruginosa), enfermedades en plantas (P.
syringae) y en animales.
368
Lillian Frioni
hongos, cuando abundan los compuestos simples. Su participacin aumenta cuando quedan materiales resistentes
Agrobacterium
El gnero comprende organismos que producen tumores
en vegetales. A. tumefaciens posee un plsmido Ti responsable de la virulencia. Se han construido vectores de
transferencia generalizado para plantas (figura 10) (Prescott et al., 1999). A. rhizogenes ha sido reclasificada actualmente con los rhizobios, por la similitud gentica observada en los anlisis de fragmentos de ARN y ADN.
T-ADN
Vector de
clonacin
Secuencia del
plsmido Ti
Produccin de sustancias probiticas, como vitaminas (B1, B2, B6, B12, biotina, cido flico)
Fijacin biolgica de N
: el gnero Frankia es empleado en algunos pases como inoculante de plntulas actinorrcicas en viveros (captulo 15 y Anexo prctico).
Estas bacterias, tienen importantes aplicaciones biotecnolgicas, ya que son grandes productores de sustancias biticas (vitaminas) y antibiticas. La figura 9 muestra las esporas y los filamentos de especies del gnero Streptomyces:
Plsmido
recombinante
Transformacin de
Agrobacterium e
infeccin de la planta
del tabaco
Genoma de
la planta
373
T-ADN y gen de la
luciferasa
Genoma de la
planta
21
Biotransformacin de residuos
orgnicos
Stevenson y Cole (1999) sealan que en los estados Unidos, los animales de granja acumulan 10 veces ms residuos orgnicos que los habitantes y que una vaca o 7
aves generan 16 veces ms residuos en relacin a los de
un hombre.
Estos aspectos ambientales del ciclo terrestre del carbono han preocupado mucho a gobiernos e investigadores
desde la dcada del 60 por la necesidad de resolver problemas creados por actividades incorrectas en el pasado.
Los estudios se han enfocado sobretodo en los problemas derivados de la acumulacin de desechos orgnicos
e inorgnicos en los suelos y causes de agua, la acumulacin de productos qumicos sintticos, la acumulacin
de materia orgnica y su contribucin al CO2 atmosfrico
y la produccin de sustancias txicas para el hombre.
El cuadro 1 muestra la composicin de los residuos orgnicos ms comunes producidos cada ao a partir de actividades domsticas, residuos urbanos slidos y lquidos,
produccin animal, industrias de alimentos, aserraderos
y gran variedad de industrias orgnicas. Estos desechos
no constituyen un problema ambiental solamente en las
ciudades, en efecto, la agricultura intensiva es fuente importante de desechos orgnicos.
Muchos residuos orgnicos constituyen fuentes potenciales de nutrientes para los vegetales (N, P, K), pueden contribuir positivamente a la calidad de los suelos, mejorar su
estructura, de modo que su empleo como abonos orgnicos resulta una prctica til para la sociedad por su bajo
costo, estimulacin de la fertilidad y produccin agrcola y
mejora de la calidad de las aguas, evitando su vertido en
las mismas.
374
Lillian Frioni
Muchos residuos orgnicos (estircol, residuos de cosechas, abonos animales, aguas servidas), se emplean
directamente como abonos en el suelo, pero se sealan numerosas limitaciones a esta prctica que se resumen:
* Son en general fertilizantes de baja concentracin en N,
P, K, etc. , de composicin variable, con alto contenido
de agua. Los gastos de transporte son en general, superiores a su valor como fertilizante. La aplicacin debe
separase de la siembra a los efectos de permitir la eliminacin del exceso de agua del abono.
* La concentracin de nutrientes, sales solubles, micronutrientes y agua vara mucho de un lugar a otro y raramente son analizados antes de su empleo. Resulta difcil recomendar una dosis correcta.
* Las sales solubles pueden causar problemas de lavado
de nitratos hacia aguas subsuperficiales, sobretodo en
cultivos irrigados,
* Muchos residuos pueden contener metales pesados
y/o compuestos orgnicos sintticos que pueden acumularse en los suelos a niveles txicos para los vegetales. Muchos vegetales no sufren daos visibles
pero acumulan estas sustancias txicas en sus tejidos y se convierten en peligro para el consumo humano. Las aplicaciones repetidas de abonos orgnicos y aguas servidas al suelo pueden incrementar
los niveles de As, Cd, Cr, Hg, Mo, Pb, Ni, Se y Zn.
Muchos estn ligados a la materia orgnica y son
liberados a formas asimilables a medida que el restos es degradado en perodos de varios aos. Existen diferencias entre pases sobre los niveles aceptables de metales txicos en los productos aplicados
al suelo.
* Residuos de la produccin avcola y animales no rumiantes contienen bacterias, virus y otros patgenos peligrosos para la salud humana cuando entran en la cadena alimenticia. La mayora de ellos muere cuando los
restos o aguas son pretratadas en lagunas u oxidadas
biolgicamente. E. coli, habitante normal del intestino
humano es una bacteria indicadora de la calidad de los
residuos y aguas, ya que no se encuentra en general
en residuos pretratados. Su poblacin en aguas tratadas, en compostajes, debe ser menor a 1000 organismos/g o por mL para que el material se considere apto
para su aplicacin.
Micropolyspora
Dactylosporangium
Streptosporangium
Microeliobosporia
Nocardia
367
les que producen. Este grupo ha adquirido importancia econmica, por el gran nmero de antibiticos formados como
metabolitos secundarios. Las esporas tienen rol reproductivo y son diseminadas por el aire o el agua. Thermoactinomyces produce esporas extremadamente resistentes al
calor, similares a las endosporas de las bacterias tpicas y
la temperatura mxima de crecimiento es de 65-68C. Son
activos en compostajes (captulo 21), o abonos.
Los representantes del gnero Frankia se asocian simbiticamente a especies de no-leguminosas (captulos 11 y 15).
Actividades y ecologa
la mayora de las especies son mesfilas (ptimo 2530C, aunque hay especies termfilas
abundan en suelos de pH 6,8-8,0 y slo excepcionalmente en suelos de pH inferior a 5,0. Esta sensibilidad
a pH cidos es empleada en el control de organismos
fitopatgenos
por su capacidad para sobrevivir en condiciones desfavorables, constituyen uno de los grupos ms distribuidos en los suelos
Funciones
Degradacin de compuestos resistentes: responden al
366
Lillian Frioni
destapar caeras, etc. Otros producen antibiticos y algunos son reconocidos en el control biolgico de enfermedades vegetales y como bioinsecticidas.
Clostridium, con numerosos representantes anaerobios
que incluyen especies benficas, fijadoras de N2, por ejemplo y otros patgenos como C. tetanii, C. botulinicum, etc.
(cuadro 10 y figura 7)
El cuadro 11 esquematiza otra importante funcin de especies de Bacillus, que es la lucha biolgica, en este
caso contra larvas de insectos, sensibles a una poderosa toxina que se sintetiza junto a la espora bacteriana.
Se ha logrado clonar este pptido y se ha incluido en
vegetales, que se convierten en resistentes a insectos
(arroz, maz, etc. Bt, que presenta incluido genes con
efecto insecticida).
Anaerobios
Ej. Clostridium
Endosporas resistentes
Comn en suelos
Biodegradadores, produccin
de enzimas
Algunos fijan N2
Actinomicetes
Aerobios o facultativos
Ej. Bacillus
375
El cuadro 2 (publicado por Stevenson y Cole, 1999) muestra el contenido promedio de nutrientes en estircol de 23
establecimientos de cra de ganado (la humedad vari
entre 21 y 54%).
Complejos sistemas microbiolgicos que transforman estos residuos resultantes de la actividad humana y que pueden llegar a provocar graves problemas de contaminacin, se desarrollaron a lo largo de miles de aos, sobretodo en el suelo. Como en general, la tasa de degradacin de residuos orgnicos es extremadamente inferior a
su tasa de generacin, y adems, muchos de los residuos no son productos naturales, el hombre se ve obligado a su tratamiento en el campo, donde se producen, o en
plantas con reactores, especialmente diseados.
Los tratamientos a que son sometidos los residuos se
pueden agrupar en:
fsicos: transformaciones termoqumicas, pirlisis (altas temperaturas)
Rango
kg/ton
N
P
K
Na
Ca
Mg
Fe
Zn
1,16-1,96
0,32-0,85
0,75-2,35
0,29-1,43
0,81-1,75
0,32-0,66
0,09-0,55
0,005-0,012
1,34
0,53
1,50
0,74
1,30
0,50
0,21
0,009
13,4
5,3
15
7,4
13
5,0
2,1
0,09
qumicos:
aprovechar
376
Lillian Frioni
No biolgicos
Orgnicos
biogs, protenas unicelulares, etanol
Orgnicos
incineracin, fabricacin
de ladrillos
Inorgnicos
lixiviacin bacteriana, nitrificacin-desnitrificacin
Inorgnicos
reciclaje de minerales
Procesos biolgicos
En los residuos orgnicos derivados de vegetales, el complejo lignocelulsico es el ms lentamente degradable en
procesos aerobios o anaerobios.
100%
60%
45%
B. Residuos inorgnicos
compuestos nitrogenados
en aerobiosis
NH4 + O2
en anaerobiosis
NO3 + e + H+
NO2
con azufre
en aerobiosis
S, S=
N2+ N2O
SO4=
SO4= + e + H
La propagacin se realiza en lugares apropiados, tipo stanos o galpones oscuros y con control de humedad y
temperatura. La cama de siembra consiste, en general,
en materiales como pajas, con suelo, estircol. Pueden
usarse grandes bolsas de plstico, colgadas en forma
vertical. Luego de varias semanas comienzan a verse los
cuerpos fructferos, que se colectan y conservan frescos
hasta su envo al mercado.
Otro hongo muy empleado es el Lentinus edulus, conocido como shiitake (figura 5). Es un hongo degradador de
celulosa que se cultiva en troncos humedecidos o sobre
aserrn. El inculo se deposita en pequeos orificios de la
madera y aproximadamente luego de un ao, produce las
fructificaciones, ms sabrosas que las de Agaricus y de
mayor precio.
Otro hongo de fcil propagacin son las numerosas variantes de Pleurotus, tpico hongo de sombrero de color
pardo, gris, amarillo y rosado.
La figura 6 esquematiza el cultivo de hongos comestibles.
Los cultivos se adquieren en forma de micelio, el que se
conserva en frascos con granos y medio de cultivo. El
micelio se propaga intensamente alrededor de los granos
aprovechando liberacin de sustancias orgnicas.
El cultivo puede realizarse en distintos dispositivos, como
estanteras con cama de materiales ligno-celulsicos (pajas, aserrn, madera), o en bolsas de plstico colgadas a
la sombra, a las cuales se les efectan orificios a los efectos de que salgan al exterior los carpforos y se puedan
cosechar.
H2S
+ Me
(SO4= reduccin)
Medio estril
Aislamiento
Esterilizacin
Inoculacin medio
de granos
Inoculacin del soporte
En
madera
En bandejas
NO3
El ciclo de nitrificacin y desnitrificacin asegura la eliminacin del N de los ecosistemas hacia la atmsfera, en forma de gases.
compuestos
10%
A. Residuos orgnicos
residuos
45%
en anaerobiosis
40%
C6H12O6
l00%
365
SMe
(metales)
(precipitado, por ejemplo como S Fe, negro)
En el suelo
Cultivos en bolsas
364
Lillian Frioni
ple vista si son externos (hongos de sombrero) o subterrneos, como los hipogeos, globulosos, como las trufas.
Estos hongos son cosechados, producindose sucesivos
ciclos sobre sustratos lignocelulsicos (rastrojos, maderas) complementados con nutrientes. No se emplean medios ricos para evitar el desarrollo de hongos contaminantes saprofitas.
compuestos
con fsforo
en aerobiosis
Pi + poli-PO
en anaerobiosis
metales
-3
4
poli-PO4
poli-PO4-3 (n+1)
-3
(n+1)
Restos slidos
+ Me++
SMe que
precipita
caloras
grasa
sodio
hidratos de carbono
fibra
proteinas
vitA
vitC
Ca
Fe
Agaricus sp
mg (%)
Pleurotus sp
mg (%)
24
0
0
15,5%
0mg
2,4%
0%
2,4%
0%
2,4%
27
0
0
3,2%
0mg
3,2%
menos 2%
2%
menos 2%
menos 2%
N2
Biodiscos aireados
Efluentes en
anaerobiosis
Reactor
metanognico
tratamiento anaerobio donde ocurren respiraciones anaerobias que aseguran la prdida de estos elementos a la
atmsfera.
poli-PO4-3 + Pi
pesados
CH4
377
Efluentes en
anaerobiosis
Reactor
desnitrificante
Reactor
nitrificante
Las aguas vertidas por industrias, establecimientos agropecuarios se tratan ms aceleradamente en reactores.
En la figura 1 se esquematiza un modelo donde primero
el proceso es anaerobio, se pierde metano y N2. Luego
el proceso es aerobio y los compuestos reducidos de N
y S se transforman en nitratos y sulfatos, que vuelven al
Compostaje
Compostaje es el trmino que se usa para designar la
degradacin aerbica y termfila de materiales orgnicos de diferente origen, en estado slido, realizado por
comunidades microbianas quimioheterotrficas existentes
en los propios residuos, bajo condiciones controladas del
que se obtiene un producto estable, el compost, que puede ser utilizado como fertilizante. Debera traducirse el
trmino compost por compuesto, pero lamentablemente
se contina con la denominacin inglesa la que es usada
tambin en otros idiomas.
378
Lillian Frioni
* Contaminantes orgnicos persistentes (COP) se encuentran en menor concentracin en el compost de bioresiduos y de residuos de poda en relacin a los que se
acumulan a partir de residuos slidos urbanos (RSU)
* La presencia de plsticos en los residuos est desafiando los sistemas industriales del bioproceso ya que las
partculas pequeas pueden permanecer en el compost
an despus de repetidos tamizados
Proceso de compostaje
Es un proceso microbiolgico realizado en la naturaleza
por organismos nativos: bacterias, hongos y actinomicetes, principalmente, actuando en sucesin de predominancia, segn la influencia de factores, como la composicin
qumica del material original, su relacin C/N, humedad,
aireacin, temperatura, pH.
Los primeros sustratos atacados son hidratos de carbono
simples, protenas, compuestos solubles en alcohol y otros
solventes orgnicos (ceras, grasas, cutinas).
En la naturaleza esta estabilizacin se da en tiempo indeterminado, de acuerdo a las condiciones que encuentra el
sustrato.
La fraccin ligno-celulsica no es degradada en su totalidad y se mezcla con la biomasa microbiana en el producto final.
Involucra 3 etapas:
pre-proceso
biodegradacin
reduccin
maduracin
Pre-proceso puede incluir solamente la molienda y pulverizacin (residuos de parques y jardines) o puede requerir tratamientos ms complejos para remover contaminantes. El tamizado separa partculas segn su tamao. Las mquinas separan papel, plsticos y otros constituyentes no deseados de la materia orgnica.
Biodegradacin requiere aireacin en pilas o en dispositivos adecuados con aireacin forzada. Durante las primeras semanas, la temperatura de la pila aumenta drsticamente debido a la energa generada por los microorganismos.
363
362
Lillian Frioni
Probiticos
Se definen como: alimentos suplementados con microorganismos viables que benefician al consumidor por
mejoramiento del balance microbiano. La FAO los define como organismos vivos administrados en cantidades adecuadas que ejercen efectos benficos en la salud
del hospedante. Se consideran hospedantes a los animales (ganado vacuno, ovino, etc.) y el hombre. La ma-
La materia orgnica se descompone ms eficiente y completamente en condiciones de oxgeno disponible y a temperaturas elevadas. Las protenas liberan amonaco y
nitratos, mientras que las grasas y carbohidratos forman
dixido de carbono y agua, va cidos orgnicos. Se suceden fases:
fase mesfila, en la que predominan bacterias y hongos productores de cidos que atacan a la materia orgnica fcilmente degradable, generando calor que favorece el desarrollo de organismos termfilos
termfila: a partir del 10o da, con la elevacin de
la temperatura, comienza esta etapa y la poblacin dominante se compone de actinomicetes, bacterias y hongos termfilos o termotolerantes.
fase
379
Microorganismos presentes
La pila se da vuelta o se airea forzadamente, para permitir bajar la temperatura y adems reinocular el material
con microorganismos desde la atmsfera ya que la alta
temperatura produjo disminucin de microorganismos
mesfilos, por pasteurizacin del sustrato. La temperatura vuelve a ascender, reinicindose el ciclo. Las pilas se
dejan de remover y/o airear cuando la temperatura no se
eleva ms, lo que indica que los sustratos fcilmente degradables han sido mineralizados.
380
Lillian Frioni
Actinomicetes
Termotolerantes
Micromonospora vulgaris
Nocardia brasiliensis
Streptomyces rectus
S. thermofuscus
S. thermophillus
S. thermoviolaceus
Thermonospora fusca
T. glaucus
Thermoactinomyces sp.
Thermopolyspora sp.
Termfilas
Bacillus stearotermophilis
Hongos
Mesfilos
Fusarium culmorum
F. roseum
Stysanus stemonitis
Coprinus cinereus
Aspergillus niger
Geothricum candidum
Mucor jansseni
Termfilos
Aspergillus fumigatus
Humicola insolens
Mucor pusillus
Dactylomyces crustaceous
Torula thermophila
Inoculacin
Se ha intentado seleccionar microorganismos para usarlos
como inoculante en cultivos puros o mezclas. Existen a nivel comercial productos recomendados para la inoculacin
de diferentes tipos de residuos. Sin embargo, los datos encontrados en la bibliografa sealan escasas diferencias en
el producto final entre restos inoculados y sin inocular.
A continuacin analizaremos algunos de los grupos microbianos de inters para el hombre que tienen desarrollo
industrial (cuadro 6). El tema Antibiticos es tratado en
los captulos 4, 14 y 17.
bacterias lcticas: inoculantes para alimentos, leche y derivados (yogur, queso, pickles)
ticas
das, para el tratamiento de grandes volmenes de slidos, como por ejemplo los residuos domiciliarios. Se
usan reactores cerrados con control de aireacin, humedad, temperatura y tiempo de retencin. En estos
ltimos, el proceso puede completarse entre 5-7 das,
mientras que en las pilas, puede llevar 3 a 8 semanas,
o ms para lograr un compost adecuado
La experiencia ha demostrado que las dimensiones ideales para las pilas de desechos son las siguientes:
Piruvato
CO2
4
acetolactato
Oxaloacetato
Formato
Acetil -CoA
Pi
CoA
NADH
Acetil
Malato
H2O
H2
P Acetaldehdo
ADP
NAHD
ATP
CO2
CO2
Acetona
NADH
Etanol
Acetato
6
Acetoacetil-CoA
NADH
NADH Etanol
Acetaldehdo
Piruvato
CO2
CO2
NADH
Fumarato
Tecnologa
Lactato
CoASH
361
CO2
Succinato
CO2
Propionato
Acetona
NADH
Isupropanol
Butiril -CoA
Pi
Coa
CoA
Butiraldehdo Butiril P
ADP
NADH
ATP
NADH
400
Lillian Frioni
conjugacin
simplificacin:
O(CH2)3COOH
Cl
Cl
A
Cl
4(2,4 DB)
OH
D
Cl
B OCH COOH
2
Cl
Cl
2,4 Diclorofenol
Cl
A) Simplificacin (Flavobacterium)
B) Activacin en el suelo
C) Detoxificacin (suelo, Arthorobacter)
E) Degradacin (Pseudomonas, suelo)
pueden ser activados. As, el cianato de potasio y el dalapn se hidrolizan lentamente en agua, resultando entonces inefectivos como herbicidas. En suelos en ambiente anaerobio, la degradacin puede ser qumica y
microbiolgica.
Adsorcin a coloides
Son retenidos a la materia orgnica (humus) y a la fraccin arcilla, y los xidos e hidrxidos de hierro y aluminio juegan importante rol en suelos pobres en materia
orgnica. En escala descendente de capacidad de adsorcin tendramos: humus > montmorillonita > illita >
caolinita, pero intervienen tambin la temperatura, el pH,
la capacidad de intercambio catinico. Los enlaces pueden ser de naturaleza fsica (fuerzas de Van der Waals)
o electrostticos, por puentes de hidrgeno, sobre todo
en molculas con grupos -NH, como los fenilcarbamatos y las ureas sustituidas. Intervienen tambin enlaces
en complejos con iones metlicos, inactivndose muchas
molculas fijadas.
As, suelos con alto nivel de materia orgnica requieren dosis relativamente mayores de la mayora de los
herbicidas y suelos arcillosos niveles superiores a los
arenosos. Para predecir las dosis de herbicidas que es
necesario aplicar en varios tipos de suelos, se han desarrollado modelos matemticos. El nivel de materia
orgnica es uno de los parmetros del suelo que ofrece las mejores correlaciones entre la adsorcin de herbicidas y propiedades edficas. El carbn activado, uno
de los materiales absorbentes ms potentes, se emplea para proteger a las semillas de la accin de los
herbicidas.
E
Cl
2,4-D
CO2,H2O,Cl-
Descomposicin qumica
Mediante reacciones de oxidacin, reduccin o hidrlisis se pueden degradar pesticidas, mientras que otros
Lavado
Los herbicidas de pre-emergencia que se aplican generalmente en la superficie del suelo pueden ser llevados
por el agua a capas sub-superficiales donde germinan la
mayora de las semillas de malezas, que son as eliminadas por estas sustancias. Las semillas grandes deben
sembrarse debajo del rea de alta concentracin del herbicida, o bien ser resistentes a ellos. El grado de lixivia-
381
Materiales a compostar
Relacin C/N
15-18
10-14
12
4-10
3-9
5.5-6.5
5-6
2-4
4
2-4
3-5
1.9
1.0-1.8
0.6
0.4-0.1
0.3
0.1
0
0.8
3
ND
4-5
3-15
6-10
6
8
ND
12
15
ND
ND
80
40-80
150
500
infinito
Un compost con materiales de C/N inferior a 30/1conducen a prdidas de N como amonio, agravadas si el pH
es alcalino. En este caso, se agregan materiales ricos
en C, como pajas, para elevar la relacin C/N o tierra,
arcillas o fertilizantes minerales que pueden retener el
amonio.
Al final del compostaje la mayor parte del N est en for
ma de NO3 en solucin que puede ser removido por el
agua y aprovechado por las plantas. Tambin puede
ocurrir fijacin de N2 atmosfrico por microorganismos
especializados, en compost estabilizados, sin presencia
de N amoniacal.
Granulometra: sta se adeca moliendo los materiales
gruesos o agregando restos como pajas en residuos de
granulometra fina como los lodos residuales u otros sustratos con tendencia a compactarse. Tambin se pueden
agregar materiales no degradables, como esferas porosas de arcillas, plstico, goma.
382
Lillian Frioni
pH : el ptimo se sita entre 6,0 y 7,5, los vegetales presentan en general reaccin cida que se puede corregir
agregando cal, ceniza vegetal u otro producto alcalino,
evitando que el pH pase de 8,0.
temperatura C
pH
70
8,0
50
7,0
30
6,0
los microorganismos, el objeto principal es la obtencin de energa y muy pocas molculas (algunos halogenados aromticos usados como insecticidas) no son
atacadas por algn grupo de microorganismo, en el suelo. Se propuso un esquema general sobre la accin de
los microorganismos y de procesos abiolgicos, sobre
los pesticidas (cuadro 6).
10
A
mesfila
B
termfila
C
mesfila
D
estabilizacin
hidrocarburos
Ms degradable
Menos degradable
alcanos superiores
(12 C)
alcanos
alifticos de
cadenas lineales
aromticos mono
y bi cclicos
alcanos de alto PM
alifticos ramificados
aromticos
policclicos
aromticos
aromticos
sustitudos
-OH
-COOH
-NH2
-OCH3
-F
-Cl
-Br
-NO2
alifticos
clorados
-Cl ms 6 C
-Cl menos 6 C
desde el C terminal
como glucosa, por ejemplo, que al disminuir en el medio inducen las enzimas necesarias para la degradacin del pesticida.
I. Enzimtico
A. Metabolismo incidental: los pesticidas no se usan directamente
como fuente de energa.
1. metabolismo por enzimas generalmente disponibles
a. enzimas de amplio espectro (hidrolasas, oxidasas, etc.)
b. enzimas especficas presentes en muchas especies
2. metabolismo inducido por productos anlogos (cometabolismo)
c. enzimas que emplean sustratos estructuralmente similares
a los de los pesticidas.
B. Catabolismo: los pesticidas se emplean como fuente de energa
d. pesticidas o parte de su molcula son rpidamente usados
e. deben inducirse enzimas especficas para su degradacin
C. Detoxificacin.
f. metabolismo por microorganismos resistentes
alcanos inferiores
II. No enzimtico
A. Participacin en reacciones fotoqumicas
B. Contribucin por cambios de pH
C. Por la produccin de reactantes orgnicos o inorgnicos
D. Por la produccin de cofactores
Una microflora especializada es responsable de la degradacin de los pesticidas mediante dos mecanismos diferentes:
I. la sustancia favorece el crecimiento y es empleada
como fuente de carbono, energa y ocasionalmente de
nitrgeno, azufre, etc. El nmero de especies activas
aumenta y el aislamiento se puede efectuar en medios
de cultivo en donde el pesticida acta como nica fuente de nutrientes. Una vez que el producto es degradado, la poblacin declina
II. cometabolismo: el compuesto no acta directamente
como fuente de nutrientes, sino que debe emplear otras,
399
txicas
degradacin, o transformacin de sustancias complejas en productos simples (puede ser sinnimo de mineralizacin, con aparicin de CO2, H2O, NH3, etc.)
398
Lillian Frioni
masa microbiana, por recuentos o por la tcnica de fumigacin-incubacin, recuentos de grupos microbianos
que realizan procesos de inters para el ambiente (FBN,
solubilizadores, mineralizantes, etc.), actividad enzimtica: deshidrogenasas, amilasas, fosfatasas, ATPasas,
etc., procesos microbianos, como la FBN, mineralizacin, oxido-reduccin, son evaluados antes y despus de
la incorporacin de estas sustancias.
Pesticidas en el suelo
La figura 1 presenta un esquema de las posibles vas a seguir por un pesticida cuando llega al suelo. Pongamos como
ejemplo el caso de la incorporacin de un herbicida. Este se
puede perder por lavado, por degradacin en el suelo, o ser
absorbido por los cultivos. El perodo en que un pesticida
persiste en el suelo es de gran importancia prctica, ya que
refleja el tiempo en que la plaga o peste estar sometida a
control, afectando tambin la polucin del ambiente: acumulacin en porciones comestibles de las plantas, en corrientes
de agua, transporte a pjaros va lombrices, etctera.
evaporacin
aplicacin
atmsfera
volatilizacin
xido-reduccin
lavado
adsorcin
fotodescomposicin
vegetales
poros del suelo
movimiento capilar y
gravitacional
difusin
absorcin:
plantas
microorganismos
fijacin: arcillas
materia orgnica
metabolismo y
degradacin
qumica
bioconcentracin
fijacin/adsorcin
difusin
formacin de complejos
con minerales
383
nativa. Como el humus, los compost aumentan la agregacin del suelo, la aireacin, infiltracin de agua, capacidad de retencin del agua y la capacidad de intercambio
catinica.
La estabilidad del compost es una caracterstica importante desde el punto de vista del mercado. La descomposicin activa y continua del compost cuando se agrega al suelo puede inhibir el crecimiento de las plantas
por la reduccin del oxgeno y del nitrgeno disponibles
en la zona de las races o por la presencia de compuestos fitotxicos.
En resumen: el compostaje de residuos biodegradables
es un excelente camino para reducir la cantidad de residuos a ser incinerados o volcados a causes de agua, o
enterrados y la cantidad de metano liberado a la atmsfera. Es un proceso esencialmente microbiano que puede
ser controlado por los factores que afectan a los microorganismos intervinientes. La falta de sustratos adecuados,
niveles de humedad o temperatura fuera de los rangos
ptimos y problemas con la difusin del oxgeno al interior
de la pila, son los factores limitantes ms frecuentes en el
compostaje.
Se necesitan normas claras para dirigir la recoleccin y
el tratamiento de estos residuos, adems de buenos controles de calidad y estndares obligatorios a los efectos
de recomendar productos de buena calidad e inocuos para
el hombre y la naturaleza.
lixiviacin
composicin qumica
las condiciones del medio: materia orgnica, arcillas, pH, humedad, tipo de suelo, etctera.
Descomposicin microbiana
Durante mucho tiempo se pens que los mecanismos de
degradacin de los pesticidas por los microorganismos
eran similares a los de los animales. Pero a medida que
las investigaciones fueron progresando, se apreciaron las
diferencias:
pH
humedad%
densidad
(kg/m3)
N%
P%
K%
6-6,5
20-35
772
2,21
0,97
0,27
5,8-7,2
34-61
304-400
0,7
0-0,03
0,02-0,36
Residuos alimenticios
40
352
0,95
0,13-0,46
0,48-0,89
Slidos municipales
45
352-481
384
Lillian Frioni
Vermicompostaje
Sus excrementos estn formados por agregados de tierra, materia orgnica digerida y secreciones intestinales
y urinarias, de ms fcil asimilacin por las races que
reciben el nombre de coprolitos. Estos son ms neutros que los suelos, pobres en arcillas y ricos en materia
orgnica, nitratos, P, K, Ca y Mg, presentando alta CIC
(capacidad de intercambio catinico), saturacin en bases y alto porcentaje de humedad. El cuadro 8 resume
las caractersticas del proceso y la figura 3 muestra un
cantero de vermicompostaje.
Para la elaboracin del vermicompostaje pueden utilizarse una gran variedad de sustratos, las lombrices prefieren los estircoles pero atacan cualquier tipo de materia orgnica, siempre que no sea muy cida o muy olorosa. El vermicompostaje es una tcnica competitiva
frente a compostaje tradicional aunque presenta algunas desventajas:
los compuestos de amplio rango, como los fumigantes, fungicidas, parecen afectar negativamente todos
los procesos biolgicos, al menos temporariamente.
El mismo efecto se encontr con la mayora de los
metales pesados
herbicidas, insecticidas, son menos perjudiciales para
la microflora y en algunos casos, pueden estimularla.
Cuadro 8- Vermicompostaje
procesos benficos (degradacin de materia orgnica, nitrificacin, fijacin del N2, solubilizacin de fosfatos)
La eficacia de un pesticida se determina por la dosis letal, que asegura la muerte de la poblacin entera y la dosis
letal 50 (DL 50), que elimina al 50% de los componentes
de la poblacin. En respuesta al efecto causado por los
pesticidas, los microorganismos muestran gran adaptabilidad, evidenciada por el rpido restablecimiento de la
actividad metablica.
Los mecanismos pueden ser:
tratamientos biocidas
397
resultados obtenidos a nivel de laboratorio a las condiciones naturales de campo, resulta muchas veces difcil
porque:
los
estudios fueron realizados bajo condiciones muy diversas, muchas veces no correctamente explicitadas en
los trabajos
en
Mtodos
Qumicos: se deben emplear tcnicas muy sensibles: cromatografa en fase gaseosa o lquida, espectrofotometra
con luz ultravioleta, para detectar trazas de pesticidas o
de sus intermediarios en la degradacin.
396
Lillian Frioni
Los pesticidas son sustancias qumicas destinadas al control de poblaciones no deseadas (pestes), de muy distintos grupos taxonmicos y se caracterizan por los organismos que atacan: insecticidas, nematicidas, herbicidas,
fungicidas. Otros, destinados a la supresin de roedores
y moluscos, han recibido menos atencin.
peratura, agua
No existen muchos datos cuantitativos sobre las transformaciones de muchos de estos productos txicos, salvo,
quiz, lo referente a los pesticidas, sobre los cuales las
investigaciones son ms abundantes. Los xenobiticos
interfieren con procesos importantes como:
fotosntesis
metabolismos oxidativos
sntesis celulares
Pesticidas
Su empleo se ha incrementado en los ltimos aos y tanto la agricultura moderna, como la conservacin de frutas
Rendimiento kg/ha
Con compost
7.750a
Sin compost
5.850b
0
7750
5850
50
9940
8750
100
10470
9640
150
10830
10740
200
10880
10470
Como se aprecia globalmente sobre todas las parcelas, el efecto de la enmienda fue favorable (a 10% de
confianza), sobretodo sin fertilizacin o con bajas dosis de nitrgeno. El agregado de compost economiza
unos 50kg de N-urea/ha, como surge de los datos del
cuadro 9.
El cuadro 10 compara estos procesos controlados con la
degradacin de la materia orgnica realizada en la naturaleza en condiciones naturales.
385
Biodegradacin anaerobia
de restos orgnicos
La digestin anaerobia consiste en una serie de procesos
de degradacin microbiana de la materia orgnica en au
sencia de agentes oxidantes (O2, NO3 , S04=).
Como productos finales de esta degradacin se produce una mezcla de gases (biogs) con predominio de
metano (CH4) usado como combustible y materia orgnica estabilizada, el biofertilizante, activador de la poblacin microbiana y mejorador de las propiedades fsicas del suelo.
Interviene en este proceso una poblacin microbiana muy
heterognea que acta en una cadena alimentaria. Uno
de los grupos terminales de esta cadena son las metanobacterias, responsables de la produccin de gas metano, usado como combustible. El sustrato que entra a los
biodigestores rurales est compuesto principalmente por
estircol u otras materias orgnicas diludas: una mezcla
compleja de celulosa, hemicelulosa, lignina, protenas, lpidos, minerales, etc. Los microorganismos utilizan estos compuestos para obtener energa y como fuente de
carbono, mineralizando cada vez ms los restos orgnicos hasta alcanzar un equilibrio. En la digestin anaerobia se distinguen cuatro etapas (figura 4).
Hidrlisis de biopolmeros
Fermentacin
Acetognesis
y deshidrogenacin
Metanognesis
Hidrlisis: la primera etapa de la degradacin de la materia orgnica es llevada a cabo por enzimas hidrolticas
de mltiples microorganismos que utilizan los compuestos de la hidrlisis. Posteriormente acta otro grupo que
ataca los productos resultantes de la accin del primer
grupo y asi sucesivamente conformando una cadena trfica con una poblacin microbiana en equilibrio.
zas en el compost
La fermentacin es la fuente de energa en las condiciones de anaerobiosis y de falta de luz de este sistema. Los
386
Lillian Frioni
principales productos finales de la hidrlisis y la fermentacin son CO2, H2, propionato, acetato y butirato.
Existen bacterias que degradan el propionato y el butirato
llevndolo a acetato, H2 y CO2. Estas bacterias actan sinrgicamente (sintrofia) con otros microorganismos que consumen el H2 producido y de esta forma permiten que se establezca el primer grupo (que es inhibido por el hidrgeno).
La metanognesis (respiracin anaerobia) es la ltima
etapa de la cadena trfica y las bacterias metanognicas
producen CH4 por la siguiente reaccin:
CO2 + 4 H2
Cada biodigestor es diferente ya que debido a que las interacciones entre los microorganismos son mltiples y complejas, en cada uno se alcanzarn poblaciones distintas.
No se puede hacer consideraciones taxonmicas generales pero es importante conocer los grandes grupos fisiolgicos de microorganismos presentes. Los microorganismos se agrupan de acuerdo a las reacciones que
emplean en la generacin de energa y se relacionan a su
vez con el consumo y produccin de hidrgeno.
CH4 + 2 H2O
Cuadro 11 - Microorganismos en biodigestores
anaerobios
Como se observa consumen hidrgeno, por lo que poseen un papel regulador en el biodigestor.
Grupo
Residuos (protenas,
polisacridos)
Productores de hidrgeno
Acetato
CO2 + H2
12 Molculas orgnicas unidas a arcilla son ms resistentes a la degradacin (1g de la arcilla montmorillinolita
presenta 600 m2 de rea superficial)
Consumidores de hidrgeno
Metanognesis
CH4
ye la biodegradacin
anaerobias estrictas
Propionato
Acetato
10 Volatilizacin
CO2 + H2
consumen el O2 presente
aerotolerantes
Fermentacin
anaerobias facultativas
Hidrlisis biopolmeros
Monmeros (azcares,
aminocidos)
Acetato
Caractersticas
CH4 + CO2
Poblacin microbiana
Dentro del biodigestor coexisten distintos grupos de microorganismos: bacterias, hongos y protozoarios (Soubes, 1994).
15 Restricciones fisiolgicas: carencia de las enzimas requeridas. Transporte de la sustancia en el suelo, limitacin de nutrientes esenciales (N, S, P. etc.)
Clordano
DDT
Dieldrin
Dioxinas
Endrin
Furanos
Un concepto muy popular en el pasado, antes de la dcada del 60, sostena que esencialmente toda sustancia
orgnica introducida en la biosfera debera ser metabolizada por los microorganismos en un perodo de
tiempo razonablemente corto. Este concepto actualmente no es del todo correcto ya que vimos que hay sustancias sintticas recalcitrantes y que persisten en el suelo en ciertas condiciones por largos perodos, como son
los bifenilos policlorados, ciertos pesticidas (sobretodo
395
Heptaclorobenceno
Hexaclorobenceno
Mirex
Toxafeno
394
Lillian Frioni
En la mayora de los casos las sustancias orgnicas biodegradables sufren los mismos tipos de reacciones de
ruptura y simplificacin que las sintticas, a saber: decarboxilacin, desaminacin, hidroxilacin, -oxidacin e hidrlisis de enlaces ster. Procesos biticos y abiticos
pueden transformar a los productos alterando su estado
qumico y consecuentemente su toxicidad y reactividad.
Idealmente se espera su conversin a:
Ejemplos
Alifticos (halogenados)
Alifticos(no halogenados)
Aromticos (halogenados)
Policclicos(no halogenados)
Policclicos (halogenados)
Pesticidas
co y bacterias anaerobias estrictas como Clostridium, Bacteroides, Propionibacterium. Las enterobacterias como E.
coli poseen la enzima formiato liasa responsable de la
generacin de H2 a partir de formiato, pero tal vez su rol
fundamental es la remocin del O2. Las bacterias lcticas
producen cido lctico y a veces etanol y CO2, a partir de
azcares. Propionibacterium fermenta cido lctico con liberacin de H2 y acetato, o acetato y propionato.
387
La reduccin del sulfato a sulfuro es ms favorable termodinmicamente que la produccin de metano. Si existe alta
disponibilidad de sulfatos proliferarn estas bacterias con
consecuencias negativas: van a emplear el H2 (sustrato de
las metanognicas) y producen sulfuros, txicos a concentraciones elevadas e indeseable en el gas de salida.
En virtud del elevado nmero de bacterias sulfatoreductoras
que existen en los reactores anaerobios y en los biodigestores rurales, aun en asusencia de sulfato (pueden metabolizar
lactato dando acetato, CO2 y H2), se postula que ejercen importante rol como acetognicas deshidrogenantes.
Bacterias acetognicas
Son las que crecen a expensas de la reaccin:
H2 + 2CO2 = acetato + H2O + H+
Pertenecen a gneros diversos como Acetobacterium,
Acetogenium y Clostridium. Tambin pueden realzar otros
metabolismos y slo un 10% del carbono en los reactores
sufrir esta transformacin.
Bacterias sulfatoreductoras
Emplean los productos de las fermentaciones como sustratos en la reduccin de sulfatos a sulfuros, de la cual
obtienen energa. Se dividen en dos grupos:
oxidantes completos que liberan CO2, H2O y S=, pueden degradar cidos orgnicos de hasta 18 carbonos
, S=, algunas propionato y butirato, que en general no pueden
seguir degradando
Bacterias desnitrificantes
Estas bacterias que obtienen energa de la oxidacin de
compuestos orgnicos y compuestos de azufre reducido
e H2, con nitratos como aceptores de electrones, estn
presentes en los reactores anaerobios y se les atribuye
junto a las Enterobacterias el rol de remocin del oxgeno
del sistema. Especies del gnero Pseudomonas son las
ms distribudas en la naturaleza.
Bacterias metanogenticas
Estos microorganismos tienen caractersticas especiales:
son Arquebacterias, hoy denominadas archae, organismos muy primitivos que se distinguen de las bacterias tpicas por poseer un seudopeptidoglicano en su
pared, algunos gneros poseen recubrimientos exteriores solamente protecos (capa S en Methanococcus), o una capa polisacrida junto a la capa S
388
Lillian Frioni
y requieren concentraciones
de oxgeno menores de 5 mg/L en el cultivo
son los nicos microorganismos capaces de generar metano y poseen enzimas exclusivas como hidrogenasas con cofactores como el F420 y F 430, que fluorece con luz ultravioleta de 420 nanometros y permite asi
visualizar clulas y colonias de estos organismos. Estas metaloprotenas determinan mecesidades especiales de Ni, Fe, Co y Se. No presentan metabolismos alternativos.
dimetilamina + H2O
1,5
El mayor nmero de especies de bacterias metanognicas pertenecen al primer grupo, y las ms frecuente son
Methanobacterium, Methanospirillum y Methanobrevibac-
393
0,25
metanol
Biofertilizante
El efluente de la digestin anaerobia en los biodigestores se denomina biofertilizante. Es un producto muy apto
para ser usado como fertilizante orgnico e inclusive
muchos establecimientos agropecuarios instalan biodigestores con el fin primario de obtener un fertilizante
orgnico complejo, cuya composicin variar de acuerdo al material orgnico.
En los casos comunes de biodigestores rurales se utiliza
estircol diludo, el biofertilizante resultante es una
suspensin homognea cuyo valor no est dado en la
cantidad de nutrientes qumicos para las plantas (por ejemplo nitrgeno o fsforo), sino como activador de la poblacin microbiana del suelo con la resultante dinamizacin de toda la actividad biolgica.
22
Degradacin de xenobiticos
392
Lillian Frioni
389
En el proceso de digestin anaerobia la relacin carbono/nitrgeno (C/N) baja, sealando una estabilizacin del
producto, que se asemeja al humus, con la fraccin
lignocelulsica no degradada y abundante biomasa microbiana.
Muchas veces se aprecia un incremento en el porcentaje
de nutrientes presentes en el biofertilizante respecto al
material original. Sin embargo, el efecto principal sobre
los cultivos no es a partir de los nutrientes qumicos sino
al proceso activador sobre la poblacin microbiana del
suelo. Asimismo, se mejoran las propiedades fsicas del
suelo (que son las que regulan la aireacin y la dinmica
del agua).
Salida de biogs
a)
Caja de entrada
Caja de
salida
La aplicacin de estos biofertilizantes en los primeros centmetros del suelo puede aportar en promedio:
Pared divisoria
+
N-NH4
N-orgnico
P total
K total
45-90kg/ha
b)
Modelo hind
Puerta
Biodigestores rurales
La figura 5 muestra los dos tipos ms frecuentes de biodigestores empleados en establecimientos agropecuarios,
el hind y el chino. En el modelo hind, el biogs formado se va acumulando bajo la campana que se eleva (flota) a medida que avanza el proceso. El biodigestor se carga
por una caja de entrada y se descarga por una caja de
salida. Todo el sistema se maneja con el principio de vasos comunicantes o sea que el volumen que entra por la
Biogs
Caja de entrada
biogs
biogs
Caja de salida
Tubo
Modelo chino
390
Lillian Frioni
Natural
Los procesos de degradacin de
los residuos orgnicos tienen una
dinmica continua: se trata de
procesos que no se detienen
Est sujeta a las condiciones
ambientales
Dirigida
Bajo condiciones controladas,
se logra acelerar la velocidad de
descomposicin de residuos
Bibliografa
Food and Agriculture Organization Recliclaje de Materia Orgnica y Biogs, FAO, 1986, Santiago de
Chile
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Lambais; M. R. Poluao Organica e seu Controle. En :
Microbiologia do Solo, 1992, Sociedade Brrasileira
de Ciencia do Solo, Campinas (SP): 91-104
Mustin, M. Le compost: Gestion de la matire organique, 1987, Franois Dubusc (ed), Pars: 954 pp.
Soubes, M. Microbiologa de la digestin anaerobia. En:
Tratamiento Anaerobio, 1994 III Taller y Seminario
Latinamericano: Tratamiento Anaerobio de Aguas
Residuales, Universidad de la Repblica, Montevideo: 15-28
Stevenson, F. J. y Cole, M. A. Cycles of Soils, Carbon,
Nitrogen, Phosphorus, Sulfur, Micronutrients, 1999
Wiley & Sons, New York
Zibilske, L. M. Composting of organic wastes. En: Principles and Applications of Soil Microbiology. 1998,
Sylvia, Fuhrmann, Hartel y Zuberer (eds), Prentice Hall,
N. Jersey: 482-497
Preguntas de repaso
1) Analice el concepto de residuo. Y cite ejemplos generados en establecimientos agropecuarios, en las ciudades y en los domicilios.
2) Compare los procesos de biodegradacin aerobia y
anaerobia de residuos orgnicos slidos con el ensilaje de forrajes.
3) Similitudes y diferencias entre los procesos aerobios y
anaerobios
4) En el caso de un tambo, como se puede realizar
la depuracin de los efluentes? Ha visitado alguna? Cmo determinara que el agua puede verterse finalmente al suelo o a causes de agua (ros,
arroyos)?
5) Cmo definira un compost? Y cmo determinara
que el mismo est maduro, es decir pronto para su
empleo en agricultura?
6) Qu limitaciones encuentra en la aplicacin de este
proceso a mezclas de distintos sustratos que se pue-
den reunir en una ciudad? Se puede lograr un producto final de composicin similar?
7) Se puede pasar de la escala de camellones (pilas largas y unos 2 m de altura) de residuos a una escala
industrial? Qu se requiere de infraestructura? Principales limitantes.
8) Qu opinin le merece si le ofrecen un biofertilizante que presenta: malos olores, pH ligeramente
cido y ms N-amonio en relacin a N-nitrato?
9) Los biodigestores anaerobios pueden disearse en
391
tamaos pequeos para ser aplicados en la industria. Qu debe contener el llamado reactor? Los
tiempos en que ocurren las distintas etapas microbiolgicas pueden descender?
10) Cmo evaluara la calidad de un biofertilizante?
11) Qu exigencias mnimas se le debe exigir a estos
productos?
12) Compare estos procesos de biodegradacin (aerobia y anaerobia) con la degradacin natural, en la
naturaleza.
390
Lillian Frioni
Natural
Los procesos de degradacin de
los residuos orgnicos tienen una
dinmica continua: se trata de
procesos que no se detienen
Est sujeta a las condiciones
ambientales
Dirigida
Bajo condiciones controladas,
se logra acelerar la velocidad de
descomposicin de residuos
Bibliografa
Food and Agriculture Organization Recliclaje de Materia Orgnica y Biogs, FAO, 1986, Santiago de
Chile
Kiehl, E. J. Fertilizantes Orgnicos, 1985 Editora Agronmica, Ceres, San Pablo
Lambais; M. R. Poluao Organica e seu Controle. En :
Microbiologia do Solo, 1992, Sociedade Brrasileira
de Ciencia do Solo, Campinas (SP): 91-104
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Soubes, M. Microbiologa de la digestin anaerobia. En:
Tratamiento Anaerobio, 1994 III Taller y Seminario
Latinamericano: Tratamiento Anaerobio de Aguas
Residuales, Universidad de la Repblica, Montevideo: 15-28
Stevenson, F. J. y Cole, M. A. Cycles of Soils, Carbon,
Nitrogen, Phosphorus, Sulfur, Micronutrients, 1999
Wiley & Sons, New York
Zibilske, L. M. Composting of organic wastes. En: Principles and Applications of Soil Microbiology. 1998,
Sylvia, Fuhrmann, Hartel y Zuberer (eds), Prentice Hall,
N. Jersey: 482-497
Preguntas de repaso
1) Analice el concepto de residuo. Y cite ejemplos generados en establecimientos agropecuarios, en las ciudades y en los domicilios.
2) Compare los procesos de biodegradacin aerobia y
anaerobia de residuos orgnicos slidos con el ensilaje de forrajes.
3) Similitudes y diferencias entre los procesos aerobios y
anaerobios
4) En el caso de un tambo, como se puede realizar
la depuracin de los efluentes? Ha visitado alguna? Cmo determinara que el agua puede verterse finalmente al suelo o a causes de agua (ros,
arroyos)?
5) Cmo definira un compost? Y cmo determinara
que el mismo est maduro, es decir pronto para su
empleo en agricultura?
6) Qu limitaciones encuentra en la aplicacin de este
proceso a mezclas de distintos sustratos que se pue-
den reunir en una ciudad? Se puede lograr un producto final de composicin similar?
7) Se puede pasar de la escala de camellones (pilas largas y unos 2 m de altura) de residuos a una escala
industrial? Qu se requiere de infraestructura? Principales limitantes.
8) Qu opinin le merece si le ofrecen un biofertilizante que presenta: malos olores, pH ligeramente
cido y ms N-amonio en relacin a N-nitrato?
9) Los biodigestores anaerobios pueden disearse en
391
tamaos pequeos para ser aplicados en la industria. Qu debe contener el llamado reactor? Los
tiempos en que ocurren las distintas etapas microbiolgicas pueden descender?
10) Cmo evaluara la calidad de un biofertilizante?
11) Qu exigencias mnimas se le debe exigir a estos
productos?
12) Compare estos procesos de biodegradacin (aerobia y anaerobia) con la degradacin natural, en la
naturaleza.
392
Lillian Frioni
389
En el proceso de digestin anaerobia la relacin carbono/nitrgeno (C/N) baja, sealando una estabilizacin del
producto, que se asemeja al humus, con la fraccin
lignocelulsica no degradada y abundante biomasa microbiana.
Muchas veces se aprecia un incremento en el porcentaje
de nutrientes presentes en el biofertilizante respecto al
material original. Sin embargo, el efecto principal sobre
los cultivos no es a partir de los nutrientes qumicos sino
al proceso activador sobre la poblacin microbiana del
suelo. Asimismo, se mejoran las propiedades fsicas del
suelo (que son las que regulan la aireacin y la dinmica
del agua).
Salida de biogs
a)
Caja de entrada
Caja de
salida
La aplicacin de estos biofertilizantes en los primeros centmetros del suelo puede aportar en promedio:
Pared divisoria
+
N-NH4
N-orgnico
P total
K total
45-90kg/ha
b)
Modelo hind
Puerta
Biodigestores rurales
La figura 5 muestra los dos tipos ms frecuentes de biodigestores empleados en establecimientos agropecuarios,
el hind y el chino. En el modelo hind, el biogs formado se va acumulando bajo la campana que se eleva (flota) a medida que avanza el proceso. El biodigestor se carga
por una caja de entrada y se descarga por una caja de
salida. Todo el sistema se maneja con el principio de vasos comunicantes o sea que el volumen que entra por la
Biogs
Caja de entrada
biogs
biogs
Caja de salida
Tubo
Modelo chino
388
Lillian Frioni
y requieren concentraciones
de oxgeno menores de 5 mg/L en el cultivo
son los nicos microorganismos capaces de generar metano y poseen enzimas exclusivas como hidrogenasas con cofactores como el F420 y F 430, que fluorece con luz ultravioleta de 420 nanometros y permite asi
visualizar clulas y colonias de estos organismos. Estas metaloprotenas determinan mecesidades especiales de Ni, Fe, Co y Se. No presentan metabolismos alternativos.
dimetilamina + H2O
1,5
El mayor nmero de especies de bacterias metanognicas pertenecen al primer grupo, y las ms frecuente son
Methanobacterium, Methanospirillum y Methanobrevibac-
393
0,25
metanol
Biofertilizante
El efluente de la digestin anaerobia en los biodigestores se denomina biofertilizante. Es un producto muy apto
para ser usado como fertilizante orgnico e inclusive
muchos establecimientos agropecuarios instalan biodigestores con el fin primario de obtener un fertilizante
orgnico complejo, cuya composicin variar de acuerdo al material orgnico.
En los casos comunes de biodigestores rurales se utiliza
estircol diludo, el biofertilizante resultante es una
suspensin homognea cuyo valor no est dado en la
cantidad de nutrientes qumicos para las plantas (por ejemplo nitrgeno o fsforo), sino como activador de la poblacin microbiana del suelo con la resultante dinamizacin de toda la actividad biolgica.
22
Degradacin de xenobiticos
394
Lillian Frioni
En la mayora de los casos las sustancias orgnicas biodegradables sufren los mismos tipos de reacciones de
ruptura y simplificacin que las sintticas, a saber: decarboxilacin, desaminacin, hidroxilacin, -oxidacin e hidrlisis de enlaces ster. Procesos biticos y abiticos
pueden transformar a los productos alterando su estado
qumico y consecuentemente su toxicidad y reactividad.
Idealmente se espera su conversin a:
Ejemplos
Alifticos (halogenados)
Alifticos(no halogenados)
Aromticos (halogenados)
Policclicos(no halogenados)
Policclicos (halogenados)
Pesticidas
co y bacterias anaerobias estrictas como Clostridium, Bacteroides, Propionibacterium. Las enterobacterias como E.
coli poseen la enzima formiato liasa responsable de la
generacin de H2 a partir de formiato, pero tal vez su rol
fundamental es la remocin del O2. Las bacterias lcticas
producen cido lctico y a veces etanol y CO2, a partir de
azcares. Propionibacterium fermenta cido lctico con liberacin de H2 y acetato, o acetato y propionato.
387
La reduccin del sulfato a sulfuro es ms favorable termodinmicamente que la produccin de metano. Si existe alta
disponibilidad de sulfatos proliferarn estas bacterias con
consecuencias negativas: van a emplear el H2 (sustrato de
las metanognicas) y producen sulfuros, txicos a concentraciones elevadas e indeseable en el gas de salida.
En virtud del elevado nmero de bacterias sulfatoreductoras
que existen en los reactores anaerobios y en los biodigestores rurales, aun en asusencia de sulfato (pueden metabolizar
lactato dando acetato, CO2 y H2), se postula que ejercen importante rol como acetognicas deshidrogenantes.
Bacterias acetognicas
Son las que crecen a expensas de la reaccin:
H2 + 2CO2 = acetato + H2O + H+
Pertenecen a gneros diversos como Acetobacterium,
Acetogenium y Clostridium. Tambin pueden realzar otros
metabolismos y slo un 10% del carbono en los reactores
sufrir esta transformacin.
Bacterias sulfatoreductoras
Emplean los productos de las fermentaciones como sustratos en la reduccin de sulfatos a sulfuros, de la cual
obtienen energa. Se dividen en dos grupos:
oxidantes completos que liberan CO2, H2O y S=, pueden degradar cidos orgnicos de hasta 18 carbonos
, S=, algunas propionato y butirato, que en general no pueden
seguir degradando
Bacterias desnitrificantes
Estas bacterias que obtienen energa de la oxidacin de
compuestos orgnicos y compuestos de azufre reducido
e H2, con nitratos como aceptores de electrones, estn
presentes en los reactores anaerobios y se les atribuye
junto a las Enterobacterias el rol de remocin del oxgeno
del sistema. Especies del gnero Pseudomonas son las
ms distribudas en la naturaleza.
Bacterias metanogenticas
Estos microorganismos tienen caractersticas especiales:
son Arquebacterias, hoy denominadas archae, organismos muy primitivos que se distinguen de las bacterias tpicas por poseer un seudopeptidoglicano en su
pared, algunos gneros poseen recubrimientos exteriores solamente protecos (capa S en Methanococcus), o una capa polisacrida junto a la capa S
386
Lillian Frioni
principales productos finales de la hidrlisis y la fermentacin son CO2, H2, propionato, acetato y butirato.
Existen bacterias que degradan el propionato y el butirato
llevndolo a acetato, H2 y CO2. Estas bacterias actan sinrgicamente (sintrofia) con otros microorganismos que consumen el H2 producido y de esta forma permiten que se establezca el primer grupo (que es inhibido por el hidrgeno).
La metanognesis (respiracin anaerobia) es la ltima
etapa de la cadena trfica y las bacterias metanognicas
producen CH4 por la siguiente reaccin:
CO2 + 4 H2
Cada biodigestor es diferente ya que debido a que las interacciones entre los microorganismos son mltiples y complejas, en cada uno se alcanzarn poblaciones distintas.
No se puede hacer consideraciones taxonmicas generales pero es importante conocer los grandes grupos fisiolgicos de microorganismos presentes. Los microorganismos se agrupan de acuerdo a las reacciones que
emplean en la generacin de energa y se relacionan a su
vez con el consumo y produccin de hidrgeno.
CH4 + 2 H2O
Cuadro 11 - Microorganismos en biodigestores
anaerobios
Como se observa consumen hidrgeno, por lo que poseen un papel regulador en el biodigestor.
Grupo
Residuos (protenas,
polisacridos)
Productores de hidrgeno
Acetato
CO2 + H2
12 Molculas orgnicas unidas a arcilla son ms resistentes a la degradacin (1g de la arcilla montmorillinolita
presenta 600 m2 de rea superficial)
Consumidores de hidrgeno
Metanognesis
CH4
ye la biodegradacin
anaerobias estrictas
Propionato
Acetato
10 Volatilizacin
CO2 + H2
consumen el O2 presente
aerotolerantes
Fermentacin
anaerobias facultativas
Hidrlisis biopolmeros
Monmeros (azcares,
aminocidos)
Acetato
Caractersticas
CH4 + CO2
Poblacin microbiana
Dentro del biodigestor coexisten distintos grupos de microorganismos: bacterias, hongos y protozoarios (Soubes, 1994).
15 Restricciones fisiolgicas: carencia de las enzimas requeridas. Transporte de la sustancia en el suelo, limitacin de nutrientes esenciales (N, S, P. etc.)
Clordano
DDT
Dieldrin
Dioxinas
Endrin
Furanos
Un concepto muy popular en el pasado, antes de la dcada del 60, sostena que esencialmente toda sustancia
orgnica introducida en la biosfera debera ser metabolizada por los microorganismos en un perodo de
tiempo razonablemente corto. Este concepto actualmente no es del todo correcto ya que vimos que hay sustancias sintticas recalcitrantes y que persisten en el suelo en ciertas condiciones por largos perodos, como son
los bifenilos policlorados, ciertos pesticidas (sobretodo
395
Heptaclorobenceno
Hexaclorobenceno
Mirex
Toxafeno
396
Lillian Frioni
Los pesticidas son sustancias qumicas destinadas al control de poblaciones no deseadas (pestes), de muy distintos grupos taxonmicos y se caracterizan por los organismos que atacan: insecticidas, nematicidas, herbicidas,
fungicidas. Otros, destinados a la supresin de roedores
y moluscos, han recibido menos atencin.
peratura, agua
No existen muchos datos cuantitativos sobre las transformaciones de muchos de estos productos txicos, salvo,
quiz, lo referente a los pesticidas, sobre los cuales las
investigaciones son ms abundantes. Los xenobiticos
interfieren con procesos importantes como:
fotosntesis
metabolismos oxidativos
sntesis celulares
Pesticidas
Su empleo se ha incrementado en los ltimos aos y tanto la agricultura moderna, como la conservacin de frutas
Rendimiento kg/ha
Con compost
7.750a
Sin compost
5.850b
0
7750
5850
50
9940
8750
100
10470
9640
150
10830
10740
200
10880
10470
Como se aprecia globalmente sobre todas las parcelas, el efecto de la enmienda fue favorable (a 10% de
confianza), sobretodo sin fertilizacin o con bajas dosis de nitrgeno. El agregado de compost economiza
unos 50kg de N-urea/ha, como surge de los datos del
cuadro 9.
El cuadro 10 compara estos procesos controlados con la
degradacin de la materia orgnica realizada en la naturaleza en condiciones naturales.
385
Biodegradacin anaerobia
de restos orgnicos
La digestin anaerobia consiste en una serie de procesos
de degradacin microbiana de la materia orgnica en au
sencia de agentes oxidantes (O2, NO3 , S04=).
Como productos finales de esta degradacin se produce una mezcla de gases (biogs) con predominio de
metano (CH4) usado como combustible y materia orgnica estabilizada, el biofertilizante, activador de la poblacin microbiana y mejorador de las propiedades fsicas del suelo.
Interviene en este proceso una poblacin microbiana muy
heterognea que acta en una cadena alimentaria. Uno
de los grupos terminales de esta cadena son las metanobacterias, responsables de la produccin de gas metano, usado como combustible. El sustrato que entra a los
biodigestores rurales est compuesto principalmente por
estircol u otras materias orgnicas diludas: una mezcla
compleja de celulosa, hemicelulosa, lignina, protenas, lpidos, minerales, etc. Los microorganismos utilizan estos compuestos para obtener energa y como fuente de
carbono, mineralizando cada vez ms los restos orgnicos hasta alcanzar un equilibrio. En la digestin anaerobia se distinguen cuatro etapas (figura 4).
Hidrlisis de biopolmeros
Fermentacin
Acetognesis
y deshidrogenacin
Metanognesis
Hidrlisis: la primera etapa de la degradacin de la materia orgnica es llevada a cabo por enzimas hidrolticas
de mltiples microorganismos que utilizan los compuestos de la hidrlisis. Posteriormente acta otro grupo que
ataca los productos resultantes de la accin del primer
grupo y asi sucesivamente conformando una cadena trfica con una poblacin microbiana en equilibrio.
zas en el compost
La fermentacin es la fuente de energa en las condiciones de anaerobiosis y de falta de luz de este sistema. Los
384
Lillian Frioni
Vermicompostaje
Sus excrementos estn formados por agregados de tierra, materia orgnica digerida y secreciones intestinales
y urinarias, de ms fcil asimilacin por las races que
reciben el nombre de coprolitos. Estos son ms neutros que los suelos, pobres en arcillas y ricos en materia
orgnica, nitratos, P, K, Ca y Mg, presentando alta CIC
(capacidad de intercambio catinico), saturacin en bases y alto porcentaje de humedad. El cuadro 8 resume
las caractersticas del proceso y la figura 3 muestra un
cantero de vermicompostaje.
Para la elaboracin del vermicompostaje pueden utilizarse una gran variedad de sustratos, las lombrices prefieren los estircoles pero atacan cualquier tipo de materia orgnica, siempre que no sea muy cida o muy olorosa. El vermicompostaje es una tcnica competitiva
frente a compostaje tradicional aunque presenta algunas desventajas:
los compuestos de amplio rango, como los fumigantes, fungicidas, parecen afectar negativamente todos
los procesos biolgicos, al menos temporariamente.
El mismo efecto se encontr con la mayora de los
metales pesados
herbicidas, insecticidas, son menos perjudiciales para
la microflora y en algunos casos, pueden estimularla.
Cuadro 8- Vermicompostaje
procesos benficos (degradacin de materia orgnica, nitrificacin, fijacin del N2, solubilizacin de fosfatos)
La eficacia de un pesticida se determina por la dosis letal, que asegura la muerte de la poblacin entera y la dosis
letal 50 (DL 50), que elimina al 50% de los componentes
de la poblacin. En respuesta al efecto causado por los
pesticidas, los microorganismos muestran gran adaptabilidad, evidenciada por el rpido restablecimiento de la
actividad metablica.
Los mecanismos pueden ser:
tratamientos biocidas
397
resultados obtenidos a nivel de laboratorio a las condiciones naturales de campo, resulta muchas veces difcil
porque:
los
estudios fueron realizados bajo condiciones muy diversas, muchas veces no correctamente explicitadas en
los trabajos
en
Mtodos
Qumicos: se deben emplear tcnicas muy sensibles: cromatografa en fase gaseosa o lquida, espectrofotometra
con luz ultravioleta, para detectar trazas de pesticidas o
de sus intermediarios en la degradacin.
398
Lillian Frioni
masa microbiana, por recuentos o por la tcnica de fumigacin-incubacin, recuentos de grupos microbianos
que realizan procesos de inters para el ambiente (FBN,
solubilizadores, mineralizantes, etc.), actividad enzimtica: deshidrogenasas, amilasas, fosfatasas, ATPasas,
etc., procesos microbianos, como la FBN, mineralizacin, oxido-reduccin, son evaluados antes y despus de
la incorporacin de estas sustancias.
Pesticidas en el suelo
La figura 1 presenta un esquema de las posibles vas a seguir por un pesticida cuando llega al suelo. Pongamos como
ejemplo el caso de la incorporacin de un herbicida. Este se
puede perder por lavado, por degradacin en el suelo, o ser
absorbido por los cultivos. El perodo en que un pesticida
persiste en el suelo es de gran importancia prctica, ya que
refleja el tiempo en que la plaga o peste estar sometida a
control, afectando tambin la polucin del ambiente: acumulacin en porciones comestibles de las plantas, en corrientes
de agua, transporte a pjaros va lombrices, etctera.
evaporacin
aplicacin
atmsfera
volatilizacin
xido-reduccin
lavado
adsorcin
fotodescomposicin
vegetales
poros del suelo
movimiento capilar y
gravitacional
difusin
absorcin:
plantas
microorganismos
fijacin: arcillas
materia orgnica
metabolismo y
degradacin
qumica
bioconcentracin
fijacin/adsorcin
difusin
formacin de complejos
con minerales
383
nativa. Como el humus, los compost aumentan la agregacin del suelo, la aireacin, infiltracin de agua, capacidad de retencin del agua y la capacidad de intercambio
catinica.
La estabilidad del compost es una caracterstica importante desde el punto de vista del mercado. La descomposicin activa y continua del compost cuando se agrega al suelo puede inhibir el crecimiento de las plantas
por la reduccin del oxgeno y del nitrgeno disponibles
en la zona de las races o por la presencia de compuestos fitotxicos.
En resumen: el compostaje de residuos biodegradables
es un excelente camino para reducir la cantidad de residuos a ser incinerados o volcados a causes de agua, o
enterrados y la cantidad de metano liberado a la atmsfera. Es un proceso esencialmente microbiano que puede
ser controlado por los factores que afectan a los microorganismos intervinientes. La falta de sustratos adecuados,
niveles de humedad o temperatura fuera de los rangos
ptimos y problemas con la difusin del oxgeno al interior
de la pila, son los factores limitantes ms frecuentes en el
compostaje.
Se necesitan normas claras para dirigir la recoleccin y
el tratamiento de estos residuos, adems de buenos controles de calidad y estndares obligatorios a los efectos
de recomendar productos de buena calidad e inocuos para
el hombre y la naturaleza.
lixiviacin
composicin qumica
las condiciones del medio: materia orgnica, arcillas, pH, humedad, tipo de suelo, etctera.
Descomposicin microbiana
Durante mucho tiempo se pens que los mecanismos de
degradacin de los pesticidas por los microorganismos
eran similares a los de los animales. Pero a medida que
las investigaciones fueron progresando, se apreciaron las
diferencias:
pH
humedad%
densidad
(kg/m3)
N%
P%
K%
6-6,5
20-35
772
2,21
0,97
0,27
5,8-7,2
34-61
304-400
0,7
0-0,03
0,02-0,36
Residuos alimenticios
40
352
0,95
0,13-0,46
0,48-0,89
Slidos municipales
45
352-481
382
Lillian Frioni
pH : el ptimo se sita entre 6,0 y 7,5, los vegetales presentan en general reaccin cida que se puede corregir
agregando cal, ceniza vegetal u otro producto alcalino,
evitando que el pH pase de 8,0.
temperatura C
pH
70
8,0
50
7,0
30
6,0
los microorganismos, el objeto principal es la obtencin de energa y muy pocas molculas (algunos halogenados aromticos usados como insecticidas) no son
atacadas por algn grupo de microorganismo, en el suelo. Se propuso un esquema general sobre la accin de
los microorganismos y de procesos abiolgicos, sobre
los pesticidas (cuadro 6).
10
A
mesfila
B
termfila
C
mesfila
D
estabilizacin
hidrocarburos
Ms degradable
Menos degradable
alcanos superiores
(12 C)
alcanos
alifticos de
cadenas lineales
aromticos mono
y bi cclicos
alcanos de alto PM
alifticos ramificados
aromticos
policclicos
aromticos
aromticos
sustitudos
-OH
-COOH
-NH2
-OCH3
-F
-Cl
-Br
-NO2
alifticos
clorados
-Cl ms 6 C
-Cl menos 6 C
desde el C terminal
como glucosa, por ejemplo, que al disminuir en el medio inducen las enzimas necesarias para la degradacin del pesticida.
I. Enzimtico
A. Metabolismo incidental: los pesticidas no se usan directamente
como fuente de energa.
1. metabolismo por enzimas generalmente disponibles
a. enzimas de amplio espectro (hidrolasas, oxidasas, etc.)
b. enzimas especficas presentes en muchas especies
2. metabolismo inducido por productos anlogos (cometabolismo)
c. enzimas que emplean sustratos estructuralmente similares
a los de los pesticidas.
B. Catabolismo: los pesticidas se emplean como fuente de energa
d. pesticidas o parte de su molcula son rpidamente usados
e. deben inducirse enzimas especficas para su degradacin
C. Detoxificacin.
f. metabolismo por microorganismos resistentes
alcanos inferiores
II. No enzimtico
A. Participacin en reacciones fotoqumicas
B. Contribucin por cambios de pH
C. Por la produccin de reactantes orgnicos o inorgnicos
D. Por la produccin de cofactores
Una microflora especializada es responsable de la degradacin de los pesticidas mediante dos mecanismos diferentes:
I. la sustancia favorece el crecimiento y es empleada
como fuente de carbono, energa y ocasionalmente de
nitrgeno, azufre, etc. El nmero de especies activas
aumenta y el aislamiento se puede efectuar en medios
de cultivo en donde el pesticida acta como nica fuente de nutrientes. Una vez que el producto es degradado, la poblacin declina
II. cometabolismo: el compuesto no acta directamente
como fuente de nutrientes, sino que debe emplear otras,
399
txicas
degradacin, o transformacin de sustancias complejas en productos simples (puede ser sinnimo de mineralizacin, con aparicin de CO2, H2O, NH3, etc.)
400
Lillian Frioni
conjugacin
simplificacin:
O(CH2)3COOH
Cl
Cl
A
Cl
4(2,4 DB)
OH
D
Cl
B OCH COOH
2
Cl
Cl
2,4 Diclorofenol
Cl
A) Simplificacin (Flavobacterium)
B) Activacin en el suelo
C) Detoxificacin (suelo, Arthorobacter)
E) Degradacin (Pseudomonas, suelo)
pueden ser activados. As, el cianato de potasio y el dalapn se hidrolizan lentamente en agua, resultando entonces inefectivos como herbicidas. En suelos en ambiente anaerobio, la degradacin puede ser qumica y
microbiolgica.
Adsorcin a coloides
Son retenidos a la materia orgnica (humus) y a la fraccin arcilla, y los xidos e hidrxidos de hierro y aluminio juegan importante rol en suelos pobres en materia
orgnica. En escala descendente de capacidad de adsorcin tendramos: humus > montmorillonita > illita >
caolinita, pero intervienen tambin la temperatura, el pH,
la capacidad de intercambio catinico. Los enlaces pueden ser de naturaleza fsica (fuerzas de Van der Waals)
o electrostticos, por puentes de hidrgeno, sobre todo
en molculas con grupos -NH, como los fenilcarbamatos y las ureas sustituidas. Intervienen tambin enlaces
en complejos con iones metlicos, inactivndose muchas
molculas fijadas.
As, suelos con alto nivel de materia orgnica requieren dosis relativamente mayores de la mayora de los
herbicidas y suelos arcillosos niveles superiores a los
arenosos. Para predecir las dosis de herbicidas que es
necesario aplicar en varios tipos de suelos, se han desarrollado modelos matemticos. El nivel de materia
orgnica es uno de los parmetros del suelo que ofrece las mejores correlaciones entre la adsorcin de herbicidas y propiedades edficas. El carbn activado, uno
de los materiales absorbentes ms potentes, se emplea para proteger a las semillas de la accin de los
herbicidas.
E
Cl
2,4-D
CO2,H2O,Cl-
Descomposicin qumica
Mediante reacciones de oxidacin, reduccin o hidrlisis se pueden degradar pesticidas, mientras que otros
Lavado
Los herbicidas de pre-emergencia que se aplican generalmente en la superficie del suelo pueden ser llevados
por el agua a capas sub-superficiales donde germinan la
mayora de las semillas de malezas, que son as eliminadas por estas sustancias. Las semillas grandes deben
sembrarse debajo del rea de alta concentracin del herbicida, o bien ser resistentes a ellos. El grado de lixivia-
381
Materiales a compostar
Relacin C/N
15-18
10-14
12
4-10
3-9
5.5-6.5
5-6
2-4
4
2-4
3-5
1.9
1.0-1.8
0.6
0.4-0.1
0.3
0.1
0
0.8
3
ND
4-5
3-15
6-10
6
8
ND
12
15
ND
ND
80
40-80
150
500
infinito
Un compost con materiales de C/N inferior a 30/1conducen a prdidas de N como amonio, agravadas si el pH
es alcalino. En este caso, se agregan materiales ricos
en C, como pajas, para elevar la relacin C/N o tierra,
arcillas o fertilizantes minerales que pueden retener el
amonio.
Al final del compostaje la mayor parte del N est en for
ma de NO3 en solucin que puede ser removido por el
agua y aprovechado por las plantas. Tambin puede
ocurrir fijacin de N2 atmosfrico por microorganismos
especializados, en compost estabilizados, sin presencia
de N amoniacal.
Granulometra: sta se adeca moliendo los materiales
gruesos o agregando restos como pajas en residuos de
granulometra fina como los lodos residuales u otros sustratos con tendencia a compactarse. Tambin se pueden
agregar materiales no degradables, como esferas porosas de arcillas, plstico, goma.
420
Lillian Frioni
Microscopa
Colocar
la preparacin
Abrir
Colocar
Volatilizacin
el condensador hasta distinguir ntidos los contornos del polgono, si la imagen no est en el centro, centrarla y ajustar el enfoque
Persistencia en el ambiente
Como hemos visto depende del tipo del suelo, de la calidad
de las aguas, la temperatura, la humedad, materia orgnica, coloides minerales, actividad biolgica. Se puede evaluar en ensayos controlados o de campo. Se citan datos de
que slo un 27 % de la variabilidad encontrada en las prdidas de Picloram en 11 suelos, en condiciones controladas,
pudo relacionarse a las propiedades de los mismos. El cuadro 7 (Stevenson y Cole, 1999) muestra la gran persistencia de insecticidas organoclorados, sobretodo DDT. Como
resultado de su pobre degradacin, su empleo est muy
restringido y aun prohibida su produccin y distribucin. La
frmula de algunos de los ms persistentes pesticidas se
presentan en la figura 3 (Alexander, 1994).
Minimizar
el material sobre las mesadas, las que se desinfectan con alcohol al comienzo y al final de la tarea
No
401
Fotodescomposicin
Muchos herbicidas absorben en el rango del ultravioleta, pero la radiacin solar con longitudes de onda menores de 295 nm que llega al suelo es despreciable. El
efecto sobre los biocidas est limitado a la superficie de
suelos y aguas; slo sern atacados (liberacin de electrones, formacin de puentes) los pesticidas no incorporados o los que ascienden por capilaridad en pocas
secas. Puede ocurrir tambin cierta sensibilizacin:
la energa es absorbida por un intermediario y transferida a la molcula herbicida por colisin, la que es as
daada. Los productos de la fotodescomposicin pueden ser similares a los obtenidos por degradacin.
Persistencia en el suelo
Meses Aos
Insecticidas fosforados
3
Herbicidas con cidos alifticos y carbamatos
3
Herbicidas con grupos nitrito, fenoxi, toluidina
6
Herbicidas con cido benzoico, amidas
12
Herbicidas derivados de la urea, triazina, picloram 18
Insecticidas organoclorados
Chlordano
Ms de 18
DDT
Dieldrin
Aldrin
hetacloro
5
4
3
2
402
Lillian Frioni
te varios aos, se obtienen mediante modelos de prediccin, curvas de desaparicin simuladas de estas sustancias.
En general, la concordancia entre valores observados y
simulados es buena y su empleo resulta muy til, sobre
todo si se consideran las dificultades en la toma de muestras representativas en el campo, la variabilidad asociada
en la determinacin de cantidades pequeas, etc.
grados de susceptibilidad: una especie puede declinar apreciablemente, una segunda puede alterarse slo
ligeramente y otras pueden resistir el efecto del pesticida. Las hifas de los hongos y las clulas vegetativas de
las bacterias son an ms afectadas que los conidios o
esclerocios de los hongos o que las endosporas bacterianas
N-orgnico
maciones de compuestos nitrogenados, se puede generalizar que, salvo en el caso de fungicidas presentes
en el suelo en alta concentracin, la mineralizacin y
la desnitrificacin no son muy afectadas, mientras que
la nitrificacin es uno de los procesos ms sensibles,
acumulndose amonio. Esta sensibilidad de los nitrificantes auttrofos se usa para evaluar los efectos txicos de diferentes dosis de pesticidas, mediante la evaluacin de los nitratos
Transferir
Inoculante
ninguno
Rhizobio sensible
Rhizobio resistente
Semillas no tratadas
rendimiento
N
rendimiento
alfalfa con thiram
270
280
490
5,9
6,6
13,2
290
440
500
N
6,8
12,2
14,6
modificacin
ninguno
Rhizobio sensible
Rhizobio resistente
1150
1820
3930
21,7
36,4
105
1100
3820
3790
23,2
97,0
106
N-NH4
Conectar
Efectos
419
418
Lillian Frioni
C-orgnico
El C-orgnico del suelo es oxidado por tratamiento con
dicromato de potasio y cido sulfrico concentrado en
caliente. El Cr+3 liberado se determina coloromtricamente y se asume que es proporcional a la materia orgnica
del suelo
Procedimiento
a) Colocar suelo fresco en las cajas, pesar las mismas
(una cifra despus de la coma) = Peso Fresco (PF)
Diluir
contenido de C de alcuotas de las soluciones estandares, por ejemplo entre 0 y 1mg/mL de solucin por el mismo procedimiento que las muestras de
suelo analizadas
La nodulacin y la fijacin del nitrgeno en leguminosas pueden ser afectadas por pesticidas, sobre todo por
aquellos aplicados a las semillas que adems se inoculan
con rhizobios especficos. Se propone separar en el tiempo las aplicaciones de inoculante y fungicida o trabajar
con mutantes de rizobios resistentes a los pesticidas ms
empleados. El cuadro 8 evidencia la importancia de esta
lnea de trabajo.
Se inform de marcada inhibicin de la actividad nitrogensica en la rizosfera de 25 variedades de sorgo,
cuando se emplearon dosis tres veces superiores a las
normales de atrazina (4,5 kg/ha)(Frioni, 1999), efecto
que desapareci en otro ensayo de campo, en Argentina, sin herbicida. En el mismo cultivo, se comprob en
otro ensayo con aplicaciones de distintas dosis de tres
herbicidas: atrazina, linurn y 2,4-D amina, que la celulolisis fue inhibida por todos los tratamientos pesticidas. Este efecto fue observado por otros autores y se
atribuye a la falta de sustratos carbonados (las malezas son suprimidas) y a una inhibicin selectiva de la
celulasa.
Numerosas revisiones incluyen determinaciones de efectos sobre procesos biolgicos como respiracin, mineralizacin del nitrgeno, nitrificacin, datos sobre recuentos de ciertos grupos de microorganismos, evaluacin
del ATP de origen microbiano, enzimas especficas (deshidrogenasas, celulasa, amilasa, etc.), fijacin del nitrgeno. Se propuso un programa de anlisis a los que
deben ser sometidos los pesticidas antes de que su distribucin sea autorizada por autoridades competentes,
donde se incluyen estudios sobre la poblacin normal
del suelo, adems de los clsicos controles sobre sanidad humana y vegetal:
1. Actividad respiratoria (CO2, O2) evaluada en el laboratorio en muestras de suelo: sin aditivos (respiracin endgena), con glucosa (proceso activado por el
desarrollo microbiano) y con restos vegetales (degradacin de materia orgnica compleja por sucesiones
microbianas).
2. Transformaciones del nitrgeno: amonificacin, nitrificacin.
403
404
Lillian Frioni
Xenobiticos inorgnicos
Muchos compuestos inorgnicos se forman como desechos en las industrias modernas, como anhdridos de S y
N y las sales de metales pesados, que se consideran xenobiticos por la elevada concentracin liberada en ambientes naturales, sobre todo aguas y suelo y los efectos
deletreos que ejercen en la biosfera. A pesar de que
muchos metales son abundantes en la corteza de la tierra, las actividades del hombre, como la combustin de
petrleo y derivados, minas y prcticas agrcolas, frecuentemente incrementan su concentracin a niveles txicos.
Entre los metales txicos a alta concentracin se incluye
el arsnico, boro, cadmio, cromo, cobre, plomo, mercurio,
molibdeno, nquel, selenio, zinc, vanadio.
La aplicacin de abonos orgnicos puede conducir a la
acumulacin de metales en el suelo, muchos de los cuales pueden ser txicos para los animales y el hombre.
El cuadro 9 (Stevenson y Cole, 1999) presenta los niveles
en minerales en abonos obtenidos por biodegradacin
anaerobia y por compostaje.
Biofertilizante
Compost
As
Cd
Cr
Hg
Ni
6-230
4-846
17-99.000
1-10.600
10-3.500
1-4,8
1-13,2
8,2-130
0,5-3,7
7-100
Pb
13-19.700
22-913
417
Los microorganismos poseen la capacidad de transformar elementos minerales, por ejemplo, al usarlos
como fuente de energa (Fe++ a Fe+++ por Thiobacillus),
aceptor de electrones (Mn+4 a Mn+2 por Bacillus), oxidacin (As), alquilacin (CH3- + Hg+2 CH3Hg-, por
Clostridium).
Anexo prctico
Muestreo y anlisis fsico-qumicos
Muestreo de suelos, aguas, alimentos, conservacin de
las muestras, humedad:
Nitrgeno: Fijacin biolgica del N 2 (FBN), mineralizacin: amonificacin, nitrificacin. Prdidas: desnitrificacin
Azufre: sulfooxidacin, sulfatorreduccin
Biodegradacin de residuos
Evaluacin del grado de madurez de compost
Bibliografa
416
Lillian Frioni
Cunningham, S. D. Y Lee, C.R. Phytoremediation: Plantbased remediation of contaminated soils and sediments. En: Bioremediation: Science and Applications.
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Hickey, W. J. Biochemistry and Metabolism of Xenobiotic Chemicals. En: Principles and Applications of
Soil Microbiology. 1998 Sylvia, Fuhrmann, Hartel y
Zuberer (eds), Prentice Hall, N. Jersey: 447-468
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Siqueira, J. O., F. M. de S. Moreira, B. M. Grisi, M. Hungria y R. S. Araujo Microorganisms e Processos
Biolgicos do Solo: Perspectiva Ambiental, 1994,
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Skipper, H. D. Bioremediation of Contamined Soils. En:
Principles and Applications of Soil Microbiology.
1998, Sylvia, Fuhrmann, Hartel y Zuberer (eds), Prentice Hall, N. Jersey: 469-481
Preguntas de repaso
1) Defina el trmino biorremediacin
2) En qu situaciones estos procedimientos son de aplicacin ventajosa en relacin a otros posibles?
3) Concepto de los trminos: bioaumentacin y bioestimulacin. Ejemplos de sus aplicaciones
4) Analice el caso de inoculacin con microorganismos
seleccionados
5) Explique brevemente estrategias para obtener estos
microorganismos disponibles para la inoculacin de
grandes reas contaminadas
6) Empleo de vegetales en la biorremediacin. Mecanismos involucrados
7) Discuta los procesos de degradacin de un polucionante por metabolismo normal y por cometabolismo.
8) Por qu conviene seleccionar vegetales (rboles y/o
herbceas) fijadoras de nitrgeno en la depuracin de
ambientes contaminados?
9) Cul es el destino de metales pesados en caso de la
fitorremediacin por rboles?
No ocurre lo mismo con rboles, ya que los metales quedan en la madera, que no integra la cadena trfica.
Resumen: grandes cantidades de residuos se generan
cada ao por actividades domsticas, agrcolas e industriales que deben ser manejados a los efectos de evitar
severos efectos contaminantes en el ambiente. Un conjunto de sustancias qumicas, conocidas como recalcitrantes, de muy lenta degradacin son introducidas deliberadamente o por accidente en los causes de aguas y en los
suelos y pueden persistir por largos perodos de tiempo.
Su persistencia es incrementada por su adsorcin a la
materia orgnica o a la fraccin mineral del suelo. Resulta
de suma importancia el conocimiento de los efectos de
una nueva sustancia, por ejemplo un pesticida, sobre los
principales grupos y procesos microbianos, adems de
manifestar su inocuidad sobre el hombre, antes de recomendar su comercializacin y empleo.
Bibliografa
Alexander, M. Biodegradation and bioremediation. 1994
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Stevenson, F. J. y Cole, M. A. Cycles of Soil, Carbon,
Nitrogen, Phosphorus, Sulfur, Micronutrients, 1999,
Wiley & Sons, New York
Preguntas de repaso
1) Cite ejemplos de sustancias denominadas recalcitrantes, de origen natural y sintticas
2) Qu destino tienen en la naturaleza?
3) Alternativas de biodegradacin de pesticidas en el suelo
4) Mecanismos fsicos, qumicos y biolgicos que puedan
explicar la desaparicin de un pesticida agregado al
suelo
5) Por qu los microorganismos son usados como organismos test para determinar el efecto de un nuevo producto a ser liberado a la naturaleza?
6) Seale algn mtodo que permita evaluar el efecto de
una nueva sustancia usada como fertilizante, en la microflora del suelo
7) Discuta los procesos de degradacin de un polucionante por metabolismo normal y por cometabolismo
8) En qu situaciones puede incrementarse el nivel de
metales pesados en un suelo?
9) Precauciones a tener en cuenta al respecto:
10) Seale algn mecanismo para la eliminacin de metales (Cd, Hg, Cr) del suelo
406
Lillian Frioni
con: bacterias simbiticas, hongos micorrcicos, microorganismos promotores del crecimiento vegetal y componentes de la microfauna
415
controla
no
se sabe aun si el carcter de FBN mejora o no la adaptabilidad y el rol depurador de la vegetacin leosa
En el caso de la absorcin directa, las molculas pequeas, de bajo peso molecular son favorecidas en relacin
a las de mayor peso molecular ya que las ltimas, sobretodo si son lipoflicas, tienden a ser excluidas de la
zona radical.
En resumen: Se analizaron procedimientos biolgicos
para lograr restaurar suelos y aguas contaminados, la
mayora de las veces por actividades del hombre, que
es necesario llevar a un estado saludable. Los abordajes incluyen remediacin pasiva o activa, con aditivos de fertilizantes, control de la humedad y temperatura, incorporacin de gases a presin (O 2, CH4), oxidantes (H2O2), compostaje, rellenos sanitarios y fitorremediacin.
La literatura abunda en situaciones particulares con abordajes realizados en general, por empresas dedicadas a
Se requieren an mayores estudios para manejar las interacciones biolgicas, fsicas y qumicas en ambientes
con mezcla compleja de contaminantes.
Bibliografa
Alexander, M. Biodegradation and bioremediation. 1994 Academic Press, San Diego, California, USA
Baker, K. H. and Herson, D.S. Bioremediation, 1994,
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Bouwer, E. J. Bioremediation of organic contaminants in
the subsurface. En: Environmental Microbiology,
1993, Wiley-Liss, New York: 287-318
414
Lillian Frioni
407
Fitovolatilizacin
Remocin de los
contaminantes del suelo y
liberacin a la atmsfera
Rizodegradacin
Metabolismo microbiano
del contaminante en la
rizosfera
Fitoextraccin
Extarccin de
contaminantes por los
vegetales
Arboles en fitorremediacin
A estas especies se les requiere:
i) que produzcan una biomasa radical muy desarrollada
capaz de estimular la actividad microbiana rizosfrica
ii) que presenten genes que secuestren metales pesados o degraden sustancias indeseables (fenoles halogenados)
i) empleo de hbridos de lamos en zona talada para convertirla a la agricultura, redujeron los nitratos un aguas
subterrneas de 50-100 a 5 mgL-1, y eliminaron el 20%
de la atrazina
23
Biorremediacin
mineralizacin
humificacin
compostaje
tos polucionantes del suelo se consideran factibles de biodegradacin microbiana, por lo que la bioremediacin se
aplica en ambientes contaminados por:
derramamiento de petrleo bruto e hidrocarburos derivados (benceno, xileno, tolueno, policclicos, etc.)
Estos contaminantes son introducidos a ambientes naturales por las actividades del hombre. Algunos entran intencionalmente al suelo, como los pesticidas, o accidentalmente, como los hidrocarburos, por prdidas de tanques, fugas en los sistemas de transporte.
Si bien en nuestro pas, este no es un problema muy grave, han ocurrido accidentes en relacin a derrames de
petrleo en el Ro de la Plata, contaminacin por plomo
en suelos y fugas de tanques de hidrocarburos en estaciones de servicio.
En USA, el servicio de proteccin ambiental (EPA) estima
que los tanques de gasolina pierden unos 40 millones de
408
Lillian Frioni
litros por ao, adems de salir al mercado unos 1.000 productos qumicos nuevos al ao. Dado estos volmenes
se comprende la necesidad de accin de verdaderas industrias para la depuracin de suelos y aguas y la proteccin del ambiente
Biorremediacin: Empleo de microorganismos, plantas o enzimas para la depuracin de polucionantes en distintos ambientes
Los contaminantes deben estar biodisponibles, es decir no adsorbido en un residuo inaccesible (arcillas, humus)
reunirse condiciones ambientales favorables para el desarrollo microbiano: temperatura del suelo, pH, aireacin, humedad
Puede
estimulacin
El costo del tratamiento debe ser menor que el de las otras tec-
Biorremadiacin natural
nologas disponibles
Control de la biodegradacin
413
Fitorremediacin
Algunas plantas exhiben una tolerancia excepcionalmente
alta a elementos minerales y son capaces de acumularlos
en sus tejidos. Estas plantas acumuladoras son en general
indgenas en un suelo particular o roca madre y se emplean para depuracin de suelos contaminados.
Una estrategia muy utilizada en la actualidad, consistente
en recrear en el sitio contaminado una comunidad planta/
microorganismos capaces de tolerar el polucionante y
participar en su eliminacin (cuadro 8, figura 3). Se asegura la degradacin de polucionantes orgnicas por plantas o microorganismos asociados (hongos micorrcicos,
metanotrficos, bacterias rizosfricas). Tambin se estn
desarrollando tcnicas genticas para producir plantas con
la capacidad de degradar atrazina y otros pesticidas. Las
plantas extraen los contaminantes, se cosechan y procesan en forma controlada (reciclaje).
412
Lillian Frioni
El cuadro 6 resume el efecto del ambiente y caractersticas de los microorgnamismos en la degradacin de hidrocarburos
microorganismo
+ N-P-K
n C-17
n C-22
n C-27
n C-34
requisito
capacidad de degradar el HC, para
contribuir a la bioemulsificacin
capacidad de FBN
nutrientes accesorios (N,P,K,Fe)
disponibles en la misma ubicacin
fsica que los microorganismos y
el hidrocarburo
ausencia de metales pesados, que
puedan daarlos
temperatura, pH en el rango
adecuado, etc.
Pastillas
Variedad de bacterias, ciertos hongos y levaduras y cianobacterias pueden oxidar HC: colonizan las gotas oleosas en superficie
ganismos indgenas.
Bioestimulacin: adicin de nutrientes, N, P, S, etc. para incre-
Fitorremediacin: empleo
No N-P-K
n C-12
entorno
409
industrial, por lo cual los suelos contaminados se transportan y depositan en estructuras del tipo de los biodigestores, con las instalaciones adecuadas para la entrada
pasiva o forzada de gases.
La bioaumentacin, es la inoculacin del sitio contaminado con microorganismos seleccionados para estimular
la degradacin. Los inoculantes pueden estar formados
por microorganismos nativos seleccionados para el proceso en cuestin o bien se pueden usar aquellos genticamente modificados, a los cuales por ingeniera gentica se les incorporaron genes activos en la biodegradacin. Puede tratarse de una sola especie o de varias especies (consorcio microbiano).
Los mismos se seleccionan en el laboratorio, inoculando con suelo o aguas, medios de cultivo con dosis crecientes de la sustancia txica en estudio, por ejemplo,
hidrocarburos, como nica fuente de C y energa. Las
colonias que se desarrollan en estos medios, se van seleccionando por su capacidad degradadora sobre el xenobitico.
Rellenos sanitarios, consisten en la aplicacin e incorporacin de suelos contaminados en la superficie de suelos no contaminados. Son en general excavaciones de
suelos muy pobres, con un fondo de arcillas o algn material impermeable, para evitar la contaminacin de las
napas freticas. El suelo contaminado es arado y se mezcla bien, pudindose incorporar nutrientes, inculo microbiano y gases, para acelerar el proceso.
Compostaje, es el uso de procesos microbianos aerobios y termfilos en pilas o reactores, para degradar el
polucionante. Los dispositivos se mezclan peridicamente y se humedecen a los efectos de lograr la mxima actividad biolgica. Los microorganismos activos se encuentran en el suelo y son incrementados por el proceso de
compostaje.
Fitorremediacin, es el empleo de vegetales para absorber, remover o transformar contaminantes. Son muy
empleadas en el caso de remocin de metales pesados,
que se acumulan en la madera en el caso de rboles o en
la fitomasa en herbcea, que debe tratarse luego en incineradores.
410
Lillian Frioni
La accin se da directamente, en plantas hiperacumulantes, o indirectamente, por estimulacin de microorganismos activos en su rizosfera.
Como vimos en el captulo anterior, en la degradacin de
una molcula recalcitrante es necesario tener en cuenta
sus caractersticas (peso molecular, solubilidad en agua y
en otros solventes, sustituyentes halogenados, etc.) y las
condiciones del ambiente.
HCl
CO2
(aire y metano)
Inyeccin
Gas natural
Compresor
Casos
Vaco
Calor
Recuperacin de metales a partir de minerales con niveles muy bajos de los mismos, no aptos para fundicin. Se emplea Thiobacillus ferrooxidans y otros microorganismos, cuya gran produccin de cido permite
extraer un 70% del hierro (biolixiviacin)
CuSO4 + Fe Cu + FeSO4
Zona
contaminada
Zona saturada
en agua
Estructura del suelo, se favorece por agregado de aditivos (pajas, arcillas) o por mezclado con arados o aireacin
Ejemplos de biorremediacin
USA: decontaminacin de suelos con TCE (tricloroetile-
Se resumen a continuacin algunos de los mltiples casos de biorremediacin sealados en la bibliografa (Eccles, 2003), que por otra parte es muy numerosa en la
actualidad. El tratamiento es en general realizado por
empresas dedicadas a la conservacin del ambiente.
Cualquiera sea la estrategia abordada, tendrn mayor inters aquellas en las cuales se obtiene un producto valorizado, que se pueda recuperar y redunde en ingresos
econmicos, como es el caso de realizar compostaje o
fitorremediacin.
Los tratamientos, adems, debern competir en eficiencia, rapidez, seguridad y costos, con los procedimientos
fsicos (empleo de solventes, extraccin mecnica, etc.)
y qumicos (cidos, lcalis), empleados tambin en la
actualidad.
411
especiales: inoculacin
soluble (3g/L)
USA: derrame de 4.000 L de diesel (45% alcanos cclicos, 30% normales y 24% aromticos). En 6
meses, la contaminacin baj a menos de 10-1.500 mg
HC/kg suelo. Microorganismos degradadores nativos +
nutrientes (N, S) y H2O2 se mezclaron con agua y se
inyectaron cada 2 semanas por 4 meses
USA: derrame de 10.000 m3 atrazina en rea
de 8 ha. Se efectu relleno sanitario arando 4 veces/
semana. Se agregaron 880kg fert/ha (N,P,K 13-13-13)+
2.000 L de inoculante de un consorcio de microorganismos degradadores (en 20 semanas, la atrazina bajo de
100 mg/kg a menos de 10 mg/kg, con variaciones en
las unidades por mezclado incompleto)
Lousiana,
En
Caso del Exxon Valdez: en marzo de 1989 se derramaron 40 millones de litros de petrleo puro en Prince
William, Alaska. Cerca de 1.600 Km de costa se afectaron y la limpieza total cost 1.500 millones de dlares.
Constituye un caso muy conocido por el impacto causado en el ambiente, superado lamentablemente por el
ocurrido en Galicia, Espaa, en el 2003.
410
Lillian Frioni
La accin se da directamente, en plantas hiperacumulantes, o indirectamente, por estimulacin de microorganismos activos en su rizosfera.
Como vimos en el captulo anterior, en la degradacin de
una molcula recalcitrante es necesario tener en cuenta
sus caractersticas (peso molecular, solubilidad en agua y
en otros solventes, sustituyentes halogenados, etc.) y las
condiciones del ambiente.
HCl
CO2
(aire y metano)
Inyeccin
Gas natural
Compresor
Casos
Vaco
Calor
Recuperacin de metales a partir de minerales con niveles muy bajos de los mismos, no aptos para fundicin. Se emplea Thiobacillus ferrooxidans y otros microorganismos, cuya gran produccin de cido permite
extraer un 70% del hierro (biolixiviacin)
CuSO4 + Fe Cu + FeSO4
Zona
contaminada
Zona saturada
en agua
Estructura del suelo, se favorece por agregado de aditivos (pajas, arcillas) o por mezclado con arados o aireacin
Ejemplos de biorremediacin
USA: decontaminacin de suelos con TCE (tricloroetile-
Se resumen a continuacin algunos de los mltiples casos de biorremediacin sealados en la bibliografa (Eccles, 2003), que por otra parte es muy numerosa en la
actualidad. El tratamiento es en general realizado por
empresas dedicadas a la conservacin del ambiente.
Cualquiera sea la estrategia abordada, tendrn mayor inters aquellas en las cuales se obtiene un producto valorizado, que se pueda recuperar y redunde en ingresos
econmicos, como es el caso de realizar compostaje o
fitorremediacin.
Los tratamientos, adems, debern competir en eficiencia, rapidez, seguridad y costos, con los procedimientos
fsicos (empleo de solventes, extraccin mecnica, etc.)
y qumicos (cidos, lcalis), empleados tambin en la
actualidad.
411
especiales: inoculacin
soluble (3g/L)
USA: derrame de 4.000 L de diesel (45% alcanos cclicos, 30% normales y 24% aromticos). En 6
meses, la contaminacin baj a menos de 10-1.500 mg
HC/kg suelo. Microorganismos degradadores nativos +
nutrientes (N, S) y H2O2 se mezclaron con agua y se
inyectaron cada 2 semanas por 4 meses
USA: derrame de 10.000 m3 atrazina en rea
de 8 ha. Se efectu relleno sanitario arando 4 veces/
semana. Se agregaron 880kg fert/ha (N,P,K 13-13-13)+
2.000 L de inoculante de un consorcio de microorganismos degradadores (en 20 semanas, la atrazina bajo de
100 mg/kg a menos de 10 mg/kg, con variaciones en
las unidades por mezclado incompleto)
Lousiana,
En
Caso del Exxon Valdez: en marzo de 1989 se derramaron 40 millones de litros de petrleo puro en Prince
William, Alaska. Cerca de 1.600 Km de costa se afectaron y la limpieza total cost 1.500 millones de dlares.
Constituye un caso muy conocido por el impacto causado en el ambiente, superado lamentablemente por el
ocurrido en Galicia, Espaa, en el 2003.
412
Lillian Frioni
El cuadro 6 resume el efecto del ambiente y caractersticas de los microorgnamismos en la degradacin de hidrocarburos
microorganismo
+ N-P-K
n C-17
n C-22
n C-27
n C-34
requisito
capacidad de degradar el HC, para
contribuir a la bioemulsificacin
capacidad de FBN
nutrientes accesorios (N,P,K,Fe)
disponibles en la misma ubicacin
fsica que los microorganismos y
el hidrocarburo
ausencia de metales pesados, que
puedan daarlos
temperatura, pH en el rango
adecuado, etc.
Pastillas
Variedad de bacterias, ciertos hongos y levaduras y cianobacterias pueden oxidar HC: colonizan las gotas oleosas en superficie
ganismos indgenas.
Bioestimulacin: adicin de nutrientes, N, P, S, etc. para incre-
Fitorremediacin: empleo
No N-P-K
n C-12
entorno
409
industrial, por lo cual los suelos contaminados se transportan y depositan en estructuras del tipo de los biodigestores, con las instalaciones adecuadas para la entrada
pasiva o forzada de gases.
La bioaumentacin, es la inoculacin del sitio contaminado con microorganismos seleccionados para estimular
la degradacin. Los inoculantes pueden estar formados
por microorganismos nativos seleccionados para el proceso en cuestin o bien se pueden usar aquellos genticamente modificados, a los cuales por ingeniera gentica se les incorporaron genes activos en la biodegradacin. Puede tratarse de una sola especie o de varias especies (consorcio microbiano).
Los mismos se seleccionan en el laboratorio, inoculando con suelo o aguas, medios de cultivo con dosis crecientes de la sustancia txica en estudio, por ejemplo,
hidrocarburos, como nica fuente de C y energa. Las
colonias que se desarrollan en estos medios, se van seleccionando por su capacidad degradadora sobre el xenobitico.
Rellenos sanitarios, consisten en la aplicacin e incorporacin de suelos contaminados en la superficie de suelos no contaminados. Son en general excavaciones de
suelos muy pobres, con un fondo de arcillas o algn material impermeable, para evitar la contaminacin de las
napas freticas. El suelo contaminado es arado y se mezcla bien, pudindose incorporar nutrientes, inculo microbiano y gases, para acelerar el proceso.
Compostaje, es el uso de procesos microbianos aerobios y termfilos en pilas o reactores, para degradar el
polucionante. Los dispositivos se mezclan peridicamente y se humedecen a los efectos de lograr la mxima actividad biolgica. Los microorganismos activos se encuentran en el suelo y son incrementados por el proceso de
compostaje.
Fitorremediacin, es el empleo de vegetales para absorber, remover o transformar contaminantes. Son muy
empleadas en el caso de remocin de metales pesados,
que se acumulan en la madera en el caso de rboles o en
la fitomasa en herbcea, que debe tratarse luego en incineradores.
408
Lillian Frioni
litros por ao, adems de salir al mercado unos 1.000 productos qumicos nuevos al ao. Dado estos volmenes
se comprende la necesidad de accin de verdaderas industrias para la depuracin de suelos y aguas y la proteccin del ambiente
Biorremediacin: Empleo de microorganismos, plantas o enzimas para la depuracin de polucionantes en distintos ambientes
Los contaminantes deben estar biodisponibles, es decir no adsorbido en un residuo inaccesible (arcillas, humus)
reunirse condiciones ambientales favorables para el desarrollo microbiano: temperatura del suelo, pH, aireacin, humedad
Puede
estimulacin
El costo del tratamiento debe ser menor que el de las otras tec-
Biorremadiacin natural
nologas disponibles
Control de la biodegradacin
413
Fitorremediacin
Algunas plantas exhiben una tolerancia excepcionalmente
alta a elementos minerales y son capaces de acumularlos
en sus tejidos. Estas plantas acumuladoras son en general
indgenas en un suelo particular o roca madre y se emplean para depuracin de suelos contaminados.
Una estrategia muy utilizada en la actualidad, consistente
en recrear en el sitio contaminado una comunidad planta/
microorganismos capaces de tolerar el polucionante y
participar en su eliminacin (cuadro 8, figura 3). Se asegura la degradacin de polucionantes orgnicas por plantas o microorganismos asociados (hongos micorrcicos,
metanotrficos, bacterias rizosfricas). Tambin se estn
desarrollando tcnicas genticas para producir plantas con
la capacidad de degradar atrazina y otros pesticidas. Las
plantas extraen los contaminantes, se cosechan y procesan en forma controlada (reciclaje).
414
Lillian Frioni
407
Fitovolatilizacin
Remocin de los
contaminantes del suelo y
liberacin a la atmsfera
Rizodegradacin
Metabolismo microbiano
del contaminante en la
rizosfera
Fitoextraccin
Extarccin de
contaminantes por los
vegetales
Arboles en fitorremediacin
A estas especies se les requiere:
i) que produzcan una biomasa radical muy desarrollada
capaz de estimular la actividad microbiana rizosfrica
ii) que presenten genes que secuestren metales pesados o degraden sustancias indeseables (fenoles halogenados)
i) empleo de hbridos de lamos en zona talada para convertirla a la agricultura, redujeron los nitratos un aguas
subterrneas de 50-100 a 5 mgL-1, y eliminaron el 20%
de la atrazina
23
Biorremediacin
mineralizacin
humificacin
compostaje
tos polucionantes del suelo se consideran factibles de biodegradacin microbiana, por lo que la bioremediacin se
aplica en ambientes contaminados por:
derramamiento de petrleo bruto e hidrocarburos derivados (benceno, xileno, tolueno, policclicos, etc.)
Estos contaminantes son introducidos a ambientes naturales por las actividades del hombre. Algunos entran intencionalmente al suelo, como los pesticidas, o accidentalmente, como los hidrocarburos, por prdidas de tanques, fugas en los sistemas de transporte.
Si bien en nuestro pas, este no es un problema muy grave, han ocurrido accidentes en relacin a derrames de
petrleo en el Ro de la Plata, contaminacin por plomo
en suelos y fugas de tanques de hidrocarburos en estaciones de servicio.
En USA, el servicio de proteccin ambiental (EPA) estima
que los tanques de gasolina pierden unos 40 millones de
406
Lillian Frioni
con: bacterias simbiticas, hongos micorrcicos, microorganismos promotores del crecimiento vegetal y componentes de la microfauna
415
controla
no
se sabe aun si el carcter de FBN mejora o no la adaptabilidad y el rol depurador de la vegetacin leosa
En el caso de la absorcin directa, las molculas pequeas, de bajo peso molecular son favorecidas en relacin
a las de mayor peso molecular ya que las ltimas, sobretodo si son lipoflicas, tienden a ser excluidas de la
zona radical.
En resumen: Se analizaron procedimientos biolgicos
para lograr restaurar suelos y aguas contaminados, la
mayora de las veces por actividades del hombre, que
es necesario llevar a un estado saludable. Los abordajes incluyen remediacin pasiva o activa, con aditivos de fertilizantes, control de la humedad y temperatura, incorporacin de gases a presin (O 2, CH4), oxidantes (H2O2), compostaje, rellenos sanitarios y fitorremediacin.
La literatura abunda en situaciones particulares con abordajes realizados en general, por empresas dedicadas a
Se requieren an mayores estudios para manejar las interacciones biolgicas, fsicas y qumicas en ambientes
con mezcla compleja de contaminantes.
Bibliografa
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416
Lillian Frioni
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Preguntas de repaso
1) Defina el trmino biorremediacin
2) En qu situaciones estos procedimientos son de aplicacin ventajosa en relacin a otros posibles?
3) Concepto de los trminos: bioaumentacin y bioestimulacin. Ejemplos de sus aplicaciones
4) Analice el caso de inoculacin con microorganismos
seleccionados
5) Explique brevemente estrategias para obtener estos
microorganismos disponibles para la inoculacin de
grandes reas contaminadas
6) Empleo de vegetales en la biorremediacin. Mecanismos involucrados
7) Discuta los procesos de degradacin de un polucionante por metabolismo normal y por cometabolismo.
8) Por qu conviene seleccionar vegetales (rboles y/o
herbceas) fijadoras de nitrgeno en la depuracin de
ambientes contaminados?
9) Cul es el destino de metales pesados en caso de la
fitorremediacin por rboles?
No ocurre lo mismo con rboles, ya que los metales quedan en la madera, que no integra la cadena trfica.
Resumen: grandes cantidades de residuos se generan
cada ao por actividades domsticas, agrcolas e industriales que deben ser manejados a los efectos de evitar
severos efectos contaminantes en el ambiente. Un conjunto de sustancias qumicas, conocidas como recalcitrantes, de muy lenta degradacin son introducidas deliberadamente o por accidente en los causes de aguas y en los
suelos y pueden persistir por largos perodos de tiempo.
Su persistencia es incrementada por su adsorcin a la
materia orgnica o a la fraccin mineral del suelo. Resulta
de suma importancia el conocimiento de los efectos de
una nueva sustancia, por ejemplo un pesticida, sobre los
principales grupos y procesos microbianos, adems de
manifestar su inocuidad sobre el hombre, antes de recomendar su comercializacin y empleo.
Bibliografa
Alexander, M. Biodegradation and bioremediation. 1994
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Alexander, M. Introduccin a la microbiologa del suelo.1994. AGT Editor, S.A. 491 pp.
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Stevenson, F. J. y Cole, M. A. Cycles of Soil, Carbon,
Nitrogen, Phosphorus, Sulfur, Micronutrients, 1999,
Wiley & Sons, New York
Preguntas de repaso
1) Cite ejemplos de sustancias denominadas recalcitrantes, de origen natural y sintticas
2) Qu destino tienen en la naturaleza?
3) Alternativas de biodegradacin de pesticidas en el suelo
4) Mecanismos fsicos, qumicos y biolgicos que puedan
explicar la desaparicin de un pesticida agregado al
suelo
5) Por qu los microorganismos son usados como organismos test para determinar el efecto de un nuevo producto a ser liberado a la naturaleza?
6) Seale algn mtodo que permita evaluar el efecto de
una nueva sustancia usada como fertilizante, en la microflora del suelo
7) Discuta los procesos de degradacin de un polucionante por metabolismo normal y por cometabolismo
8) En qu situaciones puede incrementarse el nivel de
metales pesados en un suelo?
9) Precauciones a tener en cuenta al respecto:
10) Seale algn mecanismo para la eliminacin de metales (Cd, Hg, Cr) del suelo
404
Lillian Frioni
Xenobiticos inorgnicos
Muchos compuestos inorgnicos se forman como desechos en las industrias modernas, como anhdridos de S y
N y las sales de metales pesados, que se consideran xenobiticos por la elevada concentracin liberada en ambientes naturales, sobre todo aguas y suelo y los efectos
deletreos que ejercen en la biosfera. A pesar de que
muchos metales son abundantes en la corteza de la tierra, las actividades del hombre, como la combustin de
petrleo y derivados, minas y prcticas agrcolas, frecuentemente incrementan su concentracin a niveles txicos.
Entre los metales txicos a alta concentracin se incluye
el arsnico, boro, cadmio, cromo, cobre, plomo, mercurio,
molibdeno, nquel, selenio, zinc, vanadio.
La aplicacin de abonos orgnicos puede conducir a la
acumulacin de metales en el suelo, muchos de los cuales pueden ser txicos para los animales y el hombre.
El cuadro 9 (Stevenson y Cole, 1999) presenta los niveles
en minerales en abonos obtenidos por biodegradacin
anaerobia y por compostaje.
Biofertilizante
Compost
As
Cd
Cr
Hg
Ni
6-230
4-846
17-99.000
1-10.600
10-3.500
1-4,8
1-13,2
8,2-130
0,5-3,7
7-100
Pb
13-19.700
22-913
417
Los microorganismos poseen la capacidad de transformar elementos minerales, por ejemplo, al usarlos
como fuente de energa (Fe++ a Fe+++ por Thiobacillus),
aceptor de electrones (Mn+4 a Mn+2 por Bacillus), oxidacin (As), alquilacin (CH3- + Hg+2 CH3Hg-, por
Clostridium).
Anexo prctico
Muestreo y anlisis fsico-qumicos
Muestreo de suelos, aguas, alimentos, conservacin de
las muestras, humedad:
Nitrgeno: Fijacin biolgica del N 2 (FBN), mineralizacin: amonificacin, nitrificacin. Prdidas: desnitrificacin
Azufre: sulfooxidacin, sulfatorreduccin
Biodegradacin de residuos
Evaluacin del grado de madurez de compost
Bibliografa
418
Lillian Frioni
C-orgnico
El C-orgnico del suelo es oxidado por tratamiento con
dicromato de potasio y cido sulfrico concentrado en
caliente. El Cr+3 liberado se determina coloromtricamente y se asume que es proporcional a la materia orgnica
del suelo
Procedimiento
a) Colocar suelo fresco en las cajas, pesar las mismas
(una cifra despus de la coma) = Peso Fresco (PF)
Diluir
contenido de C de alcuotas de las soluciones estandares, por ejemplo entre 0 y 1mg/mL de solucin por el mismo procedimiento que las muestras de
suelo analizadas
La nodulacin y la fijacin del nitrgeno en leguminosas pueden ser afectadas por pesticidas, sobre todo por
aquellos aplicados a las semillas que adems se inoculan
con rhizobios especficos. Se propone separar en el tiempo las aplicaciones de inoculante y fungicida o trabajar
con mutantes de rizobios resistentes a los pesticidas ms
empleados. El cuadro 8 evidencia la importancia de esta
lnea de trabajo.
Se inform de marcada inhibicin de la actividad nitrogensica en la rizosfera de 25 variedades de sorgo,
cuando se emplearon dosis tres veces superiores a las
normales de atrazina (4,5 kg/ha)(Frioni, 1999), efecto
que desapareci en otro ensayo de campo, en Argentina, sin herbicida. En el mismo cultivo, se comprob en
otro ensayo con aplicaciones de distintas dosis de tres
herbicidas: atrazina, linurn y 2,4-D amina, que la celulolisis fue inhibida por todos los tratamientos pesticidas. Este efecto fue observado por otros autores y se
atribuye a la falta de sustratos carbonados (las malezas son suprimidas) y a una inhibicin selectiva de la
celulasa.
Numerosas revisiones incluyen determinaciones de efectos sobre procesos biolgicos como respiracin, mineralizacin del nitrgeno, nitrificacin, datos sobre recuentos de ciertos grupos de microorganismos, evaluacin
del ATP de origen microbiano, enzimas especficas (deshidrogenasas, celulasa, amilasa, etc.), fijacin del nitrgeno. Se propuso un programa de anlisis a los que
deben ser sometidos los pesticidas antes de que su distribucin sea autorizada por autoridades competentes,
donde se incluyen estudios sobre la poblacin normal
del suelo, adems de los clsicos controles sobre sanidad humana y vegetal:
1. Actividad respiratoria (CO2, O2) evaluada en el laboratorio en muestras de suelo: sin aditivos (respiracin endgena), con glucosa (proceso activado por el
desarrollo microbiano) y con restos vegetales (degradacin de materia orgnica compleja por sucesiones
microbianas).
2. Transformaciones del nitrgeno: amonificacin, nitrificacin.
403
402
Lillian Frioni
te varios aos, se obtienen mediante modelos de prediccin, curvas de desaparicin simuladas de estas sustancias.
En general, la concordancia entre valores observados y
simulados es buena y su empleo resulta muy til, sobre
todo si se consideran las dificultades en la toma de muestras representativas en el campo, la variabilidad asociada
en la determinacin de cantidades pequeas, etc.
grados de susceptibilidad: una especie puede declinar apreciablemente, una segunda puede alterarse slo
ligeramente y otras pueden resistir el efecto del pesticida. Las hifas de los hongos y las clulas vegetativas de
las bacterias son an ms afectadas que los conidios o
esclerocios de los hongos o que las endosporas bacterianas
N-orgnico
maciones de compuestos nitrogenados, se puede generalizar que, salvo en el caso de fungicidas presentes
en el suelo en alta concentracin, la mineralizacin y
la desnitrificacin no son muy afectadas, mientras que
la nitrificacin es uno de los procesos ms sensibles,
acumulndose amonio. Esta sensibilidad de los nitrificantes auttrofos se usa para evaluar los efectos txicos de diferentes dosis de pesticidas, mediante la evaluacin de los nitratos
Transferir
Inoculante
ninguno
Rhizobio sensible
Rhizobio resistente
Semillas no tratadas
rendimiento
N
rendimiento
alfalfa con thiram
270
280
490
5,9
6,6
13,2
290
440
500
N
6,8
12,2
14,6
modificacin
ninguno
Rhizobio sensible
Rhizobio resistente
1150
1820
3930
21,7
36,4
105
1100
3820
3790
23,2
97,0
106
N-NH4
Conectar
Efectos
419
420
Lillian Frioni
Microscopa
Colocar
la preparacin
Abrir
Colocar
Volatilizacin
el condensador hasta distinguir ntidos los contornos del polgono, si la imagen no est en el centro, centrarla y ajustar el enfoque
Persistencia en el ambiente
Como hemos visto depende del tipo del suelo, de la calidad
de las aguas, la temperatura, la humedad, materia orgnica, coloides minerales, actividad biolgica. Se puede evaluar en ensayos controlados o de campo. Se citan datos de
que slo un 27 % de la variabilidad encontrada en las prdidas de Picloram en 11 suelos, en condiciones controladas,
pudo relacionarse a las propiedades de los mismos. El cuadro 7 (Stevenson y Cole, 1999) muestra la gran persistencia de insecticidas organoclorados, sobretodo DDT. Como
resultado de su pobre degradacin, su empleo est muy
restringido y aun prohibida su produccin y distribucin. La
frmula de algunos de los ms persistentes pesticidas se
presentan en la figura 3 (Alexander, 1994).
Minimizar
el material sobre las mesadas, las que se desinfectan con alcohol al comienzo y al final de la tarea
No
401
Fotodescomposicin
Muchos herbicidas absorben en el rango del ultravioleta, pero la radiacin solar con longitudes de onda menores de 295 nm que llega al suelo es despreciable. El
efecto sobre los biocidas est limitado a la superficie de
suelos y aguas; slo sern atacados (liberacin de electrones, formacin de puentes) los pesticidas no incorporados o los que ascienden por capilaridad en pocas
secas. Puede ocurrir tambin cierta sensibilizacin:
la energa es absorbida por un intermediario y transferida a la molcula herbicida por colisin, la que es as
daada. Los productos de la fotodescomposicin pueden ser similares a los obtenidos por degradacin.
Persistencia en el suelo
Meses Aos
Insecticidas fosforados
3
Herbicidas con cidos alifticos y carbamatos
3
Herbicidas con grupos nitrito, fenoxi, toluidina
6
Herbicidas con cido benzoico, amidas
12
Herbicidas derivados de la urea, triazina, picloram 18
Insecticidas organoclorados
Chlordano
Ms de 18
DDT
Dieldrin
Aldrin
hetacloro
5
4
3
2
440
Lillian Frioni
Maceracin del ndulo con auxilio de varilla de vidrio, bistur o ansa estril, puede efectuarse entre
dos portaobjetos o en un borde de la tapa de la caja
donde se efectuar el aislamiento, con unas gotas
de agua
tomar
la llama del mechero en posicin vertical y luego ir levantndola hasta que quede toda al rojo, pasarla por la
llama en un ngulo de 60 con la vertical, mantenindola siempre en posicin paralela al cuerpo.
flambear
una
leer
el metal adyacente
introducir
efectuar
Asociacin Rhizobium-leguminosa
(Balatti y Jardim Freire, 1996; FAO, 1983 y 1984; Duhoux
y Nicole, 2004; Graham y Vance, 2000; Milnitsky et al.,
1997; NifTAL, 1981)
Aislamiento de rhizobios a partir de ndulos (figura 1)
lavar cuidadosamente las races noduladas bajo el agua
de la canilla
elegir
Aislamiento
1. en superficie: sembrar por agotamiento con ansa
en superficie de medio EMA (extracto de levadura manitol agar), llamado tambin M-79, con rojo
Congo
2. en inclusin: colocar 1 mL de agua estril en 3 cajas de
Petri vacas. Con el ansa flambeada tomar contenido
nodular y diluirlo sucesivamente en las 3 cajas. Agregar
el medio en sobrefusin (menos de 45C) y por repetidos movimientos mezclar con el inculo
incubar
las cajas en posicin invertida a 28C: las colonias de rhizobios de crecimiento rpido aparecen a los
transferir
quemar
nuevamente el ansa
421
Las estructuras de los hongos se aprecian muy bien tocando las colonias suavemente con una cinta adhesiva,
la que luego se pega sobre un portaobjeto, de esta manera se evita la rotura del micelio que ocurre con el uso
de ansas, puntas, etc. Tambin se aprecian colocando la
caja de Petri sobre la platina del microscopio y tratando
de enfocar a bajo aumento, regulando la luz a niveles adecuados.
Bacterias
al
clulas
Tinciones
Las coloraciones de bacterias tienen por objeto:
aumentar el contraste de las clulas con el medio, lo
que permite distinguir forma y tamao
diferenciar
evidenciar
422
Lillian Frioni
Preparacin de un frotis
extendido del material (cultivo slido o lquido) sobre un
portaobjeto limpio y desengrasado con alcohol. Si se parte de material slido (alimentos, suelo, colonias sobre agar)
colocar una gota de agua en el portaobjeto y disgregar el
material en una fina capa sobre el vidrio con ayuda del
ansa
Gram positivas, retienen el primer colorante- cristal violeta o violeta de Genciana- y se ven violetas y Gram
negativas, que se decoloran con alcohol, acetona o mezcla de ambos y se se tien con el segundo colorante,
como la safranina y se ven rosadas. El complejo formado por el cristal violeta y el iodo del lugol (mordiente) es
extrado, mientras que en las G+ esto no ocurre por una
diferente composicin y estructura de la pared celular
(captulo 2).
Las levaduras, eucariotas con paredes gruesas pero sin
peptidoglicano, se tien como Gram+, en este caso no es
la composicin qumica sino la estructura fsica de la pared lo que le confiere la Gram positividad.
lavar
ma.
(Lugol: iodo 1g, ioduro de K, 2g, agua destilada 300mL :
disolver el iodo y el IK en agua, dejar de un da para el
otro para disolver completamente, guardar en frasco oscuro)
con solucin de safranina y dejar 1 minuto. Lavar
y secar
(safranina: 2,5% (p/v) en alcohol 95%, 10mL, agua destilada 100mL)
Azotobacter
observar
10
-1
-1
cubrir
leer
entre 5-7 y hasta 14 das: colonias tpicas transparentes, brillantes, distinguir de contaminantes.
Azospirillum
Coloracin diferencial (Gram): evidencia diferencias en
la composicin fsica y qumica de las bacterias y permite
diferenciarlas entre si:
Coloracin de esporas
con
cubrir
decantar
agitar
leer
439
colocar las races en frasco que pueda cerrarse hermticamente: de suero, tipo antibitico o los empleados como biberones, tapar con tapn de goma y precinto de aluminio. Reemplazar el aire por N2 y 5% de
aire, dejar a temperatura ambiente toda la noche para
superar la fase de latencia en la reduccin observada
en gramneas
incubar
los
438
Lillian Frioni
Amilolticos
Medio
solucin salina estndar
50 mL
extracto de suelo
10 mL
almidn
1,5 g
NH4NO3
1,0 g
agua
940 mL
agar
20 g
Aislamientos y recuentos
Azotobacter y Derxia
medio LG
(Dbereiner, 1980)
sacarosa
20 g
K2HPO4
0,05 g
0,15 g
KH2PO4
CaCl2
0,01 g
MgSO4 7 H2O
0,20 g
0,002 g
Na2MoO42H2O
FeCl3
0,01 g
azul bromotimol (0,5% en etanol)
2,0 mL
CaCO3
1,00 g
agar
15 g
agua
1 litro
pH
6,8 (color verde)
5g
MgSO4
2,5 g
NaCl
2,5 g
Fe2 (SO4)3
0,05 g
MnSO4
0,05 g
agua
1 litro
Para Derxia: reemplazar sacarosa por almidn o glucosa, omitir el carbonato de calcio y agregar 0,01g
NaHCO3
Recuento
Azospirillum (NFb)
(Dbereiner, 1980)
cido mlico
5,0 g
K2HPO4
0,5 g
MgSO4 7 H2O
0,2 g
NaCl
0,1 g
CaCl2
0,02 g
Na2MoO4 2 H2O
0,002 g
MnSO4 H2O
0,01 g
Fe EDTA 91,64% peso/vol, agua)
4,0 mL
azul bromotimol (0,5% p/vol. en etanol) 3,0 mL
KOH
4,5 g
biotina
0,1 mg
agua
1 litro
pH 6,8 (color verde) antes de
agregar el agar (semi-slido)
1,75 g agar
Recuento
cubrir con pequeos trozos de papel de filtro, impregnarlos con solucin de verde de malaquita y calentar
con mechero suavemente por 5 minutos, evitando ebullicin, agregar colorante de ser necesario.
(Verde de malaquita: 0,5g, agua destilada 100mL)
lavar
con agua
contrastar
lavar
Las esporas se ven verdes y las clulas vegetativas rosadas. Sin teir se pueden observar en microscopio de contraste de fases y muchas veces se aprecian en la coloracin de Gram de cultivos viejos.
Cpsulas
Colocar una gota de tinta china en un portaobjeto limpio
Siembra y aislamiento
Sembrar o inocular es introducir artificialmente un inculo microbiano en un medio adecuado, con el fin de estudiarlo, propagarlo, aislarlo en cultivo puro. Puede realizarse en medio slido, semislido o lquido, con ayuda de
ansa, pipeta, punta, hisopo.
423
Siembra en placas
en superficie: por baado, colocar 0,1-0,5mL de la muestra con pipeta estril en el centro de la caja y distribuir a
toda la caja con un rastrillo de vidrio estril
en estras, cargar el ansa y efectuar estras paralelas en
la cuarta parte de la caja, se quema el ansa y se enfra, se
gira la caja 90 y se vuelve a estriar tocando 3-4 veces el
rea sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de
caja. Por ltimo, sin quemar el ansa, se estra el resto de
la superficie sin sembrar. De esta forma se facilita el aislamiento de colonias
por inclusin: colocar 1mL de la muestra en una caja de
Petri estril y vaca, sobre ella se agregan 15-20mL de
medio de cultivo fundido y mantenido en sobrefusin a
45C, se agita la placa para mezclar intimamente, movindola 4 veces en sentido horario, 4 en sentido contrario y hacia ambos costados, antes de que el agar se solidifique.
Las cajas se incuban invertidas, para evitar que el agua
de condensacin caiga sobre el medio dando crecimiento
confluente e impidiendo la formacin de colonias.
Cada clula viable dar origen a una colonia,
de modo que la siembra en placas se usa para
cultivar, aislar y contar a los microorganismos.
Cultivo puro: a partir de colonias del mismo tipo se realiza un examen microscpico a fin de mostrar clulas se-
424
Lillian Frioni
incubar
preparar
determinar
liofilizados: tratamiento que deseca a los cultivos aplicando ciclos de vaco y congelamiento. Los cultivos se conservan desecados en ampollas de vidrio. Al usarlas se les
agrega medio de cultivo lquido y se incuba.
igual
Clculos
a)
h = 100 + H%
100
ejemplo 2
NMP 14,0 microorganismos en
N caract. 532 (10-4)
1 mL de la dilucin 10-4
Celulolticos aerobios
Medio
K2HPO4
NaNO3
MgSO4
FeSO4
agua
1g
0,5 g
0,5 g
0,01 g
1 litro
Repartir
Esterilizar
Tablas de Mc Crady
Expresar el numerador y denominador en las mismas unidades (mg/100g/mg/100g), por ejemplo multiplicar el numerador por 10-3
lleva a humedad fija (por ejemplo 75% de la capacidad de campo o la deseada) y se mezcla
ejemplo 1
N caracterstico: 321 (10-4) NMP 15,0 microorganismos
en 1 mL dilucin 10-4
Tcnica
se
nismos, con ayuda de tablas construdas a partir de algunos datos de recuentos de viables en medio slido (cajas) y luego por clculos estadsticos se infieren todas las
combinaciones posibles. Se entra en la tabla correspondiente con el nmero caracterstico y se lee en NMP en la
alcuota sembrada en la dilucin correspondiente al primero de los nmeros del N caracterstico.
100
437
3 tubos/dilucin
1
000
001
010
011
020
100
101
102
110
111
120
121
130
200
0.0
0.3
0.3
0.6
0.6
0.4
0.7
1.1
0.7
1.1
1.1
1.5
1.6
0.9
201
202
210
211
212
220
221
222
223
230
231
232
300
301
1.4
2.4
1.5
2.0
3.0
2.0
3.0
3.5
4.0
3.0
3.5
4.0
2.5
4.0
302
310
311
312
313
320
321
322
323
330
331
332
333
6.5
4.5
7.5
11.5
16.0
9.5
15.0
20.0
30.0
25.0
45.0
110.0
110.0
140.0
1 = N caracterstico; 2 = NMP
Sembrar con una alcuota de las diluciones ms concentradas (10-1) la superficie de caja de Petri con el medio anterior solidificado con 15 g/L de agar. Colocar encima un disco de papel de filtro estril del dimetro de la
caja. Incubar
Efectuar
436
Lillian Frioni
luego de esterilizado y en sobrefusin bajar el pH a 4,55,0 con cido lctico y/o ctrico
Algas
Medio
KH2PO4
NaNO3
MgSO4
CaCl2
NaCl
FeCl3
agua corriente
0,5g
0,5g
0,15g
0,05g
0,05g
0,01g
1000mL
co: celulolticos (aerobios o anaerobios), fijadores de nitrgeno, etc. Los recuentos se efectan en
se
Biomasa microbiana
las muestras no fumigadas se incuban por otros 10 das
mL cada uno
incubar
determinar
Ejemplo
1) 3 tubos/dilucin
N tubos positivos:
Grupos fisiolgicos
Protozoos
425
las
Incubar a la luz con burbujeo de aire, seguir el enriquecimiento por el incremento de los pigmentos y efectuar
aislamientos en el mismo medio slido.
5g
10g
1000mL
Clculo de la normalidad:
Medio
NaCl
agar
agua destilada
pH neutro
N tubos positivos:
N caracterstico:
las
muestras de suelo, frescas o secadas al aire y tamizadas a 2 mm se dividen en dos partes de 50 g cada
una, una de ellas se expone a los vapores de cloroformo puro, obtenidos al efectuar vaco en desecador de
vidrio cerrado hermticamente, con las muestras de
suelo en tapas de cajas de Petri y el cloroformo en vasito central. Colocar papel humedecido con agua en las
paredes para evitar la desecacin
dejar
2) 5 tubos/dilucin
Tcnica:
Se pueden expresar los resultados como N-biomasa procediendo a extraer el N-NH4+ de las muestras incubadas
426
Lillian Frioni
con KCl 2N y valorando con electrodos especficos o destilacin por arrastre de vapor. P-biomasa: extrayendo el P
soluble luego de las incubaciones.
Materiales
desecador con conexin a vaco, bomba de vaco
cloroformo puro, libre de etanol
K2SO4 0,5 M
Agitador
filtros
cido sulfrico concentrado
K2Cr206 0,0667M
estufa a 150C
espectrofotmetro
curva patrn (glucosa, ftalato de K)
Tcnica
Extraccin
tomar 1 mL de la primera suspensin-dilucin y pasarlo a otro tubo con 9 ml de agua estril (dilucin
10-2)
Dejar
Se
Filtrar con papel filtro N 42 plegado y recoger en recipientes con tapa. El pH de los filtrados debe estar entre
6,5 y 6,8
Medio
glucosa
K2HPO4
agar
extracto de suelo
agua
Tcnica:
El
10g
0,2 g
15g
20 mL
1.000 mL
Extracto de suelo
Analizar
Guardar
proceder como anteriormente hasta la suspensin-dilucin adecuada segn la densidad microbiana de las
muestras (10-7, 10-8, etc.). Cambiar los punteros de la
pipeta automtica en cada paso o usar una pipeta estril y enjugarla 5 o ms veces en una dilucin antes de
pasar a la siguiente
Fumigar
Agitar
435
Actinomicetes
Medio
glicerol
asparaginato de Na
K2HPO4
agar
agua destilada
10g
1g
1g
15g
1000 mL
Hongos
Medio
peptona
5g
glucosa
10g
KH2PO4
1g
MgSO4
0, 5g
agar
2g
sol. acuosa de Rosa de
Bengala al 1/300
100 mL
agua destilada
900 mL
Agregar en cada caja estril 1 mL de solucin de sulfato
de estreptomicina (75 mg/100 mL) esterilizada por filtracin con filtros millipore de 45 micras y luego el medio en
sobrefusin
Se emplea tambin:
extracto de malta
agar
agua
20g
20g
1L
434
Lillian Frioni
la informacin sobre las secuencias de los ADN clonados, el nombre de los genes, intensidad de emisin, se
correlacionan con cada seal detectada
primero se amplifican las secuencias clonadas y almacenadas de los genes a estudiar por PCR obteniendo
clones de molculas de ADN copia, luego de su purificacin, cien o mil de estas sondas de ADN copia diferentes se unen directamente a la superficie slida de
placas (vidrio, plstico, sintticas).
una alcuota de cada muestra es ordenada y dispuesta en los pozos microcpicos de la placa, usando un
sistema robtoco de alta velocidad controlado por computadora
Metagenmica
Extraer
Constituye un nuevo concepto en el estudio de las comunidades microbianas, conjugndose todas las tcnicas de gentica molecular en una unidad llamada metagenmica que involucra el estudio de los genomas colectivos de los microorganismos en las comunidades,
como las del suelo.
El N-aminocidos de los filtrados se evala en la reaccin con la ninhidrina: en tubo de ensayo mezclar: 0,1
mL de los filtrados con 0,5 mL de sol. de citrato de Na
(0,4M) y agitar bien. Agregar 0,5 mL de la mezcla de
reactivos:
Se clona el ADN extrado del suelo en amplios fragmentos (100kb) en hospederos cultivables que luego se analiza por secuenciacin, clonacin y con el uso de genes
reporteros para estudios de actividad, como la galactosidasa, por el gen lacz, luminiscencia, por el gen lux, fosfatasa alcalina, por el gen phoA, etc. la actividad puede
evidenciarse e medios de cultivo slidos o lquidos (Josephson y Pepper, 1998).
g ninhidrina-N.g-1 = S.V.h
g
Recuentos microbianos
gN-biomasa.g-1 = S-C . h
0,54
427
Solucin de trabajo (2,8 g N-leucina.mL-1): en frasco aforado de 100 mL, diluir 10 mL de la solucin estandar y
llevar a volumen con agua destilada. Preparar diluciones
para constuir la curva de calibracin y proceder igual que
para las muestras.
Microarreglos (microarrays)
(captulo 4)
pesar 10 g suelo fresco, de contenido de humedad conocido, introducirlo aspticamente en un frasco con 90
mL agua destilada estril, solucin fisiolgica (ClNa al
0,85%) u otro medio mineral
troles para P-soluble: ajustar el pH a 5,0 con cido sulfrico y llevar a 20mL con agua destilada
Agregar
Lillian Frioni
Deshidrogenasas
(Frioni, 1999; Paul y Clark, 1996; Schinner et al., 1995)
Fundamento: las muestras de suelo se mezclan con cloruro de p-iodo nitrotetrazolium (INT) y se incuban 2 horas
a 40 C, el p-iodo formazn formado (rojo) se extrae con
acetona, metanol y/o etanol y N-dimetilformamida (1/1),
se mide en espectrofotmetro a 464 nm con curva patrn
de INTF.
Soluciones
* HCL 3M : 100 mL concentrado (37%) con 300 mL de
agua destilada
* Buffer Tris 1M, pH 7,0: 30,28g Tris (hidroximetil-aminometano) en 200 mL de agua destilada, ajustar pH 7,0
con HCL y llevar a 250 mL en matraz aforado.
Dejar
Procedimiento
433
Nuevas tcnicas permiten establecer perfiles moleculares de la fraccin activa de la comunidad, que escapan a
este texto.
Tcnica:
Soluciones
(Alef, 1998)
* Sustrato: 500 mg INT + 2mL N-dimetilformamida, agitar
vigorosamente y llevar a 100 mL con agua destilada (aforado). Prepararlo cada vez y guardarlo en oscuridad.
Procedimiento
Suelo hmedo se tamiza a 2 mm se guarda a 5C antes
del anlisis.
Tomar : 1g suelo y 20mL fosfato buffer 60mM, en frascos
de 125mL y la mezcla se incuba en agitador a 24C por
15 minutos, luego 100L de sol. stock de 2mg/mL de FDA
(sustrato) a las muestras, no a los controles. Incubar agitando 2 horas a 24C
Parar la reaccin agregando 20mL acetona (concentracin
final 50% v/v). Agregar 100 L de sustrato a los controles.
Centrifugar a 6000rpm por 5 minutos, filtrar con Whatman
N4 y leer D-ptica del sobrenadante claro a 499 mn (si
da ms de 0,8 diluir las muestras en acetona)
Hibridacin:
el buffer con formamida y las sondas fluorescentes se precalientan y se adiciona a las muestras (de 30 minutos a varias horas de incubacin en
cmara hmeda, oscura y a 37- 50C). Las condiciones adecuadas para la complementacin se pueden
regular con la concentracin del formaldehdo, que
debilita los puentes de H y variando la temperatura de
hibridacin
se analizan tambin los ARN ribosomales constituyentes de la maquinaria de traduccin. Su contenido es proporcional a la actividad microbiana y su determinacin
resulta muy til en estudios de ecologa gentica
perturbacin
Actividades enzimticas
muestras
ambientales
428
extraccin ADN
de las muestras
captura de
los ADN
marcados
identificacin de
los organismos:
genes de ARNr,
ARNm
marcacin:
sustratos con
C13, istopos
no radiactivos
432
Lillian Frioni
Curva de calibracin
Preparar como se seala arriba, de modo que la relacin
concentracin de flourescena y la densidad ptica sea
lineal.
Resultados: en microgramos de fluorescena/g suelo
seco/hora= mg/kg suelo seco/h
429
h) Solucin estndar stock: 1 mg de p-nitrofenol/mL: disolver 1 g en agua destilada y llevar a 1000 mL. Guardar a 4C
i) Solucin estndar de trabajo: 20 g de p-nitrofenol/mL:
diluir 2 mL de solucin estndar en 100 mL de agua
destilada
j) Curva: pipetear 0 (reactivo blanco), 1, 2, 3, 4 y 5 mL de
solucin estndar de trabajo en 6 tubos, ajustar los volmenes a 5 mL con agua destilada y agregar 1 mL de
CaCl2 y 4 mL de NaOH 0,5 M, mezclar bien, filtrar por
dos papeles
Se obtiene: 0. 20, 40, 60, 80 y 100 g de p-nitrofenol
Procedimiento:
Colocar
Soluciones:
a) Sustrato para la fosfatasa cida: disolver 4,268 g de
fosfato de p-nitrofenil.6 H2O disdico en buffer para fosfatasa cida y llevar el volumen a 1000 mL con el mismo buffer en matraz aforado (hacerla cada da)
b) Sustrato para OH-: dem, pero en buffer para fosfatasa
alcalina
Agitar,
elevada) agregar 90 mL de agua destilada a las muestras y los controles, agitar brevemente, filtrar
Medir la densidad ptica a 400 nm y calcular los g
NP.g-1.h-1 con ayuda de la ecuacin de ajuste a una recta (datos de la curva patrn)
430
Lillian Frioni
tes de carbono (White el al., 1998), estableciendo correlaciones entre patrones de utilizacin de sustratos con ciertas especies bacterianas contenidas en bases de datos.
Es frecuentemente usada para valorar la estabilidad de la
comunidad ante cambios en el uso y manejo del suelo.
Variante: medida del CO2 liberado luego del agregado de
sustratos a muestras de suelo contenidas en recipientes
cerrados y/o titulacin del O2 consumido.
Protenas totales
Plsmidos
Anlisis de los steres metilados de los cidos grasos (FAME, fatty acids methyl esters)
Sistema de identificacin bacteriano que ha sido desarrollado por Microbial ID Inc. y se conoce como sistema MIDI.
Consiste en el anlisis cromatogrfico en fase gaseosa
de los steres metilados de cidos grasos derivados de la
membrana y de los lipopolisacridos. Se usa mucho en
taxonoma (sistema taxoqumico) y existe base de datos
con ms de 8.000 bacterias analizadas.
Requiere el aislamiento de microorganismos y su cultivo en
medio de agar-soja tripticasa (TSA) a 25C. El mtodo no
se presta para anlisis de organismos no cultivables. A partir
del anlisis FAME a extractos de lpidos se puede determinar la biomasa microbiana, el nivel nutricional y la composicin de la comunidad de diversos suelos (Hitzl et al., 1997)
Suelo: se requiere un inculo transparente, libre de carbono: se realiza extraccin con pirofosfato de sodio, y se
incuba con agitacin 24 horas. El sobrenadante se flocula con sales de calcio y magnesio y la fraccin lmpida se
inocula en cada uno de los hoyos de la placa.
Las comunidades pueden identificarse por la presencia o
ausencia de respuestas especficas ante distintas fuen-
gado de tampn fosfato en caso de suelos muy arcillosos (separacin de fases): 100g de suelo en baln de
fondo redondo de 1L + 200 mL. de sol. de fosfato buffer
(0,05M, pH 7,4) + 500 mL. de metanol y 250,L. de cloroformo.
El
Acidos nucleicos
431
Se requiere el aislamiento previo de los microorganismos o de los cidos nucleicos de las muestras del ecosistema
Extraccin
Extraccin
Rendimientos: del orden de 50g/g de suelo, con fragmentos de ADN de 500-1000pb hasta 25KB, segn los
procedimientos empleados.
430
Lillian Frioni
tes de carbono (White el al., 1998), estableciendo correlaciones entre patrones de utilizacin de sustratos con ciertas especies bacterianas contenidas en bases de datos.
Es frecuentemente usada para valorar la estabilidad de la
comunidad ante cambios en el uso y manejo del suelo.
Variante: medida del CO2 liberado luego del agregado de
sustratos a muestras de suelo contenidas en recipientes
cerrados y/o titulacin del O2 consumido.
Protenas totales
Plsmidos
Anlisis de los steres metilados de los cidos grasos (FAME, fatty acids methyl esters)
Sistema de identificacin bacteriano que ha sido desarrollado por Microbial ID Inc. y se conoce como sistema MIDI.
Consiste en el anlisis cromatogrfico en fase gaseosa
de los steres metilados de cidos grasos derivados de la
membrana y de los lipopolisacridos. Se usa mucho en
taxonoma (sistema taxoqumico) y existe base de datos
con ms de 8.000 bacterias analizadas.
Requiere el aislamiento de microorganismos y su cultivo en
medio de agar-soja tripticasa (TSA) a 25C. El mtodo no
se presta para anlisis de organismos no cultivables. A partir
del anlisis FAME a extractos de lpidos se puede determinar la biomasa microbiana, el nivel nutricional y la composicin de la comunidad de diversos suelos (Hitzl et al., 1997)
Suelo: se requiere un inculo transparente, libre de carbono: se realiza extraccin con pirofosfato de sodio, y se
incuba con agitacin 24 horas. El sobrenadante se flocula con sales de calcio y magnesio y la fraccin lmpida se
inocula en cada uno de los hoyos de la placa.
Las comunidades pueden identificarse por la presencia o
ausencia de respuestas especficas ante distintas fuen-
gado de tampn fosfato en caso de suelos muy arcillosos (separacin de fases): 100g de suelo en baln de
fondo redondo de 1L + 200 mL. de sol. de fosfato buffer
(0,05M, pH 7,4) + 500 mL. de metanol y 250,L. de cloroformo.
El
Acidos nucleicos
431
Se requiere el aislamiento previo de los microorganismos o de los cidos nucleicos de las muestras del ecosistema
Extraccin
Extraccin
Rendimientos: del orden de 50g/g de suelo, con fragmentos de ADN de 500-1000pb hasta 25KB, segn los
procedimientos empleados.
432
Lillian Frioni
Curva de calibracin
Preparar como se seala arriba, de modo que la relacin
concentracin de flourescena y la densidad ptica sea
lineal.
Resultados: en microgramos de fluorescena/g suelo
seco/hora= mg/kg suelo seco/h
429
h) Solucin estndar stock: 1 mg de p-nitrofenol/mL: disolver 1 g en agua destilada y llevar a 1000 mL. Guardar a 4C
i) Solucin estndar de trabajo: 20 g de p-nitrofenol/mL:
diluir 2 mL de solucin estndar en 100 mL de agua
destilada
j) Curva: pipetear 0 (reactivo blanco), 1, 2, 3, 4 y 5 mL de
solucin estndar de trabajo en 6 tubos, ajustar los volmenes a 5 mL con agua destilada y agregar 1 mL de
CaCl2 y 4 mL de NaOH 0,5 M, mezclar bien, filtrar por
dos papeles
Se obtiene: 0. 20, 40, 60, 80 y 100 g de p-nitrofenol
Procedimiento:
Colocar
Soluciones:
a) Sustrato para la fosfatasa cida: disolver 4,268 g de
fosfato de p-nitrofenil.6 H2O disdico en buffer para fosfatasa cida y llevar el volumen a 1000 mL con el mismo buffer en matraz aforado (hacerla cada da)
b) Sustrato para OH-: dem, pero en buffer para fosfatasa
alcalina
Agitar,
elevada) agregar 90 mL de agua destilada a las muestras y los controles, agitar brevemente, filtrar
Medir la densidad ptica a 400 nm y calcular los g
NP.g-1.h-1 con ayuda de la ecuacin de ajuste a una recta (datos de la curva patrn)
Lillian Frioni
Deshidrogenasas
(Frioni, 1999; Paul y Clark, 1996; Schinner et al., 1995)
Fundamento: las muestras de suelo se mezclan con cloruro de p-iodo nitrotetrazolium (INT) y se incuban 2 horas
a 40 C, el p-iodo formazn formado (rojo) se extrae con
acetona, metanol y/o etanol y N-dimetilformamida (1/1),
se mide en espectrofotmetro a 464 nm con curva patrn
de INTF.
Soluciones
* HCL 3M : 100 mL concentrado (37%) con 300 mL de
agua destilada
* Buffer Tris 1M, pH 7,0: 30,28g Tris (hidroximetil-aminometano) en 200 mL de agua destilada, ajustar pH 7,0
con HCL y llevar a 250 mL en matraz aforado.
Dejar
Procedimiento
433
Nuevas tcnicas permiten establecer perfiles moleculares de la fraccin activa de la comunidad, que escapan a
este texto.
Tcnica:
Soluciones
(Alef, 1998)
* Sustrato: 500 mg INT + 2mL N-dimetilformamida, agitar
vigorosamente y llevar a 100 mL con agua destilada (aforado). Prepararlo cada vez y guardarlo en oscuridad.
Procedimiento
Suelo hmedo se tamiza a 2 mm se guarda a 5C antes
del anlisis.
Tomar : 1g suelo y 20mL fosfato buffer 60mM, en frascos
de 125mL y la mezcla se incuba en agitador a 24C por
15 minutos, luego 100L de sol. stock de 2mg/mL de FDA
(sustrato) a las muestras, no a los controles. Incubar agitando 2 horas a 24C
Parar la reaccin agregando 20mL acetona (concentracin
final 50% v/v). Agregar 100 L de sustrato a los controles.
Centrifugar a 6000rpm por 5 minutos, filtrar con Whatman
N4 y leer D-ptica del sobrenadante claro a 499 mn (si
da ms de 0,8 diluir las muestras en acetona)
Hibridacin:
el buffer con formamida y las sondas fluorescentes se precalientan y se adiciona a las muestras (de 30 minutos a varias horas de incubacin en
cmara hmeda, oscura y a 37- 50C). Las condiciones adecuadas para la complementacin se pueden
regular con la concentracin del formaldehdo, que
debilita los puentes de H y variando la temperatura de
hibridacin
se analizan tambin los ARN ribosomales constituyentes de la maquinaria de traduccin. Su contenido es proporcional a la actividad microbiana y su determinacin
resulta muy til en estudios de ecologa gentica
perturbacin
Actividades enzimticas
muestras
ambientales
428
extraccin ADN
de las muestras
captura de
los ADN
marcados
identificacin de
los organismos:
genes de ARNr,
ARNm
marcacin:
sustratos con
C13, istopos
no radiactivos
434
Lillian Frioni
la informacin sobre las secuencias de los ADN clonados, el nombre de los genes, intensidad de emisin, se
correlacionan con cada seal detectada
primero se amplifican las secuencias clonadas y almacenadas de los genes a estudiar por PCR obteniendo
clones de molculas de ADN copia, luego de su purificacin, cien o mil de estas sondas de ADN copia diferentes se unen directamente a la superficie slida de
placas (vidrio, plstico, sintticas).
una alcuota de cada muestra es ordenada y dispuesta en los pozos microcpicos de la placa, usando un
sistema robtoco de alta velocidad controlado por computadora
Metagenmica
Extraer
Constituye un nuevo concepto en el estudio de las comunidades microbianas, conjugndose todas las tcnicas de gentica molecular en una unidad llamada metagenmica que involucra el estudio de los genomas colectivos de los microorganismos en las comunidades,
como las del suelo.
El N-aminocidos de los filtrados se evala en la reaccin con la ninhidrina: en tubo de ensayo mezclar: 0,1
mL de los filtrados con 0,5 mL de sol. de citrato de Na
(0,4M) y agitar bien. Agregar 0,5 mL de la mezcla de
reactivos:
Se clona el ADN extrado del suelo en amplios fragmentos (100kb) en hospederos cultivables que luego se analiza por secuenciacin, clonacin y con el uso de genes
reporteros para estudios de actividad, como la galactosidasa, por el gen lacz, luminiscencia, por el gen lux, fosfatasa alcalina, por el gen phoA, etc. la actividad puede
evidenciarse e medios de cultivo slidos o lquidos (Josephson y Pepper, 1998).
g ninhidrina-N.g-1 = S.V.h
g
Recuentos microbianos
gN-biomasa.g-1 = S-C . h
0,54
427
Solucin de trabajo (2,8 g N-leucina.mL-1): en frasco aforado de 100 mL, diluir 10 mL de la solucin estandar y
llevar a volumen con agua destilada. Preparar diluciones
para constuir la curva de calibracin y proceder igual que
para las muestras.
Microarreglos (microarrays)
(captulo 4)
pesar 10 g suelo fresco, de contenido de humedad conocido, introducirlo aspticamente en un frasco con 90
mL agua destilada estril, solucin fisiolgica (ClNa al
0,85%) u otro medio mineral
troles para P-soluble: ajustar el pH a 5,0 con cido sulfrico y llevar a 20mL con agua destilada
Agregar
426
Lillian Frioni
con KCl 2N y valorando con electrodos especficos o destilacin por arrastre de vapor. P-biomasa: extrayendo el P
soluble luego de las incubaciones.
Materiales
desecador con conexin a vaco, bomba de vaco
cloroformo puro, libre de etanol
K2SO4 0,5 M
Agitador
filtros
cido sulfrico concentrado
K2Cr206 0,0667M
estufa a 150C
espectrofotmetro
curva patrn (glucosa, ftalato de K)
Tcnica
Extraccin
tomar 1 mL de la primera suspensin-dilucin y pasarlo a otro tubo con 9 ml de agua estril (dilucin
10-2)
Dejar
Se
Filtrar con papel filtro N 42 plegado y recoger en recipientes con tapa. El pH de los filtrados debe estar entre
6,5 y 6,8
Medio
glucosa
K2HPO4
agar
extracto de suelo
agua
Tcnica:
El
10g
0,2 g
15g
20 mL
1.000 mL
Extracto de suelo
Analizar
Guardar
proceder como anteriormente hasta la suspensin-dilucin adecuada segn la densidad microbiana de las
muestras (10-7, 10-8, etc.). Cambiar los punteros de la
pipeta automtica en cada paso o usar una pipeta estril y enjugarla 5 o ms veces en una dilucin antes de
pasar a la siguiente
Fumigar
Agitar
435
Actinomicetes
Medio
glicerol
asparaginato de Na
K2HPO4
agar
agua destilada
10g
1g
1g
15g
1000 mL
Hongos
Medio
peptona
5g
glucosa
10g
KH2PO4
1g
MgSO4
0, 5g
agar
2g
sol. acuosa de Rosa de
Bengala al 1/300
100 mL
agua destilada
900 mL
Agregar en cada caja estril 1 mL de solucin de sulfato
de estreptomicina (75 mg/100 mL) esterilizada por filtracin con filtros millipore de 45 micras y luego el medio en
sobrefusin
Se emplea tambin:
extracto de malta
agar
agua
20g
20g
1L
436
Lillian Frioni
luego de esterilizado y en sobrefusin bajar el pH a 4,55,0 con cido lctico y/o ctrico
Algas
Medio
KH2PO4
NaNO3
MgSO4
CaCl2
NaCl
FeCl3
agua corriente
0,5g
0,5g
0,15g
0,05g
0,05g
0,01g
1000mL
co: celulolticos (aerobios o anaerobios), fijadores de nitrgeno, etc. Los recuentos se efectan en
se
Biomasa microbiana
las muestras no fumigadas se incuban por otros 10 das
mL cada uno
incubar
determinar
Ejemplo
1) 3 tubos/dilucin
N tubos positivos:
Grupos fisiolgicos
Protozoos
425
las
Incubar a la luz con burbujeo de aire, seguir el enriquecimiento por el incremento de los pigmentos y efectuar
aislamientos en el mismo medio slido.
5g
10g
1000mL
Clculo de la normalidad:
Medio
NaCl
agar
agua destilada
pH neutro
N tubos positivos:
N caracterstico:
las
muestras de suelo, frescas o secadas al aire y tamizadas a 2 mm se dividen en dos partes de 50 g cada
una, una de ellas se expone a los vapores de cloroformo puro, obtenidos al efectuar vaco en desecador de
vidrio cerrado hermticamente, con las muestras de
suelo en tapas de cajas de Petri y el cloroformo en vasito central. Colocar papel humedecido con agua en las
paredes para evitar la desecacin
dejar
2) 5 tubos/dilucin
Tcnica:
Se pueden expresar los resultados como N-biomasa procediendo a extraer el N-NH4+ de las muestras incubadas
424
Lillian Frioni
incubar
preparar
determinar
liofilizados: tratamiento que deseca a los cultivos aplicando ciclos de vaco y congelamiento. Los cultivos se conservan desecados en ampollas de vidrio. Al usarlas se les
agrega medio de cultivo lquido y se incuba.
igual
Clculos
a)
h = 100 + H%
100
ejemplo 2
NMP 14,0 microorganismos en
N caract. 532 (10-4)
1 mL de la dilucin 10-4
Celulolticos aerobios
Medio
K2HPO4
NaNO3
MgSO4
FeSO4
agua
1g
0,5 g
0,5 g
0,01 g
1 litro
Repartir
Esterilizar
Tablas de Mc Crady
Expresar el numerador y denominador en las mismas unidades (mg/100g/mg/100g), por ejemplo multiplicar el numerador por 10-3
lleva a humedad fija (por ejemplo 75% de la capacidad de campo o la deseada) y se mezcla
ejemplo 1
N caracterstico: 321 (10-4) NMP 15,0 microorganismos
en 1 mL dilucin 10-4
Tcnica
se
nismos, con ayuda de tablas construdas a partir de algunos datos de recuentos de viables en medio slido (cajas) y luego por clculos estadsticos se infieren todas las
combinaciones posibles. Se entra en la tabla correspondiente con el nmero caracterstico y se lee en NMP en la
alcuota sembrada en la dilucin correspondiente al primero de los nmeros del N caracterstico.
100
437
3 tubos/dilucin
1
000
001
010
011
020
100
101
102
110
111
120
121
130
200
0.0
0.3
0.3
0.6
0.6
0.4
0.7
1.1
0.7
1.1
1.1
1.5
1.6
0.9
201
202
210
211
212
220
221
222
223
230
231
232
300
301
1.4
2.4
1.5
2.0
3.0
2.0
3.0
3.5
4.0
3.0
3.5
4.0
2.5
4.0
302
310
311
312
313
320
321
322
323
330
331
332
333
6.5
4.5
7.5
11.5
16.0
9.5
15.0
20.0
30.0
25.0
45.0
110.0
110.0
140.0
1 = N caracterstico; 2 = NMP
Sembrar con una alcuota de las diluciones ms concentradas (10-1) la superficie de caja de Petri con el medio anterior solidificado con 15 g/L de agar. Colocar encima un disco de papel de filtro estril del dimetro de la
caja. Incubar
Efectuar
438
Lillian Frioni
Amilolticos
Medio
solucin salina estndar
50 mL
extracto de suelo
10 mL
almidn
1,5 g
NH4NO3
1,0 g
agua
940 mL
agar
20 g
Aislamientos y recuentos
Azotobacter y Derxia
medio LG
(Dbereiner, 1980)
sacarosa
20 g
K2HPO4
0,05 g
0,15 g
KH2PO4
CaCl2
0,01 g
MgSO4 7 H2O
0,20 g
0,002 g
Na2MoO42H2O
FeCl3
0,01 g
azul bromotimol (0,5% en etanol)
2,0 mL
CaCO3
1,00 g
agar
15 g
agua
1 litro
pH
6,8 (color verde)
5g
MgSO4
2,5 g
NaCl
2,5 g
Fe2 (SO4)3
0,05 g
MnSO4
0,05 g
agua
1 litro
Para Derxia: reemplazar sacarosa por almidn o glucosa, omitir el carbonato de calcio y agregar 0,01g
NaHCO3
Recuento
Azospirillum (NFb)
(Dbereiner, 1980)
cido mlico
5,0 g
K2HPO4
0,5 g
MgSO4 7 H2O
0,2 g
NaCl
0,1 g
CaCl2
0,02 g
Na2MoO4 2 H2O
0,002 g
MnSO4 H2O
0,01 g
Fe EDTA 91,64% peso/vol, agua)
4,0 mL
azul bromotimol (0,5% p/vol. en etanol) 3,0 mL
KOH
4,5 g
biotina
0,1 mg
agua
1 litro
pH 6,8 (color verde) antes de
agregar el agar (semi-slido)
1,75 g agar
Recuento
cubrir con pequeos trozos de papel de filtro, impregnarlos con solucin de verde de malaquita y calentar
con mechero suavemente por 5 minutos, evitando ebullicin, agregar colorante de ser necesario.
(Verde de malaquita: 0,5g, agua destilada 100mL)
lavar
con agua
contrastar
lavar
Las esporas se ven verdes y las clulas vegetativas rosadas. Sin teir se pueden observar en microscopio de contraste de fases y muchas veces se aprecian en la coloracin de Gram de cultivos viejos.
Cpsulas
Colocar una gota de tinta china en un portaobjeto limpio
Siembra y aislamiento
Sembrar o inocular es introducir artificialmente un inculo microbiano en un medio adecuado, con el fin de estudiarlo, propagarlo, aislarlo en cultivo puro. Puede realizarse en medio slido, semislido o lquido, con ayuda de
ansa, pipeta, punta, hisopo.
423
Siembra en placas
en superficie: por baado, colocar 0,1-0,5mL de la muestra con pipeta estril en el centro de la caja y distribuir a
toda la caja con un rastrillo de vidrio estril
en estras, cargar el ansa y efectuar estras paralelas en
la cuarta parte de la caja, se quema el ansa y se enfra, se
gira la caja 90 y se vuelve a estriar tocando 3-4 veces el
rea sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de
caja. Por ltimo, sin quemar el ansa, se estra el resto de
la superficie sin sembrar. De esta forma se facilita el aislamiento de colonias
por inclusin: colocar 1mL de la muestra en una caja de
Petri estril y vaca, sobre ella se agregan 15-20mL de
medio de cultivo fundido y mantenido en sobrefusin a
45C, se agita la placa para mezclar intimamente, movindola 4 veces en sentido horario, 4 en sentido contrario y hacia ambos costados, antes de que el agar se solidifique.
Las cajas se incuban invertidas, para evitar que el agua
de condensacin caiga sobre el medio dando crecimiento
confluente e impidiendo la formacin de colonias.
Cada clula viable dar origen a una colonia,
de modo que la siembra en placas se usa para
cultivar, aislar y contar a los microorganismos.
Cultivo puro: a partir de colonias del mismo tipo se realiza un examen microscpico a fin de mostrar clulas se-
422
Lillian Frioni
Preparacin de un frotis
extendido del material (cultivo slido o lquido) sobre un
portaobjeto limpio y desengrasado con alcohol. Si se parte de material slido (alimentos, suelo, colonias sobre agar)
colocar una gota de agua en el portaobjeto y disgregar el
material en una fina capa sobre el vidrio con ayuda del
ansa
Gram positivas, retienen el primer colorante- cristal violeta o violeta de Genciana- y se ven violetas y Gram
negativas, que se decoloran con alcohol, acetona o mezcla de ambos y se se tien con el segundo colorante,
como la safranina y se ven rosadas. El complejo formado por el cristal violeta y el iodo del lugol (mordiente) es
extrado, mientras que en las G+ esto no ocurre por una
diferente composicin y estructura de la pared celular
(captulo 2).
Las levaduras, eucariotas con paredes gruesas pero sin
peptidoglicano, se tien como Gram+, en este caso no es
la composicin qumica sino la estructura fsica de la pared lo que le confiere la Gram positividad.
lavar
ma.
(Lugol: iodo 1g, ioduro de K, 2g, agua destilada 300mL :
disolver el iodo y el IK en agua, dejar de un da para el
otro para disolver completamente, guardar en frasco oscuro)
con solucin de safranina y dejar 1 minuto. Lavar
y secar
(safranina: 2,5% (p/v) en alcohol 95%, 10mL, agua destilada 100mL)
Azotobacter
observar
10
-1
-1
cubrir
leer
entre 5-7 y hasta 14 das: colonias tpicas transparentes, brillantes, distinguir de contaminantes.
Azospirillum
Coloracin diferencial (Gram): evidencia diferencias en
la composicin fsica y qumica de las bacterias y permite
diferenciarlas entre si:
Coloracin de esporas
con
cubrir
decantar
agitar
leer
439
colocar las races en frasco que pueda cerrarse hermticamente: de suero, tipo antibitico o los empleados como biberones, tapar con tapn de goma y precinto de aluminio. Reemplazar el aire por N2 y 5% de
aire, dejar a temperatura ambiente toda la noche para
superar la fase de latencia en la reduccin observada
en gramneas
incubar
los
440
Lillian Frioni
Maceracin del ndulo con auxilio de varilla de vidrio, bistur o ansa estril, puede efectuarse entre
dos portaobjetos o en un borde de la tapa de la caja
donde se efectuar el aislamiento, con unas gotas
de agua
tomar
la llama del mechero en posicin vertical y luego ir levantndola hasta que quede toda al rojo, pasarla por la
llama en un ngulo de 60 con la vertical, mantenindola siempre en posicin paralela al cuerpo.
flambear
una
leer
el metal adyacente
introducir
efectuar
Asociacin Rhizobium-leguminosa
(Balatti y Jardim Freire, 1996; FAO, 1983 y 1984; Duhoux
y Nicole, 2004; Graham y Vance, 2000; Milnitsky et al.,
1997; NifTAL, 1981)
Aislamiento de rhizobios a partir de ndulos (figura 1)
lavar cuidadosamente las races noduladas bajo el agua
de la canilla
elegir
Aislamiento
1. en superficie: sembrar por agotamiento con ansa
en superficie de medio EMA (extracto de levadura manitol agar), llamado tambin M-79, con rojo
Congo
2. en inclusin: colocar 1 mL de agua estril en 3 cajas de
Petri vacas. Con el ansa flambeada tomar contenido
nodular y diluirlo sucesivamente en las 3 cajas. Agregar
el medio en sobrefusin (menos de 45C) y por repetidos movimientos mezclar con el inculo
incubar
las cajas en posicin invertida a 28C: las colonias de rhizobios de crecimiento rpido aparecen a los
transferir
quemar
nuevamente el ansa
421
Las estructuras de los hongos se aprecian muy bien tocando las colonias suavemente con una cinta adhesiva,
la que luego se pega sobre un portaobjeto, de esta manera se evita la rotura del micelio que ocurre con el uso
de ansas, puntas, etc. Tambin se aprecian colocando la
caja de Petri sobre la platina del microscopio y tratando
de enfocar a bajo aumento, regulando la luz a niveles adecuados.
Bacterias
al
clulas
Tinciones
Las coloraciones de bacterias tienen por objeto:
aumentar el contraste de las clulas con el medio, lo
que permite distinguir forma y tamao
diferenciar
evidenciar
464
Lillian Frioni
441
2-3 das y las de crecimiento lento, al cabo de 1 semana. Son grandes, incoloras, mucosas, de superficie lisa
y brillante. Los contaminantes generalmente se colorean con el rojo Congo, aunque hay excepciones como
Agrobacterium radiobacter y cultivos viejos de rhizobio
10 g
0,5 g
0,2 g
0,1 g
1g
15 g
10 mL
1 litro
rante, o sobre algodn y papel de filtro en cajas estriles, para su germinacin a la oscuridad y temperatura
adecuada a cada leguminosa.
Siembra
e inoculacin
Para leguminosas de semilla pequea (Medicago, Trifolium, etc.) tubos grandes (19 x 2 cm) con 25 mL de medio salino para plntulas, como el de Jensen :
CaHPO4
K2HPO4
MgSO4 7H2O
NaCl
Cl3Fe
agua
agar
pH
sembrar
Se realiza a tres niveles: laboratorio, invernculo o cmara controlada y campo. Se parte de una coleccin
de cepas autctonas y otras cedidas por centros de coleccin.
llevar
se
1,0 g
0,2 g
0,2 g
0,2 g
0,1 g
1 litro
8 g
6,8-7,2
llevar
Evaluacin:
la experiencia concluye cuando se observa la mxima diferenciacin entre los tratamientos (T) y
(N), pero antes que los primeros comiencen a secarse
(6-8 semanas). Con ayuda de ansa o varilla se sacan
las plantas con el medio, se corta la parte area, se
coloca en sobre de papel con su correspondiente numeracin y se determina su peso fresco y luego su peso
seco a 65C, hasta peso constante.
442
Lillian Frioni
Pero son sin duda los ensayos de campo los que permitirn emitir opinin ms acertada sobre el comportamiento simbitico de combinaciones rhizobio-leguminosa.
Ensayos de campo
Eleccin del lugar: los suelos con bajo nmero de rhizobios y nitrgeno disponible son probablemente los ms
tiles para el ensayo de cepas, pero para probar otras
cualidades adems de la eficiencia, como la capacidad
competitiva, se requiere una alta poblacin de rhizobios
nativos. El lugar debe estar lo suficientemente nivelado
para evitar el lavado luego de una lluvia y la contaminacin de las parcelas. Elegir el diseo experimental ms
conveniente
Inoculacin:
Incubacin:
yo de laboratorio
comparar distintos mtodos de inoculacin, sta debe efectuarse segn las normas de prctica comn en la zona.
Se desea establecer entre 1.000 a 10.000 rhizobios viables/semilla
Evaluacin: en el momento del raleo ya se aprecia nodulacin, pero sta se evala al comienzo de la floracin,
en unas 10 plantas por parcela: nmero y peso seco de
los mismos. Cosecha: una superficie determinada (1 m2)
para cultivos forrajeros y las lneas centrales para los cultivo de grano. Se evala: peso fresco y seco de la parte
area, N% y produccin de nitrgeno por hectrea. En
caso de granos: nmero de cajas o vainas por planta, peso
seco de las mismas y de los frutos, N% de frutos y se
calcula la produccin de nitrgeno = N% x materia
seca(kg/ha)
463
462
Lillian Frioni
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443
controlar la calidad
Inoculantes lquidos se usan cuando existe buena coordinacin entre el laboratorio y las tareas de campo y
son tiles a nivel experimental (solario, invernculo) o
cuando se observan fallas en la aplicacin de otros tipos de inoculantes en el campo y se desea salvar el
ensayo, se riega el surco con un cultivo denso de la
bacteria. Actualmente se vuelven a emplear para inocular grandes reas de leguminosas, como la soja en
Brasil y Argentina. La botella o recipiente de plstico
se adosa a la sembradora y el inoculante convenientemente diluido, gotea sobre las semillas a medida que
son sembradas.
Inoculantes slidos, son muy usados sobretodo cuando se separa en el tiempo la produccin de su empleo.
En general el soporte slido es la turba, tierra con alto
contenido de materia orgnica (60-70%), pero si no se
dispone de buenas turberas, se han ensayado otros
soportes: lignita, cscara de cereales molida, polmeros orgnicos (poliacrilamida, alginatos) o minerales como arcillas, tierra de diatomeas, etc.
Se usa: turba estril por rayos gamma o en autoclave
en las bolsas de poliestireno que luego se inoculan con
el caldo con ayuda de una jeringa y aguja estril. Se
deja madurar para que la bacteria se multiplique en el
soporte. Actualmente casi todos los inoculantes emplean
turba estril para evitar disminuciones del inculo por la
competencia de hongos, actinomicetes y otras bacterias
conducir
reas de investigacin para superar problemas asociados con la eleccin de las cepas y su sobrevivencia en el producto final.
Tcnicas de inoculacin
En semillas:
en seco, consiste en mezclar el inoculante en el depsito de semillas de la sembradora; ambos productos van
cayendo en el surco. A pesar de que no hay un contacto
ntimo entre el inculo y la semilla, muchos productores
lo prefieren por la comodidad que significa no emplear
agua.
hmedo,
pildorizacin,
444
Lillian Frioni
Frankia, Azospirillum, hongos micorrcicos u otro microorganismo a ser empleado como inoculante con el alginato, que queda al 2%, mantenerlo en agitacin con
barra magntica
El inoculante se forma dejando caer gotas de medioalginato sobre el cloruro de calcio, con pipeta o filtro de
porcelana con pequeos orificios. Se forman pequeas
esferas de alginato de calcio (gel) con las clulas atrapadas que se lavan para eliminar exceso de Cl2Ca con
agua estril y se dejan secar una noche bajo flujo laminar. El gel desecado ocupa pequeo volumen y se mantiene en frascos o bolsas en lugar fresco hasta su uso.
En el suelo
Cuando se aplican pesticidas, o cuando la semilla puede
daarse fcilmente con el manipuleo como en el caso de
la de man, se pueden aplicar tcnicas de inoculacin al
suelo con formas lquidas o granuladas de inoculantes.
granular,
lquidos
se emplean al igual que los anteriores cuando se desea evitar el manipuleo de la semilla, pero
se requiere transporte de agua y maquinaria con pulverizador.
461
460
Lillian Frioni
AF
NH
AH + AF
Centrifugar
25 minutos a 3.000rpm
y 664nm
Calcular
relaciones:
Q 2/4 = Ab280/Ab472
Q 4/6 = Ab472/Ab664
Q 2/6 = Ab280/Ab66
445
agregar
de una vez el polvo de recubrimiento mezclando suavemente hasta que toda la semilla quede recubierta y separada
extender
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under differing managements systems. 1998 Biol &
Fertil Soils 27:430-438
Campitelli, P., Velasco, M. y Ceppi, S. Evaluacin de la
calidad de compost: parmetros qumicos y espectroscpicos. 2005, XIV Congreso Argentino de Fsico Qumica y Qumica Inorgnica, Termas del Ro Hondo,
Santiago del Estero
Arachis hypogea
Glycine max
Medicago sativa
Phaseolus vulgaris
Inoculacin simple
seguir
atentamente las instrucciones del inoculante comercial a emplear, preparar el adhesivo y agregar el
volumen recomendado
agregar
agregar el inoculante y adhesivo a la semilla y mezclar hasta que toda la semilla quede uniformemente recubierta por una capa negra de inoculante
extender
Pildorizacin (pelletizacin)
preparar la solucin adherente, por ejemplo: celofx-A
50g/L de agua o solucin de goma arbica al 40%, con
24 horas de antelacin
agregar
4,0
3,0
4,0
2,5
Serologa
Se han empleado las reacciones antgeno-anticuerpo:
aglutinacin: interviene la totalidad de la clula
precipitacin:
Obtencin de antisuero con alto ttulo por inmunizacin en conejos; se cultiva el rhizobio en medio EMA,
slido o lquido (este ltimo evita la excesiva acumulacin de polisacridos extracelulares que acumulan muchas cepas), se prepara una suspensin densa (108 clulas/mL) luego de repetidos lavados de las clulas en
solucin fisiolgica.
10
10
0,2-5
8
Reconocimiento de rhizobios
grumos
100
100
50
100
goma
arbiga(mL)
446
Lillian Frioni
cin. Los sueros se conservan congelados, con el agregado de algn antisptico, en pequeos volmenes,
que facilitan su empleo. La determinacin del ttulo
puede efectuarse en tubos chicos de hemlisis o en
bandejas:
diluir
Reaccin somtica: comienza con la aparicin de granulaciones finas y pueden dar lugar a depsito compacto de
sobrenadante transparente.
con ndulos triturados: resulta til cuando se desea identificar a las cepas que dieron origen a un
gran nmero de ndulos. Se trabaja con el contenido nodular, sin efectuar el aislamiento. Los ndulos lavados se
maceran uno por uno en 1-2 mL de sol. fisiolgica; se
calienta a 100C unos minutos y se pipetea unas gotas
dentro de pequeos tubos o en bandejas de plstico con
cavidades individuales (tipo para ELISA). Se agregan unas
gotas de los antisueros de las cepas que se desean identificar, se cubre con un vidrio la bandeja para evitar evaporacin y se observa la aglutinacin a la media hora.
tan varias cavidades en agar-agua muy puro solidificado en caja de Petri o sobre un portaobjeto.
ELISA, mtodo indirecto muy sensible que emplea IgGanticonejo conjugado con fosfatasa alcalina y el sustrato
p-nitrofenil fosfato. La enzima libre se lee a 405 nm luego
de 30 minutos a temperatura ambiente, con la solucin
del sustrato como blanco.
Inmunofluorescencia: se emplean mucho en estudios
ecolgicos: se combina el anticuerpo con una sustancia que fluoresce en UV, como isocianato de fluorescena o naranja de acridina que al reaccionar con el
antgeno especfico produce una fluorescencia que se
visualiza en el microscopio equipado con luz fluorescente
sembrar
transferir mutantes dobles a EMA slido, confirmar resistencia a ambos antibiticos sembrando en cajas con
los dos antibiticos
confirmar
sin antibiticos; con estreptomicina y con espectinomicina para conocer la respuesta a concentraciones de
antibiticos
459
lerable y con apariencia modificada; el pH debe ser alcalino y la celulosa estar presente. Se toma 1 g de compost en un vaso de 100 ml se moja con algunas gotas de
etanol si el compost estuviera seco y se agrega 20 mL
de cido perclrico al 36%. Se agita 5 minutos y se filtra.
Se agrega 2 mL de solucin de iodo al filtrado y se
agita. Se colocan algunas gotas en una placa de vidrio y
se examina la coloracin y la cantidad de precipitado
formado.
Coloracin amarilla y poco precipitado, significa com-
Aglutinacin
Test
Un compost bien maduro presenta nitratos en abundancia y apenas trazas de amonio; un compost semimaduro
tiene amonio y no hay nitratos.
Si la muestra presenta amonio y nitratos, es porque se
trata de una mezcla de abonos con distinto tiempo de
preparacin, o que se han agregado fertilizantes minerales. Con trazas de nitrato o amonio, el compost se encuentra en fase intermedia de fermentacin, en la cual
casi todo en nitrgeno est en forma de protena (nitrgeno orgnico).
7. Test para almidn
Tres tipos de carbohidratos son encontrados en el compost: azcares, almidn y celulosa. Los azcares son
los primeros componentes en ser metabolizados, generalmente en una semana; el almidn en la cuarta a quinta semana ya est en la fase mxima de descomposicin y el compost est bioestabilizado, con olor ms to-
post maduro.
La secuencia de coloracin para el proceso de compostaje es la siguiente: azul oscuro, azul claro, ceniza, verde
y amarillo. La coloracin roja se encontrar en composts
parcialmente degradados.
458
Lillian Frioni
Tcnicas clsicas
1. Alteracin de las caractersticas
Reduccin del volumen: la masa final de la pila debe
ser por lo menos 1/3 de la del material original.
4. Test de coloides
En el compostaje la materia orgnica se va fraccionando,
pasando de materiales groseros al estado coloidal, con
partculas que no sedimentan cuando se hace una suspensin del material con solucin de sulfato de amonio.
Otra prueba muy sencilla: se toma una muestra del compost en la palma de la mano y se agrega agua suficiente
para formar una pasta, que debe ser trabajada con la punta
de los dedos, amasndola. Separando las manos se puede observar:
seleccionar
Compost
crudo: las palmas de las manos estarn prcticamente limpias porque el material se desprendi en
partculas sueltas.
fra
dividir
3. Test de temperatura
Con un termmetro se puede acompaar el proceso de
compostaje, midiendo la temperatura entre 40 y 60 cm de
profundidad.
La
2. Test de maduracin
Se introduce una vara de madera en la pila de compost
durante todo el proceso. Al removerla se verifica:
Si
Compost maduro: las palmas de las manos se mostrarn como se estuviesen recubiertas por una grasa
negra. Lavndolas, el agua tomar una coloracin negra, como el humus, cosa que no ocurrir con el compost semimaduro.
5. Test del pH
Midiendo el pH durante el compostaje, se puede saber
como se desarrolla la descomposicin, principalmente si
los datos se asocian a otros tests.
incubar a 28C y efectuar observaciones diarias, algn contaminante puede ser resistente a los niveles
de antibiticos empleados (cuidar el paso de la desinfeccin)
leer
Recuento de Rhizobios
1. Recuento total en cmara: en cmara cuenta-glbulos se aplica a cultivos en fase exponenecial de crecimiento, contenidos nodulares, caldos, en el laboratorio o en la fbrica de inoculante, antes de impregnar la
turba, donde se postula que todas las clulas estn viables. Puede evaluarse tambin la turbidez (densidad
ptica a 600 nm) frente a escala patrn confeccionada
por recuento de viables en caja.
2. Recuento de viables en medio slido: procedimiento
habitual a partir de diluciones seriadas de la muestra,
por siembra en superficie(0,2mL) o en inclusin (1 mL)
en medio EMA. Lectura en cajas con entre 30 y 300
colonias. Se emplea con cultivos puros, con inoculantes a base de turba estril y tambin con turba no estril, ya que los contaminantes pueden ser del orden
de 106/g y el rhizobio debe superar 108/g. En las ltimas diluciones predominan las colonias tpicas de esta
bacteria y pueden contarse.
3. Recuento de viables en plantas: emplea la capacidad de cada cepa de rhizobio para nodular con una leguminosa y presume que una sola clula agregada a la
planta test puede originar una poblacin que nodule a
las leguminosa especfica.
sembrar semillas germinadas estrilmente en tubos con
en cuenta el nmero de tubos positivos (con ndulos) en 4 diluciones con tubos positivos y negativos
tomar
447
Lillian Frioni
8
7
6
5
4
3
2
1
0
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
457
se
si
las races se cortaron en fragmentos de 1cm se puede calcular la longitud de raz colonizada por alguna estructura de los hongos endomicorrcicos y/o calcular el
% de segmentos colonizados
0
1
2
3
4
5
0.23
0.33
0.49
0.79
1.3
2.4
0.31
0.46
0.70
1.1
1.7
3.5
0.43
0.64
0.95
1.4
2.2
5.4
0.58
0.84
1.2
1.8
2.8
9.2
0.76
1.1
1.5
2.1
3.5
16
0.95
1.3
1.8
2.5
4.3
-
Clculos
p1 es el N bolsas positivas en la dilucin menos concentrada en donde todas las unidades son positivas, o donde
se encuentra el mayor N de tubos o bolsas positivos, p2
y p3 son los N de unidades positivas en las 2 siguientes
diluciones. Leer en la tabla el valor correspondiente a p3:
NMP en la alcuota de la segunda dilucin.
Ejemplo:
Se
positivos:
10-5
5
10-6
5
10-7
3
10-8
1
10-9
0
p1= 5; p2 = 3 y p3 = 1
NMP = 1,1 en inculo de 10-6 N de rhizobios/g = 1,1 x 106
448
Inoculantes
Una de las mayores dificultades en la aplicacin prctica
de inoculantes con estos cultivos es la imposibilidad del
hongo para propagarse en medio de cultivo. Luego de trabajoso aislamiento de esporas a partir del suelo por tcnicas de tamizado hmedo y flotacin, se caracterizan las
mismas segn claves apropiadas (morfologa, color, tipos
de paredes). Cada tipo de espora se propaga en las llamadas plantas trampas, especies como sorgo, cebolla.
Tcnica: el inculo se coloca 2-3 cm ms abajo donde se
colocarn las semillas en macetas con mezcla de suelo y
arena (1:2 v/v) con pH ligeramente cido. A los 3-4 meses
en invernculo se observa la colonizacin endomicorrtica
y el aumento del nmero de esporas en el suelo (figura 8)
456
Lillian Frioni
Materiales
segmentos de races finas de 1 cm
KOH al 10 %
H2O2(10 vol)
azul de tripn 0,05 % en lactofenol
lactofenol
Tcnica
Transferir segmentos de raz a frasco con tapa rosca de
unos 15 mL, cubrir con sol. KOH al 10 %, tapar y calentar a 90C 1-2 h o a temperatura ambiente por 1 da (en
races muy oscuras puede tratarse en autoclave 13-20
minutos)
Eliminar la KOH y sumergir las races en H
Observacin (figura 7)
O 10 vol. 15
2 2
minutos
Endomicorrizas
Nota: Algunos pases emplean un mtodo sencillo de evaluar la calidad de inoculantes en turba no estril: se inoculan unas 50 semillas con una alcuota de inoculante calculada segn las indicaciones de la bolsa; se siembran
stas en jarras de Leonard (unas 3-4 por cada inoculante)
colocando testigos sin inocular. A las 2-3 semanas se observa nodulacin: por lo menos 2 ndulos/planta. Si no se
forman estos ndulos, su calidad es inferior, o no posee el
inculo especfico.
Transferir
Eliminar
el colorante y adicionar lactofenol, donde pueden dejarse las races por mucho tiempo
Montar
entre porta y cubreobjeto un trozo de raz coloreada, aplastarlo ligeramente para separar los tejidos
enjuar
H3BO3
MnCl2
ZnSO4
CuSO4
Na2MoO4 H2O
mg/L
HCl-tiamina
ac. nicotnico
HCl-piridoxina
biotina
c. flico
pantotenato Ca
riboflavina
10
50
50
22.5
10
10
10
2.86
1.81
0.22
0.08
0.025
Soluciones madre
1) KH2PO4
100 g/L
2) MgSO47H20 10 g/L
QMOD
g/L sol.final mLsol.madre N sol.madre
Extracto de levadura
0.5
Bacto peptona
5
Glucosa
10
MgSO4 2H2O
0.2
KCl
0.2
Lecitina
5 mg
FeNa Edta 0.02 M
Sol. Oligoelementos =
a la de BAP
tampn K2HPO4
0.3 g
NaH2PO4
0.26 g
2
4
7
9
MgSO4 2H2O
0.2 mM
CaCl2 2H2O
0.07 mM
NH4Cl
5.0 mM
Propionato de Na 5 mM
FeNa EDTA
0.02 mM
Sol. Oligoelementos
vit BAP
tampn
KH2PO4/K2HPO4 10 mM
1 g/L
4) KCl
20 g/L
5) NH4Cl
53,5 g/L
1
10
10
17
7) lecitina
0,5 g/100 mL: disolver 500 mg lecitina de
soja en 50 ml alcohol absoluto, agregar 50 mL agua
destilada
8) CoCl2
9) FeNa EDTA
0,1 g/100 mL
0,734/100 mL
BAP
conc.final
3) CaCl2 2H2O
Lavar
449
g/L ml sol.madre
0.05
0.01
0.267
0.48
0.1
N sol.
5
10
5
5
1
1
1
2
3
5
6
9
10
12
10
15
450
Lillian Frioni
lavar
pasar a erlenmeyer estril tapado y esterilizar superficialmente con sol. al 3% de OsO4, 3' (bajo campana,
gases txicos). La corteza se ennegrece. Si no se dispone del xido de osmio, ensayar con hipoclorito de Ca
(1,5% P/V); de Na (1% P/V de Cl activo = agua de
Trozos en
tubos
Tomar hifas
internas
agregarse una segunda capa en sobrefusin sobre los trozos que facilita la observacin posterior al microscopio.
observar ausencia de contaminantes y colonias tpicas de Frankia pequeas, de unos 0,5 mm de dimetro al mes, se aprecian a la lupa: hifas finas creciendo
radialmente, algunas cepas forman esporangios y vesculas (stas sobre todo en medio sin N), y otras pigmentos rojos. Inicialmente difusas, luego ms densas.
El C activo facilita el pasaje del estado endoftico al
saproftico
Nota: conviene trabajar con ndulos frescos, de otra manera regenerarlos en plntulas hospedantes creciendo en
distintos dispositivos: tubos con sol. hidropnica o con
medio agarizado, en arena-vermiculita, perlita (en vasos
o macetas). El aislamiento es como precedentemente.
Coleccin
Incubar
Purificacin
70% etanol
con
Esterilizacin
pinza
cada
Aislamiento
Directamente de ndulos
Suelo
455
Confirmar pureza
Existen
CaCl2
NaCl
KH2PO4
(NH4)2HPO4
MgSO4 7H2O
sol (1g citrato frrico,
c.ctrico, 100 ml agua)
HCl-tiamina
extracto de malta
sacarosa
agar
agua destilada
0,05 g
0,025 g
0,5 g
0,2 g
0,15 g
0,64 g
1 mL
100 mg
3g
10 g
20 g
1 litro
454
Lillian Frioni
-1
a 10
-4
agitar, transferir 1 o 2 mL a tubo vaco y agregar: 2 gotas HCl concentrado y 5 gotas sol. acuosa BaCl2 al 5 %;
la presencia de sulfatos se manifiesta por aparicin de
precipitado blanco (comparar con testigo). Determinar el NMP como de costumbre.
extracto de levadura
glucosa
agar
fitina al 2 %
agua
pH
2 g
20 g
15 g
110 mL
1 litro
7,0
Solubilizadores de fsforo
Medio
extracto de levadura
glucosa
agar
agua
fuente de fosfato insoluble*
actidiona al 1%
pH
para recuento por siembra en inclusin se colocan 0,5 o 1 mL de las suspensiones-diluciones del sue-
inocular
incubar
** Oligoelementos (g/L)
lectura: colocar aproximadamente 1 mL de cada tubo a
H3BO3
MnSO4 4H2O
ZnSO4 7H2O
CuSO4 5H2O
(NH4) 2MoO4 H2O
CoSO4 7H2O
*** citrato frrico: cloruro frrico
cido ctrico
Asociaciones micorrticas
Inoculacin de plntulas
(Brundett et al., 1996 ; Gonzlez y Barrios, 1983 ; Honrubia et al., 1992, y 1994 ; Philips y Hayman, 1970; Schenk
y Perez, 1988; Sieverding, 1991)
Inculo
Ectomicorrizas
cian races engrosadas, manto fngico, muchas veces
coloreado. Efectuar cortes a mano de las bifurcaciones
dicotmicas con ayuda de bistur y observar al microscopio entre porta y cubreobjeto.
Describir
2 g
20 g
15 g
1 litro
2g
6 mL
7,0
Observar macroscpicamente races de pinos: se apre Observar colonias rodeadas de halo transparente. Pue-
451
de micorrizas: se lavan con agua corriente durante una hora, se lavan varias veces con agua destilada, se desinfectan con H2O2 110 vol. durante tiempo a
determinar (segundos a minutos), lavar con agua estril
y depositar sobre medio slido estril. Incubar a 23C
1,5
0,7
0,6
0,1
0,2
0,01
10
10
Reactivo de Nessler
solucin A:
I2Hg
IK
50 g
36,5 g
50 mL
0,2g
950 mL
KOH
150g
Agua dest. 1 litro
En el momento de usar, mezclar partes iguales de A y B.
actividad
452
Lillian Frioni
x 100
N-orgnico
Nitrificacin
Recuentos en medio lquido
nitritantes: sol.salina estndar
(NH4)2 SO4
CaCO3
agua destilada
50 mL
0,5 g
1g
950 mL
50 mL
1g
1g
950 mL
repartir
lo (3 o 5 tubos/dilucin)
incubar
21 das a 28C
Lectura
Nitritantes: se analizan en los tubos nitritos o nitratos con
reactivo difenil-amina sulfrica (difenilamina 10 g; cido
sulfrico 1 litro, verter sobre 200 mL agua destilada): vaciar casi completamente los tubos de modo que slo queden 1-2 gotas, agregar a cada uno 10 gotas de cido sulfrico concentrado y puro y 10 gotas de reactivo. Tubos
positivos: aparicin color azul intenso a altas concentraciones y fugaz a concentraciones lmites
Nitratantes: deteccin nitratos con difenilamina sulfrica,
luego de eliminar los nitratos restantes con urea en medio
sulfrico: proceder como anteriormente, agregar unos 50
mg urea, 10 gotas de cido sulfrico y 10 gotas difenilamina Tubos positivos: intenso color azul
Nitrificacin en medio slido
Slico-gel: mezclar partes iguales de sol. silicato de sodio diludo a 9Baum y sol. de HCl a 13Baum (verter
Estirilizar
20 minutos a 110C
Desnitrificacin
2g
10 g
5g
1 litro
Tcnica ecolgica
incubar en condiciones de anaerobiosis (exceso de agua)
se
Puede
Inocular
Aislamiento de microorganismos
sulfatorreductores
Medio
KNO3
glucosa
CaCO3
sol.salina estndar
453
realizarse en medio de agar simple suplementado con Na2SO4 0,5% y FeSO4 0,005 %, inoculando por
agotamiento con muestra de suelo suspendido en agua.
Incubar en la oscuridad a 25-30C por una o dos semanas. Se observan las colonias negras resultantes de la
precipitacin del SFe
NH4Cl
K2HPO4
MgSO4
Na2SO4
CaCl2
lactato de Na (al 60 %)
agua destilada
Repartir
1g
0,5 g
2 g
0,5 g
0,1 g
6 mL
1 litro
esterilizar
Siembra: si el medio sali del autoclave luego de varias
0,25 g
0,10 g
0,10 g
2 g
5 g
1 litro
ro de sodio
452
Lillian Frioni
x 100
N-orgnico
Nitrificacin
Recuentos en medio lquido
nitritantes: sol.salina estndar
(NH4)2 SO4
CaCO3
agua destilada
50 mL
0,5 g
1g
950 mL
50 mL
1g
1g
950 mL
repartir
lo (3 o 5 tubos/dilucin)
incubar
21 das a 28C
Lectura
Nitritantes: se analizan en los tubos nitritos o nitratos con
reactivo difenil-amina sulfrica (difenilamina 10 g; cido
sulfrico 1 litro, verter sobre 200 mL agua destilada): vaciar casi completamente los tubos de modo que slo queden 1-2 gotas, agregar a cada uno 10 gotas de cido sulfrico concentrado y puro y 10 gotas de reactivo. Tubos
positivos: aparicin color azul intenso a altas concentraciones y fugaz a concentraciones lmites
Nitratantes: deteccin nitratos con difenilamina sulfrica,
luego de eliminar los nitratos restantes con urea en medio
sulfrico: proceder como anteriormente, agregar unos 50
mg urea, 10 gotas de cido sulfrico y 10 gotas difenilamina Tubos positivos: intenso color azul
Nitrificacin en medio slido
Slico-gel: mezclar partes iguales de sol. silicato de sodio diludo a 9Baum y sol. de HCl a 13Baum (verter
Estirilizar
20 minutos a 110C
Desnitrificacin
2g
10 g
5g
1 litro
Tcnica ecolgica
incubar en condiciones de anaerobiosis (exceso de agua)
se
Puede
Inocular
Aislamiento de microorganismos
sulfatorreductores
Medio
KNO3
glucosa
CaCO3
sol.salina estndar
453
realizarse en medio de agar simple suplementado con Na2SO4 0,5% y FeSO4 0,005 %, inoculando por
agotamiento con muestra de suelo suspendido en agua.
Incubar en la oscuridad a 25-30C por una o dos semanas. Se observan las colonias negras resultantes de la
precipitacin del SFe
NH4Cl
K2HPO4
MgSO4
Na2SO4
CaCl2
lactato de Na (al 60 %)
agua destilada
Repartir
1g
0,5 g
2 g
0,5 g
0,1 g
6 mL
1 litro
esterilizar
Siembra: si el medio sali del autoclave luego de varias
0,25 g
0,10 g
0,10 g
2 g
5 g
1 litro
ro de sodio
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-1
a 10
-4
agitar, transferir 1 o 2 mL a tubo vaco y agregar: 2 gotas HCl concentrado y 5 gotas sol. acuosa BaCl2 al 5 %;
la presencia de sulfatos se manifiesta por aparicin de
precipitado blanco (comparar con testigo). Determinar el NMP como de costumbre.
extracto de levadura
glucosa
agar
fitina al 2 %
agua
pH
2 g
20 g
15 g
110 mL
1 litro
7,0
Solubilizadores de fsforo
Medio
extracto de levadura
glucosa
agar
agua
fuente de fosfato insoluble*
actidiona al 1%
pH
para recuento por siembra en inclusin se colocan 0,5 o 1 mL de las suspensiones-diluciones del sue-
inocular
incubar
** Oligoelementos (g/L)
lectura: colocar aproximadamente 1 mL de cada tubo a
H3BO3
MnSO4 4H2O
ZnSO4 7H2O
CuSO4 5H2O
(NH4) 2MoO4 H2O
CoSO4 7H2O
*** citrato frrico: cloruro frrico
cido ctrico
Asociaciones micorrticas
Inoculacin de plntulas
(Brundett et al., 1996 ; Gonzlez y Barrios, 1983 ; Honrubia et al., 1992, y 1994 ; Philips y Hayman, 1970; Schenk
y Perez, 1988; Sieverding, 1991)
Inculo
Ectomicorrizas
cian races engrosadas, manto fngico, muchas veces
coloreado. Efectuar cortes a mano de las bifurcaciones
dicotmicas con ayuda de bistur y observar al microscopio entre porta y cubreobjeto.
Describir
2 g
20 g
15 g
1 litro
2g
6 mL
7,0
Observar macroscpicamente races de pinos: se apre Observar colonias rodeadas de halo transparente. Pue-
451
de micorrizas: se lavan con agua corriente durante una hora, se lavan varias veces con agua destilada, se desinfectan con H2O2 110 vol. durante tiempo a
determinar (segundos a minutos), lavar con agua estril
y depositar sobre medio slido estril. Incubar a 23C
1,5
0,7
0,6
0,1
0,2
0,01
10
10
Reactivo de Nessler
solucin A:
I2Hg
IK
50 g
36,5 g
50 mL
0,2g
950 mL
KOH
150g
Agua dest. 1 litro
En el momento de usar, mezclar partes iguales de A y B.
actividad
450
Lillian Frioni
lavar
pasar a erlenmeyer estril tapado y esterilizar superficialmente con sol. al 3% de OsO4, 3' (bajo campana,
gases txicos). La corteza se ennegrece. Si no se dispone del xido de osmio, ensayar con hipoclorito de Ca
(1,5% P/V); de Na (1% P/V de Cl activo = agua de
Trozos en
tubos
Tomar hifas
internas
agregarse una segunda capa en sobrefusin sobre los trozos que facilita la observacin posterior al microscopio.
observar ausencia de contaminantes y colonias tpicas de Frankia pequeas, de unos 0,5 mm de dimetro al mes, se aprecian a la lupa: hifas finas creciendo
radialmente, algunas cepas forman esporangios y vesculas (stas sobre todo en medio sin N), y otras pigmentos rojos. Inicialmente difusas, luego ms densas.
El C activo facilita el pasaje del estado endoftico al
saproftico
Nota: conviene trabajar con ndulos frescos, de otra manera regenerarlos en plntulas hospedantes creciendo en
distintos dispositivos: tubos con sol. hidropnica o con
medio agarizado, en arena-vermiculita, perlita (en vasos
o macetas). El aislamiento es como precedentemente.
Coleccin
Incubar
Purificacin
70% etanol
con
Esterilizacin
pinza
cada
Aislamiento
Directamente de ndulos
Suelo
455
Confirmar pureza
Existen
CaCl2
NaCl
KH2PO4
(NH4)2HPO4
MgSO4 7H2O
sol (1g citrato frrico,
c.ctrico, 100 ml agua)
HCl-tiamina
extracto de malta
sacarosa
agar
agua destilada
0,05 g
0,025 g
0,5 g
0,2 g
0,15 g
0,64 g
1 mL
100 mg
3g
10 g
20 g
1 litro
456
Lillian Frioni
Materiales
segmentos de races finas de 1 cm
KOH al 10 %
H2O2(10 vol)
azul de tripn 0,05 % en lactofenol
lactofenol
Tcnica
Transferir segmentos de raz a frasco con tapa rosca de
unos 15 mL, cubrir con sol. KOH al 10 %, tapar y calentar a 90C 1-2 h o a temperatura ambiente por 1 da (en
races muy oscuras puede tratarse en autoclave 13-20
minutos)
Eliminar la KOH y sumergir las races en H
Observacin (figura 7)
O 10 vol. 15
2 2
minutos
Endomicorrizas
Nota: Algunos pases emplean un mtodo sencillo de evaluar la calidad de inoculantes en turba no estril: se inoculan unas 50 semillas con una alcuota de inoculante calculada segn las indicaciones de la bolsa; se siembran
stas en jarras de Leonard (unas 3-4 por cada inoculante)
colocando testigos sin inocular. A las 2-3 semanas se observa nodulacin: por lo menos 2 ndulos/planta. Si no se
forman estos ndulos, su calidad es inferior, o no posee el
inculo especfico.
Transferir
Eliminar
el colorante y adicionar lactofenol, donde pueden dejarse las races por mucho tiempo
Montar
entre porta y cubreobjeto un trozo de raz coloreada, aplastarlo ligeramente para separar los tejidos
enjuar
H3BO3
MnCl2
ZnSO4
CuSO4
Na2MoO4 H2O
mg/L
HCl-tiamina
ac. nicotnico
HCl-piridoxina
biotina
c. flico
pantotenato Ca
riboflavina
10
50
50
22.5
10
10
10
2.86
1.81
0.22
0.08
0.025
Soluciones madre
1) KH2PO4
100 g/L
2) MgSO47H20 10 g/L
QMOD
g/L sol.final mLsol.madre N sol.madre
Extracto de levadura
0.5
Bacto peptona
5
Glucosa
10
MgSO4 2H2O
0.2
KCl
0.2
Lecitina
5 mg
FeNa Edta 0.02 M
Sol. Oligoelementos =
a la de BAP
tampn K2HPO4
0.3 g
NaH2PO4
0.26 g
2
4
7
9
MgSO4 2H2O
0.2 mM
CaCl2 2H2O
0.07 mM
NH4Cl
5.0 mM
Propionato de Na 5 mM
FeNa EDTA
0.02 mM
Sol. Oligoelementos
vit BAP
tampn
KH2PO4/K2HPO4 10 mM
1 g/L
4) KCl
20 g/L
5) NH4Cl
53,5 g/L
1
10
10
17
7) lecitina
0,5 g/100 mL: disolver 500 mg lecitina de
soja en 50 ml alcohol absoluto, agregar 50 mL agua
destilada
8) CoCl2
9) FeNa EDTA
0,1 g/100 mL
0,734/100 mL
BAP
conc.final
3) CaCl2 2H2O
Lavar
449
g/L ml sol.madre
0.05
0.01
0.267
0.48
0.1
N sol.
5
10
5
5
1
1
1
2
3
5
6
9
10
12
10
15
Lillian Frioni
8
7
6
5
4
3
2
1
0
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
457
se
si
las races se cortaron en fragmentos de 1cm se puede calcular la longitud de raz colonizada por alguna estructura de los hongos endomicorrcicos y/o calcular el
% de segmentos colonizados
0
1
2
3
4
5
0.23
0.33
0.49
0.79
1.3
2.4
0.31
0.46
0.70
1.1
1.7
3.5
0.43
0.64
0.95
1.4
2.2
5.4
0.58
0.84
1.2
1.8
2.8
9.2
0.76
1.1
1.5
2.1
3.5
16
0.95
1.3
1.8
2.5
4.3
-
Clculos
p1 es el N bolsas positivas en la dilucin menos concentrada en donde todas las unidades son positivas, o donde
se encuentra el mayor N de tubos o bolsas positivos, p2
y p3 son los N de unidades positivas en las 2 siguientes
diluciones. Leer en la tabla el valor correspondiente a p3:
NMP en la alcuota de la segunda dilucin.
Ejemplo:
Se
positivos:
10-5
5
10-6
5
10-7
3
10-8
1
10-9
0
p1= 5; p2 = 3 y p3 = 1
NMP = 1,1 en inculo de 10-6 N de rhizobios/g = 1,1 x 106
448
Inoculantes
Una de las mayores dificultades en la aplicacin prctica
de inoculantes con estos cultivos es la imposibilidad del
hongo para propagarse en medio de cultivo. Luego de trabajoso aislamiento de esporas a partir del suelo por tcnicas de tamizado hmedo y flotacin, se caracterizan las
mismas segn claves apropiadas (morfologa, color, tipos
de paredes). Cada tipo de espora se propaga en las llamadas plantas trampas, especies como sorgo, cebolla.
Tcnica: el inculo se coloca 2-3 cm ms abajo donde se
colocarn las semillas en macetas con mezcla de suelo y
arena (1:2 v/v) con pH ligeramente cido. A los 3-4 meses
en invernculo se observa la colonizacin endomicorrtica
y el aumento del nmero de esporas en el suelo (figura 8)
458
Lillian Frioni
Tcnicas clsicas
1. Alteracin de las caractersticas
Reduccin del volumen: la masa final de la pila debe
ser por lo menos 1/3 de la del material original.
4. Test de coloides
En el compostaje la materia orgnica se va fraccionando,
pasando de materiales groseros al estado coloidal, con
partculas que no sedimentan cuando se hace una suspensin del material con solucin de sulfato de amonio.
Otra prueba muy sencilla: se toma una muestra del compost en la palma de la mano y se agrega agua suficiente
para formar una pasta, que debe ser trabajada con la punta
de los dedos, amasndola. Separando las manos se puede observar:
seleccionar
Compost
crudo: las palmas de las manos estarn prcticamente limpias porque el material se desprendi en
partculas sueltas.
fra
dividir
3. Test de temperatura
Con un termmetro se puede acompaar el proceso de
compostaje, midiendo la temperatura entre 40 y 60 cm de
profundidad.
La
2. Test de maduracin
Se introduce una vara de madera en la pila de compost
durante todo el proceso. Al removerla se verifica:
Si
Compost maduro: las palmas de las manos se mostrarn como se estuviesen recubiertas por una grasa
negra. Lavndolas, el agua tomar una coloracin negra, como el humus, cosa que no ocurrir con el compost semimaduro.
5. Test del pH
Midiendo el pH durante el compostaje, se puede saber
como se desarrolla la descomposicin, principalmente si
los datos se asocian a otros tests.
incubar a 28C y efectuar observaciones diarias, algn contaminante puede ser resistente a los niveles
de antibiticos empleados (cuidar el paso de la desinfeccin)
leer
Recuento de Rhizobios
1. Recuento total en cmara: en cmara cuenta-glbulos se aplica a cultivos en fase exponenecial de crecimiento, contenidos nodulares, caldos, en el laboratorio o en la fbrica de inoculante, antes de impregnar la
turba, donde se postula que todas las clulas estn viables. Puede evaluarse tambin la turbidez (densidad
ptica a 600 nm) frente a escala patrn confeccionada
por recuento de viables en caja.
2. Recuento de viables en medio slido: procedimiento
habitual a partir de diluciones seriadas de la muestra,
por siembra en superficie(0,2mL) o en inclusin (1 mL)
en medio EMA. Lectura en cajas con entre 30 y 300
colonias. Se emplea con cultivos puros, con inoculantes a base de turba estril y tambin con turba no estril, ya que los contaminantes pueden ser del orden
de 106/g y el rhizobio debe superar 108/g. En las ltimas diluciones predominan las colonias tpicas de esta
bacteria y pueden contarse.
3. Recuento de viables en plantas: emplea la capacidad de cada cepa de rhizobio para nodular con una leguminosa y presume que una sola clula agregada a la
planta test puede originar una poblacin que nodule a
las leguminosa especfica.
sembrar semillas germinadas estrilmente en tubos con
en cuenta el nmero de tubos positivos (con ndulos) en 4 diluciones con tubos positivos y negativos
tomar
447
446
Lillian Frioni
cin. Los sueros se conservan congelados, con el agregado de algn antisptico, en pequeos volmenes,
que facilitan su empleo. La determinacin del ttulo
puede efectuarse en tubos chicos de hemlisis o en
bandejas:
diluir
Reaccin somtica: comienza con la aparicin de granulaciones finas y pueden dar lugar a depsito compacto de
sobrenadante transparente.
con ndulos triturados: resulta til cuando se desea identificar a las cepas que dieron origen a un
gran nmero de ndulos. Se trabaja con el contenido nodular, sin efectuar el aislamiento. Los ndulos lavados se
maceran uno por uno en 1-2 mL de sol. fisiolgica; se
calienta a 100C unos minutos y se pipetea unas gotas
dentro de pequeos tubos o en bandejas de plstico con
cavidades individuales (tipo para ELISA). Se agregan unas
gotas de los antisueros de las cepas que se desean identificar, se cubre con un vidrio la bandeja para evitar evaporacin y se observa la aglutinacin a la media hora.
tan varias cavidades en agar-agua muy puro solidificado en caja de Petri o sobre un portaobjeto.
ELISA, mtodo indirecto muy sensible que emplea IgGanticonejo conjugado con fosfatasa alcalina y el sustrato
p-nitrofenil fosfato. La enzima libre se lee a 405 nm luego
de 30 minutos a temperatura ambiente, con la solucin
del sustrato como blanco.
Inmunofluorescencia: se emplean mucho en estudios
ecolgicos: se combina el anticuerpo con una sustancia que fluoresce en UV, como isocianato de fluorescena o naranja de acridina que al reaccionar con el
antgeno especfico produce una fluorescencia que se
visualiza en el microscopio equipado con luz fluorescente
sembrar
transferir mutantes dobles a EMA slido, confirmar resistencia a ambos antibiticos sembrando en cajas con
los dos antibiticos
confirmar
sin antibiticos; con estreptomicina y con espectinomicina para conocer la respuesta a concentraciones de
antibiticos
459
lerable y con apariencia modificada; el pH debe ser alcalino y la celulosa estar presente. Se toma 1 g de compost en un vaso de 100 ml se moja con algunas gotas de
etanol si el compost estuviera seco y se agrega 20 mL
de cido perclrico al 36%. Se agita 5 minutos y se filtra.
Se agrega 2 mL de solucin de iodo al filtrado y se
agita. Se colocan algunas gotas en una placa de vidrio y
se examina la coloracin y la cantidad de precipitado
formado.
Coloracin amarilla y poco precipitado, significa com-
Aglutinacin
Test
Un compost bien maduro presenta nitratos en abundancia y apenas trazas de amonio; un compost semimaduro
tiene amonio y no hay nitratos.
Si la muestra presenta amonio y nitratos, es porque se
trata de una mezcla de abonos con distinto tiempo de
preparacin, o que se han agregado fertilizantes minerales. Con trazas de nitrato o amonio, el compost se encuentra en fase intermedia de fermentacin, en la cual
casi todo en nitrgeno est en forma de protena (nitrgeno orgnico).
7. Test para almidn
Tres tipos de carbohidratos son encontrados en el compost: azcares, almidn y celulosa. Los azcares son
los primeros componentes en ser metabolizados, generalmente en una semana; el almidn en la cuarta a quinta semana ya est en la fase mxima de descomposicin y el compost est bioestabilizado, con olor ms to-
post maduro.
La secuencia de coloracin para el proceso de compostaje es la siguiente: azul oscuro, azul claro, ceniza, verde
y amarillo. La coloracin roja se encontrar en composts
parcialmente degradados.
460
Lillian Frioni
AF
NH
AH + AF
Centrifugar
25 minutos a 3.000rpm
y 664nm
Calcular
relaciones:
Q 2/4 = Ab280/Ab472
Q 4/6 = Ab472/Ab664
Q 2/6 = Ab280/Ab66
445
agregar
de una vez el polvo de recubrimiento mezclando suavemente hasta que toda la semilla quede recubierta y separada
extender
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Santiago del Estero
Arachis hypogea
Glycine max
Medicago sativa
Phaseolus vulgaris
Inoculacin simple
seguir
atentamente las instrucciones del inoculante comercial a emplear, preparar el adhesivo y agregar el
volumen recomendado
agregar
agregar el inoculante y adhesivo a la semilla y mezclar hasta que toda la semilla quede uniformemente recubierta por una capa negra de inoculante
extender
Pildorizacin (pelletizacin)
preparar la solucin adherente, por ejemplo: celofx-A
50g/L de agua o solucin de goma arbica al 40%, con
24 horas de antelacin
agregar
4,0
3,0
4,0
2,5
Serologa
Se han empleado las reacciones antgeno-anticuerpo:
aglutinacin: interviene la totalidad de la clula
precipitacin:
Obtencin de antisuero con alto ttulo por inmunizacin en conejos; se cultiva el rhizobio en medio EMA,
slido o lquido (este ltimo evita la excesiva acumulacin de polisacridos extracelulares que acumulan muchas cepas), se prepara una suspensin densa (108 clulas/mL) luego de repetidos lavados de las clulas en
solucin fisiolgica.
10
10
0,2-5
8
Reconocimiento de rhizobios
grumos
100
100
50
100
goma
arbiga(mL)
444
Lillian Frioni
Frankia, Azospirillum, hongos micorrcicos u otro microorganismo a ser empleado como inoculante con el alginato, que queda al 2%, mantenerlo en agitacin con
barra magntica
El inoculante se forma dejando caer gotas de medioalginato sobre el cloruro de calcio, con pipeta o filtro de
porcelana con pequeos orificios. Se forman pequeas
esferas de alginato de calcio (gel) con las clulas atrapadas que se lavan para eliminar exceso de Cl2Ca con
agua estril y se dejan secar una noche bajo flujo laminar. El gel desecado ocupa pequeo volumen y se mantiene en frascos o bolsas en lugar fresco hasta su uso.
En el suelo
Cuando se aplican pesticidas, o cuando la semilla puede
daarse fcilmente con el manipuleo como en el caso de
la de man, se pueden aplicar tcnicas de inoculacin al
suelo con formas lquidas o granuladas de inoculantes.
granular,
lquidos
se emplean al igual que los anteriores cuando se desea evitar el manipuleo de la semilla, pero
se requiere transporte de agua y maquinaria con pulverizador.
461
462
Lillian Frioni
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443
controlar la calidad
Inoculantes lquidos se usan cuando existe buena coordinacin entre el laboratorio y las tareas de campo y
son tiles a nivel experimental (solario, invernculo) o
cuando se observan fallas en la aplicacin de otros tipos de inoculantes en el campo y se desea salvar el
ensayo, se riega el surco con un cultivo denso de la
bacteria. Actualmente se vuelven a emplear para inocular grandes reas de leguminosas, como la soja en
Brasil y Argentina. La botella o recipiente de plstico
se adosa a la sembradora y el inoculante convenientemente diluido, gotea sobre las semillas a medida que
son sembradas.
Inoculantes slidos, son muy usados sobretodo cuando se separa en el tiempo la produccin de su empleo.
En general el soporte slido es la turba, tierra con alto
contenido de materia orgnica (60-70%), pero si no se
dispone de buenas turberas, se han ensayado otros
soportes: lignita, cscara de cereales molida, polmeros orgnicos (poliacrilamida, alginatos) o minerales como arcillas, tierra de diatomeas, etc.
Se usa: turba estril por rayos gamma o en autoclave
en las bolsas de poliestireno que luego se inoculan con
el caldo con ayuda de una jeringa y aguja estril. Se
deja madurar para que la bacteria se multiplique en el
soporte. Actualmente casi todos los inoculantes emplean
turba estril para evitar disminuciones del inculo por la
competencia de hongos, actinomicetes y otras bacterias
conducir
reas de investigacin para superar problemas asociados con la eleccin de las cepas y su sobrevivencia en el producto final.
Tcnicas de inoculacin
En semillas:
en seco, consiste en mezclar el inoculante en el depsito de semillas de la sembradora; ambos productos van
cayendo en el surco. A pesar de que no hay un contacto
ntimo entre el inculo y la semilla, muchos productores
lo prefieren por la comodidad que significa no emplear
agua.
hmedo,
pildorizacin,
442
Lillian Frioni
Pero son sin duda los ensayos de campo los que permitirn emitir opinin ms acertada sobre el comportamiento simbitico de combinaciones rhizobio-leguminosa.
Ensayos de campo
Eleccin del lugar: los suelos con bajo nmero de rhizobios y nitrgeno disponible son probablemente los ms
tiles para el ensayo de cepas, pero para probar otras
cualidades adems de la eficiencia, como la capacidad
competitiva, se requiere una alta poblacin de rhizobios
nativos. El lugar debe estar lo suficientemente nivelado
para evitar el lavado luego de una lluvia y la contaminacin de las parcelas. Elegir el diseo experimental ms
conveniente
Inoculacin:
Incubacin:
yo de laboratorio
comparar distintos mtodos de inoculacin, sta debe efectuarse segn las normas de prctica comn en la zona.
Se desea establecer entre 1.000 a 10.000 rhizobios viables/semilla
Evaluacin: en el momento del raleo ya se aprecia nodulacin, pero sta se evala al comienzo de la floracin,
en unas 10 plantas por parcela: nmero y peso seco de
los mismos. Cosecha: una superficie determinada (1 m2)
para cultivos forrajeros y las lneas centrales para los cultivo de grano. Se evala: peso fresco y seco de la parte
area, N% y produccin de nitrgeno por hectrea. En
caso de granos: nmero de cajas o vainas por planta, peso
seco de las mismas y de los frutos, N% de frutos y se
calcula la produccin de nitrgeno = N% x materia
seca(kg/ha)
463
464
Lillian Frioni
441
2-3 das y las de crecimiento lento, al cabo de 1 semana. Son grandes, incoloras, mucosas, de superficie lisa
y brillante. Los contaminantes generalmente se colorean con el rojo Congo, aunque hay excepciones como
Agrobacterium radiobacter y cultivos viejos de rhizobio
10 g
0,5 g
0,2 g
0,1 g
1g
15 g
10 mL
1 litro
rante, o sobre algodn y papel de filtro en cajas estriles, para su germinacin a la oscuridad y temperatura
adecuada a cada leguminosa.
Siembra
e inoculacin
Para leguminosas de semilla pequea (Medicago, Trifolium, etc.) tubos grandes (19 x 2 cm) con 25 mL de medio salino para plntulas, como el de Jensen :
CaHPO4
K2HPO4
MgSO4 7H2O
NaCl
Cl3Fe
agua
agar
pH
sembrar
Se realiza a tres niveles: laboratorio, invernculo o cmara controlada y campo. Se parte de una coleccin
de cepas autctonas y otras cedidas por centros de coleccin.
llevar
se
1,0 g
0,2 g
0,2 g
0,2 g
0,1 g
1 litro
8 g
6,8-7,2
llevar
Evaluacin:
la experiencia concluye cuando se observa la mxima diferenciacin entre los tratamientos (T) y
(N), pero antes que los primeros comiencen a secarse
(6-8 semanas). Con ayuda de ansa o varilla se sacan
las plantas con el medio, se corta la parte area, se
coloca en sobre de papel con su correspondiente numeracin y se determina su peso fresco y luego su peso
seco a 65C, hasta peso constante.