NV Bakteriologija MNE PDF

Crna Gora
____________________________________________
Ministarstvo zdravlja
LABORATORIJSKA
DIJAGNOSTIKA U
KLINIKOJ
BAKTERIOLOGIJI
Nacionalne smjernice dobre klinike prakse
Podgorica | 2012.
Crna Gora
_____________________________________
Ministarstvo zdravlja
Sekcija ljekara mikrobiologa Drutva ljekara Crne Gore
Laboratorijska dijagnostika u
klinikoj bakteriologiji
Podgorica, 2012. godine
Laboratorijska dijagnostika u klinikoj bakteriologiji

________________________________________________________________
Ministarstvo zdravlja Crne Gore
Sekcija ljekara mikrobiologa Drutva ljekara Crne Gore
Autori:
Dr Ljubica Mugoa, Dr Danijela Rajkovi, Dr eljka Zekovi,
Dr Slobodan Nanevski, Dr Gordana Mijovi, Dr Milena Lopici,
Dr Rua Tomi, Dr Branka Perovi, Dr Gordana Zurovac,
Dr arko Nikevi, Dr Ljubica Teri, Dr Tatjana Radunovi
Recenzenti:
Prof. dr Lazar Ranin
Prof. dr Branislava Savi
Urednik:
Doc.dr Gordana Mijovi
________________________________________________________________
ISBN 0-000-00000-0
Izdava: Ministarstvo zdravlja Crne Gore 2012
Tehnika priprema i dizajn: Aleksandar Klimovi
tampa: XXXXXXXXXXXXXXX
Tira: XXX primjeraka
Predgovor
Ovaj vodi je rezultat potrebe za podizanjem i ujednaavanjem nivoa
mikrobioloke dijagnostike na cijeloj teritoriji drave Crne Gore. Vodi kojim su
definisane standardne operativne procedure rada u obradi klinikih uzoraka,
identifikaciji kliniki najznaajnijih bakterija i ispitivanju osjetljivosti bakterija
na antibiotike i hemioterapeutike, omoguava da rezultati dobijeni u razliitim
laboratorijama budu uporedivi i da se njihova validnost ne dovodi u pitanje.
Ministarstvo zdravlja i Sekcija ljekara mikrobiologa Drutva ljekara Crne
Gore su udruili svoje snage u ostvarivanju jasnog krajnjeg cilja: da
mikrobioloki rezultati budu jo vaniji i sigurniji oslonac kliniarima u
postavljanju dijagnoza, a sve za dobrobit pacijenata.
Standardne operativne procedure rada kojima se bavi ovaj dokument se
baziraju na naunim injenicama i shodno tome podlijee periodinim
revizijama, u skladu sa napretkom nauke.
Namjera je bila da se napravi jednostavan i lako primjenljiv vodi koji e
ujedno biti dobra osnova za dalje dopunjavanje, usavravanje i unapreivanje
dobre laboratorijske prakse.
Autori
Izvod iz recenzije
Primena ovog prirunika e doprineti uvoenju jedinstvene
laboratorijske metodologije u bakteriolokim laboratorijama Crne Gore. Takoe,
ovaj prirunik e posluiti kao odlina osnova za pripremanje standardnih
operativnih procedura to e omoguiti da mikrobioloke laboratorije Crne Gore
uspeno prikupljaju i dokumentuju relevantne podatke o izazivaima zaraznih
bolesti kao i da ostvare saradnju u razmeni tih podataka sa drugim
bakteriolokim laboratorijama van zemlje..."
Prof.dr Lazar Ranin,

specijalista mikrobiologije i parazitologije,
Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu
Prof.dr Branislava Savi,
specijalista mikrobiologije i parazitologije,
Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu
Sadraj
1Ispitivanje brisa grla ............................................................................. 1

2Ispitivanje brisa nosa ............................................................................ 3
3Ispitivanje brisa nazofarinksa............................................................... 5
4
Ispitivanje sputuma .............................................................................. 6
5Ispitivanje sadraja apscesa i dubokih rana ......................................... 9

6Ispitivanje brisa koe i povrinskih rana ............................................ 11
7Ispitivanje tkiva i biopsija .................................................................. 15
8Ispitivanje brisa iz unog kanala (bris uva) i sekreta iz srednjeg uva 23
9Ispitivanje brisa oka u sluaju conjunctivitis-a i blepharitis-a ........... 25
10 Ispitivanje brisa oka u sluaju drugih infekcija oka ........................... 27
11Ispitivanje likvora ............................................................................... 29
12Ispitivanje krvi (hemokultura) ............................................................ 32
13Ispitivanje intravaskularne kanile i slinih uzoraka ........................... 35
14Ispitivanje fecesa (koprokultura) ........................................................ 38
15 Koprokultura za izolaciju Vibrio cholerae ......................................... 39
16Ispitivanje urina (urinokultura) ........................................................... 41
17Ispitivanje vaginalnog brisa ................................................................ 47
18Ispitivanje cervikalnog brisa ............................................................... 50
19Ispitivanje uretralnog brisa ................................................................. 52
20Ispitivanje prisustva genitalnih mikoplazmi ....................................... 54
21Identifikacija Staphylococcus spp. ..................................................... 55
22Identifikacija Streptococcus spp. i Enterococcus spp. ....................... 59
23Identifikacija Neisseria spp. i morfoloki slinih organizama ........... 65

24Identifikacija enterobakterija .............................................................. 68
25Identifikacija gram negativnih nefermentujuih bacila ...................... 72
26Identifikacija Haemophilus spp. i HACEK grupe organizama ......... 74
27Identifikacija Bordetella spp. ............................................................. 79
28Identifikacija Campylobacter spp. ...................................................... 81
29Identifikacija Corynebacterium diphteriae, Corynebacterium
ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis ...................................... 82
30 Identifikacija anaerobnih bakterija ..................................................... 86
31Ispitivanje osjetljivosti bakterija na antimikrobne supstance disk
difuzionionim metodom ........................................................................... 88
32Identifikacija -laktamaza proirenog spektra.................................... 98
DODATAK: Nain pripremanja hranljivih podloga koje ne postoje u
prakastom obliku kao gotove podloge .................................................. 102
Literatura ................................................................................................ 104
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI
1.1
Ispitivanje brisa grla
Uzorkovanje
Uzorkovanje obaviti sa pojavom prvih simptoma, prije antibiotske terapije.

Pacijenta zamoliti da iroko otvori usta i izgovori a. Koristei dobro
osvjetljenje i pritiskajui patulom korijen jezika, osmotriti
unutranjost usta traei znakove upale, prisustvo bilo kakvih
membrana, eksudata ili gnoja.
Uvesti bris do zadnjeg zida drijela. Polako rotirajui u ruci bris,
energino prebrisati prostor iza uvule i izmeu tonzilarnih lukova.
Prilikom ulaska i izlaska iz drijela paziti da se bris ne kontaminira
salivom i odloiti ga u sterilan kontejner (epruvetu) ili transportnu
podlogu.
Pacijent ne smije osam asova prije uzimanja brisa koristiti bilo
kakav antibiotik, niti ispirati usta bilo kakvim dezinficijensom.
1.2
Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu:

koristiti transportnu podlogu, ili
na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog
rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu
tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati,
jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije.
Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
1.3
Zasijavanje
krvni agar sa razreenjem

Dodatno kod sumnje na difteriju:
Claubergova teluritna podloga (alternativa: Leflerov koagulisani
serum, Hoyle's telurit agar)
Dodatno kod sumnje na faringealnu gonoreju i meningokokno kliconotvo:
VCN okoladni agar, GC selektivni agar
1.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24h
1.5
serum, Hoyle's telurit agar): aerobno, 35-37C, 48-72h (svakodnevno

itanje)
VCN okoladni agar, GC selektivni agar: u uslovima sa 5-10% CO2,
35-37C, 40-48h (svakodnevno itanje)
Tumaenje nalaza
nalaz Streptococcus haemolyticus gr. A, C i G su uobiajeni
1.6
patogeni.
nalaz Staphylococcus aureus znaajan u ispitivanju kliconotva
(MRSA, metilicin rezistentan Staphylococcus aureus, sojevi intrahospitalna sredina!)
Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:

Izolovana fizioloka mikroflora.
Ispitivanje brisa nosa
2.1
Uzorkovanje
Uzima se brisom ispod i iznad donje nosne koljke. Prilikom uzimanja

materijala paziti da se ne dotaknu brisom otvor i zidovi atrijuma, pa je najbolje
uzeti bris kroz nosni spekulum.
2.2
Transportovanje

2.3
Zasijavanje
krvni agar sa razreenjem i stafilokoknom crtom.

Dodatno, kod sumnje na nazalnu difteriju:
serum, Hoyles telurit agar)
Dodatno, kod sumnje na rinosklerom i ozenu:
endo agar (CLED agar)
2.4
Inkubacija
serum, Hoyles telurit agar): aerobno, 35-37C, 48-72h (svakodnevno

itanje)
Endo agar (CLED agar): aerobno, 35-37C, 16-24h
2.5
Tumaenje nalaza
Staphylococcus .aureus i Streptococcus haemolyticus gr. A: znaaj
u eradikaciji kliconotva (posebno MRSA-intrahospitalna sredina!).
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae i Moraxella
2.6
catarrhalis: izvjestiti uz napomenu da mogu imati znaaja u sklopu

zapaljenja srednjeg uva, sinusa i donjih respiratornih puteva (ako se
nau u istoj kulturi ili da dominiraju).
Klebsiella rhinoscleromatis (rhinosclerom), Klebsiella ozaenae
(ozena).
Mycobacterium leprae (ispituje se po posebnom protokolu).
Izvjetavanje

Ispitivanje brisa nazofarinksa
3.1
Uzorkovanje
Uzima se specijalnim ianim lako savitljivim brisom. Najbolje da

bris uzima ljekar specijalista otorinolaringolog ili osoba sa iskustvom.
3.2
Transportovanje
to je prije mogue (najdue dva asa). Ako je brz transport nemogu:

3.3
Zasijavanje
Bordet-Gengou-ova podloga (priprema se po potrebi); alternativa:
CCBA (charcoal cephalexin blood agar) kao selektivnija podloga.
3.4
Inkubacija
Aerobno, 35-37C, 2-7 dana (svakodnevno itanje)
3.5
Tumaenje nalaza
Ciljani uzronik: Bordetella pertussis
3.6
Izvjetavanje
Bordetella pertussis izolovana
Bordetella pertussis nije izolovana
Ispitivanje sputuma
4.1
Uzorkovanje
Daje se prvi jutarnji ispljuvak odmah nakon buenja, a prije
4.2
obavljanja line higijene. Pacijenta savjetovati da ispere usta mlakom

vodom (bez dezinficijensa) i da potom nekoliko puta duboko udahne
(provokacija kalja), saeka nadraaj na kaalj, jako se nakalje i
sadraj iz dubine plua ispljune u sterilnu posudu sa irokim otvorom.
Rjei postupci uzorkovanja: u toku bronhoskopije, bronholavaom,
transtrahealno, kod djece nazofaringealni aspirat.
Dobra praksa - davanje pisanog uputstva pacijentima.
Dobra praksa: uz sputum dostaviti bris grla na ispitivanje.
Transportovanje
Uzorak donijeti u laboratoriju unutar 2 h (mogunost transporta
4.3
4.3.1
transportni medijumi)
Ako se sumnja na bronhopneumoniju ili pneumoniju, ne moe se
odlagati transport i sputum se ne smije drati u friideru, jer bakterije,
koje su najei uzronici ovih oboljenja (Haemophilus influenzae,
Streptococcus pneumoniae), brzo propadaju na temperaturi nioj od
35C.
Zasijavanje
Ispitivanje kvaliteta uzorka
Primarnu obradu uzoraka sputuma treba vriti u komori za bezbjedan rad

klase II.
Makroskopska
evaluacija:
opisati
sputum
(purulentan,
mukopurulentan, mukoidan, krvav).
Direktni mikroskopski preparat:
Birati gnojave dijelove sputuma i napraviti preparat bojen po Gramu,
mikroskopirati pod malim uvelianjem.
Kriterijum za trijau sputuma po Murray i Washington-u su prikazani u

tabeli br.1.
TABELA 1. Kriterijum za trijau sputuma po Murray i Washington-u
Grupa
Epitelne elije po vidnom polju
Leukociti po vidnom polju
>25
<10
>25
10-25
>25
>25
10-25
>25
<10
>25
Grupe od 1-4 su neprihvatljive za kultivaciju i izvjetavaju se: Uzorak je

preteno saliva, te je neprihvatljiv za kultivaciju. Preporuuje se ponoviti
analizu, ako postoji klinika indikacija.
Ovi kriterijumi nisu odgovarajui za imunokompromitovane,
neutropenine, intubirane pacijente, kod sumnje na Mycobacterium spp. i
Legionela pneumophila, ili ako je nemogue ponoviti uzorkovanje.
Nalaz cilindrinih epitelnih elija donjeg respiratornog trakta indikuje da
je dobijen kvalitetan uzorak sputuma.
4.3.2
Kultivacija
krvni agar
endo agar
selektivni okoladni agar za Haemophilus
4.4
Inkubacija
endo agar: aerobno, 35-37C, 16-24h
okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 24-48 h
(svakodnevno itanje)
4.5
Tumaenje nalaza
Ciljani
uzronici su Haemophilus influenzae, Streptococcus

pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae (i rjee druge Gram
negativne bakterije).
Kod
4.6
cistine fibroze i bronhiektazija: Pseudomonas spp.,

Burkholderia cepacia, enterobakterije, Staphylococcus aureus.
Rijetki uzronici: Nocardia spp., Actinomyces spp. (ispituju se po
posebnom protokolu).
Izvjetavanje

Izolovana fizioloka mikroflora usne duplje.
Ispitivanje sadraja apscesa i

dubokih rana
5.1
Uzorkovanje
Uzorci koji se mogu ispitivati su:

sadraj apscesa dobijen punkcijom ili poslije incizije
bris rane
eksudat rane
Optimalno vrijeme uzimanja uzorka - prije sprovedene antimikrobne
terapije. Optimalna koliina uzorka - minimum 1 ml gnojnog sadraja, ili dobro
natopljen bris.
Optimalno je uzeti 2 brisa: jedan za kultivaciju, drugi za pravljenje
direktnog mikroskopskog preparata.
5.2
Transportovanje
to je prije mogue (najdue do pola sata). Ako je brz transport nemogu:

za briseve koristiti transportnu podlogu
prihvatljivo vrijeme transporta za sadraj apscesa zavisi od koliine
uzetog materijala:
Volumen aspiriranog sadraja:
< 1 ml
1 ml
>2 ml
5.3
5.3.1
Optimalno vrijeme za transport do laboratorije:

< 10 min.
< 30 min.
<3h
Zasijavanje
Direktan mikroskopski preparat
Bris se priprema za direktnu mikroskopiju u vidu tankog razmaza na

istom predmetnom staklu i potom boji po Gramu.
Gnojni sadraj se sterilnom pipetom ili ezom nanese na isto predmetno
staklo u koliini od jedne kapi, razmae i boji po Gramu.
Izvjestiti o prisustvu leukocita i (opisno) mikroorganizama.
10
5.3.2
Kultivacija
krvni agar
endo agar
tioglikolat bujon
podloga za anaerobne bakterije sa 5 g diskom metronidazola
Dodatno, u sluaju primarnog peritonitisa kod ena i prostatinog apscesa:
okoladni agar
5.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h
endo agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h
tioglikolat bujon: aerobno, 16-24 h presijava se po potrebi, aerobno
(krvni agar i/ili endo agar) i/ili anaerobno (podloga za anaerobe)
podloga za anaerobne bakterije: anaerobno, 35-37C, 48 h (moe i do

5 dana)
okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 48 h

5.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Staphylococcus aureus
Streptococcus haemolyticus
Druge streptokoke
Enterococcus
Enterobakterije
Pseudomonas spp.
Anaerobi
Actinomycetes
Nocardia
Neisseria gonorrhoeae
U gnoju i eksudatu rane bilo koji izolovani mikroorganizam moe biti

znaajan.
Ispitivanje brisa koe

i povrinskih rana
6.1
Uzorkovanje
11
ukoliko je prisutan sekret materijal uzeti suvim pamunim brisom

ukoliko nema sekreta bris prethodno natopiti fiziolokim rastvorom
ukoliko na koi postoje pustule, vezikule ili ulceracije sadraj iz ovih
promjena uzima se sterilnom iglom i brizgalicom.
sadraj iz ulkusa moe se uzeti irigaciono-aspiracionom metodom

pomou malog prica bez igle koji se smjesti ispod ivice ulkusa i
njeno ispere sa najmanje 1 ml sterilnog fiziolokog rastvora. Poslije
masae ivice ulcusa, ponavlja se irigacija sa jo 1 ml sterilnog
fiziolokog rastvora. Ivica ulkusa se jo jednom izmasira, a onda
aspirira 0.25 ml tenosti i smjesti u sterilan kontejner.
6.2
Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu za

briseve:
Aspirirani sadraj iz pustula moe se transportovati u sterilnim
plastinim kontejnerima.
6.3
Zasijavanje
6.3.1
Radi se, ako je vidljiv gnoj na brisu.
12
6.3.2
Kultivacija
Svi brisevi:
krvni agar
endo agar
Dodatno, u sluaju da se radi o ujedu ivotinje ili ovjeka, celulitisu, paronihiji,
povrnoj povredi:
podloga za anaerobe sa 5g diskom metronidazola
Dodatno, u sluaju celulitisa kod djece i ljudskog ugriza:
Dodatno, kod sumnje na difteriju koe:
cistein telurit krvni agar (alternativa Hoyle's teluritni ag,ar)
Dodatno, kad se trai ispitivanje na gljivine infekcije:
prema posebnom protokolu
6.4
Inkubacija
6.5

podloga za anaerobe: anaerobno, 35-37C, 48 h
okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 48 h
cistein telurit krvni agar: aerobno, 35-37C, 48 h (svakodnevno
itanje)
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Streptococcus haemolyticus gr. A, B, C i G
Bacteroides spp.
Clostridium spp.
Anaerobne koke
Koagulaza negativni stafilokoki
Enterobakterije
Pseudomonas species
Najei uzronici infekcija opekotina:
Pseudomonas spp.
Acinetobacter spp.
Bacillus spp.
Enterobakterije
Koagulaza negativni stafilokok
Najei uzronici infekcija ulkusa i dekubitusa:
Streptokoke
Anaerobni Gram - bacili
Clostridium spp.
Enterobakterije
Corynebacterium spp.
Pseudomonas spp.
Najei uzronici paronihije:
Streptococcus pyogenes
Anaerobi
Haemophilus influenzae
Najei uzronici folikulitisa:
Pseudomonas aeruginosa
Najei uzronici celulitisa:
Arcanobacterium haemolyticum
Streptococcus pneumoniae
Bacteroides spp.
Anaerobne koke
Uzronici impetiga:
Najei uzronici infekcije ujeda:
13
14
Pasteurella multocida
Anaerobi
Eikenella corrodens
Haemophilus spp.
Streptobacillus moniliformis
Bakterije koje uzrokuju erysipelas:
Streptococcus haemolyticus gr. A i G

Bakterija koja uzrokuje erysipeloid:
Erysepelothrix rhusiopathiae
Bakterije koje uzrokuju ecthyma gangrenosum:
Stenotrophomonas maltophilia
Uzronik erythrasma-e:
6.6
Corynebacterium minutissimum
Izvjetavanje

Izolovana fizioloka mikroflora koe.
Ukoliko su izolovani u istoj kulturi ili kao dominantna flora
mikroorganizmi koji su sastavni dio mikroflore koe, u zavisnosti od uputne
dijagnoze, izvjestiti uz komentar: Izolovani soj porastao u istoj kulturi ili
Izolovani soj porastao kao dominantna flora.
Ispitivanje tkiva i biopsija
7.1
Uzorkovanje
15
Optimalno vrijeme uzimanja uzorka je prije antimikrobne terapije. Uzorak

treba da uzima ljekar ili iskusna osoba. Uzorak treba da bude u dovoljnoj
koliini da bi mogle da se odrade sve dijagnostike procedure (koliina
potrebnog uzorka zavisi od broja zahtijevanih ispitivanja).
Uzorci tkiva mogu se dobiti na tri naina:
kao zatvorena procedura perkutanom biopsijomu toku operacije
(uklanjanjem devitalizovanog ili inficiranog tkiva)
post mortem
Pri uzorkovanju bilo kojim od navedenih naina mogu se javiti problemi.
Kod perkutane biopsije
nedovoljna koliina uzorka
moe se promaiti infektivna lezija
kontaminacija florom koe
Kod uzorkovanja u toku operacije uzorkovanje se ne moe ponoviti,
stoga treba voditi rauna u toku obrade ovih materijala
Kod uzorkovanja tkiva post mortem kontaminacija enterinom
florom, treba oprezno interpretirati rezultate
Mjere bezbjednosti:
izbjegavati akcidentalne povrede prilikom korienja igle
koristiti sterilne kontejnere u zatvorenim plastinim kesama
laboratorijske procedure koje daju infektivni aerosol, sjeckanje i
homogenizacija uzoraka moraju se izvoditi u komorama za
bezbjedan rad klase II, a ukoliko su u pitanju biohazardi grupe 3
kao to su Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., ili postoji
sumnja na egzotine importovane mikoze, obrada i ispitivanje
materijala mora biti izvoena u biolokom kabinetu nivoa 3.
kad god je mogue koristiti sterilne makaze, preporuljivije u
odnosu na skalpel.
Napomena: Kod hroninih infekcija tkiva potrebno je vriti ispitivanje i
na gljivice, mikobakterije i parazite.
7.2
Transportovanje
Uzorak transportovati do laboratorije to je prije mogue
16
Optimalno vrijeme transporta do laboratorije za tkiva i materijal
7.3
7.3.1
dobijen biopsijom je do 30 minuta.

Ukoliko je koliina uzorka mala, staviti ga u sterilan fizioloki rastvor
da se sprijei suenje.
Ukoliko se obrada odlae uzorak uvati u friideru.
Odlaganje due od 48h nije poeljno. (Volumen uzorka utie na
prihvatljivo vrijeme transporta. U veim komadima tkiva vijabilnost
anaeroba se odrava due vrijeme).
Zasijavanje
Homogenizovani uzorci:
Staviti kap uzorka na isto predmetno staklo sa sterilnom pipetom. Razvui
sterilnom ezom i napraviti tanak razmaz za bojenje po Gramu.
Nehomogenizovani uzorci:
Preparat se pravi otiskom - sterilnom pincetom uhvatiti dio uzorka i napraviti
otisak jednom ili sa vie strana uzorka na isto predmetno staklo, bojiti po
Gramu.
Napomena: Za gljivice, Legionella spp.,
Helicobacter pylori i parazite postoje posebne tehnike
7.3.2
Mycobacterium
spp.,
Kultivacija
Napomena: Uzorak dobijen u formalinu nije prihvatljiv za kulturu.

Primarna obrada uzorka mora biti izvoena u komori za bezbjedan rad
klase II
Usitniti ili homogenizovati uzorak sa odgovarajuim sterilnim priborom
(grinder-brus Griffits tube ili alternativne nelomljive tube) ili sterilnim
makazama u sterilnoj petrijevoj olji na parie. Kod homogenizacije dodati
0,5ml sterilne filtrirane vode, fiziolokog rastvora, peptona ili bujona da bi
pomoglo homogenizaciju.
Inokulisati svaku agar plou i obogaeni bujon sa homogenizovanim
uzorkom.
Kod nehomogenizovanih uzoraka inokulisati agar plou sa isjeckanim
komadom tkiva.
Za dobijanje pojedinanih kolonija, rairiti inokulum sa sterilnom ezom.
17
7.4
Inkubacija
Hranljive podloge i uslovi inkubacije dati su u tabeli br.2
TABELA 2. Hranljive podloge, uslovi inkubacije i ciljni mikroorganizmi

Za sve uzorke:
Klinika slika/
uslovi
- Gangrena
Myonecrosis
- Nekrotizirajui
fasciitis
- Sve druge
udruene
infekcije
Standardni
medijum
Inkubacija
itanje
kulture
Ciljni
organizmi
bilo koji
mikroorganizam
Temp.
Atmosfera
Vrijeme
krvni agar
35-37
5-10% CO2
40-48h
svakodnevno
ENDO
agar
35-37
aerobno
16-24h
16h
Podloga za
anaerobe sa
diskom 5 g
metronidazola
35-37
anaerobno
5 dana
40h i petog
dana
bujon za
zahtjevne
anaerobe koji
se presijava
nakon 40h na
krvni agar i
podlogu za
anaerobe sa
diskom 5g
metronidazola
35-37
aerobno
40-48h
N/A*
35-37
35-37
5-10% CO2
anaerobno
40-48h
5 dana
svakodnevno
40h i petog
dana
*N-negativna A-pozitivna
U sledeim situacijama dodati:

Klinika slika/
uslovi
Standardni
medijum
Inkubacija
Temp.
Atmosfera
Vrijeme
itanje
kulture
Ciljni
organizmi
Ukoliko
preparat
sugerie na
mijeanu
infekciju
Neomycin
fastidius
anaerobni agar sa
5 g diskom
metronidazola
35-37
anaerobno
5 dana
40h i petog
dana
Anaerobi
Actinomycosis
Krvni agar sa
dodatkom
metronidazola i
nalidiksne
kiseline
35-37
anaerobno
10 dana
40h,
sedmog i
desetog dana
Actinomyces
species
18
Klinika slika/
uslovi
Standardni
medijum
Inkubacija
itanje
kulture
Ciljni
organizmi
Temp.
Atmosfera
Vrijeme
35-37
aerobno
40-48h*
40h i
nakon osam
nedelja
Fungi
Imunokompromitovani, ili
suspektne
invazivne
gljivine
infekcije
Sabouraud agar
Mycetoma
Nocardiosis
LowensteinJensen-ov
medijum
35-37
aerobno
Nakon
28 dana
Svaka 3-4
dana
Aerobne
Actinomycetes
Ukoliko
preparat
sugerie na
mijeanu
infekciju ili je
mjesto
uzorkovanja
jako prljavo
Staph/strep
selektivni agar
35-37
aerobno
40-48h*
dnevno
Staphylococcus
aureus
i
25-30
Streptococcus
* inkubacija se moe produiti do 5 dana, u tom sluaju ploe treba itati nakon 40h i produiti do 5 dana
Napomena: Ukoliko je uzorak nedovoljan za sva ispitivanja, prioritet se daje

klinikim indikacijama nakon konsultacije sa klinikim mikrobiologom.
Odabrati reprezentativni dio uzorka za odreene procedure kao to su
kultura na gljivice, Legionella, Mycobacterium spp., ili pregled na parazite, u
zavisnosti od klinike slike.
7.5
Tumaenje nalaza
Bilo koji organizam izolovan iz uzoraka tkiva moe biti znaajan.
Najei izolati ukljuuju:
Streptococci
Bacteroides spp.
Clostridium spp.
Mycobacterium spp.
Enterobacteriaceae
Pseudomonas spp.
Aerobne aktinomicete
Fungi
Actinomyces spp.
7.6
19
Izvjetavanje
Opisati direktni mikroskopski preparat bojen po Gram-u: izvjetava se

nalaz upalnih celularnih elemenata i prisustvo mikroorganizama. Izvjestiti svaki
porast uz odgovarajui komentar. U sluaju negativnog rezultata, izvjestiti:
Zasijane podloge ostale su sterilne.
7.7
Komentar
Vrsta infekcije
Infekcije mekih tkiva
Detekcija uzronika je teka. Povrina lezija je obino kolonizovana
polimikrobnom florom neodreene patogenosti. Dezinfekcija povrine rane da bi
se uklonila ova flora, moe dati lano negativne rezultate ili selektovati
organizam kao to je Pseudomonas aeruginosa. Da bi se izolovao uzronik
infekcije nekad je potrebno uzorkovanje dubljeg tkiva, naroito u sluajevima
infekcije opekotina.
Infekcije mekih tkiva sa nekrozom
Termin se moe odnositi na vrstu patogena, vrstu zahvaenog tkiva,
prisustva ili odsustva gasa u tkivu. Primjeri:
streptokokna gangrena
udruena gangrena
klostridijalna i neklostridijalna gangrena
Myonecrosis
nekrotizirajui fascitis
Odgovarajui uzorci su: krv za hemokulturu, tenost iz bule i biopsija
tkiva. Ne treba uzimati bris sa povrine lezije, jer e dati mijeanu kulturu koja
je najee kontaminacija.
Nekrotizirajui fasciitis
Infekcija potkonog masnog tkiva i tkiva izmeu povrne i duboke fascije
miia. Brzo se iri, zbog odsustva unutranjih barijera. Neki autori smatraju da
postoje dva tipa. Tip I nastaje infekcijom najmanje jednom anaerobnom vrstom
(Bacteroides i Peptostreptococcus spp.) i jednom ili vie fakultativnih
anaerobnih vrsta (non grupa A streptokoke i lanovi Enterobacteriaceae).
Obligatni aerobi su rijetko implicirani. TipII (haemolyticus streptococcal
gangrena) uzrokovana sa streptokokom grupe A sam ili udruen sa drugim
vrstama npr. S. aureus.
20
Udruena gangrena
Javlja se nakon operacija u abdomenu i rezultat je mijeane infekcije
(Staphylococcus aureus, streptokoke, enterobakterije, Pseudomonas species i
anaerobne vrste).
Gasna gangrena
Nekroza tkiva, krvavo-serozna sekrecija i prisustvo gasa u tkivu, praena
znacima toksemije. Javlja se nakon trauma ili penetrirajuih povreda tkiva.
Uzronici su Clostridium species, naroito Clostridium perfringens. Nekad ove
bakterije kolonizuju ranu bez izazivanja infekcije, mogu da izazovu celulitis ili
mionekrozu.
Infekcije nesporogenim anaerobima
Znaajni uzronici infekcija u pelvinoj i skrotalnoj regiji. esto se
javljaju u polimikrobnim infekcijama sa enterobakterijama, streptokokama i
vrstama klostridijuma.
Spontana gangrena
Javlja se nakon blagih trauma tkiva ili bez vidljive povrede kod oboljelih
od karcinoma kolona, leukemije ili neutropenije. Glavni uzronici C. perfringens
i C. septicum.
Pyomiositis
Gnojna infekcija skeletnih miia, ea je u tropskim zemljama. Obino
se javlja pojedinani apsces, ali se deavaju i multipli apscesi. Oboljeli
uglavnom nemaju predisponirajue faktore, a samo kod 25% se desila povreda.
Najei uzronik je S.aureus, jako rijetko kod imunokompromitovanih
infekciju mogu izazvati gljivice i virusi.
Actinomycosis
Hronina supurativna infekcija, koju karakterie formiranje apscesa sa
produkcijom sulfurnih granula. One se uglavnom sastoje od mikro-kolonija
Actinomyces species. Uobiajena mjesta su u okolini donje vilice, grudi i
abdomena. Biopsijom promjena otkriva se uzronik, najee je to A. israelii.
Aktinomicetama slini organizmi i Actinomycetes se obino nalaze u
cervikalnim razmazima, ali je kliniki znaaj sumnjiv.
21
Traumatska inokulacija
Sa zemljom ili biljkama moe da dovede do infekcija sa Nocardia species
ili nekim gljivama kao npr Sporothrix schenkii. Nocardia vrste rastu na
jednostavnim podlogama na 35-37C, ali je potrebno due vrijeme inkubacije 2-4 nedelje.
Mycetoma
Javlja se u tropskim i subtropskim krajevima, obino nakon punktiformnih
rana. Hronini destruktivni proces zahvata kou, potkono tkivo, miie i kosti.
Stvaraju se granulacije u tkivu sa hroninom inflamacijom i fibrozom. Micetomi
mogu da se jave bilo gdje u organizmu.
Na osnovu uzronika dijele se u dvije kategorije:
1. Eumycetoma: Acremonium species, Leptospheria senegalensis,
Madurela species, Scedosporium apiospermum
2. Actinomycetoma: Actinomadura species, Nocardia species,
Streptomyces species.
Mikroorganizmi se nalaze u drenirajuim sinusima tkiva kao agregati
filamenata, koji se zovu granule. One se razlikuju od sulfurnih granulakod
aktinomikoze, jer nemaju karakteristini vorast rub. esto su organizmi u ovim
sinusima mrtvi ili se javlja kontaminacija drugim bakterijama, pa se bolji
rezultati kulture dobijaju biopsijom tkiva.
Duboke ili diseminovane gljivine infekcije
Dijagnoza se moe postaviti biopsijom tkiva.
7.7.1
Specifine vrste tkiva koje zahtijevaju dodatna ispitivanja
Srane valvule - kod sumnje na endokarditis. Rezultati kultivacije treba da

su u korelaciji sa rezultatima hemokulture ili serologijom.
Uzorci kosti kod sumnje na osteomijelitis, hemokultura moe pomoi
dijagnozi.
Biopsija sluznice eluca za ispitivanje na Helicobacter pylori.
Biopsije rektalne sluznice za ispitivanje na parazite: Entameba
hystolytica, Shistosoma mansoni i Shistosoma japonicum.
Biopsije sluznice tankog crijeva za ispitivanje na prisustvo Giardia
lamblia i mikrosporidija.
Biopsije koe za ispitivanje na Mycobacterium spp.
i parazita
Onchocerca volvulus, Mansonella streptocerca i Leishmania spp.
Bioptati plunog tkiva (perkutano, bronhoskopski,u toku operacija ili post
mortem) kod sumnje na Legionella spp., Mycobacterium spp., gljivice, posebno
22
Aspergillus spp., Nocardia spp. i Pneumocystis jiroveci. Pneumocystis carini

kod imunokompromitovanih. PCP moe da se dijagnostikuje manje invazivnim
metodama, ali su metode manje osjetljive npr. indukovani sputum ili
bronhoalveolarni lavati.
Limfni vorovi kod limfadenitisa. Sumnja na Mycobacterium
tuberculosis, Mycobacterium avium-intracellulare, Bartonella henselae,
Toxoplasma gondii, Chlamydia trachomatis. Dijagnoza se postavlja u
kombinaciji sa histolokim i serolokim ispitivanjima.
23
Ispitivanje brisa iz unog kanala

(bris uva) i sekreta iz srednjeg uva
8.1
Uzorkovanje
Bris uva uzima se tankim brisom koji se uvlai u uni kanal kroz
8.2
sterilan uni lijevak. Una koljka se povlai nagore i unazad kod

odraslih, a kod djece dole i naprijed.
Kod sumnje na otitis media bris se uzima jedino ako postoji
supuracija t.j. perforacija bubne opne. U protivnom se moe uzeti
nazofaringealni bris. Timpanocenteza se rijetko koristi.
Materijal je najbolje uzeti prije uvoenja antibiotske terapije.
Transportovanje

8.3
Zasijavanje
Preporuka je da se primarna obrada uzoraka vri u komori za bezbjedan

rad klase II.
8.3.1
Direktni preparat bojen po Gram-u za sekret iz srednjeg

uva
8.3.2
Kultivacija

krvni agar
endo agar (CLED agar)
podloga za anaerobe sa neomycinom i 5 g diskom metronidazola
24
8.4
Inkubacija
okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 40-48 h,

podloga za anaerobe: anaerobno, 35 37 C, 40 48 h (do5 dana).
8.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Streptococcus haemolyticus gr. A, C, G

Moraxella catarrhalis
Pseudomonas spp.
Enterobakterije
Anaerobne bakterije (gram -)
Candida spp.
Aspergillus spp.
Vrlo rijetki uzronici:
Aloicoccus otitidis
Korineformne vrste
Scedosporium apiospermum.
Mogui kontaminenti iz spoljanjeg unog kanala:
8.6
Alfa hemolitine streptokoke

Bacillus spp.
Enterobakterije
Izvjetavanje

Izolovana fizioloka mikroflora spoljnjeg unog kanala.
Ispitivanje brisa oka u sluaju

conjunctivitis-a i blepharitis-a
9.1
Uzorkovanje
9.2
25
odstraniti suvian sekret sterilnom gazom

preostali sekret uzeti sterilnim brisom
ukoliko nema sekreta bris se uzima sa unutranje strane donjeg kapka
kod sumnje na hlamidijalnu ili virusnu infekciju oka, materijal se
uzima skrepingom konjunktive (oftalmolog!!!)
materijal sa ronjae uzima ljekar oftalmolog u specijalistikoj
ambulanti
posebno uzeti materijal iz desnog i lijevog oka
Transportovanje

9.3
Zasijavanje
9.3.1
u sluaju ozbiljnih infekcija oka, kod neonatusa sa ljepljivim oima

i od kanalikularnog gnoja
na istim neupotrebljavanim staklima

bojiti po Gram-u
preparat se ne pravi kod blepharitis-a i conjunctivitis-a
9.3.2
Kultivacija
krvni agar (sa stafilokoknom crtom na razrijeenom dijelu)

endo agar
26
Dodatno:
ako je u pitanju novoroene i na podlogu za izolaciju Neisseria
gonorrhoeae (VCN okoladni agar)
9.4
Inkubacija
krvni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35- 37 C, 40-48 h
selektivni okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37 C, 40-48
h (svakodnevno itanje)
endo agar- aerobno, 35- 37C, 16- 24 h
Dodatno:
VCN okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37 C, 40-48 h
9.5
Tumaenje nalaza
U sluaju conjunctivitis-a i blepharitis-a patogenima se smatraju:
9.6
hemolitini streptokok gr. A, B, C i G
Moraxella spp.
Neisseria meningitidis
Clamydia trachomatis (obraeno u protokolu za virusoloke i
seroloke procedure)
Drugi mikroorganizmi
Izvjetavanje

10
27
Ispitivanje brisa oka u sluaju

drugih infekcija oka
10.1
Canaliculitis
Celulitis orbitae
Dacriocystitis
Dacrioadenitis
Keratitis
Endophtalmitis
Hypopyon
Infekcije poslije operacije ili traume
Uzorkovanje
Bris oka - uzorak ograniene vrijednosti
Pravi uzorak - aspirat iz tkiva zahvaenog infekcijom
10.2
Transportovanje
to prije poslati do laboratorije (anaerobi!) Ako je brz transport nemogu:

koristiti transportnu podlogu
10.3
Zasijavanje
10.4
krvni agar sa stafilokoknom crtom

endo agar
podloga za anaerobne bakterije sa 5g diskom metronidazola
Inkubacija
krvni agar i okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 4048 h (svakodnevno itanje)
28

podloga za anaerobne bakterije: anaerobno, 35-37C, 40-48 h (do 5
dana)
10.5
Tumaenje nalaza
U sluaju dubokih infekcija oka, u brisu oka ili aspiratu, patogenim se
smatraju sve naene bakterije.
11
Ispitivanje likvora
11.1
Uzorkovanje
29
Uzorak likvora se uzima pod najstroijim uslovima asepse

lumbalnom punkcijom izmeu 3. i 4. lumbalnog prljena.
Koa se prvo dezinfikuje alkoholom, a potom jodom i ostavi da se
11.2
osui i ponovo obrie alkoholom.

Struno lice koje obavlja punkciju mora imati na rukama sterilne
hirurke rukavice.
Za bakterioloki pregled likvor se skuplja u sterilnu epruvetu u
koliini 1-2 ml (za novoroenad moe i bilo koji manji volumen).
Najbolje je zasijati likvor odmah kraj bolesnikog kreveta.
Transportovanje
ako je neophodan transport, on ne smije biti dui od 2 sata, pri tome
11.3
se epruveta sa likvorom dri stisnuta u ruci, a po potrebi se ruka sa

epruvetom stavlja pod pazuh da bi se obezbjedila potrebna
temperatura za preivljavanje bakterija; preporuuje se transportni
termostat
ukoliko likvor mora da saeka transport uva se u termostatu na 3537 C (nikako u friideru)
Zasijavanje
11.3.1 Direktan mikroskopski preparat

upotrebiti nova, nekoriena stakla, koja se dre u alkoholu, a prije
upotrebe isperu destilovanom vodom, osue i provuku kroz plamen.

praviti dva preparata: jedan se boji po Gramu, a drugi metilenom
za pravljenje preparata koristiti sediment sa dna epruvete nakon
centrifugiranja (ne razvlaiti kap nanesenu na staklo)
nakon suenja na vazduhu, preparate fiksirati prelivanjem 95-100%
metil alkoholom koji se ostavi na preparatu 1 minut, odlije, a preparat
se ponovo sui na vazduhu. Alternativa je brzo provlaenje preparata
3 puta kroz plamen (nakon toga kada se dodirne rukom poleina
stakla treba da je blago zagrijana - ne vrua)
30
Kod sumnje na Cryptococcus neoformans, uzeti jednu kap likvora sa

dna epruvete i dodati jednu kap 50% indijskog tua i pokriti
pokrovnim staklom.
Likvor centrifugirati 5 minuta na 3000 obrtaja/min. Supernatant odliti
sterilnom Pasterovom pipetom u drugu sterilnu epruvetu, a sediment lagano
izmjeati na vorteks aparatu ili vrtei epruvetu u ruci i koristiti za pravljenje
preparata i zasijavanje (po jedna kap sedimenta na dva predmetna stakla za
preparat i po jedna kap za zasijavanje podloga).
11.3.2 Kultivacija
modanosrani infuzioni krvni agar sa stafilokoknom crtom
obogaeni okoladni agar
teni Muller-Hinton sa X i V faktorima rasta ili modano-srani
infuzioni bujon sa X i V faktorima rasta - presijava se nakon
inkubacije na modano-srani infuzioni krvni agar sa stafilokoknom
crtom i obogaeni okoladni agar
Prije zasijavanja likvor i podloge se dre u termostatu na 37 C pola
sata.
Zasijavanje se obavlja tako to se sterilnom pipetom ili ezom sa dna
epruvete uzme po jedna kap taloga i nanese na svaku od podloga. Podloge staviti
u termostat da se kap osui, a potom razvui materijal ezom po podlozi.
11.4
Inkubacija
sve zasijane podloge: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37 C, 40-48h
11.5
Tumaenje nalaza
patogenim se smatraju sve naene bakterije

Za detekciju solubilnih antigena u likvoru bakterija koje su najei
uzronici meningitisa (Neisseria meningitidis A, B, C, Streptococcus
pneumoniae i Haemophilus influenzae) radi se komercijalni lateks aglutinacioni
test. Test se izvodi prema uputstvu proizvoaa, a koristi se u sljedeim
sluajevima:
kod pacijenata sa imunodeficijencijom kod kojih leukociti mogu
nedostajati u likvoru, uprkos postojanju infekcije
pacijenti tretirani antibioticima prije nego je uzet likvor na ispitivanje
31
U izvjetaju sa negativnim rezultatom staviti napomenu: Postoji mogunost

lano negativnog rezultata.
11.6
Izvjetavanje
U sluaju negativnog rezultata, izvjestiti: Zasijane podloge ostale su

sterilne
32
12
Ispitivanje krvi (hemokultura)
12.1
Uzorkovanje
krv se uzima iz kubitalne vene pod uslovima najstroe asepse (kod
odojadi i male djece iz temporalne vene)

prije venepunkcije kou dezinfikovati alkoholom, pa jodom koji se
ostavi da se osui, pa ponovo obrie alkoholom
venepunkciju obavezno obavljati koristei sterilne rukavice
uzima se 10-30 ml za odrasle, 1-5 ml za djecu (prema tjelesnoj masi)
Idealno je uzimanje uzorka krvi 30 minuta pred oekivani skok
temperature to esto nije mogue primijeniti zbog nepredvidljivih skokova
temperature.
Zavisno od razliitih uslova i situacija treba se pridravati sljedeih
preporuka:
u akutnim febrilnim bolestima kao to su meningitis ili bakterijska
pneumonija, gdje moe biti neophodno odmah ukljuiti empirijsku
antibiotsku terapiju, ili ako se radi o pacijentima sa infekcijama kao to
su osteomijelitis ili supurativni artritis koji su bili podvrgnuti hitnoj
hirurkoj intervenciji, uzimaju se dva odvojena uzorka iz dvije ruke,
istovremeno, tj. neposredno jedan za drugim.
ako je nepoznat uzrok febriciranju, uzimaju se dva uzorka krvi u
razmaku od 45 do 60 minuta. Na ovaj nain se moe pokuati razluiti
da li postoji kontinuirano ili povremeno rasijavanje mikroorganizama u
krvotok. Nova dva uzorka krvi na isti nain mogu biti uzeta nakon 24 do
48 h poslije prvog uzorkovanja, ukoliko se za tim ukae potreba.
u sluajevima akutnog infektivnog endokarditisa, uzimaju se tri uzorka
iz tri odvojene venepunkcije u prvih 1 do 2 sata od postavljanja
dijagnoze, a potom se zapoinje terapija. Kod sumnje na subakutni
bakterijski endokarditis prvog dana se uzimaju tri odvojena uzorka krvi
sa razmakom od najmanje 30 minuta. Ukoliko se dobije negativan nalaz,
uzimaju se dva nova uzorka narednih dana. Kada su rezultati
hemokultura negativni, uprkos postojanju jasnih klinikih znakova i
simptoma bolesti, kliniar treba da mikrobiologu na to skrene panju,
kako bi se u ispitivanju naredne hemokulture primjenile obogaene
podloge.
Uobiajena je praksa da se pri svakoj venepunkciji uzme krvi dovoljno za
dvije hemokulture: jednu koja e se inkubirati aerobno i drugu koja e se
33
inkubirati anaerobno. Preporuka je za odrasle da minimalni volumen po jednoj

hemokulturi bude 10 ml krvi.
12.2
Transportovanje
krv zasijati uz postelju bolesnika, a ako je to nemogue, dodati u
12.3
epruvetu sa krvlju sterilan antikoagulans odmah po uzimanju i

transportovati bez odlaganja
zasijane podloge drati u termostatu do transporta (nikako u frideru)
Zasijavanje
Krv za hemokulture se dodaje podlozi u razmjeri 1:5 ili 1:10 kako bi se

razblaili postojei antibiotici i druge antibakterijske supstance u uzorku.
Koristiti komercijalne gotove podloge za hemokulture. Mogue je
korienje i podloge za automatizovane sisteme za ispitivanje hemokultura uz
odgovarajuu aparaturu i prema uputstvu proizvoaa.
12.4
Supkultivacija
Pozitivnost hemokulture registrovati prema uputstvu proizvoaa gotove

komercijalne podloge.
Pozitivnu hemokulturu presijati na:
Krvni agar sa stafilokoknom crtom
Podloga za anaerobe sa diskom 5 g metronidazola (na ovu podlogu
presijava se pozitivna boica za anaerobnu hemokulturu)
12.5
Inkubacija
Krvni agar sa stafilokoknom crtom: u uslovima sa 5-10% CO2, 3537C, 40-48h (svakodnevno itanje)
Podloga za anaerobe: anaerobno, 35-37C, 40-48 h (do 5 dana)
12.6
Tumaenje nalaza
Izvjetava se bilo koji izolovani organizam uz komentar o klinikom
znaaju kada postoji sumnja

Sumnja u kliniki znaaj izolata postoji kada su izolovani razliiti
mikroorganizmi u parnom uzorku hemokulture, ili ako je jedan
uzorak iz para sterilan u takvim sluajevima se u napomeni sugerie
kliniarima da ponove analizu
34
Kad se iz jedne hemokulture izoluju 2 ili vie bakterijskih vrsta koje

su mikroflora koe, preporuuje se ponavljanje analize uz naznaku da
je hemokultura kontaminirana
12.7
Izvjetavanje
U sluaju negativnog rezultata, izvjestiti: Zasijane podloge ostale su

sterilne nakon ... dana inkubacije.
13
Ispitivanje intravaskularne kanile

i slinih uzoraka
13.1
Uzorkovanje
35
vrh kanile: dezinfikovati kou oko mjesta insercije kanile, odstraniti
13.2
kanilu na aseptian nain, i odsjei sterilnim makazama vrh kanile

duine 4 cm u sterilnu posudu (ovaj uzorak daje validne informacije,
ali zahtijeva uklanjanje kanile to moe ponekad dovesti do gubljenja
prilaza veni)
brisevi-mogu se koristiti brisevi sa mjesta insercije kao alternativni
uzorci, ali rutinsko ispitivanje kod asimptomatskih pacijenata moe
imati sumnjivu vrijednost. Korisno je jedino kad postoji kliniki
dokazana lokalna infekcija. Bris koe oko CVK ili vora (HUB)
kanile moe se koristiti za prognoziranje infekcije na mjestu insercije
kanile.
Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu za

briseve:
13.3
Zasijavanje
Tehnike koje se koriste za dijagnozu lokalne ili sistemske infekcije povezane sa

kanilom ukljuuju:
semikvantitativnu i kvantitativnu kultivaciju segmenata kanile
bujon kultivacija segmenata kanile, posebno vrha
36
bojenje kanile
kultura krvi aspirirana kroz i.v. kanilu
kultura vora (eng. hub) kanile
kultura mjesta insercije kanile
ultarsonikacija kanile
13.3.1 Semikvantitativna metoda

Krvni agar
Kultura spoljne povrine kanile primjenjuje se za predvianje koji kateteri
su zaista inficirani i mogu da uzrokuju infekciju krvi. Krajnih 4 cm segmenta
kanile (uzetih pod strogo aseptinim uslovima) kotrlja se preko itave povrine
agar ploe 5 puta i broje se izrasle kolonije. Cut off preko 15 kolonija bilo kog
organizma je najee prihvatljiv za prognoziranje pojave sepse uzrokovane
kanilom. (Meutim, u praksi ovaj cut off moe biti suvie nizak ako se ne
primjenjuju stroge mjere opreza pri uklanjanju kanile, gdje cut off vei od 100
kolonija moe biti vie odgovarajui).
13.3.2 Kvantitativna metoda

Ova metoda daje informacije i o unutranjoj i o spoljanjoj povrini
kanile.
Cut off od 1000 cfu/ml se koristi kao indikator sepse.
Ova metoda je veoma zahtjevna i ne preporuuje se njena rutinska
primjena u ovom SOP-u. Ove metode su podjednako efikasne u predvianju
odsustva infekcije.
13.3.3 Obogaena metoda

Krajnji segment kanile se stavlja u obogaeni bujon. Ova metoda ne
razlikuje kolonizaciju, infekciju ili kontaminaciju kanile i ne proporuuje se u
ovom protokolu.
13.3.4 Metoda endoluminal brush

Smatra se preciznom metodom za detektovanje sepse povezane sa
kateterom bez potrebe uklanjanja katetera.
13.3.5 Brza dijaganostika metoda

Bojenje kanile (ili uzimanje otiska kanile) po Gramu ili sa Acridine
orange.
13.4
37
Inkubacija
13.5
Tumaenje nalaza (za semikvantitativnu metodu)

Mikroorganizmi koji se najee izoluju:
13.6

Staphylococcus aureus ukljuujui MRSA
Enterobacteriaceae
Pseudomonas
Enterococcocus
Corynebacterium spp.
Streptococcus
Bacillus spp.
Mogu se izolovati i gljivice: Candida albicans i dr. kvasnice,
Aspergillus spp., Fusarium spp.
Izvjetavanje
13.6.1 Kanila
Izvjestiti broj CFU izolovanog mikroorganizma uz napomenu: npr.
porast 15 CFU moe biti povezan sa sistemskom infekcijom u vezi
sa kanilom ili moe biti povrinska kolonizacija ili kontaminacija treba uzeti u obzir rezultat hemokulture.
13.6.2 Brisevi
Izvjestiti kakav je intenzitet porasta (masovan, umjeren ili oskudan)
uz napomenu koja e uzeti u obzir da li postoji ili ne lokalna
infekcija.
38
14
Ispitivanje fecesa (koprokultura)
14.1
Uzorkovanje
Feces se uzima neposredno poslije defekacije. Pacijenta savjetovati
14.2
da defekaciju obavi u nonu posudu, opranu deterdentom i dobro

ispranu (ne mora biti sterilna). Iz none posude prebaciti u kontejner
sa poklopcem, 1-2 g fecesa (veliina ljenika), pri emu treba birati
sluzave, gnojave i krvave djelove, ako ih ima.
Kod odojadi feces se uzima sa pelene na isti nain kao kod odraslih.
Rektalni bris treba uzimati samo u izuzetnim sluajevima, tj. kada je
nemogue dobiti feces.
Dobra praksa davanje pisanog uputstva pacijentima.
Transportovanje
Transport do laboratorije treba obaviti u roku od 2 sata, a u protivnom
uzorak se konzervie puferisanim glicerolom (pomijeati jednake

dijelove 0,033 M natrijum ili kalijum fosfatnog pufera i glicerola).
U sluaju negativnog nalaza analizu treba ponoviti jo 2 puta, da bi se
mogao iskljuiti eventualni patogen.
14.3
Zasijavanje
14.4
2 SS agara (Salmonella, Shigella, Yersinia enterocolitica)

selenit F bujon (Salmonella, Shigella)
sorbitol agar (EPEC O:157 H:7)
selektivna podloga za kampilobakter
Inkubacija
SS agar: aerobno, 35 - 37 C, 16-24 h
SS agar: aerobno, sobna temperatura, 16-24 h
39
Selenit F bujon: aerobno, 35 - 37C, 8-12 h, a potom presijati na SS
14.5
agar koji se inkubira aerobno, 35 - 37C, 16-24 h

sorbitol agar: aerobno, 35 - 37C, 16-24 h
selektivna podloga za kampilobakter: mikroaerofilni uslovi, 42-43C,
40-48 h.
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
14.6
Salmonella spp.
Campylobacter spp.
Shigella spp.
Yersinia enterocolitica
Escherichia coli O:157; H:7
Clostridium difficile (ispituje se po posebnom protokolu)
Vibrio cholerae (vidi protokol 13.1)
Izvjetavanje

Kulturom nisu izolovane Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp.,
Escherichia coli O:157; H:7, Yersinia enterocolitica.
15
Koprokultura za izolaciju
Vibrio cholerae
Ne radi se u rutinskoj dijagnostici ve prema epidemiolokim indikacijama!
15.1
Zasijavanje
alkalna peptonska voda (APV)
TCBS
40
15.2
Inkubacija
APV: aerobno, 35-37C, 8 h, nakon ega presijati APV na TCBS
TCBS: aerobno, 35-37C, 16-24 h
15.3
Izvjetavanje
Vibrio cholerae nije naen.
Vibrio cholerae je naen.
16
Ispitivanje urina (urinokultura)
16.1
Uzorkovanje
41
Optimalno vrijeme je prije primjene antimikrobne terapije.
16.1.1 Metodi uzimanja:

srednji mlaz urina (MSU) preporueni metod za rutinsku praksu.
Nakon pranja anogenitalne regije sa dosta vode (bez upotrebe

dezinficijensa), prvi dio istog urina se odbaci i bez prekidanja mlaza,
oko 10 ml se sakupi u sterilnu posudu. Ako se koristi borna kisjelina
posuda se puni do oznake i sadraj dobro promuka
clean - catch urin (CCU) dobra alternativa MSU. Preporuuje se
potpuno pranje periuretralnog predjela. Cijeli uzorak se sakuplja u
sterilnu posudu i alje na ispitivanje
suprapubini aspirat (SPA) urin se uzima aseptino, direktno iz
beike, aspiriranjem iglom i pricem
urin iz katetera (CSU) moe se dobiti jednom kateterizacijom / in
and out/, ili iz stalnog katetera
urin iz kese sterilna kesa se privrsti preko svjee opranih i
osuenih genitalija, a sakupljeni urin se prenosi u sterilnu posudu sa
poklopcem
filter papir poslije detaljnog pranja genitalija i okolne koe, filter
papir se stavlja u pelenu. im se ovlai, vrhom prica se izvue urin i
prebaci u sterilnu posudu
urin iz urostome dobija se preko sterilnog katetera koji aseptino
ulazi kroz urostomu
urin uzet cistoskopijom
urin iz uretera uzet u toku cistoskopije pomou ureternog katetera
uzorci za dijagnozu prostatitisa su sljedei:
prvih 5 - 8 ml urina (uretralni urin)
srednji mlaz urina (iz beike)
sekret prostate poslije masae prostate
prvih 2 - 3ml urina poslije masae prostate
42
urin za Salmonella typhi i Salmonella paratyphi - uzima se bilo koji
16.2
urin suspektnih sluajeva ili kontakta

rani jutarnji urin (EMU) - tri cijela, prvoizluena prva jutarnja urina
su potrebna za kultivisanje Mycobacterium tuberculosis
Koliina uzorka
najmanje 1 ml uzorka u sterilnu posudu sa poklopcem
napuniti do linije oznaene na posudi sa bornom kisjelinom
16.3
Transportovanje
Vrijeme izmeu uzimanja i obrade uzorka:

do 4 h - ako je mogue
do 48 h - propadanje uzorka se izbjegava hlaenjem
do 96 h - uzorak se uzima u sterilan, zatvoren kontejner sa 1-2%
bornom kisjelinom
16.4
Zasijavanje
Preporuene podloge i vrijeme inkubacije dati su u tabeli br.5

Runi metod - kalibrisanom ezom, zasijavanje povrinskim linijama.
paljivo promukati urin da se izbjegne pjenuanje
uroniti kraj sterilne, kalibrisane eze (1l, 2l, 10l) u urin odmah
ispod povrine i izvui vertikalno vodei rauna da ne bude urina van
ome
inokulisati podlogu i razvui, najvie 2 uzorka na ploi prenika 9
cm, ezom od 10 l
Broj bakterija u 1 ml urina (cfu, engl. colonies forming units) se
odreuje prema tabeli br.3
TABELA 3. Vodi za odreivanje broja bakterija u 1 ml urina runim metodom /
kalibrisanom ezom / i multipoint metodom /
cfu/ml
0.3 l
Broj cfu koristei inokulum od

1 l
2 l
5 l
10 l
1000
10
10 000
10
20
50
100
100 000
30
100
200
500
1000
43
Filter papir metod ovaj metod je senzitivan za ispitivanje urina sa vie od 10

000 cfu/ml
uroniti komercijalno pripremljen sterilan filter papir u urin do oznake
odstraniti suvini urin prevlaenjem ivice filter papira uz stranu
posude sa urinom i pustiti da se preostali urin apsorbuje u papir prije
inokulacije podloge
pritisnuti papir na agar nekoliko sekundi
Broj bakterija u 1 ml urina se odreuje prema tabeli br.4.
TABELA 4. Vodi za odreivanje broja bakterija u 1 ml urina filter papir metodom
Broj poraslih kolonija
Bacili
05
5 - 25
25
Koke
08
8 30
30
Odgovarajui cfu/ml
10 000
10 000 100 000
100 000
Multipoint metod - SPA, drugi hirurki uzeti urini i urini u kojima se oekuje
manje od 100 cfu/ml
inokulisati 100 l (0.1 ml) uzorka aseptino na cijelu Endo agar
(CLED agar) plou
za izolaciju pojedinanih kolonija, razvui inokulum sterilnom ezom
ili tapiem po cijeloj povrini ploe
cfu/ml = broj poraslih kolonija x10
Broj bakterija u 1 ml urina se odreuje prema tabeli br.3
16.5
Posebne situacije
Sumnja na crijevne groznice

paljivo dodati jednaku koliinu (5 - 10 ml) necentrifugiranog urina u
5 - 10 ml dvostruke koncentracije manitol selenita.
Odreivanje antimikrobnih supstanci

plou sa Bacillus subtilis, Escherichia coli ili Staphylococcus aureus
inokulisati ispitivanim urinom (Bacillus subtilis je pogodniji zbog
svoje osjetljivosti na iri spektar antibiotika. Ovu plou zasijati
poslednju, da se izbjegne zagaenje Bacillus subtilis-om)
44
16.6
Inkubacija
TABELA 5. Podloga, uslovi i oekivani organizmi

Kliniki
detalji
Inkubacija
Standardna
podloga
IUT
CLED agar
/endo agar /
krvni agar
Crijevne
groznice
Dvostruka
konc.
manitol
selenit
bujona
subkultura
na SS
atmos.
35-37
aerobno
35-37
aerobno
Oekivani organizam
Vrijeme itanje
1624 h
1624
16 h
Enterobacteriaceae
Enterococci
Lancfield Group B. streptokoka
Pseudomonas
Staphylococcus saprophyticus
Druge koagulaza neg. staf
16
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi
35-37
aerobno
1624
16
Za situacije:
Susp.
gljivina
infekcija
Sabouraud
agar
35-37
aerobno
40-48
40
Gljivice
Ispitivanje
prisustva
antimikrobnih
supstanci
MH agar
sa Bacillus
subtilis
(vie
uzoraka na
jednoj
ploi)
35-37
aerobno
16-24
16
Antimikrobne supstance
Podloga za
anaerobe
35-37
aerobno
40-48
40
Anaerobi
okoladni
agar
35-37
510 %
CO2
40-48
40
Osjetljivi organizmi
Sterilna
piuria
Nema
antimikr.
sredstava
45
16.7
Tumaenje nalaza
Tumaenje nalaza dato je u tabeli br.6.

TABELA 6. Tumaenje nalaza urinokulture
Porast
cfu/ml
Broj izolovanih
vrsta
mikroorganizama
2
>100.000
Svi
Bilo koji
organizam u
broju
100.000 ili
>10.000
Kliniki
detalji
Nema
MSU,
CCU,
SCU,
BAG,
Le
Simptomi
CSU
Stalni
kateter
Neuroloka
beika
Potreban
test
osjetljivosti
Sugestije
Vjerovatna
IUT
Da
Ponoviti ako
je uzorak
star ili nema
piurije.
Ako je iz
kese
predloiti
SPA, CCU.
- Mogua IUT
- kolonizacija
ako je loe
uzimanje ili
transport
Da
Ponoviti
zbog
potvrde
Tumaenje
rezultata
Vjerovatna
kolonizacija
Ne - uvati
plou 5
dana ako
pacijent
postane
septian
Razmotriti
ako pacijent
ima stalni
kateter ili
zahtijeva
terapiju
Ponoviti ako
je uzorak
star ili nema
piurije
Ako je iz
kese
predloiti
SPA, CCU
2
ili
3
1 organizam
predominira u
broju
>100.000 ili
>10.000
Svi
Nema
Mogua IUT
Da,
predominantan
organizam
Mijeani rast
nema
dominantnog
soja
Svi
Nema
Nepravilno
uzimanje ili
transport
Ne
Ponoviti
ako ima
simptome
Le
Simptomi
Vjerovatno
IUT
Da
Ponoviti
zbog
potvrde
Le
Simptomi
Djeca
Vjerovatno
IUT
predominantnom vrstom
Drugi izolat
vjerovatno
kontamin-acija
10.000
100.000
2
Tip
uzorka
Svi
1 predominantan u 10.000
Svi
Da,
predominantni
organizam
Ponoviti ili
SPA / CCU
46
Porast
cfu/ml
Broj izolovanih
vrsta
mikroorganizama
Tip
uzorka
Kliniki
detalji
Tumaenje
rezultata
Nema
Vjerovatna
kontamin-acija
1 u <10.000 ili
u 10.000100.000 ali ne
dominira
1 predominira
u 10.000
Svi
Potreban
test
osjetljivosti
Ne
Sugestije
Mijeana
kultura,
vjerovatno
kontaminacija
Vjerovatno
IUT
dominantnim
sojem
Ne uvati
ploe do 5
dana
Mijeana
kultura
ponoviti ako
ima
simptome
Kolonizacija
Ne uvati
ploe do 5
dana
Razmotriti
ako je
potrebna
terapija
Vjerovatna
IUT potrebna
klinika
ispitivanja
Da
Ponoviti da
se potvrdi
Vjerovatna
IUT potrebna
klinika
ispitivanja
Da
Ponoviti da
se potvrdi
Nema
Vjerovatno
IUT
Da
Le
Vjerovatno
IUT
Da
Le
Vjerovatno
IUT
Da,
predominantan
organizam
Nema ili je
pacijent
asimptomatian
Nema IUT
Simptomatski
perzistentna piurija
Pacijent na
antibioticima ?
Mogua
Chlamydia
Osjetljivi
organizmi
Le
Simptomi
3
Sve
kombinacije
MSU,
CCU,
CSU,
IL
1
1.000
10.000
2
Kateter
Svaka vrsta
1000
ukljucujuci E.
coli ili
S. saproph
Svi
100
10.000
Nema
porasta
Svaki
organizam
100
1 organizam
1000
< 1000 ezom

od 1 l
< 100 ezom od
10 l
SPA,
CYS,
SCU
Svi
Stalni
kateter
Neuroloka
beika
ene sa
simptomima
Prostatitis
Le
Mijeani
rast,
ponoviti
Preporuiti
dalje
ispitivanje
MSU Srednji mlaz, CCU clean catch, BAG urin iz kese, SPA suprapubicni aspirat, CSU kateter,
SCU jedna kateterizacija CYS cistoskopski urin, Le leukociti, IUT infekcija urinarnog trakta
47
17
Ispitivanje vaginalnog brisa
17.1
Uzorkovanje
Uz pomo spekuluma brisom se uzima sekret zadnjeg forniksa
vagine.
17.2
Transportovanje

17.3
Zasijavanje

dva mikroskopska preparata jedan bojen po Gram-u; drugi za neko
od dodatnih bojenja, po potrebi

izvjestiti o postojanju blastospora, leukocita i eventualnom prisustvu
intracelularnih Gram - diplokoka
izvjestiti opisno uoene mikroorganizme
izvjestiti o postojanju clue elija
izvjestiti da li mikroskopski preparat sugerie bakterijsku vaginozu
(BV) na osnovu jedne od dvije eme:
ema po Nugentovim kriterijumima:

BROJ
LAKTOBACILA
PO VIDNOM
POLJU
> 30
5 30
24
1
Nijedan
REZULTAT
BROJ
GARDNERELLA
* PO VIDNOM
POLJU
0
1
2
3
4
> 30
5 30
24
1
Nijedna
REZULTAT
BROJ
MOBILUNCUS
PO VIDNOM
POLJU
REZULTAT
4
3
2
1
0
> 30
5 30
24
1
Nijedan
4
3
2
1
0
48
Zbir sva 3 rezultat 0 3

fizioloka mikroflora
djelimino izmjenjena mikroflora: ukazuje na moguu BV; na
osnovu klinikih kriterijuma ponovo poslati na analizu radi potvrde
BV
izmjenjena mikroflora: indikovana bakterijska vaginoza
Lactobacillus - veliki gram pozitivni bacili

*Gardnerella vaginalis - mali gram labilni bacili
Mobiluncus - savijeni gram negativni ili gram labilni bacili
clue elije su epitelijalne elije prekrivene Gram varijabilnim kokobacilima i bacilima (slika br.1)
SLIKA 1. Preparat bojen po Gram-u: clue elija

(Izvor: http://pedagogie.ac-montpellier.fr/Disciplines/sti/biotechn/frottisvaginal.htm)
ema po Hejsovim kriterijumima:
I stepen
II stepen
III stepen
Fizioloka
mikroflora
preovladava Lactobacillus (Gram pozitivni tapii)
Djelimino
izmijenjena
mikroflora
mijeani laktobacili sa drugim morfotipovima bakterija; na

osnovu klinikih kriterijuma ponovo poslati na analizu radi
potvrde BV
Izmjenjena
mikroflora
malobrojni ili potuno odsutni laktobacili, ali veliki broj Gram

labilnih kokobacila tipa Gardnerella vaginalis i drugih
morfotipova bakterija; ukazuje na BV
49
17.3.2 Kultivacija
krvni agar
endo agar
17.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35 - 37C, 16-24 h
endo agar: aerobno, 35 - 37C, 16-24 h
17.5
Tumaenje nalaza
Fizioloka mikroflora: Lactobacillus ne referie se
Oportunistika flora:
17.6
Gardnerella vaginalis kultivie se po potrebi, samo kod

trudnica
Streptococcus agalactiae
Anaerobne gram negativne bakterije ne kultiviu se rutinski
Candida spp.
Enterococcus spp.
Enterobakterije
Mogui patogeni:
Trichomonas vaginalis ispitivanje posebno opisano u ovom
poglavlju
Candida spp.
Streptococcus haemolyticus grupa A, C i G
Izvjetavanje

50
18
Ispitivanje cervikalnog brisa
18.1
Uzorkovanje
Cervikalni bris se uzima iz endocervikalnog kanala nakon uklanjanja
18.2
sluzi sa povrine grlia materice tupferom ili veim brisom. Vrh

manjeg dakronskog brisa se uvue nekoliko milimetara u cervikalni
kanal, zarotira kako bi se dobile cervikalne elije i eksudat i paljivo
izvue van, vodei rauna da se pri tome ne dodirnu zidovi vagine
Ukoliko se istovremeno ispituje na prisustvo mikoplazmi i hlamidija
redosljed je sljedei:
Prvi bris za kulturelno ispitivanje bakterija (osim mikoplazmi i
hlamidija)
Drugi bris za kulturelno ispitivanje mikoplazmi
Trei bris za ispitivanje prisustva hlamidijalnih antigena (DIF
ili ELISA)
Transportovanje
Ukoliko se ne zasijava odmah, transportuje se u transportnoj podlozi.
18.3
Zasijavanje

intraceularnih Gram - diplokoka

18.3.2 Kultivacija
krvni agar
endo agar
VCN okoladni agar
18.4
51
Inkubacija
VCN okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 40-72 h
18.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Neiserria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis (obraeno u protokolu za virusoloke i
seroloke analize)
Mycoplasma hominis
Ureaplasma urealyticum
Drugi mikroorganizmi koji mogu biti znaajni:
Druge streptokoke
Enterococcus spp.
Enterobakterije
Haemophilus spp.
Listeria spp.
Pseudomonas spp.
Gljivice.
Mogui patogeni kod ena sa puerperalnom sepsom, sepsom poslije

abortusa, kod pelvine upalne bolesti i kod trudnica.
Enterococcus spp.
Enterobakterije
Anaerobne Gram negativne bakterije
Clostridium spp.
Listeria monocytogenes
18.6
Izvjetavanje
Ukoliko nije uoen porast mikroorganizama izvjestiti: Zasijane podloge ostale

su sterilne.
52
19
Ispitivanje uretralnog brisa
19.1
Uzorkovanje
Pacijentu se savjetuje da najmanje 2 h prije uzimanja uretralnog brisa
19.2
ne urinira.
Kod sumnje na gonoreju, moe biti od koristi uzimanje uzorka prije
prvog jutarnjeg uriniranja.
Ukoliko postoji spontana sekrecija, uzima se kap sekreta pomou
brisa.
Ako nema vidljive sekrecije, treba obrisati okolinu uretralnog otvora
brisom natopljenim sterilnim fiziolokim rastvorom, a potom malim
urogenitalnim dakronskim brisom ui u uretralni kanal 2-4 cm i
ostaviti ga par sekundi kako bi se natopio eksudatom.
Kod sumnje na hlamidijalnu infekciju sterilan bris se uvlai u uretru
2-4 cm i rotira 10-tak sekundi kako bi se dobilo to vie epitelnih
elija iz uretralnog kanala.
Ukoliko se istovremeno ispituje na prisustvo mikoplazmi i hlamidija
redosljed je sljedei:
Prvi bris za kulturelno ispitivanje bakterija (osim mikoplazmi i
hlamidija)
Drugi bris za kulturelno ispitivanje mikoplazmi
Trei bris za ispitivanje prisustva hlamidijalnih antigena (DIF
ili ELISA) obraeno u protokolu za virusoloke i seroloke
analize
Transportovanje
Ukoliko se ne zasijava odmah, bris se transportuje u transportnoj
podlozi
19.3
Zasijavanje

53
intraleukocitarnih Gram - diplokoka

19.3.2 Kultivacija
krvni agar
endo agar
VCN okoladni agar
19.4
Inkubacija
VCN okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 40-72 h
19.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
19.6
Chlamydia trachomatis obraeno u protokolu za virusoloke i
seroloke analize
Trichomonas vaginalis
Ureaplasma urealyticum
Mycoplasma hominis
Drugi mikroorganizmi koji mogu biti znaajni:
Druge streptokoke
Enterococcus spp.
Enterobakterije
Haemophilus spp.
Listeria spp.
Pseudomonas spp.
Staphylococcus aureus, gljivice.
Izvjetavanje

Izolovana samo fizioloka mikroflora.
54
20
Ispitivanje prisustva
genitalnih mikoplazmi
20.1
Uzorkovanje
Moe se koristiti vaginalni, cervikalni ili uretralni bris
20.2
Zasijavanje
Gotove komercijalne podloge za izolaciju mikoplazmi transport,
inkubacija i tumaenje rezultata prema uputstvu proizvoaa
55
21
Identifikacija Staphylococcus spp.
21.1
Uvod
Rod Staphylococcus obuhvata vie od 30 vrsta, a stafilokoki koji su
21.2
najee povezani sa infekcijama kod ovjeka su:

Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
Staphylococcus species koje mogu izazvati infekcije kod ljudi:
Staphylococcus capitis
Staphylococcus hominis
Staphylococcus haemolyticus
Staphylococcus lugdunensis
Staphylococcus saccharolyticus
Staphylococcus warneri
Staphylococcus caprae
Staphylococcus hyicus
Staphylococcus intermedius
Staphylococcus schleiferi
Staphylococcus simulans
Druge vrste bliske ovom rodu koje mogu izazvati infekcije kod
ovjeka:
Micrococcus luteus
Rothia mucilaginosus (ranije Micrococcus mucilaginosus)
Izolacija
21.3
Identifikacija
21.3.1 Kulturelne osobine

Kolonije su okrugle, glatke, sjajne povrine, ravnih ivica, blago
konveksne, pigmentisane, bijele ili krem boje, ponekad ute pa i narandaste,
promjera 1-2 mm, mogu pokazivati hemolizu. Ezom se razmazuju po podlozi
(kao maslac).
56
21.3.2 Mikroskopske osobine u preparatu sa kulture

Gram-pozitivne koke pojedinano, u parovima, tetradama i grozdovima
(slika br.2).
SLIKA 2. Staphylococcus
aureus bojenje po Gram-u
Izvor:
http://www.geocities.com/capecana
veral/3504/gallery.htm from Neal
Chamberlain: Photo Gallery of
Bacterial Pathogens
21.3.3 Ispitivanje fizioloko-biohemijskih osobina

Modifikovani oksidaza test
Test se izvodi sa 6% rastvorom tetra-metil-fenilen-diamina u dimetil
sulfoksidu i diferencira stafilokoke (oksidaza negativne) od mikrokoka (oksidaza
pozitivni).
Katalaza test
Stafilokoki su katalaza pozitivni, a streptokoke katalaza negativne. Test se
izvodi sa odabranim bakterijskim kolonijama poraslim na vrstoj podlozi. Ne
treba raditi sa kolonijama poraslim na podlogama koje sadre intaktne eritrocite
(krvni agar). Kolonije sa okoladnog agara mogu se upotrebiti za testiranje.
Reagens je 3-5% hidrogen peroksid. On je nestabilan i treba ga uvati u
friideru. Izbjegavati svako nepotrebno izlaganje svjetlosti.
Izvoenje:
staviti jednu kap hidrogen peroksida na predmetno staklo
mali dio suspektne kolonije nanijeti na centar pokrovnog stakalceta
obrnuti pokrovno stakalce i staviti na kap hidrogen peroksida na
ploici
posmatrati stvaranje mjehuria unutar 10 sek. Koristiti lupu ako je
potrebno za gledanje vrlo slabe produkcije katalaze.
57
Koagulaza test
Vrste roda Staphylococcus se diferenciraju prema sposobnosti da
koaguliu plazmu pomou enzima koagulaze. Staphylococcus aureus je
koagulaza pozitivan.
Vezana koagulaza se odreuje testom na ploici, a slobodna testom u
epruveti.
Reagensi i oprema: test rastvor komercijalna plazma (sa EDTA) za test
na ploici, odnosno za test u epruveti, bakterioloka oma i Pasterove pipete.
Pozitivna kontrola: Staphylococcus aureus NCTC 6751
Negativna kontrola: Staphylococcus epidermidis NCTC 4276
Izvoenje koagulaza testa na ploici:
Staviti kap destilovane vode na ploicu.
Napraviti suspenziju ispitivanog soja da bude homogena i gusta.
(Lano negativna reakcija se moe dobiti ako suspenzija nije
dovoljno gusta. Pogledati da nema autoaglutinacije. Sojevi koji
pokazuju autoaglutinaciju moraju biti testirani drugim metodama.)
Uzeti ezom plazmu i izmijeati je lagano sa homogenom
suspenzijom.
Pozitivan rezultat vidljivo stvaranje grudvica unutar 10 sek.
Negativan rezultat nema vidljivog stvaranja grudvica.
Postoje komercijalni kitovi koji sadre npr. lateks estice senzibilisane sa
IgG (monoklonsko anti-Staph. aureus antitijelo) i eritrocite obloene humanim
fibrinogenom. Staphylococcus aureus u ovoj suspenziji se proteinom A vezuje
za Fc fragment IgG na povrini lateks estica, a clumping faktorom reaguje sa
fibrinogenom na povrini eritrocita. Ovo dovodi do pojave grudvica, odnosno
aglutinacije. Test je zbog navedenog osjetljiviji od klasinog koagulaza testa na
ploici.
Izvoenje koagulaza testa u epruveti:
Staviti u epruvetu oko 1 ml komercijalne plazme pogodne za ovaj
test.
Suspendovati ispitivanu koloniju u plazmi.
Inkubirati na 35-37C i oitavati nakon 4 h.
Uoiti koagulum koji zahvata itav sadraj epruvete ili formira
slobodnu opnu fibrina. Ako je negativan, inkubirati preko noi na 2225C.
Pozitivan rezultat: stvaranje koaguluma unutar 4h na 37C ili nakon
inkubacije preko noi na 22-25C.
Negativan rezultat: nema koaguluma nakon 4h odnosno 24h.
Kod negativnog koagulaza testa na ploici obavezno uraditi test u
epruveti!
58
Novobiocin test
Koristi se u diferenciranju Staphylococcus saprophyticus (novobiocin
rezistentan) od ostalih koagulaza negativnih stafilokoka (novobiocin senzitivni).
Komercijalni testovi za biohemijsko ispitivanje stafilokoka
Identifikacija koagulaza negativnih stafilokoka pomou ovih kitova vri se
samo ako je to kliniki indikovano.
Izolovani soj se moe poslati u referentnu laboratoriju zasijan na krvni
agar ili kosi hranljivi agar.
SHEMA 1. Redosljed postupaka u identifikaciji Staphylococcus spp.
22
59
Identifikacija Streptococcus spp. i

Enterococcus spp.
22.1
Uvod
Rod Streptococcus obuhvata heterogenu grupu Gram pozitivnih, katalaza

negativnih koka koje su odgovorne za brojne infekcije kod ovjeka, a takoe su i
dio fizioloke mikroflore.
Najznaajnije vrste izazivai oboljenja kod ovjeka:
Streptococcus haemolyticus (BHS) gr. A, B, C, G
Streptococcus anginosus grupa: Streptococcus anginosus,
Streptococcus constellatus i Streptococcus intermedius
Streptococcus bovis
Viridans streptokoki (Streptococcus mutans, Streptococcuas
sanguis, Streptococcus mitis i dr.)
Enterococcus faecalis (od 1984. izdvojen iz streptokoka u
poseban rod Enterococcus zajedno sa Enterococcus faecium)
22.2
Izolacija
22.3
Identifikacija

Kolonije su sitne, sivkaste ili prozrane, konveksne i kompaktne. Kolonije
Streptococcus pneumoniae imaju centralno udubljenje (zbog aktivacije
autolizina). Neki sojevi zahtijevaju za rast prisustvo ugljen dioksida.
Na krvnom agaru streptokoki pokazuju jedan od tri tipa hemolize:
Alfa zelenkasta zona hemolize oko kolonija zbog djelimine destrukcije
eritrocita i redukcije hemoglobina u eritrocitima (Streptococcus pneumoniae i
veina viridans streptokoka, Enterococcus spp.)
60
Beta - prozirna zona oko kolonija zbog potpune destrukcije eritrocita

(Streptococcus haemolyticus gr.A, B, C,G). Streptococcus agalactiae
(streptokok gr.B) ima usku zonu hemolize oko kolonije, kolonije su neto
sjajnije i nisu kompaktne.
Gama nema hemolize (Enterococcus spp.)
Kolonije Enterococcus spp. mogu imati zonu hemolize ili biti bez
hemolize, sivkaste su, sjajne i nisu kompaktne (razmazuju se ezom).

Streptokoki su Gram-pozitivni koki, okrugli ili ovoidni, dijametra 0,61m, rasporeeni u parovima i lancima razliite duine, posebno u tenim
podlogama (slika br.3). Dijagnostiki je znaajan direktni preparat od materijala
iz primarno sterilnih regija, briseva rana, piodermija i sl., ali ne i sa mjesta gdje
se streptokoke nalaze kao dio fizioloke mikroflore.
SLIKA 3. Streptokoke grupisane u vidu dugih lanaca bojenje po Gram-u

(Izvor: http://www.geocities.com/capecanaveral/3504/gallery.htm from Neal Chamberlain: Photo Gallery of
Bacterial Pathogens)
Streptococcus pneumoniae je diplokok sa jednim otrijim polom (oblik

plamena svijee), ili je u kraim lancima, sa kapsulom u direktnom preparatu.
Direktni preparat sputuma kod sumnje na pneumokoknu pneumoniju sa
leukocitima i streptokokima pomenutog izgleda zato ima dijagnostiku
vrijednost (slika br.4).
61
Starija kultura streptokoka (koja je prela logaritamsku fazu rasta) gubi

Gram pozitivnost.
SLIKA 4. Streptococcus pneumoniae u direktnom preparatu sputuma

(Izvor: http://www.bact.wisc.edu/themicrobialworld/S.pneumoniae1.jpg)

Katalaza test
Negativan za sve streptokoke.
Bacitracin test
Osnovni je dijagnostiki test za identifikaciju Streptococcus pyogenes-a.
Radi se samo sa beta-hemolitikim streptokokama (i Streptococcus pneumoniae
moe biti osjetljiv na bacitracin), a koristi se test disk bacitracina od 0,04 U.
Pikira se nekoliko kolonija beta-hemolitikog streptokoka i ezom zasijava
krvni agar da se dobije gust, konfluentan rast. Postavlja se test disk ili test tableta
bacitracina i inkubira preko noi. Zatim se mjeri prenik zone inhibicije. Ako je
vei od 15 mm test je pozitivan. Treba imati u vidu da su odreeni sojevi
streptokoka gr. A (do 10% ) rezistentni na bacitracin i da su neki streptokoki gr.
C i G osjetljivi na bacitracin (3-5%).
Osjetljivost na trimethoprim/sulfamethoxasol
Moe se izvoditi zajedno sa bacitracinskim testom jer je vaan za
diferenciranje grupa beta-hemolitikog streptokoka C, F i G (senzitivne) od A i
B (rezistentne). Prenik zone inhibicije vei od 18 mm smatra se pozitivnim.
62
CAMP test (Christie, Atkins, Munch-Petersen)

Ovim testom se otkriva prisustvo CAMP faktora difuzibilnog proteina
koji pojaava beta hemolizu Staphylococcus aureus-a. Pozitivan je kod
Streptococcus agalactiae (gr.B).
Na krvnu plou zasijava se najprije Staphylococcus aureus u vidu crte, a
zatim okomito na nju zasijava se ispitivani soj streptokoka u vidu crte poevi od
kraja ploe do blizu stafilokokne crte. Za izvoenje ovog testa potreban je soj
Staphylococcus aureus-a sa dvostrukom zonom hemolize (slika br.5).
SLIKA 5. CAMP test koji se izvodi sa sojem Staphylococcus aureus-a sa

dvostrukom zonom hemolize
Nakon inkubacije preko noi posmatra se da li je u blizini stafilokokne
crte dolo do kopljastog pojaanja hemolize streptokoka.
Komercijalni testovi za seroloku identifikaciju grupe
Koriste se za beta-hemolitine streptokoke koje su bacitracin rezistentne,
trimethoprim/sulfamethoxasol osjetljive (Streptococcus haemolyticus gr.C, G i
F) radi identifikacije grupe.
Optohin test
Osnovni je test za diferenciranje Streptococcus pneumoniae od ostalih
alfa-hemolitikih streptokoka.
Izvodi se za alfa-hemolitike streptokoke zasijavanjem na krvnu plou
pomou eze tako da se dobije konfluentan rast, a zatim se postavlja test disk ili
test tableta sa optohinom (5g) i inkubira preko noi na 37C, u atmosferi sa 510 % CO2.
Optohin = etilhidrokuprein hidrohlorid (derivat kinina).
Test je pozitivan ako je zona inhibicije rasta vea od one koju je
proizvoa test diska ili tablete u uputstvu naznaio, negativan ako je manja.
63
Hidroliza eskulina u 40 % ui
Zasijava se kosi eskulin-uni agar ispitivanim sojem i inkubira preko
noi.
Ukoliko doe do hidrolize eskulina podloga mijenja boju u crnu (reakcija
nastalog eskuletina sa feri-citratom u podlozi).
Pozitivan je kod enterokoka i beta-hemolitikog streptokoka grupe D.
Rast u prisustvu 6,5% NaCl
Ispitivani soj se zasijava u epruvetu sa podlogom koja sadri visoku
koncentraciju NaCl (6,5%) i inkubira preko noi. Zamuenost podloge nakon
inkubacije znak je pozitivnog rezultata, a ako podloga ostane bistra rezultat je
negativan. Test je pozitivan kod enterokoka.
Komercijalni testovi za biohemijsku identifikaciju
Koriste se za identifikaciju ostalih hemolitinih streptokoka (optohin
rezistentnih, eskulin negativnih) do nivoa vrste ukoliko ta identifikacija ima
klinikog znaaja. U protivnom se mogu identifikovati kao Streptococcus
haemolyticus spp.
TABELA 7. Redosljed postupaka u identifikaciji streptokoka i enterokoka*
Dijagnostiki
kriterijum-test
Streptococcus
pyogenes
BHS
Streptococcus
gr.C, G, Enterococcus
agalactiae
F
BHS
gr.D
Streptococcus
pneumoniae
Viridans
streptokoke
Hemoliza
Osjetljivost na
bacitracin
Osjetljivost na
STX
Osjetljivost na
optohin
CAMP test
Hidroliza
eskulina u 40%
ui
Rast u prisustvu
6.5% NaCl
Grupa po
Lancfield-ovoj
C, G, F
Nema grupnog Nema grupnog

antigena
antigena
* Objanjenje tabele:
Uoiti suspektne kolonije na hranljivim podlogama i definisati tip hemolize.

Napraviti preparat sa kulture (Gram-pozitivni koki) i katalaza test (negativan).
64
Ukoliko ne raspolaemo ovim testovima uraditi: bacitracinski test, test osjetljivosti na

trimethoprim/sulfamethoxasol (SXT) i CAMP test. Identifikovati:
Streptococcus pyogenes (bacitracin pozitivan, SXT negativan)
Streptococcus agalactiae (bacitracin negativan, SXT negativan, CAMP pozitivan).
Streptococcus haemolyticus non A non B (bacitracin negativan, SXT pozitivan, CAMP
negativan).
22.4
U sluaju beta-hemolitikih streptokoka, ukoliko raspolaemo sa komercijalnim

testovima za seroloku identifikaciju, uraditi seroloku identifikaciju grupe i
identifikovati kao Streptococcus pyogenes (grupa A), Streptococcus agalactiae
(grupa B) ili beta hemolitiki streptokok grupe C, F ili G.
U sluaju alfa-hemolitikih streptokoka suspektnih kolonija uraditi optohinski test i

ako je pozitivan identifikovati kao Streptococcus pneumoniae.
U sluaju optohin negativnih alfa-hemolitikih kolonija ili nehemolitikih kolonija
uraditi test hidrolize eskulina. Ako je test hidrolize eskulina pozitivan, kao i test rasta
u prisustvu 6.5% NaCl, identifikovati kao Enterococcus spp. Ako je test hidrolize
eskulina pozitivan, a test rasta negativan identifikovati kao Streptococcus bovis,
ukoliko se komercijalnim testovima za seroloku identifikaciju potvrdi grupa D.
Ukoliko se seroloki ne potvrdi identifikovati Streptococcus spp. ukoliko je soj
vankomicin osjetljiv. Vankomicin rezistentne sojeve identifikovati kao Leuoconostoc
spp. Optohin negativni i eskulin negativni alfa-hemolitiki sojevi streptokoka mogu
se identifikovati kao Streptococcus spp. (grupa viridans).
Komentar
Seroloka klasifikacija streptokoka je zasnovana na antigenim razlikama

polisaharidnog antigena elijskog zida (C supstanca ili grupni karbohidratni
antigen) i dijeli streptokoke na grupe. Od medicinskog znaaja su grupe: A, B,
C, D, F i G. Streptococcus pneumoniae nema grupni antigen.
Viridans streptokoki je termin za alfa-hemolitike streptokoke koji su
takoe bez grupnih antigena.
23
Identifikacija Neisseria spp. i

morfoloki slinih organizama
23.1
Uvod
65
Neisseria spp. koje izazivaju oboljenja kod ljudi:
I druge najserije mogu biti povezane sa oboljenjima kod ljudi.
Najserijama sline vrste od kojih neke izazivaju oboljenja kod ljudi

(imena su im ispisana pojaanim slovima)
Moraxella lacunata
Moraxella atlantae
Moraxella nonliquefaciens
Moraxella osloensis
Kingella dentrificans
Kingella kingae
Gemella haemolysans
Gemella morbillorum
Veillonella dispar
Veillonella parvula
23.2
Izolacija
Obogaeni okoladni agar: u uslovima sa 5 10 % CO2, 3537 C,
40-48 h (svakodnevno itanje)

VCN okoladni agar (za N.gonorrhoeae iz primarno nesterilnih
uzoraka): u uslovima sa 5 10 % CO2, 3537 C, 40-48 h
krvni agar: u uslovima sa 5 10 % CO2, 3537, 1648 h inkubacije
66
23.3
Identifikacija

Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis formiraju glatke, okrugle,
vlane, sivobraon kolonije sa zelenkastim odsjajem na primarnom izolatu
Neisseria gonorrhoeae ne raste na krvnom agaru.
Moraxella catarrhalis i Moraxella lacunata formiraju jako konveksne
glatke, okrugle kolonije sa roskastim odsjajem, kompaktne (ezom povuene
klizaju po podlozi)

Neisseria spp. su Gram negativne koke, poreane u parovima, sa
paralelnim duim osovinama (slika br.6)
SLIKA 6. Neisseria meningitidis, preparat sa kulture - bojenje po Gram-u

(Izvor: http://biomarker.cdc.go.kr:8080/pathogen/pathogen_vi...)
Moraxella spp. su Gram - diplokoke (slika br.7)
SLIKA 7. Moraxella spp. preparat sa kulture bojen po Gram-u

(Izvor: http://www.buddycom.com/bacteria/gnr/acinetc1259.jpg)

Oksidaza test pozitivan:
Neisseria spp.
Kingella spp.
Oksidaza test negativan:
Gemella spp.
Veillonella spp.
23.4
Konana identifikacija
komercijalni testovi za biohemijsku identifikaciju
67
68
24
Identifikacija enterobakterija
24.1
Uvod
Familija Enterobacteriaceae ini veliku grupu razliitih mikroorganizama.

Opisano je 32 roda sa preko 130 vrsta. Glavne osobine lanova ove familije:
Gram negativni bacili, asporogeni, fakultativni anaerobi
Fermentuju glukozu,
Redukuju nitrate do nitrita
Ne produkuju citohrom oksidazu
Svi lanovi su pokretni, osim bakterija iz rodova Klebsiella i Shigella.
Yersinia spp. su pokretne na 18-25oC, ali ne i na 37oC.
24.2
Izolacija
Endo agar/MacConkey agar - diferencijalne podloge za izolaciju
gram negativnih bakterija: aerobno, 35-37oC, 16-24h

MacConkey-sorbitol agar/endo agar sa sorbitolom - za izolaciju
Escherichia coli 0157;H7: aerobno, 35-37oC, 16-24h
SS agar selektivna podloga za Salmonella i Shigella vrste iz
uzoraka stolice: aerobno, 35-37oC, 16-24h
Selenit F bujon obogaena podloga, koristi se za izolaciju
Salmonella i nekih sojeva Sigella iz stolice i drugih uzoraka koji
sadre mijeanu floru u velikom broju: aerobno, 35-37oC, 16-24h.
Supkultivaciju treba vriti nakon 8-12h
Izolacija Yersinia enterocolitica iz uzoraka stolice:

SS agar: aerobno, 25oC, 40 - 48h.
24.3
Identifikacija

Endo agar / MacConkey agar - sadre laktozu kao izvor ugljenih hidrata,
organizmi koji fermentuju laktozu stvaraju kolonije roze do crvene boje (laktoza
69
pozitivne), dok bakterije koje ne fermentuju laktozu stvaraju bezbojne ili

transparentne kolonije (laktoza negativne).
MacConkey-sorbitol agar sorbitol negativne kolonije se pojavljuju kao
bezbojne; suspektne su na E.coli 0157:H7 i dalje ih treba testirati, veina drugih
klinikih izolata Escherichia coli stvaraju pink do crvene kolonije.
SS agar na ovoj podlozi takoe se mogu razlikovati laktoza pozitivne od
laktoza negativnih (sadri laktozu kao izvor ugljenih hidrata), a moe se
detektovati produkcija vodonik sulfida -kolonije sa crnim centrom.
Prozirne, laktoza negativne, kolonije sa crnim centrom su
suspektne na Salmonella vrste i dalje se ispituju
Sitne, prozirne, laktoza negativne kolonije suspektne su na
Shigella i Yersinia vrste.

Enterobakterije su gram negativni bacili ili kokobacili, tako da
mikroskopske osobine ne mogu da se koriste kao pouzdan kriterijum za
identifikaciju.
24.3.3 Ispitivanje biohemijskih osobina

Identifikacija enterobakterija primarno se zasniva na ispitivanju
biohemijskih osobina.
U rutinskoj dijagnostici koristi se klasini biohemijski niz za ispitivanje
biohemijskih osobina:
Kliglerov dvostruki ili trostruki eer
peptonska voda za dokazivanje indola
metil red
Voges Proskauer
Simons citrat
urea
manitol
Inkubacija: aerobno, 35-37oC, 16-24h
Prikaz biohemijskih osobina nekih rodova enterobakterija dat je u tabeli
br. 8.
Za preciznu biohemijsku identifikaciju, kada je kliniki opravdano, koriste
se komercijalni biohemijski testovi.
Izolate: Yersinia enterocolitica, Shigella spp. i vrste Salmonella koje
pripadaju grupama od F-60 i 61-67 potrebno je potvrditi komercijalnim
biohemijskim testom. Salmonella vrste koje pripadaju grupama od A-E moraju
biti seroloki potvrene, pa iz tog razloga nije neophodna biohemijska potvrda
komercijalnim testom.
70
24.3.4 Ispitivanje antigenske grae

Test aglutinacije na ploici
Za ispitivanje antigene grae koristi se test aglutinacije na ploici.
Izvoenje:
Od iste bakterijske kulture, najbolje sa neselektivnog medijuma kao
to je krvni agar, moe i sa medijuma kao to su Kliglerov dvostruki
ili trostruki eer ili MacConkey agar, pripremi se suspenzija
bakterija u fiziolokom rastvoru.
Na ploici se nanese kap seruma, zatim se doda kap suspenzije i
laganim mijeanjem prati se pojava vidljivih aglutinata.
Salmonella
Salmonella vrste imaju tri glavna antigena:
1. Somatski O antigeni
2. Flagelarni H antigeni
3. Kapsularni Vi antigen - imaju ga inkapsulirane bakterije roda
Salmonella (Salmonella typhi)
Na osnovu antigenih osobina somatskih O antigena, Salmonella vrste se
dijele u grupe od A-60 i od 61-67.
98% humanih izolata pripadaju grupama od A do G.
Prvo se vri dokazivanje somatskih antigena primjenom
polivalentnih, a zatim monovalentnih antiseruma.
Zatim se dokazuju flagelarni antigeni obje faze.
Ukoliko dolazi do aglutinacije sa Vi antiserumom, da bi se dokazali
drugi antigeni, suspenzija se zagrijava10 minuta na 100oC, da se
inaktivira kapsularni antigen. Nakon hlaenja suspenzija se retestira
sa antiserumima od A-E. Ukoliko aglutinira sa antiserumom za grupu
D moe se izvjestiti kao Salmonella typhi.
Minimum seroloke potvrde za svaku laboratoriju je identifikacija
somatskog antigena monovalentnim serumom, odnosno odreivanje grupe za
tipove Salmonella koje pripadaju grupama od A-E. Vrste koje pripadaju
grupama od F-60 i 61-67, treba potvrditi biohemijski komercijalnim testom i
izvriti testiranje polivalentnim antiserumom. Izolati se mogu poslati u
referentnu laboratoriju na dalju serotipizaciju.
Obzirom da je S.enteritidis, na naim prostorima, najei uzronik
infekcija izazvanih bakterijama iz roda Salmonella, vano je da svaka
laboratorija, osim seruma za dokazivanje somatskog O antigena, ima antiserume
za dokazivanje flagelarnog H antigena za ovu vrstu.
71
Ukoliko su izolati suspektni na jedan od sledea tri serotipa Salmonella

typhi, Salmonella cholerasuis ili Salmonella paratyphi, zbog klinikog i
epidemiolokog znaaja, moraju biti biohemijski identifikovani i seroloki
potvreni.
Shigella
Na osnovu O antigena Shigella vrste pripadaju jednoj od etiri serogrupe:
A,B,C i D.
Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii i Shigella sonnei
odgovaraju ovim serogrupama. Postoji nekoliko serotipova unutar svake
serogrupe, izuzev grupe D koja sadri samo jedan serotip.
testom aglutinacije na ploici sa polivalentnim O antiserumima
utvruje se serogrupa
Zatim se monovalentnim serumima odreuje serotip unutar grupe.
Minimum seroloke potvrde je odreivanje serogrupe, osim kad je u
pitanju Shigella dysenteriae tip 1, kada se mora odrediti serotip.
Prema preporukama svjetske zdravstvene organizacije prvo se testira sa
monovalentnim A1 antiserumom, zatim polivalentnim B antiserumom i na kraju
polivalentnim D antiserumom. Serogrupa C, Shigella boydii je vrlo rijetka i
prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji i CDC (Centar za kontrolu i
prevenciju bolesti u Atlanti, engl. Centers for Disease Control and Prevetion)
nije rentabilno izvoditi rutinsko testiranje.
Ukoliko je aglutinacija neuspjena, suspenzija bakterija se zagrijava da bi
se uklonio kapsularni antigen koji moe biti prisutan, a zatim se test aglutinacije
ponavlja.
Escherichia coli O157:H7
Sorbitol negativne kolonije sa sorbitol-MacConkey agara se subkultiviu,
za serotipizaciju sa Escherichia coli O157:H7 antiserumom.
Yersinia enterocolitica
Yersinia enterocolitica podijeljena u est biogrupa: 1A, 1B, 2, 3, 4 i 5.
Vrste biogrupe 1A nisu udruene sa humanim bolestima. Identifikovano je 34
serotipa.
Biohemijski potvrene izolate treba slati u referentnu laboratoriju za
seroloku identifikaciju.
72
25
Identifikacija gram negativnih

nefermentujuih bacila
25.1
Uvod
Nefermentujui gram negativni bacili imaju sve vei kliniki znaaj zbog
poveanja broja imunokompromitovanih pacijenata.
Faktori rizika za infekciju ovim mikroorganizmima su: imunosupresija
(diabetes mellitus, cancer, transplantacija organa, hormonalni poremeaji),
traume, opekotine, vjetaki implantati.
Ovo je veoma heterogena grupa bacila, jedina zajednika osobina je
nereaktivnost na Kligler-ovom eeru /trostrukom eeru.
25.2
Izolacija
Krvni agar - neselektivna podloga: aerobno, 35-37oC, 16-24h
Endo agar/ MacConkey agar - selektivne podloge: aerobno, 35-37oC,
16-24h
25.3
Identifikacija (shema br.2)
Za identifikaciju nefermentujuih bacila koriste se sljedee osobine:

Nereaktivnost na Kligler-ovom eeru /trostrukom eeru
Preparat sa kulture - gram negativni bacili, kokobacili
Oksidaza reakcija
Za preciznu biohemijsku identifikaciju koriste se komercijalni biohemijski
testovi.
25.4
Komentar
Definitivna identifikacija nefermentujuih bacila zahtijeva vrijeme i

novac, a esto i ne odgovara dijagnozi bolesti. Odluka da se identifikuje
organizam do vrste, zavisi od materijala iz koga je izolovan:
a) da li je izolovan iz materijala koji je primarno sterilan,
b) ili iz primarno nesterilnog materijala, zajedno sa tri ili etiri bakterije.
73
Prvi sluaj zahtijeva identifikaciju i izradu antibiograma. U drugom

sluaju dovoljna je identifikacija na osnovu gore pomenutih osobina.
Nereaktivnost na
Kligler-ovom
eeru
Gram negativni
bacili
Oksidaza test pozitivan
Pseudomonas
species
Gram negativne
koke i kokobacili
Oksidaza test negativan
Uraditi komercijalni
biohemijski test
Oksidaza test
negativan
Acinetobacter
species
SHEMA 2. Identifikacija nefermentujuih bakterija
74
26
Identifikacija Haemophlius spp. i

HACEK grupe organizama
26.1
Uvod
HACEK grupa obuhvata vrste:
26.2
Haemophilus spp.
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Cardiobacterium hominis
Eikenella corrodens
Kingella spp.
Izolacija
selektivni okoladni agar za Haemophilus: u uslovima sa 510 %
CO2, 3537C, 1648h
krvni agar sa stafilokoknom crtom: u uslovima sa 510 % CO2, 35
26.3
37C, 1648h
Haemophilus ducreyi selektivni agar - u atmosferi 5 10 % CO2, 33
34C, 5 dana
Identifikacija

Haemophilus species su male, okrugle, konveksne kolonije koje se
presijavaju. Rastu poslije 24h inkubacije na okoladnom agaru. Satelitizam
Haemophilus influenzae se moe vidjeti na krvnom agaru oko kolonija
Staphylococcus aureus-a.

Haemophilus species su mali kokobacili ili dui tapii, Gram negativni,
razliitih duina, naznaenog pleomorfizma, ponekad sa filamentima (slika
br.9).
75
SLIKA 9. Haemophilus spp. u hemokulturi bojenje po Gram-u

(Izvor: http://wwwstud.uni-leipzig.de/~mai03kbz/bioinfprak/einfuerung.htm)
Drugi HACEK organizmi su sferine, ovalne ili tapiaste Gram

negativne elije sa izraenim pleomorfizmom, mogu stvarati filamente (slika
br.10).
SLIKA 10. Kingella kingae preparat sa kulture-bojenje po Gram-u

(Izvor: www.nature.com/.../v20/n9/fig_tab/6702119f2.html)
76
26.4
Konana identifikacija (ako je kliniki indikovano)

Komercijalni testovi za biohemijsko ispitivanje.
26.5
Izvjetavanje
izvjestiti o svim pozitivnim kulturama iz normalno sterilnih uzoraka
izvjestiti o prethodnoj ili potvrdnoj dijagnozi Haemophilus spp. ili
drugih lanova HACEK grupe organizama kod:
meningitisa ili modanog apscesa
facijalnog celulitisa ili septinog artritisa
epiglotitisa, pneumonije, mastoiditisa ili empiema toraksa
septikemije ili endokarditisa
pelvinog apscesa
suspektnog ankroida
26.6
Komentar
26.6.1 HACEK grupa organizama

Za razlikovanje HACEK grupe organizama od kliniki brojnih,
morfoloki slinih, aerobnih ili fakultativno anaerobnih Gram negativnih tapia,
uglavnom udruenih sa endokarditisom i infekcijama normalno sterilnih
materijala, potreban je sistematski pristup. HACEK grupa mikroorganizama su
komensali orofaringealnog/respiratornog trakta. Identifikacija je udruena sa
klinikim detaljima i izolati se dalje identifikuju, ako je kliniki indikovano.
Izolati kliniki znaajnih HACEK organizama se alju referentnoj laboratoriji.
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Ovo je Gram negativan kokobacil ili kratak tapi, 0,3-0,5 x 0,5-1,5 m,
moe pokazivati nepravilno bojenje. Povremeno se jave dui oblici (do 6 m). U
preparatu bakterije su pojedinane, u parovima ili rjee u lancima. Mogu
produkovati manje koliine sluzi. Ne zahtijevaju X i V faktor rasta. Poslije 24 h
inkubacije, kolonije na krvnom ili okoladnom agaru su manje od 0,5mm, rastu
do 1mm poslije nekoliko dana inkubacije. Mogu biti vrste, adherentne,
zvjezdaste, ponekad neravne povrine, urasle, teko se skidaju sa povrine agara.
Ako produkuju ekstacelularnu sluz, kolonije su ljepljive u primoizolatu. Povrne
kulture su slabo vitalne i mogu uginuti za 5-7 dana. Najbolje rastu u
mikroaerofilnim uslovima sa CO2 i fakultativno su anaerobne. Optimalna
temperatura rasta je 37C. Nepokretan je, ne produkuje ureazu.
77
Genus Cardiobacterium sadri samo jednu vrstu. elije su pleomorfne ili
pravi tapii (1-3 m duine), zaobljenih krajeva, a mogu imati i duge filamente.
U preparatu, bakterije su u parovima, kratkim lancima ili rozetama. Gram
negativne su, ali djelovi bakterijske elije mogu biti Gram pozitivni. Rast na
krvnom agaru je slab. Ne zahtijevaju V i X faktore rasta. Stvaraju vrlo male
kolonije, osim pri inkubaciji u vlanoj aerobnoj ili anaerobnoj atmosferi sa 5%
CO2. Poslije dvodnevne inkubacije kolonije su prenika 1 mm, glatke,
opalescentne i mogu prijanjati za agar. C.hominis je fakultativni anaerob, ali CO2
moe biti potreban nekim sojevima za primoizolaciju. Optimalna temperatura
rasta je 30-37 C. Nepokretan je, oksidaza pozitivan, ureaza i katalaza negativan.
Eikenella corrodens
Genus Eikenella sadri samo jednu vrstu. elije su pravi, nerazgranati,
nesporogeni, tanki, Gram negativni tapii 0,3-0,4 x 1,5-4 m duine. Kolonije
su vrlo sitne poslije jednodnevne inkubacije, ili su nevidljive i poslije nekoliko
dana. Kolonije imaju vlaan, ist centar. Mogu urastati u podlogu, a uta
obojenost se vidi kod starijih kultura zbog gustine bakterijskih elija. U istom
izolatu se mogu vidjeti razliite kolonije. Nehemolitine su, mada se nekad oko
kolonije moe pojaviti svijetlo zelena zona. Za aerobni rast je obino potreban
hemin, a rijetki sojevi ostaju X zavisni poslije subkultivisanja. Optimalna
temperatura rasta je 35 37 C. Nepokretna je, ali na nekim podlogama moe
biti pokretna. Sojevi su fakultativno anaerobni, oksidaza pozitivni, katalaza
negativni, ureaza negativni. Mogu se zamijeniti za Bacteroides ureolyticus, ali je
on obligatni anaerob i ureaza pozitivan.
Kingella spp.
Genus Kingella ima dvije vrste: Kingella kingae i Kingella denitrificans.
Kingella indologenes je u novom genusu identifikovana kao Sutonella
indologenes.
Kingella su pravi tapii, 10 m duine, zaobljenih ili etvrtastih krajeva.
Javljaju se u parovima ili kratkim lancima. Ne stvaraju endospore, Gram
negativni su, sa tendencijom opiranja odbojavanju.
Na krvnom agaru se javljaju dva tipa kolonija: ire, neravne i konveksne,
glatke.
Ne trai V i X faktor rasta. Rastu aerobno ili fakultativno anaerobno.
Optimalna temperatura rasta je 30 37C. Sojevi su nepokretni, oksidaza
pozitivni, katalaza negativni, ureaza negativni. Glukozu i druge ugljene hidrate
fermentuju uz produkciju kisjeline, ali ne i gasa.
78
Izgled kolonija HACEK organizama zavisi od vrste i podloge (tabela

br.9).
TABELA 9. Izgled kolonija HACEK organizama
HACEK grupa organizama
Karakteristike rasta na krvnom agaru poslije aerobne inkubacije

na 35-37C, 16-48h
Actinomyces
actinomycetemcomitans
Ne rastu u vazduhu, ali rastu uz CO2 . Male kolonije za 24h,

1mm poslije 48h. vrste adherentne, zvjezdaste kolonije
neravne povrine, mogu urastati u agar. Nehemolitine su.
Neki sojevi ne rastu uz CO2. Kolonije glatke, konveksne, sjajne,

1-2mm za 48h, blago hemolitine.
Eikenella corrodens
Kolonije vrlo male, vlane, jasan centar okruen zaravnjenjem,

mogu urastati; irenje je rijetko, vrlo malo oko kolonije.
Nehemolitine. Veliina kolonija 0.5-1mm poslije 48h,
zahtijeva 5-10 CO2.
Kingella kingae
Dva tipa kolonija: ire, neravne i glatke, konveksne. Mala zona

hemolize, sojevi su esto sa kapsulom, produkuju sluzave
kolonije. Ne zahtijava 5-10 % CO2.
Kingella denitrificans
Nehemolitine, dva tipa kolonija: ire, neravne i glatke,

konveksne.
27
Identifikacija Bordetella spp.
27.1
Uzorkovanje
79
Kad su simptomi najizraeniji, ako je mogue prije antibiotske

terapije
Uzimanje uzorka nazofaringealnog sekreta kod pacijenata sa velikim
27.2
kaljem moe izazvati napad kalja i opstrukciju vazdunih puteva,

zato mora biti dostupna oprema za reanimaciju. Osoba koja uzima
uzorak mora izbjei direktan kontakt sa pacijentom dok kalje.
Savitljiv dakronski bris se ubacuje kroz nozdrvu po podu nosne
duplje do nazofarinksa. Preporuuje se da se bris zadri na zadnjem
nazofarinksu 30-tak sekundi dok se pacijent nakalje. U praksi,
pacijent ovo tolerie samo nekoliko sekundi.
Nazofarigealni eksudat se uzima sukcionim kateterom, ubaenim kroz
nos. Eksudat se sakuplja u sterilnu plastinu posudu u kojoj se
transportuje do laboratorije
Perinazalni bris - nije dokazano koji nain uzimanja uzorka je
najbolji.
Transportovanje
Uzorak se transportuje i obrauje to je prije mogue
Podloga se moe inokulisati pored kreveta pacijenta
Bris se moe transportovati u transportnoj podlozi na bazi drvenog
uglja
27.3
Izolacija
Komercijalna podloga za Bordetella spp. ili krvni agar sa drvenim
ugljem i cefaleksinom - aerobno, 35-37C, 7 dana (oitavanje 4. i 7

dan) u vlanoj komori
(Podloga treba da je deblje razlivena)
Perinazalni i nazofaringealni bris: inokulisati brisom agar plou
Nazofaringealni aspirat: sterilnom ezom odabrati reprezentativni dio
uzorka i inokulisati punu ezu na agar plou.
80
27.4
Identifikacija

Kolonije sitne (oko 1,5 mm), glatke, sjajne, jako konveksne, srebrenaste
(kao kapi ive)

Sitni Gram - kokobacili i bacili (Slika br.8)
SLIKA 8. Bordetella pertussis preparat sa kulture bojen po Gram-u

(Izvor: http://microblog.me.uk/20)
27.5
Konana identifikacija (u referentnoj laboratoriji)

Seroloka identifikacija (ili DIF)
27.6
Izvjetavanje
Bordetella pertussis nije izolovana
Bordetella pertussis je izolovana
28
Identifikacija Campylobacter spp.
28.1
Izolacija
81
Selektivna podloga za kampilobakter: mikroaerofilni uslovi, 42C,
28.2
40-48 h.
Ako se na 1 plou zasijavaju 4 uzorka stolice, prethodno vrelom ezom
napraviti ljebove koji e plou podijeliti na 4 dijela.
Identifikacija

Slivene, sjajne kolonije, prozirne ili lagano bjeliasto-sive. Ivice nisu
jasne i stapaju se sa podlogom.
28.3
Konana identifikacija

Preparat bojen karbol fuksinom
Tipian mikroskopski izgled -galeb u letu ili slovo S (slika br.11).
Atipian mikroskopski izgled: kokoidni oblici.
28.3.2 Ispitivanje biohemijskih osobina

Katalaza pozitivan; oksidaza pozitivan
SLIKA 11. Tipian mikroskopski izgled Campylobacter spp. -galeb u letu ili slovoS
Izvor: http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch023.htm
82
29
Identifikacija Corynebacterium
diphteriae, Corynebacterium ulcerans,
Corynebacterium pseudotuberculosis
29.1
Uzorkovanje
29.1.1 Uzorci za ispitivanje

bris koe
bris grla i nosa
bris nazofarinksa
ako su prisutne membrane sa ivice membrane
29.1.2 Nain uzorkovanja

poto se radi o kontagioznom i ozbiljnom oboljenju koje zahtijeva
hospitalizaciju, uzorci se uzimaju u bolnikim uslovima
inflamiranih
povrina
u
tonzilofaringealnoj
regiji,
nazofaringealnoj regiji i nosu-uzeti energinim rotacionim pokretima
Ne skidati pseudomembrane!-opasnost od krvarenja
propisno obiljeiti uzorak i naglasiti da se radi o sumnji na difterijuvano zbog posebnih procedura u izolaciji i identifikaciji koje se
rutinski ne rade
bris
29.2
Transportovanje
uzorke transportovati odmah ili deponovati u transportni medijum
pri transportu obiljeiti prema vaeim propisima
29.3
Izolacija
Za obradu uzoraka izolaciju i identifikaciju obavezno koristiti komoru za

bezbjedan rad nivoa zatite II.
Bris koe:
83
Krvni agar: u uslovima sa 5 10 % CO2, 35-37C, 40-48 h

Cistein telurit krvni agar (Hoyles teluritni agar): aerobno, 35-37C,
16-18 h
Bris grla, nosa i nazofarinksa:
Krvni agar: anaerobno, 35-37C, 16-24 h
Cistin telurit krvni agar (Hoyle's teluritni agar): aerobno, 35-37C,
16-18 h
29.4
Identifikacija

Corynebacterium diphteriae
Hoyles teluritni agar: neprozirne sivo/crne kolonije
var. gravis: mat povrine, trone, suve, kidaju se u manje segmente kad se
uzimaju ezom, radijalno su izbrazdane, nepravilnih ivica (na krvnom agaru:
nehemolitine)
var. mitis: glatke, sjajne povrine, jasno oiviene (na krvnom agaru: mala
zona hemolize)
var. intermedius: sjajne, diskretno prozirne (na krvnom agaru: mala zona
hemolize)
var. belfanti: glatke, sjajne povrine (na krvnom agaru: mala zona
hemolize)
Corynebacterium ulcerans
Hoyle's teluritni agar: neprozirne sivo/crne kolonije, veoma suve (na
krvnom agaru: mala zona hemolize)
Corynebacterium pseudotuberculosis
Hoyle's teluritni agar: neprozirne sivo/crne kolonije, veoma suve (na
krvnom agaru: hemoliza)

Bojenje po Gramu: Gram + pleomorfni bacili, bez kapsule (slika br.12)
Specijalno bojenje po Neisser-u: u tijelu bacila tamno prebojene granulemetahromatske ili volutinske granule (energetski depoi sastavljeni od
neorganskih polifosfata)
84
SLIKA 12. Corynebacterium spp. tipian raspored razbacanih tapia ibice - u

preparatu sa kulture bojenom po Gram-u
Izvor: www.emlab.com/s/sampling/env-report-05-2007.html
29.4.3 Biohemijsko ispitivanje

Komercijalnim testovima za ispitivanje biohemijskih osobina
29.4.4 Dokazivanje toksigenosti soja

Modifikovani Elekov test za in vitro ispitivanje toksigenosti izolovanog
soja (slika br.13)
2 ml sterilnog seruma kunia i 1 ml 0.03% kalijum telurita dodati u
10 ml agara za ispitivanje virulencije (KL virulence agar Difco)
zagrijanog na 55C u vodenom kupatilu
Razliti u petri olju i rotirati 20 puta da se dobro izmjea
Prije nego se podloga stvrdne staviti sterilan filter papir dimenzija
1x8 cm natopljen difterinim antitoksinom (razblaen da sadri 100
jedinica antitoksina u ml seruma) po dijametru ploe. Papir treba da
potone na dno to treba pomoi sterilnom pincetom, ako je potrebno
Ostaviti podlogu da se stvrdne, pa je sa poluotvorenim poklopcem
smjestiti u termostat da ispari viak vlage sa povrine
Inokulisati podlogu unutar 2 h poslije suenja povlaei pod pravim
uglom u odnosu na filter papir paralelne linije 24-asovne kulture
poznatog toksinog soja, negativnog soja i ispitivanog soja.
Inkubirati 24-48 h na 35C
Traiti na ploi bijele precipitacione linije koje se pod uglom od 45
pruaju od linija zasijavanja prema filter papiru.
Rezultat:
prisustvo precipitacionih linija = toksigeni soj
odsustvo precipitacionih linija = netoksigeni soj
85
SLIKA 13. Elekov test za in vitro ispitivanje toksigenosti izolovanog soja
Sve sumnjive sojeve ili dokazane patogene sojeve odmah slati u

referentnu laboratoriju na kosom krvnom agaru radi ispitivanja
toksinosti (London).
86
30
Identifikacija anaerobnih bakterija
30.1
Uzorkovanje
Sadraj apscesa dobijen punkcijom sterilnom iglom i pricem,
potujui principe aseptinog rada. Upotreba brisa je loija alternativa
zbog izloenosti bakterija suenju i toksinom dejstvu kiseonika.
Napomena: obrada ovih uzoraka ima prioritet u odnosu na druge uzorke
30.2
Transportovanje
to je prije mogue, maksimalno do 20 minuta (najdue za pola sata).
Ako je brz transport nemogu, koristiti transportne podloge za
anaerobe.
30.3
Izolacija

Preparat bojen po Gram-u prikazuje tip i relativan broj
mikroorganizama i elija domaina. Takoe moe sugerisati upotrebu
odgovarajuih podloga i pomoi kliniaru u odreivanju terapije prije
zavrene kultivacije.
30.3.2 Kultivacija
Podloga za anaerobe sa 5 g diskom metronidazola - u anaerobnoj
atmosferi, 35 - 37 C, 48 h
Sve procedure zavriti za to krae vrijeme.

Preporuuje se uporedo aerobna kultivacija - krvni agar - aerobno,
35-37C, 18-24 h
30.4
Identifikacija
30.5
87
Na osnovu morfolokih osobina bakterijske elije (preparat sa

kulture bojen po Gram-u), izgleda kolonije, osjetljivosti na prisustvo
kiseonika (izostanak rasta na krvnom agaru u aerobnim uslovima),
pigmentacije, fluorescencije itd.
Krajnja identifikacija se vri ispitivanjem biohemijske aktivnosti
upotrebom komercijalnih testova
Minimalan nivo - naene anaerobne bakterije
Komentar
Anaerobne infekcije su najee mijeane infekcije, tj. uz anaerobne

bakterije kao uzronici se javljaju fakultativno anaerobne i aerobne bakterije.
Najee izolovane anaerobne bakterije iz humanih uzoraka su: Bacteroides
fragilis,
Prevotella
melaninogenica,
Fusobacterium,
Actinomyces,
Propionibacterium,
Bifidobacterium,
Clostridium,
Peptostreptococcus,
Veillonella.
Od znaaja su i kliniki znaci koji ukazuju na moguu anaerobnu
infekciju: prisustvo gnoja neprijatnog mirisa, gas u tkivu (krepitacije), lokacija
infekcije u blizini povrine sluzokoa, prisustvo sulfatnih granula itd.
88
31
Ispitivanje osjetljivosti bakterija

na antimikrobne supstance disk
difuzionionim metodom
31.1
Opte napomene
Antibiotici se uvaju prema uputstvu proizvoaa (u friideru, na
sobnoj temperaturi itd.)

Medijum: Zavisno od vrsta mikoorganizma za koji treba uraditi
antibiogram koriste se razliiti medijumi(podloge)
Mueller-Hinton agar (MHA) je standardizovana podloga (SZO) za
izvoenje antibiograma.
Za bakterije koje su izbirljive u nutritivnim potrebama dodaje se 4-6%
defibrinisane ovije, govee ili konjske krvi (tabela br. 10)
TABELA 10. Podloge za ispitivanje osjetljivosti razliitih sojeva bakterija na
antimikrobne supstance
Mikroorganizam
Medijum (podloga)
Enterobacteriaceae
MHA
Pseudomonas spp.
MHA
Staphylococci
MHA
Staphylococci (meticillin/oxacillin test)
Columbia agar sa 2 % NaCl
Enterococci
MHA
MHA + 5% defibrinisane krvi
Beta hemolitiki streptokoki
Haemophilus spp.
MHA + 5% defibrinisane krvi + 20 mg/l NAD
31.2
Priprema podloge
Autoklavirati podlogu i rashladiti je na 45- 50 C (vodeno kupatilo)
Razliti podlogu u Petri olje( 25ml podloge u Petri olju prenika
90mm ili oko 50 ml podloge u Petri olju prenika 160mm)
89
Debljina podloge mora da bude 4 mm

Podloga razlivena uz plamenik pod aseptinim uslovima i ohlaena
31.3
na sobnoj temperaturi uva se u friideru (2-8C) sa poklopcem

okrenutim nadolje
Prije upotrebe podloga mora stajati bar pola sata na sobnoj
temperaturi
Ako se na povrini podloge nalaze kapi kondenzovane vode,
neophodno je prije upotrebe podlogu prosuiti u termostatu tako da
povrina podloge bude okrenuta nadolje i naslonjena na otvoreni
poklopac
Pripremljena podloga se moe iskoristiti najdue za 7 dana
Inokulum
Priprema se razblaivanjem 18- 24 asovne iste bakterijske kulture
Ezom se pikira 4-5 kolonija i prenese u 5 ml fiziolokog rastvora
Gustina suspenzije se podeava poreenjem sa McFarland
31.4
standardom 0,5 za turbiditet

Inokulum se zasijava brisom, ezom ili staklenim tapiem
ravnomjerno na povrinu podloge
Poslije zasijavanja inokuluma poeljno je da podloga stoji 10-15
minuta na sobnoj temperaturi da bi se povrina osuila.
Postavljanje tableta ili diskova

Izvodi se dispenzerom ili sterilnom pincetom
Razmak izmeu diskova je najmanje 3 cm, a rastojanje od ivice suda
najmanje 1cm
Na plou prenika 10 cm nanosi se maksimalno 6 diskova, a na plou

prenika 12 cm maksimalno 8 diskova.
31.5
Izbor tableta ili diskova
Prema CLSI (Institut za klinike i laboratorijske standarde u Vejnu, SAD,

Clinical and Laboratory Standards Institute, engl.) antibiotici su podijeljeni u
grupe od A do I:
grupa A Antibiotici koji se rutinski primarno ispituju i izvjetavaju
grupa B Antibiotici koji su kliniki znaajni i mogu da se primarno
ispituju, ali se selektivno izvjetavaju npr. kad je soj rezistentan na
antibiotike iz grupe A, kod posebnih situacija npr. cefalosporini 3.
90
generacije za enterobakterije izolovane iz likvora ili kotrimoksazol za

izolate iz urina
grupa C - alternativni antibiotici (za sojeve rezistentne na vie
primarnih antibiotika)
grupa U - Antibiotici za izolate iz urina
grupa O - Ostali antibiotici
grupa I - Antibiotici u fazi istraivanja
Izbor antibiotika zavisi od brojnih faktora meu kojima su najbitniji

izolovani soj i vrsta materijala iz kojeg je izvrena izolacija.
31.5.1 Staphylococcus aureus

Izbor antibiotika
Grupa A: Oxacillin, Penicillin
Grupa B: Erytromycin, Clindamycin, Trimethoprim/sulphametoxasol,
Vancomycin, Fusidinska kiselina
Grupa C: Chloramphenicol, Ciprofloxacin (Ofloxacin), Gentamycin,
Rifampicin, Tetracyclin
Grupa U: Penicillin, Oxacillin, Norfloxacin, Nitrofurantoin,
Trimethoprim/ sulfametoxasol
Rezistencija na Ciprofloxacin se stie brzo u toku terapije, za 2-3 dana, pa
je obavezno ponovno testiranje.
Najnovije preporuke su da se umjesto diska Oxacillina koristi disk
Cefoxitima!
Ako je zona inhibicije rasta oko diska Cefoxitima 19mm izvjetava se
kao Oxacillin rezistentan (R).
Ako je zona inhibicije rasta oko diska Cefoxitima >19mm izvjetava se
kao Oxacillin osjetljiv (S).
Osjetljivost stafilokoka na beta-laktamske antibiotike se testira
Penicilinom i Oksacilinom ili Meticilinom.
Penicilin tablete za testiranje osjetljivosti na sve beta- laktamaza labilne
peniciline: Ampicillin, Amoxicillin, Azlocylin, Mezlocylin, Karbenicylin,
Piperacillin i Tikarcillin.
Oxacillin/ Meticillin tablete za testiranje osjetljivosti na beta-laktamaza
stabilne peniciline.
Tumaenje rezultata
Oxacillin S / Penicillin S Stafilokok je istovremeno osjetljiv i na druge
peniciline, beta laktamaza inhibitorne kombinacije, cefalosporine i karbapeneme
91
Oxacillin S / Penicillin R Stafilokok je rezistentan na beta- laktamaza

labilne peniciline (Ampicillin, Amoxicillin, Azlocylin, Mezlocylin,
Karbenicylin, Piperacillin, Tikarcillin), a osjetljiv na beta- laktamaza stabilne
peniciline, beta- laktamaza inhibitorne kombinacije, odgovarajue cefalosporine
(Cefahlor, Cefalexin) i Karbapeneme.
Oxacillin R Stafilokok je rezistentan na sve beta- laktamske antibiotike,
kao i karbapeneme.
Za Staphylococcus aureus koji pokazuje umjerenu osjetljivost na
Oxacillin treba uraditi oksacilin test na slanom agaru:
Podloga: MHA sa 4% NaCl i 6 g/ ml oksacilina ili 10 g/ ml meticilina
Inokulum: Suspenzija ispitivanih kolonija gustine 0,5 Mc Farland
Inkubacija: aerobno, 35-37 C, 24 h
Rezultat: Porast vie od jedne kolonije ukazuje na rezistenciju soja na
Oxacillin.
Izvjetavanje
Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupa A, B i C, a rezultate
izvjetavati u zavisnosti od vrste uzorka.
31.5.2 Streptococcus spp.

Izbor antibiotika
Grupa A:
Grupa B:
Grupa C:
Grupa U:
Penicillin ili Ampicillin, Erytromycin

Vancomycin, Chloramphenicol, Clindamycin
Cefotaxim( Ceftriaxon), Ofloxacin
Ampicillin, Ofloxacin( Ciprofloxacin), Norfloxacin,
Nitrofurantoin
Beta- hemolitiki streptokoki (BHS )

Streptococcus pyogenes se NE mora testirati na Penicillin jer u uslovima
in vitro jo nisu otkriveni rezistentni sojevi.
Streptococcus agalactiae moe biti umjereno osjetljiv (I) na Penicillin.
Tumaenje nalaza
BHS koji je S na Penicillin moe se smatrati S i na: Ampicillin,
Amoxicillin/ klavulanska kiselina, Cefahlor, Cefotaxim, Ceftibuten (samo za S.
pyogenes), Ceftriaxon, Cefuroxim, Cefpodoxim, Imipenem, Meropenem (ne
mora se testirati na ove antibiotike).
92
BHS koji je S na Erytromycin moe se smatrati S i na: Azitromycin,

Claritromycin i Diritromycin (ne mora se testirati na ove antibiotike).
Izvjetavanje
Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupa A i B, a po potrebi
(zavisno od vrste uzorka) i za antibiotike iz drugih grupa.
31.5.3 Streptococcus pneumoniae

Izbor antibiotika
Grupa A: Penicillin (Oxacillinom), Erytromycin,
Trimethoprim/sulphametoxasol
Grupa B: Ofloxacin (Ciprofloxacin), Tetracyclin, Vancomycin
Grupa C: Chloramphenicol, Rifampicin
Osjetljivost na Penicillin se radi iskljuivo Oxacillinom!
Tumaenje nalaza
Ako je S. pneumoniae S na Oxacillin znai da je S i na Penicillin.
Sojevi S.pneumoniae koji su S na Penicillin smatraju se S i na:
Ampicillin, Amoxicillin, Ampicillin + sulbactam, Amoxicillin/klavulanska
kiselina, Ceftriaxon, Cefahlor, Cefotaxim, Cefpodoxim, Imipenem i
Meropenem, pa se osjetljivost na ove antibiotike ne ispituje, jer pouzdani disk
difuzioni testovi za sada ne postoje.
Ako je soj R na Oxacillin ne smije se proglasiti R ili I na Penicillin samo
na osnovu oksacilin testa. Obavezno se radi MIK za Penicillin dilucionom
metodom ili E- testom
Ako se ne moe uraditi MIK treba u komentaru antibiograma naznaiti
da soj ima smanjenu osjetljivost na Penicillin, a da se za terapiju moe
preporuiti Ceftriaxon (izuzev za izolate iz krvi i likvora).
Za sojeve S. pneumoniae izolovane iz krvi i likvora osjetljivost na
Penicillin, Ceftriaxon, Cefotaxim i Meropenem treba utvrditi odreivanjem
MIK- ova bez prethodnog testiranja sa Oxacillinom. Za ove sojeve treba
istovremeno ispitati i osjetljivost na Vancomycin disk- difuzionim metodom ili
odreivanjem MIK- a
Ako je soj S na Erytromycin moe se smatrati S i na: Azitromycin,
Claritromycin i Diritromycin.
Izvjetavanje
93
Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupe A, a po potrebi

(zavisno od vrste uzorka) i za antibiotike iz grupa B i C.
31.5.4 Enterococcus spp.

Izbor antibiotika
Grupa A:
Grupa B:
Grupa C:
Grupa U:
Penicillin ili Ampicillin

Vancomycin
Gentamycin (120 g), Streptomycin (300 g)
Ampicillin, Ciprofloxacin (Ofloxacin), Norfloxacin,
Nitrofurantoin, Tatracyclin
Za umjereno osjetljive sojeve na aminoglikozide (zona inhibicije rasta 79 mm) treba uraditi agar dilucioni metod.
Za Vancomycin rezistentne sojeve treba testirati: Chloramphenicol,
Erytromycin, Tetracyclin, Rifampicin. U testovima in vitro sojevi enterokoka
mogu biti osjetljivi na cefalosporine, aminoglikozide (uobiajena doza),
klindamicin i kotrimoksazol, ali ovi antibiotici su kliniki neefikasni pa ih ne
treba uvrtavati u antibiogram.
Tumaenje nalaza
Sojevi enterokoka koji ne produkuju beta- laktamaze- ako su S na
Ampicillin- S su na sve peniciline, kao i na Amoxicillin/ klavulanska kiselina,
Ampicillin + sulbactam, Piperacillin + tazobactam
Rezistencija enterokoka na Ampicillin koja je uslovljena produkcijom
beta-laktamaza ne moe se pouzdano utvrditi rutinskim disk-difuzionim ili
dilucionim metodom. Preporuuje se nitrocefinski test za izolate iz krvi i
likvora!
Ako je nitrocefinski test pozitivan izolat je rezistentan na Penicillin,
kao i na acil amino, karboksi i ureidopeniciline.
Kad se testira osjetljivost enterokoka na Vancomycin, inkubacija mora biti
puna 24 sata, a oitavanje pod kosim uglom. Prisustvo bilo kakvog rasta ili
zamagljenja unutar zone inhibicije rasta ukazuje na rezistenciju!
Za sojeve sa umjerenom rezistencijom na Vancomycin treba uraditi MIK.
Za njih treba uraditi i Vankomicin test:
Podloga: MHA sa 6g vankomicina/ml
Inokulum: zasijava se 1-10 g suspenzije gustine 0,5 Mc Farland
Inkubacija: na 35-37C, 24 h
Rezultat: Pojava vie od jedne kolonije ukazuje na rezistenciju na
Vancomycin
Tetracyclin je predstavnik svih tetraciklina, pa se rezultati osjetljivosti
odnose i na Doksicyclin i Minocyclin
Rezultate osjetljivosti na velike doze aminoglikozida (Gentamycin,
Streptomycin) izvjetavati kao komentar kliniaru da e se kombinovanom
94
terapijom (npr. ampicilin sa gentamicinom) postii oekivani baktericidni

efekat!
Izvjetavanje
Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupa A, B i C, a izvjetavati
zavisno od vrste uzorka.
31.5.5 Enterobakterije
Izbor antibiotika
Grupa A: Ampicillin, Cephalexin, Gentamycin
Grupa B: Amoxicillin/klavulanska kiselina, Cefotaxim(Ceftriaxon),
Amikacin, Ciprofloxacin, Imipenem(Meropenem),
Piperacillin, Trimethoprim/sulphametoxasol
Grupa C: Aztreonam,Ceftazidim, Chloramphenicol, Netilmycin,
Tetracyclin
Grupa U: Ampicillin, Cephalexin, Ceftriaxon (Cefotaxim), Gentamycin,
Ciprofloxacin (Ofloxacin), Nitrofurantoin, Norfloxacin,
Trimethoprim/sulphametoxasol, Pipemidinska kiselina
Tumaenje nalaza
Za Salmonella spp. i Shigella spp. rutinski treba testirati samo osjetljivost

na Ampicillin, Trimethoprim/sulphametoxasol i hinolone. Za ekstraintestinalne
izolate treba ukljuiti Chloramphenicol i cefalosporine 3. generacije
Ako je soj S na Ampicillin S je i na Amoxicillin
Salmonele i igele mogu pokazivati in vitro dobru osjetljivost prema
cefalosporinima 1. i 2. generacije i aminoglikozidima, ali bez odgovarajueg
terapijskog efekta, pa ih ne bi trebalo smatrati osjetljivim.
Enterobacter spp., Citrobacter spp. i Serratia spp. mogu razviti
rezistenciju u toku terapije cefalosporinima 3. generacije. Osjetljivi izolati mogu
postati rezistentni u roku 3- 4 dana, pa je opravdano vriti ponovno ispitivanje
osjetljivosti soja izolovanog sa istog mjesta infekcije!
Izvjetavanje
u zavisnosti od vrste uzorka.
Detekcija ESBL posebni Protokol !
95
31.5.6 Haemophilus spp.

Izbor antibiotika
Grupa A: Ampicillin, Trimethoprim/sulphametoxasol
Grupa B: Cefotaxim( Ceftriaxon, Ceftazidim), Chloramphenicol,
Meropenem
Grupa C: Azitromycin, Aztreonam, Cefahlor, Imipenem, Ciprofloxacin
(Ofloxacin), Rifampicin, Tetracyclin
Podloga izbora je HTM (haemophilus test medium). Moe se koristiti i
MHA sa dodatkom 3-5% hemolizirane konjske krvi (okoladni agar), ali su
rezultati testiranja pouzdani samo za Ampicillin, Chloramphenicol, Amoxicillin/
klavulanska kiselina i Ampicillin + sulbactam.
Ne stavljati vie od 4 diska na jednu plou!!!
Za sojeve Haemophilus-a iz krvi i likvora, kao i u toku drugih tekih
infekcija, u antibiogram se ukljuuju samo Ampicillin, jedan cefalosporin 3.
generacije, Chloramphenicol i Meropenem.
Za empirijsku terapiju infekcija respiratornog trakta izazvanih
Haemophilus influenzae mogu se koristiti Amoxicillin/ klavulanska kiselina,
Azitromycin, Clarytromycin, Cefahlor, Cefpodoxim i Cefuroxim (sve oralni
antibiotici) ne moraju se rutinski testirati.
Tumaenje nalaza
Ako je soj S na Ampicillin istovremeno je S i na Amoxicillin.
Veina sojeva R na Ampicillin i Amoxicillin su produktori betalaktamaza. Nitrocefinski test moe odrediti osjetljivost na Ampicillin i
Amoxicillin.
Izvjetavanje
31.5.7 Neisseria gonorrhoeae

Izbor antibiotika
Penicillin, Tetracyclin, Ciprofloxacin

Osjetljivost N. gonorrhoeae ispituje se samo kad za to postoje klinike
indikacije (alergija na Penicillin, neodgovarajui kliniki odgovor).
Za sojeve rezistentne na Penicillin testiranje se vri i na: Ceftriaxon i
Cefoxitin.
96
Koristi se podloga za ispitivanje osjetljivosti gonokoka na antibiotike u

uslovima sa 5-10% CO2 na 35C, 24 sata.
Alternativna podloga je okoladni MHA ali se moe koristiti samo za
Penicillin, Tetracyclin i Cefoxitim.
Tumaenje rezultata
Kod svih sojeva N. gonorrhoeae prvo treba uraditi beta-laktamaza test
(Nitrocefinski test).
Ako je nitrocefinski test pozitivan soj je rezistentan na Penicillin,
Ampicillin i Amoxicillin (PPNG sojevi).
U disk - difuzionom testu ovi sojevi imaju zonu inhibicije rasta oko diska
Penicillina 19 mm.
Sojevi sa zonom inhibicije rasta 19 mm oko diska Tetracyclina su
potencijalno TRNG sojevi i za njih treba odrediti MIK dilucionom metodom.
31.5.8 Neisseria meningitidiis

N. meningitidis se ne testira disk- difuzionom metodom na: Penicillin,
Ampicillin i Rifampicin obavezno treba uraditi MIK- ove E - testom
Moe se uraditi oksacilin disk difuzioni test sa diskom Oxacillina na
KMHA.
Sojevi N. meningitidis sa zonom inhibicije rasta < 10 mm su potencijalno
rezistentni na Penicillin i Ampicillin! Ovi sojevi imaju zonu inhibicije rasta
26 mm oko diska Penicillina
Disk difuzioni test se moe uraditi i na okoladnom MHA.
31.5.9 Pseudomonas spp. i Acionetobacter spp.

Izbor antibiotika
grupa A: Ceftazidim, Gentamycin, Piperacilin,
grupa B: Amikacin, Aztreonam, Ciprofloxacin, Imipenem (Meropenem)
grupa C: Cefotaxim (Ceftriaxon), Chloramphenicol,
Trimethoprim/sulphametoxasol
grupa U: Piperacilin, Cefotaxim (Ceftriaxon), Imipenem (Meropenem),
Ceftazidim, Gentamycin, Amikacin, Ciprofloxacin
Pseudomonas aeruginosa moe brzo da razvije rezistenciju na sve
antibiotike (unutar 3- 4 dana od zapoete terapije), pa je zbog toga preporuljivo
retestirati isti soj.
Izvjetavanje
97

31.6
Inkubacija
Zasijane podloge sa postavljenim diskovima antibiotika se inkubiraju 18

24 h na odgovarajuoj temperaturi (uglavnom 35-37C) u aerobnim,
mikroaerofilnim ili anaerobnim uslovima, zavisno od vrste bakterija koje se
ispituju (tabela br.11). Ploe su okrenute poklopcem na gore.
TABELA 11. Uslovi i vrijeme inkubacije za pojedine vrste bakterija
MIKROORGANIZAM
INKUBACIJA
Enterobacteriaceae
18 - 20 sati, na 35- 37C
Pseudomonas species
18 - 20 sati, na 35- 37C
Staphylococci
18 - 20 sati, na 35- 37C
Staphylococci (meticillin/oxacillin test)
24 sata, na 30C
Haemolytic streptococci
18 20 sati, na 35- 37C
Enterococci
24 sata, na 35- 37C
1820 sati, na 3537C, u uslovima sa 510 % CO2
1820 sati, na 3537C, u uslovima sa 5-10 %CO2
1820 sati, na 35-37C, u uslovima sa 510 % CO2
1820 sati, na 3537C, u uslovima sa 510 % CO2
31.7
itanje rezultata
Mjeraem sa milimetarskom podjelom se mjeri prenik zone
inhibicije rasta za pojedine antibiotike
Na osnovu njihove vrijednosti se vri procjena stepena osjetljivosti

ispitivanog bakterijskog soja na pojedine antibiotike
Procjena se vri u skladu sa kriterijumima koje postavlja proizvoa

tableta i diskova, tako to se prema izmjerenim vrijednostima
prenika zone inhibicije rasta ispitivana bakterija svrstava u jednu od
tri kategorije:
S (sensitive) osjetljiva - Infekcija izazvana osjetljivim sojem
lijei se uobiajenim (optimalnim) terapijskim dozama
I (intermediate) umjereno osjetljiva - Infekcija izazvana
umjereno osjetljivim sojem lijei se viim terapijskim dozama
antibiotika
R (resistant) otporna - Infekcija izazvana rezistentnim sojem
ne moe se lijeiti ispitivanim antibioticima.
98
32
Identifikacija -laktamaza
proirenog spektra
32.1
Opte napomene
Beta-laktamaze proirenog spektra (eng. extended spectrum
32.2
lactamases ESBL) najznaajniji su uzrok rezistencije na

cefalosporine 2. i 3. generacije.
Proizvodnju ESBL kodiraju geni plazmida tako da je irenje meu
sojevima iste ali i razliitih vrsta jednostavno.
Da bi otkrili produkciju ESBL koristimo screening testove i potvrdne
testove.
Testiraju se sojevi Klebsiella spp., Escherichia coli i Proteus spp.
Ukoliko su izolati: Acinetobacter species, Pseudomonas aeruginosa i
Stenothrophomonas maltophilia ESBL testove ne treba raditi. U ovih
bakterija produkcija ESBL je mogu, ali rijedak uzrok rezistencije
tako da se u rutinskom radu testiranje ne preporuuje. Osim toga,
metode za screening i potvrdne testove za ove izolate jo nisu
odreene.
Produkcija ESBL je esto udruena sa rezistencijom na antibiotike
koji ne pripadaju -laktamskim antibioticima.
Bakterije sa ESBL produkcijom je teko otkriti ako su u pitanju sojevi
sa inducibilnim AmpC hromozomalnim enzimima.
Screening test
Zasniva se na standardnoj metodi izrade antibiograma disk
difuzionom metodom uz korienje odreenih cefalosporina kao

indikatora mogue produkcije ESBL (tabela br.12).
Pri izboru indikator cefalosporina treba voditi rauna o tome da je
ceftazidim indikator za TEM i SHV tipove, cefotaxim za CTX-M, a
cefpodoxim za sve tipove, tako da se kao indikator cefalosporini
mogu koristiti ili ceftazidim i cefotaksim ili samo cefpodoxim.
99
Za Enterobacteriaceae izolovane iz uzoraka vanbolnikih pacijenata
preporuuje se upotreba cefpodoxima u screening testovima.

Osjetljivost ispitivanog bakterijskog soja se procjenjuje nakon
mjerenja prenika zone inhibicije rasta u skladu sa kriterijumima koji
su standardizovani.
TABELA 12. Kriterijumi za oitavanje prenika zone inhibicije rasta u cilju

otkrivanja ESBL
Sadraj diska
Cefotaxim, 30g
Ceftazidim,30g
Escherichia coli &
Klebsiella
Ceftazidim,30g,
ostale vrste
Cefpodoxim,10g
Zone inhibicije rasta (mm)
MIC (mg/L)
R,
S,
R, >
S,
29
30
21
22
27
28
19
20
Screening test se smatra pozitivnim ukoliko je naena rezistencija na

cefotaxim/ceftazidim ili na cefpodoxim.
Ukoliko je screening test pozitivan treba uraditi potvrdne testove.

Automatizovani sistemi (npr. Phoenix i Vitek) ugrauju testove za
otkrivanje ESBL
preporukama.
32.3
predstavljaju
alternativna
rjeenja
datim
Potvrdni testovi
Zasnivaju se na dokazivanju sinergije cefalosporin/klavulanat.
Cilj im je iskljuivanje drugih mehanizama rezistencije.
Koriste se sledei testovi:
1. kombinovani disk test,
2. E-test,
3. dvostruki disk test.
32.3.1 Kombinovani disk test

Zasniva se na uporeivanju zona inhibicije rasta oko diska koji sadri
samo cefalosporin i diska koji sadri isti cefalosporin+klavulanat.
100
Na produkciju proirenog spektra -laktamaza ukazuje poveanje

prenika zone inhibicije rasta za 5 mm ili 50% u prisustvu
klavulanata.
32.3.2 E-test
Koriste se trake impregnirane sa jedne strane cefalosporinom, a sa
druge strane cefalosporin/klavulanat kombinacijom u opadajuem

gradijentu koncentracija.
Oitavanje se vri pomou skale odtampane na traci.
Mjesto presjecanja granine linije zone inhibicije rasta i trake
oznaava MIC.
Test se zasniva na uporeivanju MIC samog cefalosporina i MIC
kombinacije cefalosporin/klavulanat.
Ukoliko je razlika u MIC vrednostima 8 radi se o ESBL.
Testovi su komercijalno dostupni.
Precizni su, ali i skuplji od kombinovanih disk testova.
32.3.3 Dvostruki disk test

Zasnovan je na standardnoj metodi izrade antibiograma. Nakon
32.4
zasejavanja uz diskove koji su oznaeni kao indikator cefalosporini

postavlja se i co-amoksiklav disk.
Co-amoksiklav disk (20+10) se postavlja centralno, a sa lijeve i sa
desne strane, na udaljenosti od 25-30mm se postavljaju diskovi
cefotaxima i ceftazidima (odnosno cefpodoxima).
Slijedi inkubacija 18-20 h, u aerobnim uslovima, 35-37C i
oitavanje.
Proirenje zone inhibicije rasta oko cefalosporina uz zonu inhibicije
rasta oko co-amoksiklava ukazuje na bakterije proirenog spektra laktamaza (ESBL).
Test je jeftin i jednostavan, ali su optimalna rastojanja izmeu
diskova razliita za razliite sojeve, pa se zbog toga njegova
primjena ne preporuuje.
Kontrola testova koji se koriste za otkrivanje ESBL

Kao pozitivne kontrole mogu se koristiti: Escherichia coli ( NCTC13353, NCTC-13351 i NCTC-13352) i Klebsiella pneumoniae
(ATCCC-13392).
101
Kao negativne kontrole mogu se koristiti Escherichia coli NCTC
32.5
10418 ili ATCC-25922.

Zone inhibicije rasta u negativnim kontrolama moraju biti iste ili
varirati 2mm.
Tumaenje nalaza
Ukoliko dokaemo ESBL produkciju u nalazu naglaavamo da je
izolovani soj rezistentan na sve peniciline (izuzev temocillina), sve

cefalosporine (izuzev cefoksitima) i aztreonam bez prethodne izrade
antibiograma koji ukljuuju navedene antibiotike.
Karbapenemi (imipenem, meropenem, ertapenem) su aktivni protiv
bakterija sa ESBL ukoliko ne postoje neki drugi uzroci rezistencije.
102
33
DODATAK: Nain pripremanja hranljivih

podloga koje ne postoje u prakastom
obliku kao gotove za pripremanje podloga
Obogaeni okoladni agar

Sipati 5 gr hemoglobina u prahu u bocu od 500 ml sa perlama.
Dodati 250 ml destilate (prvo malo da se razbije hemoglobin, a zatim
se dodaje do 250 ml).
Kuvati na plameniku uz esto mukanje, pa presuti u drugu
Erlermajerovu bocu bez perlica.

U drugu Erlermajerovu bocu izmjeriti 18 gr GC medium baze (ili
19,5 gr Thayer Martin baza) i 250 ml vode, i to homogenizovati.
To se sve sterilie 15 minuta na 121C u autoklavu (autoklaviraju se
odvojeno hemoglobin i baza, pa se po autoklaviranju sjedine).
Kad se podloga rashladi na 50C dodaje se 5ml poliviteksa (1 ml
poliviteksa na 100 ml podloge), homogenizuje se i nakon toga se
razliva u Petrijeve ploe.
Selektivni okoladni agar za Haemophilus spp.

Sipati 5 gr hemoglobina u prahu u Erlermajerovu bocu od 500 ml sa
perlama.
Dodati 250 ml destilate (prvo malo, da se razbije hemoglobin, zatim
dodati do 250 ml).
kuvati na plameniku uz esto mukanje, a zatim presuti u drugu
Erlermajerovu bocu bez perlica.
Podlogu sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C i nakon toga je
ohladiti na 50C.
U tako ohlaenu podlogu dodati bacitracin (2 ml bacitracina na 500
ml podloge) i 5 ml dodatka sa X i V faktorima rasta (1ml ovog
dodatka na 100 ml podloge).
U drugu Erlermajerovu bocu izmjeriti 18 gr GC medum baze i 250ml
vode, i to homogenozovati.
Sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C.
Kad se podloga ohladi na 50C, pomijeati sadraj iz obje boce.
Tako pripremljenu podlogu razliti u Petrijeve ploe.
103
VCN okoladni agar

Otopiti 18 gr GC AGAR BASE u 250 ml destilovane vode i sterilisati
u autoklavu 15 minuta na 121 C.

U drugu tikvicu (sa perlama) sipati 5 gr hemoglobina u prahu i dodati
250 ml vode (prvo malo, da se razbije hemoglobin, zatim dodati
ostatak do 250 ml).
Kuvati na plameniku uz esto mijeanje i presuti u drugu
Erlermajerovu bocu bez perli. Sterilisati u autoklavu 15 minuta
na121C.
Autoklaviran i ohlaen na 50C sadraj iz obje tikvice se sjedini i
doda se 5 ml dodatka sa X i V faktorima rasta i 5 ml VCN dodatka (1
ml na 100 ml podloge).
Tako pripremljena podloga se razliva u Petrijeve ploe.
Podloga za anaerobe
Otopiti 10,4 gr BRAINT HEART INFUSION AGAR u 200 ml
destilovane vode.
Sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C.

Kad se autoklavira i ohladi na 50C dodati 0,2 ml vitamina K, 0,5 ml
pripremljenog i sterilisanog hemoglobina i 10 ml defibrinisane ovije

krvi.
Selektivna podloga za Campylobacter spp.

Otopiti 10 gr podloge COLUMBIA AGAR u 250 ml destilovane vode
i sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C.

Kad se ohladi na 50C dodati 5-10% (15 ml) defibrinisane ovije krvi
i 2,5 ml dodatka sa mjeavinom antibiotika za Campylobacter
podlogu (jedna flaica se rastvara sa 2 ml aqua redestilata)
Podloga za ispitivanje osjetljivosti gonokoka na antibiotike

Otopiti 7,2 gr MEDIUM BASE u 100 ml destilovane vode.Zagrijevati
na plameniku do kljuanja (da kljua oko 1 minut).
104
Sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C. Ohladiti na 50C i dodati
dodatak sa X i V faktorima rasta: 2ml na 100 ml podloge.

Lagano mijeati u jednom pravcu 3 puta i 3 puta u drugom pravcu (da
se ne stvore mjehurii). Tako pripremljenu podlogu razliti u Petrijeve
ploe (ne spaljivati ploe).
34
Literatura
1. Bradbury S.M. Collection of urine specimens in general practice-to clean or

not to clean? J R Coll Gen Pract 1988; 38: 363-365.
2. Cheesbrough M. Collection and transport of specimens. Examination of
specimens. In: Medical laboratory manual for tropical countries.
Cheesbrough M. Ed. 100-199. Butterworth-Heinemann Ltd. Cambridge,
1993.
3. Health Protection Agency. National Standard Method. http://www.hpastandardmethods.org.uk/
4. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Schreckenberger P.C., Winn W.C.
The role of the mycrobiology laboratory in the diagnosis of infectious
diseases: guidelines to practice and management. In: Diagnostic
microbiology. Winters R. Ed. 1-15. J.B.Lippincott Company, Philadelphia,
1992.
5. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Schreckenberger P.C., Winn W.C.
Guidelines for collection, transport, processing, analiysis, and reporting of
cultures from specific specimen types. In: Diagnostic microbiology. Winters
R. Ed. 61-104. J.B.Lippincott Company, Philadelphia, 1992.
6. Kunin C.M. Detection, prevention and management of urinary tract
infections: A manual for physician, nurse and allied health worker. 2nd ed.
Lea and Febriger, Philadelphia, 1974.
7. Mahon C.R., Manuselis G. Laboratory diagnosis of gastrointestinal
pathogens. In: Diagnostic microbiology. Fabion K. Ed. 965. Saunders,
Philadelphia, 2000.
8. Pelemi M.R., Lavadinovi L. Antimikrobna terapija gram negativnih
infekcija. U: Antibiotici 2001. Prostran M. Ed. 231-275. Zavod za
udbenike i nastavna sredstva, Beograd, 2001.
9. Radna Grupa za standardizaciju metodologije i interpretacije rezultata
antibiograma, Srpsko lekarsko drutvo-Mikrobioloka sekcija. Izmene i
dopune Prirunika za izradu antibiograma, Institut za imunologiju i
virusologiju Torlak, Beograd, 2001.
105
10. Shanson D.C. Blood culture technique: current controversies. J Antimicrob

Chemother 1990; 25(suppl): 17-29.
11. kerk V. Infekcije mokranog sustava-novosti u patogenezi i lijeenje.
Medicus 2003; 12(2): 197-204.
12. vabi-Vlahovi M., uki-Ivanevi S., Daki I., Mija-Vasiljevi V.,
Opavski N. Uzimanje i slanje materijala na bakterioloki pregled. U:
Praktikum iz mikrobiologije i imunologije. Jovanovi T. i sar. Eds. 16-23.
Savremena administracija, Beograd, 2000.
www.mzd.gov.me

NV Bakteriologija MNE PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

NV Bakteriologija MNE PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Crna Gora

Podgorica, 2012. godine

Laboratorijska dijagnostika u klinikoj bakteriologiji

Prof.dr Lazar Ranin,

1Ispitivanje brisa grla ............................................................................. 1

Ispitivanje sputuma .............................................................................. 6

5Ispitivanje sadraja apscesa i dubokih rana ......................................... 9

23Identifikacija Neisseria spp. i morfoloki slinih organizama ........... 65

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje brisa grla

Uzorkovanje obaviti sa pojavom prvih simptoma, prije antibiotske terapije.

to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu:

krvni agar sa razreenjem

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

serum, Hoyle's telurit agar): aerobno, 35-37C, 48-72h (svakodnevno

U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje brisa nosa

Uzima se brisom ispod i iznad donje nosne koljke. Prilikom uzimanja

to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu:

krvni agar sa razreenjem i stafilokoknom crtom.

serum, Hoyles telurit agar): aerobno, 35-37C, 48-72h (svakodnevno

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae i Moraxella

catarrhalis: izvjestiti uz napomenu da mogu imati znaaja u sklopu

U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje brisa nazofarinksa

Uzima se specijalnim ianim lako savitljivim brisom. Najbolje da

to je prije mogue (najdue dva asa). Ako je brz transport nemogu:

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

obavljanja line higijene. Pacijenta savjetovati da ispere usta mlakom

Primarnu obradu uzoraka sputuma treba vriti u komori za bezbjedan rad

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Kriterijum za trijau sputuma po Murray i Washington-u su prikazani u

Epitelne elije po vidnom polju

Leukociti po vidnom polju

Grupe od 1-4 su neprihvatljive za kultivaciju i izvjetavaju se: Uzorak je

uzronici su Haemophilus influenzae, Streptococcus

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

cistine fibroze i bronhiektazija: Pseudomonas spp.,

U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti:

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje sadraja apscesa i

Uzorci koji se mogu ispitivati su:

to je prije mogue (najdue do pola sata). Ako je brz transport nemogu:

Optimalno vrijeme za transport do laboratorije:

Bris se priprema za direktnu mikroskopiju u vidu tankog razmaza na

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

podloga za anaerobne bakterije: anaerobno, 35-37C, 48 h (moe i do

okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 48 h

U gnoju i eksudatu rane bilo koji izolovani mikroorganizam moe biti

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje brisa koe

ukoliko je prisutan sekret materijal uzeti suvim pamunim brisom

sadraj iz ulkusa moe se uzeti irigaciono-aspiracionom metodom

to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu za

Direktan mikroskopski preparat

Radi se, ako je vidljiv gnoj na brisu.

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h

Najei uzronici infekcija opekotina:

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI