Cursul 2

3. Fiziologia bacteriana
3.
3.
3.
3.
3.
3.

1.
1.
2.
3.
4.
5.

Constitutia chimica a bacteriilor

Constituia chimic a bacteriilor (b)
Metabolismul bacterian
Ci metabolice
Ci biosintetice particulare
Cultivarea bacteriilor

3. 1. Constituia chimic a bacteriilor

3. 1. 1. Apa: procent, rol
Apa reprezint peste 75-85% din greutatea umed a bacteriei. Exist ap liber
(mediu de dispersie) i ap legat fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au
puin ap, n special ap legat. Bacteriile sunt fiine acvatice prin excelen.
Vacuolele sunt formaiuni sferice care conin diferite substane n soluie apoas.
Au o membran lipoproteic numit tonoplast. Au fost descrise n special la
bacteriile acvatice i ar putea avea un rol n plutirea acestora.
Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti faptul c apa reprezint un mediu de
dispersie, este reactiv n reaciile metabolice, reprezint etapa final a unor
reacii oxidative etc.
Prin deshidratare (desicare) este posibil prezervarea culturilor bacteriene timp
ndelungat. O metod des utilizat datorit eficienei sale este liofilizarea
(criodesicarea). Studiile tiinifice au artat c, n general, germenii Gramnegativi rezist mai puin timp liofilizrii dect cei Gram-pozitivi, fenomen care a
fost pus pe seama stratului mai subire de peptidoglican. (1)
3. 1. 2. Substanele minerale
Substanele minerale reprezint 2-30% din greutatea uscat a bacteriei i variaz
n funcie de specie, vrsta culturii, compoziia chimic a mediului. Unele
elemente intr n compoziia diferitelor structuri (exemplu sulful intr n structura
aminoacizilor, fosforul n structura fosfolipidelor etc).
Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti urmtoarele:

favorizeaz schimburile cu mediul,

particip la reglarea presiunii osmotice,

pot stimula creterea i funcia bacteriei (de exemplu fierul n cazul

bacilului difteric, care condiioneaz i producerea de toxine),

activeaz unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului i a

potenialului de oxido-reducere.
Aa cum am menionat anterior, la nivel ribozomal se gsesc Mg ++ i K+.
3. 1. 3. Glucidele
n structura bacterian se pot gsi glucide simple cu rol n metabolismul
intermediar glucidic, precum i glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea
din urm au o serie de roluri, spre ex. particip la realizarea structurii peretelui
celular, fac parte din capsula unor bacterii etc.
Exist teste biochimice n care se urmrete utilizarea sau imposibilitatea
utilizrii unui anumit zahar de ctre o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru
identificarea bacteriei respective (n special n cazul enterobacteriilor folosind
mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testrile biochimice sunt de mare utilitate i
n studiul fungilor (auxanogram, zimogram).
3. 1. 4. Proteinele

Exist proteine simple (cu rol n metabolismul intermediar protidic) i proteine

complexe, cum ar fi:

mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul

hialuronic din structuri de tip capsular),

cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),

nucleoproteinele (ex. n acizii nucleici).

Este de remarcat prezena n structurile bacteriene a unui aminoacid special,
acidul diaminopimelic, precum i a aminoacizilor n forma D (ceea ce reprezint o
adaptare biochimic a bacteriilor fa de aciunea nociv a enzimelor
proteolitice).
3. 1. 5. Lipidele
Reprezint mai puin de 10% din greutatea uscat a bacteriilor i variaz
cantitativ n funcie de specie, vrsta culturii (cresc n celulele mbtrnite,
reprezentnd probabil un semn de degenerescen) i compoziia mediului. La
mycobacterii, sunt n cantitate mai mare (circa 20-40%), n special la nivel
parietal i determin o serie de proprieti specifice, inclusiv afinitatea tinctorial.
Lipidele se pot gsi libere n vacuole, combinate sau fcnd parte din diferite
structuri ale celulei bacteriene (perete, membran, mezozomi).
Dintre lipidele bacteriene putem aminti:

acizii grai speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii),

cerurile (acizi grai plus alcooli monovaleni superiori), care se gsesc n

cantitate mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. n peretele
mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre acestea, ceara D pare a fi implicat n
inducerea hipersensibilitii ntrziate (de tip IV).

fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) dinTreponema

pallidum (agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura
lipopolizaharidului bacteriilor Gram-negative, cu activitate toxic.
3. 1. Constituia chimic a bacteriilor (b)
3. 1. 6. Pigmenii
Pigmentogeneza este caracteristic bacteriilor cromogene i este dependent de
condiiile de cultivare.
Producerea de pigmeni poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. n cazul
tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sau n cazul unor specii din
genulStaphylococcus). Trebuie s reinem nc de la nceput faptul c n cazul
stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ i nu vom clasifica
drept patogen o tulpin de stafilococ n funcie de culoarea coloniei.
Stafilococii sunt condiionat patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea
este testul coagulazei care ar trebui efectuat n mod obligatoriu pentru toate
tulpinile izolate de la pacieni.
Dup localizarea pigmentului, bacteriile pot fi:

cromofore (pigmentul este legat n citoplasm);

paracromofore (pigmentul este prezent n perete sau n stratul mucos, de

exemplu la S. aureus sau la Staphylococcus epidermidis);

cromopare (pigmentul este difuzibil n mediu, de exemplu laPseudomonas

aeruginosa).
n afar de faptul c datorit producerii de pigmeni (albastru, galben-verde,
maro etc. n cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb n cazul tulpinilor
deStaphylococcus) medicul de laborator se poate orienta n alegerea testelor de
identificare ntr-un anumit context clinic i microbiologic.
Putem aminti i faptul c pigmenii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de
protecie fa de radiaiile UV (pigmeni carotenoizi), rol antibiotic (exemplu
piocianina elaborat de P. aeruginosa fa de B. anthracis) i rol enzimatic.
3. 1. 7. Enzimele

n cazul bacteriilor se poate aprecia c metabolismul este foarte intens.

Capacitatea de a elabora anumite enzime este determinat genetic (exist peste
2000 de determinani genetici diferii), precum i prin mecanisme de control care
pot modifica bagajul enzimatic n funcie de necesiti.
Dup locul de aciune, enzimele bacteriene se pot mpri n:

enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele;

enzime ectocelulare (n membrana citoplasmatic, reglnd

permeabilitatea selectiv), de exemplu permeazele;

enzime intracelulare.
n raport cu reacia catalizat, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze,
oxidoreductaze, liaze, izomeraze etc.
Dup modul de apariie, enzimele pot fi:

constitutive (exist totdeauna n celul, indiferent de natura mediului);

inductibile (sunt sintetizate de ctre bacterie numai ca rspuns la anumii

compui aprui n mediu).
Studierea comportamentului enzimatic este foarte util n taxonomie. Fiecare
unitate taxonomic bacterian (gen, specie) are un spectru de activitate
enzimatic propriu; studierea acestuia poate avea o deosebit importan n
identificarea bacteriilor.
3. 1. 8. Substane cu aciune antibiotic:

plasmidul Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora

bacteriocine, cu efect asupra altor bacterii receptive nrudite (de exemplu
colicinele elaborate de E. coli);

unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de

exemplu, B. licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizeaz gramicidina,
iar B. polymyxa sintetizeaz polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astzi, din
alte genuri, vezi capitolul nr. 48).
3. 1. 9. Vitaminele bacteriene
Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi
secretat de exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care
poate fi sintetizat de E. coli, riboflavina sintetizat de B. subtilis, vitaminele B2 i
B12 sintetizate de B. megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B i K, care
pot fi sintetizate sub influena florei bacteriene intestinale umane.
3. 1. 10. Factorii de cretere
Factorii de cretere sunt metaboliii eseniali pe care bacteria nu-i poate sintetiza
pe baza substanelor care se gsesc n mediul extern. Factorii de cretere trebuie
neaprat inclui n mediul de cultur n cazul n care dorim s izolm
microorganismul respectiv, numit microorganism pretenios (ex. factorii X i V
trebuie inclui n mediul de izolare pentru Haemophilus influenzae).
Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptndu-se la viaa parazitar, devin
dependente de o serie de astfel de factori de cretere (unele sunt att de
dependente nct nu pot fi cultivate in vitro, de exemplu bacilul leprei
-Mycobacterium leprae).
3. 2. Metabolismul bacterian
3. 2. 1. Nutriia bacterian
Nutriia bacterian reprezint suma proceselor metabolice care conduc la
producerea de materiale convertibile n energie i n diferite componente
celulare. Nutrienii sunt substane ale cror soluii pot traversa membrana
citoplasmatic pentru a fi antrenai n reaciile metabolice care asigur creterea
i multiplicarea celular.
n raport cu sursa de energie, bacteriile se mpart n:

bacterii care folosesc energie luminoas i triesc la lumin

(photobacterii) i


bacterii care i procur energia prin procese de oxidoreducere catalizate
enzimatic i triesc la ntuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).
n raport cu sursele folosite ca material de sintez n ambele diviziuni se
difereniaz:

bacterii autotrofe, capabile s-i sintetizeze toi compuii organici din

materie anorganic i

bacterii heterotrofe, dependente de prezena unor compui organici.

Nutriia principalelor bacterii studiate
Majoritatea bacteriilor comensale, condiionat patogene sau patogene importante
pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se difereniaz n funcie de tipul
respirator. Exist i bacteriile paratrofe, a cror energie trebuie oferit de gazd.
Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu
microorganismele din genurile Rickettsia i Chlamydia, care depind nutriional de
o gazd vie).
Creterea microbian necesit polimerizarea unor substane mai simple pentru a
forma: proteine, acizi nucleici, polizaharide i lipide. Aceste substane se obin fie
din mediul de cultur, fie sunt sintetizate de ctre celulele n cretere (sunt
necesare diferite coenzime i legturi macroergice de tipul celor din ATP).
Substanele necesare i coenzimele implicate se pot obine dintr-un numr relativ
redus de precursori metabolici.
Dac o celul bacterian primete substanele necesare, va sintetiza diferite
macromolecule, iar secvena aranjrii componentelor n aceste macromolecule
este determinat fie dup un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADNARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidrai i
lipide.
Dup ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansambleaz, formnd
structuri supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei
macromoleculelor i activitatea cilor metabolice sunt foarte bine reglate (exist
o permanent balan a biosintezei).
Microorganismele reprezint un grup de celule vii care utilizeaz o mare
diversitate de ci metabolice; de exemplu, mai multe ci diferite pot fi utilizate
pentru asimilarea unui singur compus simplu, benzoatul, iar o singur cale
metabolic pentru benzoat poate fi reglat de mai multe sisteme de control.
Principiul determinant pentru cile metabolice este acela al organizrii unui
numr relativ mic de tipuri de reacii biochimice, ntr-o ordine specific. Multe
dintre cile biosintetice se pot deduce avnd n vedere structura chimic de la
care se pornete, produsul final i eventual unul sau doi metabolii
intermediari. Principiul determinant al reglrii metabolismului este acela c
enzimele par a fi chemate n joc numai cnd activitatea lor este necesar.
Activitatea unei enzime poate fi modificat variind fie cantitatea ei, fie cea a
substratului pe care acioneaz.
n unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuat prin cuplarea unor
efectori specifici (metabolii care moduleaz activitatea enzimatic).
De multe ori, activitatea unei enzime care catalizeaz o etap metabolic iniial
este (poate fi) inhibat de produsul final al cii respective. O astfel de inhibiie nu
poate depinde de competiia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul
substratului. Inhibiia depinde de faptul c enzimele reglatoare sunt allosterice.
Fiecare enzim are att un situs catalitic de legare cu substratul, ct i unul sau
mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori).
Legarea unui efector de situsul su duce la o modificare conformaional a
enzimei, astfel nct afinitatea situsului catalitic scade (inhibiie allosteric) sau
crete (activare allosteric).

Cnd o bacterie peritriche se mic, flagelii se asociaz i se mic mpreun,

rezultnd o deplasare liniar. La diferite intervale de timp, bacteria i schimb
direcia (flagelii se dau peste cap). Acest comportament face posibil
chemotaxia: o celul care se ndeprteaz de sursa atractantului chimic i
schimb sensul de micare mult mai frecvent n comparaie cu una care se
apropie de atractant i ca o nsumare, bacteria se va deplasa nspre atractant.
Spre exemplu, prezena unui zahar sau a unui aminoacid este sesizat de
receptori specifici localizai pe membrana celular (de multe ori acelai receptor
particip i la transportul membranar al acelei substane). Celula bacterian este
prea mic pentru a fi capabil s detecteze existena unui gradient chimic (n
spaiu), dar s-a demonstrat experimental c detecteaz gradienii n timp (de
exemplu, concentraia unei substane scade n timp ce bacteria se ndeprteaz
de surs i crete n timp ce aceasta se apropie de surs).
Anumii compui acioneaz ca respingtori (R), iar alii ca atractani (A). Un
mecanism care ar explica rspunsul celulei fa de A/R ar implica metilarea i
respectiv demetilarea unei proteine specifice din membran, care depinde de
GMPc. Atractanii produc o inhibiie tranzitorie a demetilrii acestei proteine.
Respingtorii stimuleaz demetilarea.
Mecanismul prin care o modificare n comportamentul celular se produce ca
rspuns la o modificare de mediu poart numele de transducie senzorial.
Aceasta pare s fie responsabil de:

chemotaxie;

aerotaxie (deplasarea ctre concentraia optim de O 2);

fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe ctre lumin);

deplasarea spre acceptorul de electroni etc.

3. 2. 2. Respiraia bacterian
Respiraia reprezint suma reaciilor biochimice aerobe sau anaerobe
productoare de energie. Mecanismul de baz este reprezentat de oxidoreducerea biologic (pierderea ionilor de hidrogen sau a electronilor) de ctre o
substan chimic (donor) i transportul lor pe molecula unei alte substane
numit acceptor (prima se oxideaz, a doua se reduce: AH 2 + B <=> A + BH2).n
funcie de natura acceptorului final, respiraia poate fi: aerob sau anaerob.
Respiraia aerob (oxibiotic)
n respiraia aerob, acceptorul final de electroni este reprezentat de
oxigen.Respiraia aerob necesit existena membranei celulare. Electronii sunt
pasai de la un reductor la un oxidant prin membran cu ajutorul unui set
specific de transportori. Substratul reductor frecvent utilizat este NADPH-ul.
Enzimele catenei respiratorii sunt:
- nicotinice (cu coenzima NAD i NADP);
- flavinice (cu gruparea proteic FMN sau FAD);
- ferice (grupul prostetic conine Fe sub form de derivai ai protohemului, spre
exemplu citocromi, citocromoxidaz, peroxidaz etc).
NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN
(flavin mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid).
Pentru sinteza ATP-ului se utilizeaz fosforilarea oxidativ (la nivel de catalizator)
cuplat cu partea terminal a lanului respirator.
Respiraia anaerob (anoxibiotic)
n respiraia anaerob acceptorul final de electroni este reprezentat de orice
substan anorganic diferit de oxigen sau de orice substan organic
(fermentaia); fosforilarea se face la nivelul substratului.
Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezult prin
fermentaia zaharidelor i reprezint un caracter fiziologic stabil, foarte important
din punct de vedere taxonomic i biochimic. Etapele fermentaiei sunt mai

reduse, ctigul energetic fiind mai mic. De exemplu n cazul genuluiClostridium,

prin fermentaie acetic se obine 1 mol ATP, iar prin fermentaie butiric se obin
0,5 moli ATP. Fermentaia butiric a fost descoperit de Louis Pasteur n anul
1861 (produs de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Rolul
biologic al fermentaiei este reprezentat de producerea energiei i nu de
obinerea unor produi finali.
Sinteza ATP-ului
Sinteza ATP-ului se realizeaz prin cuplarea reaciilor de oxidoreducere cu
reaciile de fosforilare.
n respiraia aerob se utilizeaz mai ales fosforilarea oxidativ (la nivel de
catalizator) cuplat cu partea terminal a lanului respirator.
n respiraia anaerob fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii i
acceptorii fiind metabolii anorganici (dar nu O 2) sau organici (fermentaia).
Energetica respiraiei bacteriene
Prin fosforilarea oxidativ se pot obine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoz.
Prin fosforilarea substratului se pot obine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de
glucoz.
Energia este folosit apoi n procese metabolice de asimilaie.
Tipul respirator
n raport cu utilizarea proceselor pentru obinerea energiei i de relaia cu
oxigenul din mediu, bacteriile se pot grupa n 4 tipuri respiratorii principale
(vezi i Tabelul nr. 1):
- strict aerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se
dezvolt numai n prezena unei presiuni crescute a O 2, care este folosit ca
acceptor final unic. Aceste bacterii posed catalaz, peroxidaz, citocromi (de
exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula bacterian; vezi Figura nr. 1) i
utilizeaz numai procese de respiraie. Unele specii aerobe
(exempluPseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta n medii lipsite de oxigen,
dac n mediu sunt prezeni nitratul sau nitritul;
- strict anaerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Clostridium
tetani,Clostridium botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc)
cresc numai n absena O2. Nu pot supravieui n prezena O2, care nefiind redus
are o aciune bactericid. Nu au catalaz, peroxidaz (care acioneaz asupra
ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc pentru obinerea energiei
numai procese de fermentaie. Pentru cultivarea lor este necesar utilizarea unui
mediu cu potenial redox foarte sczut.
- aerob facultativ anaerob, atunci cnd bacteriile (E. coli, S. aureus, S.
pyogenes etc) se dezvolt mai bine n mediile cu oxigen, prin procese de
respiraie, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, n funcie de potenialul
redox. Majoritatea au catalaz sau citocromoxidaz, dar nu au peroxidaze
flavoproteice. n acest tip se ncadreaz majoritatea bacteriilor studiate.
- anaerob microaerofil, atunci cnd bacteriile (de exemplu Campylobacter)
tolereaz mici cantiti de O2.
3. 3. Ci metabolice
Metabolismul glucidic
Polizaharidele utilizabile de ctre bacterii nu pot ptrunde ca atare n celul. Ele
sunt degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care
scindeaz unitile monozaharidice din extremitile lanurilor polizaharidice) i
endohidrolaze (care hidrolizeaz unitile interne). Polizaharidele existente n
celul ca materiale de rezerv au o degradare diferit, prin fosforoliz, rezultnd
hexozo-monofosfai.
Principalele ci metabolice (de catabolism) sunt:

a). calea hexozo-difosfailor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care n final pentru 1

mol de glucoz se obin 1 mol de acid piruvic i 2 moli ATP;
b). calea pentozo-monofosfailor;
c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas).
Metabolismul lipidic
Multe bacterii degradeaz trigliceridele prin lipaze exocelulare n glicerol i acizi
grai liberi. Activitatea lipazic poate fi cercetat pe medii care conin gliceroltributirat. Pentru degradarea lipidelor unele bacterii, de exempluClostridium
perfrigens, posed enzime specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea
fosfolipidelor din membrana hematiilor, fosfolipaza C confer bacteriilor
proprietatea de hemoliz.
Acizii grai sunt degradai preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii grai
reprezint surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic genereaz 129
moli de ATP).
Bacteriile saprofite au proprieti lipolitice intense, participnd la biodegradarea
grsimilor i uleiurilor (mai ales n mediul marin).
Metabolismul proteic
n lumea bacterian mai rspndii sunt D-aminoacizii. Acetia pot forma diferite
polipeptide cu activitate antibiotic (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de
exemplu capsula bacilului anthraxului. Particip de asemenea i la formarea
peretelui celular (de exemplu D-Ala).
Cile de degradare sunt reprezentate mai ales de:
a). transaminarea i dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au
ci proprii de catabolism, utile n identificare);
b). decarboxilarea aminoacizilor.
3. 4. Ci biosintetice particulare
3. 4. 1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat etc. se
realizeaz utiliznd inclusiv structuri chimice care n lumea vie sunt utilizate
numai de ctre bacterii, de exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic.
3. 4. 2. Sinteza peptidoglicanului
Sinteza peptidoglicanului se desfoar pe parcursul mai multor etape (vezi
Figura nr. 3). ncepe prin sinteza n citoplasm a UDP-acid N-acetil muramicpentapeptid (NAM). Aceast structur se ataeaz de bactoprenol (un lipid din
membrana celular), dup care urmeaz un lan de reacii biochimice. Legarea
ncruciat final se realizeaz printr-o reacie de transpeptidare n care
terminaiile amino libere ale pentaglicinei nlocuiesc reziduurile terminale ale DAla de la peptidul nvecinat. Reacia este catalizat de transpeptidaze, un set de
enzime numite i PBPs (penicillin binding proteins) care au att activitate de
transpeptidaze i carboxipeptidaze, dar controleaz i gradul de legare a
peptidoglicanului (aspect foarte important n diviziunea celular). La nivelul lor se
pot lega penicilinele i alte medicamente beta-lactamice (Figura nr. 4).
Aceast cale de biosintez are o importan particular n medicin, oferind i
baza aciunii selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracin,
vancomicin, cicloserin etc). Spre deosebire de celulele gazdei,
microorganismele nu sunt izotone cu fluidele organismului. n interiorul lor
presiunea osmotic este foarte mare i viabilitatea lor depinde de integritatea
peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice compus care
inhib o etap n biosinteza peptidoglicanului la o bacterie n cretere va putea
produce liza bacterian (efect bactericid).
3. 4. 3. Sinteza LPZ
Sinteza este asemntoare cu cea a peptidoglicanului; n ambele situaii, o serie
de subuniti se asambleaz pe un lipid transportor la nivelul membranei i apoi
sunt transferate n fabrica polimerului n cretere pentru realizarea peretelui

celular. Toate componentele LPZ sunt sintetizate i ansamblate la nivelul

membranei citoplasmatice.
3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare
Capsula se sintetizeaz enzimatic din subuniti activate. n sinteza capsulei
extracelulare (poate avea structur polizaharidic sau peptidic) nu sunt
implicate lipide transportoare de provenien membranar. Prezena capsulei
este adesea determinat de condiiile de mediu. De exemplu, dextranii se pot
sintetiza pornind de la sucroz i acest lucru se va realiza doar dac exist
sucroz n mediu.
3. 4. 5. Sinteza substanelor de rezerv
Cnd nutrienii sunt n exces, bacteria poate converti o parte din ei n granule de
rezerv (vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutin, care difer
de la o bacterie la alta.
3. 5. Cultivarea bacteriilor
3. 5. 1. Definiii utile
Populaia reprezint o multitudine de indivizi ai unei specii care convieuiesc
ntr-un anumit biotop.
Clona este populaia care rezult dintr-o singur celul prin nmulire vegetativ
(diviziune binar).
Tulpina reprezint populaia microbian alctuit din descendenii unei singure
izolri n cultur pur.
Temperatura de dezvoltare
n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:
- mezofile, cu temperatura optim de 30-37C;
- psichrofile, cu temperatura optim n jur de 20C (unele acceptnd temperaturi
apropiate de 0C; Listeria spp. poate supravieui sau se poate chiar i multiplica
la temperatura din frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numrul mare
de acizi grai nesaturai coninui de membrana plasmatic. Gradul de nesaturare
al unui acid gras se coreleaz cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziie
termic (temperatura la care se topete sau se solidific lipidul). Acizii grai
nesaturai rmn n faz lichid la temperaturi joase, dar sunt denaturai la
temperaturi moderate. Fie c acizii grai din membran se afl n faz lichid sau
solid, ei afecteaz fluiditatea membranei, care afecteaz n mod direct
capacitatea de a funciona.
- termofile, cu temperatura optim de 50-60C (unele putnd s se multiplice i la
temperaturi apropiate de 95C, ca de ex. Thermus aquaticus). Bacteriile termofile
sunt adaptate s reziste la temperaturi de peste 60C printr-o varietate de
modaliti. Acizii grai din membrana bacteriilor termofile sunt acizi grai
saturai, permind membranelor s rmn stabile i funcionale la temperaturi
ridicate.
- extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optim de 80C sau mai
mare i o temperatur de dezvoltare maxim de 115C. (2) Nu sunt patogene.
Bacteriile studiate de microbiologia medical sunt n marea lor
majoritatemezofile.
3. 5. 2. Noiuni de cretere i multiplicare bacterian
Creterea oricrui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece
creterea volumului celular raportat la creterea suprafeei este mai mare, n
cursul creterii se ajunge la un punct critic. Multiplicarea celular este o
consecin a creterii. Se restabilete raportul optim dintre volumul i suprafaa
celulei.
Multiplicarea majoritii bacteriilor se face prin diviziune simpl (binar). Sporii nu
reprezint forme de multiplicare (aa cum se ntmpl n cazul fungilor sau
paraziilor).

3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor
Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii, trebuie ca din produsul
recoltat de la pacient s obinem mai nti respectivul microorganism n cultur
pur, pentru ca ulterior s i putem studia diferitele caractere n vederea
identificrii.
Metodele de cultivare a bacteriilor urmresc mai multe obiective:

obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ pentru

investigaiile propuse,

prevenirea contaminrii produsului cercetat cu un microorganism strin i

izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs

plurimicrobian n culturi monomicrobiene denumite culturi pure.
Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrei bacterii. Termenul
nsmnare definete operaia de introducere a unei cantitai de germeni
ntr-un mediu de cultur artificial, n timp ce pentru culturile celulare, ou
embrionate i mai ales animale de experien folosim termenul inoculare.
Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea bacteriilor pe medii de cultur. Mediile
solide sau lichide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare
creterii i multiplicrii bacteriene se numesc medii de cultur.
Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur
poart numele de cultur bacterian.
Mediile de cultur
Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii i pe medii artificiale.
Exist anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care
nu pot fi cultivate dect pe gazde vii, aa cum se ntmpl n cazul virusurilor,
respectiv: animale de laborator, ou de gin embrionate sau culturi de celule.
Majoritatea bacteriilor, fungii i unele protozoare se pot cultiva i pe medii
artificiale.
Mediile de cultur artificiale trebuie s fie nutritive (s conin factorii de cretere
necesari), s fie sterile, s aib un anumit pH (de obicei ntre 7,2-7,6), s aib o
anumit presiune osmotic, s aib umiditatea favorabil multiplicrii germenilor
etc.
Factorii de cretere reprezint substane eseniale pe care microorganismele nu
sunt capabile s le sintetizeze din nutrienii de care pot s dispun. Ei sunt
necesari n cantitai mici. ndeplinesc anumite roluri n biosintez. Factorii de
cretere pot fi grupai n:
1.
Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN i ARN);
2.
Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor;
3.
Vitamine: necesare n calitate de coenzime i grupri funcionale pentru
enzime.
Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesit factori de cretere. Aceste bacterii
pot sintetiza purinele eseniale, pirimidinele, aminoacizii i vitaminele pornind de
la o surs de carbon.
Alte bacterii necesit purine, pirimidine, vitamine i anumii aminoacizi pentru a
crete. Aceti compui trebuie adugai n prealabil n mediile de cultur.
Factorii de cretere nu sunt metabolizai direct ci sunt asimilai de ctre bacterii
pentru a-i ndeplini rolul n metabolism. Tulpinile mutante care necesit anumii
factori de cretere ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt
numite auxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E. coli care necesit triptofan
pentru dezvortare se va numi auxotrof-triptofan i va fi desemnat E. coli trp- (2).
Clasificarea mediilor de cultur artificiale
Aceste medii se pot clasifica dup starea de agregare, dup natura
ingredientelor, dup complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale),
dup scopul urmrit (de transport, de izolare, de identificare etc.), dup
coninutul n ap, etc. Exist medii de cultur simple (agar, ap peptonat, bulion

simplu etc) i medii de cultur mai complexe (agar-snge, bulion glucozat, agar
Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2)
Medii speciale
Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltrii unei
anumite bacterii (de exemplu mediul Lffler, cu ser coagulat de bou, pentru
bacilul difteric) (Figura nr. 5).
Prin coninutul su n substane antimicrobiene, mediul selectiv inhib
dezvoltarea altor bacterii dect cea a crei izolare se urmrete. De exemplu,
mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii n care
includem antibiotice (fa de care bacteria care se dorete a fi izolat este
rezistent) (Figura nr. 6)
Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii patogene,
inhibnd dezvoltarea florei de asociaie dintr-un produs patologic. Funcioneaz
concomitent ca mediu selectiv i ca mediu electiv (de exemplu, mediul
hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de mbogire utilizate pentru
izolarea Salmonella typhi).
Mediul diferenial conine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care
poate fi sau nu metabolizat, determinnd modificarea culorii sau aspectului
culturii. De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care
difereniaz bacteriile lactoz-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoznegative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat
lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree). (Figurile nr. 7-10).
Colonia izolat
Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii. Colonia este
totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O
colonie este o clon bacterian.
Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin
dispersie (cu ansa bacteriologic sau cu tamponul). Dup prelevarea cu ansa a
unei poriuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor
poligon; se resterilizeaz ansa; se verific temperatura, prin atingerea mediului
ntr-o zon nensmnat, ct mai periferic; cu ansa steril se traseaz a doua
latur a poligonului; se resterizeaz ansa i se repet procedeul descris pn la
realizarea a 4-5 laturi, fr a atinge prima latur. n acest mod, pe ultimele
laturi ale poligonului se vor putea observa dup trecerea timpului necesar
multiplicrii bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1)
Incubarea const n meninerea mediilor de cultur nsmnate, n condiiile
necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvolt
i duc la apariia unei culturi n circa 18-24 de ore de incubare la temperatura
optim de dezvoltare (asigurat n termostat) pentru c timpul de generaie este
de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaie de 1227 ore i n acest caz cultura devine pozitiv n 2-8 sptmni. Pentru bacteriile
strict anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz (ex. n medii la care s-au
adugat ingrediente cu activitate reductoare sau n anaerostat); dorim s
subliniem c dac transportul nu se face n condiii de anaerobioz, nu vom mai
obine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate (Figura nr. 11).
Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi
Culturile bacteriene sunt discontinue cnd se realizeaz n volum limitat de
mediu, care nu este rennoit i continue atunci cnd mediul de cultur este
continuu rennoit. O populaie bacterian poate fi meninut indefinit n faza de
multiplicare exponenial dac se adaug continuu mediu de cultur proaspt, cu
omogenizare prin curent de aer steril i evacuare a unei cantiti
corespunztoare de cultur (de exemplu n dispozitivul numit chemostat sau
turbidostat).

Chemostatul utilizeaz un mediu de cultur n care unul dintre nutrieni, aflat n

concentraie mai redus dect ceilali, funcioneaz ca factor limitant al creterii.
Mediul de cultur proaspt este admis n vasul de cultur n ritmul n care este
consumat factorul limitant, iar cultura este evacuat cu acelai ritm. Cultura este
meninut astfel la o valoare constant i submaximal ratei de cretere, reglat
prin factorul limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obinerea de tulpini
mutante pentru c dup ce rata de multiplicare a fost determinat ansa de
selectare a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12).
n laboratorul de microbiologie clinic, de regul se utilizeaz culturile
discontinue.
Timpul de generaie
Populaia care rezult prin diviziunea unei bacterii crete n progresie geometric
cu raia 2. Timpul necesar pentru dublarea populaiei se numete timp de dublare
sau timp de generaie. Timpul de generaie n faza exponenial i n condiii
optime de cultivare este determinat genetic. De exemplu, pentru E. coli este de
circa 20 minute (ca i pentru majoritatea bacteriilor studiate).
Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaie poate avea o valoare
ntre 12-27 ore.
Fazele dezvoltrii unei culturi bacteriene
Teoretic, dinamica unei populaii bacteriene ar trebui s evolueze exponenial.
Dinamica real a populaiei bacteriene n cultur discontinu are ns o evoluie
caracterizat printr-o curb la care distingem patru faze: faza de lag; faza de
multiplicare logaritmic; faza staionar i faza de declin (Figura nr. 13).
Faza de lag
Numrul bacteriilor nsmnate rmne staionar sau scade; germenii se
adapteaz la condiiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, i
consum pn la dispariie incluziile, cresc mult n dimensiuni, sintetizeaz
enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la
antibiotice. Faza de lag dureaz aproximativ 2 ore. Aceast faz este aparent
dependent de o varietate de factori incluznd dimensiunea inoculului, timpul
necesar pentru a-i reveni din ocul fizic datorat transportului, timpul necesar
pentru sinteza coenzimelor eseniale sau a factorilor de diviziune i timpul
necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza
substratul prezent n mediu. (2)
Faza de multiplicare logaritmic (exponenial)
Celulele bacteriene prezint caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt ns
ceva mai mari), citoplasma este intens bazofil i omogen, lipsit de incluzii.
Bacteriile sunt foarte sensibile la antibiotice. Aceast faz este adecvat pentru
studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor n vederea preparrii de vaccinuri.
Faza de multiplicare exponenial dureaz aproximativ 2-3 ore.
Faza staionar
Multiplicarea este realizat n progresie aritmetic, dar pentru c numrul
bacteriilor care sunt distruse este aproximativ egal cu numrul bacteriilor nou
aprute rata de cretere devine nul.
Germenii au morfologia caracteristic speciei; n aceast faz realizm
identificarea germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene
ncepe formarea sporilor. Faza staionar dureaz aproximativ 2-3 zile.
Faza de declin
Substratul nutritiv srcete, apar metabolii toxici, bacteriile sunt distruse
progresiv, se produc i enzime autolitice, rezervele de hran din incluzii (ex.
acidul poli--hidroxi butiric sau glicogenul) se consum, pentru un timp sursa de
energie rmne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. n acest
scop se pot activa mecanisme speciale de reglare i se exprim o serie de gene
care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durat

limitat de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogenez devine foarte

intens.
Aspectul culturilor pe medii solide
Condiiile de cultivare i aspectul culturii sunt caractere cheie n identificarea
bacteriilor. Aspectul coloniilor variaz ntre diferitele bacterii, fr a permite
diferenieri definitive de specie (dar au utilitate n contextul studierii tuturor
caracterelor bacteriene i n contextul general al diagnosticului de laborator, care
la rndul su trebuie s aib loc ntr-un context n care punem n balan i alte
elemente, clinice, paraclinice; colaborarea ntre medicii de diferite specialiti
este esenial). Se examineaz:

dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm

i mici, sub 1 mm),

conturul (circular, lobat, zimat),

relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),

suprafaa (lucioas, granular, rugoas),

culoarea (pigmentate, nepigmentate),

opacitatea (transparente, opace),

consistena,

aderena la mediu,

prezena sau absena hemolizei (pe medii de tipul geloz-snge). (Figura

nr. 14)
Colonia S (smooth) are suprafa bombat i neted, margini circulare i adesea
aspect strlucitor. Germenii pstreaz structura antigenic i nu aglutineaz
spontan cu soluie salin fiziologic. Germenii capsulai i pstreaz capsula.
Virulena este conservat. Majoritatea bacteriilor studiate formeaz colonii de tip
S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli etc). (Figura nr. 15)
Colonia R (rough) este plat, suprafaa ei prezint rugoziti, marginile sunt
crenelate. Structura antigenic nu este caracteristic. Nu pstreaz capsula.
Virulena nu este conservat (excepii Bacillus anthracis, Mycobacterium
tuberculosis, Corynebacterium diphteriae). O bacterie care n mod caracteristic
duce la apariia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), n cazul n care testele
de identificare prin reacii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lam, folosind
anticorpi cunoscui) nu se efectueaz la timpul potrivit ci mai trziu, prin
nbtrnire va suferi anumite modificri, coloniile vor deveni de tip R iar
identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibil. (Figura nr. 16)
Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare, mucoas. Este dat de exemplu de
bacteriile care prezint capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr.
17) Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot fi i de tip S i de tip M.
n cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obinuite nu
vom putea obine colonii izolate (a fost descris fenomenul de invazie). (Figura
nr. 18) Cultura se ntinde pe toat suprafaa plcii n strat continuu sub forma
unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea
n mediu de acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc.
Aspectul culturilor pe medii lichide
Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se dezvolt n toat masa de lichid,
tulburndu-l. Bacteriile strict aerobe se dezvolt preponderent la suprafaa
mediului. Ca un aspect particular, n apa peptonat Vibrio cholerae se poate
dezvolta i formeaz un vl la suprafaa mediului. n acest caz, pH-ul mediului
este 9-9,5.
Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbur
omogen mediul (majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19)
Variantele R realizeaz o tulburare mai puin omogen. Pot lsa mediul limpede,
formnd flocoane care se depun sau un strat (vl) la suprafaa mediului (de
exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos). (Figura nr. 20)

Alte informaii privind mediile de cultur, diferitele tehnici de cultivare,

examinarea culturilor bacteriene i diferitele tehnici de identificare fenotipice
utile n diagnosticul microbiologic sunt prezentate n anexa nr. 2.