BAB I

PENDAHULUAN
1.1

Tujuan
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengembangkan dan memvalidasi metode KCKT

fase terbalik yang tepat, akurat, direproduksi dan ekonomis untuk penentuan dari Simvastatin.
1.2

Latar Belakang
Metode analisis yang digunakan untuk menentukan kadar obat mempunyai peran

yang penting dalam hal evaluasi, interpretasi bioavailabilitas dan bioekivalensinya. Dalam
penentuan kadar obat diperlukan suatu metode analisis yang tepat dengan tingkat selektivitas
dan sensitivitas yang tinggi, gangguan yang sedikit mungkin, dan nilai akurasi serta presisi
yang tinggi. Untuk memperoleh hal tersebut, maka metode analisis yang digunakan harus
divalidasi terlebih dahulu.
Simvastatin merupakan obat yang menurunkan kadar kolesterol (hipolidemik) dan
merupakan hasil sintesa dari hasil fermentasi Aspergillus terreus. Secara in vivo Simvastatin
akan dihidrolisa menjadi metabolit aktif. Mekanisme kerja dari metabolit aktif tersebut adalah
dengan cara menghambat kerja 3-Hidroksi-3-metilglutaril koenzim A reduktase (HMG Co-A
reduktase), dimana enzim ini mengkatalisa perubahan HMG Co-A menjadi asam mevalonat
yang merupakan langkah awal dari sintesa kolesterol.
Berdasarkan survei literatur, penentuan Simvastatin mengungkapkan beberapa metode
berdasarkan kromatografi telah dilaporkan untuk penentuan. Metode kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik digunakan untuk menentukan Simvastatin dalam obat
massal dan formulasi farmasi. KCKT fase terbalik merupakan metode yang banyak
digunakan karena lebih sederhana, selektif dan waktu analisisnya lebih singkat. Metode
kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik yang tepat, akurat, reprodusibel dan ekonomis
dengan modus isokratik untuk penentuan Simvastatin dan formulasinya mengindikasikan
sesuatu yang baru dalam penelittian ilmiah. Oleh sebab itu, perlu divalidasi sesuai dengan
USP dan pedoman International Converence Harmonization (ICH).

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1.

Simvastatin
Sifat fisikokimia simvastatin adalah sebagai berikut(Moffat, 2004):

Rumus struktur:

Rumus Molekul

: C25H38O5

Berat Molekul

: 418,6

Titik Lebur

: 135o sampai 138oC

Pemerian

: Serbuk kristal putih

Kelarutan

: Tidak larut dalam air, n-heksana, dan asam klorida; larut dalam
kloroform, dimetil sulfoksida, metanol, etanol, polietilen glikol,
NaOH, dan propilen glikol.

Simvastatin berdaya menurunkan kadar LDL (Low Density Lipoprotein) dan

kolesterol total dalam 2-4 minggu. Kadar VLDL (Very Low Density Lipoprotein) dan TG
juga dapat diturunkan, sedangkan HDL (High Density Lipoprotein) dinaikkan sedikit.
Digunakan tersendiri atau dikombinasi dengan damar. Khasiat menurunkan LDL-nya kuat,
tetapi lebih lemah daripada atorvastatin (Tan dan Rahardja, 2007). Namun, dampak negatif
dari penggunaan Simvastatin yang paling umum dapat menyebabkan sakit kepala insomnia,
kelelahan otot, sakit masalah pencernaan (seperti sakit perut, diare, mual atau dispepsia) efek
samping yang serius dari simvastatin adalah myopathy, seperti nyeri otot progresif dan
kemerahan atau cokelat pada urin (Subandi, 2013)

2.2.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

KCKT disebut juga dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau

High Pressure Liquid Chromatography atau Modern Liquid Chromatography merupakan

teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu
dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi, lingkungan dan industriindustri makanan. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi memisahkan komponen campuran
senyawa kimia terlarut dengan sistem adsorpsi pada fase diam padat atau sistem partisi di
antara fase diam cair yang terikat pada penyangga padat, dan fase gerak cair. Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi dapat memisahkan makromolekul, ion, bahan alam yang tidak stabil,
polimer dan berbagai gugus polifungsi dengan berat molekul tinggi. Berbeda dengan
kromatografi gas, pemisahan pada KCKT adalah hasil antaraksi spesifik antara molekul
senyawa dengan fase diam dan fase gerak (Satiadarma, dkk., 2004).
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan
kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi
kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT
mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam
komponen tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995). KCKT merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain: farmasi, lingkungan dan industri-industri
makanan (Munson, 1984).
Menurut (Putra, 2007), kelebihan KCKT dibandingkan dengan metode lain antara
lain:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

Resolusinya baik
Mudah melaksanakannya
Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/ kerusakan bahan yang dianalisis
Dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Mudah melakukan recovery cuplikan
Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan

reprodusibilitasnya lebih baik

j. Instrumennya memungkinkan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif .
3

2.3.

Cara Kerja KCKT

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh

perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan
kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi
operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase
gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Rohman, 2009).
Pemisahan analit dalam kolom kromatografi berdasarkan pada aliran fase gerak yang
membawa campuran analit melalui fase diam dan perbedaan interaksi analit dengan
permukaan fase diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan setiap komponen dalam
campuran (Meyer, 2010).
2.4.

Komponen KCKT

2.4.1. Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat meampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase
gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa
dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Rohman, 2007).
2.4.2. Pompa
4

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon,
dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan
sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan pompa injektor kolom
oven detektor Wadah solven Data processor Universitas Sumatera Utara kecepatan
alir 3 ml/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/ menit (Rohman, 2007).
2.4.3. Injektor
Ada 3 jenis injektor, yakni syringe injector, loop valve dan automatic injector
(autosampler). Syringe injector merupakan bentuk injektor yang paling sederhana
(Meyer, 2004). Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar
aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom.
Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom (on column injection) atau
digunakan katup injeksi (Adnan, 1997).
2.4.4. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis
bergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi
menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik : garis tengah dalam 2 6 nm. Panjang bergantung pada
jenis kemasan,untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50 100 cm.
Untuk kemasan mikropartikel berpori, biasanya 10 30 cm;
b. Kolom preparatif : umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk
kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada
mode KCKT yang digunakan (Johnson, 1991).
2.4.5. Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan di

dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas,
dan memberi tanggapan untuk semua tipe senyawa. Detektor yang paling banyak
digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor
spektrofotometer uv 254 nm. Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang
gelombang uv-vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk
mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas (De Lux, 2007).
2.5.

Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu,

berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut

memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Beberapa parameter analisis yang harus
dipertimbangkan dalam validasi metode analisis diuraikan dan didefenisikan sebagaimana
cara penentuannya antara lain (WHO, 1992):
1. Ketepatan/ Kecermatan (accuracy)
Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis
dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen
perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Persen perolehan kembali
dapat ditentukan dengan cara penambahan baku pembanding (addition) dan cara
spiking.
2. Ketelitian/ Keseksamaan (precision)
Ketelitian adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari ratarata jika prosedur
ditetapkan secara berulang-ulang pada sampel yang diambil dari campuran yang
homogen. Ketelitian diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif
(koefisien variasi). Ketelitian dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability)
atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah ketelitian metode jika
dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval
yang pendek. Ketertiruan adalah ketelitian metode jika dikerjakan pada kondisi yang
berbeda.
3. Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi
yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blengko. Batas
6

deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada
analisis renik dan diartikan sebagai kuantitasi terkecil analit dalam sampel yang masih
dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.
4. Selektivitas (Spesifisitas)
Selektivitas atau spesifisitas adalah kemampuan yang hanya mengukur zat
tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin
ada dalam matriks sampel.
5. Linearitas dan Rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon secara
langsung dan proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode
adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat
ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan dan linearitas yang dapat diterima.
6. Ketangguhan (ruggedness)
Ketangguhan adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analis
sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis,
instrument, bahan pereaksi, suhu dan hari yang berbeda.
7. Kekuatan (robustness)
Kekuatan adalah suatu perubahan metode yang kecil dan terus menerus dan
mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi.

BAB III
PEMBAHASAN
Metode yang digunakan dalam determinasi dan validasi simvastatin berdasarkan
jurnal kali ini adalah dengan menggunakan metode KCKT( Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi). Berdasarkan jurnal yang ditemukan, disebutkan bahwa alasan penggunaan metode
ini dalam validasi dan determinasi simvastatin karena mempunyai akurasi, presisi, dan
linearitas yang cukup bagus dalam penentuannya, dan reprodusibel serta ekonomonis dalam
7

penggunaannya. Penggunaan metode ini dalam determinasi dan validasi simvastatin telah
disetujui oleh USP dan ICH. Metode kromatografi ini menggunakan fase diam C18, yang
mempunyai ukuran 150x460 mm. Pelarutnya menggunakan metanol dan asam fospat 0,1%
di dalam air dengan perbandingan 10:90, yang merupakan fase gerak pada panjang
gelombang 230 nm. Hasilnya menunjukkan bahwa tidak terjadi perubahan kondisi bahan
yang menjadi analit yang terlalu signifikan. Waktu retensi yang diperlukan oleh simvastatin
adalah 3,106 menit. Metode ini sangat peka terhadap simvastatin dan hasilnya benar-benar
terpisahkan tanpa tambahan dari campuran eksipien. Konsentrari yang bagus pada
simvastatin

ini

berkisar

antara

5-6

mikrogram/ml

dengn

tingkat

korelasinya

0.9999,sedangkan tingkat akurasinya berkisar antara 97,45 % - 98,32 %.

Langkah pertama dalam preparasi sampel untuk analisis simvastatin ini adalah
preparasi reagen terlebih dahulu yaitu asam orto posforat, metanol, air, dan simvastatin.
Setelah preparasi bahan, selanjutnya preparasi bahan yang akan digunakan sebgai fase gerak
yang merupakan komposisi dari metanol, asam orto posforat 01, % di dalam air. Bahan
tersebut kemudian difiltrasi dengan nilon filter setebal 0.45 mikrometer, dan dihilangkan fase
gasnya dengan

cara sonikasi untuk menghindari sumbatan dan gangguan dari partikel-

partikel kecil.
Setelah preparasi untuk fase geraknya, baru kemudian preparasi untuk pembakuan
simvastatin untuk dibakukan dalam konsentrasi tertentu. Preparasi larutan stok standar
dilakukan pada pada konsentarsi 0,5 mg/ml.

Larutan baku disiapkan dengan cara

mengencerkan larutan pada konsentrasi 50 mikrogram/ml dengan larutan fase gerak.

Langkah selanjutnya untuk preparasi sampel adalah menimbang sebanyak 20 tablet
simvastatin, baru kemudian digerus dan ditimbang hingga 50mg, lalui dipindahkan ke dalam
labu ukur 100 ml, dilarutkan dengan metanol dengan 70 ml metanol dan dibuang fase gas
dari metanol tersebut hingga hilang fase gasnya dengan cara dikocok secara perlahan . Lalu
dikalibrasi agar didapatkan konsentrasi sampel menjadi 0,5 mg/ml simvastatin dan kemudian
dibuang zat pengotornya dan disentrifugasi selama 10 menit untuk pemisahan. Zat pelarutnya
di filter dengan membran filter setebal 0,45 mikroliter, setelah difilter, sampel diencerkan lagi
dengan fase gerak untuk menentukan konsentrasi akhir sebelum diinjeksikan pada KCKT.
Kolom yang akan digunakan diseimbangkan dengan fase gerak sampai pada kondisi
yang telah ditentukan hingga dicapai kondisi sampel yang dipreparasi mencapai stabil.
Diinjeksikan secara terpisah pada injektor larutan pengencer dengan enam injektor untuk
8

larutan baku yang telah dipreparasi dan sampel dan akan terbaca hasilnya pada kromatogram.
Persyaratan sampel yang memenuhi kriteria saat terbaca pada pada kromatogram adalah
mempunyai simpangan baku relatif tidak lebih dari 2, mempunyai faktor pengekor antara 0,82,00, dan mempunyai nilai lebar puncak tidak lebih dari 2000.
Hasil validasi parameter linieritas pada metode ini sudah baik dan memenuhi syarat
karena nilai koefisien korelasi [r] yang didapatkan yaitu 0,9999. Hal ini sesuai dengan teori
yang menunjukkan bahwa nilai linieritas yang memenuhi syarat yaitu 0,995. Linieritas
suatu metode bertujuan untuk mendapatkan hasil uji yang proporsional terhadap konsentrasi
analit dala sampel pada rentang tertentu.
Hasil validasi parameter presisi pada metode ini sudah baik dan memenuhi syarat
karena nilai % RSD yang didapatkan yaitu 0,44%, 0,51% dan 0,35%. Hal ini sesuai dengan
teori yang menunjukkan bahwa nilai %RSD yang mmenuhi syarat untuk presisi yaitu 2%.
Presisi suatu metode bertujuan untuk memverifikasi suatu metode analisis akan memberikan
hasil yang sama setelah fase/tahap pengembangan (metode) selesai.
Hasil validasi parameter akurasi pada metode ini sudah baik dan memenuhi syarat
karena kesesuaian antara hasil uji yang diperoleh dan nilai yang sebenarnya saling mendekati.
Prsentase nilai recovery dari konsentrasi yang didapat yaitu 98,32%,97,82% dan 97,87 %.
Hal ini sesuai dengan teori yang menunjukkan bahwa nilai persentase recoveri yang
memenuhi syarat pada pentapan konsntrasi sivastatin yaitu sebesar 97,45%-98,32%. Akurasi
suatu etod bertujuan untuk mengetahui ktepatan hasil uji yang di perolh dan nilai yang
sebenarnya endekati dan dapat diterima.
Hasil validasi parameter LOD dan LOQ pada metode ini sudah baik dan memenuhi
persyaratan karena konsentrasi Simvastatin yang didapatkan masing-masing diperoleh untuk
LOD ditemukan sebesar 0,25 ug / ml dan LOQ ditemukan msbesar 5.0 mg / ml.
Perbandingan konsentrasi yang memenuhi syarat yaitu untuk LOD( 3:1) dan LOQ yaitu
(10:1), dimana yang didapatkan pada LOQ harus lebih besar dari LOD, Nilai untuk LOD dan
LOQ bertujuan untuk mengtahui snsitifitas alat yang digunakan.
Hasil validasi Ruggedness atau kekasaran pada metode sudah memenuhi persyaratan
karena nilai % RSD yang didapatkan yaitu 0,44%, 0,51% dan 0,35%. Hal ini sesuai dengan
teori yang menunjukkan bahwa nilai %RSD yang mmenuhi syarat untuk ruggedness yaitu

2%. Ruggedness suatu metode bertujuan untuk mengetahui tingkat reprodusibilitas hasil yang
diperoleh.
Hasil validasi Robutness atau ketahanan pada metode yang digunakan sudah
memenuhi persyaratan. Hasil uji akan berpengaruh apabila ada perubahan kecil pada kondisi
kromatografi seperti konsentrasi fase gerak, tingkat, dan panjang gelombang mengalir.
Tujuan validasi robutness adalah untuk mengidentifikasi kondisi metode dengan baik.
Hasil uji stabitas larutan sudah memenuhi persyaratan karena prosedur sesuai dengan
prosedur yang telah ditetapkan. Uji ini untuk menjamin satu metode menghasilkan suatu
presisi dan akurasi yang dapat diterima

10

DAFTAR PUSTAKA

Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan Makanan. Yogyakarta :

Penerbit Andi.
De Lux Putra, E. 2007. Dasar-dasar Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Medan : Fakultas
Farmasi USU.
Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi keempat. Jakarta : Departemen Kesehatan
RI.
Johnson, E.L. dan Stevenson, R. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: Penerbit ITB.
Meyer, V. R. 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography. 4th Edition. New
York: John Wiley & Sons Ltd.
Moffat, A.C., M.D. Osselton, B. Widdop. 2004. Clarkes Analysis of Drugs and Poisons.
Pharmaceutical Press.
Munson, J. W. 1984. Analisis Farmasi Metode Modern. Penerjemah: Harjana Parwa B.
Surabaya: Penerbit Airlangga University Press.
Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Cetakan I. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Hal. 467.
Rohman, A. 2009. Kromatografi Untuk Analisis. Edisi Ke I. Yogyakarta: Graha Ilmu. Hal.
217.
Satiadarma, K., dkk. 2004. Asas Pengembangan Prosedur Analisis. Cetakan Pertama.
Surabaya: Airlangga Universitry Press.
Subandi, A. 2013. Efektifitas Ekstrak Buah Rimbang (Solanum torvumswartz) Terhadap
Penurunan Kadar Kolesterol Total dalam Darah Pada Tikus Putih Jantan Dewasa Galur
Wistar. Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains. 15(2): 33-38.
Tjay, T.H dan Raharjo, K. 2007. Obat-obat Penting. Jakarta: Penerbit PT Elek Media
Komputindo.
WHO. 1992. Validation of Analytical Procedures Used in the Examination of Pharmaceutical
Materials. WHO technical Report Series. No. 823
11