Elintarvike- ja ympristvirologia

Norovirukset
Dos. Leena Maunula
23.11.2011 ELTDK , HY

Elintarvike- ja ympristvirologia
melko uusi osa-alue elintarvike-ja
ympristhygienian tutkimuskentss

kehitetn patogeenisille humaaniviruksille

osoitusmenetelmi, joiden avulla voidaan saada
tietoa virusten esiintymisest ympristss ja
niiden kulkeutumisreiteist

tutkimusten avulla lydetn keinoja virusten

aiheuttamien ruokamyrkytysepidemioiden
selvitykseen ja ehkisyyn

Taustaa
Ruokamyrkytystilastoissa virusten aiheuttamien
epidemioiden osuus on kasvanut 2000-luvulla
Suomessa, sek ruoka- ett vesiepidemioissa

Sama suuntaus on havaittavissa kaikissa

kehittyneiss maissa

Syit on useita: elintarvikehygienia bakteerien

suhteen on korkealla tasolla, niiden osuus
vhentynyt, virusepidemioiden
tunnistusmenetelmt kehittyneet

Elintarvikevlitteiset norovirusepidemiat
Suomessa
- useimpina vuosina suurin yksittinen ruokamyrkytysten aiheuttaja
Vuosi

Lukumr (%)

Sairastuneita

2000

15 (23)

595

2001

19 (17)

335

2002

16 (46)

547

2003

4 (18)

170

2004

7 (17)

421

2005

16 (32)

582

2006

12 (29)

860

2007

5 (17)

199

2008

12 (32)

317

Lhde: Elintarvikkeiden mikrobiologiset vaarat, Evira 1/2010

Caliciviridae
Suvut: Norovirus, Sapovirus, Vesivirus, Lagovirus
vaipaton, ikosahedraalinen, 27-40 nm halkaisijaltaan,
RNA genomi

Norovirus
5 genoryhm, joissa yhteens 29 genotyyppi
NV GI:1-8, GII:1-17, GIII:2, GIV:1, GV:1

aiheuttaa oksennus- ja ripulitautia ihmisiss, joskus oireeton

infektoi kaikenikisi ihmisi
pieni infektioannos
lyhyt inkubaatioaika 10 - 48 h, oireet kestvt yl. 12 - (48 h)
ensisijaisesti levi ihmisest toiseen fekaali-oraalitartuntana,
mutta mys ympristn ja elintarvikkeiden vlityksell
tartuntalhde aina ihmisen uloste
muodostuu vain lyhytaikainen immuniteetti
suuri geneettinen variaatio
kestv ympristss, silyy hyvin viiless. Salaatit, leikkeleet,
pakasteet yms. ovat riskituotteita
selvsti yleisin vesi- ja ruokavlitteisi epidemioita aiheuttava
virus

Noroviruksen perimn rakenne

N V ( I)

2 C

3 C

1 7 8 9 a a

3 D

7 6 5 4
( A)
n
5 3 7 1

O R F 1

polymeraasi

5 3 0 a a
O R F 2

2 1 2 a a
O R F 3

genomi: positiivinen
yksisikeinen RNA,
n. 7.4 kb

kapsidiproteiini

( A)
n

Hepatiitti A virus
Kuuluu Picornaviridae-heimoon, Hepatovirussukuun
Morfologia kuten enteroviruksilla
Kestvin enteerisist viruksista, stabiili pH1:ss

Aiheuttaa maksatulehduksen ihmisess

Infektion jlkeen muodostuu elinikinen
immuniteetti
Tehokas rokote
Suomessa hepatiitti A-virusta ei esiinny
endeemisen, 13-22 tapausta vuodessa
(2009-2011), vain sporadisia epidemioita

Trkeimmt ulosteperiset virukset

Itmisaika
(pivi)

Virus

Taudinkuva

Noro

Hepatiitti A
Hepatiitti E

0.5 - 2
14 - 60
14 - 60

liev
vakava
vaihtelee

Rota A
Adeno
Astro
Sapo
Entero

2 - 4
2 - 5
1 - 2
0.5 - 2
2 - 5

vaihtelee
liev
liev
liev
vaihtelee

Diagnostiset menetelmt potilasnytteist

EM

AG-os. (RT)-PCR SEROL

+++

+++

(++)

Adeno

++

+++

(++)

Astro

(+)

++

+++

Noro, sapo (+)

+++

(+)

(-)

++

+++

Rota

HAV, HEV

Nytelaadut: Natiiviuloste (oksennus), seerumi serologiassa

Norovirustartunta

Suoraan
Pinnat
Vesi
Ruoka

Osuudet ?
Mys yhdistelmreitit yleisi, ruoka -> henkilst toiseen

Ihmisen norovirukset: genoryhmt ja -tyypit

(Zheng et al, 2005)

GG I (prototyyppi)
I.1. (Norwalk/1968/US)
I.2. (Southampton)
I.3. (Desert Shield)
I.4. (Chiba)
I.5. (Musgrove)
I.6. (Hesse)
I.7. (Winchester)
I.8. (Boxer)

GG IV
IV.1. (Alphatron)

GG II
II.1. (Hawaii/1971/US)
II.2. (Melksham)
II.3. (Toronto)

II.4. (Bristol)

II.5. (Hillingdon)
II.6. (Seacroft)
II.7. (Leeds)
II.8. (Amsterdam)
II.9. (VABeach)
II.10. (Erfurt)
II.12. (Wortley)
II.13. (Faytil)
II.14. (M7)
II.15. (J23)
II.16. (Tiffin)
II.17. (CSE)

Norovirusdiagnoosit Suomessa 2002-2011

800

200

2002

2004

2006

2008

2010

Potilasnytteiden perusteella tehty tutkimus Suomessa (1998-2002)

- vuosittain 28 - 102 noroviruksen aiheuttamaa epidemiaa
(epidemioita kaikkiaan 62 -136)
-> yhteens 252 epidemiaa/416 tutkittua (60.6%)
- samaan aikaan vain 4 astroviruksen ja 1 rotaviruksen
aiheuttamaa epidemiaa
- esiintymispaikat:
Ravintolat, catering
Laitokset, koulut
Sairaalat, hoitolaitokset
Kylpylt
Puolustusvoimat
Yhteiskunta
Muut

53
25
97
11
12
12
40

Yhteens

252 epidemiaa

OB2004039
OB2004028
OB2004048
OB2004083
0.05
2004 variant
82
OB2004059
OB2006046
DQ078794|2004
OB2006054
99
OB2006038 2006a variant
99 OB2006070
56
OB2006089
2006b variant
100 OB2006115
AB291542|2006
78
OB2003023
OB2004003
OB2004012
97
AY588018|2002
AY581254|2003
OB2003001
2002 variant
70
EP2002022
OB2004007
AY502023|2002
93
OB2003LN457
OB2003003
60
DQ364459|2002
AJ583672|2001
AF427117|2000
99
AF080558|1996
OB2001018
OB2001058
52
OB1995001
AJ277619|1995
AF406793|
AF427116|1999
AY532123|1998
AY741811|1997
1996 variant

72
AY038600|1998
AJ004864|
DQ078829|1997
AB078336|
OB2000043
AF425766|2001
91
OB2000016
OB2000015
AF080551|1995
EP2002006
100
100 X86557|1992
X76716|1993
AF414417|1992
<1996 variant
AF145896|1994
AY032605|1987
AY030098|1987

2004 VAR

2006a VAR

Genoryhm.genotyyppi-variantti,
esim. GII.4-2006b

2006b VAR

2002 VAR

1996 VAR

<1996 VAR

Siebenga J et al. 2007

J.Virol. 81:9932-41

NOROVIRUS II.4 -VARIANTTIEN

AJALLINEN MUUNTUMINEN

Norovirusepidemiat Eurooppa,
2002-2007 (FBVE, DIVINE)
Genotyypit

Verhoef L et al. 2008

EID 14:238-43

Veriryhmantigeenit norovirusten tarttumista

edesauttavina tekijin

Donaldson et al
Tan M and X Jiang, 2010, PLoS Pathogens vol 6: e1000983

LM

Virukset vesi- ja elintarvikevlitteisten

epidemioiden aiheuttajina

pasiassa kyseess ovat lajispesifiset

virukset

virukset eivt lisnny isntsolun

ulkopuolella

saastuminen edellytt rikasta lhdett

(uloste, viemrijte)

Noroviruksen erittyminen
Days

0 1

Case 1 +

(23)

Case 2 +

4 6

12 14 15

-
>40

+ +

(32)

(18)

(26)

+
Case 3 (16)

+
+
(21) (20)

(31) (30)

+
(26)

19 20 21 23... 47

+
(27)

+
+
+
(30) (31) (32)

Atmar R et al., 2008 EID, Norwalk virus shedding:

vapaaehtoiskokeissa 69% potilaista korkein viruspitoisuus
ulosteessa vasta oireiden loppumisen jlkeen
muutamilla potilailla virusta ulosteessa 3 14 h ennen oireita

IKUINEN KIERTOKULKU
JTEVESI

ELIN
POTILAS

KASTELU

- VIHANNEKSET
- MARJAT

SUORA SAASTUTUS
- RUOAN
VALMISTUS

LUONNONVESI

OSTERIT

SIMPUKAT

KULUTTAJA

UIMAVESI
VESILAITOKSET
- J UOMAVESI
-E
LINTARVIKEVESI

Jtevesi
Yhteiskuntajtevedess esiintyvt viruspitoisuudet
heijastelevat ihmisiss esiintyvien virusepidemioiden
mr ja laajuutta

Useimpien enteeristen virusten epidemiakaudet

keskittyvt talveen ja kevseen
Poikkeuksen

muodostavat enterovirukset, joita esiintyy

eniten loppukesll ja syksyll

Adenoviruksia

esiintyy melko tasaisesti ympri vuoden

Norovirusten esiintyminen ksitellyss jtevedess

ja jokivedess
Puhdistettu jtevesi
JV

Mar
2007

April May June July Aug Sept

Oct

Nov

Dec

Jan Feb
2008

RKI

+/- -

(+/-)

HYV

KLA

Jokivesi
V84

+/-

ND

V39

ND

Le28

+/- +

ND

Noroviruksen silyvyys pohjavedess

noroviruksen silyvyytt pohjavedess on tutkittu
vapaaehtoiskokeilla
norovirus

silyy tartuttavana ainakin 60 vuorokautta (pisin

testattu aika kokeessa)

pcr-testin tulos: viruspartikkelit silyivt 427 piv

virusmrn laskematta, vasta 1266 pivn pst
todettiin tilastollisesti merkittv virusmrn
vheneminen
- Seitz SR et al., 2011 AEM: 77(19):6884-8

Noroviruksen inaktivoituminen pohjavedess

Virusten kemiallinen inaktivointi ja UV

Veden klooraus: normaalisti juomavesiverkostossa
kytettvt veden klooripitoisuudet eivt tuhoa norovirusta
(shokkikloorauspitoisuudet tehoavat, kun vaikutusaika on
riittv)

UV-valo: UV on tehokas kestvimpienkin virusten tuhoaja,

kun sit annetaan riittvn lhelt, se kohdistuu ohueen
vesikalvoon ja vesi on melko kirkasta

Otsoni: Uimahallien vesiss kytetty otsoni on todettu

keskimrin tehokkaaksi viruksille

Enteeristen virusten inaktivoituminen

Virus

Kuumennus

Kloori
(mg/l)

Norovirus

65C 30 min (?)

> 1.0

Rotavirus A

50C 30 min

0.3 - 0.5

Enterovirus

50C

0.3 0.5

Hepatiitti A - virus

60C 60 min

2.0

Lhteet: Fields (ed.): Virology, Dolin ym., 1972, Keswick ym., 1985

Indikaattoribakteerit ja virukset
Monissa norovirusten aiheuttamissa vesiepidemioissa
perinteisi indikaattoribakteereja (E.coli, koliformiset
bakteerit) ei ole osoitettavissa saastuneesta vedest

Syit voivat olla esim. virusten pieni infektiivinen annos

tai ett bakteerit ovat saattaneet tarttua esim.
maaperainekseen, mutta virukset ovat suodattuneet lpi,
tms.

Norovirustestit
Potilasnyte

Nyte elintarvikkeesta
tai ympristst

Elektronimikroskopia
(EM)

Antigeenitestit
(EIA)

++

++++

+++

Geenimonistustestit
(RT-PCR,
reaaliaikainen RT-PCR)

Virusten osoitusmenetelm
vesinytteist
1. Viruksen

konsentrointi

- useita vaihtoehtoisia tapoja, jotka perustuvat

viruksen ionivaraukseen (adsorptio/eluutio)
viruspartikkelin kokoon (ultrafiltraatio)
viruksen tiheyteen ja sedimentaatiokertoimeen
(ultrasentrifugointi)
-> virukset mahdollisimman pieness nestemrss
2. Viruksen

nukleiinihapon eristys

3. Geenimonistus
- reaaliaikainen RT-PCR, (sekvensointi)

Suomen vesivlitteiset norovirusepidemiat

1998-2003
Altistuneet/
Norovirus
Norovirus
Epidemia

tapaukset

potilaista

vedest

E1 III/98
E2 IV/98
E3 VII/98
E4 VIII/98
E5 I/99
E6II/99
E7 IV/99
E8 VII/99
E9 III/00
E10 VIII/00
E11 XII/00
E12 IV/02
E13 X/02
E14 II/03
E15 V/03
E16 VIII/03

5000/2500
15000/2000
45/13
120/40
2500/200
250/100
160/58
100/60
10000/5500
14/13
2200/300
50/25
960/300
13/11
150/95
25/20

GI.6, GII.4
GI.6, GIId
GI, GII
GII.5
GII.4
GI.3
GI.6
GI.3
GI.3, GII
GI.3
GII.4
GII.NA
GIIb
GII.4nv
GII.4nv
GI.6

GII.4
GI.3
GI.6
GI.3
GI.3
GII.4, GI.1
GII.NA
GII.4
GII.4nv
GI.6

Maunula,
Miettinen,
von Bonsdorff
2005. EID
11:1716

0.1

Emsjrjestysvertailu
potilas- ja vesinytteiden
norovirusten vlill

98-E2-patient
98-E1-water
98-E1-patient

Grimsby

00-E11-patient
00-E11-water
99-E5-patient
03-E14-patient
03-E14-water
03-E15-patient
03-E15-water
02-E12-patient
02-E12-water

Lordsdale

GII.4

00-E11-water

GII.1
GIId

98-E4-patient

GII.5
GII.b

Hawaii
98-E2-patient
Girlington
Rotterdam
Hillingdon
Melksham

04-E17-patient
04-E17-water
02-E13-patient

GIIb Hilversum
Birmingham

00-E9-patient
99-E8-patient
99-E8-water
00-E10-patient
00-E10-water
99-E6-patient
99-E6-water

GI.3

Butlins
Norwalk
Malta
Southampton

98-E2-patient
99-E7-water
99-E7-patient
03-E16-patient

Lord Harris

98-E1-patient

Bo/NLV/176/98/NET_

GI.6

ELINTARVIKKEIDEN RISKITUOTTEET
JA -VIRUKSET
______________________________________________________________________
KUORIELIMET (OSTERIT JA SIMPUKAT):

NOROVIRUKSET, HAV

TUORETUOTTEET (VIHANNEKSET,

NOROVIRUKSET, HAV

NOROVIRUKSET, HAV

VESI (RUOAN VALMISTUKSESSA)

NOROVIRUKSET,
ROTAVIRUS

VESI

ENTEERISET
UUDET VIRUKSET
(HPAI)

MARJAT)
VALMISRUOKA (KSITELTY)

______________________________________________________________________
VIIMEIST LUKUUNOTTAMATTA YHDISTELMT
PERUSTUVAT JULKAISTUIHIN TAPAUKSIIN

Ruokavlitteiset virusepidemiat tartuntareitit

raaka-aine: esim. pakastemarjat, osterit,
voileivt, tuoretuotteet, hedelmt

ruoan valmistus: ruoan ksittely,

peseminen, pilkkominen, asettelu,

astioiden ksittely, ei-oireiset tyntekijt

tarjoilu
ruokailutapahtuma: ei-oireiset ruokailijat

Ruokavlitteiset norovirusepidemiat,
USA 1998-2000
Epidemioiden lkm
Salaatti
Voileivt

20
10

Tuoretuote/hedelm
Liha

13
8

Kala

Leipomotuote

Osterit
Muut

2
14
76

Widdowson et al.
2005, EID 11:95

Suomessa raportoidut elintarvikevlitteiset

epidemiat vuonna 2009

Aiheuttaja

Liha

C. botulinum

Kala

Vilja

Kasvis

C. perfringens 3

Salmonella

Norovirus

Total

4
1

27

32

Tuntematon

17

Yhteens

30(55%)

55

Lhde: Ruokamyrkytykset Suomessa 2009, Eviran julkaisuja 2/2011

Pellolta pytn ketjun riskikohdat

Alkutuotanto

Prosessointi

Pakkaaminen

Varastointi

Kuljetus

Vhittismyynti

Ruoanvalmistus

Puhdas kasteluvesi,
yleinen hygienia

Ruoan ksittelijiden osuus epidemioissa

Tyntekijn virhetoimintoja (epid. lkm)
Patogeeni
Norovirus
Norovirus?
Hep A virus

A
232
64
83

105
42
32

32

6
1
1

10

A Infektoitunut hl tai patogeenin kantaja on ksitellyt elintarvikkeita

B Elintarvikkeiden ksittely paljain ksin
C Puutteellinen ksienpesu
D Vlineiden huonosta puhdistuksesta johtuva ruoan kontaminaatio

Todd ECD ym.,l, 2007 J Food Protection

Desinfektioaineiden tehokkuus
Rotavirus
ulostesuspensiossa

Etanoli
Klorheksidiini diglukonaatti
Natriumhypokloriitti
Fenoli+
Natrium fenaatti
Dietyleenitriamiini
Natriumkloriitti

70%
0.05%
0.125%
1.41%
0.24%
0.0192%
30%

++++
+
++++

+
+
++

+
+++
+++

+
++
++

Kirj. lhde: Abad et al. 1997, FEMS Microbiology Letters, 156:107-111.

+ = viruksen titteri laskenut 0 - 1 log
++
1-2 log
+++
2-3 log
++++
3log
->katsotaan tehokkaaksi

Rotavirus
kuiva uloste

Hepatiitti A viruksen tuhoutuminen kermassa

eri lmptiloissa

Hepatiitti A virus
tuhoutui nopeasti
85C:ssa maitotuotteissa. Rasvapitoisuuden
todettiin suojaavan virusta.

Bidawid ym,
2000

Virusten inaktivaatio (log10)

Ksittely

HAV

Keittminen
Korkea hydrostaattinen paine

>4
>3

60C 30 min
Pastrointi

<2, >4
<2

Kuivaus
Pakastus
Kyminen
Peseminen, huuhtelu

<1
<1
Ei tietoja
Ei merkittv poistoa tai
inaktivaatiota

Koopmans M, Duizer E. 2004 Int. J of Food Microbiol, 90

Noroviruksen silyminen elintarvikkeissa

Norovirus silyi infektiivisen ainakin 10 piv

jkaapissa silytetyiss valmisruoissa, kuten
salaatissa ja kalkkunassa.
Lamhoujeb ym., 2008

Virustestaus elintarvikkeista
Nyte
Kovat
pinnat
Salaatit

Viruksen
konsentrointi

Nukl.happo- Geeniekstraktio monistus

- Pintojen
pyyhkiminen

- Useita

- Huuhtelu

vaihtoehtoja, perinteinen/

- RT-PCR

runsaasti

-Homogenisaatio
kehityst
Hedelmt -Presipitaatio
Pullotettu - Suodatus
vesi
-Ruoansulatuselimistn
Osterit,
preparointi
simpukat

Varmistus

realtime

Hybridisaatio
Sekvensointi

tapahtunut

Sama menetelm kaikilla

OSTERIT JA SIMPUKAT
VIRUSINFEKTIOIDEN LEVITTJIN

KIINASSA SAASTUNEET SIMPUKAT AIHEUTTIVAT 300 000 HEPATIITTI

A INFEKTIOTA.
YHDYSVALLOISSA YHDEN PYYNTIALUKSEN OSTERISAALIS
KAHDELTA PIVLT AIHEUTTI EPIDEMIOITA YMPRI MANTEREEN.
SYYN OLI YHDEN MIEHISTN JSENEN RIPULIN POISTAMINEN
MEREEN.
EUROOPASSA V. 2001 YHDEN OSTERITUOTTAJAN SAALIIT
AIHEUTTIVAT LUKUISIA EPIDEMIOITA ERI PUOLILLA EUROOPPAA,
MM. SUOMESSA.
VIRUKSET SILYVT OSTEREISSA INFEKTIOKYKYISIN AINAKIN
VIIKON.
OSTEREIDEN KYLMKULJETUS JA SILYTYS VIRUKSELLE EDUKSI

Enteeristen virusten
esiintyminen
ostereissa

Noro

Astro

Entero

Rota

J. Horsma

Le Guyader et al., Applied and Environmental Microbiology,

Aug. 2000, p. 32413248

Sdkset koliformien mrst

vedess (USA) tai ostereissa (EU)

David Lees, International Journal of Food Microbiology 59 (2000) 81116

Norovirusepidemioita
-pakastevadelmat (serbialaisia, mm. Kanada,
Ruotsi, Suomi, 1999)
-vadelmat (serbialaisia, Ruotsi, 2002). Virus lytyi mys
marjoista
-osterit (useat Euroopan maat mys Suomi, 2001)

Hepatiitti A epidemioita
-vadelmajtel (tuontivadelmat, Ruotsi, 1996)
-tuoreet mansikat (meksikolaisia, USA, 1999)
- simpukat (300 000 sairastui, Kiina)

Pakastemarjojen aiheuttama ripuliepidemia

- n. 100 koululaista sairastunut
- 9/10 tutkitusta ulostenytteest sislsi noroviruksia
- epidemiologinen linkki lounasateriaan
- jlkiruoaksi tarjotut marjat todennkisin lhde
- koti- ja ulkomaisia marjoja sekoitettu keskenn
- norovirus osoitettiin mys marjoista
-identtinen nukleiinihapposekvenssi
potilas- ja marjanytteist

Epidemioiden torjumiseen liittyvi suosituksia

Vuonna 2000 Elintarvikevirasto (nykyinen EVIRA) antoi

suurtalouksille kehoituksen kuumentaa ulkomaista
alkuper olevat pakastemarjat

vhintn 90C 2 minuutin ajan

Norovirusten prevalenssi
elintarvikkeissa?
Ensimmist kertaa julkaistua tietoa Belgiasta,
Kanadasta ja Ranskasta (Baert ym. 2011 AEM)

Vihannekset (leafy green): 28.2% (N=641)

Kanadassa

Marjat (soft fruit): 6.7% (N=150) Ranska

Jatkotutkimuksia tarvitaan