REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA PARA LA DETECCIN

DE SALMONELLA SP, EN LECHE EN POLVO: OPTIMIZACIN DEL

MTODO EN 12 HORAS

INTEGRANTES :
ORTIZ ACHAYA MADDY
OBREGON LOPEZ MARILYN
ROCA VIDAL CHRISTIAN
UGARTE ANA
QUINO MALENA
RAMOS MENDOZA MIRIAM

SALMONELLA
Patgenos primarios.
Reservorio:
Animales. Causan gastroenteritis
(formas sistmicas).
Hombre. Causan fiebres tifoparatficas

CLASIFICACIN
Familia Enterobacteriaceae.
Gnero Salmonella:
Salmonella enterica.
Salmonella bongori.

ESTRUCTURA ANTIGNICA
Antgeno O (LPS):
Mayores (de grupo).
Menores.
Antgeno H (flagelar).
Antgeno Vi (capsular).

GNERO SALMONELLA
SEROGRUPOS

Grupo B: 4 S. typhimurium
S. paratyphi B
Grupo D: 9 S. entertidis
S. typhi

Grupo C: 6 S. virchow
Grupo A: 2 S. parathyhi A

PATOGENIA
SALMONELAS GASTROENTRICAS

Puerta de entrada: va oral.

Invasin y multiplicacin (intestino
delgado).
Muerte celular y extensin a clulas
adyacentes/tejido linfoide.

SALMONELAS TIFO-PARATFICAS
Puerta de entrada: va oral.
Colonizan mucosa intestinal.
Invasin y multiplicacin. No causan lesiones
importantes.
Linfticos locales (placas de Peyer). Sangre.
Fagocitadas por macrfagos. Se localizan en
hgado, bazo, mdula sea. Vescula biliar, intestino.
Eliminacin: va fecal.

FACTORES DE VIRULENCIA
Fimbrias .
Sistemas de secrecin tipo III:

SPI-1: invasin.
SPI-2: supervivencia en interior
macrfago.
Cpsula (Ag Vi)

Evaden fagocitosis.
Dificulta el depsito de Complemento.
Enmascaran Ag O.
Lpido A, toxinas .
Supervivencia intracelular.

GNERO SALMONELLA
FACTORES PREDISPONENTES
Edad.
Gstrico:
Hipocloridia, trnsito rpido.
Intestinal:
Tratamiento antimicrobiano.
Diverticulosis, fstulas, estenosis.
Sistema inmunolgico:
Desnutricin, diabetes, neoplasias, SIDA.

METODO DE DIAGNOSTICO POR

PCR
El uso de biochips y de enzimas de restriccin,
entre otras, ha facilitado el diagnstico
microbiolgico molecular de patgenos en
alimentos.
El diagnstico de Salmonella sp., mediante la
evaluacin de la selectividad de los
oligonucletidos despus de una etapa previa de
enriquecimiento de la muestra, demostrando una
alta probabilidad de detectar un bajo nmero de
clulas
Con el concepto de selectividad se incluyen los

MATERIALES Y MTODOS
MICROORGANISMOS EMPLEADOS Y CONDICIONES
DE CRECIMIENTO

Las cepas de Salmonell

cultivadas en caldo cerebro corazn
A temperatura de 37C
DESARROLLO DE LA PCR
a amplificar el gen invA
efecto de la temperatura de hibridizadn de los
oligonucletidos
el anlisis estadstico de los resultados se realiz
mediante el programa Statgraphics Plus versin 5.1
un termociclador PTC-100

 Desnaturalizacin Inicial De 2' A 95C

Seguidos de 30 ciclos compuestos por V a 95X,
V a 59.9C
V a 7TQ
Extensin de 5'a72C
Bromuro de etidio a una concentracin final de 0.5 Mg/ mL
el ADN obtenidos de cultivos puros de Salmonella typhi,
Salmonella paratyphi y Salmonella typhimurium
Se realiza la tcnica de PCR (EXCLUSIVIDAD)
El lmite de deteccin fue determinado realizando diluciones
de ADN de Salmonella typhi. en cultivos puros en el rango
comprendido desde 1 ng hasta 1 f

 Contaminacin artificial de las muestras y determinacin del

lmite de deteccin

Contaminacin artificial de las muestras y determinacin del

lmite de deteccin

Extraccin de ADN de la leche en polvo contaminada

artificialmente

Reproducibilidad de la PCR

RESULTADOS DEL PCR

Desarrollo de la PCR
criterio de valoracin: O, no amplifica
1, presencia de bandas tenues
1, bandas intensas

En la Figura 1 se grafican
las medias mustrales de
la temperatura de
hibridizadn con intervalos
de confianza al 95%,
demostrando que a 59.9"C
se obtuvo la media ms
alta de amplificacin, cuyo
valor decrece conforme
disminuye la temperatura.

La Figura 2 indica que no

se present amplificacin
a 0.5 mM; la mayor media
de amplificacin fue a
2mM para luego ir
disminuyendo segn el
aumento en la
concentracin de cloruro
de magnesio.

EXTRACCIN DE ADN
Se adopt el mtodo de extraccin de ADN con fenol:
cloroformo:alcohol isoamlico
Selectividad de los oligonucletdos 139-141 y lmite de
deteccin de ADN en cultivos puros:
- En los ensayos de PCR para determinar el lmite de
deteccin del ADN a partir de cultivos puros, se logr
amplificar hasta 10 pg de ADN

Figura 3. Ensayo de
selectividad de los
oligonucletidos 139-141, en
gel de agarosa 2% tincionado
con bromuro de etidio. Lnea
1: Marcador de peso
molecular 100 pb DNA
Ladder. Lnea 2: S. typhi.
Lnea 3: S. paratyphi. Lnea 4:
S. typhimurium. Lnea 5: fC.
oxytoca. Lnea 6: K.
pneumoniae. Lnea 7: M.
morganii. Lnea 8: blanco.
Lnea 9: control negativo
(ADN humano). Lnea 10,

CONTAMINACIN ARTIFICIAL DE LAS MUESTRAS Y

DETERMINACIN DEL LMITE DE DETECCIN

La metodologa empleada es capaz

de detectar clulas de Salmonella
sp. cuando es inoculada con 2
UFC / mL. La Novobiocina (45 mg /
L) y verde brillante {10 mg/L),
adicionada a los tres frascos con
225 mL de agua peptonada, no
alteraron el crecimiento de
Salmonella sp.
La dilucin 1:10 en agua destilada
estril para diluir las protenas

DISCUSIN
La selectividad de los oligonudetidos 139- 141 Utilizados en
este trabajo ha sido objeto de estudio en varias investiga
dones.
Todas las cepas evaluadas fueron detectadas, excepto de S.
litchfield y S. Senftenberg, y por el contrario, ninguno de los
gneros diferentes a Salmonella fue identificado
Lograron la deteccin de Salmonella, mediante PCR, luego de
la extraccin del ADN por el mtodo de
fenol:cloroformo:alcohol isoamlico, y el uso de 1,5 mM de
MgCl^ y una temperatura de hibridado de 54^*^ en un total
de 96 horas (17), mientras que en nuestro estudio la
deteccin se hizo en slo 12 horas.

Con el fin de mejorar los procesos

de diagnstico molecular por la
tcnica de PCR, sta se ha
combinado con otros mtodos,
como la separacin
inmunomagntica utilizando
anticuerpos (20, 21) o sondas
fluorescentes (22) antes de cada
ensayo o mediante el
enriquecimiento selectivo con el

los beneficios al sector salud al lograr un diagnstico

rpido y preciso, la relacin costo-beneficio que otorga
al sector productivo, permitiendo la liberacin de
productos alimenticios al mercado con mayor rapidez y
el ahorro de costos, justifican la implementacin de esta
tcnica.

CONCLUSION
. En este estudio se encontr que no es posible
amplificar el gen InvA directamente de leche en
polvo y que un paso de pre enriquecimiento por
espacio de 6 horas es necesario, sin la adicin de
inhibidores de flora acompaante como
Novobiacina o verde brillante..
La aplicacin del diseo factorial incompleto 6X7
arroj como resultado que al emplear 59.9C de
temperatura de hibridizacin y 2 mM de cloruro de
magnesio, se establecen las mejores condiciones
para amplificar el gen InvA de Salmonella s

GNERO SALMONELLA
CONCLUSION

. La mayor contribucin de este estudio

fue el desarrollo de un protocolo que en
12 horas es capaz de detectar 2 UFC /
mL de Salmonella sp. a partirde leche
en polvo, agilizando marcadamente el
tiempo de recuperacin de un
microorganismo de importancia en
salud pblica y en el sector productivo