FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO ACADMICO
DE CIENCIAS BSICAS

GUA DE PRCTICAS
DE
MICROBIOLOGA

SEGUNDO AO
SEGUNDO SEMESTRE ACADMICO
2015 - II
LIMA - PER

Introduccin
El Manual de Prcticas de Microbiologa tiene como objetivo orientar a los alumnos a un mejor conocimiento y
aplicacin de los procedimientos de identificacin y aislamiento de la variada flora microbiana de importancia en
medicina humana. La microbiologa es una disciplina que estudia la biologa de los microorganismos capaces de
producir enfermedad.
Desde que se describiera por primera vez la morfologa de las bacterias (Leeuwenhoek .Siglo XVII), luego el
aislamiento y diagnstico de distintos microorganismos sobretodo en las dos ltimas dcadas del Siglo pasado en
la que se inicia la denominada poca dorada de la bacteriologa, esta ha evolucionado tremendamente.
Continuamente se describen procesos infecciosos as como situaciones nuevas en los pacientes motivando ello la
disponibilidad de informacin cientfica relacionada con la microbiologa clnica y la infectologa.
Los avances tecnolgicos con aumento de la automatizacin, el desarrollo de la biologa molecular, la qumica
de los cidos nucleicos, los avances en inmunologa clnica y los conocimientos de la patogenicidad microbiana
hacen necesario la revisin continua de los textos de microbiologa.
Tenemos el convencimiento que sta orientacin acadmica proporcionar a los alumnos de la Asignatura de
Microbiologa los recursos para prever el inicio del padecimiento, as como la base para la orientacin teraputica y
la prevencin de las enfermedades infecciosas.
Se da una relacin concisa de los mtodos de laboratorio empleados en el estudio de las bacterias, hongos,
rickettsias y virus. Con tal motivo sern expuestos conceptos y ejercicios fundamentales, con lo que esperamos
uniformar criterios acorde con la actualizada tecnologa.
Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodolgicamente a fin de facilitar la aplicacin de los conceptos
bsicos y as llegar al diagnstico de los diferentes procesos infecciosos en humanos.
El objetivo de estas prcticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las tcnicas ms comnmente
utilizadas en los laboratorios de Microbiologa y permitir la observacin experimental de los conceptos aprendidos
durante las clases tericas.
Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prcticas, no es una compilacin amplia del tema, sino
un Manual que contiene los requerimientos bsicos y orientacin, adecuando los recursos y procedimientos que
contribuirn a cimentar la formacin integral del mdico humano.
Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido los objetivos, utilizando los
elementos y procedimientos de diagnstico en el proceso enseanza aprendizaje.

Generalidades

El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difcil, debido al tamao que presentan, siendo
ste entre 1 y 6 micras. Para su observacin se requiere el empleo del microscopio de luz , el cual , no proporciona
el suficiente poder de resolucin que permite observar las diferentes estructuras de las bacterias lo que hace
necesario el uso del microscopio electrnico.
Para la observacin y estudio de las bacterias se utilizan diversos mtodos. El ms simple de ellos consiste en
la observacin en fresco, de esta manera se visualizan caractersticas someras que proporcionan una idea del
tamao, forma y en ciertas especies la movilidad; estos aspectos pueden mejorarse con el empleo del microscopio
de contraste de fase.
Otra tecnologa que permite observar con mayor claridad a las bacterias, lo constituyen los mtodos tintoriales ,
que facilitan el estudio de la forma , agrupamiento, y afinidad a diversos colorantes. Entre las tcnicas de mayor
utilidad destaca la tincin de Gram, la cual permite clasificar a las bacterias segn su afinidad tintorial en Gram
positivas y Gram negativas.
Existen grupos bacterianos que para su observacin requieren otras tcnicas como la de Ziehl-Neelsen, la cual
identifica a las bacterias cido-alcohol resistente. Algunas bacterias poseen ciertas estructuras importantes que
pueden ser evidenciadas mediante tcnicas de coloracin especial como por ejemplo, para observar cpsula,
esporas, flagelos.
Para realizar el diagnstico de hongos y virus existen tcnicas particulares, las mismas que sern descritas en
los captulos correspondientes.

Normas de Bioseguridad
Disposiciones Generales
En general en todo laboratorio deben seguirse normas que garanticen la calidad de las tcnicas y asimismo, la
seguridad en el trabajo. En el caso particular del Laboratorio de Microbiologa donde se trabaja con materiales
susceptibles de contaminacin accidental, se recomienda la adopcin rigurosa de normas de seguridad e higiene a
fin de evitar el riesgo de infeccin de las personas que en l laboran.
Con tal motivo, en el Laboratorio de Microbiologa se consideran cuatro niveles de seguridad biolgica, segn los
microorganismos con los que se trabaja :
Nivel 1 :Microorganismos no patgenos y patgenos oportunistas
Nivel 2 :Microorganismos o muestras con un potencial de riesgo moderado
Nivel 3 :Microorganismos y muestras de alto riesgo; los trabajos se realizan en cabinas de seguridad , nunca
en las mesas.
Nivel 4 :Microorganismos de altsimo riesgo , solo se hacen en laboratorios de experimentacin y no en
laboratorios de microbiologa clnica . Se requiere este nivel cuando se maneja microorganismos de riesgo,
especialmente virus, tambin con algunas bacterias y hongos.
De toda forma durante las prcticas se deben cumplir las siguientes recomendaciones :
1. No ser permitido ingresar a la Sala de Prcticas sin el respectivo mandil. Como medida de precaucin no dejar
sobre las mesas de trabajo prendas de vestir o cualquier otro objeto diferente al material asignado para el ejercicio.
2. Observar en todo momento las medidas de asepsia con el material de trabajo. Los profesores de cada grupo les
indicarn la metodologa a seguir.
3. Est prohibido comer, beber y/o fumar durante las clases prcticas, as como llevarse los dedos, el lpiz o
cualquier otro objeto a las proximidades de la boca y ojos.
4. La evaluacin de los alumnos de las asignaturas correspondientes al Departamento de Ciencias Bsicas se
regir segn el Reglamento de Evaluacin de Estudiantes de Pregrado, Perodo Lectivo 2014.
5. Por razones de seguridad, ningn material de prcticas saldr de la sala de trabajo. En caso que se rompa
algn material de vidrio con cultivo bacteriano, avisar de inmediato al profesor para que disponga la inmediata
desinfeccin y limpieza.
6. Uno de los instrumentos de trabajo, el asa o mango de Kolle , terminado el ejercicio programado deber ser
esterilizado mediante flameado , de acuerdo con las instrucciones dadas por el profesor.
7. Todo material de trabajo como son: lminas portaobjetos, laminillas o pipetas, debern ser depositadas en los
bocales de vidrio con solucin desinfectante, los que estarn a la vista en cada mesa. Si fuera material de desecho,
como restos de algodn ,papel, etc. , depositarlos en los recipientes para la basura, nunca en la mesa de trabajo o
en el suelo .Los tubos, placas de Petri o frascos de cultivo se dejarn en canastillas o depsitos destinados para
ser esterilizados.
8. Los profesores estarn en todo momento atentos para orientar y/o resolver cualquier duda que se presente en el
desarrollo de las prcticas.
9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prcticas, el que deber ser estudiado con
anterioridad a cada ejercicio, de forma tal que tenga conocimiento previo de los ejercicios que se van a presentar.

Material y Equipo bsico en las prcticas de Microbiologa

En el campo de la microbiologa mdica se requieren de conocimientos bsicos, indispensables para facilitar el
estudio de los diferentes microorganismos; por tal motivo es necesario que el alumno se familiarice desde el
principio con el material y equipos empleados en el aislamiento e identificacin de los microorganismos
(bacterias, hongos y virus) . Ellos deben ser debidamente preparados y posteriormente esterilizados para asegurar
que los ejercicios renan los requisitos exigidos para el trabajo microbiolgico. A continuacin se describen algunos
de ellos:
Asa y aguja de siembra : Muy usada en la prctica microbiolgica, hecha de alambre de platino o de otro material
, se inserta en un mango que facilita su manejo. El alambre puede ser recto o terminar en forma de pequeo anillo.
Autoclave : Aparato para esterilizacin por vapor bajo presin , provisto de manmetro y una llave que regula la
presin y la temperatura a la que desea esterilizar.
Cabina de Flujo laminar : Equipo que proporciona rea estril , para los trabajos microbiolgicos, en especial en
cultivos , evitando la interferencia de los microorganismos de contaminacin ambiental.
Centrfuga : Aparato diseado para acelerar la separacin de partculas slidas suspendidas en lquidos.
Contador de colonias : Sirve para contar electrnicamente y de forma exacta las colonias de microorganismos.
Crioviales : Pequeos tubos cnicos de polipropileno resistentes a muy bajas temperatura (- 4C). Usados para
guardar muestras en la congeladora. Ejemplo: suero, cepas virales.
Estufa : Aparato de dimensiones diversas ,donde se incuban los cultivos, generalmente a 37C.
Filtros esterilizantes : Para dejar libre de contenido microbiano a productos en estado lquido, los que por su
naturaleza no pueden ser sometidos a la accin del calor en sus diferentes modalidades.
Gradilla : Soporte para tubos de ensayo.
Jarra de anaerobiosis : Instrumento til para el aislamiento de bacterias anaerobias ya que permite un cierre
hermtico no dejando ingresar oxgeno.
Lmina portaobjetos : Lmina de vidrio que se utiliza para preparar frotis bacterianos.
Matraces y balones : Recipientes volumtricos de gran utilidad para la preparacin y almacenamiento de
soluciones, colorantes ,reactivos ,medios de cultivo ,etc. Los balones se diferencian de los matraces por tener una
base esfrica con fondo plano. En ambos los cuellos terminan en un discreto reborde lo que les confiere
resistencia.
Mechero de Bunsen : Mechero de gas , en el que ste se mezcla con aire antes de producir la flama. Se utiliza
para esterilizar el asa de siembra.
Medios de cultivo : Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos .En su composicin
se incluye un nmero balanceado de nutrientes y un determinado volumen de agua. De acuerdo con su
consistencia pueden ser lquidos, semislidos y slidos. Se presentan en forma deshidratada.
Microscopio : Instrumento ptico utilizado para la observacin de microorganismos que no son visibles a simple
vista.
Pipetas : Son tubos cilndricos de diversos materiales, pueden ser graduadas y sirven para medir volumen
conocido de lquido. Otras no son graduadas y se utilizan para la transferencia de lquidos.

 Pipetas Pasteur : Varillas de vidrio de 4 mm de dimetro y de 20 a30 cm de longitud. Se les emplea para la toma
de pequeos inculos de siembra.
Pipeteadores automticos : Pipetas que absorben de forma automtica sin necesidad de uno aspirar, pequeos
volmenes (1l a 1 000 l ) de muestras.
Placa de Petri : recipiente de vidrio o plstico que , en general se usa para contener medio de cultivo y
proporciona una suficiente rea para el crecimiento bacteriano.

Autoclave

Cabina de Flujo laminar

PRCTICA N 1
OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS CLNICAS
OBJETIVOS
Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de bioseguridad apropiadas.
Conocer las tcnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes muestras clnicas para su ptimo
procesamiento.
Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clnicas.
INTRODUCCIN
En trminos de la efectividad del Laboratorio de Microbiologa ,nada es ms importante que la apropiada seleccin ,
coleccin y transporte de las muestras clnicas. Estos procedimientos quedan inutilizados muchas veces por falta
de cuidado y mtodos defectuosos usados en la recoleccin y manejo de las muestras.
Independientemente del hecho que algunos tipos demuestras requieren metodologa de recoleccin muy
especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser tenidos en cuenta al coleccionar las
muestras clnicas:
La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.
Cuando se va a proceder a tomar un espcimen clnico, es importante evitar la contaminacin con
microorganismos saprofitos del rea. Esta flora normal puede interferir con la interpretacin del cultivo y
enmascarar la presencia del verdadero agente etiolgico de la enfermedad.
Seleccionar el lugar anatmico correcto de donde se obtendr el espcimen y utilizar la tcnica apropiada y los
instrumentos o elementos adecuados para su obtencin. Especialmente en el caso de investigar microorganismos
anaerobios.
Nunca refrigerar una muestra por anaerobios.
Coleccionar un apropiado volumen de la muestra.
Insuficiente material puede ser causa de resultados falsos negativos.
Junto con la muestra se debe enviar una solicitud de anlisis en la que debe figurar el nombre del paciente,
nmero de identificacin personal, procedencia, tipo de muestra, fecha y hora de coleccin, especificar regin
anatmica, diagnstico clnico, duracin de la enfermedad, terapia antibitica , prueba requerida e iniciales del
funcionario que tom la muestra.
El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de instruccin sobre los
procedimientos a realizar.
Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibiticos o agentes antimicrobianos. Si se han
administrado, informar de ello al laboratorio. A menudo un lquido cefalorraqudeo no revela patgenos bacterianos
en frotis ni cultivo, cuando se ha tomado un antibitico en las 24 horas anteriores.
Colocar la muestra en un recipiente estril y adecuado para su transporte como cajas, gradillas, bandejas,
llevando en la base papel absorbente embebido en desinfectante, con el fin de asegurar la sobrevivencia del
posible agente infeccioso, evitar derrame del espcimen y mantener medidas de bioseguridad apropiadas.
Ordenar siempre un frotis para tincin o coloracin de Gram, para los especmenes que procedan de cavidades
aspticas y anotar su inters en determinado microorganismo.

CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA

Hoja de solicitud de anlisis no llenada correctamente
Muestras sin rotular o inadecuadamente rotuladas
Muestras sin medios de transporte adecuado, en contenedores quebrados, rotos o
con derrames
Muestras secas o con contaminacin obvia
Muestras sin preservacin adecuada
Las muestras ms frecuentes en los estudios microbiolgicos son :
ORINA :
En las muestras de orina se pueden realizar diferentes anlisis como : examen microscpico de orina, urocultivo,
determinacin de algunos residuos de medicamento (doping) e investigacin de microorganismos especiales como
Leptospira. El xito de estos exmenes depender de la tcnica con que se tome la muestra y sobre todo del
tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y el anlisis, ya que el proceso de descomposicin que se sucede
en la orina por accin de las bacterias all presentes , modifica el parmetro de los componentes y muy
especialmente altera la carga microbiana.
Procedimiento para la toma de muestra de orina para urocultivo:
Lavarse las manos
Las pacientes mujeres deben realizar previamente el lavado de los genitales externos con agua y jabn y de
adelante hacia atrs, mientras que los hombres solo lo realizarn en el caso de solicitarse cultivos.
Secarse con un apsito estril
Las muestras deben colocarse en un frasco de boca ancha y tapa de rosca estriles, depositar
aproximadamente entre 30 y 40 ml de preferencia la primera muestra de la maana a travs del chorro medio
(miccionar una buena cantidad en el inodoro y luego en el envase).
En mujeres la miccin debe ser separando los labios mayores de la vulva.
En hombres se hace la retraccin del prepucio de manera que el chorro de orina salga directamente .
Tapar el frasco con precaucin ,evitando contaminar la muestra y/o derramarla.
En casos de nios pequeos utilizar bolsas colectoras adheridas a los genitales.
La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En caso de no ser posible refrigerarla no ms de 4
horas.
HECES :
Las muestras de heces se solicitan para examen bacteriolgico, virolgico, bioqumico y para la bsqueda de
parsitos.
Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas deben colectarse antes de la
administracin de cualquier antibitico.
Procedimiento
Muestra evacuada : La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco, teniendo cuidado de no miccionar
para que sta no se mezcle con orina.
Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodn estril , el cual se desenvuelve y se lubrica
antes de su uso, introducindolo en el medio de transporte , de preferencia Cary Blair, y luego se introduce en
el recto , unos 3 cm, mediante movimientos de rotacin.
El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el medio de transporte (Cary Blair o
Amies).

El frasco con la muestra o tubo con el medio de transporte se pueden conservar a temperatura ambiente hasta su
procesamiento o envo al laboratorio, no ms de 12 horas.
No se debe refrigerar la muestra.
HEMOCULTIVO:
La sangre de los individuos sanos es estril. Una presencia repentina de bacterias habitualmente es eliminada del
torrente circulatorio en un perodo de tiempo corto de minutos a horas, excepto cuando existe una infeccin masiva
o est presente un foco intravascular infectado. Bsicamente cuando las bacterias se multiplican a tasas que
exceden el sistema retculoendotelial para las, se habla de BACTERIEMIA. El trmino FUNGEMIA se utilizar para
designar la presencia de hogos en sangre.
Siempre que exista una razn para sospechar de una bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre o
hemocultivo.
Procedimiento
Los hemocultivos se obtendrn antes de iniciar la terapia antibitica, el incumplimiento de este punto puede dar
lugar a resultados falsamente negativos, pudiendo comprometer la vida del paciente.
Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la extraccin, dificultando la
interpretacin de los resultados. Adems algunos contaminantes actan como patgenos oportunistas , por lo
que se debe ser muy cuidadoso durante la extraccin.
La toma debe realizarse por venopuncin y para ello se debe hacerse :
Lavado de manos y utilizacin de guantes estriles
Limpiar con jabn lquido o alcohol el lugar de la puncin
Aplicar durante un minuto povidona yodada, dejar secar
Desinfectar los tapones de los frascos
Efectuar la extraccin
No airear los frascos
Nunca debe hacerse la extraccin a travs de catteres ,salvo en aquellas
circunstancias en que se indica especficamente
Cuando la extraccin se realice con adaptador ,se debe esterilizar o ser de un solo uso
MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES :
Ms del 70 % de procesos estn ocasionados por virus : rinovirus , coronavirus, adenovirus(3,4,7,14,21),
parainfluenza, virus de la gripe, virus coxsakie A y otros enterovirus, virus Epstein-Barr y virus herpes simple tipo I
Entre el 10 y 20 % de la faringitis agudas en nios de 5 a 10 aos, estn ocasionados por Streptoccoccus
pyogenes. Otras bacterias patgenas son :Streptococcus grupos C o G, Corynebacterium diphteriae, Neisseria
gonorrhoeae, Haemophilus influenzae .
Procedimiento
Las muestras de exudado faringoamigdalar se obtienen con la ayuda de un depresor lingual, tocando con la
torunda todas las partes con exudados, membranas o zonas de inflamacin. Se deben frotar las criptas
tonsilares y la faringe posterior.
No se requieren medidas especiales para su transporte y conservacin.
La toma de muestra de la epiglotitis ,debido al riesgo de complicaciones, se hace por un especialista en las
condiciones adecuadas.
Es recomendable realizar hemocultivos.

 MUESTRAS NASALES :
Procedimiento
La muestra se obtiene introduciendo una torunda para cultivo, previamente embebida en suero fisiolgico estril,
unos 2 cm en la nariz y girando suavemente contra la mucosa de la superficie nasal.
CATTERES :
El estudio bacteriolgico de los catteres , nos va a permitir en ocasiones conocer el agente causal de una
bacteriemia relacionada con el catter y prevenir que aparezca dicha bacteriemia. Para valorar su importancia
podemos decir que de una u otra forma el 82 % de las bacteriemias nosocomiales se relacionan con la presencia
de catteres.
Vas de infeccin : a. Piel y catter : en los catteres perifricos y de corta duracin
b. Endoluminal : en las vas centrales tunelizadas.
Procedimiento
Desinfectar con alcohol al 70 % una zona de la piel de unos 10 cm correspondientes a la zona de entrada del
catter
Retirar el catter con la mxima asepsia, con la ayuda de pinzas y tijeras estriles, cortar los 5 cm distales del
catter que corresponde a la porcin intravascular.
Introducir el segmento del catter en un recipiente estril correctamente identificado
La muestra debe ser enviada al laboratorio en un perodo de tiempo menor de 30 minutos. Cuando no sea
posible deber ser guardada en refrigeracin a 4 C
LQUIDOS ESTRILES :
El fundamento es la bsqueda de agentes patgenos u oportunistas, que pueden estar presentes en los lquidos o
fluidos orgnicos .En este grupo incluimos lquidos producidos , ya sea de forma espontnea o bien provocada a
nivel de las serosas, en las que habitualmente no existen microorganismos y son presumiblemente estriles. Su
buen manejo presenta un triple inters por :
La trascendencia de esta patologa por su elevada morbilidad o mortalidad
Dificultad de diferenciar patgenos y oportunistas como consecuencia de cuidados teraputicos instaurados o
prtesis aplicadas previamente.
Posibilidad de contaminacin exgena, sea en la obtencin o en su manipulacin, siendo por ello muy
Importante extremar las medidas de asepsia, de recogida y procesamiento.
Muestras
Lquido asctico o peritoneal
Lquido articular o sinovial
Lquido pericrdico
Lquido pleural
Procedimiento
La obtencin de estos lquidos es un procedimiento mdico
La toma se realiza por puncin percutnea (toracocentesis, paracentesis, puncin pericrdica o puncin
articular)
Para el estudio bacteriano se requerir de 1 a 10 ml; para lquido de dilisis peritoneal se requerir de un
volumen superior a 100 ml.
Para evitar la coagulacin de algunos lquidos se utilizar heparina sin conservantes, ya que otros
anticoagulantes podran tener accin antibacteriana.
Los recipientes idneos son los viales de transporte para anaerobios
Los frascos de hemocultivo tambin son tiles para cultivar lquidos biolgicos
estriles. Si se sospecha de anaerobios colocar la muestra luego de ser extrada en un frasco para anaerobios.

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 LQUIDO CFALORRAQUIDEO (LCR)

La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central, que afecta a las leptomeninges y al lquido
cefalorraqudeo . Se trata de una urgencia mdica y requiere un diagnstico y tratamiento precoz. Su
morbimortalidad , en meningitis agudas bacterianas , se relaciona directamente con el retraso en el inicio de la
teraputica.
Los casos espordicos de meningitis agudas bacterianas , se relacionan directamente con el retraso en el inicio de
la teraputica, aparecen en edades extremas de la vida, ocurriendo el 75 % de los casos en menores de 1 ao.
Muestra
La toma de la muestra la realiza el mdico tratante o el patlogo clnico del laboratorio.
Se obtendr antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana , siempre que las condiciones lo permitan.
LCR se obtiene por puncin lumbar
Generalmente se obtendrn dos tubos, el primero se enviar para el estudio bioqumico, el segundo para el
estudio microbiolgico con el mayor volumen posible.
El tubo ms turbio se enviar a Microbiologa.
Se debe solicitar simultneamente hemocultivos, porque las meninges suelen ir acompaadas de un proceso
bacterimico
El volumen mnimo para el estudio bacteriolgico rutinario es 1 ml, aunque es preferible disponer de volmenes
superiores. Para hongos o micobacterias se necesitarn al menos 2 ml adicionales por cada uno de los
estudios, siendo deseable llegar a los 10 ml.
La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos agentes etiolgicos como
Streptococcus pneumoniae pueden lisarse rpidamente a partir de la primera hora de su recogida
Si no fuera posible se mantendr en estufa entre 35 a 37C y una parte se incubar en frasco de hemocultivo,
que se mantendr en idnticas condiciones.
Si no se dispone de estufa se mantendr a temperatura ambiente. Nunca se refrigerar pues se afectar la
viabilidad de Neisseria meningitidis y H. influenzae.
Procesamiento del lquido cefalorraqudeo
Centrifugar a 1 500 hasta 3 000 revoluciones durante 15 a 20 minutos. En caso de lquidos muy purulentos no
ser necesario centrifugar.
Recoger el sobrenadante con pipeta de Pasteur estril y conservarlo a 4C en refrigeracin.
Sembrar el sedimento con pipeta de Pasteur en : agar Sangre a 35 - 37C, atmsfera
de anhidrido carbnico (CO2) , agar Chocolate a 35 - 37C atmsfera de CO2 ,caldo Tioglicolato o caldo Infusin
Cerebro Corazn BHI a 35 - 37C por 72 horas.
Se realizarn tres extensiones para tincin : tincin de Gram, Azul de metileno, Wright.
EXTRACCIN DE SANGRE PERIFRICA :
1. Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesitar para ejecutar la obtencin de la muestra.
2. Lavarse las manos previamente a la extraccin de la sangre y si es preciso colocarse guantes.
3. El paciente deber sentarse cmodamente de manera que el brazo quede colocado paralelamente a la mesa
de trabajo , donde se realizar la extraccin de sangre.
4. Apoyar el brazo del paciente sobre un pequeo cojn bajo el codo. Con la palma de la mano hacia arriba.
5. Con la mano izquierda tirar del extremo de la ligadura, cruzndolo y a continuacin introducir este extremo por
debajo de la parte principal de la ligadura aproximadamente dos dedos por encima de la flexin del codo. sta
se deber ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar la vena , sin apretar tanto
que reduzca el paso de la sangre por las arterias.
6. Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas.
7. Con el dedo ndice de la mano izquierda palpar la vena en la que se introducir la aguja.
8. Desinfectar la zona de la piel donde se realizar la puncin con un pedazo de algodn embebido en alcohol
yodado.

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9. Tomar la jeringa con la mano derecha, colocar la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja.
10. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba, introducir la aguja en el centro de la vena sin
titubeos, de 1 a 1,5 cm aproximadamente.
11. Luego de extraer la sangre por puncin venosa, retirar la aguja de la jeringa y colocarla en un depsito de
metal ( para autoclavar o incinerar ); verter lentamente la sangre en un tubo o en el caldo de cultivo.

EVALUACIN
1. Por qu una muestra de lquido cefalorraqudeo no debe ser refrigerada , si no se enva de inmediato al
laboratorio?

2. Cules son los agentes etiolgicos de la meningitis aguda en neonatos, nios y adultos?

3. En qu casos se debe tomar una muestra de aspirado bronquial?

4. Cul es el volumen se sangre requerido para realizar un hemocultivo en un neonato, nio y en un adulto?,
cules son los agentes etiolgicos ms frecuentes de una septicemia en cada caso?

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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PRCTICA N 2
COLORACIONES BACTERIANAS SIMPLES
OBJETIVOS
Explicar la coloracin Azul de metileno.
Identificar la diferencia entre coloracin simple y coloracin diferencial
INTRODUCCIN
Debido al pequeo tamao de los microorganismos , se requiere de un microscopio ptico, ya sea de campo claro
(lo ms usado) o de campo oscuro, para hacer la descripcin morfolgica de estos. La observacin de los frotis
teidos es lo ms recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensin de los microorganismos sobre una
superficie transparente, en la cual se fijan y se tien los microorganismos.
Las coloraciones son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos
para retener (o no), determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante.
Estos colorantes pueden ser de distintos tipos:
Catinicos : sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien. Ejemplos:
Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
Aninicos : Con carga negativa, no penetran en el interior de la clula, de modo que no tien las clulas sino el
entorno. En este caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina.
Liposolubles: se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: Negro sudn.
Los colorantes aumentan el contraste combinndose qumicamente con el protoplasma microbiano y permiten
localizar estructuras especficas del microorganismo y diferenciarlos en su forma, tamao, agrupacin y afinidad a
ciertos colorantes .Las bacterias pueden presentar las siguientes formas esfricas (cocos), estos a su vez
disponerse encadenas (estreptococos) ,en pares (diplococos), o en racimos (estafilococos), sarcinas, en forma
alargadas cilndricas (bacilos) y espirales (espiroquetas y espirilos).
De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de
tinciones como son :
Simples: Utilizan un solo colorante. Las clulas presentan una composicin qumica diferente a la de su
entorno, de modo que ambos se comportan de forma distinta frente a un colorante . El colorante tie las
clulas como en el caso de : Azul de metileno, Safranina o no la tie : Nigrosina.
Diferenciales: Los diferentes tipos de clulas presentan distinta composicin qumica y por lo tanto reaccionan
de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar a los microorganismos en diferentes grupos,
segn su capacidad de tincin. Ejemplos: tincin de Gram y Ziehl-Neelsen, ambas utilizan ms de un colorante.
Selectivas: Distintas estructuras celulares tienen diferente composicin qumica de modo que se tien
selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplos: tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de
corpsculos metacromticos. Pueden utilizar uno o ms colorantes.

COLORACIN AZUL DE METILENO

Es una coloracin simple que permite observar presencia o ausencia de microorganismos y distinguir algunas
formas bacterianas : cocos, bacilos , espirilos.
Se utiliza el Azul de metileno, el cual se agrega sobre la extensin por un minuto , luego del cual se enjuaga ,se
deja secar a temperatura ambiente y se observa al microscopio con la lente de mayor aumento.

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MATERIALES
Guantes
Hisopos estriles
Bajalenguas
Lminas portaobjetos
Mechero de alcohol
Jeringa de 10cc
Algodn y alcohol yodado
Ligadura

METODOLOGA
HISOPADO FARNGEO
1. El profesor, con la colaboracin de un alumno, ensear a tomar una muestra de exudado farngeo. El
paciente ( en este caso el alumno), se sentar cmodamente frente al profesor ,el rea debe tener buena
iluminacin para que permita visualizar adecuadamente el sitio anatmico a examinar.
2. Indicar abrir la boca y con ayuda del bajalengua deprimir la lengua para favorecer que la faringe quede
expuesta, con un hisopo estril frotar firmemente la pared posterior de la faringe y las amgdalas,
particularmente en donde existan puntos blancos o reas que presenten signos de inflamacin o sangrado.
3. Cuando el paciente no tenga amgdalas, la muestra se obtendr del fondo de las fosas amigdalinas. Al retirar
el hisopo tener la precaucin de no hacer contacto con ninguna otra rea de la boca.
4. A partir de la muestra tomada, se realizar el aislamiento por el mtodo de aislamiento en estra en placa, se
utilizarn placas de agar sangre ,agar chocolate y agar manitol salado.
5. Antes de eliminar el hisopo , realizar una extensin para preparar un frotis, fijar la muestra y teir con una
tincin simple (Azul de metileno) para observar :
Morfologa de la bacteria
Agregacin o tipo de distribucin bacteriana.

RESULTADOS
Frotis de hisopado farngeo :
Hisopo

Lmina
portaobjetos

Aislamiento en estra

15

 Coloracin simple : Azul de Metileno

Cubrir el frotis con colorante Azul de metileno por un minuto
Lavar con agua corriente
Dejar secar a temperatura ambiente

1. Cubrir con Azul de

metileno

2. Lavar con
agua

Graficar lo observado al microscopio

16

EVALUACIN
1. Cules son las estructuras celulares o molculas que pueden ser observadas cuando se emplea la tincin
simple?.Ejemplos de dos (2) colorantes que podran utilizarse para realizar una tincin simple.

2. Grafique cada una de las formas bacterianas que se pueden observar al emplear la tincin simple.

3. Ejemplos de dos (2) colorantes que se podran utilizaren la realizacin de una tincin simple.

4. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple ?

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

17

PRCTICA N 3
COLORACIONES BACTERIANAS COMPUESTAS
COLORACIN DE GRAM
OBJETIVOS
Explicar el fundamento de la coloracin de Gram.
Ejecutar la tcnica de coloracin ms usada en bacteriologa : coloracin de Gram.
Establecer la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
INTRODUCCIN
Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en dos grupos taxonmicos : Gram
positivas y Gram negativas.
En esta tcnica se deben tener en cuenta tres aspectos fundamentales:
Las bacterias Gram positivas retienen firmemente el colorante inicial
Al aadir el mordiente se forma un complejo molecular de gran tamao
La penetracin est condicionada por la permeabilidad de la pared celular.
Los mecanismos antes mencionados se relacionan con la composicin qumica de la pared de las bacterias. Las
bacterias Gram positivas contienen una mayor cantidad de murena, cido teicoico, pocas protenas y algunas
contienen polisacridos.
Las bacterias Gram negativas poseen poca murena, una elevada cantidad de lpidos, protenas y polisacridos y
no contienen cido tecoico.
La murena en las bacterias Gram positivas impide que el complejo cristal violeta-yodo sea eliminado por el
decolorante alcoholacetona, ya que es insoluble en alcohol. El alto contenido de lpidos en la pared de las
bacterias Gram negativas ocasiona que el complejo cristal violeta yodo sea eliminado o disuelto por el
decolorante.
Al finalizar la coloracin las bacterias Gram positivas quedan teidas con el cristal violeta: morado y la bacterias
Gram negativas quedan teidas con el colorante de contraste : safranina : rojo.
MATERIALES
Cultivos en medio lquido de Escherichia coli y Staphylococcus sp.
Asa bacteriolgica
Equipos de coloracin para tincin de Gram
Mechero, portaobjetos y puentes para tincin
Microscopio
METODOLOGA
Preparar un frotis de cada uno de los cultivos de Escherichia coli y Staphylococcus sp
Preparacin del frotis para la tincin
Trabajar en un rea aproximadamente de 10cm de distancia de la llama del mechero( zona considerada
estril), flamear el asa, hasta el rojo vivo y dejarla enfriar por 30 segundos
Con un lpiz graso identificar cada una de las lminas portaobjetos donde se van a realizar las preparaciones.
Destapar el tubo con el cultivo, empleando para el propsito los dedos anular y meique , introducir el asa,
tomar una pequea muestra de cultivo.
Depositar el material en el centro de una lmina portaobjetos y extenderlo en un rea aproximadamente de 0,5
cm.
Cuando se trata de cultivos de medio slido , colocar una gota de agua destilada sobre la superficie ,descargar
la muestra y homogeneizar. Dejar que la preparacin seque espontneamente al aire libre.

18

 Fijar la preparacin pasndola rpidamente sobre la llama del mechero , evitando un calentamiento excesivo
para evitar que el material se carbonice.
.
Para la realizacin de un buen frotis se deben cumplir las siguientes condiciones :
Utilizar lminas limpias y en perfecto estado, libre de rayones y de manchas, deben ser previamente pasadas
por la llama del mechero para eliminar trazas de grasa y no se deben tocar con las yemas de los dedos .
Debe ser delgado, translcido y homogneo para que, durante el proceso de tincin, reciba en toda su
superficie el mismo tratamiento con las diferentes sustancias qumicas y se debe usar para la preparacin la
tcnica asptica.
Utilizar un mnimo de cultivo cuando es un medio slido.
Cuando se trabaja a partir de un medio lquido debe tomarse suficiente cantidad : una muestra con el asa de
siembra.
Tcnica de coloracin de Gram :
Cubrir las preparaciones con cristal violeta , durante un minuto, lavar ligeramente con agua.
Cubrir con lugol durante un minuto, lavar ligeramente con agua
Decolorar con la mezcla alcohol acetona , escurrir de 5 a 6 gotas y lavar con agua
Cubrir con safranina durante 30 segundos , lavar con agua y dejar secar.
Colocar sobre la coloracin una gota de aceite de inmersin .
Observar al microscopio con la lente de mayor aumento.

1. Cubrir con cristal

violeta
(1 minuto)

3. Cubrir con lugol

(1 minuto)

2. Lavar con
agua

4. Lavar con
agua

19

5. Decolorar con alcohol

acetona
(5 a 6 gotas)

7. Cubrir con safranina

(30 segundos)

6. Lavar con
agua

8. Lavar con
agua

Bacteria Gram
positiva

Bacteria Gram
negativa

20

RESULTADOS
Graficar lo observado al microscopio

EVALUACIN
1.Cules son las principales precauciones del manejo del microscopio ?

2. Por qu se debe utilizar el aceite de inmersin al realizar el estudio microscpico bacteriano ?

21

3. Factores que pueden afectar a una tincin.

4. Defina : Mordiente

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

22

PRCTICA N 4
MEDIOS DE CULTIVO
MTODOS DE SIEMBRA
OBJETIVOS
Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiolgico.
Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y funcin.
INTRODUCCIN
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, que crean las
condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Debido a que la diversidad metablica de los
microorganismos es muy amplia, la variedad de los medios de cultivo tambin lo es. La mayora de los medios de
cultivo se comercializan en forma de liofilizados , que es preciso rehidratar La preparacin de un medio de cultivo
se reduce a pesar la cantidad del medio y disolverlo en agua destilada ( libre de inhibidores de crecimiento),
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al
resto de los componentes previamente esterilizados en la autoclave.
CONDICIONES GENERALES
Presentar todos los elementos necesarios, en sus proporciones y/o cantidades necesarias.
pH adecuado
Condiciones osmticas adecuadas
Estril y preservado de cualquier contaminacin.
Medio fresco ya que se desecan y pierden humedad, concentrndose el resto de los componentes.
COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CUTIVO
Agua :destilada o desionizada
Agar : se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las
bacterias no son capaces de degradarlo.
Azcares : son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms empleados son : glucosa, lactosa y
sacarosa.
Extractos : son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales, obtenidos con agua y calor.
Ejemplo : extracto de carne , de levadura, de malta.
Peptonas : son protenas hidrolizadas ,se obtienen por digestin qumica o enzimtica de protenas animales o
vegetales.
Fluidos corporales : sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo, son aadidos a los
medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patgenos.
Sistemas amortiguadores : son sales que se aaden al medio para mantener el pH dentro del rango ptimo del
crecimiento bacteriano. Ejemplo : fosfatos bisdicos o bipotsicos.
Indicadores de pH : son indicadores cido-base que se aaden para detectar cambios de pH en el medio.
Agentes reductores : sustancias que se aaden al medio para crear condiciones que permitan el desarrollo de
los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ejemplo : cistena, tioglicolato.

23

CLASIFICACIN
Por su consistencia
Medio de cultivo lquido: caldo Nutritivo, caldo Selenito, caldo Peptonado
Medio de cultivo semislido: agar Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM), agar Movilidad, Indol y Ornitina (MIO)
Medio de cultivo slido: agar Sangre, agar Mac Conkey, agar Manitol salado.
Por su funcin o fines especiales
Medios nutritivos (simples): con nutrientes mnimos para que las bacterias poco exigentes desarrollen .
Ejemplo: caldo y agar Nutritivo.
Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se aaden ciertos productos a manera de
suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de crecimiento. Ejemplo: agar Sangre, agar Chocolate.
Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que por su composicin qumica favorecen o permiten la
multiplicacin de unos microorganismos, inhibiendo parcialmente la de otros. Ejemplo: caldo Selenito, caldo
Peptonado alcalino.
Medios selectivos: permiten el crecimiento slo de la especie que se desea aislar, para lo cual se les agrega
colorantes bacteriostticos: Azul de metileno, Verde malaquita, Verde brillante. Ejemplos: agar Mac Conkey,
agar Salmonella - Shigella (SS), agar Manitol salado.
Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que permiten detectar las
reacciones bioqumicas especficas de los microorganismos. Ejemplo: agar Triple azcar (TSI), agar rea,
agar Citrato de Simmons.
Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el traslado al laboratorio.
Ejemplo: caldo Hafna, Cary Blair, Stuard.

MATERIALES
Caldo nutritivo : en matraz y tubos
Agar nutritivo en matraz ,placas y tubos
Agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella, agar Manitol salado, agar Chocolate, agar Triple azcar (TSI),
agar rea, agar Citrato de Simmons, agar SIM.

24

METODOLOGA
Observar y diferenciar los medios de cultivo proporcionados en la prctica.

Medios Simples:

Medios Selectivos:

25

 Medios diferenciales :

EVALUACIN
1. Qu precauciones se deben tener antes de sembrar en medios para anaerobios?

26

2. Qu medios de cultivo se utilizan cuando se sospecha de ? :

Vibrio cholerae:
Clostridium botulinum:
Brucella spp:
Campylobacter jejuni:

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

27

MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO

OBJETIVOS
Conocer y realizar las diferentes tcnicas de siembra y aislamiento bacteriano.
Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro.
INTRODUCCIN
En Microbiologa se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de
microorganismos (inculo), de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay
que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los
profesores de prctica. La principal advertencia consiste en trabajar siempre prximos a la llama del mechero que ,
debido a las corrientes de conveccin verticales que genera es capaz de crear un ambiente estril en la zona
inmediatamente alrededor y debajo de la llama.
Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el nmero de clulas bacterianas (inculo) sea
transferido (inoculado) a un medio de cultivo estril. Al querer aislar una especie en particular a partir de una
mezcla de microorganismos deben emplearse tcnicas de aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura.
Esto implica la utilizacin de medios tanto simples como especiales , mayormente slidos de acuerdo a la
naturaleza del microorganismo.
Las tcnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas :
Por siembra : es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo con un medio de cultivo,
para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin , pueda desarrollar y multiplicarse in vitro.
La finalidad es el aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra problema (orina,
heces, secreciones, agua servida).
La siembra puede ser :
Por inoculacin
Por estras simples
Por dispersin o agotamiento
Por puntura
Por diluciones sucesivas : consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inculo, sta se utiliza
cuando se tienen muestras lquidas ( orina, agua) , se realiza haciendo diluciones a las muestras : 1 :100,
000, 1:10 000 etc. Luego se siembra cada dilucin en placas de Petri con medios de cultivo.
Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscpico : morfologa de las colonias,
actividades bioqumicas o caractersticas inmunolgicas de los microorganismos aislados.

1:1

28

Tomado de Microbiologa Tomo II de Granados 2 edicin

Tcnica de siembra por diluciones sucesivas

MATERIALES
Asa de siembra en aro y en punta
Tubos de vidrio de 16 x150mm
Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano :Staphylococcus aureus y Escherichia coli
Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado
Tubos con caldo y agar Nutritivo
Suero fisiolgico estril
Mechero de Bunsen
METODOLOGA
Manejo del asa bacteriolgica o de siembra :
El profesor demostrar el manejo adecuado del asa y explicar las precauciones que se deben tener en la toma de
la muestra:
Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a los microorganismos
Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo lquido, ya que en este lugar se encuentra una mayor concentracin
de microorganismos.
Observar que al retirar el asa del tubo est cubierta por una pelcula lquida.

29

El asa de siembra se
toma del
mango como si fuera un
lpiz

El tapn del tubo se toma

con el dedo meique
de la mano derecha

La boca del tubo se

flamea despus de abrirlo
y antes de cerrarlo

Mtodo de siembra por agotamiento : aislamiento a partir de un cultivo mixto

Con un lpiz graso marcar las lneas por detrs de la placa que contiene el agar , como est indicado en la
figura N 1, por lo que quedarn tres sectores : el sector uno (1) el ms pequeo de los otros dos , servir para
descargar el asa.
Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio lquido , cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla.
Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar trazando una serie de
lneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno (1) . Esto mismo se puede hacer colocando la
placa de Petri sobre la mesa y con la palma de la mano , hacer un movimiento rpido para levantar el fondo
que contiene el medio de cultivo, como lo indicar el profesor.
Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados , hasta que el sector uno (1) quede a la izquierda y el
sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar el inculo, trazar un zigzag un poco ms abierto en el sector dos
(2), invadiendo el sector uno (1) en las primeras lneas del zigzag , pero no en las ltimas.
Girar nuevamente la placa 90 grados , ahora el sector dos (2) estar a la izquierda y el sector tres (3) hacia la
derecha.
Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2) . Este paso puede repetirse
sembrando un cuarto sector.
Incubar las placas a 37 C durante 24 horas. Las placas ya sembradas debern colocarse con la tapa hacia
abajo y la parte que contiene el agar sembrado hacia arriba.

Figura N 1

2
3

Figura N 2

30

 Mtodo de siembra en caldo de cultivo

Coger el asa de siembra en aro , esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar por unos segundos.
Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la ayuda del asa de siembra coger una
colonia bien aislada (figura N 1) .
Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura N 2), coger la torunda, que est dentro de este con el
dedo meique de la mano con que se est cogiendo el asa de siembra con la colonia
Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda la colonia del asa de
siembra.
Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y homogeneizar bien el caldo.
Llevar a incubar a 37 C por 12 horas.

Figura N1
Figura N2

Transcurrido el tiempo de incubacin, observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo lquido y slido
Medio lquido: la turbidez indica desarrollo
Medio slido : presencia de colonias
RESULTADOS
Realizar la lectura, observar y graficar los resultados.
Staphylococcus aureus

Agar Nutritivo

Agar Sangre

Agar Manitol
Salado

31

 Escherichia coli

Agar Nutritivo

Agar Sangre

Agar Mac
Conkey

EVALUACIN
1. Por qu el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano? Qu sustancia se le puede
agregar para hacerlo enriquecido para bacterias Gram positivas?

2. Cul es la importancia de un cultivo puro?

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

32

PRCTICA N5
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS
Entender el fundamento del antibiograma ,el modo en que se realiza y las principales fuentes de error.
Conocer los principales mtodos de susceptibilidad a un antimicrobiano.
Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria de crecimiento rpido aislada en
prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el de difusin en agar o de Kirby-Bauer.
INTRODUCCIN
La actividad de los antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos) debe ser evaluada in vitro para obtener la
informacin que permitir decir si un microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto.
Los antimicrobianos actan produciendo toxicidad selectiva , no actan directamente sobre el husped, sino que se
combinan qumicamente con determinados sistemas de los microorganismos ,enfocando as la accin sobre los
microorganismos ms que sobre el husped.
La determinacin de la mnima concentracin inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis mnima necesaria del
quimioterpico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite hacer estudios de uso clnico y detectar
mutantes resistentes.
Dos son los procedimientos empleados para conocer sta informacin, el mtodo del tubo dilucin y el del disco
difusin en agar, a ste ltimo se le denomina : antibiograma.
Accin de los antibiticos
La actividad antimicrobiana in vitro determina:
a. La potencia de un agente antibacteriano en solucin
b. Su concentracin en los lquidos del cuerpo o en los tejidos
c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del medicamento.
Inhibicin de sntesis de pared celular: Penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina, Vancomicina, Novobiocina.
Alteracin de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B, Colistina, Nistatina,Polimixina.
Inhibicin de la sntesis proteica :Aminoglucsidos ( Kanamicina, Amikacina ,Estreptomicina ), Tetraciclinas,
Cloramfenicol, Macrlidos ( Eritromicina), Lincomicinas.
Inhibicin de sntesis de cidos nucleicos : cido Nalidxico, Novobiocina, Sulfonamidas, Trimetropin,
Rifampicina.
Medicin de la actividad antimicrobiana
Esta se determina mediante los mtodos de dilucin o difusin, utilizando un microorganismo standard y una
cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utilizan las pruebas de dilucin en tubos y el mtodo de difusin.
Prueba de dilucin
En ste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios lquidos, se inoculan despus
con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la cantidad de sustancias antimicrobiana
es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las bacterias en prueba.
Mtodo de difusin
Preparacin del inculo
La tcnica del antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello previamente se
proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa.
Cultivar la bacteria aislada en un tubo con medio lquido apropiado (caldo Nutritivo, Infusin cerebro corazn) o
preparar una suspensin directa a partir del cultivo en placa usando el siguiente mtodo:
a. Tomar una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solucin salina frotando en la pared del tubo.

33

b. Homogeneizar bien y ajustar la densidad ptica con un patrn de turbidez N 0,5 de Mac Farland : 0,5 ml de
cloruro de bario 0,048 M a 99,5 ml de cido sulfrico 0,36 N 0,18 M. Esto equivale a 108 clulas/ml .Diluir si es
necesario la suspensin o aadir ms inculo.
c. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez, sumergir una torunda estril en la suspensin, rotar
la torunda estril varias veces. Presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del
lquido, para remover el exceso de inculo.
d. Inocular la superficie seca de la placa con agar Meller Hinton estriando con una torunda en tres direcciones
mediante rotacin de la placa, para asegurar una distribucin uniforme del inculo, dejar secar la placa a
temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.
e. Colocar los discos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estril (o con un aplicador automtico)
presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo son la superficie del agar.
Distribuir los discos uniformemente de modo que estn a una distancia de 15 mm del borde de la placa y a 25 mm
uno del otro (el dimetro de los discos segn las normas de la Organizacin Mundial de la Salud debe ser de 6
mm), no deben colocarse ms de 6 discos en una placa.
La dificultad de ste mtodo est en las diferentes velocidades de crecimiento para los diversos microorganismos.
El uso de un disco para cada antibitico estandarizado , permite dar el informe de S(sensible), I (intermedio) y R
(resistente)
Factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro :
El pH del medio, ya que algunos antibiticos son ms activos a pH cido (Nitrofurantona), otros a pH alcalino
(Aminoglucsidos , Sulfonamidas)
Los componentes del medio, en este caso las protenas sricas fijan a las penicilinas desde 40 % para la
Meticilina y 98 % para la Dicloxacilina.
Estabilidad de los medicamentos ,a la temperatura de la incubadora varios agentes antimicrobianos pierden su
actividad.
Cuanto ms grande sea el inculo bacteriano, ms baja ser la sensibilidad del microorganismo.
Cuanto ms tiempo se prolonga la incubacin, mayor es la oportunidad de presentarse las mutantes
resistentes , igualmente los microorganismos que crecen rpido y activamente son ms sensibles a la accin
de los antibacterianos que aquellos que se encuentran en fase de reposo.
Dilucin en tubo
Se obtiene un resultado cuantitativo , destacando dos caractersticas importantes :
Concentracin mnima inhibitoria (CMI) :es la concentracin mnima de antimicrobiano que inhibe el
crecimiento de un microorganismo.
Concentracin mnima bactericida (CMB) : es la concentracin que mata a los microorganismos.
Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infeccin, ya que los mecanismos inmunitarios se
encargan de eliminar al microorganismo.
MATERIALES
Caldo de cultivo con suspensin bacteriana a la escala de turbidez de N 0,5 de Mc Farland
Placas de Petri con agar Meller Hinton
Torundas estriles
Discos impregnados con diferentes antibiticos
Pinzas estriles.

34

METODOLOGA
Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana ,presionar firme sobre las paredes del tubo
y extender uniformemente en la superficie de la placa de agar Meller Hinton.
Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes antibitico sobre la superficie del agar.
Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos.
Incubar a 37C durante 24 horas.

Realizar la lectura, observar y anotar los resultados.

Lectura de los discos de sensibilidad
El dimetro de la zona de inhibicin se mide con una regla milimetrada, colocada debajo de la placa de Petri.
El lmite del rea de inhibicin est dado por la inhibicin completa del desarrollo, tal como se puede apreciar a
simple vista. Los milmetros de la lectura sern llevados a la tabla correspondiente para traducir su interpretacin
en los trminos : Sensible (S), Intermedio (I) , Resistente (R).

Tomado del Manual de laboratorio para la

identificacin y prueba de susceptibilidad a los
antimicrobianos de patgenos bacterianos de
importancia para la salud pblica en el mundo en
desarrollo. Organizacin Mundial de la Salud
2004.

35

Sensible

Resistente

Lectura de los halos de Inhibicin de los discos de sensibilidad

Quimioterpico
Ampicilina AM
Amikacina AK
Ac. Nalidxico AN
Cefalotina CF
Cefoxitina CTX
Ceftriaxona CRO
Cloramfenicol C
Kanamicina K
Nitrofurantona FD
Sulfatrimetoprim SXT
Ciprofloxacino CIP

Concentracin del
Disco mcg
10 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
300 ug
231,2 ug
5 ug

Halo de Inhibicin
Sensible Intermedio Resistente
+17
14-16
-13
+17
-15
+19
14-18
-13
+18
15-17
-14
+21
16-10
-15
+21
14-20
-13
+18
15-18
-14
+18
14-17
-13
+17
15-16
-14
+16
11-15
-10
+21
16-20
-15

Antibitico

Antibitico

36

EVALUACIN
1. Qu importancia clnica tiene el antibiograma?

2. Posibles causas de error (cuatro) en el procesamiento o lectura del antibiograma.

3. En qu casos es necesario realizar la concentracin mnima inhibitoria?

4. Defina : Halo

37

5. Defina : Inhibicin

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

38

PRCTICA N 6
DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS
OBJETIVOS
Reconocer las caractersticas morfolgicas y en los cultivos de las bacterias Gram
positivas
Identificar bioqumicamente las diferentes bacterias Gram positivas de importancia
clnica.
INTRODUCCIN
Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clnica con forma de cocos como
Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus , principalmente S. pneumoniae y cocos anaerobios :
Peptostreptococcus.
Entre los bacilos Gram positivos patgenos ms comunes tenemos Bacillus anthracis, Clostridium, Gardnerella,
Listeria ,Corynebacterium.
Todas esta bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres humanos y en algunos casos
estas se encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con bacterias de la flora normal. Por eso se hace
necesario para su aislamiento e identificacin realizar toma de muestras y procesamiento bacteriolgicos correctos.
Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de Streptococcus y los Staphylococcus son los
ms fciles de aislar e identificar mediante observacin de hemlisis, pruebas bioqumicas o diferenciales
especficas como la prueba de catalasa para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus , la prueba de
coagulasa para diferenciar Staphylococcus patgenos de los no patgenos, la reaccin de Quellung para distinguir
neumococos etc.
MATERIALES
Cultivos de Streptococcus pneumoniae en agar Sangre
Cultivo de Staphylococcus aureus en agar Manitol salado y agar Sangre
Tubos con plasma (1ml) y pipetas graduadas de 1 ml estriles
Reactivo de perxido de hidrgeno
Equipo para la coloracin de Gram
Lminas portaobjetos
Asas bacteriolgicas
Mecheros
Microscopios
METODOLOGA
Pruebas bioqumicas para Staphylococcus y Streptococcus
Observar el tipo de hemlisis que presentan las placas de agar Sangre
Realizar la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar Sangre y con una de Manitol salado.
La prueba de coagulasa se realiza en un tubo conteniendo cada uno, un (1) ml de plasma
Incubar durante 4 horas a 37 C
Preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en el agar Sangre y en agar Manitol salado.

39

Preparacin de Frotis :

1. Con el asa de siembra tomar una

colonia de la placa de Petri
2. Extender la muestra sobre la lmina
portaobjetos

3. Fijar el extendido con la llama del

mechero

METODOLOGA
La identificacin de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfologa de las colonias que se observan en
los cultivos primarios y en el tipo de hemlisis en agar Sangre. Sin embargo para evitar errores de interpretacin ,
se emplean pruebas bioqumicas como :

Prueba de Catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin de perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se
encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos excluyendo los
estreptococos.
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas : la
enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno , en agua y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para
diferenciar los gneros Micrococcus y Staphylococcus : catalasa positivo del gnero Streptococcus : catalasa
negativo.

40

negativo.

Con el asa de siembra se toma una colonia

del cultivo del microorganismo y se coloca
en la lmina

Perxido de
hidrgeno

Figura N1

Figura N 2

(+) BURBUJEO: Staphylococcus

(-) NO BURBUJEO: Streptococcus

Figura N 3

Tomado de Diagnstico Microbiolgico de Bailey y Scott 11 edicin

POSITIVO

NEGATIVO

Fermentacin del manitol

El agar Manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de Staphylococcus patgenos en
cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los Staphylococcus de desarrollar en presencia de Cloruro de
sodio (Na Cl) al 7,5 % y la de fermentar manitol, en este caso se observar la formacin de un halo amarillo en el
agar circundante a las colonias.

41

 Coagulacin del plasma

Staphylococcus aureus produce una protena llamada coagulasa , capaz de aglutinar el plasma tratado con
oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el suero.
Este factor srico reacciona con la coagulasa , activando el fibringeno y produciendo un cogulo o trombo de
fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la clula) y en forma libre. El estudio de la actividad
coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos (coagulasa nido),
tambin llamado factor de agregacin , la prueba en tubo se realiza colocando un ml de plasma al que se le
agrega una asada de un cultivo nocturno de S. aureus. Se incuba la mezcla a 37 C durante 4 horas y se considera
positivo ante cualquier grado de coagulacin.

(+) PRUEBA POSITIVA

Formacin de cogulo
Staphylococcus aureus

No se forma
cogulo
Cogulo
(-) PRUEBA NEGATIVA
No hay formacin de cogulo
Staphylococcus epidermidis

Tomado de Diagnstico Microbiolgico de Bailey y Scott 11 edicin

POSITIVO

NEGATIVO

42

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS

Streptococcus

Hemlisis

Fermentacin del
manitol

Prueba de catalasa

43

 Staphylococcus aureus

Fermentacin
del manitol

Prueba de
catalasa

Prueba de
coagulasa

Prueba de
catalasa

Prueba de
coagulasa

Staphylococcus epidermidis

Fermentacin
del manitol

44

EVALUACIN
1.Pruebas bioqumicas ( dos) que permitan diferenciar:
Streptococcus pneumoniae:
Streptococcus pyogenes:
Describir cada una de ellas.

2. Realizar un flujograma para la identificacin de bacteria Gram positivas

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

45

PRCTICA N 7
IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS
PSEUDOMONA
OBJETIVOS
Conocer los procedimientos de identificacin bioqumica de las principales bacteria Gram negativas.
Interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas y correlacionarlas con la diferentes especies de
bacterias Gram negativas.
INTRODUCCIN
Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los primeros los ms abundantes
tanto en el hombre como en los animales. Varios de estos microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal ,
algunos estn asociados a infecciones entricas y a procesos infecciosos (especialmente cuando stas bacterias
invaden otros rganos o sistemas).
Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un portador sano o de la diseminacin
endgena de la bacteria en una persona susceptible, pudindose ver afectado cualquier rgano del cuerpo.
Familia de bacilos entricos
Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos . Un gran nmero de
ensayos han sido desarrollados a manera de identificar rpidamente al patgeno, para que posteriormente el
mdico, con base en el reporte, indique el tratamiento adecuado o para que los epidemilogos puedan localizar la
fuente de infeccin. Dentro de los bacilos Gram negativos , las enterobacterias son responsables del 30 a 35 %
de todas las septicemias, ms del 70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones
intestinales.
Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiolgicos de infecciones entricas tenemos :
Salmonella ,Shigella, y Escherichia coli. Estas pueden producir cuadros diarreicos e infeccin sistmica , que son
procesos infecciosos que se diseminan generalmente por va sangunea o linftica.
Medios de aislamiento primario
Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el desarrollo de otras. Esta
capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul de metileno (EMB) y Mac Conkey) y alta (agar SalmonellaShigella, Desoxicolato y Citrato) o completamente especfica (Sulfato de bismuto y Verde brillante).
Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde el principio tener
colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa :
Salmonella, Shigella.
Medios diferenciales : Pruebas Bioqumicas
Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metablicas de los microorganismos frente a
diferentes sustratos. Existen medios que permiten observar una, dos o ms caractersticas metablicas de la
bacteria inoculada. Entre los ms utilizados estn :
Agar Triple Azcar (TSI): medio slido que contiene glucosa, sales de hierro
y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los carbohidratos. Se detecta la
produccin de sulfuro de hidrgeno (H2S), as como de gas. El tubo se siembra por picadura y en estra por lo que
se debe observar tanto el fondo como la superficie del medio
Agar Lisina Hierro (LIA) : medio slido que contiene lisina, sales de hierro, glucosa y un indicador de pH. Se
determina la descarboxilacin y desaminacin oxidativa de la lisina, la produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de
hidrgeno (H2S) y la fermentacin de glucosa. Se siembra por picadura y estra.

46

 Medio para Sulfuro , Indol y Movilidad (SIM) : medio semislido, se utiliza en la produccin de sulfuro de
hidrgeno, la formacin de Indol y movilidad. Se inocula con una nica puncin con asa de siembra recta a travs
del centro, hasta una profundidad de unos dos tercios del medio.
Agar Citrato de Simmons : medio slido que contiene citrato de sodio, compuesto que puede ser utilizado como
nica fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por picadura y estra
Agar rea (Mtodo de Christensen) : medio slido, se utiliza para determinar la capacidad de un organismo para
producir la enzima ureasa, que hidroliza la rea . La hidrlisis de la rea produce amonaco y anhdrido carbnico.
La formacin de amonaco alcaliniza el medio y el cambio de pH se detecta por el cambio de color del rojo fenol de
naranja plido a magenta.
Existen ms pruebas bioqumicas que pueden utilizarse como complemento a las ya descritas como son : rojo de
metilo, Voges Proskawer, utilizacin de malonato, las cuales ayudan a determinar la especie del microorganismo
aislado. En ocasiones a pesar de recurrir a diversas pruebas metablicas, no se consigue la identificacin , siendo
necesario realizar reacciones inmunolgicas para llegar al diagnstico definitivo.
BACTERIAS PIGENAS GRAM NEGATIVAS
Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clnica son las bacterias pigenas Gram
negativas, que pueden ser cocos o cocobacilos . Las enfermedades que producen por lo general incluyen la
acumulacin de abundantes cantidades de pus y afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio. Dichas
enfermedades comprenden : uretritis purulenta (gonococo) , meningitis ,neumonas , bronquitis, sinusitis, otitis
media, conjuntivitis, epiglotitis etc.
Las bacterias pigenas Gram negativas patgenas en humanos son :Neisseria, Haemophilus, Bordetella,
Moraxella.
Las bacterias del gnero Neisseria son diplococos Gram negativos inmviles, cuyos lados adyacentes son
aplanados y ligeramente cncavos. Slo dos especies de este gnero son patgenas exclusivamente de humanos
:Neisseria gonorroheae o gonococo, agente causal de la enfermedad de transmisin sexual, la gonorrea y la N
.meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que habitan principalmente el tracto
respiratorio superior.
Espordicamente se pueden comportar como patgenos oportunistas N. sicca y
N. mucosa.
El diagnstico definitivo de una infeccin gonoccica se hace por el aislamiento en cultivo de N. gonorrhoeae.
Para el diagnstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra depender de la edad, sexo y de las
caractersticas de la infeccin.
La tincin de Gram es el mtodo de eleccin para el examen directo de las muestras. Son oxidasa positiva.
Para los cultivos , el medio debe ser de preparacin reciente, bien hidratado y precalentados. Se utilizan medios
selectivos como agar Thayer Martin modificado. Se debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas cepas
pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los medios selectivos. Debe estar adems en una
atmsfera que contenga de 3 a 5 % de CO2.
El diagnstico de la infeccin meningoccica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a partir de lquido
cefalorraqudeo, sangre, lquido sinovial, pleural o pericrdico. Las ms utilizadas son las dos primeras.
Con la tincin de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen en los medios de cultivo
enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmsfera de CO2. Son oxidasa positivo y fermentan los
carbohidratos.
MATERIALES
Placas con agar Eosina azul de metileno sembradas con cepas problemas.
Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y Salmonella-Shigella
Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA , rea, SIM, sin sembrar y

47

sembrados con cepa problema

Asas de siembra
Reactivo de Kovacs
Lminas fijadas con frotis de lquido cefalorraqudeo con tincin de Gram.
Microscopio
Aceite de inmersin
Placas de cultivo con agar Chocolate.
METODOLOGA
Enterobacterias
En las prcticas se harn los trabajos de laboratorio que nos permitan observar las caractersticas de cultivo y
con ello su identificacin
A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamente esterilizada una muestra y
sembrar por estras en los medios Eosina azul de metileno y Salmonella Shigella. Incubar a 37C por 24
horas.
Transcurrido el tiempo de incubacin , observar la morfologa de las colonias de las placas sembradas (Mac
Conkey, EMB y S-S).
Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de Simmons, LIA y SIM. Esto se hace
por puntura en los medios y luego en estras en la parte de inclinacin(pico de flauta) como lo indicar el
profesor en cada medio. Llevar a incubar a 37C por 18 a 24 horas.
Hacer la lectura de las pruebas bioqumicas, interpretar y realizar la identificacin
del microorganismo proporcionado.

Interpretacin Bioqumica
Agar Triple Azcar (TSI):
Fermentacin de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a color amarillo. Es una reaccin dbil.
Fermentacin de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo,
principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reaccin de la glucosa.
Fermentacin de lactosa : en la superficie el medio vira a amarillo.
Debido a la fermentacin puede hacer produccin de gas, lo que se manifiesta por la presencia de burbujas en
el medio.
Produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de hidrgeno (H2S): por degradacin enzimtica de aminocidos que
contienen azufre originan un precipitado de color negro. La produccin de H2S tiene lugar en ambiente cido,
de ah que el precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de la
glucosa. As , un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya
enmascarado con el precipitado negro.
Agar Lisina Hierro(LIA) :
Descarboxilacin de lisina : el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente morado en la superficie.
Fermentacin de la glucosa : en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.
Desaminacin de la lisina : vira a color rojizo en la superficie del medio. Es caracterstico de Proteus y
Providencia.
Produccin de H2S :precipitado de color negro ( por el mecanismo citado anteriormente).
Agar Citrato de Simmons :
Utilizacin de citrato como fuente de carbono : el medio vira a color azul.
Agar rea:
Los microorganismos que hidrolizan la rea producen un cambio de color en el pico de flauta de naranja plido
a magenta.

48

Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) :

Motilidad: Los cultivos mviles muestran un crecimiento difuso o turbidez lejos de la lnea de inoculacin , por lo
que observando si el crecimiento est solo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se puede
determinar si el microorganismo es inmvil o mvil.
Indol : la aparicin transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y el
cultivo indica la presencia de indol y, por lo tanto ,la prueba se considera positiva. El indol es capaz de
reaccionar con el grupo aldehdo del reactivo originando un complejo de color rojo.
Produccin de H2S: precipitado de color negro ( por el mecanismo citado anteriormente).

Escherichia
coli

Klebsiella

49

Salmonella

Shigella

50

RESULTADOS
Realizar la lectura e identificacin de los microorganismos, observar y anotar los resultados.

Escherichia coli :

TSI

Citrato de
Simmons

LIA

SIM

rea

Klebsiella sp

TSI

LIA

Citrato de
Simmons

rea

SIM

51

 Proteus sp

TSI

Citrato de
Simmons

LIA

rea

SIM

Salmonella sp

TSI

LIA

Citrato de
Simmons

rea

SIM

52

 Shigella sp

TSI

LIA

Citrato de
Simmons

rea

SIM

53

PSEUDOMONA

Las especies pertenecientes al gnero Pseudomona son ubicuos, se encuentran en la tierra, materia orgnica
en descomposicin, en la vegetacin, en el agua. Tambin podemos encontrar estos microorganismos en el
ambiente hospitalario, en lugares hmedos, como comida, baos, respiradores. No forman parte de la flora normal
del ser humano con excepcin de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos.
Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su amplia distribucin
ambiental, siendo capaces de utilizar un gran nmero de compuestos orgnicos como fuentes de carbono y
nitrgeno.
Son bacilos Gram negativos mviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios estrictos, la mayora de las
cepas son mviles por medio de uno o ms flagelos polares; utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera
oxidativa; y suelen ser citocromo oxidasa positivos
El gnero Pseudomona se divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri, Grupo Alcalgenes y
Grupo con pigmento amarillo.
Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomona aeruginosa, Pseudomona fluorescens y
Pseudomona putida , las cuales se caracterizan por la produccin de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da
fluorescencia blanca a verde azulada bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga (400nm). Slo una especie,
Pseudomona aeruginosa , produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina.
Pseudomona aeruginosa produce un aspecto caracterstico cuando crece en una placa de agar sangre , se
pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemlisis. Las colonias tienen un aspecto de piel de
caimn y con brillo metlico.
La
exudacin de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la produccin de piocianina es caracterstico en las
heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un antibitico que puede permitir que la Pseudomona
aeruginosa exista en la naturaleza, tambin puede desempear un papel en la nutricin , al funcionar como una
forma de adquirir fosfatos inorgnicos.
Se puede realizar
una identificacin rpida de Pseudomona aeruginosa si se observan las siguientes caractersticas : morfologa
tpica de las colonias, produccin de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad en la prueba de oxidasa.

CARACTERSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE:

PRUEBA
PIOVERDINA
PIOCIANINA

Pseudomona
aeruginosa
+
+

Pseudomona
fluorescens
+
-

Pseudomona
putida
+
-

MATERIALES
Placas con agar Nutritivo sembrada con cepa problema.
Asas de siembra

54

Pseudomona
aeruginosa

piocianina

RESULTADOS

EVALUACIN
1. Cules son las principales enterobacterias causantes de cuadros diarreico?

55

2. Realizar un flujograma para la identificacin de bacterias Gram negativas.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

56

PRCTICA N 8
IDENTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM
COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN
BACTERIAS ANAEROBIAS
OBJETIVOS
Conocer los riesgo y precauciones durante el procesamiento de muestras con micobacterias.
Conocer el procesamiento de las muestra para el estudio de micobacterias.
Explicar el fundamento de la coloracin de Ziehl-Neelsen.
Ejecutar la tcnica de coloracin de Ziehl-Neelsen.
INTRODUCCIN
El gnero Mycobacterium est integrado por ms de 100 especies, presentan alto contenido de cidos miclicos
en su pared que retienen las anilinas utilizadas como colorantes: fucsina , auramina, aun despus de ser tratadas
con alcohol-cido de modo que todas las especies se presentan como cido-alcohol resistentes (BAAR).
El complejo Mycobacterium tuberculosis comprende varios agentes etiolgicos de tuberculosis M. tuberculosis , M.
africanum y M. canetti, los cuales son primariamente patgenos en el hombre.
M. tuberculosis y M. africanum son las especies de micobacterias ms importantes por ser altamente patgenas
para el hombre y muy transmisibles de persona a persona por aerosoles expulsados por la tos de pacientes con
lesin pulmonar.
La muestra ms examinada en la investigacin de Mycobacterium tuberculosis es la de esputo debido a que la
tuberculosis pulmonar es la ms frecuente, sin embargo dado que la enfermedad puede manifestarse en cualquier
rgano ,con menor frecuencia puede requerirse la investigacin de muestras como orina, lquido cefalorraqudeo,
lquido pleural, lquido asctico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias, las cuales deben procesarse tambin
para cultivo.
La muestra de esputo mucopurulenta proveniente del rbol bronquial que se obtiene despus de un esfuerzo de
tos, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos, debe tener un volumen aproximado
de 3 a 5 ml .Se recomienda analizar 2 3 muestras de cada sintomtico respiratorio. La primera muestra debe
obtenerse en el momento de la consulta y la segunda al da siguiente al despertar por la maana. Puede obtenerse
una tercera muestra al momento de entregar al laboratorio la segunda muestra. El envase debe ser de boca ancha
y con tapa de rosca.
Si la muestra de esputo no va a ser procesada el mismo da, se debe introducir cada envase en una bolsa de
polietileno y anudar la bolsa por encima de la tapa ,se conservarn en refrigeracin a 4 C, para impedir la
proliferacin de la flora secundaria, preferentemente dentro de una caja de plstico.
Para manipular las muestras y sobretodo los pasajes a otros medios de cultivo es importante hacerlos en la cabina
de seguridad.
Para que la baciloscopa sea positiva es preciso que la muestra contenga entre 5 000 y 10 000 bacilos por ml de
muestra.
Las micobacterias se multiplican con ms lentitud que otras bacterias patgenas para el hombre a causa de su
pared celular hidrfoba, que las hace agruparse e inhibe la permeabilidad celular a los nutrientes
El medio de cultivo ms conocido es el Lwenstein-Jensen. La temperatura ptima de crecimiento es de 37C. Los
cultivos se revisarn diariamente hasta un total de 60 das , pasados los cuales si no hay crecimiento se
considerarn negativos.
Lectura de los extendidos
Observar cada campo microscpico en superficie y profundidad , moviendo el tornillo micromtrico antes de
desplazarse al siguiente campo; seguir un recorrido en lneas rectas, para recorrer el extendido evitando repetir la

57

lectura de los campos ,ejemplo : de izquierda a derecha. El nmero mnimo de campos a examinar es de 100 , los
cuales pueden ser ledos por un microscopista experimentado en cinco .
Los bacilos se observarn como bastoncillo delgados , ligeramente curvos, rojo fucsia, destacndose claramente
contra en fondo azul. Pueden presentarse aislados, apareados o agrupados.
Escala semicuantitativa para los extendidos examinados por tincin Ziehl-Neelsen
Resultado del examen microscpico
1. No se encuentran BAAR en 100 campos observados
2. Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos observados
3. Se observan entre 10 y 99 BAAR en 100 campos
observados
4. Se observan de 1 a 10 BAAR en 50 campos observados
5. Se observan ms de 10 BAAR en 20 campos
observados

Informe
1. No se observan bacilos cido-alcohol
resistentes
2. N exacto de bacilos en 100 campos
3. Positivo (+)
4. Positivo (++)
5.Positivo (+++)

Tincin de Ziehl-Neelsen
La cido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su pared fucsina fenicada y
retenerla aun con la accin de los decolorantes como la mezcla de cido y alcohol . Esta caracterstica se debe al
alto contenido lipdico fundamentalmente fosfolpidos, ceras y cidos miclicos.
MATERIALES
Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos
Frotis fijos de Mycobacterium tuberculosis a partir de esputos
Tubos con medios de cultivo Lwestein- Jensen mostrando colonias de micobacterias
Equipo de coloracin para tincin de Ziehl-Neelsen
Mecheros
Lminas portaobjetos
Microscopios
METODOLOGA
Preparacin y fijacin del extendido
1. Ordenar las muestras
2. Numerar las lminas portaobjetos
3. Tomar la muestra y la lmina portaobjetos y colocarlas por detrs del mechero, de manera que la llama quede
entre el operador y el frasco
4. Destapar con cuidado el envase
5.Partir un aplicador en dos. Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y la otra con la mano derecha
entre el pulgar y el ndice y con los extremos irregulares seleccionar la partcula ms densa o purulenta de la
muestra
6. Colocar las partculas seleccionadas sobre la lmina portaobjetos y extenderla con
movimientos suaves . Dejar secar el extendido a temperatura ambiente
7. Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solucin de hipoclorito de
sodio al 1 %.
8. Cerrar el envase de la muestra
9. Cuando el extendido haya secado, pasarlo sobre la llama del mechero por tres (3) o
cuatro (4) veces para fijarlo.

58

Tincin de Ziehl-Neelsen
1. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada
2. Con la llama de un hisopo embebido de alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con
movimientos de vaivn, hasta observar que se desprenden los primeros vapores blancos
3. En el trmino de 5 minutos calentar tres veces hasta la emisin de vapores.
No dejar hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal.
4. Dejar enfriar y enjuagar con abundante agua
5. Cubrir todo el extendido con la solucin decolorante y dejar actuar por tres minutos. Enjuagar con abundante
agua
6. Cubrir todo el extendido con solucin de Azul de metileno, dejar actuar por un minuto
7. Enjuagar con abundante agua
8. Dejar secar al medio ambiente

1. Cubrir con fucsina bsica

fenicada

3. Enjuagar con
abundante agua

2. Calentar suavemente con ayuda del

hisopo (5 minutos)

4. Cubrir con solucin decolorante

(3 minutos)

59

5. Enjuagar con abundante

agua

6.Cubrir con Azul de metileno

(1 minuto)

7. Enjuagar con
abundante agua

bacilos cido-alcohol
resistentes

60

Medio de cultivo
Lwenstein-Jensen

Crecimiento de
Mycobacterium tuberculosis

RESULTADOS
Realizar la observacin microscpica de las lminas y graficar los resultados.

61

BACTERIAS ANAEROBIAS

Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infecciones que comprometen todos los rganos y
regiones anatmicas del cuerpo. Los abscesos ms profundos y las lesiones necrosantes que involucran
anaerobios son polimicrobianos y pueden incluir aerobios obligados, anaerobios facultativos, microaerfilos como
microorganismos acompaantes. Estos microorganismos, de forma conjunta con el trauma, la stasis vascular o la
necrosis tisular, reducen la tensin de oxgeno y el potencial de oxidorreduccin en los tejidos y proveen las
condiciones favorables para la multiplicacin de los anaerobios obligados.
En las ltimas dcadas , las infecciones anaerobias se han vuelto ms comunes, para lo cual existen dos probables
explicaciones : a) el aislamiento por parte del laboratorio de las bacterias anaerobias ha mejorado de modo que las
infecciones endgenas no son ms mal diagnosticadas o pasan inadvertidas , b) una proporcin mayor de
pacientes est recibiendo frmacos inmunosupresores por neoplasias u otras enfermedades , lo que deriva en la
resistencia del husped inmunodeprimido. Las infecciones anaerobias primarias se establecen fcilmente en reas
de tejido daado y la bacteriemia, diseminacin metastsica de las bacterias con formacin de abscesos distantes
y una cadena progresiva de eventos , pueden suceder a veces con un desenlace mortal. Es importante el
aislamiento e identificacin de las bacterias anaerobias debido a que estas se asocian a una elevada
morbimortalidad y a que el tratamiento vara segn la especie implicada.
Aislamiento de bacterias anaerobias
Seleccin de las muestras para el cultivo :
Debido a que los anaerobios residentes a menudo estn presentes en
grandes cantidades como flora normal en las superficies de las mucosas , incluso la contaminacin mnima de una
muestra puede dar resultados errneos. Todos los materiales recogidos de lugares que carecen de flora natural
como lquidos corporales que no sea orina, exudados de abscesos profundos, aspirados con aguja fina y biopsias
de tejidos pueden ser cultivados para bacterias anaerobias.
Recoleccin y transporte de las muestras:
Al tomar muestras de piel o mucosas, se debe se descontaminar la
superficie, para lo cual se debe utilizar jabn , alcohol etlico al 70 % y tintura de yodo por un minuto ( en crculos
concntricos comenzando por el centro), tambin se puede utilizar yodopovidona al 10 % , luego de lo cual se
espera al menos 2 minutos antes de la extraccin de la muestra . El material para el cultivo anaerobio se obtiene
mejor por biopsia de tejidos o por puncin y aspiracin . El empleo de hisopos no es una alternativa adecuada
debido a la exposicin excesiva de la muestra a los efectos de la desecacin , la posibilidad de contaminacin
durante la recoleccin y a que los microorganismos pueden quedar retenidos dentro de las fibras del hisopo. Si se
utiliza un hisopo, este debe provenir de un sistema de transporte exento de oxgeno.
Un factor crucial para la viabilidad de los cultivos anaerobios es el transporte de las muestras; el efecto letal
del oxgeno atmosfrico debe ser nulo hasta que la muestra pueda procesarse en el laboratorio. Ya no se acepta
tapar de nuevo una jeringa ni el transporte de la aguja y la jeringa al laboratorio debido a los problemas secundarios
a lesiones por puncin .Por lo tanto incluso los aspirados deben inocularse en el mismo tipo de tubo o frasco
ampolla libre de oxgeno. La muestra (pus, lquidos corporales u otro material lquido) se inocula a travs del tapn
de goma despus de extraer todo el aire de la jeringa y la aguja. Si slo se puede obtener una muestra con hisopo,
se requiere de un dispositivo especial para la recoleccin con una atmsfera libre de oxgeno. Cuando se reinserta
el hisopo, debe de tenerse cuidado de no inclinar el recipiente , lo que provocara la salida y el desplazamiento del
anhdrido carbnico o el nitrgeno libre de oxgeno al aire ambiental.
El tejido puede colocarse en una pequea cantidad de lquido para preservarlo de la desecacin y luego colocarlo
en una bolsa para anaerobiosis.
Todas las
muestras deben mantenerse a temperatura ambiente hasta su procesamiento en el laboratorio, dado a que la
refrigeracin puede oxigenar la muestra. Todas las muestras deben ser remitidas al laboratorio lo antes posible.

62

 Examen directo de los materiales clnicos:

El anlisis macroscpico de las muestras es importante para establecer
la presencia de anaerobios, datos orientadores sern el hallazgo de un olor ftido, el aspecto purulento de
muestras lquidas as como el hallazgo de tejido necrtico y gas.
En los portaobjetos preparados para la tincin de Gram, es ms til la fijacin con metanol que el calor; se deben
observar caractersticas celulares y el fondo del frotis y en la tincin de Gram , observar la forma, tamao,
disposicin de las bacterias y registrar el nmero de microorganismos presentes . Observar caractersticas
morfolgicas distintivas como : presencia de esporas, ramificaciones, filamentos con corpsculos esfricos, formas
granulares. La tincin de Gram permite determinar caractersticas celulares, las tinciones de Wright y Giemsa a
veces pueden revelar informacin adicional. Las tinciones de naranja de acridina son las ms tiles para detectar
bacterias en hemocultivos, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido articular y exudados.
Procesamiento de las muestras
Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de trabajo comn con incubacin en
jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cmara anaerobia.
Jarras para anaerobiosis : el sistema que ms se utiliza para crear una atmsfera anaerobia es la jarra para
anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plstica transparente ( disponible en el comercio) con una tapa que se
cierra para hacerla hermtica. Las condiciones de anaerobiosis pueden obtenerse mediante el uso de un sobre que
se adquiere en el comercio, generador de hidrgeno y CO2, que se activa con el agregado de agua o con la
humedad proveniente de las placas de agar. La anaerobiosis se alcanza luego de 1 a 2 horas.
Bolsas plsticas anaerobias : Es una bolsa de plstico transparente , de varios tamaos, con capacidad para
una a tres placas de Petri de 100 mm de dimetro, un generador de gas H2-CO2 que produce una atmsfera
cuando se le agrega agua, partculas de catalizador de paladio fro y resazurina como indicador. La bolsa se sella
con calor luego de la activacin del generador para permitir el mantenimiento de las condiciones anaerobias.
Incubacin de los cultivos
En la mayora de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37C, para el aislamiento primario de bacterias
anaerobias a partir de muestras clnicas. Las placas inoculadas en las mesas de trabajo y colocadas en las jarras
de anaerobiosis deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4 das para permitir que los
microorganismos de crecimiento lento formen colonias; algunos anaerobios como ciertas especies de Actinomyces
y Eubacterium, crecen ms lentamente y las colonias no pueden detectarse si las jarras se abren antes. Si las
jarras se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento lento pueden morir debido a la exposicin
de oxgeno. Debe evitarse la exposicin prolongada de las placas recin inoculadas al aire ambiental, ciertos
anaerobios encontrados en muestras clnicas como Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar
un retraso prolongado en el desarrollo cuando las placas recin inoculadas se mantienen en el aire ambiental.

63

CUADRO N1 : Incidencia de anaerobios como flora normal de los seres humanos

GNERO

Piel

Tracto
Respiratorio
Superior

Intestino

Genitales
externos

Uretra

Vagina

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Bacteroides
0
+/2
+/+/+/Prevotella
0
2
2
1
+/1
Porphyromonas
0
1
1
D
D
+/Fusobacterium
0
2
1
D
D
+/Veillonella
0
2
1
0
D
1
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Finegoldia magna
1
2
2
1
+/1
Micromonas
1
2
2
1
+/1
micros
Clostridium
+/+/2
+/+/+/Actinomices
0
1
1
0
0
+/Bifidobacterium
0
1
2
0
0
+/Eubacterium
0
1
2
D
D
1
Lactobacillus
0
1
1
0
+/2
Propionibacterium
2
1
+/+/+/1
D:Desconocido; 0: No se encuentra o raro; +/-: irregular; 1: por lo comn presente; 2 : Presente en grandes
cantidades

CUADRO N2: Muestras que no deben cultivarse en medios para anaerobios

HISOPADOS FARNGEOS O NASOFARNGEOS
Hisopados gingivales
Muestras broncoscpicas o esputo
Contenido gstrico, contenido de intestino delgado, heces, hisopados rectales,
fstulas colonocutneas
Superficies de lceras por decbito, hisopados de muestras de costras de
abscesos, revestimientos mucosos
Materiales adyacentes a la piel o las mucosas
Orina de miccin espontnea
Hisopados cervicales o vaginales

64

MATERIALES
Placas con agar Chocolate
Jarra anaerobia

RESULTADOS

EVALUACIN
1. Qu personas son ms susceptibles a la contaminacin con Mycobacterium tuberculosis?

2. Defina :Multidrogorresistente

65

3. En qu casos se hace necesario realizar una prueba de susceptibilidad antibitica a los pacientes con
tuberculosis?

4. Realizar un flujograma para la identificacin de bacterias anaerobias.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

66

PRCTICA N 9
CULTIVO DE MUESTRAS CLNICAS: UROCULTIVO Y COPROCULTIVO
OBJETIVOS
Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clnica.
Identificar los microorganismos ms frecuentes causantes de patologas clnicas.
Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra para cultivo de una
muestra clnica.
CULTIVO DE ORINA: UROCULTIVO
La infeccin del tracto urinario (ITU) , se define como la presencia y multiplicacin de microorganismos en el tracto
urinario con invasin de tejidos adyacentes. La presencia de leucocitos en la orina , indica una respuesta
inflamatoria del tracto urinario, la mayora de las veces debido a una invasin tisular por bacterias. Por lo general la
piuria, est presente en las ITU , por lo que se le considera un criterio diagnstico para sta enfermedad.
La mayora de las ITU son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias , siendo la Escherichia coli
y Klebsiella sp, los ms frecuentemente aislados , en infecciones no complicadas. Tambin pueden ser causa de
ITU otros bacilos Gram negativos como Proteus sp ,Enterobacter sp y Pseudomona aeruginosa sobretodo en
pacientes sometidos a instrumentacin, portadores de catteres urinarios, con anomalas anatmicas o funcionales
del tracto urinario y en pacientes hospitalizados.
Entre las bacterias Gram positivas pueden estar Staphylococcus epidermidis y Enterococcus sp. En la mayora de
las ITU , se recupera un nico microorganismo en la orina. La presencia de ms de una especie bacteriana puede
deberse a una contaminacin de la muestra o pacientes con infecciones complicadas como por ejemplo litiasis ,
abscesos renales o sondaje prolongado.
El diagnstico definitivo de la ITU se hace mediante el cultivo de orina : urocultivo . Hay que considerar que por
cuidadosa que sea la tcnica de toma de muestra ( salvo puncin suprapbica) ,es difcil excluir la contaminacin
de la orina con las bacterias del tramo distal de la uretra , lo que puede causar interpretaciones erradas.
La orina de miccin media es la ms recomendable para el urocultivo. En pacientes femeninas es recomendable el
lavado de genitales externos, en el paciente masculino retraer la piel del prepucio. La primera parte de la miccin
casi siempre ests contaminada con la flora bacteriana uretral, por lo cual se debe descartar . La miccin media
debe recogerse en un envase estril. Se recomienda obtener la primera muestra de orina de la maana , donde se
encuentra mayor nmero de bacterias.
El cultivo de orina se realizar para identificar y cuantificar el nmero de bacterias presentes por mililitro en la
orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias (UFC) . La muestra de orina debe enviarse el
laboratorio en el plazo mximo de 2 horas a temperatura ambiente, puesto que la orina es un buen medio de cultivo
para muchas bacterias y la multiplicacin de los grmenes entre el momento de la toma de muestra y el cultivo,
alterar los resultados.
Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo , se realice un examen microscpico
cuantitativo , para determinar el nmero de leucocitos por milmetro cbico.

MATERIALES
Frasco estril de 100 ml
Asa de siembra calibrada 0,01ml
Pipetas graduadas de 1ml estriles
Placas con agar Mac Conkey y Eosina azul de metileno

67

 Lminas portaobjetos , laminilla

Equipos de coloracin para tincin de Gram
Centrfuga y microscopio
METODOLOGA
Evitar la contaminacin de la muestra, utilizando equipos estriles: frascos, pipetas,
placas de Petri, tubos de pruebas estriles.
Examen directo:
Centrifugar aproximadamente 10 ml de orina por tres (3) minutos a 3 000 rpm y
luego decantar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio a lente de
40X
Cultivo
Rotular la placa
Con el asa de siembra calibrada : 0,01 ml, previa agitacin de la muestra , tomar una muestra con el asa y
sembrar por estras en agar Mac Conkey, previamente dividida en cuatro cuadrantes , empezando las
estras por el primer cuadrante y sin esterilizar el asa continuar la siembra en el segundo, tercer y cuarto
cuadrante.
Incubar 24 horas a 37 C.

RESULTADOS
Realizar la lectura de la placa y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas bioqumicas para la
diferenciacin.
Realizar el contaje de colonias para obtener el recuento total de UFC/ml.

68

Sedimento urinario

TSI

LIA

Agar Mac Conkey

Citrato de
Simmons

rea

SIM

CULTIVO DE HECES: COPROCULTIVO

La diarrea puede definirse como el proceso de eliminacin frecuente de heces, disminucin de su consistencia o
ambas cosas. El diagnstico etiolgico se realiza mediante el cultivo de los microorganismos presentes en la
materia fecal : Coprocultivo , realizndose primero el aislamiento y luego la identificacin de las bacteria presentes
en las heces.
Las bacterias causantes de diarreas ms frecuentes son :Salmonella, Shigella y Escherichia coli enteropatgena
.Tambin puede producirse cuadros diarreicos por : Campylobacter sp, Yersinia enterocoltica , Vibrio cholerae,
Staphylococcus aureus y Clostridium difficile.
Para realizar este procedimiento se requiere que la muestra se colecte en el curso de la enfermedad, antes de
iniciar tratamiento y que se deposite en un frasco estril, procurando no mezclarla con la orina. Si esto no es
posible es conveniente conservar la muestra en un medio de transporte adecuado manteniendo en refrigeracin
hasta su siembra.

69

Muestras inaceptables:
Muestras no conservadas de ms de 4 a 6 horas.
Muestras mltiples el mismo da
Muestras contaminadas con orina.
METODOLOGA
Examen Directo
El examen microscpico directo de las heces permite la observacin de polimorfonucleares, lo que sugiere la
infeccin de por un patgeno invasivo.
Examen en fresco y/o tincin de Azul de metileno de Loeffler.
Tincin de Gram : permite observar polimorfonucleares y flora predominante.
Inoculacin
El coprocultivo se realiza a partir de muestras recin emitidas de preferencia, de las cuales se inoculan los medios
de cultivo.
Medios diferenciales
Para diferenciar a los bacilos entricos fermentadores de lactosa (L+) de los no fermentadores de lactosa (L-), e
inhibir el crecimiento de la flora Gram positiva aerobia: agar Mac Conkey, agar Eosina azul de metileno, agar Endo.
Medios selectivos
Para inhibir el crecimiento de la mayora de las enterobacterias y permitir el crecimiento de Salmonella spp y
Shigella spp : agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y agar Salmonella Shigella (SS)
Medio de enriquecimiento
Utilizar caldo Selenito para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las horas iniciales de incubacin. Se
resiembran en medio slido a partir de las 6 horas. Este medio de cultivo es fundamental para el estudio de
portadores asintomticos.
Medios especiales
Vibrio spp : Medio de enriquecimiento: agua peptonada alcalina a partir de 6 horas , subcultivar en agar TiosulfatoCitrato-Bilis-Sucrosa (TCBS)
Medio selectivo :TCBS
Campylobacter : medio selectivo : medio CAMP

MATERIALES
Muestra de heces
Placas de Petri con agar SS, EMB
Tubos con caldo Selenito
Lminas portaobjetos y laminillas
Asas de siembra
Tubos con medios diferenciales o bioqumicos.
RESULTADOS
Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas , realizar las pruebas bioqumicas para
diferenciar las especies de enterobacterias.

70

TSI

LIA

Citrato de
Simmons

rea

SIM

CULTIVO DE SANGRE: HEMOCULTIVO

La deteccin de microorganismos viales en muestras de sangre tiene gran importancia diagnstica.
Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razn que supera la capacidad del sistema retculoendotelial del
torrente sanguneo , se produce bacteriemia y fungemia. Bacteriemia persistente o crnica ocurre cuando no se ha
podido localizar o drenar adecuadamente, el foco de la infeccin.
La entrada directa de bacteria al torrente sanguneo ocurre en infecciones intravasculares como : endocarditis,
fstulas arteriovenosas, aneurismas micticos, flebitis supurativas, catteres intravenosos infectados y arteriales
permanentes. Es importante comprender las circunstancias en que puede desarrollar una bacteriemia para
planificar los mtodos de diagnstico as como la interpretacin de los resultados. Las fuentes de bacteriemias son
: sistema genitourinario 25 %, sistema respiratorio 20 % ,abscesos 10%, heridas quirrgicas 5 % ,otros sitios
conocidos10 % y sitios desconocidos 25 %.

71

Siempre que exista una razn para sospechar de bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre, perifrica o
medular. Ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el diagnstico mediante este procedimiento. El
aislamiento de un microorganismo de los hemocultivos es transcendente porque establece el diagnstico etiolgico
de la bacteriemia y permite la eleccin del tratamiento.
Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis ,neumona , pielonefritis: en estos casos el hemocultivo debe considerarse
un procedimiento de urgencia.
Bacteriemia continua de origen intravascular como endocarditis, infecciones asociadas a catteres , de origen
desconocido, con sospecha de fungemia e inmunodeprimidos, la muestra se puede tomar en cualquier momento.
Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizar la prueba cuando el paciente presenta escalofros o poco despus o
durante del pico febril. Entre el 14 y 25 % de los pacientes hospitalizados, tienen sospecha de bacteriemia y en un
14 % de los casos esta prueba establece el diagnstico.
INDICACIONES
Fiebre alta aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con hipotermia y deterioro general,
shock no explicado, infecciones localizadas, leucopenia, leucocitosis o trombopenia no relacionada con
procesos hematolgicos .
Siempre se deben realizar en un mnimo de dos (2) horas.
Nunca debe refrigerarse antes de su envo , puede conservarse en estufa.
MATERIALES
Cultivos en medios Ruz -Castaeda
METODOLOGA
Se observarn los medios usados para hemocultivo.
RESULTADOS
Grafique lo observado en la prctica.

EXUDADOS VAGINALES (exocervicales)

La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal , cuyo crecimiento y consideracin son importantes para el
estudio microbiolgico de las infecciones vaginales. Se pueden considerar tres situaciones :
Conocer cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante
Bsqueda de agentes exgenos , trasmitidos normalmente por va sexual
Deteccin de portadoras de determinados microorganismos
La mayora de las situaciones clnicas que pueden ser objeto de estudios microbiolgicos para el aislamiento o
visualizacin del agente etiolgico son :
Vulvovaginitis : agentes etiolgicos ms frecuentes : Cndida spp , principalmente C. albicans , Trichomonas
vaginalis y virus Herpes simple.
La presencia de un cultivo puro de otros microorganismos observados en tincin de Gram con leucocitos , puede
tener significacin.
Vaginosis : desde el punto de vista microbiolgico se caracteriza por la ausencia o disminucin de la flora mixta
compuesta por Gardnerella vaginalis, anaerobios (Mobilluncus, Bacteroides, cocos anaerobios) y Mycoplasma
hominis.
Infeccin gonoccica : la endocervicitis gonoccica cursa con leucorrea , el exudado vaginal no es la muestra
adecuada para el diagnstico por lo que se recomienda la obtencin de exudado endocervical.

72

Tipos de estudios microbiolgicos

Cultivo bacteriano
Cultivo de levaduras
Despistaje de Streptococcus agalactiae
Cultivo de virus Herpes simple ya que requiere de toma de muestra y medio de transporte y cultivos especiales, se
realiza por peticin expresa del clnico.
Toma de muestra
No debe usarse antisptico previo a la toma de la muestra. Si se utiliza espculo, lubricar con agua caliente.
Se recomienda tomar dos (2) hisopados .
Se introduce un hisopo estril en la vagina y se recoge la muestra de la zona de mayor exudado o en su
defecto del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el hisopo en el medio de transporte.
El envo de la muestra al laboratorio debe de ser de inmediato siempre que sea posible. Cuando no se pueda
procesar la muestra de inmediato, se mantendr en refrigeracin o a temperatura ambiente.
Si se sospecha de infeccin gonoccica, no refrigerar la muestra.
Tiempo mximo de procesamiento con medio de transporte : 24 horas.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Uno de los hisopos se emplear para el examen microscpico y el otro para el cultivo.
Examen microscpico : es el nico mtodo aceptado para el diagnstico microbiolgico de la vaginosis bacteriana.
Se har una extensin del hisopo en lmina y tincin de Gram.
Cultivo : se pueden establecer diferentes combinaciones de medios en funcin de la orientacin diagnstica : agar
Sangre en atmsfera de CO2 , agar Chocolate en atmsfera de CO2, Mac Conkey, agar Thayer Martin en
atmsfera de CO2, medio para Gardnerella en atmsfera de CO2 , Sabouraud con antibitico u otro medio para
Cndida, caldo para cultivo de Trichomonas vaginalis.
Examen de la muestra
Examen microscpico : en el exudado vaginal normal se observar flora regional con predominio de morfotipo
Lactobacillus sp y clulas epiteliales
Presencia de leucocitos
Presencia de levaduras o pseudohifas
Presencia nica o abundante , de cualquier otro microorganismo
Exudado caracterstico de vaginosis bacteriana
Presencia de clulas clue : clulas epiteliales recubiertas por bacilos o cocobacilos Gram variables.
Ausencia o escasos leucocitos.
Flora mixta alterada.
Examen en medios de cultivo
El examen en medios de cultivo : examinar todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay crecimiento de
patgenos , incubar hasta la 48 horas , a excepcin del cultivo en agar Mac Conkey que se descarta a las 18 horas.
El agar Thayer Martin se incubar hasta 72 horas si es negativo.
Agar Sangre : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial Streptococcus pyogenes o
Streptococcus pneumoniae.
Agar Chocolate : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial Haemophilus sp.
Agar MacConkey : presencia de enterobacterias.
Agar Thayer Martin : presencia de colonias grises brillantes de distintos tamaos, oxidasa positivo, compatibles
con gonococo.

73

Medio Gardnerella : presencia de colonias hemolticas puntiformes en gran cantidad posiblemente Gardnerella
vaginalis.
Agar Sabouraud : presencia de levaduras.
SECRECIN URETRAL
La uretritis es el sndrome ms comn dentro de las Enfermedades de Transmisin Sexual(ETS), aunque muestra
un claro descenso en las ltimas dcadas en relacin con otras ETS, tanto en Espaa como en otros pases
desarrollados. Atendiendo a su etiologa se clasifican en uretritis gonoccica y no gonoccica (UNG) , siendo estas
ltimas las ms frecuentes en pases desarrollados.
N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25 % de todos los episodios de uretritis. Los
restantes son causados por Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum y por un nmero variable de otros
potenciales patgenos en los que la asociacin causa-efecto con la uretritis est menos aclarada. La asociacin de
ms de un patgeno como causa de la uretritis es ms que anecdtica y la ms frecuente de ellas es la asociacin
de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la presencia de T. vaginales como nico agente
encontrado hasta en un 4 % de las uretritis no gonoccicas. Cuadros de uretritis pueden estar causados por la
presencia de condilomas intrauretrales.
La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 a 6 das tras la exposicin, en tanto que la UNG es variable, desde 1
a 5 semanas. Tanto las uretritis gonoccicas como las no gonoccicas producen supuracin uretral, disuria y
escozor.
El diagnstico de uretritis se establece si al menos se dan de los siguientes supuestos
Sntomas : historia de secrecin uretral y/o disuria
Demostracin con tincin Gram : ms de 5 leucocitos polimorfonucleares campo de 1 000 aumentos en el
examen directo de la secrecin uretral.
Los pacientes con sntomas de uretritis, sin secrecin, visible, deben ser examinados, pidindoles que no
miccionen en las 4 a 8 horas previas a la toma de muestra. Se obtienen los 5 a 10 primeros ml de orina y tras la
centrifugacin a 400 rpm se examinan al microscopio de 400 aumentos. La presencia de ms de 15 leucocitos
polimorfonucleares por campo confirma el diagnstico de uretritis.
Los sntomas de la uretritis gonoccica puede permanecer hasta ms de 7 das, por ello la uretritis posgonoccica
se suele diagnosticar despus de transcurrido este perodo. En el examen con tincin de Gram, la presencia de
diplococos Gram negativos (DGN) intracelulares , establece el diagnstico de uretritis gonoccica. La presencia de
clulas inflamatorias en el exudado uretral en ausencia de diplococos Gramnegativos y cultivo negativo para
establecer el diagnstico de UNG.
El xito del diagnstico microbiolgico de la uretritis gonoccica depende de la correcta obtencin, transporte y
procesamiento de muestras. En cada muestra deben emplearse dos hisopos, uno para el cultivo y otro para la
extensin del exudado uretral para realizar la tincin de Gram. Las muestra para cultivo debern inocularse en
medios selectivos (Thayer Martin modificado, Martin- Lewis ) e incubarse de modo inmediato a 35 a 37C durante
72 horas en una atmsfera de 3 a 10 % de CO2 y humedad. Cuando esto no sea posible , es necesario inocular las
muestras en medio de transporte (Stuart o Amies ) .
Examen microscpico : en la secrecin uretral se debe observar presencia de clulas y bacterias, en especial
diplococos Gram negativos intra y extracelulares.
Evaluar : presencia de leucocitos polimorfonucleares.
Examen en medios de cultivo : examinar, todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay crecimiento de
patgenos , incubar hasta la 48 horas. El agar Thayer Martin se incubar hasta 72 horas si es negativo.
Agar Sangre :Streptococcus pyogeneso Streptococcus pneumoniae
Agar Chocolate : Haemophilus sp, Thayer Martin , gonococo.

74

Pruebas bioqumicas : a las colonias sospechosas realizar las pruebas bioqumicas : Prueba de oxidasa y
fermentacin de carbohidrato para Neisseria.
EVALUACIN
1. Realizar un flujograma de urocultivo

2. Realizar un flujograma de secrecin de herida.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

75

OBJETIVOS

PRCTICA N 10
DIAGNSTICO MICOLGICO: HONGOS AMBIENTALES

Conocer las tcnicas para la toma de muestra en el diagnstico micolgico.

Identificar los productos patolgicos de donde se pueden aislar los agentes etiolgicos de las micosis
humanas.
Conocer las caractersticas de los exmenes directos, como de los cultivos de
hongos.
INTRODUCCIN
La mayora de los hongos tienen un hbitat saproftico, presentan una variedad de morfologa, desde las levaduras
hasta los hongos filamentosos. Los hay comestibles, de inters para la industria alimentaria, qumica farmacutica y
los venenosos. Del gran nmero de especies estudiadas hasta la fecha (ms de 250 000) muy pocas son capaces
de colonizar al ser humano inmunocompetente, produciendo en stos casos las enfermedades denominadas
micosis.
Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados morfolgicos bsicos: levaduras
y mohos.
Levadura
Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se reproduce por gemacin o fisin binaria. Una
levadura tambin puede ser el estadio morfolgico en el ciclo biolgico de una especie filamentosa ,se denomina a
esto dimorfismo.
Mohos
Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el crecimiento continuo a partir de una espora.
El elemento tubular que emerge de denomina hifa, el que sigue creciendo y ramificndose llegando a formar un
conjunto entrelazado al que se denomina micelio o talo. Parte de las hifas se introducen en el sustrato y forman
el micelio vegetativo y las que se proyectan hacia el exterior constituyen el micelio areo, muchas levaduras en
determinadas circunstancias y dependiendo de la especie , pueden producir pseudohifas.
El micelio areo muestra macroscpicamente diferentes caractersticas, lo cual contribuye a la identificacin
primaria; puede ser algodonoso, velloso, arrugado, polvoriento, cerebriforme, pigmentado o no, etc. En l se
producen los elementos de propagacin, las esporas y los conidios. Los micelios tienen la capacidad de germinar
un nuevo sustrato y as producir un nuevo elemento. Este conjunto de caractersticas observadas sobre el medio de
cultivo se denomina colonia.
Los hongos como clulas eucariticas poseen ncleo, nucleolo, retculo endoplasmtico, ribosomas, mitocondrias,
vacuolas, cuerpos lipdicos y otras inclusiones. Rodeando el citoplasma existe una membrana y una pared celular
con caractersticas muy definidas. Se multiplican a travs de estructuras
que pueden ser asexuales o sexuales previa fusin del protoplasma y ncleo de clulas distintas. Tambin lo hacen
mediante crecimiento vegetativo expansivo como ocurre de rutina en el laboratorio con levaduras o fragmentos de
micelio.
Como en otras enfermedades infecciosas , las micosis se diagnostican en el laboratorio siguiendo el esquema
clsico : examen directo, cultivos e inmunodiagnstico.
Examen directo
Se realizar un estudio directo (pelo, escama, ua ,sangre, gota de pus. exudado, etc ) colocando la muestra entre
un portaobjetos y un cubreobjetos, y luego observndola al microscopio
Se puede realizar una preparacin en fresco en lmina portaobjetos adicionando una gota de hidrxido de potasio
al 10% (KOH al 10 %). Para la visualizacin de la cpsula de Criptococcus neoformans (LCR), se puede adicionar

76

una gota de tinta china. En los exudados purulentos se recomienda realizar una tincin de Gram, Giemsa, y
tambin Wright. Sise trata de cortes histolgicos hacer una preparacin con hematoxilina y eosina.
Cultivos
El medio ms utilizado en micologa clnica es el descrito por Sabouraud. A este medio base se le aade una
cantidad superior de glucosa (40 X 100), denominndose as agar glucosado de Sabouraud (SGA) , al cual
posteriormente se le han adicionado antibiticos con el fin de evitar la contaminacin bacteriana y cicloheximida
(actidiona) , para inhibir los hongos saprofitos.
La incubacin en micologa mdica es siempre en aerobiosis, oscilando el tiempo desde 2 a 3 das para levaduras
y especies saprofitas. La temperatura de incubacin es 32 C ;los dermatofitos y otros causantes de micosis
cutneas a 25 a 30 grados centgrados (temperatura ambiental)
El producto patolgico y la tcnica de toma de muestra se elegir de acuerdocon el tipo de micosis por investigar.
MATERIALES
Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA)
Cultivos de especies ambientales :Penicillum, Alternaria, Aspergillus, Hormodendrum
Frasco con KOH al 10 %
Asa de siembra
METODOLOGA
Observar macroscpicamente y realizar preparaciones con Azul de lactofenol para su observacin microscpica.

Penicillum

Aspergillus
fumigatus

77

Aspergillus
niger

Rhizopus

78

RESULTADOS
Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas.

79

80

EVALUACIN
1. Elaborar un cuadro comparativo de caractersticas morfolgicas , nutricionales y
sensibilidad a antibiticos de hongos y bacterias.

2. Explicar las tcnicas de diagnstico directas e indirectas para hongos.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

81

PRCTICA N 11
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS
OBJETIVOS
Describir las caractersticas de las colonias de hongos causantes de las micosis
superficiales y cutneas en cultivos con agar glucosado de Sabouraud y microscpicamente.
INTRODUCCIN
La colonizacin e invasin en mayor o menor grado de una especie fngica se denomina micosis. Dentro de las
micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que colonizan la superficie queratinizada de la piel o
pelo. Varios son los agentes etiolgicos que pueden colonizar la piel.
Las infecciones cutneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran afectados piel y anexos
(pelo y uas). La infeccin puede estar limitado a la capa crnea o llegar a los estratos ms profundos , sin invasin
linftica. Producidos por los hongos denominados dermatofitos y las enfermedades por ellos producidas
dermatofitosis. La dermatomicosis incluye a cualquier proceso mictico de la piel y el de dermatofitosis se reserva
para los producidos por hongos dermatofitos.
MICOSIS SUPERFICALES
Piedra Negra
Se caracteriza por la presencia de ndulos en la porcin extrafolicular del pelo, ptreos y de color negro. El agente
causal es Piedra hortae
Piedra blanca
Muestra ndulos blanco-grisceos ,que son masas agrupadas de hifas y pueden encontrarse en la parte distal o
central de pelo axilar ,pubiano y crural. Agente causal : Trichosporum cutaneo o T. beigelii.
Tia negra
Es una infeccin superficial de la piel debido a la colonizacin de Hortaea werneckii. Se caracteriza por la
presencia de manchas negro-marronceas, no descamativas e indoloras , frecuente en las palmas ,dedos y
plantas,que en otro lugar de la piel.
Pitiriasis versicolor
Caracteriza lesiones furfurceas a veces papulomatosas o eritematosas, confluentes con pigmento variable (hipo o
hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malassezia furfur, se localiza preferente en el tronco sobre todo
hombros y espalda. Al examen microscpico detectan los grupos de levaduras con hifas
MICOSIS CUTNEAS
Dermatomicosis
Micosis producida por Cndida albicans, hongo oportunista. Agente causal de intertrigos (submamario o inguinal),
eczema de paales, onicomicosis con paroniquia y granuloma candidisico. Adems de C.albicans tambin
pueden presentar onicomicosis Cndida stellatoidea, C. tropicalis, C. guillermondi y C. parapsilosis.
Las preparaciones teidas con Gram , muestran levaduras Gram positivas redondas u ovales , con brotes de
blastosporas de 3 a 4 m acompaadas de pseudohifas de 3 a 10 micras de longitud.
La mayora de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el aislamiento de Cndida; de todas las
formas se recomienda efectuar la siembra en medio de Sabouraud con antibiticos (cloramfenicol).Los medios que
contienen actidiona (cicloheximida) inhiben el crecimiento de algunas especies .
La incubacin se realiza a temperatura ambiente (25 a 30 C) cuando se trata de medios con inhibidores y a 37C
en el caso de medios enriquecidos exentos de sustancias inhibidoras. Al cabo de 24 a 48 horas se puede

82

observar las colonias

caractersticas de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o mates de 1 a3 mm de dimetro. La
prueba de filamentacin y produccin de clamidosporas caractersticas , son muy sencillas y tiles para la
identificacin de C. albicans.
Dermatofitosis
Es una infeccin fngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo, uas) que ocurre en los seres humanos y
animales producida por un grupo de hongos estrechamente relacionados denominados dermatofitos.
Los agentes etiolgicos de las dermatofitosis se clasifican en tres gneros : Epidermophyton, Microsporum y
Trichophyton. El diagnstico se puede hacer mediante :
Examen directo
Para el estudio micolgico se procede a tomar la muestra, que en este caso sera , pelos, escamas de la piel o
muestras ungueales que se toman con pinzas o bistur estril del centro o borde de la lesin y se colocan en una
lmina. Se transportan entre dos lminas portaobjetos limpias y se observan directamente al microscopio, con una
gota de hidrxido de potasio al 10 % (KOH ) cubierto con una laminilla.
Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix) o en forma de vaina alrededor del
pelo (ectotrix).
Cultivo
Las muestras se siembran en SGA adicionando cicloheximida, que inhiben los hongos saprofitos. La identificacin
se hace sobre la base del aspecto macroscpico de las colonias entre ellos la produccin de pigmento. Luego las
caractersticas microscpicas , observacin de macroconidias y microconidias y elementos accesorios sirven para
definir cada gnero y especie.
Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las caractersticas de sus colonias desarrolladas en SGA.
MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de :
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans
Microsporum gypseum, Microsporum canis
Preparaciones en lminas portaobjetos coloreadas con azul de lactofenol.

Cndida
albicans

83

Trichophyton
mentagrophytes

Trichophyton
rubrum

Trichophyton
tonsurans

Microsporum
gypseum

84

METODOLOGA
Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.

85

EVALUACIN
1. Qu caractersticas morfolgicas en los cultivos presentan los siguientes hongos?
Epidermophyton flocosum:
Trichoporum cutaneum :

2. Cules son las manifestaciones clnicas de las micosis producidas por :

Malassezia furfur:
Piedra hortae:

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

86

PRCTICA N 12
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTNEAS, SISTMICAS Y OPORTUNISTAS
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTNEAS
OBJETIVOS
Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis subcutneas
Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de los hongos causantes de
las micosis subcutneas.
INTRODUCCIN
Se consideran en este grupo las infecciones fngicas que afectan el tejido subcutneo, dermis y epidermis,
causadas por hongos exgenos, saprofitos , cuyo hbitat es el suelo y las plantas. Las infecciones ms frecuentes
son :
La esporotricosis debida al Sporotrix schencki, que se produce habitualmente por la penetracin en la piel de
astillas, espinas o tierra contaminada; una vez establecida la infeccin tiende a permanecer localizada en el tejido
subcutneo y aser muy persistente. Se caracteriza por una lesin ulcerada en el punto de inoculacin , que va
seguida de la formacin de ndulos y abscesos mltiples que siguen las vas de drenaje de los linfticos
superficiales.
La cromomicosis (cromoblastomicosis),debido a Fonsecaea pedrosoi, Cladosporium carrionii y Phialophora
verrucosum, que se caracteriza por el desarrollo de una ppula en el sitio de la inoculacin, que ms tarde se
extiende formando lesiones verrugosas o tumorales ,semejantes a una coliflor, puede haber infeccin secundaria y
ulceracin. Las lesiones , por lo general, estn limitadas a los pies y las piernas, pero pueden afectar la cabeza, la
cara, el cuello y otras superficies del cuerpo; tambin puede haber abscesos cerebrales.
El micetoma (maduromicosis), debido a Nocardia y Streptomyces, que se caracteriza por lesiones destructivas
localizadas, granulomatosas y supuradas, que habitualmente se localizan en los pies y las manos. Las lesiones se
caracterizan por edema, coloracin purprea y deformacin tumoral del tejido subcutneo, con la presencia de
surcos sinusales que drenan pus, que contiene grnulos amarillentos o negros. La infeccin progresa
gradualmente, atacando los huesos , los msculos y otros tejidos adyacentes, hasta que por ltimo obliga a la
amputacin, a veces se produce la invasin ms extensa afectando el cerebro y otros rganos internos.
MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de:
Sporotrix schenki
Phialophora verrucosum
Preparaciones en lminas coloreadas con azul de lactofenol.
Microscopio

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METODOLOGA
Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.

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DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SISTMICAS Y OPORTUNISTAS

OBJETIVOS
Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis sistmicas y oportunistas.
Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de los hongos causantes de las micosis sistmicas y
oportunistas.
INTRODUCCIN
Las micosis sistmicas, son infecciones fngicas que afectan varios rganos y tejidos. Se dividen en dos grupos :
las producidas por especies consideradas patgenas con carcter endmico, este tipo de micosis se transmite
por inhalacin, ingesta o traumatismos : Blastomicosis y Paracoccidioidomicosis
las producidas por especies oportunistas. Estas patologas se dan en huspedes inmunodeprimidos (con
transtornos endocrinos, inmunodefiencias, enfermedades oncohematolgicas, alteraciones metablicas y
anatmicas ,drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con corticoides o
citostticos , sometidos a ciruga, dializados, quemados , transplantados y cateterizados) , son causadas por
hongos saprofitos del ambiente o comensales del cuerpo humano. Por ejemplo Cndida y Criptococcus
La infeccin se adquiere por inhalacin de conidios en la fase micelial , desarrollndose en el husped un foco
pulmonar primario. En caso del que paciente presente inmunodeficiencia puede producirse una diseminacin
sistmica.
El diagnstico de laboratorio se realiza mediante la observacin de la fase levaduriforme en los siguientes
productos: expectoracin, secrecin de lesiones mucocutneas y material de biopsia. La fase levaduriforme se
puede obtener en cultivos enriquecidos, incubados a 37C.Estas pueden ser:
Blastomicosis :Blastomyces dermatitidis
La infeccin comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por va hematgena causando lesiones
destructivas focales en los huesos, piel, prstata y vsceras, en general no se afecta el tubo digestivo.
Las lesiones cutneas son particularmente manifiestas , parecen originarse como metstasis a partir de las
lesiones pulmonares primarias que se abren a la superficie cutnea causando lesiones ulceradas y encostradas.
Las lesiones se caracterizan por inflamacin granulomatosa, microabcesos y progresiva destruccin de los tejidos,
las calcificaciones son raras.
Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioides brasilensis) :
Las primeras lesiones aparecen en las mucosa de la boca,o de la nariz y se difunden por expansin directa, es
decir a travs de los lmites cutneo-mucosos, afectan la cara, en ocasiones ,la diseminacin se produce a travs
de los tejidos linfticos incluyendo el bazo.
En el tubo digestivo las lesiones comienza en el tejido linfoide submucoso y puede originar formacin de lceras e
incluso perforaciones; pueden formarse abscesos subcutneos que por extensin a la superficie cutnea , puede
producir lesiones deformantes de gran tamao, encrostadas o ulceradas. Las lesiones cutneas
constituyen abscesos pigenos y lesiones inflamatorias granulomatosas.
Histoplasmosis :Histoplasma capsulatum
Causada por la inhalacin de esporas que lo conduce a una infeccin pulmonar, aparecen lesiones miliares
distribuidas por todo el parnquima pulmonar y aumento de tamao de los ganglios linfticos. La infeccin
iniciales benigna puede pasar completamente inadvertida o manifestarse como un infeccin respiratoria
autolimitada.

89

En un pequeo nmero de individuos la enfermedad progresa se disemina y causa lesiones en prcticamente todos
los tejidos y rganos, aparece fiebre y postracin, as como el aumento del tamao de hgado , bazo y ganglios
linfticos simulando tuberculosis miliar ; en ocasiones puede evolucionar como una enfermedad
pulmonar crnica con cavitacin, simulando la tuberculosis pulmonar crnica. Las lesiones de los tejidos se
caracterizan por la existencia de una inflamacin granulomatosa.
Coccidiodomicosis :Coccidioides immitis
La infeccin se establece por inhalacin de esporas transmitidas por el aire aproximadamente el 60 % se pone de
manifiesto nicamente por la adquisicin de una hipersensibilidad de tipo retardado frente a los antgenos del
hongo, en un 40 % se produce neumonitis aguda, acompaada con frecuencia de pleuresa y varias
erupciones cutneas, alrededor del 5 % desarrollan una enfermedad pulmonar crnica con cavitacin que se
asemeja a la tuberculosis pulmonar y conduce ocasionalmente a la calcificacin; en menos del 1 % aparece una
diseminacin con lesiones granulomatosas aspticas en muchos rganos y tejidos, entre ellos, la piel,
huesos articulaciones y meninges.
Las lesiones de la neumonitis aguda son histolgicamente semejantes a las causadas por bacterias pigenas ,
pero en la enfermedad pulmonar crnica y en las formas diseminadas , la inflamacin es granulomatosa.
Criptococosis
Esto ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de las clulas T y se debe a Cryptococcus
neoformans , este hongo se caracteriza por ser una levadura encapsulada. Su hbitat es el suelo contaminado con
materia fecal de aves.
La criptococosis es una de las enfermedades que sirve para definir el estadio SIDA en la enfermedad del virus de
Inmunodeficiencia Humana. Dentro de las formas clnicas existe : Criptococosis pulmonar, del sistema nervioso
central (SNC), diseminada , cutnea y mucocutnea.
El producto ms frecuente de analizar es el LCR , en el que se observan las tpicas levaduras capsuladas que se
destacan por contraste negativo mediante emulsin con tinta china.
Candidiasis : Cndida spp
Las infecciones caudadas por Cndida son muy variadas, este hongo de tipo levaduriforme puede llegar a ser
patgeno en humanos y animales en los cuales vive en estado saproftico. La cavidad bucal y es resto del tracto
gastrointestinal son los territorios preferentes donde C. albicans se encuentra en el 20 % de las personas y
en menor proporcin otras especies de Cndida.
Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de candidiasis :
Cambios fisiolgicos como diabetes y embarazo
Uso prolongado de antibiticos o frmacos antitumorales e inmunosupresores
Maniobras diagnsticas y teraputicas agresivas : cateterismo, sondajes
Debilidad general y/o desnutricin
Infeccin por el virus de la Inmunodeficiencia Humana y drogodependencia.
El diagnstico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostracin directa de Cndida mediante
coloraciones Giemsa, Gram en muestras clnicas y cultivo
MATERIALES
Tubos de SGA con cultivos de:
Histoplasma capsulatum
Cndida albicans
Preparaciones en lminas con azul de lactofenol
Microscopio

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METODOLOGA
Observar de las muestras macroscpicamente
Realizar preparaciones en lminas con azul de lactofenol y observar al microscopio
(10x y 40x)

Tomado de Microbiologa Tomo II de Granados 2 edicin

91

Tomado de Micologa Mdica Ilustrada Arenas 2 edicin

92

Tomado de Micologa Mdica Ilustrada Arenas 2 edicin

Tomado de Micologa Mdica Ilustrada Arenas 2 edicin

93

Tomado de Micologa Mdica Ilustrada Arenas 2 edicin

94

Tomado de Diagnstico Microbiolgico de Bailey y Scott

11 edicin

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PRCTICA N 13
DIAGNSTICO VIROLGICO
OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con las diferentes tcnicas de aislamiento de virus aprovechando las propiedades
que presentan
Observar y caracteriza morfolgicamente clulas cultivadas
Explicar la importancia de las tcnicas de cultivo de tejidos en virologa y en otras
disciplinas cientficas.
La demanda de los servicios de los laboratorios de virologa clnica, han aumentado en las ltimas dos dcadas
debido a la disponibilidad comercial de reactivos de alta calidad, el uso por parte de los mdicos de frmacos
antivirales especficos, el desarrollo de tcnicas de diagnstico rpido y la aplicacin de los procedimientos de
cultivo celular para virologa al diagnstico de otras enfermedades como infeccin genital por Chlamydia.
Las enfermedades virales que requieren diagnstico de laboratorio son las enfermedades de transmisin
sexual, las diarreas, las enfermedades respiratorias en nios y adultos, las meningitis aspticas, las enfermedades
congnitas y las infecciones en huspedes inmunodeprimidos.
CULTIVO CELULAR
Los cultivos celulares comenzaron a principio del siglo XX, con cultivos de rganos completos y luego con
mtodos de clulas individualizadas : cultivos de clulas primarias (clulas somticas de un animal de
experimentacin o tomadas de un paciente humano (que pueden mantenerse en cultivo durante un perodo breve
de tiempo) o lneas celulares inmortalizadas, las cuales en condiciones adecuadas pueden continuar creciendo en
cultivo indefinidamente.
En 1952 Renato Dulbecco fue el primero que cuantific virus animales, utilizando un ensayo de placas de lisis,
tcnica para la cual se preparan diluciones del virus con las que se infectan clulas crecidas en monocapas, que
luego se recubren con agar blando para impedir la difusin del virus. ste destruye las clulas en focos localizados
que se observan al teirse la monocapa.
MECANISMOS DE LESIN CELULAR
La infeccin viral origina una variedad de cambios que se detectan mediante el examen visual o bioqumico
de las clulas infectadas, estos cambios se deben a la produccin de protenas y cidos nucleicos vricos, y a las
alteraciones biosintticas de las clulas. En las clulas infectadas por virus se reconocen cambios fenotpicos
comunes, denominados efectos citopticos del virus , los cuales son :
Forma alterada : las clulas adherentes que normalmente estn pegadas a otras clulas ( in vivo ) o a un
sustrato artificial ( in vitro ) pueden adoptar una morfologa redondeada diferente de su apariencia aplanada normal
. Se eliminan de la clulas los procesos de ampliacin implicados en la adhesin y la movilidad.
Despegamiento del sustrato : para las clulas adherentes , esta fase de dao celular sigue de la anterior. Ambos
efectos son causados por la degradacin parcial o la disrupcin del citoesqueleto, el cual se encarga de mantener
la forma de la clula.
Lisis : es el caso ms extremo, la clula entera se rompe, se pierde la integridad de la membrana y la clula se
puede hinchar por la absorcin de lquidos extracelulares y finalmente estalla. ste es un caso extremo de dao
celular, no todos los virus causan este efecto, aunque pueden causar otros efectos citopticos.
La lisis es beneficiosa para un virus ya que constituye un mtodo para liberar nuevas partculas vricas de una
clula infectada.

96

Fusin de membranas : las membranas de las clulas adyacentes se fusionan originando una masa de
citoplasma que contiene ms de un ncleo : sincitio, o dependiendo del nmero de clulas que se fusionan : clula
gigante. Las clulas fusionadas tienen vida corta y luego se lisan.
Permeabilidad de membranas : diversos virus causan un aumento en la permeabilidad de membranas,
permitiendo la entrada de iones extracelulares como el sodio. La traduccin de algunos ARNm vricos es resistente
a altas concentraciones de iones de sodio , permitiendo la expresin de genes vricos a expensas de mensajeros
celulares.
Cuerpos de inclusin : son reas de la clulas en las que se han acumulado componentes vricos. Se trata
frecuentemente de sitios de ensamblaje de viriones y algunas inclusiones celulares consisten en acmulos
cristalinos de partculas vricas. No est claro si estas estructuras daan a la clula, pero frecuentemente estn
asociadas a virus que causan lisis celular , como los herpes virus.
Apoptosis : la infeccin vrica puede activar la apoptosis ( muerte celular programada ), mecanismo implicado en
el crecimiento normal y el desarrollo de los organismos.
INMUNODIAGNSTICO
ENSAYO INMUNOENZIMTICO
La prueba de inmunoabsorcin ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados a enzimas (EIAs) en la cual
el antgeno o anticuerpo est adsorbido a una fase slida , constituye uno de los primeros inmunoensayos
enzimticos primeramente descritos por Engvall y Perlmann en 1971 y luego aplicados al diagnstico
microbiolgico por Voller y colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las tcnicas de inmunofluorescencia (IF) de
su mayor sensibilidad ya que, la enzima acta catalticamente y de forma objetivable, por lo que es posible medir la
densidad ptica de la coloracin final. Las enzimas son seguras, de bajo costo y estables, si se comparan con los
radioistopos utilizados en radioinmunoensayo (RIA).
En la actualidad estas pruebas estn tomando un rol importante en los laboratorios mdicos y de investigacin,
porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible realizar la identificacin de muchos virus a nivel
de gnero. Estn reemplazando a los RIA en muchos laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los
problemas de manejo, eliminacin y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos .
Debido a su objetividad, facilidad de automatizacin y posibilidad de trabajar con un gran nmero de muestras,
estos ensayos inmunoenzimticos estn reemplazando parcialmente a tcnicas en el laboratorio como :
inmunofluorescencia y aglutinacin.
Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA en funcin de cmo se
combinen : el analito (antgeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de antgeno o de anticuerpo) y el sustrato.
Utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos que permiten valorar las uniones antgeno-anticuerpo que se
producen tras un periodo de incubacin, con la adicin posterior de un sustrato.
Fundamento
La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad
conocida. El color se genera por la interaccin de un sustrato cromognico y una enzima que ha sido acoplada al
anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antgeno en la fase slida, como una capa de
captura. Despus de la reaccin del antgeno con el suero del paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo
antiinmunoglobulina clase especfica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase especficos
Dentro de los parmetros fisicoqumicos que intervienen en la unin del antgeno con el anticuerpo tenemos:
Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de tomos en la superficie de las molculas
generado por un cambio elctrico. Son fuerzas dbiles presentes cuando la proximidad del Ag y el Ac es grande.
Fuerzas electrostticas originadas por la fuerza de atraccin entre molculas de carga inica opuesta, como
sucede con los grupos NH3+ (amonaco)que reaccionan vidamente con el grupo COOH- (grupo carboxilo).
Uniones por puentes de hidrgeno son de carga energtica baja entre tomos electropositivos de hidrgeno

97

y tomos electronegativos de oxgeno o nitrgeno.

Metodologa
Los mtodos de ELISA se dividen en :
ELISA directo : ensayo ELISA simple de dos capas
Las
placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el
antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Se
debe incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las
que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado y controles positivos (soluciones donde se encuentra
el antgeno buscado, o bien se le ha aadido).
ELISA indirecto
Las
placas ELISA se preparan de igual forma que en el mtodo directo, los controles positivos y negativos son los
mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antgeno, y uno secundario
marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida
a la unin de dos o ms anticuerpo secundarios por cada primario.
ELISA sndwich : ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos
Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno.
Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que
ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el
material no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada
molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos,
que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que
permite el segundo anticuerpo.
Fijacin del Antgeno a la fase slida :
La reaccin inmunolgica tiene lugar en la fase slida, sta puede ser de plstico, vidrio o nitrocelulosa. Los ms
usados son los de plstico, dentro de stos los de poliestirenogamma irradiados y los de cloruro de polivinilo ya
que tienen mayor capacidad para formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados.
El antgeno diluido en buffer es adherido a la fase slida por enlaces electrostticos entre los sitios activos del
plstico y regiones de la protena responsables de esta interaccin. El buffer puede ser carbonato a pH 9,6 o buffer
fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4.
La estabilidad de los enlaces electrostticos, el tiempo de incubacin y la temperatura son factores importantes a
tener en cuenta para evitar prdidas de las protenas y que pueden afectar la sensibilidad del ensayo.
Reaccin con anticuerpo :
La reaccin del antgeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las fisiolgicas : pH 7,4,
temperatura de 37C y concentracin salina equivalente a 0.15M de cloruro de sodio (NaCl). El tiempo puede variar
entre 1 a 3 horas.
Molculas no especficas en solucin pueden adherirse a la fase slida afectando el resultado final del ensayo, para
disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reaccin un exceso (0,1% a 1%) de una protena inerte para que
compita eficientemente por los sitios de unin inespecficos en la fase slida. Esta protena puede ser seroalbmina
bovina, casena, suero entero, gelatina u otros.
Tambin es necesario aadir al medio Tween 20 (Monolaurato de polioxietilenosorbitn{ surfactante } )para evitar
uniones inespecficas de macromolcula. Por este motivo es agregado en los tampones de dilucin y de lavado.
Adicin del conjugado enzimtico :

98

El conjugado enzimtico se prepara por unin covalente de una enzima con el anticuerpo; esta enzima puede ser
peroxidasa de rbano (Horseradish peroxidase
{ HRP } ), fosfatasa alcalina (Alcaline Phosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios a tomar en cuenta en
la seleccin de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de conjugarla
eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y costo.
Las condiciones de reaccin entre el conjugado y el complejo formado por la unin antgeno-anticuerpo son
similares a las descritas en la etapa anterior.
Adicin del sustrato:
La eleccin del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El sistema AP hidroliza al pnitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato
perxido de hidrgeno produciendo oxgeno que oxida a otros compuestos cromgenos tales como:
Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidacin genera un producto de color azul oscuro.
o-phenylenediamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de color naranja a pardo
oscuro.
cido azino-(3-etil)-benzo-sulfnico (ABTS) : la oxidacin genera un producto que puede variar del color al azul.
La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la reaccin.
La lectura se realiza en un espectrofotmetro a 405 nanmetros
PRUEBA RPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA
Uno de los pilares bsicos de la lucha contra el Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es la deteccin
precoz de las personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El diagnstico precoz ofrece
la posibilidad de beneficiarse de la terapia antirretroviral en las etapas precoces de la infeccin, as como intentar
modificar las conductas que favorecen la transmisin del virus a otras personas.
Descripcin de las pruebas de deteccin rpida del VIH
Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mnimo y generan un resultado en menos
de 15 minutos en comparacin con la prueba estndar de cribado con tcnicas de EIA, de las cuales no se dispone
del resultado hasta al cabo de unas horas o das. Tanto la prueba de deteccin rpida como el EIA detectan
anticuerpos especficos del VIH.
Se han establecido los diferentes criterios que debera cumplir una prueba de deteccin rpida del VIH:
Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%)
Ser reproducible
Ser fcil de aprender, realizar e interpretar
Ser precisa
Ser de fcil almacenamiento
No requerir equipamiento adicional
No tener carcter invasivo
Durante la realizacin de las pruebas de deteccin rpida, se recomienda que los pacientes reciban informacin y
asesoramiento sobre la enfermedad y la infeccin. Si la prueba es negativa, se considera un negativo definitivo a
no ser que haya posibilidades de que se encuentre en el perodo ventana de exposicin (primeros 3 a 6 meses de
post exposicin) . Si el resultado es positivo, se considera un resultado preliminar que debe confirmarse con
tcnicas de EIA y con la prueba Western blot .
Los resultados indeterminados se deberan repetir en un mes. La mayora de las pruebas de deteccin rpida del
VIH se comercializan con un equipo o kit que incluye todo lo necesario para realizar la prueba y no requiere un

99

equipamiento especializado. En general, disponen de un control de procedimiento incorporado en el equipo o kit.

Para la muestra, se puede utilizar sangre entera (ms fcil de realizar), plasma o suero, y los resultados se
interpretan visualmente.
Capacidad diagnstica de las pruebas de deteccin rpida del VIH
Es difcil realizar una comparacin de la capacidad diagnstica de las numerosas
pruebas de deteccin rpida comercializadas ya que son, muy distintas entre ellas. Los principios de accin ms
frecuentes en estas pruebas son la aglutinacin, la inmunoconcentracin (flowthrough), la inmunocromatografa
(lateral flow) y la fase slida (solidphase).
El mtodo de produccin y de combinacin especfica de los antgenos vara entre las distintas pruebas de
deteccin. La mayora incluye uno o ms antgenos del virus VIH-1 (gp41, gp120, gp160) y VIH-2 (gp36). Otros
incorporan el antgeno core (p24).
Actualmente, existe controversia en la duracin del perodo ventana entre 3 6 meses. En general, se recomienda
el alta mdica a los 6 meses despus de una actividad de riesgo de infeccin.
PRUEBA DE INMUNOFIJACIN DE DOT-BLOT
Prueba para la deteccin del VIH en la cual los antgenos virales se encuentran unidos a una membrana de
nitrocelulosa dentro de un contenedor plstico. Los antgenos utilizados son recombinantes o sintticos. Se utilizan
conjugados de anti-inmunoglobulina ligados a una enzima que se fija al anticuerpo del paciente. La adicin del
sustrato permite la visualizacin del color en el papel.
Su ventaja y principal indicacin es la posibilidad de identificacin entre los dos tipos de virus .Las pruebas son
rpidas y fciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados en 5 15 minutos.
TCNICAS DE INOCULACIN EN ANIMALES DE LABORATORIO
Este fue el primer mtodo que se utiliz para el aislamiento de virus , demostrndose la reaccin positiva por la
muerte y los cambios histolgicos o clnicos. Existen factores negativos en el uso de animales de laboratorio : el
confinamiento de los mismos de tal manera que no se pueda impedir una infeccin cruzada a otros animales y al
personal de laboratorio, la presencia de enfermedades vricas latentes en los animales de experimentacin que
pueden activarse por el mismo trauma que supone la inoculacin con la consiguiente interferencia a la hora de la
interpretacin de los resultados .
Debe elegirse cuidadosamente el tipo y la edad del animal que va a utilizarse , as como la va de inoculacin, ya
que cada especie tiene su propia sensibilidad y cada virus sus propios requerimientos respecto a un tipo de clulas
.El animal ms utilizado es el ratn de menos de dos das de edad especialmente como animal de rutina con fines
diagnstico siendo el que proporciona el principal mtodo de aislamiento de los virus Coxsakie A.
el ratn lactante se utiliza en virologa para :
Inocular por va intracerebral (0,06 ml) :Herpes simple
Inocular por va subcutnea (0,06 ml) : infeccin por Coxsakie, Arbovirus y
Reovirus
Inocular por va intradrmica (0,02ml) virus Coxsakie
el ratn adulto se utiliza :
Inocular por va intracerebral (0,03ml) o intraperitoneal hasta 2 ml de
encefalitis
Inocular por va intracerebral : rabia, coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intranasal( 0,05 ml): Influenza A,B y C
Inocular por va intraperitoneal o intracerebral para obtencin de
inmunosueros.
la cobaya se utiliza para :
Inocular por va intraperitoneal hasta 5 ml de coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intraperitoneal o intramuscular para obtencin de
Inmunosueros hasta un ml.
el conejo se utiliza para :
Inocular por va intradrmica Herpes tipo B
Inocular por va intradrmica para la obtencin de vacunas
Inocular por va intravenosa hasta 2 ml o intramuscular hasta 2 ml o

100

Intraperitoneal hasta 2 ml para la obtencin de inmunosueros.

Materiales : jeringa con aguja de 1 ml, embudo de cristal, tubos de ensayo, algodn.
Reactivos : alcohol etlico de 70, ter etlico, solucin de inoculacin
Tcnica :
a) Anestesiar al ratn con un algodn empapado de ter etlico colocado en el interior de un embudo invertido ,
introducir en l el ratn.
b) rasurar la zona a inyectar e inyectar la solucin de inoculacin en el lugar de inoculacin que puede ser :IC
intracraneal, IM intramuscular, IN intranasal, SC subcutnea, ID intradrmica, IV intravenosa, IP intraperitoneal.
Interpretacin de los resultados : Se manifiesta la infeccin en el ratn ,se observar sta por la sintomatologa, la
muerte o la elevacin del ttulo de anticuerpos. Se observar durante dos o ms semanas el animal inoculado

Tomado de Microbiologa Granados 1aedicin

TCNICAS DE INOCULACIN EN EMBRIN DE POLLO

Existen varios mtodos de inoculacin de huevos frtiles , dependiendo del virus que desea cultivarse. Una vez
inoculados, los huevos se incuban a temperaturas entre 35 y 38C ( dependiendo del virus).
Antes de proceder a la inoculacin de un huevo debe limpiarse cuidadosamente su superficie con alcohol.
Inoculacin corio-alantoidea
Edad del embrin : 10 a 12 das
Mtodo :
Examinar el huevo en ovoscopio provisto de lmpara de 100 vatios . sta tcnica llamada de iluminacin permite
apreciar los vasos sanguneos del embrin , la cmara de aire con claridad a travs de la cscara. Con un lpiz se
delimitar la cmara de aire as como tambin el punto en que el corio-alantoides es bien notorio y desarrollado.
Practicar una cmara de aire artificial de la siguiente manera:
a) Quitar un pequeo tringulo de cscara de encima del corio-alantoides sin daar la frfara
b) Utilizando una aguja de diseccin incidir cuidadosamente la frfara sin daar la membrana corio-alantoidea
que est debajo.
c) Realizar una pequea abertura en la cmara de aire y valindose de un gotero realizar una succin suave en
el agujero hecho anteriormente. La membrana corio- alantoidea se separa de la frfara efectundose entonces
la inoculacin a travs de la hendidura de la misma.
Sellar la abertura e incubar durante 2 a 4 das examinando diariamente
Inoculacin en saco amnitico
Edad del embrin: 7 a 14 das
Mtodo

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Proceder como para la inoculacin corio-alantoidea. Cuando la membrana corio-alantoidea aparezca se aumenta
el tamao del orificio .A travs de la membrana corio-alantoidea y utilizando unas pinzas estriles se extrae una
parte de la membrana amnitica. Inocular en la cavidad amnitica, sellar e incubar.
Inoculacin de saco alantoideo
Edad del embrin : 10 das
Mtodo
Se procede como en la inoculacin corio-alantoidea pero sin extraer la membrana. Inocular directamente en la
cavidad alantoidea . Con el agujero realizado en la cmara de aire se evita el reflujo del inculo motivado por la
presin. Sellar e incubar.
Inoculacin en saco vitelino
Edad del embrin: 3 a 8 das
Mtodo
Se efectuar la inoculacin directa a travs de la cmara de aire, puesto que a la edad sealada el saco vitelino
rellena casi por completo el huevo. Sellar e incubar.
Examen
Colocar el huevo en una placa de Petri, sobre algodn empapado en desinfectante.
Utilizando tijeras y pinzas estriles eliminar la cscara de encima de la cmara de aire. Extraer la membrana interna
(frfara) y colocarla en agua destilada estril.
Examinarla para apreciar lesiones.
La identificacin de virus aislados en huevos puede hacerse por tcnicas de neutralizacin o de fijacin del
complemento con sueros especficos. Es posible neutralizar tanto el efecto particular producido por el virus como la
formacin de placas o muerte del embrin, como en el caso de los myxovirus, neutralizar o inhibir la propiedad de
estos virus de aglutinar los hemates. Las pruebas de fijacin de complemento tienden a dar reacciones de grupo
ms que especficas de tipo.

Tomado de Manual de Tcnicas de Microbiologa Mdica Baker

Fuentes de Informacin
Arenas R. Micologa Mdica Ilustrada.2 edicin.2005. Editorial Mc Graw Hill
Bailey & Scott. Diagnstico Microbiolgico .11 edicin 2004.Editorial Mdica Panamericana.
Granados R. Microbiologa Tomo II.2 edicin.2003.Editorial Thomson Paraninfo
Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologa Mdica 18 edicin 2005 Editorial Manual Moderno
Koneman Diagnstico Microbiolgico 6 edicin .2008.Editorial Mdica Panamericana
Murray P. Microbiologa Mdica.5 edicin 2008.Editorial Elsevier
Sherris Microbiologa Mdica. 4 edicin.2005.Editorial Mc Graw Hill
Baker F.J, Breach M.R. Manual de Tcnicas de Microbiologa Mdica.1990.Editorial Acribia
Cann A Principios de Virologa Molecular.4 edicin.2005.Editorial Acribia
Organizacin Panamericana de la Salud. Oficina Sanitaria Panamericana Regional de la Organizacin
Mundial de la Salud. Garanta de calidad en el diagnstico serolgico de la Infeccin por el virus de la

102

inmunodeficiencia humana . Publicacin N 42

Ministerio de Sanidad y Poltica Social. Catalua .Espaa. Prueba de deteccin rpida de la infeccin por VIH.
AATRM Nm. 2007/3
Cristhopher Donats Cruz Malpica. Estandarizacin de la prueba de Ensayo Inmunoenzimtico para la
deteccin de anticuerpos IgG en sueros humanos para el virus Phlebotomusfever. Tesis para optar el ttulo de
qumico farmacutico. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de farmacia y Bioqumica 2001
http://sisbib.unmsm.edu.pe/Bibvirtual/tesis/Salud/Cruz_M_C/generalidades.htm
Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica. Procedimientos en Microbiologa
Clnica. www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap6.htm
Moura AC Diversidade gentica, densidadepopulacional e potencial de promoo de crescimento de
rizobactrias associadas ao cacaueiro [Tesis Maestra].Bahia : Universidade Federal do Renccavo ; 2007.
Chaves L Aspectos bioqumicos e moleculares de bacterias isoladas de terrapreta antropognica (TPA)
naregio da Amaznia Brasileira.[Tesis Maestra] Piracicaba : Universidade de So Paulo;2007

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