LIVIU ROMAN

ROBERT SANDULESCU

MARIUS BOJITA
DANIELA LUCIA MUNTEAN

VALIDAREA
METODELOR ANALITICE

Editura Medicali,
Bucurejti, 2007

CUPRINS

2007 Editura MEDICALA

INTCODUCERE

VOLUMUL-I-

Descrierea CEP a Bibliotecii Na|ionale a Romanies

Roman Liviu
Validarea metodelor analitice / Liviu Roman, Marius Bojita,
Robert SSndulescu, Daniela Lucia Muntean Bucureti: Editura
Medicala, 2007
ISBN 978-973-39-0610-0
I.
II.
IE.
IV.

Roman Liviu
Bojijfi Marius
Sandulescu Robert
Muntean Daniela Lucia

543.9

Tiparul cxecutat la
UNTVERSITATEA ,,BOGDAN-VODA" CLUJ-NAPOCA
SO G8

400560 Cluj-Napoca Str. Grigore Alexandrescu nr. 26A Tel: 00-40-264- 598.787
Fax: 00-40-264- 591.830 email: ubvfa.ubv.ro

CAP.l.METODOLOGIAANALITICAGENERALA.
1.1 Alegerea metodei de analiza

6
8

CAP.2. PROBLEMS 1 TENDINfE ACTUALEINANALIZA.

2.1. Problems ?i exigente actuale ale analizei
2.1.1. Formularea problemei ce trebuie rezolvata prin analiza
2.1.2. Exigente actuale ale analizei
2.1.3. Tendinje actuale in analiza.
2.1.3.1. Optimizarea proceselor de separare
2.1.3.2. Optimizarea detecfiei i a determinarii cantitative.
2.1.4. Parametrii de calitate mai important!

2.1.5. Economicitatea analizelor

18
18
19
19
20
22
31
32
33

CAP.3. SUBSTANTESTANDARD
$1KIATEWALEFARMACEUTICEDE
REFEKJNfA.
34
3.1. Rolul substanjelor standard sau etalon
34
3.2. Materiale de referinta pentru analiza
fermaceutica
37
3.2.1. Aspecte generate
37
3.2.2. Substance farmaceutice de referinfa.
37
3.2.3.Duratadevia|a,pastrareai data de expirare
38
3.3. Standardepentru impuritati farmaceutice.
39
3.3.1. Utilizare, siguranta 51 manipulare
40
3.3.2. Materiale de referinta pentru impuritati organice volatile produse de radian
international, USA
40
3.4. Substanfe controlate
41
3.5. Informatii generale de comanda
42
3.6. Farmacopeea americana ;i formularul de standarde de referin|a
42
3.7. Substance de referinfa, preparate biologice de referinta ?i spectre dupa
farmacopeea europeana
47
3.8. Substance de referinfa ale farmacopeii britanice
51
3.9. Farmacopeea franceza
52
3.10. Farmacopeeajaponeza
53
3.11. Farmacopeea elvefiana
54
3.12. Organizatia mondiala a sanatatii - OMS
54
3.13.Surscdeinforrnare
59
3.14. Substante de referinta pentru analiza impuritatilor farmaceutice
62
3.15. Materiale de referinta pentru macro- i microdozari 51 pentru analiza elementelor
inurme
65
3.16. Standarde pentru spectroscopie
69

3.17. Unitafi de masura 51 conversia lor

70

CAP.4. PARAMETRIIDE CALJTATEPENTRUEVAWAREA

REZULTATELOR
ANALITICE.
77
4.1. Exactitate si precizie
77
4.2. Tipuri deerori
79
4.2.1.Erori sistematice
79
4.2.2. Erori de metoda
80
4.2.3. Erori personale
80
4.2.4. Erori aleatoare
81
4.3. Tratarea statistics a datelor experimentale
83
4.4.Utilizarea statisticii la evaluarea datelor analitice si asigurarea calitafii analitice..90
4.4.1. Intervalul de incredere
91
4.4.2. Aplicarea statisticii la verificarea unei ipoteze
94
4.4.3. Compararea unei medii experimentale cu valoarea
adevarata
95
4.4.4. Compararea a doua medii experimentale
96
4.4.5. Compararea preciziei masuratorilor
97
4.4.6. Detectarea erorilor personale grave
99
4.4.7. Estimarea limitei de detectie
101
4.4.8. Estimarea limitei de cuantificare
102
4.4.9. Trasareaunei curbe de etalonare
103
4.4.10.Calibrarea prin reducerea lucrului experimental fara pierderi de informafie..! 10
4.4.11. Asigurarea calitatii analitice
119
CAP.5. CALJTATEA MEDICAMENTULUI. OBIECTIVE1 PROBLEMS.
5.1. Organizarea controlului de medicamente in romania
5.2. Norme nafionale actuale elaborate de A.N.M., referitoare la calitatea
medicamentelor
5.2.1. Hotarareanr. 4/1999 a A.N.M
5.2.2. Reguliledebunapracticadelaborator
5.2.3. Colecjia de e$antioane
5.2.4. HotaraYea nr. 6/1999 privind activitatea A.N.M. in domeniul inspecjiei
farmaceutice
5.3. Ordinul nr. 1030/2004
5.3.1. Ordinulnr. 119/2004
5.3.2. Norma din 09/02/2004
5.4. Concepte si norme Internationale privind calitatea medicamentului
5.5. Cadrul juridic international
5.6. Norme privitoare la asigurarea calitatii procesului de preparare a
medicamentelor
5.6.1. Asigurarea calitatii procesului de preparare a medicamentelor
5.6.2. Norme de buna fabricate
5.6.3. Norme de buna practica in laboratoarele de analiza
5.6.4. Aparatura

125
125
127
127
133
147
149
151
151
164
172
175
177
177
178
180
184

CAP. 6. STABILITATEA MEDICAMENTELOR.

6.1.Notiuni introductive
6.2. Calcule de stabilitate
6.3. Degradarea unor medicamente prin hidroliza
6.4. Degradarea unor medicamente prin oxidare

s.

187
187
188
190
197

CAP. 7. METODOLOGIA GENERALADE VALIDAREA METODELOR DE ANALIZA

1 CONTROL
201
7.1. Rolul validarii in analiza farmaceutica. precizia, criterii de acceptanta.
201
7.2. Rolul validarii in analiza farmaceutica
220
7.3. Variabilitatea analitica si parametrii de validare
222
7.3.1. Precizia
222
7.3.2. Nivelele de precizie si variabilitatea deviafiei standard
222
7.4. Criterii de validare a metodelor de analiza.
235
7.4.1. Definipj mai importante
237
7.4.2. Raportul de validare
252
7.5. Protocol comun de studiu pentru dozarea unei materii prime dintr-o formi
farmaceutica
.253
75.1. Studii de liniaritate, exactitate si
fidelitate
253"
7.5.2. Protocol pentru o forma farmaceutica reconstituita
254
7.5.3. Protocol de liniaritate si exactitate
255
7.5.4. Estimarea regasirii medii
261
7.5.5. Fidelitatea.
262
7.6. Sensibilitatea
275
7.7. Limita de detectie
279
7.8. Limita de cuantificare
281
7.9. Robustetea.
.282
7.10. Test de validare a dreptei de regresie cu schimbarea prealabilS a variabilei 288
7.10.1. Test de comparare cu zero a ordonantei la origina
291
7.11. Analiza variantei-ANOVA
292
7.11.1. Notiuni generate
292
7.11.2. Analiza ANOVAcuun factor.
293
7.11.3. Testul ANOVA cu doi factori
304
CAP. 8. VALIDAREA UNEIMETODELICHID - CROMATOGRAFIE.
8.1. Nofiuni introductive
8.2. Alegerea coloanelor $i a fazelor mobile
8.3. Evaluarea preciziei
8.4. Evaluarea exactita|ii si a liniaritatii
8.5. Adoptarea deciziei de acceptanfa a metodei
8.6. Limitele de detectie si de cuantificare.
8.7. Specificitatea si selectivitatea metodei
8.8. Alt! parametrii de performanja a metodei
8.9. Aplicafii practice
8.9.1. Validarea unor metode HPLC de determinare a albuterolului si
bambuterolului....

313
313
314
319
319
325
326
327
329
335
335

8.9.2. Determinarea simultana a tizanidinei si a rofecoxibului din forme farmaceutice

de dozaj prin HPLC 51HPTLC
343
8.9.3. Determinarea prin HPLC a aciclovirului 5! a impuritatilor inrudite
355

VOLUMUL-nCAP. 9. CR1TERII STANDARD DE VAUDARE. APLICAJULA DETERMINAREA IN

UVA VITAMINEI D3 DIN VITAMINOL, DUPA SEPARAREA El PRIN
HPLC
377
9.1. Criterii standard de validare
377
9.2. Validarea unei metode de determinare in UV a vitaminei D3 din vitaminol, dup5
separarea sa prin HPLC
384
9.2.1. Separarea vitaminei D3 prin HPLC
384
9.3. Dozarea vitaminei D3 in UV la 254 nm
387
CAP. 10. VALIDAREA UNEI METODE GAZCROMATOGRAFICE.
400
lO.l.Notiuniintroductive
400
10.2. Conditii deoperarein cromatografia de gaze
403
10.3. Aplicafii ale cromatografiei de gaze in analiza si controlul medicamentelor....406
10.3.1. Separarea GC a unor barbiturice si aunor amfetamine si precursori
410
10.4. Cuplajul GC-MS asocial cu radia|ii moleculare supersonice In analiza de mare
viteza
412
10.5. Cuplajul LC-GC
418
10.6. Cuplajul HPLC-HRGC
420
10.7. Determinarea urmelor de solvent! organic! dintr-un complex aluminic
422
10.7.1 Efectuarea analizei
422
10.7.2. Protocol operator
426
10.7.3.DatelevaIidariipropriu-zise
433
CAP. 11. SPECTROSCOPIA RMN IN ANALIZA MEDICAMENTELOR
11.1. Aspecte generale
11.2. Spectroscopia RMN in farmacopeile mtemajionale
11.3. Detectia impuritatilor farmaceutice
11.4. Validarea spectroscopiei RMN - cantitativS
11.4.1. Aspecte generale
11.4.2.BazeleRMN-cantitative
11.4.3. Validarea unei metode RMN

436
436
438
440
443
443
444
445

CAP. 12. VALIDAREA ANALITICA IN ETAPA DECERCETARE-DEZVOLTARE A

MEDICAMENTULUI
462
12.1. Cercetarea pentru noi molecule active si faza preclinica
463
12.2 Fazele clinice de testare
463
12.3. Aplicarea gmp in procesul de dezvoltare
465
12.4. Cerinfele unui sistem convenabil pentru testarea eficientei
470
12.5. Parametrii strategiilor de validare
471
12.5.1. Liniaritatea
471

12.5.2. Exactitatea
12.5.3. Precizia
12.5.4. Specificitatea
12.6. Studiul de validare a dizolvarii substanjelor medicamentoase
12.6.1. Prepararea probei substantei cercetate
12.6.2. Testarea calitativS a dizolvarii
12.6.3. Validarea prepararii probei
12.6.4. Validarea metodei de dizolvare
12.7. Determinarea apei dintr-un ingredient farmaceutic activ printr-o metodS
coulometrica validata
12.7.1.Reactivi simateriale
12.7.2. Validarea metodei
12.8. Studiul de validare a unui test pentru metale grele
12.8.1. Validarea metodei de dozare a metalelor grele

473
473
475
480
481
483
484
488
491
491
493
.496
498

CAP. 13.ASIGURAREA
CALITATHPROCESULUIDEPREPARAREA
MEDICAMENTULUI.
13.1. Normele de bun5 fabricate sau preparare
.._
13.2. Validarea stabilitafii
13.3. Norme de buna practica in laboratoarele de analiza
13.4. Cerinfe $i reglementSri ale validarii in industria medicamentelor.
13.4.1 Definifii importante
13.4.2. Analiza substan|elor inrudite
13.4.3. Convenabilitatea analizei unei substanje inrudite
13.4.4. Validarea experimentala a substantelor inrudite
13.4.5. Robusteteaunei metode de analiza.
13.5. Unele aspecte privind validarea producerii industriale a medicamentelor
13.6. Standarde calitative in medicatia generica
13.6.1. Asigurarea calitafii medicamentelor generice
13.6.2, bioechivalenta medicamentelor generice

506
508
509
510
515
517
518
521
524
532
533
538
538
539

CAP. 14. UTILIZAREA CHEMOMETRIEI IN ANALIZA 1CONTROLUL

MEDICAMENTELOR
14.1.Preprocesareaprobelor
14.2. Netezirea sau curatirea semnalului analitic de zgomotul de fond
14.2.1. Netezirea medie
14.2.2. Cura^irea medie succesiva
14.2.3. Curatirea mediana succesiva
14.2.4. Curatirea polinominala succesiva
14.2.5. Curajirea cu filtrul Fourier
14.3.Corectii aleliniei debaza
14.3.1. Abordarea de modelare explicits
14.3.2.Derivate
14.3.3. Diferenta simpla continua
14.3.4. Diferenta medie succesiva/continua
14.3.5. Metoda Savitzky-Golay si Gorry

542
542
543
546
547
548
548
548
550
550
552
553
554
554

14.4. Tipuri de funcjii de calibrare

555
14.4.1. Nivelul unic de calibrare
555
14.4.2. Calibrarea multi - nivel
555
14.5. Controlul calitatii formularilor farmaceutice continand catecolamine
558
14.5.1. Designul statistic experimental aplicat la medicamente
559
14.5.2. Aplicarea designului statistic la determinarea nimesulidei si a combinatiei
diazepam-otiloniu
560
14.5.3. Determinarea CZE a clortlidratului de rufloxacina
561
14.5.4. Utilizarea statisticii variate pentru determinarea altor medicamente
563
14.5.6. Designul Plackett-Burmann
565
14.6. Metode chemometrice de determinare a unor antidepresive si studiul solubilitajii
lor
566
14.6.1. Metoda raportului spectrelor derivate cu divizor dublu
568
14.6.2. Determinarea experimentala a imipraminei, amitriptilinei i perfenazinei....570
14.6.3. Teste aplicate pentru tablete
571
14.6.4. Rezultate si discufii
571
14.6.5. Exprimarea valorii analitice
577
14.6.6. Uniformitatea continutului. teste de dizolvare
579
CAP. 15. VAL1DAREA $1INTERPRETAREA DATELORINANALIZA
CLINICA.
IS.l.NoJiuni introductive,
15.2. Obiective in chimia si analiza clinica.
15.3. Interpretarea informatiilor si luarea deciziilor.
15.4. Abordarea Bayesiana in luarea deciziilor
15.5. Validarea generate a rezultatelor testelor clinice si atestelor analitice
15.6. Analiza caracteristicilor receptorului operator
CAP. 16. VALIDAREA METODELOR BIOANALITICE CLINICE
16.1.No{iuni generale
16.2.Practica validarii actuale a metodelor bioanalitice
16.2.1. Definitii siparametrii important!
16.3. Selectivitatea metodelor bioanalitice
16.4. Standarde de referinfa si curba standard
16.5. Exactitatea si precizia
16.6. Regasirea procentualS
16.7. Stabilitatea analitului
16.8. Alte verificari suplimentare
16.9. Determinarea metabolifilor.
16.10. Cercetarea stereoizomerilor
16.11. Raportul de validare
16.12. Obiectivele chimiei analitice clinice
16.12.1. Evaluarea exactitafii
16.13. Determinarea bioanalitica a lumefautrinei si validarea metodei
16.13.1. Substante $i metoda

583
583
585
586
593
....595
599
610
610
612
612
614
615
617
617
618
619
622
623
623
625
634
638
638

16.13.2. Prepararea solutiilor probelor si de standarde de calibrare si Stabilitatea

lor.

639
16.13.3. Procedeul analitic sau modul delucru
..639
16.13.4. Validarea rezultatelor
641
16.14. Determinarea rapida a canabinoidelor in produsi alimentari de canepa prin
HPLC-MS
645
16.14.1. Date generale
645

CAP. 17. VALIDAREA METODELOR BIOANALITICE NO1.

17.1. Nojiuni introductive
*
17.2. Profilele preciziei
17.3. Metodadozei eficace
17.4. Estimarea exactitajii
17.5. Test de validare a susceptililitatii antibiotice
17.6. Determinarea homocisteinei plasmatice prin metodologia fluorescenta de
polarizare imunoexperimentalS
17.7. Reactivitatea incrucisata.
17.8. Determinarea activitatii enzimatice a p-galactoxidazei..
17.9. Utilizarea unor derivafi de hapten pentru prepararea imunogenului
17.10. Stabilirea valorilor care trebuie sa fie eliminate pentru experienjele
semicantitative ale canabinoidelor
17.11. Exemplificarea analizei statistice ANOVA a unor date bioanalitice
CAP. 18. NORMEDEACREDITAREA LABORATOARELORDEANALIZA $1
CONTROL
18.1. Aspecte generale referitoare la acreditare
18.2. Acreditarea laboratoarelor de analize in Europa
18.3. Criteriide acreditare
18.4. Etapele acreditarii laboratoarelor de analize
18.5. Normede acreditare a laboratoarelor de analize in Romania
18.6. Unele aspecte ale acreditarii laboratoarelor de analiza din universitati
18.6.1. Norme ISO si IEC pentru asigurarea calitatii metodelor de analiza
18.6.2. Certificarea calitafii managementului unui laborator INNA
18.6.3. Competenta tehnicS a personalului
18.6.4. Materiale de referin{5 si de calibrare
'.

657
657
659
661
662
666
667
671
672
674
676
678

690
690
691
693
694
701
705
707
708
709
709

INTRODUCERS

Validarea unei metode de analiza este o metodologie de verificare si de confirmare a

validitatii stiintifice a unei metode de analiza. In acelasi timp, conceptul de validare poate
fi inteles si ca metodologie de acreditare stiintifica a unei metode de analizS, avand drept
scop sa demonstreze ca metoda considerata (sau procedeul analitic) corespunde utilizarii
pentru care a fost conceputa, elaboratfi si verificata.
Dupa Farmacopeea Americana, USP-XXI, validarea unei metode analitice este un
proces prin care, utilizand studii de laborator, deci prin determinari experimentale si analize matematico-statistice, se confirms ca performanfele caracteristice ale metodei validate
satisfac cerintele pentru aplicatiile practice intentionate. Prin urmare, validarea. ca
metodologie de verificare si confirmare, are ca obiect cresterea increderii comunitatii
stiintifice in rezultatele fumizate de metodele de analiza si control, tinand seama de variabilitatea ce apare la aplicarea unei metode de citre diferi|i analisti, in laboratoare diferite,
uneori cu aparatura diferita, dar de acelasi tip etc.
Se poate spune ca validarea este o components importanta in determinarea si asigurarea increderii in repetabilitatea si rcproductibilitatea rezultatelor analitice, in asigurarea
calitatii acestor rezultate, deci si in metoda de analiza ce conduce la aceste rezultate.
Conceptul de validare si lucrarile numeroase ce au ca obiect aceasta components
importanta a analizei este relativ nou. In 1985 a avut loc o conferinta care a reunit producatorii americani de medicamente (Pharmaceutical Manufacturing Association, Quality
Control Section) si reprezentantii Comisiei pentru Farmacopeea Americana, conferinta la
care au fost elaborate unele recomandari privind validarea metodelor de analiza. In 1986
revista "Pharmacopoeial Forum" a publicat un articol intitulat "Current Concept for the
validation of compendia! assays", care a starnit dezbateri si confruntari de opinii in perioada 1986-1988. Din aceste dezbateri s-a desprins concluzia ca este necesara elaborarea unui
capital pentru USP, privitor la validarea tuturor metodelor analitice ce se aplica la medicamente, capitol ce urma s5 fie oficializat in USP, editiile XX -XXV.

in 1988, tot revista "Pharmacopoeial Forum" a publicat un text intitulat "Validation

of compendial assay-guidelines", care a fost apoi inclus in suplimentul USP-XXI, ca un
capital aparte intitulat "Validation of compendial methods" pus in aplicare din ianuarie
1990, capital ce a aparut si in USP XXII - XXV.
Pe de alta parte, pentru a veni in sprijinul producatorilor de medicamente, in vederea
obtinerii autorizatiilor de fabricate pe baza dosarelor ce le-au intocmit pentru validare,
"Federal Code of Regulation" a publicat un text intitulat "Guidelines for submitting samples and analytical data for method evaluation".
Concomitent, au avut loc diverse si ample comentarii asupra aceleiasi probleme a
producatorilor europeni de medicamente, dezbateri ce au determinat "Comitetul CEE pentru specialitati fannaceutice, Grupul pentru calitatea medicamentelor", sa elaboreze o nota
explicativa al carei text final a fost adoptat in august 1989 cu Nr. CEE/844/87 si care a constituit apoi nucleul elaborarii unor reglementari privind metodologia validarii metodelor de
analiza si control in tarile europene avansate, mai ales in acelea care sunt membre ale CEE
(Franta, Marea Britanie, Germania, Belgia, Italia, Olanda etc.).
Cu toate divergentele de opinii privitoare la conceptele si definitiile utilizate sau la
modul de abordare a problemelor, necesitatea validarii tuturor metodelor si procedeelor
analitice este azi unanim acceptata. In perioada 1990- 1996 au aparut numeroase materiale
si carti privitoare la metodologia validarii metodelor si procedeelor de analiza, ca si la aplicarea practica a acestei metodologii. fn Romania, aceasta este prima carte de acest fel,
prima editie fiind publicata in anul 1998.
fn prezent exista o adevarata strategic a validarii, in stransa legatura cu conceptele si
tendintele ce sunt incluse in strategia analitica in general, desigur cu accent pe strategia
analizei si controlului de medicamente, care implica analiza si controlul puritatii materiilor
prime utilizate in producerea medicamentelor, a produsilor intermediari, a substantelor
medicamentoase finale si a formelor farmaceutice rezultate prin conditionarea lor.
Pe de alta parte, este cunoscut faptul ca nici o substanta medicamentoasa sau nici un
medicament nu poate patrunde pe piata europeana si pe cea americana fara a fi insotite de
dosarul de validare aferent.
Trebuie subliniat faptul ca principalul scop al validarii consta in selectarea celor mai
bune si mai accesibile metode de detectie si de dozare a unei specii medicamentoase, sau
a unor impuritati farmaceutice, produsi de degradare (metaboliti), numiti si substante inrudite sau a unor componente biologice. Astfel de metode se bazeaza pe date si performante
obiective, deziderat cerut de reglementarile in domeniul analizei si controlului de medicamente, ca si de cele referitoare la laboratoarele clinice, care trebuie sa aiba la indemana,
atunci cand se introduc metode sau teste noi de analiza, documentatia aferenta privind
descrierea detaliata a metodei si a datelor validarii.
insemnatatea deosebita a validarii rezulta si din faptul ca rezultatcle analitice
fumizate de metodele confirmate si acceptate trebuie sa fie de mare Jncredere, deci sa fie
sigure, deoarece, pe baza lor si a altar date clinice, se adopts decizii de mare raspundere in
stabilirea diagnosticului si a conduitei terapeutice, de care depinde refacerea omului
suferind.
Mai trebuie subliniat ca, de la aparitia primei editii a lucrarii "Validarea metodelor de
analiza si control, Bazele teoretice si practice" (Liviu Roman, Marius Bojita, Robert

Sandulescu, Ed. Medicala, Bucuresti, 1998), au aparut numeroase lucrari, review-uri, publicatii, ca si noi documente si norme europene, americane etc, ceea ce a impus revizuirea,
completarea si corijarea unor erori sau scapari, astfel incat sa poata fi elaborate aceasta a
doua editie, imbunatatita, mai extinsa si mai utila prin problematica si exemplele mai
bogate si mai bine puse la punct.
In context, este de mentionat ca, in actuala editie, sunt cuprinse si Normele Nationale
ale Agentiei Nationale a Medicamentului, referitoare la calitatea medicamentului (1999),
precum si Ordinul nr. 1030/2004 al Ministerului Sanata|ii, pentru modificarea Ordinului
Ministerului Sanatatii nr. 119/2004 pentru aprobarea "Normelor privind autorizarea si
fiinctionarea laboratoarelor care efectueaza analize medicale". Tot aici este de precizat ca
in acest an (28.03.2005) au aparut uncle "Norme metodologice de acreditare", elaborate de
RENAR - Romania, care este Asociatia de Acreditare din Romania (Romanian
Accreditation Association).
Din aceasta succinta expunere de motive rezulta necesitatea $i insemnatatea
elaborarii si publicarii acestei lucrari utile pentru cercetatorii analisti din toate domeniile de
activitate, cu precadere pentru cei ce lucreaza in industria medicamentelor, in laboratoarele
de analiza si control, in laboratoarele clinice (de chimie clinica), de biochimie, de biologic
in general si de biologic moleculara, in laboratoarele de control al mediului (apa, aer, sol,
alimente) etc. Apreciem cJ in prezent si cu atat mai inult in viitor nu se mai poate concepe
si accepta sa se lucreze cu metode de analiza nevalidate, neverificate, care nu indeplinesc
criteriile stiintifice de acceptanta impuse de comunitatea stiintific^ internationala si mai
ales de cea europeana, in perspectiva aderarii Romaniei la Comunitatea Europeana.
Suntem deschisi observatiilor si sugestiilor cititorilor si confratilor nostri.

Autorii

Formularea iniJialS a problemei In analizS.

Cantitatea, starea,
concentratia

Atomi, ioni, grupari

functionale, molecule
Pregatirea ejantionului
prin pretratare

(^SeparareJ)

CAP. 1. METODOLOGIA ANALITICA GENERALA

Trecere intr-o
forma masurabil&

Metode combinate

fn toate domeniile. de activitate umana se folosesc metode de analiza a substantelor

chimice, medicamentoase sau nu, de mteres biologic si medical, de interes alimentar etc.,
metode care trebuie sa fie performante, deci de foarte buna calitate.
Conceptul de performanta inseamna valoare, ceea ce in orice domeniu inseamna calitate, iar calitatea este cerinta fundamentals a dezvoltarii, adica a progresului stiin^ific,
tehnic si tehnologic, ceea ce inseamna, mai ales in condi^iile actuate, competitie intre producatorii de medicamente, dar si intre producatorii de bunuri de larga utilitate publica.
Aceasta competitie in domeniul medicamentului inseamna calitatea materiilor prime, a
produsilor intermediari, a produsilor finali si a formelor de dozaj, respectiv a medicamentelor in forma finala de distributie. Calitatea inseamna si stabilitatea medicamentelor
in timp si lipsa toxicitatii si actiunilor adverse sau eel putin minimizarea acestora. Dar calitatea, in orice etapa si in orice domeniu, se atesta prin buletinele de analiza, deci prin
metodele de analiza fizice, chimice si instrumentale, iar calitatea metodelor de analiza se
atesta prin validarea acestora conform metodologiei de validare, metodologie care are la
baza metodologia analitica ale carei etape si faze sunt reprezentate prin Strategia analitica
(Fig. 1.1). Prin parcurgerea tuturor acestor etape si a rigorilor ce se impun in fiecare etapa,
se urmareste optimizarea continua a metodelor de analiza, in pas cu dezvoltarea stiintifica
si tehnologica, ceea ce inseamna optimizarea procedeelor de separare a analitilor, optimizarea detectiei (specificitate, selectivitate, limita de detectie), a determinarii cantitative
(exactitate. precizie, repetabilitate, reproductibilitate, limita de cuantificare) si a evaluarii
rezultatelor analitice, care trebuie sa fie obiective si de mare incredere; adica ele trebuie sa
fie sigure, iar acest ultim aspect este de importanta capitala, deoarece pe baza sigurantci
rezultatelor analitice se iau decizii, ceea ce, in domeniul medical si farmaceutic, inseamna
calitatea viejii si redarea sansei de a trai oamenilor bolnavi.

Selectarea metodei
- fizica
- chimica
- directa
- indirecta

Marimea masurata

Rezultatul masuratorii
Analiza calitativa, cantitativiL,
determinari de structura
Evaluarea:
- analiza erorilor
- prezentarea datelor
- protocol analitic
Fig. 1.1. Strategia analitica generals
Din examinarea schemes strategiei analitice generale se poate constata ca
strategic cuprinde practic toate etapele executarii unei analize, care implied:
1) formularea si cunoasterea problemei care trebuie rezolvata prin analiza;
2) cunoasterea calitativa a naturii si compozijiei materialului dat pentru analiza:
atomi, ioni, molecule, molecule complexe, macromolecule, grupari functionale,

3)
4)

5)

6)
7)

8)

natura matricei etc., precum si cantitatea de material de aualizat, starea lui, eventual concentratia aproximativa;
esantionarea, care implica pregatirea materialului prin omogenizarea lui si evaluarea cantitatii potrivite de material in vederea executarii analizei;
pregatirea esantionului, deci a probei, in cadrul unui proces complex de pregatire
si pretratare a probei, care implica: cantarirea exacts a cantitatii de proba,
dizolvarea (cu evitarea contaminarii cu impuritati si a pierderilor de analit),
imbogStirea / preconcentrarea analitului pentru a-1 aduce la un nivel de concentratie detectabil si dozabil, purificarea analitului prin separare (extractie, cromatografie etc.), transformarea analitului intr-o forma masurabila, prin derivatizare chimica, utilizand metode potrivite, singure sau combinate sub forma unor
cuplaje de metode, una de separare si alta de detectie-dozare;
marimea ce trebuie masurata si selectarea metodei de masurare, efectuarea
masuratorii, care serveste in analiza calitativa (detectie) si cantitativa (dozare),
pentru determinari structurale etc.;
evaluarea rezultatelor analitice si a erorilor;
prezentarea datelor sub forma unui protocol analitic care trebuie sa includa
descrierea tuturor fazelor si procedeelor utilizate, rezultatele finale obiectivizate
prin calcule matematice si statistice;
formularea concluziilor si luarea deciziei in raport cu problema analitica data
initial si cu ceea ce asteapta beneficiarul in legatura cu aceasta.

1.1. Alegerea metodei de analiza

Alegerea metodei de analiza se face tinand seama de o serie de. criterii, intre care:
problema analitica care trebuie sa fie rezolvata, natura probei si complexitatea matricei
probei, etapele necesare a fi parcurse, operatii care trebuie sa fie facute, cantitatea de material (esantion) data pentru analiza, de cerintele impuse de beneficiar in privinta specificitatii, selectivitatii, sensibilitatii, costurilor, sigurantei (certitudinii) datelor care se obtin
etc.
finand seama de toate aceste aspecte, nu se poate face o clasificare generala riguroasa a tuturor metodelor de analizS, dar se pot face clasificari in functie de anumiti
parametri. Astfel, in tabelul 1.1 este prezentata o clasificare a metodelor de analiza in
functie de cantitatea de analit si de tipul sau forma esantionului.
O clasificare a componentilor in functie de natura lor si de marimea probei ce trebuie
luata in lucru este prezentata mai sugestiv si mai exact in tabelul 1.2, iar in tabelul 1.3 este
prezentata sensibilitatea comparative a metodelor de analiza.
La alegerea metodelor de analiza trebuie sa se tina seama de domeniile de concentratie in care o metoda ofera rezultate de incredere, deci exacte si precise. De aceea, in
tabelul 1.4 sunt prezentate metodele cantitative de analiza In functie de domeniile de concentratie in care pot ele opera si unele dintre caracteristicile lor. In tabelul 1.5 sunt date
metodele electroanalitice si domeniile de concentratie in care opereaza si de care depinde
sensibilitatea lor.

Tabelul 1.1- ClasiGcarea epantioanelor de analiza in functie de cantitatea de analit

$i de tipul epantionului

S domeniul de masa al esantionului

Q domeniul de masa absoluta

+2 grame (g)
+1
0 decigrame (dg)
-1 centrigrame (eg)
-2 miligrame (mg)
-3 micrograme ( g)
-4
-5
-6 nanograme (ng)
-7
-8
-9 picograme (pg)
-10
-11
-12 femtograme (fm)
-13
-14
-15 attograme (ag)
-16
-17
-18

C proportia

esantioane microscopice
compus principal
semi-micro
microscopic
submicroscopic
ultramicroscopic

compus secundar
urme

ppm

ppb

microurme
nanourme

ppt

ppq

picourme

+2
+1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-14
-15
-16
-17
-18

Nota: p reprezinta exponentni lui 10 f al unitatii d& masurare

Tabelul 1.2. Tipuri de component! fi marimea probei

Component!
major!

Component! de analizat
Component!
Component! minor!
secundari
(urme)

10-9

10-24. 1Q-27
10-21 . i0-24
10-18 . 10-21
10-15-10-18
10-12-10-15

IO- - l(H

io-

10-9-10-12

10-18 - 10-19

io-15 - io-16

10-21
10-18

10-12 - 10-13

10-15

10-9 - 10-10
6

IO- -IO3

io-12

Grame proba
10-18 (attogramica)
10-15 (femtogramica)
10-12 (picogramica)
1Q-9 (nanogramica)
1Q-6 (microgramica)
10'3 (miligramica)

Urtnare din pag. 10

Cromatografia

Tabelul 1.3. Compararea sensibilitatilor metodelor analitice in funcfie de tipul lor

Metoda de analizl

Sensibilitatea

microgravimetrica

pana la 10 g (1 ng)

microvolumetrica

intre 10'9 - lO'10 g (1 - 0,1 ng)

absorbjia atomica electrotermala

pana la 1Q-11 g (0,01 ng)

fluorimetria

pana la lO'11 - 10'12 g (0,01 ng - 1 pi5)

analiza prin masuratori cinetice

panaialO- 1 3 g(0,lpg)

Cromatografia de gaze

panalalO- 1 3 g(0,lpg)

activarea cu neutron!

pana la 10'14 g (0,01 pg)

tehnici radioizotopice

pana la 1047 g (0,01 ag)

Intr-o maniera similara, se pot face subclasificari ale diverselor tipuri de metode, de
exemplu cromatografice, specrrofotometrice, termice etc.
In acest context trebuie precizat ca, pentru a obtine rezultate analitice bune, de
mcredere, este necesara o atenta prelevare si. pregatire a probei. Asa, de exemplu, primul
pas in efectuarea unei analize este obtinerea unei probe reprezentative si omogene, in care
concentratia analitului este uniforma in toata masa materialului de analizat sau in tot volumul solutiei sale. Omogenizarea probei, mai ales daca se pleaca de la materiale solide,
implica triturarea atenta a materialului (de exemplu, comprimate), fara pierderi si fara con-

pana la
(Crotnatograiia
10-18
capilara micelara
(6000 mol.)
cu detectie
fluorescenta)
Spectroscopia atom- 10-7-10-12
ica de emisie
Spectroscopia atom- 10-6-10-9
ica de absorbtie
10-2-10-10
Cinetica

RadiochimicS.

Gravimetria
Titrimetria chimica

Titrarea
potenjiometrica
Voltametria

Domeniul
Precizia
Tip de
de cone.
aprox. %
analit
ruol/L
CHIMICE
- anorganic
10-1-10-2
0,1
- organic
lo-i-io-4 0,1 - 1,0 - anorganic
- organic
INSTRUMENTALE
2
- anorganic
lo-i-io-6
10-3-10-10

Electrogravimetria

lo-i-io-

Spectro fotometria

10-3-10-8

Spectrotluorimetria

10-6-10-9

2-5

- anorganic
- organic
0,01 - 2 - anorganic
- organic
2
- anorganic
- organic
2 - 5 - organic

Selectivitatea

Viteza
de
executie

mare

ridicat

anorganic

mare

mare

ridicat

anorganic

mare

mare

- anorganic buna mare

- organic moderata
- enzime mare
- anorganic mare
mare
- organic

moderat ridicat
moderat

2-3

10-12-10-15

mare

Tabelul 1.5. Tipuri de metode electroanalitice $i domeniile de concentrate

in care se pot aplica
stripping voltametria
polarografia puls diferentiala

Tabelul 1.4. Clasificarea metodelor cantitative de analiza $i caracteristicile lor

Metoda

rapida - moderat moderata mare

organic
buna
(multicomponent)
organic
mare

2-5

10-4-10-9

polarografia cu scanare rapida.

Costul

slaba mica
moderata
idem
idem

scazut

buna

idem

polarografia AC
coulometria; 1 const,
voltametria - electrod solid
polarografia DC

idem

amperometria
potentiometria

buna

mare

moderata moderat

moderata slabmoderata
buna
mare moderata moderata
moderata moderata

'

coulometria; E const
j_

10'

10-'M

10 M

107M

10'M

10 M

moderat
slabmoderat
moderat

taminarea lui. La fel de importanta este si etapa de dizolvare / pretratare, prin care trebuie
sa se asigure un domeniu de concentratie a analitului corespunzator domeniului de concentratie in care poate opera metoda. De regula, la prelevarea si pregatirea / pretratarea materialelor date spre analiza trebuie sa se aiba in vedere cantitatea necesara efectiv analizei,

Continuare in pag. 11

10

11

dar si asigurarea unei contraprobe in cuantum indestulator pentru eventuale verificari sau
expertize. Exista si cazuri in care probele sunt cantitativ mici, de aceea ele se consuma integral sau, daca este posibil, se aleg metode de analiza nedestructive.
In cazul probelor biologice (sange, urina etc.), compozitia lor variaza mult daca
recoltarea se face inainte si dupa masa sau chiar dimineaja, inaintea servirii mesei (mai ales
pentru urina) care, uneori, trebuie sa fie colectata pe 24 ore.
Analistul trebuie sa tina seama ca pentru conservarea probelor/analitilor trebuie sa se
adauge unii reactivi, cum este NaF pentru glucoza, sau anticoagulanti, ca de exemplu
acidul citric si citratul de sodiu, substante care pot afecta si falsifica rezultatele analitice.
Este important sa se pastreze contraprobe pentru expertize in caz de litigiu sau de nevoia
repetarii analizei pentru dobandirea certitudinii lor.
Frecvent, la obtinerea probelor trebuie sa se ia unele precautiuni pentru a preveni si
micsora contaminarea, pierderea de analit si descompunerea probelor sau modificarea
matricei lor datorata aerului, luminii sau containerelor utilizate. De asemenea, probele trebuie sa fie ferite de umezeala, iar probele care contin enzime usor degradabile trebuie sa
fie analizate imediat dupa prelevare. Aceasta prevedere este valabila si pentru concentratiile in urme, care se pot pierde prin adsorbtie pe peretii containerelor in timpul transportului
si conservarii.
fn cazul probelor solide, acestea trebuie sa fie uscate in prealabil, deci inaintea efectuarii analizei, in etuva, la 110-120C, timp de 2 ore, dupa care se introduc in exicator pentru a se raci in absenta umiditatii si a aerului.
Toate aspectele mentionate mai sus trebuie respectate si avute in vedere, deoarece
cuantumul erorii produse in etapa de esantionare-prelevare este de 40-45% din eroarea
totals, deci foarte mare si ea trebuie redusa la maximum.
Esantionarea include, in primul rand, obtinerea unor probe analitice "valide", omogene si reprezentative, de aceea aceasta etapa este una dificila in mersul analizei si ea necesita o anumita "tratare statistica" pentru corecta prelevare si prelucrare-pregatire a probelor.
Aceasta tratare statistica este necesara deoarece exactitatea si precizia masuratorilor
analitice sunt afectate si limitate de erori intr-o masura mai mare decat in etapele de
masurare analitica.
In tratarea statistica a esantionarii trebuie sa se defineasca, mai intai, "varianta generala" a analizei, S 0 care se exprima prin suma varianjelor esantionarii, Ss, si a "restului de operajii analitice", S2a :
c^

O^_i_ C1^

On Oc "> ij,,

f~\ \\

V^'-^J

Varianta datorata esantionarii se poate cunoaste atunci cand se prepara probe multiple din materialul dat pentru analiza si utilizand tehnici precise de masurare a semnalelor
analitice. Trebuie precizat ca, reducand valoarea variantei S a la 1/3 din valoarea variantei
esantionSrii, se obtine un castig mic.

Se considers, pentru exemplificare, cazul unei deviatii standard absolute pentru

esantionare egala cu 3,0%, iar deviatia standard absolutS a analizei este Sa= 1%; in acest caz:
S20= (3,0)2 + (1,0)2 = 10, iar S0 = 3,2%.
Deoarece imprecizia esantionarii este egala cu 0,93, iar aceea a rnasuratorii analitice
cu 0,07 (caz in care S^ = 1% = 0,93 + 0,07%), rezulta o contributie practic neinsemnata a
variantei analizei (Sa = 0,07%) si o contributie mare a variantei esantionarii (Ss = 3,0%) la
varian^a generala S,,.
Din aceste consideratii se desprinde "concluzia" ca, atunci cand imprecizia
esantionarii probei este mai mare, este mai bine sa se execute un numar mai mare de
analize pe un numar mare de probe, chiar printr-o metoda mai putin precisa, dar mai
rapida.
Evident ca ideal este sa se lucreze pe un numar rezonabil de probe (n = 3-5), dar cu
o foarte mare atentie in fazele de prelucrare si pretratare, pentru a micsora cat mai mult erorile, respectiv incertitudinea acestei faze importante a analizei.
Pe de altS parte, trebuie stiut ca valoarea adevarata (care face obiectul masuratorii
analitice) trebuie s5 se incadreze in domeniul de concentratie al continutului in analit al
materialului integral dat spre analiza; acest domeniu (interval) se poate estima cu un test
"t", la un nivel de incredere dat, utilizand relatia:

=
Jn
din care se scoate expresia de calcul a testului:

(1.2)

/=Se reaminteste ca X reprezinta media aritmetica a rezultatelor analitice obtinute

printr-o anumita metoda de analiza a materialului dat, iar s este deviatia standard a unei
probe individuale, obtinuta anterior printr-o analiza a unor probe dintr-un material similar
sau pe materialul dat, daca se pot executa suficiente probe; n este numarul de probe efectuate in analiza.
Tot in acest context al tratarii statistice a esantionarii se pune si problema "marimii
minime" a unei probe, utilizand procedee statistice potrivite pentru materiale heterogene,
procedee bazate pe varianta esantionarii. Asa, de exemplu, pentru o populatie de particule
a unor specii diferite, foarte bine amestecate pentru omogenizare, marimea minima a
probei, pentru cantitati individuale, se poate calcula din "constanta de esantionare" a lui
Ingamell - K^.

aR2 = Ks

(1.4)

in care a este masa (greutatea) probei analizate, R este deviatia standard relativa (procentuala) a compozitiei probei, iar Ks este cantitatea de proba pentru o incertitudine de 1% a
esantionarii, la un nivel de siguranta de 68% (o); constanta Ks se obtine determinand
12

13

deviatia standard dintr-o serie de probe cu greutatea a; din relatia ultima rezulta ca varianta
esantionarii este invers proportionals cu greutatea probei.
Revenind la marimea minima a unui esanlion initial, se considera, pentru exemplificare, ca un material dat pentru analiza confine Ks = 0,54 g N2 %; daca trebuie sS se determine azotul prin analiza, cu o precizie de 0,2% (R = 0,2%), cantitatea minima a de esantion
care trebuie asigurata pentru executarea analizei este egala cu:
0,45

de unde:

(1.5)

(jgviatie standard finala a rezultatelor R = 0,01%, se pleaca de la valoarea testului t = 1,96

pentru n = (vezi Tabelul 4.1, p. 94, cu valorile lui t), la un nivel de siguranta de 95%;
2
2
aceasta valoare a lui t, ca si valorile S S si S X servesc la calcularea numarului preliminar
de probe:
' (0.020)' _ 3,8416 0,0004
6,0 probe
(0,016)"
0,000256

S*

Dar pentru npr = 6, valoarea t = 2,447 (si nu cu t pentru n = =), deci in aceste circumstan{e:
, = (2.447? (0,020? = 5,9870 - 0,0004
(0,016)?
0,000256

0,45
= 11,25 g
0,04

Desigur ca cele 11,25 g material de analizat trebuie sa fie macinate fin pentru omogenizare, iar din materialul omogenizat se cantaresc probe de cateva zeci sau sute de mg,
la balanta analitica, in functie de metoda de analiza aleasa, respectiv de sensibilitatea ei si
in functie de tipurile de component! si de marimea probei.
O alta problems importanta, in contextul esantionarii $i prelucrarii probei, este aceea
a numarului minim de analize care trebuie efectuate, pentru a obtine un nivel de incredere
si de siguranta corespunzator pentru rezultatele analitice, iar pentru aceasta se utilizeaza
relatia:
.7

nt

R -X2

(1.6)

in care:
r= valoarea testului Student pentru nivelul de incredere dorit (90%, 95% sau 99%);
5 j = varianta esantionarii;
R - deviatia standard relativa acceptabila a mediei rezultatelor analitice;
X = media aritmetica a rezultatelor analitice obtinute prin analiza.

insS. pentru n = 9, valoare lui t = 2,262 si prin urmare:

_ (2,262?-(0,020?
**'

(0,016?

5,1166' 0,0004 = 7,999 = 8,0 probe

0,000256

In concluzie, pentru a obtine o deviatie standard finala de R = 0,016% a rezultatelor

analitice, trebuie sa se analizeze opt probe la un nivel de incredere de 95%, rezonabil.
In unele cazuri se impune o separate foarte buna a componentilor dintr-o probS. Asa,
de exemplu, in analiza si controlul medicamentelor ilicite este necesara separarea analitilor
prin cromatografie capilara micelara electrocinetica (numita si electroforeza capilara in
mediu micelar), MEKC (micellar electrokinetic capillary chromatography), metoda care
are o foarte mare capacitate de rezolutie, asa cum rezulta din Fig. 1.2
Fig. 1.2. Separarea prin MEKC a unor droguri cfe interes judiciar
0,400,35-

Marimile X si Ss se pot obtine din masuratori analitice preliminare (sau pot fi

cunoscute din masuratori similare anterioare); pe de alt5 parte, trebuie retinut ca produsul
dintre media aritmetica X si varianta Ss reprezinta deviatia standard absoluta, iar
R = SX/X', prin urmare, ecuatia anterioara se poate serie astfel:

2-

be c

0,30-

0,25-

0,20k

0,15-

0,10-

(1.7)

0,05j_

n-

0.00

Marimile Ss si Sx se pot exprima ca deviatii standard absolute sau relative.

Pentru exemplificare, se considera un material care confine 5% analit (g/g), deviatia
standard relativa a esantionarii fund Ss = 0,020%; deviatia standard R = 0,16% (pentru un
nivel de incredere de 95%), iar deviatia standard pentru continurul de 5% analit este Sx =
0,08%.
Pentru calcularea numarului minim de probe care trebuie sa fie analizate, pentru o

12

16

20

24

28

32

36

40

44

Conditii: capilarS de 47 cm cu d.i. = 50 \im; dislanja pani la detector: 25 cm; voltaj = 20 IcV; T = 40C,
tampon SDS 85 mM/fos&t 8,5 raM/borat 8,5 mM/15% acctonitril, pH = 8,5; detector UV, 210 nm;
cone, probei 250 mg/mL din fiecare drog
(a) psilocibina, (b) morfina, (c) fenobarbital, (d) psilocini, (e) codeina, (f) metaqualona, (g) LSD, (h) heroina,
(i) amfetamina, (j) librium, (k) cocaina, (1) metamfetamini, (m) lorazepam, (n) diazepatn, (o) fentanil, (p) PCP,
(q) canabidiol, (r)^-THC-tetrahidrocanabinol

14

15

Asa cum se poate observa din figura 1.2, separarea MEKC a drogurilor analizate se
face cu forme foarte bune, inguste, ale picurilor $i nu se observa nici o descompunere, pentru nici una dintre substantele cercetate, desigur in conditiile stabilite. Electroforeza MEKC
s-a dovedit foarte potrivita pentru aceste droguri, deoarece toate substantele sunt si trebuie
sa fie eluate inainte sau in timpul micelar (tmc), care este in aceste cazuri mai mic de 45
minute.
Se poate spune ca MEKC este o tehnica foarte buna pentru analiza heroinei confiscate, deoarece se poate determina prin aceasta tehnica heroina, produsii de baza i falsificatorii, in mai putin de 7 minute, timp care include si spalarea.
Uneori, pentru imbunatatirea detec|iei analitilor este necesara o derivatizare prealabila sau preconcentrare a lor prealabila cand se produce o cre$tere a concentrarii de zeci,
sute sau mii de ori, asa cum rezulta din Tabelul 1.6 dat in contimiare.
Desigur ca mai exista i alte multe aspecte privind metodologia analitica, dar aici s-au
prezentat numai cateva mai importante pentru injelegerea nevoii de a fi respectate exigen^ele actuale ale analizei in general, ale controlului de medicamente in particular i ale
validarii.

1 Liviu Roman, Robert SSndulescu, Cbimie analitica, Vol. 2, Analiza chimica

cantitativa, Ed. Didactica i Pedagocica, Bucure?ti, 1999 (a se vedea $i vol. 3);
: 2 Darius Bojita, Liviu Roman, Robert Sandulescu, Radu Oprean, Analiza fi contmlul
jnedicamentelor, Ed. Intelcredo, Deva, 2003
3 Candin Liteanu, Elena Hopartean, Chimie analitica cantitativa, Volumetria, Ed.
Didactica si Pedagogica, Bucureti, 1972
4 Constantin Gh. Macarovici, Analiza chimica cantitativa anorganica, Ed. Academiei,
Bucuresti, 1979
5 Christian G.D., Analytical Chemistry, Fifth Edition J, Wiley and Sons Inc., New York,
1994
6 Mahuzier G., Hamon M., Ferrier D., Prognon P., Cbimie Analytique, Tome 2,
Methodes de Separation, 3eme Edition, Masson, Paris, 1999

Tabelul 1.6. Metode de preconcentrare pentru imbunatatirea detectiei in CE

Factorul
dc cretere
Metoda
a concentrate!
Legarea directa intracapilara
100-1000
Derivatizarea
a ligandului
analitului
100-1000
Legarea directa a ligandului
Puterea detectorilor
la membrana
Legarea ligandului la granuAglomerarea probei
50
le de silicagel
(preconcentrarea)
Legarea ligandului la granu1000
Amplificarea
le de silicagel (1 fiita)
campului
Legarea ligandului la granuIzotacoforeza
20-1000
le de silicagel (2 frite)
Ligand legat la microcanale
20-1000
Izotacoforeza
multiple (1 frita)
pasagera
100-1000
Focalizarea
izoelectrica
Fibre poroase
3000
5000
Concentrate generala
Metoda

16

Factorul
de cre$tere
a concentratici
1000
100-500
50-3000
200

50-7000
500-4000

17

2.1.1. Formularea problemei ce trebuie rezolvata prin analiza

CAP. 2. PROBLEMS 1TENDINTE ACTUALE

IN ANALIZA

2.1. Probleme i exigente actuale ale analizei

Forenularea problemei care trebuie sa fie rezolvata prin analiza impune cunoasterea
domeniului pentru a putea concepe si proiecta traseul detaliat al analizei, in functie de ceinntele beneficiarului analizei, de nature materialului de analizat, de felul si cantitatea
probei (solida, lichida, gazoasa, omogena sau heterogena), de compozitia probei (natura
matricei, prezenfa unor interferenti si tipul acestora, daca este vorba de materii prime, reactivi, produsi intermediari sau fini^i, de probe clinice-biologice, de mediu etc.).
La toate acestea trebuie sa se adauge cunoasterea cat mai larga si profunda a datelor
anterioare si actuale din literatura, referitoare la problema analitica si la caracteristicile
aparatelor si instrumentelor de analiza, referitoare la etapele preanalitice care implica
esantionarea - pregatirea materialului, dizolvarea, preconcentrarea si purificarea analitului
(daca acestea sunt necesare), existenta interferentilor, a efectelor lor si, in general, a
efectelor matricei si modalitatile de rninimizare sau eliminare a acestora (deci a zgomotului de fond), astfel incat senmalul analitic care trebuie sa se obtina sa fie curat, lipsit de
efecte si semnale secundare, parazite, care influenteaza negativ rezultatele analitice,
uneori compromitand analiza.
Mai trebuie avut in vedere ca analistul trebuie sa evite la maximum erorile personale
datorate neglijentei sau ignorantei. De asemenea, trebuie stiut ca erorile comise in etapele
preanalitice, deci inaintea masuratorii, cum sunt cele din etapele de pregatire si pretratare,
care impun procese de omogenizare, filtrare, extractie, preconcentrare, precipitare etc., la
care se adauga si erorile comise direct de analist, pot atinge un cuantum de pana la 90%
din eroarea finala.
De aceea, unul dintre succesele importante obtinute de un analist este tocmai reducerea pana la zero a erorilor preanalitice, ceea ce este posibil numai daca analistul cunoaste
aceste probleme, daca el dispune de maiestria profesionala reala, bazata pe o experienta
bogata, pe pregatirea sa teoretica si practica si pe probitatea sa stiintifica si morala.

In general, metodele de analiza (chimice si instrumentale) au un rol principal, fundamental in asigurarea calitatii medicamentelor, dar si a calitatii mediului, a calitatii actului
medical concretizat in diagnosticul formulat in fiecare caz in parte. De asemenea, metodele
de analiza sunt indispensabile in cercetarea stiintifica, in laboratoarele de interes biomedical, in domeniul agricol si alimentar, in domeniul bunurilor de larg consum etc. Efectuarea
analizelor in domeniul controlului calitatii medicamentului si in laboratoarele clinicer este
2.1.2. Exigente actuale ale analizei
asigurata de persoane cu inalta calificare care trebuie sa aiba un volum impresionant de
cunostin^e fundamentale de chimie generala, chimie analitica, chimie anorganica, de
In lumina celor expuse mai sus, se pot formula urmatoarele cerinte si exigente referichimie fizica, fizica, matematica si statistics si, evident, de informatica. Prin urmare, cei ce
toare
la
metodele de analiza si aplicatiile lor in diverse domenii:
lucreaza pentni atestarea calitatii in aceste domenii de foarte mare interes public trebuie sa
1) cunoasterea problemei de analizat, bine formulata si definita;
aiba o temeinica si bogata cultura profesionala (pe langa aceea generala), dublata de un
2) ce fel de informafii trebuie sa se obtina prin analiza;
inalt simt al raspunderii pentru rezultatele analitice pe care le produc si pe baza carora se
3) ce fel de proba trebuie sa se analizeze:
iau decizii, care nu este ingaduit sa puna in pericol sanatatea sau chiar viata oamenilor.
- daca ea este reprezentativa si omogena;
lata de ce conceperea si elaborarea metodelor de analiza si control chimie si instru- compozitia probei, natura matricei, componentii majori, minori, urme, activi
mental se constitute intr-o adevarata stiinta, care trebuie sa tina seama de strategia analitica
sau ingrediente inactive;
generala, de strategia de validare, de legile, normativele si conventiile nationale si inter4) ce pregatire si ce pretratament trebuie sa se aplice probei:
nationale in acest domeniu, de exigentele si tendintele actuale care se manifesta in dome- omogenizare;
niul vast al metodelor de analiza.
- daca este necesara o dizolvare specials (acida, bazica, oxidativa, in faza solida
sau lichida, etc.);
- daca este necesara preconcentrarea, separarea si purificarea analipilor sau a
componentelor straine;
18

19

5) care sunt cele mai potrivite procedee si tehnici de pregatire si pretratare, implicit
procedeele de eliminare sau reducere la minimum (daca este posibil, pana la zero)
a interferentilor, efectelor dc matrice in general si a zgomotului de fond, care sunt
surse importante de semnale parazite sau secundare, cu efect nedorit asupra
puritatii semnalului analitic si, implicit, asupra calitatii rezultatelor analitice;
6) care este domeniul de concentratie al analitului in proba si ce trebuie facut in cazul cantitatilor foarte mici pentru aducerea lui la nivelul concentratiei detectabile si dozabile;
- care sunt impuritatile farmaceuticc din proba, concentratia lor (fie si aproximativa) si structura lor;
7) ce fel de masuratori (marimi) chimice si instrumentale (sau ambele) trebuie sa se
faca si sa se evalueze, ce fel de instrumente de analiza trebuie sa se utilizeze sau
cuplaje de metode (de separare, detectie si dozare) pentru a se obtine in final
regasiri procentuale acceptabile:
- care este specificitatea, selectivitatea si sensibilitatea metodei de analiza care
trebuie aplicata;
- ce posibilitati de optimizare a acestor parametri exista (ex.: derivatizare preanalitica, precoloana cromatografica sau postcoloana);
- ce performante au analizoarele sau instrumentele preconizate a fi utilizate si
daca acestea corespund exigentelor referitoare la exactitatea, fidelitatea = precizia (repetabilitatea si reproductibilitatea rezultatelor);
- daca aceste instrumente de analiza sunt certificate, deci cu performante cunoscute si corifirmate;
8) ce puritate trebuie sa aiba apa, solventii, reactivii si alte materiale de laborator,
pentru a se evita contaminarea probelor si implicit, interferentele suplimentare;
9) ce substante si materiale standard, de referinta sunt necesare, de unde provin
(NIST, PROMOCHEM etc.), pentru:
- substantele medicamentoase;
- impuritatile farmaceutice;
10) daca metodele si procedeele de analiza ce se intentioneaza a fi utilizate corespund
legislatiei si normativelor in vigoare, nationale si intemationale, deci sunt validate sau recunoscute ca metode performante;
11) costurile implicate si bugetul disponibil, daca este posibila reducerea lor prin
reducerea lucrului experimental fara pierdere de informatie; deci scaderea raportului costuri/beneficii;
12) timpul pentru analiza si predarea protocolului cu datele obtinute, beneficiarului.
2.1.3. Tendintele actuate in analiza
Desigur ca pot fi formulate si alte cerinte pe langa cele prezentate mai sus, dar nu
au fost expuse deoarece, in continuare, vor rezulta din tendintele ce se manifests in
prezent in domeniul analizei (dar si din expunerile ulterioare). Aceste tending sunt strans
legate de problematica generala a analizei, inclusiv de aceea a analizei si controlului de
medicaments, dar mai ales de aspectele privind optimizarea proceselor analitice fundamentale.
20

Cunoasterea cerintelor, exigentelor si a tendinfelor actuale care se manifests in domeniul analizei este o obligatie majora pentru to{i cei ce executa analize si slujesc "functia de
service" a chimiei analitice si deci a metodelor de analiza si control, care trebuie sa stie si
sa con?tientizeze ca rezultatele analitice fumizate de ei trebuie sa fie exacte, precise
(fidele), corecte, deci de mare incredere, deoarece pe baza lor se adopta decizii in toate
domeniile de activitate, precum:
1) domeniul productiei medicamentelor, ceea ce impune controlul riguros al calitatii:
- materiilor prime utilizate in sinteza medicamentelor;
- produsilor intermediari;
- produsilor finiti, inclusiv al formelor farmaceutice;
- conservarii in depozite, pe raft sau in farmacii;
- stabilitatii medicamentelor in timp;
- controlului toxicologic;
- studiilor privind mecanismele de actiune a medicamentelor;
- studiilor de biodisponibilitate si metabolizarea medicamentelor;
- controlului abuzurilor de medicamente, cu accent pe consumul de droguri;
- extractelor de plante medicinale;
- produselor cosmetice;.
2) domeniul medical $i biologic:
- calitatea analizelor biochimice si in general al analizelor clinice in laboratoarele
clinice; inclusiv in cazul unor urgente medicale, cand de calitatea deciziilor
depinde viata bobiavilor;
- calitatea analizelor in medicina legala si toxicologia judiciara;
- calitatea analizelor in biologia moleculara;
3) domeniul alimentelor cu accent pe calitatea:
- analizelor de pesticide si alte substante controlate, precum coloranti, edulcoranti, conservanti etc., in preparatele de lapte, carne, bauturi racoritoare, conserve de legume, peste, fructe etc.;
4) domeniile tehnice:
- chimica: industria chimica in care se produc :
- carburanti;
- solventi;
- detergenti;
- coloranti si vopsele;
- agenti de curatire;
- de prospectare si extractie: gaze naturale, petrol, minereuri diverse;
- de prelucrare metalurgica.
Desigur ca la aceste domenii se mai pot adauga cercetarile arheologice in care se fac
numeroase analize chimice si fizico-chimice, pictura, sculptura etc.
Indiferent de domeniul in care se aplica procedee, tehnici si metode de analiza,
deciziile care se iau pe baza rezultatelor analitice au si un caracter juridic, deci analistul are
o mare raspundere juridica, iar prin aceasta se confera aceasta raspundere actului
analitic.
21

Din toate acestea decurge necesitatea lucrului experimental ingrijit, atent, scrupulos ^
(pedant), components personals importanta a actului analitic de control-calitate.
$,
intrucat obiectivele mari ale metodelor analitice sunt separarea, purificarea, detecjia |
si cuantificarea sau dozarea analijilor, dar si a impuritatilor, se expun in continuare cateva <^
dintre tendin^ele ce se manifests in prezent in domeniile acestea.
,

,coon
"OCOCH,
aspirtnS

icoon

2.1.3.1. Optimizarea proceselor de separare

Ideal ar fi ca analizele sa se poatS efectua direct pe proba data pentru analiza, fara
nici o prelucrare si pretratare prealabila si eventual fara distrugerea analijilor. Acest
deziderat este rar indeplinit si posibil. De aceea, in majoritatea cazurilor este necesara
separarea anali^ilor si in prezent se pune un mare accent pe optimizarea proceselor de
separare, ceea ce implica evitarea, pe cat posibil, a procedeelor de precipitare si filtrare, adesea greoaie si laborioase si uneori cu pierderi de analit si cu posibila contaminare a probei si inlocuirea lor cu procedee de extractie, cromatografice, electroforetice etc.:

CH,
ihuprofcn
(ncid2-<4-izobuiilfcnil) propionir)

10

Fig. 2.1. Extractia SPE fi detenninarea HPLC a aspirinei

din capsule de Alka-Seltzer (a) fi a ibuprofenului din urina (b)
b) extractia unor xantine din serul uman pe faza solida SPE si separare HPLC; prin
acest procedeu, durata tuturor proceselor de extractie, separarea, detectia, dozarea, calculul rezultatelor si validarea dureaza numai 2-3 ore; Fig. 2.2.

1) procedee de extractie optimizate, cum sunt:

- extractia lichid-Iichid, cu varianta extractiei sinergice, cu amestecuri de solventi a caror capacitate de extractie se potenteaza reciproc; aceasta capacitate
depinde de structura solventului, de bazicitatea lui, de orientarea sterica a atomilor donori, de polaritatea solventilor, de pH-ul solutiilor, de existenta reactiilor secundare posibile (de precipitare, complexare etc.); pentru evaluarea calitatii extractiei se calculeaza: constanta sau coeficientul de repartitie, factorul de
recuperare, factorul de separare, randamentul de extractie, regasirea procentuala
etc. (vezi "Analiza si Controlul Medicamentelor", vol. 1, pag. 386 si urmatoarele, M. Boji^a, L. Roman. R. SSndulescu, R. Oprean, Ed. Intelcredo - Deva,
2002/2003);
- extractia in faza solida SPE, care se bazeaza pe procese elementare de transfer
de masa din solutia de analit pe o faza stationara solida (procese analoge cu cele
cromatografice); fazele stafionare sunt selective, cu granulometrie de 40-60 [im;
dintre acestea se pot men^iona octadecilsilanul (Si-C18), Si-C8, Si-C6H5, Si-CN
(vezi op. citat mai sus, pag. 416);
- prin aplicarea acestei metode se simplifies matricea probei, deoarece prin fixarea
analitului in cartu? se elimina toti componentii indezirabili in efluentul care
paraseste cartusul; apoi se spala cartusul (care este in fond o minicoloana cromatografica) cu solventi potriviti, dupa care se elueaza analitul extras de asemenea
cu un alt solvent potrivit, care contine numai analitul pur, separat; in continuare se
dau doua exemple de aplicatii ale extractiei SPE asociate cu HPLC:
a) extractia aspirin ei din capsule de Alka-Seltzer de 100 mg, dupa dizolvare in 100
mL apa distilata si a ibuprofenului din urina, pe cartuse de Polysorb MP-2; cromatogramele
corespunzatoare sunt date in Fig. 2.1

IS

Fig. 2.2. Detenninarea SPE+HPLC

automata a xantinelor introduse in
ser; 0,5 ppm cu HySphere Resin GP
ca sorbent SPE

i
(

i
f

>

'

Conditii de extractie-separare:
- coloana LiChrospherRPIS (1224,0 mm),
particulc cu d = 5 (im; - elusnt: acetonitril
12% tn apa, la 1 mL/min; - protocol SPE: solvatarca sorbcntului: 2 mL CHjOH,
apoi 2 mL apa la 5 mT /min;
- 100 |iL injectat cu 2,5 mL apa la 2 mL/min.

- spre deosebire de alte procedee de extractie (ex.: microextractia), cuplajul SPEHPLC nu este prea laborios ?i corespunde mai bine metodologiei de validare,
deoarece nu urmareste numai cresterea regasirii procentuale (ceea ce, din punct
de vedere al validarii este important dar, nu este suficient), ci si compararea
capacitatii de retentie a sorbentilor, precum ?i eficienta lor, de asemenea se poate
urmari si determina si proeentajul de intarziere a trecerii solutiei prin carhis si
procentajul de adsorbtie in sistemul de pregatire al probei; in prezent, acest mod
de extractie, separare, detectie este automatizat complet; in Fig. 2.3 se prezinta
o schema de principiu pentru extractie SPE-HPLC/MS (extractul SPE este
transferal printr-o capilara direct in cromatograful HPLC; fiecare pic care
paraseste capilara coloanei HPLC este transferat direct in camera de ionizare a
unui spectrometru de masa).

23

Fig. 2.3. Schema de principiu

a unui cuplaj SPE-HPLC/MS

eliberare
solvent

Cartue

SPE

-A= modul de extracfie, care aratS

pozijia valvei (1);
- cartusul se conditioneaza inaintea
extracfici pria sp&laic cu solvent
eliberat din iwitatea SOU;
- se iojecteaza in cartuy o porfiune
alicota din solufia anahtului, iar
interferenfii sunt iudeplrtafi prin
sp&larc (in cflucnt);
-se elueaza analilii din cartuy cu un
solvent potrivit si se transfers in
coloana HPLC, iar efluentul este
condus in MS.

printre avantajele extractiei in faza soiida SPE se numara urmatoarele:

- se obtin extracte de puritate determinata de selectivitatea si eficienta sorbenjilor;
- capacitatea mare de extractie prin varierea polaritatii;
- mi se produce emulsionarea probei;
- se reduce consumul de solventi organici;
- se lucreaza la presume joasa, consum mic de energie;
- miniaturizarea aparaturii si simplificarea unor procese analitice;
- regasiri procentuale rnari datorita preconcentrarii, practic cantitative a
analijilor;
- posibilitati de derivatizare pre- si post-extractie;
- posibilitatea cu cuplare cu HPLC si GC;
- aplicatii largi in analiza si controlul medicamentelor, cu limite de detectie
foarte mici, de ng, nM etc.

mieroextraetia in faza soiida - SPME, care este o tehnica de concentrare si

separare a analitilor din proba, procese ce se realizeaza pe o faza legata depusa
pe fibre de sticla, dispuse sub forma unui manuncbi acoperit cu un polimer si
fixat intr-un tub de otel inox, introdus intr-o seringa prevazuta la un capat cu
un ac de otel inox; acest manunchi de fibra de sticla poate fi considerat ca o
sonda care se introduce cu un capat in solutia probei, iar dupa un timp se
scoate; analitii se repartizeaza pe suprafata polimerului, de aceea acest capat al
sondei (care a fost introdus in solutia probei) se orienteaza astfel incat analitul
(sau analitii) de pe fibre sa fie in contact cu interfata de desorbtie pentru separare HPLC sau GC; In Fig. 2.4 se prezinta schema cuplajului SPME-HPLC.

24

ddertomlUV-Vfc

Fig. 2.4. Schema cuplajului-sistem SPME-HPLC (a) fi a SPME

- filtre (b): 1 = tab polimer-eler-cetonS, PEEK; 2 - douipiese din PEEKwanson inchis;
3 legatorH din otel inox in forma de T de 1/16 inch (I inch = 2,54 cm), Valco Instruments Co.
Huston - Texas; 4 = tub PEEK cu piesa de legaturS de 0,005 inch d.i. (Sigma Aldrige); 5 = tuburi
inox de 1/16 inch o.d. si 0,02 inch d.i. (Supelco)

- pentru exemplificare, se prezinta extractia SPE si separarea GC/MS a Iidocainei

(anestezic local) din solutii care contin 1 ng/mL, utilizand fibre de sticla de 7 m acoperite
cu PDMS - faza legata (neafectata de ceilalti componenti din proba); Fig. 2.5.

(b)
8,33

timp (min)

9,16 8,33

timp (min)

(c)
9,16 8,33

timp (min)

9,16

Fig. 2.5. Cromatograma GC-MS a Jidocainei

dupa extractia ei din metanol (a), din hidroxid de sodiu neutralizat
cu acid trifluoracetic (b) si din fosfat 0,25 M cu pH = 12 (c)

au fost supuse extractiei probe de 2 mL, la 22C, timp de 40 min, apoi analitul a fost desorbit la 250 C, timp de 3 min; coloana GC a fost de 30 cm
0,25 mm, d.i. = 0,25 m, d.p. HP-MS; detectia s-a facut cu capcana ionica
MS cu ionizare prin impact electronic (aria picurilor = 3030019 pentru a;
1587462 pentru b; 5084767 pentru c).
este de mentionat ca nurneroase substante rnedicamentoase se extrag prin
microextrac{ie SPME, urmata de analiza lichid-cromatografica LC asociata cu
MS, pentru a se evita concentratiile man de saruri care pot interfera; in Fig. 2.6
se prezinta date comparative pentru analiza dexametazonei prin LC-MS, dupa
25

extracjia ei prin SPME.

Fig. 2.7. Schema sistemului de extractie-analiza prin injectie In flux continuu

(nesegmentat) - FIA
Fig. 2.6. Cromatograme LC-MS ale dexametazonei
din solutii 15% de NaCl (a) si de NaOH - neutralizat cu acid trifluoracetic (b)
-0,1 mg/mL dexamctazona; -programare injector cu 15 cai de retragere;
- 40nLecare la 140 fJlVmio; -pic 1, injectie 5 pL, arie: 3800000;
- pic 2, injectie 5 u.L, arie: 7000000; - pic 3, injectie 5 /*L, arie; 13000;
-pic 4, la tub, arie 69.

Nota: la utilizarea metanolului si a acetonitrilului (ambii solventi miscibili cu apa), s-au

constatat diferente la extractia unor anestezice locale, precum carbisocaina, heptacaina, pentacaina, dar si in cazul mexiletinei (antiaritmic), stoladinei (cardioprotector) si a unor beta-blocante; de aceea s-a lucrat la concentratii reduse de acetonitril,
cu o eliberare eficienta a medicamentelor din cartusul SiO^ - CIS (Sep-Pak CIS,
Silipore CIS, CP-Elut CIS si Separcol-Si CIS); s-a utilizat un GC - HewlettPackard Model 5880 - cu detector termoionic.

1 = pompa pcristaltica; 2 = derivatizare; 3 = valvS de injecjie a probei de 12 mL

sau 25 mL; 4 = probe apoasc; 5 = baie de ghcata pentru raciiea clorofonnului;
6 = amestecarea fazelor; 7 = separare de faze; 8 = fotomctru;
9,10, 11 = evacuare; R = 0 , 1 5 m 5 i L = 2 m = serpentine din teflon de 0,8 mm

- extractia prih sistemul AASP (advanced automated sample processor), produs de

Varian, in care este vorba de extractie in faza solida, pentru concentrarea, separarea
si purificarea analitilor si pentru indepartarea componentilor indezirabili odata cu
matricea lor si efectele de matrice; Fig. 2.8.

AASP v a l w a !n}cc|K

g . SorbaK SK3, - CIB

- extractia in flux segments! cu bule de aer (SFA = segmented flow analysis) sau in
flux continuu nesegmentat, cu injectie in flux - FIA (flow injection analysis);
analiza FIA s-a dovedit a fi de preferat deoarece, in acest caz, nu are loc o dispersie
excesiva a analitilor si nici contaminarea, beneficiind si de alte avantaje, intre care:
- viteza de analiza mai mare, intre 100 si 300 de analize pe ora;
- timp de raspuns mai bun, de regula mai putin de 1 min. intre injectia probei si
semnalul-raspuns al detectorului;
- timpi de pornire si de oprire mai mici, de cca. 5 min pentru fiecare;
- echipament mai simplu, mai economic.
- in Fig. 2.7 se prezinta o schema de principiu a sistemului de extractie-analiza prin
injectie in flux continuu (FIA):

26

Fig. 2.8. Sistemul de separare-purificartepreanalitica prin AASP

- acest sistem include un sistem miniaturizat de extractie SPE in faza solida, dotat cu
casete con{innd cate 10 cartuse incarcate cu 40-50 mg SiO2 - Cl 8; acest modul se
poate cupla cu un cromatograf HPLC, determinarea necesitand parcurgerea urmatoarelor etape:
- solvatarea fazei legate, indepartarea excesului de agent de solvatare cu o solutie
27

similara cu aceea a matricei probei;

preconditionarea probei prin ajustarea pH-ului (daca este cazul) si adaugarea
standardului intern;
trecerea solutiei probei prin cartus pentru rejinerea analitilor pe SiO2 - CIS;
indepartarea interferentilor indezirabili cu o solute potrivita care sa nu poata
dizolva analitii;
eluarea analifilor cu o faza mobila potrivita si evaporarea eluentului pana la
uscare (daca se poate);
dizolvarea analitilor din reziduul uscat intr-un solvent potrivit, ceea ce se
numeste "reconstiruirea probei", dar cu analiji separaji si purificati prin
AASP;
injectarea unei parti alicote din proba reconstituita in sistemul HPLC;
acest sistem are avantajul ca purificarea analitilor prin AASP are un efect benefic asupra rezolutiei picurilor, asa cum se poate observa din Fig. 2.9:

a) farii purificare
b) cu purificare

Fig. 2.9. Efeclul sistemului de purificare SPE a frontului cromatograGc

- sistemul AASP de extractie-purificare a fost aplicat la separarea si purificarea
unor benzodiazepine din ser, intre care clordiazeproxid si diazepam (tranchilizant minor) si a propranololului (beta-blocant) de metabolitii sai (4-OH
propranolol si prometalol).

Fig. 2.10. Diagrama de faza

presiune-temperatura
pentru bioxidul de carbon
metanolul pentru CO2, care nu poate extrage analitii polari;
- eliminarea fluidului supercritic din extract se face printr-o simpla destindere,
cand el se volatilizeaza practic instantaneu, recuperandu-se si reutilizandu-se;
- reziduul ramas este analitul extras, concentrat si purificat, care este supus imediat analizei; in Fig. 2.11 se prezinta schema generala a unui sistem SFE (a),
care se poate cupla cu un sistem GC (ex.: GC 5890 Series n - Hewlett-Packard)
cu detector cu captura de electron! pentru detenninarea regasirii procentuale; in
Fig. 2.11 (b) este prezentata gazcromatograma unui ulei esenjial de Syzygium
aromaticum (cuisoare), din care s-au separat si detectat eugenolul (1), -cariofilenul (2), -cariofilenul (3) si eugenolul acetat (4), cu o foarte buna rezolutie:
- pentru separarea analitilor se mai pot utiliza cromatografia de lichide (HPLC,
5000000

- 3S-C. 2SOO pa (aprox.

172,2 aim)
- limp exuac'ie: 20 min

4SOOOOO

4000000

- prcs. extracts; 450

- extractia cu fluide supercritice - SPE (Supercritical fluid extraction) este o

tehnica de separare-purificare-concentrare in care "solventul de extractie este un
fluid supercritic omogen" (numit si gaz dens), care se afla in domeniul supercritic util, format la o presume si temperatura superioare punctului critic C (Fig.
2.10); presiunea si temperatura critice sunt caracteristice fiecarei faze-fluid; asa, de
exemplu, in cazul CO2 presiunea critica Pc = 72,9 ban (atmosfere), iar temperatura critica Tc = 31 C;
- un fluid supercritic are cateva caracteristici importante, intre care:
- densitate apropiata de aceea a lichidului din care provine, in functie de presiune; deci densitatea poate varia;
- vascozitatea, care este inferioara lichidului din care provine;
- capacitatea de dizolvare mai mare decat aceea a lichidului din care provine;
aceasta capacitate se poate man prin adaugarea unui modificator, cum este
28

3000000 |

debUmelru

15000M

1000000
500000
0

(a)

10.00

20.00

30.00

40,00

(b)

Fig. 2.11. Schema unui sistem SFE

de exemplu), pe strat subtire, in faza gazoasa, de excludere difuzie, de afinitate
etc., precum si electroforeza pe gel, hartie cromatografica, dar mai ales electroforeza capilara zonala in mediu micelar;

- optimizarea metodelor cromatografice de separare se face prin:

- optimizarea coloanelor, deci a fazelor stationare legate chimic, a granulajiei,
suprafe^ei specifice, a polarita^i pentru metodele LC, mai ales HPLC;
- optimizarea coloanelor pentru cromatografia capilara electrocinetica, cromatografia cu fluide supercritice, cromatografia de gaze, cromatografia
pe schimbatori de ioni, pe site moleculare;
- optimizarea parametrilor operational!: diametrul particulelor si cresterea
numarului de platouri teoretice implicit a rezolutiei, la care se adauga
programarea temperaturii, presiunii si compozitia fazei mobile, prin
automatizarea modulelor de fumizare a acestora;
asa cum s-a aratat mai sus, una din tendintele manifeste si presante este, in prezent,
optimizarea coloanelor cromatografice de separare, cuplate cu detectori electrochimici, spectrofotometrici, MS-spectrometrici etc.; pentru exemplificare, in Fig.
2.12 si in Fig. 2.13 se prezinta cromatogramele HPLC obtinute la separarea unor
anticonvulsivante si a unor antidepresive, pe coloane Vydac 208 HS 3410 C8:

- (rebuie precizat ca aceste coloane se pot utiliza si la separarea, detectia si dozarea

altor tipuri de medicamente, mai ales baze organice medicamentoase (ex.: alcaloizii), antihistaminicele, vitaminele hidrosolubile, catecolaminele etc. (coloanele Vydac mentionate
mai sus sunt cu faze inverse).
2.1.3.2. Optimizarea detectiei $i a deterrainarii cantitative
1) Optimizarea detecfiei, ceea ce se manifests in tendinta de optimizare a detectorilor
instrumentali, cum sunt:
- cei spectrofotometrici UV-VIS cu diode In serie (sau bareta de diode);
. cei defluorescen^acu raze X,fluorofotometricisi de cherniluminiscenta;
- cei de radioactivitate si RMN;
- cei de spectrometrie de masa;
- detectorii electrochimici, cum sunt cei de conductivitate, potentiometrie si, in general, cei
voltamperometrici (amperometrici, voltametrici, polarografici etc.); in continuare se fac
referiri mai ales la acesti detectori mai putin cunoscuti, dar care cunosc in prezent o dezvoltare accentuata; in context, o atentie aparte merit! sa fie acordata electrozilor pe baza de
carbon:
- de carbon vitros ca atare sau acoperit cu un film de mercur, argint sau aur, sau cu film
polimeric dopat cu modificatori;
- electrozi pasta de carbon modificata cu agenti complexanti chelatanti (cu grupari
functionale cu atomi de azot, oxigen si sulf) sau cu biocomponente (deci biosenzori),
cum sunt enzimele (asociate cu cofactor si mediator), celulele de culrura, ^esuturi, bacterii, anticorpi etc.;
- electrozii cu fibre de carbon sau de sticla sub forma de manunchi, imbracate intr-un film
polimeric, pe care se fixeaza componente electroactive;
- electrozii membrana polimerica din PVC, teflon (rrifluorpolietilena), polipirol, polianilina etc., dopate cu componente electroactive (diversi reactivi care asigura selectivitatea
si sensibilitatea, cum sunt agentii chelatanti, polioxometalatii etc.);
- electrozii picatura de mercur sau picatura de mercur suspendata utilizati in polarografie, in
stripping voltametria cu puls normal sau differential, cu acumulare catodica adsorbtiva etc.;
cu astfel de senzori si biosenzori se pot atinge limite de detectie in domeniul 10"9-10"12
mol/L;
- in afara de senzorii mentionati mai exista senzori cu efect de camp (ISFET), senzorii galvanici, de gaze (O2, H, CO, CO2 etc.) cu semiconductor! sau traductori de masa sensibili,
precum si electrozi membrana din argila (in general silicati); anumite tipuri de argile se
pot utiliza si in amestec cu pasta de carbon care este componenta preponderenta.
2) Optimizarea determinarii cantitative prin:
- scaderea limitei de cuantificare a substantelor medicamentoase, metabolitilor si a impuritatilor farmaceutice;
-utilizarea standardelor de referinta de certa puritate, deci de certa calitate, pentru substantele medicamentoase, impuritati farmaceutice, interferenti si metaboliti;
- cresterea exactitatii si fidelitatii (preciziei) metodelor de analiza, deci a sigiirantei rezultatelor;

Fig. 2.12. Separarea. unor

an ticon vulsivan te
- coloana Vydac 208HS3410-C8;
- 3 |i; 4,6100 mm; eluent: ACN;
- 15-50% la 1,5 mL/min;
- 1 = barbital; 2 = fenacetamid;
3 = etotoin; 4 = fenobarbital;
~5 = fensuximid; 6 = mefenitoin;
7 = carbamazepin;
8 = metsuximid; 9 = diazepam
Uirfn.

Fig.2.13. Separarea unor antidepresive

- coloana Vydac 208HS3410-C8;
- 3 |i; 4,6100 mm; eluent: fosfat 0,25 M;
- pH = 3; acetom'tril 25% la 20 mL/min.;
- detecfie UV;
- 1 =doxepin; 2 = desipramin; 3 ~ imipramin;
4 = nortriptilin; 5 = amitriptilin

fain.
30

31

- diminuarea drastica a erorilor, mai ales in etapele preanalitice prin lucrul experimental
corect, riguros, ingrijit etc., precum si reducerea zgomotului de fond;
- calcularea corecta a rezultatelor analitice, evaluarea statistics a erorilor prin utilizarea
analizelor statistice, a algoritmilor, a testelor de concordanta, de liniaritate etc.;
- utilizarea chemometriei in procesul de programare a experimentelor;
- validarea metodelor noi de analiza si utilizarea in determinarile analitice numai a metodelor recunoscute, confirmate si validate.
2.1.4. Parametrii de calitate mai important!
Inainte de rezumarea acestor parametri, trebuie precizat ca in modul de abordare si
de efectuare a analizei trebuie sa se tina seama de problema care trebuie sa fie rezolvata
prin analiza, de complexitatea ei, de rapiditatea necesara (de exemplu, in laboratorul clinic
adesea se impune efectuarea unor analize-teste rapide, chiar in timpul interventiilor chirurgicale) etc.
- pentru exemplificare, se mentioneaza problema din ce in ce mai grava a dopajului cu
substante interzise, cum sunt stimulentele, steroidele, diureticele, narcoticele, analgezicele,
-blocantele, sedativele, hipnoticele etc., care impune adesea testarea rapida a_unora dintre
metabolitii lor, deoarece in intoxicatii grave, deci in situatii limita, nu se pot detecta substantele ca atare care au fost utilizate; de regula, testarea se face din probe de urina (sau
sange) pentru identificare, iar daca timpul permite, i dozarea lor instrumentala rapida prin
HPLC, GC, GC-MS, MS, RMN etc., cu extractie SPE sau fara extractie;
- parametrii de calitate mai importanti sunt urmatorii:
- specificitatea si selectivitatea;
- sensibilitatea: - pragul de detectie;
- pragul de cuantificare;
- liniaritatea semnal analitic / concentratie; domeniul de concentratie sau de activitate;
- oblicitatea / abaterea: curbe etalon, parametri statistic! - coeficient de corelatie;
- precizia sau fidelitatea metodei de analiza:
- repetabilitatea, coeficientul de variatie CV al acesteia;
- reproductibilitatea, coeficientul ei de variatie;
- precizia intermediara;
- robustetea;
- exactitatea, exprimata prin regasirea procentuala;
- exprimarea rezultatului final, X, RSD, a, s, S p , t, intervalul de incredere,
evaluarea erorilor, eliminarea controlata a rezultatelor indoielnice;
- puritatea semnalului analitic:
- interference, efecte, zgomot de fond;
- netezirea sau curatirea semnalului analitic automat (programe)
sau prin algoritmi;
- eliminarea efectelor indezirabile;
- parametrii operatori pentru diversele metode de analiza.

32

2.1.5. Economicitatea analizelor

Acest obiectiv se refera la stiinja organizarii cercetarii, adica la managementul ecornic al cercetarii, ceea ce implica gestionarea corecta a sumelor investite in aparatura,
vi standarde, solvenfi etc., cu generozitate, dar si cu raspundere. In lume, numai in
iomeniul sanatatii si eel farmaceutic, se cheltuiesc sume enorme pentru zeci de miliarde de
re De aceea laboratoarele ?i institutiile in care se fac analize trebuie sa tina seama de
nortul costuri/beneficii, care trebuie sa fie cat mai mic; iar pentru aceasta trebuie sa se
iba jn vedere urmatoarele cerinte:
- documentarea corecta cu privire la problemele analitice de rezolvat;
- programarea numarului de analize necesare, a reactivilor, materialelor de referinta,
solventilor etc.;
- utilizarea judicioasa a fondurilor si a instrumentelor de analiza;
- reducerea la strictul necesar a consumului de reactivi, materiale, energie etc.;
- reducerea la maximum a numarului de analize gresite pentru reducerea costurilor si
a risipei;
- reducerea pierderilor de analiti si a contaminarii, precum ?i a erorilor, pana la eliminarea lor, in etapele preanalitice, deci inaintea masuratorilor analitice;
- reducerea lucrului experimental fara pierderi de informatie, ceea ce inseamna
reducerea costurilor, reducerea tiinpului per analiza si reducerea efortului uman;
- asigurarea obiectivitatii si sigurantei rezultatelor analitice, respectiv a increderii in
aceste rezultate, prin indeplinirea conditiilor/criteriilor de acceptanta, conform
normelor actuale de validare a metodelor si rezultatelor statistice;
- cresterea continua a gradului de instructie si calificare a specialistilor in acest domeniu, ceea ce asigura atat competenta lor, cat si responsabilitatea lor profesionala,
etica si juridica;
in acest mod se pot indeplini cele trei man deziderate in domeniul produselor farmaceutice:
- calitate; - siguran^a; - eficienta terapeutica.

1. Liviu Roman, Robert Sandulescu, Chimie analitica,

- Vol. 1, Analiza chimica calitativa, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1999
- Vol. 2, Analiza cbimica cantitativa, Ed. Didactica ?i Pedagogic!, Bucuresti, 1999
- Vol. 3, Metode de separare $i analiza instrumentala, Ed. Didactica si Pedagogica,
Bucuresti, 1999
2. Liviu Roman, Marius Bojita, Robert Sandulescu, Validarea metodelor de analiza fi
control, Ed. Medicala, Bucuresti, 1998
3. Marius Bojita, Liviu Roman, Robert Sandulescu, Radu Oprean,, Analiza fi controlul
medicamentelor, Vol. 1 si Vol. 2, Ed. Intelcredo, Deva, 2003
4. Kenner C.T., O'Brien R.E., Analytical Separation and Determination, A Textbook on
Quantitative Analysis, The MacMillan Company, New York, 1971
5. Liteanu C., Gocan S., Bold A., Separatologie analitica, Ed. Didactica si Pedagogica,
Bucuresti, 1981
6. Morait Gh., Roman L., Chimie analitica, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1983
33

p ntru determinarea concentratiei constituentilor acestor materiale se utilizeazS, de

fobicei, trei metodologii:
- analiza printr-o metoda standard, de referinta, validatS in prealabil;
- analiza prin mai multe metode independente, dar fiabile;
if - analiza intr-o retea de mai multe laboratoare asociate, tehnic competente si care sunt
ft
bine infbrmate cu privire la materialul de cercetat (este deci vorba de studii colabo
rative, interlaboratoare).
J|
La utilizarea materialelor de referintS etalon pentru detectarea unei oblicitati (abalieri), adesea se intalneste situatia in care media analizelor efectuate pe etalon difera putin
Ike rezultatul sau continutul teoretic; in astfel de cazuri se pune problema cunoasterii fapItului ca aceasta diferen^a se datoreaza unei erori aleatoare sau erorii sistematice a (oblifbitatii) metodei, ceea ce se poate stabili printr-un test statistic dat putin mai jos.
CAP. 3. SUBSTANTE STANDARD SI MATERIALE
1
In cazul in care nu exista (sau nu este disponibil) un esantion etalon, concomitent
FARMACEUTICE DE REFERINTA
leu metoda testata se poate utiliza o a doua metoda independents si fiabila, care trebuie
Ea difere cat mai putin posibil de aceea testata, pentru a micsora la maximum posibiliitea ca un factor comun din proba sa aiba acelasi efect asupra celor doua metode. Este
isa recomandabila, si in acest caz, utilizarea unui test statistic pentru a stabili daca dife;nta dintre cele doua metode se datoreazS unei erori aleatoare sau unei erori sistematice
Dblicitatii) (vezi tratarea statistics a rezultatelor analitice compararea a doua medii
xperimentale).
3.1. Rolul substantelor standard sau etalon
,,,
In sfarsit, este posibil sa se detecteze unele tipuri de erori constante, efectuand
Substantele etalon sunt substante preparate in stare de puritate avansata, al caror |'dozari blanc", dozari in care se efectueaza o analiza in toate etapele ei, dar in absenta anacontinut calitativ si cantitativ este garantat; de regula, se considers ca o substanta etalon are Jjitului. Rezultatele analizelor blanc sunt utilizate pentru a corecta masuratorile facute
o puritate acceptabila daca ea are un continut procentual mai mare sau eel putin egal cu jjisupra probei.
99,95%, iar impuritatile individuale sunt mai mici de 10-3-lQ-4%.
|
Pe de alta parte, este important faptul cS dozajele blanc evidentiaza erorile datorate
Substantele etalon sunt utilizate la obtinerea unor solutii standard, la stabilirea titru- :|contaminantilor interferenti, proveniti din reactivi si din recipientele folosite in efectuarea
lui unor solutii de lucru in analiza de rutina si la verificarea oblicitatii unei metode de anal- fanalizei. La fel de important este si faptul cS dozajele blanc permit sS se corecteze datele
iza (deci a efectului unei erori sistematice asupra unei serii de determinari). De aceea, cea litrarilor chimice, prin evaluarea excesului de titrant necesar pentru a produce virajul indimai buna metoda de apreciere a oblicitatii unei metode de analiza este aceea de a analiza |patorilor la punctul de echivalenta.
cu aceasta metoda substante de referinta sau etalon, denumite in literatura de limba engleza }
Revenind la posibilitatea de a stabili daca o metoda de analiza este afectatS de o
mai ales "materiale de referintS etalon" sau "materiale standard de referinta - SRM", al feroare sistematica/oblicitate, arunci cand ea este utilizata la analiza unui esantion etalon cu
caror continut in unui sau mai multi component! este cunoscut (deci se cunoaste concen- |> compozitie exact cunoscuta, se poate folosi un test de comparare a mediei experimentale
'
'
|a metodei cu valoarea adevSrata. In acest context, se examineaza si se exemplifies oblicitratja jor-\'
Materialele standard de referintS se obtin, de regula, prin sinteza, prin cantarirea aten- jtatea posibila prin Fig. 3.1, in care sunt prezentate doua curbe care arata distributia de
ta a cantitatilor de constituent! puri' necesari, dupa care se amesteca pentru a obtine un ffrecvenfa a rezultatelor analizei unor esantioane identice prin cele doua metode, ale caror
esantion om'ogen, a carui compozitie se calculeaza plecand de la cantitatile initiate cantarite erori aleatoare sunt de aceeasi marime; metoda A nu are oblicitate, iar in acest caz media
(masurate). Evident ca un material etalon sintetic trebuie sa aiba o compozitie globala populatiei UA = xr, deci cu valoarea reala. In schimb, metoda B este afectata de o oblicitate
foarte apropiata de aceea a probelor de analizat. Analistul trebuie sa se asigure de |eroare sistematica) Ob, care este egala cu:
cunoasterea exacta a concentratiei analitului.
|
Trebuie spus ca exists o diferenta intre substantele etalon primare si secundare, care 1O =n -x =n -u.
B
A
sunt utilizate pentru obtinerea solutiilor titrate sau pentru dozarea directs a unor analiti si J
" r
C3-1)
materialele standard de referinta, care includ roci, minerale, amestecuri gazoase, sticle, |
amestecuri de hidrocarburi, poumeri, pulberi urbane (prafuri), ape de ploaie si sedimente I
Se face precizarea ca oblicitatea afecteaza cu "aceeasi cantitate (cuantum)" toate
de rauri (ex.: NIST oferS peste 900 de astfel de materiale de referin|a etalon).
j^lc seriei de analize (rezultate), care poate fi pozitiva sau negativS. Cand se doreste a se

34

35

biais
"S

I'll

3.2. Materiale de referinta pcuiru analiza farmaceutica

3.2.1. Aspecte generale

Asa cum se cunoaste, Promochem este eel mai mare distribuitor oficial autorizat peni^tnj standarde de referin^S prevazute in farmacopeile americanS. (USP XXIII - XXV), britanica europeana si altele; Promochem face disponibile Substantele sale chimice de refet yinta (CRSs) catre utilizatorii industriali, in concordan|a cu listele generale ale USP oficiale
^an anul 1999 - 2005. In acest mod, producatorii de medicamente si laboratoarele de analiza
5si control a medicamentelor au posibilitatea armonizarii activitatii lor, in concordanta cu
*cele mai noi cerinfe si prevederi privind siguran^a si calitatea medicamentelor.
Materialele de referinta sunt, in fapt, substante farmaceutice de referinta utilizate
lin analiza farmaceutica, spre deosebire de "materialele de referinta certificate", care sunt
, ...
Iproduse in confbrmitate cu Ghidurile ISO 30-35 si care sunt livrate cu documente de cerItificare detaliate.
Substantele "chimico-farmaceutice de referinta" (CRSs) ocupa o pozilie apartc in
Scresterea continua a domeniului materialelor de referinta si standarde primare care fac
Fig. 3.1. Exemplu de oblicitate, Ofo
Sobiectul ofertelor Promochem. De subliniat faptul ca exista cateva diferente intre CRSs si
aCRMs si alte materiale de referinta si standarde, iar necunoasterea lor si incapacitatea de a
evidentia o oblicitate prin analiza unui esantion cu compozitie exacta cunoscuta, este posi- faprecia aceste diferente poate duce la intelegeri gresite.
bil ca media experimentala X sa difere de media populatiei (1 (care exprima valoarea
prezumata, reala, adevarata), asa cum se observa din figura anterioara. Pentru a sti daca
3.2.2. Substante farmaceutice de referinta
aceasta diferenta se datoreaza unei erori aleatoare sau daca ea se datoreaza unei erori sistematice, se compara diferenta X xr cu diferenta observata, care poate fi determinate de
De la inceput, trebuie subliniat faptul ca legislatta in acest domeniu este conceputa
o eroare aleatoare.
pentru a proteja si asigura calitatea medicamentelor. Monografiile din farmacopei devin tot
Daca diferenta observata este mai mica decat aceea calculate, pentru un grad de pro- :mai sofisticate, mai complicate, in pas cu dezvoltarea metodelor si tehnicilor analitice, ceea
babilitate dat, se poate respinge ipoteza nula, deoarece X ?i xr sunt identice, deci nu este ice a impus aparitia substantelor de referinta inalt purificate si detaliat caracterizate. Aceste
vorba de o eroare sistematica (oblicitate) semnificativa (adica este posibila o oarecare 'substante raspund cerintelor si exigentelor USP, EP, BP si ale altor farmacopei, cum sunt
eroare sistematica, dar ea este atat de mica incat nu poate fi detectata).
J:farmacopeile franceza (FP), elvetiana (SP), japoneza (JP) etc., fiind in continua crestere, ca
Daca diferenta X - xr este net (vizibil) mai mare decat valoarea asteptata (numita si Jo consecinta a nevoii de sisteme de calitate, ca si a calitStii sistemelor, concomitent cu
valoare critica), se poate admite ca diferenta este reala si deci este vorba de o eroare sis- 'cresterea utilizarii medicamentelor generale, specifice.
tematica semnificativa. Aceasta valoare critica, pentru respingerea ipotezei nule, se calDin aceste considerente a aparut nevoia "aplicatiilor nemonografice", cum este
culeaza cu ajutorul relatiei:
i cazul substantelor nedescrise in monografiile oficiale ale farmacopeilor, dar necesare. Iar
jsubstantele CRSs, utilizate cu aten|ie si responsabilitate, pot satisface aceasta necesitate;
I dar aceste substance trebuie intelese si considerate ca materiale ce raspund procedeelor de
ts
(3.2) Janaliza descrise in farmacopei.
X-x, =
Farmacopeea americana a inrrodus un rezumat al masuratorilor (Summary of
; Measurements), care este o forma de certificare care cuprinde constatarile rapoartelor
N = numarul de masuratori utilizate.
colaborative (interlaboratoare) rezultate din procesul de certificare a substantelor care
: "eandideaza" la calitatea si stanitul de substante de referinta; lista acestor substante este
Atunci cand exista o estimare buna a abaterii standard C, se poate inlocui in aceasta ' inclusa in forma completa a cataloagelor Promochem.
ecuatie s cu o si t cu z, care reprezinta abaterea de la medie.
Substantele farmaceutice de referinta sunt produse pentru scopuri specifice, caracte%nstice, iar producatorii urmeaza riguros protocoalele pentru a objine asigurarea ca aceste
-isubstante de referinta corespund scopurilor propuse. Certificarea lor utilizeaza cerintele de
36

37

baza ale Ghidurilor ISO REMCO, dar sunt modificate de farmacopee pentru a reflecta ce- ;
Cu toate acestea, materialele farmaceutice de referinta sunt atent si riguros controlate
rintele monografiilor farmaceutice asociate. Caracteristicile lor daunatoare (toxice) sunt :
"tre producatori, ele neavand nici o eticheta sau documente ale producatorilor, care sa
determinate de unele "laboratoarc de referinta" (referente) prin expertii lor, iar datele ... fafa sau termen de expirare. Pe de alta parte, metodele folosite de catre producatori
sunt supuse unei revederi (revizuiri) riguroase, inainte ca lotul lor sa fie certificat oficial. ;
tru controlul produselor lor, ca si recomandarile facute utilizatorilor, variaza. Detaliile
In mod normal, datele actuale si valorile specifice obtinute din procesele de masurare \
t date in introducerea la fiecare sectie, inscriind diferitele colectii CRS in acest catalog.
nu sunt disponibile sau necesare prin monografia m care o astfel de substantS. de referinta ;
Substantele farmaceutice de referinta i materialele de referinta descrise in caeste utilizata.
taloeul Promochem 1999 sunt publicate de diferite farmacopei, ca o parte integrants
Procedeul de certificare utilizat de USP este descris in introducerea la lista sub- :; monografiei analitice in care utilizarea lor este necesara; este important de retinut ca
stanfelor de referinta a USP, inclusa in cataloged Promochem 2000. Farmacopeea euro- |: ajjstii nastreaza inregistrarile lor, mai ales in legatura cu masele variabile. Promochem
peana, EP, detaliaza procedeul urmat intre-un Ghid Tehnic al EP, axat pe elaborarea mono- .* ublica cu regularitate catalogul sau, cu toate ca autoritatile publica modificarea monografiilor, iar capitolul general (1.4) este axat pe Editia 1999 a EP.
' erafiilor ?i a standardelor pc tot parcursul anului. De aceea, se recomanda utilizatorilor
Pentru alte substance de referinta - CRSs a caror puritate reala sau pentru cercetarea " isa obtina cele mai recente informatii prin contactarea Promochem cu regularitate, iar
valorii acesteia este necesara utilizarea lor corecta, ele sunt oferite (livrate) astfel:
-pentru substantele de referinta USP sa se aboneze la Pharmacopoeial Forum (PF), iar pen- cu eticheta tiparita USP, pe flacon;
-?tru substantele de referinta EP sa se aboneze la Pharmeuropa.
- oficializate in catalogul EP-RSC 51 sectia EP a acestui catalog (Promochem);
Editia acestui catalog pastrata pe "website" este actualizata si modernizata cu regu- inscrise in publicatia BP a standardelor testate oferite cu produsul.
Jlaritate ?i se poate consulta si verifica site-ul la www.promochem.com. paginile putanduSse recenza ?i incarca pentru tiparire, folosind Adobe Acrobat Software (vezi mai departe
3.2.3. Durata de viata, pastrarea si data de expirare
Isurse de informare - Source of Information).
Substantele farmaceutice de referinta sunt preparate pentru o utilizare definita si
3.3. Standarde pentru impuritati farmaceutice
trebuie sa fie cumparate proaspete, atunci cand este necesar si nu pentru pastrare timp
indelungat.
De la prima publicare a catalogului Promochem, in 1995, se mentine interesul penPastrarea pentru un termen scurt se face la +4 C, la intuneric, afara de cazul altor :itru impuritatile farmaceutice prezente in substantele active (vezi mai departe date referiindicatii, cu protectie impotriva umidit&tii. Marimea ambalajului este conceputa pentru a toare la catalogul Promochem 2001 pentru substantele de referinta utilizate in analiza
permite un numar limitat de analize repetate care sunt cerute de "Buna Practica Analitica" ! impuritatilor farmaceutice).
(Good Analytical Practice), dar ambalajul deschis nu trebuie pastrat pentru utilizare ulteFarmacopeile Europeana si Britanica au introdus in unele monografii o lista
rioara.
fcuprinzand impuritatile care pot fi prezente in substantele active. Pe de altS parte,
Este, de asemenea, important faptul ca tuturor substantelor farmaceutice de referinta J autorilafile de licentiere au aratat un interes mai mare fata de impuritatile prezente
li se dau numere specifice ?i Htere de lot, ele fiind riguros controlate de catre producatori, ; ?in produsele formulate, mai ales in privinta substantelor general active. Acest interes a
fara a li se da insa termene de valabilitate si de expirare. In context, trebuie avut in vedere ; ^determinat solicitarea de la Promochem a unor standarde pentru impuritati, in afara de cele
ca loturile noi sunt preparate in avans pe masura epuizarii asteptate a lotului curent, aflat ; 'intalnite in sursele farmaceutice normale; de aici nevoia de a se intelege necesitatea fundain desfacere; noile loturi nu trebuie sa fie distincte de cele vechi.
jmentala a standardelor de impuritati, care provin, de regula, din procesele de fabricate sau
Cand un material este retras din van/are, deoarece lotul a fost epuizat (vandut) ^din degradarea produselor finite. Cand impuritatile de degradare au o semnificatie farmasau cand lotul nu mai este valabil (fiind prea vechi), utilizatorii trebuie sa-1 utilizeze : ;cologica, testele pentru aceste substante sunt adesea incluse in monografiile substantelor
imediat si sa nu-1 mai pastreze; acest fapt se refera la perioada de timp in care loturile "sunt hprincipale originale (materiile prime principale).
oficiale", iar aceasta informatie de lot este furnizata de USP 5! EP in literatura sau bibliTestele pentru impuritatile semnificative in procesele farmacologice pot fi incluse in
ografia lor, fiind disponibila totdeauna de la Promochem.
"monografiile substantelor originale, dar cum impuritatile multor procese nu sunt cunoscute
Daca are loc o Intarziere in fumizarea (eliberarea) unui nou lot, toti consumatorii care 'a. fi active, nu sunt date in literatura, dar sunt incluse in cateva teste. Referintele farmaau cerut, dar n-au primit. substantele comandate inainte. vor fi informal! imediat despre :copcilor EP si BP la cunoa$terea impuritatilor se bazeaza pe datele existente in produsele
;j licentiate. Trebuie subliniat ca nu toate impuritatile vor fi gSsite intr-un lot particular al subnoul lot disponibil.
Exista rare situatii in care un material este retras de catre producator; si in astfel de istantelor active si ca profilul impuritatilor reale este, de obicei, caracteristic unui proces
cazuri, toate stocurile detinute de utilizatori nu mai sunt valabile si trebuie sa fie dis- p:particular de fabricatie. Numai sursa disponibila a standardelor de impuritati pentru multe
truse. Evident ca Promochem are obligatia sa informeze toti consumatorii care au ?;procese este totusi manufacturata. Producatorii renumiti ofera, de regula, accesul la standardele de impuritati specifice proceselor lor, ca parte a dosarului lor "Drug Master File".
cumparat materialul retras.

38

39

Un astfel de acces este desigur confidential intre eel care produce si aprovizioneaza si conEvident ca formularea originala ERU 001, odata modificata. in PF 22, aceasta din
sumator, deoarece facerea publica a informatiilor legate de procese poate fi folositoare con- ? - devine oficiala si numai aceasta este valabila si va continua sa fie disponibila.
curentei. Standardele de impuritati nelistate (neinregistrate) in acest catalog sunt disponiA mai survenit o modificare la PF 19, data In PF 19 No. 6, facuta la cererea
bile la cerere.
^'P ocean Pharmaceutical Manufacturers Association", adaugandu-se acetonitril, piridina
4i 1,2-dicloretan.
3.3.1. Utilizare, siguranta i manipulare
Noul amestec are compozitia prezentata mai jos si nu a fost niciodatS facuta oficiala
'' USP dar este disponibila la Promochem, insa nu este clar, in acest stadiu, dac2 formuEste extrem de important faptul ca "mainte de a deschide si utiliza un flacon en o larea va fi modificata pentru a reflecta modificarile descrise in PF 24/4, tabelul 3.2.
substanta etalon, trebuie sa fie chile cu atentie orice fel de documente care insotesc
astfel de substan je".
irabe/u/3.2
Si, mai ales, trebuie sa se acorde o atentie specials, marita, instructiunilor refeCantitatea
Substanta din amestec
ritoare la pre-amestecare, adaugarea diluentului (solventului de diluare) la materialele
1000
ng/mL
- clorura de metilen (diclormetan)
liofilizate si la marimea minima a probei care trebuie sa fie utilizata, deoarece
200 (ig/mL
- benzen
folosirea unor probe mai niici decat cele recomandate este o sursa de erori.
200 jig/mL
tricloreteni
Pe de alta parte, trebuie sa se tina seama ca unele materiale farmaceutice de refe200 ug/mL
rinta $i unele materiale judiciare de referinia sunt toxice, neccsitand o manipulare
- 1,2-dicloretan
speciala (materiale de acest fel sunt identificate in catalog). De altfel, toate materialele
100 ug/mL
- cloroform
de referinta trebuie sa fie manipulate cu foarte mare atentie, ca si cum ar fi bio-active,
200 ug/mL
- 1,4-dioxan
toxice sau infectante, iar deschiderea ambalajelor (flacoane si fiole), con tin and astfel
100 Ug/mL
- acetonitril
de substante, se face nmnai de catre personalul cunoscator si instruit in acest sens.
200 ug/mL
- piridina
Toate substantele farmaceutice si judiciare de referinta si Standardele se utilizeaza
numai pentra nevoile laboratorului de analiza si control si nu se pot utiliza pentru uzul terapeutic curent.

In continuare, se dau trei produse ERU in tabelul 3.3.

3.3.2. Materiale de referinta pentru impuritati organice volatile produse iTabelul 3.3
de Radian International, USA
Metoda
Produsul
Datele referitoare la USP General Methods 467 Organic Volatile Impurity au fost
USP Method <467>
ERU 001
modificate cu regularitate si aduse la zi, dupa introducerea pentru prima data de catre
Organic Volatile Impurity Standard
Radian a "Reference Material, ERU 001" in 1995. Metoda particulara specials, privind utiUSP Method <467>
ERU 002
lizarea unui astfel de material, ca si detaliile aferente sau variatii privind aplicarea metodei
Modified PF 19 Organic Volatile Impurity
sunt specificate in monografiile individuale in care astfel de teste sunt necesare.
USP Method <467>
ERU 003
Amestecul original ERU 001, modificarea in PF 19, Number 3, Page 5335 si ultima
Euro EPMA Formula
formulare descrisa in Volume 22, Number 4, Page 2654 al Pharmaceutical Forum sunt date
in tabelul 3.1.
3.4. Substante controlate
Tabelul 3.1
Substanta din amestec
- clorura de metilen
- cloroform
- benzen
- 1,4-dioxan
- tricloretilena
40

ERU 001
1000 |ig/mL
500 ug/mL
1000 ug/mL
1000 ug/mL
1000 Ug/rnL

PF 19/3
1000 ug/mL
100 ug/mL
200 ug/mL
200 ug/mL
200 ug/mL

PF 22/4
1000 ug/mL
500 ug/mL
1000 ug/mL
1000 ug/mL
1000 ug/mL

Volumul
5 x 1 mL
4 x 1 mL
4 x 1 mL

Un numar deloc neglijabil de substante farmaceutice de referinta si judiciare de refegiinta, intre care mai ales narcotice, tranchilizante si alte medicamente de care se face
?: abuz, prezentate in catalogul Promochem, sunt "substante controlate" in tarile de origine
|corespunzatoare, de exemplu in USA pentru USP, Franta pentru EP si Marea Britanie peni'rtm BP, "fiind marcate" pe eticheta produsului cu "controlled substance".
Cumpararea, detinerea si utilizarea substantelor controlate fac obiectul unor
|reglementari nationale si internationale, concepute astfel meat sa limiteze abuzul lor.
|De aceea, consumatorul are responsabilitatea obtinerii oricarei autorizatii necesare
41

pentru cumpararea, posesia si utilizarea substantelor controlate, supunandu-se

autoritatii tarii importatoare, inainte de a face comanda.
Administrarea complexa, asociata cu aprovizionarea si posesia acestor materiale)
obliga Promochem sa se asigure ca to\i consumatorii care cer substante controlate sunt
constienti de toate cerintele importante nationale, de sarcinile asociate si timpii firesti de
eliberare.
Consumatorii doritori sa obtina substance controlate trebuie sa contacteze ofkiile Promochem de vanzare, inainte de a comanda, pentru a clarifica impreuna cu
specialistii fumizorilor procedeul de urmat si costul exact.
Toate cererile de substante controlate trebuie sa fie inaintate In sens si semnate
de o persoana autorizata. Comenzile trebuie sa fie insotite de autorizafia originals de
import sau de posesie. Cererile prin fax sunt binevenite, dar comenzile trebuie sa fie trimise cu documente originale prin posti.

omandarea USP Reference Standards Commitee, care aproba selectia si coresponden^a

' rodus nou si lot nou sau de inlocuire, in acord cu procedura descrisa mai jos.
S rtimentul, deci domeniul standardelor de referinja disponibile din USP, include:
- standarde de referinta oficiale curent in USP si NF;
standarde de referinta anterioare, cerute pentru o durata mai scurta, printr-o monografie USP sau prin NF;
- standarde de referinta Food Chemical Codex;
substante autentice, care sunt chimicale de inalta puritate, caracterizate, incluzand
medicamente de abuz, care sunt testate colaborativ (interlaboratoare) si facute
disponibile prin USP incepind cu ianuarie 2000; listele catalogului includ toate
amendamentele si produsele devenite oficiale prin USP, rncepand cu ianuarie 2000.

1) Producerea i certificarea standardelor de referinta

Dezvoltarea standardelor de referinta USP este un proces multifazic (cu mai multe
3.5. Informatii generale de comanda
'faze) care implica o cooperare voita (convenita) intre industria farmaceutica, agentiile
J guvernamentale si staff-ul stiintific a] USP si membrii Comitetului de Revizie. Etapele de
Procedeele de furnizare si preturile sunt date in lista de prejuri care insoteste cata- ! urmat ale procesului (pe parcursul a 1-2 ani) sunt urmatoarele:
logul Promochem sau se pot obtine de la oficiile locale de vanzare ale Promochem; cu
- prepararea si purificarea materialului "candidat la calitatea de standard de referinta";
aceste oficii trebuie sa se clarifice si detaliile si costurile, mai ales ca pentru unele cazuri
- testarea si caracterizarea printr-un studiu colaborativ (interlaboratoare);
(putine) se cer expedi^ii la rece (in frigider), licente speciale, substante controlate etc.
- revederea si recenzarea stiintifica initiala; lucrul analitic ulterior este adesea necePreturile pentru "bun a fi expediat in afara EU" sunt de resortul strict al FOB
sar, fiind posibila si respingerea materialului candidat si reluarea procedurii;
Shipping, iar pentru produsele care implica procedee speciale de expedite (Cooled
- prepararea scrisorii USP Reference Standards Commitee, continand datele studiilor
Shipping, licenta specials, substante controlate etc.) se aplica prefuri aditionale la costurile
colaborative, scrisoare ce va fi utilizata de organismul mentionat; acest document
este un raport intern al USP echivalent certificarii si el trebuie sa fie unanim apronormale de transport.
Odata expediate catre consumator, returnarea materialelor de referinta nu este perbat si confirmat de datele analitice; analistii trebuie sa solicite acest document;
misa, exceptand cazul ca materialul este alterat. Pentru o astfel de ratiune este foarte impor- ambalarea si controlul final de calitaie si testarea omogenitajii, a integritatii ambalajului etc.
tant ca utilizatorii sa fie siguri ca produsul cerat, deci comandat, acopera (satisface) nevoile
Tinand seama de natura riguroasa a procesului de aprobare si a timpului necesar, este
lor. Tot din astfel de ratiuni, staff-ul tehnic al' Promochem doreste sa discute cu utilizatorii explicabil faptul ca USP nu poate avea.disponibil un lot nou, inainte ca lotul existent sa fie
despre folosirea unui anumit produs in ideea de a verifica daca produsul corespunde sco- epuizat. Dar USP fumizcaza cu regularitate, pentru Promochem, informatii aproximative
purilor pentru care se doreste a fi comandat; service-ul acestor "sfetnici" nu se terminS privind disponibilitatea noului lot recomandat de USP RS.
odata cu vanzarea materialelor de referinta, ei putand discuta cu utilizatorii si aplicatiile
In conditii normale, un nou lot devine oficial si pastrat pentru utilizare ulterioara,
unui anumit material de referinta, ei fiind obligati sa acorde asistenta profesionala de spe- inainte ca lotul vechi sa fie complet vandut; modificarea necesara ca un lot vechi sa ramana
oficial inca pentru o perioada de timp implica recertiflcarea pentru a nu elimina lotul vechi
cialitate oricand este necesar.
icare mai poate fi bun si a introduce loturile urmatoare, ceea ce implica deseurile inutile.
USP nu ofera un certificat de analiza, dar a fost introdus un rezumat extras din do3.6. Farmacopeea Americana i formularul de standarde de referinta
(National Formulary Reference Standards NF) de la Conventia Farmacopeii cumental original realizat de staff-ul USP Division of Drug Standards Development; mai
jos este prezentat un exemplu de certificat nou; certificatele sunt disponibile pentru toate
USA, Inc.
.lotunle curente ale USP RS (Refecrence Substances) si pot fi comandate prin Promochem,
Substantele de referinta USP sunt de inalta puritate. deoarece sunt utilizate in (fiind expediate catre utilizatori direct de catre USP.
Pe pag. T8 a "USP Standards of Quality" este prezentat un exemplu de rezumat al masuratometode-test oficiale ale USP si NF. Atunci cand aceste substante sunt folosite ca parte a
monografiei principale oficiale, aceasta ofera mijloacele de a verifica conformitatea (com- I rilor, pentru un standard de referin|a USP, facut de USP Division of Standards, pe baza constatarilor
plianta) materialului cu standardele pentru identitate, concentrate, calitate si puritate pre- |> laboratoarelor colaborative, privind evaluarea materialului "candidat". Documentul original este in
I acord cu USP Document Disclosure Policy, confidential (Catalog Promochem 1999, p. 9).
vazute de USP 24 - NF 19.
Standardele de referinta USP sunt eliberate numai sub autoritatea USP Board of Trustees,
42

43

Tabelul 3.4. Exemplu de rezumat al unor maswatori pentru un standard de referinfa USP
Irythromycin MW 717,93 Nr. Catalog 24201-0
Lot F Formula moleculara: C37H67NO12
loncentratia declarata: 97%. Continutul este stabilit pe o baza "as is", fara uscare.
(potenta declarata)
Preparare si prezentare: fiole de sticla chihlimbarii. Fiecare fiola contine cca. 150 mg.
Conformitate: lotul este potrivit (convenabil) pentru a demonstra confonnitatea (complimta) cu toate cerintele monografiei "Erythromycin USP 23-9 Supl" in care aceasta USP
iS este necesara. Rezultatele pentru lotul actual sunt oferite numai pentru informatie.
'ierdere la uscare: 2,1% in timpul ambalarii (impachetarii)
Continutul titrabil cu HC1O4: potrivit cu concentratia
'uritatea cromatografica prin LC ?i TLC: satisfacatoare pentru aplicatii oficiale
erintele tuturor altor monografii: conforme
Data oficiala: acest rezumat este facut pentru a aplica intreaga perioada a statutului oficial al acestui lot, stabilita prin catalogul oficial - vezi mai jos, stabilitatea, conservareapastrarea si perioada de utilizare.
Semnatura: ss
Vicepresedinte si Director al Dezvoltarii Standardelor
Rockeville, MD 20852, USA, Tel.:
Fax:
Net:
Evaluarea omogenitatii
Lotul a fost testat pentru omogenitate prin analizarea probelor selectate intamplator
(aleator) in si intre laboratoare. Toate rezultatele au fost intre limitele admise ale metodei.
Nivelul omogenitatii se dovedeste a fi satisfacator pentru procedeul descris in monografie.
Instruction! de utilizare: urmeaza instructiunile de pe eticheta si din monografia
corespunzatoare (potrivita) USP si notele de indramare date in capitolul <11> a!
USP XXIII, USP XXV si once supliment ulterior.
Stabilitate, conservare si perioada de utilizare
Aceasta este responsabilitatea fiecarui analist, de a stabili ca transports
(aprovizionarea) special al standardelor de referinta USP este in executie (in curs de
desfasurare); pot fi cumparate numai cantitati suficiente pentru uzul imediat, trebuind sa
se evite pastrarea timp indelungat.
Pentru asigurarea accesului prompt la ultimele informatii, USPC publica un
"Catalog Oficial al Standardelor de Referinta si Substance autentice", care include denu
mirile loturilor, abonatnentul bilunar al publicatiei "Pharmacopoeial Forum". Acest sis
tern ofera un control mai bun, mai corect si flexibilitate in raspunsul la revizuirile in
folosirea standardelor de referinta, decat distribuirea datelor de expirare a unitatilor individuale. Catalogul aferent celei mai recente editii a Pharmacopoeial Forum identifies articolele care sunt oficiale in colectia USP Reference Standards, la data publicarii.
In catalogul oficial apar doua coloane pentru identificarea loturilor oficiale:
- prima coloana identified lotul curent oficial existent, expediat dc USPC Reference
Standards Committee;
- in unele cazuri un lot anterior poate fi considerat inca oficial; un astfel de lot poate
fi identificat in coloana a doua; in fapt, acest lot anterior este adus la "statutul oficial" pentru inca eel mult un an dupa ce lotul curent (actual) este distribuit, excepcontinuare in pag. 45
44

tamTcazuT schimbarii cerintelor monografiei sau a limitarilor stabilitajii, cand lotul

anterior nu mai corespunde.
Acest fel de informatie este de asemenea disponibila in sectia Reference Standards
USP Home Page la www.usp.org.
Autorizarea loturilor oficiale
Autorizarea loturilor oficiale de standarde de referinta USP, cu stabilirea si elibeea lor se face sub autoritatea USP Board of Trustees, dupa recomandarea USP
Reference Standards Committee, care trece printr-un proces de selectie si verificare a
potrivirii fiecarui lot.
Caracteristicile primejdioase (daunatoare) ale fiecarui lot al specimenului selectat
pentru a fi standard sunt determinate de regula independent, in trei sau mai multe
laboratoare ale USP si US FDA (sau altele), care participa la testarea aproape a tuturor
noilor standarde si la inlocuirea standardelor existente; la aceste testari participa laboratoarele academice si industriale de pe tot cuprinsul USA.
Incertitudinea masuratorilor
Aceasta este caracteristica laboratorului si are loc la data efectuarii analizei, respectiv in timpul analizei. Selectia numarului de specimene replicate sau de standarde cade in
esponsabilitatea laboratorului, fiind direct legate de obtinerea certitudinii dorita privind
concordanja si conformitatea cu cerintele oficiale (vezi USP 23 General Notices si cerinfe
sub "Test Results Statistics and Standards).
Utilizarea materialelor ne-monografice
Pentru a sprijini aplicatiile materialelor ne-monografice (deci neprevazute in monografii, dar necesare) care sunt permise de USP General Notices, in baza utilizarii unor
metode alternative, se poate utiliza un anumit material notand continutul statuat (stabilit)
anterior. Insa validarea metodei de analizS si standardul utilizat in astfel de situatii si aplicatii cade in sarcina si responsabilitatea laboratorului individual care efectueaza aplicatia.
Factorii continuitatii sunt atribuiti unor inlocuiri de lot al standardelor de referinta,
pentnl a asigura compatibilitatea rezultatelor pe perioade mai lungi de timp. Acestea sunt
intelesurile strict numai pentru cercetarea oficiala si pentru aceeasi validare a aplicatiilor
pretinse (adica efectuate).
Nota juridica (legala)
Aceasta se refera la faptul ca informatiile continute in acest document se pot utiliza
Qumai pentru procedeele si metodele descrise in versiunea actuala (oficial valabila) a
monografiilor USP.
Prin urmare, nici USP, contractorii acesteia, nici o persoana care actioneaza in
nurhele sau (al USP) nu pot produce:
- nici o garantie, justificare, nici reprezenta sau exprima alte opinii privind acuratetea,
plenitudinea si utilitatea informatiilor din acest document pentru alte procedee si
metode decat cele existente in monografiile in vigoare;
- nici o informatie continuta in acest document nu poate fi utilizata pentru a incalca
contmuare m pag. 46
45

Tabelul 3.4 continuare din pag. 45

recunoasterea drepturilor emitentului;

- nu se pot utiliza informatiile si metodele in cauza pentru a produce daune rezultate
din aceasta utilizare;
- in caz de conflict in rezultatele testului sau in privinta cercetarii, sunt determinante
numai metodele si procedeele oficiale, ca si inscrisurile de pe eticheta.
O descriere completa a bazelor (fundamentelor) pentru utilizare proprie si pentru
procedeele de control al lotului, pentru USP NF Reference Standards este data in
"General Chopter 11" a USP-24 NF 19.
Analistii sunt insistent sfaturfi sa revada aceasta sectiune asupra bazelor obisnuite
(uzuale), iar copii ale acestei sectii facuta din USP pentru PC si modificari recomandate
in suplimente se pot obtine numai de la Promochem, la cerere scrisa.
2) Perioada de utilizare si termene de expirare

Promochem a initial un program prin care, impreuna cu USP, sa fie aduse "US
g,, jjj conformitate cu cerintele europene; totusi, chiar si o astfel de informatie a fost
"lata din date oferite de ofertanti (care aprovizioneaza) si din domeniul public si nu
' fost verificate independent de staff-ul stiintific al Promochem si, prin urmare, nu poate
g garantata.
3.7. Substante de referinta, preparate biologice de referinfa si spectre
dupa Farmacopeea European* (EP)
Comisia Farmacopeii Europene, care se intruneste de trei on pe an, include printre
membrii sai, delegati din {Sri care au adoptat aceasta farmacopee.
La intalnirile acestei comisii sunt adoptate monografii noi, ceea ce implica si aparitia
unor noi substante chimice de referinta, EPCRS. Odata adoptate noile monografii EP de
catre comisia mentionati, ele sunt publicate intr-o publicatie anuala sau intr-o fascicula;
apoi ele sunt adoptate de catre membrii statelor incepand cu 1 ianuarie a anului urmator.
Pentru a sprijini monografiile EP, s-a intocmit o colectie a substantelor de referinja.
disponibile, care include:
- substante chimice de referinta oficiale in EP (EPCRS);
- spectre de referinta;
- preparate de referinta, intre care enzime si substraturi din "International
Commission on Pharmaceutical Enzymes and Certified Viscozity Standards", de la
Laboratoarele Van Swinden.
Noile liste ale EPCRS sunt publicate de trei on pe an, listele din acest catalog fiind
fgcute dupa EP List No. 26, October 2000.

Standardele de referinta USP nu sunt etichetate cu o data de expirare, deoarece sis- .temul numarului oficial de lot prezinta o flexibilitate mai mare decat termenul de expirare. i
Stocurile USP RS sunt controlate si verificate regulat si riguros, iarprin."Indexul ofi-1
cial al numarului de lot", tiparit de 6 on/an in Pharmacopoeia! Forum (PF), statutul oficial j
al tuturor loturilor poate fi controlat, fiind reglementat.
Lista in PF arata codul pentru identificarea lotului curent. In unele cazuri, un alt cod de
lot este identificat sub coloana si conduce la "lotul anterior/data". Once lot indicat in aceastS
coloana este de asemenea oficial pana la sfarsitul lunii mentionate; de exemplu, F-l (06/00)
se refera la faptul ca lotul F-l este oficial pana la 30 iunie 2000. "Nici o informatie" sau
"NONE" (deloc, nimic) in coloana exprima faptul ca numai lotul curent oficial poate fi uti- f|
1) Legaturi cu alte farmacopei din Europa
lizat, precum si faptul ca nici un lot anterior nu trebuie utilizat.
Este important ca fiecare analisf are responsabilitatea de a se asigura ca subs- 1
tantele USP de referinta sunt actuate, viabile.
Este de apreciat ca, odata ce apare o monografie EP, once substanta de referinja,
spectru sau preparat cerut, vor fi disponibile.
Cand o monografie EP este adoptata de catre membrii statelor Consiliului Europei,
3) Substante controlate
once
material de referinta disponibil din farmacopeile nationale, de exemplu British
I
Lista USP contine scheme I, II, III si IV cu reglementari privind substantele contro- Pharmacopeea (BP) si Pharmacopee Fran9aise (PF), sa inceteze a mai fi valabile, in
late. Informatii privind procedurile speciale ce trebuie aplicate se pot cere de la favoarea substantelor de referinta EP. Multe Jari membre ale Comisiei Farmacopeii
Europene au adoptat EP pe deplin, iar monografiile lor cer numai EPCRS.
Promochem pentru detalii si costuri.
In schimb, alte tari care sunt membre ale Comisiei EP mentin monografiile farma4) Fise cu date privind siguranta materialelor
copeilor nationale, mai ales pentru formele dozate, care necesita utilizarea substantelor de
referinta separate (corespunzatoare).
Este vorba in fapt de buletine care contin date referitoare la siguranta materialelor, |;
In sectiile catalogului Promochem, pentru astfel de substante sunt date liste cu RS
respectiv a tuturor standardelor de referinta USP RS (Material Safety Data Sheets -1 produse pentru monografiile farmacopeilor britanica, franceza si elvetiana.
Alte tan membre ale Comisiei EP au monografii nationale care nu necesita substante
MSDS), dezvoltate de USP in termeni de USP EPA Occupational Safety and Hazardous %
Substances Act, care sunt disponibile si care sunt oferite de USP; de notat ca MSDS oferite 1 de referinta speciale, de exemplu DAB (Germania), in timp ce Farmacopeea Italiana utide USP, dar distribuite de Promochem la toti clientii, nu sunt integral conforme cu cerintele * lizeaza un amestec de EPCRS si RS din Farmacopeea Internationala, IP. Substantele de
EU si deci este posibil sa nu fie in concordanta cu "Buletinele de date ale Sigurantei mate- referintS IP sunt descrise (date) in sectia acestui catalog Promochem, referitoare la'WHO
(World Health Organization - OMS).
rialelor" ale EP pentru aceleasi substante chimice.
46

47

In legatura cu producerea si certificarea substantelor de referinta EP si a preparatelor,

acestea sunt selectate si verificate de laboratoarele EP pentru a deveni compatibile (corespunzatoare) cu. utilizarea, asa cum se prescrie in monografiile principale ale EP.
Certificatele analizelor sau ale altor informatii nu sunt si nici nu pot fi facute disponibile prin Laboratoarele EP, in legatura cu utilizarea prescrisa EP-CRS.
Substantele de referinta din EP sunt concepute pentru aplicatii specifice care sunt
identificate printr-un numar de cod sau numere, incluse in descrierea fiecarui produs.
Este posibila si utilizarea altor CRS decat cele date in catalog, dar utilizatorul este
responsabil de verificarea corespunzatoare a EPCRS pentru orice utilizare non-monografica. In Tabelul 3.5 sunt prezentate unele CRS utilizabile, indicate prin numarul de cod.
Tabelul 3.5. Coduri ale unor CRS ?i utilizarea lor
Utilizarea

Codul
1
2
3

3A
4
4A
5
5A

6
7
8
8A
9
10
11
12
13
14
15
15A
16
17

18
19
19A
20
20A
21
22

Identificarea prin IR
Identificarea prin TLC
Identificarea prin punctul de topire
Identificarea prin depolimerizare
Identificarea prin LC
Identificarea prin cartografia peptidei
Identificarea prin electroforeza
Identificarea prin cromatografie de excludere (size exclusion)
Identificarea prin GC
Identificarea prin RMN
Identificarea prin UV sau colorimetric
Test pentru substante inrudite, prin UV sau colorimetric
Test pentru substante inrudite, prin TLC
Test pentru substante inrudite, prin LC
Test pentru substance inrudite, prin cromatografie de excludere
Test pentru substance inrudite, prin electroforeza
Test pentru substante inrudite, prin GC
Test prin UV sau colorimetric
Test prin LC
Test prin cromatografie de excludere
Test prin GC
Test microbiologic
Biotest
Imunotest
Test pe substrat cromogenic
Test prin titrare volumetrica
Test prin viteza de hidroliza
Metode generale
Alte propuneri

(Catalog Promochem, 2001, pag. 35)

48

M terialele de referinta trebuie s fie utilizate asa cum sunt livrate, afara de cazul in
noerafia declara c5 este necesar un procedeu de uscare.
2) Deschiderea
Pentru substantele de referinta oferite in flacoane (fiole) de sticla sigilate este recourmatorul procedeu EP de deschidere:
- se bate usor flaconul pentru a colecta materialul in partea de jos a ambalajului;
- se taie capatul opus, de exemplu al fiolei, cu o pilS sau creion de diamant;
- se incalzeste taieiura cu o bagheta de sticla incandescenta si se preseaza rapid (prin
apasare);
. daca sticla nu se sparge, se taie mai profund si pe o lungime mai mare ?i se repeta
procedure;
- este necesara protectia ochilor si a mainilor.
Numeroase substante de referinta sunt livrate ca materiale liofilizate, intr-un flacon
cu perete despartitor. De aceea nu trebuie sa se incerce deschiderea flaconului de sticla si
sa se cantareasca pudra. Este important sa fie urmate intocmai instructiunile monografiilor,
iar materialul se dizolva intr-un solvent-tampon, solutia rezultata putandu-se manipula volumetric.

mandat

3) Pastrare, perioada de utilizare, termen de expirare

Substantele chimice de referinta sunt inspectate cu regularitate si analizate in mod
repetat de staff-ul stiintific al EP. Fiecare EP CRS este primita de consumator astfel meat
ea sa fie potrivita pentru utilizarea dorita.
EP recomanda sa fie cumparat materialul numai atat cat este necesar pentru uzul imediat, iar flaconul sa fie pastrat nedeschis inainte de utilizare, la +2C sau la +8C, in func|ie
de indicatiile date de furnizor.
Exista substance de referinta prefixate, a caror eticheta este marcata cu semnul ||*||,
care trebuie sa fie pSstrate la -20C, iar altele marcate (tot prefixate) cu semnul ||**||, care
trebuie sa fie pastrate la -80C; intre acestea figureaza:
- Interferon alfa 2 a CRS;
- Interferon alfa 2 b CRS;
- Interferon gama 1 b CRS;
- Solutie CRS de Interferon 1 b de validare;
- Poliovaccin, inactivat, BRP;
- Vaccin Oreion (viu) BRP;
- Vaccin Rubella (viu) BRP.
Pentru Vero si RK 13, ambele prefixate - marcate cu semnul ||***||, este recomandata
temperatura azotului lichid.
Odata deschis un flacon continand CRS, EP nu mai poate garanta stabilitatea matenalului pentru timp mai indelungat, iar CRS neutilizat trebuie sa fie aruncat, nepastrandui se pentru o utilizare ulterioara.
Cele mai multe EP CRS pot fi transportate la temperatura obisnuita, dar unele trebuie
49

sa fie mentinute la temperaturi controlate; prin uimare, acestea din urma trebuie sa fie
transportate in conditii speciale care, impreuni cu alte detalii, pot fi obtinute la cerere.
Toate noile substante chimice de referinta EP incep cu "Sena 1" (Lotul sau Grupul
1), iar inlocuirea loturilor se numeroteaza cu 2, 3 etc. Perioada de utilizare si datele de expirare nu sunt date, dar cand se schimba senile (loturile), catalogul EP CRS arata data dupa
care lotul vechi nu mai este oficial.
Spre exemplu, specificatia urmatoare: "Sena 2 este valabila pana la 30 Noiembrie
2000" se refera la faptul ca lotul 2 nu mai este oficial incepand cu data de 1 Decembrie
2000, iar Sena sau Lotul 3 devine oficiala incepand cu aceasta ultima data.
Este insa posibil ca EP sa dea o perioada mica de suprapunere, astfel meat substantele
de referinta ale casei producatoare pot fi re-certificate fai de fostele si viitoarele serii sau
loturi.
Potentiala toxicitate a unor substante de referinfj necesita unele precautii pentru
evitarea contactului cu ele pe timpul utilizarii lor. Astfel de substante trebuie sa fie manipulate intr-un spatiu Tnchis, cu manusi, sau trebuie sa fie utilizate manusi si ochelari de protectie sau imbracaminte specials, si masca de protectie a ochilor si a cailor respiratorii.
Pe de alta parte, produsele biologice, intre care $i sangele, trebuie sa fie considerate ca substante cu rise potential pentru sanatate, ele trebuind sa fie utilizate si vandute in
acord cu procedeele de siguranta stabilite de laboratoare.
4) Substante controlate

T ' h'dele standard sunt disponibile din stoc in ambalaje de 250 mL si sunt certificate
la urmatoarele vascozitati:
= 0 6 - 2 1 ; 4,9; 0,19; 33; 52; 57; 66; 85; 104; 130; 170; 215; 270; 340; 425; 530;
630- 830- 1004; 1315; 1818; 3625; 5075; 18.350 sau 47.000 mmVi
m = 0 4; 1,6;' 4,1; 8,17; 28; 45; 49; 57; 74; 91; 114; 145; 190; 240; 300; 375; 470;
580; 745; 866; 1180; 1574; 3150; 4430; 16.200 sau 41.600 mPas
Toate vascozitatile sunt calibrate fata de apa pura. Valorile declarate sunt valori no al ' valorile certificate nu trebuie sa devieze cu mai mult de 10% din valorile nominale.
Incertitudinea vascozitatilor certificate este mai mica de 0,2% la cea mai scazuta vascozitate si este panS la 1,1% la 80.000 mmVi.

Onr

Perioada de utilizare. Standardele pana la 500 mPas se bazeaza pe uleiuri minerale

au o viata pe raft de 12 luni de la data certificarii. Peste 500 mPas se utilizeaza
"Polyisobutylene" (poliizobutilena), care are o viata pe raft mai scurta si trebuie sa fie
comandata atunci cand este necesar.
Pe de alta parte, se pot prepara si certifica lichide pentru orice vascozitate cuprinsa
intre 0,6 mmV1 si 80.000 mmV1 (pretul depinde de vascozitatea ceruta, de gradul de precizie dintre vascozitatea nominala ceruta si certificata, de temperatura si de certificarea
; vascozitatii dinamice).
7) Enzime standard

I
Comisia intemationala pentru enzime farmaceutice a impus stabilirea unor metode
Lista EP contine un numar de substante supuse programelor III si IV referitoare la p
"Reglementari asupra substantelor controlate"; pentru procedeele speciale de cerere trebuie % cantitative de evaluare si defmirea exacta a activitatii enzimatice pentru enzimele semnificativ farmacologice.
contactat Promochem, acesta comunicand si costurile.
Ca o consecinta a acestei cerinte, Federatia Farmaceutica Intemationala - FIP
m
(Federation International Pharmaceutique) a produs si certificat substante de referinta pen5) Siguranta materialului. Data - Fise
tru enzime si substraturi.
Produsele FIP cerute in unele monografii sunt marcate cu (EP), ex. FIP 2 (EP) ...
Fisele referitoare la datele privind siguranta materialelor EP CRS sunt disponibile la
cerere, fiind incluse in editiile CD ROM ale monografiilor Farmacopeii Europene si site- Amylase (pancreatic), spre deosebire de FIP 1 Amylase (fungal).
ul EP. Trebuie precizat ca si astfel de informatii oferite au fost redactate din date fiirnizate
3.8. Substante de referinta ale Farmacopeii Britanice - BP
de distribuitori si de la domeniul public si nu au fost verificate independent de staff-ul
stiintific al EP si nici de Promochem, de aceea ele nu pot fi garantate.
Substanfele de referinta ale Farmacopeii Britanice - BP-CRS disponibile din BP sunt
publicate sub egida "British Pharmacopeia Commission" si sunt utilizate numai in teste si
6) Lichide certificate pentru masuratori de vascozitate
incercari ale BP 99.
Lichidele cu vascozitate certificate (Newtoniene) sunt furnizate de Van Swinden
Lista din catalogul Promochem este actuala, deci oficiala din aprilie 2000 si include
Laboratorium BV si sunt distribuite de Promochem, fiind disponibile cu vascozitati cinematice pana la 80.000 mmV1 si sunt certificate la temperaturi cuprinse in domenjul 10 C- toate BP CRS disponibile, necesare pentru a Tntelege si a urma monografiile incluse in BP
99, care au devenit oficiale la 1 decembrie 2000. Cele mai multe monografii pentru sub140C.
stantele active sunt coroborate cu monografiile publicate de EP si astfel este necesara utiVascozitatea cinematica se exprima si se certifica in mmV sau in mPas (vascozitate
lizarea EP CRS - European Pharmacopoeia Chemical Reference Substances. Detalii ale
dinamica, m), m = v x densitate .
acesteia sunt gasite in Lista EP RS (substante de referinta din Farmacopeea Europeans) din
acest catalog Promochem.
1 mPas = s cps (centipoise)
1 mmV = 1 cts (centistocke)

so

51