Instructivo para deteccin de

alrgenos
ALERT Peanut Allergen

ESPECIFICACIONES DE PRODUCTO
Control previsto: 5 ppm de cacahuate
Tiempo aproximado de la prueba: 30 minutos
Pruebas por kit: 20
ALERT para el cacahuate, est destinado para el anlisis cualitativo de
residuos de protena de cacahuate en los productos alimenticios, en las
superficies ambientales y enjuagues de limpieza.
OBJETIVO
Conocer la presencia de residuos de alrgenos en los enjuagues de limpieza en
las superficies ambientales, as como en el producto terminado.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
ALERT para alrgenos de cacahuate, es un ensayo inmunoenzimtico (SELISA) de captura. La prueba es un ensayo Elisa de sndwich la protena de
cacahuate es extrada de una muestra de campo utilizando una solucin salina
bufferada (PBS) mediante agitacin constante en un bao de agua caliente
seguida por centrifugacin o filtracin. La protena extrada es transferida a
unos pozos recubiertos con anticuerpos de captura, donde la protena se une a
los anticuerpos durante la incubacin.
Cualquier protena que no se uni se elimina con un lavado y se agrega un
segundo anticuerpo (detector), que est ligado a una enzima. El anticuerpo
detector se une a la protena que se ligo previamente. Despus de un segundo
lavado, se agrega el substrato. El color se desarrolla como resultado de la
presencia del anticuerpo del anticuerpo detector ligado. Se agrega una solucin
inhibitoria (STOP) y el color resultante en la solucin es observado. Un color
azul indica muestras fuertemente positiva. Un color rojo indica cacahuate
escaso o ausente.

DEFINICIONES

ALRGENOS: Son protenas del alimento que pueden crear una

respuesta inmune en individuos susceptibles. Si se ingieren pueden
causar severas alergias, vomito, diarrea, dificultad para respirar,
inflamacin de la boca y la lengua y descenso rpido de la presin
sangunea.
ANTICUERPOS: Es una protena producida por el sistema inmunitario
del cuerpo cuando detecta sustancias dainas, llamadas antgenos.
ENSAYO INMUNOENZIMTICO: Es un inmuno-ensayo en la cual
un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a
una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de
color o algn otro tipo
ENZIMA: protena que cataliza las reacciones bioqumicas del
metabolismo. Las enzimas actan sobre las molculas conocidas como
sustratos y permiten el desarrollo de los diversos procesos celulares.
POZO: Recipientes pequeos de plstico con antgenos pre-contenidos.
SOLUCIN BUFFER: Soluciones que ante la adicin de un cido o base
son capaces de reaccionar oponiendo la parte de componente bsica o
cida para mantener fijo el pH.
SOLUCIN DE EXTRACCIN: Solucin empleada para separar un
producto orgnico de una mezcla de reaccin o para aislarlo de sus
fuentes naturales.
SUSTRATO: Molcula sobre la que acta una enzima.

MATERIALES
Micropozos
Recubiertos
Con
Anticuerpos

Goteros
Vacos No
Etiquetados
Para Muestra
Con Punta

Gotero
Etiqueta
Amarillo
Control
Cacahuate (5
Ppm)

Gotero
Etiqueta Azul
Conjugado De
Anticuerpos
(Con Etiqueta
De Enzima)

Gotero
Etiqueta
Verde
Sustrato KBlue

Gotero
Etiqueta
Roja
Solucin
Inhibitoria
(Red Stop)

Bolsas De
Disolvente
De
Extraccin
De Polvo
Seco (Pbs
De 10 Mm) (1
Bolsa- 1 Litro
Solucin
Extraccin)

Frasco De
Concentrado
De Solucin
Buffer
(tamponado)
De Lavado
(Pbs-Tween
De 10 Mm) (1
Fraso- 1 Litro
Solucin
Buffer De
Lavado)

Muestra De 50
G De Aditivo
De Extraccin

Cuchara
Plstica De
Medicin

Juego de Extraccin de Alrgenos (producto Neogen ALERT)

Licuadora de alta velocidad con un vaso de 250 mL o recipientes
desechables de 250 mL.
Bscula con capacidad de pesar + 0.1 g
Bao mara agitado. (60 C + 1)
Termmetro.
Papel filtro Whatman # .
Dos frascos de 1 L para preparar soluciones de lavado y de extraccin.
Toallas de papel absorbente.
Marcador a prueba de agua.
Botella de lavado.

Agua destilada o desionizada.

Temporizador.
Probeta graduada de 150 mL.

PRECAUCIONES
1. Las muestras previstas para probar contenido de cacahuate, se debern
de extraer por separado de las muestras para probar alrgenos de otros
alimentos. Los aditivos de extraccin para cada tipo de prueba, estn
diseados especficamente para el alrgeno del alimento objetivo.
2. Los componentes del kit ALERT para alrgenos de cacahuate, como
son controles y reactivos de extraccin, pueden contener uno o ms de
los siguientes materiales potencialmente alrgicos: leche, protena de
huevo, protena de cacahuate o protena de soya. Si es alrgico a
cualquiera de estos compuestos, tenga precaucin al utilizar ste
producto.
3. Refrigere el kit entre 2-8 C cuando no est en uso. No congele el kit.
4. Antes de su uso, permita que el kit alcance la temperatura ambiente
(18-30 C)
5. No utilice los componentes del kit despus de la fecha de vencimiento.
6. No mezcle los reactivos de un kit con un nmero de lote, con los de otro
nmero de lote.
7. No corra ms de 6 pozos por prueba.
8. Slo utilice los tiempos de incubacin especficos. Otros tiempos pueden
dar resultados poco precisos.

DESARROLLO
PREPARACIN DE SOLUCIONES
1. Solucin de extraccin: Prepare la solucin de extraccin agregando
una bolsa del disolvente de extraccin, 10mM PBS, a 1 L de agua
destilada. Revuelva para mezclar completamente. Cubra y refrigere las
porciones no utilizadas a 2-8 C.
2. Solucin buffer de lavado: Prepare la solucin buffer de lavado,
vertiendo todo el concentrado de bufferado (tamponado) de lavado, en
un frasco vaco de 1 L. Enjuague el recipiente del concentrado de
tamponado con agua destilada, y vierta en el frasco de 1L, para
asegurar que se utilice todo el concentrado. Llene el frasco de 1L con
agua destilada adicional y revuelva para asegurar que quede bien
mezclado. Cubra y refrigere las porciones no utilizadas 2-8 C.
*Nota: Deseche las porciones no utilizadas de la solucin
de extraccin y de tamponado de lavado cuando haya
usado completamente el kit.

3. Pozos de anticuerpos: Mantenga los pozos sellados en la bolsa de

papel metalizado hasta que se necesiten. Retire los pozos de la bolsa de
papel metalizado solamente hasta que se hayan extrado las muestras, y
que est listo para empezar el procedimiento de la prueba.

PREPARACIN Y EXTRACCIN DE LAS MUESTRAS

La muestra que se pruebe, se deber moler y mezclar completamente antes de
proceder con el procedimiento de extraccin.
1. Prepare la solucin de extraccin, como se describe en la preparacin
de soluciones.
2. Caliente la solucin de extraccin a 60 C.
3. Obtenga una muestra representativa. Si la muestra es de tamao de
partcula ms grande, macerarla a un tamao de partcula ms fina.
4. Transfiera 5 g de muestra o 5mL de muestra lquida, a un frasco de
plstico desechable o a un vaso de licuadora de 250 mL.
5. Agregue una cucharada rasa de aditivo de extraccin de cacahuate al
frasco /vaso de la muestra.
6. Vierta 125 mL de la solucin de extraccin a 60 C frasco /vaso de la
muestra y tpelo.
7. Extraiga agitando (150 rpm) en un bao mara a 60 C, durante 15
minutos. Retire el frasco del bao. Alternativa: Batir a velocidad alta
durante 2 minutos.
8. Deje reposar el material durante 5 minutos. Nota: En algunos casos,
se requerir filtrar para lograr un sobrenadante libre de material
suspendido. Filtre el extracto vertiendo cuando menos 5 mL a travs
de un papel filtro Whatman # 4.
9. Use una pipeta para transferir aproximadamente 1 mL del
sobrenadante (la porcin superior de lquido del extracto) a un frasco
de muestras con gotero. Enseguida, etiquete y coloque la punta del
gotero en el frasco.
10.Empiece el procedimiento de la prueba una vez que la muestra se
haya enfriado a temperatura ambiente (cuando menos 15 minutos).
PREPARACIN Y EXTRACCIN PARA HISOPOS AMBIENTALES
1. Preparar la solucin de extraccin como se describe en las notas de
procedimiento.
2. Prepare la solucin de trabajo combinado 125 mL de la solucin de
extraccin en un contenedor separado y agregue una cuchara del
aditivo para el alrgeno. Prepare una solucin de trabajo fresca
diariamente. Nota: Prepare 125 mL de solucin de trabajo por cada
25 hisopos ambientales.
3. Precaliente la solucin de trabajo a 60 C. Agite el recipiente para
disolver el aditivo.
4. Colecte la muestra con un hisopo, usando uno de los siguientes
mtodos:
Para superficies secas: Abra un nuevo hisopo y remjelo
con la solucin de extraccin. Frote un rea de 10 cm x 10
cm usando una tcnica cuadricular. (No humedezca los
hisopos con la solucin de trabajo).

5.
6.

7.
8.

Para superficies hmedas: Abra un nuevo hisopo y

frtelo en un rea de 10 cm x 10 cm usando una tcnica de
cuadricular. No humedezca el hisopo antes de su uso.
Regrese el hisopo a su tubo original una vez efectuada la muestra.
Recuerde de marcar cada tubo.
Retire el hisopo del tubo, y adicione 5 mL de solucin de trabajo a 60
C al tubo. Mezcle colocando el hisopo en el tubo y agite durante 2
minutos en la mano (invirtiendo el tubo).
Retire el hisopo del tubo.
Coloque un nuevo punto de gotero en el tubo. La solucin en el tubo
ahora sirve como una muestra. Nota: Tenga cuidado al invertir el
tubo, un poco de lquido puede gotear.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Antes de usarlos, permita que el kit y todos los reactivos se lleven a
temperatura a,biente (18-30 C)
1. Retire un pozo para cada muestra que se va a probar, ms 1 poza para
el control y colquelos en una superficie plana.
2. Mezcle cada reactivo revolviendo el gotero antes de usarlo.
3. Aada al primer pozo 3 gotas del gotero control, con etiqueta amarilla.
Aada 3 gotas de cada extracto de muestras a un pozo respectivamente
e identifquelos con el marcador indeleble. Mezcle durante 20 segundos
deslizando hacia adelante y hacia atrs los pozos sobre una superficie
plana.
Control

S1

S2

S3

S4

S5

4. Incube los micropozos 10 minutos a temperatura ambiente (18-30 C).

5. Agite para sacar el contenido de los pozos. Con un frasco de lavado lleno
con solucin buffer de lavado, llene cada pozo y agite para sacar el
contenido. Repita 5 veces el lavado. Retire el excedente del lavado
volteando el pozo de cabeza y golpeando vigorosamente los pozos con
una toalla desechable.
6. Aada a cada pozo 3 gotas del gotero de conjugado con etiqueta azul.
Mezcle durante 20 segundos deslizando hacia adelante y hacia atrs los
pozos sobre una superficie plana.
7. Incube los micropozos 10 minutos a temperatura ambiente (18-30 C).
8. Agite para sacar el contenido de los pozos. Con un frasco de lavado lleno
con solucin buffer de lavado, llene cada pozo y agite para sacar el
contenido. Repita 5 veces el lavado. Retire el excedente del lavado
volteando el pozo de cabeza y golpeando vigorosamente los pozos con
una toalla desechable.

9. Aada a cada pozo 3 gotas del gotero de sustrato con etiqueta verde.
Mezcle durante 20 segundos deslizando hacia adelante y hacia atrs los
pozos sobre una superficie plana.
10.Incube los micropozos 10 minutos a temperatura ambiente (18-30 C).
11.Aada a cada pozo 3 gotas del gotero de solucin inhibidora con
etiqueta roja. Mezcle durante 20 segundos deslizando hacia adelante y
hacia atrs los pozos sobre una superficie plana. Los resultados estn
listos para ser interpretados.
INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
Compare visualmente el color de un pozo de muestra (S1, S2, S3, etc.) con el
color del pozo control. Si el pozo de muestras tiene MS COLOR AZUL que el
pozo de control, la muestra resulta POSITIVA para contaminacin de
cacahuate de ms de 5 ppm.

Si el pozo de muestras tiene MENOS COLOR AZUL O MS COLOR ROJO que

el pozo de control, la muestra contiene menos de 5 ppm de contaminacin de
cacahuate.

REFERENCIA
http://www.neogen.com/FoodSafety/pdf/ProdInfo/A-Peanut.pdf