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Revista Cubana de Farmacia

versin On-line ISSN 1561-2988

RevCubanaFarmv.41n.2CiudaddelaHabanaMayoago.2007

Empresa Laboratorio Farmacutico "Julio Trigo"

Desarrollo de un mtodo analtico para el control de la


calidad del colirio de pilocarpina 2 %
Martha Botet Garca,1 Caridad Margarita Garca Pea,2 Jacqueline Aylema
Romero,3 Caridad Rodrguez4 y Vivian Martnez Espinosa5

Resumen
Se desarroll y valid un mtodo analtico alternativo para el control de la calidad del
colirio de pilocarpina por espectrofotometra ultravioleta, ya que este mtodo resulta
ms rpido, sencillo y econmico. Adems, se valid el mtodo analtico reportado para
el estudio de estabilidad por cromatografa lquida de alta resolucin. Ambos mtodos
se compararon estadsticamente y resultaron especficos, lineales, precisos y exactos
en el rango de concentraciones estudiadas.
Palabras clave: Pilocarpina, cromatografa lquida de alta resolucin,
espectrofotometra ultravioleta.
El clorhidrato de pilocarpina es una amina terciaria, parasimpaticomimtica que
estimula directamente los receptores colinrgicos. Produce la contraccin del msculo
esfnter del iris, da lugar a la constriccin del msculo pupilar (miosis); constriccin del
msculo ciliar (acomodacin), lo que provoca el aumento de la acomodacin y una
reduccin de la presin intraocular, asociada con un incremento del flujo de salida y un
decremento del flujo de entrada del humor acuoso. Adems tambin puede inhibir la
secrecin del humor acuoso.1
La espectrofotometra ultravioleta es un poderoso instrumento en una variedad de
problemas analticos. Aunque en muchas oportunidades tiene el inconveniente de la
falta de especificidad, debido a la interferencia con los productos de degradacin, los
cuales en ocasiones pueden presentar un espectro idntico al componente sin
degradar, y en otras las concentraciones a determinar son muy pequeas y estn por
debajo del lmite de sensibilidad del mtodo o dentro de su error experimental.2
La cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR) le brinda la posibilidad al analista de
emplear esta herramienta para solucionar los inconvenientes de los mtodos
espectrofotomtricos en los estudios de estabilidad, pues adems de presentar una
alta sensibilidad y exactitud, es en esencia un mtodo separativo, lo que permite medir
con gran selectividad el compuesto deseado, siempre y cuando se encuentre un
sistema cromatogrfico que asegure una adecuada separacin.3
La validacin es el proceso establecido para la obtencin de pruebas documentadas de

que el mtodo es lo suficientemente fiable para producir el resultado esperado.4-6


Los parmetros analticos que pueden ser considerados en la validacin de un mtodo
analtico, segn se expresa en la United States Pharmacopoeia (USP 26, USP 27), son
exactitud, precisin, especificidad, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin,
linealidad, rango, tolerancia y robustez.

El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar un mtodo analtico alternativo para
el control de la calidad del colirio de pilocarpina y su validacin. Adems, demostrar si
existen diferencias significativas entre el mtodo desarrollado y el reportado en la
Farmacopea de los Estados Unidos, USP 27, previamente validado.

Mtodos
Las muestras del colirio de pilocarpina al 2 %, utilizadas para el desarrollo de este
trabajo fueron identificadas como lote 2004, fabricado en la Empresa Farmacutica
Julio Trigo.
Validacin del mtodo analtico para la cuantificacin por CLAR

En el ensayo se emple un cromatgrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER)


ajustado a 215 nm, un dosificador de 20 L e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La
separacin se realiz isocrticamente sobre una columna hypersil ODS, longitud de 25
cm, dimetro interno 4 mm y tamao de partculas 5 m. La fase mvil utilizada
consisti en una mezcla desgasificada de KH2PO4 0,02 M, Acetonitrilo (88:12) con una
velocidad de flujo de 1,5 mL/min.
Con el objetivo de evaluar la especificidad del mtodo se analiz la sustancia de
referencia qumica del clorhidrato de pilocarpina (de calidad USP, con 100 % de
pureza), el placebo y una muestra del producto terminado sometida a condiciones
drsticas como: hidrlisis cida HCl 0,1 N e hidrlisis bsica, almacenada a una
temperatura de 70 oC durante 21 das.
Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se prepar una curva de
calibracin con soluciones patrn de clorhidrato de pilocarpina en un rango de
concentraciones de 48 a 112 g/mL, que representan del 60 al 140 % de la
concentracin terica del principio activo en la solucin.
Se evalu la precisin del mtodo. La repetibilidad se estudi sobre la base de 6
determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas en 2 das diferentes para
comprobar la precisin intermedia del mtodo.
En el estudio de la exactitud se emple el mtodo de recuperacin; se prepararon
muestras con diferentes niveles de clorhidrato de pilocarpina que representan el 80,
100 y 120 % de la concentracin terica del principio activo en la solucin, segn la
formulacin propuesta. Con el objetivo de verificar la relacin lineal de la respuesta
analtica con respecto a los diferentes niveles de concentracin utilizados, se realiz el
estudio de linealidad a travs de los coeficientes de variacin de los factores de
respuesta CVf, los cuales deben ser menores que el 5 %. Adems se realiz la prueba
de proporcionalidad, para lo cual se utiliz el estadgrafo t Student, con el objetivo de
demostrar la proporcionalidad de la seal obtenida. Tambin se determin la influencia

del factor concentracin en la variabilidad de la respuesta obtenida, a travs de la


prueba de Cochran (G calculada debe ser menor que G tabulada).4-6
Desarrollo y validacin del mtodo analtico para la cuantificacin por espectrofotometra ultravioleta
(UV)

En el desarrollo del mtodo analtico por espectrofotometra ultravioleta se utiliz un


espectrofotmetro Spectronic GnesisTM 2PC. Para la seleccin adecuada de la
longitud de onda a utilizar, se realizaron previamente espectros UV, en la zona de 200
a 400 nm, con la sustancia de referencia, producto terminado, placebo y materia prima
del clorhidrato de pilocarpina, disueltos en agua destilada; se observ un mximo de
absorbancia a 215 nm.
La solucin de referencia se obtuvo disolviendo el clorhidrato de pilocarpina, sustancia
de referencia, en agua destilada hasta obtener una concentracin de 20 mg/mL
aproximadamente.
En la preparacin de la solucin de ensayo para la valoracin se disolvi una alcuota
de la muestra del colirio en agua destilada hasta una concentracin de alrededor de
20 mg/mL. Se lee a 215 nm contra un blanco de agua destilada.
Con el objetivo de evaluar la especificidad del mtodo se emplearon muestras con la
sustancia de referencia qumica del clorhidrato de pliocarpina, placebo, muestra de
producto terminado pilocarpina colirio y muestras sometidas a condiciones drsticas de
hidrlisis cida y bsica, realizando un scanning de las soluciones entre 200 y 400 nm.
Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se prepar una curva de
calibracin con solucin patrn de clorhidrato de pilocarpina en un rango de
concentraciones de 10 hasta 30 mg/mL que representan del 50-150 % de la
concentracin terica del principio activo en la solucin.
Se evalu la precisin del mtodo. La repetibilidad se estudi sobre la base de 6
determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas en 2 das diferentes para
comprobar la precisin intermedia del mtodo; para el estudio se utilizaron los
estadgrafos F-Fischer y t-Student, con el objetivo de determinar la existencia de
diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por ambos analistas y entre
las medias obtenidas, respectivamente. Primeramente, se realiz la prueba de Fischer
y se verific la homogeneidad de las varianzas alcanzadas por diferentes analistas; se
debi obtener un valor calculado menor que el tabulado. En el caso del estadgrafo tStudent se debe obtener tambin un valor calculado menor que el tabulado.
En el estudio de la exactitud se emple el mtodo de recuperacin, para lo cual se
prepararon muestras con diferentes niveles, que representan el 80, 100 y 120 % de la
concentracin terica del principio activo en la solucin.
Comparacin estadstica

Con el objetivo de realizar una comparacin estadstica entre los resultados por CLAR y
los obtenidos por el mtodo analtico alternativo desarrollado por espectrofotometra
ultravioleta se aplic el estadgrafo de la t de Student para determinar si existan
diferencias significativas entre los 2 mtodos.

Resultados

Validacin del mtodo analtico para la cuantificacin por CLAR

La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del mtodo.


Como se observa al comparar la seal obtenida para la sustancia de referencia (I) y la
muestra de pilocarpina clorhidrato (II), existe similitud en cuanto al tiempo de
retencin. En el cromatograma correspondiente al placebo (III) no se obtuvo ninguna
seal en la zona de inters, lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de
la solucin no interfieren en la determinacin del principio activo. En cuanto a las
muestras sometidas a condiciones drsticas; se observan en los cromatogramas (IV, V)
la aparicin de picos secundarios, atribuibles a un posible producto de degradacin, el
cual no interfiere en la determinacin del principio activo.

Fig. Resultados del estudio de especificidad del mtodo cromatogrfico. ICromatograma de la sustancia de referencia qumica. II- Cromatograma del producto
terminado (muestra). III- Cromatograma del placebo. IV- Cromatograma de la
muestra degradada por hidrlisis cida. V- Cromatograma de la muestra degradada por
hidrlisis bsica.
Simultneamente se realiz un scanning al pico correspondiente al principio activo en
un rango de 200 a 400 nm, para una pureza del 99,5 %.
En la tabla 1 se reportan los resultados del estudio de la linealidad del sistema y la
exactitud. Los resultados del estudio de precisin del mtodo desarrollado aparecen
reportados en la tabla 2.
Tabla 1. Resultados del estudio de la linealidad del sistema y exactitud
Parmetros
Linealidad del sistema

Exactitud

CLAR
y= 0,30663 X + 2,018
r = 0,99956
CVf= 0,94 %
tcalc= 2,03
ttab= 3,18
y= 1,14589 x - 0,89245
r= 0,99945
CVf= 1,58 %
R= 99,28 %
tcalc = 1,69
ttab = 2,57

UV
y= 23,677 x + 0,00193614
r= 0,99948.
CVf = 1,13 %
tcalc= 2,99
ttab= 3,18
y = 0,999788 x + 0,0138373
r= 0,99916
CVf= 2,17 %
R= 99,70 %
tcalc= 1,77
ttab= 3,18

Lmites
y= a x + b
r 0,99900
CVf 5,0 %
tcalc < ttab
y= a x + b
r 0,99000
CVf 5,0 %
R= 98,0 102,0 %
tcalc < ttab

Gcalc= 0,5879
Gtab = 0,9750

Gcalc= 0,8709
Gtab= 0,9750

Gcalc < Gtab

Tabla 2. Resultados del estudio de la precisin del mtodo analtico por CLAR
Analista 1
Analista 2
Da 1
Da 2
Da 1
Da 2
103,5 %
102,2 %
102,8 %
102,9 %
102,8 %
102,0 %
102,7 %
102,5 %
102,5 %
102,1 %
103,8 %
102,4 %
102,5 %
102,0 %
102,5 %
103,6 %
103,0 %
102,4 %
102,8 %
103,0 %
103,0 %
102,4 %
103,0 %
102,6 %
CV = 0,33 %
CV = 0,16 %
CV = 0,40 %
CV = 0,39 %
Fcal= 2,52 Ftab (10,10 / 0,05)= 2,97
tcal= 1,59 ttab (22 / 0,05)= 2,07
Validacin del mtodo analtico para la cuantificacin por UV

Los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del mtodo realizado a 215 nm,
al placebo, la sustancia de referencia qumica, y el colirio de pilocarpina se muestran
en la tabla 3.
Tabla 3. Estudio de especificidad por espectrofotometra ultravioleta
Muestra
Placebo
Sustancia de referencia qumica de
clorhidrato de pilocarpina
Colirio de pilocarpina 2 %

Absorbancia (310 nm)


0,002
0,003
0,003
0,410
0,403
0,405
0,406

0,399

0,404

En la tabla 1 se reportan los resultados del estudio de la linealidad del sistema y la


exactitud, mientras que los resultados correspondientes a la precisin aparecen en la
tabla 4.
Tabla 4. Resultados del estudio de la precisin por espectrofotometra
Analista 1
Da 1
99,7 %
99,6 %
99,9 %
100,5 %
100,9 %

Analista 2
Da 2
99,8 %
98,9 %
100,8 %
100,8 %
101,7 %

Da 1
100,7 %
98,7 %
99,4 %
99,9 %
100,9 %

Da 2
99,3 %
99,6 %
100,5 %
100,9 %
98,1 %

101,9 %
CV= 0,80 %

99,7 %
CV= 0,90 %

101,2 %
CV= 0,88 %

tcal= 1,79
ttab= 2,33

99,6 %
CV= 0,98 %
Fcal= 2,45
Ftab= 5,05

Leyenda: CV: coeficiente de variacin; t: estadgrafo t-Student; F:


estadgrafo F-Fischer.
Comparacin estadstica

Los resultados de la comparacin estadstica de los resultados obtenidos por CLAR y el


mtodo analtico desarrollado por espectrofotometra ultravioleta se aprecian en la
tabla 5.
Tabla 5. Comparacin estadstica de los mtodos por CLAR y UV
CLAR
(%)
102,9
102,5
102,4
103,6
103,0
102,6
Media= 101,5%
CV= 1,35 %

Espectrofotometra
(%)
100,5
100,9
101,9
101,7
101,2
100,9
Media= 101,4 %
CV= 1,38 %
Tcal = 1,98
ttab= 2,33
CVf = 2,09

Lmites

CVf 5,0 %
tcal< ttab

Discusin
Como se puede apreciar en la figura el mtodo reportado por CLAR resulta especfico al
no detectarse interferencias de picos adicionales en la zona de elusin del producto
principal. El scanning realizado con el objetivo de determinar la pureza del pico de
pilocarpina, en el rango de 200 a 500 nm demostr que no exista solapamiento de
otros productos de degradacin.
Los resultados obtenidos en el estudio de especifidad del mtodo espectrofotomtrico,
reflejados en la tabla 3, al analizar muestras del placebo, la sustancia de referencia de
clorhidrato de pilocarpina y el producto terminado, indican que los excipientes no
interfieren en la determinacin del principio activo, lo que demuestra la especificidad
del mtodo para el control de la calidad al no observarse absorbancia del placebo a la
longitud de onda mxima del principio activo. Sin embargo, al analizar las muestras
sometidas a condiciones drsticas se observaron interferencias de los productos de
degradacin a la longitud de mxima absorbancia de la pilocarpina, lo que demuestra
que el mtodo no es especfico para el estudio de estabilidad del colirio.
Las curvas de calibracin de los mtodos validados para el control de la calidad y el
estudio de estabilidad del colirio de pilocarpina resultaron ser lineales. Al aplicar la
prueba del intercepto a cada uno de los mtodos, resultaron no significativos ya que

las t tab fueron mayores que las t cal, por lo que se rechaza la hiptesis nula de que el
intercepto es igual a cero, para ambos mtodos. En la prueba de linealidad mediante el
coeficiente de variacin de los factores de respuesta CVf, se obtuvieron coeficientes de
variacin menor del 5 % y se demostr el cumplimiento de la linealidad en el intervalo
de concentraciones estudiados para ambos mtodos validados.
En los estudios de repetibilidad se obtuvieron coeficientes de variacin adecuados,
menores que 1,5 % lo que demuestra la buena precisin de los mtodos. Los valores
obtenidos para los estudios de la precisin intermedia demostraron que no existen
diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes
das para una probabilidad de 0,05 %, ya que los valores de F cal son menores que la F
tab. Al realizar las prueba de la t de Student para ambos mtodos, el valor calculado
result ser menor que el tabulado, lo cual demuestra que no existen diferencias
significativas entre las medias alcanzadas con un nivel de significacin del 5 %.
En los estudios de exactitud realizados para los 2 mtodos, los valores de porcentaje
de recobro estuvieron dentro de los lmites establecidos para los mtodos
espectrofotomtricos y cromatograficos (98-102 %), y los valores del coeficiente de
variacin para cada uno de los niveles de concentracin estudiados resultaron menores
que el 5 %. En la influencia del factor concentracin sobre la variabilidad de los
resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran, las concentraciones
empleadas son equivalentes, lo que indica que la concentracin no influye en la
variabilidad de estos. No existieron diferencias significativas entre las recuperaciones
medias y el 100 % de recuperacin al aplicar la prueba de la t de Student, ya que la t
cal fue menor que la t tab, por lo que el mtodo es exacto. La curva de recuperacin
reportada de mg tericos contra los mg prcticos demostr un comportamiento lineal.
La prueba de significacin del intercepto result no significativa y el valor de la
pendiente no difiere significativamente de la unidad. Los valores alcanzados de la
pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlacin demostraron la exactitud y
linealidad del mtodo.
Al analizar estadsticamente los resultados obtenidos de los mtodos analticos por
CLAR y el desarrollado por espectrofotometra ultravioleta, para la cuantificacin del
colirio de pilocarpina 2 %, para el estudio de estabilidad y control de la calidad,
respectivamente, se pudo comprobar que no existen diferencias significativas entre los
resultados, al ser la t cal menor que la t tab.

Summary
Development of a analytical method for quality control of 2 % Pilocarpine eyedrops

A alternating and analytical method was developed and validated for quality control of
Pilocarpine eyedrops by UV spectrophotometry, since this method is more fast, simple,
and cheap. Also, for stability study by high performance liquid chromatography,
reported analytical method was validated. Both methods were statistically compared,
and were specific, linear, accurate, and in the rank of study concentrations.
Key words: Pilocarpine, high performance lilquid chromatography, UV
spectrophotometry.

Referencias bibliogrficas

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1989. p. 1224-6.
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Methodology, ICH-Q2B, Geneva, 1996. ICH harmonized tripartite guideline.
Methodology of validation of analytical method. Recomendado en nov. 1996. Geneva:
ICH; 1996.
Recibido: 8 de enero de 2007. Aprobado: 9 de febrero de 2007.
MC. Martha Botet Garca. Empresa Laboratorio Farmacutico "Julio Trigo". Avenida
Independencia km 7.5, Boyeros, La Habana, Cuba. Correo
electrnico: caridad@cidem.quimefa.cu
1 Master en Tecnologa y Control de Medicamentos. Empresa Laboratorio Farmacutico
"Julio Trigo".
2 Master en Tecnologa y Control de Medicamentos. Investigador Agregado. Centro de
Investigacin y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).
3 Licenciada en Bioqumica. Reserva Cientfica. CIDEM
4 Tcnica en Anlisis Qumico. Empresa Laboratorio Farmacutico "Julio Trigo".
5 Tcnica en Tecnologa Farmacutica. CIDEM.