Gram boyama

Beyin omur ilik sıvısı örneği içinde Gram-pozitif Bacillus Anthracis (mor çubuklar). Eğer
olsalardı Gram-negatif bakteriler pembe görüneceklerdi. Diğer hücreler akyuvardır.
Gram boyama, bakterileri hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre iki
büyük gruba (Gram-pozitif, Gram-negatif) ayırmak için kullanılan empirik bir yöntemdir.
Bu metodu bulan kişi, Danimarkalı bilim adamı Hans Christian Gram'dır. Bu metodu, 1884
yılında, pnömokoklar (Streptococcus pneumoniae) ile Klebsiella pneumoniae bakterilerini
ayırt edebilmek için geliştirmiştir.

Kullanım
Araştırmalarda
Gram boyama, bakteriyoloji laboratuvarındaki en faydalı boyama tekniklerinden biridir. Bu
teknik, bir bakteri örneğinin kimliğinin belirlenmesinde ilk aşama olan Gram-pozitif/Gram-
negatif ayrımının yapılmasında kullanılır.
Tıbbi Alanda
Gram boyama, enfeksiyon şüphesi olan vücut sıvılarında ve biyopsi örneklerine de uygulanır.
Menenjit şüphesi olan Beyin omurilik sıvısı örneklerinde veya Septik artrit şüphesi olan
eklem sıvısı örneklerinde uygulanabilen bu teknik, zamanın kısıtlı ve tedavinin acil
olabileceği durumlarda, bazen günlerce beklemeye sebep olan kültür uygulamalarından çok
daha çabuk sonuç verir.
Yöntem
Gram boyama yapmak için hazırlanmış preparatın üzerine kristal viyole boyası damlatılıp 1
dakika beklenir ve iyot-lugol çözeltisi ile yıkanarak kristal viyole uzaklaştırılır. Preparata
tekrar iyot-lugol çözeltisi damlatılarak 1 - 2 dakika bekletilip, distile su ile yıkanarak iyot-
lugol çözeltisi uzaklaştırılır. Preparatın üzerine %96 'lık etil alkol veya eter – aseton çözeltisi
damlatılarak 10 - 15 saniye beklenir, distile su ile yıkanır ve karşıt boya olarak safranin
damlatılır ve 20 - 30 saniye bekletilir. Preparat distile su ile yıkanarak havada kendi halinde
kurumaya bırakılır, preparata immersiyon yağı damlatılır ve 100 'lük objektifle incelenir. Mor
renkli bakteriler Gram pozitif, pembe-kırmızı renkli bakteriler ise Gram negatif olarak
değerlendirilir. Gram boyama için gerekli olan tüm çözeltiler hazır ticari kitler halinde de
pazarlanmaktadır.
Mekanizma
Gram-pozitif bakterilerin kristal viyole/iyot kompleksini tutma özelliğine sahip peptidoglikan
yapıda hücre duvarları vardır. Hücre duvarlarının ağsı ve kat kat peptidoglikandan oluşan
yapısı boya parçacıklarını tutar. Gram-negatif bakterilerin hücre duvarı ise sadece ince bir
peptidoglikan katmanında oluşur ve boyaları tutamaz. Gram-negatif bakterilerde aynı
zamanda lipid yapıda bir dış zar duvardır.
Alkol, Gram-pozitif hücre duvarının su kaybedip büzüşmesine neden olur bu yüzden boya
tanecikleri moleküllerin arasına sıkışır. Gram-negatif bakterilerdeki ince olan peptidoglikan
katman boya parçalarını tutamaz; alkol dış zardaki lipitleri çözünce boya dağılır, hücrenin
rengi açılır. Renk açılması adımı önemlidir ve belli bir yetenek gerektirir çünkü Gram-pozitif
olma kesin bir sonuç vermeyebilir. Renk açılmasının ardından birinciden farklı ikinci bir boya
(safranin or fuchsin) uygulanır, bu boya rengi açılmış hücreleri boyayarak onların
görünmelerini sağlar. Gram pozitifler birinci boyayla mora boyandıkları için ikinci boya
onların rengini etkilemez, ama Gram negatif olanlar pembe-kırmızı olurlar.
Genellikle (istisnalar mevcuttur), Gram-negatif bakteriler hastalık yapıcı kuvvetleri açısından
daha tehlikelidirler. Gram-negatiflerin dış zarlarının üstünde, antikorların bağlanmasını
engelleyen bir sümük tabakaları vardır. Bakterinin dışında kapsül bulunması da hastalık
yapıcı etkinliğini arttıran (virülans) faktörlerdendir. Gram-negatif bakteriler bütün bunlara ek
olarak, dış zarlarında lipopolisakkarit bulunur, bu yangının (enflamasyonun) artmasına neden
olan bir endotoksindir. Yangı o derece şiddetli olabilir ki septik şok meydana gelebilir. Gram-
pozitiflerin ise hücre duvarlarını koruyan dış zarları yoktur ve vücudun ürettiği lizozim enzimi
çıplak peptidoglikan katmanlarına zarar vererek bakteriyi imha eder. Gram-pozitifler bu
özellikleri yüzünden penisilin gibi beta-laktam antibiyotiklere daha duyarlıdırlar.

Gram-pozitif

Gram-pozitif bir bakteri olan Bacillus Anthracis

Gram-pozitif gram boyama prosedüründen geçtikten sonra, mikroskop altında mavi-siyah,
mor renk alan bakterilerdir. Bu rengin sebebi gram-pozitif bakterilerin hücre duvarlarının
kristal viyole/iyot karışımını tutmasıdır. Gram-negatif bakterilerin aksine gram-pozitif
bakterilerin hücre duvarlarının dışında ¨Dış Zar¨ bulunmaz. Peptidoglikan hücre duvarı daha
kalın olan gram-pozitiflerin boyaları tutma kuvvetleri fazladır.
Orjinal bakteri sınıflandırmasında gram-pozitifler Firmikütler şubesini oluşturuyorlardı.
Firmikütler şubesi çok geniştir ve içerdiği bazı ünlü familyalar şunlardır: Bacillus, Listeria,
Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, ve Clostridium. Bu şube, Mycoplasma
grubunun da üyesi olduğu Mollikütleri de içine almak üzere genişletilmiştir. Bu bakteriler
hücre duvarına sahip olmadıkları için gram boyasıyla boyanamazlar ancak boyanabilen
türlerden geliştikleri varsayılmaktadır.
Actinobacteria gram-pozitiflerin başka bir ailesidir. Actinobacteria ve Firmikütler,
DNAlarındaki yüksek ve düşük G+C miktarı sebebiyle (sırasıyla) guanin ve sitozin grupları
olarak adlandırılırlar. İkinci hücre zarına sahip olmamaları ve sterollere sahip olmaları
sebebiyle bu şubelerin ökaryotların ataları oldukları iddia edilmiştir.
Deinococcus-Thermus grubu bakteriler de yapıları gram-negatif bakterilerle aynı olmasına
rağmen boyanma şekilleri yüzünden gram-pozitif sayılmışlardır.
Hem gram-pozitif bakterilerin hem de gram-neagit bakterilerin S-tabakası denen ayrı bir
zarları daha vardır. Gram-negatiflerde s-katmanı, dış zara yapışıktır. Gram-pozitiflerde ise s-
katmanı, peptidoglikan tabakasına yapışıktır. Gram-pozitiflerin kendilerine has bir özellikleri
hücre duvarlarında teyikoik asit bulundurmalarıdır. Lipoteyikoik asit denen, özel teyikoik asit
türünün lipid kısmı, peptidoglikan tabakasının hücreye ¨ demirlenmesine¨ yardımcı olur.
Gram-pozitif bakteriler
Gram-pozitif bakteriler Gram boyama işlemi sonunda kristal viole renk veren bakterilerdir.
Gram-pozitif bakteriler mikroskop altında mavi veya viole renk verirken, Gram-negatif
bakteriler pembemsi renk verirler. Gram sınıflandırma sistemi ampiriktir ve daha çok hücre
duvarı arasındaki yapı farklarına dayanır.
Karakteristik özellikleri
Şu özellikler genellikle Gram pozitif bakterilerde bulunur:
1. Sitoplazmik zar (membran)
2. Polisakkarit kapsül
3. Çok kalın bir hücre duvarı (peptidoglikan)
4. Eğer filagellum mevcut ise , bunu korumak için iki halka içerirler.Gram negatif
bakterilerde ise buna karşılık 4 halkalı yapı bulunur çünkü bunların sadece bir
membran tabakası vardır.
5. Şelat yapıcı ajan olarak ve bazı tiplerde yapışmayı sağlamakla görevli olan Teikoik
asitler ve lipotekoik asitler mevcuttur

Gram-negatif

Gram-negatif olan Brucella bir ¨kokobasil¨ türüdür. (Resim: Dr.Larry Stauffer/2002)

Gram-negatif bakteriler Gram boyama prosedürü sırasında kristal viyole boyasını tutmayan
bakterilerdir. Gram-pozitif bakteriler, alkolle yıkandıktan sonra mavi rengi tutmaya devam
ederlerken, Gram-negatif bakteriler mavi rengi kaybederler. Gram boyama testinde kristal
viyoleden sonra bir karşı boya eklenir. Bu boya Gram-negatif bakterileri kırmızı-pembe renge
boyar. Bu test, hücre duvarlarının türüne göre çok farklı olan iki bakteri tipini ayırmakta son
derece faydalıdır.
Gram-negatif bakterilerin pek çoğu patojendir. Yani, insanlarda hastalık yapma yetisine
sahiplerdir. Bu hastalık yapma yetisi, Gram-negatif hücre duvarının bazı özelliklerinden, isim
vermek gerekirse LPS (lipopolisakkarit) içeriğinden kaynaklanmaktadır. LPS'ler
endotoksinlerdir.
Özellikleri
1. Hücre duvarlarında gram-pozitiflere oranla daha ince peptidoglikan vardır.
2. Peptidoglikan tabakasının dışında başka bir lipopolisakkarit zar vardır.
(Lipopolisakkarit tabaka; lipid A, polisakkarit çekirdekler ve O antijeni içerir. Ayrıca,
bu lipopolisakkarit tabaka mikroorganizmaya toksik etki kazandırır.)
3. Dış zarda, belli molekülleri geçiren ¨Porin¨ler vardır.
4. Peptidoglikan tabakası ve dış zar arasında periplazmik boşluk denen bir boşluk
vardır.
5. S-katmanı peptidoglikana değil, dış zara bağlıdır.
6. Flagella (eğer varsa) iki değil dört halkalıdır.
7. Teikoik asit veya lipoteikoik asit yoktur.
8. Sitoplazmik zar
Bazı gram-negatif bakteri türleri
Proteobacteria türleri arasında önemli olanlar: Escherichia coli, Salmonella,
v.b.Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas,
Bdellovibrio, acetic acid bacteria, Legionella .
Tıbbi açıdan manalı Kok (Bakteri) türleri arasında bel soğukluğu etmeni Neisseria
gonorrhoeae, menenjit etmeni Neisseria meningitidis ve solunum sisteminde enfeksiyon
yapan Moraxella catarrhalis sayılabilir.
Tıbbi açıdan manalı basil türleri birkaç gruba ayrılırlar. Solunum sistemini etkileyenler:
Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas
aeruginosa. İdrar yollarını etkileyenler: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter
cloacae, Serratia marcescens. Sindirim sistemini etkileyenler: Helicobacter pylori,
Salmonella enteritidis, Salmonella typhi'.