Tincin Simple y Tincin Gram

Telenchana Prez Erika Vanessa

Laboratorio de Microbiologa, Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos,
Universidad Tcnica de Ambato

Resumen
La observacin de bacterias vivas o muertas con microscopa ptica, puede
realizarse por diferentes procedimientos como son la observacin directa de
microorganismos o con el tratamiento utilizando colorantes mediante tincin
positiva y negativa. En el presente trabajo se describen los mtodos y las
tcnicas ms habituales para la observacin se muestras (tincin simple y
tincin de Gram) en el microscopio donde

observaron tres muestras

bacteriolgicas identificando su tamao y agrupacin bacteriana dando

como resultado en tincin simple bacterias de tipo alargado (Bacilos), al
igual que en tincin de Gram bacterias alargadas (Bacilos) siendo Gram
negativas.
Introduccin
Los primeros estudios sobre morfologa bacteriana los realiz Anthony Van
Leeuwenhoek y se limitaron a la descripcin del aspecto grande, brusco
o grueso de estos microorganismos. Con las mejoras realizadas al
microscopio ptico y la implementacin de las tcnicas de tincin
bacteriana, se mejor notoriamente la observacin de los aspectos
morfolgicos externos como el tamao, la forma y la agrupacin que son
considerados como caractersticas morfolgicas generales de las clulas
bacterianas (Villafane, 2008).
El tamao tan pequeo de las bacterias no permite observarlas a simple
vista, ya que su promedio oscila entre 0.5 y 2.0 micrmetros de dimetro.
En cuanto a su forma, las bacterias se agrupan en tres tipos principales
bacilos, cocos, curvos o helicodales. Las caractersticas morfolgicas de las
bacterias se pueden apreciar mediante tcnicas microscpicas, ya sea en su
estado vivo o muerto. En la morfologa bacteriana se encuentran
caractersticas mayores como el tamao, la forma o estructura y el tipo de
agrupacin. Algunas veces estas caractersticas se relacionan con el gnero
y en ocasiones con una especie determinada, sin embargo actualmente el

tamao de una bacteria puede medirse con mxima exactitud. Segn la

especie las bacterias pueden ser esfricas, en forma de bastn o de espiral.
Estas formas pueden sufrir variaciones por diferentes circunstancias
(exgenas) a las bacterias como aumento de la presin osmtica del medio,
escasez de humedad, entre otras (Olivas, n.d.).
El tamao y forma de la mayora de clulas bacterianas resulta difcil de ver
con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar
el contraste es la utilizacin de colorantes. El estudio microscpico de las
bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes
apreciando su forma y tamao, en general todas la bacterias vivas son
prcticamente incoloras es decir no presenta suficiente contraste con el
medio acuoso que se encuentran, por tal razn es necesario teirlas para
que produzcan un contraste con respecto al medio que se encuentran
(Snchez, 1982).
La tincin es un mtodo sencillo y una de las tcnicas ms utilizadas en los
laboratorios para clasificar microorganismos. Existen dos tipos de tinciones
para la diferenciacin de bacterias, tincin simple y tincin diferencial de
Gram. En la tincin simple o directa se tie homologadamente la clula por
lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad
definiendo su morfologa y agrupacin bacteriana, solo se utiliza un
colorante bsico, que puede ser azul de metileno, safranina, cristal de
violeta etc. En la tincin compuesta o diferencial desarrollada por el doctor
Christian Gram en 1884 se requiere la combinacin de dos o ms colorantes
que permite clasificar las especies de bacterias. De acuerdo con la
estructura de la pared bacteriana se pueden agrupar las bacterias en Gram
positivas y Gram negativas. Las Gram positivas poseen una capa ms
gruesa en donde el colorante cristal violeta queda adherido y aparecen con
el citoplasma teido uniformemente de color azul o violeta mientras que las
Gram negativas tienen una capa ms delgada haciendo que se coloreen de
rosado o rojo al teirse de safranina, estas diferencias estn basadas en la
estructura y composicin qumica de la pared celular (Tortora, Funke, &
Case, 2007).
El objetivo de esta prctica mediante la preparacin de muestras
bacteriolgicas y bajo diferentes tcnicas de tincin (tincin Simple y tincin

diferencial de Gram) se pretende establecer diferencias morfolgicas y

estructurales entre y dentro de los microorganismos, identificar su tipologa
y clasificacin bacteriana.
Material y mtodos
Para la preparacin del frotis se coloca una gota de agua estril (agua
destilada) sobre un portaobjetos limpio. Con un asa de transferencia
previamente flameada, se transfiere una pequea cantidad de clulas de
cultivos bacterianos. Se distribuyen y mezclan uniformemente las clulas
bacterianas de la muestra con el agua destilada y se esparce con frotes
suaves la suspensin en el portaobjetos. Terminado este procedimiento el
asa bacteriolgica debe ser flameada nuevamente. Se deja secar la muestra
al ambiente para evitar el rompimiento o desintegracin de la suspensin y
una vez seca se fija el frotis pasando la placa por la llama del mechero tres
veces fijndola al portaobjetos. Dejndolo enfriar completamente se
procede a realizar la tincin simple y tincin de Gram en 3 muestras
diferentes.
Para la tincin simple se cubre totalmente la muestra preparada con azul de
metileno y se deja actuar el colorante por 1 minuto. Luego se procede a
lavar con agua destilada eliminando el exceso de colorante. Se deja secar
completamente la placa al ambiente y una vez seco se coloca en el
microscopio y se observa con el objetivo de inmersin.
En la tincin diferencial de Gram se utiliza cuatro soluciones diferentes.
Primero se coloca cristal violeta en toda la extensin del frotis hasta cubrirlo
por completo y se deja actuar por 1 minuto para luego ser lavado con agua
destilada y eliminar excesos. Posteriormente se cubre la suspensin con
lugol, durante 1 minuto y nuevamente se lava con agua destilada. Para
decolorar la muestra se aplica etanol al 95% por 30 segundos y se lava con
agua destilada.

Finalmente se tie el frotis con

safranina, durante 1

minuto, se lava el exceso con agua destilada y se deja secar al ambiente.

Una vez seco se coloca en el microscopio y se procede a observar la
muestra con el lente de inmersin.
Resultados

TINCIN SIMPLE
Muestra TG022 (Objetivo 100x)

Forma: Cilndrica alargada

Agrupacin bacteriana: Estreptobacilos
TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM
Muestra TG024 (Objetivo
Muestra DG123 (Objetivo 100x)
100x)

Forma: Cilndrica alargada

Agrupacin bacteriana:
Gram negativo

Forma: Cilndrica alargada

Agrupacin bacteriana:
Diplobacilos
Gram negativo

Discusin
En la prctica realizada se observaron y analizaron tres muestras
bacteriolgicas diferentes, utilizando un proceso denominado tincin. Este
proceso de tincin es un mtodo sencillo que increment el contraste entre
la clula y su entorno y por lo tanto contribuy a mejorar la imagen
observada y el cambio de color de los microorganismos. Para esta
experimentacin se utilizaron dos tipos de tinciones aplicados con
frecuencia en un laboratorio de microbiologa, la tincin simple la tincin
diferencial de Gram, para el anlisis de la placa que contena la muestra
TG022 se utiliz la tincin simple, ya que este tipo de tincin celular destaca
al microorganismo de forma completa con el empleo de un solo tipo de
colorante (azul de metileno) para que se vean las formas y las estructuras
celulares ms simples, el tipo de colorante utilizado fue de carcter bsico
porque permite la mayora de colorantes estn formados por iones cargados
positivamente y en este caso las clulas bacterianas estn dbilmente
cargadas haciendo que este tipo de colorante se adhiera a la pared celular
por enlaces inicos dbiles adems acta sobre todas las clulas de las

bacterias de forma rpida, y as observando esta placa con el objetivo de

inmersin se identificaron bacterias con forma alargada y cilndrica de forma
desagrupada caracterstica principal de los Estreptobacilos. Para la muestra
TG024 y DG123 se utiliz la tincin diferencial de Gram con el empleo de
ms de dos sustancias, que permitieron distinguir a que grandes grupos
pertenecan si al de las Gram positivas que retienen el primer colorante
utilizado o al de las Gram negativas que se tien con el segundo colorante,
esto se pudo establecer debido a que se utiliz el cristal violeta como
colorante primario haciendo que se tia toda la muestra de un mismo color,
para despus de un breve lapso cubrir la muestra con lugol logrando su
combinacin en el citoplasma de cada bacteria y colorendolo de violeta
oscuro o prpura y despus haber agregado el etanol y decolorarlas
parcialmente, las bacterias que conservan este color se denominan Gram
positivas mientras que las que lo pierden Gram negativas, despus del
proceso de decoloracin rpidamente se incorpora un colorante bsico de
contraste o secundario (safranina) que tie de color rosado las clulas que
no retuvieron el complejo cristal violeta-yodo, y si se tien de un color azul
o violeta son Gram positivas mientras que si se tien de rosado o rojo son
Gram negativas, como en el caso de las dos muestras analizadas con el
objetivo de inmersin TG024 y DG123 que al igual que en la tincin simple
se distinguieron bacterias de forma alargada y cilndrica en el caso de la
muestra TG024 son bacterias del grupo de los.. y la muestra DG123 son
Diplobacilos.

Cuestionario

Por qu se utilizan colorantes bsicos en la tincin simple? Nombre 3

ejemplos.

En las tinciones simples se usa un nico colorante de carcter bsico. Casi

todos los colorantes son sales, es decir estn formados por iones. Se utilizan
estos colorantes porque las clulas bacterianas estn dbilmente cargadas
en su superficie con cargas negativas mientras que en los colorantes
bsicos, la parte que proporciona el color est cargada positivamente. Los
ms utilizados son el Cristal Violeta, el Azul de Metileno y la Safranina
(Cavallini, 2005).

Sealar las diferencias entre la tincin simple y la tincin diferencial

de Gram.

Tincin simple o directa:

*Es una solucin acuosa o alcohlica de un colorante bsico.
*Se utiliza un solo colorante.
*Todas las estructuras celulares

bsicas se tien con la misma tonalidad

destacando el microorganismo completo.

Tincin compuesta o diferencial de Gram:
*Esta tincin diferencial depende de la estructura de la pared celular de las
bacterias logrando distinguirlas en dos grupos (Gram positiva Gram
negativa).
* Se utilizan varios colorantes combinados.
*Las estructuras celulares se diferencian o tien en funcin de los diferentes
colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica.
(Tortora et al., 2007)

Cul es la funcin del lugol y del alcohol en la tincin de Gram?

Lugol (mordiente):
Esta sustancia se denomina mordiente El lugol (yoduro) reacciona con el
cristal violeta y forma un complejo violeta-yoduro haciendo que todas las
clulas continen con dicha tonalidad, acta como mordiente se combina
con un constituyente celular y lo altera de tal modo que tie el colorante
primario aplicado a la muestra e intensifica dicha coloracin.
Alcohol:
Acta como decolorante ya que extrae el colorante de las clulas teidas,
cuando se aade a una mezcla de bacterias Gram positivas y Gram
negativas teidas con cristal violeta, las bacterias Gram positivas quedan
teidas de violeta mientras que las que las bacterias Gram negativas

pierdan su color violeta haciendo que solo se retenga

el colorante

secundario.
(Lpez, 2014)

Escriba las diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram

negativas y 2 ejemplos de cada grupo

Bacterias Gram positivas:

*Se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram.
*Retienen un colorante especfico.
* No tiene membrana externa.
*No tienen espacio periplasmtico.
*Poseen otros componentes como cidos teicoicos y lipoteicoicos, que
sirven como agentes quelantes y en ciertos tipos de adherencia.
Ejemplos: Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis.
Bacterias Gram negativas:
* Se tien del colorante secundario generalmente de color rosado o rojo.
*Presentan dos membranas lipdicas entre las que se localiza una fina pared
celular de peptidoglicano.
*Entre la membrana citoplasmtica interna y la membrana externa se
localiza el espacio periplsmico.
*Solubles en solventes orgnicos como el alcohol.
Ejemplos: Morganella morganii, Chlamydia trachomatis.
Conclusiones
Se identificaron las diferentes caractersticas morfolgicas que presentan
las bacterias con el anlisis de tres muestras de cultivo bacteriano logrando
visualizar bacterias de forma cilndrica y alargada, denominndolas as
como Bacilos con la aplicacin de tcnicas sencillas de tincin que
incrementaron el contraste de las clulas, til para detectar las estructuras

celulares bsicas mediante la tincin homologada del material celular

mejorando la observacin microscpica.
Se clasificaron las muestras bacterianas en dos grupos, como Gram
positivas y Gram negativas fundamentndonos en que las bacterias Gram
positivas retienen el cristal violeta y por lo tanto se ven de un color violeta
intenso mientras que las Gram negativas pierden el color violeta con el
agente decolorante y toman un color rosado al teirse con la safranina
como se observ en las dos muestras utilizadas (TG024 y DG123).
Bibliografa
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